Datasets:

Jingmei

/

Pandemic_PMC

like 0

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7158279/

Infektionen, Impfungen, Reisemedizin

9.1 Differenzialdiagnose Fieber Definition Erhöhung der Körpertemperatur infolge einer gestörten Wärmeregulation (Sollwertverstellung durch Pyrogen- oder Toxinwirkung, z.B. von Makrophagen, Tumorzellen, Stoffwechselprodukten, Bakterienbestandteilen); bis 38 °C subfebrile Temp., bis 38,5 °C mäßiges Fieber, über 39 °C hohes Fieber. 9.1.1 Differenzialdiagnose bei Fieber mit Lokalbefund Bei Kindern s.a. 16.4.1. Tab. 9.1 DD bei Fieber Körperregion mit Lokal-Symptomen Untersuchung auf/Begleitbefund Mögliche Ursache Weiterführende Untersuchung Kopf Starke Kopfschmerzen Akute Sinusitis, Arteriitis temporalis (18.5.3) BSG ↑↑, CRP ↑ Meningismus, neurologische Ausfälle Meningitis, Hirnabszess, Enzephalitis (21.5) Klinikeinweisung zu CCT, Liquordiagn. Ohren Stechende Ohrenschmerzen, Schwerhörigkeit Otitis media (23.6.3), beginnender Zoster Otoskopie, Druckschmerz am Mastoid Zähne Schwellung und Schmerzen im Kieferbereich Zahnwurzelabszess, Sialadenitis (23.8.1) Zum Zahnarzt schicken; Drüsenausführungsgang: auf Eiter achten NNH Spontan-, Druck- und Klopfschmerz Sinusitis (23.5.2) Sono, Diaphanoskopie, evtl. Facharztüberweisung zum HNO-Arzt Mund/Rachen Tonsillenvergrößerung, eitrige Beläge Streptokokken-Angina (23.3.2); Mononukleose ( 9.4.3 ); Scharlach (16.7.3) Abstrich auf Bakterien, Serologie Hals/Nacken LK-Schwellungen Mononukleose ( 9.4.3 ), Tonsillitis (23.3.2), Toxoplasmose ( 9.6.1 ), M. Hodgkin (19.4.3), Seitenstrangangina (23.7.1), Scharlach, Röteln Sono, großes BB, Serologie, evtl. Exstirpation Thorax RG, Dämpfung Dyspnoe, Tachykardie Pneumonie (12.3.3), Lungenembolie (12.9.2) Rö-Thorax, ggf. Klinikeinweisung Leber Druckschmerz, Vergrößerung Hepatitis (8.7.1), Cholezystitis (8.9.2) Sono, Serologie Cholestase Cholangitis (8.9.3), Cholelithiasis (8.9.1) Sono, außer bei Hep. immer Klinikeinweisung Unterbauch Druckschmerz, keine Diarrhö Peritonitis (8.1.6), Appendizitis (8.5.3), Ileus (8.1.6) Klinikeinweisung Chirurgie Darmgeräusche spärlich oder hochgestellt Adnexitis (14.3.3), Ileus (8.1.6) Klinikeinweisung Gynäkologie oder Chirurgie Diarrhö und Druckschmerz Inf. Gastroenteritis ( Tab. 9.15 ) Bakt. Stuhldiagn. M. Crohn und Colitis ulcerosa (8.5.2) Sono, kleines BB, CRP, Koloskopie Flanken Klopfschmerz, Dysurie Harnwegsinf. (13.3.2), Pyelonephritis (13.3.3) U-Stix, Urikult®, Sono, Klinikeinweisung bei V.a. Urosepsis Spondylitis (6.1) Röntgen, weitere Bildgebung durch Facharzt Gelenke Rötung, Schwellung, Druckschmerz Rheumatische Erkr. (18), Eitrige Arthritis (6.5.13), Sarkoidose (12.7.2) Facharztüberweisung oder Klinikeinweisung je nach Lokalbefund oder AZ Extremitäten Klopfschmerz, Rötung, Schwellung Akute Osteomyelitis (6.5.13), Phlegmone, Abszess (4.3.4), Erysipel (26.5.2) Facharztüberweisung oder Klinikeinweisung je nach Befund Haut Flächenhafte Rötung, Lymphangitis Erysipel (26.5.2), Phlegmone, Zoster LK-Status; Klinikeinweisung je nach Lokalbefund und AZ 9.1.2 Differenzialdiagnose nach Fieberverlauf • Kontinua: Anhaltend Fieber:DDhohes Fieber ( 1 °C) mit Fieber > 39 °C, zwischendurch Perioden mit niedrigerer Temperatur, vorübergehend auch Abfall auf Normalwerte möglich: Z.B. Sepsis durch einen streuenden Herd, z.B. Endokarditis (10.7.1). Klinikeinweisung zur Diagn. und Ther. • Biphasisches Fieber: Temperaturanstieg für 1–2 d auf > 39 °C (Erregerausbreitung), Abfalls der Temperatur, zweiter meist länger andauernder Temperaturanstieg (Organbefall). Influenza ( 9.4.4 ), viele Virusinf. Symptomatische Behandlung, Klinikeinweisung bei schlechtem AZ. • Undulierendes Fieber: Über 2–3 d langsam ansteigendes und wieder abfallendes, mäßig hohes (bis 39 °C) Fieber im Wechsel mit Perioden normaler Temperatur über mehrere Wochen hinweg. Brucellose ( 9.3.4 ), Tumorfieber, Autoimmunkrankheiten. Klinikeinweisung zur Diagn., ggf. Ther. • Rekurrierendes Fieber: In regelmäßigen Abständen auftretendes, mehrere Tage anhaltendes hohes Fieber (> 39 °C). Malaria möglich, andere bakt. Erkr. ( Diagn.: Reiseanamnese, EDTA-Blut für Plasmodiennachweis, 9.10.8 und 9.10.9 ). • Subfebril: Temperaturerhöhung dem physiologischen Tagesablauf angepasst, nicht über 38 °C. Tumorfieber (bes. maligne Lymphome; 19.4.3), Tbc (12.3.5), Arzneimittelfieber (drug fever; toxische oder allergische Reaktion, v.a. bei Sulfonamiden), Lungenembolie (12.9.2), Hyperthyreose (17.6.2), chron. Tonsillitis (23.3.2), Endokarditis (10.7.1), RA (18.3.1), Polymyalgia rheumatica (18.5.3), unter antibiotischer Ther. • Remittierendes Fieber: Max. Schwankungen ≤ 1,5 °C, Temp. abends höher als morgens. Vorkommen: Pyelonephritis (13.3.3), Tbc (12.3.5), Rheumat. Fieber, Sepsis. Abb. 9.1 Fieberverläufe, typische Fieberverläufe sind sehr seltenFieberverläufe Diagnostik Fieber objektivieren (selbst messen). Ganzkörperstatus; Labor: Je nach Befund, Fieberverlauf und AZ, großes BB, CRP, BSG, Urinstatus, Transaminasen, Blutkulturen (mehrmalig; am besten bei Fieberanstieg). Evtl. RF, ANA, HIV-Test. Abdomen-Sono, Rö-Thorax. Abhängig von Befunden bzw. längerem Persistieren Klinikeinweisung zur weiterführenden Diagn. Bei psychisch auffälligen Pat. an mögliche Manipulation des Thermometers denken! 9.1.3 Vorgehen nach Fieberdauer • Kinder 1 J.: Zuwarten bei Fieber bis 3 d, so weit kein klarer Lokalbefund vorliegt und der AZ es erlaubt, rein symptomatische Ther. (16.14.1), dann Facharztüberweisung zum Kinderarzt bei reduziertem AZ. • Bislang gesunde Erw.: Bei fehlendem Lokalbefund zunächst abwarten, nach 2–3 d diagn. Klärung anstreben: Ganzkörperstatus, großes BB, BSG, CRP, Transaminasen, Blutkulturen, Urin-Status, Abdomen-Sono. So weit kein klarer Lokalbefund vorliegt und der AZ es erlaubt, rein symptomatische Ther. Bei Fortbestehen des Fiebers ohne wegweisenden Befund über 7 d hinaus i.d.R. Klinikeinweisung. • Erw. mit Vorerkr.: Prüfen, ob das Fieber auf eine Aktivierung der Grunderkr. (z.B. Autoimmunerkr., malignes Lymphom) zurückzuführen ist, Behandlung der Grunderkr., ggf. Facharztüberweisung oder Klinikeinweisung bei reduziertem AZ, bei hohem Fieber und Vorliegen eines Immundefekts (HIV-Inf., immunsuppressive Ther., Z.n. Splenektomie), sowie bei Fortbestehen des Fiebers über 1 Wo. hinaus. Bei Diab. mell. vermehrt BZ-Kontrollen durch den Pat. selbst oder den HA wegen Gefahr der BZ-Entgleisung. Fieber unbekannter Herkunft, das länger als 2 Wo. besteht: 40 % Infektionen, 25 % Tumoren, 20 % immunologische Erkrankungen, 5–10 % seltene Ursachen. 9.1.1 Differenzialdiagnose bei Fieber mit Lokalbefund Bei Kindern s.a. 16.4.1. Tab. 9.1 DD bei Fieber Körperregion mit Lokal-Symptomen Untersuchung auf/Begleitbefund Mögliche Ursache Weiterführende Untersuchung Kopf Starke Kopfschmerzen Akute Sinusitis, Arteriitis temporalis (18.5.3) BSG ↑↑, CRP ↑ Meningismus, neurologische Ausfälle Meningitis, Hirnabszess, Enzephalitis (21.5) Klinikeinweisung zu CCT, Liquordiagn. Ohren Stechende Ohrenschmerzen, Schwerhörigkeit Otitis media (23.6.3), beginnender Zoster Otoskopie, Druckschmerz am Mastoid Zähne Schwellung und Schmerzen im Kieferbereich Zahnwurzelabszess, Sialadenitis (23.8.1) Zum Zahnarzt schicken; Drüsenausführungsgang: auf Eiter achten NNH Spontan-, Druck- und Klopfschmerz Sinusitis (23.5.2) Sono, Diaphanoskopie, evtl. Facharztüberweisung zum HNO-Arzt Mund/Rachen Tonsillenvergrößerung, eitrige Beläge Streptokokken-Angina (23.3.2); Mononukleose ( 9.4.3 ); Scharlach (16.7.3) Abstrich auf Bakterien, Serologie Hals/Nacken LK-Schwellungen Mononukleose ( 9.4.3 ), Tonsillitis (23.3.2), Toxoplasmose ( 9.6.1 ), M. Hodgkin (19.4.3), Seitenstrangangina (23.7.1), Scharlach, Röteln Sono, großes BB, Serologie, evtl. Exstirpation Thorax RG, Dämpfung Dyspnoe, Tachykardie Pneumonie (12.3.3), Lungenembolie (12.9.2) Rö-Thorax, ggf. Klinikeinweisung Leber Druckschmerz, Vergrößerung Hepatitis (8.7.1), Cholezystitis (8.9.2) Sono, Serologie Cholestase Cholangitis (8.9.3), Cholelithiasis (8.9.1) Sono, außer bei Hep. immer Klinikeinweisung Unterbauch Druckschmerz, keine Diarrhö Peritonitis (8.1.6), Appendizitis (8.5.3), Ileus (8.1.6) Klinikeinweisung Chirurgie Darmgeräusche spärlich oder hochgestellt Adnexitis (14.3.3), Ileus (8.1.6) Klinikeinweisung Gynäkologie oder Chirurgie Diarrhö und Druckschmerz Inf. Gastroenteritis ( Tab. 9.15 ) Bakt. Stuhldiagn. M. Crohn und Colitis ulcerosa (8.5.2) Sono, kleines BB, CRP, Koloskopie Flanken Klopfschmerz, Dysurie Harnwegsinf. (13.3.2), Pyelonephritis (13.3.3) U-Stix, Urikult®, Sono, Klinikeinweisung bei V.a. Urosepsis Spondylitis (6.1) Röntgen, weitere Bildgebung durch Facharzt Gelenke Rötung, Schwellung, Druckschmerz Rheumatische Erkr. (18), Eitrige Arthritis (6.5.13), Sarkoidose (12.7.2) Facharztüberweisung oder Klinikeinweisung je nach Lokalbefund oder AZ Extremitäten Klopfschmerz, Rötung, Schwellung Akute Osteomyelitis (6.5.13), Phlegmone, Abszess (4.3.4), Erysipel (26.5.2) Facharztüberweisung oder Klinikeinweisung je nach Befund Haut Flächenhafte Rötung, Lymphangitis Erysipel (26.5.2), Phlegmone, Zoster LK-Status; Klinikeinweisung je nach Lokalbefund und AZ 9.1.2 Differenzialdiagnose nach Fieberverlauf • Kontinua: Anhaltend Fieber:DDhohes Fieber ( 1 °C) mit Fieber > 39 °C, zwischendurch Perioden mit niedrigerer Temperatur, vorübergehend auch Abfall auf Normalwerte möglich: Z.B. Sepsis durch einen streuenden Herd, z.B. Endokarditis (10.7.1). Klinikeinweisung zur Diagn. und Ther. • Biphasisches Fieber: Temperaturanstieg für 1–2 d auf > 39 °C (Erregerausbreitung), Abfalls der Temperatur, zweiter meist länger andauernder Temperaturanstieg (Organbefall). Influenza ( 9.4.4 ), viele Virusinf. Symptomatische Behandlung, Klinikeinweisung bei schlechtem AZ. • Undulierendes Fieber: Über 2–3 d langsam ansteigendes und wieder abfallendes, mäßig hohes (bis 39 °C) Fieber im Wechsel mit Perioden normaler Temperatur über mehrere Wochen hinweg. Brucellose ( 9.3.4 ), Tumorfieber, Autoimmunkrankheiten. Klinikeinweisung zur Diagn., ggf. Ther. • Rekurrierendes Fieber: In regelmäßigen Abständen auftretendes, mehrere Tage anhaltendes hohes Fieber (> 39 °C). Malaria möglich, andere bakt. Erkr. ( Diagn.: Reiseanamnese, EDTA-Blut für Plasmodiennachweis, 9.10.8 und 9.10.9 ). • Subfebril: Temperaturerhöhung dem physiologischen Tagesablauf angepasst, nicht über 38 °C. Tumorfieber (bes. maligne Lymphome; 19.4.3), Tbc (12.3.5), Arzneimittelfieber (drug fever; toxische oder allergische Reaktion, v.a. bei Sulfonamiden), Lungenembolie (12.9.2), Hyperthyreose (17.6.2), chron. Tonsillitis (23.3.2), Endokarditis (10.7.1), RA (18.3.1), Polymyalgia rheumatica (18.5.3), unter antibiotischer Ther. • Remittierendes Fieber: Max. Schwankungen ≤ 1,5 °C, Temp. abends höher als morgens. Vorkommen: Pyelonephritis (13.3.3), Tbc (12.3.5), Rheumat. Fieber, Sepsis. Abb. 9.1 Fieberverläufe, typische Fieberverläufe sind sehr seltenFieberverläufe Diagnostik Fieber objektivieren (selbst messen). Ganzkörperstatus; Labor: Je nach Befund, Fieberverlauf und AZ, großes BB, CRP, BSG, Urinstatus, Transaminasen, Blutkulturen (mehrmalig; am besten bei Fieberanstieg). Evtl. RF, ANA, HIV-Test. Abdomen-Sono, Rö-Thorax. Abhängig von Befunden bzw. längerem Persistieren Klinikeinweisung zur weiterführenden Diagn. Bei psychisch auffälligen Pat. an mögliche Manipulation des Thermometers denken! 9.1.3 Vorgehen nach Fieberdauer • Kinder 1 J.: Zuwarten bei Fieber bis 3 d, so weit kein klarer Lokalbefund vorliegt und der AZ es erlaubt, rein symptomatische Ther. (16.14.1), dann Facharztüberweisung zum Kinderarzt bei reduziertem AZ. • Bislang gesunde Erw.: Bei fehlendem Lokalbefund zunächst abwarten, nach 2–3 d diagn. Klärung anstreben: Ganzkörperstatus, großes BB, BSG, CRP, Transaminasen, Blutkulturen, Urin-Status, Abdomen-Sono. So weit kein klarer Lokalbefund vorliegt und der AZ es erlaubt, rein symptomatische Ther. Bei Fortbestehen des Fiebers ohne wegweisenden Befund über 7 d hinaus i.d.R. Klinikeinweisung. • Erw. mit Vorerkr.: Prüfen, ob das Fieber auf eine Aktivierung der Grunderkr. (z.B. Autoimmunerkr., malignes Lymphom) zurückzuführen ist, Behandlung der Grunderkr., ggf. Facharztüberweisung oder Klinikeinweisung bei reduziertem AZ, bei hohem Fieber und Vorliegen eines Immundefekts (HIV-Inf., immunsuppressive Ther., Z.n. Splenektomie), sowie bei Fortbestehen des Fiebers über 1 Wo. hinaus. Bei Diab. mell. vermehrt BZ-Kontrollen durch den Pat. selbst oder den HA wegen Gefahr der BZ-Entgleisung. Fieber unbekannter Herkunft, das länger als 2 Wo. besteht: 40 % Infektionen, 25 % Tumoren, 20 % immunologische Erkrankungen, 5–10 % seltene Ursachen. 9.2 Impfungen Die Immunisierung durch Impfungen ist eine der wichtigsten und wirksamsten Maßnahmen zum Schutz vor Infektionskrankheiten. Mit einer hohen Durchimpfungsrate können einzelne Krankheitserreger regional oder sogar weltweit ausgerottet werden. Immunität gegen Erkr. lässt sich passiv durch Immunglobulingabe, aktiv durch Impfung oder Kombination beider Methoden erreichen. 9.2.1 Allgemeine Regeln für Impfungen In Deutschland besteht keine Impfpflicht. Impfempfehlungen werden durch die obersten Gesundheitsbehörden der Länder ausgesprochen. Diese öffentliche Empfehlung hat im Fall von Impfschäden wichtige Bedeutung für die weitere Versorgung (§ 20 IfSG). • Passive Immunisierung durch Immunglobuline: Vorteil der sofortigen Schutzwirkung. Nachteil: Schutz ist nur von kurzer Dauer (4 Wo. bis 3 Mon.), es besteht nur humorale Immunität. • Aktive Immunisierung: Der Organismus wird mit Antigenen von Krankheitserregern konfrontiert und muss selbst eine Immunität ausbilden. Der Schutz tritt verzögert ein, ist aber von langer Dauer. • Impfung:allgemeine RegelnTotimpfstoffe: Abgetötete Krankheitserreger oder Immunisierung, passiveaufbereitete Antigene; keine Impfinfektion möglich, deshalb auch bei Pat. mit Immundefekten applizierbar. I.d.R. Grundimmunisierung durch 3 Inj., meist i.m. • Lebendimpfstoffe: Enthalten Immunisierung, aktiveattenuierte, aber vermehrungsfähige Krankheitserreger → Risiko für Immunsupprimierte und Schwangere. Applikation s.c. oder p.o. (je nach Impfstoff). Informationen zu Impfungen Hersteller-Informationen: In TotimpfstoffPackungsbeilagen, Fachinformationen und wissenschaftlichen Basis-Broschüren. Hersteller können auch jederzeit telefonisch kontaktiert werden → Service-Nummern der Arzneimittelhersteller finden sich z.B. in der Roten Liste. Behördliche LebendimpfstoffInformationen: Das Robert-Koch-Institut unterhält eine Ständige Impfkommission (STIKO), die Impfempfehlungen regelmäßig überarbeitet (letzte Fassung vom Juli 2008). Die Empfehlungen sind im Anhang der "Roten Liste" abgedruckt. Bestellung der Impfempfehlungen der STIKO bei: Robert-Koch-Institut, Kennwort "STIKO-Empfehlungen", Nordufer 20, 13353 Berlin, unter Fax-Nr. 01888-754-2628 oder unter [email protected]. Kontraindikationen für Impfungen • Akute behandlungspflichtige Infektionserkrankungen: Impfung frühestens 2 Wo. nach Genesung. • OP: Bei dringender Ind. kann bei vorangegangener Impfung ein operativer Eingriff jederzeit durchgeführt werden. Bei elektiven OPs wird für Totimpfstoffe ein Abstand von 3 d, für Lebendimpfstoffe ein Abstand von 14 d empfohlen. Dies soll helfen, unerwünschte Impfreaktionen von OP-Komplikationen zu unterscheiden. Impfungen aus dringender bzw. vitaler Ind. (Hep. B, Tollwut) sind unverzüglich durchzuführen. Bislang keine Hinweise auf eine Inkompatibilität zwischen Impfungen und OP. Eine Ausnahme bilden OP in Verbindung mit Immunsuppression, z.B. Transplantationen. Impfungen sind in diesem Fall in Zusammenarbeit mit den behandelnden Ärzte zu planen. • Grav.: Alle nicht dringend indizierten Impfungen ( 9.2.4 ). • Bei Immunsuppression bzw. Immundefekt: Es gelten die Herstellerangaben, die z.T. sehr restriktiv sind. • Allergie gegen Bestandteile eines Impfstoffs (z.B. Hühnereiweiß, 9.2.4 ). • Nach Auftreten von KO bei einer Impfung besteht bis zur Klärung der Ursachen eine KI für denselben Impfstoff. Keine Kontraindikationen sind • Banale Infektionen mit subfebriler Temperatur. • Möglicher Kontakt des Impflings zu Personen mit Infektionskrankheiten. • Krampfanfälle in der Familie; Fieberkrämpfe (bei bekannter Disposition Gabe eines Antipyretikums bei der Impfung). • Chron. Erkrankungen, nichtprogrediente ZNS-Erkrankungen. • Ekzeme u.a. Dermatosen, lokalisierte Hautinfektionen. • Behandlung mit Antibiotika, niedrig dosierten Kortikosteroiden (≤ 10 mg Hydrocortison-Äquivalent) oder lokal angewendeten Steroidpräparaten. • Bei Totimpfstoffen: Angeborene oder erworbene Immundefekte; Neugeborenenikterus; Frühgeburtlichkeit (Frühgeborene sollten unabhängig vom Geburtsgewicht gemäß dem empfohlenen Impfalter geimpft werden). Aufklärung vor Impfungen • Art, Risiken und Behandlungsmöglichkeiten der zu verhütenden Krankheit. • Nutzen der Impfung. • Art des Impfstoffs, Durchführung der Impfung. • NW und Risiken des Impfstoffs. • Info. über KO d. Punktion (Blutung, Verletzung von Nerven u. Gefäßen, Inf.). • Mögliche Lokalreaktionen (Rötung, Schwellung, Schmerzhaftigkeit). • KI für die Impfung. • Empfehlungen über Verhaltensmaßnahmen im Anschluss an die Impfung. • Beginn und Dauer der Schutzwirkung, Notwendigkeit von Auffrischimpfungen. • "Öffentliche Impfungen": Schriftliche Aufklärung wird empfohlen; zusätzlich muss Möglichkeit zum Gespräch gegeben sein. Aufklärungsmerkblätter (inkl. Fragebogen und Einwilligungserklärung) für Impfungen im Kindesalter sind erhältlich bei: Deutsches Grünes Kreuz, Schuhmarkt 4, 35037 Marburg. Impfanamnese • Allgemeiner Gesundheitszustand? • Immunschwäche, -defekt? • Durchgemachte Infektionskrankheiten? • Frühere Impfungen, Auftreten von Impfreaktionen? • Gravidität. • Allergien. Impfabstände • Wichtig für einen lang dauernden Impfschutz: Der bei der Grundimmunisierung erforderliche Mindestzeitraum (s. einzelne Impfungen) zwischen vorletzter und letzter Impfung darf nicht unterschritten werden. • Es gibt keine unzulässig großen Abstände zwischen Impfungen. Jede Impfung gilt. Auch eine für viele Jahre unterbrochene Grundimmunisierung muss nicht neu begonnen werden. • Ist nicht bekannt, wann zuletzt bzw. ob überhaupt eine Impfung stattgefunden hat, ist dies kein Grund, eine Grundimmunisierung nicht zu beginnen oder Impfungen aufzuschieben oder nicht durchzuführen. • Serologische Kontrollen zur Überprüfung des Impfschutzes sind i.d.R. nicht angezeigt. Es genügt meist 1 Auffrischimpfung. Spezielles Schema beachten bei Tetanus ( 9.2.3 ), Tollwut ( 9.2.3 ), Hepatitis B ( 9.2.3 ). • Durch zusätzliche Impfungen bei bereits bestehendem Impfschutz steigt das Risiko für KO nur bei BCG-Impfung, Tetanustoxoid (verstärkte Lokalreaktion) und Pneumokokken-Impfung (systemische, allergische Reaktionen). • Lebendimpfstoffe: Können simultan verabreicht werden; werden sie nicht simultan verabreicht, ist ein Mindestabstand von 4 Wo. zu empfehlen. Voraussetzung: Vollständiges Abklingen der Impfreaktion, keine KO. • Totimpfstoffe (inaktivierte Krankheitserreger, d.h. deren Antigenbestandteile/Toxoide): Keine Mindestabstände zu anderen Impfungen erforderlich, auch nicht zu solchen mit Lebendimpfstoffen. • Bei Wiederholungsimpfungen im Rahmen der Grundimmunisierung sollte für die weiteren Impfungen das gleiche Präparat verwendet werden. Bei schlechter Verträglichkeit bzw. unzureichender Immunantwort nach Abschluss einer Impfserie kann eine Impfung mit dem Präparat eines anderen Herstellers u.U. den gewünschten Impferfolg haben. • Kombinationsimpfstoffe helfen, Injektionen und Impftermine einzusparen; manchmal sind sie auch preiswerter als die Summe der jeweiligen Monovakzinen. Umgang mit Impfstoffen Vor allem Lebendimpfstoffe sind temperaturlabil und müssen vor Erwärmung und Gefrieren geschützt werden. Alle Impfstoffe sind bei 2–8 °C zu lagern, wobei die Temperatur permanent mit einem geeichten Minimax-Thermometer kontrolliert werden muss. Impfstoffe, die falsch gelagert oder eingefroren wurden, sind zu verwerfen. Angebrochene Amp. sofort verbrauchen, v.a. wegen der Gefahr der bakteriellen Kontamination ( cave: Spritzenabszess). Für die Injektion eine neue Kanüle verwenden. An der Aufziehkanüle anhaftender Impfstoff kann zu Lokalreaktionen der Haut führen. Injektionsort (Herstellerangaben beachten!) • Subkutan: Am dors. Oberarm oder ventrolat. am Oberschenkel. Bei Antikoagulation auch i.m. Impfstoffe (Herstellerangaben beachten). • Intramuskulär: Die meisten Totimpfstoffe werden i.m. injiziert. Impfstoffmengen bis 1 ml in den M. deltoideus oder M. triceps brachii. Injektion in den M. deltoideus ergibt bessere Immunität als intraglutäale Injektion. So lange der M. deltoideus nicht genügend ausgebildet ist, wird die Injektion in den M. vastus lateralis (anterolateraler Oberschenkel) empfohlen. Hier besteht kaum Gefahr, Nerven oder Gefäße zu verletzen. Impfreaktionen Häufig auftretende, milde, selbstlimitierende Symptome. • Lokalreaktionen: Rötung, Schwellung, Schmerzhaftigkeit im Bereich der Injektionsstelle; klingen innerhalb von 72 h ab. Bei anhaltenden Beschwerden an eine Infektion denken. • An den ersten beiden Tagen nach Impfung können subfebrile Temperaturen auftreten. Bei Disposition zu Fieberkrämpfen: Simultane Gabe von Antipyretika. • MMR-Impfung: Zwischen 7. und 12. d ist eine leichte masernähnliche Symptomatik mit subfebrilen Temperaturen möglich. Impfkomplikationen Bei regelrechter Anwendung der amtlich zugelassenen Impfstoffe extrem selten. • Bei Verdacht: Immunstatus und ggf. interkurrente Infektionen zum Zeitpunkt der Impfung abklären → Serum und ggf. mikrobiologische Proben (Serum-Stuhlproben) asservieren. • Meldung an das örtliche Gesundheitsamt und die Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft, Herbert-Levin-Platz 1, 10623 Berlin, Tel. (030) 40 04 56–5 00, Fax (030) 40 04 56–5 55. • Impfling bzw. Eltern/Sorgeberechtigte auf gesetzliche Regelungen zur Versorgung nach Impfschäden hinweisen (IfSG §§ 60–64, 66). Der Antrag ist beim zuständigen Versorgungsamt zu stellen. Impfdokumentation • Immer doppelte Dokumentation durchführen (in den Impfunterlagen des Impflings und in den Aufzeichnungen des Arztes). • Möglichst vorhandene Dokumente (Impfbücher) weiterführen. Falls diese nicht vorliegen, kann eine separate Bescheinigung ausgestellt werden. Zum späteren Nachtrag in Impfbücher ist jeder Arzt berechtigt. • Bei Neuausgabe von Impfbüchern WHO-gerechte Formulare bevorzugen ("Internationale Bescheinigungen über Impfungen und Impfbuch", erhältlich beim Deutschen Grünen Kreuz, s.o.). • Dokumentiert werden: Tag der Impfung; Art der Impfung; Bezeichnung des Impfstoffs (Handelsname); Chargen-Nummer (sehr wichtig!); impfender Arzt. Abrechnung von Impfungen • Kassenleistung sind alle öffentlich empfohlenen Impfungen. Die Einstufung erfolgt durch die STIKO und kann sich von Bundesland zu Bundesland unterscheiden. • Kosten für Indikationsimpfungen aufgrund beruflicher Risiken werden von der gesetzlich benannten Stelle (i.d.R. Arbeitgeber) übernommen. • Sonder- und Reiseimpfungen müssen privat abgerechnet werden. Tab. 9.2 Kombinationsimpfstoffe Tetanus Diphtherie Pertussis Polio (Salk) HiB Hepatitis A Hepatitis B Komb.-Impfstoffe Präparate, z.B. x x DT-Impfstoff Behring®, DT-Impfstoff Merieux®, Td-Impfstoff Merieux®, Td-pur®, Td-Rix® x x x DTP-Impfstoff Merieux®, Infanrix® DTPa, Boostrix® x x x x Infanrix® + Hib x x x x Quatro-Virelon®, TETRAVAC® x x x REVAXIS® x x x x Repevax® x x x x x PENTAVAC®, Infanrix-IPV + Hib x x x x x x HEXAVAC®, Infanrix hexa® x x PROCOMVAX® x x Twinrix® Masern Mumps Röteln Varizellen x x M-MVax® x x x MMR Triplovax®, M-M-RVax®, Priorix® x x x x Priorix-Tetra® Tab. 9.3 Impfkalender Kinder- und JugendimpfungenImpfung:bei Kindern/Jugendlichen Impfstoff Vollendeter Lebensmonat Vollendetes Lebensjahr Geb. 2 3 4 11–14 15–23 5–6 9–17 DTaP ∗ 1. 2. 3. 4. Td A A aP A A Hib ∗ 1. 2. ∗∗ 3. 4. HB Np 1. 2 . ∗∗ 3. 4. G Pneumokokken 1. 2. 3. 4. IPV 1. 2. ∗∗ 3. 4. A MMR 1. 2. ∗∗∗ Varizellen 1. 2 G ∗∗∗∗ Meningokokken 1. ab 12 Mon. HPV 12–17, lt. STIKO Standardimpfung für Mädchen A: Auffrischimpfung, Abstand zur letzten Impfung mind. 5 J. G: Grundimmunisierung aller bislang ungeimpften Kinder bzw. Komplettierung eines unvollständigen Impfschutzes DTaP: Diphtherie, Tetanus, Pertussis azellulär Td: Kombinationsimpfstoff Tetanus mit reduziertem Diphtherie-Toxoidgehalt ab > 5 LJ aP: Pertussis azellulär Hib: Haemophilus influenzae Typ B HB: Hepatitis B IPV: Inaktivierte Poliovakzine (Salk) MMR: Masern, Mumps, Röteln HPV: Humane Papillomviren Np: Postexpositionelle Hep.-B-Prophylaxe bei Neugeborenen HB s Ag-pos. Mütter ( 9.2.3 ) ∗ Abstände zwischen 1. und 2. sowie 2. und 3. Impfung mind. 4 Wo.; Abstand zwischen 3. und 4. Impfung mind. 6 Mon. ∗∗ Bei monovalenter Anwendung bzw. bei Kombinationsimpfstoffen ohne Pertussiskomponente kann diese Dosis entfallen ∗∗∗ Ein Mon. Mindestabstand zwischen den MMR-Impfungen ∗∗∗∗ Ungeimpfte Kinder ohne pos. Varizellen-Anamnese, 9–13 J. 1 Dosis, Kinder ab 13 J. 2 Dosen im Abstand von 6 Wo. (öffentlich empfohlene Impfungen der STIKO, Stand 7/2008; Quelle: Epid. Bulletin 30/2008) Tab. 9.4 Standardimpfungen für Erwachsene Impfung Personenkreis Impfmodus Wiederimpfung Vorsichtsmaßnahmen Tetanus (TI) Diphtherie (TI) Alle Erw. Grundimmunisierung mit Diphtherie-Tetanus (Td); Kombinationsimpfstoff: 0/4 Wo./1 J.; 0,5 ml i.m., Tetanus bei Verletzung∗ Bei Verletzung ∗ ; sonst alle 10 J. 1 Dosis Allergische Reaktionen Polio-Salk (TI) Alle Erw. 0/8 Wo./6 Mon.bzw. 1 J. 1 Dosis alle10 J. Keine speziellen Influenza (TI) Personen > 60 J. oder mit chron. Erkr. von Herz und Lunge und beruflich Exponierte Im Herbst eine Dosis i.m. Jährlich im Herbst. Cave: Erregerwechsel Hühnereiweiß-Allergie Pneumokokken (TI) Wie Influenza; geplante Splenektomie; Asplenie; beruflich Exponierte Jugendliche 2 Injektionen: 0/4 Wo. s.c., Erw. nur 1 Dosis 1 Dosis, Erw. und Jugendliche alle 6 J. Zeitabstand zur Wiederimpfung beachten! Röteln (LI) Alle seroneg. F mit Kinderwunsch Röteln-Monovakzine 1 Dosis (0,5 ml) s.c. oder Masern-Mumps-Röteln; Kombinationsimpfstoff 1 Dosis (0,5 ml) s.c. Falls Röteln-AK unter 1 : 32 in HAH. Titerkontrolle 4 Wo. p.v. Neomycin-Allergie, Hühnereiweiß- Allergie KI: Grav. ∗∗ ; Immundefizienz Ausführliche Informationen ( 9.2.3 ); LI = Lebendimpfstoff, TI = Totimpfstoff. ∗ Vorgehen ( 9.2.3 ). ∗∗ Bei versehentlicher Impfung ist ein Schwangerschaftsabbruch nicht indiziert. (öffentlich empfohlene Impfungen der STIKO, Stand 7/2008; Quelle: Epid. Bulletin 30/2008) 9.2.2 Impftabellarium Um mit möglichst wenig Injektionen STIKOauszukommen, sollten Kombinationsimpfstoffe bevorzugt werden. Wichtige Kombinationsimpfstoffe sind: Tab. 9.5 Indikations- und Sonderimpfungen Ausführliche Informationen 9.2.3 Impfung Personenkreis Impfmodus Wiederimpfung Vorsichtsmaßnahmen FSME (TI) Personen mit Naturkontakt in Endemiegebieten ∗∗ Grundimmunisierung: 0/4 Wo./1 J. i.m. Alle 5 J. 1 Dosis Hühnereiweiß-Allergie, neurologische Störungen Hepatitis A (TI) Exponiertes Personal, z.B. im Medizinbereich, Homosexuelle, Hämophile, Kontaktpersonen zu HA-Erkrankten Grundimmunisierung nach Angaben des Herstellers, 2 bzw. 3 Injektionen Alle 10 J. 1 Dosis Vortestung auf HA-AK, bei Geburtsjahr vor 1950 oder langem Aufenthalt im Endemiegeb. Impfung Personenkreis Impfmodus Wiederimpfung Vorsichtsmaßnahmen Hepatitis A (TI) Postexpositionsprophylaxe, aktive und passive Immunisierung erforderlich Immunglobulin + Grundimmunisierung Schutz für 3 Mon. Hepatitis B (TI) Medizinisches und zahnmedizinisches Personal; Pat. mit häufiger Übertragung von Blutprodukten; Kontaktpersonen Erkrankter • Grundimmunisierung: 0/4 Wo./6 Mon. i.m.; bei Risikogruppen: Titerkontrolle • Postexpositionell: Aktive und passive Immunisierung Titer 6 Wo. nach letzter Impfung: • 98 % Hühnereiweiß-Allergie; wegen evtl. verstärkter NW möglichst 4 Wo. Abstand zu anderen Lebendimpfungen Hepatitis A (TI) Länder mit schlechter Hygiene Grundimmunisierung nach Angaben des Herstellers, 2 bzw. 3 Injektionen i.m. 0/4 Wo./1 J. 2 Wo. nach 2. Impfung; 10 J.; > 95 % Test auf HA-Ak, bei Geburtsjahrgängen vor 1950 Hepatitis B (TI) Längere Aufenthalte in Afrika und Fernost Grundimmunisierung: 0/4 Wo./6 Mon. i.m. 2 Wo. nach 2. Impfung ca. 10 J., 95 % Titerkontrolle bei Risikogruppen ( 9.2.3 ) Japan-Enzephalitis (TI) Südostasien (> 1 Mon. Aufenthalt in ländlichen Gebieten, nicht für "Normal-Touristen") Grundimmunisierung: s.c. Tag 0/7/30 2 Wo. p.v.; 1–4 J.; > 90 % Bezug durch Internationale Apotheke Meningokokken (TI) Typ A, C, W, Y Sahelzone, Vorderasien, tropisches Südamerika (Arbeitsaufenthalte, Trekkingreisen) Kinder: Ab 7. Lebensmon. und Erw.: s.c. 1 Dosis 1 Wo. p.v.; 1–3 J.; 98 % Schützt nicht gegen den in Europa häufigen Typ B Tollwut (präexpositionell, TI) Südostasien, Südamerika (> 3 Mon. Aufenthalt, berufl. Exposition) Grundimmunisierung: i.m. 0/4 Wo./1 J. 2 Wo. nach 2. Impfung; 2–5 J.; 99 % Bei Exposition Auffrischung mit 2 Impfungen: i.m. Tag 0/3 Typhus (TI) Grundimmunisierung: i.m. oder s.c. 1 Dosis Erw. und Kinder ab 2. Lj. 1 Wo. p.v.; 3 J.; ca. 50–60 % Keine bes. LI = Lebendimpfstoff, TI = Totimpfstoff, p.v.: post vaccinem Tab. 9.7 Zeitplan für Reiseimpfungen Mindestabstände von Impfungen zum Abreisetermin. Bei Grundimmunisierungen darf der Mindestabstand zwischen 1. und 2. Impfung nicht unterschritten werden. Woche vor der Abreise 6. 5. 4. 3. 2. 1. Maßnahme Diphtherie/Tetanus G1 G2, A FSME G1 G2, A Gelbfieber (LI) X Hepatitis-A-Immunglobulin X Hepatitis-A-Impfung G1, A Hepatitis-B- und Kombinationsimpfung Hep. A/Hep. B G1 G2, A Malaria-Prophylaxe X Meningokokken X Polio tot (Salk) G1 G2, A Tollwut G1 G2 A G3 Typhus ∗ X G1: Grundimmunisierung, 1. Dosis; G2: 2. Dosis; G3: 3. Dosis. A: Auffrischimpfung ∗ Bei oralem Lebendimpfstoff Abstand zu Gelbfieber-Impfung und zu Malariaprophylaxe beachten ( 9.2.3 ). • Bei Kindern mit Diphtherie:ImpfungKombinationsimpfstoffen gegen Diphtherie (D), Tetanus (T), Haem. infl. Typ B (HiB), Pertussis (P) und Hep. B. Verfügbare Präparate Tab. 9.2 . • Impfstoff für Kinder bis zum vollendeten 5. Lj.: 75 IE Toxoid. Vom 5. bis zum vollendeten 6. Lj. mit reduzierter Dosis = 30 IE impfen (0,2 ml des Kinderimpfstoffs). Ab dem 6. Lj. Erw.-Impfstoff "d" mit 5 IE Toxoid (Diphtherie-Adsorbat-Impfstoff für Erw.) anwenden! • Erw. mit Grundimmunisierung: Alle 10 J. 1 Injektion (= 0,5 ml) mit Kombinationsimpfstoff Tetanus-Diphtherie (Td-Impfstoff; bei Antikoagulation auch s.c. Gabe möglich). Bei ausreichender Tetanus-Immunität Impfung mit "d"-Diphtherie-Monovakzine. Nebenwirkungen Am Impftag oder dem darauf folgenden Tag Temperatur ↑ bei 2–3 % der Säuglinge. Selten verstärkte Lokalreaktion. "d"-Impfstoff bisher ohne Begleiterscheinungen. Schutzwirkung 1 Wo. nach der 2. Impfung; Konversionsrate: Über 98 %; Schutzquote: Ca. 80 %. Keine letalen Verläufe bei Geimpften. Dauer: Primär 5–7 J. Nach Booster im 7. J. wesentlich länger. Wiederimpfungen 1. Booster vor Schulbeginn, 2. mit ca. 10 J., danach alle 10 J. Bei Expositionsgefahr Auffrischimpfung mit 1 Dosis, wenn Grundimmunisierung mehr als 3 J. zurückliegt. Bei Verletzungen Impfung mit Tetanus-Monovakzine, wenn letzte Td-Impfung 99 %; Schutzquote: > 99 %; Dauer: 10–15 J. Amtliche Anerkennung: 10 J. Wiederimpfung Alle 10 J. bei Bedarf. Kontraindikationen Klinisch relevante Hühnereiweißallergie, manifeste Immundefizienz; Gravidität, außer bei Expositionsgefahr. Keine Impfung von Kindern 12 J. 600 mg/d in 1 Einzeldosis für 4 d Schwangere ggf. Ceftriaxon 250 mg i.m. Hepatitis-A-Impfung Kostenübernahme indikationsbezogen durch Krankenkassen. Indikation Reisende in Gebiete mit hoher Hep.-A-Durchseuchung (Naher Osten, Afrika, Südostasien, Südamerika), Indikationsimpfung für Angehörige von Entwicklungsdiensten, Hep.-A-gefährdetes Personal medizinischer Einrichtungen und Laboratorien, Personal in Kindertagesstätten, Einrichtungen für geistig Behinderte, Abwasserentsorgung, homosexuelle Männer, Hämophile. Impfstoff Totimpfstoffe mit oder ohne Hepatitis:ImpfungAluminiumhydroxid, z.B. Havrix® 720 Kinder, Havrix® 1440, VAQTA®, VAQTA® Kinder. Impfmodus 2 Injektionen à 1 ml i.m. bevorzugt in den M. deltoideus im Abstand von 6–12 Mon. Nebenwirkungen Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen, verstärkte Lokalreaktion. Schutzwirkung Nach der 1. Impfung; Konversionsrate: 95 %. Dauer: > 10 J. werden angenommen. Impfschutz für 1 J. besteht ab 10 Tage nach der ersten Impfung. Eine eingeleitete Grundimmunisierung bei Reisenden (im Ausland, nach der Rückkehr) und bei Kontaktpersonen sollte in jedem Fall vervollständigt werden. Wiederimpfung Alle 10 J. Kontraindikationen Strenge Indikationsstellung bei Schwangeren. Besonderheiten Vor Impfung Anti-HAV-Titer bestimmen, sofern Pat. vor 1950 geboren wurde; bei Antikoagulation ist auch s.c. Gabe möglich. Tab. 9.10 Schema der Hepatitis-A-Immunprophylaxe für Reisende (Virushepatitiden 8.7.1) Grundimmunisierung 1. Impfung an Tag 2. Impfung 3. Impfung ≥ 4 Wo. Zeit • HA-Monovakzine 0 6–12 Mon. – • Kombinationsimpfung HA/HB 0 4–6 Wo. 6–12 Mon. 3 Wo. Zeit HA-Monovakzine 0 6–12 Mon. – Passive Immunisierung Impfstoff Nichtspezifisches Gammaglobulin (IgG). Indikation Wenn aktive Immunisierung nicht möglich ist. PEP bei engem Kontakt zu Erkrankten bzw. Konsum HA-Virus-kontaminierter Nahrungsmittel. Immunglobulingabe bis zu 10 d nach Exposition sinnvoll. Strenge Indikationsstellung! Dosierung Herstellerinformationen beachten. Aktive Immunisierung Impfmodus Grundimmunisierung: Bei den neueren Impfstoffen (z.B. Havrix 1440®, VAQTA®) 2 Impfungen in den M. deltoideus. Schema 0/6–12 Mon. Hepatitis-B-Impfung Virushepatitiden 8.7.1. Indikation Öffentlich empfohlene Standardimpfung bei Kindern ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendlichen bis zum 17. Lj. Indikationsimpfung bei Personen mit bes. Risiko, sowie als PEP. • Präexpositionell: (Indikationsgruppen 1–7). – Hep.-B-gefährdetes medizinisches und zahnmedizinisches Personal; andere Personengruppen mit Infektionsrisiko durch Blutkontakt zu Infizierten, z.B. Polizisten, Hepatitis:Hepatitis B, ImpfungFeuerwehr (1). – Dialysepat., Pat. mit häufiger Übertragung von Blut und Blutprodukten, Pat. vor ausgedehnten chirurgischen Eingriffen (2). – Pat. mit chron. Lebererkr., die HbsAg-neg. sind (3). – Durch Kontakt mit HBsAg-Trägern in Familie und Gemeinschaft (z.B. in Kindergärten, Kinderheimen, Pflegestätten) potenziell gefährdete Personen (4). – Pat. in psychiatrischen Anstalten oder Einrichtungen für Zerebralgeschädigte oder Verhaltensgestörte (5). – Bes. Risikogruppen, wie z.B. homosexuell aktive Männer, i.v. Drogenabhängige, Prostituierte, länger einsitzende Strafgefangene (6). – Reisende in Regionen mit hoher Hep.-B-Prävalenz (Entwicklungsländer) bei längerfristigem Aufenthalt (ab 6 Mon.) oder bei zu erwartenden engen Kontakten zur einheimischen Bevölkerung (7). • Postexpositionell: Nach Verletzung mit möglicherweise HBV-kontaminierten Gegenständen (z.B. Injektionsnadel). Neugeborene HBsAg-pos. Mütter. Schwangere werden entsprechend den Mutterschaftsrichtlinien nach der 32. SSW möglichst nahe dem Geburtstermin auf HBsAg untersucht. Bei pos. Ergebnis wird unmittelbar post partum mit der Hep.-B-Immunisierung des Kindes (Simultanimpfung) begonnen. HBsAG-positive Schwangere sollten unbedingt durch in der Hepatologie Erfahrene betreut werden. Wenn der pos. HBsAg-Status der Mutter erst nachträglich bekannt wird, kann die passive Immunisierung bis 7 Tage post partum nachgeholt werden. Nach abgeschlossener Grundimmunisierung beim Kind serol. Kontrolle (Anti-HBs, HBsAg). Impfstoff Totimpfstoff, Adsorbatimpfstoff, z.B. Engerix® B Kinder, Engerix® B Erw., HBV VAXPRO®. Impfmodus • Grundimmunisierung mit 3 Impfungen, Injektion bevorzugt in den M. deltoideus. Schema: 0/4 Wo./6–12 Mon. Titerkontrolle 4 Wo. nach der 3. Dosis. • PEP innerhalb von 24 h durchführen (sinnvoll bis 72 h). Gabe von Hep.-B-Immunglobulin (je nach Präparat i.v. oder i.m.). Simultan an anderer Stelle Applikation der Hep.-B-Vakzine. Anschließend bei fehlender bzw. unvollständiger Grundimmunisierung die weiteren Impfungen entsprechend den Richtlinien nachholen. Tab. 9.11 Hepatitis-B-Postexpositionsprophylaxe (PEP) Vorgeschichte Keine Maßnahmen Anti-HBs-Bestimmung Anti-HBs (IU/l) Hep.-B-Vakzine Hep.-B-Immunglobulin Anti-HBs nach Grundimmunisierung ≥ 100 IU/l und letzte Impfung vor ≤ 5 J. Ja Innerhalb der letzten 12 Mon. wurde ein Anti-HBs-Wert ≥ 100 IU/l gemessen Ja Anti-HBs nach Grundimmunisierung war ≥ 100 IU/l und letzte Impfung vor 5–10 J. Nein Ja Nein Nicht oder unvollständig geimpft, der Impferfolg wurde nie kontrolliert ≥ 100 Nein Nein Lowresponder (Anti-HBs nach Grundimmunisierung 1 : 40); Schutzquote: Je nach Antigenkorrespondenz: Schutz vor Erkr. 50–60 %; Schutz vor schweren Verläufen 90 %. Wiederimpfung Jährlich im Herbst vor Beginn der Grippesaison. Kontraindikationen Klinisch relevante Hühnereiweißallergie. Besonderheiten Schützt nur gegen Erkrankung an Influenza, nicht jedoch vor grippalen Infekten. Bei Antikoagulation ist auch s.c. Gabe möglich. Passive Immunisierung Wegen Variabilität des Erregers nicht sinnvoll, ggf. Chemoprophylaxe mit dem Neuraminidase-Inhibitor Zanamivir (z.B. Relenza®) oder Oseltamivir (Tamiflu®)( 9.4.4 , Influenza). Japan-Enzephalitis-Impfung Indikation Reiseimpfung: Längerer Aufenthalt (> 4 Wo.) während der Übertragungszeit (in den Tropen während der Regenzeit, in gemäßigten Zonen v.a. von Spätsommer bis Frühherbst) in Endemiegebieten (Süd- und Ostasien), Bevölkerung in Endemiegebieten. Impfstoff Totimpfstoff; abgetötete Viren (Korea), z.T. auch chinesische Lebendvaccine. Impfmodus 3 Impfungen von 1,0 ml s.c. an den Tagen 0/7/30. KinderJapan-Enzephalitis, Impfung 90 %; Dauer: mind. 4 J. Wiederimpfung Nach 1–4 J. Kontraindikationen Keine bes., allg. KI ( 9.2.1 ). Besonderheiten Impfstoff in Deutschland nicht zugelassen, kann aber über eine internationale Apotheke bezogen werden. Passive Immunisierung Nicht verfügbar. Masern-Impfung Masern 16.7.1. Indikation • Öffentlich empfohlene Impfung bei Kindern ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendlichen. Ziel ist die Eradikation der Masern. • Öffentlich empfohlen für ungeimpftes medizinisches Personal und Personal in der Kinderbetreuung. Anamnestische Angaben über durchgemachte Masern ohne serol. Kontrolle nicht verwertbar. Vorgesehene Impfung zum Impftermin in jedem Fall Masern:Impfungdurchführen, da NW Masern-Mumps-Röteln (Kombinationsimpfstoff)bei Impfung nach durchgemachter Infektion oder mehrfachen Impfungen nicht bekannt. Impfstoff Lebendimpfstoff, attenuiertes Masernvirus, Kühlkette! Gegen Licht und Wärme sehr empfindlich. Monovakzine, z.B. Masern-Impfstoff Merieux® (Amp. 0,5 ml) und Bestandteil von Kombinationsimpfstoffen ( Tab. 9.2 ). Impfmodus Grundimmunisierung bei Kindern und Jugendlichen mit 2 Impfdosen im Abstand von mind. 4 Wo., auch bei Erw. möglichst 2 Impfdosen s.c. (oder i.m.). Vorzugsweise mit Kombinationsimpfstoff MMR ( 9.2.2 , Tab. 9.3 ). Nebenwirkungen Bei 3–5 % der Geimpften um den 9. d p.v. Temperaturerhöhung, z.T. mit uncharakteristischem Exanthem, "Impfmasern" mit mildem Verlauf. Schutzwirkung Sofort! Bis zu 48 h nach Exposition auch Inkubationsimpfung möglich; Konversionsrate: 97–99 %; Dauer: Wahrscheinlich lebenslang. Kontraindikationen AIDS, Allergie gegen Hühnereiweiß ( 9.2.4 ). Besonderheiten Nach Immunglobulin- und Serumgaben 4 Mon. Abstand zur Impfung! Inkubationsimpfung nur bis 48 h nach Exposition sinnvoll. Kinder mit asymptomatischer HIV-Infektion können geimpft werden. Passive Immunisierung Keine. Meningokokken-Impfung Indikation • Pat. mit Asplenie, geplanter Splenektomie, Hypogammaglobulinämie, Komplementdefekten. • Impfung gegen Meningokokken der Serogruppe C: Von der STIKO empfohlene Standardimpfung für alle Kinder > 1 J. (1 Impfdosis ab dem 12. LM, z.B. Menjugate® Kit, Neis-Vac-C®). • Reiseimpfung für Reisen in Endemiegebiete (Sahelzone, Vorderasien, tropisches Südamerika): Impfung gegen Meningokokken der Serogruppen A, C, W, Y; Zur Meningokokken:ImpfungEinreise nach Saudi-Arabien ist eine AC oder ACWY-Impfung erforderlich, z.B. für Mekka-Pilger. Gültigkeit: 10 d–3 J. nach der letzten Impfung. Bei Kindern 3 Mon. 10 mg/kg KG/d in 2 Einzeldosen für 2 d 1–12 J. 20 mg/kg KG/d in 2 Einzeldosen für 2 d ≤ 450 mg/d > 12 J. 1200 mg/d in 2 Einzeldosen für 2 d Schwangere Ggf. Ceftriaxon 250 mg i.m. Mumps-Impfung Indikation Öffentlich empfohlene Standardimpfung für Kinder ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendliche. Erw. ohne Impfung, seroneg. exponierte Personen (z.B. Lehrer). Öffentlich empfohlen für medizinisches Personal und Personal in der Kinderbetreuung. Anamnestische Angaben über durchgemachte Mumps ohne serol. Kontrolle nicht verwertbar. Vorgesehene Impfung zum Impftermin in jedem Fall durchführen, da NW bei Impfung nach durchgemachter Infektion oder mehrfachen Mumps:ImpfungImpfungen nicht bekannt. Impfstoff Lebendimpfstoff, attenuiertes Mumpsvirus. Sehr licht- und wärmeempfindlich: Kühlkette! Vorzugsweise als Kombinationsimpfstoff (MMR; Tab. 9.2 ). Impfmodus 1 Impfdosis, vorzugsweise mit Kombinationsimpfstoff MMR, z.B. M-M-R Vax®. Bei Kindern 2 Impfdosen ( 9.2.2 , Tab. 9.3 ). Nebenwirkungen Selten, in der 2. Wo. p.v. Temperaturerhöhung. Schutzwirkung 2 Wo. p.v.; Konversionsrate: Ca. 97 %; Dauer: Wahrscheinlich lebenslang. Kontraindikationen Immundefizienz, AIDS, Allergie gegen Hühnereiweiß ( 9.2.4 ). Besonderheiten Mumpsimpfung kann bei Kindern mit asymptomatischer HIV-Inf. erfolgen. Passive Immunisierung Nutzen von Immunglobulinen nicht erwiesen. Pertussis-Impfung Pertussis 16.7.7. Indikation Öffentlich empfohlen für Säuglinge ab vollendetem 2. Lebensmon., Kinder und Jugendliche bis zum 18. Lj. Personal in Päd. und Infektionsmedizin sowie in Gemeinschaftseinrichtungen für das Vorschulalter. Impfstoff Totimpfstoff. Kombinationsimpfstoffe mit Diphtherie, Pertussis, Polio, HiB, Hep. B ( Tab. 9.2 ). Wegen besserer Verträglichkeit gereinigten, azellulären Impfstoff bevorzugen. Pertussis:Impfung Impfmodus Kinder ab vollendetem 2. Lebensmon.: 4 Impfungen, Pneumokokken:Impfung3 × 0,5 ml i.m. im Abstand von je 4–8 Wo., 0,5 ml i.m. 6–12 Mon. nach der 3. Impfung, Auffrischimpfung ab vollendetem 5.–6. Lj. Erw. 1 Impfung. Nebenwirkungen • Ganzkeimvakzine: Schmerzen lokal. Bei Reflux ins Unterhautfettgewebe Induration, Rötung, Schwellung. Fieber bei ca. 20 % am selben oder folgenden Tag, in 0,1 % zerebraler Krampfanfall. • Azellulärer Impfstoff: Gelegentlich verstärkte Lokalreaktion. Schutzwirkung 2 Wo. nach der 2. Impfung; Konversionsrate: > 80 %; Dauer: Ca. 10 J., Dauer der Immunität nach Erkrankung 15–20 J. Wiederimpfung Alle 10 J. Die Immunität ist nicht dauerhaft; trotz vollständiger Grundimmunisierung als Kind kann der Erw. später wieder an Pertussis erkranken, der hier atypisch als hartnäckige Bronchitis verläuft. Kontraindikationen • Ganzkeimvakzine: HIV-pos. Kinder. Progressive neurologische Erkr., Epilepsie → nur gesunde Kinder impfen. • Azellulärer Impfstoff: Unverträglichkeit von Ganzkeim- oder azellulärem Pertussisimpfstoff, progressive neurologische Erkr. (bisher keine Erfahrung). Passive Immunisierung Nutzen von Immunglobulinen nicht gesichert. Chemoprophylaxe Bei ungeimpften Kindern mit Kontakt zu Erkrankten, auch bei beruflicher oder familiärer Exponierten: Erythromycin 50 mg/kg KG/d für 2 Wo. o. Roxithromycin, Clarithromycin o. Azithromycin in Standarddosierung für 2 Wo. Pneumokokken-Impfung Indikationen Personen mit erhöhter gesundheitlicher Gefährdung infolge einer Grundkrankheit oder ungeimpftes Personal in Einrichtungen der Pädiatrie. • Alter > 60 J. • Immundefekte: Asplenie, Hypogammaglobulinämie, Komplementdefekt, HIV-Inf., Sichelzellenanämie, Leukosen, nach KMT. • Chron. Erkrankungen von Herz, Kreislauf, Atemwegen, Niere. • Diabetes mellitus. • Liquorfistel. • Vor Pneumokokken:ImpfungEinleitung einer immunsuppressiven Ther. • Von der STIKo empfohlene Standardimpfung für alle Kinder. Impfstoff • Konjugat-Impfstoff: Die 7 häufigsten Kapselpolysaccharidtypen konjugiert mit einem Trägerprotein; Totimpfstoff, z.B. Prevenar®. Geeignet für Kinder ab 2 Mon. bis zum vollendeten 2. Lj. Immunisierung: – Sgl. und KK 90), Totimpfstoff; Pneumovax® 23. Geeignet für Kinder ab dem vollendeten 2. Lj., Jugendliche und Erw. Immunisierung: Kinder ab vollendetem 2. Lj. und Erw.: 1 × 0,5 ml s.c. oder i.m. Nebenwirkungen Stärkere Lokalreaktion, Schwellung regionaler LK, Fieber, Abgeschlagenheit. Bei i.c. Injektion können schwere Lokalreaktionen auftreten. Kontraindikationen Schwere Pneumokokken-Inf. oder -Impfung während der letzten 5 J. Schutzwirkung 2 Wo. p.v.; Konversionsrate: > 90 %; Dauer: 3–5 J.; Schutzquote: 75–80 %. Wiederimpfung Bei fortbestehender Ind. Erw. alle 6 J., Kinder 80 %, postexpositionell ca. 60 %. Tetanus-Impfung Indikation Bundesweit öffentlich empfohlene Standardimpfung aller Kinder und Erwachsenen wegen permanenter Infektionsgefahr. Impfstoff Totimpfstoff, Toxoid. Der Standardimpfstoff zur Grundimmunisierung und für den Verletzungsfall enthält 40 IE Tetanus-Toxoid. Impfstoffe mit 2 IE Tetanus-Toxoid, z.B. Td-Rix®, sind nur zur Auffrischimpfung bei abgeschlossener Grundimmunisierung geeignet. Impfmodus Grundimmunisierung bei Kindern ab vollendetem 2. Tetanus:ImpfungLebensmon. mit 3 Injektionen, z.B. Tetanol® à 0,5 ml i.m. Impfschema: 0/4–8 Wo./7–12 Mon. Bei Kindern mit Kombinationsimpfstoff gegen Diphtherie (D), Tetanus (T), Haem. infl. Typ B (HiB), Pertussis (P), Hep. B, Polio ( Tab. 9.2 ). Auffrischung im 5.–6.. Lj., Wiederholung alle 10 J. Vorgehen bei Verletzungen Bei nachgewiesener und glaubhafter kompletter Grundimmunisierung: • Letzte Impfung vor ≤ 5 J.: Keine Impfung. • Letzte Impfung vor 5–10 J.: – Bei sauberen geringfügigen Wunden keine Impfung. – Bei allen anderen Verletzungen 1 Impfung. • Letzte Impfung vor > 10 J.: 1 Impfung. Keine, fragliche oder unvollständige Grundimmunisierung: • Bei geringfügigen, sauberen Verletzungen: Beginn oder Vervollständigung der Grundimmunisierung. • Bei allen anderen Verletzungen: Impfung + Tetanus-Immunglobulin. • Bei 2 Tetanus-Impfungen in der Vorgeschichte und wenn die Verletzung nicht länger als 24 h zurückliegt, nur Impfung und kein Tetanus-Immunglobulin. Durchführung der Simultanimpfung Simultan und kontralateral zur Impfinjektion 250 IE Antitoxin, z.B. Tetagam N® 1 Amp.. Bei schweren Blutverlusten, vernachlässigten Wunden oder ausgedehnten Verbrennungen: 500 IE Antitoxin, z.B. Tetagam N® 2 Amp. intradeltoidal, anschließend Grundimmunisierung vervollständigen. Im Zweifelsfall und bei V.a. Unverträglichkeit Titer bestimmen. Nebenwirkungen Stärkere Lokalreaktion, mitunter starke Induration mit Rötung, Schwellung und Überwärmung bei Hyperimmunisierung. Schutzwirkung 1 Wo. nach 2. Impfung der Grundimmunisierung; Konversionsrate: 99 %; Dauer: Mindestens 10 J. Wiederimpfung Im 10. Lj., dann alle 10 J. 1 Impfdosis (0,5 ml i.m.), vorzugsweise mit Td-Impfstoff, z.B. Td-pur®, "d": Diphtherie. Bei Verletzungen Impfung mit Tetanus-Monovakzine, wenn letzte Td-Impfung 0,01 IE Antitoxin/ml. Gehäuft Impf-Unverträglichkeiten, wenn Titer > 4 IE Antitoxin/ml. Kontraindikationen Keine bes., allg. KI ( 9.2.1 ). Sehr gut verträglicher Impfstoff. Besonderheiten Auch als Kombinationsimpfstoffe DT, DPT, DPT-Polio und Td (nach dem 7. Lj.). Bei Antikoagulanzienther. kann das Antitoxin Tetagam N® auch s.c. angewendet werden. Passive Immunisierung Nach Verletzung ohne ausreichenden Impfschutz Simultanimpfung (s.o.). Tollwut-Impfung Tollwut 9.4.8 . Indikation Postexpositionell; präexpositionell öffentlich empfohlen für Risikogruppen (z.B. Förster, Veterinäre). Reiseimpfung bei Reisen nach Afrika, Asien und Südamerika. Impfstoff Totimpfstoff. Impfmodus postexpositionell (PEP) Sofortiger Beginn der Behandlung! Wunddesinfektion, wenn vertretbar, mit 70 % Ethanol, sonst PVP-Jod, z.B. Betaisodona®; bei richtiger Durchführung Reduktion des Infektionsrisikos um 90 %. 1 Dosis, Tollwut:Impfungz.B. Rabipur®, 1 ml i.m. an den Tagen: 0–3–7–14–28. Am Tag 0 zusätzlich homologes Tollwut-Hyperimmunglobulin, z.B. Berirab® Tollwut Immunglobulin, exakt 20 IE/kg KG i.m., nicht überdosieren! So viel wie möglich vom Immunglobulin um die Verletzungen herum instillieren, den Rest entfernt vom Verletzungsort injizieren. Empfehlungen der WHO zur Postexpositionsprophylaxe bei Tollwut Tollwut:Postexpositionsprophylaxe • Expositions-Kategorie 1: Berühren oder Füttern von Tieren; Belecken der intakten Haut, Berühren eines Impfstoffköders bei intakter Haut: Keine Schutzimpfung, Vorsichtsmaßnahme! Bislang ist noch keine Tollwutinf. durch ein solches Ereignis ausgelöst worden. • Expositions-Kategorie 2: Knabbern an der intakten Haut; oberflächliche Kratzer, die nicht zum Bluten führten; Belecken der nicht intakten Haut: Aktive Schutzimpfung durchführen. • Expositions-Kategorie 3: Jegliche Bissverletzung oder Kratzwunden, die die Haut durchdringen; Kontamination von Schleimhäuten mit Speichel (z.B. Lecken, Spritzer), Kontakt von Hautverletzungen oder Schleimhäuten mit Impfstoffködern: Aktive plus passive Immunisierung. Impfmodus präexpositionell 4 Impfungen mit 1 ml Impfstoff zum Zeitpunkt: 0/1/12 Mon. i.m. oder nach Schnellschema: 0/7/21 o. 28 d/2–5 J. Nebenwirkungen Gelegentlich am Injektionsort Druckgefühl. Schutzwirkung Präexpositionell sehr sicher, postexpositionell abhängig von der Lokalisation der Wunde. Ungünstige Prognose bei Bisswunden im Gesicht. Wiederimpfung Nach 3 J. 1 Dosis. Immunisierung bei Bissverletzungen abhängig vom Zeitpunkt der letzten Impfung: 1–5 J. → 0–3 d; > 5 J. → entsprechend ungeimpften Personen. Kontraindikationen Bei postexpositioneller Impfung keine, da Erkrankung immer tödlich verläuft. Präexpositionelle Impfung: Allg. KI ( 9.2.1 ). Passive Immunisierung Nach Exposition Simultanimpfung (PEP). Typhus-Impfung Typhus 9.3.1 . Indikation Reisen (Mittelmeer, Orient, Fernreisen). Kinder ab vollendetem 2. Lj. Nur aktive Immunisierung möglich, passive nicht verfügbar. Lebendimpfstoff, oral Impfstoff Lebendimpfstoff = Oralimpfstoff, sehr sicherer Totimpfstoff Thyphim Vi® 1 × s.c., besser 1 × 0,5 ml Thyphim Vi® s.c./i.m. Impfmodus An Tag 1, 3 und 5 je 1 Kps., z.B. Typhoral L®, 1 h vor der Mahlzeit. Nebenwirkungen Gelegentlich Typhus:ImpfungÜbelkeit, Durchfall, Temperaturerhöhung. Schutzwirkung 1 Wo. nach der 3. Impfung; schützt nur gegen Salmonella typhi, nicht jedoch gegen Salmonella paratyphi oder Enteritis-Salmonellen. Schutzrate: 40–60 %; Dauer: 3 J. Wiederimpfung Nach 2 J. Vor oder bei massiver Exposition jährlich. Kontraindikationen Kinder 5 mg Prednison-Äquivalent) und Zytostatika. Keine Lebend-, aber alle Totimpfstoffe. Relative Ausnahme: Varizellen. • Frühgeburtlichkeit: Frühgeborene sollten, unabhängig vom Geburtsgewicht, gemäß dem empfohlenen Impfalter geimpft werden. HIV und AIDS Impfungen induzieren die HI-Virus-Replikation um das 3- bis 5fache. Die HIV-Konz. erreicht 4–6 Wo. p.v. wieder die Ausgangswerte. Bedeutung für die Progression bisher unklar. Impfungen unter antiretroviralem Schutz durchzuführen, ist eine mögliche Vorsichtsmaßnahme. • Asymptomatische HIV-Inf.: Keine Einschränkung. • AIDS: Nur Totimpfstoffe und passive Immunisierung. • HIV-pos. Kinder: Wegen übertragener mütterlicher Ak kann erst Impfung:bei HIV und AIDSim Alter von 1 J. endgültig festgestellt werden, ob das Kind tatsächlich infiziert wurde. Empfehlungen der STIKO in dieser Situation: Für alle Impfungen gelten die gleichen Ind. und KI wie für Nichtinfizierte. Allergische Reaktionen Eine allergische Reaktion auf eine Impfung kann durch den Impfstoff selbst oder durch Hilfsstoffe im Präparat verursacht sein. Um die Immunität abzuklären, zuerst eine Titerbestimmung der entsprechenden AK durchführen. Wenn kein erhöhter AK-Titer vorliegt, allergologische Abklärung auf Hilfsstoffe. Hühnereiweiß Impfstoffe gegen folgende Krankheiten enthalten Hühnerprotein (nach abnehmender Konz. geordnet): Gelbfieber, Influenza, Masern, Mumps, FSME, Tollwut. V.a. Hühnereiweißallergie vor Impfung allergologisch abklären. Einteilung der allergischen Reaktion in 3 Schweregrade. • Grad 1: Allg. Unverträglichkeit von Hühnereiern ohne allergische oder anaphylaktische Symptome, neg. Hauttest: Keine Gegenanzeigen Hühnereiweiß (Impfsera)für Impfungen, auch nichtImpfung:allergische Reaktion gegen Influenza oder Gelbfieber. • Grad 2: Im Hauttest nachgewiesene, jedoch klinisch nicht bedeutsame Hühnereiweißallergie: Gelbfieber-Impfung ist relativ kontraindiziert und darf nur in dringlichen Fällen gegeben werden. Impfung gegen Influenza in der Klinik. • Grad 3: Pat. mit Sofortreaktion nach Verzehr von Hühnereiweiß mit Urtikaria, Laryngo-/Bronchospasmus, RR-Abfall. Impfung gegen Influenza und Gelbfieber kontraindiziert. Impfung gegen Masern, Mumps, FSME und Tollwut (präexpositionell) in der Klinik. Neomycin U.a. in folgenden Impfstoffen enthalten: Masern, Mumps, Röteln, Polio (je nach Hersteller unterschiedlich). Notfallseren, Informationen Im hinteren Abschnitt der Roten Liste® (rosa Seiten), befindet sich ein Verzeichnis von Notfalldepots, in denen folgende Seren und Plasmaderivate aufbewahrt werden: Botulismus-Antitoxin vom Pferd, Hep.-B-Immunglobulin, polyvalentes Immunglobulin, Schlangengift-Immunserum polyvalent Europa, Tetanus-Immunglobulin, Tollwut-Immunglobulin, Tollwut-Impfstoff, Varicella-Zoster-Immunglobulin. C1-Inhibitor, Diphtherie-Antitoxin vom Pferd, Obidoxim, Prothrombin-Konzentrat (PPSB), Röteln-Immunglobulin. Zusätzlich in der Roten Liste®: • Verzeichnis von Informations- und Behandlungszentren für Vergiftungen für Deutschland und Europa ( Tab. 3.3 ). • Impfempfehlungen; Impfvorschriften für den internationalen Reiseverkehr. • Empfehlungen zur Malariaprophylaxe. 9.2.1 Allgemeine Regeln für Impfungen In Deutschland besteht keine Impfpflicht. Impfempfehlungen werden durch die obersten Gesundheitsbehörden der Länder ausgesprochen. Diese öffentliche Empfehlung hat im Fall von Impfschäden wichtige Bedeutung für die weitere Versorgung (§ 20 IfSG). • Passive Immunisierung durch Immunglobuline: Vorteil der sofortigen Schutzwirkung. Nachteil: Schutz ist nur von kurzer Dauer (4 Wo. bis 3 Mon.), es besteht nur humorale Immunität. • Aktive Immunisierung: Der Organismus wird mit Antigenen von Krankheitserregern konfrontiert und muss selbst eine Immunität ausbilden. Der Schutz tritt verzögert ein, ist aber von langer Dauer. • Impfung:allgemeine RegelnTotimpfstoffe: Abgetötete Krankheitserreger oder Immunisierung, passiveaufbereitete Antigene; keine Impfinfektion möglich, deshalb auch bei Pat. mit Immundefekten applizierbar. I.d.R. Grundimmunisierung durch 3 Inj., meist i.m. • Lebendimpfstoffe: Enthalten Immunisierung, aktiveattenuierte, aber vermehrungsfähige Krankheitserreger → Risiko für Immunsupprimierte und Schwangere. Applikation s.c. oder p.o. (je nach Impfstoff). Informationen zu Impfungen Hersteller-Informationen: In TotimpfstoffPackungsbeilagen, Fachinformationen und wissenschaftlichen Basis-Broschüren. Hersteller können auch jederzeit telefonisch kontaktiert werden → Service-Nummern der Arzneimittelhersteller finden sich z.B. in der Roten Liste. Behördliche LebendimpfstoffInformationen: Das Robert-Koch-Institut unterhält eine Ständige Impfkommission (STIKO), die Impfempfehlungen regelmäßig überarbeitet (letzte Fassung vom Juli 2008). Die Empfehlungen sind im Anhang der "Roten Liste" abgedruckt. Bestellung der Impfempfehlungen der STIKO bei: Robert-Koch-Institut, Kennwort "STIKO-Empfehlungen", Nordufer 20, 13353 Berlin, unter Fax-Nr. 01888-754-2628 oder unter [email protected]. Kontraindikationen für Impfungen • Akute behandlungspflichtige Infektionserkrankungen: Impfung frühestens 2 Wo. nach Genesung. • OP: Bei dringender Ind. kann bei vorangegangener Impfung ein operativer Eingriff jederzeit durchgeführt werden. Bei elektiven OPs wird für Totimpfstoffe ein Abstand von 3 d, für Lebendimpfstoffe ein Abstand von 14 d empfohlen. Dies soll helfen, unerwünschte Impfreaktionen von OP-Komplikationen zu unterscheiden. Impfungen aus dringender bzw. vitaler Ind. (Hep. B, Tollwut) sind unverzüglich durchzuführen. Bislang keine Hinweise auf eine Inkompatibilität zwischen Impfungen und OP. Eine Ausnahme bilden OP in Verbindung mit Immunsuppression, z.B. Transplantationen. Impfungen sind in diesem Fall in Zusammenarbeit mit den behandelnden Ärzte zu planen. • Grav.: Alle nicht dringend indizierten Impfungen ( 9.2.4 ). • Bei Immunsuppression bzw. Immundefekt: Es gelten die Herstellerangaben, die z.T. sehr restriktiv sind. • Allergie gegen Bestandteile eines Impfstoffs (z.B. Hühnereiweiß, 9.2.4 ). • Nach Auftreten von KO bei einer Impfung besteht bis zur Klärung der Ursachen eine KI für denselben Impfstoff. Keine Kontraindikationen sind • Banale Infektionen mit subfebriler Temperatur. • Möglicher Kontakt des Impflings zu Personen mit Infektionskrankheiten. • Krampfanfälle in der Familie; Fieberkrämpfe (bei bekannter Disposition Gabe eines Antipyretikums bei der Impfung). • Chron. Erkrankungen, nichtprogrediente ZNS-Erkrankungen. • Ekzeme u.a. Dermatosen, lokalisierte Hautinfektionen. • Behandlung mit Antibiotika, niedrig dosierten Kortikosteroiden (≤ 10 mg Hydrocortison-Äquivalent) oder lokal angewendeten Steroidpräparaten. • Bei Totimpfstoffen: Angeborene oder erworbene Immundefekte; Neugeborenenikterus; Frühgeburtlichkeit (Frühgeborene sollten unabhängig vom Geburtsgewicht gemäß dem empfohlenen Impfalter geimpft werden). Aufklärung vor Impfungen • Art, Risiken und Behandlungsmöglichkeiten der zu verhütenden Krankheit. • Nutzen der Impfung. • Art des Impfstoffs, Durchführung der Impfung. • NW und Risiken des Impfstoffs. • Info. über KO d. Punktion (Blutung, Verletzung von Nerven u. Gefäßen, Inf.). • Mögliche Lokalreaktionen (Rötung, Schwellung, Schmerzhaftigkeit). • KI für die Impfung. • Empfehlungen über Verhaltensmaßnahmen im Anschluss an die Impfung. • Beginn und Dauer der Schutzwirkung, Notwendigkeit von Auffrischimpfungen. • "Öffentliche Impfungen": Schriftliche Aufklärung wird empfohlen; zusätzlich muss Möglichkeit zum Gespräch gegeben sein. Aufklärungsmerkblätter (inkl. Fragebogen und Einwilligungserklärung) für Impfungen im Kindesalter sind erhältlich bei: Deutsches Grünes Kreuz, Schuhmarkt 4, 35037 Marburg. Impfanamnese • Allgemeiner Gesundheitszustand? • Immunschwäche, -defekt? • Durchgemachte Infektionskrankheiten? • Frühere Impfungen, Auftreten von Impfreaktionen? • Gravidität. • Allergien. Impfabstände • Wichtig für einen lang dauernden Impfschutz: Der bei der Grundimmunisierung erforderliche Mindestzeitraum (s. einzelne Impfungen) zwischen vorletzter und letzter Impfung darf nicht unterschritten werden. • Es gibt keine unzulässig großen Abstände zwischen Impfungen. Jede Impfung gilt. Auch eine für viele Jahre unterbrochene Grundimmunisierung muss nicht neu begonnen werden. • Ist nicht bekannt, wann zuletzt bzw. ob überhaupt eine Impfung stattgefunden hat, ist dies kein Grund, eine Grundimmunisierung nicht zu beginnen oder Impfungen aufzuschieben oder nicht durchzuführen. • Serologische Kontrollen zur Überprüfung des Impfschutzes sind i.d.R. nicht angezeigt. Es genügt meist 1 Auffrischimpfung. Spezielles Schema beachten bei Tetanus ( 9.2.3 ), Tollwut ( 9.2.3 ), Hepatitis B ( 9.2.3 ). • Durch zusätzliche Impfungen bei bereits bestehendem Impfschutz steigt das Risiko für KO nur bei BCG-Impfung, Tetanustoxoid (verstärkte Lokalreaktion) und Pneumokokken-Impfung (systemische, allergische Reaktionen). • Lebendimpfstoffe: Können simultan verabreicht werden; werden sie nicht simultan verabreicht, ist ein Mindestabstand von 4 Wo. zu empfehlen. Voraussetzung: Vollständiges Abklingen der Impfreaktion, keine KO. • Totimpfstoffe (inaktivierte Krankheitserreger, d.h. deren Antigenbestandteile/Toxoide): Keine Mindestabstände zu anderen Impfungen erforderlich, auch nicht zu solchen mit Lebendimpfstoffen. • Bei Wiederholungsimpfungen im Rahmen der Grundimmunisierung sollte für die weiteren Impfungen das gleiche Präparat verwendet werden. Bei schlechter Verträglichkeit bzw. unzureichender Immunantwort nach Abschluss einer Impfserie kann eine Impfung mit dem Präparat eines anderen Herstellers u.U. den gewünschten Impferfolg haben. • Kombinationsimpfstoffe helfen, Injektionen und Impftermine einzusparen; manchmal sind sie auch preiswerter als die Summe der jeweiligen Monovakzinen. Umgang mit Impfstoffen Vor allem Lebendimpfstoffe sind temperaturlabil und müssen vor Erwärmung und Gefrieren geschützt werden. Alle Impfstoffe sind bei 2–8 °C zu lagern, wobei die Temperatur permanent mit einem geeichten Minimax-Thermometer kontrolliert werden muss. Impfstoffe, die falsch gelagert oder eingefroren wurden, sind zu verwerfen. Angebrochene Amp. sofort verbrauchen, v.a. wegen der Gefahr der bakteriellen Kontamination ( cave: Spritzenabszess). Für die Injektion eine neue Kanüle verwenden. An der Aufziehkanüle anhaftender Impfstoff kann zu Lokalreaktionen der Haut führen. Injektionsort (Herstellerangaben beachten!) • Subkutan: Am dors. Oberarm oder ventrolat. am Oberschenkel. Bei Antikoagulation auch i.m. Impfstoffe (Herstellerangaben beachten). • Intramuskulär: Die meisten Totimpfstoffe werden i.m. injiziert. Impfstoffmengen bis 1 ml in den M. deltoideus oder M. triceps brachii. Injektion in den M. deltoideus ergibt bessere Immunität als intraglutäale Injektion. So lange der M. deltoideus nicht genügend ausgebildet ist, wird die Injektion in den M. vastus lateralis (anterolateraler Oberschenkel) empfohlen. Hier besteht kaum Gefahr, Nerven oder Gefäße zu verletzen. Impfreaktionen Häufig auftretende, milde, selbstlimitierende Symptome. • Lokalreaktionen: Rötung, Schwellung, Schmerzhaftigkeit im Bereich der Injektionsstelle; klingen innerhalb von 72 h ab. Bei anhaltenden Beschwerden an eine Infektion denken. • An den ersten beiden Tagen nach Impfung können subfebrile Temperaturen auftreten. Bei Disposition zu Fieberkrämpfen: Simultane Gabe von Antipyretika. • MMR-Impfung: Zwischen 7. und 12. d ist eine leichte masernähnliche Symptomatik mit subfebrilen Temperaturen möglich. Impfkomplikationen Bei regelrechter Anwendung der amtlich zugelassenen Impfstoffe extrem selten. • Bei Verdacht: Immunstatus und ggf. interkurrente Infektionen zum Zeitpunkt der Impfung abklären → Serum und ggf. mikrobiologische Proben (Serum-Stuhlproben) asservieren. • Meldung an das örtliche Gesundheitsamt und die Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft, Herbert-Levin-Platz 1, 10623 Berlin, Tel. (030) 40 04 56–5 00, Fax (030) 40 04 56–5 55. • Impfling bzw. Eltern/Sorgeberechtigte auf gesetzliche Regelungen zur Versorgung nach Impfschäden hinweisen (IfSG §§ 60–64, 66). Der Antrag ist beim zuständigen Versorgungsamt zu stellen. Impfdokumentation • Immer doppelte Dokumentation durchführen (in den Impfunterlagen des Impflings und in den Aufzeichnungen des Arztes). • Möglichst vorhandene Dokumente (Impfbücher) weiterführen. Falls diese nicht vorliegen, kann eine separate Bescheinigung ausgestellt werden. Zum späteren Nachtrag in Impfbücher ist jeder Arzt berechtigt. • Bei Neuausgabe von Impfbüchern WHO-gerechte Formulare bevorzugen ("Internationale Bescheinigungen über Impfungen und Impfbuch", erhältlich beim Deutschen Grünen Kreuz, s.o.). • Dokumentiert werden: Tag der Impfung; Art der Impfung; Bezeichnung des Impfstoffs (Handelsname); Chargen-Nummer (sehr wichtig!); impfender Arzt. Abrechnung von Impfungen • Kassenleistung sind alle öffentlich empfohlenen Impfungen. Die Einstufung erfolgt durch die STIKO und kann sich von Bundesland zu Bundesland unterscheiden. • Kosten für Indikationsimpfungen aufgrund beruflicher Risiken werden von der gesetzlich benannten Stelle (i.d.R. Arbeitgeber) übernommen. • Sonder- und Reiseimpfungen müssen privat abgerechnet werden. Tab. 9.2 Kombinationsimpfstoffe Tetanus Diphtherie Pertussis Polio (Salk) HiB Hepatitis A Hepatitis B Komb.-Impfstoffe Präparate, z.B. x x DT-Impfstoff Behring®, DT-Impfstoff Merieux®, Td-Impfstoff Merieux®, Td-pur®, Td-Rix® x x x DTP-Impfstoff Merieux®, Infanrix® DTPa, Boostrix® x x x x Infanrix® + Hib x x x x Quatro-Virelon®, TETRAVAC® x x x REVAXIS® x x x x Repevax® x x x x x PENTAVAC®, Infanrix-IPV + Hib x x x x x x HEXAVAC®, Infanrix hexa® x x PROCOMVAX® x x Twinrix® Masern Mumps Röteln Varizellen x x M-MVax® x x x MMR Triplovax®, M-M-RVax®, Priorix® x x x x Priorix-Tetra® Tab. 9.3 Impfkalender Kinder- und JugendimpfungenImpfung:bei Kindern/Jugendlichen Impfstoff Vollendeter Lebensmonat Vollendetes Lebensjahr Geb. 2 3 4 11–14 15–23 5–6 9–17 DTaP ∗ 1. 2. 3. 4. Td A A aP A A Hib ∗ 1. 2. ∗∗ 3. 4. HB Np 1. 2 . ∗∗ 3. 4. G Pneumokokken 1. 2. 3. 4. IPV 1. 2. ∗∗ 3. 4. A MMR 1. 2. ∗∗∗ Varizellen 1. 2 G ∗∗∗∗ Meningokokken 1. ab 12 Mon. HPV 12–17, lt. STIKO Standardimpfung für Mädchen A: Auffrischimpfung, Abstand zur letzten Impfung mind. 5 J. G: Grundimmunisierung aller bislang ungeimpften Kinder bzw. Komplettierung eines unvollständigen Impfschutzes DTaP: Diphtherie, Tetanus, Pertussis azellulär Td: Kombinationsimpfstoff Tetanus mit reduziertem Diphtherie-Toxoidgehalt ab > 5 LJ aP: Pertussis azellulär Hib: Haemophilus influenzae Typ B HB: Hepatitis B IPV: Inaktivierte Poliovakzine (Salk) MMR: Masern, Mumps, Röteln HPV: Humane Papillomviren Np: Postexpositionelle Hep.-B-Prophylaxe bei Neugeborenen HB s Ag-pos. Mütter ( 9.2.3 ) ∗ Abstände zwischen 1. und 2. sowie 2. und 3. Impfung mind. 4 Wo.; Abstand zwischen 3. und 4. Impfung mind. 6 Mon. ∗∗ Bei monovalenter Anwendung bzw. bei Kombinationsimpfstoffen ohne Pertussiskomponente kann diese Dosis entfallen ∗∗∗ Ein Mon. Mindestabstand zwischen den MMR-Impfungen ∗∗∗∗ Ungeimpfte Kinder ohne pos. Varizellen-Anamnese, 9–13 J. 1 Dosis, Kinder ab 13 J. 2 Dosen im Abstand von 6 Wo. (öffentlich empfohlene Impfungen der STIKO, Stand 7/2008; Quelle: Epid. Bulletin 30/2008) Tab. 9.4 Standardimpfungen für Erwachsene Impfung Personenkreis Impfmodus Wiederimpfung Vorsichtsmaßnahmen Tetanus (TI) Diphtherie (TI) Alle Erw. Grundimmunisierung mit Diphtherie-Tetanus (Td); Kombinationsimpfstoff: 0/4 Wo./1 J.; 0,5 ml i.m., Tetanus bei Verletzung∗ Bei Verletzung ∗ ; sonst alle 10 J. 1 Dosis Allergische Reaktionen Polio-Salk (TI) Alle Erw. 0/8 Wo./6 Mon.bzw. 1 J. 1 Dosis alle10 J. Keine speziellen Influenza (TI) Personen > 60 J. oder mit chron. Erkr. von Herz und Lunge und beruflich Exponierte Im Herbst eine Dosis i.m. Jährlich im Herbst. Cave: Erregerwechsel Hühnereiweiß-Allergie Pneumokokken (TI) Wie Influenza; geplante Splenektomie; Asplenie; beruflich Exponierte Jugendliche 2 Injektionen: 0/4 Wo. s.c., Erw. nur 1 Dosis 1 Dosis, Erw. und Jugendliche alle 6 J. Zeitabstand zur Wiederimpfung beachten! Röteln (LI) Alle seroneg. F mit Kinderwunsch Röteln-Monovakzine 1 Dosis (0,5 ml) s.c. oder Masern-Mumps-Röteln; Kombinationsimpfstoff 1 Dosis (0,5 ml) s.c. Falls Röteln-AK unter 1 : 32 in HAH. Titerkontrolle 4 Wo. p.v. Neomycin-Allergie, Hühnereiweiß- Allergie KI: Grav. ∗∗ ; Immundefizienz Ausführliche Informationen ( 9.2.3 ); LI = Lebendimpfstoff, TI = Totimpfstoff. ∗ Vorgehen ( 9.2.3 ). ∗∗ Bei versehentlicher Impfung ist ein Schwangerschaftsabbruch nicht indiziert. (öffentlich empfohlene Impfungen der STIKO, Stand 7/2008; Quelle: Epid. Bulletin 30/2008) 9.2.2 Impftabellarium Um mit möglichst wenig Injektionen STIKOauszukommen, sollten Kombinationsimpfstoffe bevorzugt werden. Wichtige Kombinationsimpfstoffe sind: Tab. 9.5 Indikations- und Sonderimpfungen Ausführliche Informationen 9.2.3 Impfung Personenkreis Impfmodus Wiederimpfung Vorsichtsmaßnahmen FSME (TI) Personen mit Naturkontakt in Endemiegebieten ∗∗ Grundimmunisierung: 0/4 Wo./1 J. i.m. Alle 5 J. 1 Dosis Hühnereiweiß-Allergie, neurologische Störungen Hepatitis A (TI) Exponiertes Personal, z.B. im Medizinbereich, Homosexuelle, Hämophile, Kontaktpersonen zu HA-Erkrankten Grundimmunisierung nach Angaben des Herstellers, 2 bzw. 3 Injektionen Alle 10 J. 1 Dosis Vortestung auf HA-AK, bei Geburtsjahr vor 1950 oder langem Aufenthalt im Endemiegeb. Impfung Personenkreis Impfmodus Wiederimpfung Vorsichtsmaßnahmen Hepatitis A (TI) Postexpositionsprophylaxe, aktive und passive Immunisierung erforderlich Immunglobulin + Grundimmunisierung Schutz für 3 Mon. Hepatitis B (TI) Medizinisches und zahnmedizinisches Personal; Pat. mit häufiger Übertragung von Blutprodukten; Kontaktpersonen Erkrankter • Grundimmunisierung: 0/4 Wo./6 Mon. i.m.; bei Risikogruppen: Titerkontrolle • Postexpositionell: Aktive und passive Immunisierung Titer 6 Wo. nach letzter Impfung: • 98 % Hühnereiweiß-Allergie; wegen evtl. verstärkter NW möglichst 4 Wo. Abstand zu anderen Lebendimpfungen Hepatitis A (TI) Länder mit schlechter Hygiene Grundimmunisierung nach Angaben des Herstellers, 2 bzw. 3 Injektionen i.m. 0/4 Wo./1 J. 2 Wo. nach 2. Impfung; 10 J.; > 95 % Test auf HA-Ak, bei Geburtsjahrgängen vor 1950 Hepatitis B (TI) Längere Aufenthalte in Afrika und Fernost Grundimmunisierung: 0/4 Wo./6 Mon. i.m. 2 Wo. nach 2. Impfung ca. 10 J., 95 % Titerkontrolle bei Risikogruppen ( 9.2.3 ) Japan-Enzephalitis (TI) Südostasien (> 1 Mon. Aufenthalt in ländlichen Gebieten, nicht für "Normal-Touristen") Grundimmunisierung: s.c. Tag 0/7/30 2 Wo. p.v.; 1–4 J.; > 90 % Bezug durch Internationale Apotheke Meningokokken (TI) Typ A, C, W, Y Sahelzone, Vorderasien, tropisches Südamerika (Arbeitsaufenthalte, Trekkingreisen) Kinder: Ab 7. Lebensmon. und Erw.: s.c. 1 Dosis 1 Wo. p.v.; 1–3 J.; 98 % Schützt nicht gegen den in Europa häufigen Typ B Tollwut (präexpositionell, TI) Südostasien, Südamerika (> 3 Mon. Aufenthalt, berufl. Exposition) Grundimmunisierung: i.m. 0/4 Wo./1 J. 2 Wo. nach 2. Impfung; 2–5 J.; 99 % Bei Exposition Auffrischung mit 2 Impfungen: i.m. Tag 0/3 Typhus (TI) Grundimmunisierung: i.m. oder s.c. 1 Dosis Erw. und Kinder ab 2. Lj. 1 Wo. p.v.; 3 J.; ca. 50–60 % Keine bes. LI = Lebendimpfstoff, TI = Totimpfstoff, p.v.: post vaccinem Tab. 9.7 Zeitplan für Reiseimpfungen Mindestabstände von Impfungen zum Abreisetermin. Bei Grundimmunisierungen darf der Mindestabstand zwischen 1. und 2. Impfung nicht unterschritten werden. Woche vor der Abreise 6. 5. 4. 3. 2. 1. Maßnahme Diphtherie/Tetanus G1 G2, A FSME G1 G2, A Gelbfieber (LI) X Hepatitis-A-Immunglobulin X Hepatitis-A-Impfung G1, A Hepatitis-B- und Kombinationsimpfung Hep. A/Hep. B G1 G2, A Malaria-Prophylaxe X Meningokokken X Polio tot (Salk) G1 G2, A Tollwut G1 G2 A G3 Typhus ∗ X G1: Grundimmunisierung, 1. Dosis; G2: 2. Dosis; G3: 3. Dosis. A: Auffrischimpfung ∗ Bei oralem Lebendimpfstoff Abstand zu Gelbfieber-Impfung und zu Malariaprophylaxe beachten ( 9.2.3 ). • Bei Kindern mit Diphtherie:ImpfungKombinationsimpfstoffen gegen Diphtherie (D), Tetanus (T), Haem. infl. Typ B (HiB), Pertussis (P) und Hep. B. Verfügbare Präparate Tab. 9.2 . • Impfstoff für Kinder bis zum vollendeten 5. Lj.: 75 IE Toxoid. Vom 5. bis zum vollendeten 6. Lj. mit reduzierter Dosis = 30 IE impfen (0,2 ml des Kinderimpfstoffs). Ab dem 6. Lj. Erw.-Impfstoff "d" mit 5 IE Toxoid (Diphtherie-Adsorbat-Impfstoff für Erw.) anwenden! • Erw. mit Grundimmunisierung: Alle 10 J. 1 Injektion (= 0,5 ml) mit Kombinationsimpfstoff Tetanus-Diphtherie (Td-Impfstoff; bei Antikoagulation auch s.c. Gabe möglich). Bei ausreichender Tetanus-Immunität Impfung mit "d"-Diphtherie-Monovakzine. Nebenwirkungen Am Impftag oder dem darauf folgenden Tag Temperatur ↑ bei 2–3 % der Säuglinge. Selten verstärkte Lokalreaktion. "d"-Impfstoff bisher ohne Begleiterscheinungen. Schutzwirkung 1 Wo. nach der 2. Impfung; Konversionsrate: Über 98 %; Schutzquote: Ca. 80 %. Keine letalen Verläufe bei Geimpften. Dauer: Primär 5–7 J. Nach Booster im 7. J. wesentlich länger. Wiederimpfungen 1. Booster vor Schulbeginn, 2. mit ca. 10 J., danach alle 10 J. Bei Expositionsgefahr Auffrischimpfung mit 1 Dosis, wenn Grundimmunisierung mehr als 3 J. zurückliegt. Bei Verletzungen Impfung mit Tetanus-Monovakzine, wenn letzte Td-Impfung 99 %; Schutzquote: > 99 %; Dauer: 10–15 J. Amtliche Anerkennung: 10 J. Wiederimpfung Alle 10 J. bei Bedarf. Kontraindikationen Klinisch relevante Hühnereiweißallergie, manifeste Immundefizienz; Gravidität, außer bei Expositionsgefahr. Keine Impfung von Kindern 12 J. 600 mg/d in 1 Einzeldosis für 4 d Schwangere ggf. Ceftriaxon 250 mg i.m. Hepatitis-A-Impfung Kostenübernahme indikationsbezogen durch Krankenkassen. Indikation Reisende in Gebiete mit hoher Hep.-A-Durchseuchung (Naher Osten, Afrika, Südostasien, Südamerika), Indikationsimpfung für Angehörige von Entwicklungsdiensten, Hep.-A-gefährdetes Personal medizinischer Einrichtungen und Laboratorien, Personal in Kindertagesstätten, Einrichtungen für geistig Behinderte, Abwasserentsorgung, homosexuelle Männer, Hämophile. Impfstoff Totimpfstoffe mit oder ohne Hepatitis:ImpfungAluminiumhydroxid, z.B. Havrix® 720 Kinder, Havrix® 1440, VAQTA®, VAQTA® Kinder. Impfmodus 2 Injektionen à 1 ml i.m. bevorzugt in den M. deltoideus im Abstand von 6–12 Mon. Nebenwirkungen Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen, verstärkte Lokalreaktion. Schutzwirkung Nach der 1. Impfung; Konversionsrate: 95 %. Dauer: > 10 J. werden angenommen. Impfschutz für 1 J. besteht ab 10 Tage nach der ersten Impfung. Eine eingeleitete Grundimmunisierung bei Reisenden (im Ausland, nach der Rückkehr) und bei Kontaktpersonen sollte in jedem Fall vervollständigt werden. Wiederimpfung Alle 10 J. Kontraindikationen Strenge Indikationsstellung bei Schwangeren. Besonderheiten Vor Impfung Anti-HAV-Titer bestimmen, sofern Pat. vor 1950 geboren wurde; bei Antikoagulation ist auch s.c. Gabe möglich. Tab. 9.10 Schema der Hepatitis-A-Immunprophylaxe für Reisende (Virushepatitiden 8.7.1) Grundimmunisierung 1. Impfung an Tag 2. Impfung 3. Impfung ≥ 4 Wo. Zeit • HA-Monovakzine 0 6–12 Mon. – • Kombinationsimpfung HA/HB 0 4–6 Wo. 6–12 Mon. 3 Wo. Zeit HA-Monovakzine 0 6–12 Mon. – Passive Immunisierung Impfstoff Nichtspezifisches Gammaglobulin (IgG). Indikation Wenn aktive Immunisierung nicht möglich ist. PEP bei engem Kontakt zu Erkrankten bzw. Konsum HA-Virus-kontaminierter Nahrungsmittel. Immunglobulingabe bis zu 10 d nach Exposition sinnvoll. Strenge Indikationsstellung! Dosierung Herstellerinformationen beachten. Aktive Immunisierung Impfmodus Grundimmunisierung: Bei den neueren Impfstoffen (z.B. Havrix 1440®, VAQTA®) 2 Impfungen in den M. deltoideus. Schema 0/6–12 Mon. Hepatitis-B-Impfung Virushepatitiden 8.7.1. Indikation Öffentlich empfohlene Standardimpfung bei Kindern ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendlichen bis zum 17. Lj. Indikationsimpfung bei Personen mit bes. Risiko, sowie als PEP. • Präexpositionell: (Indikationsgruppen 1–7). – Hep.-B-gefährdetes medizinisches und zahnmedizinisches Personal; andere Personengruppen mit Infektionsrisiko durch Blutkontakt zu Infizierten, z.B. Polizisten, Hepatitis:Hepatitis B, ImpfungFeuerwehr (1). – Dialysepat., Pat. mit häufiger Übertragung von Blut und Blutprodukten, Pat. vor ausgedehnten chirurgischen Eingriffen (2). – Pat. mit chron. Lebererkr., die HbsAg-neg. sind (3). – Durch Kontakt mit HBsAg-Trägern in Familie und Gemeinschaft (z.B. in Kindergärten, Kinderheimen, Pflegestätten) potenziell gefährdete Personen (4). – Pat. in psychiatrischen Anstalten oder Einrichtungen für Zerebralgeschädigte oder Verhaltensgestörte (5). – Bes. Risikogruppen, wie z.B. homosexuell aktive Männer, i.v. Drogenabhängige, Prostituierte, länger einsitzende Strafgefangene (6). – Reisende in Regionen mit hoher Hep.-B-Prävalenz (Entwicklungsländer) bei längerfristigem Aufenthalt (ab 6 Mon.) oder bei zu erwartenden engen Kontakten zur einheimischen Bevölkerung (7). • Postexpositionell: Nach Verletzung mit möglicherweise HBV-kontaminierten Gegenständen (z.B. Injektionsnadel). Neugeborene HBsAg-pos. Mütter. Schwangere werden entsprechend den Mutterschaftsrichtlinien nach der 32. SSW möglichst nahe dem Geburtstermin auf HBsAg untersucht. Bei pos. Ergebnis wird unmittelbar post partum mit der Hep.-B-Immunisierung des Kindes (Simultanimpfung) begonnen. HBsAG-positive Schwangere sollten unbedingt durch in der Hepatologie Erfahrene betreut werden. Wenn der pos. HBsAg-Status der Mutter erst nachträglich bekannt wird, kann die passive Immunisierung bis 7 Tage post partum nachgeholt werden. Nach abgeschlossener Grundimmunisierung beim Kind serol. Kontrolle (Anti-HBs, HBsAg). Impfstoff Totimpfstoff, Adsorbatimpfstoff, z.B. Engerix® B Kinder, Engerix® B Erw., HBV VAXPRO®. Impfmodus • Grundimmunisierung mit 3 Impfungen, Injektion bevorzugt in den M. deltoideus. Schema: 0/4 Wo./6–12 Mon. Titerkontrolle 4 Wo. nach der 3. Dosis. • PEP innerhalb von 24 h durchführen (sinnvoll bis 72 h). Gabe von Hep.-B-Immunglobulin (je nach Präparat i.v. oder i.m.). Simultan an anderer Stelle Applikation der Hep.-B-Vakzine. Anschließend bei fehlender bzw. unvollständiger Grundimmunisierung die weiteren Impfungen entsprechend den Richtlinien nachholen. Tab. 9.11 Hepatitis-B-Postexpositionsprophylaxe (PEP) Vorgeschichte Keine Maßnahmen Anti-HBs-Bestimmung Anti-HBs (IU/l) Hep.-B-Vakzine Hep.-B-Immunglobulin Anti-HBs nach Grundimmunisierung ≥ 100 IU/l und letzte Impfung vor ≤ 5 J. Ja Innerhalb der letzten 12 Mon. wurde ein Anti-HBs-Wert ≥ 100 IU/l gemessen Ja Anti-HBs nach Grundimmunisierung war ≥ 100 IU/l und letzte Impfung vor 5–10 J. Nein Ja Nein Nicht oder unvollständig geimpft, der Impferfolg wurde nie kontrolliert ≥ 100 Nein Nein Lowresponder (Anti-HBs nach Grundimmunisierung 1 : 40); Schutzquote: Je nach Antigenkorrespondenz: Schutz vor Erkr. 50–60 %; Schutz vor schweren Verläufen 90 %. Wiederimpfung Jährlich im Herbst vor Beginn der Grippesaison. Kontraindikationen Klinisch relevante Hühnereiweißallergie. Besonderheiten Schützt nur gegen Erkrankung an Influenza, nicht jedoch vor grippalen Infekten. Bei Antikoagulation ist auch s.c. Gabe möglich. Passive Immunisierung Wegen Variabilität des Erregers nicht sinnvoll, ggf. Chemoprophylaxe mit dem Neuraminidase-Inhibitor Zanamivir (z.B. Relenza®) oder Oseltamivir (Tamiflu®)( 9.4.4 , Influenza). Japan-Enzephalitis-Impfung Indikation Reiseimpfung: Längerer Aufenthalt (> 4 Wo.) während der Übertragungszeit (in den Tropen während der Regenzeit, in gemäßigten Zonen v.a. von Spätsommer bis Frühherbst) in Endemiegebieten (Süd- und Ostasien), Bevölkerung in Endemiegebieten. Impfstoff Totimpfstoff; abgetötete Viren (Korea), z.T. auch chinesische Lebendvaccine. Impfmodus 3 Impfungen von 1,0 ml s.c. an den Tagen 0/7/30. KinderJapan-Enzephalitis, Impfung 90 %; Dauer: mind. 4 J. Wiederimpfung Nach 1–4 J. Kontraindikationen Keine bes., allg. KI ( 9.2.1 ). Besonderheiten Impfstoff in Deutschland nicht zugelassen, kann aber über eine internationale Apotheke bezogen werden. Passive Immunisierung Nicht verfügbar. Masern-Impfung Masern 16.7.1. Indikation • Öffentlich empfohlene Impfung bei Kindern ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendlichen. Ziel ist die Eradikation der Masern. • Öffentlich empfohlen für ungeimpftes medizinisches Personal und Personal in der Kinderbetreuung. Anamnestische Angaben über durchgemachte Masern ohne serol. Kontrolle nicht verwertbar. Vorgesehene Impfung zum Impftermin in jedem Fall Masern:Impfungdurchführen, da NW Masern-Mumps-Röteln (Kombinationsimpfstoff)bei Impfung nach durchgemachter Infektion oder mehrfachen Impfungen nicht bekannt. Impfstoff Lebendimpfstoff, attenuiertes Masernvirus, Kühlkette! Gegen Licht und Wärme sehr empfindlich. Monovakzine, z.B. Masern-Impfstoff Merieux® (Amp. 0,5 ml) und Bestandteil von Kombinationsimpfstoffen ( Tab. 9.2 ). Impfmodus Grundimmunisierung bei Kindern und Jugendlichen mit 2 Impfdosen im Abstand von mind. 4 Wo., auch bei Erw. möglichst 2 Impfdosen s.c. (oder i.m.). Vorzugsweise mit Kombinationsimpfstoff MMR ( 9.2.2 , Tab. 9.3 ). Nebenwirkungen Bei 3–5 % der Geimpften um den 9. d p.v. Temperaturerhöhung, z.T. mit uncharakteristischem Exanthem, "Impfmasern" mit mildem Verlauf. Schutzwirkung Sofort! Bis zu 48 h nach Exposition auch Inkubationsimpfung möglich; Konversionsrate: 97–99 %; Dauer: Wahrscheinlich lebenslang. Kontraindikationen AIDS, Allergie gegen Hühnereiweiß ( 9.2.4 ). Besonderheiten Nach Immunglobulin- und Serumgaben 4 Mon. Abstand zur Impfung! Inkubationsimpfung nur bis 48 h nach Exposition sinnvoll. Kinder mit asymptomatischer HIV-Infektion können geimpft werden. Passive Immunisierung Keine. Meningokokken-Impfung Indikation • Pat. mit Asplenie, geplanter Splenektomie, Hypogammaglobulinämie, Komplementdefekten. • Impfung gegen Meningokokken der Serogruppe C: Von der STIKO empfohlene Standardimpfung für alle Kinder > 1 J. (1 Impfdosis ab dem 12. LM, z.B. Menjugate® Kit, Neis-Vac-C®). • Reiseimpfung für Reisen in Endemiegebiete (Sahelzone, Vorderasien, tropisches Südamerika): Impfung gegen Meningokokken der Serogruppen A, C, W, Y; Zur Meningokokken:ImpfungEinreise nach Saudi-Arabien ist eine AC oder ACWY-Impfung erforderlich, z.B. für Mekka-Pilger. Gültigkeit: 10 d–3 J. nach der letzten Impfung. Bei Kindern 3 Mon. 10 mg/kg KG/d in 2 Einzeldosen für 2 d 1–12 J. 20 mg/kg KG/d in 2 Einzeldosen für 2 d ≤ 450 mg/d > 12 J. 1200 mg/d in 2 Einzeldosen für 2 d Schwangere Ggf. Ceftriaxon 250 mg i.m. Mumps-Impfung Indikation Öffentlich empfohlene Standardimpfung für Kinder ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendliche. Erw. ohne Impfung, seroneg. exponierte Personen (z.B. Lehrer). Öffentlich empfohlen für medizinisches Personal und Personal in der Kinderbetreuung. Anamnestische Angaben über durchgemachte Mumps ohne serol. Kontrolle nicht verwertbar. Vorgesehene Impfung zum Impftermin in jedem Fall durchführen, da NW bei Impfung nach durchgemachter Infektion oder mehrfachen Mumps:ImpfungImpfungen nicht bekannt. Impfstoff Lebendimpfstoff, attenuiertes Mumpsvirus. Sehr licht- und wärmeempfindlich: Kühlkette! Vorzugsweise als Kombinationsimpfstoff (MMR; Tab. 9.2 ). Impfmodus 1 Impfdosis, vorzugsweise mit Kombinationsimpfstoff MMR, z.B. M-M-R Vax®. Bei Kindern 2 Impfdosen ( 9.2.2 , Tab. 9.3 ). Nebenwirkungen Selten, in der 2. Wo. p.v. Temperaturerhöhung. Schutzwirkung 2 Wo. p.v.; Konversionsrate: Ca. 97 %; Dauer: Wahrscheinlich lebenslang. Kontraindikationen Immundefizienz, AIDS, Allergie gegen Hühnereiweiß ( 9.2.4 ). Besonderheiten Mumpsimpfung kann bei Kindern mit asymptomatischer HIV-Inf. erfolgen. Passive Immunisierung Nutzen von Immunglobulinen nicht erwiesen. Pertussis-Impfung Pertussis 16.7.7. Indikation Öffentlich empfohlen für Säuglinge ab vollendetem 2. Lebensmon., Kinder und Jugendliche bis zum 18. Lj. Personal in Päd. und Infektionsmedizin sowie in Gemeinschaftseinrichtungen für das Vorschulalter. Impfstoff Totimpfstoff. Kombinationsimpfstoffe mit Diphtherie, Pertussis, Polio, HiB, Hep. B ( Tab. 9.2 ). Wegen besserer Verträglichkeit gereinigten, azellulären Impfstoff bevorzugen. Pertussis:Impfung Impfmodus Kinder ab vollendetem 2. Lebensmon.: 4 Impfungen, Pneumokokken:Impfung3 × 0,5 ml i.m. im Abstand von je 4–8 Wo., 0,5 ml i.m. 6–12 Mon. nach der 3. Impfung, Auffrischimpfung ab vollendetem 5.–6. Lj. Erw. 1 Impfung. Nebenwirkungen • Ganzkeimvakzine: Schmerzen lokal. Bei Reflux ins Unterhautfettgewebe Induration, Rötung, Schwellung. Fieber bei ca. 20 % am selben oder folgenden Tag, in 0,1 % zerebraler Krampfanfall. • Azellulärer Impfstoff: Gelegentlich verstärkte Lokalreaktion. Schutzwirkung 2 Wo. nach der 2. Impfung; Konversionsrate: > 80 %; Dauer: Ca. 10 J., Dauer der Immunität nach Erkrankung 15–20 J. Wiederimpfung Alle 10 J. Die Immunität ist nicht dauerhaft; trotz vollständiger Grundimmunisierung als Kind kann der Erw. später wieder an Pertussis erkranken, der hier atypisch als hartnäckige Bronchitis verläuft. Kontraindikationen • Ganzkeimvakzine: HIV-pos. Kinder. Progressive neurologische Erkr., Epilepsie → nur gesunde Kinder impfen. • Azellulärer Impfstoff: Unverträglichkeit von Ganzkeim- oder azellulärem Pertussisimpfstoff, progressive neurologische Erkr. (bisher keine Erfahrung). Passive Immunisierung Nutzen von Immunglobulinen nicht gesichert. Chemoprophylaxe Bei ungeimpften Kindern mit Kontakt zu Erkrankten, auch bei beruflicher oder familiärer Exponierten: Erythromycin 50 mg/kg KG/d für 2 Wo. o. Roxithromycin, Clarithromycin o. Azithromycin in Standarddosierung für 2 Wo. Pneumokokken-Impfung Indikationen Personen mit erhöhter gesundheitlicher Gefährdung infolge einer Grundkrankheit oder ungeimpftes Personal in Einrichtungen der Pädiatrie. • Alter > 60 J. • Immundefekte: Asplenie, Hypogammaglobulinämie, Komplementdefekt, HIV-Inf., Sichelzellenanämie, Leukosen, nach KMT. • Chron. Erkrankungen von Herz, Kreislauf, Atemwegen, Niere. • Diabetes mellitus. • Liquorfistel. • Vor Pneumokokken:ImpfungEinleitung einer immunsuppressiven Ther. • Von der STIKo empfohlene Standardimpfung für alle Kinder. Impfstoff • Konjugat-Impfstoff: Die 7 häufigsten Kapselpolysaccharidtypen konjugiert mit einem Trägerprotein; Totimpfstoff, z.B. Prevenar®. Geeignet für Kinder ab 2 Mon. bis zum vollendeten 2. Lj. Immunisierung: – Sgl. und KK 90), Totimpfstoff; Pneumovax® 23. Geeignet für Kinder ab dem vollendeten 2. Lj., Jugendliche und Erw. Immunisierung: Kinder ab vollendetem 2. Lj. und Erw.: 1 × 0,5 ml s.c. oder i.m. Nebenwirkungen Stärkere Lokalreaktion, Schwellung regionaler LK, Fieber, Abgeschlagenheit. Bei i.c. Injektion können schwere Lokalreaktionen auftreten. Kontraindikationen Schwere Pneumokokken-Inf. oder -Impfung während der letzten 5 J. Schutzwirkung 2 Wo. p.v.; Konversionsrate: > 90 %; Dauer: 3–5 J.; Schutzquote: 75–80 %. Wiederimpfung Bei fortbestehender Ind. Erw. alle 6 J., Kinder 80 %, postexpositionell ca. 60 %. Tetanus-Impfung Indikation Bundesweit öffentlich empfohlene Standardimpfung aller Kinder und Erwachsenen wegen permanenter Infektionsgefahr. Impfstoff Totimpfstoff, Toxoid. Der Standardimpfstoff zur Grundimmunisierung und für den Verletzungsfall enthält 40 IE Tetanus-Toxoid. Impfstoffe mit 2 IE Tetanus-Toxoid, z.B. Td-Rix®, sind nur zur Auffrischimpfung bei abgeschlossener Grundimmunisierung geeignet. Impfmodus Grundimmunisierung bei Kindern ab vollendetem 2. Tetanus:ImpfungLebensmon. mit 3 Injektionen, z.B. Tetanol® à 0,5 ml i.m. Impfschema: 0/4–8 Wo./7–12 Mon. Bei Kindern mit Kombinationsimpfstoff gegen Diphtherie (D), Tetanus (T), Haem. infl. Typ B (HiB), Pertussis (P), Hep. B, Polio ( Tab. 9.2 ). Auffrischung im 5.–6.. Lj., Wiederholung alle 10 J. Vorgehen bei Verletzungen Bei nachgewiesener und glaubhafter kompletter Grundimmunisierung: • Letzte Impfung vor ≤ 5 J.: Keine Impfung. • Letzte Impfung vor 5–10 J.: – Bei sauberen geringfügigen Wunden keine Impfung. – Bei allen anderen Verletzungen 1 Impfung. • Letzte Impfung vor > 10 J.: 1 Impfung. Keine, fragliche oder unvollständige Grundimmunisierung: • Bei geringfügigen, sauberen Verletzungen: Beginn oder Vervollständigung der Grundimmunisierung. • Bei allen anderen Verletzungen: Impfung + Tetanus-Immunglobulin. • Bei 2 Tetanus-Impfungen in der Vorgeschichte und wenn die Verletzung nicht länger als 24 h zurückliegt, nur Impfung und kein Tetanus-Immunglobulin. Durchführung der Simultanimpfung Simultan und kontralateral zur Impfinjektion 250 IE Antitoxin, z.B. Tetagam N® 1 Amp.. Bei schweren Blutverlusten, vernachlässigten Wunden oder ausgedehnten Verbrennungen: 500 IE Antitoxin, z.B. Tetagam N® 2 Amp. intradeltoidal, anschließend Grundimmunisierung vervollständigen. Im Zweifelsfall und bei V.a. Unverträglichkeit Titer bestimmen. Nebenwirkungen Stärkere Lokalreaktion, mitunter starke Induration mit Rötung, Schwellung und Überwärmung bei Hyperimmunisierung. Schutzwirkung 1 Wo. nach 2. Impfung der Grundimmunisierung; Konversionsrate: 99 %; Dauer: Mindestens 10 J. Wiederimpfung Im 10. Lj., dann alle 10 J. 1 Impfdosis (0,5 ml i.m.), vorzugsweise mit Td-Impfstoff, z.B. Td-pur®, "d": Diphtherie. Bei Verletzungen Impfung mit Tetanus-Monovakzine, wenn letzte Td-Impfung 0,01 IE Antitoxin/ml. Gehäuft Impf-Unverträglichkeiten, wenn Titer > 4 IE Antitoxin/ml. Kontraindikationen Keine bes., allg. KI ( 9.2.1 ). Sehr gut verträglicher Impfstoff. Besonderheiten Auch als Kombinationsimpfstoffe DT, DPT, DPT-Polio und Td (nach dem 7. Lj.). Bei Antikoagulanzienther. kann das Antitoxin Tetagam N® auch s.c. angewendet werden. Passive Immunisierung Nach Verletzung ohne ausreichenden Impfschutz Simultanimpfung (s.o.). Tollwut-Impfung Tollwut 9.4.8 . Indikation Postexpositionell; präexpositionell öffentlich empfohlen für Risikogruppen (z.B. Förster, Veterinäre). Reiseimpfung bei Reisen nach Afrika, Asien und Südamerika. Impfstoff Totimpfstoff. Impfmodus postexpositionell (PEP) Sofortiger Beginn der Behandlung! Wunddesinfektion, wenn vertretbar, mit 70 % Ethanol, sonst PVP-Jod, z.B. Betaisodona®; bei richtiger Durchführung Reduktion des Infektionsrisikos um 90 %. 1 Dosis, Tollwut:Impfungz.B. Rabipur®, 1 ml i.m. an den Tagen: 0–3–7–14–28. Am Tag 0 zusätzlich homologes Tollwut-Hyperimmunglobulin, z.B. Berirab® Tollwut Immunglobulin, exakt 20 IE/kg KG i.m., nicht überdosieren! So viel wie möglich vom Immunglobulin um die Verletzungen herum instillieren, den Rest entfernt vom Verletzungsort injizieren. Empfehlungen der WHO zur Postexpositionsprophylaxe bei Tollwut Tollwut:Postexpositionsprophylaxe • Expositions-Kategorie 1: Berühren oder Füttern von Tieren; Belecken der intakten Haut, Berühren eines Impfstoffköders bei intakter Haut: Keine Schutzimpfung, Vorsichtsmaßnahme! Bislang ist noch keine Tollwutinf. durch ein solches Ereignis ausgelöst worden. • Expositions-Kategorie 2: Knabbern an der intakten Haut; oberflächliche Kratzer, die nicht zum Bluten führten; Belecken der nicht intakten Haut: Aktive Schutzimpfung durchführen. • Expositions-Kategorie 3: Jegliche Bissverletzung oder Kratzwunden, die die Haut durchdringen; Kontamination von Schleimhäuten mit Speichel (z.B. Lecken, Spritzer), Kontakt von Hautverletzungen oder Schleimhäuten mit Impfstoffködern: Aktive plus passive Immunisierung. Impfmodus präexpositionell 4 Impfungen mit 1 ml Impfstoff zum Zeitpunkt: 0/1/12 Mon. i.m. oder nach Schnellschema: 0/7/21 o. 28 d/2–5 J. Nebenwirkungen Gelegentlich am Injektionsort Druckgefühl. Schutzwirkung Präexpositionell sehr sicher, postexpositionell abhängig von der Lokalisation der Wunde. Ungünstige Prognose bei Bisswunden im Gesicht. Wiederimpfung Nach 3 J. 1 Dosis. Immunisierung bei Bissverletzungen abhängig vom Zeitpunkt der letzten Impfung: 1–5 J. → 0–3 d; > 5 J. → entsprechend ungeimpften Personen. Kontraindikationen Bei postexpositioneller Impfung keine, da Erkrankung immer tödlich verläuft. Präexpositionelle Impfung: Allg. KI ( 9.2.1 ). Passive Immunisierung Nach Exposition Simultanimpfung (PEP). Typhus-Impfung Typhus 9.3.1 . Indikation Reisen (Mittelmeer, Orient, Fernreisen). Kinder ab vollendetem 2. Lj. Nur aktive Immunisierung möglich, passive nicht verfügbar. Lebendimpfstoff, oral Impfstoff Lebendimpfstoff = Oralimpfstoff, sehr sicherer Totimpfstoff Thyphim Vi® 1 × s.c., besser 1 × 0,5 ml Thyphim Vi® s.c./i.m. Impfmodus An Tag 1, 3 und 5 je 1 Kps., z.B. Typhoral L®, 1 h vor der Mahlzeit. Nebenwirkungen Gelegentlich Typhus:ImpfungÜbelkeit, Durchfall, Temperaturerhöhung. Schutzwirkung 1 Wo. nach der 3. Impfung; schützt nur gegen Salmonella typhi, nicht jedoch gegen Salmonella paratyphi oder Enteritis-Salmonellen. Schutzrate: 40–60 %; Dauer: 3 J. Wiederimpfung Nach 2 J. Vor oder bei massiver Exposition jährlich. Kontraindikationen Kinder 98 % Hühnereiweiß-Allergie; wegen evtl. verstärkter NW möglichst 4 Wo. Abstand zu anderen Lebendimpfungen Hepatitis A (TI) Länder mit schlechter Hygiene Grundimmunisierung nach Angaben des Herstellers, 2 bzw. 3 Injektionen i.m. 0/4 Wo./1 J. 2 Wo. nach 2. Impfung; 10 J.; > 95 % Test auf HA-Ak, bei Geburtsjahrgängen vor 1950 Hepatitis B (TI) Längere Aufenthalte in Afrika und Fernost Grundimmunisierung: 0/4 Wo./6 Mon. i.m. 2 Wo. nach 2. Impfung ca. 10 J., 95 % Titerkontrolle bei Risikogruppen ( 9.2.3 ) Japan-Enzephalitis (TI) Südostasien (> 1 Mon. Aufenthalt in ländlichen Gebieten, nicht für "Normal-Touristen") Grundimmunisierung: s.c. Tag 0/7/30 2 Wo. p.v.; 1–4 J.; > 90 % Bezug durch Internationale Apotheke Meningokokken (TI) Typ A, C, W, Y Sahelzone, Vorderasien, tropisches Südamerika (Arbeitsaufenthalte, Trekkingreisen) Kinder: Ab 7. Lebensmon. und Erw.: s.c. 1 Dosis 1 Wo. p.v.; 1–3 J.; 98 % Schützt nicht gegen den in Europa häufigen Typ B Tollwut (präexpositionell, TI) Südostasien, Südamerika (> 3 Mon. Aufenthalt, berufl. Exposition) Grundimmunisierung: i.m. 0/4 Wo./1 J. 2 Wo. nach 2. Impfung; 2–5 J.; 99 % Bei Exposition Auffrischung mit 2 Impfungen: i.m. Tag 0/3 Typhus (TI) Grundimmunisierung: i.m. oder s.c. 1 Dosis Erw. und Kinder ab 2. Lj. 1 Wo. p.v.; 3 J.; ca. 50–60 % Keine bes. LI = Lebendimpfstoff, TI = Totimpfstoff, p.v.: post vaccinem Tab. 9.7 Zeitplan für Reiseimpfungen Mindestabstände von Impfungen zum Abreisetermin. Bei Grundimmunisierungen darf der Mindestabstand zwischen 1. und 2. Impfung nicht unterschritten werden. Woche vor der Abreise 6. 5. 4. 3. 2. 1. Maßnahme Diphtherie/Tetanus G1 G2, A FSME G1 G2, A Gelbfieber (LI) X Hepatitis-A-Immunglobulin X Hepatitis-A-Impfung G1, A Hepatitis-B- und Kombinationsimpfung Hep. A/Hep. B G1 G2, A Malaria-Prophylaxe X Meningokokken X Polio tot (Salk) G1 G2, A Tollwut G1 G2 A G3 Typhus ∗ X G1: Grundimmunisierung, 1. Dosis; G2: 2. Dosis; G3: 3. Dosis. A: Auffrischimpfung ∗ Bei oralem Lebendimpfstoff Abstand zu Gelbfieber-Impfung und zu Malariaprophylaxe beachten ( 9.2.3 ). • Bei Kindern mit Diphtherie:ImpfungKombinationsimpfstoffen gegen Diphtherie (D), Tetanus (T), Haem. infl. Typ B (HiB), Pertussis (P) und Hep. B. Verfügbare Präparate Tab. 9.2 . • Impfstoff für Kinder bis zum vollendeten 5. Lj.: 75 IE Toxoid. Vom 5. bis zum vollendeten 6. Lj. mit reduzierter Dosis = 30 IE impfen (0,2 ml des Kinderimpfstoffs). Ab dem 6. Lj. Erw.-Impfstoff "d" mit 5 IE Toxoid (Diphtherie-Adsorbat-Impfstoff für Erw.) anwenden! • Erw. mit Grundimmunisierung: Alle 10 J. 1 Injektion (= 0,5 ml) mit Kombinationsimpfstoff Tetanus-Diphtherie (Td-Impfstoff; bei Antikoagulation auch s.c. Gabe möglich). Bei ausreichender Tetanus-Immunität Impfung mit "d"-Diphtherie-Monovakzine. Nebenwirkungen Am Impftag oder dem darauf folgenden Tag Temperatur ↑ bei 2–3 % der Säuglinge. Selten verstärkte Lokalreaktion. "d"-Impfstoff bisher ohne Begleiterscheinungen. Schutzwirkung 1 Wo. nach der 2. Impfung; Konversionsrate: Über 98 %; Schutzquote: Ca. 80 %. Keine letalen Verläufe bei Geimpften. Dauer: Primär 5–7 J. Nach Booster im 7. J. wesentlich länger. Wiederimpfungen 1. Booster vor Schulbeginn, 2. mit ca. 10 J., danach alle 10 J. Bei Expositionsgefahr Auffrischimpfung mit 1 Dosis, wenn Grundimmunisierung mehr als 3 J. zurückliegt. Bei Verletzungen Impfung mit Tetanus-Monovakzine, wenn letzte Td-Impfung 99 %; Schutzquote: > 99 %; Dauer: 10–15 J. Amtliche Anerkennung: 10 J. Wiederimpfung Alle 10 J. bei Bedarf. Kontraindikationen Klinisch relevante Hühnereiweißallergie, manifeste Immundefizienz; Gravidität, außer bei Expositionsgefahr. Keine Impfung von Kindern 12 J. 600 mg/d in 1 Einzeldosis für 4 d Schwangere ggf. Ceftriaxon 250 mg i.m. Chemoprophylaxe der HiB-Meningitis Erfolgt mit Rifampicin oder Cetriaxon 250 mg einmalig i.m. Indikation Asymptomatische HiB-Träger jeden Alters können Zweiterkr. verursachen! Deshalb alle Personen (einschließlich Erw., auch geimpfte Personen) im Haushalt des Erkrankten einbeziehen, falls in der Familie mind. ein Kind 12 J. 600 mg/d in 1 Einzeldosis für 4 d Schwangere ggf. Ceftriaxon 250 mg i.m. Hepatitis-A-Impfung Kostenübernahme indikationsbezogen durch Krankenkassen. Indikation Reisende in Gebiete mit hoher Hep.-A-Durchseuchung (Naher Osten, Afrika, Südostasien, Südamerika), Indikationsimpfung für Angehörige von Entwicklungsdiensten, Hep.-A-gefährdetes Personal medizinischer Einrichtungen und Laboratorien, Personal in Kindertagesstätten, Einrichtungen für geistig Behinderte, Abwasserentsorgung, homosexuelle Männer, Hämophile. Impfstoff Totimpfstoffe mit oder ohne Hepatitis:ImpfungAluminiumhydroxid, z.B. Havrix® 720 Kinder, Havrix® 1440, VAQTA®, VAQTA® Kinder. Impfmodus 2 Injektionen à 1 ml i.m. bevorzugt in den M. deltoideus im Abstand von 6–12 Mon. Nebenwirkungen Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen, verstärkte Lokalreaktion. Schutzwirkung Nach der 1. Impfung; Konversionsrate: 95 %. Dauer: > 10 J. werden angenommen. Impfschutz für 1 J. besteht ab 10 Tage nach der ersten Impfung. Eine eingeleitete Grundimmunisierung bei Reisenden (im Ausland, nach der Rückkehr) und bei Kontaktpersonen sollte in jedem Fall vervollständigt werden. Wiederimpfung Alle 10 J. Kontraindikationen Strenge Indikationsstellung bei Schwangeren. Besonderheiten Vor Impfung Anti-HAV-Titer bestimmen, sofern Pat. vor 1950 geboren wurde; bei Antikoagulation ist auch s.c. Gabe möglich. Tab. 9.10 Schema der Hepatitis-A-Immunprophylaxe für Reisende (Virushepatitiden 8.7.1) Grundimmunisierung 1. Impfung an Tag 2. Impfung 3. Impfung ≥ 4 Wo. Zeit • HA-Monovakzine 0 6–12 Mon. – • Kombinationsimpfung HA/HB 0 4–6 Wo. 6–12 Mon. 3 Wo. Zeit HA-Monovakzine 0 6–12 Mon. – Passive Immunisierung Impfstoff Nichtspezifisches Gammaglobulin (IgG). Indikation Wenn aktive Immunisierung nicht möglich ist. PEP bei engem Kontakt zu Erkrankten bzw. Konsum HA-Virus-kontaminierter Nahrungsmittel. Immunglobulingabe bis zu 10 d nach Exposition sinnvoll. Strenge Indikationsstellung! Dosierung Herstellerinformationen beachten. Aktive Immunisierung Impfmodus Grundimmunisierung: Bei den neueren Impfstoffen (z.B. Havrix 1440®, VAQTA®) 2 Impfungen in den M. deltoideus. Schema 0/6–12 Mon. Passive Immunisierung Impfstoff Nichtspezifisches Gammaglobulin (IgG). Indikation Wenn aktive Immunisierung nicht möglich ist. PEP bei engem Kontakt zu Erkrankten bzw. Konsum HA-Virus-kontaminierter Nahrungsmittel. Immunglobulingabe bis zu 10 d nach Exposition sinnvoll. Strenge Indikationsstellung! Dosierung Herstellerinformationen beachten. Aktive Immunisierung Impfmodus Grundimmunisierung: Bei den neueren Impfstoffen (z.B. Havrix 1440®, VAQTA®) 2 Impfungen in den M. deltoideus. Schema 0/6–12 Mon. Hepatitis-B-Impfung Virushepatitiden 8.7.1. Indikation Öffentlich empfohlene Standardimpfung bei Kindern ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendlichen bis zum 17. Lj. Indikationsimpfung bei Personen mit bes. Risiko, sowie als PEP. • Präexpositionell: (Indikationsgruppen 1–7). – Hep.-B-gefährdetes medizinisches und zahnmedizinisches Personal; andere Personengruppen mit Infektionsrisiko durch Blutkontakt zu Infizierten, z.B. Polizisten, Hepatitis:Hepatitis B, ImpfungFeuerwehr (1). – Dialysepat., Pat. mit häufiger Übertragung von Blut und Blutprodukten, Pat. vor ausgedehnten chirurgischen Eingriffen (2). – Pat. mit chron. Lebererkr., die HbsAg-neg. sind (3). – Durch Kontakt mit HBsAg-Trägern in Familie und Gemeinschaft (z.B. in Kindergärten, Kinderheimen, Pflegestätten) potenziell gefährdete Personen (4). – Pat. in psychiatrischen Anstalten oder Einrichtungen für Zerebralgeschädigte oder Verhaltensgestörte (5). – Bes. Risikogruppen, wie z.B. homosexuell aktive Männer, i.v. Drogenabhängige, Prostituierte, länger einsitzende Strafgefangene (6). – Reisende in Regionen mit hoher Hep.-B-Prävalenz (Entwicklungsländer) bei längerfristigem Aufenthalt (ab 6 Mon.) oder bei zu erwartenden engen Kontakten zur einheimischen Bevölkerung (7). • Postexpositionell: Nach Verletzung mit möglicherweise HBV-kontaminierten Gegenständen (z.B. Injektionsnadel). Neugeborene HBsAg-pos. Mütter. Schwangere werden entsprechend den Mutterschaftsrichtlinien nach der 32. SSW möglichst nahe dem Geburtstermin auf HBsAg untersucht. Bei pos. Ergebnis wird unmittelbar post partum mit der Hep.-B-Immunisierung des Kindes (Simultanimpfung) begonnen. HBsAG-positive Schwangere sollten unbedingt durch in der Hepatologie Erfahrene betreut werden. Wenn der pos. HBsAg-Status der Mutter erst nachträglich bekannt wird, kann die passive Immunisierung bis 7 Tage post partum nachgeholt werden. Nach abgeschlossener Grundimmunisierung beim Kind serol. Kontrolle (Anti-HBs, HBsAg). Impfstoff Totimpfstoff, Adsorbatimpfstoff, z.B. Engerix® B Kinder, Engerix® B Erw., HBV VAXPRO®. Impfmodus • Grundimmunisierung mit 3 Impfungen, Injektion bevorzugt in den M. deltoideus. Schema: 0/4 Wo./6–12 Mon. Titerkontrolle 4 Wo. nach der 3. Dosis. • PEP innerhalb von 24 h durchführen (sinnvoll bis 72 h). Gabe von Hep.-B-Immunglobulin (je nach Präparat i.v. oder i.m.). Simultan an anderer Stelle Applikation der Hep.-B-Vakzine. Anschließend bei fehlender bzw. unvollständiger Grundimmunisierung die weiteren Impfungen entsprechend den Richtlinien nachholen. Tab. 9.11 Hepatitis-B-Postexpositionsprophylaxe (PEP) Vorgeschichte Keine Maßnahmen Anti-HBs-Bestimmung Anti-HBs (IU/l) Hep.-B-Vakzine Hep.-B-Immunglobulin Anti-HBs nach Grundimmunisierung ≥ 100 IU/l und letzte Impfung vor ≤ 5 J. Ja Innerhalb der letzten 12 Mon. wurde ein Anti-HBs-Wert ≥ 100 IU/l gemessen Ja Anti-HBs nach Grundimmunisierung war ≥ 100 IU/l und letzte Impfung vor 5–10 J. Nein Ja Nein Nicht oder unvollständig geimpft, der Impferfolg wurde nie kontrolliert ≥ 100 Nein Nein Lowresponder (Anti-HBs nach Grundimmunisierung 1 : 40); Schutzquote: Je nach Antigenkorrespondenz: Schutz vor Erkr. 50–60 %; Schutz vor schweren Verläufen 90 %. Wiederimpfung Jährlich im Herbst vor Beginn der Grippesaison. Kontraindikationen Klinisch relevante Hühnereiweißallergie. Besonderheiten Schützt nur gegen Erkrankung an Influenza, nicht jedoch vor grippalen Infekten. Bei Antikoagulation ist auch s.c. Gabe möglich. Passive Immunisierung Wegen Variabilität des Erregers nicht sinnvoll, ggf. Chemoprophylaxe mit dem Neuraminidase-Inhibitor Zanamivir (z.B. Relenza®) oder Oseltamivir (Tamiflu®)( 9.4.4 , Influenza). Japan-Enzephalitis-Impfung Indikation Reiseimpfung: Längerer Aufenthalt (> 4 Wo.) während der Übertragungszeit (in den Tropen während der Regenzeit, in gemäßigten Zonen v.a. von Spätsommer bis Frühherbst) in Endemiegebieten (Süd- und Ostasien), Bevölkerung in Endemiegebieten. Impfstoff Totimpfstoff; abgetötete Viren (Korea), z.T. auch chinesische Lebendvaccine. Impfmodus 3 Impfungen von 1,0 ml s.c. an den Tagen 0/7/30. KinderJapan-Enzephalitis, Impfung 90 %; Dauer: mind. 4 J. Wiederimpfung Nach 1–4 J. Kontraindikationen Keine bes., allg. KI ( 9.2.1 ). Besonderheiten Impfstoff in Deutschland nicht zugelassen, kann aber über eine internationale Apotheke bezogen werden. Passive Immunisierung Nicht verfügbar. Masern-Impfung Masern 16.7.1. Indikation • Öffentlich empfohlene Impfung bei Kindern ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendlichen. Ziel ist die Eradikation der Masern. • Öffentlich empfohlen für ungeimpftes medizinisches Personal und Personal in der Kinderbetreuung. Anamnestische Angaben über durchgemachte Masern ohne serol. Kontrolle nicht verwertbar. Vorgesehene Impfung zum Impftermin in jedem Fall Masern:Impfungdurchführen, da NW Masern-Mumps-Röteln (Kombinationsimpfstoff)bei Impfung nach durchgemachter Infektion oder mehrfachen Impfungen nicht bekannt. Impfstoff Lebendimpfstoff, attenuiertes Masernvirus, Kühlkette! Gegen Licht und Wärme sehr empfindlich. Monovakzine, z.B. Masern-Impfstoff Merieux® (Amp. 0,5 ml) und Bestandteil von Kombinationsimpfstoffen ( Tab. 9.2 ). Impfmodus Grundimmunisierung bei Kindern und Jugendlichen mit 2 Impfdosen im Abstand von mind. 4 Wo., auch bei Erw. möglichst 2 Impfdosen s.c. (oder i.m.). Vorzugsweise mit Kombinationsimpfstoff MMR ( 9.2.2 , Tab. 9.3 ). Nebenwirkungen Bei 3–5 % der Geimpften um den 9. d p.v. Temperaturerhöhung, z.T. mit uncharakteristischem Exanthem, "Impfmasern" mit mildem Verlauf. Schutzwirkung Sofort! Bis zu 48 h nach Exposition auch Inkubationsimpfung möglich; Konversionsrate: 97–99 %; Dauer: Wahrscheinlich lebenslang. Kontraindikationen AIDS, Allergie gegen Hühnereiweiß ( 9.2.4 ). Besonderheiten Nach Immunglobulin- und Serumgaben 4 Mon. Abstand zur Impfung! Inkubationsimpfung nur bis 48 h nach Exposition sinnvoll. Kinder mit asymptomatischer HIV-Infektion können geimpft werden. Passive Immunisierung Keine. Meningokokken-Impfung Indikation • Pat. mit Asplenie, geplanter Splenektomie, Hypogammaglobulinämie, Komplementdefekten. • Impfung gegen Meningokokken der Serogruppe C: Von der STIKO empfohlene Standardimpfung für alle Kinder > 1 J. (1 Impfdosis ab dem 12. LM, z.B. Menjugate® Kit, Neis-Vac-C®). • Reiseimpfung für Reisen in Endemiegebiete (Sahelzone, Vorderasien, tropisches Südamerika): Impfung gegen Meningokokken der Serogruppen A, C, W, Y; Zur Meningokokken:ImpfungEinreise nach Saudi-Arabien ist eine AC oder ACWY-Impfung erforderlich, z.B. für Mekka-Pilger. Gültigkeit: 10 d–3 J. nach der letzten Impfung. Bei Kindern 3 Mon. 10 mg/kg KG/d in 2 Einzeldosen für 2 d 1–12 J. 20 mg/kg KG/d in 2 Einzeldosen für 2 d ≤ 450 mg/d > 12 J. 1200 mg/d in 2 Einzeldosen für 2 d Schwangere Ggf. Ceftriaxon 250 mg i.m. Chemoprophylaxe einer Meningokokken-Meningitis Erfolgt mit Rifampicin, Ciprofloxacin oder Ceftriaxon. Indikation Asymptomatische Meningokokken-Träger jeden Alters können Zweiterkr. verursachen! Deshalb alle Personen (einschließlich Erw., auch geimpfte Personen) im Haushalt des Erkrankten einbeziehen, falls in der Familie mind. ein Kind 3 Mon. 10 mg/kg KG/d in 2 Einzeldosen für 2 d 1–12 J. 20 mg/kg KG/d in 2 Einzeldosen für 2 d ≤ 450 mg/d > 12 J. 1200 mg/d in 2 Einzeldosen für 2 d Schwangere Ggf. Ceftriaxon 250 mg i.m. Mumps-Impfung Indikation Öffentlich empfohlene Standardimpfung für Kinder ab vollendetem 2. Lebensmon. und Jugendliche. Erw. ohne Impfung, seroneg. exponierte Personen (z.B. Lehrer). Öffentlich empfohlen für medizinisches Personal und Personal in der Kinderbetreuung. Anamnestische Angaben über durchgemachte Mumps ohne serol. Kontrolle nicht verwertbar. Vorgesehene Impfung zum Impftermin in jedem Fall durchführen, da NW bei Impfung nach durchgemachter Infektion oder mehrfachen Mumps:ImpfungImpfungen nicht bekannt. Impfstoff Lebendimpfstoff, attenuiertes Mumpsvirus. Sehr licht- und wärmeempfindlich: Kühlkette! Vorzugsweise als Kombinationsimpfstoff (MMR; Tab. 9.2 ). Impfmodus 1 Impfdosis, vorzugsweise mit Kombinationsimpfstoff MMR, z.B. M-M-R Vax®. Bei Kindern 2 Impfdosen ( 9.2.2 , Tab. 9.3 ). Nebenwirkungen Selten, in der 2. Wo. p.v. Temperaturerhöhung. Schutzwirkung 2 Wo. p.v.; Konversionsrate: Ca. 97 %; Dauer: Wahrscheinlich lebenslang. Kontraindikationen Immundefizienz, AIDS, Allergie gegen Hühnereiweiß ( 9.2.4 ). Besonderheiten Mumpsimpfung kann bei Kindern mit asymptomatischer HIV-Inf. erfolgen. Passive Immunisierung Nutzen von Immunglobulinen nicht erwiesen. Pertussis-Impfung Pertussis 16.7.7. Indikation Öffentlich empfohlen für Säuglinge ab vollendetem 2. Lebensmon., Kinder und Jugendliche bis zum 18. Lj. Personal in Päd. und Infektionsmedizin sowie in Gemeinschaftseinrichtungen für das Vorschulalter. Impfstoff Totimpfstoff. Kombinationsimpfstoffe mit Diphtherie, Pertussis, Polio, HiB, Hep. B ( Tab. 9.2 ). Wegen besserer Verträglichkeit gereinigten, azellulären Impfstoff bevorzugen. Pertussis:Impfung Impfmodus Kinder ab vollendetem 2. Lebensmon.: 4 Impfungen, Pneumokokken:Impfung3 × 0,5 ml i.m. im Abstand von je 4–8 Wo., 0,5 ml i.m. 6–12 Mon. nach der 3. Impfung, Auffrischimpfung ab vollendetem 5.–6. Lj. Erw. 1 Impfung. Nebenwirkungen • Ganzkeimvakzine: Schmerzen lokal. Bei Reflux ins Unterhautfettgewebe Induration, Rötung, Schwellung. Fieber bei ca. 20 % am selben oder folgenden Tag, in 0,1 % zerebraler Krampfanfall. • Azellulärer Impfstoff: Gelegentlich verstärkte Lokalreaktion. Schutzwirkung 2 Wo. nach der 2. Impfung; Konversionsrate: > 80 %; Dauer: Ca. 10 J., Dauer der Immunität nach Erkrankung 15–20 J. Wiederimpfung Alle 10 J. Die Immunität ist nicht dauerhaft; trotz vollständiger Grundimmunisierung als Kind kann der Erw. später wieder an Pertussis erkranken, der hier atypisch als hartnäckige Bronchitis verläuft. Kontraindikationen • Ganzkeimvakzine: HIV-pos. Kinder. Progressive neurologische Erkr., Epilepsie → nur gesunde Kinder impfen. • Azellulärer Impfstoff: Unverträglichkeit von Ganzkeim- oder azellulärem Pertussisimpfstoff, progressive neurologische Erkr. (bisher keine Erfahrung). Passive Immunisierung Nutzen von Immunglobulinen nicht gesichert. Chemoprophylaxe Bei ungeimpften Kindern mit Kontakt zu Erkrankten, auch bei beruflicher oder familiärer Exponierten: Erythromycin 50 mg/kg KG/d für 2 Wo. o. Roxithromycin, Clarithromycin o. Azithromycin in Standarddosierung für 2 Wo. Pneumokokken-Impfung Indikationen Personen mit erhöhter gesundheitlicher Gefährdung infolge einer Grundkrankheit oder ungeimpftes Personal in Einrichtungen der Pädiatrie. • Alter > 60 J. • Immundefekte: Asplenie, Hypogammaglobulinämie, Komplementdefekt, HIV-Inf., Sichelzellenanämie, Leukosen, nach KMT. • Chron. Erkrankungen von Herz, Kreislauf, Atemwegen, Niere. • Diabetes mellitus. • Liquorfistel. • Vor Pneumokokken:ImpfungEinleitung einer immunsuppressiven Ther. • Von der STIKo empfohlene Standardimpfung für alle Kinder. Impfstoff • Konjugat-Impfstoff: Die 7 häufigsten Kapselpolysaccharidtypen konjugiert mit einem Trägerprotein; Totimpfstoff, z.B. Prevenar®. Geeignet für Kinder ab 2 Mon. bis zum vollendeten 2. Lj. Immunisierung: – Sgl. und KK 90), Totimpfstoff; Pneumovax® 23. Geeignet für Kinder ab dem vollendeten 2. Lj., Jugendliche und Erw. Immunisierung: Kinder ab vollendetem 2. Lj. und Erw.: 1 × 0,5 ml s.c. oder i.m. Nebenwirkungen Stärkere Lokalreaktion, Schwellung regionaler LK, Fieber, Abgeschlagenheit. Bei i.c. Injektion können schwere Lokalreaktionen auftreten. Kontraindikationen Schwere Pneumokokken-Inf. oder -Impfung während der letzten 5 J. Schutzwirkung 2 Wo. p.v.; Konversionsrate: > 90 %; Dauer: 3–5 J.; Schutzquote: 75–80 %. Wiederimpfung Bei fortbestehender Ind. Erw. alle 6 J., Kinder 80 %, postexpositionell ca. 60 %. Passive Immunisierung Indikation Röteln-Prävention bei seroneg. Schwangeren bis zur 16. SSW. Zuverlässige Unterdrückung einer Infektion nur innerhalb der ersten 4 d nach Röteln-Exposition. Bei Exposition vor der 6. SSW erneute Immunglobulingabe nach 4–5 Wo. Impfstoff Es gibt keine Präparate mit spezifischem Röteln-Immunglobulin. Zur PEP bei seroneg. Schwangeren Human-Immunglobulin mit ausreichender Röteln-AK-Konz. verwenden, z.B. Beriglobin®, Sandoglobulin®. Dos. Röteln:passive Immunisierungnach Angaben des Herstellers. Schutzwirkung Präventiv > 80 %, postexpositionell ca. 60 %. Tetanus-Impfung Indikation Bundesweit öffentlich empfohlene Standardimpfung aller Kinder und Erwachsenen wegen permanenter Infektionsgefahr. Impfstoff Totimpfstoff, Toxoid. Der Standardimpfstoff zur Grundimmunisierung und für den Verletzungsfall enthält 40 IE Tetanus-Toxoid. Impfstoffe mit 2 IE Tetanus-Toxoid, z.B. Td-Rix®, sind nur zur Auffrischimpfung bei abgeschlossener Grundimmunisierung geeignet. Impfmodus Grundimmunisierung bei Kindern ab vollendetem 2. Tetanus:ImpfungLebensmon. mit 3 Injektionen, z.B. Tetanol® à 0,5 ml i.m. Impfschema: 0/4–8 Wo./7–12 Mon. Bei Kindern mit Kombinationsimpfstoff gegen Diphtherie (D), Tetanus (T), Haem. infl. Typ B (HiB), Pertussis (P), Hep. B, Polio ( Tab. 9.2 ). Auffrischung im 5.–6.. Lj., Wiederholung alle 10 J. Vorgehen bei Verletzungen Bei nachgewiesener und glaubhafter kompletter Grundimmunisierung: • Letzte Impfung vor ≤ 5 J.: Keine Impfung. • Letzte Impfung vor 5–10 J.: – Bei sauberen geringfügigen Wunden keine Impfung. – Bei allen anderen Verletzungen 1 Impfung. • Letzte Impfung vor > 10 J.: 1 Impfung. Keine, fragliche oder unvollständige Grundimmunisierung: • Bei geringfügigen, sauberen Verletzungen: Beginn oder Vervollständigung der Grundimmunisierung. • Bei allen anderen Verletzungen: Impfung + Tetanus-Immunglobulin. • Bei 2 Tetanus-Impfungen in der Vorgeschichte und wenn die Verletzung nicht länger als 24 h zurückliegt, nur Impfung und kein Tetanus-Immunglobulin. Durchführung der Simultanimpfung Simultan und kontralateral zur Impfinjektion 250 IE Antitoxin, z.B. Tetagam N® 1 Amp.. Bei schweren Blutverlusten, vernachlässigten Wunden oder ausgedehnten Verbrennungen: 500 IE Antitoxin, z.B. Tetagam N® 2 Amp. intradeltoidal, anschließend Grundimmunisierung vervollständigen. Im Zweifelsfall und bei V.a. Unverträglichkeit Titer bestimmen. Nebenwirkungen Stärkere Lokalreaktion, mitunter starke Induration mit Rötung, Schwellung und Überwärmung bei Hyperimmunisierung. Schutzwirkung 1 Wo. nach 2. Impfung der Grundimmunisierung; Konversionsrate: 99 %; Dauer: Mindestens 10 J. Wiederimpfung Im 10. Lj., dann alle 10 J. 1 Impfdosis (0,5 ml i.m.), vorzugsweise mit Td-Impfstoff, z.B. Td-pur®, "d": Diphtherie. Bei Verletzungen Impfung mit Tetanus-Monovakzine, wenn letzte Td-Impfung 0,01 IE Antitoxin/ml. Gehäuft Impf-Unverträglichkeiten, wenn Titer > 4 IE Antitoxin/ml. Kontraindikationen Keine bes., allg. KI ( 9.2.1 ). Sehr gut verträglicher Impfstoff. Besonderheiten Auch als Kombinationsimpfstoffe DT, DPT, DPT-Polio und Td (nach dem 7. Lj.). Bei Antikoagulanzienther. kann das Antitoxin Tetagam N® auch s.c. angewendet werden. Passive Immunisierung Nach Verletzung ohne ausreichenden Impfschutz Simultanimpfung (s.o.). Vorgehen bei Verletzungen Bei nachgewiesener und glaubhafter kompletter Grundimmunisierung: • Letzte Impfung vor ≤ 5 J.: Keine Impfung. • Letzte Impfung vor 5–10 J.: – Bei sauberen geringfügigen Wunden keine Impfung. – Bei allen anderen Verletzungen 1 Impfung. • Letzte Impfung vor > 10 J.: 1 Impfung. Keine, fragliche oder unvollständige Grundimmunisierung: • Bei geringfügigen, sauberen Verletzungen: Beginn oder Vervollständigung der Grundimmunisierung. • Bei allen anderen Verletzungen: Impfung + Tetanus-Immunglobulin. • Bei 2 Tetanus-Impfungen in der Vorgeschichte und wenn die Verletzung nicht länger als 24 h zurückliegt, nur Impfung und kein Tetanus-Immunglobulin. Durchführung der Simultanimpfung Simultan und kontralateral zur Impfinjektion 250 IE Antitoxin, z.B. Tetagam N® 1 Amp.. Bei schweren Blutverlusten, vernachlässigten Wunden oder ausgedehnten Verbrennungen: 500 IE Antitoxin, z.B. Tetagam N® 2 Amp. intradeltoidal, anschließend Grundimmunisierung vervollständigen. Im Zweifelsfall und bei V.a. Unverträglichkeit Titer bestimmen. Tollwut-Impfung Tollwut 9.4.8 . Indikation Postexpositionell; präexpositionell öffentlich empfohlen für Risikogruppen (z.B. Förster, Veterinäre). Reiseimpfung bei Reisen nach Afrika, Asien und Südamerika. Impfstoff Totimpfstoff. Impfmodus postexpositionell (PEP) Sofortiger Beginn der Behandlung! Wunddesinfektion, wenn vertretbar, mit 70 % Ethanol, sonst PVP-Jod, z.B. Betaisodona®; bei richtiger Durchführung Reduktion des Infektionsrisikos um 90 %. 1 Dosis, Tollwut:Impfungz.B. Rabipur®, 1 ml i.m. an den Tagen: 0–3–7–14–28. Am Tag 0 zusätzlich homologes Tollwut-Hyperimmunglobulin, z.B. Berirab® Tollwut Immunglobulin, exakt 20 IE/kg KG i.m., nicht überdosieren! So viel wie möglich vom Immunglobulin um die Verletzungen herum instillieren, den Rest entfernt vom Verletzungsort injizieren. Empfehlungen der WHO zur Postexpositionsprophylaxe bei Tollwut Tollwut:Postexpositionsprophylaxe • Expositions-Kategorie 1: Berühren oder Füttern von Tieren; Belecken der intakten Haut, Berühren eines Impfstoffköders bei intakter Haut: Keine Schutzimpfung, Vorsichtsmaßnahme! Bislang ist noch keine Tollwutinf. durch ein solches Ereignis ausgelöst worden. • Expositions-Kategorie 2: Knabbern an der intakten Haut; oberflächliche Kratzer, die nicht zum Bluten führten; Belecken der nicht intakten Haut: Aktive Schutzimpfung durchführen. • Expositions-Kategorie 3: Jegliche Bissverletzung oder Kratzwunden, die die Haut durchdringen; Kontamination von Schleimhäuten mit Speichel (z.B. Lecken, Spritzer), Kontakt von Hautverletzungen oder Schleimhäuten mit Impfstoffködern: Aktive plus passive Immunisierung. Impfmodus präexpositionell 4 Impfungen mit 1 ml Impfstoff zum Zeitpunkt: 0/1/12 Mon. i.m. oder nach Schnellschema: 0/7/21 o. 28 d/2–5 J. Nebenwirkungen Gelegentlich am Injektionsort Druckgefühl. Schutzwirkung Präexpositionell sehr sicher, postexpositionell abhängig von der Lokalisation der Wunde. Ungünstige Prognose bei Bisswunden im Gesicht. Wiederimpfung Nach 3 J. 1 Dosis. Immunisierung bei Bissverletzungen abhängig vom Zeitpunkt der letzten Impfung: 1–5 J. → 0–3 d; > 5 J. → entsprechend ungeimpften Personen. Kontraindikationen Bei postexpositioneller Impfung keine, da Erkrankung immer tödlich verläuft. Präexpositionelle Impfung: Allg. KI ( 9.2.1 ). Passive Immunisierung Nach Exposition Simultanimpfung (PEP). Typhus-Impfung Typhus 9.3.1 . Indikation Reisen (Mittelmeer, Orient, Fernreisen). Kinder ab vollendetem 2. Lj. Nur aktive Immunisierung möglich, passive nicht verfügbar. Lebendimpfstoff, oral Impfstoff Lebendimpfstoff = Oralimpfstoff, sehr sicherer Totimpfstoff Thyphim Vi® 1 × s.c., besser 1 × 0,5 ml Thyphim Vi® s.c./i.m. Impfmodus An Tag 1, 3 und 5 je 1 Kps., z.B. Typhoral L®, 1 h vor der Mahlzeit. Nebenwirkungen Gelegentlich Typhus:ImpfungÜbelkeit, Durchfall, Temperaturerhöhung. Schutzwirkung 1 Wo. nach der 3. Impfung; schützt nur gegen Salmonella typhi, nicht jedoch gegen Salmonella paratyphi oder Enteritis-Salmonellen. Schutzrate: 40–60 %; Dauer: 3 J. Wiederimpfung Nach 2 J. Vor oder bei massiver Exposition jährlich. Kontraindikationen Kinder 5 mg Prednison-Äquivalent) und Zytostatika. Keine Lebend-, aber alle Totimpfstoffe. Relative Ausnahme: Varizellen. • Frühgeburtlichkeit: Frühgeborene sollten, unabhängig vom Geburtsgewicht, gemäß dem empfohlenen Impfalter geimpft werden. HIV und AIDS Impfungen induzieren die HI-Virus-Replikation um das 3- bis 5fache. Die HIV-Konz. erreicht 4–6 Wo. p.v. wieder die Ausgangswerte. Bedeutung für die Progression bisher unklar. Impfungen unter antiretroviralem Schutz durchzuführen, ist eine mögliche Vorsichtsmaßnahme. • Asymptomatische HIV-Inf.: Keine Einschränkung. • AIDS: Nur Totimpfstoffe und passive Immunisierung. • HIV-pos. Kinder: Wegen übertragener mütterlicher Ak kann erst Impfung:bei HIV und AIDSim Alter von 1 J. endgültig festgestellt werden, ob das Kind tatsächlich infiziert wurde. Empfehlungen der STIKO in dieser Situation: Für alle Impfungen gelten die gleichen Ind. und KI wie für Nichtinfizierte. Allergische Reaktionen Eine allergische Reaktion auf eine Impfung kann durch den Impfstoff selbst oder durch Hilfsstoffe im Präparat verursacht sein. Um die Immunität abzuklären, zuerst eine Titerbestimmung der entsprechenden AK durchführen. Wenn kein erhöhter AK-Titer vorliegt, allergologische Abklärung auf Hilfsstoffe. Hühnereiweiß Impfstoffe gegen folgende Krankheiten enthalten Hühnerprotein (nach abnehmender Konz. geordnet): Gelbfieber, Influenza, Masern, Mumps, FSME, Tollwut. V.a. Hühnereiweißallergie vor Impfung allergologisch abklären. Einteilung der allergischen Reaktion in 3 Schweregrade. • Grad 1: Allg. Unverträglichkeit von Hühnereiern ohne allergische oder anaphylaktische Symptome, neg. Hauttest: Keine Gegenanzeigen Hühnereiweiß (Impfsera)für Impfungen, auch nichtImpfung:allergische Reaktion gegen Influenza oder Gelbfieber. • Grad 2: Im Hauttest nachgewiesene, jedoch klinisch nicht bedeutsame Hühnereiweißallergie: Gelbfieber-Impfung ist relativ kontraindiziert und darf nur in dringlichen Fällen gegeben werden. Impfung gegen Influenza in der Klinik. • Grad 3: Pat. mit Sofortreaktion nach Verzehr von Hühnereiweiß mit Urtikaria, Laryngo-/Bronchospasmus, RR-Abfall. Impfung gegen Influenza und Gelbfieber kontraindiziert. Impfung gegen Masern, Mumps, FSME und Tollwut (präexpositionell) in der Klinik. Neomycin U.a. in folgenden Impfstoffen enthalten: Masern, Mumps, Röteln, Polio (je nach Hersteller unterschiedlich). Notfallseren, Informationen Im hinteren Abschnitt der Roten Liste® (rosa Seiten), befindet sich ein Verzeichnis von Notfalldepots, in denen folgende Seren und Plasmaderivate aufbewahrt werden: Botulismus-Antitoxin vom Pferd, Hep.-B-Immunglobulin, polyvalentes Immunglobulin, Schlangengift-Immunserum polyvalent Europa, Tetanus-Immunglobulin, Tollwut-Immunglobulin, Tollwut-Impfstoff, Varicella-Zoster-Immunglobulin. C1-Inhibitor, Diphtherie-Antitoxin vom Pferd, Obidoxim, Prothrombin-Konzentrat (PPSB), Röteln-Immunglobulin. Zusätzlich in der Roten Liste®: • Verzeichnis von Informations- und Behandlungszentren für Vergiftungen für Deutschland und Europa ( Tab. 3.3 ). • Impfempfehlungen; Impfvorschriften für den internationalen Reiseverkehr. • Empfehlungen zur Malariaprophylaxe. Impfungen und Schwangerschaft Nach Möglichkeit sollten Impfungen außerhalb der Grav. erfolgen. Wegen einer theoretisch möglichen Gefährdung des Feten keine parenteralen Lebendimpfstoffe anwenden. • Unbedenkliche Impfungen in der Grav.: Typhus, Tollwut (vitale Ind.), Polio-Salk, Tetanus, Hep. A, Hep. B, Diphtherie, Influenza. • Impfung nur bei sorgfältiger Risikoabwägung wegen fehlender Erfahrung bei Schwangeren: FSME, Meningokokken, Masern (bei Bedarf passive Immunisierung), Impfung:bei SchwangerenPneumokokken, Mumps, Japan-Enzephalitis. • Kontraindiziert in der Grav.: Varizellen, Masern und Röteln: Bei Bedarf passive Immunisierung, versehentliche Impfung während der Grav. keine Ind. für Schwangerschaftsabbruch. Impfen bei bestimmten Grundkrankheiten Grundsätzlich keine KI für Standardimpfungen sind: Asthma, Mukoviszidose, Zöliakie, chron. Herz-/Lungenerkr., Down-Syndrom, stabile neurologische Erkr., Unterernährung, hypotrophe Kinder und Frühgeborene, postnataler Ikterus. • Diabetes mellitus: Dringlich indizierte Impfungen sind Influenza, Mumps, Pneumok. • Herzfehler (angeboren/erworben): Dringlich indizierte Impfung:bei chron. KrankheitenImpfungen sind Influenza, Pneumok.Diabetes mellitus:indizierte Impfungen, Masern. • Geistig/körperlich Behinderte: Dringlich indizierte Impfungen sind Tetanus, Polio; Hep. A, Hep. B, Diphtherie. • Mukoviszidose: Dringlich indizierte Impfungen sind Pertussis, Influenza und Pneumok., Masern. • Sichelzellenanämie: Dringlich indizierte Impfungen sind Influenza, Pneumokokken. • Herz:Herzfehler, indizierte ImpfungenLungenemphysem, chron. Bronchitis: Dringlich indizierte Impfungen sind Influenza, Pneumok. • Autoimmunerkr., Rheumatische Erkr.: Oft keine Impfung während aktiver Krankheitsphasen oder immunsuppressiver Ther. möglich; in diesen Fällen Mukoviszidose:indizierte Impfungenauf passive Immunisierung ausweichen. • Antikoagulation/Gerinnungsstörungen: Gelbfieber u.a. Lebendimpfungen (Thrombozytenabfall 4–6 d p.v.Sichelzellenanämie:indizierte Impfungen). Möglichst keine i.m. Injektionen, ggf. auf Impfstoffe ausweichen, die s.c. appliziert werden können. • Elektive operative Eingriffe: 2 Wo. Abstand zu Impfungen wegen möglicher Impfreaktionen. • Z.n. Splenektomie: Dringlich indizierte Impfung: Pneumok., Hib, Meningokokken. • Immunsuppression: Systemische Glukokortikoide (> 5 mg Prednison-Äquivalent) und Zytostatika. Keine Lebend-, aber alle Totimpfstoffe. Relative Ausnahme: Varizellen. • Frühgeburtlichkeit: Frühgeborene sollten, unabhängig vom Geburtsgewicht, gemäß dem empfohlenen Impfalter geimpft werden. HIV und AIDS Impfungen induzieren die HI-Virus-Replikation um das 3- bis 5fache. Die HIV-Konz. erreicht 4–6 Wo. p.v. wieder die Ausgangswerte. Bedeutung für die Progression bisher unklar. Impfungen unter antiretroviralem Schutz durchzuführen, ist eine mögliche Vorsichtsmaßnahme. • Asymptomatische HIV-Inf.: Keine Einschränkung. • AIDS: Nur Totimpfstoffe und passive Immunisierung. • HIV-pos. Kinder: Wegen übertragener mütterlicher Ak kann erst Impfung:bei HIV und AIDSim Alter von 1 J. endgültig festgestellt werden, ob das Kind tatsächlich infiziert wurde. Empfehlungen der STIKO in dieser Situation: Für alle Impfungen gelten die gleichen Ind. und KI wie für Nichtinfizierte. Allergische Reaktionen Eine allergische Reaktion auf eine Impfung kann durch den Impfstoff selbst oder durch Hilfsstoffe im Präparat verursacht sein. Um die Immunität abzuklären, zuerst eine Titerbestimmung der entsprechenden AK durchführen. Wenn kein erhöhter AK-Titer vorliegt, allergologische Abklärung auf Hilfsstoffe. Hühnereiweiß Impfstoffe gegen folgende Krankheiten enthalten Hühnerprotein (nach abnehmender Konz. geordnet): Gelbfieber, Influenza, Masern, Mumps, FSME, Tollwut. V.a. Hühnereiweißallergie vor Impfung allergologisch abklären. Einteilung der allergischen Reaktion in 3 Schweregrade. • Grad 1: Allg. Unverträglichkeit von Hühnereiern ohne allergische oder anaphylaktische Symptome, neg. Hauttest: Keine Gegenanzeigen Hühnereiweiß (Impfsera)für Impfungen, auch nichtImpfung:allergische Reaktion gegen Influenza oder Gelbfieber. • Grad 2: Im Hauttest nachgewiesene, jedoch klinisch nicht bedeutsame Hühnereiweißallergie: Gelbfieber-Impfung ist relativ kontraindiziert und darf nur in dringlichen Fällen gegeben werden. Impfung gegen Influenza in der Klinik. • Grad 3: Pat. mit Sofortreaktion nach Verzehr von Hühnereiweiß mit Urtikaria, Laryngo-/Bronchospasmus, RR-Abfall. Impfung gegen Influenza und Gelbfieber kontraindiziert. Impfung gegen Masern, Mumps, FSME und Tollwut (präexpositionell) in der Klinik. Neomycin U.a. in folgenden Impfstoffen enthalten: Masern, Mumps, Röteln, Polio (je nach Hersteller unterschiedlich). Notfallseren, Informationen Im hinteren Abschnitt der Roten Liste® (rosa Seiten), befindet sich ein Verzeichnis von Notfalldepots, in denen folgende Seren und Plasmaderivate aufbewahrt werden: Botulismus-Antitoxin vom Pferd, Hep.-B-Immunglobulin, polyvalentes Immunglobulin, Schlangengift-Immunserum polyvalent Europa, Tetanus-Immunglobulin, Tollwut-Immunglobulin, Tollwut-Impfstoff, Varicella-Zoster-Immunglobulin. C1-Inhibitor, Diphtherie-Antitoxin vom Pferd, Obidoxim, Prothrombin-Konzentrat (PPSB), Röteln-Immunglobulin. Zusätzlich in der Roten Liste®: • Verzeichnis von Informations- und Behandlungszentren für Vergiftungen für Deutschland und Europa ( Tab. 3.3 ). • Impfempfehlungen; Impfvorschriften für den internationalen Reiseverkehr. • Empfehlungen zur Malariaprophylaxe. 9.3 Bakterielle Infektionen Tab. 9.13 Häufige bakterielle Infektionen in der Praxis Krankheitsbild Typische Erreger Therapie Angina tonsillaris (23.3.2) Viren (40 %), A-Streptok. (30 %) Penicillin-V, Cefalexin Akute Bronchitis (12.3.2) Viren (90 %), Mykoplasmen Evtl. Doxycyclin Chron. Bronchitis (12.4) Haem. infl., Pneumok., Moraxella Antiobstruktive Ther. (12.6.3), Rauchverbot. Antibiotika nur bei akuter Exazerbation: Amoxicillin/Clavulansäure, Cephalosporin 2, Chinolone 4 Sinusitis (23.5.2) Pneumok., Haem. infl., Staph. aureus, Streptok. Schleimhautabschwellende Mittel, Kamillendampf; Amoxicillin/Clavulansäure, Cephalosporin 2, Makrolide (z.B. Azithromycin) Otitis media (23.6.3) Pneumok., Haem. infl., Moraxella, Staph. aureus Wärmebehandlung des Ohres, schleimhautabschwellende Mittel Amoxicillin/Clavulansäure, Cephalosporin 2, Makrolide (z.B. Azithromycin) Otitis externa (23.6.1) Staph. aureus, Pseudomonas, Candida Nach Grunderkr. und Erreger, ggf. Abstrich und Kultur Pneumonie (12.3.3) Pneumok. (60 %), Mykoplasmen, Haem. infl., Legionellen, Chlamydia pneumoniae 12.3.3 HWI (13.3.2) E. coli, Enterokokken Reichlich trinken; Co- trimoxazol, Ciprofloxacin Urethritis (13.3) Chlamydien, Ureaplasmen; Gonokokken Doxycyclin, Ciprofloxacin, Partnerbehandlung Tab. 9.16 Übersicht Zoonosen Leitsymptome Tier Exposition Erreger/Erkrankung Fieber, Allgemeinsymptome, Pneumonie Schaf, Ziege Aerosole Q-Fieber ( 9.3.11 , Tab. 9.19 ) Schaf, Ziege, Rind Milchprodukte, Ausscheidungen Brucellose ( 9.3.4 ) Geflügel, Tauben Aerosole Ornithose ( 9.3.11 , Tab. 9.19 ) Fieber, Allgemeinsymptome, Arthralgien Ratte, Nagetier Biss, Kratzer Rattenbissfieber ( 9.3.11 , Tab. 9.19 ) Lokalinf., abszedierend oder phlegmonös Hund Biss Pasteurellose ( 9.3.11 , Tab. 9.19 ) Katze Biss, Kratzer Pasteurellose ( 9.3.11 , Tab. 9.19 ), Katzenkratzkrankheit ( 9.3.8 ) Schwein, Fisch, Wildtier Hautkontakt zu inf. Fleisch Erysipeloid ( 9.3.11 , Tab. 9.19 ) Ratte, Nagetier Biss Rattenbissfieber ( 9.3.11 , Tab. 9.19 ) Angaben zur Meldepflicht 9.11 Tab. 9.17 Neurotrope Erreger und ihre Diagnostik Meningitis, lymphozytär Häufig Lyme-Borrelien ( 9.3.3 ) Serologie, Liquor-PCR Treponema pallidum (Lues, 9.8.2 ) Serologie Mumps-Virus (16.7.8) Serologie, Liquor-PCR Coxsackie-/ECHO-Viren ( 9.4.5 ) Serologie, Liquor-PCR Selten Adeno-Viren Serologie, Liquor-PCR Herpes-(HSV-2-)Virus ( 9.4.1 ) PCR FSME ( 9.4.7 ) Serologie Polio-Viren ( 9.4.9 ) Serologie, Liquor-PCR Enzephalitis/Enzephalopathie HSV-1 (50 % aller Fälle! 9.4.1 ) PCR, Serologie FSME-Virus ( 9.4.7 ) Serologie, PCR Enterovirus Typ 70, 71 Serologie, PCR Treponema pallidum (Lues, 9.8.2 ) Serologie Varicella-Zoster-Virus ( 9.4.2 ) Serologie, PCR Masern-Virus (16.7.1) Serologie, PCR HIV ( 9.9.5 ) Serologie, PCR Influenza-Virus ( 9.4.4 ) Serologie, PCR Tollwut-Virus (Rabies; 9.4.8 ) Antigen, PCR, Serologie Guillain-Barré-Syndrom EBV ( 9.4.3 ) Serologie, PCR Influenza-/Parainfluenza-Virus ( 9.4.4 ) Serologie, PCR HBV (8.7.1) Serologie, PCR CMV ( 9.4.6 ) Serologie, PCR VZV ( 9.4.2 ) Serologie, PCR HSV ( 9.4.1 ) Serologie, PCR Schlaffe Lähmungen Polio-Viren ( 9.4.9 ) Serologie, PCR Enterovirus 70, 71 Serologie, PCR Coxsackie A7, A9, B2–B5 ( 9.4.5 ) Serologie, PCR Clostridium botulinum (Toxin → Botulismus Tab. 9.14 ) Serologie VZV ( 9.4.2 ) Serologie Tab. 9.18 Antibiose bei Lyme-Borreliose Krankheitsstadium Antibiotische Behandlung Erythema migrans Erwachsene Doxycyclin 2 × 100 mg p.o. für 3 Wo. Kinder > 8 J. Amoxicillin 3 × 500 mg p.o. für 3 Wo. Alternativen Erythromycin 4 × 500 mg p.o. für 3 Wo. Cefuroximaxetil 3 × 500 mg p.o. für 3 Wo. Schwangere, Stillzeit Amoxicillin 3 × 500 mg p.o. für 3 Wo. Kinder 3 Wo. Stuhl; Antigen-EIA, Mikroskopie, PCR Metronidazol 3 × 500 mg für 7–10 d ∗ bei unkompliziertem Verlauf nur symptomatische Ther. 9.3.1 Salmonellen Salmonellen-Gastroenteritis Erreger Salmonella (= S.) enteritidis, S. typhimurium und weitere 1600 Serotypen. Erregerreservoir im Tierreich, Inf. durch Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln, z.B. Geflügel-, Rind-, Schweinefleisch, Wurst, Eiern. Seit 1993 Vorkommen auch in Gewürzen (Paprika, Peperoni). Übertragung von Mensch zu Mensch durch Schmierinf. möglich, aber selten. Für Erkr. hohe Erregerdosis erforderlichSalmonellen:Gastroenteritis. Klinik 8–48 h p.i. Lebensmittelvergiftung:SalmonelloseÜbelkeit, Erbrechen, später Gastroenteritis:Salmonellenkrampfartige Leibschmerzen und Durchfall: Einige dünne Stühle bis zu massiver wässriger, blutiger oder eitriger Diarrhoe. Dauer: 3 d. In der Hälfte der Fälle Fieber; Dauer > 3 d spricht für septischen Verlauf oder Organinf. Verlaufsformen: Gastroenteritis 75 %, Sepsis mit oder ohne Gastroenteritis 10 %, septische Lokalherde 5 %, z.B. Osteomyelitis, Arthritis, Meningitis. Asymptomatische Ausscheider 1 %. Diagnostik Erregernachweis in Stuhl und asservierten Nahrungsmitteln. Bei Fieber und/oder blutiger Diarrhoe Blutkulturen. Therapie Bei unkomplizierter Erkr. nur ausreichende orale Flüssigkeitszufuhr. Bei Fieber oder blutigem Stuhl Antibiose mit Ciprofloxacin p.o. 2 × 500 mg tägl. (wirkt gegen fast alle bakt. Enteritiserreger). Bei schwerem Verlauf Klinikeinweisung, v.a. Kinder und alte Menschen ( cave: Exsikkose). Nach Ende der Erkr. Stuhlkontrollen auf Erregerausscheidung. Meist spontane Elimination innerhalb weniger Wo. Bei Erregerausscheidung > 3 Mon. Versuch der medikamentösen Eradikation mit Ofloxacin 2 × 500 mg für 10 d. Bei V.a. Lebensmittelinf. durch öffentlich in Verkehr gebrachte Nahrungsmittel den Lebensmittelkontrolldienst (Landratsamt/Kreisgesundheitsamt) verständigen. Beschäftigte im Lebensmittelbereich: Tätigkeitsverbot, bis 3 Stuhlproben an aufeinander folgenden Tagen neg. sind. Bei Salm.-Ausscheidung > 3 Mon. hinaus entschädigt der Staat den Pat. für den Verdienstausfall. Typhus Erreger Salmonella typhi und paratyphi. In Europa selten. Übertragung durch kontaminierte Lebensmittel und Trinkwasser. Klinik Unbehandelt charakteristischer 4-wöchiger Ablauf. • 1.Wo.: Stufenförmig ansteigendes Fieber, Leibschmerzen, Kopfschmerzen, relative Bradykardie. • 2.Wo.: Verstopfung, Husten, Splenomegalie, Roseolen am Oberbauch. • 3.Wo.: Somnolenz, erbsbreiartige Durchfälle. • 4.Wo.: BesserungTyphus. Komplikationen Darmperforation,Salmonellen:Typhus Organinf. (Meningitis, Arthritis, Cholezystitis). Diagnostik Blutkultur (zu 90 % während der 1. Wo. pos.). Ab 2. Wo. Erregernachweis in Stuhl und Urin sowie Serologie (Widal). Großes BB: Leukos normal oder ↓, Eosinopenie. Therapie Im Frühstadium ambulante Behandlung mit Ciprofloxacin 2 × 500 mg p.o. tägl. mind. für 2 Wo. empfohlen, ist dies nicht möglich, Klinikeinweisung. Impfung bei Fernreisenden ( 9.2.3 ). 9.3.2 Anthrax (Milzbrand) Erreger Bacillus anthracis. Zoonose, weltweites Vorkommen, in Europa sehr selten. Inf. durch Berührung von verseuchten Tierkadavern und -häuten von Pflanzenfressern; Inhalation oder Verschlucken von infektiösem Staub. Anthrax-Sporen bleiben über Jahrzehnte infektionstüchtig. In Deutschland seit 2000 keine humane Erkr. Verdacht, Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Abhängig von Eintrittspforte 3 Milzbrandformen: Haut-, Lungen-, Darmmilzbrand. Zunächst AnthraxLokalinf.,Milzbrand später Generalisation des Err., Auslösung der Krankheitserscheinungen durch das Anthraxtoxin. Bei generalisierter Inf. immer letaler Verlauf. • Hautmilzbrand: Bei 95 % nach 2–7 d rasch aufschießende schmerzlose Papel, dann Übergang in ein mit schwärzlichem Schorf bedecktes Geschwür, das von einem ausgedehnten Erythem umgeben ist. Chirurgische Maßnahmen sind kontraindiziert. Durch Toxineinschwemmung hohes Fieber, Hypotonie, Arrhythmie. KO: Sepsis bei 5–20 %. Bei Chemother. gute Prognose. • Lungenmilzbrand: Nach 2- bis 3-tägigen grippalen Symptomen schlagartig Bronchopneumonie mit hohem Fieber, Hämoptoe, Schock. Prognose bei manifester Pneumonie infaust. • Darmmilzbrand (sehr selten): Initial Leibschmerzen, später perakut blutige Diarrhoe, Peritonitis, Schock. Prognose infaust. Diagnostik Erregernachweis durch Abstriche von Hautläsionen, Nase, Rachen; aus Blutkulturen, mikroskopisch. Therapie Sofortiger Therapiebeginn bei Verdacht bzw. Therapie aller potenziell Exponierten für 8 Wo. mit Ciprofloxacin 2 × 500 mg/d oder Doxycyclin 2 × 100 mg/d. Ein Human-Impfstoff ist weltweit nicht zugelassen. Bei Anthrax-Erkr. stationäre Behandlung. 9.3.3 Lyme-Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi (Spirochäte); durch Zecken (10–30 % infiziert) auf den Menschen übertragen. Übertragung durch Stechfliegen unwahrscheinlich. Vorgehen bei Zeckenbiss Zeckenbiss:ErstmaßnahmenFrühzeitige Entfernung einer festgesaugten Zecke (Übertragung erst ab 24 h Saugdauer, Risiko proportional zur Dauer). Große vollgesaugte Zecken mit den Fingern herausdrehen; kleine, noch leere Zecken mithilfe einer Pinzette entfernen, wobei der Zeckenkörper nicht gequetscht werden darf, um Inokulation des infektiösen Speichels zu vermeiden. Vom Ersticken mit Öl oder Klebstoff wird abgeraten; durch verlängerten Kontakt und verstärkte Speichelabsonderung der Zecke erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Inf. Der in der Wunde verbliebene Zeckenkopf ist nicht infektiös und kann mit spitzer Pinzette entfernt werden. Von Chemoprophylaxe nach Zeckenbiss wird abgeraten; Risiko von Unverträglichkeitund schlechter Effektivität. Abb. 9.2 Abschätzung der Saugdauer bei Zecken Klinik Einteilung des Krankheitsverlaufs in 3 Stadien möglich, allerdings individuell sehr variabel. Frühstadium kann übersprungen werden oder in Spätstadien nur ein einzelnes Symptom vorhanden sein. Hohe Spontanheilungsrate im Frühstadium. Dennoch zur Prävention Borreliose:Lyme-Borreliosegefährlicher Spätmanifestationen Lyme-Borreliose immer antibiotische Behandlung. Erythema migrans (Frühstadium): • Lokalbefund: An der Bissstelle oft Papel mit Hyperpigmentation. Von dort sich zentrifugal ausbreitendes Erythem (über 7–10 d, aber bis zu 1 Mon. möglich), Kriterium: Durchmesser ≥ 5 cm, später mit zentraler Abblassung. Verlauf über 3–6 Wo. Nur 10–30 % der Pat. können sich an Zeckenbiss erinnern. • Begleitsymptome: Allgemeinbeschwerden 80 %, Müdigkeit 54 %, Myalgie 44 %, Arthralgie 44 %, Kopfschmerzen 42 %, Fieber mit E*(*rythema migrans (Borreliose)*)*Schüttelfrost 40 %, Nackensteifigkeit 35 %, Appetitlosigkeit 26 %, Lymphadenopathie 26 %. Selten: Fazialislähmung. Spätstadien: Lyme-Meningitis: • Begleitsymptome: Kein bzw. leichtes Fieber (37,5–38,5°C); Allgemeinsymptome (40 %): Müdigkeit, Übelkeit, Appetitlosigkeit, Gewichtsabnahme; Muskel- und Gelenkschmerzen (20–30 %); geringer Meningismus, milder Kopfschmerz. Hirnnervenausfälle (50 % d.F.): Zu 80–90 % N. facialis betroffen. Selten Nn. oculomotorius, trochlearis und abducens. DD: MS, andere Inf. des ZNS (21.5) → Facharztüberweisung. • Periphere Lyme-MeningitisNeuropathie: Meningitis:Lyme-Radikulopathie, überwiegend im Bereich des Zeckenbisses. Über Wo. anhaltende, wandernde Schmerzen, v.a. nachts. Lyme-Arthritis: Chron., intermittierende, mono- oder oligoartikuläre Arthritis der großen Gelenke, v.a. des Knies ohne systemische Symptome. DD: Arthritiden (18.1). Neuroborreliose: 1,5–15 J. nach Erstinf. Multifokaler Befall des ZNS in wechselnder Ausprägung, Abgrenzung zur MS schwierig. Symptome: Meningitis, Myelitis, Hirnnervenausfälle, Enzephalitis, Mono- und Polyneuritis, Sensibilitätsstörungen, Ataxie, Para- und Tetraparesen, Blasenstörungen, epileptische Anfälle, psychische Auffälligkeiten. Sonstige Spätstadien: Haut: Acrodermatitis chronica atrophicans (atrophische, gefältelte Haut, wie "Zigarettenpapier"); Herz: Myokarditis, Pankarditis, Arrhythmien. Diagnostik Bei verdächtigen Hauterscheinungen (Erythema migrans), unklaren rheumatischen Beschwerden oder neurologischen Störungen (z.B. Fazialisparese) nach Zeckenbiss oder -exposition fragen. In Spätstadien erschwert die Vielfalt möglicher Symptome die Diagnose. Serologie: • Borrelien-Ak: Erhöhte Titer treten auch bei klinisch Gesunden auf. Seroprävalenz von Borrelien-Ak in Mitteleuropa: Gesunde Normalbevölkerung 10 %, Wald- und Landarbeiter 12,5–30 % → Bestimmung von IgG- und IgM-AK (quantitativ EIA). Nur wenn pos., weitere Differenzierung mit Immunoblot. In Zweifelsfällen trotz neg. EIA Immunoblot anfordern, weil dieser wesentlich größeres Antigenspektrum abdeckt. – Erythema migrans: Serokonversion (EIA) zu 35 % bei Erstvorstellung, zu 85 % ein Mon. nach Diagnosestellung. – Lyme-Meningitis: Serologie nahezu immer pos. – Lyme-Arthritis: Serologie meist pos., PCR aus Synovialflüssigkeit bei unbehandelten (!) Pat. zu 85 % pos. • TPHA-Test bei neurologischer Symptomatik zum Ausschluss einer Lues (ebenfalls Spirochäten, daher Kreuzreaktion möglich). Jeder pos. Ak-Befund im ELISA muss durch einen Immunoblot bestätigt werden. Cave: Bislang ist noch kein serol. Aktivitätsparameter verfügbar. Wegen langsamer Serokonversion muss die Diagnose "Lyme-Borreliose" häufig klin. gestellt werden. Liquor: • Lyme-Meningitis: Befund ähnlich wie bei viraler Meningitis. In 80 % d.F. Pleozytose (100–1000/3 Zellen) zu über 90 % Lymphozyten. Eiweißerhöhung (bis 1 g/dl). Intrathekale Synthese von IgG, IgM, IgA; bevorzugt IgM-Bildung. • Neuroborreliose: Lymphozytose (300/3 Zellen), mäßige Eiweißerhöhung (1g/dl), normale Glukose. Entscheidend: Intrathekale AK-Produktion oder positive PCR. PCR: • Arthritis: Aus Synovialflüssigkeit zu 85 % pos. • Meningitis: Aus Liquor zu 40–50 % pos. • Neuroborreliose: Aus Liquor zu 54 % pos. Bei völlig unauffälligem Laborbefund ist eine chron. Lyme-Borreliose unwahrscheinlich. Cave: Erfolg der Ther. nur klinisch beurteilbar. Wenn trotz lege artis durchgeführter Ther. die Symptome persistieren, muss die Diagnose "Borreliose" verworfen werden. In frühen Stadien oft rascher Abfall des Titers spezifischer Ak, in Spätstadien hingegen Persistenz hoher Ak-Titer bzw. nur sehr langsamer Rückgang. Titer-Kontrolle frühestens 6 Mon. nach Ther. sinnvoll. Keine zuverlässige Immunität nach durchgemachter Borreliose, Reinf. möglich. Prognose In Frühstadien: Hohe Spontanheilungsrate. In Spätstadien: Unbehandelt Remissionen der Beschwerden, jedoch nur selten Erregerelimination. Ansprechrate der antibiotischen Ther.: 80–95 %. Residualschäden insgesamt: Ca. 5 %. 9.3.4 Brucellose Erreger B. melitensis (Schafe und Ziegen, am häufigsten), B. abortus (Rind, M. Bang), B. suis (Schwein), B. canis (Hund), B. ovis (Hase), B. neotomae (Ratten). Zoonose, weltweites Vorkommen. Inf. durch direkten Kontakt zu erkrankten Tieren (perkutan) oder Trinken nicht-pasteurisierter Schafs- oder Ziegenmilch (Käse!). Erhöhtes Infektionsrisiko für Veterinäre, Beschäftigte in Landwirtschaft und Fleischverarbeitung. Die meisten Inf. Maltafiebererfolgen im Morbus:BangAusland (z.B. Mittelmeerraum, "BrucelloseMaltafieber"). Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Bang, MorbusVielgestaltig und uncharakteristisch. IKZ 1 Wo. bis mehrere Mon. (!), dann meist schleichender Beginn mit Kopf-, Gelenk- und Gliederschmerzen und chron. Fieber über Wo. bis Mon. (septisch, kontinuierlich oder undulierend). Schwellung von Milz und Lk (50 %), Hepatomegalie 25 %. KO: Endokarditis, Osteomyelitis, Meningoenzephalitis. Diagnostik Gezielte Anamnese (berufliche Exposition, Ernährung, Auslandsreise). Leukozytenzahl normal oder ↓, Granulozytopenie, relative Lymphozytose (80 %). Ak-Titeranstieg (Titer ≥ 1 : 100), Erregernachweis in Blutkulturen, Urin, Liquor, evtl. in Biopsien. Cave: Falsch-positive Reaktionen finden sich bei Yersinia-enterocolitica- und Cholerainfektionen bzw. nach Choleraimpfung. Therapie Schwierig. Trotz wirksamer antibiotischer Ther. häufig Rezidive. In komplizierten Fällen Klinikeinweisung. Doxycyclin 200 mg/d plus Rifampicin für 6–12 Wo., bei Neurobrucellose o. Endokarditis länger. Alternative: Co-trimoxazol 2 × 480 mg/d, plus Rifampicin 600 mg/d. Cave: Resistenzen gegen Rifampicin möglich. BB-Kontrollen. 9.3.5 Listeriose Erreger Listeria monocytogenes. Zoonose. Ubiquitäres Vorkommen in der Natur, Inf. durch direkten Kontakt zu infizierten Tieren oder durch Milch und Milchprodukte (bes. Camembert). Wachstum des Err. auch bei +4°C (Kühlschrank); wird durch Pasteurisierung nicht vollständig inaktiviert. Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Erkr. selten. Manifeste Erkrankungen v.a. bei Schwangeren und älteren Personen mit konsumierender Grunderkr. sowie bei NG. Krankheitsbilder: • Systemische Inf.: Sepsis, ListerioseMeningitis, Enzephalitis, selten auch Endokarditis. Oft uncharakteristische, grippeähnliche Symptome. Pathohistologisch 2 Verlaufsformen: Akut-eitrige Entzündung und granulomatöse Verlaufsform mit Abszessbildung, sog. Listeriomen. • Schwangeren-Listeriose: Grippaler bis septischer Verlauf vorwiegend im letzten Trimenon. Bei schwerem Verlauf Abort bzw. Gefahr der Frühgeburt. • Neugeborenen-Listeriose: Durch intrauterine oder perinatale Inf., Manifestation als septische Neugeborenen-Granulomatose. Diagnostik Erregernachweis aus Blutkulturen, Liquor oder Biopsien. Serologie unzuverlässig. Therapie Klinikeinweisung zur i.v. Antibiose (Amoxicillin plus Aminoglykosid); Expositionsprophylaxe v.a. für Schwangere indiziert: H-Milch; kein Camembert, Kontakt zu Kühen, Schafen, Schweinen meiden. 9.3.6 Diphtherie Erreger Corynebacterium diphtheriae. In Mitteleuropa selten, meist importierte Fälle aus Osteuropa. Übertragung durch Tröpfcheninf. Schleimhautschädigung durch Toxinbildung. IKZ 3–12 d, Manifestation bei 20 % der Infizierten. Durch Toxinfernwirkung Myokarditis und Polyneuritis möglich. Verdacht, Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik • Lokale, benigne Rachendiphtherie (mäßiges Fieber, typischer DiphtherieLokalbefund): Großflächig entzündetes Tonsillengebiet mit Corynebacterium diphtheriaePseudomembranen (fest haftende weiß-graue Beläge aus nekrotischem Material, beim Ablösen kommt es zur Blutung), süßlicher Foetor ex ore, Schwellung des Rachens und der regionalen Lk, Höhepunkt der Erkr. nach 3–5 d. KO: Larynxdiphtherie mit bellendem Husten und Stridor ("echter" Krupp). • Andere lokale Manifestationen: Nasendiphtherie (blutiger Schnupfen), Augendiphtherie,Rachen:Diphtherie Nabeldiphtherie. • Toxische, maligne Diphtherie: Myokarditis, Herz-Kreislauf-Versagen, unstillbares Erbrechen, Haut- und Schleimhautblutungen. Bei Abwehrschwäche oder als KO einer lokalen Diphtherie. Diagnostik Klinischer Aspekt (liegt Grundimmunisierung > 10 J. zurück, sind schwere Verläufe möglich). Erregernachweis aus Nasen-, Rachenabstrich. Cave: Pseudomembranen vorher ablösen. Therapie Klinikeinweisung schon bei Verdacht zur Antibiose (Penicillin-G oder Erythromycin). Bei Kontaktpersonen des Erkrankten Chemoprophylaxe (Penicillin G oder Erythromycin) und Auffrischimpfung schon nach 5 Jahren ( 9.2.3 ). 9.3.7 Chlamydia-trachomatis-Infektionen Krankheitsbilder Trachom (Serotypen A–C); unspezifische Genitalinf., Neugeborenen-Pneumonie, Einschlusskörperchen-Konjunktivitis (Serotypen D–K); Lymphogranuloma venereum (Serotypen L1–L13; 9.8.5 ). Klinik Dysurie, Pollakisurie, Urethralsekretion, vaginaler Fluor. Sonst.: Pneumonie, Konjunktivitis. Komplikationen • Bei chron. Inf.: Salpingitis (14.3.3) mit ektopischen Schwangerschaften oder Sterilität, reaktive Chlamydia:trachomatisArthritis. • Sexuelle Übertragung. • TrachomNeugeborenen-Inf.: Übertragung unter der Geburt führt beim NG zu Einschlusskörperchen-Konjunktivitis oder Pneumonie. Beim reifen NG relativ gutartiger Verlauf, bei Frühgeborenen schlechte Prognose. Deshalb bei Schwangeren konsequentes Chlamydien-Screening. Die Credé-Prophylaxe gegen Konjunktivitis ist wirkungslos, stattdessen PVP-Jod verwenden. Einschlusskörperchen-Konjunktivitis: Gutartiger Verlauf, spontane Abheilung nach 3–16 Mon., unter Ther. nach 2–3 d. • Trachom: Keratokonjunktivitis mit Entropium; v.a. in den Tropen und Subtropen verbreitet, bei langem Verlauf Erblindung. Diagnostik Abstriche von Urethra und Zervix für Gensonde oder PCR (s.a. 14.1.2), Urin-PCR, Sputum-PCR. Therapie In unkomplizierten Fällen Einmaldosis von Azithromycin 1 × 1 g = 1 × 4 Kps. à 250 mg. Alternative: Doxycyclin 2 × 100 mg für 7 d. In chron. Fällen Ther. mit Doxycyclin für mind. 20 d. Partnerbehandlung! 9.3.8 Katzenkratzkrankheit Erreger Rel. häufige Zoonose. Err.: Bartonella henselae. Übertragung durch Katzen 95 %, Hunde 4 %, 1 % ohne Tierkontakt. Inf. auch durch Belecken von Hautläsionen oder Schleimhäuten möglich. Klinik • Hautbefund: Nach 3–10 d Auftreten eines 3–5 mm großen Bläschens oder einer Pustel; später Umwandlung zur Papel, die mehrere d bis Mon. bestehen bleibt. Abheilung ohne Narbenbildung. Bei Einbringen von infektiösem Material in das Auge, Katzenkratzkrankheitkonjunktivales Granulom. • Lk: 2 Wo. (3–70 d) nach dem Kratzer schmerzhafte Schwellung eines oder mehrerer regionärer Lk. Größe 1–5 cm, selten größer. • Begleitsymptome: In 30 % d.F. Fieber; in 50 % d.F. Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen, Appetitlosigkeit. Komplikationen ZNS-Befall mit Krampfanfällen, fokalen Ausfällen, Neuroretinitis. Diagnostik Vorgeschichte, klin. Aspekt, Serologie. Aus Biopsiematerial PCR und Histologie. Differenzialdiagnose Malignes Lymphom, Mononukleose, Toxoplasmose. Therapie Symptomatisch, kühle Umschläge auf geschwollene Lk. Antibiotika nur bei KO, wirksam sind Makrolide, z.B. Azithromycin oder Gyrasehemmer wie Ciprofloxacin. Prognose Nahezu immer Restitutio ad integrum. Rückbildung der Lk-Schwellung über 2–6 Mon., in 2 % d.F. über 1–3 J. Bei Neuroretinitis in seltenen Fällen bleibende leichte Visuseinschränkung. 9.3.9 Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) Erreger E. coli, toxinbildende Stämme (Verotoxin, SLT = Shiga-like-Toxin), > 160 Serotypen. Inf. durch Genuss unpasteurisierter Milchprodukte, roher/unzureichend gegarter (Rind-)Fleischprodukte. Übertragung von Mensch zu Mensch durch Schmierinf. Direkte Übertragung vom Tier auf den Menschen selten. Niedrige Infektionsdosis (nur 100 Keime erforderlich). Bes. gefährdet sind Kinder 10 J. Umgebungsuntersuchungen sowie Kontrolluntersuchungen bei Rekonvaleszenten: Erregerausscheidung ca. 2–3 Wo., zu 10 % auch > 1 Mon. Überwachung und Berufsbeschränkungen ähnlich wie bei Salmonellosen, bis 3 Stuhlproben neg. sind. Kein Verzehr roher oder unzureichend gegarter Fleischprodukte durch Kinder 20 °C); Verzehr kontaminierter Muscheln Nekrotisierende Wundinf.; primäre Sepsis; bullöse Hautnekrose. Ungünstige Prognose Klinikeinweisung bei Verdacht Klinikeinweisung Ciprofloxacin i.v., Abtragung von Nekrosen, evtl. Schockther. 9.3.1 Salmonellen Salmonellen-Gastroenteritis Erreger Salmonella (= S.) enteritidis, S. typhimurium und weitere 1600 Serotypen. Erregerreservoir im Tierreich, Inf. durch Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln, z.B. Geflügel-, Rind-, Schweinefleisch, Wurst, Eiern. Seit 1993 Vorkommen auch in Gewürzen (Paprika, Peperoni). Übertragung von Mensch zu Mensch durch Schmierinf. möglich, aber selten. Für Erkr. hohe Erregerdosis erforderlichSalmonellen:Gastroenteritis. Klinik 8–48 h p.i. Lebensmittelvergiftung:SalmonelloseÜbelkeit, Erbrechen, später Gastroenteritis:Salmonellenkrampfartige Leibschmerzen und Durchfall: Einige dünne Stühle bis zu massiver wässriger, blutiger oder eitriger Diarrhoe. Dauer: 3 d. In der Hälfte der Fälle Fieber; Dauer > 3 d spricht für septischen Verlauf oder Organinf. Verlaufsformen: Gastroenteritis 75 %, Sepsis mit oder ohne Gastroenteritis 10 %, septische Lokalherde 5 %, z.B. Osteomyelitis, Arthritis, Meningitis. Asymptomatische Ausscheider 1 %. Diagnostik Erregernachweis in Stuhl und asservierten Nahrungsmitteln. Bei Fieber und/oder blutiger Diarrhoe Blutkulturen. Therapie Bei unkomplizierter Erkr. nur ausreichende orale Flüssigkeitszufuhr. Bei Fieber oder blutigem Stuhl Antibiose mit Ciprofloxacin p.o. 2 × 500 mg tägl. (wirkt gegen fast alle bakt. Enteritiserreger). Bei schwerem Verlauf Klinikeinweisung, v.a. Kinder und alte Menschen ( cave: Exsikkose). Nach Ende der Erkr. Stuhlkontrollen auf Erregerausscheidung. Meist spontane Elimination innerhalb weniger Wo. Bei Erregerausscheidung > 3 Mon. Versuch der medikamentösen Eradikation mit Ofloxacin 2 × 500 mg für 10 d. Bei V.a. Lebensmittelinf. durch öffentlich in Verkehr gebrachte Nahrungsmittel den Lebensmittelkontrolldienst (Landratsamt/Kreisgesundheitsamt) verständigen. Beschäftigte im Lebensmittelbereich: Tätigkeitsverbot, bis 3 Stuhlproben an aufeinander folgenden Tagen neg. sind. Bei Salm.-Ausscheidung > 3 Mon. hinaus entschädigt der Staat den Pat. für den Verdienstausfall. Typhus Erreger Salmonella typhi und paratyphi. In Europa selten. Übertragung durch kontaminierte Lebensmittel und Trinkwasser. Klinik Unbehandelt charakteristischer 4-wöchiger Ablauf. • 1.Wo.: Stufenförmig ansteigendes Fieber, Leibschmerzen, Kopfschmerzen, relative Bradykardie. • 2.Wo.: Verstopfung, Husten, Splenomegalie, Roseolen am Oberbauch. • 3.Wo.: Somnolenz, erbsbreiartige Durchfälle. • 4.Wo.: BesserungTyphus. Komplikationen Darmperforation,Salmonellen:Typhus Organinf. (Meningitis, Arthritis, Cholezystitis). Diagnostik Blutkultur (zu 90 % während der 1. Wo. pos.). Ab 2. Wo. Erregernachweis in Stuhl und Urin sowie Serologie (Widal). Großes BB: Leukos normal oder ↓, Eosinopenie. Therapie Im Frühstadium ambulante Behandlung mit Ciprofloxacin 2 × 500 mg p.o. tägl. mind. für 2 Wo. empfohlen, ist dies nicht möglich, Klinikeinweisung. Impfung bei Fernreisenden ( 9.2.3 ). Salmonellen-Gastroenteritis Erreger Salmonella (= S.) enteritidis, S. typhimurium und weitere 1600 Serotypen. Erregerreservoir im Tierreich, Inf. durch Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln, z.B. Geflügel-, Rind-, Schweinefleisch, Wurst, Eiern. Seit 1993 Vorkommen auch in Gewürzen (Paprika, Peperoni). Übertragung von Mensch zu Mensch durch Schmierinf. möglich, aber selten. Für Erkr. hohe Erregerdosis erforderlichSalmonellen:Gastroenteritis. Klinik 8–48 h p.i. Lebensmittelvergiftung:SalmonelloseÜbelkeit, Erbrechen, später Gastroenteritis:Salmonellenkrampfartige Leibschmerzen und Durchfall: Einige dünne Stühle bis zu massiver wässriger, blutiger oder eitriger Diarrhoe. Dauer: 3 d. In der Hälfte der Fälle Fieber; Dauer > 3 d spricht für septischen Verlauf oder Organinf. Verlaufsformen: Gastroenteritis 75 %, Sepsis mit oder ohne Gastroenteritis 10 %, septische Lokalherde 5 %, z.B. Osteomyelitis, Arthritis, Meningitis. Asymptomatische Ausscheider 1 %. Diagnostik Erregernachweis in Stuhl und asservierten Nahrungsmitteln. Bei Fieber und/oder blutiger Diarrhoe Blutkulturen. Therapie Bei unkomplizierter Erkr. nur ausreichende orale Flüssigkeitszufuhr. Bei Fieber oder blutigem Stuhl Antibiose mit Ciprofloxacin p.o. 2 × 500 mg tägl. (wirkt gegen fast alle bakt. Enteritiserreger). Bei schwerem Verlauf Klinikeinweisung, v.a. Kinder und alte Menschen ( cave: Exsikkose). Nach Ende der Erkr. Stuhlkontrollen auf Erregerausscheidung. Meist spontane Elimination innerhalb weniger Wo. Bei Erregerausscheidung > 3 Mon. Versuch der medikamentösen Eradikation mit Ofloxacin 2 × 500 mg für 10 d. Bei V.a. Lebensmittelinf. durch öffentlich in Verkehr gebrachte Nahrungsmittel den Lebensmittelkontrolldienst (Landratsamt/Kreisgesundheitsamt) verständigen. Beschäftigte im Lebensmittelbereich: Tätigkeitsverbot, bis 3 Stuhlproben an aufeinander folgenden Tagen neg. sind. Bei Salm.-Ausscheidung > 3 Mon. hinaus entschädigt der Staat den Pat. für den Verdienstausfall. Typhus Erreger Salmonella typhi und paratyphi. In Europa selten. Übertragung durch kontaminierte Lebensmittel und Trinkwasser. Klinik Unbehandelt charakteristischer 4-wöchiger Ablauf. • 1.Wo.: Stufenförmig ansteigendes Fieber, Leibschmerzen, Kopfschmerzen, relative Bradykardie. • 2.Wo.: Verstopfung, Husten, Splenomegalie, Roseolen am Oberbauch. • 3.Wo.: Somnolenz, erbsbreiartige Durchfälle. • 4.Wo.: BesserungTyphus. Komplikationen Darmperforation,Salmonellen:Typhus Organinf. (Meningitis, Arthritis, Cholezystitis). Diagnostik Blutkultur (zu 90 % während der 1. Wo. pos.). Ab 2. Wo. Erregernachweis in Stuhl und Urin sowie Serologie (Widal). Großes BB: Leukos normal oder ↓, Eosinopenie. Therapie Im Frühstadium ambulante Behandlung mit Ciprofloxacin 2 × 500 mg p.o. tägl. mind. für 2 Wo. empfohlen, ist dies nicht möglich, Klinikeinweisung. Impfung bei Fernreisenden ( 9.2.3 ). 9.3.2 Anthrax (Milzbrand) Erreger Bacillus anthracis. Zoonose, weltweites Vorkommen, in Europa sehr selten. Inf. durch Berührung von verseuchten Tierkadavern und -häuten von Pflanzenfressern; Inhalation oder Verschlucken von infektiösem Staub. Anthrax-Sporen bleiben über Jahrzehnte infektionstüchtig. In Deutschland seit 2000 keine humane Erkr. Verdacht, Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Abhängig von Eintrittspforte 3 Milzbrandformen: Haut-, Lungen-, Darmmilzbrand. Zunächst AnthraxLokalinf.,Milzbrand später Generalisation des Err., Auslösung der Krankheitserscheinungen durch das Anthraxtoxin. Bei generalisierter Inf. immer letaler Verlauf. • Hautmilzbrand: Bei 95 % nach 2–7 d rasch aufschießende schmerzlose Papel, dann Übergang in ein mit schwärzlichem Schorf bedecktes Geschwür, das von einem ausgedehnten Erythem umgeben ist. Chirurgische Maßnahmen sind kontraindiziert. Durch Toxineinschwemmung hohes Fieber, Hypotonie, Arrhythmie. KO: Sepsis bei 5–20 %. Bei Chemother. gute Prognose. • Lungenmilzbrand: Nach 2- bis 3-tägigen grippalen Symptomen schlagartig Bronchopneumonie mit hohem Fieber, Hämoptoe, Schock. Prognose bei manifester Pneumonie infaust. • Darmmilzbrand (sehr selten): Initial Leibschmerzen, später perakut blutige Diarrhoe, Peritonitis, Schock. Prognose infaust. Diagnostik Erregernachweis durch Abstriche von Hautläsionen, Nase, Rachen; aus Blutkulturen, mikroskopisch. Therapie Sofortiger Therapiebeginn bei Verdacht bzw. Therapie aller potenziell Exponierten für 8 Wo. mit Ciprofloxacin 2 × 500 mg/d oder Doxycyclin 2 × 100 mg/d. Ein Human-Impfstoff ist weltweit nicht zugelassen. Bei Anthrax-Erkr. stationäre Behandlung. 9.3.3 Lyme-Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi (Spirochäte); durch Zecken (10–30 % infiziert) auf den Menschen übertragen. Übertragung durch Stechfliegen unwahrscheinlich. Vorgehen bei Zeckenbiss Zeckenbiss:ErstmaßnahmenFrühzeitige Entfernung einer festgesaugten Zecke (Übertragung erst ab 24 h Saugdauer, Risiko proportional zur Dauer). Große vollgesaugte Zecken mit den Fingern herausdrehen; kleine, noch leere Zecken mithilfe einer Pinzette entfernen, wobei der Zeckenkörper nicht gequetscht werden darf, um Inokulation des infektiösen Speichels zu vermeiden. Vom Ersticken mit Öl oder Klebstoff wird abgeraten; durch verlängerten Kontakt und verstärkte Speichelabsonderung der Zecke erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Inf. Der in der Wunde verbliebene Zeckenkopf ist nicht infektiös und kann mit spitzer Pinzette entfernt werden. Von Chemoprophylaxe nach Zeckenbiss wird abgeraten; Risiko von Unverträglichkeitund schlechter Effektivität. Abb. 9.2 Abschätzung der Saugdauer bei Zecken Klinik Einteilung des Krankheitsverlaufs in 3 Stadien möglich, allerdings individuell sehr variabel. Frühstadium kann übersprungen werden oder in Spätstadien nur ein einzelnes Symptom vorhanden sein. Hohe Spontanheilungsrate im Frühstadium. Dennoch zur Prävention Borreliose:Lyme-Borreliosegefährlicher Spätmanifestationen Lyme-Borreliose immer antibiotische Behandlung. Erythema migrans (Frühstadium): • Lokalbefund: An der Bissstelle oft Papel mit Hyperpigmentation. Von dort sich zentrifugal ausbreitendes Erythem (über 7–10 d, aber bis zu 1 Mon. möglich), Kriterium: Durchmesser ≥ 5 cm, später mit zentraler Abblassung. Verlauf über 3–6 Wo. Nur 10–30 % der Pat. können sich an Zeckenbiss erinnern. • Begleitsymptome: Allgemeinbeschwerden 80 %, Müdigkeit 54 %, Myalgie 44 %, Arthralgie 44 %, Kopfschmerzen 42 %, Fieber mit E*(*rythema migrans (Borreliose)*)*Schüttelfrost 40 %, Nackensteifigkeit 35 %, Appetitlosigkeit 26 %, Lymphadenopathie 26 %. Selten: Fazialislähmung. Spätstadien: Lyme-Meningitis: • Begleitsymptome: Kein bzw. leichtes Fieber (37,5–38,5°C); Allgemeinsymptome (40 %): Müdigkeit, Übelkeit, Appetitlosigkeit, Gewichtsabnahme; Muskel- und Gelenkschmerzen (20–30 %); geringer Meningismus, milder Kopfschmerz. Hirnnervenausfälle (50 % d.F.): Zu 80–90 % N. facialis betroffen. Selten Nn. oculomotorius, trochlearis und abducens. DD: MS, andere Inf. des ZNS (21.5) → Facharztüberweisung. • Periphere Lyme-MeningitisNeuropathie: Meningitis:Lyme-Radikulopathie, überwiegend im Bereich des Zeckenbisses. Über Wo. anhaltende, wandernde Schmerzen, v.a. nachts. Lyme-Arthritis: Chron., intermittierende, mono- oder oligoartikuläre Arthritis der großen Gelenke, v.a. des Knies ohne systemische Symptome. DD: Arthritiden (18.1). Neuroborreliose: 1,5–15 J. nach Erstinf. Multifokaler Befall des ZNS in wechselnder Ausprägung, Abgrenzung zur MS schwierig. Symptome: Meningitis, Myelitis, Hirnnervenausfälle, Enzephalitis, Mono- und Polyneuritis, Sensibilitätsstörungen, Ataxie, Para- und Tetraparesen, Blasenstörungen, epileptische Anfälle, psychische Auffälligkeiten. Sonstige Spätstadien: Haut: Acrodermatitis chronica atrophicans (atrophische, gefältelte Haut, wie "Zigarettenpapier"); Herz: Myokarditis, Pankarditis, Arrhythmien. Diagnostik Bei verdächtigen Hauterscheinungen (Erythema migrans), unklaren rheumatischen Beschwerden oder neurologischen Störungen (z.B. Fazialisparese) nach Zeckenbiss oder -exposition fragen. In Spätstadien erschwert die Vielfalt möglicher Symptome die Diagnose. Serologie: • Borrelien-Ak: Erhöhte Titer treten auch bei klinisch Gesunden auf. Seroprävalenz von Borrelien-Ak in Mitteleuropa: Gesunde Normalbevölkerung 10 %, Wald- und Landarbeiter 12,5–30 % → Bestimmung von IgG- und IgM-AK (quantitativ EIA). Nur wenn pos., weitere Differenzierung mit Immunoblot. In Zweifelsfällen trotz neg. EIA Immunoblot anfordern, weil dieser wesentlich größeres Antigenspektrum abdeckt. – Erythema migrans: Serokonversion (EIA) zu 35 % bei Erstvorstellung, zu 85 % ein Mon. nach Diagnosestellung. – Lyme-Meningitis: Serologie nahezu immer pos. – Lyme-Arthritis: Serologie meist pos., PCR aus Synovialflüssigkeit bei unbehandelten (!) Pat. zu 85 % pos. • TPHA-Test bei neurologischer Symptomatik zum Ausschluss einer Lues (ebenfalls Spirochäten, daher Kreuzreaktion möglich). Jeder pos. Ak-Befund im ELISA muss durch einen Immunoblot bestätigt werden. Cave: Bislang ist noch kein serol. Aktivitätsparameter verfügbar. Wegen langsamer Serokonversion muss die Diagnose "Lyme-Borreliose" häufig klin. gestellt werden. Liquor: • Lyme-Meningitis: Befund ähnlich wie bei viraler Meningitis. In 80 % d.F. Pleozytose (100–1000/3 Zellen) zu über 90 % Lymphozyten. Eiweißerhöhung (bis 1 g/dl). Intrathekale Synthese von IgG, IgM, IgA; bevorzugt IgM-Bildung. • Neuroborreliose: Lymphozytose (300/3 Zellen), mäßige Eiweißerhöhung (1g/dl), normale Glukose. Entscheidend: Intrathekale AK-Produktion oder positive PCR. PCR: • Arthritis: Aus Synovialflüssigkeit zu 85 % pos. • Meningitis: Aus Liquor zu 40–50 % pos. • Neuroborreliose: Aus Liquor zu 54 % pos. Bei völlig unauffälligem Laborbefund ist eine chron. Lyme-Borreliose unwahrscheinlich. Cave: Erfolg der Ther. nur klinisch beurteilbar. Wenn trotz lege artis durchgeführter Ther. die Symptome persistieren, muss die Diagnose "Borreliose" verworfen werden. In frühen Stadien oft rascher Abfall des Titers spezifischer Ak, in Spätstadien hingegen Persistenz hoher Ak-Titer bzw. nur sehr langsamer Rückgang. Titer-Kontrolle frühestens 6 Mon. nach Ther. sinnvoll. Keine zuverlässige Immunität nach durchgemachter Borreliose, Reinf. möglich. Prognose In Frühstadien: Hohe Spontanheilungsrate. In Spätstadien: Unbehandelt Remissionen der Beschwerden, jedoch nur selten Erregerelimination. Ansprechrate der antibiotischen Ther.: 80–95 %. Residualschäden insgesamt: Ca. 5 %. 9.3.4 Brucellose Erreger B. melitensis (Schafe und Ziegen, am häufigsten), B. abortus (Rind, M. Bang), B. suis (Schwein), B. canis (Hund), B. ovis (Hase), B. neotomae (Ratten). Zoonose, weltweites Vorkommen. Inf. durch direkten Kontakt zu erkrankten Tieren (perkutan) oder Trinken nicht-pasteurisierter Schafs- oder Ziegenmilch (Käse!). Erhöhtes Infektionsrisiko für Veterinäre, Beschäftigte in Landwirtschaft und Fleischverarbeitung. Die meisten Inf. Maltafiebererfolgen im Morbus:BangAusland (z.B. Mittelmeerraum, "BrucelloseMaltafieber"). Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Bang, MorbusVielgestaltig und uncharakteristisch. IKZ 1 Wo. bis mehrere Mon. (!), dann meist schleichender Beginn mit Kopf-, Gelenk- und Gliederschmerzen und chron. Fieber über Wo. bis Mon. (septisch, kontinuierlich oder undulierend). Schwellung von Milz und Lk (50 %), Hepatomegalie 25 %. KO: Endokarditis, Osteomyelitis, Meningoenzephalitis. Diagnostik Gezielte Anamnese (berufliche Exposition, Ernährung, Auslandsreise). Leukozytenzahl normal oder ↓, Granulozytopenie, relative Lymphozytose (80 %). Ak-Titeranstieg (Titer ≥ 1 : 100), Erregernachweis in Blutkulturen, Urin, Liquor, evtl. in Biopsien. Cave: Falsch-positive Reaktionen finden sich bei Yersinia-enterocolitica- und Cholerainfektionen bzw. nach Choleraimpfung. Therapie Schwierig. Trotz wirksamer antibiotischer Ther. häufig Rezidive. In komplizierten Fällen Klinikeinweisung. Doxycyclin 200 mg/d plus Rifampicin für 6–12 Wo., bei Neurobrucellose o. Endokarditis länger. Alternative: Co-trimoxazol 2 × 480 mg/d, plus Rifampicin 600 mg/d. Cave: Resistenzen gegen Rifampicin möglich. BB-Kontrollen. 9.3.5 Listeriose Erreger Listeria monocytogenes. Zoonose. Ubiquitäres Vorkommen in der Natur, Inf. durch direkten Kontakt zu infizierten Tieren oder durch Milch und Milchprodukte (bes. Camembert). Wachstum des Err. auch bei +4°C (Kühlschrank); wird durch Pasteurisierung nicht vollständig inaktiviert. Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Erkr. selten. Manifeste Erkrankungen v.a. bei Schwangeren und älteren Personen mit konsumierender Grunderkr. sowie bei NG. Krankheitsbilder: • Systemische Inf.: Sepsis, ListerioseMeningitis, Enzephalitis, selten auch Endokarditis. Oft uncharakteristische, grippeähnliche Symptome. Pathohistologisch 2 Verlaufsformen: Akut-eitrige Entzündung und granulomatöse Verlaufsform mit Abszessbildung, sog. Listeriomen. • Schwangeren-Listeriose: Grippaler bis septischer Verlauf vorwiegend im letzten Trimenon. Bei schwerem Verlauf Abort bzw. Gefahr der Frühgeburt. • Neugeborenen-Listeriose: Durch intrauterine oder perinatale Inf., Manifestation als septische Neugeborenen-Granulomatose. Diagnostik Erregernachweis aus Blutkulturen, Liquor oder Biopsien. Serologie unzuverlässig. Therapie Klinikeinweisung zur i.v. Antibiose (Amoxicillin plus Aminoglykosid); Expositionsprophylaxe v.a. für Schwangere indiziert: H-Milch; kein Camembert, Kontakt zu Kühen, Schafen, Schweinen meiden. 9.3.6 Diphtherie Erreger Corynebacterium diphtheriae. In Mitteleuropa selten, meist importierte Fälle aus Osteuropa. Übertragung durch Tröpfcheninf. Schleimhautschädigung durch Toxinbildung. IKZ 3–12 d, Manifestation bei 20 % der Infizierten. Durch Toxinfernwirkung Myokarditis und Polyneuritis möglich. Verdacht, Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik • Lokale, benigne Rachendiphtherie (mäßiges Fieber, typischer DiphtherieLokalbefund): Großflächig entzündetes Tonsillengebiet mit Corynebacterium diphtheriaePseudomembranen (fest haftende weiß-graue Beläge aus nekrotischem Material, beim Ablösen kommt es zur Blutung), süßlicher Foetor ex ore, Schwellung des Rachens und der regionalen Lk, Höhepunkt der Erkr. nach 3–5 d. KO: Larynxdiphtherie mit bellendem Husten und Stridor ("echter" Krupp). • Andere lokale Manifestationen: Nasendiphtherie (blutiger Schnupfen), Augendiphtherie,Rachen:Diphtherie Nabeldiphtherie. • Toxische, maligne Diphtherie: Myokarditis, Herz-Kreislauf-Versagen, unstillbares Erbrechen, Haut- und Schleimhautblutungen. Bei Abwehrschwäche oder als KO einer lokalen Diphtherie. Diagnostik Klinischer Aspekt (liegt Grundimmunisierung > 10 J. zurück, sind schwere Verläufe möglich). Erregernachweis aus Nasen-, Rachenabstrich. Cave: Pseudomembranen vorher ablösen. Therapie Klinikeinweisung schon bei Verdacht zur Antibiose (Penicillin-G oder Erythromycin). Bei Kontaktpersonen des Erkrankten Chemoprophylaxe (Penicillin G oder Erythromycin) und Auffrischimpfung schon nach 5 Jahren ( 9.2.3 ). 9.3.7 Chlamydia-trachomatis-Infektionen Krankheitsbilder Trachom (Serotypen A–C); unspezifische Genitalinf., Neugeborenen-Pneumonie, Einschlusskörperchen-Konjunktivitis (Serotypen D–K); Lymphogranuloma venereum (Serotypen L1–L13; 9.8.5 ). Klinik Dysurie, Pollakisurie, Urethralsekretion, vaginaler Fluor. Sonst.: Pneumonie, Konjunktivitis. Komplikationen • Bei chron. Inf.: Salpingitis (14.3.3) mit ektopischen Schwangerschaften oder Sterilität, reaktive Chlamydia:trachomatisArthritis. • Sexuelle Übertragung. • TrachomNeugeborenen-Inf.: Übertragung unter der Geburt führt beim NG zu Einschlusskörperchen-Konjunktivitis oder Pneumonie. Beim reifen NG relativ gutartiger Verlauf, bei Frühgeborenen schlechte Prognose. Deshalb bei Schwangeren konsequentes Chlamydien-Screening. Die Credé-Prophylaxe gegen Konjunktivitis ist wirkungslos, stattdessen PVP-Jod verwenden. Einschlusskörperchen-Konjunktivitis: Gutartiger Verlauf, spontane Abheilung nach 3–16 Mon., unter Ther. nach 2–3 d. • Trachom: Keratokonjunktivitis mit Entropium; v.a. in den Tropen und Subtropen verbreitet, bei langem Verlauf Erblindung. Diagnostik Abstriche von Urethra und Zervix für Gensonde oder PCR (s.a. 14.1.2), Urin-PCR, Sputum-PCR. Therapie In unkomplizierten Fällen Einmaldosis von Azithromycin 1 × 1 g = 1 × 4 Kps. à 250 mg. Alternative: Doxycyclin 2 × 100 mg für 7 d. In chron. Fällen Ther. mit Doxycyclin für mind. 20 d. Partnerbehandlung! 9.3.8 Katzenkratzkrankheit Erreger Rel. häufige Zoonose. Err.: Bartonella henselae. Übertragung durch Katzen 95 %, Hunde 4 %, 1 % ohne Tierkontakt. Inf. auch durch Belecken von Hautläsionen oder Schleimhäuten möglich. Klinik • Hautbefund: Nach 3–10 d Auftreten eines 3–5 mm großen Bläschens oder einer Pustel; später Umwandlung zur Papel, die mehrere d bis Mon. bestehen bleibt. Abheilung ohne Narbenbildung. Bei Einbringen von infektiösem Material in das Auge, Katzenkratzkrankheitkonjunktivales Granulom. • Lk: 2 Wo. (3–70 d) nach dem Kratzer schmerzhafte Schwellung eines oder mehrerer regionärer Lk. Größe 1–5 cm, selten größer. • Begleitsymptome: In 30 % d.F. Fieber; in 50 % d.F. Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen, Appetitlosigkeit. Komplikationen ZNS-Befall mit Krampfanfällen, fokalen Ausfällen, Neuroretinitis. Diagnostik Vorgeschichte, klin. Aspekt, Serologie. Aus Biopsiematerial PCR und Histologie. Differenzialdiagnose Malignes Lymphom, Mononukleose, Toxoplasmose. Therapie Symptomatisch, kühle Umschläge auf geschwollene Lk. Antibiotika nur bei KO, wirksam sind Makrolide, z.B. Azithromycin oder Gyrasehemmer wie Ciprofloxacin. Prognose Nahezu immer Restitutio ad integrum. Rückbildung der Lk-Schwellung über 2–6 Mon., in 2 % d.F. über 1–3 J. Bei Neuroretinitis in seltenen Fällen bleibende leichte Visuseinschränkung. 9.3.9 Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) Erreger E. coli, toxinbildende Stämme (Verotoxin, SLT = Shiga-like-Toxin), > 160 Serotypen. Inf. durch Genuss unpasteurisierter Milchprodukte, roher/unzureichend gegarter (Rind-)Fleischprodukte. Übertragung von Mensch zu Mensch durch Schmierinf. Direkte Übertragung vom Tier auf den Menschen selten. Niedrige Infektionsdosis (nur 100 Keime erforderlich). Bes. gefährdet sind Kinder 10 J. Umgebungsuntersuchungen sowie Kontrolluntersuchungen bei Rekonvaleszenten: Erregerausscheidung ca. 2–3 Wo., zu 10 % auch > 1 Mon. Überwachung und Berufsbeschränkungen ähnlich wie bei Salmonellosen, bis 3 Stuhlproben neg. sind. Kein Verzehr roher oder unzureichend gegarter Fleischprodukte durch Kinder 20 °C); Verzehr kontaminierter Muscheln Nekrotisierende Wundinf.; primäre Sepsis; bullöse Hautnekrose. Ungünstige Prognose Klinikeinweisung bei Verdacht Klinikeinweisung Ciprofloxacin i.v., Abtragung von Nekrosen, evtl. Schockther. 9.4 Virale Infektionen 9.4.1 Herpes-simplex-Virus-Infektionen Erreger HSV-Typ-1: Extragenitale Haut und Schleimhäute. HSV-Typ-2: Genitale Schleimhäute. Übertragung durch Schmierinf. und direkten Kontakt. 90 % aller Erw. sind infiziert, jedoch meist inapparent, 15 % scheiden Viren aus. Die Viren persistieren in sensiblen Ganglienzellen. Charakteristisch für die Herpes-Inf. sind endogene Rezidive, hervorgerufen durch Irritation latent infizierter Neurone durch Fieber (Herpes febrilis), UV-Virusinfektion:ÜbersichtBestrahlung (Herpes solaris), Menstruation, Stress oder weitere Herpes-simplex-Virus-InfektionInf., auch ohne Fieber (z.B. Bronchitis). Klinik Je nach Manifestationsform: Erstinf. verläuft bei 99 % aller Infizierten inapparent. Stomatitis aphthosa (25.5.4), Herpes labialis (26.4.1), Herpes genitalis (14.3), Ekzema herpeticatum, Herpesenzephalitis (21.5.3). 9.4.2 Varicella-Zoster-Infektionen Erreger Varicella-Zoster-Virus (VZV), verursacht bei Erstinf. Windpocken (Varizellen), kann in den Nervenganglien persistieren und im höheren Alter zu endogenen Rezidiven in Form der Gürtelrose (Zoster) führen. Windpocken (16.7.4); Zoster (Gürtelrose, 26.4.2). 9.4.3 Infektiöse Mononukleose Synonym Pfeiffer-Drüsenfieber. Erreger Epstein-Barr-Virus (EBV). Häufung im Frühjahr, vorwiegend Varicella-Zoster-InfektionJugendl. Übertragung durch Speichel: "kissing disease". In 60 % klinisch inapparenter Verlauf. Klinik IKZ 7 d–3 Wo. Prodromi: Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen (1–3 d). Akutstadium: Fieber (38–39°C), Halsschmerzen, zervikale Lk-Schwellungen (85 %), Splenomegalie (70 %), Pharyngotonsillitis Mononukleose, infektiösemit Pseudomembranen (40 %). Infektiöse MononukleoseGelegentlich auch Pfeiffer-DrüsenfieberHepatomegalie (20 %) mit Ikterus (10 %) oder Exanthem (5 %). Dauer ca. 2 Wo. Rekonvaleszenz: In den nächsten 2 Wo. Rückgang des Fiebers. Bei Kindern sind Pharyngotonsillitis (95 %), Hepatomegalie (40 %) und Ikterus (20 %) häufiger. DD: Zytomegalie. Diagnostik Bei frischer Inf.: Typische Klinik. Labor: Im Diff.-BB: 10 000–25 000 Leukos/μl mit 70 % monozytoiden Zellen ("Pfeiffer-Zellen"), Paul-Bunnell-Test auf heterophile Ak pos. (z.B. Clearview Monosticon®-Teststreifen, Fa. Unipath-Difco) bei Erw. und Kindern ≥ 5 J., oft Transaminasen ↑. EBV-Serologie: VCA-IgG, VCA-IgM, Anti-EBNA, Anti-CMV nur dann, wenn o.g. Kriterien nicht ausreichen oder V.a. chron. oder reaktivierte Inf. Ggf. zusätzlich Abdomen-Sono: Splenomegalie, evtl. Hepatomegalie, vergrößerte intraabdominale Lk? Therapie Ambulant, Klinikeinweisung nur bei KO. Bettruhe bis zur Entfieberung, anschließend körperliche Schonung bis zur Rückbildung der Splenomegalie (1–2 Mon.). Mundpflege z.B. mit Hexetidin, Antitussiva, Antipyretika (kein ASS wegen Thrombozytenfunktionsstörung). Antibiotika nur bei bakt. Superinf., Cefuroxim oder Roxithromycin. Cave: Kein Ampicillin oder Amoxicillin wegen Provokation eines Exanthems. Keine kräftige Milzpalpation wegen der Gefahr der Milzruptur. Komplikationen Milzruptur, Stauungsikterus. Selten Atemwegsobstruktion, Pneumonie, hämolytische Anämie, Meningoenzephalitis, Fazialisparese, Myokarditis. Bei Immunschwäche oder Immunsuppression chron. oder reaktivierte EBV-Inf. mit Fieber, generalisierter Lymphadenopathie, Hepatosplenomegalie und PNP. Bei AIDS häufig orale Haarzellleukoplakie ( Tab. 9.27 ). Bei Afrikanern: Burkitt-Lymphom. Assoziation des EBV mit Nasopharynx-Ca (Hinweis: EBV-VCA-IgA ↑↑). X-linked lymphoproliferatives Sy.: Sehr selten; genetisch disponierte männliche Pat. entwickeln bei EBV-Inf. eine aplastische Anämie, Immunschwäche und maligne Lymphome. Prognose ohne Stammzellentransplantation infaust, Untersuchung von Geschwistern auf den Gendefekt. Prognose Gut, nur selten KO. 9.4.4 Influenza Erreger Influenza-Virus; genetisch sehr variabel, meist Gruppe A, seltener Gruppe B oder C. Übertragung durch Tröpfcheninf., gehäuft Herbst und Winter. Erhöhte Gefährdung für ältere Personen und Sgl. Ind. und Durchführung der Schutzimpfung 9.2.3 . Differenzialdiagnose Inf. durch eine Vielzahl anderer Viren, die unkomplizierte Atemwegsinf. verursachen ("grippaler Inf.") z.B. Parainfluenzaviren. Klinik Nach kurzer IKZ (1–5 d) ohne InfluenzaProdromi hohes Fieber mit Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Grippe:InfluenzaGliederschmerzen, Halsschmerzen, trockenem Husten, Tracheobronchitis, Gastroenteritis (20 %). Bei Fieber länger als 3–4 d, produktivem Husten und Anstieg der Leukos V.a. bakt. Superinf. Komplikationen Hämorrhagische oder eitrige Bronchopneumonie, Otitis media, Myokarditis, Perikarditis mit Erguss, Meningoenzephalitis, Guillain-Barré-Sy. Diagnostik Klinischer Verlauf; in den ersten 3 Krankheitstagen Virus-Antigennachweis oder PCR aus Rachenspülwasser oder Nasopharynxabstrich. Retrospektiv durch Serologie. Therapie Symptomatisch: Bettruhe, Antipyretika, Antitussiva, Antibiotika bei Superinf. (Amoxicillin, Roxithromycin). Bei Erw. in reduziertem AZ und/oder epidemischem Auftreten zusätzlich Chemoprophylaxe oder Therapie. • Ther.: Am 1. oder 2. d nach Symptombeginn Zanamivir, z.B. Relenza®, 2 × 10 mg/d inhalativ für 5 d oder Oseltamivir, z.B. Tamiflu®, 2 × 75 mg/d für 5 d. NW: Selten. • Chemoprophylaxe: Zanamivir, z.B. Relenza®, 1 × 10 mg/d inhalativ für 4 Wo.. NW: Selten. KI: Keine speziellen. Für Kinder 30 und Schwangere. Letalität allg. bisher vergleichbar mit der jährl. saisonalen Grippewelle. Diagnostik Abstrichentnahme aus Nase und Rachen unter Gewährleistung des Arbeitsschutzes für das Praxispersonal (Mund-Nase-Schutz, Handschuhe, Schutzbrille etc.); Einsendung an spezialisiertes Labor. Influenza-Ag-Schnelltests sollten wegen fehlender Spezifität und Sensitivität nicht durchgeführt werden. Bis zum Vorliegen des Testergebnisses Pat. aufklären über Hygienemaßnahmen (Händedesinfektion, Husten in den Ärmel statt in die Hand, Menschenansammlungen meiden, sofortige Entsorgung von Einmaltaschentüchern etc.). Therapie Antivirale Therapie mit Neuraminidasehemmern Oseltamivir (Tamiflu®) und nur in speziellen Situationen Zanamivir (Relenza®) über Inhalationen mildert Krankheitsverlauf und reduziert Komplikationshäufigkeit und Virusausscheidung. Therapiebeginn möglichst innerhalb der ersten 36–48 h (späterer Therapiebeginn unsicher wirksam). Bei klin. schwer erkr. Pat. sollte der Pat. nach telef. Anmeldung umgehend stationär eingewiesen werden. Prophylaxe Keine medikamentöse Prophylaxe sinnvoll, auch nicht von Kontaktpersonen. Isolation von Kontaktpersonen muss je nach Berufstätigkeit und Kontakt mit großen Menschengruppen im Einzellfall entschieden werden (z.B. Erzieherinnen im Kindergarten, Krankenschwestern, Ärzte). Infizierte Patienten müssen 7 Tage und bis zur Fieberfreiheit isoliert werden. Familienangehörige sollten Mundschutz tragen, sich in getrennten Wohnräumen aufhalten und auf häufiges Händewaschen und Desinfektionsmaßnahmen hingewiesen werden. Ärzte und Personal sollten zusätzlich Handschuhe, Schutzkittel und ggf. Schutzbrillen tragen und, wenn möglich, einen Mindestabstand von 1 m zum Patienten einhalten. Ein Impfstoff steht ab Herbst/Winter 2009 zur Verfügung. Meldepflicht Meldepflicht für Krankheitsverdacht, Erkr. und Tod (seit dem 3. Mai 2009). Algorithmus der DEGAM für den amb. hausärztl. Versorgungsbereich S. 1768. 9.4.1 Herpes-simplex-Virus-Infektionen Erreger HSV-Typ-1: Extragenitale Haut und Schleimhäute. HSV-Typ-2: Genitale Schleimhäute. Übertragung durch Schmierinf. und direkten Kontakt. 90 % aller Erw. sind infiziert, jedoch meist inapparent, 15 % scheiden Viren aus. Die Viren persistieren in sensiblen Ganglienzellen. Charakteristisch für die Herpes-Inf. sind endogene Rezidive, hervorgerufen durch Irritation latent infizierter Neurone durch Fieber (Herpes febrilis), UV-Virusinfektion:ÜbersichtBestrahlung (Herpes solaris), Menstruation, Stress oder weitere Herpes-simplex-Virus-InfektionInf., auch ohne Fieber (z.B. Bronchitis). Klinik Je nach Manifestationsform: Erstinf. verläuft bei 99 % aller Infizierten inapparent. Stomatitis aphthosa (25.5.4), Herpes labialis (26.4.1), Herpes genitalis (14.3), Ekzema herpeticatum, Herpesenzephalitis (21.5.3). 9.4.2 Varicella-Zoster-Infektionen Erreger Varicella-Zoster-Virus (VZV), verursacht bei Erstinf. Windpocken (Varizellen), kann in den Nervenganglien persistieren und im höheren Alter zu endogenen Rezidiven in Form der Gürtelrose (Zoster) führen. Windpocken (16.7.4); Zoster (Gürtelrose, 26.4.2). 9.4.3 Infektiöse Mononukleose Synonym Pfeiffer-Drüsenfieber. Erreger Epstein-Barr-Virus (EBV). Häufung im Frühjahr, vorwiegend Varicella-Zoster-InfektionJugendl. Übertragung durch Speichel: "kissing disease". In 60 % klinisch inapparenter Verlauf. Klinik IKZ 7 d–3 Wo. Prodromi: Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen (1–3 d). Akutstadium: Fieber (38–39°C), Halsschmerzen, zervikale Lk-Schwellungen (85 %), Splenomegalie (70 %), Pharyngotonsillitis Mononukleose, infektiösemit Pseudomembranen (40 %). Infektiöse MononukleoseGelegentlich auch Pfeiffer-DrüsenfieberHepatomegalie (20 %) mit Ikterus (10 %) oder Exanthem (5 %). Dauer ca. 2 Wo. Rekonvaleszenz: In den nächsten 2 Wo. Rückgang des Fiebers. Bei Kindern sind Pharyngotonsillitis (95 %), Hepatomegalie (40 %) und Ikterus (20 %) häufiger. DD: Zytomegalie. Diagnostik Bei frischer Inf.: Typische Klinik. Labor: Im Diff.-BB: 10 000–25 000 Leukos/μl mit 70 % monozytoiden Zellen ("Pfeiffer-Zellen"), Paul-Bunnell-Test auf heterophile Ak pos. (z.B. Clearview Monosticon®-Teststreifen, Fa. Unipath-Difco) bei Erw. und Kindern ≥ 5 J., oft Transaminasen ↑. EBV-Serologie: VCA-IgG, VCA-IgM, Anti-EBNA, Anti-CMV nur dann, wenn o.g. Kriterien nicht ausreichen oder V.a. chron. oder reaktivierte Inf. Ggf. zusätzlich Abdomen-Sono: Splenomegalie, evtl. Hepatomegalie, vergrößerte intraabdominale Lk? Therapie Ambulant, Klinikeinweisung nur bei KO. Bettruhe bis zur Entfieberung, anschließend körperliche Schonung bis zur Rückbildung der Splenomegalie (1–2 Mon.). Mundpflege z.B. mit Hexetidin, Antitussiva, Antipyretika (kein ASS wegen Thrombozytenfunktionsstörung). Antibiotika nur bei bakt. Superinf., Cefuroxim oder Roxithromycin. Cave: Kein Ampicillin oder Amoxicillin wegen Provokation eines Exanthems. Keine kräftige Milzpalpation wegen der Gefahr der Milzruptur. Komplikationen Milzruptur, Stauungsikterus. Selten Atemwegsobstruktion, Pneumonie, hämolytische Anämie, Meningoenzephalitis, Fazialisparese, Myokarditis. Bei Immunschwäche oder Immunsuppression chron. oder reaktivierte EBV-Inf. mit Fieber, generalisierter Lymphadenopathie, Hepatosplenomegalie und PNP. Bei AIDS häufig orale Haarzellleukoplakie ( Tab. 9.27 ). Bei Afrikanern: Burkitt-Lymphom. Assoziation des EBV mit Nasopharynx-Ca (Hinweis: EBV-VCA-IgA ↑↑). X-linked lymphoproliferatives Sy.: Sehr selten; genetisch disponierte männliche Pat. entwickeln bei EBV-Inf. eine aplastische Anämie, Immunschwäche und maligne Lymphome. Prognose ohne Stammzellentransplantation infaust, Untersuchung von Geschwistern auf den Gendefekt. Prognose Gut, nur selten KO. 9.4.4 Influenza Erreger Influenza-Virus; genetisch sehr variabel, meist Gruppe A, seltener Gruppe B oder C. Übertragung durch Tröpfcheninf., gehäuft Herbst und Winter. Erhöhte Gefährdung für ältere Personen und Sgl. Ind. und Durchführung der Schutzimpfung 9.2.3 . Differenzialdiagnose Inf. durch eine Vielzahl anderer Viren, die unkomplizierte Atemwegsinf. verursachen ("grippaler Inf.") z.B. Parainfluenzaviren. Klinik Nach kurzer IKZ (1–5 d) ohne InfluenzaProdromi hohes Fieber mit Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Grippe:InfluenzaGliederschmerzen, Halsschmerzen, trockenem Husten, Tracheobronchitis, Gastroenteritis (20 %). Bei Fieber länger als 3–4 d, produktivem Husten und Anstieg der Leukos V.a. bakt. Superinf. Komplikationen Hämorrhagische oder eitrige Bronchopneumonie, Otitis media, Myokarditis, Perikarditis mit Erguss, Meningoenzephalitis, Guillain-Barré-Sy. Diagnostik Klinischer Verlauf; in den ersten 3 Krankheitstagen Virus-Antigennachweis oder PCR aus Rachenspülwasser oder Nasopharynxabstrich. Retrospektiv durch Serologie. Therapie Symptomatisch: Bettruhe, Antipyretika, Antitussiva, Antibiotika bei Superinf. (Amoxicillin, Roxithromycin). Bei Erw. in reduziertem AZ und/oder epidemischem Auftreten zusätzlich Chemoprophylaxe oder Therapie. • Ther.: Am 1. oder 2. d nach Symptombeginn Zanamivir, z.B. Relenza®, 2 × 10 mg/d inhalativ für 5 d oder Oseltamivir, z.B. Tamiflu®, 2 × 75 mg/d für 5 d. NW: Selten. • Chemoprophylaxe: Zanamivir, z.B. Relenza®, 1 × 10 mg/d inhalativ für 4 Wo.. NW: Selten. KI: Keine speziellen. Für Kinder 30 und Schwangere. Letalität allg. bisher vergleichbar mit der jährl. saisonalen Grippewelle. Diagnostik Abstrichentnahme aus Nase und Rachen unter Gewährleistung des Arbeitsschutzes für das Praxispersonal (Mund-Nase-Schutz, Handschuhe, Schutzbrille etc.); Einsendung an spezialisiertes Labor. Influenza-Ag-Schnelltests sollten wegen fehlender Spezifität und Sensitivität nicht durchgeführt werden. Bis zum Vorliegen des Testergebnisses Pat. aufklären über Hygienemaßnahmen (Händedesinfektion, Husten in den Ärmel statt in die Hand, Menschenansammlungen meiden, sofortige Entsorgung von Einmaltaschentüchern etc.). Therapie Antivirale Therapie mit Neuraminidasehemmern Oseltamivir (Tamiflu®) und nur in speziellen Situationen Zanamivir (Relenza®) über Inhalationen mildert Krankheitsverlauf und reduziert Komplikationshäufigkeit und Virusausscheidung. Therapiebeginn möglichst innerhalb der ersten 36–48 h (späterer Therapiebeginn unsicher wirksam). Bei klin. schwer erkr. Pat. sollte der Pat. nach telef. Anmeldung umgehend stationär eingewiesen werden. Prophylaxe Keine medikamentöse Prophylaxe sinnvoll, auch nicht von Kontaktpersonen. Isolation von Kontaktpersonen muss je nach Berufstätigkeit und Kontakt mit großen Menschengruppen im Einzellfall entschieden werden (z.B. Erzieherinnen im Kindergarten, Krankenschwestern, Ärzte). Infizierte Patienten müssen 7 Tage und bis zur Fieberfreiheit isoliert werden. Familienangehörige sollten Mundschutz tragen, sich in getrennten Wohnräumen aufhalten und auf häufiges Händewaschen und Desinfektionsmaßnahmen hingewiesen werden. Ärzte und Personal sollten zusätzlich Handschuhe, Schutzkittel und ggf. Schutzbrillen tragen und, wenn möglich, einen Mindestabstand von 1 m zum Patienten einhalten. Ein Impfstoff steht ab Herbst/Winter 2009 zur Verfügung. Meldepflicht Meldepflicht für Krankheitsverdacht, Erkr. und Tod (seit dem 3. Mai 2009). Algorithmus der DEGAM für den amb. hausärztl. Versorgungsbereich S. 1768. 9.5 Mykosen 9.5.1 Allgemeines • Einteilung der Pilzarten: Sprosspilze (hefeartiges Wachstum) und Hyphenpilze (fädiges Wachstum). Bei vielen pathogenen Pilzen Dimorphismus: Im Gewebe hefeähnliches, in Kultur hyphenartiges Wachstum. • Hautmykosen kommen auch bei immunkompetenten Personen vor. Pilzerkr. der Schleimhäute und innerer Organe treten meist als opportunistische Inf. bei Immunschwäche unterschiedlichster Genese auf, wie z.B. Diab. mell., hämatologische Erkr., Z.n. Radiatio, Zytostatika oder Glukokortikoidsteroidther., AIDS. • Infektionsquellen: Bei Candida-Spezies endogen aus dem Darm des Pat.; bei allen anderen Pilzen durch die ubiquitär vorhandenen Sporen, bei Dermatophyten Auskeimen in feuchtem Hautmilieu, bei Err. von Systemmykosen Sporeninhalation. • Systemmykosen: Primär auftretende Systemmykosen (z.B. Kokzidioidomykose) in Europa extrem selten, Einschleppung v.a. aus Nord- oder Südamerika möglich. Klinik: Uncharakteristische Symptome; selten akuter Beginn, meist schleichender Verlauf mit Fieber, Nachtschweiß, Abgeschlagenheit, Gewichtsverlust, unspezifischen Organssymptomen. Diagn.: Kultureller und serol. Nachweis schwierig. Vorgehen: Bei Verdacht Klinikeinweisung. 9.5.2 Candidosen (Soor) Haut-/Schleimhaut-Candidose Klinik Je nach Lokalisation Glossitis, Ösophagitis, Intertrigo, Balanitis (13.7.2), Vulvitis mit weißlichem geruchlosem Fluor (14.3), Urethritis (13.3) mit Dysurie, Paronychie oder Nagelveränderungen. Bei Schleimhautbefall Juckreiz, weißliche, abwischbare Beläge. Die Schleimhaut unter den Belägen ist gerötet, kann bluten und ulzerieren. Bei Hautbefall flache kleine Bläschen und Pusteln, manchmal weißer Belag und Schuppung. Candida-Mykose:Haut/Schleimhaut Diagnostik Klinischer Aspekt, mikroskopisches Nativpräparat (32.1.5) aus Abstrichen von Haut-/Schleimhautläsionen. Ggf. Einsendung zum kulturellen Nachweis. Bei V.a. Ösophagitis (retrosternales Brennen) Facharztüberweisung zur Gastroskopie. Therapie Lokalbehandlung mit Nystatin oder Amphotericin B Creme, Suspension etc., aber auch bei Hautbefall Clotrimazol bis zur Rückbildung der Beschwerden. Bei Immunschwäche ( 9.5.1 ) zusätzlich systemische Ther. mit Fluconazol: Erw. 100 mg/d p.o., Kinder > 1 J.: 3–6 mg/kg KG/d. Darmcandidose Starke Candida-Mykose:DarmVermehrung bei Schädigung der normalen Darmflora durch antibakt. Ther. Krankheitswert erst bei Diarrhoe und Keimzahl > 10 6 /ml. Vorkommen: Bei antibiotisch vorbehandelten Pat. oder schwerer Immunschwäche. Klinik Meist asymptomatisch, gelegentlich leichte Diarrhoe, Blähungen. Diagnostik Stuhluntersuchung auf pathogene Keime mit Zusatzfrage Candidose möglich (in Kultur Hinweis auf massenhaftes Auftreten?). Therapie Wenn möglich Antibiotika absetzen, symptomatische Ther. der Diarrhö. Orale Gabe von Nystatin 3 × 2 Drgs./d oder Amphotericin B 2 × 100 mg/d, jeweils für 2 Wo. Bei Immunschwäche zusätzlich systemische Ther. mit Fluconazol 100 mg/d. Der Nutzen einer speziellen Diät oder einer Darmsäuerung ist nicht erwiesen. Candidasepsis Uncharakteristisches Sepsisbild bei Immunschwäche ( 9.9.5 , Tab. 9.27 ), Klinikeinweisung bei Verdacht. 9.5.3 Systemische Mykosen Tab. 9.21 Übersicht systemische Mykosen Erreger Vorkommen; Risikofaktoren Krankheitsbilder Nachweis ∗ Aspergillus sp. (Schimmelpilz) Ubiquitär, z.B. Blumenerde; Abwehrschwäche Otomykose, Lungenbefall: Diffus oder Aspergillome. Seltener Endokarditis, Endophthalmitis Kultur aus Sputum, BAL, sterilen Biopsien + Histologie Mucor (Schimmelpilz) Ubiquitär; Abwehrschwäche Otomykose, Sinusitis, Enzephalitis, Hirnsinusthrombose Kultur aus Abszessaspiraten, Liquor. Histologie Candida albicans ( 9.5.2 ) Bestandteil der Darmflora; Abwehrschwäche, nosokomial Haut- und Schleimhautbefall (Soor); Sepsis Direktpräparat; Kultur aus Abstrichen, Biopsien, Blutkulturen Coccidioides immitis Südwest-USA, Mittel- und Südamerika; sehr selten; obligat pathogen In 60 % grippeähnlicher Verlauf; in 40 % Pneumonie, Pleuritis, Arthralgien; in 0,5 % Sepsis Präparat und Kultur aus Sputum, BAL Cryptococcus neoformans 9.9.5 Histoplasma capsulatum USA; Vogelkot, Fledermauskot; sehr selten; obligat pathogen Primärinf.: Tbc-ähnliche Lungenerkr. Bei AIDS Befall von Leber, Milz, Lk, KM Mikroskopische Präparate, Kultur aus Sputum, Eiter, Biopsien Blastomyces dermatidis Nordamerika; sehr selten; obligat pathogen Hautbefall mit Papillomatose, Mikroabszesse mit Fistelung; Befall von Leber, Milz, Lk, Knochen Mikroskopische Präparate, Kultur aus Sputum, Eiter, Biopsien Blastomyces brasiliensis Südamerika; sehr selten, obligat pathogen Ulzerierende Stomatitis mit Zahnausfall; sekundärer Befall von Haut, Lk, Milz, Leber; Pneumonie Mikroskopische Präparate, Kultur aus Sputum, Eiter, Biopsien ∗ Außer bei Erythrococcus neoformans PCR aus Biopsaten und Abstrichen möglich; serologische Methoden haben eine schlechte Sensitivität. 9.5.4 Dermatophytosen Erkr. durch Fadenpilze, die Haut (Flechten = Tineae), Nägel (Onychomykosen) und Haare (Trichophytosen) befallen können. Tineae sind meist Mischinf. aus Epidermophyton- und Trichophytonarten. Hautbefall (26.6). 9.5.1 Allgemeines • Einteilung der Pilzarten: Sprosspilze (hefeartiges Wachstum) und Hyphenpilze (fädiges Wachstum). Bei vielen pathogenen Pilzen Dimorphismus: Im Gewebe hefeähnliches, in Kultur hyphenartiges Wachstum. • Hautmykosen kommen auch bei immunkompetenten Personen vor. Pilzerkr. der Schleimhäute und innerer Organe treten meist als opportunistische Inf. bei Immunschwäche unterschiedlichster Genese auf, wie z.B. Diab. mell., hämatologische Erkr., Z.n. Radiatio, Zytostatika oder Glukokortikoidsteroidther., AIDS. • Infektionsquellen: Bei Candida-Spezies endogen aus dem Darm des Pat.; bei allen anderen Pilzen durch die ubiquitär vorhandenen Sporen, bei Dermatophyten Auskeimen in feuchtem Hautmilieu, bei Err. von Systemmykosen Sporeninhalation. • Systemmykosen: Primär auftretende Systemmykosen (z.B. Kokzidioidomykose) in Europa extrem selten, Einschleppung v.a. aus Nord- oder Südamerika möglich. Klinik: Uncharakteristische Symptome; selten akuter Beginn, meist schleichender Verlauf mit Fieber, Nachtschweiß, Abgeschlagenheit, Gewichtsverlust, unspezifischen Organssymptomen. Diagn.: Kultureller und serol. Nachweis schwierig. Vorgehen: Bei Verdacht Klinikeinweisung. 9.5.2 Candidosen (Soor) Haut-/Schleimhaut-Candidose Klinik Je nach Lokalisation Glossitis, Ösophagitis, Intertrigo, Balanitis (13.7.2), Vulvitis mit weißlichem geruchlosem Fluor (14.3), Urethritis (13.3) mit Dysurie, Paronychie oder Nagelveränderungen. Bei Schleimhautbefall Juckreiz, weißliche, abwischbare Beläge. Die Schleimhaut unter den Belägen ist gerötet, kann bluten und ulzerieren. Bei Hautbefall flache kleine Bläschen und Pusteln, manchmal weißer Belag und Schuppung. Candida-Mykose:Haut/Schleimhaut Diagnostik Klinischer Aspekt, mikroskopisches Nativpräparat (32.1.5) aus Abstrichen von Haut-/Schleimhautläsionen. Ggf. Einsendung zum kulturellen Nachweis. Bei V.a. Ösophagitis (retrosternales Brennen) Facharztüberweisung zur Gastroskopie. Therapie Lokalbehandlung mit Nystatin oder Amphotericin B Creme, Suspension etc., aber auch bei Hautbefall Clotrimazol bis zur Rückbildung der Beschwerden. Bei Immunschwäche ( 9.5.1 ) zusätzlich systemische Ther. mit Fluconazol: Erw. 100 mg/d p.o., Kinder > 1 J.: 3–6 mg/kg KG/d. Darmcandidose Starke Candida-Mykose:DarmVermehrung bei Schädigung der normalen Darmflora durch antibakt. Ther. Krankheitswert erst bei Diarrhoe und Keimzahl > 10 6 /ml. Vorkommen: Bei antibiotisch vorbehandelten Pat. oder schwerer Immunschwäche. Klinik Meist asymptomatisch, gelegentlich leichte Diarrhoe, Blähungen. Diagnostik Stuhluntersuchung auf pathogene Keime mit Zusatzfrage Candidose möglich (in Kultur Hinweis auf massenhaftes Auftreten?). Therapie Wenn möglich Antibiotika absetzen, symptomatische Ther. der Diarrhö. Orale Gabe von Nystatin 3 × 2 Drgs./d oder Amphotericin B 2 × 100 mg/d, jeweils für 2 Wo. Bei Immunschwäche zusätzlich systemische Ther. mit Fluconazol 100 mg/d. Der Nutzen einer speziellen Diät oder einer Darmsäuerung ist nicht erwiesen. Candidasepsis Uncharakteristisches Sepsisbild bei Immunschwäche ( 9.9.5 , Tab. 9.27 ), Klinikeinweisung bei Verdacht. Haut-/Schleimhaut-Candidose Klinik Je nach Lokalisation Glossitis, Ösophagitis, Intertrigo, Balanitis (13.7.2), Vulvitis mit weißlichem geruchlosem Fluor (14.3), Urethritis (13.3) mit Dysurie, Paronychie oder Nagelveränderungen. Bei Schleimhautbefall Juckreiz, weißliche, abwischbare Beläge. Die Schleimhaut unter den Belägen ist gerötet, kann bluten und ulzerieren. Bei Hautbefall flache kleine Bläschen und Pusteln, manchmal weißer Belag und Schuppung. Candida-Mykose:Haut/Schleimhaut Diagnostik Klinischer Aspekt, mikroskopisches Nativpräparat (32.1.5) aus Abstrichen von Haut-/Schleimhautläsionen. Ggf. Einsendung zum kulturellen Nachweis. Bei V.a. Ösophagitis (retrosternales Brennen) Facharztüberweisung zur Gastroskopie. Therapie Lokalbehandlung mit Nystatin oder Amphotericin B Creme, Suspension etc., aber auch bei Hautbefall Clotrimazol bis zur Rückbildung der Beschwerden. Bei Immunschwäche ( 9.5.1 ) zusätzlich systemische Ther. mit Fluconazol: Erw. 100 mg/d p.o., Kinder > 1 J.: 3–6 mg/kg KG/d. Darmcandidose Starke Candida-Mykose:DarmVermehrung bei Schädigung der normalen Darmflora durch antibakt. Ther. Krankheitswert erst bei Diarrhoe und Keimzahl > 10 6 /ml. Vorkommen: Bei antibiotisch vorbehandelten Pat. oder schwerer Immunschwäche. Klinik Meist asymptomatisch, gelegentlich leichte Diarrhoe, Blähungen. Diagnostik Stuhluntersuchung auf pathogene Keime mit Zusatzfrage Candidose möglich (in Kultur Hinweis auf massenhaftes Auftreten?). Therapie Wenn möglich Antibiotika absetzen, symptomatische Ther. der Diarrhö. Orale Gabe von Nystatin 3 × 2 Drgs./d oder Amphotericin B 2 × 100 mg/d, jeweils für 2 Wo. Bei Immunschwäche zusätzlich systemische Ther. mit Fluconazol 100 mg/d. Der Nutzen einer speziellen Diät oder einer Darmsäuerung ist nicht erwiesen. Candidasepsis Uncharakteristisches Sepsisbild bei Immunschwäche ( 9.9.5 , Tab. 9.27 ), Klinikeinweisung bei Verdacht. 9.5.3 Systemische Mykosen Tab. 9.21 Übersicht systemische Mykosen Erreger Vorkommen; Risikofaktoren Krankheitsbilder Nachweis ∗ Aspergillus sp. (Schimmelpilz) Ubiquitär, z.B. Blumenerde; Abwehrschwäche Otomykose, Lungenbefall: Diffus oder Aspergillome. Seltener Endokarditis, Endophthalmitis Kultur aus Sputum, BAL, sterilen Biopsien + Histologie Mucor (Schimmelpilz) Ubiquitär; Abwehrschwäche Otomykose, Sinusitis, Enzephalitis, Hirnsinusthrombose Kultur aus Abszessaspiraten, Liquor. Histologie Candida albicans ( 9.5.2 ) Bestandteil der Darmflora; Abwehrschwäche, nosokomial Haut- und Schleimhautbefall (Soor); Sepsis Direktpräparat; Kultur aus Abstrichen, Biopsien, Blutkulturen Coccidioides immitis Südwest-USA, Mittel- und Südamerika; sehr selten; obligat pathogen In 60 % grippeähnlicher Verlauf; in 40 % Pneumonie, Pleuritis, Arthralgien; in 0,5 % Sepsis Präparat und Kultur aus Sputum, BAL Cryptococcus neoformans 9.9.5 Histoplasma capsulatum USA; Vogelkot, Fledermauskot; sehr selten; obligat pathogen Primärinf.: Tbc-ähnliche Lungenerkr. Bei AIDS Befall von Leber, Milz, Lk, KM Mikroskopische Präparate, Kultur aus Sputum, Eiter, Biopsien Blastomyces dermatidis Nordamerika; sehr selten; obligat pathogen Hautbefall mit Papillomatose, Mikroabszesse mit Fistelung; Befall von Leber, Milz, Lk, Knochen Mikroskopische Präparate, Kultur aus Sputum, Eiter, Biopsien Blastomyces brasiliensis Südamerika; sehr selten, obligat pathogen Ulzerierende Stomatitis mit Zahnausfall; sekundärer Befall von Haut, Lk, Milz, Leber; Pneumonie Mikroskopische Präparate, Kultur aus Sputum, Eiter, Biopsien ∗ Außer bei Erythrococcus neoformans PCR aus Biopsaten und Abstrichen möglich; serologische Methoden haben eine schlechte Sensitivität. 9.5.4 Dermatophytosen Erkr. durch Fadenpilze, die Haut (Flechten = Tineae), Nägel (Onychomykosen) und Haare (Trichophytosen) befallen können. Tineae sind meist Mischinf. aus Epidermophyton- und Trichophytonarten. Hautbefall (26.6). 9.6 Protozoeninfektionen 9.6.1 Toxoplasmose Candida-Mykose:Sepsis Erreger Toxoplasma gondii, weltweite Verbreitung, hohe Durchseuchung (50–70 %). Hauptwirt: Katzen, Mensch Dermatophytoseals (Fehl-)Zwischenwirt. Übertragung durch Verzehr zystenhaltigen rohen Fleisches von Schwein, Schaf, Ziege sowie durch Katzenkot und kontaminierten Erdboden, aber auch Genuss von ungewaschenem Salat u. Gemüse. Meist klinisch stumme Primärinf. Obligat intrazelluläre Lebensweise des Erregers, Persistenz v.a. im ZNS. Nachlassende Immunität führt Protozoeninfektionzur reaktivierten ToxoplasmoseToxoplasmose. Konnatale Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik • Postnatale Inf.: Bei Immunkompetenten meist inapparent. In seltenen Fällen fieberhafte Erkr. mit zervikal betonter, generalisierter, nicht dolenter Lk-Schwellung. Gelegentlich Hepatosplenomegalie. KO (v.a. Enzephalitis) sehr selten, in diesen Fällen besteht V.a. Immunschwäche (dann meist Reaktivierung einer inapparent verlaufenen Erstinf.). Persistenz der Lk-Schwellungen für mehrere Wo., sonst sehr gute Prognose. • Enzephalitis bei Immunsupprimierten: Durch reaktivierte Inf. 50–70 % aller HIV-pos. Pat. sind infiziert, 40 % davon erkranken im Stadium AIDS an einer ZNS-Toxoplasmose. Leitsymptome: Fokale neurologische Ausfälle und hirnorganisches Psychosyndrom mit oder ohne Fieber. Diagnostik Serologisch mit polyvalentem Toxo-Ak-Suchtest bzw. von IgG und IgM qualitativ. Wenn IgM pos., weitere Beurteilung durch quantitative Bestimmung von IgG und IgM mit Verlaufskontrolle nach 2–3 Wo. Bei V.a. Enzephalitis Klinikeinweisung. Pränatale/konnatale Toxoplasmose Bes. Bedeutung, weil sie zu einer schweren kindlichen Schädigung führen kann. Bei Primärinf. der Schwangeren in 50 % d.F. Inf. der Frucht. 50–80 % der Schwangeren sind seroneg. und damit gefährdet. Die Primärinf. verläuft bei 75 % der Schwangeren inapparent. Das Schädigungsausmaß hängt vom Zeitpunkt der Inf. ab und ist im 1. Trimenon am größten. Bei der Geburt haben nur 6–10 % der Kinder klinische Symptome, die klassische Trias "Hydrozephalus, Retinochorioiditis, zerebrale Kalzifikationen" tritt nur in 2 % auf. Am häufigsten ist die Geburt von subklinisch infizierten Kindern. In der Neugeborenenperiode ggf. Fieber, Konvulsionen oder prolongierter Ikterus. Am häufigsten ist der latente Verlauf, wobei sich die Schädigung erst im Kindes- und Jugendalter manifestiert: Retinochorioiditis, Schielen, Taubheit, psychomotorische Retardierung, Epilepsie. Serologisch lässt sich der Infektionsstatus von Mutter und Kind zuverlässig beurteilen. Noch keine obligate Untersuchung im Rahmen der Schwangerenvorsorge. Tab. 9.22 Serologie nach Stufenplan (möglichst durch Gynäkologen nach Absprache mit der Schwangeren) IgG IgM Infektionsstatus Maßnahmen 1 Negativ – ∗ Infektionsgefährdet Kontrollen alle 2 Mon. 2 Positiv Negativ Inaktive Inf. Keine weiteren Maßnahmen 3 Negativ Positiv Siehe Zeilen 5–8 Quantitative AK-Bestimmung ∗∗ 4 Positiv Positiv 5 IgG niedrig IgM niedrig Inaktive (latente) Inf. Kontrolle in 2–3 Wo. 6 IgG hoch IgM niedrig Abklingende Inf. 7 IgG hoch IgM hoch Aktive Inf. Therapie; Kontrolle in 2–3 Wo.; Speziallabor ∗∗∗ zur weiteren Differenzierung 8 IgG niedrig IgM hoch Primärinf. ∗ Eine alleinige Bestimmung von IgG wird als Screeninguntersuchung aus Kosten-Nutzen-Gründen als ausreichend angesehen, größere Sicherheit bietet aber die gleichzeitige Bestimmung von IgG und IgM; falls angeboten, Untersuchung mit einem polyvalenten (= IgG-/IgM-/IgA-)Test ∗∗ Ergebnisse und Bewertung methodenabhängig ∗∗∗ Speziallabor für Toxoplasmose: IgG-Avidität, IgM-ISAGA (= Immunosorbent Agglutinationsassay) Vorgehen bei einer akuten Toxoplasmose in der Schwangerschaft • Einleiten der antiparasitären Chemother. durch Gynäkologen. • Bis zum Ende der 15. SSW nur mit Spiramycin; danach auf Pyrimethamin + Sulfadiazin umstellen. • Ab der 16. SSW Kombinationsther. Pyrimethamin + Sulfadiazin, Therapiezyklen von 4 Wo. mit behandlungsfreien Intervallen von 4 Wo. Zur Prävention einer Depression der Hämatopoese supportive Gabe von Folinsäure. Bei Unverträglichkeit von Sulfonamiden Ther. mit Spiramycin. Reduktion der intrauterinen Infektionsrate durch Spiramycin um 60 %, durch Pyrimethamin + Sulfadiazin um 90 %. Die Ther. führt nicht zur Eradikation der Toxoplasmen, sondern induziert den Übergang in die Latenz und reduziert das Schädigungsausmaß. Sofern sonographisch kein V.a. intrauterine Schädigung, besteht keine Ind. zur Abruptio. Ab der 16. SSW und wenn bisher keine Ther. erfolgt ist, kann durch Fruchtwasser-PCR geklärt werden, ob es zu einer fet. Inf. gekommen ist. Präventivmaßnahmen bei seronegativen Schwangeren • Katzenkontakt vermeiden bzw. das Katzenklo tägl. von einer nichtschwangeren Person mit heißem Wasser gut reinigen lassen. • Gemüse und Obst gut waschen. • Hände nach Gartenarbeiten, Zubereitung von Fleisch und vor jedem Essen gründlich mit Seife waschen. • Nur ausreichend erhitztes Fleisch (> 70 °C) essen. 9.6.2 Lambliasis (Giardiasis) Erreger Giardia lamblia (Syn. Lamblia intestinalis), weltweite Verbreitung, in warmen Ländern häufiger. Inf. durch fäkal verunreinigtes Trinkwasser und Lebensmittel. Asymptomatische Träger sind häufig. Klinik IKZ 4 d–4 Wo. Symptome nur bei starkem Befall: Akute oder chron. wässrige Diarrhoe, Bauchschmerzen, Malabsorptionssyndrom. Gutartiger Verlauf. Diagnostik Antigennachweis oder mikroskopischer Nachweis im Stuhl; bei neg. Stuhl Untersuchung Gardiasisvon Duodenalsaft oder -biopsie. Stuhl-PCR Lambliasisam sensitivsten. Therapie Metronidazol 3 × 250 mg/d p.o. für 7 d. Kontrolluntersuchung nach 2 Mon., da Rezidive möglich. 9.6.3 Sonstige Protozoeninfektionen Malaria 9.10.8 , Pneumocystis carinii 9.9.5 , Trichomoniasis 9.8.3 . Tab. 9.23 Protozoeninfektionen Krankheit, Erreger Vorkommen; Übertragung; IKZ Krankheitsbild Nachweis Amöbenruhr, Entamoeba histolytica Tropische/subtropische Länder; Trinkwasser, Lebensmittel; 4 d–4 Mon. Abdominalschmerzen, blutig-schleimiger Stuhl. KO: Leberabszess Aus Stuhl Antigennachweis oder mikroskopisch. Amöbenstuhl-PCR. Serologie Kryptosporidien ( 9.9.5 ) Ubiquitär; Zoonose, Schmierinf.; 3–12 d, sehr häufige Durchfallerreger Akute Gastroenteritis. Bei AIDS profuse wässrige Durchfälle Mikroskopisch oder Antigennachweis aus Stuhl Isospora belli Ubiquitär; Schmierinf.; 3–12 d Bei AIDS profuse wässrige Durchfälle Mikroskopisch aus Stuhlproben Haut-Leishmaniose, versch. Leishmania-Spezies Mittelmeerraum, Naher Osten, Nordafrika; Stechfliegen; 2–6 Wo. Schlecht heilende Hautulzera Tupfpräparate aus Ulzera, Färbung nach Giemsa, Biopsie, PCR Schleimhaut-Leishmaniose, L. brasiliensis u.a. Süd- und Mittelamerika; Stechfliegen; 10 d–6 Mon. Haut- und Schleimhautulzera; Destruktion des Gesichtsschädels Viszerale Leishmaniose, L. donovani Naher Osten, Indien, Mittelmeerraum; Stechfliegen; 10 d–12 Mon. Schleichende, fieberhafte Erkr., Hepatosplenomegalie Mikroskopisch aus Milz-, Leber-, Lk-, KM-Punktaten. Serologie, PCR Chagas-Krankheit, Trypanosoma cruzi Mittel- und Südamerika; Zoonose, Wanzen; 10–20 d Akutes Stadium: Fieber, Lk-Schwellung, Gesichtsödeme Chron. Stadium: Megaorgane, Herzinsuff. Akutes Stadium: Err. im Blut, ggf. nach Anreicherung Chron. Stadium: Serologie, Biopsien. Schlafkrankheit, Trypanosoma brucei gambiense, T. brucei rhodesiense Tropisches Afrika; Tse-Tse-Fliege Stadium 1: 1–3 Wo., Stadium 2: 4 Wo.–12 Mon. An Einstichstellen Primäraffekt (Ulkus) Stadium 1: Fieber, general. Lk-Schwellung. Stadium 2: Neurol. Ausfälle, Schläfrigkeit Serologie. Err.-Nachweis aus Primäraffekt, Blut, Lk-Punktaten, Liquor Angaben zur Meldepflicht 9.11 9.6.1 Toxoplasmose Candida-Mykose:Sepsis Erreger Toxoplasma gondii, weltweite Verbreitung, hohe Durchseuchung (50–70 %). Hauptwirt: Katzen, Mensch Dermatophytoseals (Fehl-)Zwischenwirt. Übertragung durch Verzehr zystenhaltigen rohen Fleisches von Schwein, Schaf, Ziege sowie durch Katzenkot und kontaminierten Erdboden, aber auch Genuss von ungewaschenem Salat u. Gemüse. Meist klinisch stumme Primärinf. Obligat intrazelluläre Lebensweise des Erregers, Persistenz v.a. im ZNS. Nachlassende Immunität führt Protozoeninfektionzur reaktivierten ToxoplasmoseToxoplasmose. Konnatale Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik • Postnatale Inf.: Bei Immunkompetenten meist inapparent. In seltenen Fällen fieberhafte Erkr. mit zervikal betonter, generalisierter, nicht dolenter Lk-Schwellung. Gelegentlich Hepatosplenomegalie. KO (v.a. Enzephalitis) sehr selten, in diesen Fällen besteht V.a. Immunschwäche (dann meist Reaktivierung einer inapparent verlaufenen Erstinf.). Persistenz der Lk-Schwellungen für mehrere Wo., sonst sehr gute Prognose. • Enzephalitis bei Immunsupprimierten: Durch reaktivierte Inf. 50–70 % aller HIV-pos. Pat. sind infiziert, 40 % davon erkranken im Stadium AIDS an einer ZNS-Toxoplasmose. Leitsymptome: Fokale neurologische Ausfälle und hirnorganisches Psychosyndrom mit oder ohne Fieber. Diagnostik Serologisch mit polyvalentem Toxo-Ak-Suchtest bzw. von IgG und IgM qualitativ. Wenn IgM pos., weitere Beurteilung durch quantitative Bestimmung von IgG und IgM mit Verlaufskontrolle nach 2–3 Wo. Bei V.a. Enzephalitis Klinikeinweisung. Pränatale/konnatale Toxoplasmose Bes. Bedeutung, weil sie zu einer schweren kindlichen Schädigung führen kann. Bei Primärinf. der Schwangeren in 50 % d.F. Inf. der Frucht. 50–80 % der Schwangeren sind seroneg. und damit gefährdet. Die Primärinf. verläuft bei 75 % der Schwangeren inapparent. Das Schädigungsausmaß hängt vom Zeitpunkt der Inf. ab und ist im 1. Trimenon am größten. Bei der Geburt haben nur 6–10 % der Kinder klinische Symptome, die klassische Trias "Hydrozephalus, Retinochorioiditis, zerebrale Kalzifikationen" tritt nur in 2 % auf. Am häufigsten ist die Geburt von subklinisch infizierten Kindern. In der Neugeborenenperiode ggf. Fieber, Konvulsionen oder prolongierter Ikterus. Am häufigsten ist der latente Verlauf, wobei sich die Schädigung erst im Kindes- und Jugendalter manifestiert: Retinochorioiditis, Schielen, Taubheit, psychomotorische Retardierung, Epilepsie. Serologisch lässt sich der Infektionsstatus von Mutter und Kind zuverlässig beurteilen. Noch keine obligate Untersuchung im Rahmen der Schwangerenvorsorge. Tab. 9.22 Serologie nach Stufenplan (möglichst durch Gynäkologen nach Absprache mit der Schwangeren) IgG IgM Infektionsstatus Maßnahmen 1 Negativ – ∗ Infektionsgefährdet Kontrollen alle 2 Mon. 2 Positiv Negativ Inaktive Inf. Keine weiteren Maßnahmen 3 Negativ Positiv Siehe Zeilen 5–8 Quantitative AK-Bestimmung ∗∗ 4 Positiv Positiv 5 IgG niedrig IgM niedrig Inaktive (latente) Inf. Kontrolle in 2–3 Wo. 6 IgG hoch IgM niedrig Abklingende Inf. 7 IgG hoch IgM hoch Aktive Inf. Therapie; Kontrolle in 2–3 Wo.; Speziallabor ∗∗∗ zur weiteren Differenzierung 8 IgG niedrig IgM hoch Primärinf. ∗ Eine alleinige Bestimmung von IgG wird als Screeninguntersuchung aus Kosten-Nutzen-Gründen als ausreichend angesehen, größere Sicherheit bietet aber die gleichzeitige Bestimmung von IgG und IgM; falls angeboten, Untersuchung mit einem polyvalenten (= IgG-/IgM-/IgA-)Test ∗∗ Ergebnisse und Bewertung methodenabhängig ∗∗∗ Speziallabor für Toxoplasmose: IgG-Avidität, IgM-ISAGA (= Immunosorbent Agglutinationsassay) Vorgehen bei einer akuten Toxoplasmose in der Schwangerschaft • Einleiten der antiparasitären Chemother. durch Gynäkologen. • Bis zum Ende der 15. SSW nur mit Spiramycin; danach auf Pyrimethamin + Sulfadiazin umstellen. • Ab der 16. SSW Kombinationsther. Pyrimethamin + Sulfadiazin, Therapiezyklen von 4 Wo. mit behandlungsfreien Intervallen von 4 Wo. Zur Prävention einer Depression der Hämatopoese supportive Gabe von Folinsäure. Bei Unverträglichkeit von Sulfonamiden Ther. mit Spiramycin. Reduktion der intrauterinen Infektionsrate durch Spiramycin um 60 %, durch Pyrimethamin + Sulfadiazin um 90 %. Die Ther. führt nicht zur Eradikation der Toxoplasmen, sondern induziert den Übergang in die Latenz und reduziert das Schädigungsausmaß. Sofern sonographisch kein V.a. intrauterine Schädigung, besteht keine Ind. zur Abruptio. Ab der 16. SSW und wenn bisher keine Ther. erfolgt ist, kann durch Fruchtwasser-PCR geklärt werden, ob es zu einer fet. Inf. gekommen ist. Präventivmaßnahmen bei seronegativen Schwangeren • Katzenkontakt vermeiden bzw. das Katzenklo tägl. von einer nichtschwangeren Person mit heißem Wasser gut reinigen lassen. • Gemüse und Obst gut waschen. • Hände nach Gartenarbeiten, Zubereitung von Fleisch und vor jedem Essen gründlich mit Seife waschen. • Nur ausreichend erhitztes Fleisch (> 70 °C) essen. Pränatale/konnatale Toxoplasmose Bes. Bedeutung, weil sie zu einer schweren kindlichen Schädigung führen kann. Bei Primärinf. der Schwangeren in 50 % d.F. Inf. der Frucht. 50–80 % der Schwangeren sind seroneg. und damit gefährdet. Die Primärinf. verläuft bei 75 % der Schwangeren inapparent. Das Schädigungsausmaß hängt vom Zeitpunkt der Inf. ab und ist im 1. Trimenon am größten. Bei der Geburt haben nur 6–10 % der Kinder klinische Symptome, die klassische Trias "Hydrozephalus, Retinochorioiditis, zerebrale Kalzifikationen" tritt nur in 2 % auf. Am häufigsten ist die Geburt von subklinisch infizierten Kindern. In der Neugeborenenperiode ggf. Fieber, Konvulsionen oder prolongierter Ikterus. Am häufigsten ist der latente Verlauf, wobei sich die Schädigung erst im Kindes- und Jugendalter manifestiert: Retinochorioiditis, Schielen, Taubheit, psychomotorische Retardierung, Epilepsie. Serologisch lässt sich der Infektionsstatus von Mutter und Kind zuverlässig beurteilen. Noch keine obligate Untersuchung im Rahmen der Schwangerenvorsorge. Tab. 9.22 Serologie nach Stufenplan (möglichst durch Gynäkologen nach Absprache mit der Schwangeren) IgG IgM Infektionsstatus Maßnahmen 1 Negativ – ∗ Infektionsgefährdet Kontrollen alle 2 Mon. 2 Positiv Negativ Inaktive Inf. Keine weiteren Maßnahmen 3 Negativ Positiv Siehe Zeilen 5–8 Quantitative AK-Bestimmung ∗∗ 4 Positiv Positiv 5 IgG niedrig IgM niedrig Inaktive (latente) Inf. Kontrolle in 2–3 Wo. 6 IgG hoch IgM niedrig Abklingende Inf. 7 IgG hoch IgM hoch Aktive Inf. Therapie; Kontrolle in 2–3 Wo.; Speziallabor ∗∗∗ zur weiteren Differenzierung 8 IgG niedrig IgM hoch Primärinf. ∗ Eine alleinige Bestimmung von IgG wird als Screeninguntersuchung aus Kosten-Nutzen-Gründen als ausreichend angesehen, größere Sicherheit bietet aber die gleichzeitige Bestimmung von IgG und IgM; falls angeboten, Untersuchung mit einem polyvalenten (= IgG-/IgM-/IgA-)Test ∗∗ Ergebnisse und Bewertung methodenabhängig ∗∗∗ Speziallabor für Toxoplasmose: IgG-Avidität, IgM-ISAGA (= Immunosorbent Agglutinationsassay) Vorgehen bei einer akuten Toxoplasmose in der Schwangerschaft • Einleiten der antiparasitären Chemother. durch Gynäkologen. • Bis zum Ende der 15. SSW nur mit Spiramycin; danach auf Pyrimethamin + Sulfadiazin umstellen. • Ab der 16. SSW Kombinationsther. Pyrimethamin + Sulfadiazin, Therapiezyklen von 4 Wo. mit behandlungsfreien Intervallen von 4 Wo. Zur Prävention einer Depression der Hämatopoese supportive Gabe von Folinsäure. Bei Unverträglichkeit von Sulfonamiden Ther. mit Spiramycin. Reduktion der intrauterinen Infektionsrate durch Spiramycin um 60 %, durch Pyrimethamin + Sulfadiazin um 90 %. Die Ther. führt nicht zur Eradikation der Toxoplasmen, sondern induziert den Übergang in die Latenz und reduziert das Schädigungsausmaß. Sofern sonographisch kein V.a. intrauterine Schädigung, besteht keine Ind. zur Abruptio. Ab der 16. SSW und wenn bisher keine Ther. erfolgt ist, kann durch Fruchtwasser-PCR geklärt werden, ob es zu einer fet. Inf. gekommen ist. Präventivmaßnahmen bei seronegativen Schwangeren • Katzenkontakt vermeiden bzw. das Katzenklo tägl. von einer nichtschwangeren Person mit heißem Wasser gut reinigen lassen. • Gemüse und Obst gut waschen. • Hände nach Gartenarbeiten, Zubereitung von Fleisch und vor jedem Essen gründlich mit Seife waschen. • Nur ausreichend erhitztes Fleisch (> 70 °C) essen. Pränatale/konnatale Toxoplasmose Bes. Bedeutung, weil sie zu einer schweren kindlichen Schädigung führen kann. Bei Primärinf. der Schwangeren in 50 % d.F. Inf. der Frucht. 50–80 % der Schwangeren sind seroneg. und damit gefährdet. Die Primärinf. verläuft bei 75 % der Schwangeren inapparent. Das Schädigungsausmaß hängt vom Zeitpunkt der Inf. ab und ist im 1. Trimenon am größten. Bei der Geburt haben nur 6–10 % der Kinder klinische Symptome, die klassische Trias "Hydrozephalus, Retinochorioiditis, zerebrale Kalzifikationen" tritt nur in 2 % auf. Am häufigsten ist die Geburt von subklinisch infizierten Kindern. In der Neugeborenenperiode ggf. Fieber, Konvulsionen oder prolongierter Ikterus. Am häufigsten ist der latente Verlauf, wobei sich die Schädigung erst im Kindes- und Jugendalter manifestiert: Retinochorioiditis, Schielen, Taubheit, psychomotorische Retardierung, Epilepsie. Serologisch lässt sich der Infektionsstatus von Mutter und Kind zuverlässig beurteilen. Noch keine obligate Untersuchung im Rahmen der Schwangerenvorsorge. Tab. 9.22 Serologie nach Stufenplan (möglichst durch Gynäkologen nach Absprache mit der Schwangeren) IgG IgM Infektionsstatus Maßnahmen 1 Negativ – ∗ Infektionsgefährdet Kontrollen alle 2 Mon. 2 Positiv Negativ Inaktive Inf. Keine weiteren Maßnahmen 3 Negativ Positiv Siehe Zeilen 5–8 Quantitative AK-Bestimmung ∗∗ 4 Positiv Positiv 5 IgG niedrig IgM niedrig Inaktive (latente) Inf. Kontrolle in 2–3 Wo. 6 IgG hoch IgM niedrig Abklingende Inf. 7 IgG hoch IgM hoch Aktive Inf. Therapie; Kontrolle in 2–3 Wo.; Speziallabor ∗∗∗ zur weiteren Differenzierung 8 IgG niedrig IgM hoch Primärinf. ∗ Eine alleinige Bestimmung von IgG wird als Screeninguntersuchung aus Kosten-Nutzen-Gründen als ausreichend angesehen, größere Sicherheit bietet aber die gleichzeitige Bestimmung von IgG und IgM; falls angeboten, Untersuchung mit einem polyvalenten (= IgG-/IgM-/IgA-)Test ∗∗ Ergebnisse und Bewertung methodenabhängig ∗∗∗ Speziallabor für Toxoplasmose: IgG-Avidität, IgM-ISAGA (= Immunosorbent Agglutinationsassay) Vorgehen bei einer akuten Toxoplasmose in der Schwangerschaft • Einleiten der antiparasitären Chemother. durch Gynäkologen. • Bis zum Ende der 15. SSW nur mit Spiramycin; danach auf Pyrimethamin + Sulfadiazin umstellen. • Ab der 16. SSW Kombinationsther. Pyrimethamin + Sulfadiazin, Therapiezyklen von 4 Wo. mit behandlungsfreien Intervallen von 4 Wo. Zur Prävention einer Depression der Hämatopoese supportive Gabe von Folinsäure. Bei Unverträglichkeit von Sulfonamiden Ther. mit Spiramycin. Reduktion der intrauterinen Infektionsrate durch Spiramycin um 60 %, durch Pyrimethamin + Sulfadiazin um 90 %. Die Ther. führt nicht zur Eradikation der Toxoplasmen, sondern induziert den Übergang in die Latenz und reduziert das Schädigungsausmaß. Sofern sonographisch kein V.a. intrauterine Schädigung, besteht keine Ind. zur Abruptio. Ab der 16. SSW und wenn bisher keine Ther. erfolgt ist, kann durch Fruchtwasser-PCR geklärt werden, ob es zu einer fet. Inf. gekommen ist. Präventivmaßnahmen bei seronegativen Schwangeren • Katzenkontakt vermeiden bzw. das Katzenklo tägl. von einer nichtschwangeren Person mit heißem Wasser gut reinigen lassen. • Gemüse und Obst gut waschen. • Hände nach Gartenarbeiten, Zubereitung von Fleisch und vor jedem Essen gründlich mit Seife waschen. • Nur ausreichend erhitztes Fleisch (> 70 °C) essen. 9.6.2 Lambliasis (Giardiasis) Erreger Giardia lamblia (Syn. Lamblia intestinalis), weltweite Verbreitung, in warmen Ländern häufiger. Inf. durch fäkal verunreinigtes Trinkwasser und Lebensmittel. Asymptomatische Träger sind häufig. Klinik IKZ 4 d–4 Wo. Symptome nur bei starkem Befall: Akute oder chron. wässrige Diarrhoe, Bauchschmerzen, Malabsorptionssyndrom. Gutartiger Verlauf. Diagnostik Antigennachweis oder mikroskopischer Nachweis im Stuhl; bei neg. Stuhl Untersuchung Gardiasisvon Duodenalsaft oder -biopsie. Stuhl-PCR Lambliasisam sensitivsten. Therapie Metronidazol 3 × 250 mg/d p.o. für 7 d. Kontrolluntersuchung nach 2 Mon., da Rezidive möglich. 9.6.3 Sonstige Protozoeninfektionen Malaria 9.10.8 , Pneumocystis carinii 9.9.5 , Trichomoniasis 9.8.3 . Tab. 9.23 Protozoeninfektionen Krankheit, Erreger Vorkommen; Übertragung; IKZ Krankheitsbild Nachweis Amöbenruhr, Entamoeba histolytica Tropische/subtropische Länder; Trinkwasser, Lebensmittel; 4 d–4 Mon. Abdominalschmerzen, blutig-schleimiger Stuhl. KO: Leberabszess Aus Stuhl Antigennachweis oder mikroskopisch. Amöbenstuhl-PCR. Serologie Kryptosporidien ( 9.9.5 ) Ubiquitär; Zoonose, Schmierinf.; 3–12 d, sehr häufige Durchfallerreger Akute Gastroenteritis. Bei AIDS profuse wässrige Durchfälle Mikroskopisch oder Antigennachweis aus Stuhl Isospora belli Ubiquitär; Schmierinf.; 3–12 d Bei AIDS profuse wässrige Durchfälle Mikroskopisch aus Stuhlproben Haut-Leishmaniose, versch. Leishmania-Spezies Mittelmeerraum, Naher Osten, Nordafrika; Stechfliegen; 2–6 Wo. Schlecht heilende Hautulzera Tupfpräparate aus Ulzera, Färbung nach Giemsa, Biopsie, PCR Schleimhaut-Leishmaniose, L. brasiliensis u.a. Süd- und Mittelamerika; Stechfliegen; 10 d–6 Mon. Haut- und Schleimhautulzera; Destruktion des Gesichtsschädels Viszerale Leishmaniose, L. donovani Naher Osten, Indien, Mittelmeerraum; Stechfliegen; 10 d–12 Mon. Schleichende, fieberhafte Erkr., Hepatosplenomegalie Mikroskopisch aus Milz-, Leber-, Lk-, KM-Punktaten. Serologie, PCR Chagas-Krankheit, Trypanosoma cruzi Mittel- und Südamerika; Zoonose, Wanzen; 10–20 d Akutes Stadium: Fieber, Lk-Schwellung, Gesichtsödeme Chron. Stadium: Megaorgane, Herzinsuff. Akutes Stadium: Err. im Blut, ggf. nach Anreicherung Chron. Stadium: Serologie, Biopsien. Schlafkrankheit, Trypanosoma brucei gambiense, T. brucei rhodesiense Tropisches Afrika; Tse-Tse-Fliege Stadium 1: 1–3 Wo., Stadium 2: 4 Wo.–12 Mon. An Einstichstellen Primäraffekt (Ulkus) Stadium 1: Fieber, general. Lk-Schwellung. Stadium 2: Neurol. Ausfälle, Schläfrigkeit Serologie. Err.-Nachweis aus Primäraffekt, Blut, Lk-Punktaten, Liquor Angaben zur Meldepflicht 9.11 9.7 Wurmerkrankungen Präpatenz: Zeitraum zwischen Inf. und erstem Auftreten von Geschlechtsprodukten (Eier oder Larven) im Stuhl, Blut, Urin. 9.7.1 Madenwurm-Infektion Erreger Enterobius vermicularis (Oxyuren), Größe 10–12 mm. Häufigste Wurmerkr. des Menschen in Mitteleuropa. Sitz der Würmer im Ileum und Kolon, die Eier werden von den Würmern außen (!) am After abgelegt. Übertragungswege: • Durch Kratzen am After digital-orale Reinf. • Schmierinf. • Aufnahme der Eier mit kontaminiertem Gemüse. Präpatenz 5–8 Wo. Klinik Häufiges Symptom: Oft heftiges Afterjucken mit Schlafstörungen; bei weibl. Pat. Vulvovaginitis und Madenwurm-InfektionSalpingitis möglich. Diagnostik Nachweis der Eier im Analabstrich: Morgens wird ein Klebestreifen auf den After aufgedrückt, anschließend auf einen Objektträger geklebt und mikroskopiert (s.a. 32.1.5). Stuhlmikroskopie. Therapie • Pyrvinium, z.B. Molevac® 1 Drg. bzw. 5 ml/10 kg KG als Einmaldosis. • Alternativ: Mebendazol, z.B. Vermox® 100 mg (nicht in den ersten 6 Mon. der Grav.) als Einmaldosis. • Alternativ: Pyrantelembonat, z.B. Helmex®. Erw.: 10 mg/kg KG, max. 1 g. Kinder: <12 kg KG ½ Messl., 12–22 kg KG 1 Messl., 22–41 kg KG 2 Messl., 41–75 kg KG 3 Messl. Suspension. • KI: Alter < 6 Mon. Wiederholung nach 14 d. Strenge Ind. bei Kindern < 1 J. • Untersuchung und Mitbehandlung von Kontaktpersonen. • Nach dem Stuhlgang Hände mit Seife und Nagelbürste reinigen. Bett- und Leibwäsche 8 d lang tägl. wechseln und auskochen, tägl. den Fußboden saugen. • Kontrolluntersuchungen nach 2, 4 und 6 Wo. 9.7.2 Spulwurm-Infektion (Ascariasis) Erreger Ascaris lumbricoides, Größe 10–40 cm. Einziger Wirt ist der Mensch. Sitz der adulten Würmer im Dünndarm. Übertragungsweg: Kontamination von Gemüse durch Fäkaldüngung, nach oraler Aufnahme der Eier Wanderung der Larve im Körper: Dünndarm → Portalvenen → Leber → Herz → Lunge → Alveolen → Trachea → Pharynx → Darm. In Mitteleuropa relativ häufig, Durchseuchung in der Dritten Welt 50–90 %. Präpatenz 7 Wo.–3 Mon. Klinik Ascaris lumbricoidesCa. 1 Wo. p.i.Spulwurm-Infektion oft leichtes Fieber, Husten mit blutig tingiertem Sputum (flüchtiges Lungeninfiltrat). Darmbefall zu 85 % asymptomatisch; abhängig von der Befallsstärke uncharakteristische Abdominalbeschwerden, Appetitlosigkeit, Malabsorption. KO (selten): Einwanderung in Gallengänge bzw. Pankreasgang, Ileus durch Wurmknäuel. Diagnostik Mikroskopischer Nachweis der Eier im Stuhl, ggf. nach Anreicherung. Großes BB: Eosinophilie. Therapie Mebendazol, z.B. Vermox® 2 × 100 mg p.o. für 3 d (nicht in den ersten 6 Mon. der Grav.). In diesen Fällen Einmaldosis Pyrantel, z.B. Helmex®, Erw.: 10 mg/kg KG, Kinder: 6–12 J. 500 mg, 2–6 J. 250 mg, ½–2 J. 125 mg. KI: Kinder < 6 Mon. 9.7.3 Bandwurm-Infektion (Zestoden) Erreger Inf. durch Aufnahme von Finnen (Größe 3–10 mm) in rohem Fleisch von Zwischenwirten, z.B. Hackfleisch. Sitz der adulten Würmer im Dünndarm, Größe mehrere Meter, Ausscheidung von Wurmgliedern (= Proglottiden). Benennung der Wurmspezies nach dem Zwischenwirt: • Rinderbandwurm (Taenia saginata), häufig, Rinderbefall in Mitteleuropa 1–2 %, Präpatenz 11 Wo. • Schweinbandwurm (Taenia solium), selten, Präpatenz 5–11 Wo.; auch die Eier Bandwurm-Infektionsind für den Menschen infektiös (Zystizerkose). • Fischbandwurm (Diphyllobotrium latum), selten, Präpatenz 20 d. Klinik Darmbefall meist symptomlos, gelegentlich uncharakteristische Abdominalbeschwerden, gelegentlich Appetitverlust, Gewichtsverlust. Zystizerkose: Nach Aufnahme von Eiern des Schweinebandwurms Invasion der Larven mit Finnenbildung in der Muskulatur (meist symptomlos) oder in anderen Organen. KO: Neurozystizerkose bei Befall des ZNS mit fokalen Ausfällen, Krampfanfällen, Erblindung. Diagnostik • Makroskopisch: Gelbweiße Wurmglieder im Stuhl, anfangs eigenbeweglich. Cave: Infektionsgefahr mit Zystizerkose bei Schweinebandwurm! • Mikroskopisch: Nachweis der Wurmeier im Stuhl. Diff.-BB: Meist keine Eosinophilie. Therapie Einmaldosis Praziquantel, z.B. Cesol® Tbl. à 150 mg, 5–10 mg/kg KG p.o., Kinder < 2 J. 0,5 g, 2–6 J. 1,0 g. Alternativ: Niclosamid, z.B. Yomesan® Tbl. à 0,5 g, 2 g p.o. als ED. Wirkung nur auf adulte Würmer. Strenge Hygiene bei Behandlung von T. solium wegen Gefahr der Autoinf. Bei V.a. Zystizerkose Klinikeinweisung. Prognose Sehr gut. Bei Neurozystizerkose abhängig von der Lokalisation. 9.7.4 Echinokokkus-Infektion Echinococcus granulosus (Hundebandwurm) Erreger Sitz der adulten Würmer (Größe 4 mm) im Dünndarm von Hunden. Natürlicher Zwischenwirt: Weidetiere. Bei oraler Aufnahme von Eiern Invasion der Larven mit Finnenbildung in Leber (60 %), Lunge (20 %) u.a. Organen. Langsam verdrängendes Wachstum in Form von Zysten (Größe bis 20 cm und mehr) durch Tochterfinnen. Vorkommen weltweit, in Mitteleuropa meist importierte Fälle. Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Beschwerden durch Echinokokkus-InfektionRaumforderung der Zysten, je Hundebandwurmnach Lokalisation: Oberbauchschmerzen, tastbarer Oberbauchtumor, Cholestase. Bei Lungenbefall Atelektasen, Hämoptysen, bei ZNS-Befall (selten) fokal-neurologische Ausfälle, Krampfanfälle. Komplikationen Selten; lokale oder hämatogene Metastasierung nach Punktion oder Ruptur der Zysten. Bei Zystenruptur oft anaphylaktischer Schock. Diagnostik Abdomen-Sono, CT, Serologie (pos. bei Leberbefall 90 %, bei Lungenbefall 60 %). Nur selten Eosinophilie. Diagn. Punktion der Zysten ist streng kontraindiziert. Therapie Klinikeinweisung zur operativen Entfernung oder Verödung (PAIR) der Zyste(n). Prä- und postop. Chemother. mit Albendazol, z.B. Eskazole® 10–15 mg/kg KG/d (Standarddosis 2 × 400 mg/d) für mehrere Mon. In inoperablen Fällen unbefristet, da die Chemother. nur parasitostatisch wirkt. Prognose In operablen Fällen sehr gut, in inoperablen Fällen abhängig von der Lokalisation. Prophylaxe Hunde und Katzen regelmäßig entwurmen und nur mit gekochtem Fleisch füttern. Echinococcus alveolaris (Fuchsbandwurm) Erreger Sitz der adulten Würmer (Größe 2 mm) im Dünndarm von Fuchs, Hund, Katze; natürlicher Zwischenwirt = Feldmaus. Nach oraler Aufnahme der Eier Invasion der Larven mit Finnenbildung in der Leber. Durch infiltrativ-destruierendes Wachstum Organzerstörung und Übergriff auch auf andere Abdominalorgane. Langsames Wachstum über viele J., Manifestationsgipfel: 40. Lj. Endemiegebiete in Süddeutschland, Österreich und Osteuropa. Klinik Uncharakteristische Oberbauchbeschwerden, FuchsbandwurmCholestasezeichen. Diagnostik Abdomen-Sono, CT, Serologie. Nur selten Eosinophilie. Therapie Entfernung des Parasiten durch Radikal-OP oft nicht möglich. Chemother. mit Albendazol, z.B. Eskazole® 10–15 mg/kg KG, bei kurativer OP 2 J., sonst lebenslang. Überwachung der Pat. für mind. 10 J. Chemother. wirkt nur parasitostatisch. Prognose 5JÜR bei adäquater Ther. 90 % (abhängig von der Lokalisation). Prophylaxe Hunde/Katzen regelmäßig entwurmen und nur mit gekochtem Fleisch füttern. Handschuhe beim Umgang mit (toten) Füchsen. Erhöhtes Risiko für Beerensammler und Jäger epidemiologisch nicht gesichert. 9.7.5 Trichinose Erreger Trichinella spiralis, weltweites Vorkommen. Inf. durch Verzehr von trichinenhaltigem ungenügend erhitztem Fleisch, meist vom Schwein (geräucherter Schinken!); evtl. auch Bären oder andere Wildtiere betroffen. Adulte Würmer im Darm, Invasion der Larven in die Muskulatur, dort Verkapselung als Trichinen. Oft Kleinepidemien. Klinik Je nach Befallsstärke asymptomatisch bis lebensbedrohlich. Nach 1–7 d Durchfälle, ab dem 7. d Fieber (meist Kontinua), Muskelschmerzen, evtl. Doppelbilder, TrichinoseGesichtsschwellung, Lidödeme. Diagnostik Großes BB: Leukozytose, Eosinophilie. CK-Erhöhung. Serologie. Klinikeinweisung bei Verdacht. Umgebungsuntersuchung. Therapie Stationär. Mebendazol, z.B. Vermox® für 14 d, ggf. plus Prednison. Prognose Bei adäquater Behandlung gut, selten Tod durch Herzrhythmusstörungen bei myokardialer Eosinophilie. 9.7.1 Madenwurm-Infektion Erreger Enterobius vermicularis (Oxyuren), Größe 10–12 mm. Häufigste Wurmerkr. des Menschen in Mitteleuropa. Sitz der Würmer im Ileum und Kolon, die Eier werden von den Würmern außen (!) am After abgelegt. Übertragungswege: • Durch Kratzen am After digital-orale Reinf. • Schmierinf. • Aufnahme der Eier mit kontaminiertem Gemüse. Präpatenz 5–8 Wo. Klinik Häufiges Symptom: Oft heftiges Afterjucken mit Schlafstörungen; bei weibl. Pat. Vulvovaginitis und Madenwurm-InfektionSalpingitis möglich. Diagnostik Nachweis der Eier im Analabstrich: Morgens wird ein Klebestreifen auf den After aufgedrückt, anschließend auf einen Objektträger geklebt und mikroskopiert (s.a. 32.1.5). Stuhlmikroskopie. Therapie • Pyrvinium, z.B. Molevac® 1 Drg. bzw. 5 ml/10 kg KG als Einmaldosis. • Alternativ: Mebendazol, z.B. Vermox® 100 mg (nicht in den ersten 6 Mon. der Grav.) als Einmaldosis. • Alternativ: Pyrantelembonat, z.B. Helmex®. Erw.: 10 mg/kg KG, max. 1 g. Kinder: <12 kg KG ½ Messl., 12–22 kg KG 1 Messl., 22–41 kg KG 2 Messl., 41–75 kg KG 3 Messl. Suspension. • KI: Alter < 6 Mon. Wiederholung nach 14 d. Strenge Ind. bei Kindern < 1 J. • Untersuchung und Mitbehandlung von Kontaktpersonen. • Nach dem Stuhlgang Hände mit Seife und Nagelbürste reinigen. Bett- und Leibwäsche 8 d lang tägl. wechseln und auskochen, tägl. den Fußboden saugen. • Kontrolluntersuchungen nach 2, 4 und 6 Wo. 9.7.2 Spulwurm-Infektion (Ascariasis) Erreger Ascaris lumbricoides, Größe 10–40 cm. Einziger Wirt ist der Mensch. Sitz der adulten Würmer im Dünndarm. Übertragungsweg: Kontamination von Gemüse durch Fäkaldüngung, nach oraler Aufnahme der Eier Wanderung der Larve im Körper: Dünndarm → Portalvenen → Leber → Herz → Lunge → Alveolen → Trachea → Pharynx → Darm. In Mitteleuropa relativ häufig, Durchseuchung in der Dritten Welt 50–90 %. Präpatenz 7 Wo.–3 Mon. Klinik Ascaris lumbricoidesCa. 1 Wo. p.i.Spulwurm-Infektion oft leichtes Fieber, Husten mit blutig tingiertem Sputum (flüchtiges Lungeninfiltrat). Darmbefall zu 85 % asymptomatisch; abhängig von der Befallsstärke uncharakteristische Abdominalbeschwerden, Appetitlosigkeit, Malabsorption. KO (selten): Einwanderung in Gallengänge bzw. Pankreasgang, Ileus durch Wurmknäuel. Diagnostik Mikroskopischer Nachweis der Eier im Stuhl, ggf. nach Anreicherung. Großes BB: Eosinophilie. Therapie Mebendazol, z.B. Vermox® 2 × 100 mg p.o. für 3 d (nicht in den ersten 6 Mon. der Grav.). In diesen Fällen Einmaldosis Pyrantel, z.B. Helmex®, Erw.: 10 mg/kg KG, Kinder: 6–12 J. 500 mg, 2–6 J. 250 mg, ½–2 J. 125 mg. KI: Kinder < 6 Mon. 9.7.3 Bandwurm-Infektion (Zestoden) Erreger Inf. durch Aufnahme von Finnen (Größe 3–10 mm) in rohem Fleisch von Zwischenwirten, z.B. Hackfleisch. Sitz der adulten Würmer im Dünndarm, Größe mehrere Meter, Ausscheidung von Wurmgliedern (= Proglottiden). Benennung der Wurmspezies nach dem Zwischenwirt: • Rinderbandwurm (Taenia saginata), häufig, Rinderbefall in Mitteleuropa 1–2 %, Präpatenz 11 Wo. • Schweinbandwurm (Taenia solium), selten, Präpatenz 5–11 Wo.; auch die Eier Bandwurm-Infektionsind für den Menschen infektiös (Zystizerkose). • Fischbandwurm (Diphyllobotrium latum), selten, Präpatenz 20 d. Klinik Darmbefall meist symptomlos, gelegentlich uncharakteristische Abdominalbeschwerden, gelegentlich Appetitverlust, Gewichtsverlust. Zystizerkose: Nach Aufnahme von Eiern des Schweinebandwurms Invasion der Larven mit Finnenbildung in der Muskulatur (meist symptomlos) oder in anderen Organen. KO: Neurozystizerkose bei Befall des ZNS mit fokalen Ausfällen, Krampfanfällen, Erblindung. Diagnostik • Makroskopisch: Gelbweiße Wurmglieder im Stuhl, anfangs eigenbeweglich. Cave: Infektionsgefahr mit Zystizerkose bei Schweinebandwurm! • Mikroskopisch: Nachweis der Wurmeier im Stuhl. Diff.-BB: Meist keine Eosinophilie. Therapie Einmaldosis Praziquantel, z.B. Cesol® Tbl. à 150 mg, 5–10 mg/kg KG p.o., Kinder < 2 J. 0,5 g, 2–6 J. 1,0 g. Alternativ: Niclosamid, z.B. Yomesan® Tbl. à 0,5 g, 2 g p.o. als ED. Wirkung nur auf adulte Würmer. Strenge Hygiene bei Behandlung von T. solium wegen Gefahr der Autoinf. Bei V.a. Zystizerkose Klinikeinweisung. Prognose Sehr gut. Bei Neurozystizerkose abhängig von der Lokalisation. 9.7.4 Echinokokkus-Infektion Echinococcus granulosus (Hundebandwurm) Erreger Sitz der adulten Würmer (Größe 4 mm) im Dünndarm von Hunden. Natürlicher Zwischenwirt: Weidetiere. Bei oraler Aufnahme von Eiern Invasion der Larven mit Finnenbildung in Leber (60 %), Lunge (20 %) u.a. Organen. Langsam verdrängendes Wachstum in Form von Zysten (Größe bis 20 cm und mehr) durch Tochterfinnen. Vorkommen weltweit, in Mitteleuropa meist importierte Fälle. Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Beschwerden durch Echinokokkus-InfektionRaumforderung der Zysten, je Hundebandwurmnach Lokalisation: Oberbauchschmerzen, tastbarer Oberbauchtumor, Cholestase. Bei Lungenbefall Atelektasen, Hämoptysen, bei ZNS-Befall (selten) fokal-neurologische Ausfälle, Krampfanfälle. Komplikationen Selten; lokale oder hämatogene Metastasierung nach Punktion oder Ruptur der Zysten. Bei Zystenruptur oft anaphylaktischer Schock. Diagnostik Abdomen-Sono, CT, Serologie (pos. bei Leberbefall 90 %, bei Lungenbefall 60 %). Nur selten Eosinophilie. Diagn. Punktion der Zysten ist streng kontraindiziert. Therapie Klinikeinweisung zur operativen Entfernung oder Verödung (PAIR) der Zyste(n). Prä- und postop. Chemother. mit Albendazol, z.B. Eskazole® 10–15 mg/kg KG/d (Standarddosis 2 × 400 mg/d) für mehrere Mon. In inoperablen Fällen unbefristet, da die Chemother. nur parasitostatisch wirkt. Prognose In operablen Fällen sehr gut, in inoperablen Fällen abhängig von der Lokalisation. Prophylaxe Hunde und Katzen regelmäßig entwurmen und nur mit gekochtem Fleisch füttern. Echinococcus alveolaris (Fuchsbandwurm) Erreger Sitz der adulten Würmer (Größe 2 mm) im Dünndarm von Fuchs, Hund, Katze; natürlicher Zwischenwirt = Feldmaus. Nach oraler Aufnahme der Eier Invasion der Larven mit Finnenbildung in der Leber. Durch infiltrativ-destruierendes Wachstum Organzerstörung und Übergriff auch auf andere Abdominalorgane. Langsames Wachstum über viele J., Manifestationsgipfel: 40. Lj. Endemiegebiete in Süddeutschland, Österreich und Osteuropa. Klinik Uncharakteristische Oberbauchbeschwerden, FuchsbandwurmCholestasezeichen. Diagnostik Abdomen-Sono, CT, Serologie. Nur selten Eosinophilie. Therapie Entfernung des Parasiten durch Radikal-OP oft nicht möglich. Chemother. mit Albendazol, z.B. Eskazole® 10–15 mg/kg KG, bei kurativer OP 2 J., sonst lebenslang. Überwachung der Pat. für mind. 10 J. Chemother. wirkt nur parasitostatisch. Prognose 5JÜR bei adäquater Ther. 90 % (abhängig von der Lokalisation). Prophylaxe Hunde/Katzen regelmäßig entwurmen und nur mit gekochtem Fleisch füttern. Handschuhe beim Umgang mit (toten) Füchsen. Erhöhtes Risiko für Beerensammler und Jäger epidemiologisch nicht gesichert. Echinococcus granulosus (Hundebandwurm) Erreger Sitz der adulten Würmer (Größe 4 mm) im Dünndarm von Hunden. Natürlicher Zwischenwirt: Weidetiere. Bei oraler Aufnahme von Eiern Invasion der Larven mit Finnenbildung in Leber (60 %), Lunge (20 %) u.a. Organen. Langsam verdrängendes Wachstum in Form von Zysten (Größe bis 20 cm und mehr) durch Tochterfinnen. Vorkommen weltweit, in Mitteleuropa meist importierte Fälle. Erkrankung und Tod meldepflichtig. Klinik Beschwerden durch Echinokokkus-InfektionRaumforderung der Zysten, je Hundebandwurmnach Lokalisation: Oberbauchschmerzen, tastbarer Oberbauchtumor, Cholestase. Bei Lungenbefall Atelektasen, Hämoptysen, bei ZNS-Befall (selten) fokal-neurologische Ausfälle, Krampfanfälle. Komplikationen Selten; lokale oder hämatogene Metastasierung nach Punktion oder Ruptur der Zysten. Bei Zystenruptur oft anaphylaktischer Schock. Diagnostik Abdomen-Sono, CT, Serologie (pos. bei Leberbefall 90 %, bei Lungenbefall 60 %). Nur selten Eosinophilie. Diagn. Punktion der Zysten ist streng kontraindiziert. Therapie Klinikeinweisung zur operativen Entfernung oder Verödung (PAIR) der Zyste(n). Prä- und postop. Chemother. mit Albendazol, z.B. Eskazole® 10–15 mg/kg KG/d (Standarddosis 2 × 400 mg/d) für mehrere Mon. In inoperablen Fällen unbefristet, da die Chemother. nur parasitostatisch wirkt. Prognose In operablen Fällen sehr gut, in inoperablen Fällen abhängig von der Lokalisation. Prophylaxe Hunde und Katzen regelmäßig entwurmen und nur mit gekochtem Fleisch füttern. Echinococcus alveolaris (Fuchsbandwurm) Erreger Sitz der adulten Würmer (Größe 2 mm) im Dünndarm von Fuchs, Hund, Katze; natürlicher Zwischenwirt = Feldmaus. Nach oraler Aufnahme der Eier Invasion der Larven mit Finnenbildung in der Leber. Durch infiltrativ-destruierendes Wachstum Organzerstörung und Übergriff auch auf andere Abdominalorgane. Langsames Wachstum über viele J., Manifestationsgipfel: 40. Lj. Endemiegebiete in Süddeutschland, Österreich und Osteuropa. Klinik Uncharakteristische Oberbauchbeschwerden, FuchsbandwurmCholestasezeichen. Diagnostik Abdomen-Sono, CT, Serologie. Nur selten Eosinophilie. Therapie Entfernung des Parasiten durch Radikal-OP oft nicht möglich. Chemother. mit Albendazol, z.B. Eskazole® 10–15 mg/kg KG, bei kurativer OP 2 J., sonst lebenslang. Überwachung der Pat. für mind. 10 J. Chemother. wirkt nur parasitostatisch. Prognose 5JÜR bei adäquater Ther. 90 % (abhängig von der Lokalisation). Prophylaxe Hunde/Katzen regelmäßig entwurmen und nur mit gekochtem Fleisch füttern. Handschuhe beim Umgang mit (toten) Füchsen. Erhöhtes Risiko für Beerensammler und Jäger epidemiologisch nicht gesichert. 9.7.5 Trichinose Erreger Trichinella spiralis, weltweites Vorkommen. Inf. durch Verzehr von trichinenhaltigem ungenügend erhitztem Fleisch, meist vom Schwein (geräucherter Schinken!); evtl. auch Bären oder andere Wildtiere betroffen. Adulte Würmer im Darm, Invasion der Larven in die Muskulatur, dort Verkapselung als Trichinen. Oft Kleinepidemien. Klinik Je nach Befallsstärke asymptomatisch bis lebensbedrohlich. Nach 1–7 d Durchfälle, ab dem 7. d Fieber (meist Kontinua), Muskelschmerzen, evtl. Doppelbilder, TrichinoseGesichtsschwellung, Lidödeme. Diagnostik Großes BB: Leukozytose, Eosinophilie. CK-Erhöhung. Serologie. Klinikeinweisung bei Verdacht. Umgebungsuntersuchung. Therapie Stationär. Mebendazol, z.B. Vermox® für 14 d, ggf. plus Prednison. Prognose Bei adäquater Behandlung gut, selten Tod durch Herzrhythmusstörungen bei myokardialer Eosinophilie. 9.8 Sexuell übertragbare Krankheiten Meldepflicht 9.11 . 9.8.1 Gonorrhö Synonym Tripper. Erreger Neisseria gonorrhoeae (Gonokokken), häufigste Geschlechtskrankheit. Übertragung fast ausschließlich durch Geschlechtsverkehr, intrazelluläres Wachstum. Klinik Beim M nach 2–5 d Urethritis mit Rötung, Dysurie und eitrigem Ausfluss. KO: Harnröhrenstriktur. Bei F Befall von Zervix, seltener der Urethra, meist blande Symptomatik. Bei Sexuell übertragbare KrankheitenZervizitis reichlich grün-gelber Ausfluss. Bei aufsteigender Inf. Zeichen der Adnexitis (14.3.3 Gonorrhoe). Atypische Lokalisationen bei entsprechenden Sexualpraktiken: Proktitis, Pharyngitis. Bei Neugeborenen Konjunktivitis (Credé-Prophylaxe bzw. PVP Jod → auch Aktivität gegen Chlamydien). Komplikationen Chron. Inf. mit lokaler Ausbreitung (Prostatitis, Epididymitis, Peritonitis) oder septischer Ausbreitung (Monarthritis des Kniegelenks). Sterilität. Diagnostik Mikroskopisch aus Abstrichen von Urethra und Zervix, jeweils ein Gram- und Methylenblau-Präparat (Abstriche auf Objektträger aufbringen, lufttrocknen, hitzefixieren und verschicken; s.a. 32.1.8). Kulturelle Untersuchung empfehlenswert zur Resistenztestung. Cave: Empfindlicher Err., der bei unsachgemäßem Transport rasch abstirbt (Versand z.B. in Port-a-cul®-Röhrchen, Fa. Becton-Dickinson). Gleichzeitig auch Material für Untersuchung auf Chlamydien einschicken, häufig Simultaninf. PCR am sensitivsten. Therapie Einmaldosis von Cephalosporin 2. u. 3. Generation, wie Ceftriaxon 500 mg i.m., wegen häufiger Chlamydien-Simultaninf. im Anschluss Doxycyclin 200 mg/d für 7 d p.o. oder Roxithromycin 2 × 150 mg/d für 7 d p.o.; nach 1 Wo. Therapiekontrolle (Kultur); Partnerbehandlung. Bes. in Südostasien treten häufig multiresistente Stämme auf. An die Möglichkeit einer Doppelinf. denken: Nichtgonorrhoische Urethritis (NGU), HIV, Lues (vor und 6 Wo. nach Ther. serol. Luesdiagn.!). Bei allen sexuell übertragbaren Krankheiten stets gleichzeitige Partnerbehandlung! 9.8.2 Syphilis (Lues) Erreger Treponema pallidum. Übertragung durch Geschlechtsverkehr oder Blutkontakt. Klinik Verlauf in mehreren Stadien. • Primärstadium: Nach 2–12 Wo. Primäraffekt: Schmerzloses Ulcus durum an der Eintrittsstelle des Err. (Penis, Zervix; je nach Sexualpraktik auch extragenitale Läsionen), vergrößerte Leistenlymphknoten. Abheilung nach ca. 5 Wo. • Sekundärstadium (verläuft oft auch symptomarm): 6–8 Wo. nach dem Primärstadium vielfältige Syphilis LuesHauterscheinungen (Eruptionsstadium): Roseolenartiges Exanthem (generalisiert), makulopapulöses Exanthem (Stamm), nässende Effloreszenzen sind hoch infektiös, Condylomata lata (intertriginös), kleinflächige Alopezie; Schleimhaut: Plaques muqueuses; generalisierte Lk-Schwellung. Abklingen nach 4 Wo.; intermittierender Verlauf über J. ist möglich. In ca. 30 % d. Fälle spontane Heilung. • Tertiärstadium: Organmanifestationen nach Mon. bis J. – Haut: Gruppen von derben, braunroten Knoten, subkutane Knoten (Gummen). – Knochenzerstörungen (z.B. Sattelnase). – Mesaortitis luica mit KO: Koronarstenose, thorakales Aortenaneurysma. • Neurolues: Chron. Enzephalitis mit intellektuellem Abbau bis zur Demenz, bei Befall der Rückenmark-Hinterstränge Tabes dorsalis mit Ataxie, Hyporeflexie, Schmerzattacken. • Lues connata bei intrauteriner Inf. ab dem 5. Mon., Manifestation durch Abort, Hepatosplenomegalie, Ikterus, Osteochondritis, Osteomyelitis, Pneumonie, variable Hauterscheinungen. Auch chron.-symptomarmer Verlauf ist möglich. Diagnostik Serologische Untersuchungen: • TPHA (Treponema-Pallidum-Hämagglutinations-Assay): AK-Such- und Ausschlusstest, bleibt lebenslang pos. • FTA-ABS (Fluoreszenz-Treponema-AK-Absorptions-Test): Spez. Bestätigungstest. • VDRL-Reaktion (Veneral Disease Research Laboratory-Test) bzw. Cardiolipin-Test zur Beurteilung der Krankheitsaktivität, wird in 4–6 Wo. p.i. positiv und i.d.R. wenige Mon. nach erfolgreicher Ther. wieder negativ. • Lues-IgM: Bestimmung bei V.a. Primärinf. bzw. akute Krankheitsphase. Positives Ergebnis bedeutet immer Therapiebedürftigkeit. Tab. 9.24 Anforderung und Beurteilung der Lues-Serologie nach Stufenplan Anforderung bzw. Nachforderung bei der Erstuntersuchung entsprechend Stufenplan, d.h. bei pos. Test die nächste Untersuchung: TPHA → FTA-ABS → VDRL + Lues-IgM TPHA FTA-ABS VDRL IgM Interpretation 1 Neg. – – – Kein Anhalt für Inf., ggf. erneut in 2–3 Wo. ∗ 2 Pos. Neg. – – Unspezifische Reaktion, ggf. erneut in 2–3 Wo. ∗ 3 Pos. Pos. Neg. Neg. IgG-Serumnarbe, keine Ther. ∗ 4 ≥ 1 : 20 Pos. Neg. Pos. Primärinf. bzw. akute Inf. → Ther. 5 ≥ 1 : 80 Pos. ≥ 1 : 4 Pos. Abhängig von Vorgeschichte: Therapiebedürftige Lues oder Restbefund 6 ≥ 1 : 80 ∗∗ Pos. ≥ 1 : 16 Neg. Abhängig von Vorgeschichte: Therapiebedürftige Lues oder Restbefund; bei chron. Inf. kann die IgM-Bildung supprimiert sein ∗∗ ∗ Bei verdächtigem Primäraffekt DD von Ulcus molle, Herpes genitalis ∗∗ Bei chron. Inf. oft sehr hohe TPHA-Titer von ≥ [B3] 1 : 5096. Zur Abklärung einer Neurolues Liquor auf Eiweiß, Zellstatus, intrathekale Ig-Synthese (Reiber-Diagramm), intrathekale Synthese von Lues-IgG untersuchen Verlaufskontrolle durch Bestimmung von VDRL oder Lues-IgM in 3-monatigen Abständen. Bei sanierender Behandlung kommt es zum Titerrückgang um mind. 3 Stufen binnen 3–12 Mon.; nach 12 Mon. sollte kein Lues-IgM mehr vorhanden sein. Fehlender Rückgang bzw. erneuter Anstieg bedeuten Misserfolg der Ther. bzw. Reinf. Bei unklaren Allgemeinbeschwerden mit neurologischen Störungen oder Gelenkbeschwerden gleichzeitig Borrelien-Serologie. Therapie Ambulant, Klinikeinweisung bei Neurosyphilis und Lues connata. • Primär- u. Sekundärstadium: Benzathinpenicillin G, z.B. Tardocillin® Einmaldosis 2,4 Mio. E i.m., je 1,2 Mio. E in jede Gesäßhälfte. Bei Penicillinunverträglichkeit Doxycyclin 2 × 100 mg/d für 2 Wo. oder Roxithromycin 300 mg/d für 2 Wo. • Späte oder unbekannte Stadien: Benzathinpenicillin G, z.B. Tardocillin® 2,4 Mio. E i.m. an den Tagen 1, 8 u. 15. Bei Penicillinunverträglichkeit Doxycyclin 2 × 100 mg/d o. Roxithromycin 300 mg/d für 4 Wo. • Bei Neurosyphilis oder gleichzeitiger HIV-Infektion stationäre Einweisung. Penicillin Mittel der Wahl. Während der Antibiose in 60–90 % Jarisch-Herxheimer-Reaktion mit Fieber, Schüttelfrost und Abgeschlagenheit. Gutartiger Verlauf, ggf. Gabe von Antipyretika und Steroiden. Serologische Kontrollen nach 3, 6 u. 12 Mon. durchführen! Partnerbehandlung anregen! Schwangerenvorsorge (15.1). 9.8.3 Trichomoniasis Erreger Trichomonas vaginalis, sexuelle Übertragung (auch 14.3.2). Klinik Bei starker Vermehrung Urethritis und Kolpitis mit schaumigem Fluor. IKZ 4–28 d. Diagnostik Rasche Untersuchung von Vaginal- und Urethralabstrichen mit Phasenkontrastmikroskop; Err. fällt durch seine Beweglichkeit auf. Therapie Metronidazol 2 × 250 mg p.o. für 6 d. Eine relative Metronidazol-Resistenz ist möglich, dann Behandlung mit Metronidazol 2 g/d plus Lokalbehandlung mit Clotrimazol für 5 d. 9.8.4 Ulcus molle Trichomoniasis Erreger Haemophilus ducreyi. In Europa selten, in den Tropen häufig. Klinik Nach 2–5 d meist multiple, druckschmerzhafte Genitalulzera und vergrößerte, schmerzhafte inguinale Lk (Bubonen). KO: Fistelung. Doppelinf. mit Lues oder Lymphogranuloma venereum kommen vor. Diagnostik Facharztüberweisung zum Dermatologen. Kultur aus Abstrich, Punktat. 9.8.5 Lymphogranuloma venereum Synonym Lymphogranuloma inguinale. Erreger Ulcus:molleChlamydia trachomatis, Serotyp L. In Europa selten. Übertragung durch Geschlechtsverkehr, je nach Sexualpraktiken auch extragenitale Läsionen möglich. Andere Chlamydieninf. Tab. 9.19 . Klinik Nach 3–21 d zuerst Papel, dann schmerzloses Geschwür am Genitale, Schwellung der inguinalen Lk (Bubonen) mit Abszedierung. Komplikationen Proktitis, genitale Elephantiasis. Diagnostik Facharztüberweisung zum Dermatologen. Kultur (Spezialmedium), PCR. 9.8.6 Condylomata acuminata Lymphogranuloma venereum Synonym Feigwarzen. Erreger Humane Papillomaviren (HPV), mehrere Serotypen (i.d.R. 6, 11); gehäuft bei Promiskuität und bei HIV-Positiven. Klinik IKZ 1–8 Mon., dann an Penis, Vulva, Zervix oder in der Analregion vereinzelt bis beetförmig angeordnete spitze Wärzchen, evtl. blumenkohlähnliche Gebilde bei massivem Befall. Auch Befall der Mundhöhle möglich. Diagnostik Condylomata acuminataKlinischer Aspekt, PCR Differenzialdiagnose Ca, FeigwarzenLues. Therapie Je nach HPV (Humanes Papillomavirus):Condylomata acuminataAusmaß lokale Behandlung mit Podophyllinlösung, Vereisung oder chirurgische Entfernung (Exzision, Kürettage) und histologische Klärung der Dignität. Besonderheiten Zusammen mit den Kondylom-verursachenden Viren sind Mischinf. mit weiteren HPV-Typen (z.B. 16, 18, sog. High-risk-Typen) möglich, die zu malignen Veränderungen führen können (z.B. Zervix-Ca). Impfung gegen die zwei häufigsten HPV-Subtypen möglich. 9.8.1 Gonorrhö Synonym Tripper. Erreger Neisseria gonorrhoeae (Gonokokken), häufigste Geschlechtskrankheit. Übertragung fast ausschließlich durch Geschlechtsverkehr, intrazelluläres Wachstum. Klinik Beim M nach 2–5 d Urethritis mit Rötung, Dysurie und eitrigem Ausfluss. KO: Harnröhrenstriktur. Bei F Befall von Zervix, seltener der Urethra, meist blande Symptomatik. Bei Sexuell übertragbare KrankheitenZervizitis reichlich grün-gelber Ausfluss. Bei aufsteigender Inf. Zeichen der Adnexitis (14.3.3 Gonorrhoe). Atypische Lokalisationen bei entsprechenden Sexualpraktiken: Proktitis, Pharyngitis. Bei Neugeborenen Konjunktivitis (Credé-Prophylaxe bzw. PVP Jod → auch Aktivität gegen Chlamydien). Komplikationen Chron. Inf. mit lokaler Ausbreitung (Prostatitis, Epididymitis, Peritonitis) oder septischer Ausbreitung (Monarthritis des Kniegelenks). Sterilität. Diagnostik Mikroskopisch aus Abstrichen von Urethra und Zervix, jeweils ein Gram- und Methylenblau-Präparat (Abstriche auf Objektträger aufbringen, lufttrocknen, hitzefixieren und verschicken; s.a. 32.1.8). Kulturelle Untersuchung empfehlenswert zur Resistenztestung. Cave: Empfindlicher Err., der bei unsachgemäßem Transport rasch abstirbt (Versand z.B. in Port-a-cul®-Röhrchen, Fa. Becton-Dickinson). Gleichzeitig auch Material für Untersuchung auf Chlamydien einschicken, häufig Simultaninf. PCR am sensitivsten. Therapie Einmaldosis von Cephalosporin 2. u. 3. Generation, wie Ceftriaxon 500 mg i.m., wegen häufiger Chlamydien-Simultaninf. im Anschluss Doxycyclin 200 mg/d für 7 d p.o. oder Roxithromycin 2 × 150 mg/d für 7 d p.o.; nach 1 Wo. Therapiekontrolle (Kultur); Partnerbehandlung. Bes. in Südostasien treten häufig multiresistente Stämme auf. An die Möglichkeit einer Doppelinf. denken: Nichtgonorrhoische Urethritis (NGU), HIV, Lues (vor und 6 Wo. nach Ther. serol. Luesdiagn.!). Bei allen sexuell übertragbaren Krankheiten stets gleichzeitige Partnerbehandlung! 9.8.2 Syphilis (Lues) Erreger Treponema pallidum. Übertragung durch Geschlechtsverkehr oder Blutkontakt. Klinik Verlauf in mehreren Stadien. • Primärstadium: Nach 2–12 Wo. Primäraffekt: Schmerzloses Ulcus durum an der Eintrittsstelle des Err. (Penis, Zervix; je nach Sexualpraktik auch extragenitale Läsionen), vergrößerte Leistenlymphknoten. Abheilung nach ca. 5 Wo. • Sekundärstadium (verläuft oft auch symptomarm): 6–8 Wo. nach dem Primärstadium vielfältige Syphilis LuesHauterscheinungen (Eruptionsstadium): Roseolenartiges Exanthem (generalisiert), makulopapulöses Exanthem (Stamm), nässende Effloreszenzen sind hoch infektiös, Condylomata lata (intertriginös), kleinflächige Alopezie; Schleimhaut: Plaques muqueuses; generalisierte Lk-Schwellung. Abklingen nach 4 Wo.; intermittierender Verlauf über J. ist möglich. In ca. 30 % d. Fälle spontane Heilung. • Tertiärstadium: Organmanifestationen nach Mon. bis J. – Haut: Gruppen von derben, braunroten Knoten, subkutane Knoten (Gummen). – Knochenzerstörungen (z.B. Sattelnase). – Mesaortitis luica mit KO: Koronarstenose, thorakales Aortenaneurysma. • Neurolues: Chron. Enzephalitis mit intellektuellem Abbau bis zur Demenz, bei Befall der Rückenmark-Hinterstränge Tabes dorsalis mit Ataxie, Hyporeflexie, Schmerzattacken. • Lues connata bei intrauteriner Inf. ab dem 5. Mon., Manifestation durch Abort, Hepatosplenomegalie, Ikterus, Osteochondritis, Osteomyelitis, Pneumonie, variable Hauterscheinungen. Auch chron.-symptomarmer Verlauf ist möglich. Diagnostik Serologische Untersuchungen: • TPHA (Treponema-Pallidum-Hämagglutinations-Assay): AK-Such- und Ausschlusstest, bleibt lebenslang pos. • FTA-ABS (Fluoreszenz-Treponema-AK-Absorptions-Test): Spez. Bestätigungstest. • VDRL-Reaktion (Veneral Disease Research Laboratory-Test) bzw. Cardiolipin-Test zur Beurteilung der Krankheitsaktivität, wird in 4–6 Wo. p.i. positiv und i.d.R. wenige Mon. nach erfolgreicher Ther. wieder negativ. • Lues-IgM: Bestimmung bei V.a. Primärinf. bzw. akute Krankheitsphase. Positives Ergebnis bedeutet immer Therapiebedürftigkeit. Tab. 9.24 Anforderung und Beurteilung der Lues-Serologie nach Stufenplan Anforderung bzw. Nachforderung bei der Erstuntersuchung entsprechend Stufenplan, d.h. bei pos. Test die nächste Untersuchung: TPHA → FTA-ABS → VDRL + Lues-IgM TPHA FTA-ABS VDRL IgM Interpretation 1 Neg. – – – Kein Anhalt für Inf., ggf. erneut in 2–3 Wo. ∗ 2 Pos. Neg. – – Unspezifische Reaktion, ggf. erneut in 2–3 Wo. ∗ 3 Pos. Pos. Neg. Neg. IgG-Serumnarbe, keine Ther. ∗ 4 ≥ 1 : 20 Pos. Neg. Pos. Primärinf. bzw. akute Inf. → Ther. 5 ≥ 1 : 80 Pos. ≥ 1 : 4 Pos. Abhängig von Vorgeschichte: Therapiebedürftige Lues oder Restbefund 6 ≥ 1 : 80 ∗∗ Pos. ≥ 1 : 16 Neg. Abhängig von Vorgeschichte: Therapiebedürftige Lues oder Restbefund; bei chron. Inf. kann die IgM-Bildung supprimiert sein ∗∗ ∗ Bei verdächtigem Primäraffekt DD von Ulcus molle, Herpes genitalis ∗∗ Bei chron. Inf. oft sehr hohe TPHA-Titer von ≥ [B3] 1 : 5096. Zur Abklärung einer Neurolues Liquor auf Eiweiß, Zellstatus, intrathekale Ig-Synthese (Reiber-Diagramm), intrathekale Synthese von Lues-IgG untersuchen Verlaufskontrolle durch Bestimmung von VDRL oder Lues-IgM in 3-monatigen Abständen. Bei sanierender Behandlung kommt es zum Titerrückgang um mind. 3 Stufen binnen 3–12 Mon.; nach 12 Mon. sollte kein Lues-IgM mehr vorhanden sein. Fehlender Rückgang bzw. erneuter Anstieg bedeuten Misserfolg der Ther. bzw. Reinf. Bei unklaren Allgemeinbeschwerden mit neurologischen Störungen oder Gelenkbeschwerden gleichzeitig Borrelien-Serologie. Therapie Ambulant, Klinikeinweisung bei Neurosyphilis und Lues connata. • Primär- u. Sekundärstadium: Benzathinpenicillin G, z.B. Tardocillin® Einmaldosis 2,4 Mio. E i.m., je 1,2 Mio. E in jede Gesäßhälfte. Bei Penicillinunverträglichkeit Doxycyclin 2 × 100 mg/d für 2 Wo. oder Roxithromycin 300 mg/d für 2 Wo. • Späte oder unbekannte Stadien: Benzathinpenicillin G, z.B. Tardocillin® 2,4 Mio. E i.m. an den Tagen 1, 8 u. 15. Bei Penicillinunverträglichkeit Doxycyclin 2 × 100 mg/d o. Roxithromycin 300 mg/d für 4 Wo. • Bei Neurosyphilis oder gleichzeitiger HIV-Infektion stationäre Einweisung. Penicillin Mittel der Wahl. Während der Antibiose in 60–90 % Jarisch-Herxheimer-Reaktion mit Fieber, Schüttelfrost und Abgeschlagenheit. Gutartiger Verlauf, ggf. Gabe von Antipyretika und Steroiden. Serologische Kontrollen nach 3, 6 u. 12 Mon. durchführen! Partnerbehandlung anregen! Schwangerenvorsorge (15.1). 9.8.3 Trichomoniasis Erreger Trichomonas vaginalis, sexuelle Übertragung (auch 14.3.2). Klinik Bei starker Vermehrung Urethritis und Kolpitis mit schaumigem Fluor. IKZ 4–28 d. Diagnostik Rasche Untersuchung von Vaginal- und Urethralabstrichen mit Phasenkontrastmikroskop; Err. fällt durch seine Beweglichkeit auf. Therapie Metronidazol 2 × 250 mg p.o. für 6 d. Eine relative Metronidazol-Resistenz ist möglich, dann Behandlung mit Metronidazol 2 g/d plus Lokalbehandlung mit Clotrimazol für 5 d. 9.8.4 Ulcus molle Trichomoniasis Erreger Haemophilus ducreyi. In Europa selten, in den Tropen häufig. Klinik Nach 2–5 d meist multiple, druckschmerzhafte Genitalulzera und vergrößerte, schmerzhafte inguinale Lk (Bubonen). KO: Fistelung. Doppelinf. mit Lues oder Lymphogranuloma venereum kommen vor. Diagnostik Facharztüberweisung zum Dermatologen. Kultur aus Abstrich, Punktat. 9.8.5 Lymphogranuloma venereum Synonym Lymphogranuloma inguinale. Erreger Ulcus:molleChlamydia trachomatis, Serotyp L. In Europa selten. Übertragung durch Geschlechtsverkehr, je nach Sexualpraktiken auch extragenitale Läsionen möglich. Andere Chlamydieninf. Tab. 9.19 . Klinik Nach 3–21 d zuerst Papel, dann schmerzloses Geschwür am Genitale, Schwellung der inguinalen Lk (Bubonen) mit Abszedierung. Komplikationen Proktitis, genitale Elephantiasis. Diagnostik Facharztüberweisung zum Dermatologen. Kultur (Spezialmedium), PCR. 9.8.6 Condylomata acuminata Lymphogranuloma venereum Synonym Feigwarzen. Erreger Humane Papillomaviren (HPV), mehrere Serotypen (i.d.R. 6, 11); gehäuft bei Promiskuität und bei HIV-Positiven. Klinik IKZ 1–8 Mon., dann an Penis, Vulva, Zervix oder in der Analregion vereinzelt bis beetförmig angeordnete spitze Wärzchen, evtl. blumenkohlähnliche Gebilde bei massivem Befall. Auch Befall der Mundhöhle möglich. Diagnostik Condylomata acuminataKlinischer Aspekt, PCR Differenzialdiagnose Ca, FeigwarzenLues. Therapie Je nach HPV (Humanes Papillomavirus):Condylomata acuminataAusmaß lokale Behandlung mit Podophyllinlösung, Vereisung oder chirurgische Entfernung (Exzision, Kürettage) und histologische Klärung der Dignität. Besonderheiten Zusammen mit den Kondylom-verursachenden Viren sind Mischinf. mit weiteren HPV-Typen (z.B. 16, 18, sog. High-risk-Typen) möglich, die zu malignen Veränderungen führen können (z.B. Zervix-Ca). Impfung gegen die zwei häufigsten HPV-Subtypen möglich. 9.9 HIV und AIDS 9.9.1 Epidemiologie und Übertragungswege Erreger HIV (human immunodeficiency virus); Retrovirus, das durch Befall der T-Helfer-Zellen (= CD4-Zellen) langfristig zur erworbenen Immunschwäche AIDS (= acquired immunodeficiency syndrome) führt. Weltweit vorherrschend ist Virustyp HIV-1, in Westafrika daneben auch relevanter Anteil von HIV-2 Inf. (langsamerer Krankheitsverlauf als bei HIV-1). Doppelinfektionen mit HIV-1 und HIV-2 können vorkommen. Epidemiologie Anteil unter den HIV-Infizierten in Europa: Homosexuelle Kontakte 50 %, i.v. Drogenmissbrauch 10 %, heterosexuelle Kontakte ca. 20 %, Anzahl zunehmend, Pat. aus Endemiegebieten der Dritten Welt 20 %, Transmission Mutter-Kind durch Stechinsekten, soziale Kontakte, Anhusten, Küssen, gemeinsam benutztes Geschirr, Trinkgefäß oder Essbesteck nachgewiesen. Infektiosität: Vergleichsweise niedrig, hängt vom Krankheitsstadium des HIV-Infizierten ab. Bes. hohe Viruskonz. bei akuter HIV-Inf. und im Stadium AIDS. Natürlicher Verlauf: 3–6 Wo. nach Inf. in 40–80 % d.F. fieberhaftes, Mononukleose-ähnliches Krankheitsbild (akute HIV-Inf.). Anschließend abhängig von inokulierter Virusmenge und Wirtsfaktoren, langer asymptomatischer Verlauf. Nach initial hoher Virämie (= Virusload) Gleichgewichtszustand (= Setpoint) aus Virusreplikation und -elimination auf niedrigerem Niveau. Progression zum Stadium AIDS umso rascher, je höher der Setpoint. Ohne Behandlung befinden sich in USA und Europa 50 % der Infizierten 10 J. bzw. 65 % 15 J.p.i. im Stadium AIDS. 9.9.2 Labordiagnostik Testmethoden HIV-Suchtest = HIV-Ak-Bestimmung: Bestimmt Ak gegen HIV-1 und HIV-2. Suchtest: ELISA. Bestätigung einer Inf. durch Immunoblot (Western Blot), um seltene falsch-positive Befunde auszuschließen, z.B. in Schwangerschaft, bei anderen Inf., Autoimmunkrankheiten und nach Transfusionen und Transplantationen. Auftreten der Ak i.d.R. 3 Mon. p.i., selten spätere Serokonversion. Zum definitiven Ausschluss einer HIV-Inf.: Weitere HIV siehe AIDSTests nach 3 und 6 AIDS:LabordiagnostikMon. Bei medizinischer AIDS:HIV-TestInd. über die HIV-TestKrankenkassen abrechenbar, Begründung auf dem Krankenschein z.B. chron. Diarrhoe, atypische Pneumonie, unklare Lk-Schwellungen, chron. Fieber. Bei HIV-Angst des Pat. wegen Zugehörigkeit zu einer Risikogruppe, Abrechnung privat oder auf kostenlosen Test beim Gesundheitsamt verweisen. Virusload: Bestimmung der Anzahl von HIV-RNA Kopien pro ml Plasma. Methoden: Quantitative PCR (Q-PCR), branched-chain-DNA-Methode (b-DNA) und die "nucleic acid sequence based amplification" (NASBA). Nachweisgrenze bei ultrasensitiven Tests 20 Kopien/ml. Die Höhe der Virämie korreliert direkt mit der Geschwindigkeit der Progression zum Stadium AIDS. Ind.: Marker für Indikationsstellung und Kontrolle der antiretroviralen Ther. Bei Erstdiagnose sollte auch immer eine genotypische (PCR) Resistenzbestimmung durchgeführt werden. Für Verlaufskontrollen ist wichtig, dass Messmethode und möglichst auch Labor beibehalten werden. Indikation für einen HIV-Test • Unklares, über längere Zeit bestehendes Fieber. • Unklarer Gewichtsverlust, chron. Diarrhoe, Demenz oder Thrombozytopenie, v.a. bei jüngeren Pat. • Infektionserkr., deren Inzidenz bei HIV-Infizierten erhöht ist: Tbc, rezid. bakt. Pneumonien, akute Hepatitis B oder C. • Hauterkrankung in ungewöhnlicher Ausprägung: – Kaposi-Sarkom: Hellrote, livide oder braunrote Infiltrate mit gelbem Hof, die im Verlauf der Hautspaltlinien angeordnet sind; treten auch in der Mundschleimhaut und im Genitalbereich auf. – Orale Haarzellleukoplakie: Nicht abstreifbare weiße Beläge an den seitlichen Zungenrändern. – Seborrhoisches Ekzem: Bevorzugt in talgdrüsenreichen Arealen fettige, groblamelläre Schuppung auf scharf begrenzten Erythemen. – Rezid. Herpes zoster (26.4.2) bei jungen Erw. mit Neigung zur Generalisation. – Persistierender Herpes genitalis ( 9.4.1 ): Nicht heilende, schmerzhafte Ulzera im Genital- und Analbereich. – Condylomata acuminata ( 9.8.6 ) im Analbereich oder an atyp. Lokalisation. – Soor (weiße oder gelbliche abstreifbare Beläge an Mundschleimhaut und Zunge) ohne entsprechende Grunderkr. (z.B. Diab. mell.), v.a. bei jüngeren Pat. • Maligne Lymphome. • Expositionsverdacht (z.B. durch Nadelstichverletzung). • Präventiv bei Bordellbesuchern, Prostituierten, Sextouristen (Krankenkasse zahlt nicht); vor/bei neuen Sexualpartnern, bei Kinderwunsch. • HIV-Angst: AIDS-Phobie (nur einmalig). Beratung vor dem HIV-Test Die Mitteilung, HIV-pos. zu sein, ist für jeden Betroffenen ein Schock. Deshalb schon vor der Testdurchführung Abklärung folgender Punkte: • Motiv für die Durchführung des Tests. • Was tun bei pos. Testergebnis? • Soziales Umfeld. • Psychische Belastbarkeit, Verhalten in der Wartezeit (Erkennen einer möglichen Suizidalität). • Über die Möglichkeit aufklären, ggf. frühzeitig mit der antiretroviralen Therapie und der Prophylaxe opportunistischer Infektionen zu beginnen. • Abgrenzung zur AIDS-Hypochondrie (v.a. heterosexuelle Pat. ohne Zugehörigkeit zu Risikogruppen), meist assoziiert mit anderen hypochondrischen Befürchtungen (z.B. Kanzerophobie), schuldbeladenes Verhältnis zur Sexualität. Vorgehen: Von weiteren HIV-Tests abraten, ggf. zu Psychotherapie motivieren. Bei Ablehnung des Tests und gleichzeitiger AIDS-Angst darauf hinweisen, dass durch die Ungewissheit die Angst immer bestehen bleibt und dass es Vorteile durch Kenntnis eines pos. Ak-Status gibt: Lebensverlängerung durch antiretrovirale Therapie und Prophylaxe opportunistischer Infektionen; außerdem Schutz des Sexualpartners möglich. Grundsätzlich und ausschließlich persönliche Mitteilung des Testergebnisses, egal, ob pos. oder neg. Beratung bei positivem HIV-Test Grundsätzlich muss der pos. Suchtest durch Immunoblot-Test bestätigt sein. Bei definitiv HIV-pos. Diagn. stützt sich das weitere Vorgehen auf ein ungestörtes Vertrauensverhältnis zwischen HA und Pat. Es dürfen keine unberechtigten Hoffnungen geweckt werden, aber es muss das Gefühl vermittelt werden, dass der HA dem Pat. zur Seite steht, wenn Symptome "kontrolliert" werden müssen. Therapeutische Optionen • Aufklärung über Krankheitsverlauf ( 9.9.3 ): HIV-pos. bedeutet nicht AIDS; i.d.R. langsame Progression; 35 % Langzeitüberlebende (auch nach 15 J. noch kein AIDS); keine Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit im asymptomatischen Stadium. • Aufklärung über Verbesserung der Prognose durch antiretrovirale Ther. und Prophylaxe opportunistischer Inf. ( 9.9.6 ): Durch die neue antiretrovirale Kombinationsther. kann der Virusload über längere Zeit unter der Nachweisgrenze gehalten werden → Krankheitsprogression lässt sich bremsen. • Besprechen der weiterführenden Diagnostik und der Kontrolluntersuchungen. • Bei Wunsch des Pat. psychother. Betreuung anbieten. Psychosoziale Hilfe • Hinweis auf Selbsthilfegruppen (35.2). • Berufliche Einschränkungen: Offiziell keine, außer bei Übernahme ins Beamtenverhältnis auf Lebenszeit. Bei Ärzten: Von operativer Tätigkeit abraten (Übertragungen durch HIV-pos. Operateure sind dokumentiert). Gesunde Lebensführung und Hygiene • Körperliche Überanstrengung vermeiden (z.B. Leistungssport), keine Kampfsportarten wegen des Risikos blutender Verletzungen, sonst Breitensport uneingeschränkt möglich. • Ausgewogene Ernährung; spezielle Diät bringt keine Vorteile. • Bei neg. Toxoplasmose-IgG Kontakt zu Katzen vermeiden. • Prävention der sexuellen HIV-Übertragung durch Kondome ("safer sex"), ggf. Umstellung der Sexualgewohnheiten. Partnerbenachrichtigung Die AIDS:gesunde LebensführungDeutsche Krankenhausgesellschaft und die Bundesärztekammer empfehlen: Der Arzt darf gefährdete Personen (z.B. wenn der infizierte Pat. seinem Partner die Inf. zu verschweigen gedenkt) in diesen Fällen warnen. Eine Verpflichtung zur Warnung des Partners des HIV-infizierten Pat. besteht dann, wenn auch der Partner des Infizierten bei dem Arzt in Behandlung ist. Diese Auffassung wurde vom OLG Frankfurt/Main am 05.10.1999 (AZ: 8U 7/99) bestätigt. Kontrazeption Bei HIV-diskordanten Partnern sollten Kondome verwendet werden, um das HIV-Übertragungsrisiko zu minimieren. Unter antiretroviraler Therapie werden orale Kontrazeptiva schneller metabolisiert. Daher auch Kondome bevorzugen, wenn der Partner ebenfalls infiziert ist. HIV-positive Kinder Prophylaxe von "Kinderkrankheiten" in der Umgebung von HIV-Positiven ( 9.9.6 ); Impfungen bei HIV-pos. Kindern ( 9.9.6 ). Zusätzlich zur medizinischen Betreuung der Kinder darauf hinweisen, dass die Eltern durch AIDS pflegebedürftig werden bzw. versterben. Kindergarten und Schulbesuch: Kein erhöhtes Infektionsrisiko durch übliche soziale Kontakte, daher keine Informationspflicht gegenüber Dritten. Die Bescheinigung über die Freiheit von Infektionskrankheiten nach IfSG kann ausgefüllt werden. 9.9.3 Stadieneinteilung und Verlauf Klinische Stadieneinteilung (Kategorien A–C der CDC-Klassifikation) Kategorie A Akute HIV-Inf. (mononucleosis-like-illness): Nach einer IKZ von 3–6 Wo. akute, Mononukleose-ähnliche Erkr. mit Fieber, Gliederschmerzen, makulösem Exanthem am oberen Stamm (70 % d.F.), Lk-Schwellungen, Angina, Splenomegalie. Leuko-, Lympho-, oft auch Thrombopenie. Immer spontane Rückbildung der Symptome. Diagn.: Ausschluss einer Mononukleose, HIV-AK meist noch neg. (Serokonversion erfolgt nach 1–3 Mon.), zellulärer Immunstatus. Bei Verdacht AIDS:StadieneinteilungHIV-PCR quantitativ. Wegen unspezifischer und variabler Symptomatik wird die Diagn. ohne V.a. HIV-Exposition meist nicht gestellt. Generalisierte Lymphadenopathie (= Lymphadenopathie-Syndrom, LAS): Persisitierende Lk-Schwellungen an mind. zwei extragenitalen Stellen für > 3 Mon. HIV-AK meist pos. Asymptomatische HIV-Inf.: Pat. ist klinisch gesund und infektiös. CD4-Zellen meist > 500/μl (Anzahl der CD4-Zellen orientiert über das Ausmaß des Immundefekts). Kategorie B AIDS-related Complex: Auftreten von Erkr., die keine AIDS-definierenden Erkr. laut Kategorie C sind, aber auf eine Störung der zellulären Immunität hinweisen: Mund-Soor, chron. vulvovaginale Candidiasis, Fieber > 38,5 °C, Diarrhoe > 4 Wo., rezid. Herpes simplex oder Herpes zoster mehrerer Dermatome, periphere Neuropathie, bazilläre Angiomatose, idiopathische thrombozytopenische Purpura. Kategorie C AIDS: Auftreten einer oder mehrerer AIDS-definierender Erkr.: Pneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP); Toxoplasma-Enzephalitis; ösophageale Candida-Inf. oder Befall von Bronchien, Trachea oder Lungen; chron. Herpes-simplex-Ulzera oder Herpes-Bronchitis, -Pneumonie oder -Ösophagitis; CMV-Retinitis; generalisierte CMV-Inf. (nicht von Leber oder Milz); rezid. Salm.-Septikämien; rezid. Pneumonien innerhalb eines J.; extrapulmonale Kryptokokkeninf.; chron. intestinale Kryptosporidieninf.; chron. intestinale Inf. mit Isospora belli; disseminierte oder extrapulmonale Histoplasmose; Tbc; Inf. mit Mycobacterium-avium-Complex (MAI) oder M. kansasii, disseminiert oder extrapulmonal; Kaposi-Sarkom; Non-Hodgkin-Lymphome; invasives Zervix-Ca; HIV-Enzephalopathie; progressive multifokale Leukenzephalopathie; Wasting-Syndrom (chron. Diarrhoe, ungewollter Gewichtsverlust > 10 % des KG). CDC-Klassifikation von 1993 Einteilung nach klinischen Gesichtspunkten und Anzahl der CD4-Zellen/μl. Tab. 9.25 CDC-Klassifikation (1993) Laborkategorie CD4-Zellen/μl Klinische Kategorie A (asymptomatisch oder akute HIV-Inf.) B (Symptome, kein AIDS) C (Symptome, AIDS) 1: ≥ 500 A1 B1 C1 2: 200–499 A2 B2 C2 3: 30 000/ml im Rahmen des Monitorings bei antiretroviraler Ther. – Resistenzbestimmung vor Aufnahme einer Behandlung. 9.9.5 Häufige Krankheitsbilder bei AIDS Tab. 9.26 Häufige AIDS-Krankheiten in Relation zur CD4-Zahl CD4-Zellen/ μ l Häufige AIDS-Manifestationen > 200 Frühe Manifestationen von Kaposi-Sarkom, Non-Hodgkin-Lymphom oder Tbc möglich 1000/μl Durch die Einführung hochwirksamer antiretroviraler Therapieregime lässt sich das Auftreten vieler AIDS-definierender Erkr. verhindern bzw. hinauszögern. Bei Verbesserung der Immunität unter antiretroviraler Ther. kommt es zu deren Remission. Tab. 9.27 Häufige Komplikationen bei AIDS Symptome bei AIDS Mögliche Ursache Abgeschlagenheit, Fieber, Gewichtsverlust • Sepsis: Pneumok., Salmonellen, A-Streptok. • Beginnende opportunistische Inf., malignes Lymphom Retrosternale Schmerzen Ösophagitis durch Candida, CMV, Herpes, Kaposi-Sarkom des Ösophagus oder Magens Dyspnoe, Husten, Fieber Pneumonie durch Pneumocystis carinii, Bakterien, CMV, Tbc Übelkeit und Erbrechen Arzneimittel-NW, Kaposi-Sarkom, Lymphom des Magens Diarrhoe Durch Kryptosporidien, Isospora species, Lamblien, Amöben, Salmonellen, Yersinien, enteropathogene Coli-Stämme, Arzneimittel-NW, CMV, Mykobakterien Bauchschmerzen, Koliken, Obstipation CMV-Enteritis, abdom. Inf. mit Mycobacterium avium, medikamenteninduzierte Pankreatitis, Kaposi-Sarkom des Darms, maligne Lymphome des Darms. Perforation, Appendizitis Neurologische Ausfälle und Fieber ZNS-Toxoplasmose, ZNS-Lymphom. Meningitis durch Bakterien, Kryptokokken, HIV, HSV Hirnorganischer Abbau HIV-Enzephalopathie Auge, Sehstörungen • Retinitis: Zytomegalie, Toxoplasmose, Herpes • NW einer Ethambutol-Ther.: Ablatio retinae Haut • Erytheme, Exantheme: Arzneimittel-NW, Mykosen • Bläschen, Pusteln: Herpes simplex, Zoster, Mykosen • Papeln, Knoten, Tumoren: Kaposi-Sarkom, Mollusca contagiosa, kutane Lymphome, Mykobakteriosen, bazilläre Angiomatose • Juckreiz: Internistische Ursachen (26.1.2), Arzneimittelreaktion Mundhöhle • Beläge: Soor, orale Haarzellleukoplakie • Zungenbrennen: Soor, Zytomegalie, Herpes Anal-genitale Schmerzen Analvenenthrombose, Herpes, Soor, Gonorrhö, Lues Nichttuberkulöse Mykobakterien Erreger Meist Mycobacterium avium (MAI-Stämme), selten M. kansasii oder M. xenopi. AIDS:assoziierte KrankheitenErkrankungsrisiko hoch, wenn CD4 100/μl erreicht werden kann. Prognose Protrahierter Verlauf, insgesamt ungünstig. Bazilläre Angiomatose Erreger Bartonella henselae, gramneg. Bakterium, verursacht bei Immunkompetenten die Katzenkratzkrankheit. In 2/3 d.F. sind auch hier Verletzungen durch Katzen der Auslöser ( 9.3.8 ). Klinik Lokal aggregierte oder disseminiert stehende rötliche, gelegentlich blaulivide oder hautfarbene Knoten oder Papeln. Bis ca. 5 cm groß, mitunter auch exanthematische Ausbreitung hunderter kleinster Läsionen ohne bevorzugte Lokalisation. Konsistenz gummiartig, prall-elastisch. Effloreszenzen: Beginn als winzige, blaurote Papeln, die ab einer bestimmten Größe ulzerieren können und sich dann mit einer Kruste überziehen. Abheilung meist als Restitutio ad integrum. Manchmal bleiben eine Hyperpigmentierung oder Induration. Bei Rückbildung größerer Knoten können sich atrophische, unter das Hautniveau eingesunkene Narben bilden. Häufig Befall von Schleimhäuten und inneren Organen. Allgemeinsymptome: Abgeschlagenheit, Appetitlosigkeit, Erbrechen, Diarrhö, Nachtschweiß, Fieber, Schüttelfrost, krampfartige abdom. Schmerzen. Differenzialdiagnose Kaposi-Sarkom. Diagnostik Nachweis von Bakterien durch Biopsie von angiomatösen Neubildungen der Haut; histologisch in der HE- und Warthin-Starry-Färbung bzw. durch PCR oder Serologie. Therapie Gutes Ansprechen auf Roxithromycin, Azithromycin, Doxycyclin und Ciprofloxacin. Prognose Unbehandelt letaler Verlauf möglich. CMV-Retinitis Übertragung durch Sexualkontakte, Muttermilch und Schleimhautkontakt. Meist inapparenter Verlauf, Reaktivierung der latenten Inf. bei Immunschwäche. Erkrankungsrisiko hoch, wenn CD4 200/μl α2a-Interferon-Behandlung möglich. • Zytostatisch: Bei rasch progredientem Verlauf, klinisch relevantem Befall innerer Organe, generalisiertem Lymphödem insbesondere mit Doxorubicin (liposomal) und/oder Etoposid. Prognose Individuell sehr unterschiedlich. Kryptokokkose Erreger Der Err., ein Hefepilz, kommt weltweit und ubiquitär vor. Übertragung durch Inhalation von Staub aus eingetrocknetem Vogelkot (Tauben u.a. Vögel). Zunächst asymptomatische Inf. der Lunge, von dort aus hämatogene Streuung, bevorzugt ins ZNS. Erhöhtes Risiko, wenn CD4 200/ml Elimination des Err. innerhalb 2–3 Wo., bei niedrigerer CD4-Zellzahl chron. Persistenz mit häufigen Rezidiven. Pneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP) Nach wie vor häufigste AIDS-definierende Erkr. in Europa und Nordamerika. Err. kommt weltweit und ubiquitär vor. Durch zunehmendes Know-how und Prophylaxe ( 9.9.6 ) heute meist frühzeitig diagnostizier- und behandelbar. Klinik Typische Trias: Fieber, trockener Husten, zunehmende Belastungsdyspnoe. Abgeschlagenheit, Leistungsminderung und Gewichtsverlust. Akute Verläufe innerhalb einer Wo. möglich, meist aber über eine bis mehrere Wo. zunehmende Beschwerden. Auskultation unauffällig, evtl. verschärftes Atemgeräusch. Komplikationen Respiratorische Insuffizienz, Pneumothorax. Diagnostik Nachweis durch RöPneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP)-Thorax (milchglasartige bilaterale PcP (Pneumocystis-carinii-Pneumonie)Infiltrate), mikroskopischer Erregernachweis aus Reizsputum oder Bronchiallavage. Bei Verdacht Klinikeinweisung oder Facharztüberweisung in HIV-Schwerpunktpraxis. Therapie Nur bei leichten Formen ambulant. Behandlungsdauer 3 Wo. Co-trimoxazol Mittel 1. Wahl. Alternativ: Pentamidin, z.B. Pentacarinat®-Infusion. Klinikeinweisung, wenn pO 2 30 000 Kopien/ml Plasma • Pat. mit CD4-Zellen antiretrovirale Ther. vor der 15. Schwangerschaft:AIDSSSW bzw. diese unterbrechen, wenn der mütterliche Gesundheitszustand dies zulässt. Immer häufiger werden Frauen unter antiretroviraler Ther. schwanger, bei denen die Teratogenität selbst der Einzelsubstanzen noch nicht im Tierversuch abgeklärt wurde. Behandlung aus mütterlicher Indikation • Bisher nicht therapierte Patientin mit Therapieindikation: – Die Behandlung von HIV-pos. Schwangeren sollte Zentren vorbehalten bleiben, die hier Erfahrung haben → Überweisung. – Neugeborene 4 Wo. lang mit Zidovudin-Sirup (z.B. Retrovir®) 4 × 2 mg/kg KG/d oder für 10 d i.v. behandeln; Beginn spätestens 6 h post partum. • Geplante Grav. bei laufender antiretroviraler Ther.: Mit einem mit der HIV-Ther. vertrauten Zentrum abklären, ob eine Therapiepause bis zur 15. SSW in Betracht kommt. Behandlung aus kindlicher Indikation • Schwangerenvorsorge: Auch HIV-pos. Schwangeren wird die übliche Schwangerenvorsorge entsprechend den aktuell gültigen Mutterschaftsrichtlinien empfohlen. Danach soll der Schwangeren nach ausführlicher Aufklärung ein HIV-Test angeboten werden; HIV-Beratung, HIV-Test und Ergebnis werden nicht im Mutterpass dokumentiert. • Für Notfälle einen an den Geburtshelfer/die Hebamme gerichteten verschlossenen Briefumschlag im Mutterpass aufbewahren, der das Ergebnis des HIV-Tests enthält. • Unauffälliger Schwangerschaftsverlauf, niedriges HIV-1-Transmissionsrisiko, keine Therapieindikation seitens der Mutter: – Ggf. Zidovudin-Monother. (z.B. Retrovir® 2 × 250 mg/d) ab der 32. SSW. – Sectio am wehenlosen Uterus in der 37. SSW unter einer peripartalen i.v. Zidovudin-Gabe. – Neugeborene 4 Wo. lang mit Zidovudin-Sirup 4 × 2 mg/kg KG/d oder für 10 d i.v. behandeln; Beginn spätestens 6 h post partum. • Risikoschwangerschaft, vorzeitige Wehentätigkeit, Zwillinge: Behandlung durch FA mit entsprechender Erfahrung. • Keine Ther. in der Grav.: Entbindung durch eine primäre Sectio unter der o.g. i.v. Zidovudin-Ther. Kinder 4 Wo. post partum mit Zidovudin behandeln (s.o.). • Die Ther. sollte primär durch ein HIV-Behandlungszentrum koordiniert werden. 9.9.7 Medikamente bei HIV-Patienten Tab. 9.30 Nebenwirkungen, Kontraindikationen, Wechselwirkungen von bei HIV eingesetzten Medikamenten Medikament; Indikation Nebenwirkungen Kontraindikationen Wechselwirkungen Antiretrovirale Medikamente Nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren = NRTI AZT = Zidovudin (z.B. Retrovir®) Anämie, Leukopenie, Thrombopenie, Kopfschmerzen (50 %), Übelkeit; Myopathie Hb 400 Grippale Symptome, Verwirrtheit, Depression, Arrhythmien, RR-Abfall, Übelkeit, Diarrhoe, Thrombopenie Schwere Leberschädigung, Insuff. von: Herz, Knochenmark; Epilepsie; Depression Vorsicht bei gleichzeitiger Gabe von myelotoxischen Substanzen; Wirkungsverstärkung von Tranquilizern ∗ Zahlreiche Medikamente dürfen nicht zusammen mit Protease-Inhibitoren verabreicht werden ( Tab. 9.31 ) ∗∗ Nur diese Zubereitung mit hoher Bioverfügbarkeit verwenden Tab. 9.31 Zu beachtende Wechselwirkungen mit Protease-Inhibitoren Gruppe Kontraindikation Alternativen Antibiotika Rifampicin, Rifabutin Clarithromycin, Azithromycin, Ethambutol Antihistaminika Astemizol, Terfenadin Cetirizin, Loratadin Sedativa Midazolam, Triazolam Temazepam, Lorazepam Magen-Darm-Mittel Cisaprid MCP Lipidsenker Simvastatin, Lovastatin Atorvastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Cerivastatin Orale Kontrazeptiva (unsichere Wirkung) Kondom, Spirale Antikoagulanzien Cumarine (erhöhte Blutungsneigung) Heparin Aktuell: www.hiv-druginteractions.org 9.9.8 Vorgehen bei Kontakt mit HIV-kontaminiertem Material und Postexpositionsprophylaxe (PEP) Infektionsrisiko Art des übertragenen Materials: Blut, Samenflüssigkeit und Vaginalsekret haben i.d.R. die höchsten Viruskonz. bei HIV-Infizierten. In anderen Körperflüssigkeiten ist HIV in deutlich niedrigeren Konz. vorhanden. Die höchsten Viruskonz. treten beim Vollbild AIDS und AIDS:Medikamente bei HIV-Patientender akuten HIV-Erkr. auf. Art der Exposition: Berufliche HIV-Übertragungen bisher nur durch Blut oder Viruskonzentrat (Viruskultur) bei Stich- und Schnittverletzungen (Serokonversionsrate bei Nadelstichverletzungen: 0,3 %), Kontakt mit einer offenen AIDS:PostexpositionsprophylaxeWunde oder nicht-intakter (geschädigter) Haut oder Schleimhautexposition. Erste Hilfe und chronologischer Ablauf Nach jeder HIV-Exposition unverzüglich (in Sek.!) die folgenden Sofortmaßnahmen in der genannten Reihenfolge einleiten (ggf. kann anschließend an die Sofortmaßnahmen telefonisch weiterer Rat eingeholt werden): • Dekontamination der Verletzung: – Stichverletzung: Blutung fördern für > 1 Min. (kein Quetschen und Ausdrücken direkt im Einstichbereich, um keine Erregerverschleppung in tiefere Gewebsschichten zu begünstigen). Tupfer mit viruzidem Antiseptikum satt benetzen, über der Stichverletzung fixieren und für > 10 Min. durch fortlaufende Applikation des Antiseptikums feucht halten. – Schnittverletzung: Ggf. Blutfluss durch Spreizen der Wunde verstärken (> 1 Min.), danach antiseptische Spülung mit viruzidem Antiseptikum (> 10 Min.). – Hautexposition (geschädigte oder entzündlich veränderte Haut): Entfernen des potenziell infektiösen Materials. Danach Abreiben der Hautoberfläche unter großzügiger Einbeziehung des Umfelds um das sichtbar kontaminierte Areal mit einem Hautantiseptikum. – Kontamination des Auges: Reichliches Ausspülen mit 5 % wässriger PVP-Jod-Lösung. Falls nicht sofort verfügbar: Betaisodona®-Lösung 1:1 mit sterilem Aqua dest. oder notfalls mit Leitungswasser verdünnt. Falls auch nicht verfügbar, mit Wasser spülen. – Aufnahme in die Mundhöhle: Sofortiges, möglichst vollständiges Ausspucken des aufgenommenen Materials. Danach mehrfaches kurzes Spülen (ca. 4- bis 5-mal) der Mundhöhle mit Wasser oder mit 80%igem unvergälltem Ethanol. • Systemische, medikamentöse HIV-PEP, Beginn innerhalb von 2 h. • Unfalldokumentation (D-Arzt). • Hepatitis-B- und -C-Serologie, abklären, ob Hep.-B-PEP erforderlich ist. • Erster HIV-AK-Test, Wiederholung nach 3 und 6 Monaten. Tab. 9.32 Indikationen zur HIV-PEP (nach beruflicher Exposition) Verletzung mit Injektionsnadel oder anderer Hohlraumnadel (Körperflüssigkeit mit hoher Viruskonz.: Blut, Liquor, Punktatmaterial, Organmaterial, Viruskulturmaterial) → Empfehlen Schnittverletzung, sichtbares Blut → Empfehlen Oberflächliche Verletzung (z.B. mit chirurgischer Nadel) → Anbieten Kontakt zu Schleimhaut oder verletzter/geschädigter Haut mit Flüssigkeiten mit hoher Viruskonz. → Anbieten Kontakt von intakter Haut mit Blut (auch bei hoher Viruskonz.) → Nicht empfehlen Haut- oder Schleimhautkontakt mit Körperflüssigkeiten wie Urin und Speichel → Nicht empfehlen Tab. 9.33 Indikationen zur HIV-PEP (nach sexueller u.a. Exposition) Ungeschützter vaginaler oder analer Geschlechtsverkehr (z.B. infolge eines gerissenen Kondoms) mit einer HIV-infizierten Person → Empfehlen Gebrauch HIV-kontaminierten Injektionsbestecks durch mehrere Drogengebrauchende gemeinsam oder nacheinander → Empfehlen Ungeschützter oraler Geschlechtsverkehr mit der Aufnahme von Sperma des HIV-infizierten Partners in den Mund → Anbieten Küssen u.a. Sexualpraktiken ohne Sperma-/Blut-Schleimhautkontakte sowie S/M-Praktiken ohne Blut-zu-Blut-Kontakte → Nicht empfehlen Verletzung an gebrauchtem Spritzenbesteck zur Injektion von Drogen oder Insulin → Nicht empfehlen Bei Kontakt mit altem, weggeworfenen Spritzenbesteck einschließlich einer Verletzung durch diese (wie häufig bei spielenden Kindern) wird eine PEP nicht empfohlen. Kinder sollten jedoch in jedem Fall dem spezialisierten Arzt mit Impfunterlagen und dem Spritzenbesteck zur weiteren Untersuchung und Antikörperkontrolle vorgestellt werden. Maximaler Schutz wahrscheinlich nur bei Beginn der PEP innerhalb der ersten 2 h (Schutzrate > 90 %). Ggf. Überweisung (Taxi) zu entsprechend ausgestatteter Klinik oder HIV-Praxis mit vorheriger telefonischer Ankündigung. Sind seit der Exposition mehr als 24 h verstrichen, sind PEP-Maßnahmen vermutlich sinnlos. Auch bei lege artis durchgeführter PEP sind Serokonversionen beschrieben. Medikamente für die HIV-PEP Immer simultan eine Kombination aus 3 Wirkstoffen, i.d.R. 2 NRTI plus PI, z.B. AZT/3TC (Combivir®) 2 × 1 Tbl./d plus LPV/RTV (Kaletra®) 2 × 2 Tbl./d. Prophylaxemodifikation Eine Modifikation der Prophylaxe-Regime dann in Erwägung ziehen, wenn die Index-Person antiretroviral vorbehandelt ist. Schwangerschaft Bei Frauen im gebärfähigen Alter ohne sichere Antikonzeption sollte eine indizierte PEP zwar begonnen, sofort jedoch zusätzlich ein Schwangerschaftstest durchgeführt werden. Derzeit kann keine Substanz als unbedenklich zur Behandlung wie zur Prophylaxe eingestuft werden. Nebenwirkungen der antiretroviralen Medikamente Bei gesunden Menschen und bei kurzer Therapiedauer gering und reversibel. Gastrointestinale Beschwerden, Abgeschlagenheit und Kopfschmerzen sind am häufigsten. Bei Diarrhoe, Übelkeit, Kopfschmerzen ggf. symptomatisch behandeln und PEP fortsetzen. In Studien hat mehr als ein Drittel der Behandelten die Maßnahme wegen subjektiv empfundener NW vorzeitig beendet, deshalb ist entsprechende Aufklärung über NW wichtig. Spezielle NW und Risiken bei PEP In Einzelfällen kann sich bei entsprechender Disposition ein Diab. mell. manifestieren, bei bekanntem Diabetes die Stoffwechsellage unter Protease-Inhibitoren entgleisen. WW von Protease-Inhibitoren mit anderen Medikamenten Tab. 9.31 . Laborkontrollen • HIV-Ak nach 3 und 6 Mon. • Großes BB, GPT, γ-GT, Krea, Harnsäure. • BZ initial, alle 2 Wo. und 2 Wo. nach Ende der PEP. • HIV-PCR bei grippalem Krankheitsbild innerhalb von 4 Wo. nach Exposition oder nach Ende der PEP. Kostenübernahme: Bei beruflicher HIV-Exposition im Sinne eines Unfalls durch die Berufsgenossenschaften. Bei außerberuflicher, v.a. privat veranlasster HIV-Exposition werden die Kosten durch die GKV i.d.R. nicht übernommen; im Einzelfall stichhaltige, nachvollziehbare Begründung! Nicht berufliche Unfälle werden der GKV zugeordnet. 9.9.1 Epidemiologie und Übertragungswege Erreger HIV (human immunodeficiency virus); Retrovirus, das durch Befall der T-Helfer-Zellen (= CD4-Zellen) langfristig zur erworbenen Immunschwäche AIDS (= acquired immunodeficiency syndrome) führt. Weltweit vorherrschend ist Virustyp HIV-1, in Westafrika daneben auch relevanter Anteil von HIV-2 Inf. (langsamerer Krankheitsverlauf als bei HIV-1). Doppelinfektionen mit HIV-1 und HIV-2 können vorkommen. Epidemiologie Anteil unter den HIV-Infizierten in Europa: Homosexuelle Kontakte 50 %, i.v. Drogenmissbrauch 10 %, heterosexuelle Kontakte ca. 20 %, Anzahl zunehmend, Pat. aus Endemiegebieten der Dritten Welt 20 %, Transmission Mutter-Kind durch Stechinsekten, soziale Kontakte, Anhusten, Küssen, gemeinsam benutztes Geschirr, Trinkgefäß oder Essbesteck nachgewiesen. Infektiosität: Vergleichsweise niedrig, hängt vom Krankheitsstadium des HIV-Infizierten ab. Bes. hohe Viruskonz. bei akuter HIV-Inf. und im Stadium AIDS. Natürlicher Verlauf: 3–6 Wo. nach Inf. in 40–80 % d.F. fieberhaftes, Mononukleose-ähnliches Krankheitsbild (akute HIV-Inf.). Anschließend abhängig von inokulierter Virusmenge und Wirtsfaktoren, langer asymptomatischer Verlauf. Nach initial hoher Virämie (= Virusload) Gleichgewichtszustand (= Setpoint) aus Virusreplikation und -elimination auf niedrigerem Niveau. Progression zum Stadium AIDS umso rascher, je höher der Setpoint. Ohne Behandlung befinden sich in USA und Europa 50 % der Infizierten 10 J. bzw. 65 % 15 J.p.i. im Stadium AIDS. 9.9.2 Labordiagnostik Testmethoden HIV-Suchtest = HIV-Ak-Bestimmung: Bestimmt Ak gegen HIV-1 und HIV-2. Suchtest: ELISA. Bestätigung einer Inf. durch Immunoblot (Western Blot), um seltene falsch-positive Befunde auszuschließen, z.B. in Schwangerschaft, bei anderen Inf., Autoimmunkrankheiten und nach Transfusionen und Transplantationen. Auftreten der Ak i.d.R. 3 Mon. p.i., selten spätere Serokonversion. Zum definitiven Ausschluss einer HIV-Inf.: Weitere HIV siehe AIDSTests nach 3 und 6 AIDS:LabordiagnostikMon. Bei medizinischer AIDS:HIV-TestInd. über die HIV-TestKrankenkassen abrechenbar, Begründung auf dem Krankenschein z.B. chron. Diarrhoe, atypische Pneumonie, unklare Lk-Schwellungen, chron. Fieber. Bei HIV-Angst des Pat. wegen Zugehörigkeit zu einer Risikogruppe, Abrechnung privat oder auf kostenlosen Test beim Gesundheitsamt verweisen. Virusload: Bestimmung der Anzahl von HIV-RNA Kopien pro ml Plasma. Methoden: Quantitative PCR (Q-PCR), branched-chain-DNA-Methode (b-DNA) und die "nucleic acid sequence based amplification" (NASBA). Nachweisgrenze bei ultrasensitiven Tests 20 Kopien/ml. Die Höhe der Virämie korreliert direkt mit der Geschwindigkeit der Progression zum Stadium AIDS. Ind.: Marker für Indikationsstellung und Kontrolle der antiretroviralen Ther. Bei Erstdiagnose sollte auch immer eine genotypische (PCR) Resistenzbestimmung durchgeführt werden. Für Verlaufskontrollen ist wichtig, dass Messmethode und möglichst auch Labor beibehalten werden. Indikation für einen HIV-Test • Unklares, über längere Zeit bestehendes Fieber. • Unklarer Gewichtsverlust, chron. Diarrhoe, Demenz oder Thrombozytopenie, v.a. bei jüngeren Pat. • Infektionserkr., deren Inzidenz bei HIV-Infizierten erhöht ist: Tbc, rezid. bakt. Pneumonien, akute Hepatitis B oder C. • Hauterkrankung in ungewöhnlicher Ausprägung: – Kaposi-Sarkom: Hellrote, livide oder braunrote Infiltrate mit gelbem Hof, die im Verlauf der Hautspaltlinien angeordnet sind; treten auch in der Mundschleimhaut und im Genitalbereich auf. – Orale Haarzellleukoplakie: Nicht abstreifbare weiße Beläge an den seitlichen Zungenrändern. – Seborrhoisches Ekzem: Bevorzugt in talgdrüsenreichen Arealen fettige, groblamelläre Schuppung auf scharf begrenzten Erythemen. – Rezid. Herpes zoster (26.4.2) bei jungen Erw. mit Neigung zur Generalisation. – Persistierender Herpes genitalis ( 9.4.1 ): Nicht heilende, schmerzhafte Ulzera im Genital- und Analbereich. – Condylomata acuminata ( 9.8.6 ) im Analbereich oder an atyp. Lokalisation. – Soor (weiße oder gelbliche abstreifbare Beläge an Mundschleimhaut und Zunge) ohne entsprechende Grunderkr. (z.B. Diab. mell.), v.a. bei jüngeren Pat. • Maligne Lymphome. • Expositionsverdacht (z.B. durch Nadelstichverletzung). • Präventiv bei Bordellbesuchern, Prostituierten, Sextouristen (Krankenkasse zahlt nicht); vor/bei neuen Sexualpartnern, bei Kinderwunsch. • HIV-Angst: AIDS-Phobie (nur einmalig). Beratung vor dem HIV-Test Die Mitteilung, HIV-pos. zu sein, ist für jeden Betroffenen ein Schock. Deshalb schon vor der Testdurchführung Abklärung folgender Punkte: • Motiv für die Durchführung des Tests. • Was tun bei pos. Testergebnis? • Soziales Umfeld. • Psychische Belastbarkeit, Verhalten in der Wartezeit (Erkennen einer möglichen Suizidalität). • Über die Möglichkeit aufklären, ggf. frühzeitig mit der antiretroviralen Therapie und der Prophylaxe opportunistischer Infektionen zu beginnen. • Abgrenzung zur AIDS-Hypochondrie (v.a. heterosexuelle Pat. ohne Zugehörigkeit zu Risikogruppen), meist assoziiert mit anderen hypochondrischen Befürchtungen (z.B. Kanzerophobie), schuldbeladenes Verhältnis zur Sexualität. Vorgehen: Von weiteren HIV-Tests abraten, ggf. zu Psychotherapie motivieren. Bei Ablehnung des Tests und gleichzeitiger AIDS-Angst darauf hinweisen, dass durch die Ungewissheit die Angst immer bestehen bleibt und dass es Vorteile durch Kenntnis eines pos. Ak-Status gibt: Lebensverlängerung durch antiretrovirale Therapie und Prophylaxe opportunistischer Infektionen; außerdem Schutz des Sexualpartners möglich. Grundsätzlich und ausschließlich persönliche Mitteilung des Testergebnisses, egal, ob pos. oder neg. Beratung bei positivem HIV-Test Grundsätzlich muss der pos. Suchtest durch Immunoblot-Test bestätigt sein. Bei definitiv HIV-pos. Diagn. stützt sich das weitere Vorgehen auf ein ungestörtes Vertrauensverhältnis zwischen HA und Pat. Es dürfen keine unberechtigten Hoffnungen geweckt werden, aber es muss das Gefühl vermittelt werden, dass der HA dem Pat. zur Seite steht, wenn Symptome "kontrolliert" werden müssen. Therapeutische Optionen • Aufklärung über Krankheitsverlauf ( 9.9.3 ): HIV-pos. bedeutet nicht AIDS; i.d.R. langsame Progression; 35 % Langzeitüberlebende (auch nach 15 J. noch kein AIDS); keine Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit im asymptomatischen Stadium. • Aufklärung über Verbesserung der Prognose durch antiretrovirale Ther. und Prophylaxe opportunistischer Inf. ( 9.9.6 ): Durch die neue antiretrovirale Kombinationsther. kann der Virusload über längere Zeit unter der Nachweisgrenze gehalten werden → Krankheitsprogression lässt sich bremsen. • Besprechen der weiterführenden Diagnostik und der Kontrolluntersuchungen. • Bei Wunsch des Pat. psychother. Betreuung anbieten. Psychosoziale Hilfe • Hinweis auf Selbsthilfegruppen (35.2). • Berufliche Einschränkungen: Offiziell keine, außer bei Übernahme ins Beamtenverhältnis auf Lebenszeit. Bei Ärzten: Von operativer Tätigkeit abraten (Übertragungen durch HIV-pos. Operateure sind dokumentiert). Gesunde Lebensführung und Hygiene • Körperliche Überanstrengung vermeiden (z.B. Leistungssport), keine Kampfsportarten wegen des Risikos blutender Verletzungen, sonst Breitensport uneingeschränkt möglich. • Ausgewogene Ernährung; spezielle Diät bringt keine Vorteile. • Bei neg. Toxoplasmose-IgG Kontakt zu Katzen vermeiden. • Prävention der sexuellen HIV-Übertragung durch Kondome ("safer sex"), ggf. Umstellung der Sexualgewohnheiten. Partnerbenachrichtigung Die AIDS:gesunde LebensführungDeutsche Krankenhausgesellschaft und die Bundesärztekammer empfehlen: Der Arzt darf gefährdete Personen (z.B. wenn der infizierte Pat. seinem Partner die Inf. zu verschweigen gedenkt) in diesen Fällen warnen. Eine Verpflichtung zur Warnung des Partners des HIV-infizierten Pat. besteht dann, wenn auch der Partner des Infizierten bei dem Arzt in Behandlung ist. Diese Auffassung wurde vom OLG Frankfurt/Main am 05.10.1999 (AZ: 8U 7/99) bestätigt. Kontrazeption Bei HIV-diskordanten Partnern sollten Kondome verwendet werden, um das HIV-Übertragungsrisiko zu minimieren. Unter antiretroviraler Therapie werden orale Kontrazeptiva schneller metabolisiert. Daher auch Kondome bevorzugen, wenn der Partner ebenfalls infiziert ist. HIV-positive Kinder Prophylaxe von "Kinderkrankheiten" in der Umgebung von HIV-Positiven ( 9.9.6 ); Impfungen bei HIV-pos. Kindern ( 9.9.6 ). Zusätzlich zur medizinischen Betreuung der Kinder darauf hinweisen, dass die Eltern durch AIDS pflegebedürftig werden bzw. versterben. Kindergarten und Schulbesuch: Kein erhöhtes Infektionsrisiko durch übliche soziale Kontakte, daher keine Informationspflicht gegenüber Dritten. Die Bescheinigung über die Freiheit von Infektionskrankheiten nach IfSG kann ausgefüllt werden. Testmethoden HIV-Suchtest = HIV-Ak-Bestimmung: Bestimmt Ak gegen HIV-1 und HIV-2. Suchtest: ELISA. Bestätigung einer Inf. durch Immunoblot (Western Blot), um seltene falsch-positive Befunde auszuschließen, z.B. in Schwangerschaft, bei anderen Inf., Autoimmunkrankheiten und nach Transfusionen und Transplantationen. Auftreten der Ak i.d.R. 3 Mon. p.i., selten spätere Serokonversion. Zum definitiven Ausschluss einer HIV-Inf.: Weitere HIV siehe AIDSTests nach 3 und 6 AIDS:LabordiagnostikMon. Bei medizinischer AIDS:HIV-TestInd. über die HIV-TestKrankenkassen abrechenbar, Begründung auf dem Krankenschein z.B. chron. Diarrhoe, atypische Pneumonie, unklare Lk-Schwellungen, chron. Fieber. Bei HIV-Angst des Pat. wegen Zugehörigkeit zu einer Risikogruppe, Abrechnung privat oder auf kostenlosen Test beim Gesundheitsamt verweisen. Virusload: Bestimmung der Anzahl von HIV-RNA Kopien pro ml Plasma. Methoden: Quantitative PCR (Q-PCR), branched-chain-DNA-Methode (b-DNA) und die "nucleic acid sequence based amplification" (NASBA). Nachweisgrenze bei ultrasensitiven Tests 20 Kopien/ml. Die Höhe der Virämie korreliert direkt mit der Geschwindigkeit der Progression zum Stadium AIDS. Ind.: Marker für Indikationsstellung und Kontrolle der antiretroviralen Ther. Bei Erstdiagnose sollte auch immer eine genotypische (PCR) Resistenzbestimmung durchgeführt werden. Für Verlaufskontrollen ist wichtig, dass Messmethode und möglichst auch Labor beibehalten werden. Indikation für einen HIV-Test • Unklares, über längere Zeit bestehendes Fieber. • Unklarer Gewichtsverlust, chron. Diarrhoe, Demenz oder Thrombozytopenie, v.a. bei jüngeren Pat. • Infektionserkr., deren Inzidenz bei HIV-Infizierten erhöht ist: Tbc, rezid. bakt. Pneumonien, akute Hepatitis B oder C. • Hauterkrankung in ungewöhnlicher Ausprägung: – Kaposi-Sarkom: Hellrote, livide oder braunrote Infiltrate mit gelbem Hof, die im Verlauf der Hautspaltlinien angeordnet sind; treten auch in der Mundschleimhaut und im Genitalbereich auf. – Orale Haarzellleukoplakie: Nicht abstreifbare weiße Beläge an den seitlichen Zungenrändern. – Seborrhoisches Ekzem: Bevorzugt in talgdrüsenreichen Arealen fettige, groblamelläre Schuppung auf scharf begrenzten Erythemen. – Rezid. Herpes zoster (26.4.2) bei jungen Erw. mit Neigung zur Generalisation. – Persistierender Herpes genitalis ( 9.4.1 ): Nicht heilende, schmerzhafte Ulzera im Genital- und Analbereich. – Condylomata acuminata ( 9.8.6 ) im Analbereich oder an atyp. Lokalisation. – Soor (weiße oder gelbliche abstreifbare Beläge an Mundschleimhaut und Zunge) ohne entsprechende Grunderkr. (z.B. Diab. mell.), v.a. bei jüngeren Pat. • Maligne Lymphome. • Expositionsverdacht (z.B. durch Nadelstichverletzung). • Präventiv bei Bordellbesuchern, Prostituierten, Sextouristen (Krankenkasse zahlt nicht); vor/bei neuen Sexualpartnern, bei Kinderwunsch. • HIV-Angst: AIDS-Phobie (nur einmalig). Beratung vor dem HIV-Test Die Mitteilung, HIV-pos. zu sein, ist für jeden Betroffenen ein Schock. Deshalb schon vor der Testdurchführung Abklärung folgender Punkte: • Motiv für die Durchführung des Tests. • Was tun bei pos. Testergebnis? • Soziales Umfeld. • Psychische Belastbarkeit, Verhalten in der Wartezeit (Erkennen einer möglichen Suizidalität). • Über die Möglichkeit aufklären, ggf. frühzeitig mit der antiretroviralen Therapie und der Prophylaxe opportunistischer Infektionen zu beginnen. • Abgrenzung zur AIDS-Hypochondrie (v.a. heterosexuelle Pat. ohne Zugehörigkeit zu Risikogruppen), meist assoziiert mit anderen hypochondrischen Befürchtungen (z.B. Kanzerophobie), schuldbeladenes Verhältnis zur Sexualität. Vorgehen: Von weiteren HIV-Tests abraten, ggf. zu Psychotherapie motivieren. Bei Ablehnung des Tests und gleichzeitiger AIDS-Angst darauf hinweisen, dass durch die Ungewissheit die Angst immer bestehen bleibt und dass es Vorteile durch Kenntnis eines pos. Ak-Status gibt: Lebensverlängerung durch antiretrovirale Therapie und Prophylaxe opportunistischer Infektionen; außerdem Schutz des Sexualpartners möglich. Grundsätzlich und ausschließlich persönliche Mitteilung des Testergebnisses, egal, ob pos. oder neg. Beratung bei positivem HIV-Test Grundsätzlich muss der pos. Suchtest durch Immunoblot-Test bestätigt sein. Bei definitiv HIV-pos. Diagn. stützt sich das weitere Vorgehen auf ein ungestörtes Vertrauensverhältnis zwischen HA und Pat. Es dürfen keine unberechtigten Hoffnungen geweckt werden, aber es muss das Gefühl vermittelt werden, dass der HA dem Pat. zur Seite steht, wenn Symptome "kontrolliert" werden müssen. Therapeutische Optionen • Aufklärung über Krankheitsverlauf ( 9.9.3 ): HIV-pos. bedeutet nicht AIDS; i.d.R. langsame Progression; 35 % Langzeitüberlebende (auch nach 15 J. noch kein AIDS); keine Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit im asymptomatischen Stadium. • Aufklärung über Verbesserung der Prognose durch antiretrovirale Ther. und Prophylaxe opportunistischer Inf. ( 9.9.6 ): Durch die neue antiretrovirale Kombinationsther. kann der Virusload über längere Zeit unter der Nachweisgrenze gehalten werden → Krankheitsprogression lässt sich bremsen. • Besprechen der weiterführenden Diagnostik und der Kontrolluntersuchungen. • Bei Wunsch des Pat. psychother. Betreuung anbieten. Psychosoziale Hilfe • Hinweis auf Selbsthilfegruppen (35.2). • Berufliche Einschränkungen: Offiziell keine, außer bei Übernahme ins Beamtenverhältnis auf Lebenszeit. Bei Ärzten: Von operativer Tätigkeit abraten (Übertragungen durch HIV-pos. Operateure sind dokumentiert). Gesunde Lebensführung und Hygiene • Körperliche Überanstrengung vermeiden (z.B. Leistungssport), keine Kampfsportarten wegen des Risikos blutender Verletzungen, sonst Breitensport uneingeschränkt möglich. • Ausgewogene Ernährung; spezielle Diät bringt keine Vorteile. • Bei neg. Toxoplasmose-IgG Kontakt zu Katzen vermeiden. • Prävention der sexuellen HIV-Übertragung durch Kondome ("safer sex"), ggf. Umstellung der Sexualgewohnheiten. Partnerbenachrichtigung Die AIDS:gesunde LebensführungDeutsche Krankenhausgesellschaft und die Bundesärztekammer empfehlen: Der Arzt darf gefährdete Personen (z.B. wenn der infizierte Pat. seinem Partner die Inf. zu verschweigen gedenkt) in diesen Fällen warnen. Eine Verpflichtung zur Warnung des Partners des HIV-infizierten Pat. besteht dann, wenn auch der Partner des Infizierten bei dem Arzt in Behandlung ist. Diese Auffassung wurde vom OLG Frankfurt/Main am 05.10.1999 (AZ: 8U 7/99) bestätigt. Kontrazeption Bei HIV-diskordanten Partnern sollten Kondome verwendet werden, um das HIV-Übertragungsrisiko zu minimieren. Unter antiretroviraler Therapie werden orale Kontrazeptiva schneller metabolisiert. Daher auch Kondome bevorzugen, wenn der Partner ebenfalls infiziert ist. HIV-positive Kinder Prophylaxe von "Kinderkrankheiten" in der Umgebung von HIV-Positiven ( 9.9.6 ); Impfungen bei HIV-pos. Kindern ( 9.9.6 ). Zusätzlich zur medizinischen Betreuung der Kinder darauf hinweisen, dass die Eltern durch AIDS pflegebedürftig werden bzw. versterben. Kindergarten und Schulbesuch: Kein erhöhtes Infektionsrisiko durch übliche soziale Kontakte, daher keine Informationspflicht gegenüber Dritten. Die Bescheinigung über die Freiheit von Infektionskrankheiten nach IfSG kann ausgefüllt werden. 9.9.3 Stadieneinteilung und Verlauf Klinische Stadieneinteilung (Kategorien A–C der CDC-Klassifikation) Kategorie A Akute HIV-Inf. (mononucleosis-like-illness): Nach einer IKZ von 3–6 Wo. akute, Mononukleose-ähnliche Erkr. mit Fieber, Gliederschmerzen, makulösem Exanthem am oberen Stamm (70 % d.F.), Lk-Schwellungen, Angina, Splenomegalie. Leuko-, Lympho-, oft auch Thrombopenie. Immer spontane Rückbildung der Symptome. Diagn.: Ausschluss einer Mononukleose, HIV-AK meist noch neg. (Serokonversion erfolgt nach 1–3 Mon.), zellulärer Immunstatus. Bei Verdacht AIDS:StadieneinteilungHIV-PCR quantitativ. Wegen unspezifischer und variabler Symptomatik wird die Diagn. ohne V.a. HIV-Exposition meist nicht gestellt. Generalisierte Lymphadenopathie (= Lymphadenopathie-Syndrom, LAS): Persisitierende Lk-Schwellungen an mind. zwei extragenitalen Stellen für > 3 Mon. HIV-AK meist pos. Asymptomatische HIV-Inf.: Pat. ist klinisch gesund und infektiös. CD4-Zellen meist > 500/μl (Anzahl der CD4-Zellen orientiert über das Ausmaß des Immundefekts). Kategorie B AIDS-related Complex: Auftreten von Erkr., die keine AIDS-definierenden Erkr. laut Kategorie C sind, aber auf eine Störung der zellulären Immunität hinweisen: Mund-Soor, chron. vulvovaginale Candidiasis, Fieber > 38,5 °C, Diarrhoe > 4 Wo., rezid. Herpes simplex oder Herpes zoster mehrerer Dermatome, periphere Neuropathie, bazilläre Angiomatose, idiopathische thrombozytopenische Purpura. Kategorie C AIDS: Auftreten einer oder mehrerer AIDS-definierender Erkr.: Pneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP); Toxoplasma-Enzephalitis; ösophageale Candida-Inf. oder Befall von Bronchien, Trachea oder Lungen; chron. Herpes-simplex-Ulzera oder Herpes-Bronchitis, -Pneumonie oder -Ösophagitis; CMV-Retinitis; generalisierte CMV-Inf. (nicht von Leber oder Milz); rezid. Salm.-Septikämien; rezid. Pneumonien innerhalb eines J.; extrapulmonale Kryptokokkeninf.; chron. intestinale Kryptosporidieninf.; chron. intestinale Inf. mit Isospora belli; disseminierte oder extrapulmonale Histoplasmose; Tbc; Inf. mit Mycobacterium-avium-Complex (MAI) oder M. kansasii, disseminiert oder extrapulmonal; Kaposi-Sarkom; Non-Hodgkin-Lymphome; invasives Zervix-Ca; HIV-Enzephalopathie; progressive multifokale Leukenzephalopathie; Wasting-Syndrom (chron. Diarrhoe, ungewollter Gewichtsverlust > 10 % des KG). CDC-Klassifikation von 1993 Einteilung nach klinischen Gesichtspunkten und Anzahl der CD4-Zellen/μl. Tab. 9.25 CDC-Klassifikation (1993) Laborkategorie CD4-Zellen/μl Klinische Kategorie A (asymptomatisch oder akute HIV-Inf.) B (Symptome, kein AIDS) C (Symptome, AIDS) 1: ≥ 500 A1 B1 C1 2: 200–499 A2 B2 C2 3: 3 Mon. HIV-AK meist pos. Asymptomatische HIV-Inf.: Pat. ist klinisch gesund und infektiös. CD4-Zellen meist > 500/μl (Anzahl der CD4-Zellen orientiert über das Ausmaß des Immundefekts). Kategorie B AIDS-related Complex: Auftreten von Erkr., die keine AIDS-definierenden Erkr. laut Kategorie C sind, aber auf eine Störung der zellulären Immunität hinweisen: Mund-Soor, chron. vulvovaginale Candidiasis, Fieber > 38,5 °C, Diarrhoe > 4 Wo., rezid. Herpes simplex oder Herpes zoster mehrerer Dermatome, periphere Neuropathie, bazilläre Angiomatose, idiopathische thrombozytopenische Purpura. Kategorie C AIDS: Auftreten einer oder mehrerer AIDS-definierender Erkr.: Pneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP); Toxoplasma-Enzephalitis; ösophageale Candida-Inf. oder Befall von Bronchien, Trachea oder Lungen; chron. Herpes-simplex-Ulzera oder Herpes-Bronchitis, -Pneumonie oder -Ösophagitis; CMV-Retinitis; generalisierte CMV-Inf. (nicht von Leber oder Milz); rezid. Salm.-Septikämien; rezid. Pneumonien innerhalb eines J.; extrapulmonale Kryptokokkeninf.; chron. intestinale Kryptosporidieninf.; chron. intestinale Inf. mit Isospora belli; disseminierte oder extrapulmonale Histoplasmose; Tbc; Inf. mit Mycobacterium-avium-Complex (MAI) oder M. kansasii, disseminiert oder extrapulmonal; Kaposi-Sarkom; Non-Hodgkin-Lymphome; invasives Zervix-Ca; HIV-Enzephalopathie; progressive multifokale Leukenzephalopathie; Wasting-Syndrom (chron. Diarrhoe, ungewollter Gewichtsverlust > 10 % des KG). CDC-Klassifikation von 1993 Einteilung nach klinischen Gesichtspunkten und Anzahl der CD4-Zellen/μl. Tab. 9.25 CDC-Klassifikation (1993) Laborkategorie CD4-Zellen/μl Klinische Kategorie A (asymptomatisch oder akute HIV-Inf.) B (Symptome, kein AIDS) C (Symptome, AIDS) 1: ≥ 500 A1 B1 C1 2: 200–499 A2 B2 C2 3: 30 000/ml im Rahmen des Monitorings bei antiretroviraler Ther. – Resistenzbestimmung vor Aufnahme einer Behandlung. 9.9.5 Häufige Krankheitsbilder bei AIDS Tab. 9.26 Häufige AIDS-Krankheiten in Relation zur CD4-Zahl CD4-Zellen/ μ l Häufige AIDS-Manifestationen > 200 Frühe Manifestationen von Kaposi-Sarkom, Non-Hodgkin-Lymphom oder Tbc möglich 1000/μl Durch die Einführung hochwirksamer antiretroviraler Therapieregime lässt sich das Auftreten vieler AIDS-definierender Erkr. verhindern bzw. hinauszögern. Bei Verbesserung der Immunität unter antiretroviraler Ther. kommt es zu deren Remission. Tab. 9.27 Häufige Komplikationen bei AIDS Symptome bei AIDS Mögliche Ursache Abgeschlagenheit, Fieber, Gewichtsverlust • Sepsis: Pneumok., Salmonellen, A-Streptok. • Beginnende opportunistische Inf., malignes Lymphom Retrosternale Schmerzen Ösophagitis durch Candida, CMV, Herpes, Kaposi-Sarkom des Ösophagus oder Magens Dyspnoe, Husten, Fieber Pneumonie durch Pneumocystis carinii, Bakterien, CMV, Tbc Übelkeit und Erbrechen Arzneimittel-NW, Kaposi-Sarkom, Lymphom des Magens Diarrhoe Durch Kryptosporidien, Isospora species, Lamblien, Amöben, Salmonellen, Yersinien, enteropathogene Coli-Stämme, Arzneimittel-NW, CMV, Mykobakterien Bauchschmerzen, Koliken, Obstipation CMV-Enteritis, abdom. Inf. mit Mycobacterium avium, medikamenteninduzierte Pankreatitis, Kaposi-Sarkom des Darms, maligne Lymphome des Darms. Perforation, Appendizitis Neurologische Ausfälle und Fieber ZNS-Toxoplasmose, ZNS-Lymphom. Meningitis durch Bakterien, Kryptokokken, HIV, HSV Hirnorganischer Abbau HIV-Enzephalopathie Auge, Sehstörungen • Retinitis: Zytomegalie, Toxoplasmose, Herpes • NW einer Ethambutol-Ther.: Ablatio retinae Haut • Erytheme, Exantheme: Arzneimittel-NW, Mykosen • Bläschen, Pusteln: Herpes simplex, Zoster, Mykosen • Papeln, Knoten, Tumoren: Kaposi-Sarkom, Mollusca contagiosa, kutane Lymphome, Mykobakteriosen, bazilläre Angiomatose • Juckreiz: Internistische Ursachen (26.1.2), Arzneimittelreaktion Mundhöhle • Beläge: Soor, orale Haarzellleukoplakie • Zungenbrennen: Soor, Zytomegalie, Herpes Anal-genitale Schmerzen Analvenenthrombose, Herpes, Soor, Gonorrhö, Lues Nichttuberkulöse Mykobakterien Erreger Meist Mycobacterium avium (MAI-Stämme), selten M. kansasii oder M. xenopi. AIDS:assoziierte KrankheitenErkrankungsrisiko hoch, wenn CD4 100/μl erreicht werden kann. Prognose Protrahierter Verlauf, insgesamt ungünstig. Bazilläre Angiomatose Erreger Bartonella henselae, gramneg. Bakterium, verursacht bei Immunkompetenten die Katzenkratzkrankheit. In 2/3 d.F. sind auch hier Verletzungen durch Katzen der Auslöser ( 9.3.8 ). Klinik Lokal aggregierte oder disseminiert stehende rötliche, gelegentlich blaulivide oder hautfarbene Knoten oder Papeln. Bis ca. 5 cm groß, mitunter auch exanthematische Ausbreitung hunderter kleinster Läsionen ohne bevorzugte Lokalisation. Konsistenz gummiartig, prall-elastisch. Effloreszenzen: Beginn als winzige, blaurote Papeln, die ab einer bestimmten Größe ulzerieren können und sich dann mit einer Kruste überziehen. Abheilung meist als Restitutio ad integrum. Manchmal bleiben eine Hyperpigmentierung oder Induration. Bei Rückbildung größerer Knoten können sich atrophische, unter das Hautniveau eingesunkene Narben bilden. Häufig Befall von Schleimhäuten und inneren Organen. Allgemeinsymptome: Abgeschlagenheit, Appetitlosigkeit, Erbrechen, Diarrhö, Nachtschweiß, Fieber, Schüttelfrost, krampfartige abdom. Schmerzen. Differenzialdiagnose Kaposi-Sarkom. Diagnostik Nachweis von Bakterien durch Biopsie von angiomatösen Neubildungen der Haut; histologisch in der HE- und Warthin-Starry-Färbung bzw. durch PCR oder Serologie. Therapie Gutes Ansprechen auf Roxithromycin, Azithromycin, Doxycyclin und Ciprofloxacin. Prognose Unbehandelt letaler Verlauf möglich. CMV-Retinitis Übertragung durch Sexualkontakte, Muttermilch und Schleimhautkontakt. Meist inapparenter Verlauf, Reaktivierung der latenten Inf. bei Immunschwäche. Erkrankungsrisiko hoch, wenn CD4 200/μl α2a-Interferon-Behandlung möglich. • Zytostatisch: Bei rasch progredientem Verlauf, klinisch relevantem Befall innerer Organe, generalisiertem Lymphödem insbesondere mit Doxorubicin (liposomal) und/oder Etoposid. Prognose Individuell sehr unterschiedlich. Kryptokokkose Erreger Der Err., ein Hefepilz, kommt weltweit und ubiquitär vor. Übertragung durch Inhalation von Staub aus eingetrocknetem Vogelkot (Tauben u.a. Vögel). Zunächst asymptomatische Inf. der Lunge, von dort aus hämatogene Streuung, bevorzugt ins ZNS. Erhöhtes Risiko, wenn CD4 200/ml Elimination des Err. innerhalb 2–3 Wo., bei niedrigerer CD4-Zellzahl chron. Persistenz mit häufigen Rezidiven. Pneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP) Nach wie vor häufigste AIDS-definierende Erkr. in Europa und Nordamerika. Err. kommt weltweit und ubiquitär vor. Durch zunehmendes Know-how und Prophylaxe ( 9.9.6 ) heute meist frühzeitig diagnostizier- und behandelbar. Klinik Typische Trias: Fieber, trockener Husten, zunehmende Belastungsdyspnoe. Abgeschlagenheit, Leistungsminderung und Gewichtsverlust. Akute Verläufe innerhalb einer Wo. möglich, meist aber über eine bis mehrere Wo. zunehmende Beschwerden. Auskultation unauffällig, evtl. verschärftes Atemgeräusch. Komplikationen Respiratorische Insuffizienz, Pneumothorax. Diagnostik Nachweis durch RöPneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP)-Thorax (milchglasartige bilaterale PcP (Pneumocystis-carinii-Pneumonie)Infiltrate), mikroskopischer Erregernachweis aus Reizsputum oder Bronchiallavage. Bei Verdacht Klinikeinweisung oder Facharztüberweisung in HIV-Schwerpunktpraxis. Therapie Nur bei leichten Formen ambulant. Behandlungsdauer 3 Wo. Co-trimoxazol Mittel 1. Wahl. Alternativ: Pentamidin, z.B. Pentacarinat®-Infusion. Klinikeinweisung, wenn pO 2 100/μl erreicht werden kann. Prognose Protrahierter Verlauf, insgesamt ungünstig. Bazilläre Angiomatose Erreger Bartonella henselae, gramneg. Bakterium, verursacht bei Immunkompetenten die Katzenkratzkrankheit. In 2/3 d.F. sind auch hier Verletzungen durch Katzen der Auslöser ( 9.3.8 ). Klinik Lokal aggregierte oder disseminiert stehende rötliche, gelegentlich blaulivide oder hautfarbene Knoten oder Papeln. Bis ca. 5 cm groß, mitunter auch exanthematische Ausbreitung hunderter kleinster Läsionen ohne bevorzugte Lokalisation. Konsistenz gummiartig, prall-elastisch. Effloreszenzen: Beginn als winzige, blaurote Papeln, die ab einer bestimmten Größe ulzerieren können und sich dann mit einer Kruste überziehen. Abheilung meist als Restitutio ad integrum. Manchmal bleiben eine Hyperpigmentierung oder Induration. Bei Rückbildung größerer Knoten können sich atrophische, unter das Hautniveau eingesunkene Narben bilden. Häufig Befall von Schleimhäuten und inneren Organen. Allgemeinsymptome: Abgeschlagenheit, Appetitlosigkeit, Erbrechen, Diarrhö, Nachtschweiß, Fieber, Schüttelfrost, krampfartige abdom. Schmerzen. Differenzialdiagnose Kaposi-Sarkom. Diagnostik Nachweis von Bakterien durch Biopsie von angiomatösen Neubildungen der Haut; histologisch in der HE- und Warthin-Starry-Färbung bzw. durch PCR oder Serologie. Therapie Gutes Ansprechen auf Roxithromycin, Azithromycin, Doxycyclin und Ciprofloxacin. Prognose Unbehandelt letaler Verlauf möglich. CMV-Retinitis Übertragung durch Sexualkontakte, Muttermilch und Schleimhautkontakt. Meist inapparenter Verlauf, Reaktivierung der latenten Inf. bei Immunschwäche. Erkrankungsrisiko hoch, wenn CD4 200/μl α2a-Interferon-Behandlung möglich. • Zytostatisch: Bei rasch progredientem Verlauf, klinisch relevantem Befall innerer Organe, generalisiertem Lymphödem insbesondere mit Doxorubicin (liposomal) und/oder Etoposid. Prognose Individuell sehr unterschiedlich. Kryptokokkose Erreger Der Err., ein Hefepilz, kommt weltweit und ubiquitär vor. Übertragung durch Inhalation von Staub aus eingetrocknetem Vogelkot (Tauben u.a. Vögel). Zunächst asymptomatische Inf. der Lunge, von dort aus hämatogene Streuung, bevorzugt ins ZNS. Erhöhtes Risiko, wenn CD4 200/ml Elimination des Err. innerhalb 2–3 Wo., bei niedrigerer CD4-Zellzahl chron. Persistenz mit häufigen Rezidiven. Pneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP) Nach wie vor häufigste AIDS-definierende Erkr. in Europa und Nordamerika. Err. kommt weltweit und ubiquitär vor. Durch zunehmendes Know-how und Prophylaxe ( 9.9.6 ) heute meist frühzeitig diagnostizier- und behandelbar. Klinik Typische Trias: Fieber, trockener Husten, zunehmende Belastungsdyspnoe. Abgeschlagenheit, Leistungsminderung und Gewichtsverlust. Akute Verläufe innerhalb einer Wo. möglich, meist aber über eine bis mehrere Wo. zunehmende Beschwerden. Auskultation unauffällig, evtl. verschärftes Atemgeräusch. Komplikationen Respiratorische Insuffizienz, Pneumothorax. Diagnostik Nachweis durch RöPneumocystis-carinii-Pneumonie (PcP)-Thorax (milchglasartige bilaterale PcP (Pneumocystis-carinii-Pneumonie)Infiltrate), mikroskopischer Erregernachweis aus Reizsputum oder Bronchiallavage. Bei Verdacht Klinikeinweisung oder Facharztüberweisung in HIV-Schwerpunktpraxis. Therapie Nur bei leichten Formen ambulant. Behandlungsdauer 3 Wo. Co-trimoxazol Mittel 1. Wahl. Alternativ: Pentamidin, z.B. Pentacarinat®-Infusion. Klinikeinweisung, wenn pO 2 30 000 Kopien/ml Plasma • Pat. mit CD4-Zellen antiretrovirale Ther. vor der 15. Schwangerschaft:AIDSSSW bzw. diese unterbrechen, wenn der mütterliche Gesundheitszustand dies zulässt. Immer häufiger werden Frauen unter antiretroviraler Ther. schwanger, bei denen die Teratogenität selbst der Einzelsubstanzen noch nicht im Tierversuch abgeklärt wurde. Behandlung aus mütterlicher Indikation • Bisher nicht therapierte Patientin mit Therapieindikation: – Die Behandlung von HIV-pos. Schwangeren sollte Zentren vorbehalten bleiben, die hier Erfahrung haben → Überweisung. – Neugeborene 4 Wo. lang mit Zidovudin-Sirup (z.B. Retrovir®) 4 × 2 mg/kg KG/d oder für 10 d i.v. behandeln; Beginn spätestens 6 h post partum. • Geplante Grav. bei laufender antiretroviraler Ther.: Mit einem mit der HIV-Ther. vertrauten Zentrum abklären, ob eine Therapiepause bis zur 15. SSW in Betracht kommt. Behandlung aus kindlicher Indikation • Schwangerenvorsorge: Auch HIV-pos. Schwangeren wird die übliche Schwangerenvorsorge entsprechend den aktuell gültigen Mutterschaftsrichtlinien empfohlen. Danach soll der Schwangeren nach ausführlicher Aufklärung ein HIV-Test angeboten werden; HIV-Beratung, HIV-Test und Ergebnis werden nicht im Mutterpass dokumentiert. • Für Notfälle einen an den Geburtshelfer/die Hebamme gerichteten verschlossenen Briefumschlag im Mutterpass aufbewahren, der das Ergebnis des HIV-Tests enthält. • Unauffälliger Schwangerschaftsverlauf, niedriges HIV-1-Transmissionsrisiko, keine Therapieindikation seitens der Mutter: – Ggf. Zidovudin-Monother. (z.B. Retrovir® 2 × 250 mg/d) ab der 32. SSW. – Sectio am wehenlosen Uterus in der 37. SSW unter einer peripartalen i.v. Zidovudin-Gabe. – Neugeborene 4 Wo. lang mit Zidovudin-Sirup 4 × 2 mg/kg KG/d oder für 10 d i.v. behandeln; Beginn spätestens 6 h post partum. • Risikoschwangerschaft, vorzeitige Wehentätigkeit, Zwillinge: Behandlung durch FA mit entsprechender Erfahrung. • Keine Ther. in der Grav.: Entbindung durch eine primäre Sectio unter der o.g. i.v. Zidovudin-Ther. Kinder 4 Wo. post partum mit Zidovudin behandeln (s.o.). • Die Ther. sollte primär durch ein HIV-Behandlungszentrum koordiniert werden. Antiretrovirale Therapie (ART) Die hochaktive antiretrovirale Therapie (highly active antiretroviral therapy = HAART) vermag Virusload unter die Nachweisgrenze der quantitativen PCR zu bringen und eine Remission der Immunschwäche mit Anstieg der CD4-Zellen zur erreichen. Der Pool an HIV-infizierten Zellen wird auch bei lang dauernder Ther. nicht eliminiert, da weiterhin eine HIV-Replikation auf sehr niedrigem Niveau stattfindet und es sehr AIDS:antiretrovirale Therapielanglebige Zellen gibt, in denen Antiretrovirale TherapieHIV überdauert. Die HAARTLebensqualität HIV:HAARTkann durch NW der HAART beeinträchtigt werden. Behandlungsziele der HIV-Ther. sind: • Verlängerte Lebenserwartung. • Erhaltung bzw. Verbesserung der Lebensqualität durch Vermeiden HIV-assoziierter Erkr.; damit auch verminderte Behandlungskosten für opportunistische Inf. und verlängerte Berufstätigkeit des Pat. • Senkung der Infektiosität. Tab. 9.28 Indikationen für eine HAART Gesicherte, dringende Behandlungsindikation • AIDS- oder HIV-assoziierte Symptome (C- oder B-Symptome nach CDC 1993) bzw. mit Immunthrombozytopenie • Pat. mit Viruslast > 30 000 Kopien/ml Plasma • Pat. mit CD4-Zellen antiretrovirale Ther. vor der 15. Schwangerschaft:AIDSSSW bzw. diese unterbrechen, wenn der mütterliche Gesundheitszustand dies zulässt. Immer häufiger werden Frauen unter antiretroviraler Ther. schwanger, bei denen die Teratogenität selbst der Einzelsubstanzen noch nicht im Tierversuch abgeklärt wurde. Behandlung aus mütterlicher Indikation • Bisher nicht therapierte Patientin mit Therapieindikation: – Die Behandlung von HIV-pos. Schwangeren sollte Zentren vorbehalten bleiben, die hier Erfahrung haben → Überweisung. – Neugeborene 4 Wo. lang mit Zidovudin-Sirup (z.B. Retrovir®) 4 × 2 mg/kg KG/d oder für 10 d i.v. behandeln; Beginn spätestens 6 h post partum. • Geplante Grav. bei laufender antiretroviraler Ther.: Mit einem mit der HIV-Ther. vertrauten Zentrum abklären, ob eine Therapiepause bis zur 15. SSW in Betracht kommt. Behandlung aus kindlicher Indikation • Schwangerenvorsorge: Auch HIV-pos. Schwangeren wird die übliche Schwangerenvorsorge entsprechend den aktuell gültigen Mutterschaftsrichtlinien empfohlen. Danach soll der Schwangeren nach ausführlicher Aufklärung ein HIV-Test angeboten werden; HIV-Beratung, HIV-Test und Ergebnis werden nicht im Mutterpass dokumentiert. • Für Notfälle einen an den Geburtshelfer/die Hebamme gerichteten verschlossenen Briefumschlag im Mutterpass aufbewahren, der das Ergebnis des HIV-Tests enthält. • Unauffälliger Schwangerschaftsverlauf, niedriges HIV-1-Transmissionsrisiko, keine Therapieindikation seitens der Mutter: – Ggf. Zidovudin-Monother. (z.B. Retrovir® 2 × 250 mg/d) ab der 32. SSW. – Sectio am wehenlosen Uterus in der 37. SSW unter einer peripartalen i.v. Zidovudin-Gabe. – Neugeborene 4 Wo. lang mit Zidovudin-Sirup 4 × 2 mg/kg KG/d oder für 10 d i.v. behandeln; Beginn spätestens 6 h post partum. • Risikoschwangerschaft, vorzeitige Wehentätigkeit, Zwillinge: Behandlung durch FA mit entsprechender Erfahrung. • Keine Ther. in der Grav.: Entbindung durch eine primäre Sectio unter der o.g. i.v. Zidovudin-Ther. Kinder 4 Wo. post partum mit Zidovudin behandeln (s.o.). • Die Ther. sollte primär durch ein HIV-Behandlungszentrum koordiniert werden. 9.9.7 Medikamente bei HIV-Patienten Tab. 9.30 Nebenwirkungen, Kontraindikationen, Wechselwirkungen von bei HIV eingesetzten Medikamenten Medikament; Indikation Nebenwirkungen Kontraindikationen Wechselwirkungen Antiretrovirale Medikamente Nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren = NRTI AZT = Zidovudin (z.B. Retrovir®) Anämie, Leukopenie, Thrombopenie, Kopfschmerzen (50 %), Übelkeit; Myopathie Hb 400 Grippale Symptome, Verwirrtheit, Depression, Arrhythmien, RR-Abfall, Übelkeit, Diarrhoe, Thrombopenie Schwere Leberschädigung, Insuff. von: Herz, Knochenmark; Epilepsie; Depression Vorsicht bei gleichzeitiger Gabe von myelotoxischen Substanzen; Wirkungsverstärkung von Tranquilizern ∗ Zahlreiche Medikamente dürfen nicht zusammen mit Protease-Inhibitoren verabreicht werden ( Tab. 9.31 ) ∗∗ Nur diese Zubereitung mit hoher Bioverfügbarkeit verwenden Tab. 9.31 Zu beachtende Wechselwirkungen mit Protease-Inhibitoren Gruppe Kontraindikation Alternativen Antibiotika Rifampicin, Rifabutin Clarithromycin, Azithromycin, Ethambutol Antihistaminika Astemizol, Terfenadin Cetirizin, Loratadin Sedativa Midazolam, Triazolam Temazepam, Lorazepam Magen-Darm-Mittel Cisaprid MCP Lipidsenker Simvastatin, Lovastatin Atorvastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Cerivastatin Orale Kontrazeptiva (unsichere Wirkung) Kondom, Spirale Antikoagulanzien Cumarine (erhöhte Blutungsneigung) Heparin Aktuell: www.hiv-druginteractions.org 9.9.8 Vorgehen bei Kontakt mit HIV-kontaminiertem Material und Postexpositionsprophylaxe (PEP) Infektionsrisiko Art des übertragenen Materials: Blut, Samenflüssigkeit und Vaginalsekret haben i.d.R. die höchsten Viruskonz. bei HIV-Infizierten. In anderen Körperflüssigkeiten ist HIV in deutlich niedrigeren Konz. vorhanden. Die höchsten Viruskonz. treten beim Vollbild AIDS und AIDS:Medikamente bei HIV-Patientender akuten HIV-Erkr. auf. Art der Exposition: Berufliche HIV-Übertragungen bisher nur durch Blut oder Viruskonzentrat (Viruskultur) bei Stich- und Schnittverletzungen (Serokonversionsrate bei Nadelstichverletzungen: 0,3 %), Kontakt mit einer offenen AIDS:PostexpositionsprophylaxeWunde oder nicht-intakter (geschädigter) Haut oder Schleimhautexposition. Erste Hilfe und chronologischer Ablauf Nach jeder HIV-Exposition unverzüglich (in Sek.!) die folgenden Sofortmaßnahmen in der genannten Reihenfolge einleiten (ggf. kann anschließend an die Sofortmaßnahmen telefonisch weiterer Rat eingeholt werden): • Dekontamination der Verletzung: – Stichverletzung: Blutung fördern für > 1 Min. (kein Quetschen und Ausdrücken direkt im Einstichbereich, um keine Erregerverschleppung in tiefere Gewebsschichten zu begünstigen). Tupfer mit viruzidem Antiseptikum satt benetzen, über der Stichverletzung fixieren und für > 10 Min. durch fortlaufende Applikation des Antiseptikums feucht halten. – Schnittverletzung: Ggf. Blutfluss durch Spreizen der Wunde verstärken (> 1 Min.), danach antiseptische Spülung mit viruzidem Antiseptikum (> 10 Min.). – Hautexposition (geschädigte oder entzündlich veränderte Haut): Entfernen des potenziell infektiösen Materials. Danach Abreiben der Hautoberfläche unter großzügiger Einbeziehung des Umfelds um das sichtbar kontaminierte Areal mit einem Hautantiseptikum. – Kontamination des Auges: Reichliches Ausspülen mit 5 % wässriger PVP-Jod-Lösung. Falls nicht sofort verfügbar: Betaisodona®-Lösung 1:1 mit sterilem Aqua dest. oder notfalls mit Leitungswasser verdünnt. Falls auch nicht verfügbar, mit Wasser spülen. – Aufnahme in die Mundhöhle: Sofortiges, möglichst vollständiges Ausspucken des aufgenommenen Materials. Danach mehrfaches kurzes Spülen (ca. 4- bis 5-mal) der Mundhöhle mit Wasser oder mit 80%igem unvergälltem Ethanol. • Systemische, medikamentöse HIV-PEP, Beginn innerhalb von 2 h. • Unfalldokumentation (D-Arzt). • Hepatitis-B- und -C-Serologie, abklären, ob Hep.-B-PEP erforderlich ist. • Erster HIV-AK-Test, Wiederholung nach 3 und 6 Monaten. Tab. 9.32 Indikationen zur HIV-PEP (nach beruflicher Exposition) Verletzung mit Injektionsnadel oder anderer Hohlraumnadel (Körperflüssigkeit mit hoher Viruskonz.: Blut, Liquor, Punktatmaterial, Organmaterial, Viruskulturmaterial) → Empfehlen Schnittverletzung, sichtbares Blut → Empfehlen Oberflächliche Verletzung (z.B. mit chirurgischer Nadel) → Anbieten Kontakt zu Schleimhaut oder verletzter/geschädigter Haut mit Flüssigkeiten mit hoher Viruskonz. → Anbieten Kontakt von intakter Haut mit Blut (auch bei hoher Viruskonz.) → Nicht empfehlen Haut- oder Schleimhautkontakt mit Körperflüssigkeiten wie Urin und Speichel → Nicht empfehlen Tab. 9.33 Indikationen zur HIV-PEP (nach sexueller u.a. Exposition) Ungeschützter vaginaler oder analer Geschlechtsverkehr (z.B. infolge eines gerissenen Kondoms) mit einer HIV-infizierten Person → Empfehlen Gebrauch HIV-kontaminierten Injektionsbestecks durch mehrere Drogengebrauchende gemeinsam oder nacheinander → Empfehlen Ungeschützter oraler Geschlechtsverkehr mit der Aufnahme von Sperma des HIV-infizierten Partners in den Mund → Anbieten Küssen u.a. Sexualpraktiken ohne Sperma-/Blut-Schleimhautkontakte sowie S/M-Praktiken ohne Blut-zu-Blut-Kontakte → Nicht empfehlen Verletzung an gebrauchtem Spritzenbesteck zur Injektion von Drogen oder Insulin → Nicht empfehlen Bei Kontakt mit altem, weggeworfenen Spritzenbesteck einschließlich einer Verletzung durch diese (wie häufig bei spielenden Kindern) wird eine PEP nicht empfohlen. Kinder sollten jedoch in jedem Fall dem spezialisierten Arzt mit Impfunterlagen und dem Spritzenbesteck zur weiteren Untersuchung und Antikörperkontrolle vorgestellt werden. Maximaler Schutz wahrscheinlich nur bei Beginn der PEP innerhalb der ersten 2 h (Schutzrate > 90 %). Ggf. Überweisung (Taxi) zu entsprechend ausgestatteter Klinik oder HIV-Praxis mit vorheriger telefonischer Ankündigung. Sind seit der Exposition mehr als 24 h verstrichen, sind PEP-Maßnahmen vermutlich sinnlos. Auch bei lege artis durchgeführter PEP sind Serokonversionen beschrieben. Medikamente für die HIV-PEP Immer simultan eine Kombination aus 3 Wirkstoffen, i.d.R. 2 NRTI plus PI, z.B. AZT/3TC (Combivir®) 2 × 1 Tbl./d plus LPV/RTV (Kaletra®) 2 × 2 Tbl./d. Prophylaxemodifikation Eine Modifikation der Prophylaxe-Regime dann in Erwägung ziehen, wenn die Index-Person antiretroviral vorbehandelt ist. Schwangerschaft Bei Frauen im gebärfähigen Alter ohne sichere Antikonzeption sollte eine indizierte PEP zwar begonnen, sofort jedoch zusätzlich ein Schwangerschaftstest durchgeführt werden. Derzeit kann keine Substanz als unbedenklich zur Behandlung wie zur Prophylaxe eingestuft werden. Nebenwirkungen der antiretroviralen Medikamente Bei gesunden Menschen und bei kurzer Therapiedauer gering und reversibel. Gastrointestinale Beschwerden, Abgeschlagenheit und Kopfschmerzen sind am häufigsten. Bei Diarrhoe, Übelkeit, Kopfschmerzen ggf. symptomatisch behandeln und PEP fortsetzen. In Studien hat mehr als ein Drittel der Behandelten die Maßnahme wegen subjektiv empfundener NW vorzeitig beendet, deshalb ist entsprechende Aufklärung über NW wichtig. Spezielle NW und Risiken bei PEP In Einzelfällen kann sich bei entsprechender Disposition ein Diab. mell. manifestieren, bei bekanntem Diabetes die Stoffwechsellage unter Protease-Inhibitoren entgleisen. WW von Protease-Inhibitoren mit anderen Medikamenten Tab. 9.31 . Laborkontrollen • HIV-Ak nach 3 und 6 Mon. • Großes BB, GPT, γ-GT, Krea, Harnsäure. • BZ initial, alle 2 Wo. und 2 Wo. nach Ende der PEP. • HIV-PCR bei grippalem Krankheitsbild innerhalb von 4 Wo. nach Exposition oder nach Ende der PEP. Kostenübernahme: Bei beruflicher HIV-Exposition im Sinne eines Unfalls durch die Berufsgenossenschaften. Bei außerberuflicher, v.a. privat veranlasster HIV-Exposition werden die Kosten durch die GKV i.d.R. nicht übernommen; im Einzelfall stichhaltige, nachvollziehbare Begründung! Nicht berufliche Unfälle werden der GKV zugeordnet. Infektionsrisiko Art des übertragenen Materials: Blut, Samenflüssigkeit und Vaginalsekret haben i.d.R. die höchsten Viruskonz. bei HIV-Infizierten. In anderen Körperflüssigkeiten ist HIV in deutlich niedrigeren Konz. vorhanden. Die höchsten Viruskonz. treten beim Vollbild AIDS und AIDS:Medikamente bei HIV-Patientender akuten HIV-Erkr. auf. Art der Exposition: Berufliche HIV-Übertragungen bisher nur durch Blut oder Viruskonzentrat (Viruskultur) bei Stich- und Schnittverletzungen (Serokonversionsrate bei Nadelstichverletzungen: 0,3 %), Kontakt mit einer offenen AIDS:PostexpositionsprophylaxeWunde oder nicht-intakter (geschädigter) Haut oder Schleimhautexposition. Erste Hilfe und chronologischer Ablauf Nach jeder HIV-Exposition unverzüglich (in Sek.!) die folgenden Sofortmaßnahmen in der genannten Reihenfolge einleiten (ggf. kann anschließend an die Sofortmaßnahmen telefonisch weiterer Rat eingeholt werden): • Dekontamination der Verletzung: – Stichverletzung: Blutung fördern für > 1 Min. (kein Quetschen und Ausdrücken direkt im Einstichbereich, um keine Erregerverschleppung in tiefere Gewebsschichten zu begünstigen). Tupfer mit viruzidem Antiseptikum satt benetzen, über der Stichverletzung fixieren und für > 10 Min. durch fortlaufende Applikation des Antiseptikums feucht halten. – Schnittverletzung: Ggf. Blutfluss durch Spreizen der Wunde verstärken (> 1 Min.), danach antiseptische Spülung mit viruzidem Antiseptikum (> 10 Min.). – Hautexposition (geschädigte oder entzündlich veränderte Haut): Entfernen des potenziell infektiösen Materials. Danach Abreiben der Hautoberfläche unter großzügiger Einbeziehung des Umfelds um das sichtbar kontaminierte Areal mit einem Hautantiseptikum. – Kontamination des Auges: Reichliches Ausspülen mit 5 % wässriger PVP-Jod-Lösung. Falls nicht sofort verfügbar: Betaisodona®-Lösung 1:1 mit sterilem Aqua dest. oder notfalls mit Leitungswasser verdünnt. Falls auch nicht verfügbar, mit Wasser spülen. – Aufnahme in die Mundhöhle: Sofortiges, möglichst vollständiges Ausspucken des aufgenommenen Materials. Danach mehrfaches kurzes Spülen (ca. 4- bis 5-mal) der Mundhöhle mit Wasser oder mit 80%igem unvergälltem Ethanol. • Systemische, medikamentöse HIV-PEP, Beginn innerhalb von 2 h. • Unfalldokumentation (D-Arzt). • Hepatitis-B- und -C-Serologie, abklären, ob Hep.-B-PEP erforderlich ist. • Erster HIV-AK-Test, Wiederholung nach 3 und 6 Monaten. Tab. 9.32 Indikationen zur HIV-PEP (nach beruflicher Exposition) Verletzung mit Injektionsnadel oder anderer Hohlraumnadel (Körperflüssigkeit mit hoher Viruskonz.: Blut, Liquor, Punktatmaterial, Organmaterial, Viruskulturmaterial) → Empfehlen Schnittverletzung, sichtbares Blut → Empfehlen Oberflächliche Verletzung (z.B. mit chirurgischer Nadel) → Anbieten Kontakt zu Schleimhaut oder verletzter/geschädigter Haut mit Flüssigkeiten mit hoher Viruskonz. → Anbieten Kontakt von intakter Haut mit Blut (auch bei hoher Viruskonz.) → Nicht empfehlen Haut- oder Schleimhautkontakt mit Körperflüssigkeiten wie Urin und Speichel → Nicht empfehlen Tab. 9.33 Indikationen zur HIV-PEP (nach sexueller u.a. Exposition) Ungeschützter vaginaler oder analer Geschlechtsverkehr (z.B. infolge eines gerissenen Kondoms) mit einer HIV-infizierten Person → Empfehlen Gebrauch HIV-kontaminierten Injektionsbestecks durch mehrere Drogengebrauchende gemeinsam oder nacheinander → Empfehlen Ungeschützter oraler Geschlechtsverkehr mit der Aufnahme von Sperma des HIV-infizierten Partners in den Mund → Anbieten Küssen u.a. Sexualpraktiken ohne Sperma-/Blut-Schleimhautkontakte sowie S/M-Praktiken ohne Blut-zu-Blut-Kontakte → Nicht empfehlen Verletzung an gebrauchtem Spritzenbesteck zur Injektion von Drogen oder Insulin → Nicht empfehlen Bei Kontakt mit altem, weggeworfenen Spritzenbesteck einschließlich einer Verletzung durch diese (wie häufig bei spielenden Kindern) wird eine PEP nicht empfohlen. Kinder sollten jedoch in jedem Fall dem spezialisierten Arzt mit Impfunterlagen und dem Spritzenbesteck zur weiteren Untersuchung und Antikörperkontrolle vorgestellt werden. Maximaler Schutz wahrscheinlich nur bei Beginn der PEP innerhalb der ersten 2 h (Schutzrate > 90 %). Ggf. Überweisung (Taxi) zu entsprechend ausgestatteter Klinik oder HIV-Praxis mit vorheriger telefonischer Ankündigung. Sind seit der Exposition mehr als 24 h verstrichen, sind PEP-Maßnahmen vermutlich sinnlos. Auch bei lege artis durchgeführter PEP sind Serokonversionen beschrieben. Medikamente für die HIV-PEP Immer simultan eine Kombination aus 3 Wirkstoffen, i.d.R. 2 NRTI plus PI, z.B. AZT/3TC (Combivir®) 2 × 1 Tbl./d plus LPV/RTV (Kaletra®) 2 × 2 Tbl./d. Prophylaxemodifikation Eine Modifikation der Prophylaxe-Regime dann in Erwägung ziehen, wenn die Index-Person antiretroviral vorbehandelt ist. Schwangerschaft Bei Frauen im gebärfähigen Alter ohne sichere Antikonzeption sollte eine indizierte PEP zwar begonnen, sofort jedoch zusätzlich ein Schwangerschaftstest durchgeführt werden. Derzeit kann keine Substanz als unbedenklich zur Behandlung wie zur Prophylaxe eingestuft werden. Nebenwirkungen der antiretroviralen Medikamente Bei gesunden Menschen und bei kurzer Therapiedauer gering und reversibel. Gastrointestinale Beschwerden, Abgeschlagenheit und Kopfschmerzen sind am häufigsten. Bei Diarrhoe, Übelkeit, Kopfschmerzen ggf. symptomatisch behandeln und PEP fortsetzen. In Studien hat mehr als ein Drittel der Behandelten die Maßnahme wegen subjektiv empfundener NW vorzeitig beendet, deshalb ist entsprechende Aufklärung über NW wichtig. Spezielle NW und Risiken bei PEP In Einzelfällen kann sich bei entsprechender Disposition ein Diab. mell. manifestieren, bei bekanntem Diabetes die Stoffwechsellage unter Protease-Inhibitoren entgleisen. WW von Protease-Inhibitoren mit anderen Medikamenten Tab. 9.31 . Laborkontrollen • HIV-Ak nach 3 und 6 Mon. • Großes BB, GPT, γ-GT, Krea, Harnsäure. • BZ initial, alle 2 Wo. und 2 Wo. nach Ende der PEP. • HIV-PCR bei grippalem Krankheitsbild innerhalb von 4 Wo. nach Exposition oder nach Ende der PEP. Kostenübernahme: Bei beruflicher HIV-Exposition im Sinne eines Unfalls durch die Berufsgenossenschaften. Bei außerberuflicher, v.a. privat veranlasster HIV-Exposition werden die Kosten durch die GKV i.d.R. nicht übernommen; im Einzelfall stichhaltige, nachvollziehbare Begründung! Nicht berufliche Unfälle werden der GKV zugeordnet. 9.10 Reisemedizin Die Hausarztpraxis ist meist erste Anlaufstelle für reisemedizinische Fragen. Aufgaben des Hausarztes • Einschätzung der Reisefähigkeit. • Beratung über Chemoprophylaxe und allg. Verhaltensmaßnahmen. • Durchführung von Impfungen. • Untersuchung/Screening des zurückgekehrten Reisenden. 9.10.1 Allgemeine Empfehlungen zur Reisefähigkeit Vor reisemedizinischen Maßnahmen/Beratungen muss abgeklärt sein • Allg. Gesundheitszustand/"Fitness"? • Aktuelle, chron., ansteckende Erkrankungen? • Dauermedikation? Immunsuppression? • Gravidität? • Reisemedizin, Empfehlungen:AutoreisenAllergien? • Impfstatus? Kontraindikationen für Reisen Bei der Entscheidung, ob ein Pat. reisefähig ist, bes. für Fernreisen, muss zwischen absoluten KI und relativen KI unterschieden werden. Relative KI für eine Reise bedeutet, dass nach Risikoabschätzung und Beratung durch den Arzt sowie sorgfältiger Vorbereitung der Reise, z.B. medikamentöse und ärztliche Notfallversorgung gewährleistet, Reisefähigkeit bestehen kann. Absolute KI für Fernreisen • Maligner Hypertonus, dekompensierte Herzinsuff. (Reisemedizin, Empfehlungen:ReisefähigkeitNYHA III und IV), Infarkt innerhalb der letzten 6 Mon. • Dekompensierte Niereninsuffizienz. • Dekompensierte Leberzirrhose. • Schwere bzw. dekompensierte Neurosen oder Psychosen, dekompensiertes Anfallsleiden. • Medikamenten-, Drogen- oder Alkoholabhängigkeit. • Reisemedizin, Empfehlungen:Kontraindikationen für ReisenAusgeprägte Anämie (Hb 200/120 mmHg (während des Fluges sinkt der systolische Druck, der diastolische erhöht sich, deshalb bes. Gefahr bei hohen diastolischen Werten!). • Bei dekompensierter Herzinsuff. (NYHA IV) oder Angina pectoris. • Bei Anfallsleiden (relativ, falls starke Sedierung und evtl. Reisemedizin, Empfehlungen:FlugverbotBegleitung, Flug möglich). • Bei HNO-Erkr. mit Druckausgleichsstörungen in der Eustachischen Röhre: Akute Otitis media, Paukenerguss, Tubendysfunktion, akute Erkr. der NNH (23.5.2). Cave: Barotrauma. Barotrauma durch gestörten Druckausgleich Klinik: Stechende Ohrenschmerzen, Schwerhörigkeit, Ohrensausen, gelegentlich Schwindel, evtl. serös-blutige Ergüsse. KO: Trommelfellruptur. Prophylaxe: Nach Abklingen der akuten HNO-Erkr. kann der Pat. fliegen, jedoch sollten prophylaktisch einige Zeit vor dem Start und bes. ca. 30 Min. vor dem Sinkflug abschwellende Nasentropfen tief in die Nase geträufelt werden (ebenso bei Erkältungen und leichter Sinusitis). Sinnvoll ist auch, Kaugummi mitzuführen: Ständiges Kauen und Schlucken hält die Tube offen. Bei Ohrendruck Valsalva-Manöver: Nase zuhalten und gleichzeitig Luft schlucken. Sgl. und Kleinkindern sollte Flüssigkeit zum Trinken angeboten werden, um durch Schlucken den Druckausgleich herzustellen. Tab. 9.35 Flugreisetauglichkeit nach operativen Eingriffen Operation ∗ /Erkrankung Flugreisetauglichkeit frühestens ∗∗ Bauchraum Diagnostische Laparotomie Nach 3 d Appendektomie Nach 10 d Herniotomie Nach 10 d Magen-Darm-Blutung Nach 2–3 Wo. Cholezystektomie Nach 6 Wo. Gastrektomie Nach 6 Wo. Darmresektion Nach 6 Wo. Nephrektomie Nach 6 Wo. Transurethrale Resektion (TUR) Nach 3 Wo. Stoßwellenlithotripsie (SWL) Nach 8–10 d Brustraum Z.B. diagnostische Thorakotomie Nach 1 Wo. Lobektomie Nach 12 Wo. Pneumektomie Nach 6–9 Mon. Rezid. Spontanpneumothorax Nach 6–8 Wo. Pneumothorax Nach 4–6 Wo. Gefäßoperationen Aneurysma-OP Nach 3 Wo. Bypass-OP Nach 1–2 Wo. gemäß kardiol. Beurteilung PTCA Nach 2 Wo. Schädel Pneumenzephalus Flugverbot Tumorexstirpation Nach 6–12 Mon. Angioplastik Nach 6–12 Mon. Subarachnoidalblutung Nach 6 Wo. in Begleitung eines Arztes Schwere Commotio cerebri Entscheidung Neurologe Stapedektomie Nach 7 d Keratoplastik Wenige Tage nach Klinikentlassung Katarakt-OP Nach 1 d Netzhaut-/Glaskörperblutung Nach 4 Wo. ∗ Normaler Heilungsverlauf (keine KO) vorausgesetzt ∗∗ Kann individuell variieren (z.B. Vorerkr., Begleiterkr., Alter!) → evtl. auch später Autoreisen • Keine Fahrten unter Zeitdruck (Puls- und Blutdruckerhöhung). • Hitzestau im Auto vermeiden, im Sommer keine Fahrten um die Mittagszeit. • Nachtfahrten – cave: Risiko für Pat. mit Nachtblindheit, Katarakt (Beratung durch Augenarzt), Epileptiker. Zur ärztlichen Beratung gehört die Beurteilung der Fahrtauglichkeit: Erkrankungs- und therapiebedingte Einschränkungen (z.B. Medikamenten-NW) sind zu berücksichtigen. Nicht nur aus reisemedizinischer Sicht, sondern auch aus forensischen Gründen muss der Pat. auf Einschränkungen der Fahrtauglichkeit hingewiesen werden. Dazu gehören z.B.: • Schwere Herzrhythmusstörungen (Kreislaufschwäche bei ventrikulärer Fahrtauglichkeit:ReisemedizinTachykardie, Synkopen, Entladung eines implantierten automatischen Defibrillators, s. Kasten). • Reisemedizin, Empfehlungen:FahrtauglichkeitDiab. mell. mit Neigung zu Hypoglykämien (gilt für alle Klassen). Insulinpflichtige Diabetiker dürfen nur in Ausnahmefällen Fahrzeuge zur Fahrgastbeförderung oder LKW (Führerscheinklasse C, D) führen (relevant, falls der Pat. Reisen mit Kleinbussen/Wohnwagen als Selbstfahrer plant!). • Medikamente, wie z.B. Psychopharmaka, Hypnotika, Sedativa, Antiepileptika (21.8). • Psychische Erkr., die akut dekompensieren können, z.B. schwere Neurosen, Schizophrenien, chron. progrediente hirnorganische Erkr. Fahrtüchtigkeit bei Herzrhythmusstörungen Richtlinien für Pat. nach schwerer ventrikulärer Tachykardie oder Kammerflimmern: Bei komplexen ventrikulären Herzrhythmusstörungen, z.B. Tachykardie, Kammerflimmern, nach Auftreten von Synkopen oder bei Z.n. Reanimation besteht für mind. 6 Mon. vollständige Fahruntüchtigkeit. Danach ist regelmäßige Kontrolle der Effektivität einer medikamentösen Behandlung von Rhythmusstörungen mit Durchführung eines 24-h-Langzeit-EKG erforderlich. Danach darf der Pat. wieder selbst fahren, wenn sich bei elektrophysiologischer Testung keine Arrhythmien mehr auslösen lassen und eine stabile medikamentöse Einstellung gesichert ist. Die Eignung zum Führen von Kraftfahrzeugen der Klasse C oder zum Führen von Fahrzeugen, die der Fahrgastbeförderung gemäß § 15 d StVZO dienen (Klasse D), bleibt ausgeschlossen. 9.10.2 Empfehlungen für Schwangere Allgemeine Verhaltensregeln Bei komplikationslosem Verlauf einer Grav. bestehen unter Beachtung einiger Vorsichtsmaßnahmen allg. keine Bedenken gegen Reisen: • Thromboserisiko reduzieren. Prophylaxe: Sitzplatz am Gang reservieren; keine "eingezwängten" Haltungen und Sitzpositionen, flexible/bequeme Kleidung; Kompressionsstrümpfe tragen, häufig aufstehen und sich bewegen bzw. entsprechend bei Auto-/Schwangerschaft:ReisenBusfahrten häufigere Pausen Reisemedizin, Empfehlungen:für Schwangereeinlegen. Isometrische Übungen, Fuß wippen. • Dehydratation vermeiden, da Thromboserisiko erhöht und Obstipationsneigung verstärkt werden. • Kinetosen: Reiseübelkeit und -erbrechen kann durch die Grav. verstärkt sein. Prophylaxe und Ther. der Kinetosen ( Tab. 9.42 ). Cave: NW der meisten Mittel, z.B. eingeschränkte Fahrtüchtigkeit. • Impfungen und Chemoprophylaxe ( 9.10.7 ). Mutterpass und Impfbefreiungszeugnis(se) mitführen ( 9.10.7 und Abb. 9.3 ). Für den Notfall kann eine Liste wichtiger Begriffe bezüglich Grav./Geburt in Englisch oder der jeweiligen Sprache des Reiselandes nützlich sein. Abb. 9.3 Häufigkeit von Erkrankungen auf Reisen. Vergleich: Junge Erwachsene/Senioren Kontraindikationen für Reisen in der Schwangerschaft Relativ (abhängig von Reiseziel, -art, -dauer): • Im ersten Trimenon und 4 Wo. vor der Entbindung. • Mehrlingsschwangerschaft. Absolut: • V.a. Zervixinsuff., Abortneigung, Blutungsneigung. • Rhesusinkompatibilität in vorausgegangenen Schwangerschaften. • Reisen in Epidemiegebiete und in Malariagebiete. • Reisen in Länder oder Gegenden ohne gute ärztliche und fachärztliche Versorgung. • Bekannte KO während früherer Schwangerschaften. Reisetransportmittel • Flugzeug: Die Bestimmungen der einzelnen Fluggesellschaften zur Flugerlaubnis variieren. Bis zur 32. SSW bestehen meist keine Einschränkungen für Schwangere; mit Attest eines Arztes kann eine Erlaubnis bis zur 36. SSW möglich sein. Genaueres muss die Schwangere bei der entsprechenden Gesellschaft erfragen. • Kraftfahrzeug: Sicherheitsgurt immer richtig anlegen (Abb. 15.2). Bei längeren Fahrten regelmäßig Pausen einlegen und Füße vertreten (Verbesserung des venösen Rückflusses). Verhalten am Reiseziel • Klimatische Extrembedingungen vermeiden, kein intensives Sonnenbaden ( cave: Wärme-/Kreislaufbelastung und störende Pigmentflecken). • Kein schneller Aufstieg in große Höhen (ab 2000 m messbarer relativer Sauerstoffmangel, d.h. Höhen > 2000 m ganz meiden); einige Tage zur Akklimatisierung abwarten. • Keine Sportarten mit erhöhtem Traumatisierungsrisiko (z.B. Ski alpin, Wasserski, Tauchen, Mannschafts- und Kontaktsportarten) bzw. übermäßige körperliche Belastung vermeiden (Durchblutungssteigerungen in Muskel und Haut verringern plazentare Durchblutung und Sauerstoffversorgung). 9.10.3 Empfehlungen für ältere Menschen Allgemeine Verhaltensregeln (s.a. 9.10.6 , 9.10.1 , Tab. 9.34 ). Höheres Alter ist per se keine KI für Fernreisen. Jedoch ist das Krankheitsrisiko erhöht und die allg. Belastbarkeit oft eingeschränkt. Dies zeigt auch die Verschiebung der Erkrankungsursachen im Urlaub zugunsten der Erkr. des Herz-Kreislauf-Systems bei Reisenden > 60 J. Bei älteren Menschen besteht ein erhöhtes Risiko für: • Herzinfarkt und Reisemedizin, Empfehlungen:für ältere Menschenapoplektischen Insult: Der Reisende muss wissen, dass die Hygienestandards sowie das Niveau der medizinischen Versorgung und des Rettungsdienstes im Urlaubsland häufig nicht ausreichend sind (Abschluss einer Reiserückholversicherung prüfen). • Akute Verwirrtheitszustände durch ungewohnte Umgebung bei Zerebralsklerose. • Dekompensation einer Herzinsuff. oder zerebraler Durchblutungsstörungen, z.B. durch Hypoxie im Flugzeug oder tropische Temperaturen. • Dehydratation bei Kinetosen und Diarrhö. Tab. 9.34 Flugbedingte Gesundheitsprobleme und ihre Prophylaxe Risiko Vorerkr./Risikofaktoren Prophylaxe Bemerkungen Hypoxie Lungenerkr., Herzinsuff., Koronarinsuff., Anämie • Keine Flüge in Flugzeugen ohne Druckausgleich • Keine zu üppigen Mahlzeiten VC Strümpfe, Socken tragen und ausreichend Repellents und Insektizidspray mitnehmen ( Tab. 9.36 ). Versicherungsschutz Eine private Reisekrankenversicherung mit Rückhol-Garantie ist zu empfehlen. Für privat Versicherte: Klären, ob die Versicherung diese Rückhol-Garantie beinhaltet (nicht bei allen Privatkassen vertraglich gesichert!). Verhalten im Reiseland • Kein Baden in Süßwasserseen oder -tümpeln, Flüssen und Kanälen, auch nicht Hände oder Füße darin waschen ( cave: Bilharziose, Lambliasis bzw. Reisediarrhoe durch Kontamination mit Fäkalien). • Keine invasiven Maßnahmen, die medizinisch nicht dringend notwendig sind und unter unsterilen Kautelen durchgeführt werden: z.B. Akupunktur, "Gesundheitsspritzen", sonstige Spritzen; keine Ohrdurchstechungen oder Tätowierungen ( cave: HIV-, Hep.-B-Inf.). • Kein ungeschützter Geschlechtsverkehr: (ausreichend) Qualitätskondome aus Apotheken und Drogerien des Heimatlandes mitnehmen ( cave: HIV-, Hep.-B- und -C-Inf. u.a. Geschlechtskrankheiten) oder sexuelle Abstinenz. • Aufenthalt in mückensichern Räumen, mit Klimaanlage, Anwendung von Moskitonetzen. Reiseapotheke • Art und Umfang der Reiseapotheke wird bestimmt durch Reiseart, Reisedauer, Zielland, Zahl und Alter der Mitreisenden (Kinder? Senioren?) sowie deren Vorerkr. und/oder spezielle Dispositionen für bestimmte Erkr. Cave: Verschreibung ist keine Kassenleistung. • Hinweise zur Verwendung der einzelnen Mittel dem Reisenden möglichst schriftlich mitgeben; nicht auf die Informationen der Beipackzettel verlassen, da diese für Laien Reisemedizin, Empfehlungen:Reiseapothekeoft nicht verständlich sind. • Keine wärmeempfindlichen Medikamente für Reisen in warme Länder (z.B. Suppositorien für Kinder), wenn keine Kühlmöglichkeit zu erwarten ist. 9.10.7 Reiseimpfungen und Chemoprophylaxe Allgemeines Vorgehen (s.a. 9.2.1 , 9.10.1 ). • Impfstatus überprüfen: Polio, Diphtherie, Tetanus, bei Kindern zusätzlich HiB, Keuchhusten, Masern, Mumps, Röteln, Meningokokken, Pneumokokken, Hepatitis B; wenn nötig, Grundimmunisierung ( 9.2.3 ). Cave: Auf Impfdokumente oder Titer verlassen, nicht auf Angaben des Pat./Reisenden! • Obligatorische Impfungen für das jeweilige Reiseland erfragen (Tropeninstitute, Impfung:Reiseimpfungen www.gesundes-reisen.de , Reisemedizin, Empfehlungen:Impfungen Adressen 35.1.2) unter Berücksichtigung der Reiseroute; einige Länder verlangen einen Impfnachweis schon für eine Zwischenlandung ohne eigentliche Einreise in das Land (v.a. für Gelbfieber! Bestimmungen wechseln häufig). • Empfehlenswerte Impfungen: Abhängig von Gesundheitsstatus, Zielland, Reiseroute und Reiseart sowie Reisetransportmittel. • Individuellen Impfplan erstellen und durchführen. Cave: KI für Impfungen und Impfabstände (Tabellen in 9.2.2 ). Impfbefreiungszeugnis Falls obligatorische Impfungen bei Reisenden kontraindiziert sind, muss ein Impfbefreiungszeugnis mit Unterschrift des Arztes und einem Beglaubigungsstempel mitgeführt werden; je nach Reiseland in englischer oder französischer Sprache und evtl. in der Sprache des Ziellandes. Cave: Einreiseländer müssen Impfbefreiungszeugnisse nicht anerkennen! Abb. 9.4 Impfbefreiungszeugnis bei KI für obligatorische Impfungen Obligatorische und empfohlene Reiseimpfungen 9.2.2 , Tab. 9.6 , Impfplan bei Reiseimpfungen 9.2.2 , Impfbefreiungszeugnis Tab. 9.7 . Malaria und Malariaprophylaxe Definition Weltweit verbreitete Infektionskrankheit durch Protozoen, die durch vier verschiedene Plasmodienarten hervorgerufen wird ( Tab. 9.37 ). Übertragung durch den Stich der Anopheles-Mücke. Tab. 9.37 Malariaformen im Vergleich Form M. quartana M. tertiana M. tropica Erreger P. malariae P. vivax P. ovale P. falciparum IKZ 21–42 d, bis zu mehreren J. möglich I.A. 10–21 d, bis zu mehreren J. möglich 7–20 d Klinik Beginnt allmählich Bis zu 1 Wo. uncharakteristisches Fieber Plötzlicher uncharakteristischer Beginn Fieberschübe I.d.R. jeden 3. d (im 72-h-Abstand) I.d.R. jeden 2. d (im 48-h-Abstand) Hohes Fieber, unregelmäßig und Kontinua; afebrile Verläufe möglich Weitere Symptome Hepatosplenomegalie Schüttelfrost, Anämie, Splenomegalie Schüttelfrost, GIT- Beschwerden, Erbrechen, Anämie, Ikterus, Hepatosplenomegalie KO Nephropathie – Zerebrale, kardiale, renale M., DIC Prognose/Verlauf Rezidive bis ca. 20 J. p.i., gutartig Gut, Ausheilung nach ca. 2 J. (bis dahin häufig Rezidive möglich) Unbehandelt oft nach wenigen Tagen tödlich Ther. (Klinikeinweisung immer schon bei Verdacht) Chloroquin Chloroquin + Primaquin Je nach Resistenz Chloroquin, Chinin, Mefloquin, Athemisine, Lumefantrin, Atovaquon Besonderheiten Mischformen durch gleichzeitige Inf. mit mehreren Plasmodien möglich → Überlappung der Fieberschübe P. = Plasmodium, M. = Malaria Tab. 9.38 Empfohlene Chemoprophylaxe Medikament Dosierung Einnahmezeitraum Chloroquin, z.B. Resochin ® 2 Tbl./Wo. à 150 mg, bei KG > 75 kg 3 Tbl./Wo. à 150 mg; Kinder ab 6 Mon. 5 mg/kg KG/Wo. 1 Wo. vor Abreise (2. Einnahme am Abreisetag) bis 4 Wo. nach Reise plus Proguanil, z.B. Paludrine ® 2 Tbl./d à 100 mg; Kinder 5 kg KG: 5 mg/kg KG/Wo. 1 Wo. vor Abreise (2. Einnahme am Abreisetag) bis 4 Wo. nach Reise; bei längerfristiger Anwendung besser Zone-B-Med. u. Stand-by-Med. mitnehmen Atovaquon/Proguanil ∗ , z.B. Malarone ® 1 Tbl./d à 250/100 mg, max. 4 Wo., besser verträglich als Lariam®; Kinder ab 11 kg KG 1 Junior Tabl. à 62,5/25 mg pro 10 kg KG/d 1 d vor Abreise bis 1 Wo. nach Reise Doxycyclin ∗ , z.B. Doxy v. ct ® 1–2 Tbl./d à 100 mg, je nach KG; nicht für Kinder Malariaprophylaxeempfehlungen: www.dtg.org Tab. 9.39 Empfohlene Chemoprophylaxe bei Kindern (Resistenzzonen und Einnahmezeitraum wie bei Erwachsenen) Medikament Dosierung Chloroquin, z.B. Resochin ® Ab 6 Mon. und 7 kg KG 5 mg/kg KG/Wo. Proguanil, z.B. Paludrine ® 50 4 2 2 2 10 150 mg 10–13 32–50 3 1 1,5 1,5 7 150 mg 7–9 22–31 2 1 1 1 5 150 mg 4–6 16–21 4 2 2 2 10 50 mg 2–3 12–15 3 1 1,5 1,5 7 50 mg 0,5–1 7–11 2 1 1 1 5 50 mg Mefloquin ∗ 1. d 2. d Gesamt (Base) (z.B. Lariam®) 25 mg/kg, 1. Dosis ⠔, 2. Dosis ⠓ der Gesamtdosis Erw.; ≥ 13 > 45 4 2 6 250 mg 10–12 32–45 3 1,5 4,5 250 mg 7–9 24–31 2 1 3 250 mg 4–6 17–24 1,5 0,75 2,25 250 mg 2–3 11–16 1 0,5 1,5 250 mg 0,5–1 7–11 0,5 0,5 1 250 mg Atovaquon + Proguanil ∗∗ 1. d 2. d 3. d Gesamt (Base) (z.B. Malarone®) 70 mg/kg KG Erw.; ≥ 12 > 40 4 4 4 12 350 mg 9–11 31–40 3 3 3 9 350 mg 5–9 21–30 2 2 2 6 350 mg 2–5 11–20 1 1 1 3 350 mg Arthemeter +Lumifantrin ∗∗∗ Start 1. d, 8 h 2. d, ↔ 12 h 3. d, ↔ 12 h Gesamt (Base) (z.B. Riamet®) Erw.; ≥ 12 ≥ 35 4 4 2 × 4 2 × 4 24 140 mg Bei den meisten Mitteln wird die Einnahme nach einer Mahlzeit ausdrücklich empfohlen. Falls innerhalb 1 h erbrochen wird, nochmals Einnahme derselben Dosis. Bei Kleinkindern und Sgl. konsequente Expositionsprophylaxe, Behandlung möglichst nur durch Arzt mit spezieller Erfahrung (Kinderarzt) ↔ Einnahmeintervall am Tag, z.B. 12 h ∗ Grav., Stillzeit, Kinder Verbindung mit Duftstoffen, Konservierungsmitteln, Fett und Emulgatoren in Kosmetika und Sonnenschutzmitteln. Klinik: Juckende, evtl. nässende Pusteln oder Quaddeln, vorwiegend an lichtexponierten Hautstellen (Dekolleté, Arme, Oberschenkel). Prophylaxe: (26.9.2) Allergiegetestete, möglichst fettfreie Sonnenschutzmittel. Evtl. weitgehend auf direkte Sonnenexposition verzichten. Sonnenbrand Prophylaxe Sonnenallergiedurch konsequenten Sonnenschutz mit mind. LSF 12; bei Allergie:Sonnen-sehr Hellhäutigen sowie in bestimmten Gegenden (Gletscher, Äquatorialgebiet, Australien) und über die Mittagszeit (11.00–15.00 Uhr) höheren LSF, "sun blocker" bzw. strikte Expositionsvermeidung: Langsame und hauttypgerechte Adaptation: Morgens oder nachmittags, nie über die Mittagszeit, helle Haut nie entblößt in die Sonne, 26.9.1. Phototoxizität Cave: Doxycyclin, Johanniskrautpräparate. UV-Konjunktivitis ("Schneeblindheit") Prophylaxe: Möglichst Gletscherbrille (seitlich geschlossen) tragen, auf modische Brillenformen (z.B. Schmetterlingsbrille) verzichten. Sonnenstich Prophylaxe: Immer Kopfbedeckung tragen, gilt v.a. für Kinder und ältere Menschen ( cave: Glatze). Risiken durch Sport und Freizeitaktivitäten Aufenthalt in großen Höhen/Hochgebirge Reizschwelle für die Höhenanpassung beim Gesunden liegt bei ca. 2500 m ü.M. Bei zu schnellem Aufstieg über diese Höhe hinaus Gefahr der Akklimatisierungsstörungen (Höhenkrankheit/akute Bergkrankheit). Entscheidend für die Reizschwelle ist die tägl. Schlafhöhe (Übernachtung), nicht die am Tag erreichte Maximalhöhe. Höhenkrankheit. Klinik: Kopfschmerzen, Schwächegefühl, Müdigkeit am Tag und Schlafstörungen in der Nacht, Appetitlosigkeit. Ther.: Abstieg in tiefere Lagen und/oder Aufstiegspause mit nachfolgend langsameren Aufstiegen. Prophylaxe: Guter Trainingszustand vor Antritt der Reise (evtl. Check-up durchführen); keine zu großen Höhenunterschiede tägl. bewältigen, keine Gewalttouren; auf ausreichende Flüssigkeits- und Salzzufuhr achten; größere Touren nur mit erfahrenen Bergführern, die mit Reisemedizin, Empfehlungen:Höhenkrankheiteiner höhengerechten Aufstiegstaktik vertraut sind. Höhenkrankheit Akute Bergkrankheit (schwere Form der Höhenkrankheit). Klinik: Höhenlungenödem mit Dyspnoe, RG der Atemwege und rapidem Leistungsabfall (lebensbedrohlich!). Ther.: Sofortiger Abstieg bzw. Abtransport des Pat. in tiefere Lagen, Sauerstoffgabe; medikamentös: Nifedipin p.o. 10–20 mg plus 20 mg in Retardform sofort, danach alle 6 h 20 mg in Retardform. Tauchen • Bestimmung der Tauchfähigkeit: Der Tauchsport verlangt B*(*ergkrankheit, akute*)*ein hohes Maß an körperlicher und mentaler Fitness; Minimum-Check-up: Herz-Kreislauf-Funktion und Lungenfunktion. Bei älteren Reisenden evtl. Belastungs-EKG. Psychische Belastbarkeit abschätzen! Bei HNO-Erkr. in der Anamnese ist vor einem Tauchurlaub ein fachärztliches Attest durch HNO-Arzt Voraussetzung (wird von Tauchschulen u.U. auch verlangt). • Sportmedizin:TauchenProphylaxe Tauchen:Tauchfähigkeitvon Tauchunfällen. – Aufklärung über Dekompressionskrankheit und Luftembolie. – Psychische Stabilität und mentale Fitness: Es kann unter Wasser bei bestimmter Disposition zu (lebensgefährlichen) Panikreaktionen oder euphorischen Überreaktionen kommen. – Keine Tauchgänge bei Schleimhautschwellung (Schnupfen, Erkältungen, allergischen Reaktionen); auch keine schleimhautabschwellenden Nasentropfen vor Tauchgängen Tauchen:Prophylaxe von Tauchunfällenanwenden. Gefahr: Lässt ihre Wirkung noch während des Tauchgangs nach, ist beim Auftauchen der Überdruckausgleich nicht mehr möglich. Folge: Barotraumen in Ohren und NNH (23.6.3). Cave: Zusammenhang wird von Laien oft nicht verstanden und deshalb nicht befolgt! – Vor und nach Tauchgängen keinen Alkohol trinken, nicht rauchen, keine Medikamente einnehmen. Abhängig von Dauer und Tiefe der Tauchgänge darf für mind. 24–48 h danach nicht geflogen werden (genaue Zeit wird nach dem letzten Tauchgang berechnet, diese Berechnung zu lernen, ist Bestandteil einer seriösen Tauchausbildung). Infektiöse Erkrankungen Bilharziose (Schistosomiasis) Definition Durch im menschlichen Venensystem (Endwirt) lebende Pärchenegel (Schistosomen) verursacht. In warmem Süßwasser werden von Wasserschnecken (= Zwischenwirt) die Wimpernlarven (Mirazidien) aufgenommen und als Zerkarien (Infektionslarven) freigesetzt. IKZ bis 3 Mon. Inf. perkutan beim Baden. Vorkommen: Afrika; Naher, Mittlerer und Ferner Osten; Südamerika. Klinik, Diagnostik, Therapie Unterschiedlich je nach Subtyp: Schistosoma haematobium Bilharziose(SchistosomiasisAfrika, Mittl. Osten): Befällt Venengeflecht des kleinen Beckens. Klinik: Blasenbilharziose mit hämorrhagischer Zystitis. KO: Blasenpapillome, Blasenfisteln. Diagn.: Eier im Urin, bei Primärinf. Serologie. Ther.: Praziquantel, z.B. Biltricide®. Schistosoma mansoni (Afrika, Naher Osten, Südamerika): Befällt Leber und Darm. Klinik: Darmbilharziose mit ruhrähnlicher Kolitis. KO: Perirektale Abszesse, Polypen, Leberzirrhose. Diagn.: Eier im Stuhl oder Rektalbereich, Serologie. Ther.: Praziquantel (40 mg/kg KG tgl. über 3 d). Schistosoma japonicum (Ferner Osten): Eiablage im Blutgefäßsystem. Eier dringen durch die Darmwand ins Darmlumen. Klinik und Diagn. wie Schistosoma mansoni. Ther.: Praziquantel (s.o., oft muss höher dosiert undd länger behandelt werden). Prophylaxe In den entsprechenden Gebieten nicht in Süßwasserseen und -tümpeln baden, waten oder sich waschen. Cholera Häufige Erkr. in Entwicklungsländern, vorwiegend in Armutsvierteln (Slums). Für Touristen ist das Erkrankungsrisiko niedrig, da kein oder selten Kontakt mit Slumbewohnern oder Aufenthalt in Slums. Dengue-Fieber Synonym Siebentagefieber; break bone fever. Erreger Dengue-Virus, 4 Serotypen. Alle Typen können das prognostisch günstig verlaufende klassische Dengue-Fieber und das hämorrhagische Dengue-Fieber (DHF, schwer verlaufend, hohe Letalität) sowie das Dengue-Schock-Sy. (DSS) hervorrufen. Übertragung durch tagaktive Mücken (v.a. Aedes aegypti), die in der Nähe menschlicher Behausungen in Wasseransammlungen brüten. Nach Stich und Eintritt in die Dengue-FieberBlutbahn Vermehrung Siebentagefieberin regionalen Lk; von dort in andere Gewebe, v.a. in die Haut; IKZ 5–8 d. Gesamtletalität bis zu 10 %. Vorkommen: Tropische und subtropische Länder Asiens und Afrikas; Zentral- und Südamerika, Südstaaten der USA; endemisch bzw. epidemisch. Cave: Gelgentliche Epidemien durch importierte Inf. in Südeuropa möglich. Klinik Fieber, Schüttelfrost, retroorbitale Kopfschmerzen, sehr starke Knochen-, Gelenk- und Muskelschmerzen; Injektion der Konjunktiven typisch. Diffuses, stammbetontes Erythem am 2.–3. d, danach morbilliformes Exanthem am Rumpf mit zentripetaler Ausbreitung auf Kopf und Extremitäten, verbunden mit einem zweiten Fieberschub. Evtl. petechiale Blutungen und Epistaxis. Abklingen der Symptome nach 5–6 d, jedoch protrahierte Rekonvaleszenz von mehreren Wo. Therapie Klinikeinweisung zur Diagnosestellung, ggf. intensivmedizinische Maßnahmen. Cave: ASS wegen vermehrter Blutungsneigung, Ausweichmittel Paracetamol. Prophylaxe Expositionsprophylaxe; Haut durch Kleidung und Repellentien schützen. Schlafen in Räumen mit Klimaanlage. Keine Impfung möglich. Gelbfieber Erreger Durch Arboviren hervorgerufene und die Stechmücke Aedes aegypti sowie Haemagogus-Arten (Moskitos) übertragene Erkr. Gesamtletalität ca. 20–30 % (WHO). IKZ 3–6 d. Vorkommen: Norden Südamerikas und Zentralafrika Abb. 9.6 ; Asien ist frei von Gelbfieber! Hauptreservoir sind Primaten. Abb. 9.6 Gelbfieberverbreitung in Afrika und Südamerika Klinik Initialstadium (3 d): Plötzlicher Beginn mit Fieber bis 40°C, Schüttelfrost, starke Kopf- und Gliederschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Gelbfieber:Erkrankungsrisikenevtl. relative Bradykardie. Remissionsstadium: Fieberabfall am 3. oder 4. d, evtl. Ausheilung. Bei schwerem Verlauf Stadium der Organschädigung: Hepatitis mit Ikterus und Erbrechen, Nephritis mit Proteinurie, hämorrhagische Diathese mit profusen Blutungen. KO: Leber-, Nieren-, Multiorganversagen, Meningoenzephalitis. Diagnostik Tropenanamnese bei ungeimpften (oder zu spät geimpften) Personen mit typischer Klinik, evtl. IgM-Ak-Nachweis, PCR. Therapie Klinikeinweisung (Verdachtsdiagnose "Gelbfieber" angeben) zur Diagnosestellung (Ak-Nachweis), intensivmedizinische Maßnahmen. Prophylaxe Impfung ( 9.2.3 ) für alle Reisen in Endemiegebiete. Cave: Viele Staaten, in denen Gelbfieber nicht vorkommt, verlangen eine Impfbescheinigung bei Einreise aus Infektionsgebieten. Aktuelle Information bei Gelbfieberimpfstellen erfragen. Adressen 35.1.2. Hepatitis A Häufige Erkr. in Ländern mit schlechten hygienischen Verhältnissen; Übertragung vorwiegend fäkal-oral, verunreinigte Gewässer, Meerbuchten, aber auch durch Blutprodukte (seltenGelbfieber:Prophylaxe). IKZ 2–6 Wo. Vorkommen: Ubiquitär in Ländern mit schlechten hygienischen Verhältnissen. Inzidenz in Entwicklungsländern bes. hoch (ca. 50–300 Fälle/100 000 Einw.). Klinik Im Kindesalter (bis ca. 6 J.) meist anikterisch, oft nur gastrointestinale Symptome. Bei Inf. im Erwachsenenalter lange und schwere Verläufe möglich. Cave: Bei Reisenden über 50 J. ohne Immunität häufiger als in jungen Jahren fulminante Verläufe mit höherer Letalität (ca. 2,7 % im Vergleich zu normalerweise nur 0,05 %). Prophylaxe Aktive HAV-Impfung (z.B. Havrix®) für alle Fernreisenden; aufgrund der guten Verträglichkeit und der fast 100 %igen Schutzwirkung sollte die aktive Schutzimpfung einer passiven Impfprophylaxe (Globulin i.m.) vorgezogen werden. Impfschemata und Dosis 9.2.3 , Tab. 9.10 . Leishmaniose (Kala-Azar) 9.6.3 , Tab. 9.23 ; Pest 9.3.11 , Tab. 9.19 . Unkomplizierte Reisediarrhö Betrifft 20–50 % aller Fernreisenden. Erreger 85 % bakt. (meist pathogene E.-coli-Stämme), 10 % viral, 5 % Protozoen. Klinik Flüssiger oder wässriger Stuhl, häufig abdom. Krämpfe, Übelkeit, Blähungen; plötzlicher Beginn, milder bis mittelschwerer Verlauf über durchschnittlich 3–4 d; in 10 % > 1 Wo. Therapie • Flüssigkeitssubstitution: Orale Rehydratationssalze (z.B. Elotrans®-Pulver); in den Apotheken tropischer Länder ist "oral rehydration Diarrhoe:Reisediarrhoesalts" (ORS) verfügbar, Reise:Diarrhoedieses im angegebenen Volumen abgekochtem Wasser auflösen; auch für Diabetiker geeignet. • Gezuckerten Tee trinken, Salzgebäck essen ("Cola und Salzstangen"). • Bes. durch Exsikkose gefährdet: Kleinkinder und Säuglinge. • Reduktion der Stuhlfrequenz durch Motilitätshemmer. – Loperamid: Ab 14 J. 4 mg initial, dann 2 mg nach jedem wässrigen Stuhlgang, max. 16 mg tägl.; Kinder 8–13 J. 2 mg initial, dann 2 mg nach jedem wässrigen Stuhlgang, max. 8 mg tägl.; bei Kindern 3 d und evtl. Blut im Stuhl. Cave: Malaria. Therapie • Flüssigkeitssubstitution und Antibiotikum, z.B. Ciprofloxacin: 2 × 500 mg/d für 3 Tage. • Bei Fieber oder blutigem Stuhl auf Motilitätshemmer verzichten. • Keine Besserung bei Fieber oder blutigem Stuhl nach 2 d → Arzt aufsuchen. • Keine Besserung bei wässriger Diarrhoe nach 3 d → V.a. Lambliasis (häufiger Durchfallerreger in warmen Ländern) → Metronidazol 3 × 500 mg für 7 d. Tab. 9.43 Tropenvirosen und andere fieberhafte Allgemeinerkrankungen Krankheit/Erreger Vektor Vorkommen Schweres hämorrhagisches Fieber mit Exanthem durch Arboviren Dengue Mücken Afrika, Südostasien, Mittelamerika Gelbfieber Mücken Afrika, Süd- und Zentralafrika Chikungunya Mücken Afrika, Südostasien Rift-Valley Mücken Ostafrika, Niltal, Krim-Kongo Mücken, Zecken! Zentralafrika, Bulgarien, Südrussland Marburg-Virus Mücken Zentralafrika Ebola-Virus Mücken Zentralafrika Hämorrhagisches Fieber (HF) Leptospirose Nagetiere (Urin) Zentraleuropa bzw. weltweit Hanta-Virus-Inf. Nagetiere (Urin) Typ Hantaan: China, Korea Lassa-Fieber Nagetiere (Urin) West- und Zentralafrika Argentinisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Argentinien Bolivianisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Anden Venezuelanisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Venezuela Muskel- und Gelenkschmerzen, mit/ohne Exanthem Dengue Mücken Afrika, Südostasien, Mittelamerika Chikungunya Mücken Afrika, franz. Insel Réunion, Südostasien. Leitsymptom: Qualvolle, ca. 1 Wo. andauernde Muskel- und Gelenkschmerzen O'nyong-nyong Mücken Uganda, Zaire, Kenia Ross-River-Fieber (epidemische Polyarthritis) Mücken Pazifik, Australien (relativ häufig) Sandmückenfieber Mücken Mittelmeerraum, Mittlerer Osten, Nordindien Oroya-Fieber (hämolytische Anämie) Mücken Peru und angrenzende Andenstaaten Meningitis/Enzephalitis durch Arboviren FSME Zecken Zentraleuropa, Eurasien, Sibirien, China Gelbfieber Mücken Norden Südamerikas, Zentralafrika Japan-Enzephalitis Mücken Südostasien West-Nil Mücken Afrika, Mittlerer Osten Pferdeenzephalitis Mücken Nord- und Südamerika St.-Louis-Enzephalitis Mücken Nordamerika, Karibik La Crosse Mücken Nordamerika Murray-Valley-E. Mücken Australien Flecktyphusartige Erkrankungen Klassisches Fleckfieber Kleiderlaus Weltweit Rocky Mountain spotted fever Zecken Nord- und Südamerika Murines Fleckfieber Rattenfloh Südostasien, Australien, Mittelamerika Fièvre boutonneuse Zecken Südfrankreich, Mittelmeerraum, Afrika, Indien, China Tsutsugamushi-Fieber Stechmilben Japan, Südkorea, Südchina, Taiwan, Südostasien, Indien, Indonesien, Nordaustralien Prophylaxe Wie bei unkomplizierter Reisediarrhoe. 9.10.9 Screening nach Reiseende Indikationen Ein Screening des zurückgekehrten Reisenden mit exakter Reiseanamnese (Route, Reisemittel, Charakter der Reise, Dauer u.a.) ist nach längerem Tropenaufenthalt unter schwierigen Bedingungen angezeigt, z.B. nach Arbeitsaufenthalten oder Abenteuerreisen (auch wenn der Rückkehrende symptomlos ist) und immer, wenn eines oder mehrere der folgenden Symptome auftritt: • Unklares Fieber, "Erkältungsgefühl". • Reisemedizin, Empfehlungen:Screening nach ReiseendeIkterus. • Diarrhoe (v.a. bei schleimig-blutigem Stuhl). • Lymphadenopathie. • Schmerzen beim Wasserlassen/Blut im Urin, genitale Affektionen (Schmerzen, Pruritus, Ulzerationen). • Pruritus und Dermatopathien. • Parästhesien. Cave: Immer auch an das Versagen der Malaria-Prophylaxe denken. Frühzeitig Kontakt mit Tropenmediziner aufnehmen (35.1.2). Tab. 9.44 Leitsymptome der häufigsten "Importkrankheiten" Beginn Fieber GIT-Symptome Hautsymptome Pulmonale Symptome Wenige Tage nach Rückkehr Malaria, Arbovirosen (Dengue, Gelbfieber), Rickettsiosen, enteropathogene Darmbakteriosen Virale und bakt. Inf. (u.a. Cholera) Larva migrans cutanea, kutane Myiasen, Ektoparasiten Virale und bakt. Inf. Einige Wo. nach Rückkehr ∗ Malaria, Hepatitis, Abdominaltyphus, Rickettsiosen, akute Bilharziose, invasive Amöbose, Leishmaniosen Giardiose (Lambliasis), intestinale Amöbose, Darmhelminthen Strongyloidose Askaridose, Strongyloidose, Toxokarose Mon. (J.) n. Rückkehr Malaria, Filariosen ∗∗ viszerale Leishmaniose Intestinale Amöbose, Darmhelminthen Kutane Leishmaniosen, Lepra ∗∗ , Filariosen ∗∗ ∗ Nach Langzeitaufenthalten entsprechend früher ∗∗ Fast nur bei Reisenden nach beruflicher Exposition/nach Langzeitaufenthalten Diagnostik • BSG. • Diff.-BB: Auf Eosinophilie achten: Hinweis für Helminthiasis. • Leberfunktionsparameter. • Serol. Tests zum Nachweis von Ak gegen Viren, Bakterien, Protozoen, Helminthen nur bei konkretem Verdacht sinnvoll. Je nach Ergebnis: Überweisung an Kollegen mit speziellen Kenntnissen oder an eine tropenmedizinische Klinik/Ambulanz. Adressen 35.1.2. • Bei V.a. Malaria Pat. zur Blutabnahme in geeignetes Labor schicken, wo ausreichende Erfahrung in Anfertigung und Auswertung z.B. eines "Dicken Tropfens" vorliegt; vorher telefonisch Rücksprache nehmen; bei entsprechender Klinik immer sofort Klinikeinweisung. Plasmodiensuche immer im EDTA-Blut. Abklärung einer Bluteosinophilie nach Tropenaufenthalten: • Stuhluntersuchung auf Helminthenlarven zum Ausschluss einer Strongyloidiasis, ggf. Serologie. • Gewebshelminthen-Suchtest (wenn 2 der 3 Hauptind. zutreffen). Indikationen zum serologischen Suchtest: • Bluteosinophilie (Wurmerkr. mit Gewebestadien): 15 % aller Tropenrückkehrer (Anteil höher bei Langzeitaufenthalten). • Expositionsverdacht: Infektionswege. – Per os: Nahrung, Schmutzinf., Tierkontakte, Trinkwasser. – Perkutan: Insektenstiche, Süßwasser, Boden. • Unspezifischer klinischer Befund. – Fieber: Schistosoma (Katayama-Sy., Filarien, Trichinella, Toxocara). – GIT-Beschwerden: Schistosoma, Strongyloides, Toxocara. – Hautsymptomatik: Strongyloides, Loa, Onchocerca (Toxocara). – Lungensymptomatik: Schistosoma, Paragonimus, Strongyloides, Toxocara (Ascaris). • Serum-IgE-Spiegel > 1000 IU/ml. 9.10.1 Allgemeine Empfehlungen zur Reisefähigkeit Vor reisemedizinischen Maßnahmen/Beratungen muss abgeklärt sein • Allg. Gesundheitszustand/"Fitness"? • Aktuelle, chron., ansteckende Erkrankungen? • Dauermedikation? Immunsuppression? • Gravidität? • Reisemedizin, Empfehlungen:AutoreisenAllergien? • Impfstatus? Kontraindikationen für Reisen Bei der Entscheidung, ob ein Pat. reisefähig ist, bes. für Fernreisen, muss zwischen absoluten KI und relativen KI unterschieden werden. Relative KI für eine Reise bedeutet, dass nach Risikoabschätzung und Beratung durch den Arzt sowie sorgfältiger Vorbereitung der Reise, z.B. medikamentöse und ärztliche Notfallversorgung gewährleistet, Reisefähigkeit bestehen kann. Absolute KI für Fernreisen • Maligner Hypertonus, dekompensierte Herzinsuff. (Reisemedizin, Empfehlungen:ReisefähigkeitNYHA III und IV), Infarkt innerhalb der letzten 6 Mon. • Dekompensierte Niereninsuffizienz. • Dekompensierte Leberzirrhose. • Schwere bzw. dekompensierte Neurosen oder Psychosen, dekompensiertes Anfallsleiden. • Medikamenten-, Drogen- oder Alkoholabhängigkeit. • Reisemedizin, Empfehlungen:Kontraindikationen für ReisenAusgeprägte Anämie (Hb 200/120 mmHg (während des Fluges sinkt der systolische Druck, der diastolische erhöht sich, deshalb bes. Gefahr bei hohen diastolischen Werten!). • Bei dekompensierter Herzinsuff. (NYHA IV) oder Angina pectoris. • Bei Anfallsleiden (relativ, falls starke Sedierung und evtl. Reisemedizin, Empfehlungen:FlugverbotBegleitung, Flug möglich). • Bei HNO-Erkr. mit Druckausgleichsstörungen in der Eustachischen Röhre: Akute Otitis media, Paukenerguss, Tubendysfunktion, akute Erkr. der NNH (23.5.2). Cave: Barotrauma. Barotrauma durch gestörten Druckausgleich Klinik: Stechende Ohrenschmerzen, Schwerhörigkeit, Ohrensausen, gelegentlich Schwindel, evtl. serös-blutige Ergüsse. KO: Trommelfellruptur. Prophylaxe: Nach Abklingen der akuten HNO-Erkr. kann der Pat. fliegen, jedoch sollten prophylaktisch einige Zeit vor dem Start und bes. ca. 30 Min. vor dem Sinkflug abschwellende Nasentropfen tief in die Nase geträufelt werden (ebenso bei Erkältungen und leichter Sinusitis). Sinnvoll ist auch, Kaugummi mitzuführen: Ständiges Kauen und Schlucken hält die Tube offen. Bei Ohrendruck Valsalva-Manöver: Nase zuhalten und gleichzeitig Luft schlucken. Sgl. und Kleinkindern sollte Flüssigkeit zum Trinken angeboten werden, um durch Schlucken den Druckausgleich herzustellen. Tab. 9.35 Flugreisetauglichkeit nach operativen Eingriffen Operation ∗ /Erkrankung Flugreisetauglichkeit frühestens ∗∗ Bauchraum Diagnostische Laparotomie Nach 3 d Appendektomie Nach 10 d Herniotomie Nach 10 d Magen-Darm-Blutung Nach 2–3 Wo. Cholezystektomie Nach 6 Wo. Gastrektomie Nach 6 Wo. Darmresektion Nach 6 Wo. Nephrektomie Nach 6 Wo. Transurethrale Resektion (TUR) Nach 3 Wo. Stoßwellenlithotripsie (SWL) Nach 8–10 d Brustraum Z.B. diagnostische Thorakotomie Nach 1 Wo. Lobektomie Nach 12 Wo. Pneumektomie Nach 6–9 Mon. Rezid. Spontanpneumothorax Nach 6–8 Wo. Pneumothorax Nach 4–6 Wo. Gefäßoperationen Aneurysma-OP Nach 3 Wo. Bypass-OP Nach 1–2 Wo. gemäß kardiol. Beurteilung PTCA Nach 2 Wo. Schädel Pneumenzephalus Flugverbot Tumorexstirpation Nach 6–12 Mon. Angioplastik Nach 6–12 Mon. Subarachnoidalblutung Nach 6 Wo. in Begleitung eines Arztes Schwere Commotio cerebri Entscheidung Neurologe Stapedektomie Nach 7 d Keratoplastik Wenige Tage nach Klinikentlassung Katarakt-OP Nach 1 d Netzhaut-/Glaskörperblutung Nach 4 Wo. ∗ Normaler Heilungsverlauf (keine KO) vorausgesetzt ∗∗ Kann individuell variieren (z.B. Vorerkr., Begleiterkr., Alter!) → evtl. auch später Autoreisen • Keine Fahrten unter Zeitdruck (Puls- und Blutdruckerhöhung). • Hitzestau im Auto vermeiden, im Sommer keine Fahrten um die Mittagszeit. • Nachtfahrten – cave: Risiko für Pat. mit Nachtblindheit, Katarakt (Beratung durch Augenarzt), Epileptiker. Zur ärztlichen Beratung gehört die Beurteilung der Fahrtauglichkeit: Erkrankungs- und therapiebedingte Einschränkungen (z.B. Medikamenten-NW) sind zu berücksichtigen. Nicht nur aus reisemedizinischer Sicht, sondern auch aus forensischen Gründen muss der Pat. auf Einschränkungen der Fahrtauglichkeit hingewiesen werden. Dazu gehören z.B.: • Schwere Herzrhythmusstörungen (Kreislaufschwäche bei ventrikulärer Fahrtauglichkeit:ReisemedizinTachykardie, Synkopen, Entladung eines implantierten automatischen Defibrillators, s. Kasten). • Reisemedizin, Empfehlungen:FahrtauglichkeitDiab. mell. mit Neigung zu Hypoglykämien (gilt für alle Klassen). Insulinpflichtige Diabetiker dürfen nur in Ausnahmefällen Fahrzeuge zur Fahrgastbeförderung oder LKW (Führerscheinklasse C, D) führen (relevant, falls der Pat. Reisen mit Kleinbussen/Wohnwagen als Selbstfahrer plant!). • Medikamente, wie z.B. Psychopharmaka, Hypnotika, Sedativa, Antiepileptika (21.8). • Psychische Erkr., die akut dekompensieren können, z.B. schwere Neurosen, Schizophrenien, chron. progrediente hirnorganische Erkr. Fahrtüchtigkeit bei Herzrhythmusstörungen Richtlinien für Pat. nach schwerer ventrikulärer Tachykardie oder Kammerflimmern: Bei komplexen ventrikulären Herzrhythmusstörungen, z.B. Tachykardie, Kammerflimmern, nach Auftreten von Synkopen oder bei Z.n. Reanimation besteht für mind. 6 Mon. vollständige Fahruntüchtigkeit. Danach ist regelmäßige Kontrolle der Effektivität einer medikamentösen Behandlung von Rhythmusstörungen mit Durchführung eines 24-h-Langzeit-EKG erforderlich. Danach darf der Pat. wieder selbst fahren, wenn sich bei elektrophysiologischer Testung keine Arrhythmien mehr auslösen lassen und eine stabile medikamentöse Einstellung gesichert ist. Die Eignung zum Führen von Kraftfahrzeugen der Klasse C oder zum Führen von Fahrzeugen, die der Fahrgastbeförderung gemäß § 15 d StVZO dienen (Klasse D), bleibt ausgeschlossen. Vor reisemedizinischen Maßnahmen/Beratungen muss abgeklärt sein • Allg. Gesundheitszustand/"Fitness"? • Aktuelle, chron., ansteckende Erkrankungen? • Dauermedikation? Immunsuppression? • Gravidität? • Reisemedizin, Empfehlungen:AutoreisenAllergien? • Impfstatus? Kontraindikationen für Reisen Bei der Entscheidung, ob ein Pat. reisefähig ist, bes. für Fernreisen, muss zwischen absoluten KI und relativen KI unterschieden werden. Relative KI für eine Reise bedeutet, dass nach Risikoabschätzung und Beratung durch den Arzt sowie sorgfältiger Vorbereitung der Reise, z.B. medikamentöse und ärztliche Notfallversorgung gewährleistet, Reisefähigkeit bestehen kann. Absolute KI für Fernreisen • Maligner Hypertonus, dekompensierte Herzinsuff. (Reisemedizin, Empfehlungen:ReisefähigkeitNYHA III und IV), Infarkt innerhalb der letzten 6 Mon. • Dekompensierte Niereninsuffizienz. • Dekompensierte Leberzirrhose. • Schwere bzw. dekompensierte Neurosen oder Psychosen, dekompensiertes Anfallsleiden. • Medikamenten-, Drogen- oder Alkoholabhängigkeit. • Reisemedizin, Empfehlungen:Kontraindikationen für ReisenAusgeprägte Anämie (Hb 200/120 mmHg (während des Fluges sinkt der systolische Druck, der diastolische erhöht sich, deshalb bes. Gefahr bei hohen diastolischen Werten!). • Bei dekompensierter Herzinsuff. (NYHA IV) oder Angina pectoris. • Bei Anfallsleiden (relativ, falls starke Sedierung und evtl. Reisemedizin, Empfehlungen:FlugverbotBegleitung, Flug möglich). • Bei HNO-Erkr. mit Druckausgleichsstörungen in der Eustachischen Röhre: Akute Otitis media, Paukenerguss, Tubendysfunktion, akute Erkr. der NNH (23.5.2). Cave: Barotrauma. Barotrauma durch gestörten Druckausgleich Klinik: Stechende Ohrenschmerzen, Schwerhörigkeit, Ohrensausen, gelegentlich Schwindel, evtl. serös-blutige Ergüsse. KO: Trommelfellruptur. Prophylaxe: Nach Abklingen der akuten HNO-Erkr. kann der Pat. fliegen, jedoch sollten prophylaktisch einige Zeit vor dem Start und bes. ca. 30 Min. vor dem Sinkflug abschwellende Nasentropfen tief in die Nase geträufelt werden (ebenso bei Erkältungen und leichter Sinusitis). Sinnvoll ist auch, Kaugummi mitzuführen: Ständiges Kauen und Schlucken hält die Tube offen. Bei Ohrendruck Valsalva-Manöver: Nase zuhalten und gleichzeitig Luft schlucken. Sgl. und Kleinkindern sollte Flüssigkeit zum Trinken angeboten werden, um durch Schlucken den Druckausgleich herzustellen. Tab. 9.35 Flugreisetauglichkeit nach operativen Eingriffen Operation ∗ /Erkrankung Flugreisetauglichkeit frühestens ∗∗ Bauchraum Diagnostische Laparotomie Nach 3 d Appendektomie Nach 10 d Herniotomie Nach 10 d Magen-Darm-Blutung Nach 2–3 Wo. Cholezystektomie Nach 6 Wo. Gastrektomie Nach 6 Wo. Darmresektion Nach 6 Wo. Nephrektomie Nach 6 Wo. Transurethrale Resektion (TUR) Nach 3 Wo. Stoßwellenlithotripsie (SWL) Nach 8–10 d Brustraum Z.B. diagnostische Thorakotomie Nach 1 Wo. Lobektomie Nach 12 Wo. Pneumektomie Nach 6–9 Mon. Rezid. Spontanpneumothorax Nach 6–8 Wo. Pneumothorax Nach 4–6 Wo. Gefäßoperationen Aneurysma-OP Nach 3 Wo. Bypass-OP Nach 1–2 Wo. gemäß kardiol. Beurteilung PTCA Nach 2 Wo. Schädel Pneumenzephalus Flugverbot Tumorexstirpation Nach 6–12 Mon. Angioplastik Nach 6–12 Mon. Subarachnoidalblutung Nach 6 Wo. in Begleitung eines Arztes Schwere Commotio cerebri Entscheidung Neurologe Stapedektomie Nach 7 d Keratoplastik Wenige Tage nach Klinikentlassung Katarakt-OP Nach 1 d Netzhaut-/Glaskörperblutung Nach 4 Wo. ∗ Normaler Heilungsverlauf (keine KO) vorausgesetzt ∗∗ Kann individuell variieren (z.B. Vorerkr., Begleiterkr., Alter!) → evtl. auch später Autoreisen • Keine Fahrten unter Zeitdruck (Puls- und Blutdruckerhöhung). • Hitzestau im Auto vermeiden, im Sommer keine Fahrten um die Mittagszeit. • Nachtfahrten – cave: Risiko für Pat. mit Nachtblindheit, Katarakt (Beratung durch Augenarzt), Epileptiker. Zur ärztlichen Beratung gehört die Beurteilung der Fahrtauglichkeit: Erkrankungs- und therapiebedingte Einschränkungen (z.B. Medikamenten-NW) sind zu berücksichtigen. Nicht nur aus reisemedizinischer Sicht, sondern auch aus forensischen Gründen muss der Pat. auf Einschränkungen der Fahrtauglichkeit hingewiesen werden. Dazu gehören z.B.: • Schwere Herzrhythmusstörungen (Kreislaufschwäche bei ventrikulärer Fahrtauglichkeit:ReisemedizinTachykardie, Synkopen, Entladung eines implantierten automatischen Defibrillators, s. Kasten). • Reisemedizin, Empfehlungen:FahrtauglichkeitDiab. mell. mit Neigung zu Hypoglykämien (gilt für alle Klassen). Insulinpflichtige Diabetiker dürfen nur in Ausnahmefällen Fahrzeuge zur Fahrgastbeförderung oder LKW (Führerscheinklasse C, D) führen (relevant, falls der Pat. Reisen mit Kleinbussen/Wohnwagen als Selbstfahrer plant!). • Medikamente, wie z.B. Psychopharmaka, Hypnotika, Sedativa, Antiepileptika (21.8). • Psychische Erkr., die akut dekompensieren können, z.B. schwere Neurosen, Schizophrenien, chron. progrediente hirnorganische Erkr. Fahrtüchtigkeit bei Herzrhythmusstörungen Richtlinien für Pat. nach schwerer ventrikulärer Tachykardie oder Kammerflimmern: Bei komplexen ventrikulären Herzrhythmusstörungen, z.B. Tachykardie, Kammerflimmern, nach Auftreten von Synkopen oder bei Z.n. Reanimation besteht für mind. 6 Mon. vollständige Fahruntüchtigkeit. Danach ist regelmäßige Kontrolle der Effektivität einer medikamentösen Behandlung von Rhythmusstörungen mit Durchführung eines 24-h-Langzeit-EKG erforderlich. Danach darf der Pat. wieder selbst fahren, wenn sich bei elektrophysiologischer Testung keine Arrhythmien mehr auslösen lassen und eine stabile medikamentöse Einstellung gesichert ist. Die Eignung zum Führen von Kraftfahrzeugen der Klasse C oder zum Führen von Fahrzeugen, die der Fahrgastbeförderung gemäß § 15 d StVZO dienen (Klasse D), bleibt ausgeschlossen. 9.10.2 Empfehlungen für Schwangere Allgemeine Verhaltensregeln Bei komplikationslosem Verlauf einer Grav. bestehen unter Beachtung einiger Vorsichtsmaßnahmen allg. keine Bedenken gegen Reisen: • Thromboserisiko reduzieren. Prophylaxe: Sitzplatz am Gang reservieren; keine "eingezwängten" Haltungen und Sitzpositionen, flexible/bequeme Kleidung; Kompressionsstrümpfe tragen, häufig aufstehen und sich bewegen bzw. entsprechend bei Auto-/Schwangerschaft:ReisenBusfahrten häufigere Pausen Reisemedizin, Empfehlungen:für Schwangereeinlegen. Isometrische Übungen, Fuß wippen. • Dehydratation vermeiden, da Thromboserisiko erhöht und Obstipationsneigung verstärkt werden. • Kinetosen: Reiseübelkeit und -erbrechen kann durch die Grav. verstärkt sein. Prophylaxe und Ther. der Kinetosen ( Tab. 9.42 ). Cave: NW der meisten Mittel, z.B. eingeschränkte Fahrtüchtigkeit. • Impfungen und Chemoprophylaxe ( 9.10.7 ). Mutterpass und Impfbefreiungszeugnis(se) mitführen ( 9.10.7 und Abb. 9.3 ). Für den Notfall kann eine Liste wichtiger Begriffe bezüglich Grav./Geburt in Englisch oder der jeweiligen Sprache des Reiselandes nützlich sein. Abb. 9.3 Häufigkeit von Erkrankungen auf Reisen. Vergleich: Junge Erwachsene/Senioren Kontraindikationen für Reisen in der Schwangerschaft Relativ (abhängig von Reiseziel, -art, -dauer): • Im ersten Trimenon und 4 Wo. vor der Entbindung. • Mehrlingsschwangerschaft. Absolut: • V.a. Zervixinsuff., Abortneigung, Blutungsneigung. • Rhesusinkompatibilität in vorausgegangenen Schwangerschaften. • Reisen in Epidemiegebiete und in Malariagebiete. • Reisen in Länder oder Gegenden ohne gute ärztliche und fachärztliche Versorgung. • Bekannte KO während früherer Schwangerschaften. Reisetransportmittel • Flugzeug: Die Bestimmungen der einzelnen Fluggesellschaften zur Flugerlaubnis variieren. Bis zur 32. SSW bestehen meist keine Einschränkungen für Schwangere; mit Attest eines Arztes kann eine Erlaubnis bis zur 36. SSW möglich sein. Genaueres muss die Schwangere bei der entsprechenden Gesellschaft erfragen. • Kraftfahrzeug: Sicherheitsgurt immer richtig anlegen (Abb. 15.2). Bei längeren Fahrten regelmäßig Pausen einlegen und Füße vertreten (Verbesserung des venösen Rückflusses). Verhalten am Reiseziel • Klimatische Extrembedingungen vermeiden, kein intensives Sonnenbaden ( cave: Wärme-/Kreislaufbelastung und störende Pigmentflecken). • Kein schneller Aufstieg in große Höhen (ab 2000 m messbarer relativer Sauerstoffmangel, d.h. Höhen > 2000 m ganz meiden); einige Tage zur Akklimatisierung abwarten. • Keine Sportarten mit erhöhtem Traumatisierungsrisiko (z.B. Ski alpin, Wasserski, Tauchen, Mannschafts- und Kontaktsportarten) bzw. übermäßige körperliche Belastung vermeiden (Durchblutungssteigerungen in Muskel und Haut verringern plazentare Durchblutung und Sauerstoffversorgung). 9.10.3 Empfehlungen für ältere Menschen Allgemeine Verhaltensregeln (s.a. 9.10.6 , 9.10.1 , Tab. 9.34 ). Höheres Alter ist per se keine KI für Fernreisen. Jedoch ist das Krankheitsrisiko erhöht und die allg. Belastbarkeit oft eingeschränkt. Dies zeigt auch die Verschiebung der Erkrankungsursachen im Urlaub zugunsten der Erkr. des Herz-Kreislauf-Systems bei Reisenden > 60 J. Bei älteren Menschen besteht ein erhöhtes Risiko für: • Herzinfarkt und Reisemedizin, Empfehlungen:für ältere Menschenapoplektischen Insult: Der Reisende muss wissen, dass die Hygienestandards sowie das Niveau der medizinischen Versorgung und des Rettungsdienstes im Urlaubsland häufig nicht ausreichend sind (Abschluss einer Reiserückholversicherung prüfen). • Akute Verwirrtheitszustände durch ungewohnte Umgebung bei Zerebralsklerose. • Dekompensation einer Herzinsuff. oder zerebraler Durchblutungsstörungen, z.B. durch Hypoxie im Flugzeug oder tropische Temperaturen. • Dehydratation bei Kinetosen und Diarrhö. Tab. 9.34 Flugbedingte Gesundheitsprobleme und ihre Prophylaxe Risiko Vorerkr./Risikofaktoren Prophylaxe Bemerkungen Hypoxie Lungenerkr., Herzinsuff., Koronarinsuff., Anämie • Keine Flüge in Flugzeugen ohne Druckausgleich • Keine zu üppigen Mahlzeiten VC Strümpfe, Socken tragen und ausreichend Repellents und Insektizidspray mitnehmen ( Tab. 9.36 ). Versicherungsschutz Eine private Reisekrankenversicherung mit Rückhol-Garantie ist zu empfehlen. Für privat Versicherte: Klären, ob die Versicherung diese Rückhol-Garantie beinhaltet (nicht bei allen Privatkassen vertraglich gesichert!). Verhalten im Reiseland • Kein Baden in Süßwasserseen oder -tümpeln, Flüssen und Kanälen, auch nicht Hände oder Füße darin waschen ( cave: Bilharziose, Lambliasis bzw. Reisediarrhoe durch Kontamination mit Fäkalien). • Keine invasiven Maßnahmen, die medizinisch nicht dringend notwendig sind und unter unsterilen Kautelen durchgeführt werden: z.B. Akupunktur, "Gesundheitsspritzen", sonstige Spritzen; keine Ohrdurchstechungen oder Tätowierungen ( cave: HIV-, Hep.-B-Inf.). • Kein ungeschützter Geschlechtsverkehr: (ausreichend) Qualitätskondome aus Apotheken und Drogerien des Heimatlandes mitnehmen ( cave: HIV-, Hep.-B- und -C-Inf. u.a. Geschlechtskrankheiten) oder sexuelle Abstinenz. • Aufenthalt in mückensichern Räumen, mit Klimaanlage, Anwendung von Moskitonetzen. Reiseapotheke • Art und Umfang der Reiseapotheke wird bestimmt durch Reiseart, Reisedauer, Zielland, Zahl und Alter der Mitreisenden (Kinder? Senioren?) sowie deren Vorerkr. und/oder spezielle Dispositionen für bestimmte Erkr. Cave: Verschreibung ist keine Kassenleistung. • Hinweise zur Verwendung der einzelnen Mittel dem Reisenden möglichst schriftlich mitgeben; nicht auf die Informationen der Beipackzettel verlassen, da diese für Laien Reisemedizin, Empfehlungen:Reiseapothekeoft nicht verständlich sind. • Keine wärmeempfindlichen Medikamente für Reisen in warme Länder (z.B. Suppositorien für Kinder), wenn keine Kühlmöglichkeit zu erwarten ist. Allgemeine Verhaltensregeln Essen und Trinken Strikte Dialyse:ReisemedizinEinhaltung der Regel: "Koch es, brat es, schäl es – oder meide es!", um sich vor Durchfall u.a. Infektionskrankheiten zu schützen. Eindringlich darauf hinweisen, dass nur die strikte Einhaltung der Verhaltensregeln prophylaktisch wirkt. Konkret heißt dies: • Wasser: Nur abgekocht verwenden. Getränke aus verschlossenen FlaschenErnährung:auf Reisen oder Dosen. Cave: Immer Reisemedizin, Empfehlungen:Infektionsprophylaxedarauf achten, dass der Verschluss in Restaurants Reisemedizin, Empfehlungen:Ernährungerst am Tisch geöffnet wird; in anderen Situationen immer selbst öffnen. Keine Eiswürfel in Getränken, keine offenen Fruchtsäfte, kein offenes Eis. • Selbstgekauftes Obst und Gemüse sehr gut waschen bzw. selbst schälen. • Nur gut gekochte oder gebratene Speisen verzehren, die frisch und noch warm serviert werden. Besser ist der Verzicht auf rohes Gemüse und Salate, rohe Wurstwaren, unvollständig gekochte/gebratene oder rohe Fische und Meeresfrüchte; generell Speisen meiden, die schon längere Zeit vor dem Verzehr vorbereitet wurden (z.B. Pudding) und/oder durch direkten Handkontakt zubereitet wurden (z.B. "Handgeformtes" wie Fisch-, Gemüse- und Fleischklößchen). Persönliche Hygiene • Hände vor jedem Essen mit Seife waschen. • Möglichst keine Gemeinschaftshandtücher benutzen. • Jeden Kontakt mit Blut, Stuhl und Urin vermeiden. Kleidung • An Kopfbedeckung und Sonnenbrille denken ( cave: Sonnenstich, Hitzschlag, Konjunktivitis). • Möglichst immer Schuhwerk tragen, auch am Strand nicht barfuß gehen ( cave: giftige Insekten, Schlangen, Parasiten u.a.). • In Gebieten mit Infektionsrisiko durch Mücken, Zecken, Flöhe (Malaria, FSME, Borreliose, Dengue-Fieber, 9.10.8 ): Haut bedeckt halten, auch an Unterschenkeln und Armen; lange Hosen oder Reisemedizin, Empfehlungen:KleidungStrümpfe, Socken tragen und ausreichend Repellents und Insektizidspray mitnehmen ( Tab. 9.36 ). Versicherungsschutz Eine private Reisekrankenversicherung mit Rückhol-Garantie ist zu empfehlen. Für privat Versicherte: Klären, ob die Versicherung diese Rückhol-Garantie beinhaltet (nicht bei allen Privatkassen vertraglich gesichert!). Verhalten im Reiseland • Kein Baden in Süßwasserseen oder -tümpeln, Flüssen und Kanälen, auch nicht Hände oder Füße darin waschen ( cave: Bilharziose, Lambliasis bzw. Reisediarrhoe durch Kontamination mit Fäkalien). • Keine invasiven Maßnahmen, die medizinisch nicht dringend notwendig sind und unter unsterilen Kautelen durchgeführt werden: z.B. Akupunktur, "Gesundheitsspritzen", sonstige Spritzen; keine Ohrdurchstechungen oder Tätowierungen ( cave: HIV-, Hep.-B-Inf.). • Kein ungeschützter Geschlechtsverkehr: (ausreichend) Qualitätskondome aus Apotheken und Drogerien des Heimatlandes mitnehmen ( cave: HIV-, Hep.-B- und -C-Inf. u.a. Geschlechtskrankheiten) oder sexuelle Abstinenz. • Aufenthalt in mückensichern Räumen, mit Klimaanlage, Anwendung von Moskitonetzen. Reiseapotheke • Art und Umfang der Reiseapotheke wird bestimmt durch Reiseart, Reisedauer, Zielland, Zahl und Alter der Mitreisenden (Kinder? Senioren?) sowie deren Vorerkr. und/oder spezielle Dispositionen für bestimmte Erkr. Cave: Verschreibung ist keine Kassenleistung. • Hinweise zur Verwendung der einzelnen Mittel dem Reisenden möglichst schriftlich mitgeben; nicht auf die Informationen der Beipackzettel verlassen, da diese für Laien Reisemedizin, Empfehlungen:Reiseapothekeoft nicht verständlich sind. • Keine wärmeempfindlichen Medikamente für Reisen in warme Länder (z.B. Suppositorien für Kinder), wenn keine Kühlmöglichkeit zu erwarten ist. 9.10.7 Reiseimpfungen und Chemoprophylaxe Allgemeines Vorgehen (s.a. 9.2.1 , 9.10.1 ). • Impfstatus überprüfen: Polio, Diphtherie, Tetanus, bei Kindern zusätzlich HiB, Keuchhusten, Masern, Mumps, Röteln, Meningokokken, Pneumokokken, Hepatitis B; wenn nötig, Grundimmunisierung ( 9.2.3 ). Cave: Auf Impfdokumente oder Titer verlassen, nicht auf Angaben des Pat./Reisenden! • Obligatorische Impfungen für das jeweilige Reiseland erfragen (Tropeninstitute, Impfung:Reiseimpfungen www.gesundes-reisen.de , Reisemedizin, Empfehlungen:Impfungen Adressen 35.1.2) unter Berücksichtigung der Reiseroute; einige Länder verlangen einen Impfnachweis schon für eine Zwischenlandung ohne eigentliche Einreise in das Land (v.a. für Gelbfieber! Bestimmungen wechseln häufig). • Empfehlenswerte Impfungen: Abhängig von Gesundheitsstatus, Zielland, Reiseroute und Reiseart sowie Reisetransportmittel. • Individuellen Impfplan erstellen und durchführen. Cave: KI für Impfungen und Impfabstände (Tabellen in 9.2.2 ). Impfbefreiungszeugnis Falls obligatorische Impfungen bei Reisenden kontraindiziert sind, muss ein Impfbefreiungszeugnis mit Unterschrift des Arztes und einem Beglaubigungsstempel mitgeführt werden; je nach Reiseland in englischer oder französischer Sprache und evtl. in der Sprache des Ziellandes. Cave: Einreiseländer müssen Impfbefreiungszeugnisse nicht anerkennen! Abb. 9.4 Impfbefreiungszeugnis bei KI für obligatorische Impfungen Obligatorische und empfohlene Reiseimpfungen 9.2.2 , Tab. 9.6 , Impfplan bei Reiseimpfungen 9.2.2 , Impfbefreiungszeugnis Tab. 9.7 . Malaria und Malariaprophylaxe Definition Weltweit verbreitete Infektionskrankheit durch Protozoen, die durch vier verschiedene Plasmodienarten hervorgerufen wird ( Tab. 9.37 ). Übertragung durch den Stich der Anopheles-Mücke. Tab. 9.37 Malariaformen im Vergleich Form M. quartana M. tertiana M. tropica Erreger P. malariae P. vivax P. ovale P. falciparum IKZ 21–42 d, bis zu mehreren J. möglich I.A. 10–21 d, bis zu mehreren J. möglich 7–20 d Klinik Beginnt allmählich Bis zu 1 Wo. uncharakteristisches Fieber Plötzlicher uncharakteristischer Beginn Fieberschübe I.d.R. jeden 3. d (im 72-h-Abstand) I.d.R. jeden 2. d (im 48-h-Abstand) Hohes Fieber, unregelmäßig und Kontinua; afebrile Verläufe möglich Weitere Symptome Hepatosplenomegalie Schüttelfrost, Anämie, Splenomegalie Schüttelfrost, GIT- Beschwerden, Erbrechen, Anämie, Ikterus, Hepatosplenomegalie KO Nephropathie – Zerebrale, kardiale, renale M., DIC Prognose/Verlauf Rezidive bis ca. 20 J. p.i., gutartig Gut, Ausheilung nach ca. 2 J. (bis dahin häufig Rezidive möglich) Unbehandelt oft nach wenigen Tagen tödlich Ther. (Klinikeinweisung immer schon bei Verdacht) Chloroquin Chloroquin + Primaquin Je nach Resistenz Chloroquin, Chinin, Mefloquin, Athemisine, Lumefantrin, Atovaquon Besonderheiten Mischformen durch gleichzeitige Inf. mit mehreren Plasmodien möglich → Überlappung der Fieberschübe P. = Plasmodium, M. = Malaria Tab. 9.38 Empfohlene Chemoprophylaxe Medikament Dosierung Einnahmezeitraum Chloroquin, z.B. Resochin ® 2 Tbl./Wo. à 150 mg, bei KG > 75 kg 3 Tbl./Wo. à 150 mg; Kinder ab 6 Mon. 5 mg/kg KG/Wo. 1 Wo. vor Abreise (2. Einnahme am Abreisetag) bis 4 Wo. nach Reise plus Proguanil, z.B. Paludrine ® 2 Tbl./d à 100 mg; Kinder 5 kg KG: 5 mg/kg KG/Wo. 1 Wo. vor Abreise (2. Einnahme am Abreisetag) bis 4 Wo. nach Reise; bei längerfristiger Anwendung besser Zone-B-Med. u. Stand-by-Med. mitnehmen Atovaquon/Proguanil ∗ , z.B. Malarone ® 1 Tbl./d à 250/100 mg, max. 4 Wo., besser verträglich als Lariam®; Kinder ab 11 kg KG 1 Junior Tabl. à 62,5/25 mg pro 10 kg KG/d 1 d vor Abreise bis 1 Wo. nach Reise Doxycyclin ∗ , z.B. Doxy v. ct ® 1–2 Tbl./d à 100 mg, je nach KG; nicht für Kinder Malariaprophylaxeempfehlungen: www.dtg.org Tab. 9.39 Empfohlene Chemoprophylaxe bei Kindern (Resistenzzonen und Einnahmezeitraum wie bei Erwachsenen) Medikament Dosierung Chloroquin, z.B. Resochin ® Ab 6 Mon. und 7 kg KG 5 mg/kg KG/Wo. Proguanil, z.B. Paludrine ® 50 4 2 2 2 10 150 mg 10–13 32–50 3 1 1,5 1,5 7 150 mg 7–9 22–31 2 1 1 1 5 150 mg 4–6 16–21 4 2 2 2 10 50 mg 2–3 12–15 3 1 1,5 1,5 7 50 mg 0,5–1 7–11 2 1 1 1 5 50 mg Mefloquin ∗ 1. d 2. d Gesamt (Base) (z.B. Lariam®) 25 mg/kg, 1. Dosis ⠔, 2. Dosis ⠓ der Gesamtdosis Erw.; ≥ 13 > 45 4 2 6 250 mg 10–12 32–45 3 1,5 4,5 250 mg 7–9 24–31 2 1 3 250 mg 4–6 17–24 1,5 0,75 2,25 250 mg 2–3 11–16 1 0,5 1,5 250 mg 0,5–1 7–11 0,5 0,5 1 250 mg Atovaquon + Proguanil ∗∗ 1. d 2. d 3. d Gesamt (Base) (z.B. Malarone®) 70 mg/kg KG Erw.; ≥ 12 > 40 4 4 4 12 350 mg 9–11 31–40 3 3 3 9 350 mg 5–9 21–30 2 2 2 6 350 mg 2–5 11–20 1 1 1 3 350 mg Arthemeter +Lumifantrin ∗∗∗ Start 1. d, 8 h 2. d, ↔ 12 h 3. d, ↔ 12 h Gesamt (Base) (z.B. Riamet®) Erw.; ≥ 12 ≥ 35 4 4 2 × 4 2 × 4 24 140 mg Bei den meisten Mitteln wird die Einnahme nach einer Mahlzeit ausdrücklich empfohlen. Falls innerhalb 1 h erbrochen wird, nochmals Einnahme derselben Dosis. Bei Kleinkindern und Sgl. konsequente Expositionsprophylaxe, Behandlung möglichst nur durch Arzt mit spezieller Erfahrung (Kinderarzt) ↔ Einnahmeintervall am Tag, z.B. 12 h ∗ Grav., Stillzeit, Kinder 75 kg 3 Tbl./Wo. à 150 mg; Kinder ab 6 Mon. 5 mg/kg KG/Wo. 1 Wo. vor Abreise (2. Einnahme am Abreisetag) bis 4 Wo. nach Reise plus Proguanil, z.B. Paludrine ® 2 Tbl./d à 100 mg; Kinder 5 kg KG: 5 mg/kg KG/Wo. 1 Wo. vor Abreise (2. Einnahme am Abreisetag) bis 4 Wo. nach Reise; bei längerfristiger Anwendung besser Zone-B-Med. u. Stand-by-Med. mitnehmen Atovaquon/Proguanil ∗ , z.B. Malarone ® 1 Tbl./d à 250/100 mg, max. 4 Wo., besser verträglich als Lariam®; Kinder ab 11 kg KG 1 Junior Tabl. à 62,5/25 mg pro 10 kg KG/d 1 d vor Abreise bis 1 Wo. nach Reise Doxycyclin ∗ , z.B. Doxy v. ct ® 1–2 Tbl./d à 100 mg, je nach KG; nicht für Kinder Malariaprophylaxeempfehlungen: www.dtg.org Tab. 9.39 Empfohlene Chemoprophylaxe bei Kindern (Resistenzzonen und Einnahmezeitraum wie bei Erwachsenen) Medikament Dosierung Chloroquin, z.B. Resochin ® Ab 6 Mon. und 7 kg KG 5 mg/kg KG/Wo. Proguanil, z.B. Paludrine ® 50 4 2 2 2 10 150 mg 10–13 32–50 3 1 1,5 1,5 7 150 mg 7–9 22–31 2 1 1 1 5 150 mg 4–6 16–21 4 2 2 2 10 50 mg 2–3 12–15 3 1 1,5 1,5 7 50 mg 0,5–1 7–11 2 1 1 1 5 50 mg Mefloquin ∗ 1. d 2. d Gesamt (Base) (z.B. Lariam®) 25 mg/kg, 1. Dosis ⠔, 2. Dosis ⠓ der Gesamtdosis Erw.; ≥ 13 > 45 4 2 6 250 mg 10–12 32–45 3 1,5 4,5 250 mg 7–9 24–31 2 1 3 250 mg 4–6 17–24 1,5 0,75 2,25 250 mg 2–3 11–16 1 0,5 1,5 250 mg 0,5–1 7–11 0,5 0,5 1 250 mg Atovaquon + Proguanil ∗∗ 1. d 2. d 3. d Gesamt (Base) (z.B. Malarone®) 70 mg/kg KG Erw.; ≥ 12 > 40 4 4 4 12 350 mg 9–11 31–40 3 3 3 9 350 mg 5–9 21–30 2 2 2 6 350 mg 2–5 11–20 1 1 1 3 350 mg Arthemeter +Lumifantrin ∗∗∗ Start 1. d, 8 h 2. d, ↔ 12 h 3. d, ↔ 12 h Gesamt (Base) (z.B. Riamet®) Erw.; ≥ 12 ≥ 35 4 4 2 × 4 2 × 4 24 140 mg Bei den meisten Mitteln wird die Einnahme nach einer Mahlzeit ausdrücklich empfohlen. Falls innerhalb 1 h erbrochen wird, nochmals Einnahme derselben Dosis. Bei Kleinkindern und Sgl. konsequente Expositionsprophylaxe, Behandlung möglichst nur durch Arzt mit spezieller Erfahrung (Kinderarzt) ↔ Einnahmeintervall am Tag, z.B. 12 h ∗ Grav., Stillzeit, Kinder Verbindung mit Duftstoffen, Konservierungsmitteln, Fett und Emulgatoren in Kosmetika und Sonnenschutzmitteln. Klinik: Juckende, evtl. nässende Pusteln oder Quaddeln, vorwiegend an lichtexponierten Hautstellen (Dekolleté, Arme, Oberschenkel). Prophylaxe: (26.9.2) Allergiegetestete, möglichst fettfreie Sonnenschutzmittel. Evtl. weitgehend auf direkte Sonnenexposition verzichten. Sonnenbrand Prophylaxe Sonnenallergiedurch konsequenten Sonnenschutz mit mind. LSF 12; bei Allergie:Sonnen-sehr Hellhäutigen sowie in bestimmten Gegenden (Gletscher, Äquatorialgebiet, Australien) und über die Mittagszeit (11.00–15.00 Uhr) höheren LSF, "sun blocker" bzw. strikte Expositionsvermeidung: Langsame und hauttypgerechte Adaptation: Morgens oder nachmittags, nie über die Mittagszeit, helle Haut nie entblößt in die Sonne, 26.9.1. Phototoxizität Cave: Doxycyclin, Johanniskrautpräparate. UV-Konjunktivitis ("Schneeblindheit") Prophylaxe: Möglichst Gletscherbrille (seitlich geschlossen) tragen, auf modische Brillenformen (z.B. Schmetterlingsbrille) verzichten. Sonnenstich Prophylaxe: Immer Kopfbedeckung tragen, gilt v.a. für Kinder und ältere Menschen ( cave: Glatze). Risiken durch Sport und Freizeitaktivitäten Aufenthalt in großen Höhen/Hochgebirge Reizschwelle für die Höhenanpassung beim Gesunden liegt bei ca. 2500 m ü.M. Bei zu schnellem Aufstieg über diese Höhe hinaus Gefahr der Akklimatisierungsstörungen (Höhenkrankheit/akute Bergkrankheit). Entscheidend für die Reizschwelle ist die tägl. Schlafhöhe (Übernachtung), nicht die am Tag erreichte Maximalhöhe. Höhenkrankheit. Klinik: Kopfschmerzen, Schwächegefühl, Müdigkeit am Tag und Schlafstörungen in der Nacht, Appetitlosigkeit. Ther.: Abstieg in tiefere Lagen und/oder Aufstiegspause mit nachfolgend langsameren Aufstiegen. Prophylaxe: Guter Trainingszustand vor Antritt der Reise (evtl. Check-up durchführen); keine zu großen Höhenunterschiede tägl. bewältigen, keine Gewalttouren; auf ausreichende Flüssigkeits- und Salzzufuhr achten; größere Touren nur mit erfahrenen Bergführern, die mit Reisemedizin, Empfehlungen:Höhenkrankheiteiner höhengerechten Aufstiegstaktik vertraut sind. Höhenkrankheit Akute Bergkrankheit (schwere Form der Höhenkrankheit). Klinik: Höhenlungenödem mit Dyspnoe, RG der Atemwege und rapidem Leistungsabfall (lebensbedrohlich!). Ther.: Sofortiger Abstieg bzw. Abtransport des Pat. in tiefere Lagen, Sauerstoffgabe; medikamentös: Nifedipin p.o. 10–20 mg plus 20 mg in Retardform sofort, danach alle 6 h 20 mg in Retardform. Tauchen • Bestimmung der Tauchfähigkeit: Der Tauchsport verlangt B*(*ergkrankheit, akute*)*ein hohes Maß an körperlicher und mentaler Fitness; Minimum-Check-up: Herz-Kreislauf-Funktion und Lungenfunktion. Bei älteren Reisenden evtl. Belastungs-EKG. Psychische Belastbarkeit abschätzen! Bei HNO-Erkr. in der Anamnese ist vor einem Tauchurlaub ein fachärztliches Attest durch HNO-Arzt Voraussetzung (wird von Tauchschulen u.U. auch verlangt). • Sportmedizin:TauchenProphylaxe Tauchen:Tauchfähigkeitvon Tauchunfällen. – Aufklärung über Dekompressionskrankheit und Luftembolie. – Psychische Stabilität und mentale Fitness: Es kann unter Wasser bei bestimmter Disposition zu (lebensgefährlichen) Panikreaktionen oder euphorischen Überreaktionen kommen. – Keine Tauchgänge bei Schleimhautschwellung (Schnupfen, Erkältungen, allergischen Reaktionen); auch keine schleimhautabschwellenden Nasentropfen vor Tauchgängen Tauchen:Prophylaxe von Tauchunfällenanwenden. Gefahr: Lässt ihre Wirkung noch während des Tauchgangs nach, ist beim Auftauchen der Überdruckausgleich nicht mehr möglich. Folge: Barotraumen in Ohren und NNH (23.6.3). Cave: Zusammenhang wird von Laien oft nicht verstanden und deshalb nicht befolgt! – Vor und nach Tauchgängen keinen Alkohol trinken, nicht rauchen, keine Medikamente einnehmen. Abhängig von Dauer und Tiefe der Tauchgänge darf für mind. 24–48 h danach nicht geflogen werden (genaue Zeit wird nach dem letzten Tauchgang berechnet, diese Berechnung zu lernen, ist Bestandteil einer seriösen Tauchausbildung). Infektiöse Erkrankungen Bilharziose (Schistosomiasis) Definition Durch im menschlichen Venensystem (Endwirt) lebende Pärchenegel (Schistosomen) verursacht. In warmem Süßwasser werden von Wasserschnecken (= Zwischenwirt) die Wimpernlarven (Mirazidien) aufgenommen und als Zerkarien (Infektionslarven) freigesetzt. IKZ bis 3 Mon. Inf. perkutan beim Baden. Vorkommen: Afrika; Naher, Mittlerer und Ferner Osten; Südamerika. Klinik, Diagnostik, Therapie Unterschiedlich je nach Subtyp: Schistosoma haematobium Bilharziose(SchistosomiasisAfrika, Mittl. Osten): Befällt Venengeflecht des kleinen Beckens. Klinik: Blasenbilharziose mit hämorrhagischer Zystitis. KO: Blasenpapillome, Blasenfisteln. Diagn.: Eier im Urin, bei Primärinf. Serologie. Ther.: Praziquantel, z.B. Biltricide®. Schistosoma mansoni (Afrika, Naher Osten, Südamerika): Befällt Leber und Darm. Klinik: Darmbilharziose mit ruhrähnlicher Kolitis. KO: Perirektale Abszesse, Polypen, Leberzirrhose. Diagn.: Eier im Stuhl oder Rektalbereich, Serologie. Ther.: Praziquantel (40 mg/kg KG tgl. über 3 d). Schistosoma japonicum (Ferner Osten): Eiablage im Blutgefäßsystem. Eier dringen durch die Darmwand ins Darmlumen. Klinik und Diagn. wie Schistosoma mansoni. Ther.: Praziquantel (s.o., oft muss höher dosiert undd länger behandelt werden). Prophylaxe In den entsprechenden Gebieten nicht in Süßwasserseen und -tümpeln baden, waten oder sich waschen. Cholera Häufige Erkr. in Entwicklungsländern, vorwiegend in Armutsvierteln (Slums). Für Touristen ist das Erkrankungsrisiko niedrig, da kein oder selten Kontakt mit Slumbewohnern oder Aufenthalt in Slums. Dengue-Fieber Synonym Siebentagefieber; break bone fever. Erreger Dengue-Virus, 4 Serotypen. Alle Typen können das prognostisch günstig verlaufende klassische Dengue-Fieber und das hämorrhagische Dengue-Fieber (DHF, schwer verlaufend, hohe Letalität) sowie das Dengue-Schock-Sy. (DSS) hervorrufen. Übertragung durch tagaktive Mücken (v.a. Aedes aegypti), die in der Nähe menschlicher Behausungen in Wasseransammlungen brüten. Nach Stich und Eintritt in die Dengue-FieberBlutbahn Vermehrung Siebentagefieberin regionalen Lk; von dort in andere Gewebe, v.a. in die Haut; IKZ 5–8 d. Gesamtletalität bis zu 10 %. Vorkommen: Tropische und subtropische Länder Asiens und Afrikas; Zentral- und Südamerika, Südstaaten der USA; endemisch bzw. epidemisch. Cave: Gelgentliche Epidemien durch importierte Inf. in Südeuropa möglich. Klinik Fieber, Schüttelfrost, retroorbitale Kopfschmerzen, sehr starke Knochen-, Gelenk- und Muskelschmerzen; Injektion der Konjunktiven typisch. Diffuses, stammbetontes Erythem am 2.–3. d, danach morbilliformes Exanthem am Rumpf mit zentripetaler Ausbreitung auf Kopf und Extremitäten, verbunden mit einem zweiten Fieberschub. Evtl. petechiale Blutungen und Epistaxis. Abklingen der Symptome nach 5–6 d, jedoch protrahierte Rekonvaleszenz von mehreren Wo. Therapie Klinikeinweisung zur Diagnosestellung, ggf. intensivmedizinische Maßnahmen. Cave: ASS wegen vermehrter Blutungsneigung, Ausweichmittel Paracetamol. Prophylaxe Expositionsprophylaxe; Haut durch Kleidung und Repellentien schützen. Schlafen in Räumen mit Klimaanlage. Keine Impfung möglich. Gelbfieber Erreger Durch Arboviren hervorgerufene und die Stechmücke Aedes aegypti sowie Haemagogus-Arten (Moskitos) übertragene Erkr. Gesamtletalität ca. 20–30 % (WHO). IKZ 3–6 d. Vorkommen: Norden Südamerikas und Zentralafrika Abb. 9.6 ; Asien ist frei von Gelbfieber! Hauptreservoir sind Primaten. Abb. 9.6 Gelbfieberverbreitung in Afrika und Südamerika Klinik Initialstadium (3 d): Plötzlicher Beginn mit Fieber bis 40°C, Schüttelfrost, starke Kopf- und Gliederschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Gelbfieber:Erkrankungsrisikenevtl. relative Bradykardie. Remissionsstadium: Fieberabfall am 3. oder 4. d, evtl. Ausheilung. Bei schwerem Verlauf Stadium der Organschädigung: Hepatitis mit Ikterus und Erbrechen, Nephritis mit Proteinurie, hämorrhagische Diathese mit profusen Blutungen. KO: Leber-, Nieren-, Multiorganversagen, Meningoenzephalitis. Diagnostik Tropenanamnese bei ungeimpften (oder zu spät geimpften) Personen mit typischer Klinik, evtl. IgM-Ak-Nachweis, PCR. Therapie Klinikeinweisung (Verdachtsdiagnose "Gelbfieber" angeben) zur Diagnosestellung (Ak-Nachweis), intensivmedizinische Maßnahmen. Prophylaxe Impfung ( 9.2.3 ) für alle Reisen in Endemiegebiete. Cave: Viele Staaten, in denen Gelbfieber nicht vorkommt, verlangen eine Impfbescheinigung bei Einreise aus Infektionsgebieten. Aktuelle Information bei Gelbfieberimpfstellen erfragen. Adressen 35.1.2. Hepatitis A Häufige Erkr. in Ländern mit schlechten hygienischen Verhältnissen; Übertragung vorwiegend fäkal-oral, verunreinigte Gewässer, Meerbuchten, aber auch durch Blutprodukte (seltenGelbfieber:Prophylaxe). IKZ 2–6 Wo. Vorkommen: Ubiquitär in Ländern mit schlechten hygienischen Verhältnissen. Inzidenz in Entwicklungsländern bes. hoch (ca. 50–300 Fälle/100 000 Einw.). Klinik Im Kindesalter (bis ca. 6 J.) meist anikterisch, oft nur gastrointestinale Symptome. Bei Inf. im Erwachsenenalter lange und schwere Verläufe möglich. Cave: Bei Reisenden über 50 J. ohne Immunität häufiger als in jungen Jahren fulminante Verläufe mit höherer Letalität (ca. 2,7 % im Vergleich zu normalerweise nur 0,05 %). Prophylaxe Aktive HAV-Impfung (z.B. Havrix®) für alle Fernreisenden; aufgrund der guten Verträglichkeit und der fast 100 %igen Schutzwirkung sollte die aktive Schutzimpfung einer passiven Impfprophylaxe (Globulin i.m.) vorgezogen werden. Impfschemata und Dosis 9.2.3 , Tab. 9.10 . Leishmaniose (Kala-Azar) 9.6.3 , Tab. 9.23 ; Pest 9.3.11 , Tab. 9.19 . Unkomplizierte Reisediarrhö Betrifft 20–50 % aller Fernreisenden. Erreger 85 % bakt. (meist pathogene E.-coli-Stämme), 10 % viral, 5 % Protozoen. Klinik Flüssiger oder wässriger Stuhl, häufig abdom. Krämpfe, Übelkeit, Blähungen; plötzlicher Beginn, milder bis mittelschwerer Verlauf über durchschnittlich 3–4 d; in 10 % > 1 Wo. Therapie • Flüssigkeitssubstitution: Orale Rehydratationssalze (z.B. Elotrans®-Pulver); in den Apotheken tropischer Länder ist "oral rehydration Diarrhoe:Reisediarrhoesalts" (ORS) verfügbar, Reise:Diarrhoedieses im angegebenen Volumen abgekochtem Wasser auflösen; auch für Diabetiker geeignet. • Gezuckerten Tee trinken, Salzgebäck essen ("Cola und Salzstangen"). • Bes. durch Exsikkose gefährdet: Kleinkinder und Säuglinge. • Reduktion der Stuhlfrequenz durch Motilitätshemmer. – Loperamid: Ab 14 J. 4 mg initial, dann 2 mg nach jedem wässrigen Stuhlgang, max. 16 mg tägl.; Kinder 8–13 J. 2 mg initial, dann 2 mg nach jedem wässrigen Stuhlgang, max. 8 mg tägl.; bei Kindern 3 d und evtl. Blut im Stuhl. Cave: Malaria. Therapie • Flüssigkeitssubstitution und Antibiotikum, z.B. Ciprofloxacin: 2 × 500 mg/d für 3 Tage. • Bei Fieber oder blutigem Stuhl auf Motilitätshemmer verzichten. • Keine Besserung bei Fieber oder blutigem Stuhl nach 2 d → Arzt aufsuchen. • Keine Besserung bei wässriger Diarrhoe nach 3 d → V.a. Lambliasis (häufiger Durchfallerreger in warmen Ländern) → Metronidazol 3 × 500 mg für 7 d. Tab. 9.43 Tropenvirosen und andere fieberhafte Allgemeinerkrankungen Krankheit/Erreger Vektor Vorkommen Schweres hämorrhagisches Fieber mit Exanthem durch Arboviren Dengue Mücken Afrika, Südostasien, Mittelamerika Gelbfieber Mücken Afrika, Süd- und Zentralafrika Chikungunya Mücken Afrika, Südostasien Rift-Valley Mücken Ostafrika, Niltal, Krim-Kongo Mücken, Zecken! Zentralafrika, Bulgarien, Südrussland Marburg-Virus Mücken Zentralafrika Ebola-Virus Mücken Zentralafrika Hämorrhagisches Fieber (HF) Leptospirose Nagetiere (Urin) Zentraleuropa bzw. weltweit Hanta-Virus-Inf. Nagetiere (Urin) Typ Hantaan: China, Korea Lassa-Fieber Nagetiere (Urin) West- und Zentralafrika Argentinisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Argentinien Bolivianisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Anden Venezuelanisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Venezuela Muskel- und Gelenkschmerzen, mit/ohne Exanthem Dengue Mücken Afrika, Südostasien, Mittelamerika Chikungunya Mücken Afrika, franz. Insel Réunion, Südostasien. Leitsymptom: Qualvolle, ca. 1 Wo. andauernde Muskel- und Gelenkschmerzen O'nyong-nyong Mücken Uganda, Zaire, Kenia Ross-River-Fieber (epidemische Polyarthritis) Mücken Pazifik, Australien (relativ häufig) Sandmückenfieber Mücken Mittelmeerraum, Mittlerer Osten, Nordindien Oroya-Fieber (hämolytische Anämie) Mücken Peru und angrenzende Andenstaaten Meningitis/Enzephalitis durch Arboviren FSME Zecken Zentraleuropa, Eurasien, Sibirien, China Gelbfieber Mücken Norden Südamerikas, Zentralafrika Japan-Enzephalitis Mücken Südostasien West-Nil Mücken Afrika, Mittlerer Osten Pferdeenzephalitis Mücken Nord- und Südamerika St.-Louis-Enzephalitis Mücken Nordamerika, Karibik La Crosse Mücken Nordamerika Murray-Valley-E. Mücken Australien Flecktyphusartige Erkrankungen Klassisches Fleckfieber Kleiderlaus Weltweit Rocky Mountain spotted fever Zecken Nord- und Südamerika Murines Fleckfieber Rattenfloh Südostasien, Australien, Mittelamerika Fièvre boutonneuse Zecken Südfrankreich, Mittelmeerraum, Afrika, Indien, China Tsutsugamushi-Fieber Stechmilben Japan, Südkorea, Südchina, Taiwan, Südostasien, Indien, Indonesien, Nordaustralien Prophylaxe Wie bei unkomplizierter Reisediarrhoe. Kinetosen Prophylaxe • Leichte, fettarme Mahlzeiten vor und während der Reise, kein Alkohol. • Nicht lesen; nach vorn blicken und ein Objekt fixieren. • Kauen (Apfel, Kaugummi) soll ebenfalls präventiv wirken. Jet-lag (Syndrom der Zeitverschiebung) • Durch Zeitverschiebung bei Interkontinentalflügen hervorgerufene Störung des Kinetosenzirkadianen Reisemedizin, Empfehlungen:KinetosenRhythmus. Dadurch Beeinträchtigung mentaler und physiologischer Funktionen, z.B. Schlaf- und Wachzustand, Gedächtnis- und Konzentrationsleistungen, Hormonausschüttung, Darm- und Blasenfunktion. • Für eine Zeitverschiebung ab 2 h werden mind. 24 h benötigt, um den Jet-lag auszugleichen (sog. Resynchronisationszeit). • Reisemedizin, Empfehlungen:Jet-lagFlüge von Ost nach West (Jet-lagZeitverlängerung, Verschiebung der Schlafphase) sind weniger beeinträchtigend als Flüge von West nach Ost (Zeitverkürzung, häufig Überspringen der Schlafphase). Entsprechend der Zeitverschiebung kann Reisenden ein verändertes Einnahmeschema für Medikamente mitgegeben werden, z.B. Diabetikern 9.10.5 und 17.1.4! Prophylaxe und Therapie Anpassung des Schlaf-Wach-Rhythmus schon vor der Reise; aus praktischen Gründen meist jedoch nur für 2–3 h möglich. Risiken durch natürliche Umweltbedingungen Sonnen- und UV-Lichtexposition Trotz zunehmender Aufklärung über kurz- und langfristige Risiken intensiver Sonnenlichtexposition (Melanome 26.10.3, Basaliome 26.10.4, vorzeitige Alterung der Haut) wird das Risiko nach wie vor unterschätzt. Zu den vermeidbaren kurzfristigen Folgen intensiver Sonnenstrahlung, die das Allgemeinbefinden am Urlaubsort beeinträchtigen, gehören: Polymorphe Lichtdermatose ("Sonnenallergie") Ätiol.: Sonnenstrahlung in SonnenschutzVerbindung mit Duftstoffen, Konservierungsmitteln, Fett und Emulgatoren in Kosmetika und Sonnenschutzmitteln. Klinik: Juckende, evtl. nässende Pusteln oder Quaddeln, vorwiegend an lichtexponierten Hautstellen (Dekolleté, Arme, Oberschenkel). Prophylaxe: (26.9.2) Allergiegetestete, möglichst fettfreie Sonnenschutzmittel. Evtl. weitgehend auf direkte Sonnenexposition verzichten. Sonnenbrand Prophylaxe Sonnenallergiedurch konsequenten Sonnenschutz mit mind. LSF 12; bei Allergie:Sonnen-sehr Hellhäutigen sowie in bestimmten Gegenden (Gletscher, Äquatorialgebiet, Australien) und über die Mittagszeit (11.00–15.00 Uhr) höheren LSF, "sun blocker" bzw. strikte Expositionsvermeidung: Langsame und hauttypgerechte Adaptation: Morgens oder nachmittags, nie über die Mittagszeit, helle Haut nie entblößt in die Sonne, 26.9.1. Phototoxizität Cave: Doxycyclin, Johanniskrautpräparate. UV-Konjunktivitis ("Schneeblindheit") Prophylaxe: Möglichst Gletscherbrille (seitlich geschlossen) tragen, auf modische Brillenformen (z.B. Schmetterlingsbrille) verzichten. Sonnenstich Prophylaxe: Immer Kopfbedeckung tragen, gilt v.a. für Kinder und ältere Menschen ( cave: Glatze). Risiken durch Sport und Freizeitaktivitäten Aufenthalt in großen Höhen/Hochgebirge Reizschwelle für die Höhenanpassung beim Gesunden liegt bei ca. 2500 m ü.M. Bei zu schnellem Aufstieg über diese Höhe hinaus Gefahr der Akklimatisierungsstörungen (Höhenkrankheit/akute Bergkrankheit). Entscheidend für die Reizschwelle ist die tägl. Schlafhöhe (Übernachtung), nicht die am Tag erreichte Maximalhöhe. Höhenkrankheit. Klinik: Kopfschmerzen, Schwächegefühl, Müdigkeit am Tag und Schlafstörungen in der Nacht, Appetitlosigkeit. Ther.: Abstieg in tiefere Lagen und/oder Aufstiegspause mit nachfolgend langsameren Aufstiegen. Prophylaxe: Guter Trainingszustand vor Antritt der Reise (evtl. Check-up durchführen); keine zu großen Höhenunterschiede tägl. bewältigen, keine Gewalttouren; auf ausreichende Flüssigkeits- und Salzzufuhr achten; größere Touren nur mit erfahrenen Bergführern, die mit Reisemedizin, Empfehlungen:Höhenkrankheiteiner höhengerechten Aufstiegstaktik vertraut sind. Höhenkrankheit Akute Bergkrankheit (schwere Form der Höhenkrankheit). Klinik: Höhenlungenödem mit Dyspnoe, RG der Atemwege und rapidem Leistungsabfall (lebensbedrohlich!). Ther.: Sofortiger Abstieg bzw. Abtransport des Pat. in tiefere Lagen, Sauerstoffgabe; medikamentös: Nifedipin p.o. 10–20 mg plus 20 mg in Retardform sofort, danach alle 6 h 20 mg in Retardform. Tauchen • Bestimmung der Tauchfähigkeit: Der Tauchsport verlangt B*(*ergkrankheit, akute*)*ein hohes Maß an körperlicher und mentaler Fitness; Minimum-Check-up: Herz-Kreislauf-Funktion und Lungenfunktion. Bei älteren Reisenden evtl. Belastungs-EKG. Psychische Belastbarkeit abschätzen! Bei HNO-Erkr. in der Anamnese ist vor einem Tauchurlaub ein fachärztliches Attest durch HNO-Arzt Voraussetzung (wird von Tauchschulen u.U. auch verlangt). • Sportmedizin:TauchenProphylaxe Tauchen:Tauchfähigkeitvon Tauchunfällen. – Aufklärung über Dekompressionskrankheit und Luftembolie. – Psychische Stabilität und mentale Fitness: Es kann unter Wasser bei bestimmter Disposition zu (lebensgefährlichen) Panikreaktionen oder euphorischen Überreaktionen kommen. – Keine Tauchgänge bei Schleimhautschwellung (Schnupfen, Erkältungen, allergischen Reaktionen); auch keine schleimhautabschwellenden Nasentropfen vor Tauchgängen Tauchen:Prophylaxe von Tauchunfällenanwenden. Gefahr: Lässt ihre Wirkung noch während des Tauchgangs nach, ist beim Auftauchen der Überdruckausgleich nicht mehr möglich. Folge: Barotraumen in Ohren und NNH (23.6.3). Cave: Zusammenhang wird von Laien oft nicht verstanden und deshalb nicht befolgt! – Vor und nach Tauchgängen keinen Alkohol trinken, nicht rauchen, keine Medikamente einnehmen. Abhängig von Dauer und Tiefe der Tauchgänge darf für mind. 24–48 h danach nicht geflogen werden (genaue Zeit wird nach dem letzten Tauchgang berechnet, diese Berechnung zu lernen, ist Bestandteil einer seriösen Tauchausbildung). Infektiöse Erkrankungen Bilharziose (Schistosomiasis) Definition Durch im menschlichen Venensystem (Endwirt) lebende Pärchenegel (Schistosomen) verursacht. In warmem Süßwasser werden von Wasserschnecken (= Zwischenwirt) die Wimpernlarven (Mirazidien) aufgenommen und als Zerkarien (Infektionslarven) freigesetzt. IKZ bis 3 Mon. Inf. perkutan beim Baden. Vorkommen: Afrika; Naher, Mittlerer und Ferner Osten; Südamerika. Klinik, Diagnostik, Therapie Unterschiedlich je nach Subtyp: Schistosoma haematobium Bilharziose(SchistosomiasisAfrika, Mittl. Osten): Befällt Venengeflecht des kleinen Beckens. Klinik: Blasenbilharziose mit hämorrhagischer Zystitis. KO: Blasenpapillome, Blasenfisteln. Diagn.: Eier im Urin, bei Primärinf. Serologie. Ther.: Praziquantel, z.B. Biltricide®. Schistosoma mansoni (Afrika, Naher Osten, Südamerika): Befällt Leber und Darm. Klinik: Darmbilharziose mit ruhrähnlicher Kolitis. KO: Perirektale Abszesse, Polypen, Leberzirrhose. Diagn.: Eier im Stuhl oder Rektalbereich, Serologie. Ther.: Praziquantel (40 mg/kg KG tgl. über 3 d). Schistosoma japonicum (Ferner Osten): Eiablage im Blutgefäßsystem. Eier dringen durch die Darmwand ins Darmlumen. Klinik und Diagn. wie Schistosoma mansoni. Ther.: Praziquantel (s.o., oft muss höher dosiert undd länger behandelt werden). Prophylaxe In den entsprechenden Gebieten nicht in Süßwasserseen und -tümpeln baden, waten oder sich waschen. Cholera Häufige Erkr. in Entwicklungsländern, vorwiegend in Armutsvierteln (Slums). Für Touristen ist das Erkrankungsrisiko niedrig, da kein oder selten Kontakt mit Slumbewohnern oder Aufenthalt in Slums. Dengue-Fieber Synonym Siebentagefieber; break bone fever. Erreger Dengue-Virus, 4 Serotypen. Alle Typen können das prognostisch günstig verlaufende klassische Dengue-Fieber und das hämorrhagische Dengue-Fieber (DHF, schwer verlaufend, hohe Letalität) sowie das Dengue-Schock-Sy. (DSS) hervorrufen. Übertragung durch tagaktive Mücken (v.a. Aedes aegypti), die in der Nähe menschlicher Behausungen in Wasseransammlungen brüten. Nach Stich und Eintritt in die Dengue-FieberBlutbahn Vermehrung Siebentagefieberin regionalen Lk; von dort in andere Gewebe, v.a. in die Haut; IKZ 5–8 d. Gesamtletalität bis zu 10 %. Vorkommen: Tropische und subtropische Länder Asiens und Afrikas; Zentral- und Südamerika, Südstaaten der USA; endemisch bzw. epidemisch. Cave: Gelgentliche Epidemien durch importierte Inf. in Südeuropa möglich. Klinik Fieber, Schüttelfrost, retroorbitale Kopfschmerzen, sehr starke Knochen-, Gelenk- und Muskelschmerzen; Injektion der Konjunktiven typisch. Diffuses, stammbetontes Erythem am 2.–3. d, danach morbilliformes Exanthem am Rumpf mit zentripetaler Ausbreitung auf Kopf und Extremitäten, verbunden mit einem zweiten Fieberschub. Evtl. petechiale Blutungen und Epistaxis. Abklingen der Symptome nach 5–6 d, jedoch protrahierte Rekonvaleszenz von mehreren Wo. Therapie Klinikeinweisung zur Diagnosestellung, ggf. intensivmedizinische Maßnahmen. Cave: ASS wegen vermehrter Blutungsneigung, Ausweichmittel Paracetamol. Prophylaxe Expositionsprophylaxe; Haut durch Kleidung und Repellentien schützen. Schlafen in Räumen mit Klimaanlage. Keine Impfung möglich. Gelbfieber Erreger Durch Arboviren hervorgerufene und die Stechmücke Aedes aegypti sowie Haemagogus-Arten (Moskitos) übertragene Erkr. Gesamtletalität ca. 20–30 % (WHO). IKZ 3–6 d. Vorkommen: Norden Südamerikas und Zentralafrika Abb. 9.6 ; Asien ist frei von Gelbfieber! Hauptreservoir sind Primaten. Abb. 9.6 Gelbfieberverbreitung in Afrika und Südamerika Klinik Initialstadium (3 d): Plötzlicher Beginn mit Fieber bis 40°C, Schüttelfrost, starke Kopf- und Gliederschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Gelbfieber:Erkrankungsrisikenevtl. relative Bradykardie. Remissionsstadium: Fieberabfall am 3. oder 4. d, evtl. Ausheilung. Bei schwerem Verlauf Stadium der Organschädigung: Hepatitis mit Ikterus und Erbrechen, Nephritis mit Proteinurie, hämorrhagische Diathese mit profusen Blutungen. KO: Leber-, Nieren-, Multiorganversagen, Meningoenzephalitis. Diagnostik Tropenanamnese bei ungeimpften (oder zu spät geimpften) Personen mit typischer Klinik, evtl. IgM-Ak-Nachweis, PCR. Therapie Klinikeinweisung (Verdachtsdiagnose "Gelbfieber" angeben) zur Diagnosestellung (Ak-Nachweis), intensivmedizinische Maßnahmen. Prophylaxe Impfung ( 9.2.3 ) für alle Reisen in Endemiegebiete. Cave: Viele Staaten, in denen Gelbfieber nicht vorkommt, verlangen eine Impfbescheinigung bei Einreise aus Infektionsgebieten. Aktuelle Information bei Gelbfieberimpfstellen erfragen. Adressen 35.1.2. Hepatitis A Häufige Erkr. in Ländern mit schlechten hygienischen Verhältnissen; Übertragung vorwiegend fäkal-oral, verunreinigte Gewässer, Meerbuchten, aber auch durch Blutprodukte (seltenGelbfieber:Prophylaxe). IKZ 2–6 Wo. Vorkommen: Ubiquitär in Ländern mit schlechten hygienischen Verhältnissen. Inzidenz in Entwicklungsländern bes. hoch (ca. 50–300 Fälle/100 000 Einw.). Klinik Im Kindesalter (bis ca. 6 J.) meist anikterisch, oft nur gastrointestinale Symptome. Bei Inf. im Erwachsenenalter lange und schwere Verläufe möglich. Cave: Bei Reisenden über 50 J. ohne Immunität häufiger als in jungen Jahren fulminante Verläufe mit höherer Letalität (ca. 2,7 % im Vergleich zu normalerweise nur 0,05 %). Prophylaxe Aktive HAV-Impfung (z.B. Havrix®) für alle Fernreisenden; aufgrund der guten Verträglichkeit und der fast 100 %igen Schutzwirkung sollte die aktive Schutzimpfung einer passiven Impfprophylaxe (Globulin i.m.) vorgezogen werden. Impfschemata und Dosis 9.2.3 , Tab. 9.10 . Leishmaniose (Kala-Azar) 9.6.3 , Tab. 9.23 ; Pest 9.3.11 , Tab. 9.19 . Unkomplizierte Reisediarrhö Betrifft 20–50 % aller Fernreisenden. Erreger 85 % bakt. (meist pathogene E.-coli-Stämme), 10 % viral, 5 % Protozoen. Klinik Flüssiger oder wässriger Stuhl, häufig abdom. Krämpfe, Übelkeit, Blähungen; plötzlicher Beginn, milder bis mittelschwerer Verlauf über durchschnittlich 3–4 d; in 10 % > 1 Wo. Therapie • Flüssigkeitssubstitution: Orale Rehydratationssalze (z.B. Elotrans®-Pulver); in den Apotheken tropischer Länder ist "oral rehydration Diarrhoe:Reisediarrhoesalts" (ORS) verfügbar, Reise:Diarrhoedieses im angegebenen Volumen abgekochtem Wasser auflösen; auch für Diabetiker geeignet. • Gezuckerten Tee trinken, Salzgebäck essen ("Cola und Salzstangen"). • Bes. durch Exsikkose gefährdet: Kleinkinder und Säuglinge. • Reduktion der Stuhlfrequenz durch Motilitätshemmer. – Loperamid: Ab 14 J. 4 mg initial, dann 2 mg nach jedem wässrigen Stuhlgang, max. 16 mg tägl.; Kinder 8–13 J. 2 mg initial, dann 2 mg nach jedem wässrigen Stuhlgang, max. 8 mg tägl.; bei Kindern 3 d und evtl. Blut im Stuhl. Cave: Malaria. Therapie • Flüssigkeitssubstitution und Antibiotikum, z.B. Ciprofloxacin: 2 × 500 mg/d für 3 Tage. • Bei Fieber oder blutigem Stuhl auf Motilitätshemmer verzichten. • Keine Besserung bei Fieber oder blutigem Stuhl nach 2 d → Arzt aufsuchen. • Keine Besserung bei wässriger Diarrhoe nach 3 d → V.a. Lambliasis (häufiger Durchfallerreger in warmen Ländern) → Metronidazol 3 × 500 mg für 7 d. Tab. 9.43 Tropenvirosen und andere fieberhafte Allgemeinerkrankungen Krankheit/Erreger Vektor Vorkommen Schweres hämorrhagisches Fieber mit Exanthem durch Arboviren Dengue Mücken Afrika, Südostasien, Mittelamerika Gelbfieber Mücken Afrika, Süd- und Zentralafrika Chikungunya Mücken Afrika, Südostasien Rift-Valley Mücken Ostafrika, Niltal, Krim-Kongo Mücken, Zecken! Zentralafrika, Bulgarien, Südrussland Marburg-Virus Mücken Zentralafrika Ebola-Virus Mücken Zentralafrika Hämorrhagisches Fieber (HF) Leptospirose Nagetiere (Urin) Zentraleuropa bzw. weltweit Hanta-Virus-Inf. Nagetiere (Urin) Typ Hantaan: China, Korea Lassa-Fieber Nagetiere (Urin) West- und Zentralafrika Argentinisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Argentinien Bolivianisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Anden Venezuelanisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Venezuela Muskel- und Gelenkschmerzen, mit/ohne Exanthem Dengue Mücken Afrika, Südostasien, Mittelamerika Chikungunya Mücken Afrika, franz. Insel Réunion, Südostasien. Leitsymptom: Qualvolle, ca. 1 Wo. andauernde Muskel- und Gelenkschmerzen O'nyong-nyong Mücken Uganda, Zaire, Kenia Ross-River-Fieber (epidemische Polyarthritis) Mücken Pazifik, Australien (relativ häufig) Sandmückenfieber Mücken Mittelmeerraum, Mittlerer Osten, Nordindien Oroya-Fieber (hämolytische Anämie) Mücken Peru und angrenzende Andenstaaten Meningitis/Enzephalitis durch Arboviren FSME Zecken Zentraleuropa, Eurasien, Sibirien, China Gelbfieber Mücken Norden Südamerikas, Zentralafrika Japan-Enzephalitis Mücken Südostasien West-Nil Mücken Afrika, Mittlerer Osten Pferdeenzephalitis Mücken Nord- und Südamerika St.-Louis-Enzephalitis Mücken Nordamerika, Karibik La Crosse Mücken Nordamerika Murray-Valley-E. Mücken Australien Flecktyphusartige Erkrankungen Klassisches Fleckfieber Kleiderlaus Weltweit Rocky Mountain spotted fever Zecken Nord- und Südamerika Murines Fleckfieber Rattenfloh Südostasien, Australien, Mittelamerika Fièvre boutonneuse Zecken Südfrankreich, Mittelmeerraum, Afrika, Indien, China Tsutsugamushi-Fieber Stechmilben Japan, Südkorea, Südchina, Taiwan, Südostasien, Indien, Indonesien, Nordaustralien Prophylaxe Wie bei unkomplizierter Reisediarrhoe. Bilharziose (Schistosomiasis) Definition Durch im menschlichen Venensystem (Endwirt) lebende Pärchenegel (Schistosomen) verursacht. In warmem Süßwasser werden von Wasserschnecken (= Zwischenwirt) die Wimpernlarven (Mirazidien) aufgenommen und als Zerkarien (Infektionslarven) freigesetzt. IKZ bis 3 Mon. Inf. perkutan beim Baden. Vorkommen: Afrika; Naher, Mittlerer und Ferner Osten; Südamerika. Klinik, Diagnostik, Therapie Unterschiedlich je nach Subtyp: Schistosoma haematobium Bilharziose(SchistosomiasisAfrika, Mittl. Osten): Befällt Venengeflecht des kleinen Beckens. Klinik: Blasenbilharziose mit hämorrhagischer Zystitis. KO: Blasenpapillome, Blasenfisteln. Diagn.: Eier im Urin, bei Primärinf. Serologie. Ther.: Praziquantel, z.B. Biltricide®. Schistosoma mansoni (Afrika, Naher Osten, Südamerika): Befällt Leber und Darm. Klinik: Darmbilharziose mit ruhrähnlicher Kolitis. KO: Perirektale Abszesse, Polypen, Leberzirrhose. Diagn.: Eier im Stuhl oder Rektalbereich, Serologie. Ther.: Praziquantel (40 mg/kg KG tgl. über 3 d). Schistosoma japonicum (Ferner Osten): Eiablage im Blutgefäßsystem. Eier dringen durch die Darmwand ins Darmlumen. Klinik und Diagn. wie Schistosoma mansoni. Ther.: Praziquantel (s.o., oft muss höher dosiert undd länger behandelt werden). Prophylaxe In den entsprechenden Gebieten nicht in Süßwasserseen und -tümpeln baden, waten oder sich waschen. Cholera Häufige Erkr. in Entwicklungsländern, vorwiegend in Armutsvierteln (Slums). Für Touristen ist das Erkrankungsrisiko niedrig, da kein oder selten Kontakt mit Slumbewohnern oder Aufenthalt in Slums. Dengue-Fieber Synonym Siebentagefieber; break bone fever. Erreger Dengue-Virus, 4 Serotypen. Alle Typen können das prognostisch günstig verlaufende klassische Dengue-Fieber und das hämorrhagische Dengue-Fieber (DHF, schwer verlaufend, hohe Letalität) sowie das Dengue-Schock-Sy. (DSS) hervorrufen. Übertragung durch tagaktive Mücken (v.a. Aedes aegypti), die in der Nähe menschlicher Behausungen in Wasseransammlungen brüten. Nach Stich und Eintritt in die Dengue-FieberBlutbahn Vermehrung Siebentagefieberin regionalen Lk; von dort in andere Gewebe, v.a. in die Haut; IKZ 5–8 d. Gesamtletalität bis zu 10 %. Vorkommen: Tropische und subtropische Länder Asiens und Afrikas; Zentral- und Südamerika, Südstaaten der USA; endemisch bzw. epidemisch. Cave: Gelgentliche Epidemien durch importierte Inf. in Südeuropa möglich. Klinik Fieber, Schüttelfrost, retroorbitale Kopfschmerzen, sehr starke Knochen-, Gelenk- und Muskelschmerzen; Injektion der Konjunktiven typisch. Diffuses, stammbetontes Erythem am 2.–3. d, danach morbilliformes Exanthem am Rumpf mit zentripetaler Ausbreitung auf Kopf und Extremitäten, verbunden mit einem zweiten Fieberschub. Evtl. petechiale Blutungen und Epistaxis. Abklingen der Symptome nach 5–6 d, jedoch protrahierte Rekonvaleszenz von mehreren Wo. Therapie Klinikeinweisung zur Diagnosestellung, ggf. intensivmedizinische Maßnahmen. Cave: ASS wegen vermehrter Blutungsneigung, Ausweichmittel Paracetamol. Prophylaxe Expositionsprophylaxe; Haut durch Kleidung und Repellentien schützen. Schlafen in Räumen mit Klimaanlage. Keine Impfung möglich. Gelbfieber Erreger Durch Arboviren hervorgerufene und die Stechmücke Aedes aegypti sowie Haemagogus-Arten (Moskitos) übertragene Erkr. Gesamtletalität ca. 20–30 % (WHO). IKZ 3–6 d. Vorkommen: Norden Südamerikas und Zentralafrika Abb. 9.6 ; Asien ist frei von Gelbfieber! Hauptreservoir sind Primaten. Abb. 9.6 Gelbfieberverbreitung in Afrika und Südamerika Klinik Initialstadium (3 d): Plötzlicher Beginn mit Fieber bis 40°C, Schüttelfrost, starke Kopf- und Gliederschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Gelbfieber:Erkrankungsrisikenevtl. relative Bradykardie. Remissionsstadium: Fieberabfall am 3. oder 4. d, evtl. Ausheilung. Bei schwerem Verlauf Stadium der Organschädigung: Hepatitis mit Ikterus und Erbrechen, Nephritis mit Proteinurie, hämorrhagische Diathese mit profusen Blutungen. KO: Leber-, Nieren-, Multiorganversagen, Meningoenzephalitis. Diagnostik Tropenanamnese bei ungeimpften (oder zu spät geimpften) Personen mit typischer Klinik, evtl. IgM-Ak-Nachweis, PCR. Therapie Klinikeinweisung (Verdachtsdiagnose "Gelbfieber" angeben) zur Diagnosestellung (Ak-Nachweis), intensivmedizinische Maßnahmen. Prophylaxe Impfung ( 9.2.3 ) für alle Reisen in Endemiegebiete. Cave: Viele Staaten, in denen Gelbfieber nicht vorkommt, verlangen eine Impfbescheinigung bei Einreise aus Infektionsgebieten. Aktuelle Information bei Gelbfieberimpfstellen erfragen. Adressen 35.1.2. Hepatitis A Häufige Erkr. in Ländern mit schlechten hygienischen Verhältnissen; Übertragung vorwiegend fäkal-oral, verunreinigte Gewässer, Meerbuchten, aber auch durch Blutprodukte (seltenGelbfieber:Prophylaxe). IKZ 2–6 Wo. Vorkommen: Ubiquitär in Ländern mit schlechten hygienischen Verhältnissen. Inzidenz in Entwicklungsländern bes. hoch (ca. 50–300 Fälle/100 000 Einw.). Klinik Im Kindesalter (bis ca. 6 J.) meist anikterisch, oft nur gastrointestinale Symptome. Bei Inf. im Erwachsenenalter lange und schwere Verläufe möglich. Cave: Bei Reisenden über 50 J. ohne Immunität häufiger als in jungen Jahren fulminante Verläufe mit höherer Letalität (ca. 2,7 % im Vergleich zu normalerweise nur 0,05 %). Prophylaxe Aktive HAV-Impfung (z.B. Havrix®) für alle Fernreisenden; aufgrund der guten Verträglichkeit und der fast 100 %igen Schutzwirkung sollte die aktive Schutzimpfung einer passiven Impfprophylaxe (Globulin i.m.) vorgezogen werden. Impfschemata und Dosis 9.2.3 , Tab. 9.10 . Leishmaniose (Kala-Azar) 9.6.3 , Tab. 9.23 ; Pest 9.3.11 , Tab. 9.19 . Unkomplizierte Reisediarrhö Betrifft 20–50 % aller Fernreisenden. Erreger 85 % bakt. (meist pathogene E.-coli-Stämme), 10 % viral, 5 % Protozoen. Klinik Flüssiger oder wässriger Stuhl, häufig abdom. Krämpfe, Übelkeit, Blähungen; plötzlicher Beginn, milder bis mittelschwerer Verlauf über durchschnittlich 3–4 d; in 10 % > 1 Wo. Therapie • Flüssigkeitssubstitution: Orale Rehydratationssalze (z.B. Elotrans®-Pulver); in den Apotheken tropischer Länder ist "oral rehydration Diarrhoe:Reisediarrhoesalts" (ORS) verfügbar, Reise:Diarrhoedieses im angegebenen Volumen abgekochtem Wasser auflösen; auch für Diabetiker geeignet. • Gezuckerten Tee trinken, Salzgebäck essen ("Cola und Salzstangen"). • Bes. durch Exsikkose gefährdet: Kleinkinder und Säuglinge. • Reduktion der Stuhlfrequenz durch Motilitätshemmer. – Loperamid: Ab 14 J. 4 mg initial, dann 2 mg nach jedem wässrigen Stuhlgang, max. 16 mg tägl.; Kinder 8–13 J. 2 mg initial, dann 2 mg nach jedem wässrigen Stuhlgang, max. 8 mg tägl.; bei Kindern 3 d und evtl. Blut im Stuhl. Cave: Malaria. Therapie • Flüssigkeitssubstitution und Antibiotikum, z.B. Ciprofloxacin: 2 × 500 mg/d für 3 Tage. • Bei Fieber oder blutigem Stuhl auf Motilitätshemmer verzichten. • Keine Besserung bei Fieber oder blutigem Stuhl nach 2 d → Arzt aufsuchen. • Keine Besserung bei wässriger Diarrhoe nach 3 d → V.a. Lambliasis (häufiger Durchfallerreger in warmen Ländern) → Metronidazol 3 × 500 mg für 7 d. Tab. 9.43 Tropenvirosen und andere fieberhafte Allgemeinerkrankungen Krankheit/Erreger Vektor Vorkommen Schweres hämorrhagisches Fieber mit Exanthem durch Arboviren Dengue Mücken Afrika, Südostasien, Mittelamerika Gelbfieber Mücken Afrika, Süd- und Zentralafrika Chikungunya Mücken Afrika, Südostasien Rift-Valley Mücken Ostafrika, Niltal, Krim-Kongo Mücken, Zecken! Zentralafrika, Bulgarien, Südrussland Marburg-Virus Mücken Zentralafrika Ebola-Virus Mücken Zentralafrika Hämorrhagisches Fieber (HF) Leptospirose Nagetiere (Urin) Zentraleuropa bzw. weltweit Hanta-Virus-Inf. Nagetiere (Urin) Typ Hantaan: China, Korea Lassa-Fieber Nagetiere (Urin) West- und Zentralafrika Argentinisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Argentinien Bolivianisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Anden Venezuelanisches HF (mit neurologischen Ausfällen) Nagetiere (Urin) Venezuela Muskel- und Gelenkschmerzen, mit/ohne Exanthem Dengue Mücken Afrika, Südostasien, Mittelamerika Chikungunya Mücken Afrika, franz. Insel Réunion, Südostasien. Leitsymptom: Qualvolle, ca. 1 Wo. andauernde Muskel- und Gelenkschmerzen O'nyong-nyong Mücken Uganda, Zaire, Kenia Ross-River-Fieber (epidemische Polyarthritis) Mücken Pazifik, Australien (relativ häufig) Sandmückenfieber Mücken Mittelmeerraum, Mittlerer Osten, Nordindien Oroya-Fieber (hämolytische Anämie) Mücken Peru und angrenzende Andenstaaten Meningitis/Enzephalitis durch Arboviren FSME Zecken Zentraleuropa, Eurasien, Sibirien, China Gelbfieber Mücken Norden Südamerikas, Zentralafrika Japan-Enzephalitis Mücken Südostasien West-Nil Mücken Afrika, Mittlerer Osten Pferdeenzephalitis Mücken Nord- und Südamerika St.-Louis-Enzephalitis Mücken Nordamerika, Karibik La Crosse Mücken Nordamerika Murray-Valley-E. Mücken Australien Flecktyphusartige Erkrankungen Klassisches Fleckfieber Kleiderlaus Weltweit Rocky Mountain spotted fever Zecken Nord- und Südamerika Murines Fleckfieber Rattenfloh Südostasien, Australien, Mittelamerika Fièvre boutonneuse Zecken Südfrankreich, Mittelmeerraum, Afrika, Indien, China Tsutsugamushi-Fieber Stechmilben Japan, Südkorea, Südchina, Taiwan, Südostasien, Indien, Indonesien, Nordaustralien Prophylaxe Wie bei unkomplizierter Reisediarrhoe. 9.10.9 Screening nach Reiseende Indikationen Ein Screening des zurückgekehrten Reisenden mit exakter Reiseanamnese (Route, Reisemittel, Charakter der Reise, Dauer u.a.) ist nach längerem Tropenaufenthalt unter schwierigen Bedingungen angezeigt, z.B. nach Arbeitsaufenthalten oder Abenteuerreisen (auch wenn der Rückkehrende symptomlos ist) und immer, wenn eines oder mehrere der folgenden Symptome auftritt: • Unklares Fieber, "Erkältungsgefühl". • Reisemedizin, Empfehlungen:Screening nach ReiseendeIkterus. • Diarrhoe (v.a. bei schleimig-blutigem Stuhl). • Lymphadenopathie. • Schmerzen beim Wasserlassen/Blut im Urin, genitale Affektionen (Schmerzen, Pruritus, Ulzerationen). • Pruritus und Dermatopathien. • Parästhesien. Cave: Immer auch an das Versagen der Malaria-Prophylaxe denken. Frühzeitig Kontakt mit Tropenmediziner aufnehmen (35.1.2). Tab. 9.44 Leitsymptome der häufigsten "Importkrankheiten" Beginn Fieber GIT-Symptome Hautsymptome Pulmonale Symptome Wenige Tage nach Rückkehr Malaria, Arbovirosen (Dengue, Gelbfieber), Rickettsiosen, enteropathogene Darmbakteriosen Virale und bakt. Inf. (u.a. Cholera) Larva migrans cutanea, kutane Myiasen, Ektoparasiten Virale und bakt. Inf. Einige Wo. nach Rückkehr ∗ Malaria, Hepatitis, Abdominaltyphus, Rickettsiosen, akute Bilharziose, invasive Amöbose, Leishmaniosen Giardiose (Lambliasis), intestinale Amöbose, Darmhelminthen Strongyloidose Askaridose, Strongyloidose, Toxokarose Mon. (J.) n. Rückkehr Malaria, Filariosen ∗∗ viszerale Leishmaniose Intestinale Amöbose, Darmhelminthen Kutane Leishmaniosen, Lepra ∗∗ , Filariosen ∗∗ ∗ Nach Langzeitaufenthalten entsprechend früher ∗∗ Fast nur bei Reisenden nach beruflicher Exposition/nach Langzeitaufenthalten Diagnostik • BSG. • Diff.-BB: Auf Eosinophilie achten: Hinweis für Helminthiasis. • Leberfunktionsparameter. • Serol. Tests zum Nachweis von Ak gegen Viren, Bakterien, Protozoen, Helminthen nur bei konkretem Verdacht sinnvoll. Je nach Ergebnis: Überweisung an Kollegen mit speziellen Kenntnissen oder an eine tropenmedizinische Klinik/Ambulanz. Adressen 35.1.2. • Bei V.a. Malaria Pat. zur Blutabnahme in geeignetes Labor schicken, wo ausreichende Erfahrung in Anfertigung und Auswertung z.B. eines "Dicken Tropfens" vorliegt; vorher telefonisch Rücksprache nehmen; bei entsprechender Klinik immer sofort Klinikeinweisung. Plasmodiensuche immer im EDTA-Blut. Abklärung einer Bluteosinophilie nach Tropenaufenthalten: • Stuhluntersuchung auf Helminthenlarven zum Ausschluss einer Strongyloidiasis, ggf. Serologie. • Gewebshelminthen-Suchtest (wenn 2 der 3 Hauptind. zutreffen). Indikationen zum serologischen Suchtest: • Bluteosinophilie (Wurmerkr. mit Gewebestadien): 15 % aller Tropenrückkehrer (Anteil höher bei Langzeitaufenthalten). • Expositionsverdacht: Infektionswege. – Per os: Nahrung, Schmutzinf., Tierkontakte, Trinkwasser. – Perkutan: Insektenstiche, Süßwasser, Boden. • Unspezifischer klinischer Befund. – Fieber: Schistosoma (Katayama-Sy., Filarien, Trichinella, Toxocara). – GIT-Beschwerden: Schistosoma, Strongyloides, Toxocara. – Hautsymptomatik: Strongyloides, Loa, Onchocerca (Toxocara). – Lungensymptomatik: Schistosoma, Paragonimus, Strongyloides, Toxocara (Ascaris). • Serum-IgE-Spiegel > 1000 IU/ml. 9.11 Infektionsschutzgesetz Nach dem zuletzt im Dezember 2008 überarbeiteten Infektionsschutzgesetz (IfSG) hat sich die Meldepflicht für Ärzte deutlich vereinfacht. Alle in §6 aufgeführten Erkr. müssen durch den behandelnden Arzt an das zuständige Gesundheitsamt übermittelt werden. Daneben ist nach §7 IfSG der Nachweis einer Reihe von Infektionserregern meldepflichtig, diese Meldung muss durch das diagnostizierende Labor erfolgen. Meldepflichtige Erkrankungen nach IfSG §6 (1) Namentlich ist zu melden: Der Krankheitsverdacht, die Erkrankung sowie der Tod an: a. Botulismus b. Cholera c. Diphtherie d. humaner spongiformer Enzephalopathie, außer familiär-hereditärer Formen e. akuter Virushepatitis f. enteropathischem hämolytisch-urämischem Syndrom (HUS) g. virusbedingtem hämorrhagischen Fieber h. Masern i. Meningokokken-Meningitis oder -Sepsis j. Milzbrand k. Poliomyelitis l. Pest m. Tollwut n. Typhus abdominalis/Paratyphus sowie die Erkrankung und der Tod an einer: o. behandlungsbedürftigen Tuberkulose der Verdacht auf und die Erkrankung an einer: p. über das übliche Ausmaß einer Impfreaktion hinausgehenden gesundheitlichen Schädigung durch eine Schutzimpfung q. mikrobiell bedingten Lebensmittelvergiftung oder an einer akuten infektiösen Gastroenteritis bei beruflich exponierten Personen oder wenn zwei oder mehr gleichartige Erkr. auftreten, bei denen ein epidemischer Zusammenhang wahrscheinlich ist oder vermutet wird, r. die Verletzung eines Menschen durch ein tollwutkrankes, oder -ansteckungsverdächtiges Tier sowie die Berührung eines solchen Tieres oder Tierkörpers. (2) Dem Gesundheitsamt ist über die Meldung Nr. 1 hinaus mitzuteilen, wenn Personen, die an einer behandlungsbedürftigen Lungentuberkulose leiden, eine Behandlung verweigern oder abbrechen. (3) Dem Gesundheitsamt ist unverzüglich das gehäufte Auftreten nosokomialer Infektionen, bei denen ein epidemischer Zusammenhang wahrscheinlich ist oder vermutet wird, als Ausbruch nichtnamentlich zu melden. (4) Das Auftreten einer bedrohlichen Krankheit oder von zwei oder mehr gleichartigen Erkr., bei denen ein epidemischer Zusammenhang wahrscheinlich ist oder vermutet wird, wenn dies auf eine schwerwiegende Gefahr für die Allgemeinheit hinweist und Krankheitserreger als Ursache in Betracht kommen, muss dem Gesundheitsamt unverzüglich gemeldet werden, z.B. 2009 für die so genannte Schweinegrippe ( 9.4.12 ). MRSA-Nachweis wird nach § 7 IfSG vom Labor namentlich an das zuständige Gesundheitsamt gemeldet. Infektionskrankheiten:Infektionsschutzgesetz Meldung wann und wohin? Die namentliche Meldung muss unverzüglich, spätestens innerhalb von 24 h an das für den aktuellen Aufenthaltsort des Betroffenen zuständige Gesundheitsamt (GA), bei Meldung durch diagnostische Institute an das für den Einsender zuständige GA erfolgen. Eine Meldung darf wegen einzelner fehlender Angaben nicht verzögert werden. Quarantäneerkrankungen Lungenpest, virales hämorrhagisches Fieber, hochkontagiöse Meldepflicht:Infektionskrankheitenlebensgefährliche Infektionserkr. Diese Erkr. sollen nur in den Kompetenz- und Behandlungszentren in Berlin, Hamburg, Frankfurt, Leipzig, München und Stuttgart betreut werden. Besuchsverbot von Gemeinschaftseinrichtungen (Schulen, Heimen u.a.) bei Erkrankung an oder Verdacht auf (A = Regelung für Ausscheider: Besuch von Gemeinschaftseinrichtungen nach Rücksprache mit dem Gesundheitsamt möglich): Cholera (A); Diphtherie (A); EHEC-Enteritis; virales hämorrhagisches Fieber (A); Haem. infl.; Typ b-Meningitis; Impetigo contagiosa; Keuchhusten; ansteckungsfähige Lungentuberkulose; Lausbefall; Masern; Meningokokken-Inf.; Mumps; Paratyphus (A); Pest; Polio; Scabies (Krätze); Scharlach oder sonst. A-Streptok.-Inf.; Shigellose; Typhus abdominalis (A); Virushepatitis A oder E; Windpocken. Tätigkeitsverbot im Lebensmittelbereich • Erkr. an oder V.a.: Typhus abdominalis; Paratyphus; Cholera; Shigellenruhr; Salmonellose, einer anderen infektiösen Gastroenteritis; Virushepatitis A oder E. • Infizierte Wunden oder Hautkrankheiten, bei denen die Möglichkeit einer Übertragung der Krankheitserreger über Lebensmittel besteht. • Ausscheider von: Choleravibrionen, EHEC, Salmonellen, Shigellen. 9.12 Internet • Informationen zu seltenen Viruserkr. vom Robert-Koch-Institut: www.rki.de • HIV: – Umfangreiche Informationen über die WW der in der HIV-Ther. eingesetzten Medikamente: www.hiv.net – Leitlinien zu Diagnostik und Ther. der HIV-Inf. und zur antiretroviralen Ther. im Erwachsenenalter: www.awmf-online.de – Leitlinien für Diagnostik und Ther. der HIV-Inf. und zur antiretroviralen Ther. im Erwachsenenalter und bei Kindern. Stand September 2008: www.daignet.de/site-content/hiv-therapie/ – Leitlinien zur antiretroviralen Ther. der HIV-Inf., Deutsch-Österreichische Empfehlungen. Stand September 2008: www.rki.de • Reiseinformationen: – Bernhard-Nocht-Institut: www.gesundes-reisen.de – Deutsche Gesellschaft für Tropenmedizin: www.dtg.org – Aktuelle deutsche Empfehlungen zu Schutz- und Reiseimpfungen: www.rki.de/STIKO – Leitlinien zur Malariaprophylaxe und -therapie. der Deutschen Gesellschaft für Tropenmedizin: www.dtg.org/malaria.html

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4670856/

Building International Genomics Collaboration for Global Health Security

Genome science and technologies are transforming life sciences globally in many ways and becoming a highly desirable area for international collaboration to strengthen global health. The Genome Science Program at the Los Alamos National Laboratory is leveraging a long history of expertise in genomics research to assist multiple partner nations in advancing their genomics and bioinformatics capabilities. The capability development objectives focus on providing a molecular genomics-based scientific approach for pathogen detection, characterization, and biosurveillance applications. The general approaches include introduction of basic principles in genomics technologies, training on laboratory methodologies and bioinformatic analysis of resulting data, procurement, and installation of next-generation sequencing instruments, establishing bioinformatics software capabilities, and exploring collaborative applications of the genomics capabilities in public health. Genome centers have been established with public health and research institutions in the Republic of Georgia, Kingdom of Jordan, Uganda, and Gabon; broader collaborations in genomics applications have also been developed with research institutions in many other countries. Background and Introduction In early 2010, the prominent general scientific society in the US, the American Association for the Advancement of Science (AAAS), recognized that international scientific collaboration is critical to addressing complex societal challenges in health, agriculture, environment, energy, and global security, and organized a series of four conferences under the common theme of "International Engagement: Responsible Bioscience for a Safe and Secure Society." In a period of 2 years, these conferences examined the critical issues and explored the potentially sustainable approaches for collaboration between the scientists in the US and other countries, with the focus on the broader Middle Eastern and North African region. The major themes resulting from these conferences revealed a clear desire for cooperative research and development with responsible scientific practice and progressive action to enhance the infectious disease surveillance under the One Health concept ( 1 ). Although the AAAS conference series was focused on one region, the concept derived from the meeting and approaches that can be taken are undoubtedly applicable to many other countries and regions. Successful and sustainable partnerships that build upon mutual interests, complementary capabilities, and supporting infrastructure are essential to addressing complex global challenges, such as approaching the One Health concept. Scientists with interest and resources to initiate and maintain partnerships with colleagues in other countries, and who are able to overcome existing barriers to collaboration, serve as the foundation for successful international cooperation. Reducing global health security risk from the spread of dangerous infectious diseases, whether natural or manmade, is a shared priority among the worldwide public health communities. It has also become an overarching objective for international cooperative biothreat reduction and scientific engagement efforts. Engaging with and empowering infectious disease detection and surveillance capabilities in the partner countries enable a global network to reduce risk and enhance compliance with international guidelines, such as the International Health Regulations (from the World Health Organization in 2005) and those by World Organization for Animal Health (OIE). Extensive international collaborations have been developed to address global health security challenges, with activities, such as bioethics discussion, responsive scientific conduct, biorisk management, and field epidemiology, which have resulted in a positive global impact. A well-suited scientific approach complementary to the above activities is next-generation sequencing-enabled genomics research for global health security applications. Genomics is a relatively new scientific discipline but is fundamental to many approaches to health security. Aided by highly automated Next-Generation DNA Sequencing (NGS) technologies, the field has been advancing dramatically, both in the depth of understanding genome structure and function of living organisms, and in the breadth of applications in areas, such as medicine (disease mechanisms, diagnostics, and therapeutics) and agriculture ( 2 , 3 ). Using high-throughput DNA sequencing for pathogen detection during an infectious disease outbreak or for biosurveillance was previously slow, cost prohibitive, and required in-depth training and expertise. In the past decade, due to the advancement of highly automated instrument platforms, streamlined operational procedures and protocols, available reagent kits, and data analysis pipelines ( 4 ), NGS has been in effect democratized, expanding from central sequencing laboratories to individual institutions. As a result, genomics has become a highly desirable area that inspires broad international collaborations targeting diverse applications ( 5 ). Examples of global health security related applications include infectious disease diagnosis, previously unknown pathogens identification, sample archive characterization, and biosurveillance. Even though NGS technology has made high-throughput DNA sequencing more accessible, the existence of the automated instruments and streamlined procedures cannot replace the in-depth knowledge and expertise to use the instruments with high proficiency and accuracy; nor can the analytic algorithms analyze the experimental outcomes with precise interpretation. Without specialized training and technical expertise, these technology advancements cannot be fully utilized. In support of the overarching scientific engagement objectives, the Genome Science Program at the Los Alamos National Laboratory (LANL) has been leveraging our own capabilities to provide support to a growing number of partner countries on four continents in developing molecular genomic-based pathogen detection and characterization capabilities. We approach such development by first understanding partner country needs and gaps in building genomics and bioinformatics capacities. This is followed by scientific and technical training, facility building, and dissemination of pipelines and processes for microorganism genotypic characterization. Continuous subject matter expertise reachback support is provided to the collaborators. Our efforts in these areas enable the education of the next generation of life scientists in the partner countries, providing a robust foundation in genomic science through didactic and practical instruction, and the required technical infrastructure for genomics research by integrating sequencing and analytic capabilities. While these genomics capabilities are being developed, the collaborators start engaging in scientific collaborations utilizing NGS and other molecular techniques, such as real-time PCR and immunoassays. By applying these methods and correlating the findings, we aim to better understand emerging infectious diseases within the partner countries that are of global concern. The collaboration efforts will not only benefit the host countries and regions with state-of-the-art life science methods and technologies but also build a trusted international network with a shared passion in addressing global emerging infectious disease challenges. Such networks provide the potential for sharing resources, which is essential for approaching the One Health objective and reducing health threats globally. Strategy and Approach Our international genomics development and collaboration efforts have been built upon prior engagement activities carried out by other institutions and sponsored by various donors. We initially sought collaborations with countries that have been partners with our sponsors for several years, such as the Republic of Georgia and the Kingdom of Jordan. Many of the collaborating institutions already have well-established capabilities in molecular diagnostics and genetic analysis, and hold principle responsibilities in public and veterinary health in their respective countries. To effectively achieve the scientific engagement objectives, we have developed a phased strategy for establishing genomics laboratories in partner countries, followed by continuous technical support and cooperative scientific research to address some of the pressing public and veterinary health challenges. Phased Approaches for Capability Building Our phased approach for establishing genomics centers with partner countries provides both the starting momentum to build a capability and flexibility that is responsive to the evolution of technologies and business practices, which reduces risks in achieving sustainability. The four phases can be summarized as: (1) scientific engagement evaluation, (2) technical strategy and development planning, (3) infrastructure and technical capability building, and (4) instrument operation and bioinformatics training. One most critical consideration throughout all phases is the sustainability development. Depending on the existing capabilities and infrastructure readiness, we do not necessarily go through all phases with any given partner institution. The phased approach to engagement and sustainment is shown in Figure 1 . Figure 1 Phased approach, for NGS-based scientific engagement development . Phase I, Scientific Engagement Evaluation and Requirement Analysis In order to provide meaningful assistance to our partner countries and their particular institutions, it is essential to understand host country public health challenges and requirements, and to carefully consider what a genomics capability can accomplish to address their specific challenges. We first work directly with host nation scientists and leadership to understand existing capabilities and expertise in pathogen detection and characterization, urgent public and veterinary health issues, and to assess the technologies and capabilities compatible with genomics and bioinformatics. Essential areas of consideration include: host country objectives in genomic science and technology, desired near- and long-term outcomes, type and availability of samples to be processed, anticipated throughput and turnaround, potential future resources, anticipated implementation timeline, and a long-term sustainability vision. Other assessment areas include the existing technical expertise in laboratory operation and bioinformatics, laboratory infrastructure, computational infrastructure, and administrative skills. An initial development strategy is formulated based on a requirement analysis for the engagement partner to achieve full operational capability, including the approach to narrowing the gaps between the desirable end goals and the current status of these resources. Direct interactions with prominent regional life scientists, medical, public health, and agriculture professionals provide the collaborators with unique opportunities to identify areas for advancement that would significantly impact the science in the region or in the country; this allows us to build trust for a long-term collaborative relationship. The availability of advanced genomic science capabilities meets the foundational need that would impact almost all areas of the life sciences and presents opportunities for technology and economic development. During this phase, we start deliberating a long-term sustainability plan, based on the initial observations and development objectives. Phase II, Technical Strategy and Development Planning Once the requirements and objectives are defined, we begin formulating the technology strategy and development plan for a given institution to reach the target objectives. Planning includes personnel professional development, infrastructure preparation, NGS instrument acquisition, and initiating collaboration logistics including sample transportation and information sharing procedures. A technical action plan is generated that provides a framework of recommended protocols, workflows, and required training. In addition, the action plan provides recommended paths to address the gaps and challenges in the existing laboratory equipment, facility, and computational resources. We also generate a training plan to outline the tasks required for laboratory staff to obtain proficiency using specific operational protocols, pipelines, and processes. This includes sample preparation and management, instrument operation, sequence data analysis, and initial interpretation for biological significance. During this phase, we also introduce fundamental principles and basic techniques of molecular- and genomic-based approaches for pathogen and infectious disease detection and characterization, and assist partner countries to further define priorities and needs for enhancing these capabilities. Initial training in these topics is provided either at LANL and/or at the partner site. Phase III, Infrastructure and Technical Capability Development The engagement activities subsequently progress into preparation of the NGS laboratory facility, acquisition of laboratory instruments and computational equipment, dissemination of standardized operational protocols, and technical training for proficiency building. The engagement collaborators work closely to design and configure appropriate laboratory space and bioinformatics systems at the partner facility. In this phase, careful consideration of local constraints, logistics, and experience available at the engagement partner site are critical. The steps in this phase include Wet-lab and informatics hardware specification and laboratory setup . The specification is based on the existing facility infrastructure, equipment, expertise and target goals. It includes wet-lab operational protocols and bioinformatics systems required to accomplish the development objectives. Laboratory equipment required for various wet-lab processes, and informatics hardware and software to process data and perform analysis are specified and acquisition is initiated. In some cases, the acquisition is handled by LANL, and in other cases by a third-party integrating contractor. Laboratory setup is performed by a combination of vendors, partner staff, and LANL staff. Good laboratory practice (GLP) is used as a guiding principle to ensure high quality experimental output, minimize potential cross-contamination, and protect the laboratory personnel. Deploy wet-lab processes . We work with engagement partners to deploy standardized wet-lab protocols and processes. Example protocols include DNA library preparation for bacterial isolate sequencing, RNA library preparation for viral sample sequencing, targeted microbial sequencing protocols, whole genome sequencing (WGS), and general Illumina MiSeq platform sequencing procedures. Implementation of GLP is stressed during this phase, and training in GLP is delivered throughout all relevant phases. Deploy informatics pipelines . Informatics pipelines coordinated with wet-lab protocols are provided to the partner facility. Examples include initial sequencing data quality control and reporting, data quality treatment, genomic assembly, reference-based assembly, and metagenomic analysis. Phase IV, Training on Instrument Operation and Bioinformatics Processing A strong foundation built through training is a vital component of the entire engagement activity. The collaborators work closely to coordinate training sessions in both the US and on-site in the host country facility. The primary goal is to instill a strong foundation in both scientific principles and operational processes during the exchange. On-site training focuses on development and implementation of sample preparation, sequencing library generation, genome sequencing, and sequencing data analysis procedures in compliance with GLP regulations. Great attention is paid to hands-on troubleshooting, and additional training is provided as needed. Training in this phase is an avenue to disseminate best biosafety and biosecurity practices. Throughout the exchange and following period, the US scientists monitor partner performance and provide feedback to the sponsors and partner country scientists. Bioinformatics reachback assistance is provided to support current mission and long-term development of sustainable approaches. Assistance is also provided to the partners in the development and execution of research projects that utilizes the capability. Updating or expanding protocols and processes and providing new versions to the engagement partners are a continuous practice. Sustainability Development The sustained utilization of the new genomics capability and continued service to society is the ultimate goal for the genomics centers being developed. To support sustainable development, we assist the institutions in identifying research and operational areas, such as training their fellow scientists and public health practitioners, conducting hypothesis-driven research, and providing services to community. The basic research, applied research, and operational areas that will benefit from advanced genomics science are extremely broad, virtually in all life sciences and related fields of practice. Priorities are identified based on research activities, public health responsibilities, and perceived societal significance. These priority areas include emerging or unknown pathogenic microorganism identification, molecular epidemiology, phylogenetic characterization of infectious agents, and infectious disease surveillance. In addition, genomics-assisted design and development of new diagnostic signatures and assays, and their applications in veterinary and agricultural practices have become important areas of engagement. After deploying genomics technologies at a partner site and delivering initial training, successful capability establishment at the host site typically requires on going assistance. LANL provides reachback support to the engagement partners, by delivering remote, near real-time technical advice on wet-lab, informatics, and data analysis. Laboratory support includes advice on sample preparation procedures and protocols, and recommendation of specific reagents or kits to use. Informatics-focused reachback support can be especially important for some partners, as they may have limited existing informatics capability to draw on. Reachback on data analysis is very common, and can usually be a point of collaboration, from sequencing data quality evaluation to interpreting biological significance. Internet connectivity is very important for these purposes, and can sometimes be the rate-limiting factor. Scientists at partner institutions are regularly invited to attend and contribute to the annual Sequencing, Finishing, and Analysis in the Future (SFAF) meetings that LANL has hosted for the past decade [SFAF ( 6 )]. This conference provides an opportunity for the engagement partners to gain up-to-date knowledge on new techniques and technologies, and to present their own research results. Since 2013, LANL has hosted annual NGS training workshop in Los Alamos for engagement partners. The workshop includes principles of NGS and hands-on training in both laboratory techniques and bioinformatics. These opportunities provide avenues to broaden expertise and our collaborations with international partners. Phased Approaches for Capability Building Our phased approach for establishing genomics centers with partner countries provides both the starting momentum to build a capability and flexibility that is responsive to the evolution of technologies and business practices, which reduces risks in achieving sustainability. The four phases can be summarized as: (1) scientific engagement evaluation, (2) technical strategy and development planning, (3) infrastructure and technical capability building, and (4) instrument operation and bioinformatics training. One most critical consideration throughout all phases is the sustainability development. Depending on the existing capabilities and infrastructure readiness, we do not necessarily go through all phases with any given partner institution. The phased approach to engagement and sustainment is shown in Figure 1 . Figure 1 Phased approach, for NGS-based scientific engagement development . Phase I, Scientific Engagement Evaluation and Requirement Analysis In order to provide meaningful assistance to our partner countries and their particular institutions, it is essential to understand host country public health challenges and requirements, and to carefully consider what a genomics capability can accomplish to address their specific challenges. We first work directly with host nation scientists and leadership to understand existing capabilities and expertise in pathogen detection and characterization, urgent public and veterinary health issues, and to assess the technologies and capabilities compatible with genomics and bioinformatics. Essential areas of consideration include: host country objectives in genomic science and technology, desired near- and long-term outcomes, type and availability of samples to be processed, anticipated throughput and turnaround, potential future resources, anticipated implementation timeline, and a long-term sustainability vision. Other assessment areas include the existing technical expertise in laboratory operation and bioinformatics, laboratory infrastructure, computational infrastructure, and administrative skills. An initial development strategy is formulated based on a requirement analysis for the engagement partner to achieve full operational capability, including the approach to narrowing the gaps between the desirable end goals and the current status of these resources. Direct interactions with prominent regional life scientists, medical, public health, and agriculture professionals provide the collaborators with unique opportunities to identify areas for advancement that would significantly impact the science in the region or in the country; this allows us to build trust for a long-term collaborative relationship. The availability of advanced genomic science capabilities meets the foundational need that would impact almost all areas of the life sciences and presents opportunities for technology and economic development. During this phase, we start deliberating a long-term sustainability plan, based on the initial observations and development objectives. Phase II, Technical Strategy and Development Planning Once the requirements and objectives are defined, we begin formulating the technology strategy and development plan for a given institution to reach the target objectives. Planning includes personnel professional development, infrastructure preparation, NGS instrument acquisition, and initiating collaboration logistics including sample transportation and information sharing procedures. A technical action plan is generated that provides a framework of recommended protocols, workflows, and required training. In addition, the action plan provides recommended paths to address the gaps and challenges in the existing laboratory equipment, facility, and computational resources. We also generate a training plan to outline the tasks required for laboratory staff to obtain proficiency using specific operational protocols, pipelines, and processes. This includes sample preparation and management, instrument operation, sequence data analysis, and initial interpretation for biological significance. During this phase, we also introduce fundamental principles and basic techniques of molecular- and genomic-based approaches for pathogen and infectious disease detection and characterization, and assist partner countries to further define priorities and needs for enhancing these capabilities. Initial training in these topics is provided either at LANL and/or at the partner site. Phase III, Infrastructure and Technical Capability Development The engagement activities subsequently progress into preparation of the NGS laboratory facility, acquisition of laboratory instruments and computational equipment, dissemination of standardized operational protocols, and technical training for proficiency building. The engagement collaborators work closely to design and configure appropriate laboratory space and bioinformatics systems at the partner facility. In this phase, careful consideration of local constraints, logistics, and experience available at the engagement partner site are critical. The steps in this phase include Wet-lab and informatics hardware specification and laboratory setup . The specification is based on the existing facility infrastructure, equipment, expertise and target goals. It includes wet-lab operational protocols and bioinformatics systems required to accomplish the development objectives. Laboratory equipment required for various wet-lab processes, and informatics hardware and software to process data and perform analysis are specified and acquisition is initiated. In some cases, the acquisition is handled by LANL, and in other cases by a third-party integrating contractor. Laboratory setup is performed by a combination of vendors, partner staff, and LANL staff. Good laboratory practice (GLP) is used as a guiding principle to ensure high quality experimental output, minimize potential cross-contamination, and protect the laboratory personnel. Deploy wet-lab processes . We work with engagement partners to deploy standardized wet-lab protocols and processes. Example protocols include DNA library preparation for bacterial isolate sequencing, RNA library preparation for viral sample sequencing, targeted microbial sequencing protocols, whole genome sequencing (WGS), and general Illumina MiSeq platform sequencing procedures. Implementation of GLP is stressed during this phase, and training in GLP is delivered throughout all relevant phases. Deploy informatics pipelines . Informatics pipelines coordinated with wet-lab protocols are provided to the partner facility. Examples include initial sequencing data quality control and reporting, data quality treatment, genomic assembly, reference-based assembly, and metagenomic analysis. Phase IV, Training on Instrument Operation and Bioinformatics Processing A strong foundation built through training is a vital component of the entire engagement activity. The collaborators work closely to coordinate training sessions in both the US and on-site in the host country facility. The primary goal is to instill a strong foundation in both scientific principles and operational processes during the exchange. On-site training focuses on development and implementation of sample preparation, sequencing library generation, genome sequencing, and sequencing data analysis procedures in compliance with GLP regulations. Great attention is paid to hands-on troubleshooting, and additional training is provided as needed. Training in this phase is an avenue to disseminate best biosafety and biosecurity practices. Throughout the exchange and following period, the US scientists monitor partner performance and provide feedback to the sponsors and partner country scientists. Bioinformatics reachback assistance is provided to support current mission and long-term development of sustainable approaches. Assistance is also provided to the partners in the development and execution of research projects that utilizes the capability. Updating or expanding protocols and processes and providing new versions to the engagement partners are a continuous practice. Phase I, Scientific Engagement Evaluation and Requirement Analysis In order to provide meaningful assistance to our partner countries and their particular institutions, it is essential to understand host country public health challenges and requirements, and to carefully consider what a genomics capability can accomplish to address their specific challenges. We first work directly with host nation scientists and leadership to understand existing capabilities and expertise in pathogen detection and characterization, urgent public and veterinary health issues, and to assess the technologies and capabilities compatible with genomics and bioinformatics. Essential areas of consideration include: host country objectives in genomic science and technology, desired near- and long-term outcomes, type and availability of samples to be processed, anticipated throughput and turnaround, potential future resources, anticipated implementation timeline, and a long-term sustainability vision. Other assessment areas include the existing technical expertise in laboratory operation and bioinformatics, laboratory infrastructure, computational infrastructure, and administrative skills. An initial development strategy is formulated based on a requirement analysis for the engagement partner to achieve full operational capability, including the approach to narrowing the gaps between the desirable end goals and the current status of these resources. Direct interactions with prominent regional life scientists, medical, public health, and agriculture professionals provide the collaborators with unique opportunities to identify areas for advancement that would significantly impact the science in the region or in the country; this allows us to build trust for a long-term collaborative relationship. The availability of advanced genomic science capabilities meets the foundational need that would impact almost all areas of the life sciences and presents opportunities for technology and economic development. During this phase, we start deliberating a long-term sustainability plan, based on the initial observations and development objectives. Phase II, Technical Strategy and Development Planning Once the requirements and objectives are defined, we begin formulating the technology strategy and development plan for a given institution to reach the target objectives. Planning includes personnel professional development, infrastructure preparation, NGS instrument acquisition, and initiating collaboration logistics including sample transportation and information sharing procedures. A technical action plan is generated that provides a framework of recommended protocols, workflows, and required training. In addition, the action plan provides recommended paths to address the gaps and challenges in the existing laboratory equipment, facility, and computational resources. We also generate a training plan to outline the tasks required for laboratory staff to obtain proficiency using specific operational protocols, pipelines, and processes. This includes sample preparation and management, instrument operation, sequence data analysis, and initial interpretation for biological significance. During this phase, we also introduce fundamental principles and basic techniques of molecular- and genomic-based approaches for pathogen and infectious disease detection and characterization, and assist partner countries to further define priorities and needs for enhancing these capabilities. Initial training in these topics is provided either at LANL and/or at the partner site. Phase III, Infrastructure and Technical Capability Development The engagement activities subsequently progress into preparation of the NGS laboratory facility, acquisition of laboratory instruments and computational equipment, dissemination of standardized operational protocols, and technical training for proficiency building. The engagement collaborators work closely to design and configure appropriate laboratory space and bioinformatics systems at the partner facility. In this phase, careful consideration of local constraints, logistics, and experience available at the engagement partner site are critical. The steps in this phase include Wet-lab and informatics hardware specification and laboratory setup . The specification is based on the existing facility infrastructure, equipment, expertise and target goals. It includes wet-lab operational protocols and bioinformatics systems required to accomplish the development objectives. Laboratory equipment required for various wet-lab processes, and informatics hardware and software to process data and perform analysis are specified and acquisition is initiated. In some cases, the acquisition is handled by LANL, and in other cases by a third-party integrating contractor. Laboratory setup is performed by a combination of vendors, partner staff, and LANL staff. Good laboratory practice (GLP) is used as a guiding principle to ensure high quality experimental output, minimize potential cross-contamination, and protect the laboratory personnel. Deploy wet-lab processes . We work with engagement partners to deploy standardized wet-lab protocols and processes. Example protocols include DNA library preparation for bacterial isolate sequencing, RNA library preparation for viral sample sequencing, targeted microbial sequencing protocols, whole genome sequencing (WGS), and general Illumina MiSeq platform sequencing procedures. Implementation of GLP is stressed during this phase, and training in GLP is delivered throughout all relevant phases. Deploy informatics pipelines . Informatics pipelines coordinated with wet-lab protocols are provided to the partner facility. Examples include initial sequencing data quality control and reporting, data quality treatment, genomic assembly, reference-based assembly, and metagenomic analysis. Phase IV, Training on Instrument Operation and Bioinformatics Processing A strong foundation built through training is a vital component of the entire engagement activity. The collaborators work closely to coordinate training sessions in both the US and on-site in the host country facility. The primary goal is to instill a strong foundation in both scientific principles and operational processes during the exchange. On-site training focuses on development and implementation of sample preparation, sequencing library generation, genome sequencing, and sequencing data analysis procedures in compliance with GLP regulations. Great attention is paid to hands-on troubleshooting, and additional training is provided as needed. Training in this phase is an avenue to disseminate best biosafety and biosecurity practices. Throughout the exchange and following period, the US scientists monitor partner performance and provide feedback to the sponsors and partner country scientists. Bioinformatics reachback assistance is provided to support current mission and long-term development of sustainable approaches. Assistance is also provided to the partners in the development and execution of research projects that utilizes the capability. Updating or expanding protocols and processes and providing new versions to the engagement partners are a continuous practice. Sustainability Development The sustained utilization of the new genomics capability and continued service to society is the ultimate goal for the genomics centers being developed. To support sustainable development, we assist the institutions in identifying research and operational areas, such as training their fellow scientists and public health practitioners, conducting hypothesis-driven research, and providing services to community. The basic research, applied research, and operational areas that will benefit from advanced genomics science are extremely broad, virtually in all life sciences and related fields of practice. Priorities are identified based on research activities, public health responsibilities, and perceived societal significance. These priority areas include emerging or unknown pathogenic microorganism identification, molecular epidemiology, phylogenetic characterization of infectious agents, and infectious disease surveillance. In addition, genomics-assisted design and development of new diagnostic signatures and assays, and their applications in veterinary and agricultural practices have become important areas of engagement. After deploying genomics technologies at a partner site and delivering initial training, successful capability establishment at the host site typically requires on going assistance. LANL provides reachback support to the engagement partners, by delivering remote, near real-time technical advice on wet-lab, informatics, and data analysis. Laboratory support includes advice on sample preparation procedures and protocols, and recommendation of specific reagents or kits to use. Informatics-focused reachback support can be especially important for some partners, as they may have limited existing informatics capability to draw on. Reachback on data analysis is very common, and can usually be a point of collaboration, from sequencing data quality evaluation to interpreting biological significance. Internet connectivity is very important for these purposes, and can sometimes be the rate-limiting factor. Scientists at partner institutions are regularly invited to attend and contribute to the annual Sequencing, Finishing, and Analysis in the Future (SFAF) meetings that LANL has hosted for the past decade [SFAF ( 6 )]. This conference provides an opportunity for the engagement partners to gain up-to-date knowledge on new techniques and technologies, and to present their own research results. Since 2013, LANL has hosted annual NGS training workshop in Los Alamos for engagement partners. The workshop includes principles of NGS and hands-on training in both laboratory techniques and bioinformatics. These opportunities provide avenues to broaden expertise and our collaborations with international partners. Results We have successfully established genome centers with partner institutions in four different countries: Republic of Georgia, Kingdom of Jordan, Uganda, and Gabon, and developed extensive genomic research collaboration with several other countries. These genome centers are provided with a standardized sequencing platform, standard operating protocols and GLP training, and bioinformatics analysis tools and associated computational hardware. Standardized Platforms and Processes At LANL, we have extensive experience with most NGS platforms. During the past decade, we have acquired every major NGS instrument to conduct scientific research and to provide sequencing service and training to our collaborators. The Illumina MiSeq instrument was selected as the sequencing platform of choice for the international genomics engagement activities for its compact physical size, accompanying reagent kits, standardized operation procedures, high quality data output, and broad applications ( 4 , 7 ). We have developed and disseminated standardized protocols for sample preparation, quality control, sequencing, and data management protocols. The standardized protocols require a few other supporting laboratory instruments for DNA fragmentation, quality control, quantification of DNA fragments, and quantitative PCR, which are also provided to our partner facilities. The general process flow is summarized in Figure 2 . Figure 2 The standard NGS laboratory and bioinformatics pipeline setting deployed to the partner laboratories . Standard computer software and hardware have also been specified to simplify installation and ongoing support. For computational resources, the CLC Genomics Workbench (Qiagen) was selected from several commercial options as an analysis and visualization tool. This software package provides an integrated environment with most types of tools necessary for our partners to analyze sequencing data generated by MiSeq. In-house developed bioinformatics tools are also disseminated to the partner laboratories. The LANL developed EDGE Bioinformatics ( 8 ) is an analytic tool that integrates a selection of open source tools accessed by a web-based interface. EDGE has been deployed to several of our partner facilities and has proven to be an easy-to-use tool for rapid analysis of NGS data, requiring little specialized bioinformatics expertise. The computational hardware provided to our partners is fully sufficient to process sequencing data generated by the MiSeq platform at the partner's site. This approach to deploying and training on a repertoire of technology and equipment has enabled us to franchise genomics centers with standardized procedures for our partners. The training and support we can provide is greatly enabled by this standardization. Current Collaborations We have successfully established genome centers with four partner institutions in Georgia, Jordan, Uganda, and Gabon (Figure 3 ). These genome centers are provided with a standardized sequencing platform, standard operation and GLP protocols, and bioinformatics analysis tools and associated computational hardware. We travel to each site and assist with setup and configuration for laboratory equipment and computational resources. On-site training for both laboratory and bioinformatics are also provided during these visits. We typically guide the partners to perform one or more sequencing runs on the newly provided equipment while we are on-site. A brief description of each genome center is provided in Section " Established Genome Centers " below. In addition to establishing these genome centers, we provide training and engage in collaborative research with other institutions that either already have NGS capability or are on a path to acquire it. This type of collaboration has taken place in nine different countries (Figure 3 ), and allows the partners to broaden international collaboration networks and to exercise and enhance local capabilities. These collaborations bring together complementary skill sets and resources, benefiting all participating parties and paving a good path to improved global health. Figure 3 Partner countries . Red marks indicate genome centers established by our program. Yellow marks countries that are in collaborations focusing on training and research. Established Genome Centers Republic of Georgia: Genomics Center at the National Center for Disease Control and Public Health The National Center for Disease Control and Public Health of Georgia (NCDC) was originally established in 1937 as the Anti-Plague Station, investigating species and the spread of Yersinia pestis in Georgia. After a tularemia outbreak in Southern Georgia in 1946, the institutional mission scope was expanded to include the investigation of tularemia and subsequently other infectious diseases, such as anthrax. The institution has since become the leading epidemiological control organization in Georgia, and later established the national reference laboratory now known as the R. G. Lugar Center for Public Health Research in 2013. The genome center at Georgian NCDC was established in 2012. Extensive training took place for the Georgian scientists at both LANL and NCDC on NGS sample preparation protocols, MiSeq operations, and bioinformatics analysis of sequencing data. Reachback support in the form of teleconference calls, emails, and remote logins has been delivered to the Georgians on a regular basis. Today, the NCDC genome center is fully functional and more than 10 staffs have been trained and are regularly using the capabilities to conduct scientific research in pathogen virulence characterization and biosurveillance for infectious diseases. LANL and NCDC scientists have also embarked on joint research projects utilizing the new NGS capability. An example of research activities is highlighted in Section " Initial Cooperative Research Highlights ," and a new project has been initiated as a result of a competitive proposal process. Kingdom of Jordan: Jordan University of Science and Technology The Princess Haya Biotechnology Center (PHBC) at the Jordan University of Science and Technology (JUST) was established in 2005. The Center represents the state-of-the-art biotechnology in clinical applications, supported by Princess Haya Bint Al Hussein, with a primary responsibility directed toward supporting the Jordanian medical and scientific communities. It is hosted at the King Abdullah University Hospital and is equipped with modern facilities for carrying out research, diagnostic laboratory testing and training in areas of genomics, proteomics, metabolomics, hematology, and other clinical areas. In 2012, LANL initiated collaborations with the PHBC to develop an NGS genomics capability. Applying the phased approach detailed in Section " STRATEGY AND APPROACH ," a functional NGS facility for genomics research and training was established in early 2015. Leveraging our experience with the Georgian project, we specified laboratory equipment and computational resources to match the capability target, level of PHBC staff expertise, and existing PHBC laboratory resources. During 2013 through 2015, extensive training and traveling took place for JUST staff to receive GLP, laboratory protocols, and bioinformatics analysis trainings, at both LANL and JUST. Currently, joint research projects are being planned to exercise the genomics capability and further train JUST staff. Uganda: The Uganda Virus Research Institute Uganda Virus Research Institute (UVRI) is a Ugandan national reference laboratory for various viral diseases including hemorrhagic fevers, HIV, and Influenza. An NGS capability based on the MiSeq platform is being incorporated into laboratory operations at UVRI, especially during epidemic outbreak investigations for enhanced pathogen detection. In August 2013, LANL staff traveled to Uganda for the initial evaluation of UVRI facilities and expertise, the Phase I in our overall approach. New construction at UVRI was beginning on the space that would become the home of the genome center. Recommendations on infrastructure details as a fully functional genomics laboratory were quickly provided and implemented. Detailed planning for the genome center development completed in 2013. During 2014, facility construction was completed and laboratory equipment was delivered. In October 2014, LANL scientists traveled to Uganda to assist UVRI staff in setting up the genome center and to deliver the first round of on-site training to UVRI staff. LANL staff returned to UVRI in February 2015 to deliver additional training in laboratory protocols and bioinformatics analysis. During this visit, the genome center started sequencing and analyzing several clinical samples of unknown viral diseases. Gabon: International Center for Medical Research in Franceville Los Alamos National Laboratory is working with a research institute in Gabon, the International Center for Medical Research in Franceville (CIRMF) to enhance their genomics capabilities. CIRMF was founded in 1979 to conduct research in fertility, immunology, pathology, and microbiology. Today, CIRMF has refocused almost exclusively on infectious diseases with an emphasis on microbiological monitoring and assistance to public health. LANL is assisting the CIRMF to set up a genomics center to achieve these objectives. In February 2015, LANL staff traveled to Franceville to provide technical assistance to the facility and staff, to assist in addressing technical challenges in operating a newly acquired MiSeq, and to set up a new bioinformatics system that we assisted CIRMF in acquiring. In this engagement, the early evaluation and planning phases were unnecessary, as the CIRMF was already in the process of developing a genomics capability. An evaluation of the current state and the level of expertise were performed and recommendations for additional equipment and training were given. These recommendations are now being implemented. Initial Cooperative Research Highlights Through these international partnerships, extensive collaboration planning and executions are being carried out. After 2–3 years of collaboration, research efforts have started producing initial results at various centers. A few examples are listed below: CRISPR Analysis of Yersinia pestis Strains from Georgia Three Y. pestis strains isolated from two historical natural plague sites of Georgia were analyzed based on their CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) features. In the Y. pestis genome, three CRISPR elements YPa, YPb, and YPc are found at three distinct loci and presently 137 spacer sequences are known ( 9 ). These CRISPR elements are highly correlated with the region and location of isolation, potentially providing important genotyping and evolutionary information, which could help to trace the source of outbreaks. The MiSeq platform at the Georgian NCDC Lugar Center was used to conduct WGS of the isolates. The Georgian scientists have gained sufficient analytical skills through training, and successfully applied the two bioinformatic pipelines that have been deployed (CLCBio Genomics Workbench and EDGE Bioinformatics) to perform the analysis. MERS-CoV Patient Sample Analysis In 2013, an outbreak of MERS-CoV occurred in the Middle East, including Jordan ( 10 , 11 ). Two individuals with severe respiratory symptoms were suspected of having been infected by the virus were admitted to the King Abdullah University Hospital; the throat swabs were sent to PHBC for analysis. One of the patients did not survive after hospital admission. Total RNA was isolated by PHBC staff, and samples were sequenced with the MiSeq platform and supplemented with additional Illumina HiSeq sequencing. The presence of MERS-CoV virus was confirmed in both samples using NGS. Even though the samples were degraded, the virus was present in sufficient abundance for us to obtain the entire viral genome from one of the samples, revealing that it was related to the original outbreak in Saudi Arabia. This type of high-resolution analysis of clinical samples can now be achieved at JUST by the trained local scientists and laboratory staff. It will enable faster detection and more detailed tracking of future outbreaks, and reach further research objectives. RNA Virus Sequencing and Analysis at the UVRI Genome Center After two rounds of training, the UVRI staff analyzed several blood samples from patients presenting with various viral hemorrhagic fever (VHF) symptoms. RNA was extracted and converted to sequencing libraries for sequencing on the UVRI MiSeq instrument. The URVI scientists applied the standardized protocols received during the laboratory setup and training session to perform an initial quality control check, quantification, RNA sample preparation, and concentration measurement. Sequencing library preparation, validation, and quantification were performed using standard protocols provided by LANL, and NGS was performed on the UVRI MiSeq. The Ugandan scientists successfully applied the two bioinformatic pipelines that have been deployed (CLCBio Genomics Workbench and EDGE Bioinformatics) to perform the sequencing data analysis. While no hemorrhagic fever viruses were present in the samples, the analyses revealed some potential bacterial pathogens that may have caused the symptoms. Our collaboration partners continue to actively explore the application of NGS to their local needs. Research ideas include the characterization of samples from long-term archives. This would include the application of NGS to the investigation of past unexplained illnesses, characterization of pathogens from geographical areas across different time periods, and possibly the identification of previously unknown pathogens to the local area. Studying the zoonotic diseases endemic to the partner countries is also of high interest. And many partners are interested in developing a quality reference database of pathogen strains within their purview. Application to clinical, animal, and agricultural samples is a common theme. Standardized Platforms and Processes At LANL, we have extensive experience with most NGS platforms. During the past decade, we have acquired every major NGS instrument to conduct scientific research and to provide sequencing service and training to our collaborators. The Illumina MiSeq instrument was selected as the sequencing platform of choice for the international genomics engagement activities for its compact physical size, accompanying reagent kits, standardized operation procedures, high quality data output, and broad applications ( 4 , 7 ). We have developed and disseminated standardized protocols for sample preparation, quality control, sequencing, and data management protocols. The standardized protocols require a few other supporting laboratory instruments for DNA fragmentation, quality control, quantification of DNA fragments, and quantitative PCR, which are also provided to our partner facilities. The general process flow is summarized in Figure 2 . Figure 2 The standard NGS laboratory and bioinformatics pipeline setting deployed to the partner laboratories . Standard computer software and hardware have also been specified to simplify installation and ongoing support. For computational resources, the CLC Genomics Workbench (Qiagen) was selected from several commercial options as an analysis and visualization tool. This software package provides an integrated environment with most types of tools necessary for our partners to analyze sequencing data generated by MiSeq. In-house developed bioinformatics tools are also disseminated to the partner laboratories. The LANL developed EDGE Bioinformatics ( 8 ) is an analytic tool that integrates a selection of open source tools accessed by a web-based interface. EDGE has been deployed to several of our partner facilities and has proven to be an easy-to-use tool for rapid analysis of NGS data, requiring little specialized bioinformatics expertise. The computational hardware provided to our partners is fully sufficient to process sequencing data generated by the MiSeq platform at the partner's site. This approach to deploying and training on a repertoire of technology and equipment has enabled us to franchise genomics centers with standardized procedures for our partners. The training and support we can provide is greatly enabled by this standardization. Current Collaborations We have successfully established genome centers with four partner institutions in Georgia, Jordan, Uganda, and Gabon (Figure 3 ). These genome centers are provided with a standardized sequencing platform, standard operation and GLP protocols, and bioinformatics analysis tools and associated computational hardware. We travel to each site and assist with setup and configuration for laboratory equipment and computational resources. On-site training for both laboratory and bioinformatics are also provided during these visits. We typically guide the partners to perform one or more sequencing runs on the newly provided equipment while we are on-site. A brief description of each genome center is provided in Section " Established Genome Centers " below. In addition to establishing these genome centers, we provide training and engage in collaborative research with other institutions that either already have NGS capability or are on a path to acquire it. This type of collaboration has taken place in nine different countries (Figure 3 ), and allows the partners to broaden international collaboration networks and to exercise and enhance local capabilities. These collaborations bring together complementary skill sets and resources, benefiting all participating parties and paving a good path to improved global health. Figure 3 Partner countries . Red marks indicate genome centers established by our program. Yellow marks countries that are in collaborations focusing on training and research. Established Genome Centers Republic of Georgia: Genomics Center at the National Center for Disease Control and Public Health The National Center for Disease Control and Public Health of Georgia (NCDC) was originally established in 1937 as the Anti-Plague Station, investigating species and the spread of Yersinia pestis in Georgia. After a tularemia outbreak in Southern Georgia in 1946, the institutional mission scope was expanded to include the investigation of tularemia and subsequently other infectious diseases, such as anthrax. The institution has since become the leading epidemiological control organization in Georgia, and later established the national reference laboratory now known as the R. G. Lugar Center for Public Health Research in 2013. The genome center at Georgian NCDC was established in 2012. Extensive training took place for the Georgian scientists at both LANL and NCDC on NGS sample preparation protocols, MiSeq operations, and bioinformatics analysis of sequencing data. Reachback support in the form of teleconference calls, emails, and remote logins has been delivered to the Georgians on a regular basis. Today, the NCDC genome center is fully functional and more than 10 staffs have been trained and are regularly using the capabilities to conduct scientific research in pathogen virulence characterization and biosurveillance for infectious diseases. LANL and NCDC scientists have also embarked on joint research projects utilizing the new NGS capability. An example of research activities is highlighted in Section " Initial Cooperative Research Highlights ," and a new project has been initiated as a result of a competitive proposal process. Kingdom of Jordan: Jordan University of Science and Technology The Princess Haya Biotechnology Center (PHBC) at the Jordan University of Science and Technology (JUST) was established in 2005. The Center represents the state-of-the-art biotechnology in clinical applications, supported by Princess Haya Bint Al Hussein, with a primary responsibility directed toward supporting the Jordanian medical and scientific communities. It is hosted at the King Abdullah University Hospital and is equipped with modern facilities for carrying out research, diagnostic laboratory testing and training in areas of genomics, proteomics, metabolomics, hematology, and other clinical areas. In 2012, LANL initiated collaborations with the PHBC to develop an NGS genomics capability. Applying the phased approach detailed in Section " STRATEGY AND APPROACH ," a functional NGS facility for genomics research and training was established in early 2015. Leveraging our experience with the Georgian project, we specified laboratory equipment and computational resources to match the capability target, level of PHBC staff expertise, and existing PHBC laboratory resources. During 2013 through 2015, extensive training and traveling took place for JUST staff to receive GLP, laboratory protocols, and bioinformatics analysis trainings, at both LANL and JUST. Currently, joint research projects are being planned to exercise the genomics capability and further train JUST staff. Uganda: The Uganda Virus Research Institute Uganda Virus Research Institute (UVRI) is a Ugandan national reference laboratory for various viral diseases including hemorrhagic fevers, HIV, and Influenza. An NGS capability based on the MiSeq platform is being incorporated into laboratory operations at UVRI, especially during epidemic outbreak investigations for enhanced pathogen detection. In August 2013, LANL staff traveled to Uganda for the initial evaluation of UVRI facilities and expertise, the Phase I in our overall approach. New construction at UVRI was beginning on the space that would become the home of the genome center. Recommendations on infrastructure details as a fully functional genomics laboratory were quickly provided and implemented. Detailed planning for the genome center development completed in 2013. During 2014, facility construction was completed and laboratory equipment was delivered. In October 2014, LANL scientists traveled to Uganda to assist UVRI staff in setting up the genome center and to deliver the first round of on-site training to UVRI staff. LANL staff returned to UVRI in February 2015 to deliver additional training in laboratory protocols and bioinformatics analysis. During this visit, the genome center started sequencing and analyzing several clinical samples of unknown viral diseases. Gabon: International Center for Medical Research in Franceville Los Alamos National Laboratory is working with a research institute in Gabon, the International Center for Medical Research in Franceville (CIRMF) to enhance their genomics capabilities. CIRMF was founded in 1979 to conduct research in fertility, immunology, pathology, and microbiology. Today, CIRMF has refocused almost exclusively on infectious diseases with an emphasis on microbiological monitoring and assistance to public health. LANL is assisting the CIRMF to set up a genomics center to achieve these objectives. In February 2015, LANL staff traveled to Franceville to provide technical assistance to the facility and staff, to assist in addressing technical challenges in operating a newly acquired MiSeq, and to set up a new bioinformatics system that we assisted CIRMF in acquiring. In this engagement, the early evaluation and planning phases were unnecessary, as the CIRMF was already in the process of developing a genomics capability. An evaluation of the current state and the level of expertise were performed and recommendations for additional equipment and training were given. These recommendations are now being implemented. Republic of Georgia: Genomics Center at the National Center for Disease Control and Public Health The National Center for Disease Control and Public Health of Georgia (NCDC) was originally established in 1937 as the Anti-Plague Station, investigating species and the spread of Yersinia pestis in Georgia. After a tularemia outbreak in Southern Georgia in 1946, the institutional mission scope was expanded to include the investigation of tularemia and subsequently other infectious diseases, such as anthrax. The institution has since become the leading epidemiological control organization in Georgia, and later established the national reference laboratory now known as the R. G. Lugar Center for Public Health Research in 2013. The genome center at Georgian NCDC was established in 2012. Extensive training took place for the Georgian scientists at both LANL and NCDC on NGS sample preparation protocols, MiSeq operations, and bioinformatics analysis of sequencing data. Reachback support in the form of teleconference calls, emails, and remote logins has been delivered to the Georgians on a regular basis. Today, the NCDC genome center is fully functional and more than 10 staffs have been trained and are regularly using the capabilities to conduct scientific research in pathogen virulence characterization and biosurveillance for infectious diseases. LANL and NCDC scientists have also embarked on joint research projects utilizing the new NGS capability. An example of research activities is highlighted in Section " Initial Cooperative Research Highlights ," and a new project has been initiated as a result of a competitive proposal process. Kingdom of Jordan: Jordan University of Science and Technology The Princess Haya Biotechnology Center (PHBC) at the Jordan University of Science and Technology (JUST) was established in 2005. The Center represents the state-of-the-art biotechnology in clinical applications, supported by Princess Haya Bint Al Hussein, with a primary responsibility directed toward supporting the Jordanian medical and scientific communities. It is hosted at the King Abdullah University Hospital and is equipped with modern facilities for carrying out research, diagnostic laboratory testing and training in areas of genomics, proteomics, metabolomics, hematology, and other clinical areas. In 2012, LANL initiated collaborations with the PHBC to develop an NGS genomics capability. Applying the phased approach detailed in Section " STRATEGY AND APPROACH ," a functional NGS facility for genomics research and training was established in early 2015. Leveraging our experience with the Georgian project, we specified laboratory equipment and computational resources to match the capability target, level of PHBC staff expertise, and existing PHBC laboratory resources. During 2013 through 2015, extensive training and traveling took place for JUST staff to receive GLP, laboratory protocols, and bioinformatics analysis trainings, at both LANL and JUST. Currently, joint research projects are being planned to exercise the genomics capability and further train JUST staff. Uganda: The Uganda Virus Research Institute Uganda Virus Research Institute (UVRI) is a Ugandan national reference laboratory for various viral diseases including hemorrhagic fevers, HIV, and Influenza. An NGS capability based on the MiSeq platform is being incorporated into laboratory operations at UVRI, especially during epidemic outbreak investigations for enhanced pathogen detection. In August 2013, LANL staff traveled to Uganda for the initial evaluation of UVRI facilities and expertise, the Phase I in our overall approach. New construction at UVRI was beginning on the space that would become the home of the genome center. Recommendations on infrastructure details as a fully functional genomics laboratory were quickly provided and implemented. Detailed planning for the genome center development completed in 2013. During 2014, facility construction was completed and laboratory equipment was delivered. In October 2014, LANL scientists traveled to Uganda to assist UVRI staff in setting up the genome center and to deliver the first round of on-site training to UVRI staff. LANL staff returned to UVRI in February 2015 to deliver additional training in laboratory protocols and bioinformatics analysis. During this visit, the genome center started sequencing and analyzing several clinical samples of unknown viral diseases. Gabon: International Center for Medical Research in Franceville Los Alamos National Laboratory is working with a research institute in Gabon, the International Center for Medical Research in Franceville (CIRMF) to enhance their genomics capabilities. CIRMF was founded in 1979 to conduct research in fertility, immunology, pathology, and microbiology. Today, CIRMF has refocused almost exclusively on infectious diseases with an emphasis on microbiological monitoring and assistance to public health. LANL is assisting the CIRMF to set up a genomics center to achieve these objectives. In February 2015, LANL staff traveled to Franceville to provide technical assistance to the facility and staff, to assist in addressing technical challenges in operating a newly acquired MiSeq, and to set up a new bioinformatics system that we assisted CIRMF in acquiring. In this engagement, the early evaluation and planning phases were unnecessary, as the CIRMF was already in the process of developing a genomics capability. An evaluation of the current state and the level of expertise were performed and recommendations for additional equipment and training were given. These recommendations are now being implemented. Initial Cooperative Research Highlights Through these international partnerships, extensive collaboration planning and executions are being carried out. After 2–3 years of collaboration, research efforts have started producing initial results at various centers. A few examples are listed below: CRISPR Analysis of Yersinia pestis Strains from Georgia Three Y. pestis strains isolated from two historical natural plague sites of Georgia were analyzed based on their CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) features. In the Y. pestis genome, three CRISPR elements YPa, YPb, and YPc are found at three distinct loci and presently 137 spacer sequences are known ( 9 ). These CRISPR elements are highly correlated with the region and location of isolation, potentially providing important genotyping and evolutionary information, which could help to trace the source of outbreaks. The MiSeq platform at the Georgian NCDC Lugar Center was used to conduct WGS of the isolates. The Georgian scientists have gained sufficient analytical skills through training, and successfully applied the two bioinformatic pipelines that have been deployed (CLCBio Genomics Workbench and EDGE Bioinformatics) to perform the analysis. MERS-CoV Patient Sample Analysis In 2013, an outbreak of MERS-CoV occurred in the Middle East, including Jordan ( 10 , 11 ). Two individuals with severe respiratory symptoms were suspected of having been infected by the virus were admitted to the King Abdullah University Hospital; the throat swabs were sent to PHBC for analysis. One of the patients did not survive after hospital admission. Total RNA was isolated by PHBC staff, and samples were sequenced with the MiSeq platform and supplemented with additional Illumina HiSeq sequencing. The presence of MERS-CoV virus was confirmed in both samples using NGS. Even though the samples were degraded, the virus was present in sufficient abundance for us to obtain the entire viral genome from one of the samples, revealing that it was related to the original outbreak in Saudi Arabia. This type of high-resolution analysis of clinical samples can now be achieved at JUST by the trained local scientists and laboratory staff. It will enable faster detection and more detailed tracking of future outbreaks, and reach further research objectives. RNA Virus Sequencing and Analysis at the UVRI Genome Center After two rounds of training, the UVRI staff analyzed several blood samples from patients presenting with various viral hemorrhagic fever (VHF) symptoms. RNA was extracted and converted to sequencing libraries for sequencing on the UVRI MiSeq instrument. The URVI scientists applied the standardized protocols received during the laboratory setup and training session to perform an initial quality control check, quantification, RNA sample preparation, and concentration measurement. Sequencing library preparation, validation, and quantification were performed using standard protocols provided by LANL, and NGS was performed on the UVRI MiSeq. The Ugandan scientists successfully applied the two bioinformatic pipelines that have been deployed (CLCBio Genomics Workbench and EDGE Bioinformatics) to perform the sequencing data analysis. While no hemorrhagic fever viruses were present in the samples, the analyses revealed some potential bacterial pathogens that may have caused the symptoms. Our collaboration partners continue to actively explore the application of NGS to their local needs. Research ideas include the characterization of samples from long-term archives. This would include the application of NGS to the investigation of past unexplained illnesses, characterization of pathogens from geographical areas across different time periods, and possibly the identification of previously unknown pathogens to the local area. Studying the zoonotic diseases endemic to the partner countries is also of high interest. And many partners are interested in developing a quality reference database of pathogen strains within their purview. Application to clinical, animal, and agricultural samples is a common theme. CRISPR Analysis of Yersinia pestis Strains from Georgia Three Y. pestis strains isolated from two historical natural plague sites of Georgia were analyzed based on their CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) features. In the Y. pestis genome, three CRISPR elements YPa, YPb, and YPc are found at three distinct loci and presently 137 spacer sequences are known ( 9 ). These CRISPR elements are highly correlated with the region and location of isolation, potentially providing important genotyping and evolutionary information, which could help to trace the source of outbreaks. The MiSeq platform at the Georgian NCDC Lugar Center was used to conduct WGS of the isolates. The Georgian scientists have gained sufficient analytical skills through training, and successfully applied the two bioinformatic pipelines that have been deployed (CLCBio Genomics Workbench and EDGE Bioinformatics) to perform the analysis. MERS-CoV Patient Sample Analysis In 2013, an outbreak of MERS-CoV occurred in the Middle East, including Jordan ( 10 , 11 ). Two individuals with severe respiratory symptoms were suspected of having been infected by the virus were admitted to the King Abdullah University Hospital; the throat swabs were sent to PHBC for analysis. One of the patients did not survive after hospital admission. Total RNA was isolated by PHBC staff, and samples were sequenced with the MiSeq platform and supplemented with additional Illumina HiSeq sequencing. The presence of MERS-CoV virus was confirmed in both samples using NGS. Even though the samples were degraded, the virus was present in sufficient abundance for us to obtain the entire viral genome from one of the samples, revealing that it was related to the original outbreak in Saudi Arabia. This type of high-resolution analysis of clinical samples can now be achieved at JUST by the trained local scientists and laboratory staff. It will enable faster detection and more detailed tracking of future outbreaks, and reach further research objectives. RNA Virus Sequencing and Analysis at the UVRI Genome Center After two rounds of training, the UVRI staff analyzed several blood samples from patients presenting with various viral hemorrhagic fever (VHF) symptoms. RNA was extracted and converted to sequencing libraries for sequencing on the UVRI MiSeq instrument. The URVI scientists applied the standardized protocols received during the laboratory setup and training session to perform an initial quality control check, quantification, RNA sample preparation, and concentration measurement. Sequencing library preparation, validation, and quantification were performed using standard protocols provided by LANL, and NGS was performed on the UVRI MiSeq. The Ugandan scientists successfully applied the two bioinformatic pipelines that have been deployed (CLCBio Genomics Workbench and EDGE Bioinformatics) to perform the sequencing data analysis. While no hemorrhagic fever viruses were present in the samples, the analyses revealed some potential bacterial pathogens that may have caused the symptoms. Our collaboration partners continue to actively explore the application of NGS to their local needs. Research ideas include the characterization of samples from long-term archives. This would include the application of NGS to the investigation of past unexplained illnesses, characterization of pathogens from geographical areas across different time periods, and possibly the identification of previously unknown pathogens to the local area. Studying the zoonotic diseases endemic to the partner countries is also of high interest. And many partners are interested in developing a quality reference database of pathogen strains within their purview. Application to clinical, animal, and agricultural samples is a common theme. Conclusion Our experience in collaborating with our international partners has been very fruitful and rewarding. We have successfully assisted in the development of genome centers in four countries: Republic of Georgia, Kingdom of Jordan, Uganda, and Gabon. We have also established long-term partnerships with genomic laboratories in many other countries. Enthusiasm for utilizing NGS at each center continues to build, and several projects have begun. These early projects aim to detect and characterize pathogens from clinical, animal, or environmental samples. These collaborative experiences have not gone without certain challenges. Some of the challenges have been of a logistical nature, such as acquiring reagents in a timely fashion, which is critical to the success of the research and training. On more than one occasion after reagents were ordered, the items were delivered after the manufacturer listed expiration date due to logistical delays. Proper infrastructure support is another main challenge for NGS capability, including environmental heating, cooling and ventilation. Stable and clean electrical power is very important and not always present. Reliable and efficient Internet access is required for NGS operation; Internet access is improving rapidly in all partner locations, but remains a point of concern. Partner staff expertise and proficiency building is key to the success of these collaborations. Most scientists and technicians are experienced biologists but lack bioinformatics expertise. Training a biologist in the techniques of genome science is relatively straightforward but achieving informatics proficiency requires a basic starting level which is lacking. The partner countries typically do not have ready access to bioinformatics skills, and this continues to be a challenge. Our recent deployment of the EDGE bioinformatics tool has been an attempt to overcome this challenge, which was designed for general users without specialized bioinformatics training. Sustainment of the genome science capabilities with our partners is a key concern. We continue to improve the expertise of these partners through training and scientific conference opportunities. Sustainable use of the established NGS technologies will be strengthened by performing regular research projects. These research projects will be funded by international sponsors, and will provide funds for reagents and research time by partner staff. Over time, this approach will enable the partners to exercise and develop genomic capabilities and continue on a path to sustainability. A recently funded research project with NCDC in Georgia resulted from a competitive proposal process is a positive example. Development of genome centers in many countries around the World will not only help the local public health authorities identify and monitor disease outbreaks but will also enable true global biosurveillance at a high temporal, geographic, and information resolution ( 12 – 14 ). Considering the potential for the rapid spread of the known pandemic pathogens and future emerging ones, a network of genome centers that can rapidly provide high-resolution genomic data will help improve the speed and accuracy of outbreak detection and monitoring, and reduce the global threat from these pathogens. The speed and efficacy of mitigation will be largely increased by the ability to test the samples locally, without having to ship the sample long distances. This approach offers a large safety benefit, as clinical samples containing live pathogens do not have to be moved long distances or across borders, and potentially cause additional outbreaks. Successful scientific partnerships and sustainable technical capacity are essential to addressing complex global health security challenges to realize the One Health concept. Conflict of Interest Statement The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest. Funding The authors wish to thank the US Defense Threat Reduction Agency Cooperative Biological Engagement Program, US Department of State Biosecurity Engagement Program, the United Kingdom Global Partnership Programme, and the Foreign Affairs, Trade and Development Canada Global Partnership Program, for funding the effort.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6013667/

Characterization of a Two-Component System Transcriptional Regulator, LtdR, That Impacts Group B Streptococcal Colonization and Disease

ABSTRACT Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus [GBS]) is often a commensal bacterium that colonizes healthy adults asymptomatically and is a frequent inhabitant of the vaginal tract in women. However, in immunocompromised individuals, particularly the newborn, GBS may transition to an invasive pathogen and cause serious disease. Despite the use of the currently recommended intrapartum antibiotic prophylaxis for GBS-positive mothers, GBS remains a leading cause of neonatal septicemia and meningitis. To adapt to the various host environments encountered during its disease cycle, GBS possesses multiple two-component regulatory systems (TCSs). Here we investigated the contribution of a transcriptional regulator containing a LytTR domain, LtdR, to GBS pathogenesis. Disruption of the ltdR gene in the GBS chromosome resulted in a significant increase in bacterial invasion into human cerebral microvascular endothelial cells (hCMEC) in vitro as well as the greater penetration of the blood-brain barrier (BBB) and the development of meningitis in vivo . Correspondingly, infection of hCMEC with the Δ ltdR mutant resulted in increased secretion of the proinflammatory cytokines interleukin-8 (IL-8), CXCL-1, and IL-6. Further, using a mouse model of GBS vaginal colonization, we observed that the Δ ltdR mutant was cleared more readily from the vaginal tract and also that infection with the Δ ltdR mutant resulted in increased cytokine production from human vaginal epithelial cells. RNA sequencing revealed global transcriptional differences between the Δ ltdR mutant and the parental wild-type GBS strain. These results suggest that LtdR regulates many bacterial processes that can influence GBS-host interactions to promote both bacterial persistence and disease progression.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4320191/

Genetic and non-genetic parameters of replacement rate component traits in Holstein Friesian cattle

Records on 3092 pregnancies distributed over a period of 24 years (1986 to 2010) were used to estimate genetic and non genetic parameters of threshold traits in Holstein Friesian. Parity, season and year of calving were included in the model to estimate their effect on replacement traits. A total of 105 sires' records were used to study the genetic component of the characters. The overall averages for abnormal and normal births, male–female sex ratios, mortality and culling rate in females up to age at first calving and female replacement rates based on female births and total pregnancies were estimated as 12.0% and 88.0%, 52.5% and 47.5%, 23.0% and 7.0% and 70.0% and 29.0% respectively. The effects of parity and year of calving on above traits were found to be significant, except parity effects on culling rate and replacement rate based on total pregnancies, which were non-significant. The season effects for all traits were non-significant. Average 3.45 pregnancies were required to produce one heifer that becomes replacement of the old and low producer cow. The heritability culling and replacement rate from total pregnancy were 0.71 and 0.66 suggesting sufficient additive genetic variance for selecting sires in these traits. Better feeding and health management could reduce mortality and force culling female calves. Introduction Threshold traits are a special class of characters which are qualitative on phenotypic scale but they are, on the contrary, affected by polygenic as well as by environment. Replacement rate in a cow herd is the function of calf production, which is influenced by incidences of abnormal births, sex ratio, post natal mortality and culling of heifers from birth to the age at first calving (Banik and Naskar 2006 ). The number of replacements heifers is the most important aspect to the advantage of culling inferior females. The genetic gain to a great extent depends on the heritability of the trait and intensity of selection which mainly depends on the number of replacement heifers entering the herd (Rawal and Tomar 1998 ). Furthermore, information on genetic and non-genetic parameters of replacement rate component traits is helpful in improving the breeding and management practices in a cow herd. In view of the above an investigation on estimation of genetic variability and effect of some non genetic factors viz. parity, season and year of calving on replacement rate component traits in Holstein Friesian herd was under taken. Materials and methods Description of the study area Holeta Cattle Genetic Improvement Center is located 33 km west of Addis Ababa, in West Shoa Zone of Oromia Regional state. The center lies at longitude 38º 30′ E and latitude 9º 3′ N and at about 2400 meters above sea level. The site is characterized by cool sub-tropical climate with mean maximum and minimum temperatures of 22.3°C and 6.16°C, respectively with mean relative humidity of 59%. The mean annual rainfall ranged from 818 to 1247 with an average of 1014 mm. The seasons are classified in to dry, short rainy, and long rainy which last from October to February, March to May and June to September, respectively (HARC Holeta Agricultural Research Center 2008 ). Herd management Cows grazing on native pasture from 8:00 am to 3:00 pm during the rainy season and they are allowed to forage irrigated pasture from February to May. Milking cows were grouped according to their milk production classes as high (>14 liters), medium (8 to 14 liters) and low (14 liters), medium (8 to 14 liters) and low (< 8 liters) yielding and provided with additional 0.5 kg concentrate per liter of milk, while pregnant dry cows are supplied with 3 kg of concentrates per day in the last two months of pregnancy. The concentrate mix was composed of 30% wheat middling, 30% noug seed cake ( Guizeta abysinica ), 25% wheat bran, 10% corn, 4% limestone and 1% salt. All animals had free access to water. Calves were separated from their dams after birth and allowed to receive colostrums for the first 5 days of their age. Bucket-feeding of whole milk continued until weaning at 120 days of age. They were given 5, 4, 3, and 2 liters of milk per day from 5 to 65; 66 to 85; 86 to 105; and 106 to 120 days of ages, respectively. Besides, some concentrates and hay starting from the age of 15 days were provided. Most of the cows were served at first observed heat after calving. Heifers were inseminated after maintaining 280 kg of body weight. Heat detections were routinely followed three times in a day, i.e. early in the morning after milking; in the resting period in mid day; and in the afternoon before milking. Heat detections were carried out by herd attendants and AI technicians. Services were given after the AI technicians confirmed the heat status and then pregnancy diagnosis is conducted by manual rectal palpation after three months of last service. Regular vaccinations against contagious bovine pleura-pneumonia, lumpy skin disease, anthrax, and blackleg, foot and mouth disease and pasteurellosis were given and treatments provided when incidence of cases observed. Culling was practiced as a result of fertility failures, chronic mastitis, tuberculosis, old ages, and emaciations and in some cases due to low daily milk production. Data description and analysis Abnormal birth includes stillbirth and abortion. A calf born dead between 260 days and full term or calf died within 24 hrs after birth is designated as stillbirth while abortion the loss of the fetus between the age of 42 days and approximately 260 days. Sex ratio is defined as the probability of a cow at a given lactation producing a live female calf. Mortality is the probability of a female calf died before reaching to the age at first caving. Culling is the probability of a female calf culled before reaching to the age at first caving. Replacement rate is defined as proportion of young females that become replacements to that of the total females born and of total pregnancies in particular year A total of 3092 calving collected over 24 years from 1986 to 2010 from 105 Friesian sires were used. In this study only singleton births were considered. Twin births were few and removed from the analysis. The traits considered were abnormal and normal births, sex ratios, mortality, and culling and survival rate up to the age at first calving and replacement rates based on female calves born and total pregnancies. The fixed effects studied were parity, season and year of calving. Proportions were estimated for each trait and transformed to arcsine and analyzed using the SAS procedures of General Linear Model (SAS Statistical Agricultural System 2002 ). Where, Y ijkl = i th observation (replacement rate/component traits) from a cow belonging to k th parity, calved in j th season of i th year; μ = overall mean; P i = effect of i th parity of lactation (1… 8 + ) Q k = effect of k th year of calving (1… 24) S j = effect of j th season of calving (1, 2, 3) e ijkl = random error specific to the particular observation and assumed to be normally and independently distributed with mean zero and variance σ 2 ie.σ 2 ~ NID(0, σ 2 e ). Sex ratio is expected to be 1:1. The equality of observed overall sex ratio (percent male birth) with expected overall sex ratio was tested by Chi square ( χ 2 ) test. Random model was used to study the effect of sires on the different threshold traits. Tomar et al. (1991) devised a method for genetic analysis of proportion data without transformation by conducting the analysis of variance using the following method. Where, n i = number of total progenies of i th sire a i = number of affected progenies of i th sire N = ∑n i p i = a i / n i = average incidence of the trait among progenies of i th sire q i = 1- p i Sire component of variance (σ 2 s ) was estimated from the mean squares of between sire (MS s ) and within sire component of variance (σ 2 w ) using the following formula: Where, Where, S = number of sires; N = total number of observations; n i = number of observations for i th sire. Heritability was estimated using paternal half-sib correlation methods using least squares analysis of variance for different traits. And, Where, σ 2 s = sire component of variance σ 2 w = σ 2 e = error variance Standard error of heritability estimated according to Tomar et al. ( 1991 ). Results Averages of replacement rate component traits The overall averages were 12.0% and 88.0%, 52.5% and 47.5%, 23.0% and 7.0% and 70.0% and 29.0% for abnormal births, normal births, sex ratios, mortality, culling, replacement rate based on female births and total pregnancy, respectively (Table 1 ). Parity and year of calving were found to be significant, except parity effects on culling rate and replacement rate based on total pregnancies, which were non-significant. The season differences for all the traits observed were non-significant. Table 1 Least squares means for the effect of birth season, parity and year on replacement rate and component traits at Holta Bull Dam Station Source Total preg. Proportion of birth from total pregnancy Proportion from normal births (sex ratio) Proportion from female calves birth Female replacement rate from Abnormal Normal Male Births Female births Died Culled Female births Total Preg. Overall 3092 360(0.12) 2732(0.88) 1435(0.525) 1297(0.475) 303(0.23) 90(0.07) 904(0.70) 0.29 Season NS NS NS NS NS NS NS NS Dry 1368 172(0.13) 1198(0.88) 615(0.51) 583(0.49) 142(0.24) 36(0.06) 405(0.70) 0.30 Short 740 83(0.11) 656(0.89) 355(0.54) 301(0.46) 66(0.22) 20(0.07) 215(0.71) 0.29 Long 984 105(0.11) 878(0.89) 465(0.53) 413(0.47) 95(0.23) 34(0.08) 284(0.69) 0.29 Parity * * *** * * NS *** NS 1 898 141(0.16) 757(0.84) 391(0.52) 366(0.48) 97(0.27) 22(0.06) 247(0.67) 0.28 2 660 70(0.11) 590(0.89) 329(0.56) 261(0.44) 61(0.23) 16(0.06) 184(0.70) 0.28 3 493 43(0.09) 450(0.91) 245(0.54) 205(0.46) 46(0.22) 14(0.07) 145(0.71) 0.29 4 373 34(0.09) 339(0.91) 169(0.50) 170(0.50) 35(0.21) 18(0.11) 117(0.69) 0.31 5 258 32(0.12) 226(0.88) 111(0.49) 115(0.51) 30(0.26) 9(0.08) 76(0.66) 0.29 6 169 17(0.10) 152(0.90) 75(0.49) 77(0.51) 10(0.13) 6(0.08) 61(0.79) 0.36 7 113 13(0.12) 100(0.88) 49(0.49) 51(0.51) 14(0.27) 3(0.06) 34(0.67) 0.30 8+ 128 12(0.09) 116(0.91) 66(0.57) 52(0.43) 10(0.19) 2(0.04) 40(0.77) 0.32 Year *** *** *** *** *** *** *** *** 1986-88 70 4(0.06) 66(0.94) 38(0.58) 28(0.42) 0(0.0) 0(0.0 28(1.0) 0.40 1989 71 6(0.08) 65(0.92) 39(0.60) 26(0.40) 0(0.0) 0(0.0) 26(1.00) 0.37 1990 89 11(0.12) 78(0.88) 42(0.54) 36(0.46) 0(0.0) 0(0.0) 36(1.00) 0.40 1991 52 8(0.16) 44(0.84) 21(0.48) 23(0.52) 0(0.0) 0(0.0) 23(1.00) 0.44 1992 39 7(0.19) 32(0.81) 12(0.37) 20(0.63) 0(0.0) 0(0.0) 20(1.00) 0.51 1993 117 10(0.08) 107(0.92) 48(0.45) 59(0.55) 7(0.12) 0(0.0) 51(0.88) 0.44 1994 192 28(0.15) 165(0.85) 84(0.51) 81(0.49) 12(0.15) 3(0.04) 66(0.81) 0.34 1995 123 8(0.07) 115(0.93) 62(0.54) 53(0.46) 13(0.25) 2(0.03) 38(0.72) 0.31 1996 143 19(0.13) 124(0.87) 69(0.56) 55(0.44) 4(0.07) 1(0.02) 50(0.91) 0.35 1997 159 14(0.09) 145(0.91) 81(0.56) 64(0.44) 22(0.34) 2(0.03) 40(0.63) 0.25 1998 177 19(0.11) 158(0.89) 78(0.49) 80(0.51) 17(0.21) 18(0.23) 45(0.56) 0.25 1999 157 9(0.06) 148(0.94) 75(0.51) 73(0.49) 21(0.29) 14(0.19) 38(0.52) 0.24 2000 200 19(0.10) 181(0.90) 100(0.55) 81(0.45) 15(0.19) 10(0.12) 56(0.69) 0.28 2001 190 40(0.21) 151(0.79) 76(0.51) 75(0.49) 17(0.23) 8(0.11) 50(0.67) 0.26 2002 214 25(0.12) 189(0.88) 113(0.60) 76(0.40) 15(0.20) 10(0.13) 51(0.67) 0.24 2003 193 31(0.16) 162(0.84) 83(0.51) 79(0.49) 26(0.33) 5(0.06) 29(0.61) 0.25 2004 175 20(0.11) 155(0.89) 80(0.52) 75(0.48) 20(0.27) 8(0.11) 47(0.63) 0.27 2005 147 17(0.12) 130(0.88) 65(0.50) 65(0.50) 29(0.47) 6(0.09) 30(0.46) 0.20 2006 162 20(0.12) 142(0.88) 74(0.52) 68(0.48) 33(0.49) 1(0.02) 34(0.50) 0.21 2007 175 25(0.14) 150(0.86) 76(0.51) 74(0.49) 36(0.47) 2(0.03) 40(0.49) 0.21 2008 86 4(0.05) 82(0.95) 38(0.46) 44(0.54) 14(0.32) 0(0.0) 30(0.68) 0.35 2009 77 9(0.12) 68(0.88) 41(0.60) 27(0.40) 2(0.07) 0(0.0) 25(0.93) 0.32 2010 84 9(0.11) 75(89.0) 40(0.53) 35(0.47) 0(0.0) 0(0.0) 35(1.00) 0.42 Preg. = pregnancy; * = (P ≤ 0.05); *** = (P ≤ 0.01); NS = not significant. Figures in parentheses are proportions. Heritability of replacement rate component traits The heritability estimates of replacement rate and its component traits are given in Table 2 . Low h 2 were observed for total calves born, total normal calves born and female calves born which were 0.11 ± 0.018, 0.12 ± 0.018 and 0.10 ± 0.019, respectively. The heritability estimate of selective value i.e. the total female calves reached to milking herd was observed to be 0.66 ± 0.029 and this value was high; however, the value for coefficient of gene replication was negative and very small. Table 2 Heritability of replacement rate and its component traits in Holstein Friesian at Holeta Bull Dam Station Trait Heritability ± SE Abnormal births 0.16 ± 0.009 Sex ratio 0.10 ± 0.019 Mortality 0.18 ± 0.029 Culling 0.71 ± 0.029 Replacement rate from female calves born 0.66 ± 0.029 Averages of replacement rate component traits The overall averages were 12.0% and 88.0%, 52.5% and 47.5%, 23.0% and 7.0% and 70.0% and 29.0% for abnormal births, normal births, sex ratios, mortality, culling, replacement rate based on female births and total pregnancy, respectively (Table 1 ). Parity and year of calving were found to be significant, except parity effects on culling rate and replacement rate based on total pregnancies, which were non-significant. The season differences for all the traits observed were non-significant. Table 1 Least squares means for the effect of birth season, parity and year on replacement rate and component traits at Holta Bull Dam Station Source Total preg. Proportion of birth from total pregnancy Proportion from normal births (sex ratio) Proportion from female calves birth Female replacement rate from Abnormal Normal Male Births Female births Died Culled Female births Total Preg. Overall 3092 360(0.12) 2732(0.88) 1435(0.525) 1297(0.475) 303(0.23) 90(0.07) 904(0.70) 0.29 Season NS NS NS NS NS NS NS NS Dry 1368 172(0.13) 1198(0.88) 615(0.51) 583(0.49) 142(0.24) 36(0.06) 405(0.70) 0.30 Short 740 83(0.11) 656(0.89) 355(0.54) 301(0.46) 66(0.22) 20(0.07) 215(0.71) 0.29 Long 984 105(0.11) 878(0.89) 465(0.53) 413(0.47) 95(0.23) 34(0.08) 284(0.69) 0.29 Parity * * *** * * NS *** NS 1 898 141(0.16) 757(0.84) 391(0.52) 366(0.48) 97(0.27) 22(0.06) 247(0.67) 0.28 2 660 70(0.11) 590(0.89) 329(0.56) 261(0.44) 61(0.23) 16(0.06) 184(0.70) 0.28 3 493 43(0.09) 450(0.91) 245(0.54) 205(0.46) 46(0.22) 14(0.07) 145(0.71) 0.29 4 373 34(0.09) 339(0.91) 169(0.50) 170(0.50) 35(0.21) 18(0.11) 117(0.69) 0.31 5 258 32(0.12) 226(0.88) 111(0.49) 115(0.51) 30(0.26) 9(0.08) 76(0.66) 0.29 6 169 17(0.10) 152(0.90) 75(0.49) 77(0.51) 10(0.13) 6(0.08) 61(0.79) 0.36 7 113 13(0.12) 100(0.88) 49(0.49) 51(0.51) 14(0.27) 3(0.06) 34(0.67) 0.30 8+ 128 12(0.09) 116(0.91) 66(0.57) 52(0.43) 10(0.19) 2(0.04) 40(0.77) 0.32 Year *** *** *** *** *** *** *** *** 1986-88 70 4(0.06) 66(0.94) 38(0.58) 28(0.42) 0(0.0) 0(0.0 28(1.0) 0.40 1989 71 6(0.08) 65(0.92) 39(0.60) 26(0.40) 0(0.0) 0(0.0) 26(1.00) 0.37 1990 89 11(0.12) 78(0.88) 42(0.54) 36(0.46) 0(0.0) 0(0.0) 36(1.00) 0.40 1991 52 8(0.16) 44(0.84) 21(0.48) 23(0.52) 0(0.0) 0(0.0) 23(1.00) 0.44 1992 39 7(0.19) 32(0.81) 12(0.37) 20(0.63) 0(0.0) 0(0.0) 20(1.00) 0.51 1993 117 10(0.08) 107(0.92) 48(0.45) 59(0.55) 7(0.12) 0(0.0) 51(0.88) 0.44 1994 192 28(0.15) 165(0.85) 84(0.51) 81(0.49) 12(0.15) 3(0.04) 66(0.81) 0.34 1995 123 8(0.07) 115(0.93) 62(0.54) 53(0.46) 13(0.25) 2(0.03) 38(0.72) 0.31 1996 143 19(0.13) 124(0.87) 69(0.56) 55(0.44) 4(0.07) 1(0.02) 50(0.91) 0.35 1997 159 14(0.09) 145(0.91) 81(0.56) 64(0.44) 22(0.34) 2(0.03) 40(0.63) 0.25 1998 177 19(0.11) 158(0.89) 78(0.49) 80(0.51) 17(0.21) 18(0.23) 45(0.56) 0.25 1999 157 9(0.06) 148(0.94) 75(0.51) 73(0.49) 21(0.29) 14(0.19) 38(0.52) 0.24 2000 200 19(0.10) 181(0.90) 100(0.55) 81(0.45) 15(0.19) 10(0.12) 56(0.69) 0.28 2001 190 40(0.21) 151(0.79) 76(0.51) 75(0.49) 17(0.23) 8(0.11) 50(0.67) 0.26 2002 214 25(0.12) 189(0.88) 113(0.60) 76(0.40) 15(0.20) 10(0.13) 51(0.67) 0.24 2003 193 31(0.16) 162(0.84) 83(0.51) 79(0.49) 26(0.33) 5(0.06) 29(0.61) 0.25 2004 175 20(0.11) 155(0.89) 80(0.52) 75(0.48) 20(0.27) 8(0.11) 47(0.63) 0.27 2005 147 17(0.12) 130(0.88) 65(0.50) 65(0.50) 29(0.47) 6(0.09) 30(0.46) 0.20 2006 162 20(0.12) 142(0.88) 74(0.52) 68(0.48) 33(0.49) 1(0.02) 34(0.50) 0.21 2007 175 25(0.14) 150(0.86) 76(0.51) 74(0.49) 36(0.47) 2(0.03) 40(0.49) 0.21 2008 86 4(0.05) 82(0.95) 38(0.46) 44(0.54) 14(0.32) 0(0.0) 30(0.68) 0.35 2009 77 9(0.12) 68(0.88) 41(0.60) 27(0.40) 2(0.07) 0(0.0) 25(0.93) 0.32 2010 84 9(0.11) 75(89.0) 40(0.53) 35(0.47) 0(0.0) 0(0.0) 35(1.00) 0.42 Preg. = pregnancy; * = (P ≤ 0.05); *** = (P ≤ 0.01); NS = not significant. Figures in parentheses are proportions. Heritability of replacement rate component traits The heritability estimates of replacement rate and its component traits are given in Table 2 . Low h 2 were observed for total calves born, total normal calves born and female calves born which were 0.11 ± 0.018, 0.12 ± 0.018 and 0.10 ± 0.019, respectively. The heritability estimate of selective value i.e. the total female calves reached to milking herd was observed to be 0.66 ± 0.029 and this value was high; however, the value for coefficient of gene replication was negative and very small. Table 2 Heritability of replacement rate and its component traits in Holstein Friesian at Holeta Bull Dam Station Trait Heritability ± SE Abnormal births 0.16 ± 0.009 Sex ratio 0.10 ± 0.019 Mortality 0.18 ± 0.029 Culling 0.71 ± 0.029 Replacement rate from female calves born 0.66 ± 0.029 Discussion Averages of replacement rate component traits The overall average incidence of abnormal birth rates based on total pregnancies was 12.0% while 88.0% of births were normal (Table 1 ). Similar prenatal death rates were reported by Singh et al. ( 2002 ) in Holstein × Sahiwal, Atrey ( 2003 ) in Frieswal crosses and Birhanu et al. ( 2011 ) in Holstein Friesian. The average abnormal births in Holstein Friesian were higher in dry season than both rainy seasons but the differences were non-significant. This might be because of very low seasonal climatic variations in the area. However, significant season effects on abnormal births in exotic and crossbred cows were observed by Atrey ( 2003 ) and Banik and Naskar ( 2006 ). The differences in observations could be due to wide differences in seasonal climatic conditions of the locations where the different herds were located. The parity of calving had significant effects (P ≤ 0.05) on prenatal calf losses due to abnormal birth in Holstein Friesian and agreed with those observed by Kumar et al. ( 1995 ), (Mehrotra and Dey 1998b ) in exotic and crossbred cattle. The highest incidences of abnormal births (16.0%) in first parity could be related to under developed reproductive system in younger cows by the time of their first calving, resulting in dystocia and prenatal death of calves. This observation was in conformity with Birhanu et al. ( 2011 ). The year effects on abnormal births were significant (P ≤ 0.01). This could be attributed to change in management and health care of lactating cows over different years. Similar results were observed by Kumar et al. ( 1995 ) and Mukherjee and Tomar ( 1997b ). The overall male (52.5%) and female (47.5%) sex ratio was significantly deviated from expected sex ratio of 1:1( χ 2 c (1, 0.01) =7.31). Similar findings were reported by Atrey ( 2003 ) and Banik and Naskar ( 2006 ). Season effects for sex ratio were non-significant indicating that the trait is mostly determined by chance factor and not by environment. Similar observations were also reported by Mukherjee et al. ( 2000 ) and Atrey ( 2003 ). The male birth varies from 49.0% to 57.0% among different parities and the differences in sex ratios among parities within male and female groups were significant (P ≤ 0.01). These findings were contrary to the reports of Rawal and Tomar ( 1995 ) and Mukherjee et al. ( 2000 ). The observed higher male calf ratio than the overall average sex ratio in the young and older cows were in agreement with Tomar and Verma ( 1988a ). Such difference in observations for a chance determined trait cannot be explained with valid and logical reasons. The year effects on sex ratios were significant (P ≤ 0.01) and agreed with Kumar et al. ( 1992 ) and (Lathwal and Kumar 1993 ). The average mortality rate in females from birth to age at first calving was found to be 23.0%. This mortality rate was high and could be related to inadequate health and feeding management of heifers, confirming observations of Birhanu et al. ( 2011 ). Higher mortality rates of 35.4 to 63.0% among female calves were reported by Banik and Naskar ( 2006 ). The difference in observations of various workers may be attributed to the variations in herd management practices at different farms. Season effects on mortality rates of females from birth to age at first calving were found to be non-significant. Similar non significant season effect on females mortality were observed by (Lathwal and Kumar 1993 ) and Mukherjee and Tomar ( 1997b ) for various cattle herds. Parity effects on female's mortality from birth to age at first calving were found to be significant (P ≤ 0.05). The highest mortality was observed in the first parity cows which could be because of lesser skeletal development. Higher mortality of calves from older cows could be attributed to the small sample size. Significant parity effects on calf mortality were reported by Singh et al. ( 2002 ) and Atrey ( 2003 ). On the contrary, non-significant parity effects on female calf mortality were reported by Mukherjee and Tomar ( 1997b ) and (Tomar and Verma 1988a ). Dairy production in tropical countries like Ethiopia is influenced by poor adaptation of exotic breeds and high calf mortality. After studying the dynamics of Friesian herds in four dairy farms Menjo et al. ( 2009 ) concluded that 25% of the Holstein Friesian cattle born on the Kenyan large scale farms were lost before reaching to a productive age, indicating the limitations of such animals' adaptability to the prevailing environmental conditions. Moreover, Moran ( 2011 ) reviewed 17 studies documented on mortality of calves in Asia, tropical Africa and south America and summarized that pre-weaning calf mortality ranged from 15 to 25% and often as high as 50%. The main reasons attributed to the death of exotic breeds in these countries were poor adaptation coupled with poor health, feeding and management problems. The year differences in mortality rates of the Holstein Friesian heifers were found to be highly significant (P ≤ 0.01). This could be attributed to the management and environmental differences over different years and agreed with reports of Rawal and Tomar ( 1994b ), Mukherjee and Tomar ( 1997b ). However, values for the year 2010 should be interpreted cautiously since animals may not get sufficient time for expression of component traits. The overall female culling rate up to age at first calving, computed from total female calves born was observed to be 7% (Table 1 ). Lower culling rate in female calves were reported by (Chaudhery et al. 1984 ) and Singh et al. ( 1987 ) for Friesian × indigenous crosses breeds. However, Shahi and Kumar ( 2006 ) reported a higher culling rate of 17.8% for Holstein crosses. The observed variations among the reports may be because of the differences in the management practices, standards of culling and replacement need at different livestock farms. Season differences in culling rates of female calves were found to be statistically non-significant. These results agreed with the reports of (Lathwal and Kumar 1993 ) and Mukherjee and Tomar ( 1997b ). The differences in heifer's culling rates according to dam's parity order were non significant and agreed with Singh ( 2001 ) and Atrey ( 2003 ). Year differences for culling rates in female calves were highly significant (P ≤ 0.01). This could be resulted from the variations in disease incidences, climatic conditions, management practices, replacement need and availability of replacement heifers over different years. Significant differences over years for culling rate have been reported by (Tomar and Rawal 1996 ) and Mukherjee and Tomar ( 1997b ). The overall replacement rate in Holstein Friesian computed from total female calves born was 70.0%. These observations agreed with 68.5% (Tomar and Verma 1988a ) and 69.5% (Tomar and Rawal, 1994 ). However, female replacement rate at Holeta was lower than 92.2% (Tomar and Verma 1988b ) and 74.7% Atrey ( 2003 ) reported for different cattle herds. The differences due to season of calving in replacement rate from female calf born were found to be non significant. However, significant effects of season of calving on replacement rate on female calf's basis were reported by Tomar and Verma ( 1988a ) and Atrey ( 2003 ). Dams' parity order was significant and ranged from 66% in 5 th parity to 83% in 8 th parity. Similar findings were reported by (Lathwal and Kumar 1993 ) and Tomar and Rawal ( 1994 ). Lower replacement rate in some parity could be related to the combined effect of high mortality, culling and high male births. The year differences (Table 1 ) in replacement rates basis on female calves born were highly significant (P ≤ 0.01). This could be attributed to the differences in culling and mortality of female calves over different years and supported by the findings of (Lathwal and Kumar 1993 ) and Atrey ( 2003 ). However, Tomar and Verma ( 1988b ) reported non-significant year effects on replacement rate computed from female calves born. The overall replacement rate computed from total pregnancies was estimated as 29.0%. These observations indicated that about 3 to 4 pregnancies were required to produce one heifer replacement. The present overall replacement rate from total pregnancies was lower than the reports of Tomar and Rawal ( 1994 ), and (Tomar and Verma 1988a ). The season differences in replacement rates based on total pregnancies was not significant and agreed with Tomar and Rawal ( 1994 ). Whereas, Tomar and Verma ( 1988a ) and Atrey ( 2003 ) has reported significant season effects on replacement rate based on total pregnancies. The average replacement rate based on total pregnancies among dam's parities ranged from lowest of 28% in 1 st and 2 nd parity to 36% in 6 th parity. However, no definite trend was observed for replacement rate among dam's parities and the observed differences were non-significant. The year effects on replacement rate based on total pregnancies were highly significant (P ≤ 0.01). Significantly lower replacement rates in some years may be because of very high abnormal birth, mortality and culling rates during these years. These findings agreed with Tomar and Rawal ( 1994 ) and Atrey ( 2003 ). Heritability of replacement rate component traits The low heritability (0.16 ± 0.01) of abnormal birth in Holstein Friesian indicated very small chances of reducing the abnormal birth through selection. This finding was in complete conformity with the reports of (Rawal and Tomar 1996c ). However, Rawal and Tomar ( 1996a ) and Atrey ( 2003 ) have reported heritability values ranging from 0.042 to 0.10. The low heritability (0.10 ± 0.02) for sex ratio could be due to chance factor and was in agreement to that of 0.095 (Rawal and Tomar 1995 ). Very low heritability estimates (0.016) for sex ratio have been observed by Lathwal and Kumar ( 1993 ) in zebu and 0.017 by Powell et al. ( 1975 ) in exotic cattle. These reports showed that the variation in sex ratio was mainly due to non genetic factors consisting of random union of gametes in determination of sex of the calf. The heritability estimate of mortality in Holstein Friesian female calves was 0.18 ± 0.03 suggesting that selection could be used for reducing the mortality rate in female calves genetically. Very close findings were reported by Atrey ( 2003 ). Medium heritability estimate (0.38) was found Lathwal and Kumar ( 1993 ) for the mortality in female calves. Improvement in non-genetic factors viz. feeding, health and overall management of heifers could be more helpful in reducing the female calf mortality. The heritability of culling rate in female calves from birth to age at first calving was high (0.71 ± 0.03), suggesting that culling rate in female calves could be altered through selection among the female progenies of the different sires. Moreover, culling in female calves as a result of poor growth, reproductive problems and susceptibility to diseases and parasites might have been influenced by inherited genes related to the genetic makeup of the calf, hence contributing to the high heritability of the trait. However, lower heritability values of culling rate than the present estimate were reported by (Schwenger et al. 1989 ) and Atrey ( 2003 ) for different breeds of cattle. Replacement rate from female calf births had high heritability (0.66 ± 0.03) indicating and sires of the daughter greatly affected the status of female calves reaching to the milking herd. Lower heritability of 0.23 (Mukherjee and Tomar 1997b ) has been reported for a tropical breed of cattle. In the present study ANOVA method without transformation was used. Since the method can present negative estimates especially when the error term is high, it is plausible to consider linear threshold model for genetic analysis for big data set. Averages of replacement rate component traits The overall average incidence of abnormal birth rates based on total pregnancies was 12.0% while 88.0% of births were normal (Table 1 ). Similar prenatal death rates were reported by Singh et al. ( 2002 ) in Holstein × Sahiwal, Atrey ( 2003 ) in Frieswal crosses and Birhanu et al. ( 2011 ) in Holstein Friesian. The average abnormal births in Holstein Friesian were higher in dry season than both rainy seasons but the differences were non-significant. This might be because of very low seasonal climatic variations in the area. However, significant season effects on abnormal births in exotic and crossbred cows were observed by Atrey ( 2003 ) and Banik and Naskar ( 2006 ). The differences in observations could be due to wide differences in seasonal climatic conditions of the locations where the different herds were located. The parity of calving had significant effects (P ≤ 0.05) on prenatal calf losses due to abnormal birth in Holstein Friesian and agreed with those observed by Kumar et al. ( 1995 ), (Mehrotra and Dey 1998b ) in exotic and crossbred cattle. The highest incidences of abnormal births (16.0%) in first parity could be related to under developed reproductive system in younger cows by the time of their first calving, resulting in dystocia and prenatal death of calves. This observation was in conformity with Birhanu et al. ( 2011 ). The year effects on abnormal births were significant (P ≤ 0.01). This could be attributed to change in management and health care of lactating cows over different years. Similar results were observed by Kumar et al. ( 1995 ) and Mukherjee and Tomar ( 1997b ). The overall male (52.5%) and female (47.5%) sex ratio was significantly deviated from expected sex ratio of 1:1( χ 2 c (1, 0.01) =7.31). Similar findings were reported by Atrey ( 2003 ) and Banik and Naskar ( 2006 ). Season effects for sex ratio were non-significant indicating that the trait is mostly determined by chance factor and not by environment. Similar observations were also reported by Mukherjee et al. ( 2000 ) and Atrey ( 2003 ). The male birth varies from 49.0% to 57.0% among different parities and the differences in sex ratios among parities within male and female groups were significant (P ≤ 0.01). These findings were contrary to the reports of Rawal and Tomar ( 1995 ) and Mukherjee et al. ( 2000 ). The observed higher male calf ratio than the overall average sex ratio in the young and older cows were in agreement with Tomar and Verma ( 1988a ). Such difference in observations for a chance determined trait cannot be explained with valid and logical reasons. The year effects on sex ratios were significant (P ≤ 0.01) and agreed with Kumar et al. ( 1992 ) and (Lathwal and Kumar 1993 ). The average mortality rate in females from birth to age at first calving was found to be 23.0%. This mortality rate was high and could be related to inadequate health and feeding management of heifers, confirming observations of Birhanu et al. ( 2011 ). Higher mortality rates of 35.4 to 63.0% among female calves were reported by Banik and Naskar ( 2006 ). The difference in observations of various workers may be attributed to the variations in herd management practices at different farms. Season effects on mortality rates of females from birth to age at first calving were found to be non-significant. Similar non significant season effect on females mortality were observed by (Lathwal and Kumar 1993 ) and Mukherjee and Tomar ( 1997b ) for various cattle herds. Parity effects on female's mortality from birth to age at first calving were found to be significant (P ≤ 0.05). The highest mortality was observed in the first parity cows which could be because of lesser skeletal development. Higher mortality of calves from older cows could be attributed to the small sample size. Significant parity effects on calf mortality were reported by Singh et al. ( 2002 ) and Atrey ( 2003 ). On the contrary, non-significant parity effects on female calf mortality were reported by Mukherjee and Tomar ( 1997b ) and (Tomar and Verma 1988a ). Dairy production in tropical countries like Ethiopia is influenced by poor adaptation of exotic breeds and high calf mortality. After studying the dynamics of Friesian herds in four dairy farms Menjo et al. ( 2009 ) concluded that 25% of the Holstein Friesian cattle born on the Kenyan large scale farms were lost before reaching to a productive age, indicating the limitations of such animals' adaptability to the prevailing environmental conditions. Moreover, Moran ( 2011 ) reviewed 17 studies documented on mortality of calves in Asia, tropical Africa and south America and summarized that pre-weaning calf mortality ranged from 15 to 25% and often as high as 50%. The main reasons attributed to the death of exotic breeds in these countries were poor adaptation coupled with poor health, feeding and management problems. The year differences in mortality rates of the Holstein Friesian heifers were found to be highly significant (P ≤ 0.01). This could be attributed to the management and environmental differences over different years and agreed with reports of Rawal and Tomar ( 1994b ), Mukherjee and Tomar ( 1997b ). However, values for the year 2010 should be interpreted cautiously since animals may not get sufficient time for expression of component traits. The overall female culling rate up to age at first calving, computed from total female calves born was observed to be 7% (Table 1 ). Lower culling rate in female calves were reported by (Chaudhery et al. 1984 ) and Singh et al. ( 1987 ) for Friesian × indigenous crosses breeds. However, Shahi and Kumar ( 2006 ) reported a higher culling rate of 17.8% for Holstein crosses. The observed variations among the reports may be because of the differences in the management practices, standards of culling and replacement need at different livestock farms. Season differences in culling rates of female calves were found to be statistically non-significant. These results agreed with the reports of (Lathwal and Kumar 1993 ) and Mukherjee and Tomar ( 1997b ). The differences in heifer's culling rates according to dam's parity order were non significant and agreed with Singh ( 2001 ) and Atrey ( 2003 ). Year differences for culling rates in female calves were highly significant (P ≤ 0.01). This could be resulted from the variations in disease incidences, climatic conditions, management practices, replacement need and availability of replacement heifers over different years. Significant differences over years for culling rate have been reported by (Tomar and Rawal 1996 ) and Mukherjee and Tomar ( 1997b ). The overall replacement rate in Holstein Friesian computed from total female calves born was 70.0%. These observations agreed with 68.5% (Tomar and Verma 1988a ) and 69.5% (Tomar and Rawal, 1994 ). However, female replacement rate at Holeta was lower than 92.2% (Tomar and Verma 1988b ) and 74.7% Atrey ( 2003 ) reported for different cattle herds. The differences due to season of calving in replacement rate from female calf born were found to be non significant. However, significant effects of season of calving on replacement rate on female calf's basis were reported by Tomar and Verma ( 1988a ) and Atrey ( 2003 ). Dams' parity order was significant and ranged from 66% in 5 th parity to 83% in 8 th parity. Similar findings were reported by (Lathwal and Kumar 1993 ) and Tomar and Rawal ( 1994 ). Lower replacement rate in some parity could be related to the combined effect of high mortality, culling and high male births. The year differences (Table 1 ) in replacement rates basis on female calves born were highly significant (P ≤ 0.01). This could be attributed to the differences in culling and mortality of female calves over different years and supported by the findings of (Lathwal and Kumar 1993 ) and Atrey ( 2003 ). However, Tomar and Verma ( 1988b ) reported non-significant year effects on replacement rate computed from female calves born. The overall replacement rate computed from total pregnancies was estimated as 29.0%. These observations indicated that about 3 to 4 pregnancies were required to produce one heifer replacement. The present overall replacement rate from total pregnancies was lower than the reports of Tomar and Rawal ( 1994 ), and (Tomar and Verma 1988a ). The season differences in replacement rates based on total pregnancies was not significant and agreed with Tomar and Rawal ( 1994 ). Whereas, Tomar and Verma ( 1988a ) and Atrey ( 2003 ) has reported significant season effects on replacement rate based on total pregnancies. The average replacement rate based on total pregnancies among dam's parities ranged from lowest of 28% in 1 st and 2 nd parity to 36% in 6 th parity. However, no definite trend was observed for replacement rate among dam's parities and the observed differences were non-significant. The year effects on replacement rate based on total pregnancies were highly significant (P ≤ 0.01). Significantly lower replacement rates in some years may be because of very high abnormal birth, mortality and culling rates during these years. These findings agreed with Tomar and Rawal ( 1994 ) and Atrey ( 2003 ). Heritability of replacement rate component traits The low heritability (0.16 ± 0.01) of abnormal birth in Holstein Friesian indicated very small chances of reducing the abnormal birth through selection. This finding was in complete conformity with the reports of (Rawal and Tomar 1996c ). However, Rawal and Tomar ( 1996a ) and Atrey ( 2003 ) have reported heritability values ranging from 0.042 to 0.10. The low heritability (0.10 ± 0.02) for sex ratio could be due to chance factor and was in agreement to that of 0.095 (Rawal and Tomar 1995 ). Very low heritability estimates (0.016) for sex ratio have been observed by Lathwal and Kumar ( 1993 ) in zebu and 0.017 by Powell et al. ( 1975 ) in exotic cattle. These reports showed that the variation in sex ratio was mainly due to non genetic factors consisting of random union of gametes in determination of sex of the calf. The heritability estimate of mortality in Holstein Friesian female calves was 0.18 ± 0.03 suggesting that selection could be used for reducing the mortality rate in female calves genetically. Very close findings were reported by Atrey ( 2003 ). Medium heritability estimate (0.38) was found Lathwal and Kumar ( 1993 ) for the mortality in female calves. Improvement in non-genetic factors viz. feeding, health and overall management of heifers could be more helpful in reducing the female calf mortality. The heritability of culling rate in female calves from birth to age at first calving was high (0.71 ± 0.03), suggesting that culling rate in female calves could be altered through selection among the female progenies of the different sires. Moreover, culling in female calves as a result of poor growth, reproductive problems and susceptibility to diseases and parasites might have been influenced by inherited genes related to the genetic makeup of the calf, hence contributing to the high heritability of the trait. However, lower heritability values of culling rate than the present estimate were reported by (Schwenger et al. 1989 ) and Atrey ( 2003 ) for different breeds of cattle. Replacement rate from female calf births had high heritability (0.66 ± 0.03) indicating and sires of the daughter greatly affected the status of female calves reaching to the milking herd. Lower heritability of 0.23 (Mukherjee and Tomar 1997b ) has been reported for a tropical breed of cattle. In the present study ANOVA method without transformation was used. Since the method can present negative estimates especially when the error term is high, it is plausible to consider linear threshold model for genetic analysis for big data set. Conclusion From the foregoing discussion, it could be concluded that on an average 3.45 pregnancies are required to produce one heifer that become replacement of the old and low producer cows. Further, sufficient additive genetic variance was available to affect the selection for low incidence of abnormal births, low female calf mortality rate, and low female culling rate. Authors' information GG: MSc in Animal Production, Assistant Professor, PhD scholar. HS: PhD, Professor in Animal Breeding, advisor.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8438180/

Identification of Biomarkers for Systemic Distribution of Nanovesicles From Lactobacillus johnsonii N6.2

The ability of bacterial extracellular vesicles (EV) to transport biological molecules has increased the research to determine their potential as therapeutic agents. In this study, Lactobacillus johnsonii N6.2-derived nanovesicles (NV) were characterized to identify components that may serve as biomarkers in host-microbe interactions. Comparative proteomic and lipidomic analyses of L. johnsonii N6.2 NV and cell membrane (CM) were performed. The lipidomic profiles indicated that both fractions contained similar lipids, however, significant differences were observed in several classes. LC-MS/MS proteomic analysis indicated that NV contained several unique and differentially expressed proteins when compared to the CM. Analysis of Gene Ontology (GO) terms, based on cellular component, showed significant enrichment of proteins in the cytoplasm/intracellular space category for the NV fraction. Based on these results, the proteins T285_RS00825 (named Sdp), Eno3 and LexA were selected for studies of localization and as potential biomarkers for host-microbe interactions. Immunogold staining, followed by scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM, respectively), revealed that Sdp was preferentially localized along the cell wall/membrane, and on NV-like structures surrounding the bacteria. These results were confirmed using immunofluorescence staining in Caco-2 cells incubated with NV. Consequently, we evaluated the potential for NV surface-exposed proteins to generate an immune response in the host. Plasma from individuals administered L. johnsonii N6.2 showed that IgA and IgG antibodies were generated against NV and Sdp domains in vivo . Altogether, these results show that L. johnsonii N6.2 NV have the potential to mediate host interactions through immune modulation. Introduction In recent years, extracellular vesicles have gained increasing attention in the medical and scientific communities due to their ability to mediate cellular communication and transport biological molecules, as well as their potential use as therapeutic agents ( 1 – 4 ). The term extracellular vesicle includes a wide variety of cell-derived membrane structures produced by eukaryotic, prokaryotic and archaeal cells alike ( 5 ). In the literature, extracellular vesicles originating from Gram-negative bacteria are generally referred to as outer membrane vesicles (OMVs) ( 6 ), while membrane vesicles (MVs) are more commonly associated with Gram-positive bacteria and mycobacteria ( 7 ). Herein, we describe nanovesicles (NV) as 20 – 200 nm extracellular vesicles produced by Gram-positive bacteria ( 8 , 9 ), that transport lipids, proteins, nucleic acids and metabolites between cells to facilitate both local and systemic host-microbe interactions, and can elicit differential effects on recipient cells ( 5 , 10 – 14 ). OMVs have been studied in depth for more than a decade, and their role in pathogenesis, microbial physiology and immune modulation have been well characterized ( 6 ). This is in stark contrast to the EVs produced by Gram-positive bacteria, which have only recently been explored. OMVs derived from Gram-negative bacteria have been shown to facilitate biological functions, including communication, competition, biofilm formation, pathogenesis and survival under stress conditions ( 1 ). Consequently, OMVs have also been shown to stimulate the innate and adaptive immune response through activation of toll-like receptors (TLRs), NOD-like receptors, and antigen delivery to antigen-presenting cells, which subsequently trigger T-cell and B-cell responses ( 5 ). The mechanism by which NV are formed and released from the cell wall of Gram-positive bacteria remains largely unknown, however, extracellular vesicles have been described in several cell-walled organisms, and their capacity to transport biologically active molecules and elicit local and systemic cellular responses have been documented ( 9 , 11 , 15 – 18 ). In Bacillus anthracis , NV enhance virulence by translocating anthrax toxins to the extracellular space ( 19 ), and Staphylococcus aureus strain 8325-4 has been shown to enhance virulence by cargoing an α-toxin to host cells ( 18 ). In contrast, recent studies in several Lactobacillus species have highlighted the potential of NV as beneficial mechanistic effectors. L. plantarum WCFS1 up-regulates the host defense genes to enhance the immune response, providing protective effects against vancomycin-resistant enterococci ( 20 ). Lactobacillus rhamnosus GG-derived NV were reported to inhibit the growth of hepatic cancer cells through apoptotic means, where a significant increase in the bax/bcl2 expression ratio was observed following incubation of NV with the HepG2 cell line ( 21 ). It was also observed that two vaginal Lactobacillus species, Lactobacillus crispatus BC3 and Lactobacillus gasseri BC12, protect human tissues from HIV-1 infection by inhibiting viral attachment of target cells ( 14 ). In this report, we isolate and characterize NV derived from L. johnsonii N6.2. We have previously shown that L. johnsonii N6.2 mitigates the onset of Type 1 diabetes (T1D) when administered to Biobreeding Diabetes-Prone (BBDP) rats, where administration of the bacteria improved the epithelial barrier by increasing the expression of tight junction proteins and mucus production, while decreasing the intestinal oxidative stress response ( 22 , 23 ). Further analysis indicated that the prevention of T1D correlated with Th17 cell bias, as well as elevated IL-23 levels in the mesenteric lymph nodes; in vitro experiments showed modification of dendritic cells contributed to the Th17 bias ( 24 ). The effects of L. johnsonii N6.2 were also observed in vitro on human intestinal epithelial cells, to determine the TLR signaling pathways and their effects on the innate immune response. Increased expression of TLR7 and TLR9 was observed in response to L. johnsonii N6.2 cell-free extracts and pure nucleic acids, suggesting that L. johnsonii N6.2 produces bioactive components to aid in the stimulation of the innate immune response ( 23 ). In vitro, L. johnsonii N6.2 was also found to produce H 2 O 2 , a strong inhibitor of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) in the host ( 25 ). IDO is the rate limiting step in the kynurenine pathway, where tryptophan is catabolized to produce a variety of immunoregulatory and neuroactive catabolites ( 26 ). In BBDP rats administered L. johnsonii N6.2, intestinal IDO mRNA levels were lower than the controls. This correlated with the low levels of kynurenine observed in the blood plasma of BBDP rats that received L. johnsonii N6.2 ( 25 ). In a subsequent clinical trial, healthy adults were administered L. johnsonii N6.2 to evaluate the safety, tolerability and general response to this microorganism, where L. johnsonii N6.2 was confirmed to be safe for human consumption ( 27 ). The administration of L. johnsonii N6.2 was also found to promote systemic effects on the circulating leukocytes and metabolites. The tryptophan: kynurenine ratio was significantly different in the treatment group, where increased concentrations of tryptophan in human serum positively correlated with increased Lactobacillus cell counts over time. Moreover, significant increases in monocytes and NK cells correlated with the percentage of CD4 + T cells, and the serum levels of IgA increased with L. johnsonii N6.2 supplementation in human subjects ( 27 ). Taken together, the systemic effects promoted by L. johnsonii N6.2 administration in BBDP rats and human studies suggest bioactive components produced by L. johnsonii N6.2 may interact with cells at distal locations. We hypothesize L. johnsonii N6.2 produces NV that can elicit an immune response in the host. In this study, we isolated and characterized the morphology and molecular composition of NV derived from L. johnsonii N6.2. The localization of significantly enriched proteins was determined using SEM and TEM with immunogold labeling, and Sdp domains, SH3b2 and SH3b6, were subsequently identified as biomarkers for host-microbe interactions. Materials and Methods Bacterial Strains Lactobacillus johnsonii N6.2, isolated from the gut of Biobreeding Diabetes-Resistant rats, was cultivated under anaerobic, static conditions in de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) media. As a control, L. johnsonii N6.2 was grown under aerobic conditions (100 rpm) until an OD600 of 0.5 was reached. For NV preparation, 500 mL of the MRS media was ultracentrifuged (Beckman) at 175,000 x g for 2 h, at 4°C to remove exosomes and extracellular vesicles that may be present in the yeast or beef extract used to make the media, followed by filter-sterilized (0.2 µm). L. johnsonii N6.2 was inoculated into the exosome-depleted-MRS at 1% (v/v) and incubated at 37°C to OD600 = 1 (early stationary phase). Escherichia coli DH5α and BL21 strains were cultivated in Luria broth supplemented with ampicillin (100 µg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and grown at 37°C for cloning and protein expression, respectively. Cell Fractionation, Isolation and Purification of L. johnsonii N6.2 NV 500 mL L. johnsonii N6.2 cultures were centrifuged at 20,000 x g for 20 min, at 4°C and the cell pellet was stored at -80°C until cell fractionation was needed. The supernatant was filter-sterilized (0.2 µm) to ensure the removal of residual bacterial cells. The filtered supernatant was then subjected to ultracentrifugation at 175,000 x g for 2 h, at 4°C. The resulting NV pellets were washed twice with PBS using the same parameters in previous ultracentrifugation steps. The NV pellet was stored at -80°C until further use or immediately used for quantification using Nanosight NS300 (Malvern instruments Ltd, Malvern, UK). For fractionation of the L. johnsonii N6.2 whole cells, the cell pellet was resuspended in PBS and subjected to cell lysis using a French press. The resulting lysed suspension was centrifuged at 20,000 x g for 20 min, at 4°C. The supernatant (cell-free extract/total protein extract, TE) was subjected to ultracentrifugation at 175,000 x g for 2 h, at 4°C. The pellet contained the cell membrane (CM) fraction, and the supernatant containing intracellular (IC) proteins was stored at -80°C until further use. The pellet was washed twice with PBS using previous ultracentrifugation parameters and then stored at -80°C. Nanoparticle Tracking Analysis Nanoparticle tracking analysis (NTA) determines size distribution and concentration of particles, utilizing light scattering and Brownian motion. Crude NV pellets were suspended in 400 µL of PBS. The suspension was diluted for optimal measurements and measured using NanoSight NS300 (Malvern instruments Ltd, Malvern, UK) in the University of Florida's cytometry core at the Interdisciplinary Center for Biotechnology Research. Videos were recorded for 60 s (five times), with the camera level at 15, and analyzed with NTA software 4.3 (Malvern instruments Ltd, Malvern, UK). To calculate the amount of NV per bacterial cell, a ratio of particles/CFU was performed. Calculating a ratio of 1.45 x 10 12 particles/L over 3.6 x 10 10 CFU/L estimates that ~40 NV are produced per bacterial cell. Untargeted Lipidomics Similar sized pellets (3 mg) of NV and CM were resuspended and washed in 1 mL of 1% NaCl (w/v). Samples were subsequently ultracentrifuged at 175,000 x g for 2 h, at 4°C. The resulting pellet was frozen at -80°C for 2 h. The pellets were introduced to the solvents chloroform, methanol and water in a ratio of 1:2:0.8 (v/v/v), respectively. The mixture stood for 18 h with occasional shaking and was then separated in a separatory funnel with a final chloroform, methanol, and water ratio of 1:1:0.9 (v/v/v). Lipids were extracted from the lower chloroform phase. The chloroform was evaporated in a thermo-heating block at 65°C under a fume hood. Lipids were resuspended in 500 µL of chloroform. Lipid concentration was determined using a colorimetric assay through a sulfuric acid/vanillin/phosphoric acid method. It was standardized against cholesterol dilutions (2mg/mL, 1 mg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 62.5 µg/mL, 31.3 µg/mL, 15.7 µg/mL). Global lipidomic profiling was conducted by the Mass Spectrometry core at the Southeast Center for Integrated Metabolomics at the University of Florida. It was performed on a Thermo Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer with Dionex UHPLC and autosampler. All samples were analyzed in positive and negative heated electrospray ionization with a mass resolution of 35,000 at m/z 200 as separate injections. Separation was achieved on an Acquity BEH C18 1.7 µm, 100 x 2.1 mm column with mobile phase A as 60:40 Acetonitrile:10 mM Ammonium formate with 0.1% formic acid in water and mobile phase B as 90:8:2 2-propanol: acetonitrile: 10mM ammonium formate with 0.1% formic acid in water. The flow rate was 500 µL/min with a column temperature of 50°C. 5 µL was injected for negative ions and 3 µL for positive ions. From both negative and positive ionization lipid determination, the data was analyzed through the normalization of each individual lipid's peak area over the sum of all the lipids' peak area detected within one sample of either NV or CM. To determine enriched lipids in each sample, a ratio of the average of NV lipids and an average of CM lipids was conducted. Average of NV over the average of CM lipids, or an average of CM over the average of NV lipids, with a ratio > 1.5 was considered enriched. Proteomics 3 mg of NV and CM pellet were resuspended in 1x Laemmli buffer (1M Tris pH 6.8, 100% glycerol, β-mercaptoethanol, DTT, SDS, and 0.005% bromophenol blue). The resulting suspension was incubated in a water bath at 40°C for 30 min. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was conducted using the mini-PROTEAN Tetra cell (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Fifteen µL of each sample (Total Extract, Intracellular Extract, Cell Membrane and Nanovesicles) was loaded into the corresponding wells, separating through a homogeneous SDS-PAGE gel (12.5%) for 40 mins at 200 V. The gel was stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). For proteomic analyses, polyacrylamide gel extracts of three biological replicates from nanovesicle and cell membrane protein samples were sent for mass spectroscopy. 15 µL of each sample was loaded into the corresponding wells, separating through a homogeneous SDS-PAGE gel (12.5%) at 200 V until the sample ran 1.5 cm into the gel. The gel was stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). LC-MS/MS was conducted on these samples by the Proteomics core at the Interdisciplinary Center for Biotechnology Research at the University of Florida. Using zip tip and trypsin in-gel digestion for each sample, each sample was run during a 2 h gradient on the Orbitrap-Fusion instrument. The LC-MS/MS raw data was analyzed with Scaffold software (version Scaffold_4.8.7; Proteome Software Inc., Portland, OR, USA). Protein identifications were considered positive by recognizing 2 or more peptide hits in at least one of the samples with a peptide threshold of 95% as validated by the Peptide Prophet Algorithm. Blast2Go (version 5.2.5) was used to obtain GO annotations curated from the Scaffold data against the Firmicute database created using Blast2GO with Firmicute data obtained from NCBI. Further analysis on specific proteins identified from the proteomic data included MultAlin, Phobius, TMHMM, and the signal peptide predictor server, SignalP 4.1. Data are available via ProteomeXchange with identifier PXD027785. Simple modular architecture research tool [SMART ( 28 , 29 )] was used to identify homologs to protein T285_RS00825. Non-redundant proteins were curated to generate a Newick tree and iTOL database of each protein domain. iTOL was used to generate a phylogenetic tree ( 30 ). Gene Cloning, Expression and Protein Purification Standard methods were used for L. johnsonii N6.2 genomic DNA isolation (QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit, Germantown, Maryland, USA), restriction enzyme digestion, agarose gel electrophoresis, ligation and transformation ( 31 , 32 ). The primers are listed in Table 1 . The p15TVL (GenBank accession EF456736) vector plasmids were isolated using the QIAprep ® Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Valencia, CA) and PCR products were purified using QIAquick purification kits (QIAGEN). The p15TVL plasmid clones were transformed into E. coli DH5α. Positive selection of transformed bacterial colonies were subjected to colony PCR to amplify the gene insert and verify that the sequence was correct and in frame with the plasmid by sequencing with T7 universal primers (Eton Bioscience). His-tagged fusion proteins were over-expressed in E. coli BL1 (DE3). Cells were grown in Luria Broth at 37°C to an optical density of ~0.8 and genes were overexpressed with 0.5 mM isopropyl-tiol-β-D-galactopyranoside (IPTG). After induction with IPTG, the cells were incubated at 17°C for 16 h and harvested by centrifugation at 7,800 x g for 20 min. Cells were resuspended in binding buffer (500 mM NaCl, 5% glycerol, 50 nM Tris, 5 mM imidazole, pH 8.0). For protein purification, cells were lysed using a French press and the lysates were centrifuged at 35,000 x g for 45 min. The supernatant was applied to a Ni 2+ affinity column. The column was washed with 200 mL of wash buffer (binding buffer with 25 mM imidazole) and the proteins were eluted with elution buffer (binding buffer with 250 mM imidazole). The purified proteins were dialyzed against 10 mM Tris (pH=8), 2.5% glycerol, 500 mM NaCl and 0.5 mM TCEP, and stored at -80°C ( 31 , 32 ). Protein concentrations were measured by Bradford assay (Bio-Rad). Bovine serum albumin (BSA; Gold BioTechnology, St. Louis, MO, USA) was used as the standard. Table 1 Primers used for cloning and protein purification. Primer Names Locus Tags Sequences (5'→3') SH3b2_Fw T285_RS00825 TTGTATTTCCAGGGCCCAAGTACAAACACTAACGTAAATA SH3b2_Rv T285_RS00825 CAAGCTTCGTCATCACTTTTCTGCTGGTTGACTT SH3b6_Fw T285_RS00825 TTGTATTTCCAGGGCGCTAATAAGCCTGTTCGACAAA SH3b6_Rv T285_RS00825 CAAGCTTCGTCATCATTATCTGTAAGTTCCCCATGCTT Enolase_Fw T285_RS03880 TTGTATTTCCAGGGCATGCTCAAATCAGTTATTGAG Enolase_Rv T285_RS03880 CAAGCTTCGTCATCATTAATCTAAGTCAACGTTGTC LexA_Fw T285_RS03645 TTGTATTTCCAGGGCATGACTGAACCACATGCAAA LexA_RV T285_RS03645 CAAGCTTCGTCATCATTAATCAATATTATTACGATATAGACC Polyclonal Antibody Generation Polyclonal antibodies were generated against purified LexA (T285_RS03645), Enolase (Eno3, T285_RS03880), Sdp_SH3b2 (domain from T285_RS00825) and Sdp_SH3b6 (domain from T285_RS00825) proteins. Approximately 2-3 mg of each protein was provided to Pacific Immunology. For the custom polyclonal antibody production, a 13-week immunization protocol was followed. Two New Zealand White rabbits were immunized against each protein with the first immunization in complete Freund's adjuvant and boosted with three immunizations with incomplete Freund's adjuvant. The polyclonal antibodies were purified through affinity column purification (Pacific Immunology Corp.). Western Blot Analysis Western blots were utilized to evaluate the sensitivity and specificity of each antibody. Purified proteins (LexA, Eno3, Sdp_SH3b6, Sdp_SH3b2), NV, and total protein extract (TE) collected from L. johnsonii N6.2 under anaerobic and aerobic conditions were loaded at different concentrations (100 ng, 1 µg, 10 µg, and 100 µg). Proteins were separated by SDS-PAGE (10%), at 200 V for 40 mins and transferred at 500 mA for 60 mins onto a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad) using a semi-dry blotting unit (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA). Membranes were blocked with 5% non-fat dry milk overnight at 4°C. Membranes were washed three times with 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) Tris buffered saline (TBS-T). Primary antibodies (anti-LexA, anti-Eno3, anti-Sdp_SH3b2 and anti-Sdp_SH3b6) were incubated in 5% non-fat dry milk overnight at 4°C, at a dilution of 1:1,000. Membranes were washed three times with TBS-T, and the secondary antibody, goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody conjugated to horseradish peroxidase (Abcam, Cambridge, MA, USA), was incubated in 5% non-fat dry milk for 1 h at room temperature, at a dilution of 1:2,500. Membranes were washed three times with TBS-T and visualized with ProSignal Femto Solution (Genesee Scientific, San Diego, CA, USA) using the automatic imager FluorChem R (Protein Simple, San Jose, CA, USA). Optiprep Density Gradient Purification Optiprep™ (60% w/v solution of iodixanol in water; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) density gradient ultracentrifugation was performed on the crude pellet of NV resulting from a 1.5 L culture. A working solution of 50% (w/v) iodixanol was made by mixing 5 volumes of 60% (w/v) Optiprep™ in one volume of 6x dilution solution (0.85% NaCl, 60 mM HEPES, pH 7.4). A discontinuous gradient of 50%, 45%, 40%, 35%, 30% and 25% was made by diluting the 50% iodixanol working solution with the 1x dilution solution (DS: 0.85% NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.4). Following ultracentrifugation, the crude NV pellet was dissolved in 0.333 mL of the 6x dilution solution and mixed with 1.667 mL of the Optiprep™ solution. The 50% iodixanol solution containing the sample was then overlaid with 2 mL of the 45%, 40%, 35%, 30% and 25% solutions. Ultracentrifugation was performed at 175,000 x g at 4°C for 16 h (SW 41 Ti rotor, Beckman Coulter). From the top, 1 mL fractions were collected and the refraction indices of each fraction was measured using a refractometer with corresponding densities being determined through Optiprep Application Sheet V01. This procedure was carried out twice to perform protein precipitation and to retrieve purified NV pellets. Each fraction was subjected to Trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation, with one volume of 100% TCA to four volumes of sample. The samples were incubated at -20°C for 20 min and centrifuged at 19,000 x g for five min. Protein pellets were washed three times with 200 µl of ice cold ethanol and centrifuged at 19,000 x g for five min. The pellets were subjected to drying to remove excess ethanol. The samples were immediately resuspended in 100 µl of 4x SDS sample buffer and boiled for 10 min prior to SDS PAGE. The samples were diluted by 1/5 and loaded into the gel at 15 µl per sample (fractions 1-12). Western blots were performed as stated in section 4.8. Fractions were washed in ~50 mL of DS and combined when necessary. Pellets obtained from the combined fractions 1-2, 3-5, 6-7, and 8-9 were resuspended in 200 µl of PBS, and size and concentration was determined through Nanosight NS300 as stated in section 4.3. Electron Microscopy L. johnsonii N6.2 was grown in exosome-free MRS for 24 h. Cells were obtained by centrifugation at 7,000 x g for 15 min, at 4°C, washed in exosome-free 0.9% peptone water (w/v) and fixed with 2% glutaraldehyde (v/v) in exosome-free 0.9% peptone water (w/v) at 4°C for transmission electron microscopy (TEM) and Trump's fixative solution (VWR, USA) for scanning electron microscopy (SEM). All electron microscopy imaging was conducted by the Microscopy core in the University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research. Scanning Electron Microscopy L. johnsonii N6.2 cultures were fixed with Trump's fixative solution (VWR, USA), placed onto 0.2 μm polycarbonate membrane and processed by Pelco BioWave Pro laboratory microwave (Ted Pella, Redding, CA, USA). The samples were washed three times with PBS (pH= 7.2), post-fixed with 1% buffered osmium tetroxide. After the post-fixation step, the samples were washed with distilled water and dehydrated with a graded ethanol series (25%, 50%, 75%, 95%, 100%). The final step was to preserve the surface structures of the samples by drying them in a critical point dryer (Autosamdri-815, Tousimis Research Corp, Rockville MD, USA). The samples were mounted on carbon adhesive tabs on aluminum specimen mounts and Au/Pd sputter coated (DeskV Denton Vacuum, Moorestown, NJ, USA). Digital micrographs were acquired by field-emission scanning electron microscope (SU-5000, Hitachi High Technologies America, Inc. Schaumburg, IL, USA). Transmission Electron Microscopy L. johnsonii N6.2 was fixed with 2% glutaraldehyde (v/v) in exosome-free 0.9% peptone water (w/v), at 4°C. Then cells were processed by Pelco BioWave Pro laboratory microwave (Ted Pella, Redding, CA, USA), washed with 0.1M sodium cacodylate buffer without lysine (pH=7.2), fixed with 1% glutaraldehyde/sodium cacodylate buffer containing 500 ppm ruthenium red, washed with sodium cacodylate buffer and post-fixed with buffered 1% osmium tetroxide (500 ppm ruthenium red). The samples were washed again with buffer and distilled water. Fixed cells were dehydrated with graded ethanol series (25%, 50%, 75%, 95%, 100%) followed by anhydrous acetone wash. Then samples were infiltrated in 30%, 50%, 70%, 100% Embed/Araldite epoxy resin containing Z6040 embedding primer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) and cured at 60°C for 48 h. Ultra-thin sections were collected on 100 mesh carbon coated Fromvar copper grids, post-stained with UranyLess and 3% Reynold's lead citrate for one minute each. Sections were examined with a FEI Tecnai G2 Spirit Twin TEM (FEI Corp., Hillsboro, OR, USA) and digital images were acquired with a Gatan UltraScan 2k x 2k camera and Digital Micrograph software (Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA). The NV were processed for TEM using a glow discharged carbon coated Formvar 400 mesh copper grid floated onto 10 µL droplet of sample for 5 minutes. Excess solution was dabbed off with filter paper and grid was floated on 1% uranyl acetate for 30 seconds. Stain was removed with filter paper, air dried, and examined with FEI Tecnai G2 Spirit Twin TEM (FEI Corp., Hillsboro, OR, USA). Digital images were acquired with Gatan UltraScan 2k x 2k camera and Digital Micrograph software (Gatan, Inc., Pleasaton, CA, USA). Cryo-Transmission Electron Microscopy Three microliter aliquots of the NV were applied to C-flat holey carbon grids (Protochips, Inc.) and vitrified using a Vitrobot™ Mark IV (FEI Co.) operated at 4°C and with ~90% humidity in the control chamber. The vitrified sample was stored under liquid nitrogen and transferred into a Gatan cryo-holder (Model 626/70) for imaging. The sample was examined using a 4k x 4k CCD camera (Gatan, Inc.) on a Tecnai (FEI Co.) G2 F20-TWIN Transmission Electron Microscope operated at a voltage of 200 kV using low dose conditions (~20 e/à 2). Images were recorded with a defocus of approximately -2µm to improve contrast. Immunogold Electron Microscopy Immuno-Transmission Electron Microscopy (iTEM) For immunoelectron microscopy, L. johnsonii N6.2 cells were resuspended into primary fixative containing 4% paraformaldehyde and 0.5% glutaraldehyde, in exosome-free 0.9% peptone water (w/v). Fixed cells were processed with the aid of a Pelco BioWave Pro laboratory microwave (Ted, Pella, Redding CA, USA) and SBT digital orbital shaker (Southwest Science, Trenton, NJ, USA). Samples were washed several times in exosome-free 0.9% peptone water (w/v) and encapsulated in buffered 3% agarose. Specimen was water washed and dehydrated in a graded ethanol series, 25%, 50%, 75%, 95%, and 100% followed by 100% anhydrous ethanol. Dehydrated samples were infiltrated in ethanol-lowicryl HM20 resin with Z6040 embedding primer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) at 50% and 100%, and UV cured at -20°C for 24 h. Ultra-thin sections (120 nm) were collected on Formvar-carbon coated 100 mesh nickel grids. Immunogold labeling for Transmission Electron Microscopy (TEM): Immunogold labeling was performed by exposure of the ultrathin sections at room temperature as follows: sections were treated with NH 4 Cl in high-salt tween (HST) buffer, rinsed with HST, incubated in a blocking solution (1% non-fat dry milk, 0.5% cold water fish skin gelatin, 0.01% Tween-20 in HST), and incubated overnight at 4°C in a moist chamber, in primary antibody (Anti-LexA, Anti-Sdp_SH3b2, Anti-Sdp_SH3b6, and Anti-enolase at 1:200 dilution). Negative control was established by replacing primary antibody with HST. Sections were washed in HST, followed by PBS, and incubated with a goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody conjugated to 12 nm colloidal gold in a 1:20 dilution (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA). Sections were further washed in PBS, fixed in Trump's fixative (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), water washed, and post-stained with 2% uranyl acetate and Reynold's lead citrate. TEM Imaging: Sections were examined with a FEI Tecnai G2 Spirit Twin TEM (FEI Corp., Hillsboro, OR) operated at 120 kV, and digital images were randomly acquired with a Gatan UltraScan 2k x 2k camera and Digital Micrograph software (Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA). Immuno-Scanning Electron Microscopy (iSEM) Cells were resuspended into primary fixative containing 4% paraformaldehyde and 0.5% glutaraldehyde, in 0.5% peptone water (w/v). Cells (1:50 dilution) were deposited onto poly-L-lysine treated 0.2 μm membrane filters. Filters were incubated onto primary fixative overnight at 4°C in a moist chamber. After fixation, immunogold labeling was performed by exposure of the filters at room temperature as follows: filters were treated with NH4Cl in HST, rinsed with HST, incubated in a blocking solution (1% non-fat dry milk, 0.5% cold water fish skin gelatin, 0.01% Tween-20 in HST), and incubated overnight at 4°C in a moist chamber, in primary antibody (Anti- LexA, Anti-Sdp_SH3b2, Anti-Sdp_SH3b6, and Anti-enolase at 1:200 dilution). Negative control was established by replacing primary antibody with HST. Filters were washed in HST, followed by PBS, and incubated with a goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody conjugated to 12 nm colloidal gold (1:20 dilution; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), washed in PBS, fixed in Trump's fixative (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), and water washed. After immunogold labeling, the filters were processed for SEM with the aid of a Pelco BioWave laboratory microwave (Ted, Pella, Redding CA, USA). Filters were dehydrated in a graded ethanol series 25%, 50%, 75%, 95%, 100% and critical point dried (autosamdri-815, Tousimis, Rockville, MD, USA). Filters were mounted on carbon adhesive tabs on aluminum specimen mounts, and carbon coated (Cressington 328/308R, Ted Pella, Redding, CA, USA). Samples were kept under house vacuum until ready to image. SEM Imaging: Specimens were examined with secondary electrons (SE) and backscatter electrons (BSE), and digital micrographs were randomly acquired with a field-emission SEM (SU-5000, Hitachi High Technologies America, Schaumburg, IL, USA) operated at 5 kV. Immunogold particles from both iTEM and iSEM were expressed as percentages of each cellular fraction/NV-like structures to the overall amount of immunogold particles detecting each protein. Further analysis was conducted to express the amount of immunogold particles in each cellular fraction/NV-like structure per image. For iTEM, 19 images were counted per protein, whereas 15 images were counted per protein. Culture, Immunofluorescence Staining and Confocal Microscopy of Caco-2 Cells Human epithelial intestinal Caco-2 cells were cultured in 75 cm 2 flasks (Thermo Fisher Scientific, Denmark) in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC, Manassas, VA, USA) supplemented with 15% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2% of 10,000 units of penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 µg of amphotericin B per mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and maintained in an incubator at 37°C, 95% relative humidity, and 5% CO 2 . To ensure adherence to the coverslips used for imaging, each coverslip was placed into a well within a 6-well plate and treated with 1 mL of 50 µg/mL Poly-D-Lysine hydrobromide solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). The coverslips were incubated in the solution for 3 h. After the incubation, the Poly-D-Lysine hydrobromide solution was removed and the treated coverslips were rinsed with 1 mL of sterile water and allowed to dry before introducing the cells. Caco-2 cells were seeded onto a 6-well plate containing Poly-D-Lysine treated coverslips at 3x10 5 cells per well, in 2 mL of Caco-2 medium. The cells were incubated for 48 h to reach confluence. Once the cells reached confluence, they were treated with Caco-2 medium containing 1x10 10 crude vesicles, 1x10 10 purified vesicles, or the vesicle suspension buffer (PBS) as a control. The cells were incubated for 30 minutes with their respective treatments. After incubation, the cells were rinsed once with 1 mL of 1x PBS and subsequently fixed using 4% paraformaldehyde in 1 mL of PBS for 10 min. Cells were rinsed with PBS containing 10 mM glycine and 0.2% sodium azide (PBS-GSA) between each step. After fixing, the cells were incubated with 1 mL of Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) containing 1 µg/mL Wheat Germ Agglutinin, and Alexa Fluor 488 conjugate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) per well and incubated for 10 minutes to stain the cell membrane. To ensure the Wheat Germ Agglutinin did not stain internal membrane structures, cells were fixed again with 1 mL of 4% paraformaldehyde in PBS for 10 minutes. Cells are permeabilized by treating them with 1 mL of PBS-GSA containing 0.5% Triton X-100 per well for three minutes and blocked with 1 mL of PBS-GSA containing 1% BSA and 0.1% TWEEN 20 per well for 30 minutes. The coverslips were then incubated with PBS-GSA 1% BSA containing 1:100 of the primary anti-Sdp_SH3b2 antibody and incubated for 30 minutes. After removing the primary antibody solution, the cells were rinsed and treated with PBS-GSA 1% BSA containing 1:200 of the secondary goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody– Texas Red antibody conjugate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). The secondary antibody solution was removed, and the cells were rinsed with PBS. The coverslip was then mounted onto a slide using ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). The cells were incubated in the dark, at room temperature for 24 h and images were captured using a Zeiss LSM 800 confocal microscope utilizing C-Apochromat 40x/1.20 W Korr objective (Carl Zeiss, Berlin, Germany). Images were captured and processed using the ZEN 2.3 blue edition software ( https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html ). Immunoglobulin ELISA Assay IgA, IgM and IgG Human enzyme-linked immunoassay (ELISA) kits (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) were used following the manufacturer protocols. For each assay, NV and purified proteins (LexA, Eno3, Sdp_SH3b6, Sdp_SH3b2) were coated at 50 µg/ml. Coating with IgA, IgG and IgM were included for the standard calibration curves following the manufacturer recommended concentrations, as well as for determinations of total IgA, IgG and IgM. Plasma samples obtained from a prior human trial where participants were administered a placebo or L. johnsonii N6.2 (IRB # 201400370) were tested in triplicate. Antigens were coated on 96-well plates and incubated against the plasma samples of each subject per each timepoint. The primary (anti-IgM, anti-IgA, and anti-IgG) and the secondary (conjugated with horseradish peroxidase) antibodies were used to determine the concentration of specific ACAb to each antigen. Serial dilutions of each plasma sample were used to determine the adequate dilution to detect the specific ACAb. For IgA and IgM, the optimum serum dilution was 1/5 for all antigens, and for total IgA and IgM, dilutions 1/10000 and 1/5000 were optimal, respectively. For IgG, each dilution for each antigen remained variable per subject, however, total IgG had an optimal dilution of 1/50000. The data was expressed as mg/dL and was then normalized by a ratio of specific Ig: total Ig, multiplied by the plasma sample with the highest average total Ig value. Statistical Analysis For both proteomic and lipid analysis, a bivariate analysis was performed using student's t-test. Blast2Go statistical analysis was determined based on enriched proteins of NV and CM using an enrichment analysis (Fischer's Exact test) with a cutoff of a false discovery rate (FDR) 1.5 was considered enriched. Proteomics 3 mg of NV and CM pellet were resuspended in 1x Laemmli buffer (1M Tris pH 6.8, 100% glycerol, β-mercaptoethanol, DTT, SDS, and 0.005% bromophenol blue). The resulting suspension was incubated in a water bath at 40°C for 30 min. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was conducted using the mini-PROTEAN Tetra cell (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Fifteen µL of each sample (Total Extract, Intracellular Extract, Cell Membrane and Nanovesicles) was loaded into the corresponding wells, separating through a homogeneous SDS-PAGE gel (12.5%) for 40 mins at 200 V. The gel was stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). For proteomic analyses, polyacrylamide gel extracts of three biological replicates from nanovesicle and cell membrane protein samples were sent for mass spectroscopy. 15 µL of each sample was loaded into the corresponding wells, separating through a homogeneous SDS-PAGE gel (12.5%) at 200 V until the sample ran 1.5 cm into the gel. The gel was stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). LC-MS/MS was conducted on these samples by the Proteomics core at the Interdisciplinary Center for Biotechnology Research at the University of Florida. Using zip tip and trypsin in-gel digestion for each sample, each sample was run during a 2 h gradient on the Orbitrap-Fusion instrument. The LC-MS/MS raw data was analyzed with Scaffold software (version Scaffold_4.8.7; Proteome Software Inc., Portland, OR, USA). Protein identifications were considered positive by recognizing 2 or more peptide hits in at least one of the samples with a peptide threshold of 95% as validated by the Peptide Prophet Algorithm. Blast2Go (version 5.2.5) was used to obtain GO annotations curated from the Scaffold data against the Firmicute database created using Blast2GO with Firmicute data obtained from NCBI. Further analysis on specific proteins identified from the proteomic data included MultAlin, Phobius, TMHMM, and the signal peptide predictor server, SignalP 4.1. Data are available via ProteomeXchange with identifier PXD027785. Simple modular architecture research tool [SMART ( 28 , 29 )] was used to identify homologs to protein T285_RS00825. Non-redundant proteins were curated to generate a Newick tree and iTOL database of each protein domain. iTOL was used to generate a phylogenetic tree ( 30 ). Gene Cloning, Expression and Protein Purification Standard methods were used for L. johnsonii N6.2 genomic DNA isolation (QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit, Germantown, Maryland, USA), restriction enzyme digestion, agarose gel electrophoresis, ligation and transformation ( 31 , 32 ). The primers are listed in Table 1 . The p15TVL (GenBank accession EF456736) vector plasmids were isolated using the QIAprep ® Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Valencia, CA) and PCR products were purified using QIAquick purification kits (QIAGEN). The p15TVL plasmid clones were transformed into E. coli DH5α. Positive selection of transformed bacterial colonies were subjected to colony PCR to amplify the gene insert and verify that the sequence was correct and in frame with the plasmid by sequencing with T7 universal primers (Eton Bioscience). His-tagged fusion proteins were over-expressed in E. coli BL1 (DE3). Cells were grown in Luria Broth at 37°C to an optical density of ~0.8 and genes were overexpressed with 0.5 mM isopropyl-tiol-β-D-galactopyranoside (IPTG). After induction with IPTG, the cells were incubated at 17°C for 16 h and harvested by centrifugation at 7,800 x g for 20 min. Cells were resuspended in binding buffer (500 mM NaCl, 5% glycerol, 50 nM Tris, 5 mM imidazole, pH 8.0). For protein purification, cells were lysed using a French press and the lysates were centrifuged at 35,000 x g for 45 min. The supernatant was applied to a Ni 2+ affinity column. The column was washed with 200 mL of wash buffer (binding buffer with 25 mM imidazole) and the proteins were eluted with elution buffer (binding buffer with 250 mM imidazole). The purified proteins were dialyzed against 10 mM Tris (pH=8), 2.5% glycerol, 500 mM NaCl and 0.5 mM TCEP, and stored at -80°C ( 31 , 32 ). Protein concentrations were measured by Bradford assay (Bio-Rad). Bovine serum albumin (BSA; Gold BioTechnology, St. Louis, MO, USA) was used as the standard. Table 1 Primers used for cloning and protein purification. Primer Names Locus Tags Sequences (5'→3') SH3b2_Fw T285_RS00825 TTGTATTTCCAGGGCCCAAGTACAAACACTAACGTAAATA SH3b2_Rv T285_RS00825 CAAGCTTCGTCATCACTTTTCTGCTGGTTGACTT SH3b6_Fw T285_RS00825 TTGTATTTCCAGGGCGCTAATAAGCCTGTTCGACAAA SH3b6_Rv T285_RS00825 CAAGCTTCGTCATCATTATCTGTAAGTTCCCCATGCTT Enolase_Fw T285_RS03880 TTGTATTTCCAGGGCATGCTCAAATCAGTTATTGAG Enolase_Rv T285_RS03880 CAAGCTTCGTCATCATTAATCTAAGTCAACGTTGTC LexA_Fw T285_RS03645 TTGTATTTCCAGGGCATGACTGAACCACATGCAAA LexA_RV T285_RS03645 CAAGCTTCGTCATCATTAATCAATATTATTACGATATAGACC Polyclonal Antibody Generation Polyclonal antibodies were generated against purified LexA (T285_RS03645), Enolase (Eno3, T285_RS03880), Sdp_SH3b2 (domain from T285_RS00825) and Sdp_SH3b6 (domain from T285_RS00825) proteins. Approximately 2-3 mg of each protein was provided to Pacific Immunology. For the custom polyclonal antibody production, a 13-week immunization protocol was followed. Two New Zealand White rabbits were immunized against each protein with the first immunization in complete Freund's adjuvant and boosted with three immunizations with incomplete Freund's adjuvant. The polyclonal antibodies were purified through affinity column purification (Pacific Immunology Corp.). Western Blot Analysis Western blots were utilized to evaluate the sensitivity and specificity of each antibody. Purified proteins (LexA, Eno3, Sdp_SH3b6, Sdp_SH3b2), NV, and total protein extract (TE) collected from L. johnsonii N6.2 under anaerobic and aerobic conditions were loaded at different concentrations (100 ng, 1 µg, 10 µg, and 100 µg). Proteins were separated by SDS-PAGE (10%), at 200 V for 40 mins and transferred at 500 mA for 60 mins onto a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad) using a semi-dry blotting unit (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA). Membranes were blocked with 5% non-fat dry milk overnight at 4°C. Membranes were washed three times with 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) Tris buffered saline (TBS-T). Primary antibodies (anti-LexA, anti-Eno3, anti-Sdp_SH3b2 and anti-Sdp_SH3b6) were incubated in 5% non-fat dry milk overnight at 4°C, at a dilution of 1:1,000. Membranes were washed three times with TBS-T, and the secondary antibody, goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody conjugated to horseradish peroxidase (Abcam, Cambridge, MA, USA), was incubated in 5% non-fat dry milk for 1 h at room temperature, at a dilution of 1:2,500. Membranes were washed three times with TBS-T and visualized with ProSignal Femto Solution (Genesee Scientific, San Diego, CA, USA) using the automatic imager FluorChem R (Protein Simple, San Jose, CA, USA). Optiprep Density Gradient Purification Optiprep™ (60% w/v solution of iodixanol in water; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) density gradient ultracentrifugation was performed on the crude pellet of NV resulting from a 1.5 L culture. A working solution of 50% (w/v) iodixanol was made by mixing 5 volumes of 60% (w/v) Optiprep™ in one volume of 6x dilution solution (0.85% NaCl, 60 mM HEPES, pH 7.4). A discontinuous gradient of 50%, 45%, 40%, 35%, 30% and 25% was made by diluting the 50% iodixanol working solution with the 1x dilution solution (DS: 0.85% NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.4). Following ultracentrifugation, the crude NV pellet was dissolved in 0.333 mL of the 6x dilution solution and mixed with 1.667 mL of the Optiprep™ solution. The 50% iodixanol solution containing the sample was then overlaid with 2 mL of the 45%, 40%, 35%, 30% and 25% solutions. Ultracentrifugation was performed at 175,000 x g at 4°C for 16 h (SW 41 Ti rotor, Beckman Coulter). From the top, 1 mL fractions were collected and the refraction indices of each fraction was measured using a refractometer with corresponding densities being determined through Optiprep Application Sheet V01. This procedure was carried out twice to perform protein precipitation and to retrieve purified NV pellets. Each fraction was subjected to Trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation, with one volume of 100% TCA to four volumes of sample. The samples were incubated at -20°C for 20 min and centrifuged at 19,000 x g for five min. Protein pellets were washed three times with 200 µl of ice cold ethanol and centrifuged at 19,000 x g for five min. The pellets were subjected to drying to remove excess ethanol. The samples were immediately resuspended in 100 µl of 4x SDS sample buffer and boiled for 10 min prior to SDS PAGE. The samples were diluted by 1/5 and loaded into the gel at 15 µl per sample (fractions 1-12). Western blots were performed as stated in section 4.8. Fractions were washed in ~50 mL of DS and combined when necessary. Pellets obtained from the combined fractions 1-2, 3-5, 6-7, and 8-9 were resuspended in 200 µl of PBS, and size and concentration was determined through Nanosight NS300 as stated in section 4.3. Electron Microscopy L. johnsonii N6.2 was grown in exosome-free MRS for 24 h. Cells were obtained by centrifugation at 7,000 x g for 15 min, at 4°C, washed in exosome-free 0.9% peptone water (w/v) and fixed with 2% glutaraldehyde (v/v) in exosome-free 0.9% peptone water (w/v) at 4°C for transmission electron microscopy (TEM) and Trump's fixative solution (VWR, USA) for scanning electron microscopy (SEM). All electron microscopy imaging was conducted by the Microscopy core in the University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research. Scanning Electron Microscopy L. johnsonii N6.2 cultures were fixed with Trump's fixative solution (VWR, USA), placed onto 0.2 μm polycarbonate membrane and processed by Pelco BioWave Pro laboratory microwave (Ted Pella, Redding, CA, USA). The samples were washed three times with PBS (pH= 7.2), post-fixed with 1% buffered osmium tetroxide. After the post-fixation step, the samples were washed with distilled water and dehydrated with a graded ethanol series (25%, 50%, 75%, 95%, 100%). The final step was to preserve the surface structures of the samples by drying them in a critical point dryer (Autosamdri-815, Tousimis Research Corp, Rockville MD, USA). The samples were mounted on carbon adhesive tabs on aluminum specimen mounts and Au/Pd sputter coated (DeskV Denton Vacuum, Moorestown, NJ, USA). Digital micrographs were acquired by field-emission scanning electron microscope (SU-5000, Hitachi High Technologies America, Inc. Schaumburg, IL, USA). Transmission Electron Microscopy L. johnsonii N6.2 was fixed with 2% glutaraldehyde (v/v) in exosome-free 0.9% peptone water (w/v), at 4°C. Then cells were processed by Pelco BioWave Pro laboratory microwave (Ted Pella, Redding, CA, USA), washed with 0.1M sodium cacodylate buffer without lysine (pH=7.2), fixed with 1% glutaraldehyde/sodium cacodylate buffer containing 500 ppm ruthenium red, washed with sodium cacodylate buffer and post-fixed with buffered 1% osmium tetroxide (500 ppm ruthenium red). The samples were washed again with buffer and distilled water. Fixed cells were dehydrated with graded ethanol series (25%, 50%, 75%, 95%, 100%) followed by anhydrous acetone wash. Then samples were infiltrated in 30%, 50%, 70%, 100% Embed/Araldite epoxy resin containing Z6040 embedding primer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) and cured at 60°C for 48 h. Ultra-thin sections were collected on 100 mesh carbon coated Fromvar copper grids, post-stained with UranyLess and 3% Reynold's lead citrate for one minute each. Sections were examined with a FEI Tecnai G2 Spirit Twin TEM (FEI Corp., Hillsboro, OR, USA) and digital images were acquired with a Gatan UltraScan 2k x 2k camera and Digital Micrograph software (Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA). The NV were processed for TEM using a glow discharged carbon coated Formvar 400 mesh copper grid floated onto 10 µL droplet of sample for 5 minutes. Excess solution was dabbed off with filter paper and grid was floated on 1% uranyl acetate for 30 seconds. Stain was removed with filter paper, air dried, and examined with FEI Tecnai G2 Spirit Twin TEM (FEI Corp., Hillsboro, OR, USA). Digital images were acquired with Gatan UltraScan 2k x 2k camera and Digital Micrograph software (Gatan, Inc., Pleasaton, CA, USA). Cryo-Transmission Electron Microscopy Three microliter aliquots of the NV were applied to C-flat holey carbon grids (Protochips, Inc.) and vitrified using a Vitrobot™ Mark IV (FEI Co.) operated at 4°C and with ~90% humidity in the control chamber. The vitrified sample was stored under liquid nitrogen and transferred into a Gatan cryo-holder (Model 626/70) for imaging. The sample was examined using a 4k x 4k CCD camera (Gatan, Inc.) on a Tecnai (FEI Co.) G2 F20-TWIN Transmission Electron Microscope operated at a voltage of 200 kV using low dose conditions (~20 e/à 2). Images were recorded with a defocus of approximately -2µm to improve contrast. Immunogold Electron Microscopy Immuno-Transmission Electron Microscopy (iTEM) For immunoelectron microscopy, L. johnsonii N6.2 cells were resuspended into primary fixative containing 4% paraformaldehyde and 0.5% glutaraldehyde, in exosome-free 0.9% peptone water (w/v). Fixed cells were processed with the aid of a Pelco BioWave Pro laboratory microwave (Ted, Pella, Redding CA, USA) and SBT digital orbital shaker (Southwest Science, Trenton, NJ, USA). Samples were washed several times in exosome-free 0.9% peptone water (w/v) and encapsulated in buffered 3% agarose. Specimen was water washed and dehydrated in a graded ethanol series, 25%, 50%, 75%, 95%, and 100% followed by 100% anhydrous ethanol. Dehydrated samples were infiltrated in ethanol-lowicryl HM20 resin with Z6040 embedding primer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) at 50% and 100%, and UV cured at -20°C for 24 h. Ultra-thin sections (120 nm) were collected on Formvar-carbon coated 100 mesh nickel grids. Immunogold labeling for Transmission Electron Microscopy (TEM): Immunogold labeling was performed by exposure of the ultrathin sections at room temperature as follows: sections were treated with NH 4 Cl in high-salt tween (HST) buffer, rinsed with HST, incubated in a blocking solution (1% non-fat dry milk, 0.5% cold water fish skin gelatin, 0.01% Tween-20 in HST), and incubated overnight at 4°C in a moist chamber, in primary antibody (Anti-LexA, Anti-Sdp_SH3b2, Anti-Sdp_SH3b6, and Anti-enolase at 1:200 dilution). Negative control was established by replacing primary antibody with HST. Sections were washed in HST, followed by PBS, and incubated with a goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody conjugated to 12 nm colloidal gold in a 1:20 dilution (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA). Sections were further washed in PBS, fixed in Trump's fixative (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), water washed, and post-stained with 2% uranyl acetate and Reynold's lead citrate. TEM Imaging: Sections were examined with a FEI Tecnai G2 Spirit Twin TEM (FEI Corp., Hillsboro, OR) operated at 120 kV, and digital images were randomly acquired with a Gatan UltraScan 2k x 2k camera and Digital Micrograph software (Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA). Immuno-Scanning Electron Microscopy (iSEM) Cells were resuspended into primary fixative containing 4% paraformaldehyde and 0.5% glutaraldehyde, in 0.5% peptone water (w/v). Cells (1:50 dilution) were deposited onto poly-L-lysine treated 0.2 μm membrane filters. Filters were incubated onto primary fixative overnight at 4°C in a moist chamber. After fixation, immunogold labeling was performed by exposure of the filters at room temperature as follows: filters were treated with NH4Cl in HST, rinsed with HST, incubated in a blocking solution (1% non-fat dry milk, 0.5% cold water fish skin gelatin, 0.01% Tween-20 in HST), and incubated overnight at 4°C in a moist chamber, in primary antibody (Anti- LexA, Anti-Sdp_SH3b2, Anti-Sdp_SH3b6, and Anti-enolase at 1:200 dilution). Negative control was established by replacing primary antibody with HST. Filters were washed in HST, followed by PBS, and incubated with a goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody conjugated to 12 nm colloidal gold (1:20 dilution; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), washed in PBS, fixed in Trump's fixative (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), and water washed. After immunogold labeling, the filters were processed for SEM with the aid of a Pelco BioWave laboratory microwave (Ted, Pella, Redding CA, USA). Filters were dehydrated in a graded ethanol series 25%, 50%, 75%, 95%, 100% and critical point dried (autosamdri-815, Tousimis, Rockville, MD, USA). Filters were mounted on carbon adhesive tabs on aluminum specimen mounts, and carbon coated (Cressington 328/308R, Ted Pella, Redding, CA, USA). Samples were kept under house vacuum until ready to image. SEM Imaging: Specimens were examined with secondary electrons (SE) and backscatter electrons (BSE), and digital micrographs were randomly acquired with a field-emission SEM (SU-5000, Hitachi High Technologies America, Schaumburg, IL, USA) operated at 5 kV. Immunogold particles from both iTEM and iSEM were expressed as percentages of each cellular fraction/NV-like structures to the overall amount of immunogold particles detecting each protein. Further analysis was conducted to express the amount of immunogold particles in each cellular fraction/NV-like structure per image. For iTEM, 19 images were counted per protein, whereas 15 images were counted per protein. Immuno-Transmission Electron Microscopy (iTEM) For immunoelectron microscopy, L. johnsonii N6.2 cells were resuspended into primary fixative containing 4% paraformaldehyde and 0.5% glutaraldehyde, in exosome-free 0.9% peptone water (w/v). Fixed cells were processed with the aid of a Pelco BioWave Pro laboratory microwave (Ted, Pella, Redding CA, USA) and SBT digital orbital shaker (Southwest Science, Trenton, NJ, USA). Samples were washed several times in exosome-free 0.9% peptone water (w/v) and encapsulated in buffered 3% agarose. Specimen was water washed and dehydrated in a graded ethanol series, 25%, 50%, 75%, 95%, and 100% followed by 100% anhydrous ethanol. Dehydrated samples were infiltrated in ethanol-lowicryl HM20 resin with Z6040 embedding primer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) at 50% and 100%, and UV cured at -20°C for 24 h. Ultra-thin sections (120 nm) were collected on Formvar-carbon coated 100 mesh nickel grids. Immunogold labeling for Transmission Electron Microscopy (TEM): Immunogold labeling was performed by exposure of the ultrathin sections at room temperature as follows: sections were treated with NH 4 Cl in high-salt tween (HST) buffer, rinsed with HST, incubated in a blocking solution (1% non-fat dry milk, 0.5% cold water fish skin gelatin, 0.01% Tween-20 in HST), and incubated overnight at 4°C in a moist chamber, in primary antibody (Anti-LexA, Anti-Sdp_SH3b2, Anti-Sdp_SH3b6, and Anti-enolase at 1:200 dilution). Negative control was established by replacing primary antibody with HST. Sections were washed in HST, followed by PBS, and incubated with a goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody conjugated to 12 nm colloidal gold in a 1:20 dilution (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA). Sections were further washed in PBS, fixed in Trump's fixative (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), water washed, and post-stained with 2% uranyl acetate and Reynold's lead citrate. TEM Imaging: Sections were examined with a FEI Tecnai G2 Spirit Twin TEM (FEI Corp., Hillsboro, OR) operated at 120 kV, and digital images were randomly acquired with a Gatan UltraScan 2k x 2k camera and Digital Micrograph software (Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA). Immuno-Scanning Electron Microscopy (iSEM) Cells were resuspended into primary fixative containing 4% paraformaldehyde and 0.5% glutaraldehyde, in 0.5% peptone water (w/v). Cells (1:50 dilution) were deposited onto poly-L-lysine treated 0.2 μm membrane filters. Filters were incubated onto primary fixative overnight at 4°C in a moist chamber. After fixation, immunogold labeling was performed by exposure of the filters at room temperature as follows: filters were treated with NH4Cl in HST, rinsed with HST, incubated in a blocking solution (1% non-fat dry milk, 0.5% cold water fish skin gelatin, 0.01% Tween-20 in HST), and incubated overnight at 4°C in a moist chamber, in primary antibody (Anti- LexA, Anti-Sdp_SH3b2, Anti-Sdp_SH3b6, and Anti-enolase at 1:200 dilution). Negative control was established by replacing primary antibody with HST. Filters were washed in HST, followed by PBS, and incubated with a goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody conjugated to 12 nm colloidal gold (1:20 dilution; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), washed in PBS, fixed in Trump's fixative (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), and water washed. After immunogold labeling, the filters were processed for SEM with the aid of a Pelco BioWave laboratory microwave (Ted, Pella, Redding CA, USA). Filters were dehydrated in a graded ethanol series 25%, 50%, 75%, 95%, 100% and critical point dried (autosamdri-815, Tousimis, Rockville, MD, USA). Filters were mounted on carbon adhesive tabs on aluminum specimen mounts, and carbon coated (Cressington 328/308R, Ted Pella, Redding, CA, USA). Samples were kept under house vacuum until ready to image. SEM Imaging: Specimens were examined with secondary electrons (SE) and backscatter electrons (BSE), and digital micrographs were randomly acquired with a field-emission SEM (SU-5000, Hitachi High Technologies America, Schaumburg, IL, USA) operated at 5 kV. Immunogold particles from both iTEM and iSEM were expressed as percentages of each cellular fraction/NV-like structures to the overall amount of immunogold particles detecting each protein. Further analysis was conducted to express the amount of immunogold particles in each cellular fraction/NV-like structure per image. For iTEM, 19 images were counted per protein, whereas 15 images were counted per protein. Culture, Immunofluorescence Staining and Confocal Microscopy of Caco-2 Cells Human epithelial intestinal Caco-2 cells were cultured in 75 cm 2 flasks (Thermo Fisher Scientific, Denmark) in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC, Manassas, VA, USA) supplemented with 15% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2% of 10,000 units of penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 µg of amphotericin B per mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and maintained in an incubator at 37°C, 95% relative humidity, and 5% CO 2 . To ensure adherence to the coverslips used for imaging, each coverslip was placed into a well within a 6-well plate and treated with 1 mL of 50 µg/mL Poly-D-Lysine hydrobromide solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). The coverslips were incubated in the solution for 3 h. After the incubation, the Poly-D-Lysine hydrobromide solution was removed and the treated coverslips were rinsed with 1 mL of sterile water and allowed to dry before introducing the cells. Caco-2 cells were seeded onto a 6-well plate containing Poly-D-Lysine treated coverslips at 3x10 5 cells per well, in 2 mL of Caco-2 medium. The cells were incubated for 48 h to reach confluence. Once the cells reached confluence, they were treated with Caco-2 medium containing 1x10 10 crude vesicles, 1x10 10 purified vesicles, or the vesicle suspension buffer (PBS) as a control. The cells were incubated for 30 minutes with their respective treatments. After incubation, the cells were rinsed once with 1 mL of 1x PBS and subsequently fixed using 4% paraformaldehyde in 1 mL of PBS for 10 min. Cells were rinsed with PBS containing 10 mM glycine and 0.2% sodium azide (PBS-GSA) between each step. After fixing, the cells were incubated with 1 mL of Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) containing 1 µg/mL Wheat Germ Agglutinin, and Alexa Fluor 488 conjugate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) per well and incubated for 10 minutes to stain the cell membrane. To ensure the Wheat Germ Agglutinin did not stain internal membrane structures, cells were fixed again with 1 mL of 4% paraformaldehyde in PBS for 10 minutes. Cells are permeabilized by treating them with 1 mL of PBS-GSA containing 0.5% Triton X-100 per well for three minutes and blocked with 1 mL of PBS-GSA containing 1% BSA and 0.1% TWEEN 20 per well for 30 minutes. The coverslips were then incubated with PBS-GSA 1% BSA containing 1:100 of the primary anti-Sdp_SH3b2 antibody and incubated for 30 minutes. After removing the primary antibody solution, the cells were rinsed and treated with PBS-GSA 1% BSA containing 1:200 of the secondary goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody– Texas Red antibody conjugate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). The secondary antibody solution was removed, and the cells were rinsed with PBS. The coverslip was then mounted onto a slide using ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). The cells were incubated in the dark, at room temperature for 24 h and images were captured using a Zeiss LSM 800 confocal microscope utilizing C-Apochromat 40x/1.20 W Korr objective (Carl Zeiss, Berlin, Germany). Images were captured and processed using the ZEN 2.3 blue edition software ( https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html ). Immunoglobulin ELISA Assay IgA, IgM and IgG Human enzyme-linked immunoassay (ELISA) kits (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) were used following the manufacturer protocols. For each assay, NV and purified proteins (LexA, Eno3, Sdp_SH3b6, Sdp_SH3b2) were coated at 50 µg/ml. Coating with IgA, IgG and IgM were included for the standard calibration curves following the manufacturer recommended concentrations, as well as for determinations of total IgA, IgG and IgM. Plasma samples obtained from a prior human trial where participants were administered a placebo or L. johnsonii N6.2 (IRB # 201400370) were tested in triplicate. Antigens were coated on 96-well plates and incubated against the plasma samples of each subject per each timepoint. The primary (anti-IgM, anti-IgA, and anti-IgG) and the secondary (conjugated with horseradish peroxidase) antibodies were used to determine the concentration of specific ACAb to each antigen. Serial dilutions of each plasma sample were used to determine the adequate dilution to detect the specific ACAb. For IgA and IgM, the optimum serum dilution was 1/5 for all antigens, and for total IgA and IgM, dilutions 1/10000 and 1/5000 were optimal, respectively. For IgG, each dilution for each antigen remained variable per subject, however, total IgG had an optimal dilution of 1/50000. The data was expressed as mg/dL and was then normalized by a ratio of specific Ig: total Ig, multiplied by the plasma sample with the highest average total Ig value. Statistical Analysis For both proteomic and lipid analysis, a bivariate analysis was performed using student's t-test. Blast2Go statistical analysis was determined based on enriched proteins of NV and CM using an enrichment analysis (Fischer's Exact test) with a cutoff of a false discovery rate (FDR) 1.5. The enriched NV lipids were composed of TG (29%), CL (23%), PG (41%), MGDG (5%) and PE (2%), whereas the enriched CM lipids were composed of DG (63%), DGDG (30%), PG (6%) and MGDG (0.47%) ( Figure 2B ). PG lipids were significantly enriched ( p = 0.01) in the NV when compared to the CM. Figure 2 The lipid profiles of NV and CM from L. johnsonii N6.2. (A) The total lipid composition of NV (left) and CM (right) represented as percentages. (B) The enriched lipids found in the NV and CM represented as percentages. PE, glycerophosphoethanolamines; PG, glycerophosphoglycerols; TG, triradylglycerolipids; CL, cardiolipins; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; DG, diradylglycerolipids. Table 2 Lipids enriched in the NV of L. johnsonii N6.2. The Mean and standard deviation (± SD) was calculated from the relative abundance obtained from each biological triplicate. Differential Lipids Molecular Annotation Ion Mode (+/-) CM Mean ± SD NV Mean ± SD p-value CL CL(16:0_18:1_18:1_18:1) – 0.75 ± 0.26 8.11 ± 1.04 0.025 CL CL(18:1_18:1_18:1_18:1) – 1.87 ± 0.02 17.46 ± 2.04 0.029 CL CL(36:2)(36:2) + 0.08 ± 0.02 2.03 ± 0.45 0.050 PE PE(34:2) + 0.10 ± 0.00 2.67 ± 0.06 0.006 PG PG(16:0_18:1) – 2.22 ± 0.12 4.89 ± 0.03 0.007 PG PG(18:1_18:1) – 10.18 ± 0.66 17.65 ± 0.97 0.009 PG PG(17:1_20:2) + 0.70 ± 0.16 15.43 ± 0.91 0.012 PG PG(37:3) + 0.19 ± 0.01 1.66 ± 0.12 0.017 PG PG(36:2) + 0.09 ± 0.00 3.05 ± 0.30 0.023 TG TG(20:3_20:3_20:4) + 0.06 ± 0.00 2.69 ± 0.03 0.002 TG TG(16:0_17:1_18:0) + 0.13 ± 0.00 0.85 ± 0.02 0.006 TG TG(16:0_18:0_18:0) + 0.17 ± 0.00 3.45 ± 0.11 0.007 TG TG(16:0_16:0_18:1) + 0.32 ± 0.00 3.74 ± 0.19 0.012 TG TG(16:0_18:0_20:0) + 0.10 ± 0.00 1.81 ± 0.10 0.013 TG TG(16:0_18:0_18:1) + 0.28 ± 0.00 3.62 ± 0.21 0.014 TG TG(17:0_18:0_18:1) + 0.08 ± 0.00 0.44 ± 0.03 0.016 TG TG(16:0_16:0_18:0) + 0.23 ± 0.01 4.48 ± 0.32 0.017 TG TG(18:0_18:1_18:1) + 0.47 ± 0.01 1.96 ± 0.14 0.020 TG TG(18:1_18:1_18:1) + 1.09 ± 0.02 3.17 ± 0.21 0.022 TG TG(16:0_17:1_18:1) + 0.26 ± 0.01 0.65 ± 0.05 0.024 TG TG(16:0_18:1_18:1) + 0.93 ± 0.01 5.24 ± 0.47 0.024 TG TG(20:3_20:4_20:4) + 0.07 ± 0.00 3.21 ± 0.41 0.029 Table 3 Lipids enriched in the CM of L. johnsonii N6.2. Differential Lipids Molecular Annotation Ion Mode (+/-) CM Mean ± SD NV Mean ± SD p-value DG DG(16:1_18:1) + 2.36 ± 0.02 1.90 ± 0.01 0.002 DG DG(17:1_18:1) + 3.73 ± 0.27 1.12 ± 0.18 0.006 DG DG(15:0_18:1) + 0.50 ± 0.02 0.16 ± 0.01 0.006 DG DG(18:0_18:1) + 1.29 ± 0.03 0.71 ± 0.01 0.006 DG DG(17:0_18:1) + 2.11 ± 0.13 0.63 ± 0.06 0.007 DG DG(18:3_19:0) + 2.75 ± 0.12 0.36 ± 0.04 0.007 DG DG(18:2_19:0) + 31.48 ± 1.86 5.10 ± 0.06 0.016 DG DG(18:1_18:1) + 19.27 ± 0.48 16.79 ± 0.28 0.020 DGDG DGDG(18:1_20:1) – 1.10 ± 0.03 0.04 ± 0.02 0.001 DGDG DGDG(17:1_18:1) – 13.47 ± 0.42 2.49 ± 0.32 0.001 DGDG DGDG(17:0_18:1) – 13.82 ± 0.38 5.46 ± 0.27 0.001 DGDG DGDG(15:0_18:1) – 1.59 ± 0.05 0.43 ± 0.07 0.003 DGDG DGDG(16:0_18:1) – 6.60 ± 0.21 3.85 ± 0.22 0.003 DGDG DGDG(16:1_18:1) – 5.62 ± 0.15 2.97 ± 0.07 0.004 DGDG DGDG(18:2_19:0) + 6.69 ± 0.47 0.62 ± 0.29 0.004 DGDG DGDG(18:0_18:1) + 0.22 ± 0.02 0.05 ± 0.02 0.005 DGDG DGDG(17:0_18:1) + 3.29 ± 0.25 0.85 ± 0.26 0.005 DGDG DGDG(17:1_18:1) + 4.03 ± 0.29 0.52 ± 0.15 0.006 DGDG DGDG(14:0_18:1) – 1.37 ± 0.02 0.35 ± 0.06 0.007 DGDG DGDG(18:1_18:2) – 1.07 ± 0.01 0.16 ± 0.05 0.011 DGDG DGDG(18:1_18:1) – 20.20 ± 0.74 12.51 ± 0.22 0.015 DGDG DGDG(15:0_18:1) + 0.56 ± 0.05 0.14 ± 0.01 0.019 DGDG DGDG(18:1_18:1) + 5.00 ± 0.39 2.33 ± 0.65 0.028 DGDG DGDG(18:1_20:1) + 0.22 ± 0.03 0.01 ± 0.01 0.029 DGDG DGDG(16:0_18:1) + 1.73 ± 0.14 0.83 ± 0.24 0.034 DGDG DGDG(10:0_18:1) – 0.41 ± 0.01 0.10 ± 0.05 0.037 MGDG MGDG(18:2_19:0) + 0.68 ± 0.03 0.34 ± 0.03 0.004 PG PG(17:1_18:1) – 6.26 ± 0.33 3.45 ± 0.16 0.011 PG PG(37:2) + 3.03 ± 0.53 1.24 ± 0.41 0.035 TG TG(17:1_18:0_18:1) + 0.62 ± 0.00 0.45 ± 0.00 0.001 The Mean and standard deviation (± SD) was calculated from the relative abundance obtained from each biological triplicate. L. johnsonii N6.2 NV Have a Distinctive Proteome SDS-PAGE was carried out to evaluate the protein profiles of NV, CM, intracellular fraction (IC) and total protein extract (TE) from L. johnsonii N6.2 ( Figure S1 ). The NV protein profile was found to be significantly different among the four fractions analyzed, while the patterns obtained from the IC and CM fractions were both present in the TE profile. Proteomic analysis was subsequently performed using liquid chromatography-tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS) with proteins extracted from the NV and CM fractions. Proteomic analysis indicated that NV contained several unique and differentially expressed proteins when compared to the CM ( Table 4 ). 708 protein clusters were identified between the CM and NV triplicates where 524 of these protein clusters were identified in the CM and 366 identified in the NV. Table 4 Enriched protein composition found within the NV as compared to the CM of L. johnsonii N6.2. Locus Tag Annotation NV Mean ± SD CM Mean ± SD p-value T285_RS00825 Lysin 35.35 ± 10.29 4.48 ± 0.002 0.018 T285_RS01325 Dipeptidase 33.34 ± 12.02 4.08 ± 4.32 0.020 T285_RS01720 2,3-bisphosphate-dependent phosphoglycerate mutase 28.50 ± 6.44 1.70 ± 1.19 0.008 T285_RS02260 Alanine–tRNA ligase 25.33 ± 11.08 3.37 ± 2.26 0.035 T285_RS02345 Membrane protein/penicillin-binding protein 86.55 ± 14.30 19.40 ± 8.81 0.002 T285_RS02490 Arginine–tRNA ligase 15.62 ± 4.95 2.61 ± 1.58 0.017 T285_RS03880 Enolase 3 355.64 ± 40.61 45.98 ± 19.86 1.5. The enriched NV lipids were composed of TG (29%), CL (23%), PG (41%), MGDG (5%) and PE (2%), whereas the enriched CM lipids were composed of DG (63%), DGDG (30%), PG (6%) and MGDG (0.47%) ( Figure 2B ). PG lipids were significantly enriched ( p = 0.01) in the NV when compared to the CM. Figure 2 The lipid profiles of NV and CM from L. johnsonii N6.2. (A) The total lipid composition of NV (left) and CM (right) represented as percentages. (B) The enriched lipids found in the NV and CM represented as percentages. PE, glycerophosphoethanolamines; PG, glycerophosphoglycerols; TG, triradylglycerolipids; CL, cardiolipins; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; DG, diradylglycerolipids. Table 2 Lipids enriched in the NV of L. johnsonii N6.2. The Mean and standard deviation (± SD) was calculated from the relative abundance obtained from each biological triplicate. Differential Lipids Molecular Annotation Ion Mode (+/-) CM Mean ± SD NV Mean ± SD p-value CL CL(16:0_18:1_18:1_18:1) – 0.75 ± 0.26 8.11 ± 1.04 0.025 CL CL(18:1_18:1_18:1_18:1) – 1.87 ± 0.02 17.46 ± 2.04 0.029 CL CL(36:2)(36:2) + 0.08 ± 0.02 2.03 ± 0.45 0.050 PE PE(34:2) + 0.10 ± 0.00 2.67 ± 0.06 0.006 PG PG(16:0_18:1) – 2.22 ± 0.12 4.89 ± 0.03 0.007 PG PG(18:1_18:1) – 10.18 ± 0.66 17.65 ± 0.97 0.009 PG PG(17:1_20:2) + 0.70 ± 0.16 15.43 ± 0.91 0.012 PG PG(37:3) + 0.19 ± 0.01 1.66 ± 0.12 0.017 PG PG(36:2) + 0.09 ± 0.00 3.05 ± 0.30 0.023 TG TG(20:3_20:3_20:4) + 0.06 ± 0.00 2.69 ± 0.03 0.002 TG TG(16:0_17:1_18:0) + 0.13 ± 0.00 0.85 ± 0.02 0.006 TG TG(16:0_18:0_18:0) + 0.17 ± 0.00 3.45 ± 0.11 0.007 TG TG(16:0_16:0_18:1) + 0.32 ± 0.00 3.74 ± 0.19 0.012 TG TG(16:0_18:0_20:0) + 0.10 ± 0.00 1.81 ± 0.10 0.013 TG TG(16:0_18:0_18:1) + 0.28 ± 0.00 3.62 ± 0.21 0.014 TG TG(17:0_18:0_18:1) + 0.08 ± 0.00 0.44 ± 0.03 0.016 TG TG(16:0_16:0_18:0) + 0.23 ± 0.01 4.48 ± 0.32 0.017 TG TG(18:0_18:1_18:1) + 0.47 ± 0.01 1.96 ± 0.14 0.020 TG TG(18:1_18:1_18:1) + 1.09 ± 0.02 3.17 ± 0.21 0.022 TG TG(16:0_17:1_18:1) + 0.26 ± 0.01 0.65 ± 0.05 0.024 TG TG(16:0_18:1_18:1) + 0.93 ± 0.01 5.24 ± 0.47 0.024 TG TG(20:3_20:4_20:4) + 0.07 ± 0.00 3.21 ± 0.41 0.029 Table 3 Lipids enriched in the CM of L. johnsonii N6.2. Differential Lipids Molecular Annotation Ion Mode (+/-) CM Mean ± SD NV Mean ± SD p-value DG DG(16:1_18:1) + 2.36 ± 0.02 1.90 ± 0.01 0.002 DG DG(17:1_18:1) + 3.73 ± 0.27 1.12 ± 0.18 0.006 DG DG(15:0_18:1) + 0.50 ± 0.02 0.16 ± 0.01 0.006 DG DG(18:0_18:1) + 1.29 ± 0.03 0.71 ± 0.01 0.006 DG DG(17:0_18:1) + 2.11 ± 0.13 0.63 ± 0.06 0.007 DG DG(18:3_19:0) + 2.75 ± 0.12 0.36 ± 0.04 0.007 DG DG(18:2_19:0) + 31.48 ± 1.86 5.10 ± 0.06 0.016 DG DG(18:1_18:1) + 19.27 ± 0.48 16.79 ± 0.28 0.020 DGDG DGDG(18:1_20:1) – 1.10 ± 0.03 0.04 ± 0.02 0.001 DGDG DGDG(17:1_18:1) – 13.47 ± 0.42 2.49 ± 0.32 0.001 DGDG DGDG(17:0_18:1) – 13.82 ± 0.38 5.46 ± 0.27 0.001 DGDG DGDG(15:0_18:1) – 1.59 ± 0.05 0.43 ± 0.07 0.003 DGDG DGDG(16:0_18:1) – 6.60 ± 0.21 3.85 ± 0.22 0.003 DGDG DGDG(16:1_18:1) – 5.62 ± 0.15 2.97 ± 0.07 0.004 DGDG DGDG(18:2_19:0) + 6.69 ± 0.47 0.62 ± 0.29 0.004 DGDG DGDG(18:0_18:1) + 0.22 ± 0.02 0.05 ± 0.02 0.005 DGDG DGDG(17:0_18:1) + 3.29 ± 0.25 0.85 ± 0.26 0.005 DGDG DGDG(17:1_18:1) + 4.03 ± 0.29 0.52 ± 0.15 0.006 DGDG DGDG(14:0_18:1) – 1.37 ± 0.02 0.35 ± 0.06 0.007 DGDG DGDG(18:1_18:2) – 1.07 ± 0.01 0.16 ± 0.05 0.011 DGDG DGDG(18:1_18:1) – 20.20 ± 0.74 12.51 ± 0.22 0.015 DGDG DGDG(15:0_18:1) + 0.56 ± 0.05 0.14 ± 0.01 0.019 DGDG DGDG(18:1_18:1) + 5.00 ± 0.39 2.33 ± 0.65 0.028 DGDG DGDG(18:1_20:1) + 0.22 ± 0.03 0.01 ± 0.01 0.029 DGDG DGDG(16:0_18:1) + 1.73 ± 0.14 0.83 ± 0.24 0.034 DGDG DGDG(10:0_18:1) – 0.41 ± 0.01 0.10 ± 0.05 0.037 MGDG MGDG(18:2_19:0) + 0.68 ± 0.03 0.34 ± 0.03 0.004 PG PG(17:1_18:1) – 6.26 ± 0.33 3.45 ± 0.16 0.011 PG PG(37:2) + 3.03 ± 0.53 1.24 ± 0.41 0.035 TG TG(17:1_18:0_18:1) + 0.62 ± 0.00 0.45 ± 0.00 0.001 The Mean and standard deviation (± SD) was calculated from the relative abundance obtained from each biological triplicate. L. johnsonii N6.2 NV Have a Distinctive Proteome SDS-PAGE was carried out to evaluate the protein profiles of NV, CM, intracellular fraction (IC) and total protein extract (TE) from L. johnsonii N6.2 ( Figure S1 ). The NV protein profile was found to be significantly different among the four fractions analyzed, while the patterns obtained from the IC and CM fractions were both present in the TE profile. Proteomic analysis was subsequently performed using liquid chromatography-tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS) with proteins extracted from the NV and CM fractions. Proteomic analysis indicated that NV contained several unique and differentially expressed proteins when compared to the CM ( Table 4 ). 708 protein clusters were identified between the CM and NV triplicates where 524 of these protein clusters were identified in the CM and 366 identified in the NV. Table 4 Enriched protein composition found within the NV as compared to the CM of L. johnsonii N6.2. Locus Tag Annotation NV Mean ± SD CM Mean ± SD p-value T285_RS00825 Lysin 35.35 ± 10.29 4.48 ± 0.002 0.018 T285_RS01325 Dipeptidase 33.34 ± 12.02 4.08 ± 4.32 0.020 T285_RS01720 2,3-bisphosphate-dependent phosphoglycerate mutase 28.50 ± 6.44 1.70 ± 1.19 0.008 T285_RS02260 Alanine–tRNA ligase 25.33 ± 11.08 3.37 ± 2.26 0.035 T285_RS02345 Membrane protein/penicillin-binding protein 86.55 ± 14.30 19.40 ± 8.81 0.002 T285_RS02490 Arginine–tRNA ligase 15.62 ± 4.95 2.61 ± 1.58 0.017 T285_RS03880 Enolase 3 355.64 ± 40.61 45.98 ± 19.86 <0.001 T285_RS03940 L-lactate dehydrogenase 76.53 ± 9.23 4.61 ± 2.46 0.002 T285_RS04000 GTP pyrophosphokinase 21.60 ± 3.22 7.31 ± 5.10 0.016 T285_RS04015 Aspartate–tRNA ligase 19.19 ± 9.56 1.17 ± 0.38 0.041 T285_RS04110 Sigma factor SigA 10.58 ± 0.05 5.32 ± 2.83 0.042 T285_RS04625 Penicillin-binding protein 1A 40.65 ± 11.74 21.23 ± 2.95 0.048 T285_RS05135 Hu family DNA-binding protein 15.67 ± 3.26 5.10 ± 1.31 0.009 T285_RS05565 GTP-binding protein TypA 26.82 ± 0.66 10.97 ± 7.87 0.036 T285_RS05640 Isoleucine–tRNA ligase 17.34 ± 5.89 0.75 ± 0.0004 0.020 T285_RS05935 Glucose-6-phosphate isomerase 25.94 ± 12.35 1.12 ± 0.53 0.037 T285_RS06185 Triosephosphate isomerase 18.36 ± 8.51 3.36 ± 0.53 0.046 T285_RS06195 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 98.35 ± 15.73 15.67 ± 2.69 0.005 T285_RS06765 Threonine–tRNA ligase 38.42 ± 6.29 4.48 ± 0.003 0.006 T285_RS07040 Aspartyl/glutamyl-tRNA(Asn/Gln) amidotransferase subunit B 27.22 ± 9.02 7.38 ± 1.44 0.030 T285_RS07350 Bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase 40.53 ± 4.78 15.62 ± 11.33 0.024 T285_RS08820 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating 15.50 ± 4.77 1.49 ± 1.05 0.015 T285_RS08830 tRNA uridine 5-carboxymethylaminomethyl modification enzyme (MnmG) 10.39 ± 0.32 4.04 ± 1.06 0.003 The Mean and standard deviation (± SD) was calculated from the relative abundance obtained from each biological triplicate. Blast2Go analysis was conducted against the protein FASTA dataset provided through LC-MS/MS. These analyses included an enrichment Fisher's Exact test to determine the statistical significance of enriched proteins from NV and CM fractions, as well as a comparison of the protein composition of the NV and CM under the three Gene Ontology (GO) term categories: cellular component, molecular function and biological processes. Analysis of GO terms based on cellular component ( Figure 3A ), indicates the enriched proteins of NV that were significantly ( p < 0.002) associated with GO terms of cytoplasmic/intracellular proteins. Analysis of the molecular function GO terms ( Figure 3B ) showed the enriched proteins of NV are ligase activity forming carbon-oxygen bonds ( p = 1.93 x 10 -5 ), and catalytic activity acting on a tRNA ( p = 2.59 x 10 -5 ). The enriched proteins of the CM were significant in the GO term primary active transmembrane transporter activity ( p = 1.07 x 10 -4 ). According to the GO term biological processes ( Figure 3C ), the proteins found in the CM were significant in ion transport ( p = 1.21 x 10 -4 ) and transmembrane transport ( p = 5.69 x 10 -6 ). The proteins found in the NV were significant in NADPH regeneration ( p = 1.86 x 10 -5 ), oxidation-reduction process ( p = 9.45 x 10 -4 ), ATP metabolic process ( p = 2.94 x 10 -8 ), organic substance catabolic process ( p = 2.41 x 10 -6 ), biosynthetic process ( p = 4.76 x 10 5 ), small molecule metabolic process ( p = 9.91 x 10 -8 ), nitrogen compound metabolic process ( p = 9.89 x 10 -6 ), cellular metabolic process ( p = 3.26 x 10 -5 ), primary metabolic process ( p = 7.05 x 10 -6 ), and organic substance metabolic process ( p = 3.72 x 10 -6 ). Cellular component localization of proteins enriched in the CM did not reach statistical significance. Figure 3 Bioinformatic analysis of protein composition of NV and CM from L. johnsonii N6.2. (A) Cellular component GO terms of NV (left) and CM (right). (B) Molecular function GO terms of NV (left) and CM (right). (C) Biological processes GO terms of NV (left) and CM (right). Several proteins were found at equally high concentrations in NV and CM, including a sugar ABC transporter substrate-binding protein, enolase 1, 30S ribosomal proteins (S2, S3 and S5), ABC transporter substrate-binding protein (periplasmic binding protein type 2 superfamily), foldase protein PrsA, ABC transporter substrate-binding protein family 5, extracellular solute-binding protein (T285_RS02130) and 50S ribosomal protein L1. Proteins unique to NV are adenylate kinase, aminopeptidase C, cysteine-tRNA ligase, acetate kinase, leucine-tRNA ligase, phosphoketolase, transcription termination/antitermination protein NusA, ATP-dependent 6-phosphofructokinase, dTDP-glucose 4,6-dehydratase, levansucrase, UDP-glucose 4-epimerase, phosphoenolpyruvate-protein phophotransferase, peptidase, surface protein (aggregation promoting factor; T285_RS07210), hypothetical protein (aggregation promoting protein; T285_RS07215), pyroglutamyl-peptidase I and adhesion ( Table 5 ). In summary, the enriched proteins identified in NV mostly consist of cytoplasmic proteins involved in glycolysis and protein synthesis. These results confirm that NV are the product of active budding of the cell wall rather than the result of cell lysis. Table 5 Proteins uniquely identified in the NV of L. johnsonii N6.2. Locus Tag Annotation Mean ± SD T285_RS01605 Adenylate kinase 7.79 ± 7.58 T285_RS01810 Aminopeptidase C 19.30 ± 14.44 T285_RS01835 Cysteine–tRNA ligase 1.89 ± 0.71 T285_RS02315 Acetate kinase 29.16 ± 3.69 T285_RS02460 Leucine–tRNA ligase 8.37 ± 6.92 T285_RS03045 Phosphoketolase 36.09 ± 10.16 T285_RS03745 Transcription termination/antitermination protein NusA 5.23 ± 5.26 T285_RS05200 ATP-dependent 6-phosphofructokinase 18.99 ± 7.35 T285_RS05350 dTDP-glucose 4,6-dehydratase 4.48 ± 2.27 T285_RS05980 Levansucrase 6.50 ± 1.36 T285_RS06305 UDP-glucose 4-epimerase (GalE) 11.50 ± 8.38 T285_RS06485 Phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase 18.81 ± 13.66 T285_RS06950 Peptidase 35.34 ± 8.15 T285_RS07210 Surface protein, aggregation promoting factor 23.02 ± 5.46 T285_RS07215 Hypothetical protein (aggregation promoting protein) 8.72 ± 3.21 T285_RS08570 Pyroglutamyl-peptidase I 8.47 ± 4.30 T285_RS08930 Adhesin 43.15 ± 39.12 The Mean and standard deviation (± SD) was calculated from the relative abundance obtained from each biological triplicate. Proteins Identified From NV and CM as Potential Biomarkers Several proteins were selected for antibody production to evaluate their use as potential biomarkers for NV. For this experiment, Eno3 was selected since it is found at high concentrations and represents the category of metabolism, while T285_RS00825, a protein annotated as a SH3b domain-containing protein (herein named Sdp), was selected since it is a membrane bound protein. Both proteins were significantly enriched in the NV fraction ( p = 0.02 and p = 0.002, respectively). LexA (23 kDa) is a cytoplasmic transcriptional regulator that represses genes involved in the SOS response and is associated with oxidative stress responses ( 33 ). LexA was selected as an internal control since it was not present in the NV or CM fractions. Sdp contains a glycosyl hydrolase family 25 (GH25) domain near its N-terminal, and six tandem repeats containing src-homology-3 (SH3b) domains ( Figure S2A ). Sdp has a predicted MW of 102 kDa, with a predicted signal peptide at the N-terminal region of the protein, prior to the GH25 domain, with a cleavage site between residues 38A and 39A. Analysis using transmembrane prediction servers (Phobius and TMHMM) suggest the protein is located outside the cell (or non-cytoplasmic), with TMHMM indicating a 40% probability that the N-terminal is located in the membrane. Homologs of Sdp in other Lactobacillus species contain two or less SH3b domains ( Figure S3 ), with the exception of L. taiwanensis strains which have four to six SH3b domains, and L. gasseri 224-1 which has six SH3b domains. We hypothesize L. johnsonii N6.2 Sdp is inserted in the membrane of the NV, and the SH3b domains are located outside of the NV. Sequence alignments performed with each of the SH3b domains (numbered 1 through 6 from N- to C- terminus, respectively), showed that SH3b2 has higher identity to the other domains within Sdp, while SH3b6 showed more sequence divergence ( Figure S2B ). Based on these results, the SH3b2 (named Sdp_SH3b2) and SH3b6 (named Sdp_SH3b6) domains were selected for protein purification and subsequently used to determine localization of Sdp in NV and L. johnsonii N6.2 whole cells. Enolase is a metalloenzyme that is primarily involved in the conversion of 2-phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate in the glycolysis pathway, however, a role in bacterial adhesion binding to the extracellular matrix, mucin and other proteins has also been described ( 34 – 37 ). Similar reports have shown enolase to be a cell surface protein capable of binding human plasminogen, laminin, or fibronectin ( 38 ). Three enolases were identified in the genome of L. johnsonii N6.2. Enolase three (Eno3) shares 72.88% identity with enolase 2, and 56.04% identity with enolase 1. Eno3 (47 kDa) was present in the NV and CM fractions and was also significantly enriched in NV ( p = 8 x 10 -4 ). The selected genes or domains ( sdp_SH3b2, sdp_SH3b6, lexA and eno3 ) were cloned to fuse a His-tag and subsequently purified using Ni-NTA agarose. The yields obtained were 576 mg/L, 537 mg/L, 6760 mg/L and 2960 mg/L for Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6, LexA and Eno3, respectively ( Figure S2C ). The purified proteins were used for the generation of polyclonal antibodies. The detection limit of each antibody was determined using purified protein, where the detection limit for anti-sdp_SH3b2 and anti-sdp_SH3b6 were found to be 1 ng and 100 ng, respectively. The detection limit for anti-Eno3 and anti-LexA were both 1 ng of purified protein (Eno3 and LexA, respectively). Western blots were conducted with NV and L. johnsonii N6.2 total cell extract (TE) to further examine the specificity of antibodies generated against Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6, Eno3 and LexA, and to determine the presence or absence of these proteins within the NV and TE fractions ( Figure 4 ). The native Sdp (~100 kDa) was detected in the NV fraction using anti-Sdp_SH3b2 ( Figure 4A ) and anti-Sdp_SH3b6 ( Figure 4B ), however, neither domain was detected in the TE fraction. Eno3 was detected on both cellular fractions ( Figure 4C ), in agreement with the high abundancy of this protein observed in the proteomic analyses. LexA was only detected against the purified protein and was not observed in the NV or TE fraction ( Figure 4D ). The reactivity of the anti-lexA antibody was confirmed in L. johnsonii N6.2 total cell extract (TE) grown in aerobic conditions ( Figure S4 ). Figure 4 Distribution of Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6, Eno3 and LexA in cell fractions. Representative Western blots are shown using anti-Sdp_SH3b2 (A) , anti-Sdp_SH3b6 (B) , anti-Enolase (C) , and anti-LexA (D) against L. johnsonii N6.2 total protein extract (TE) and NV. The corresponding purified protein was used as a positive control in each gel. The predicted size of the purified Sdp_SH3b2 and Sdp_SH3b6 domains is ~15 kDa. When present in NV, the predicted size for the detection of Sdp_SH3b2 and Sdp_SH3b6 is ~100 kDa (Sdp). The predicted MW of LexA and Eno3 is 27 kDa and 47 kDa, respectively. Arrows are indicating the band of the pure protein. To confirm that each of the identified proteins was a component of the NV cargo and not an artifact of cellular debris or protein aggregation from the extraction process, Optiprep™ density gradient was performed on the crude NV pellet. Based on the refractive index, the density of the purified NV was determined to be 1.16 – 1.26 g/mL. These results are in agreement with a recent report in L. plantarum ( 39 ). Following density gradient centrifugation using Optiprep™, the presence of NV-derived proteins within each fraction was evaluated by western blot using anti-Sdp_SH3b2 ( Figure S5A ). Fractions 3 through 9 had prominent bands detected in the western blot while no signal was observed in fractions 10, 11 or 12 using anti-Sdp_SH3b2 ( Figure S5A ). Fraction 12 is where free protein aggregates are collected. The association of Sdp with NVs was confirmed by further NV purification from the different fractions. Due to the concentration obtained, the fractions were pooled and subjected to ultracentrifugation to obtain F1 (fractions 1 and 2), F2 (fractions 3, 4 and 5), F3 (fractions 6 and 7), F4 (fractions 8 and 9) and F5 (fractions 10, 11 and 12). Following the ultracentrifugation step, F1 resulted in a very small pellet, fractions F2, F3 and F4 resulted in similar sized pellets, and no pellet was obtained from fraction F5. The NV size and concentration was determined for fractions F1, F2, F3 and F4, and compared to the crude NV pellet using NS300 ( Figure S5B ). The concentration of F1 was 5.81x10 9 particles/L, F2 was 9.67 x 10 10 particles/L, F3 was 1.11 x 10 11 particles/L and F4 was 1.67 x 10 11 particles/L, and the crude NV had a concentration of 1.45 x 10 12 particles/L. The main peaks observed with each fraction corresponded to particle sizes ranging from 110 nm to 136 nm, consistent with the average particle size (124 nm) observed in the crude NV pellet ( Figure S5B ). Western blots were subsequently conducted against Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6, Eno3 and LexA to further examine the distribution of the selected proteins within each purified NV fraction. When compared to the crude NV, similar banding of the Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6 and Eno3 was visualized in the purified NV fractions ( Figure S5C ). The control LexA was not visualized in any of the fractions or crude NV. Based on these results, it was concluded that our approach to using exosome-free MRS media for NV preparation is sufficient to obtain a crude extract of NV with a similar size and protein composition to the purified NV. Protein Localization Visualized Using Immunogold and Immunofluorescence Staining Antibodies generated against Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6, Eno3 and LexA were used to confirm the localization of each protein through immunogold staining and visualization under TEM. Anti-LexA and secondary antibody alone were used as a negative control. Representative TEM images are shown in Figure 5 and a summary of the quantitative TEM analyses are shown in Table S1 . Each image (n=19 per antibody) was counted in respect to the number of total immunogold bacterial particles determined on each cell, and free particles located on the surrounding grid. Bacterial particles were further analyzed based on their association with bacterial structures, such as the cell wall, cell membrane, cytoplasm, and cap-like structures. Figure 5 Immunogold staining of L. johnsonii N6.2 whole cells. Representative TEM images of immunogold staining of anti-Sdp_SH3b2 (A) , anti-Sdp_SH3b6 (B) , anti-Eno3 (C) and anti-LexA (D) . Black arrows indicate location of 12 nm gold particles that appear as black round dots. Using anti-Sdp_SH3b2, 94% of the gold particles (n = 907) were associated with bacterial structures ( Figure 5A ). Of those, 3% of the particles were associated with the cell wall, 25% with the cell membrane, 71% were detected in the cytoplasm, and 1% of the particles were located in cap-like structures ( Table S1 ). Anti-Sdp_SH3b6 resulted in a lower number of immunogold particles detected overall (n = 439), as well as associated with bacterial structures (48%) ( Figure 5B and Table S1 ). Anti-Sdp_SH3b6 particles bound to bacterial structures were further divided into the number associated with the cell wall (13%), cell membrane (30%), cytoplasm (55%), and the cap-like structures (1%). We speculate that the decreased signal obtained may be due to gold particles being released from the NV during washing steps. Only anti-Sdp_SH3b2 and anti-Sdp_SH3b6 were found to show immunogold particles localized to the cap-like structure, at 6 and 3 particles, respectively. In contrast, 99% of the gold particles were localized in bacterial structures using anti-Eno3 ( Figure 5C ; n = 7687). Of the anti-Eno3 bacteria-associated particles, 4% were located on the cell wall, 16% at the cell membrane, and 80% were found within the cytoplasm. The statistical analyses showed that this protein was significantly ( p < 0.001) associated with the cytoplasmic fraction when compared to the cell wall and cell membrane. Similarly, Eno3 showed a significant localization in the cytoplasm compared to that of SH3b2 ( p < 0.001) and SH3b6 ( p < 0.001). As expected, using anti-LexA or the secondary antibody controls resulted in the detection of very low numbers of gold particles ( Figure 5D and Table S1 ). To evaluate the presence of these proteins on the surface of NV and whole L. johnsonii N6.2 cells, immunogold staining was performed through SEM. Whole bacteria cells were used for imaging due to the size limitations in working with purified NV. Gold particles conjugated to anti-Sdp_SH3b2, anti-Sdp_SH3b6 and anti-Eno3 were present on the cell surface ( Figure 6 ), where the highest labelling intensity was observed on NV protruding from the cell surface. Figure 6 Immunogold staining of L. johnsonii N6.2 whole cells. SEM [BSE (left) and SE (right)] images of immunogold staining of Sdp_SH3b2 (A) , Sdp_SH3b6 (B) , and Eno3 (C) . On BSE images, 12 mm gold particles appear as fluorescent dots. The surface location of Sdp was confirmed by the abundant localization of anti-SH3b2 (85% of the particles detected). Quantification of the anti-Sdp_SH3b2 particles indicated that Sdp has significantly more abundant ( p < 0.001) localization to NV-like structures, with 75% of particles located on NV-like structures budding off the cell surface, 5% on free NV-like structures and only 20% located elsewhere on the cell surface, ( Table S2 ). These results are consistent with the TEM data where six particles were observed on cap-like structures. Similar results were obtained when Sdp detection was evaluated using anti-Sdp_SH3b6, albeit with fewer particles quantified ( Table S2 ). SEM also allowed the detection of Eno3 with 96% of gold particles associated to bacterial surfaces, where 68% of the anti-Eno3 particles were associated to NV-like structures on the cell surface, 13% on free NV-like structures, and 19% were associated elsewhere on the cell wall ( Table S2 ). Since technical limitations preclude immunostaining of NV, the ability of anti-Sdp to target NV was evaluated using L. johnsonii- derived NV internalized in Caco-2 cells, a human intestinal cell line model. Following incubation of Caco-2 cells with NV, a Texas Red conjugate against anti-Sdp_SH3b2 was used to visualize NV within the Caco-2 cells. From the images obtained, the anti-Sdp_SH3b2 labeling was observed in Caco-2 cells treated with the crude NV and purified NV fractions F2, F3 and F4 ( Figure 7 ). These results indicate that Sdp_SH3b2 is associated with the NV in agreement with the immunogold assays. Figure 7 Immunofluorescence of NV associated protein Sdp_SH3b2 in Caco-2 Cells. From top to bottom, control cells, crude NV (CNV), purified NV from fractions 3-5 (F2), purified NV from fractions 6-7 (F3) and purified NV from fractions 8-9 (F4). From left to right, DAPI to stain the nucleus, Alexa 488 to stain cell membrane, Texas Red conjugate to visualize NV through anti-Sdp_SH3b2, and the merged image at a magnification of 40x. Sdp_SH3b2 and Sdp_SH3b6 Domains Can Be Recognized by Human IgA and IgG To determine if L. johnsonii N6.2 NV or purified proteins can be recognized by the host, three different immunoglobulins (IgM, IgA and IgG) were quantified from plasma samples obtained from a clinical trial, where healthy adults were administered L. johnsonii N6.2 ( 27 ). The sample set comprises the placebo (control) group and the L. johnsonii N6.2 treatment group, across five different time points: baseline (T0), 2 weeks after beginning treatments (T2), week 4 (T4), week 8 end of treatment (T8), and after a four-week washout period at week 12 (T12). We adapted a method developed by Paun et al. ( 40 ) for the detection of anti-commensal antibody (ACAb), to test immunoglobulins against NV, Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6, Eno3 and LexA in human samples. Briefly, for each assay, NV and purified proteins (LexA, Eno3, Sdp_SH3b6, Sdp_SH3b2) were coated at 50 µg/ml. The coated plates were then incubated against the plasma samples of each subject per each timepoint (see Materials and Methods for details). An elevated IgA ACAb response against NV was observed at T2 in subjects that received L. johnsonii N6.2, however, it did not reach statistical significance ( p = 0.052). The IgA ACAb response against NV was significantly higher at T4 ( p = 0.008) and T8 ( p = 0.002) in subjects that received L. johnsonii N6.2 ( Figure 8A ). While the IgA ACAb response against the commensal bacterial antigens indicated that NV induced a slight increase in immunogenicity over time within the treatment group, it did not reach statistical significance. The IgA ACAb response against Sdp_SH3b2 was significantly higher ( p = 0.02) at T8 in the treatment group ( Figure 8B ). A significant increase in the level of IgA ACAb against Sdp_SH3B2 was also observed within the treatment group during the treatment period ( p < 0.001). A similar pattern was observed for IgA ACAb response against Sdp_SH3b6 ( Figure 8C ); the IgA ACAb response against Sdp_SH3b6 was significantly higher at T8 ( p = 0.000003) in subjects that received L. johnsonii N6.2. Within the treatment group, a significant increase was observed over time ( p < 0.003). As expected, the IgA ACAb response against SH3b6 was significantly lower ( p = 0.01) following the washout period (T8 to T12). A decrease in IgA ACAb response against NV and SH3b2 was also observed during the washout period but did not reach statistical significance. No significant differences were observed for IgA ACAb response against Eno3 or LexA, within or between treatment groups ( Figures 8D, E ). Figure 8 IgA ACAb generation against L. johnsonii N6.2 proteins and NV. Normalized IgA ratio of specific IgA generated against the antigens, NV (A) , Sdp_SH3b2 (B) , Sdp_SH3b6 (C) , Eno3 (D) and LexA (E) , over total plasma IgA. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. The IgG ACAb response against NV was significantly higher at T2 ( p = 0.006) in subjects that received L. johnsonii N6.2 ( Figure 9A ). Within the treatment group, an increase in IgG ACAb response against NV was observed over time, however, these differences did not reach statistical significance. The IgG ACAb response against Sdp_SH3b2 was significantly higher at T8 ( p = 0.03) in subjects that received L. johnsonii N6.2 ( Figure 9B ). Within the treatment group, a significant increase ( p < 0.05) in IgG ACAb response against Sdp_SH3b2 was also observed during the treatment period ( Figure 9B ). The IgG ACAb response against Sdp_SH3b6 was significantly higher at T2 ( p = 0.02) in subjects that received L. johnsonii N6.2 ( Figure 9C ), while no significant differences were observed for IgG ACAb response against Eno3 or LexA, within or between treatment groups ( Figures 9D, E ). ELISA assays were also conducted to determine the immunological response of IgM against the L. johnsonii N6.2 NV and proteins, however, no significant differences were observed ( Figure S6 ). Figure 9 IgG ACAb generation against L. johnsonii N6.2 proteins and NV. Normalized IgG ratio of specific IgG generated against the antigens, NV (A) , Sdp_SH3b2 (B) , Sdp_SH3b6 (C) , Eno3 (D) and LexA (E) , over total plasma IgG. *p < 0.05 and **p < 0.001. Discussion In this study, the morphological and molecular characteristics of L. johnsonii N6.2 NV were elucidated and the SH3b2 and SH3b6 domains of Sdp were identified as potential biomarkers for NV. The protein and lipid composition of L. johnsonii N6.2 NV were found to be significantly different when compared to the CM. The lipid composition of L. johnsonii N6.2 NV was enriched with PG, TG and CL, whereas the lipids of the CM were enriched with DG and DGDG. The stark differences observed between the lipid composition of NV and CM suggests that NV are formed as specialized structures, rather than by random budding from the cell surface. This is further supported by the TEM and SEM imaging of NV in this study, where indications of cell lysis or cell division was not observed. In a recent article, the lipid profile of L. plantarum extracellular vesicles (EV) was characterized, where 67 of the 320 identified lipids were enriched in the EV, while 19 were decreased ( 13 ). Interestingly, there is no overlap between the enriched lipids identified in L. johnsonii NV and L. plantarum EVs, however, we speculate that some of the observed differences may be due to the metabolic capabilities of each species, or possibly from differences in sample preparation. In the study by Kim et al. ( 13 ), the EV is compared to total cell extracts, while in this study, we utilized exosome-depleted media during growth and purification of the NV, and we used purified cell membranes to compare to the NV. NV lipidomic studies in Bacillus anthracis and Group B Streptococcus show a broad composition of lipids similar to their CM ( 19 , 41 ). Though broadly similar in composition, the CM and NV in Streptococcus pyogenes and Listeria monocytogenes have been reported to show differences in phospholipid and fatty acid content. In S. pyogenes , NV are enriched in anionic phosphatidylglycerol, but cardiolipins are diminished ( 42 ), while in L. monocytogenes , NV are enriched in phosphatidylethanolamine, sphingolipids and triacylglycerols ( 8 ). The dissimilarities in lipid composition between NV and CM suggest that vesicle production may be promoted through lipid-enriched domains within the CM ( 43 ). This is seen in S. aureus , where a reduction in lipoprotein content improves membrane fluidity, resulting in increased NV production ( 44 ). In Gram-negative bacteria, the asymmetrical distribution of phospholipids is proposed to be the major force triggering vesicle production, where an accumulation of phospholipids in the outer leaflet of the outer membrane leads to the expansion and outward bulging of the membrane ( 45 ). It has also been reported that pre-existing patches of negatively charged outer membranes are enriched with A-LPS in Gram-negative bacteria ( 46 ), and mutations that affect A-LPS biosynthesis were found to inhibit the selective sorting of cargo proteins into OMVs produced by Porphynoomonas gingivalis ( 47 ). In eukaryotic cells, the formation of exosomes involves lipid raft-like regions enriched in cholesterol and specific glycolipids and phospholipids, including phosphatidylcholine and sphingolipids ( 48 ). These lipid regions have been proposed to bind specific RNAs with high affinity, which are subsequently encapsulated and released as cargo within the exosomes ( 48 ). Taken together, these findings suggest that the lipid domains of bacterial cells can directly influence the cargo inside EVs. The protein cargo in L. johnsonii NV was evaluated and determined to be significantly different from the CM. Proteins of intracellular localization and function were enriched in the NV, in agreement with previous reports. When comparing the NV-associated proteins identified in L. johnsonii N6.2 and other Lactobacillus species, we found some overlap between the main cytoplasmic enzymes present in the NV, however, there are numerous proteins with unique localization among species. In L. casei BL23 and L. rhamnosus (JB‐1), EVs were found to contain cytoplasmic proteins similar to L. johnsonii N6.2-derived NV ( 10 , 49 ), while, membrane proteins were found to be more abundant in L. plantarum -derived EVs ( 20 ). Some proteins found at high concentrations in other Lactobacillus- derived vesicles, such as enolase ( 14 ), triosephosphate isomerase ( 14 ), and an adhesin protein ( 49 ) were also identified in L. johnsonii N6.2-derived NV. Similar observations were reported when comparing NV derived from L. acidophilus ATCC 53544, L. casei ATCC 393, and L. reuteri ATCC 23272, where the proteomic analysis revealed that the most abundant proteins differed among each species ( 50 ), however, some of the differences observed are likely due to the large genomic divergence and metabolic potential among these species. Taken together, these findings suggest different mechanisms of host-microbe interaction may exist within commensal bacteria from the same genus, however, further studies are needed to establish genomic and proteomic correlations to fully understand these differences. Two proteins (Eno3 and Sdp) were purified and utilized in localization and immunogenicity studies. Enolase is a multifunctional protein that has recently been identified in several bacterial-derived EVs and OMVs. While the enzymatic activity of enolase is most commonly associated with glycolysis and gluconeogenesis, active forms of enolase have also been found to play a role in virulence and other activities unrelated to central metabolism, as seen in Mycobacterium tuberculosis ( 51 ) and in Borrelia burgdorferi , where an enolase was identified as a plasminogen receptor released by OMVs ( 52 ). In the fungal pathogen Aspergillus fumigatus , enolase also acts as a virulence factor in recruiting human regulators ( 53 ), and in Trichomonas vaginalis , enolase plays a role in virulence by activating plasminogen to plasmin ( 54 ). Interestingly, some commensal bacteria, including L. johnsonii, L. crispatus and L. plantarum , also encode enolases that can bind plasminogen and activate plasmin ( 55 ), among other moonlighting activities. A surface-associated protein homologous to enolase (Eno3) from L. gasseri ATC 3323 was found to inhibit the adherence of Neisseria gonorrhoeae to epithelial cells ( 55 ). Similar to L. gasseri ATCC 33323, L. johnsonii N6.2 also has three enolase genes, and our results support the surface localization of Eno3 in L. johnsonii N6.2. Using immunogold staining and TEM, we observed that Eno3 is associated with membranes and present in the cytoplasm, and SEM showed association of Eno3 on the cell surface. While these results are consistent with observations of Eno3 from L. gasseri , future studies are needed to determine if L. johnsonii N6.2 Eno3 has a similar role in pathogen exclusion. Immunogold staining of the Sdp_SH3b2 and Sdp_SH3b6 domains in L. johnsonii N6.2 support the membrane localization and association of these domains on the surface of NV. While the function of bacterial SH3b domains is not well known, they are proposed to be cell wall binding domains in prokaryotes ( 56 , 57 ). SH3b domains have been identified on diverse proteins in conjunction with a variety of domains, including N- acetylmuramyl-L-alanine amidase, peptidase U20 family, peptidase M23 family, lysins (LysM), kinases and lysozymes ( 58 ). SH3b domains were recently reported to have two binding sites, in which one recognizes the pentaglycine crossbridge and the other recognizes the peptide stem of the cell wall ( 59 ). In Staphylococcus simulans , a lysostaphin SH3b domain binds to the pentaglycine interpeptide bridges of S. aureus peptidoglycan ( 60 ), while the SH3b domain of a phage endolysin was able to bind three types of staphylococcal peptidoglycan and Streptococcus uberis in absence of pentaglycine ( 57 ). While the primary biological function of Sdp may be related to the linkage of pentaglycine bridges, to bind to the cell wall, it is also thought to play a role in other moonlighting functions. A study regarding the diphtheria toxin repressor reported that the C-terminal domain resembled the folding structure of SH3 domains in eukaryotes ( 61 ). They presented structural evidence that the SH3 domain binds to a proline-rich segment linking the N- and C-terminal domains of the repressor. This binding interaction is thought to activate the repressor and decrease toxin expression ( 61 ). Structural and biophysical analysis also indicated the proline-rich peptide may function as a switch to modulate the activation of repressor activity ( 62 ). While the potential regulatory role of Sdp was not examined in this study, these finding support further investigation into the moonlighting activity of Sdp in L. johnsonii . Overall, it was observed that Sdp_SH3b2 and Sdp_SH3b6 had more immunogold particles located on NV-like structures on the cell surface, or surrounding the cell when compared to Eno3, supporting its extracellular display. To determine if proteins localized on the surface of NV could be used as biomarkers of in vivo production, we examined the potential for NV proteins to generate an immune response in human subjects. To this end, an ELISA assay was developed using purified NV, Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6, Eno3 and LexA proteins, to evaluate the host ACAb response to L. johnsonii N6.2 administration. The Sdp_SH3b2 and Sdp_SH3b6 domains generated the strongest IgA ACAb response, followed by whole NV, while no ACAb response was observed with Eno3 or LexA. In our previous study, we found that the total IgA concentration increased over time in the group that received L. johnsonii N6.2 ( 27 ). Here, we were able to show that the increase in IgA resulted from a specific response to components of the L. johnsonii N6.2 NV. In addition, a similar pattern was observed with IgG. Previous studies had used whole bacterial cells to study the host response to commensal microorganisms. Paun et al. ( 40 ), evaluated the titers and isotypes of ACAb to determine if patterns of ACAb responses are associated with T1D. The sera from subjects with recent-onset T1D and healthy controls exhibited differences in the IgA ACAb response against L. acidophilus , and the ACAb responses to intestinal microbes were found to be associated with the HLA-DR genotype, islet autoantibody and future diagnosis of T1D ( 40 ). A similar study found that commensal bacteria (Proteobacteria-rich) induce the serum levels of IgA, providing a protective effect against polymicrobial sepsis ( 63 ). Here, were able to show that the increased IgA production previously observed in subjects administered L. johnsonii N6.2 is due to the sensing of specific components present in the NV. In agreement with these findings we observed a decrease in the level of IgA recognizing NV, Sdp_SH3b2 and Sdp_SH3b6 after the washout period, which suggests continuous administration of the bacteria may be needed to confer benefits to the host. A limitation of the immunogenicity data obtained against NVs or purified proteins is that the clinical trial was designed to evaluate the immunological response to whole bacteria, in contrast to purified components. As such, further studies in animal models are needed to confirm these observations. The production of NV by beneficial microorganisms offers an alternative mechanism of host microbe interactions, however, many questions remain unanswered. Among them are how these structures are formed and released through the peptidoglycan layer (and possibly S-layer), how these structures interact with host cells (either epithelial or immune cells), and do NV only exert an effect on the host locally or can they potentially "travel" to distant locations. While scarce information is available on OMVs entering the bloodstream from intestinal epithelial cells ( 64 , 65 ), the beneficial effects of administering pure EVs have been reported. There are no previously reported biomarkers for tracking the movement of vesicles in the host, however, in this work we characterized NV from L. johnsonii N6.2 and identified Sdp as a biomarker for NV. We were able to further determine that subjects consuming L. johnsonii N6.2 are able to generate IgA and IgG against the Sdp_SH3b domains, which were found to be enriched in NV. Future studies will be directed to determine if NV are sensed by antigen-presenting cells at the intestinal interphase and/or following systemic distribution upon entering the bloodstream. Data Availability Statement The datasets presented in this study can be found in online repositories. The names of the repository/repositories and accession number(s) can be found below: http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD027785 . Ethics Statement The studies involving human participants were reviewed and approved by Institutional Review Board at the University of Florida. The patients/participants provided their written informed consent to participate in this study. Author Contributions NH and DS performed the research. NH, CG, DS, CG, and GL wrote the manuscript and conceived the study. All authors contributed to the article and approved the submitted version. Funding This study was partially funded by the National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health under University of Florida Clinical and Translational Science Awards TL1TR001428 and UL1TR001427 and the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health under award number 1R01DK121130. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. Author Disclaimer The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. Conflict of Interest GL holds U.S. Patent No. 9,474,773. The remaining authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest. Publisher's Note All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher. Supplementary Material The Supplementary Material for this article can be found online at: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.723433/full#supplementary-material Supplementary Figure 1 SDS-PAGE Gel of L. johnsonii N6.2 protein composition of different cellular components. From left to right, the gel shows the molecular weight ladder (MW), total extract (TE), intracellular extract (IC), cell membrane (CM) and nanovesicles (NV). Click here for additional data file. Supplementary Figure 2 Graphical illustration of the conserved domains found in T285_RS00825, and SDS-PAGE gel of purified proteins. (A) Conserved domains found in T285_RS00825 (top row) and selected domains for protein purification (bottom row). The amino acid sequence is 1 to 935 amino acids. Glyco_25 – Glycosyl hydrolases family 25; Lysozyme M1; muramidase and SH3b – Bacterial SH3 Domain Homologs. (B) Multiple alignment of the six Sdp_SH3b domains found in the T285_RS00825 protein. (C) From left to right: molecular weight ladder, SH3b2 domain, SH3b6 domain, Enolase 3, and LexA. Click here for additional data file. Supplementary Figure 3 Phylogenetic tree of SMART domains, Glyco_25 and Sdp_SH3b, in relation to T285_RS00825. Royal blue clade = Lactobacillus; Cyan clade = Pediococcus ; Gray-blue clade = Enterococcus ; Navy blue clade = Streptococcus ; Green clade = Bacillales; Orange clade = Clostridium ; Black clade = Anerolineaceae; Yellow clade = Aciduliprofundum ; Purple clade = Caudovirales. Click here for additional data file. Supplementary Figure 4 LexA expression under aerobic conditions. A representative western blot of LexA under static conditions, aerobic conditions and the purified LexA protein. Click here for additional data file. Supplementary Figure 5 Optiprep purification of crude NV by ultracentrifugation. (A) Western blot of the specificity of the Sdp_SH3b2 domain in protein precipitated Optiprep fractions: 1 through 12 (from top to bottom of the tube) and their respective densities. (B) Nanosight size and concentration of crude NV (solid line), fractions 1-2 (F1; long dashed lines), fractions 3-5 (F2; dots), fractions 6-7 (F3; short dashed lines) and fractions 8-9 (F4; dot and dashed line). (C) From left to right, western blots showing specificity of Sdp_SH3b2, Sdp_SH3b6, Eno3 and LexA in the fractions 1-2 (F1), fractions 3-5 (F2), fractions 6-7 (F3), fractions 8-9 (F4), the crude NV (CNV) and the respective purified protein. Click here for additional data file. Supplementary Figure 6 IgM ACAb generation against L. johnsonii N6.2 proteins and NV. Normalized IgM ratio of specific IgM generated against the antigens, NV (A) , Sdp_SH3b2 (B) , Sdp_SH3b6 (C) , Eno3 (D) and LexA (E) , over total plasma IgM. Click here for additional data file. Click here for additional data file.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8703829/

SARS-CoV-2 Inactivation Simulation Using 14 MeV Neutron Irradiation

The SARS-CoV-2 virus is deadly, contagious, can cause COVID-19 disease, and endangers public health and safety. The development of SARS-CoV-2 inactivation technology is crucial and imminent in current pandemic period. Neutron radiation is usually used to sterilize viruses because neutron radiation is 10 times more effective than gamma-rays in inactivating viruses. In this work we established a closed SARS-CoV-2 inactivation container model by the Monte Carlo method and simulated the inactivation performance by using several different neutrons sources. To study the effects of inactivation container factors, including the reflector thickness, the type of the reflector material, the SARS-CoV-2 layer area and the distance from the radiation source on the energy deposition of a single neutron particle in SARS-CoV-2 sample, we simulated the neutron energy deposition on a SARS-CoV-2 sample. The simulation results indicate that the saturated thicknesses of reflector materials for graphite, water and paraffin are approximately 30 cm, 15 cm, and 10 cm, respectively, and the energy deposition (radiation dose) becomes larger when the SARS-CoV-2 layer area is smaller and the SARS-CoV-2 layer is placed closer to the neutron source. The calculated single-neutron energy deposition on 10 × 10 cm 2 SARS-CoV-2 layer is about 3.0059 × 10 −4 MeV/g with graphite as the reflection layer, when the 14 MeV neutron source intensity is 10 12 n/s and the SARS-CoV-2 layer is 5 cm away from the neutron source. If the lethal dose of SARS-CoV-2 is assumed as the IAEA recommended reference dose, 25 kGy, the SARS-CoV-2 could be decontaminated in about 87 min, and the sterilization time could be less than 52 s if the 14 MeV neutron intensity is increased to 10 14 n/s. 1. Introduction The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) [ 1 ] is currently sweeping round the world and has caused the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pneumonia (shown in Figure 1 [ 1 ]). This is a new strain of coronavirus, which is contagious, can spread rapidly and widely through carriers, and has threatened human lives globally. Although the coronavirus was discovered in the 1930s [ 2 ], coronaviruses gained worldwide attention when the severe acute respiratory syndrome outbreak shook the world in 2003. Biologists' interest in this family of viruses grew in the aftermath of the epidemic of 2003, leading to the identification of many new coronavirus family members. The coronavirus break out in 2003 also gave a hint of the ability of coronaviruses to jump across species. Before gaining worldwide attention for threatening public health in 2003, the diseases associated with coronaviruses were mainly of veterinary interest. Coronaviruses can infect a wide variety of creatures, such as mammals and birds [ 3 ], causing respiratory and enteric diseases and, in some rarer cases, hepatitis and neurologic disease. Infection can be acute or persistent. Coronaviruses are enveloped, spherical or pleiomorphic viruses, with a radius of approximately 60 nm. The most distinctive feature of coronaviruses is the club-shaped spike projections emanating from the surface of the virion. These spikes are a defining feature of the virion and give them the appearance of a corona, giving the name, coronaviruses. Within the shell of the virion is the nucleocapsid. Coronaviruses have helically symmetrical nucleocapsids, which is uncommon among positive-sense RNA viruses, but far more common in negative-sense RNA viruses. The coronavirus in the current pandemic can spread from an infected individual's mouth or nose in small liquid particles when they cough, sneeze, speak, sing or breathe in closed or open areas. These particles range from larger respiratory droplets to smaller aerosols. It is important to practice respiratory etiquette, for example by coughing into a flexed elbow, and if an infected person feels unwell, to stay home and self-isolate until they recover [ 4 , 5 ]. Most people infected with the coronavirus will experience mild to moderate respiratory illness and recover without requiring special medical treatment. However, some will become seriously ill and require medical attention. Older people and those with underlying medical conditions like cardiovascular disease, diabetes, chronic respiratory disease, or cancer are more likely to develop serious illness. However, any person, at any age, can get sick with coronavirus and become seriously ill or die. The coronavirus pandemic around world has caused millions of deaths as well as lasting health problems in some individuals who have survived the illness. Although COVID-19 vaccines have been authorized for emergency use by the most countries and vaccination programs are in progress across the many parts of the world, the development of SARS-CoV-2 inactivation technology is crucial and imminent in current pandemic period. Effective vaccines against SARS-CoV-2 in humans are still in research and development and some of the promising vaccines have been pre-approved and used in some countries [ 6 , 7 ]. When bulk goods, such as luggage, medical instrumentations, tools, etc., are contaminated by SARS-CoV-2 in public areas, the traditional medical procedures, including pasteurization, alcohol and ultraviolet irradiation, which are generally used to kill common pathogenic bacteria [ 8 ], just do not work. Using alcohol to sterilize SARS-CoV-2 contamination is only feasible in some cases of surface contamination; it does not work effectively against SARS-CoV-2 hidden inside sealed containers, luggage, food, and so on. Compared with traditional sterilization methods, radiation sterilization technology [ 9 ] has the advantages of short time, high efficiency, no damage, low energy consumption, and suitability for large-scale sterilization. There are chemical and physical techniques for virus inactivation and radiation disinfection or sterilization is a physical method, acting mainly through the inactivation of viruses by gamma rays and electron beam irradiation [ 10 ]. There are many studies using irradiation technologies such as X-rays, neutron irradiation, etc., to inactivate different viruses [ 11 , 12 , 13 ]. The γ-ray irradiation technique has been used to kill bacteria and anthrax hidden in sealed metal equipment or large luggage because the γ-ray irradiation is more penetrative than electron beams [ 10 ]. However, theoretical study showed that the neutron irradiation yielded higher sterilization efficiency for anthrax spores than γ-ray irradiation. Neutrons can penetrate sealed equipment to kill both anthrax spores, not only on surfaces, but also those hidden inside bulk goods or luggage, because neutrons have no charge and can penetrate. Simulation study has shown that 2.5 MeV neutron irradiation from a D-D neutron generator can sterilize all anthrax spores in a sample within approximately 1 min [ 14 ]. The radiation particle type and energy affect the irradiation inactivation efficiency significantly because they have quite different weighting factors. The radiation weighting factor represents the relative radiation damage to the tissue or organ resulting from the unit deposition energy. The radiation damage depends not only on the deposition energy, but also on the radiation type and energy. The radiation weighting factor of photon and electron particles is 1, which is independent of the energy of the radiation. However, for neutron radiation, the weighting factor is energy-dependent, and its value may be from 5 to 20. The weighting factor of 14 MeV neutrons is 10, compared with electrons and γ-rays, the weighting factor of which is 1, meaning that the neutrons can cause 10 times the damage to organisms that γ-rays can for the same energy deposition or radiation dose. The virus inactivation is mainly caused by damage from the irradiation to the viral nucleic acid, including RNA and DNA. A single-strand break (for single-stranded viruses) or a double-strand break led by irradiation damage is enough to kill the viruses [ 15 ]. Several different neutron sources can create enough neutron irradiation to sterilize all kind of viruses. The common neutron sources used to sterilize the virus contamination are radioisotope neutron sources and monoenergetic neutron generators. There are many radioisotope neutron sources, the typical radioisotope neutrons sources used in nuclear technology are 252 Cf (Californium-252 neutron source) and 241 Am-Be (Americium beryllium neutron source). The half-life of 252 Cf neutron source is about 2.6 years, while the half-life of 241 Am-Be is 432.2 years. The neutron energy spectrum emitted from 252 Cf neutron source is similar to the fission neutron spectrum, with 2 MeV average neutron energy. 241 Am-Be neutron source emits both neutrons and α particles, with 4.5 MeV average neutron energy. Neutron generators are electronic devices that contain compact linear particle accelerators and produce neutrons by fusing isotopes of hydrogen atoms together. The fusion reactions take place in these electronic devices by accelerating either deuterium, tritium, or a mixture of these two isotopes into a metal hydride target which also contains deuterium, tritium, or a mixture of these isotopes. There are two different types of monoenergetic neutron generators, D-D neutron generators and T–D neutron generators [ 16 ]. Fusion of deuterium atoms (D + D) results in the formation of a He-3 ion and a neutron with a kinetic energy of approximately 2.5 MeV. Fusion of a deuterium and a tritium atom (D + T) results in the formation of a He-4 ion and a neutron with a kinetic energy of approximately 14.1 MeV [ 17 ]. Neutron generators have wide applications in physics, nuclear technology, materials analysis, and medicine. The use of neutron irradiation in the treatment of food and food packaging is regulated by the U.S. Food & Drug Administration (FDA), which controls the energy of neutrons used for inspection of food and packaged food ranging from 1 MeV to 14 MeV [ 18 ]. In the coronavirus inactivation simulation calculations, we choose a 14 MeV neutron generator to sterilize SARS-CoV-2, because it has high neutron yield and monochromatic energy spectrum and can generate pulsed neutrons. The 14 MeV neutron generator can be turned off to stop neutron generation, so it is easy to shield, store and transport. We set up a SARS-CoV-2 inactivation model and placed the neutron source above the SARS-CoV-2 layer at a height of 5 cm. In MCNP simulation calculations, we consider the effects of the simulation set-up components, including the reflector material, the reflector thickness, the SARS-CoV-2 layer area, and the distance between the samples and the neutron source [ 16 ]. In this study, we set up a simulation model by MCNP code [ 19 ] and calculated the single-neutron energy deposition, the effect of the reflector materials and reflector thickness, and the incident neutron energy that is needed to sterilize SARS-CoV-2 contamination. The simulation results present the effect of reflector materials, reflector thickness on the neutron energy deposition in SARS-CoV-2 layer and illustrate the available estimated sterilization time using 14 MeV neutron generator. 2. Materials and Methods The SARS-CoV-2 virion is composed of 29 proteins in total including 16 non-structural proteins and nine accessory proteins [ 20 ], which are hydrogen (proton)-rich materials. Neutrons and hydrogen atoms have high nuclear interaction cross sections, which indicates the possibility of interaction between neutrons and hydrogen atoms is high and neutrons can cause damage to SARS-CoV-2 DNA strands. SARS-CoV-2 belongs to the coronavirus family that includes the other well-known viruses SARS-CoV and MERS-CoV [ 21 ], and is an enveloped, single-stranded, positive-sense RNA virus of similar size to other coronaviruses [ 20 ]. RNA has a single chain structure that is easy to break and recombine. When neutrons hit the SARS-CoV-2 virus, they will interact with the nuclei of the hydrogen, oxygen and carbon atoms within the proteins of the SARS-CoV-2 virion. The neutrons tend to knock protons out of hydrogen nuclei meanwhile and transfer their energy to the protons. The scattered protons are ionizing radiation and interact with biological molecules as they go through the SARS-CoV-2 layer. In this way, the protons deposit their energy to biological molecules along their tracks by ionizing or exciting surrounding viral molecules, and the deposited energy induces the biological damage. The damage severity is directly related to the local rate of energy deposition along the protons penetration track [ 17 ]. The biological damage can cause the single chain of RNA to break. The viruses lack enzymes and are therefore unable to repair any damage in their RNA and DNA [ 22 ]. This is the reason why we decide to use penetrating neutron radiation to sterilize SARS-CoV-2 contamination. We set up a virus inactivation model shown in Figure 2 to simulate inactivation of SARS-CoV-2 using 14 MeV neutrons by MCNP code. This model consists of a stainless-steel container, a surrounding reflector layer, a SARS-CoV-2 layer, and 14 MeV neutron sources. We used water, paraffin, and graphite as the reflector materials because these three materials are hydrogen-rich and good for reflecting and "slowing down" neutrons. Figure 2 shows the simulation model of neutron irradiation inactivation of SARS-CoV-2. In this model, the SARS-CoV-2 samples are supported by a stainless-steel frame at the bottom of the container; The SARS-CoV-2 layer area is 10 × 10 cm 2 and the thickness of the SARS-CoV-2 layer is 1 mm. We used a 14 MeV neutron source in the simulation model. For the simulation calculations, we set up a simulation model in MCNP code to calculate the average energy deposition in the SARS-CoV-2 layer. For the simulation calculations, we wrote the input file in MCNP code to calculate the single-neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample. The neutrons interact with the SARS-CoV-2 sample and deposit their energy within the SARS-CoV-2 sample mainly through neutron–proton collisions. We calculated the single-neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 layer with different reflector thicknesses, various reflector materials, and different distances between the SARS-CoV-2 sample and the neutron source. In the simulation, we ignored the energy deposition of γ-ray irradiation which is created by the neutrons' interaction with the reflector materials. 3. Results and Discussions We calculated the average energy deposition per particle in the SARS-CoV-2 sample using 14 MeV and 2.5 MeV neutrons, and 1.33 MeV gamma rays with the source 5 cm away from the SARS-CoV-2 sample, as shown in Figure 3 . The calculation results show that the 14 MeV neutrons deposit more energy than the other two irradiation sources, therefore we choose 14 MeV neutrons to irradiate SARS-CoV-2 sample in the simulation model. Figure 4 shows that the reflector materials had an effect on the neutron energy deposition. Figure 5 a–c show the effect of the distance between the neutron source and the SARS-CoV-2 sample on the neutron energy deposition with water, graphite, and paraffin as reflectors, respectively. 3.1. The Effect of the Reflector Materials and Reflector Thickness on the Neutron Energy Deposition in the SARS-CoV-2 Layer The simulation results of energy deposition using 14 MeV neutrons for three reflector materials are shown in Figure 4 . We can see that the single-neutron energy deposition increases rapidly when the reflector thickness is less than 10 cm for the three materials used (water, paraffin or graphite). However, the single-neutron energy deposition shows almost no further increase when the thickness of reflector materials reaches a certain value; we call this reflector thickness the saturated thickness. Therefore, using reflector materials thicker than the saturated thickness to increase the single-neutron energy deposition is ineffective. The results in Figure 4 show that the saturated thickness varies with different reflector materials. The saturated thicknesses of graphite, water, and paraffin are approximately 30 cm, 15 cm, and 10 cm, respectively. In the anthrax sterilization research using 2.5 MeV neutrons radiation, the saturated thickness was about 15 cm [ 17 ]. The saturated thickness is not closely related to the distance between the neutron source and the SARS-CoV-2 sample. From Figure 5 a–c, we can see that the saturated thicknesses for graphite, water, and paraffin reflecting materials at 5 cm and 10 cm distances are still about 30 cm, 15 cm, and 10 cm, respectively, which shows that the saturated thickness is independent of the distance between the neutron source and the SARS-CoV-2 sample. This independence phenomenon also appeared in the anthrax sterilization work. 3.2. The Effect of the Distance between the Neutron Source and SARS-CoV-2 Sample on the Neutron Energy Deposition We can see from the results shown in Figure 5 a–c that the single-neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample becomes greater when the SARS-CoV-2 layer is set much closer to the neutron source. At the same time, we find that these distance-related results are somewhat off the inverse-square law. However, the result is still reasonable because the SARS-CoV-2 sample was in a square shape, meaning each protein molecule had different distance to the neutron source, and we also used the reflector in the model. Both these factors can cause the neutron energy deposition to be off the inverse-square law somewhat. In real neutron-based inactivation of SARS-CoV-2 experimental set-up, it would be necessary to place the neutron source as close as possible to the SARS-CoV-2 area and to use a reflector to increase the energy deposition in the SARS-CoV-2 layer. 3.3. The Effect of the SARS-CoV-2 Layer Area on the Neutron Energy Deposition Figure 6 illustrates the energy deposition on SARS-CoV-2 samples with different layer areas using 14 MeV neutrons and the graphite reflector. It is clear that the energy deposition in the SARS-CoV-2 sample with an area of 20 × 20 cm 2 is less than that of the 10 × 10 cm 2 SARS-CoV-2 layer. This is because the average distance between the protein molecules in the SARS-CoV-2 layer and the neutron source becomes larger with the increase in the SARS-CoV-2 layer area, and the lower average neutron penetration into the SARS-CoV-2 layer leads to lower energy deposition. Therefore, we suggest that medical products contaminated by SARS-CoV-2 should be placed around the neutron source in a circle to improve the sterilization efficiency. 3.4. The Sterilization Time Estimation of SARS-CoV-2 Using Neutron Irradiation The virus damage induced by ionizing radiation is due to chemical alteration of the biological molecules, by the ionization or excitation caused by their interaction with the radiation. In the ionization or excitation process, the ionizing radiation particles deposit their energy onto the biological molecules. When a neutron collides with a proton in SARS-CoV-2, it transfers all its energy to the proton because a neutron has the same mass as a hydrogen nucleus (proton), thus it deposits all its energy in the SARS-CoV-2 virion. Therefore, compared with other forms of radiation, neutrons can create greater biological damage to SARS-CoV-2. Neutrons also collide with the oxygen and carbon nuclei in SARS-CoV-2. However, the oxygen and carbon nuclei are more than 10 times heavier than a neutron; therefore, during collision only a small part of the neutron's energy transfers to the oxygen and carbon nuclei. The energy transfer in neutron–proton collisions dominates the energy transfers to SARS-CoV-2 when irradiated by neutrons, so the neutron–proton collision is the dominant biological damage mechanism within SARS-CoV-2. The inactivation cross-section of viruses relates to the irradiation dose. The typical survival curves of viruses [ 23 ] show that the survival rates of C16 bacteriophages [ 13 ] and the foot-and-mouth-disease picornavirus (FMDV) [ 24 ] reach the in order of 1.0 × 10 −2 when the irradiation dose is 2 kGy and 10 kGy, respectively. The study of γ-ray irradiation used to disinfect anthrax suggested that a dose of 2.0 × 10 6 rad was recommended to kill the most anthrax. The SI equivalent of 2.0 × 10 6 rad is 20 kGy [ 9 ]. The International Atomic Energy Agency (IAEA) has suggested that when the pollution level and types of contaminated microorganisms cannot be confirmed, the standard irradiation dose can be set to 25 kGy [ 25 ]. The choice of 25 kGy for sterilization using gamma radiation was first suggested in 1959 by Artandli. The dose was proposed based on minimum killing dose of medical products for about 150 microbial species. 25 kGy was selected as the dose for sterilization because it is 40% above the minimum dose required to kill the resistant microorganisms [ 26 ]. Accordingly, 25 kGy is the minimum irradiation dose established for sterilization. Radiation sterilization at a dose of 25 kGy provides such a high safety factor that testing for sterility is generally considered superfluous. Therefore, it is reasonable to use the reference dose 25 kGy as the lethal dose for SARS-COV-2. When reference dose irradiated by γ rays is 25 kGy, the lethal dose for SARS-COV-2 irradiated by neutrons becomes 2.5 kGy, because the weighting factor of neutrons is 10 and γ rays' is 1. Thus, the necessary dose using neutrons irradiation to kill SARS-COV-2 virus is 25/10 = 2.5 kGy and the no survival reference dose level D for SARS CoV-2 using neutron irradiation is: D = 2500 Gy (1) It can be seen from the simulation data shown in Figure 2 , Figure 3 , Figure 4 , Figure 5 and Figure 6 that the highest damage to the SARS-COV-2 caused by neutrons is with the 14 MeV neutron generator as the radiation source, graphite as the reflection layer (saturated thickness), the SARS-COV-2 layer area of 10 × 10 cm 2 , the distance between neutron source and SARS-CoV-2 layer of 5 cm. Under these conditions, the energy deposition of a single neutron in SARS-COV-2 is about 3.0059 × 10 −4 MeV/g (see Figure 6 for detail). Using this, we calculated the time needed to kill the SARS-CoV-2. The estimated sterilization time of the SARS-COV-2 by using 14 MeV neutron irradiation can be calculated as [ 27 ]: (2) t = D ( G y ) d ( MeV / g ) × 10 6 × 1.6 × 10 − 19 × 10 3 × Q × A ( n / s ) × 60 ( Minutes ) where, D is the assumed lethal dose for SARS-COV-2, which is about 2500 Gy (2500 J/kg) provied in Equation (1); Q is the neutron weighting factor, which for 14.0 MeV energy is 10; d is the single-neutron energy deposition in the SARS-COV-2; and A is the intensity of radioactive neutrons. The intensity of the neutron source A in this study is 10 12 n/s, and the 14 MeV neutron energy deposition d is about 3.0059 × 10 −4 MeV/g in Figure 6 . We inserted these A and d parameters into Equation (2), and the estimated sterilization time is 87 min. The calculated sterilization time shrinks to about 52 s if the neutron intensity increases to 10 14 n/s, which is feasible because a D-D neutron generator with 10 14 n/s neutron intensity has been successfully developed [ 28 ]. 3.1. The Effect of the Reflector Materials and Reflector Thickness on the Neutron Energy Deposition in the SARS-CoV-2 Layer The simulation results of energy deposition using 14 MeV neutrons for three reflector materials are shown in Figure 4 . We can see that the single-neutron energy deposition increases rapidly when the reflector thickness is less than 10 cm for the three materials used (water, paraffin or graphite). However, the single-neutron energy deposition shows almost no further increase when the thickness of reflector materials reaches a certain value; we call this reflector thickness the saturated thickness. Therefore, using reflector materials thicker than the saturated thickness to increase the single-neutron energy deposition is ineffective. The results in Figure 4 show that the saturated thickness varies with different reflector materials. The saturated thicknesses of graphite, water, and paraffin are approximately 30 cm, 15 cm, and 10 cm, respectively. In the anthrax sterilization research using 2.5 MeV neutrons radiation, the saturated thickness was about 15 cm [ 17 ]. The saturated thickness is not closely related to the distance between the neutron source and the SARS-CoV-2 sample. From Figure 5 a–c, we can see that the saturated thicknesses for graphite, water, and paraffin reflecting materials at 5 cm and 10 cm distances are still about 30 cm, 15 cm, and 10 cm, respectively, which shows that the saturated thickness is independent of the distance between the neutron source and the SARS-CoV-2 sample. This independence phenomenon also appeared in the anthrax sterilization work. 3.2. The Effect of the Distance between the Neutron Source and SARS-CoV-2 Sample on the Neutron Energy Deposition We can see from the results shown in Figure 5 a–c that the single-neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample becomes greater when the SARS-CoV-2 layer is set much closer to the neutron source. At the same time, we find that these distance-related results are somewhat off the inverse-square law. However, the result is still reasonable because the SARS-CoV-2 sample was in a square shape, meaning each protein molecule had different distance to the neutron source, and we also used the reflector in the model. Both these factors can cause the neutron energy deposition to be off the inverse-square law somewhat. In real neutron-based inactivation of SARS-CoV-2 experimental set-up, it would be necessary to place the neutron source as close as possible to the SARS-CoV-2 area and to use a reflector to increase the energy deposition in the SARS-CoV-2 layer. 3.3. The Effect of the SARS-CoV-2 Layer Area on the Neutron Energy Deposition Figure 6 illustrates the energy deposition on SARS-CoV-2 samples with different layer areas using 14 MeV neutrons and the graphite reflector. It is clear that the energy deposition in the SARS-CoV-2 sample with an area of 20 × 20 cm 2 is less than that of the 10 × 10 cm 2 SARS-CoV-2 layer. This is because the average distance between the protein molecules in the SARS-CoV-2 layer and the neutron source becomes larger with the increase in the SARS-CoV-2 layer area, and the lower average neutron penetration into the SARS-CoV-2 layer leads to lower energy deposition. Therefore, we suggest that medical products contaminated by SARS-CoV-2 should be placed around the neutron source in a circle to improve the sterilization efficiency. 3.4. The Sterilization Time Estimation of SARS-CoV-2 Using Neutron Irradiation The virus damage induced by ionizing radiation is due to chemical alteration of the biological molecules, by the ionization or excitation caused by their interaction with the radiation. In the ionization or excitation process, the ionizing radiation particles deposit their energy onto the biological molecules. When a neutron collides with a proton in SARS-CoV-2, it transfers all its energy to the proton because a neutron has the same mass as a hydrogen nucleus (proton), thus it deposits all its energy in the SARS-CoV-2 virion. Therefore, compared with other forms of radiation, neutrons can create greater biological damage to SARS-CoV-2. Neutrons also collide with the oxygen and carbon nuclei in SARS-CoV-2. However, the oxygen and carbon nuclei are more than 10 times heavier than a neutron; therefore, during collision only a small part of the neutron's energy transfers to the oxygen and carbon nuclei. The energy transfer in neutron–proton collisions dominates the energy transfers to SARS-CoV-2 when irradiated by neutrons, so the neutron–proton collision is the dominant biological damage mechanism within SARS-CoV-2. The inactivation cross-section of viruses relates to the irradiation dose. The typical survival curves of viruses [ 23 ] show that the survival rates of C16 bacteriophages [ 13 ] and the foot-and-mouth-disease picornavirus (FMDV) [ 24 ] reach the in order of 1.0 × 10 −2 when the irradiation dose is 2 kGy and 10 kGy, respectively. The study of γ-ray irradiation used to disinfect anthrax suggested that a dose of 2.0 × 10 6 rad was recommended to kill the most anthrax. The SI equivalent of 2.0 × 10 6 rad is 20 kGy [ 9 ]. The International Atomic Energy Agency (IAEA) has suggested that when the pollution level and types of contaminated microorganisms cannot be confirmed, the standard irradiation dose can be set to 25 kGy [ 25 ]. The choice of 25 kGy for sterilization using gamma radiation was first suggested in 1959 by Artandli. The dose was proposed based on minimum killing dose of medical products for about 150 microbial species. 25 kGy was selected as the dose for sterilization because it is 40% above the minimum dose required to kill the resistant microorganisms [ 26 ]. Accordingly, 25 kGy is the minimum irradiation dose established for sterilization. Radiation sterilization at a dose of 25 kGy provides such a high safety factor that testing for sterility is generally considered superfluous. Therefore, it is reasonable to use the reference dose 25 kGy as the lethal dose for SARS-COV-2. When reference dose irradiated by γ rays is 25 kGy, the lethal dose for SARS-COV-2 irradiated by neutrons becomes 2.5 kGy, because the weighting factor of neutrons is 10 and γ rays' is 1. Thus, the necessary dose using neutrons irradiation to kill SARS-COV-2 virus is 25/10 = 2.5 kGy and the no survival reference dose level D for SARS CoV-2 using neutron irradiation is: D = 2500 Gy (1) It can be seen from the simulation data shown in Figure 2 , Figure 3 , Figure 4 , Figure 5 and Figure 6 that the highest damage to the SARS-COV-2 caused by neutrons is with the 14 MeV neutron generator as the radiation source, graphite as the reflection layer (saturated thickness), the SARS-COV-2 layer area of 10 × 10 cm 2 , the distance between neutron source and SARS-CoV-2 layer of 5 cm. Under these conditions, the energy deposition of a single neutron in SARS-COV-2 is about 3.0059 × 10 −4 MeV/g (see Figure 6 for detail). Using this, we calculated the time needed to kill the SARS-CoV-2. The estimated sterilization time of the SARS-COV-2 by using 14 MeV neutron irradiation can be calculated as [ 27 ]: (2) t = D ( G y ) d ( MeV / g ) × 10 6 × 1.6 × 10 − 19 × 10 3 × Q × A ( n / s ) × 60 ( Minutes ) where, D is the assumed lethal dose for SARS-COV-2, which is about 2500 Gy (2500 J/kg) provied in Equation (1); Q is the neutron weighting factor, which for 14.0 MeV energy is 10; d is the single-neutron energy deposition in the SARS-COV-2; and A is the intensity of radioactive neutrons. The intensity of the neutron source A in this study is 10 12 n/s, and the 14 MeV neutron energy deposition d is about 3.0059 × 10 −4 MeV/g in Figure 6 . We inserted these A and d parameters into Equation (2), and the estimated sterilization time is 87 min. The calculated sterilization time shrinks to about 52 s if the neutron intensity increases to 10 14 n/s, which is feasible because a D-D neutron generator with 10 14 n/s neutron intensity has been successfully developed [ 28 ]. 4. Conclusions In this paper, the effect of reflector materials, reflector thickness and the SARS-CoV-2 layer area on the neutron energy deposition in a SARS-CoV-2 layer are studied. In order to focus on the neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 layer when the neutron irradiation is used to sterilize the SARS-CoV-2 and minimize the time of the simulation calculation, the energy deposition in the SARS-CoV-2 by other means, such as gamma rays from the surrounding reflector material was ignored when we used MCNP code to do the simulation calculation. As can be seen from the simulation data, the greater the thickness of the reflector layer is, the more neutron energy is deposited. The neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample increases with increasing thickness of the reflector, when the thickness of the reflector reaches the saturated thickness, further increases in the thickness of the reflector have little impact on the neutron energy deposition. The different reflector materials also have different effects on the neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample. Among all the three reflector materials, graphite gives the maximum neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample. The saturated thickness of paraffin is only 33% that of graphite, and water is only 50% of graphite. Considering all the factors that affect the neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample, graphite has the best reflecting effect to sterilize the SARS-CoV-2 viruses, but it has a high density, and is therefore hard to transport. Although water's neutron-reflecting effect is not as good as that of the graphite, water is readily available anywhere and anytime, thus water may be the ideal reflector material for sterilization of SARS-CoV-2 contamination. Our calculation results also show that smaller the area of the SARS-CoV-2 layer is, the greater the average energy deposition. This is because the average distance between the protein molecules in SARS-CoV-2 layer and neutron source becomes greater as the SARS-CoV-2 layer area increases, and fewer neutrons penetrate the SARS-CoV-2 layer, leading to lower average neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample. In our simulation calculation, a 14 MeV neutron generator was used as the radiation source, the sample area of the SARS-CoV-2 layer was 10 × 10 cm 2 , and the distance between the neutron source and the SARS-CoV-2 sample was set to 5 cm. The single-neutron energy deposition in the SARS-CoV-2 sample was about 3.0059 × 10 −4 MeV/g. The lethal dose of the SARS-CoV-2 is 25 kGy. Our calculation results show that SARS-CoV-2 can be completely sterilized by 14 MeV neutron irradiation within about 87 min, and the estimated sterilization time shrinks to about 52 s if the neutron intensity is increased to 10 14 n/s.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4200455/

Checklist of the ‘lower Brachycera ’ of Finland: Tabanomorpha , Asilomorpha and associated families ( Diptera )

Abstract A checklist of the 'lower Brachycera ' of Finland is presented. This part of the complete checklist of Finnish Diptera covers the families Acroceridae , Asilidae , Athericidae , Bombyliidae , Mythicomyiidae , Rhagionidae , Scenopinidae , Stratiomyidae , Tabanidae , Therevidae , Xylomyidae and Xylophagidae . Citation Kahanpää J, Winqvist K, Zeegers T (2014) Checklist of the 'lower Brachycera' of Finland: Tabanomorpha, Asilomorpha and associated families (Diptera). In: Kahanpää J, Salmela J (Eds) Checklist of the Diptera of Finland. ZooKeys 441: 165–181. doi: 10.3897/zookeys.441.7198 Introduction This part of the checklist of the Diptera of Finland covers non-eremoneuran true flies ( Diptera : Brachycera ). The brachyceran flies excluded from the clade Eremoneura are often called the 'lower Brachycera ' due to their basal position in the true fly tree of life. It remains unclear whether this assemblage of families is a monophyletic clade. There are also several models for the relative relationships of the various superfamilies and families. A simple classification scheme following Marshall (2012) is adopted for this checklist. Only two infraorders, Tabanomorpha and Asilomorpha , are recognized. The presentation order of families follows Woodley et al. (2009) . World catalogues have recently been published for Stratiomyidae ( Woodley 2001 , 2011b ), Xylomyidae ( Woodley 2011a ), Xylophagidae ( Woodley 2011c ), Bombyliidae ( Evenhuis and Greathead 1999 , 2003 ) and Mythicomyiidae ( Evenhuis 2002 ). The Finnish species were last listed by Kahanpää and Winqvist (2005) . Five species have been added since the last checklist: Haematopota italica Meigen, 1804, Lasiopogon septentrionalis Lehr, 1984, Nemotelus infortunatus Kahanpää, 2010, Xylophagus inermis Krivosheina & Krivosheina, 2000 and Zabrachia tenella (Jaennicke, 1866) (see Kahanpää 2013 , Cannings and Kahanpää 2013 , Kahanpää 2010, this paper, and Krivosheina and Rozkošný 1990 respectively). Table 1 summarizes the current family species counts for the world, Europe (based on Fauna Europaea), and Finland. Table 1. Number of species in tabanomorph and asilomorph families plus Acroceridae . Family Number of species in Level of knowledge World Europe Finland Tabanomorpha : Stratiomyidae 2715 ( Woodley 2001 , 2011b ) 141 29 good Xylomyidae 138 ( Woodley 2011a ) 13–14 1 good Xylophagidae 134 ( Woodley 2011c ) 8 5 average–good Rhagionidae 694 ( Pape et al. 2011 ) 85 15–16 average–good Athericidae 124 ( Pape et al. 2011 ) 10 1 good Tabanidae 4405 ( Pape et al. 2011 ) 213 38–39 good Asilomorpha : Asilidae 7513 ( Pape et al. 2011 ) 524 35 good Bombyliidae ~5000 ( Evenhuis and Greathead 1999 , 2003 ) 335 18–19 good Mythicomyiidae ~330 ( Evenhuis 2002 , Pape et al. 2011 ) 30 1 average Scenopinidae 416 ( Pape et al. 2011 ) 17 3 good Therevidae 1129 ( Pape et al. 2011 ) 99 17 average–good unplaced : Acroceridae 392 ( Pape et al. 2011 ) 34 5 average Tabanomorpha The stratiomyoid and xylophagoid lineages are often treated as infraorders ( Woodley et al. 2009 ). The soldierflies ( Stratiomyidae ) are very diverse in the tropics but the species diversity decreases sharply towards the higher latitudes. The wood soldier flies (xylomyids) is a small fly family associated with dead wood. The Fauna Entomologica Scandinavica series has a volume on stratiomyoid flies ( Rozkošný 1973 ). A new Nemotelus species was recently described from Finland ( Kahanpää 2010a ). The Finnish rhagionids are relatively well known but a few additional species could occur in the country. Ptiolina is a problematic genus and the number of recognized species in Northern Europe has varied from two to seven during the last century. Athericidae was traditionally placed as a subfamily of Rhagionidae , but it seems more closely associated with Tabanidae ( Marshall 2012 ). Itämies et al. (1990 , 1993 ) have studied the distribution of Atherix ibis in Finland. The Finnish xylophagid fauna is relatively well sampled. Adults of the North European species can be identified using Nartshuk (1988) or Kahanpää (2009) . The larvae can also be identified at least at the last larval stage ( Stubbs and Drake 2001 , Krivosheina and Krivosheina 1966 ). The tabanid nomenclature (especially Hybomitra ) is quite convoluted and records in older publications must be taken with a grain of salt. Karvonen (1969) summarized the distribution of tabanids in Finland, but this work is now partially obsolete due to the difficulties in identifying Hybomitra and Haematopota before Chvála et al. (1972) was published. For identification of North European tabanids Chvála et al. (1972) complemented with pictures in Zeegers and van Haaren (2000) or Krčmar et al. (2011) is recommended. An illustrated guide to the Finnish species is in preparation (A. Haarto, unpublished). Asilomorpha The asilids and bombyliids of Finland are rather well known from a faunistic point of view but little is known about their ecology. Most of the North European species are easy to identify but problems with Villa resulted in a cascade of name changes in the late 20th century. Falck (2009) and Blöchlinger (2008) are good starting points for identifying Villa adults. François (1969) has male genitalia figures for some of the more difficult Villa species. The Mythicomyiidae or micro bee flies were long seen as a subfamily of Bombyliidae . Identifying Thereva species was also fraught with difficulties in the past but by the end of the 20th century the North European fauna was pretty well understood. A review of the Finnish therevid fauna with keys has recently been published ( Haarto and Winqvist 2006 ). The window flies, Scenopinidae , is a smallish asiloid lineage associated with the therevids. It has even been proposed they are a specialized subgroup of the Therevidae ( Woodley 2009 ). Acroceridae The small-headed flies ( Acroceridae ) are a fly family of obscure origin. Affinities with Nemestrinidae , Tabanoidea , Stratiomyoidea , Bombyliidae and Asilomorpha have been proposed (see Marshall 2012 for further discussion). Finnish acrocerid records are mostly of single adults caught by sweep-netting, although Storå (1956) found groups of 20–40 Acrocera orbiculus swarming on a coastal meadow. The acrocerid species seem to have declined in abundance during the 20th century. Four of our five Finnish species are now on the national red list ( Kahanpää 2010b ). Tabanomorpha The stratiomyoid and xylophagoid lineages are often treated as infraorders ( Woodley et al. 2009 ). The soldierflies ( Stratiomyidae ) are very diverse in the tropics but the species diversity decreases sharply towards the higher latitudes. The wood soldier flies (xylomyids) is a small fly family associated with dead wood. The Fauna Entomologica Scandinavica series has a volume on stratiomyoid flies ( Rozkošný 1973 ). A new Nemotelus species was recently described from Finland ( Kahanpää 2010a ). The Finnish rhagionids are relatively well known but a few additional species could occur in the country. Ptiolina is a problematic genus and the number of recognized species in Northern Europe has varied from two to seven during the last century. Athericidae was traditionally placed as a subfamily of Rhagionidae , but it seems more closely associated with Tabanidae ( Marshall 2012 ). Itämies et al. (1990 , 1993 ) have studied the distribution of Atherix ibis in Finland. The Finnish xylophagid fauna is relatively well sampled. Adults of the North European species can be identified using Nartshuk (1988) or Kahanpää (2009) . The larvae can also be identified at least at the last larval stage ( Stubbs and Drake 2001 , Krivosheina and Krivosheina 1966 ). The tabanid nomenclature (especially Hybomitra ) is quite convoluted and records in older publications must be taken with a grain of salt. Karvonen (1969) summarized the distribution of tabanids in Finland, but this work is now partially obsolete due to the difficulties in identifying Hybomitra and Haematopota before Chvála et al. (1972) was published. For identification of North European tabanids Chvála et al. (1972) complemented with pictures in Zeegers and van Haaren (2000) or Krčmar et al. (2011) is recommended. An illustrated guide to the Finnish species is in preparation (A. Haarto, unpublished). Asilomorpha The asilids and bombyliids of Finland are rather well known from a faunistic point of view but little is known about their ecology. Most of the North European species are easy to identify but problems with Villa resulted in a cascade of name changes in the late 20th century. Falck (2009) and Blöchlinger (2008) are good starting points for identifying Villa adults. François (1969) has male genitalia figures for some of the more difficult Villa species. The Mythicomyiidae or micro bee flies were long seen as a subfamily of Bombyliidae . Identifying Thereva species was also fraught with difficulties in the past but by the end of the 20th century the North European fauna was pretty well understood. A review of the Finnish therevid fauna with keys has recently been published ( Haarto and Winqvist 2006 ). The window flies, Scenopinidae , is a smallish asiloid lineage associated with the therevids. It has even been proposed they are a specialized subgroup of the Therevidae ( Woodley 2009 ). Acroceridae The small-headed flies ( Acroceridae ) are a fly family of obscure origin. Affinities with Nemestrinidae , Tabanoidea , Stratiomyoidea , Bombyliidae and Asilomorpha have been proposed (see Marshall 2012 for further discussion). Finnish acrocerid records are mostly of single adults caught by sweep-netting, although Storå (1956) found groups of 20–40 Acrocera orbiculus swarming on a coastal meadow. The acrocerid species seem to have declined in abundance during the 20th century. Four of our five Finnish species are now on the national red list ( Kahanpää 2010b ). Checklist part 1: Tabanomorpha ( sensu lato ) suborder Brachycera Macquart, 1834 clade Orthorrapha Brauer, 1863 superfamily Stratiomyoidea Latreille, 1802 STRATIOMYIDAE Latreille, 1802 BERIDINAE Westwood, 1838 BERIS Latreille, 1802 Beris chalybata (Forster, 1771) Beris clavipes (Linnaeus, 1767) Beris fuscipes Meigen, 1820 Beris hauseri Stuke, 2004 = strobli auct. nec. Dušek & Rozkošný, 1968 Beris morrisii Dale, 1841 NEMOTELINAE Kertész, 1912 NEMOTELUS Geoffroy, 1762 sg. Camptopelta Williston, 1917 Nemotelus nigrinus Fallén, 1817 sg. Nemotelus Geoffroy, 1762 Nemotelus infortunatus Kahanpää, 2010 Nemotelus notatus Zetterstedt, 1842 Nemotelus uliginosus (Linnaeus, 1767) PACHYGASTRINAE Loew, 1856 BERKSHIRIA Johnson, 1914 = Pseudowallacea Kertész, 1921 Berkshiria hungarica (Kertesz, 1921) = albistylum misid. = barovskii misid. NEOPACHYGASTER Austen, 1901 Neopachygaster meromelas (Dufour, 1841) = orbitalis (Wahlberg, 1854) ZABRACHIA Coquillett, 1901 Zabrachia minutissima (Zetterstedt, 1838) Zabrachia tenella (Jaennicke, 1866) see Notes SARGINAE Walker, 1834 CHLOROMYIA Duncan, 1837 Chloromyia formosa (Scopoli, 1763) MICROCHRYSA Loew, 1855 Microchrysa cyaneiventris (Zetterstedt, 1842) Microchrysa flavicornis (Meigen, 1822) Microchrysa polita (Linnaeus, 1758) SARGUS Fabricius, 1798 Sargus cuprarius (Linnaeus, 1758) Sargus flavipes Meigen, 1822 = nigripes Zetterstedt, 1842 = splendens auct. nec. Meigen, 1804 Sargus iridatus (Scopoli, 1763) Sargus rufipes Wahlberg, 1854 STRATIOMYINAE Latreille, 1802 tribe Oxycerini Enderlein, 1914 OXYCERA Meigen, 1803 Oxycera centralis Loew, 1863 = centralis Frey, 1911 preocc. = freyi Lindner, 1938 Oxycera dives Loew, 1845 Oxycera trilineata (Linnaeus, 1767) tribe Stratiomyini Latreille, 1802 ODONTOMYIA Meigen, 1803 Odontomyia angulata (Panzer, 1798) Odontomyia argentata (Fabricius, 1794) Odontomyia microleon (Linnaeus, 1758) OPLODONTHA Rondani, 1863 Oplodontha viridula (Fabricius, 1775) STRATIOMYS Geoffroy, 1762 Stratiomys singularior (Harris, 1776) = furcata Fabricius, 1794 XYLOMYIDAE Verrall, 1901 XYLOMYA Rondani, 1861 Xylomya czekanovskii Pleske, 1925 = interrupta auct. nec. (Pleske, 1926) = maculata auct. nec. (Meigen, 1804) superfamily Xylophagoidea Fallén, 1810 XYLOPHAGIDAE Fallén, 1810 XYLOPHAGUS Meigen, 1803 = Erinna Meigen, 1800 suppr. Xylophagus ater Meigen, 1804 see Notes = compeditus Wiedemann, 1820 Xylophagus cinctus (De Geer, 1776) Xylophagus inermis Krivosheina & Krivosheina, 2000 see Notes = matsumurae misid. Xylophagus junki (Szilády, 1932) Xylophagus kowarzi (Pleske, 1925) see Notes = ater auct. nec. Meigen, 1804 superfamily Rhagionoidea Latreille, 1802 RHAGIONIDAE Latreille, 1802 RHAGIONINAE Latreille, 1802 RHAGIO Fabricius, 1775 Rhagio annulatus (De Geer, 1776) Rhagio lineola Fabricius, 1794 Rhagio maculatus (De Geer, 1776) Rhagio notatus (Meigen, 1820) Rhagio scolopaceus (Linnaeus, 1758) Rhagio tringarius (Linnaeus, 1758) CHRYSOPILINAE Bezzi, 1903 CHRYSOPILUS Macquart, 1826 Chrysopilus auratus (Fabricius, 1805) ?= cristatus (Fabricius, 1775) nom. dubium Chrysopilus luteolus (Fallén, 1814) Chrysopilus nubecula (Fallén, 1814) ? Chrysopilus suomianus (Szilády, 1934) see Notes SPANIINAE Rondani, 1856 OMPHALOPHORA Becker, 1900 Omphalophora oculata Becker, 1900 = lapponica Frey, 1911 PTIOLINA Zetterstedt, 1842 Ptiolina nigra Zetterstedt, 1842 Ptiolina nigrina Wahlgren, 1854 see Notes Ptiolina nitida Wahlgren, 1854 Ptiolina obscura (Fallén, 1814) SPANIA Meigen, 1830 Spania nigra Meigen, 1830 SYMPHOROMYIA Frauenfeld, 1867 sg. Paraphoromyia Becker, 1921 Symphoromyia crassicornis (Panzer, 1806) ATHERICIDAE Nowicki, 1873 ATHERIX Meigen, 1803 Atherix ibis (Fabricius, 1798) superfamily Tabanoidea Latreille, 1802 TABANIDAE Latreille, 1802 CHRYSOPSINAE Lutz, 1905 tribe Chrysopsini Lutz, 1905 CHRYSOPS Meigen, 1803 sg. Chrysops Meigen, 1803 Chrysops caecutiens (Linnaeus, 1758) Chrysops divaricatus Loew, 1858 Chrysops nigripes Zetterstedt, 1838 = lapponicus Loew, 1858 Chrysops relictus Meigen, 1820 = melanopleurus Wahlberg, 1848 Chrysops rufipes Meigen, 1820 Chrysops sepulcralis (Fabricius, 1794) Chrysops viduatus (Fabricius, 1794) = pictus Meigen, 1820 TABANINAE Latreille, 1802 tribe Haematopotini Enderlein, 1922 HAEMATOPOTA Meigen, 1803 Haematopota crassicornis Wahlberg, 1848 Haematopota italica Meigen, 1804 Haematopota pluvialis (Linnaeus, 1758) = italica misid. ? Haematopota subcylindrica Pandellé, 1883 see Notes HEPTATOMA Meigen, 1803 Heptatoma pellucens (Fabricius, 1776) tribe Tabanini Latreille, 1802 ATYLOTUS Osten Sacken, 1876 Atylotus fulvus (Meigen, 1820) Atylotus plebeius (Fallén, 1817) Atylotus rusticus (Linnaeus, 1767) Atylotus sublunaticornis (Zetterstedt, 1842) HYBOMITRA Enderlein, 1922 Hybomitra arpadi (Szilády, 1923) Hybomitra astuta (Osten Sacken, 1876) see Notes = polaris (Frey, 1915) Hybomitra auripila (Meigen, 1820) see Notes = aterrima (Meigen, 1820) Hybomitra bimaculata (Macquart, 1826) = tropica misid. ?= solstitialis (Meigen, 1820) see Notes Hybomitra borealis (Fabricius, 1781) = lapponicus (Wahlberg, 1848) Hybomitra ciureai (Séguy, 1937) = schineri Lyneborg, 1959 Hybomitra distinguenda (Verrall, 1909) Hybomitra kaurii Chvála & Lyneborg, 1970 = borealis misid. Hybomitra lundbecki Lyneborg, 1959 = fulvicornis misid. Hybomitra lurida (Fallén, 1817) Hybomitra montana (Meigen, 1820) Hybomitra muehlfeldi (Brauer, 1880) = flaviceps (Zetterstedt, 1842) Hybomitra nigricornis (Zetterstedt, 1842) Hybomitra nitidifrons (Szilády, 1914) = confinis misid. Hybomitra sexfasciata (Hine, 1923) = borealis anderi Kauri, 1951 Hybomitra tarandina (Linnaeus, 1758) Hybomitra tropica (Linnaeus, 1758) TABANUS Linnaeus, 1758 Tabanus autumnalis Linnaeus, 1761 Tabanus bovinus Linnaeus, 1758 Tabanus bromius Linnaeus, 1758 Tabanus cordiger Meigen, 1820 Tabanus maculicornis Zetterstedt, 1842 Tabanus sudeticus Zeller, 1842 Checklist part 2: Asilomorpha suborder Brachycera Macquart, 1834 clade Orthorrapha Brauer, 1863 superfamily Asiloidea Latreille, 1802 ASILIDAE Latreille, 1802 ASILINAE Latreille, 1802 ASILUS Linnaeus, 1758 Asilus crabroniformis Linnaeus, 1758 DIDYSMACHUS Lehr, 1996 Didysmachus picipes (Meigen, 1820) DYSMACHUS Loew, 1860 Dysmachus trigonus (Meigen, 1804) MACHIMUS Loew, 1849 Machimus setibarbis Loew, 1849 NEOITAMUS Osten Sacken, 1878 Neoitamus cothurnatus (Meigen, 1820) Neoitamus cyanurus (Loew, 1849) Neoitamus socius (Loew, 1871) NEOMOCHTHERUS Osten Sacken, 1878 Neomochtherus pallipes (Meigen, 1820) PAMPONERUS Loew, 1849 Pamponerus germanicus (Linnaeus, 1758) PHILONICUS Loew, 1849 Philonicus albiceps (Meigen, 1820) RHADIURGUS Loew, 1849 Rhadiurgus variabilis (Zetterstedt, 1838) TOLMERUS Loew, 1849 Tolmerus atricapillus (Fallén, 1814) Tolmerus pyragra (Zeller, 1840) LAPHRINAE Macquart, 1838 tribe Andrenosomatini Hull, 1962 ANDRENOSOMA Rondani, 1856 Andrenosoma albibarbe (Meigen, 1820) tribe Laphrini Macquart, 1838 CHOERADES Walker, 1851 Choerades fuliginosus (Panzer, 1798) Choerades gilvus (Linnaeus, 1758) Choerades igneus (Meigen, 1820) Choerades lapponicus (Zetterstedt, 1842) Choerades marginatus (Linnaeus, 1758) LAPHRIA Meigen, 1803 Laphria flava (Linnaeus, 1761) Laphria gibbosa (Linnaeus, 1758) LEPTOGASTRINAE Schiner, 1862 LEPTOGASTER Meigen, 1803 Leptogaster cylindrica (De Geer, 1776) Leptogaster guttiventris Zetterstedt, 1842 STENOPOGONINAE Hull, 1962 tribe Dioctriini Hendel, 1936 DIOCTRIA Meigen, 1803 Dioctria atricapilla Meigen, 1804 Dioctria cothurnata Meigen, 1820 Dioctria hyalipennis (Fabricius, 1794) Dioctria oelandica (Linnaeus, 1758) Dioctria rufipes (De Geer, 1776) tribe Stegopogonini Hull, 1962 CYRTOPOGON Loew, 1847 Cyrtopogon flavimanus (Meigen, 1820) Cyrtopogon lapponicus (Zetterstedt, 1838) Cyrtopogon lateralis (Fallén, 1814) Cyrtopogon luteicornis (Zetterstedt, 1842) = luteicornis var . pollinosus Frey, 1911 Cyrtopogon pulchripes Loew, 1871 tribe Stichopogonini Hardy, 1930 LASIOPOGON Loew, 1847 Lasiopogon cinctus (Fabricius, 1781) Lasiopogon septentrionalis Lehr, 1984 BOMBYLIIDAE Latreille, 1802 PHTHIRIINAE Becker, 1913 tribe Phthiriini Becker, 1913 PHTHIRIA Meigen, 1803 Phthiria pulicaria (Mikan, 1796) BOMBYLIINAE Latreille, 1802 tribe Bombyliini Latreille, 1802 BOMBYLIUS Linnaeus, 1758 sg. Bombylius Linnaeus, 1758 Bombylius discolor Mikan, 1796 Bombylius major Linnaeus, 1758 Bombylius minor Linnaeus, 1758 = allibarbis Zetterstedt, 1842 = albibarbis emend. SYSTOECHUS Loew, 1855 Systoechus ctenopterus (Mikan, 1796) = sulphureus (Mikan, 1796) Systoechus gradatus (Wiedemann, 1820) ANTHRACINAE Latreille, 1804 tribe Anthracini Latreille, 1804 ANTHRAX Scopoli, 1763 Anthrax anthrax (Schrank, 1781) Anthrax trifasciatus Meigen, 1804 = leucogaster Wiedemann, 1820 Anthrax varius Fabricius, 1794 tribe Exoprosopini Becker, 1913 EXOPROSOPA Macquart, 1840 Exoprosopa capucina (Fabricius, 1781) MICOMITRA Bowden, 1964 Micomitra stupida (Rossi, 1790) tribe Villini Hull, 1973 HEMIPENTHES Loew, 1869 Hemipenthes maura (Linnaeus, 1758) Hemipenthes morio (Linnaeus, 1758) THYRIDANTHRAX Osten Sacken, 1886 Thyridanthrax fenestratus (Fallén, 1814) VILLA Lioy, 1864 Villa cingulata (Meigen, 1804) ? Villa halteralis (Kowarz, 1883) see Notes Villa hottentotta (Linnaeus, 1758) Villa modesta (Meigen, 1820) Villa occulta (Wiedemann, 1820) MYTHICOMYIIDAE Melander, 1902 GLABELLULINAE Cockerell, 1914 GLABELLULA Bezzi, 1902 Glabellula arctica (Zetterstedt, 1838) SCENOPINIDAE Burmeister, 1835 SCENOPINUS Latreille, 1802 Scenopinus fenestralis (Linnaeus, 1758) Scenopinus niger (De Geer, 1776) Scenopinus sp. A see Notes = vitripennis misid. THEREVIDAE Newman, 1834 THEREVINAE Newman, 1834 ACROSATHE Irwin & Lyneborg, 1981 Acrosathe annulata (Fabricius, 1805) DIALINEURA Rondani, 1856 Dialineura anilis (Linnaeus, 1761) DICHOGLENA Irwin & Lyneborg, 1981 Dichoglena nigripennis (Ruthe, 1831) PANDIVIRILIA Irwin & Lyneborg, 1981 Pandivirilia eximia (Meigen, 1820) PSILOCEPHALA Zetterstedt, 1838 Psilocephala imberbis (Fallén, 1814) SPIRIVERPA Irwin & Lyneborg, 1981 Spiriverpa lunulata (Zetterstedt, 1838) = clausa (Frey, 1911) THEREVA Latreille, 1796 Thereva cinifera Meigen, 1830 = subfasciata Schummel, 1830 Thereva fuscinervis Zetterstedt, 1838 Thereva handlirschi Kröber, 1912 = praestans Collin, 1948 Thereva inornata Verrall, 1909 Thereva lanata Zetterstedt, 1838 Thereva microcephala Loew, 1847 Thereva nobilitata (Fabricius, 1775) Thereva plebeja (Linnaeus, 1758) Thereva strigata (Fabricius, 1794) Thereva unica (Harris, 1780) = bipunctata Meigen, 1820 Thereva valida Loew, 1847 = circumscripta auct. nec. Loew, 1847 Checklist part 3: families of uncertain position ( incertae sedis ) suborder Brachycera Macquart, 1834 clade Orthorrapha Brauer, 1863 ? superfamily Nemestrinoidea Griffith & Pidgeon, 1832 ACROCERIDAE Leach, 1815 ACROCERA Meigen, 1803 = Paracrocera Mik, 1886 sg. Acrocera Meigen, 1803 Acrocera orbiculus (Fabricius, 1787) = globulus (Panzer, 1804) = borealis Zetterstedt, 1838 OGCODES Latreille, 1796 sg. Ogcodes Latreille, 1796 Ogcodes borealis Cole, 1919 see Notes Ogcodes gibbosus (Linnaeus, 1758) Ogcodes nigripes (Zetterstedt, 1838) see Notes Ogcodes pallipes Latreille in Olivier, 1812 Excluded species Anastoechus nitidulus (Fabricius, 1794) labeling mistake Beris geniculata Curtis, 1830 misidentified Cliorismia ardea (Fabricius, 1794) not found within present borders Cliorismia rustica (Panzer, 1804) not found within present borders Choerades fimbriata (Meigen, 1820) mistake Choerades ursulus (Loew, 1851) misidentified see Notes Chrysopilus splendidus (Meigen, 1820) mistake Cyrtopogon maculipennis (Macquart, 1834) labeling mistake Epitriptus arthriticus (Zeller, 1840) mistake Machimus gonatistes (Zeller, 1840) not found within present borders Odontomyia hydroleon (Linnaeus, 1758) not found within present borders Pandivirilia nigroanalis (Kröber, 1928) misidentified Phthiria canescens Loew, 1846 not found within present borders Tabanus miki Brauer, 1880 misidentified Tolmerus cingulatus (Fabricius, 1781) mistake Villa fasciata (Meigen, 1804) not found within present borders = circumdata (Meigen, 1820) = venusta (Meigen, 1820) Villa longicornis Lyneborg, 1965 not found within present borders Villa panisca (Rossi, 1790) not found within present borders = circumdata auct. nec. (Meigen, 1820) Xylophagus matsumurae Miyatake, 1965 misidentified Notes Choerades ursulus (Loew, 1851) is a poorly known taxon. It was synonymized with Choerades fuliginosus by Lehr (1991) but later considered valid by Bosák and Hradský (2001) . Kahanpää and Winqvist (2005) accepted it as a Finnish species but upon re-examination we consider it most likely that the single Finnish specimen previously identified as Choerades ursulus is a dark male of Choerades fuliginosus . Chrysopilus suomianus (Szilády, 1934) . The type locality of this species is Enontekiö, Finland ( Szilády 1934 ). Unfortunately the type material seems lost and the name is probably best treated as a nomen dubium . Based on Szilády's original description it may be a dark form of Chrysopilus nubecula . Hybomitra astuta (Osten Sacken, 1876) . Kahanpää and Winqvist (2005) could not locate any material in Finnish collections. Several new records of this species have since been made and its presence in Finland is now confirmed. Hybomitra auripila (Meigen, 1820) . The synonymy of Hybomitra auripila (Meigen, 1820) with Hybomitra aterrima (Meigen, 1820) was established by Schacht (1994) and is accepted here. Schiner (1862) already mentioned Hybomitra aterrima as synonym to Hybomitra auripila . Since we consider him to be the first revisor, the name Hybomitra auripila is valid under the current Code. Hybomitra solstitialis (Meigen, 1820) has long been known to be a problematic taxon. It is separated from Hybomitra bimaculata (Macquart, 1826) based on color characters alone. The examined Finnish material includes a range of intermediates between typical Hybomitra bimaculata and Hybomitra solstitialis forms. It seems likely that the two names are synonymous, but types should be consulted before synonymy is formally published. Haematopota subcylindrica Pandellé, 1883 . First recorded from Finland by Vuorimies (1984) . Unfortunately the specimens listed in his paper could not be found and their identification remains somewhat doubtful. Ogcodes borealis Cole, 1919 . A single Finnish specimen collected in the mid-19 th century is the sole Palearctic record of this species. Originally identified and published by Hackman (1970) , the record was later confirmed by Kahanpää and Winqvist (2005) . Ogcodes borealis Cole sensu Schlinger (1960) may be a species complex. Ogcodes nigripes (Zetterstedt, 1838) is probably a senior synonym of Ogcodes zonatus Erichson, 1840. Ptiolina nigrina Wahlgren, 1854 may be a synonym of Ptiolina nigra Zetterstedt, 1842. Scenopinus sp. A is an apparently undescribed species near Scenopinus fenestralis with black femora. It occurs widely in Finland in association with bird nests. Villa halteralis (Kowarz, 1883) . See Kahanpää and Winqvist (2005) for a discussion of the single supposed Finnish record of this species. Xylophagus ater Meigen, 1804 . This name has widely been used for two species. Old Finnish checklists ( Frey et al. 1941 , Hackman 1980 ) followed the model also used in the world checklist Woodley (2011c) and used this name for the species also known as Xylophagus kowarzi (Pleske, 1925). On the British Isles the name Xylophagus ater is used as a senior name for Xylophagus compeditus Wiedemann in Meigen, 1820. According to Alexander and Clements (1991) and Chandler (1998a , b ) the British usage is correct and it is followed here. Thus, Xylophagus ater is the common species with females easily identified by the three stripes of dusting on the mesonotum. Xylophagus inermis Krivosheina & Krivosheina, 2000 was described as a subspecies of Xylophagus matsumurae Miyatake, 1965 = maculatus Matsumura, 1916 (preoccupied by Xylophagus maculatus Meigen, 1804) ( Krivosheina and Krivosheina 2000 ). It was raised to a full species status in the recent world catalogue ( Woodley 2011c ). All collected Finnish specimens formerly identified as Xylophagus matsumurae were examined and they belong to Xylophagus inermis . Zabrachia tenella (Jaennicke, 1866) . First recorded from Finland by Krivosheina and Rozkošný (1990) . We have examined the Finnish Zabrachia material and confirmed the presence of both Zabrachia tenella and Zabrachia minutissima in the country.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4903938/

Use of Nanoparticles to Deliver Immunomodulatory Oligonucleotides

Synthetic oligonucleotides (ODN) containing unmethylated 'CpG motifs' stimulate the innate immune system to produce cytokines, chemokines and polyreactive antibodies. CpG ODN have shown promise as vaccine adjuvants and for the treatment of infectious diseases and cancer. The immunostimulatory activity of CpG ODN is inhibited by DNA containing "suppressive" motifs. ODN expressing suppressive motifs (Sup ODN) reduce ongoing immune reactions and show promise in the treatment of autoimmune and inflammatory diseases. This work reviews recent progress in the use of nanoparticles as carriers of CpG and Sup ODN to target their delivery to the GI tract and lungs.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3388845/

Targeted cytotoxic therapy: adapting a rapidly progressing anti-cancer paradigm for depletion of persistent HIV-infected cell reservoirs

Purpose of review HIV infected cells persisting in the face of highly active antiretroviral therapy (HAART) are arguably the greatest hurdle to eradication of the virus from the body. Complementary strategies aimed at selective killing of infected cells are described. Recent findings Pioneered by research in the cancer field, various approaches are under development for selective killing of HIV-infected cells. These include targeted cytotoxic proteins, adoptive cell therapy, cytocidal virotherapy, and targeted non-biological drug carriers. Summary These developmental efforts may provide a critical complement to antiretroviral therapy in efforts to achieve HIV eradication, or a "functional cure" whereby therapy can be stopped without viral rebound. Purpose of review HIV infected cells persisting in the face of highly active antiretroviral therapy (HAART) are arguably the greatest hurdle to eradication of the virus from the body. Complementary strategies aimed at selective killing of infected cells are described. Recent findings Pioneered by research in the cancer field, various approaches are under development for selective killing of HIV-infected cells. These include targeted cytotoxic proteins, adoptive cell therapy, cytocidal virotherapy, and targeted non-biological drug carriers. Summary These developmental efforts may provide a critical complement to antiretroviral therapy in efforts to achieve HIV eradication, or a "functional cure" whereby therapy can be stopped without viral rebound.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7150309/

Bioterrorism and Biodefense

Key Concepts • Bioterrorism continues to pose a global threat due to ongoing geopolitical conflicts. • Early recognition of bioterrorism is critical to preserving individual and public health. Agents of bioterrorism concern are prioritized according to their potential to cause high mortality and major impact on public health (category A); to be associated with moderate morbidity (category B); or to represent emerging threats and future concerns (category C). • Clinical syndromes caused by agents of bioterrorism must be differentiated from those due to other, naturally occurring infectious diseases. • Biodefense represents the range of public health responses that can prevent or mitigate the effects of bioterrorism and of outbreaks of naturally occurring, emerging infectious diseases. Introduction Bioterrorism, the deliberate use of microbial agents or their toxins as weapons against noncombatants outside the setting of armed conflict is conceptually analogous to biologic warfare in a combat theater. 'Biodefense' represents the range of responses, including surveillance, diagnostic, therapeutic and preventive measures employed to mitigate the impact of not only bioterrorism threat agents but of outbreaks of naturally occurring, emerging infectious diseases as well. Since the multifocal anthrax attacks that followed the catastrophic events on September 11, 2001 in the USA, ongoing, geopolitical turmoil and escalating conflicts around the world have ensured that bioterrorism will remain a persistent global concern. Biologic weapons have been used against both military and civilian targets throughout history. Although the development or use of biologic weapons was banned by an international Convention in 1972, 1 multiple signatories, including the former Soviet Union and Iraq, violated the terms and spirit of the agreement. The accidental release of aerosolized anthrax spores from a military plant in Sverdlovsk in 1979, resulting in at least 68 human deaths from inhalational anthrax, verified the existence of an active Soviet offensive biologic weapons program. Threat Assessment Biologic agents are considered weapons of mass destruction (WMD) because their use may result in large-scale morbidity and mortality. In a World Health Organization-sponsored model of the hypothetical casualty estimates from the intentional release of 50 g of aerosolized anthrax spores upwind from a population center of 500 000 (analogous to a medium-sized metropolitan area), nearly 200 000 people might be killed or incapacitated by the event. 2 Biologic weapons possess unique properties among all WMD. Unlike other weapons, most biologic agents are associated with a clinical latency period of days to weeks, during which time exposed individuals are asymptomatic, making early detection difficult. Additionally, specific antimicrobial therapy and/or vaccines are available for the treatment and prevention, respectively, of illness caused by biologic weapons; casualties from other forms of WMD can generally only be treated by decontamination, trauma mitigation, and supportive care. Due to heightened global tensions, bioterrorism is a credible threat and a potential tool for political coercion. Several events over the past three decades signal a shift in terrorism trends: the intentional contamination of restaurant salad bars with Salmonella by a religious cult trying to influence a local election in The Dalles, Oregon in 1984; 3 the revelations that Aum Shinrikyo, the Japanese cult responsible for the sarin gas attack in the Tokyo subway system in 1995 experimented on multiple occasions with aerosolizing anthrax from downtown Tokyo rooftops; the findings of massive quantities of weaponized biologic agents in Iraq following the first Gulf War; 4 and the domestic anthrax attacks in the USA in 2001. The aims of bioterrorism are similar to those of other forms of terrorism: to cause morbidity and mortality among civilian populations, disruption of societal fabric, and exhaustion or diversion of resources. 5 Terrorist goals may be achieved without furthering all of these aims but simply by a perceived credible threat of action or by a small-scale agent deployment. The anthrax attacks in 2001 evoked fear and anxiety and diverted public health and healthcare resources away from other critical activities despite the limited number of casualties associated with the event. Thus, agents of bioterrorism may be viewed as 'weapons of mass terror'. Biologic weapons offer other, significant advantages to terrorists: • they are relatively inexpensive to acquire as compared with conventional or nuclear weaponry; • they can be deployed in a stealth fashion due to a variable clinical latency period, thus allowing the perpetrator opportunity to escape if desired; • person-to-person transmission may amplify their effective range; and • they evoke anxiety and panic in a population that is, in some instances, out of proportion to their physical effects. The technology for bioterrorism is 'dual use', i.e. it can serve legitimate functions such as vaccine or pharmaceutical production as readily as biologic weapons production, thus affording credible cover for rogue nations. For large-scale bioterrorism, biologic agents must undergo complex processes of production, cultivation, chemical modification and weaponization. Therefore, state sponsorship or direct support from organizations with significant resources and infrastructure would predictably be required to incite such events. 5 However, some threat agents may be acquired by terrorist groups on the black market. 6 Additionally, the anthrax attacks in the USA in late 2001 illustrated the devastating results that can be achieved with relatively primitive delivery methods, e.g. high-speed mail-sorting equipment and mailed letters. Numerous attributes contribute to the effectiveness of a biologic weapon: • availability or ease of large-scale production; • ease of dissemination, especially by the aerosol route; • stability in storage and delivery; • transmission characteristics; and • clinical virulence. The last refers to the reliability with which the pathogen causes mortality, morbidity or social disruption. The Centers for Disease Control and Prevention (CDC) have prioritized biologic agent threats based upon the aforementioned characteristics, 7 , 8 thus influencing current preparedness strategies ( Table 75-1 ). Category A agents, the highest priority, are associated with high mortality and the greatest potential for major impact on public health. Category B agents are 'incapacitating' because of their potential for moderate morbidity but relatively low mortality. Most category A and B agents have been experimentally weaponized in the past. Category C agents include emerging threats and pathogens that are potentially effective weapons. With the burgeoning fields of molecular biology and genomics, future risk scenarios may have to contend with genetically altered, designer pathogens that may be equipped with enhanced virulence, such as antimicrobial resistance or augmented toxin production, or modifications that enhance dissemination, such as prolonged aerosol stability (see Table 75-1 ). TABLE 75-1 Agents of Concern for Use in Bioterrorism Highest Priority: Category A (Based Upon Potential Mortality, Morbidity, Virulence, Transmissibility, Aerosol Feasibility and Psychosocial Implications of an Attack) Microbe/Toxin Disease Bacillus anthracis Anthrax: inhalational, cutaneous Variola virus Smallpox and its variants Yersinia pestis Plague: pneumonic, bubonic, septicemic Clostridium botulinum toxin Botulism Francisella tularensis Tularemia: pneumonic, typhoidal Viral hemorrhagic fevers Filoviruses Ebola, Marburg Arenaviruses Lassa fever, South American hemorrhagic fevers Bunyaviruses Rift Valley fever, Crimean-Congo hemorrhagic fever Flaviviruses Dengue Moderately High Priority: Category B (Based Upon Potential Morbidity, Aerosol Feasibility, Dissemination Characteristics and Diagnostic Difficulty) Microbe/Toxin Disease Coxiella burnetii Q fever Brucella spp. Brucellosis Burkholderia mallei Glanders Burkholderia pseudomallei Melioidosis Alphaviruses (e.g. EEE, VEE) Viral encephalitides Ricinus communis toxin Ricin intoxication Staphylococcal enterotoxin B Staphylococcal toxin illness Salmonella spp., Shigella dysenteriae , Escherichia coli O157:H7, Vibrio cholerae , Cryptosporidium parvum , Listeria monocytogenes , Campylobacter jejuni , Yersinia enterocolitica Food- and water-borne gastroenteritis Rickettsia prowazekii Epidemic typhus Chlamydia psittaci Psittacosis Epsilon toxin of Clostridium perfringens C. perfringens intoxication Emerging Threat Agents: Category C (Based Upon Potential For Production And Dissemination, Availability, Morbidity/Mortality) Microbe/Toxin Disease Hantaviruses Viral hemorrhagic fevers Flaviviruses Yellow fever, West Nile virus Mycobacterium tuberculosis Multidrug-resistant tuberculosis Nipah virus Systemic flu-like illness Miscellaneous: (Other Examples of Candidate Threat Agents that Possess some Elements of Bioterrorism Concern) Genetically engineered vaccine- and/or antimicrobial-resistant category A or B agents HIV-1 Adenoviruses Influenza Rotaviruses Molecular hybrid pathogens (e.g. smallpox–plague, smallpox–ebola) Severe acute respiratory syndrome coronavirus EEE, eastern equine encephalomyelitis; VEE, Venezuelan equine encephalomyelitis. Adapted from Patrozou E., Artenstein A.: Bioterrorism . In: Schlossberg D., ed. Clinical infectious diseases , 3rd ed. New York: Cambridge University Press; 2008:865-877. Bioterrorism Recognition Bioterrorism is insidious; with the absence of advance warning or specific intelligence information, clinical illness will be manifest before the circumstances of a release event are known. Affected individuals will therefore initially be seen in healthcare settings, in contrast to scenarios involving conventional weaponry or a natural disaster in which police, firefighters, paramedics and other emergency services personnel are first responders. Physicians and other healthcare workers must therefore maintain a high index of suspicion for suggestive epidemiologic clues and clinical features to enhance early recognition, management and communication of information to minimize the deleterious effects of bioterrorism on individual patients and on the public health. Early recognition is hampered for several reasons: • Potential targets of terrorists are widespread and somewhat unpredictable. • Immediate recognition of a common source outbreak from a bioterrorist event might be missed secondary to a clinical latency period following exposure and casualties are likely to present for medical attention in diverse locations and at varying times. 9 This illustrates the critical importance of surveillance, data sharing and real-time communication. • Initial symptoms of bioterrorism-associated diseases may be nonspecific. In the absence of a known exposure, many mildly symptomatic individuals may either not seek medical attention or may be misdiagnosed with a nonspecific, 'flu-like' illness. However, once beyond the early stages, many of these illnesses progress rapidly and treatment may be less effective. • Most of the diseases caused by agents of bioterrorism are rarely, if ever, seen in clinical practice. Therefore, physicians are likely to be inexperienced with their clinical characteristics. • By definition, agents of bioterrorism have been laboratory-manipulated and may therefore not demonstrate the classic clinical features of naturally occurring infection. This was illustrated by differences in the clinical manifestations of inhalational anthrax in the USA in October 2001 as compared with historical accounts of naturally occurring disease. 10 Early identification of bioterrorism may be facilitated by the recognition of certain epidemiologic and clinical clues: • Clustering of patients with common clinical syndromes, especially unusual or known to be associated with bioterrorism agents, should prompt notification of public health authorities. • The recognition of a single case of a rare or non-endemic infection in the absence of a travel history or other potential natural exposure. • Unusual epidemiologic patterns of disease, such as atypical age distributions, unexpected clinical severity, or concurrent illness in human and animal populations. For some agents of bioterrorism and several naturally occurring, emerging infectious diseases, evidence supports the potential role of animals as early warning sentinels of an attack or as markers of persistent exposure risks to humans. 11 Infectious diseases specialists are uniquely suited to play pivotal roles in the recognition, investigation, and mitigation of bioterrorism, based on: • an understanding of epidemiologic principles and risk assessment; • expertise in specific threat agents, their clinical presentations and diagnostic approaches; • knowledge of communicability and infection control principles; and • an understanding of the tenets of treatment and prophylaxis of infectious diseases. Threat Agents This section will describe the highest priority, category A agents. Extensive descriptions of specific pathogens can be found in related chapters in this text (cross-referenced in Table 75-2 ) and in other sources. 12 , 13 Clinical incubation periods, transmission characteristics and infection control procedures for agents of bioterrorism are provided in Table 75-2 . Syndromic differential diagnoses for select, common clinical presentations are detailed in Table 75-3 . TABLE 75-2 Epidemiologic Characteristics for Selected Category A and B Bioterrorism-Associated Diseases Disease Incubation Period Range (Days) Person-to-Person Transmission Infection Control Precautions For Patients Case Fatality Rate Inhalational anthrax (see Chapter 134) 2–43 * No Standard Untreated 100% Treated 45% Cutaneous anthrax (see Chapter 134) 1–12 No Standard Untreated 20% Treated <1% Botulism (see Chapter 22) 12–72 hours No Standard 6% Primary pneumonic plague (see Chapter 126) 1–6 Yes Droplet Untreated 100% Treated ~50% Bubonic plague (see Chapter 126) 2–8 No Standard Untreated 60% Treated <5% Smallpox 7–19 Yes Contact and airborne Unvaccinated 30% Vaccinated 3% Tularemia pneumonia (see Chapter 127) 1–21 No Standard Untreated 60% Treated <4% Viral hemorrhagic fevers (see Chapter 132) 2–21 Yes Contact and airborne Marburg 25% Ebola 80% Other forms 2–30% Viral encephalitides (see Chapter 20) 1–14 No Standard 10–35% Q fever (see Chapter 187) 2–41 No Standard 3% Brucellosis (see Chapter 129) 5–60 No Standard Untreated 5% Glanders 1–21 Yes Contact and droplet Untreated – approaches 100% Treated – low * Based on limited data from human outbreaks; experimental animal data support clinical latency periods of up to 100 days. Adapted from Patrozou E., Artenstein A.: Bioterrorism . In: Schlossberg D., ed. Clinical infectious diseases , 3rd ed. New York: Cambridge University Press; 2008:865-877. TABLE 75-3 Syndromic Differential Diagnoses and Clinical Clues for Category A Agents of Bioterrorism Syndrome Clinical Presentation Differential Diagnosis Bioterrorism-Associated Disease Disease-Specific Clues Influenza-like illness Nonspecific respiratory symptoms: malaise, myalgias, nausea, emesis, dyspnea, cough with or without chest discomfort, without coryza or rhinorrhea, leading to abrupt onset of respiratory distress, with or without shock, mental status changes, with chest radiograph abnormalities (wide mediastinum or infiltrates or pleural effusions) Influenza, community-acquired bacterial pneumonia, viral pneumonia, Legionella , Q fever, psittacosis, Mycoplasma , Pneumocystis pneumonia, tularemia, dissecting aortic aneurysm, bacterial mediastinitis, SVC syndrome, Nipah virus Inhalational anthrax Abdominal pain, headache, mental status abnormalities, hypoxemia Mediastinal adenopathy: ~90% ( Figure 75-2 ) Hemorrhagic pleural effusions: ≈70% Meningoencephalitis: possibly ≈50% Blood cultures positive in untreated patients Skin lesion(s) Pruritic, painless papule on exposed areas leading to vesicle(s), ulcer, then edematous black eschar, with or without massive local edema and regional adenopathy and fever, evolving over 3–7 days Recluse spider bite, staphylococcal lesion, atypical Lyme disease, orf, glanders, tularemia, plague, rat-bite fever, ecthyma gangrenosum, rickettsialpox, cutaneous diphtheria Cutaneous anthrax Painless; spider bite is a painful lesion Nonpitting local edema ( Figure 75-1 ) If untreated, may become systemic Blood cultures, skin biopsy positive Fulminant pneumonia Abrupt onset, rapidly progressive respiratory illness with cough, fever, rigors, headache, sore throat, myalgias, dyspnea, pleuritic chest pain, GI symptoms, lung consolidation, with or without hemoptysis, shock; variable progression to respiratory failure Severe community-acquired bacterial or viral pneumonia, inhalational anthrax, pulmonary infarct or hemorrhage, influenza, Mycoplasma pneumonia, Legionella , Q fever, SARS, tuberculosis, melioidosis Pneumonic plague Lobar or multilobar involvement, with or without buboes Hemoptysis is common with characteristic sputum Gram stain Pulmonary tularemia Cough generally nonproductive Pulse–temperature dissociation in 40% Sepsis with bleeding diathesis and capillary leak Sepsis syndrome, GI symptoms, mucosal hemorrhage, altered vascular permeability, DIC, purpura, acral gangrene, hepatitis, hypotension, with or without CNS findings, multiorgan system failure Meningococcemia; toxic shock syndromes; leptospirosis; typhoid fever; borreliosis; typhoidal tularemia; overwhelming postsplenectomy sepsis; Rocky Mountain spotted fever; hemolytic uremic syndrome; TTP; SLE; hemorrhagic smallpox Septicemic plague DIC occurs in minority of aerosol exposures Cutaneous findings as late sequelae, with or without buboes High-grade bacteremia Viral hemorrhagic fever Maculopapular rash in Ebola, Marburg Variable presenting signs depending on specific VHF type Febrile prodrome with generalized exanthem Fever, malaise, prostration, headache, myalgias and enanthema followed by development of synchronous, progressive, centrifugal papular/vesicular/pustular rash with or without hemorrhagic component, with systemic toxicity Varicella, drug eruption, Stevens–Johnson syndrome, measles, secondary syphilis, erythema multiforme, disseminated herpes zoster or simplex, meningococcemia, monkeypox, insect bites Smallpox Palms and soles involved Lesions are firm and almost nodular Secondary bacterial infection common Hemorrhagic variant in pregnant and immunocompromised Progressive weakness Acute onset of afebrile, symmetric, descending flaccid paralysis, dilated pupils, diplopia or blurred vision, dysphagia, dysarthria, ptosis, dry mucous membranes, clear sensorium, no sensory changes Myasthenia gravis, brain stem CVA, polio, Guillain–Barré syndrome variant, tick paralysis, chemical intoxication Botulism Few GI symptoms in aerosol attacks Low-dose inhalation exposure – delayed Dx Anticholinergic effects CVA, cerebrovascular accident; DIC, disseminated intravascular coagulation; GI, gastrointestinal; SLE, systemic lupus erythematosus; SVC syndrome, superior vena cava syndrome; TTP, thrombotic thrombocytopenic purpura; VHF, viral hemorrhagic fever. Anthrax Anthrax results from infection with Bacillus anthracis , a gram-positive, spore-forming, rod-shaped organism that exists in its host as a vegetative bacillus and in the environment as a spore. Details of the microbiology and pathogenesis of anthrax are found in Chapter 134. In nature anthrax is a zoonotic disease of herbivores that is prevalent in many geographic regions; sporadic human disease results from environmental or occupational contact with endospore-contaminated animal products. 14 Anthrax is uncommon in higher-income countries. In low- and middle-income countries (LMIC) the cutaneous form of anthrax is the most common presentation; gastrointestinal and inhalational forms are exceedingly rare in naturally acquired disease. Recently, a novel, soft-tissue form of infection was described in injection drug users in Europe. 15 Cutaneous anthrax is rarely seen in current-day industrialized countries due to importation restrictions. The last known case of naturally occurring inhalational anthrax in the USA occurred in 1976. 16 The 2001 anthrax attacks in the USA were on a relatively small scale, and nearly 40% of the confirmed cases were of the cutaneous variety. 17 The serious events following the outbreak were related to inhalational disease. Therefore, planning for larger-scale events with aerosolized anthrax is warranted. The differential diagnoses of cutaneous and inhalational anthrax are described in Table 75-3 . The lesion of cutaneous anthrax may be similar in appearance to other lesions, including cutaneous forms of other agents of bioterrorism; however, it may be distinguished by epidemiologic as well as certain clinical features. Anthrax is traditionally a painless lesion, unless secondarily infected, and it is associated with significant local edema ( Figure 75-1 ). The bite of Loxosceles reclusa , the brown recluse spider, shares many of the local and systemic features of anthrax but is typically painful from the outset and lacks significant edema. 18 Cutaneous anthrax may be associated with systemic disease and its attendant mortality in up to 20% of cases if untreated; with appropriate therapy, mortality is <1%. 16 Figure 75-1 Lesion of cutaneous anthrax. (©Diepgen T.L., Yihune G., et al . Dermatology Online Atlas ( http://www.dermis.net ). Reprinted with permission.) Once the inhaled endospores reach the alveoli, they are phagocytosed by macrophages and transported to regional lymph nodes, where they germinate into vegetative bacteria and, subsequently, disseminate hematogenously. 14 The bacteria generate potent exotoxins, lethal toxin and edema toxin, which lead to hemorrhagic mediastinitis, systemic illness and death. Spores may remain latent for extended periods of time in the host, up to 100 days in some experimental animal models, 17 resulting in prolonged clinical incubation periods following exposure to endospores. Cases of inhalational anthrax occurred up to 43 days after exposure in the Sverdlovsk experience, although the average incubation period is 2–10 days, perhaps influenced by inoculum. 15 Although the clinical experience derived from the 2001 USA attacks had much in common with the clinical manifestations of inhalational anthrax noted in the Sverdlovsk cases, some novel findings emerged. Of 11 confirmed cases of inhalational anthrax, 5 (45%) died. Although this contrasts with a case fatality rate of greater than 85% reported from Sverdlovsk, the reliability of reported data from the latter outbreak is questionable 17 and, perhaps more importantly, patients in the 2001 outbreak were more likely to receive appropriate treatment at an earlier stage. Patients with inhalational anthrax almost uniformly seek medical attention an average of 3.3 days after symptom onset with fevers, chills, malaise, myalgias, nonproductive cough, chest discomfort, dyspnea, nausea or vomiting, tachycardia, peripheral neutrophilia and liver enzyme elevations. 11 , 19 Many of these findings are nondiagnostic and overlap considerably with those of influenza or other common viral respiratory tract infections. Data suggest that discrimination between inhalational anthrax and benign, influenza-like illnesses may be possible on the basis of initial symptoms: shortness of breath, nausea, and vomiting are significantly more common in anthrax, while rhinorrhea is uncommonly seen in anthrax but noted in the majority of community-acquired viral respiratory infections. 20 Other common clinical manifestations of inhalational anthrax include abdominal pain, headache, mental status abnormalities and hypoxemia. Abnormalities on chest radiography appear to be universally present, although these may only be identified retrospectively in some cases. Pleural effusions are the most common abnormality; infiltrates, consolidation and/or mediastinal adenopathy/widening are noted in the majority of cases ( Figure 75-2a ). Mediastinal adenopathy appears to be an early indicator of disease; CT scan is more sensitive than chest radiographs for this finding ( Figure 75-2b ). In the 2001 outbreak, more than 80% of cases were noted to have mediastinal widening with or without pleural effusions or infiltrates. Figure 75-2 (a) Chest X-ray, inhalational anthrax, United States, 2001 demonstrating mediastinal widening (arrows). (b) Chest CT scan demonstrating mediastinal widening (arrows) and bilateral pleural effusions. (From Jernigan J., Stephens D.S., Ashford D.A., et al.: Bioterrorism-related inhalational anthrax: The first 10 cases reported in the United States. Emerg Infect Dis 2001; 7:933-944.) The clinical manifestations generally evolve to a fulminant septic picture with progressive respiratory failure. B. anthracis is routinely isolated in blood cultures if obtained prior to the initiation of antimicrobials ( Figure 75-3 ). Pleural fluid is typically hemorrhagic; the bacteria can either be isolated in culture or documented by antigen-specific immunohistochemical stains of this material ( Figure 75-4 ) in most patients. 11 The average time from hospitalization until death was 3 days (range 1–5 days). Autopsy typically reveals hemorrhagic mediastinal lymphadenitis and disseminated metastatic infection. Pathology data from the Sverdlovsk outbreak confirm meningeal involvement, typically hemorrhagic meningitis, in 50%; 21 meningoencephalitis was the presenting diagnosis ( Figure 75-5 ) in the index case in the USA from 2001. 22 Figure 75-3 Bacillus anthracis . (a) Bacillus anthracis appearing as Gram-positive bacilli. (b) The typical 'jointed bamboo-rod' appearance of the organism from blood cultures. (Courtesy of CDC and Dr William A. Clark.) Figure 75-4 Pleural fluid cell block immunohistochemical stain demonstrating Bacillus anthracis antigen (red) within a mononuclear inflammatory cell infiltrate. (From Jernigan J., Stephens D.S., Ashford D.A., et al.: Bioterrorism-related inhalational anthrax: The first 10 cases reported in the United States. Emerg Infect Dis 2001; 7:933-944.) Figure 75-5 Cerebrospinal fluid Gram stain from anthrax index case, United States, 2001, demonstrating numerous gram-positive rods and neutrophils. (From Jernigan J., Stephens D.S., Ashford D.A., et al.: Bioterrorism-related inhalational anthrax: The first 10 cases reported in the United States. Emerg Infect Dis 2001; 7:933-944.) The diagnosis of inhalational anthrax consists of a compatible clinical presentation in the context of a known exposure, a possible exposure, or epidemiologic factors suggesting bioterrorism, e.g. clustered cases of a rapidly progressive, systemic illness. The diagnosis should also be considered in a single individual with a consistent or suggestive clinical illness in the absence of another etiology. Table 75-3 delineates a detailed differential diagnosis of anthrax. The early recognition and treatment of inhalational anthrax appear to be associated with a survival advantage; 11 in the USA experience, patients who received appropriate antimicrobials within 4.7 days of symptom onset had a mortality rate of 40% as compared with a mortality rate of 75% for those treated after that period. 23 Therefore, prompt, empiric antimicrobial therapy should be initiated if infection is clinically suspected. Combination parenteral therapy is appropriate in the ill individual for a number of reasons: 11 • to cover the possibility of antimicrobial resistance; • to target specific bacterial virulence properties, e.g. the theoretical effect of clindamycin on toxin production; • to optimize adequate drug penetration into the central nervous system; and • to favorably impact survival. In order to optimize the outcome in inhalational anthrax, novel therapies, such as toxin inhibitors or receptor antagonists, are in development with effective antimicrobial agents, optimal hemodynamic and ventilatory support, and pleural fluid drainage. 23 , 24 A variety of such strategies, guided by the pathogenesis of the organism and its disease-producing toxins, has shown promise in animal studies and will likely be components of effective therapeutic regimens in the future. 25 , 26 Detailed therapeutic and postexposure prophylaxis recommendations for adults, children and special groups have been recently reviewed elsewhere. 17 , 24 , 27 Anthrax vaccine adsorbed (AVA), the current product in use for select indications, is effective in preventing cutaneous anthrax in human clinical trials and in preventing inhalational disease after aerosol challenge in nonhuman primates. 28 The vaccine has generally been found to be safe but requires multiple initial doses over 18 months with the need for frequent boosting. Second-generation anthrax vaccines employing recombinant protective antigen are in clinical trials and several experimental products containing spore and capsule antigens are in development. A fully humanized monoclonal antibody, raxibacumab, has been approved for the treatment and prevention of inhalational anthrax. 26 Smallpox The last known naturally acquired case of smallpox occurred in Somalia in 1977; in 1980, as the culmination of a 12-year, intensive campaign by the WHO, smallpox became the first and only disease to be eradicated as a scourge of humans. 29 However, because of concerns that variola virus stocks may have either been removed from or sequestered outside of their WHO-designated repositories, smallpox is considered to be a potential agent of bioterrorism. Smallpox could be a devastatingly effective weapon as its re-introduction into human populations would be a global public health catastrophe. It is stable in aerosol form with a low infective dose; case fatality rates approach 30%; secondary attack rates among unvaccinated close contacts are 37–88% and are amplified, especially in healthcare settings; and much of the world's population is susceptible. Routine civilian vaccination was terminated more than two decades ago and vaccine-induced immunity may wane over time to some extent in vaccinees. 30 Although a second-generation smallpox vaccine has been approved for use, it is currently not routinely recommended. There are no known antiviral therapies of proven clinical effectiveness against this pathogen. Following an average incubation period of 10–12 days (range 7–19 days), patients experience the acute onset of a 2- to 3-day prostrating prodrome consisting of fever, rigors, malaise, vomiting, headache and backache. They subsequently develop a centrifugally distributed eruption that initially involves the face and extremities and then generalizes as it evolves through macular, papular, vesicular, and pustular stages in synchronous (i.e. lesions progress concurrently and have similar appearances diffusely) fashion over approximately 8 days, with umbilication in the latter stages ( Figure 75-6 ). An oropharyngeal enanthem typically precedes the exanthem by 1 or 2 days; this is indicative of high titer viral replication in the upper respiratory tract and correlates with high infectivity. The rash generally remains denser peripherally and typically involves the palms and soles in its early stages, a potentially useful clue in narrowing the differential diagnosis ( Figure 75-7 ). The umbilicated pustules begin crusting during the second week of the eruption. Separation of scabs is usually complete by the end of the third week, but the course of the systemic illness may be attenuated and the appearance of the exanthem milder in those with partial, pre-existing immunity or more progressive and virulent in those with immunodeficient states. Figure 75-6 Smallpox. (a) Third day of rash in smallpox. Additional lesions continue to appear and some of the papules are becoming obviously vesicular. (b) Fifth day of rash in smallpox. Almost all the papules have now become vesicular or pustular, the truly 'vesicular' stage usually being very brief. Some of the lesions on the upper arm show early umbilication. (c) Eighth day of rash in smallpox. This case is now clearly classified as discrete ordinary-type smallpox. In the confluent subtype of ordinary-type smallpox the lesions would have been confluent on the face and forearms: in the semiconfluent subtype they would have been confluent on the face but not on the forearms. (d) Twentieth day of rash in smallpox. The scabs have separated except on the palms of the hands and the soles of the feet, leaving depigmented areas. (From Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., et al.: Smallpox and its eradication, Geneva, World Health Organization, 1988.) Figure 75-7 (a) Typical centrifugal distribution of the rash in smallpox. (b) Patient with smallpox, Kosovo, Yugoslavia epidemic, March and April 1972. The scabs will eventually fall off leaving marks on the skin that will become pitted scars. The infection is transmissible until all scabs have fallen off. ((a) Courtesy of CDC and Dr Paul B. Dean; (b) Courtesy of CDC and Dr William Foege.) The differential diagnosis of smallpox (see Table 75-3 ) may be aided by a number of features: synchronous lesions, umbilicated appearance in the pustular stage, early involvement of palms and soles, and the centrifugal distribution of the eruption. Historically, varicella and drug reactions posed the most frequent diagnostic dilemmas, 30 along with monkeypox in Africa and importation of monkeypox along with animal reservoirs from Africa. 31 Although the diagnosis of smallpox is suggested by clinical features, definitive diagnosis requires analysis of blood and lesional contents or scrapings from crusts by electron microscopy, viral antigen immunohistochemistry, polymerase chain reaction, and viral isolation. Because processing and evaluation of specimens from a suspected case of smallpox requires high-level biocontainment facilities, collaboration with public health authorities is necessary. Smallpox is transmitted from person-to-person by respiratory droplet nuclei and, less commonly, by contact with lesions or contaminated fomites. Airborne transmission by fine-particle aerosols has been documented 32 and should be assumed as a potential mode of spread in a bioterrorism event. The virus is communicable from the onset of the enanthem, generally one or two days prior to the rash, until all of the scabs have separated; however, the highest transmission risk occurs during the first week of the rash due to high titers of replicating virus in the oropharynx. Household members, other face-to-face contacts, and healthcare workers have traditionally been at highest risk for secondary transmission; the latter group is of greatest concern with regards to amplification of infection, especially among medically vulnerable populations. Thus, hospitalized cases of suspected smallpox must immediately be placed in negative-pressure rooms with contact and airborne precautions. Those not requiring hospital-level care should remain isolated at home in order to avoid infecting others. The suspicion of a single smallpox case should prompt immediate notification of local public health authorities and the hospital epidemiologist. Containment of the disease is predicated on the 'ring vaccination' strategy, which was successfully deployed in the WHO global eradication campaign and which mandates the identification and immunization of all directly exposed persons or those at high risk of exposure, including close contacts, healthcare workers, and laboratory personnel. Vaccination of infected individuals, if deployed within 4 days of infection during the early incubation period, can significantly attenuate or prevent disease and may favorably impact secondary transmission. 30 Because the disease does not exist in nature, the occurrence of even a single case of smallpox would be tantamount to bioterrorism and would warrant an epidemiologic investigation to ascertain the perimeter of the initial release, so that ring vaccination can be accomplished. 33 Botulism Botulism is an acute neurologic disease resulting from intoxication with Clostridium botulinum that occurs sporadically and in focal outbreaks throughout the world. Generally, the illness is associated with wound contamination by the bacterial form or ingestion of preformed, food-borne toxin. A detailed discussion of botulism is found in Chapter 22. Aerosol forms of the toxin, a rare mode of acquisition in nature, have been weaponized for use in bioterrorism although their actual use has never been documented. 4 Botulinum toxin is considered to be the most toxic molecule known; it is lethal to humans in minute quantities and acts by blocking the release of the neurotransmitter acetylcholine from presynaptic vesicles, thereby inhibiting muscle contraction. 34 Botulism presents with the clinical features of an acute, afebrile, symmetric, descending, flaccid paralysis without mental status or sensory changes. The disease manifests initially in the bulbar musculature; fatigue, dizziness, dysphagia, dysarthria, diplopia, dry mouth, dyspnea, ptosis, ophthalmoparesis, tongue weakness and facial muscle paresis are early findings seen in more than 75% of cases. Progressive muscular involvement leads to respiratory failure in untreated cases. The clinical presentations of food-borne and inhalational botulism are indistinguishable in experimental animals. 34 The diagnosis of botulism is based largely on epidemiologic and clinical features and the exclusion of other possible differential diagnoses (see Table 75-3 ); there is no commercial assay currently available to confirm intoxication. While sporadic or clustered cases occur regularly, albeit infrequently in higher-income countries, it must be recognized that any single case of botulism could be the result of bioterrorism or could herald a larger-scale event. Certainly, large numbers of epidemiologically unrelated, geographically dispersed or multifocal cases should raise the specter of an intentional release of the agent, either in food/water supplies or as an aerosol. The mortality from food-borne botulism has declined from 60% to 6% over the last four decades, probably as a result of improvements in intensive and supportive care. Because the need for mechanical ventilation may be prolonged in these patients, the finite resource of ventilators would be rapidly overwhelmed in the event of a large-scale bioterrorism event using botulism toxin, even though these devices are part of the Strategic National Stockpile in the USA for such incidents. New developments in ventilator technology may mitigate some of the predicted shortfalls. Treatment with an equine antitoxin is available in limited supply from the CDC and may ameliorate disease if given early. Plague Plague, a systemic disease caused by the gram-negative pathogen Yersinia pestis , presents in a variety of clinical forms in nature as detailed in Chapter 126. Plague is endemic in parts of South East Asia, Africa and the western USA. While naturally acquired disease results from a variety of exposure modes, bioterrorism carried out using aerosolized preparations of the agent would likely result in cases of primary pneumonic plague occurring outside of endemic areas. However, as was the case with the anthrax attacks in the USA in 2001, unexpected forms of the disease, such as bubonic and septicemic plague, might also occur in an event. Primary pneumonic plague classically presents as an acute, febrile, pneumonic illness with prominent respiratory and systemic symptoms; gastrointestinal symptoms, purulent sputum production or hemoptysis occur variably. 35 Chest roentgenogram typically shows patchy, bilateral, multilobar infiltrates or consolidations ( Figure 75-8 ). Untreated or inappropriately treated patients progress rapidly to develop respiratory failure, vascular collapse, purpuric skin lesions, necrotic digits and death. The differential diagnosis involves other etiologies of rapidly progressive pneumonia and includes clinical syndromes caused by a number of other agents of bioterrorism (see Table 75-3 ). The diagnosis may be suggested by observing the characteristic small, gram-negative, coccobacillary forms in sputum specimens with bipolar or 'safety pin' pattern uptake of Giemsa or Wright stain ( Figure 75-9 ). 36 Culture confirmation is necessary to confirm the diagnosis; the microbiology laboratory should be notified in advance if plague is suspected, as special techniques and precautions must be employed to prevent inadvertent transmission to laboratory personnel. Figure 75-8 Chest X-ray, pneumonic plague, demonstrating multilobar infiltrates. (Courtesy of CDC and Dr Jack Poland.) Figure 75-9 Peripheral blood smear demonstrating bipolar uptake of stain, the so-called 'safety pin' appearance of Yersinia pestis . (Courtesy of CDC and Dr Jack Poland.) Treatment recommendations for plague have been reviewed elsewhere. 27 , 36 Pneumonic plague can be transmitted from person-to-person by respiratory droplet nuclei, thus placing close contacts, such as patients and healthcare workers in the healthcare setting at risk. Domestic cats may participate in maintaining a transmission chain during a bioterrorism event. 11 Prompt recognition and treatment of cases, appropriate deployment of postexposure prophylaxis, and early institution of droplet precautions for infected individuals will interrupt secondary transmission of plague. Tularemia The causative agent of tularemia, Francisella tularensis , is another small gram-negative coccobacillus that would be predicted to cause a primary pneumonic illness if delivered as an aerosol in a bioterrorism event. Once again, however, vigilance is necessary as naturally occurring disease can be acquired by a variety of routes and present in many clinical forms; an intentional release of bacteria may also result in more than one form of tularemia. Pulmonic tularemia presents with the abrupt onset of a febrile systemic illness with prominent upper respiratory symptoms, pleuritic chest pain, and the variable development of pneumonia, hilar adenopathy, and progression to respiratory failure and death in approximately 30% of inappropriately treated patients. 37 The diagnosis is generally established on clinical features, based on the differential diagnosis (see Table 75-3 ) and microbiologic data. Laboratory personnel should be notified in advance if tularemia is suspected, as the organism can be very infectious when manipulated in laboratory conditions. This agent is discussed in depth in Chapter 127. Viral Hemorrhagic Fevers Pathogenic members of four distinct families of RNA viruses are potential agents of viral hemorrhagic fevers (VHF): the agents of Ebola, Marburg, Lassa fever, Rift Valley fever and Crimean-Congo hemorrhagic fever. These syndromes are discussed in detail in Chapter 132. VHF cause clinical syndromes with many common features: fever, malaise, headache, myalgias, prostration, mucosal hemorrhage and other signs of increased vascular permeability, leading to shock and multiorgan system failure in advanced cases. 38 Additionally, specific VHF pathogens are associated with distinct target organ effects. Hemorrhagic fever viruses represent emerging infections in nature due to their sporadic occurrence in focal outbreaks throughout the world when their ecological niches are disrupted by expanding human populations. These viruses are also potential weapons of bioterrorism for a number of reasons: • some are highly infectious in aerosol form; • they are transmissible in healthcare settings; • they cause high morbidity and mortality; and • they are purported to have been successfully weaponized. Blood and other body fluids from infected patients are infectious. Hence, person-to-person airborne transmission may occur and strict contact and airborne precautions should be instituted in these cases. 38 Transmission in healthcare settings is a well-described risk with these agents. Treatment is largely supportive and includes the early use of vasopressors as needed. Ribavirin is effective against some forms of VHF but not those caused by Ebola and Marburg viruses. Nonetheless, this drug should be initiated empirically in patients presenting with a consistent clinical syndrome until an alternate etiology is confirmed. Anthrax Anthrax results from infection with Bacillus anthracis , a gram-positive, spore-forming, rod-shaped organism that exists in its host as a vegetative bacillus and in the environment as a spore. Details of the microbiology and pathogenesis of anthrax are found in Chapter 134. In nature anthrax is a zoonotic disease of herbivores that is prevalent in many geographic regions; sporadic human disease results from environmental or occupational contact with endospore-contaminated animal products. 14 Anthrax is uncommon in higher-income countries. In low- and middle-income countries (LMIC) the cutaneous form of anthrax is the most common presentation; gastrointestinal and inhalational forms are exceedingly rare in naturally acquired disease. Recently, a novel, soft-tissue form of infection was described in injection drug users in Europe. 15 Cutaneous anthrax is rarely seen in current-day industrialized countries due to importation restrictions. The last known case of naturally occurring inhalational anthrax in the USA occurred in 1976. 16 The 2001 anthrax attacks in the USA were on a relatively small scale, and nearly 40% of the confirmed cases were of the cutaneous variety. 17 The serious events following the outbreak were related to inhalational disease. Therefore, planning for larger-scale events with aerosolized anthrax is warranted. The differential diagnoses of cutaneous and inhalational anthrax are described in Table 75-3 . The lesion of cutaneous anthrax may be similar in appearance to other lesions, including cutaneous forms of other agents of bioterrorism; however, it may be distinguished by epidemiologic as well as certain clinical features. Anthrax is traditionally a painless lesion, unless secondarily infected, and it is associated with significant local edema ( Figure 75-1 ). The bite of Loxosceles reclusa , the brown recluse spider, shares many of the local and systemic features of anthrax but is typically painful from the outset and lacks significant edema. 18 Cutaneous anthrax may be associated with systemic disease and its attendant mortality in up to 20% of cases if untreated; with appropriate therapy, mortality is <1%. 16 Figure 75-1 Lesion of cutaneous anthrax. (©Diepgen T.L., Yihune G., et al . Dermatology Online Atlas ( http://www.dermis.net ). Reprinted with permission.) Once the inhaled endospores reach the alveoli, they are phagocytosed by macrophages and transported to regional lymph nodes, where they germinate into vegetative bacteria and, subsequently, disseminate hematogenously. 14 The bacteria generate potent exotoxins, lethal toxin and edema toxin, which lead to hemorrhagic mediastinitis, systemic illness and death. Spores may remain latent for extended periods of time in the host, up to 100 days in some experimental animal models, 17 resulting in prolonged clinical incubation periods following exposure to endospores. Cases of inhalational anthrax occurred up to 43 days after exposure in the Sverdlovsk experience, although the average incubation period is 2–10 days, perhaps influenced by inoculum. 15 Although the clinical experience derived from the 2001 USA attacks had much in common with the clinical manifestations of inhalational anthrax noted in the Sverdlovsk cases, some novel findings emerged. Of 11 confirmed cases of inhalational anthrax, 5 (45%) died. Although this contrasts with a case fatality rate of greater than 85% reported from Sverdlovsk, the reliability of reported data from the latter outbreak is questionable 17 and, perhaps more importantly, patients in the 2001 outbreak were more likely to receive appropriate treatment at an earlier stage. Patients with inhalational anthrax almost uniformly seek medical attention an average of 3.3 days after symptom onset with fevers, chills, malaise, myalgias, nonproductive cough, chest discomfort, dyspnea, nausea or vomiting, tachycardia, peripheral neutrophilia and liver enzyme elevations. 11 , 19 Many of these findings are nondiagnostic and overlap considerably with those of influenza or other common viral respiratory tract infections. Data suggest that discrimination between inhalational anthrax and benign, influenza-like illnesses may be possible on the basis of initial symptoms: shortness of breath, nausea, and vomiting are significantly more common in anthrax, while rhinorrhea is uncommonly seen in anthrax but noted in the majority of community-acquired viral respiratory infections. 20 Other common clinical manifestations of inhalational anthrax include abdominal pain, headache, mental status abnormalities and hypoxemia. Abnormalities on chest radiography appear to be universally present, although these may only be identified retrospectively in some cases. Pleural effusions are the most common abnormality; infiltrates, consolidation and/or mediastinal adenopathy/widening are noted in the majority of cases ( Figure 75-2a ). Mediastinal adenopathy appears to be an early indicator of disease; CT scan is more sensitive than chest radiographs for this finding ( Figure 75-2b ). In the 2001 outbreak, more than 80% of cases were noted to have mediastinal widening with or without pleural effusions or infiltrates. Figure 75-2 (a) Chest X-ray, inhalational anthrax, United States, 2001 demonstrating mediastinal widening (arrows). (b) Chest CT scan demonstrating mediastinal widening (arrows) and bilateral pleural effusions. (From Jernigan J., Stephens D.S., Ashford D.A., et al.: Bioterrorism-related inhalational anthrax: The first 10 cases reported in the United States. Emerg Infect Dis 2001; 7:933-944.) The clinical manifestations generally evolve to a fulminant septic picture with progressive respiratory failure. B. anthracis is routinely isolated in blood cultures if obtained prior to the initiation of antimicrobials ( Figure 75-3 ). Pleural fluid is typically hemorrhagic; the bacteria can either be isolated in culture or documented by antigen-specific immunohistochemical stains of this material ( Figure 75-4 ) in most patients. 11 The average time from hospitalization until death was 3 days (range 1–5 days). Autopsy typically reveals hemorrhagic mediastinal lymphadenitis and disseminated metastatic infection. Pathology data from the Sverdlovsk outbreak confirm meningeal involvement, typically hemorrhagic meningitis, in 50%; 21 meningoencephalitis was the presenting diagnosis ( Figure 75-5 ) in the index case in the USA from 2001. 22 Figure 75-3 Bacillus anthracis . (a) Bacillus anthracis appearing as Gram-positive bacilli. (b) The typical 'jointed bamboo-rod' appearance of the organism from blood cultures. (Courtesy of CDC and Dr William A. Clark.) Figure 75-4 Pleural fluid cell block immunohistochemical stain demonstrating Bacillus anthracis antigen (red) within a mononuclear inflammatory cell infiltrate. (From Jernigan J., Stephens D.S., Ashford D.A., et al.: Bioterrorism-related inhalational anthrax: The first 10 cases reported in the United States. Emerg Infect Dis 2001; 7:933-944.) Figure 75-5 Cerebrospinal fluid Gram stain from anthrax index case, United States, 2001, demonstrating numerous gram-positive rods and neutrophils. (From Jernigan J., Stephens D.S., Ashford D.A., et al.: Bioterrorism-related inhalational anthrax: The first 10 cases reported in the United States. Emerg Infect Dis 2001; 7:933-944.) The diagnosis of inhalational anthrax consists of a compatible clinical presentation in the context of a known exposure, a possible exposure, or epidemiologic factors suggesting bioterrorism, e.g. clustered cases of a rapidly progressive, systemic illness. The diagnosis should also be considered in a single individual with a consistent or suggestive clinical illness in the absence of another etiology. Table 75-3 delineates a detailed differential diagnosis of anthrax. The early recognition and treatment of inhalational anthrax appear to be associated with a survival advantage; 11 in the USA experience, patients who received appropriate antimicrobials within 4.7 days of symptom onset had a mortality rate of 40% as compared with a mortality rate of 75% for those treated after that period. 23 Therefore, prompt, empiric antimicrobial therapy should be initiated if infection is clinically suspected. Combination parenteral therapy is appropriate in the ill individual for a number of reasons: 11 • to cover the possibility of antimicrobial resistance; • to target specific bacterial virulence properties, e.g. the theoretical effect of clindamycin on toxin production; • to optimize adequate drug penetration into the central nervous system; and • to favorably impact survival. In order to optimize the outcome in inhalational anthrax, novel therapies, such as toxin inhibitors or receptor antagonists, are in development with effective antimicrobial agents, optimal hemodynamic and ventilatory support, and pleural fluid drainage. 23 , 24 A variety of such strategies, guided by the pathogenesis of the organism and its disease-producing toxins, has shown promise in animal studies and will likely be components of effective therapeutic regimens in the future. 25 , 26 Detailed therapeutic and postexposure prophylaxis recommendations for adults, children and special groups have been recently reviewed elsewhere. 17 , 24 , 27 Anthrax vaccine adsorbed (AVA), the current product in use for select indications, is effective in preventing cutaneous anthrax in human clinical trials and in preventing inhalational disease after aerosol challenge in nonhuman primates. 28 The vaccine has generally been found to be safe but requires multiple initial doses over 18 months with the need for frequent boosting. Second-generation anthrax vaccines employing recombinant protective antigen are in clinical trials and several experimental products containing spore and capsule antigens are in development. A fully humanized monoclonal antibody, raxibacumab, has been approved for the treatment and prevention of inhalational anthrax. 26 Smallpox The last known naturally acquired case of smallpox occurred in Somalia in 1977; in 1980, as the culmination of a 12-year, intensive campaign by the WHO, smallpox became the first and only disease to be eradicated as a scourge of humans. 29 However, because of concerns that variola virus stocks may have either been removed from or sequestered outside of their WHO-designated repositories, smallpox is considered to be a potential agent of bioterrorism. Smallpox could be a devastatingly effective weapon as its re-introduction into human populations would be a global public health catastrophe. It is stable in aerosol form with a low infective dose; case fatality rates approach 30%; secondary attack rates among unvaccinated close contacts are 37–88% and are amplified, especially in healthcare settings; and much of the world's population is susceptible. Routine civilian vaccination was terminated more than two decades ago and vaccine-induced immunity may wane over time to some extent in vaccinees. 30 Although a second-generation smallpox vaccine has been approved for use, it is currently not routinely recommended. There are no known antiviral therapies of proven clinical effectiveness against this pathogen. Following an average incubation period of 10–12 days (range 7–19 days), patients experience the acute onset of a 2- to 3-day prostrating prodrome consisting of fever, rigors, malaise, vomiting, headache and backache. They subsequently develop a centrifugally distributed eruption that initially involves the face and extremities and then generalizes as it evolves through macular, papular, vesicular, and pustular stages in synchronous (i.e. lesions progress concurrently and have similar appearances diffusely) fashion over approximately 8 days, with umbilication in the latter stages ( Figure 75-6 ). An oropharyngeal enanthem typically precedes the exanthem by 1 or 2 days; this is indicative of high titer viral replication in the upper respiratory tract and correlates with high infectivity. The rash generally remains denser peripherally and typically involves the palms and soles in its early stages, a potentially useful clue in narrowing the differential diagnosis ( Figure 75-7 ). The umbilicated pustules begin crusting during the second week of the eruption. Separation of scabs is usually complete by the end of the third week, but the course of the systemic illness may be attenuated and the appearance of the exanthem milder in those with partial, pre-existing immunity or more progressive and virulent in those with immunodeficient states. Figure 75-6 Smallpox. (a) Third day of rash in smallpox. Additional lesions continue to appear and some of the papules are becoming obviously vesicular. (b) Fifth day of rash in smallpox. Almost all the papules have now become vesicular or pustular, the truly 'vesicular' stage usually being very brief. Some of the lesions on the upper arm show early umbilication. (c) Eighth day of rash in smallpox. This case is now clearly classified as discrete ordinary-type smallpox. In the confluent subtype of ordinary-type smallpox the lesions would have been confluent on the face and forearms: in the semiconfluent subtype they would have been confluent on the face but not on the forearms. (d) Twentieth day of rash in smallpox. The scabs have separated except on the palms of the hands and the soles of the feet, leaving depigmented areas. (From Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., et al.: Smallpox and its eradication, Geneva, World Health Organization, 1988.) Figure 75-7 (a) Typical centrifugal distribution of the rash in smallpox. (b) Patient with smallpox, Kosovo, Yugoslavia epidemic, March and April 1972. The scabs will eventually fall off leaving marks on the skin that will become pitted scars. The infection is transmissible until all scabs have fallen off. ((a) Courtesy of CDC and Dr Paul B. Dean; (b) Courtesy of CDC and Dr William Foege.) The differential diagnosis of smallpox (see Table 75-3 ) may be aided by a number of features: synchronous lesions, umbilicated appearance in the pustular stage, early involvement of palms and soles, and the centrifugal distribution of the eruption. Historically, varicella and drug reactions posed the most frequent diagnostic dilemmas, 30 along with monkeypox in Africa and importation of monkeypox along with animal reservoirs from Africa. 31 Although the diagnosis of smallpox is suggested by clinical features, definitive diagnosis requires analysis of blood and lesional contents or scrapings from crusts by electron microscopy, viral antigen immunohistochemistry, polymerase chain reaction, and viral isolation. Because processing and evaluation of specimens from a suspected case of smallpox requires high-level biocontainment facilities, collaboration with public health authorities is necessary. Smallpox is transmitted from person-to-person by respiratory droplet nuclei and, less commonly, by contact with lesions or contaminated fomites. Airborne transmission by fine-particle aerosols has been documented 32 and should be assumed as a potential mode of spread in a bioterrorism event. The virus is communicable from the onset of the enanthem, generally one or two days prior to the rash, until all of the scabs have separated; however, the highest transmission risk occurs during the first week of the rash due to high titers of replicating virus in the oropharynx. Household members, other face-to-face contacts, and healthcare workers have traditionally been at highest risk for secondary transmission; the latter group is of greatest concern with regards to amplification of infection, especially among medically vulnerable populations. Thus, hospitalized cases of suspected smallpox must immediately be placed in negative-pressure rooms with contact and airborne precautions. Those not requiring hospital-level care should remain isolated at home in order to avoid infecting others. The suspicion of a single smallpox case should prompt immediate notification of local public health authorities and the hospital epidemiologist. Containment of the disease is predicated on the 'ring vaccination' strategy, which was successfully deployed in the WHO global eradication campaign and which mandates the identification and immunization of all directly exposed persons or those at high risk of exposure, including close contacts, healthcare workers, and laboratory personnel. Vaccination of infected individuals, if deployed within 4 days of infection during the early incubation period, can significantly attenuate or prevent disease and may favorably impact secondary transmission. 30 Because the disease does not exist in nature, the occurrence of even a single case of smallpox would be tantamount to bioterrorism and would warrant an epidemiologic investigation to ascertain the perimeter of the initial release, so that ring vaccination can be accomplished. 33 Botulism Botulism is an acute neurologic disease resulting from intoxication with Clostridium botulinum that occurs sporadically and in focal outbreaks throughout the world. Generally, the illness is associated with wound contamination by the bacterial form or ingestion of preformed, food-borne toxin. A detailed discussion of botulism is found in Chapter 22. Aerosol forms of the toxin, a rare mode of acquisition in nature, have been weaponized for use in bioterrorism although their actual use has never been documented. 4 Botulinum toxin is considered to be the most toxic molecule known; it is lethal to humans in minute quantities and acts by blocking the release of the neurotransmitter acetylcholine from presynaptic vesicles, thereby inhibiting muscle contraction. 34 Botulism presents with the clinical features of an acute, afebrile, symmetric, descending, flaccid paralysis without mental status or sensory changes. The disease manifests initially in the bulbar musculature; fatigue, dizziness, dysphagia, dysarthria, diplopia, dry mouth, dyspnea, ptosis, ophthalmoparesis, tongue weakness and facial muscle paresis are early findings seen in more than 75% of cases. Progressive muscular involvement leads to respiratory failure in untreated cases. The clinical presentations of food-borne and inhalational botulism are indistinguishable in experimental animals. 34 The diagnosis of botulism is based largely on epidemiologic and clinical features and the exclusion of other possible differential diagnoses (see Table 75-3 ); there is no commercial assay currently available to confirm intoxication. While sporadic or clustered cases occur regularly, albeit infrequently in higher-income countries, it must be recognized that any single case of botulism could be the result of bioterrorism or could herald a larger-scale event. Certainly, large numbers of epidemiologically unrelated, geographically dispersed or multifocal cases should raise the specter of an intentional release of the agent, either in food/water supplies or as an aerosol. The mortality from food-borne botulism has declined from 60% to 6% over the last four decades, probably as a result of improvements in intensive and supportive care. Because the need for mechanical ventilation may be prolonged in these patients, the finite resource of ventilators would be rapidly overwhelmed in the event of a large-scale bioterrorism event using botulism toxin, even though these devices are part of the Strategic National Stockpile in the USA for such incidents. New developments in ventilator technology may mitigate some of the predicted shortfalls. Treatment with an equine antitoxin is available in limited supply from the CDC and may ameliorate disease if given early. Plague Plague, a systemic disease caused by the gram-negative pathogen Yersinia pestis , presents in a variety of clinical forms in nature as detailed in Chapter 126. Plague is endemic in parts of South East Asia, Africa and the western USA. While naturally acquired disease results from a variety of exposure modes, bioterrorism carried out using aerosolized preparations of the agent would likely result in cases of primary pneumonic plague occurring outside of endemic areas. However, as was the case with the anthrax attacks in the USA in 2001, unexpected forms of the disease, such as bubonic and septicemic plague, might also occur in an event. Primary pneumonic plague classically presents as an acute, febrile, pneumonic illness with prominent respiratory and systemic symptoms; gastrointestinal symptoms, purulent sputum production or hemoptysis occur variably. 35 Chest roentgenogram typically shows patchy, bilateral, multilobar infiltrates or consolidations ( Figure 75-8 ). Untreated or inappropriately treated patients progress rapidly to develop respiratory failure, vascular collapse, purpuric skin lesions, necrotic digits and death. The differential diagnosis involves other etiologies of rapidly progressive pneumonia and includes clinical syndromes caused by a number of other agents of bioterrorism (see Table 75-3 ). The diagnosis may be suggested by observing the characteristic small, gram-negative, coccobacillary forms in sputum specimens with bipolar or 'safety pin' pattern uptake of Giemsa or Wright stain ( Figure 75-9 ). 36 Culture confirmation is necessary to confirm the diagnosis; the microbiology laboratory should be notified in advance if plague is suspected, as special techniques and precautions must be employed to prevent inadvertent transmission to laboratory personnel. Figure 75-8 Chest X-ray, pneumonic plague, demonstrating multilobar infiltrates. (Courtesy of CDC and Dr Jack Poland.) Figure 75-9 Peripheral blood smear demonstrating bipolar uptake of stain, the so-called 'safety pin' appearance of Yersinia pestis . (Courtesy of CDC and Dr Jack Poland.) Treatment recommendations for plague have been reviewed elsewhere. 27 , 36 Pneumonic plague can be transmitted from person-to-person by respiratory droplet nuclei, thus placing close contacts, such as patients and healthcare workers in the healthcare setting at risk. Domestic cats may participate in maintaining a transmission chain during a bioterrorism event. 11 Prompt recognition and treatment of cases, appropriate deployment of postexposure prophylaxis, and early institution of droplet precautions for infected individuals will interrupt secondary transmission of plague. Tularemia The causative agent of tularemia, Francisella tularensis , is another small gram-negative coccobacillus that would be predicted to cause a primary pneumonic illness if delivered as an aerosol in a bioterrorism event. Once again, however, vigilance is necessary as naturally occurring disease can be acquired by a variety of routes and present in many clinical forms; an intentional release of bacteria may also result in more than one form of tularemia. Pulmonic tularemia presents with the abrupt onset of a febrile systemic illness with prominent upper respiratory symptoms, pleuritic chest pain, and the variable development of pneumonia, hilar adenopathy, and progression to respiratory failure and death in approximately 30% of inappropriately treated patients. 37 The diagnosis is generally established on clinical features, based on the differential diagnosis (see Table 75-3 ) and microbiologic data. Laboratory personnel should be notified in advance if tularemia is suspected, as the organism can be very infectious when manipulated in laboratory conditions. This agent is discussed in depth in Chapter 127. Viral Hemorrhagic Fevers Pathogenic members of four distinct families of RNA viruses are potential agents of viral hemorrhagic fevers (VHF): the agents of Ebola, Marburg, Lassa fever, Rift Valley fever and Crimean-Congo hemorrhagic fever. These syndromes are discussed in detail in Chapter 132. VHF cause clinical syndromes with many common features: fever, malaise, headache, myalgias, prostration, mucosal hemorrhage and other signs of increased vascular permeability, leading to shock and multiorgan system failure in advanced cases. 38 Additionally, specific VHF pathogens are associated with distinct target organ effects. Hemorrhagic fever viruses represent emerging infections in nature due to their sporadic occurrence in focal outbreaks throughout the world when their ecological niches are disrupted by expanding human populations. These viruses are also potential weapons of bioterrorism for a number of reasons: • some are highly infectious in aerosol form; • they are transmissible in healthcare settings; • they cause high morbidity and mortality; and • they are purported to have been successfully weaponized. Blood and other body fluids from infected patients are infectious. Hence, person-to-person airborne transmission may occur and strict contact and airborne precautions should be instituted in these cases. 38 Transmission in healthcare settings is a well-described risk with these agents. Treatment is largely supportive and includes the early use of vasopressors as needed. Ribavirin is effective against some forms of VHF but not those caused by Ebola and Marburg viruses. Nonetheless, this drug should be initiated empirically in patients presenting with a consistent clinical syndrome until an alternate etiology is confirmed. Associated Issues and Sequelae of Bioterrorism Surveillance Surveillance is perhaps the most critical element in the early recognition and identification of bioterrorism events. For the individual clinician, surveillance is analogous to clinical vigilance. In the broader context of communities and larger populations, it involves a public health system and infrastructure designed to detect perturbations in the baseline occurrence of either symptoms, as is the case with syndromic surveillance systems, or diseases, as is the case with a standard public health system of reporting. Syndromic surveillance systems, such as monitoring prescription drug sales from retail pharmacies, have been used to successfully track influenza activity and that of other emerging infectious diseases and have been proposed as surrogate indicators of early disease activity. 39 Quarantine Quarantine, the physical separation and geographic restriction of groups of uninfected individuals potentially exposed to a communicable illness, has been variably considered to be a management strategy following bioterrorism. The potential effectiveness, feasibility, legality and consequences of quarantine were reviewed following the USA anthrax attacks. 40 The logistics of this approach are complex and impractical and it can be associated with adverse consequences such as increased risk of disease transmission among a quarantined group or public unrest. It seems clear that there are only limited scenarios in which the potential public health benefits of the imposition of quarantine may outweigh the potential problems it engenders; these scenarios involve highly transmissible, lethal agents. In most situations a disease-specific containment strategy, based on transmission epidemiology and disease prevention tenets, is preferable. Management of Special Patient Populations The approach to the management of diseases of bioterrorism must include provisions for children, pregnant women and immunocompromised individuals. Specific recommendations for treatment and prophylaxis of these special patient groups for selected bioterrorism agents have been reviewed elsewhere. 16 , 27 , 36 , 37 The approach requires an assessment of the risk of using certain drugs or products in select populations versus the potential risk of the infection in question, accounting for the extent of exposure and agent involved. Live virus vaccines, such as smallpox, pose higher risk to these special groups than to others. This consideration will impact mass vaccination decisions and, like most other aspects of medicine, will require an assessment of risk versus benefit. Psychosocial Morbidity An often overlooked but vitally important issue is that of psychosocial morbidity related to bioterrorism. Acute anxiety reactions and exacerbations of chronic psychiatric illness during the stress of the event, or post-traumatic stress disorder (PTSD) in its aftermath may affect clinical victims of bioterrorism as well as healthcare workers and other first responders. Nearly half of the emergency department visits during the Gulf War missile attacks in Israel in 1991 were related to acute psychological illness or exacerbations of underlying behavioral problems. 41 Data from recent acts of terrorism in the USA suggest that PTSD and/or depression may develop in more than 35% of those impacted by the events. 42 , 43 Although close proximity to an event and personal loss appear to be directly correlated with PTSD and depression, respectively, those indirectly involved also experience substantial morbidity. 43 The long-term psychosocial impact of these events and of the persistent threat of terrorism in general remains to be determined. Surveillance Surveillance is perhaps the most critical element in the early recognition and identification of bioterrorism events. For the individual clinician, surveillance is analogous to clinical vigilance. In the broader context of communities and larger populations, it involves a public health system and infrastructure designed to detect perturbations in the baseline occurrence of either symptoms, as is the case with syndromic surveillance systems, or diseases, as is the case with a standard public health system of reporting. Syndromic surveillance systems, such as monitoring prescription drug sales from retail pharmacies, have been used to successfully track influenza activity and that of other emerging infectious diseases and have been proposed as surrogate indicators of early disease activity. 39 Quarantine Quarantine, the physical separation and geographic restriction of groups of uninfected individuals potentially exposed to a communicable illness, has been variably considered to be a management strategy following bioterrorism. The potential effectiveness, feasibility, legality and consequences of quarantine were reviewed following the USA anthrax attacks. 40 The logistics of this approach are complex and impractical and it can be associated with adverse consequences such as increased risk of disease transmission among a quarantined group or public unrest. It seems clear that there are only limited scenarios in which the potential public health benefits of the imposition of quarantine may outweigh the potential problems it engenders; these scenarios involve highly transmissible, lethal agents. In most situations a disease-specific containment strategy, based on transmission epidemiology and disease prevention tenets, is preferable. Management of Special Patient Populations The approach to the management of diseases of bioterrorism must include provisions for children, pregnant women and immunocompromised individuals. Specific recommendations for treatment and prophylaxis of these special patient groups for selected bioterrorism agents have been reviewed elsewhere. 16 , 27 , 36 , 37 The approach requires an assessment of the risk of using certain drugs or products in select populations versus the potential risk of the infection in question, accounting for the extent of exposure and agent involved. Live virus vaccines, such as smallpox, pose higher risk to these special groups than to others. This consideration will impact mass vaccination decisions and, like most other aspects of medicine, will require an assessment of risk versus benefit. Psychosocial Morbidity An often overlooked but vitally important issue is that of psychosocial morbidity related to bioterrorism. Acute anxiety reactions and exacerbations of chronic psychiatric illness during the stress of the event, or post-traumatic stress disorder (PTSD) in its aftermath may affect clinical victims of bioterrorism as well as healthcare workers and other first responders. Nearly half of the emergency department visits during the Gulf War missile attacks in Israel in 1991 were related to acute psychological illness or exacerbations of underlying behavioral problems. 41 Data from recent acts of terrorism in the USA suggest that PTSD and/or depression may develop in more than 35% of those impacted by the events. 42 , 43 Although close proximity to an event and personal loss appear to be directly correlated with PTSD and depression, respectively, those indirectly involved also experience substantial morbidity. 43 The long-term psychosocial impact of these events and of the persistent threat of terrorism in general remains to be determined. Conclusion The response to bioterrorism is unique among WMD because it necessitates management strategies common to all disasters as well as the application of basic infectious diseases principles: surveillance, infection control, antimicrobial therapy and prophylaxis, and vaccine prevention. For these reasons, physicians (and specifically infectious diseases specialists) are likely first responders to bioterrorism and must keep their diagnostic and clinical skills current and remain clinically vigilant to potential threat agents. Because we clinicians are expected to be reliable sources of information for our patients, colleagues and public health authorities, we must guard against the inexorable 'bioterrorism fatigue' that may otherwise result from a persistent state of heightened readiness without an actual event taking place. 5 References available online at expertconsult.com .

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10174486/

A minisatellite-based MLVA for deciphering the global epidemiology of the bacterial cassava pathogen Xanthomonas phaseoli pv. manihotis

Cassava Bacterial Blight (CBB) is a destructive disease widely distributed in the different areas where this crop is grown. Populations studies have been performed at local and national scales revealing a geographical genetic structure with temporal variations. A global epidemiology analysis of its causal agent Xanthomonas phaseoli pv. manihotis ( Xpm ) is needed to better understand the expansion of the disease for improving the monitoring of CBB. We targeted new tandem repeat (TR) loci with large repeat units, i.e. minisatellites, that we multiplexed in a scheme of Multi-Locus Variable number of TR Analysis (MLVA-8). This genotyping scheme separated 31 multilocus haplotypes in three clusters of single-locus variants and a singleton within a worldwide collection of 93 Xpm strains isolated over a period of fifty years. The major MLVA-8 cluster 1 grouped strains originating from all countries, except the unique Chinese strain. On the contrary, all the Xpm strains genotyped using the previously developed MLVA-14 microsatellite scheme were separated as unique haplotypes. We further propose an MLVA-12 scheme which takes advantage of combining TR loci with different mutation rates: the eight minisatellites and four faster evolving microsatellite markers, for global epidemiological surveillance. This MLVA-12 scheme identified 78 haplotypes and separated most of the strains in groups of double-locus variants (DLV) supporting some phylogenetic relationships. DLV groups were subdivided into closely related clusters of strains most often sharing the same geographical origin and isolated over a short period, supporting epidemiological relationships. The main MLVA-12 DLV group#1 was composed by strains from South America and all the African strains. The MLVA-12 scheme combining both minisatellite and microsatellite loci with different discriminatory power is expected to increase the accuracy of the phylogenetic signal and to minimize the homoplasy effects. Further investigation of the global epidemiology of Xpm will be helpful for a better control of CBB worldwide. Introduction Molecular genotyping of bacterial pathogens allows a comprehensive view of their epidemiology and evolution. The ability to differentiate genotypes at different spatial and temporal scales can be informative of the dispersion and micro or macroevolution of bacterial pathogens [ 1 – 3 ]. At a local scale, this approach can shed light on the microevolutionary processes within populations, and track back the spread of bacterial isolates and the associated pathways. At a long-term or global scale, it can for instance unravel the invasion routes and characterize some bacterial lineages associated to pathological or adaptative traits for epidemiological surveillance. Genotyping methods based on several molecular markers have been developed to analyze the genetic diversity of pathogenic bacteria. The type of marker should be selected according to the research question to be answered because each marker has different mutation rates i.e. different speed of evolution and stability [ 2 – 6 ]. Markers with a desired molecular clock can be selected according to the evolutionary scale under study. Global epidemiology studies or international surveillance of pathogens require tools that can produce unambiguous data and are easily transferrable among different laboratories. Multilocus sequence typing (MLST) is a nucleotide sequence-based approach using markers that are conserved, stable, with relatively low evolution rates. It enables international comparison of isolates and global epidemiology [ 7 ]. However, some bacterial pathogens, the so-called genetically monomorphic bacteria [ 8 ], do not exhibit enough variability in their housekeeping genes making this approach insufficiently resolutive [ 8 ]. Various subtyping methods emerged with the advent of whole genome sequencing. In situations where large numbers of high-quality draft genomes can be obtained, single nucleotide polymorphism (SNP) typing is a powerful approach for epidemiological surveillance and phylogenetic analyses [ 8 – 11 ]. Technically simple and still robust systems are also necessary for routine epidemiological investigations in situations where an easy access to large sets of compete genomes is impossible to achieve. In such situations, Tandem Repeats (TRs) and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs) have been mainly applied as typing tools with regard to their reliability, discriminatory power, transferability, ease of application and cost [ 12 , 13 ]. TRs are short motifs of DNA fragments repeated in tandem that can vary in number due to addition or deletion of motifs. Multiple loci variable number tandem repeat analysis (MLVA) targets multiple TR loci which allows a high discriminatory power if a sufficiently large number of TRs is targeted. Two classes have been proposed to separate these informative molecular markers: microsatellites with a repeat unit size 0.99 for all strains in the dataset. Interestingly, the large polymorphism revealed for strains from South America split them in the seven clusters. Strains originating from Argentina (n = 4), Brazil (n = 12), Colombia (n = 28) and Venezuela (n = 21) were assigned to three (Argentina) or four (other countries) distinct clusters. Cluster #1 included strains from South America (Argentina, Brazil and Colombia) together with strains from Viet Nam. Cluster #2 mostly included strains from South America (Argentina, Brazil and Venezuela) together with a single strain from New Zealand. All African strains gathered in cluster #3 together with some strains from Colombia and Venezuela. Clusters #4 and 5 solely included strains from Colombia and Venezuela, respectively. Cluster #6 primarily included strains from South America (Brazil and Colombia) together with a few strains from China and New Zealand. Cluster #7 included strains from all countries in South America (Argentina, Brazil, Colombia and Venezuela). The structure revealed by DAPC was overall consistent with the produced MST (Figs 3 and S2 ). 10.1371/journal.pone.0285491.g003 Fig 3 Genetic structure of a worldwide collection of Xanthomonas phaseoli pv. manihotis based on the discriminant analysis of principal components (DAPC) of minisatellite and microsatellite data (MLVA-12). Numbers and colors represent the seven genetic clusters retained from Bayesian information criterion (BIC) values. (A) Scatterplot representing axes 1 and 2 of the DAPC. (B) Scatterplot representing axes 1 and 3 of the DAPC. Pathogenicity patterns are not associated to genetic groups The AUDPC values were used to determine if cassava varieties are resistant (∑AUPDC ≤39), moderately resistant (39 0.99 for all strains in the dataset. Interestingly, the large polymorphism revealed for strains from South America split them in the seven clusters. Strains originating from Argentina (n = 4), Brazil (n = 12), Colombia (n = 28) and Venezuela (n = 21) were assigned to three (Argentina) or four (other countries) distinct clusters. Cluster #1 included strains from South America (Argentina, Brazil and Colombia) together with strains from Viet Nam. Cluster #2 mostly included strains from South America (Argentina, Brazil and Venezuela) together with a single strain from New Zealand. All African strains gathered in cluster #3 together with some strains from Colombia and Venezuela. Clusters #4 and 5 solely included strains from Colombia and Venezuela, respectively. Cluster #6 primarily included strains from South America (Brazil and Colombia) together with a few strains from China and New Zealand. Cluster #7 included strains from all countries in South America (Argentina, Brazil, Colombia and Venezuela). The structure revealed by DAPC was overall consistent with the produced MST (Figs 3 and S2 ). 10.1371/journal.pone.0285491.g003 Fig 3 Genetic structure of a worldwide collection of Xanthomonas phaseoli pv. manihotis based on the discriminant analysis of principal components (DAPC) of minisatellite and microsatellite data (MLVA-12). Numbers and colors represent the seven genetic clusters retained from Bayesian information criterion (BIC) values. (A) Scatterplot representing axes 1 and 2 of the DAPC. (B) Scatterplot representing axes 1 and 3 of the DAPC. Pathogenicity patterns are not associated to genetic groups The AUDPC values were used to determine if cassava varieties are resistant (∑AUPDC ≤39), moderately resistant (39<∑AUDPC<44), moderately susceptible (44<∑AUDPC<49), or susceptible (∑AUDPC≥49) to the eight Xpm strains evaluated ( Table 4 and S3 Fig ). One cultivar, cv. 60444, was susceptible to all strains tested and two varieties (NGA11 and CM523-7) were susceptible to nearly all strains tested. On the other hand, cultivars COL1505 and CM6438-14 were resistant or moderately resistant to at least three of the strains evaluated ( Table 4 ). Regarding the strain pathogenicity level, strains CIAT1202, UA556, UA2164, CIO151 and CIAT1241 caused disease in all inoculated varieties. On the opposite hand, strain CIAT1135 was poorly pathogenic. Based on this information, pathological patterns were classified as follows. The more virulent strains (CIAT1202, UA556, UA2164, CIO151 and CIAT1241) were classified in group I. Strains with intermediate virulence (UA1591 and CIAT1205) were designated in group II. The least virulent strain CIAT1135 was assigned to group III ( Table 4 ). 10.1371/journal.pone.0285491.t004 Table 4 Pathogenicity tests performed using eight representative Xpm strains. Cassava Variety Strain CM523-7 NGA11 COL1505 CM6438-14 cv.60444 Relative virulence group Haplotype MLVA-8 (MLVA-12) Country CIAT1202 S (58,5±3,4) S (66,7±1,1) S (61,8±5,0) NE S (52±3,1) I 13 (30) Colombia UA556 S (68,2±7,6) S (56,4±5,1) MS (47,2±11,2) S (69,1±7,3) S (73,3±3,8) I 4 (11) Colombia UA1591 R (29,9±8,9) S (49,6±6,3) MR (41,9±8,8) MR (42,4±2,4) NE II 7 (59) Colombia UA2164 S (55,6±8,5) S (81±2,5) S (60,9±4,5) NE NE I 1 (7) Colombia CIO151 S (59,3±1,2) S (69,1±10,1) S (53,1±5,5) S (50,7±2,0) MS (44,9±6,5) I 18 (18) Colombia CIAT1135 R (5,2±2,0) R (20,3±3,7) R (0) R (22,9±2,4) NE. III 19 (16) China CIAT1205 MS (47,1±3,0) S (67,2±3,1) R (26,3±6,2) NE MS (48,1±8,9) II 23 (25) New Zealand CIAT1241 S (67±5,8) S (68,5±2,5) S (53,5±6,0) S (55,4±7,4) NE I 15 (58) Argentina Data shown is the mean of the sum of AUDPC in arbitrary units at 28 dpi from five replicates per genotype. A genotype was considered resistant (R) if ∑AUPDC ≤39, moderately resistant (MR) if 39<∑AUDPC<44, moderately susceptible (MS) when 44<∑AUDPC<49 and susceptible (S) when ∑AUDPC≥49, NE: Not evaluated. Discussion Epidemiology can be deciphered at different time and space scales by selecting the level of genomic resolution of the markers to monitor either the geographic spread of inoculum or the prevalence of certain epidemic or endemic clones for surveillance [ 2 – 4 , 6 ]. Cassava Bacterial Blight is a destructive disease widely distributed in the different tropical areas where cassava is grown. It has recently been reported in new areas [ 50 ]. A global molecular epidemiology analysis is needed to better understand the expansion of the disease for improving the monitoring of CBB. We recently developed a MLVA scheme targeting microsatellites with a high discriminatory power expected to be more adapted to local epidemiology and outbreak analysis [ 40 ]. Here, we evaluated new minisatellites for their usefulness in describing the relationships of non-epidemiologically related strains and large-scale epidemiology. These tandem repeat sequences, i.e. micro- and minisatellites, show motifs whose length variability is one of the main factors known to influence the mutation rate of VNTRs [ 14 ]. We propose a MLVA-12 scheme which takes advantages of combining TR loci with different mutation rates for global epidemiological surveillance. Eight minisatellites (MLVA-8) with a unit length ranging from 10 to 26 bp (i.e. markers with an expected low mutation rate) separated a world collection of Xpm strains isolated over a period of fifty years (1966–2016) in three CCs and a singleton. The major CC1 grouped strains originating from all the represented countries, except the unique Chinese strain that was included in our collection. All the strains from Africa grouped in this CC while strains from South America, the continent where the disease probably originated, were distributed in the three CCs. The MLVA-8 dataset confirmed (i) a more extensive genetic diversity for the South American strains than for the African strains and (ii) the hypothesis of some genetic links between African strains and some South-American strains as previously shown using four RFLP probes and SNPs based-phylogeny [ 26 , 37 ]. The MLVA-8 scheme alone lacked discriminatory power and therefore did not reveal a fully meaningful epidemiological perspective at a global scale. The relatively low number of minisatellite loci identified and their low mutation rates both are factors favoring homoplasy [ 51 , 52 ]. In contrast, 89 out of 93 Xpm strains genotyped using the MLVA-14 scheme were separated as unique haplotypes clearly confirming the high mutation rate of this genotyping technique, consistent with a previous study and suitable for small scale epidemiology [ 40 ]. A MLVA-12 scheme combining the eight minisatellites and four microsatellites from the MLVA-14 and displaying the lowest evolution rates is proposed to increase discriminatory power and minimize homoplasy effects [ 51 , 52 ]. In consequence the MLVA-12 scheme, will increase the genetic space of possible patterns as compared to MLVA-8 and would be suitable for epidemiological surveillance. The variable mutation rates within the MLVA-12 scheme allowed a nested approach where the genetic relationships among strains is described within deeper phylogenetic clusters. Such approaches, when combining markers with different discriminatory power, progressively or simultaneously, have been found to increase the accuracy of the phylogeny and to minimize the homoplasy effects [ 4 , 52 , 53 ]. A DAPC analysis of MLVA-12 data separated the haplotypes in seven distinct clusters. Interestingly, this analysis placed strains from South America in all clusters. This further supports the wide genetic diversity already described in South America ( i . e . center of origin of cassava and the continent where CBB was firstly reported [ 26 , 30 , 33 , 37 ]. In contrast, all African strains studied here grouped in a single cluster also containing strains from South America, suggesting a possible relatedness and the existence of a common ancestor. However, based on MLVA-14, the amount of genetic relatedness between African and the closest South American strains did not support recent epidemiological links. Cassava was introduced in Africa during the seventeenth and eighteenth centuries at a period where regular communications already existed between the two continents [ 54 ]. After its first description in Brazil in 1912, cassava bacterial blight was first reported in continental Africa in the early 1970's [ 24 , 54 ]. The pathogenic bacterium was likely introduced in this continent through transportation of infected plant material after multiple introduction events into both Eastern and Western African coasts. Three strains isolated in New-Zealand during outbreaks in 1960s or in 1980 were distributed in two different DAPC clusters, one of them sharing an MLVA-12 haplotype with a strain from Venezuela and the others were SLVs of Colombian and Brazilian strains. This result supports the occurrence of multiple introduction events of Xpm in this country. No clear correlation between the MLVA profiles and virulence patterns occurred. The different haplotypes representative of the genetic variability of observed within our world Xpm collection from MLV8-dataset produced different pathological patterns though all the isolates were virulent on the Colombian cassava varieties. Such variability in the pathogenicity of Xpm from an international collection without any link between the genetic and pathological patterns was previously reported using different molecular markers [ 55 ]. Variations of strain aggressiveness and a lack of correlation between the genetic and pathological patterns were further described at a regional or local scale in different countries revealing dynamic spatio-temporal changes within the Xpm populations [ 29 , 30 , 33 , 36 , 38 ]. Conclusions The MLVA-12 scheme proposed in this study combined both minisatellite and microsatellite loci that brought complementary information based on their different discriminatory power. Xpm is a monomorphic plant pathogen widely spread in tropical regions. This portable and resolving genotyping tool could be useful to further investigate the global epidemiology of this plant pathogenic bacterium of cassava, whose improved understanding will require additional data. Supporting information S1 Fig Minimum spanning tree displaying the relationships between haplotypes using the MLVA-14 Microsatellite scheme. Colors indicate the origin of the haplotype, and the circle size indicates the number of strains of each haplotype. Blue circles indicate clonal complexes and orange circles indicate groups of double locus variants. Numbers indicate the number of loci variants between haplotypes. (TIF) Click here for additional data file. S2 Fig Minimum spanning tree displaying the relationships between haplotypes using the MLVA-12 scheme. Colors indicate the origin of the haplotype, and the circle size is relative to the number of strains of each haplotype. The solid lines represent clonal complexes (CCs) grouping single locus variants and dotted lines group up to double locus variants. Numbers indicate the number of loci variants between haplotypes. (TIF) Click here for additional data file. S3 Fig Disease symptoms for resistant (R), moderately resistant (MR), susceptible (S), and moderately susceptible (MS) cultivars. (TIF) Click here for additional data file. S4 Fig Original images of agarose gel from Fig 1. (TIF) Click here for additional data file. S1 Table Worldwide collection of Xanthomonas phaseoli pv. manihotis strains analyzed in this study and haplotypes obtained from the different MLVA schemes. (DOCX) Click here for additional data file. S2 Table Multiplex scheme and primer pairs used in the MLVA-14 scheme targeting microsatellites. (DOCX) Click here for additional data file. S3 Table Diversity indices for MLVA-8 scheme from genotyping of a worldwide collection of Xpm (n = 93). (DOCX) Click here for additional data file. S4 Table Diversity indices for MLVA-14 scheme from genotyping of a worldwide collection of Xpm (n = 93). (DOCX) Click here for additional data file.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4286306/

Vaccinations for Pregnant Women

In the United States, eradication and reduction of vaccine-preventable diseases through immunization has directly increased life expectancy by reducing mortality. Although immunization is a public priority, vaccine coverage among adult Americans is inadequate. The Institute of Medicine, the Community Preventive Services Task Force, and other public health entities have called for the development of innovative programs to incorporate adult vaccination into routine clinical practice. Obstetrician–gynecologists are well-suited to serve as vaccinators of women in general and more specifically pregnant women. Pregnant women are at risk for vaccine-preventable disease–related morbidity and mortality and adverse pregnancy outcomes, including congenital anomalies, spontaneous abortion, preterm birth, and low birth weight. In addition to providing direct maternal benefit, vaccination during pregnancy likely provides direct fetal and infant benefit through passive immunity (transplacental transfer of maternal vaccine-induced antibodies). This article reviews: 1) types of vaccines; 2) vaccines specifically recommended during pregnancy and postpartum; 3) vaccines recommended during pregnancy and postpartum based on risk factors and special circumstances; 4) vaccines currently under research and development for licensure for maternal-fetal immunization; and 5) barriers to maternal immunization and available patient and provider resources.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1230913/

Pathophysiological Manifestations in Mice Exposed to Anthrax Lethal Toxin

Pathophysiological changes associated with anthrax lethal toxin included loss of plasma proteins, decreased platelet count, slower clotting times, fibrin deposits in tissue sections, and gross and histopathological evidence of hemorrhage. These findings suggest that blood vessel leakage and hemorrhage lead to disseminating intravascular coagulation and/or circulatory shock as an underlying pathophysiological mechanism.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6050581/

Receptor-Based Peptides for Inhibition of Leukotoxin Activity

The Gram-negative bacterium Aggregatibacter actinomycetemcomitans , commonly associated with localized aggressive periodontitis (LAP), secretes an RTX (repeats-in-toxin) protein leukotoxin (LtxA) that targets human white blood cells, an interaction that is driven by its recognition of the lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) integrin. In this study, we report on the inhibition of LtxA-LFA-1 binding as an antivirulence strategy to inhibit LtxA-mediated cytotoxicity. Specifically, we designed and synthesized peptides corresponding to the reported LtxA binding domain on LFA-1 and characterized their capability to inhibit LtxA binding to LFA-1 and subsequent cytotoxic activity in human immune cells. We found that several of these peptides, corresponding to sequential β -strands in the LtxA-binding domain of LFA-1, inhibit LtxA activity, demonstrating the effectiveness of this approach. Further investigations into the mechanism by which these peptides inhibit LtxA binding to LFA-1 reveal a correlation between toxin-peptide affinity and LtxA-mediated cytotoxicity, leading to a diminished association between LtxA and LFA-1 on the cell membrane. Our results demonstrate the possibility of using target-based peptides to inhibit LtxA activity, and we expect that a similar approach could be used to hinder the activity of other RTX toxins.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7535958/

Smallpox Vaccination-Associated Myopericarditis

Myopericarditis related to a smallpox vaccination often goes unrecognized and untreated because physicians are not routinely screening for vaccination administration.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6814643/

Omnipresence of inflammasome activities in inflammatory bone diseases

The inflammasomes are intracellular protein complexes that are assembled in response to a variety of perturbations including infections and injuries. Failure of the inflammasomes to rapidly clear the insults or restore tissue homeostasis can result in chronic inflammation. Recurring inflammation is also provoked by mutations that cause the constitutive assembly of the components of these protein platforms. Evidence suggests that chronic inflammation is a shared mechanism in bone loss associated with aging, dysregulated metabolism, autoinflammatory, and autoimmune diseases. Mechanistically, inflammatory mediators promote bone resorption while suppressing bone formation, an imbalance which over time leads to bone loss and increased fracture risk. Thus, while acute inflammation is important for the maintenance of bone integrity, its chronic state damages this tissue. In this review, we discuss the role of the inflammasomes in inflammation-induced osteolysis. Introduction Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (NLRs, e.g., NLRP1) or absent in melanoma 2-like receptors (ALRs, e.g., AIM 2) associate with caspase-1 directly or indirectly via apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC) to form intracellular protein complexes called inflammasomes. These macromolecular structures are assembled in response to perturbations caused by microbial products also known as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). For example, anthrax lethal factor, bacterial muramyl dipeptide, and bacterial flagellin induce the nucleation of the NLRP1 inflammasome, NLRP3 inflammasome, and NLRC4 inflammasome, respectively [ 1 , 2 ]. The inflammasomes are also activated by host endogenous cues from damaged cells or exogenous materials, signals commonly known as danger-associated molecular patterns (DAMPs). In this regard, the NLRP3 inflammasome stands out, owing to its ability to sense a wide range of structurally different molecular entities including crystalline materials, misfolded or aggregated proteins, metabolites, prosthetic implant wear debris, and certain materials found in the environment such as asbestos and silica particles [ 3 – 5 ] (Fig. 1 ). The NLRC4 inflammasome and AIM2 inflammasome are also activated to some extent by endogenous DAMPs [ 6 – 8 ]. The inflammatory responses induced by PAMPs or DAMPs can be either acute when the perturbation is rapidly resolved, and the homeostasis is restored, or chronic and pathologic when rapid clearance mechanisms fail. Finally, activating mutations in NLRP1 , NLRP3 , NLRC4 , or MEFV cause inflammasome assembly independently of PAMPs or DAMPs [ 9 – 15 ]. Fig. 1 Mechanisms of activation of the NLRP3 inflammasome. Activation of the NLRP3 inflammasome involves two steps. Induction of priming signals upon ligation of pathogen recognition receptors (PRRs) such as TLR4 and TLR2, and cytokine receptors including IL-1 receptor (IL-1R; positive feedback) and TNF receptor (TNFR). These signals induce the transcription of NLRP3 and pro-IL-1β through NF-κB; pro-IL-18 is constitutively expressed. Priming of NLRP3 can also be induced by its deubiquitination, independently of de novo protein synthesis (not depicted). pro-IL-1β mRNA are stabilized by p38α MAPK. Increased expression of NLRP3 enables the recruitment of pro-caspase-1 via ASC upon sensing of secondary signals, which are triggered by a wide range of stimuli including K + efflux, Ca 2+ influx, phagocytosis of microorganisms, and particulate materials (causing lysosome destabilization/rupture and release of cathepsins and reactive oxygen species (ROS)), and mitochondrial dysfunction. NLRP3 -activating mutations in the NACHT domain cause constitutive activation of this inflammasome. Proximity-induced reaction leads to auto-activation of caspase-1, which then processes pro-IL-1β and pro-IL-18 into IL-1β and IL-18, respectively. Caspase-1 also cleaves GSDMD into GSDMD-N-terminal (N-term) and GSDMD-C-terminal (C-term) fragments. GSDMD-N-term translocates to the plasma membranes where it oligomerizes and forms pores through which IL-1β and IL-18 are secreted. However, excessive pore formation causes pyroptosis, resulting in the release of not only IL-1β and IL-18, but also other mediators such as IL-1α, S100A8/9, and HMGB1. ARE, AU rich elements; ASC, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD; GSDMD, gasdermin D; HMGB1, high-mobility group box 1; IL-1, interleukin-1; LPS, lipopolysaccharide; NF-κB, nuclear factor kappa B; NLRP3, NLR family, pyrin domain containing 3; TLR, toll-like receptor; TNF-α, tumor necrosis factor-α. Stimulation of the noncanonical NLRP3 inflammasome also occurs secondarily to the activation of caspase-11, which also cleaves GSDMD Caspase-1 processes pro-interleukin-1β (pro-IL-1β) and pro-IL-18 into IL-1β and IL-18, respectively [ 16 ]. It also cleaves gasdermin D (GSDMD), generating an N-terminal fragment that translocates from the cytoplasm to the plasma membrane where it forms pores through which IL-1β and IL-18 are secreted [ 17 , 18 ]. However, excessive pore formation resulting from sustained activation of GSDMD in both infectious and sterile conditions compromises membrane integrity, and ultimately ruptures the cell, releasing pro-inflammatory cytoplasmic contents into the extracellular environment. This form of cell death, termed pyroptosis, is inflammatory and results in the recruitment of immune cells and the perpetuation of inflammation [ 19 , 20 ]. Caspase-8 and neutrophil elastase can also generate IL-1β and IL-18 whereas caspase-8, caspase-11 (ortholog of human caspase-4 and caspase-5), and neutrophil elastase efficiently process GSDMD [ 21 – 28 ]. Sustained exposure to supra-physiological levels of IL-1β and IL-18, ultimately, inflicts damage to multiple tissues including the skeleton. Coordinated actions of the osteoclasts and the osteoblasts are essential to maintain bone mass and quality. The osteoclasts remove the old or defective matrix, which is replenished fully by the osteoblasts; this tightly regulated process is known as bone coupling [ 29 ]. Several growth factors, including bone morphogenetic proteins (BMPs) and Wnts control the differentiation of the osteoblasts from mesenchymal stem cells whereas the osteoclasts differentiate from myeloid progenitors exposed to signals generated by macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) [ 30 , 31 ]. The osteoblast and osteoclast differentiation programs are antagonized and enhanced, respectively, by pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-1β. Excessive bone resorption by the osteoclasts at the expenses of bone formation by the osteoblasts in inflammatory conditions creates an imbalance, which over time leads to bone loss and increased fracture risk [ 32 ]. In this article, we review the role of the inflammasomes in bone resorption and highlight the collateral effects of these protein complexes on other skeletal cells. Mechanisms of bone resorption that are relevant to the inflammasomes IL-1β plays numerous roles in bone pathophysiology. It stimulates RANKL production by mesenchymal cells (e.g., stromal cells, osteoblasts, and osteocytes), synoviocytes, and T cells directly or indirectly through the regulation of IL-6, IL-17, and TNF-α expression [ 33 – 38 ]. The reciprocal regulation of IL-1β production by these cytokines and the reported RANKL-independent actions of IL-6 and TNF-α in osteoclast differentiation indicate that these responses are complex and multidirectional [ 39 , 40 ]. Irrespective of the hierarchy of the events, IL-1β and its effectors act in synergy with RANKL to promote osteoclast differentiation and activity while suppressing osteogenesis [ 32 ]. IL-1β also stimulates its own synthesis, a positive feedback mechanism that underlies the chronicity of inflammasome actions in bone diseases [ 33 , 41 ]. On the other hand, while pro-inflammatory actions of IL-18 in skin disorders [ 42 ] and infection-associated allergic diseases [ 43 ] are well described, the role of this cytokine in bone is ambiguous. Indeed, IL-18 can inhibit or stimulate bone resorption, depending on cell-contexts [ 44 – 46 ]. Secretion of IL-1β through GSDMD-assembled pores by live cells has been reported [ 18 , 26 ]. This phenomenon referred to as a hyper-reactive state occurs independently of pyroptosis and may be characteristic of diseases of low-grade inflammation as discussed later in this review. GSDMD pores have an inner diameter of 10–20 nm, which is much bigger than the diameter of mature IL-1β and IL-18 (approximately 5 nm) [ 17 , 20 , 47 – 49 ]. There is thus far no basis for such large pores to facilitate only the secretion of these cytokines, implying that molecules with smaller sizes such as eicosanoids, which are also important regulators of bone resorption may be secreted through GSDMD pores. On the other hand, pyroptosis is presumably prominent in diseases marked by chronic episodes of high-grade inflammation such as inflammasomopathies. In this context, IL-1β and IL-18 are concomitantly secreted alongside alarmins including IL-1α, S100A8/9, HMGB1 [ 50 , 51 ], and possibly lipid mediators such as eicosanoids [ 52 ]; this outcome may underlie the limited efficacy of IL-1 blockers in the treatment of bone diseases. Indeed, not only are these alarmins produced by myeloid cells, synovial cells, and osteoblasts [ 53 , 54 ], but they are also potent modulators of inflammation and osteoclastogenesis, regulating the expression of RANKL, TNF-α, IL-1β, and IL-6 [ 33 , 55 ]. Inflammasome signaling also leads to the cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) by caspase-7, a response that ultimately promotes the degradation of this negative regulator of osteoclast differentiation and bone resorption [ 56 ]. Thus, the inflammasomes are key players in the pathogenesis of inflammatory osteolysis. Understanding the biology of these signaling platforms is essential for the development of effective therapies targeting inflammatory bone loss. Widespread activities of the inflammasomes in inflammatory osteolysis Evidence suggests that the inflammasomes are implicated in a wide range of diseases of bone loss driven by sterile and non-sterile inflammation (Table 1 ). Table 1 Inflammasomes and their activators in inflammatory bone diseases Activators Disorders Description of the activators Inflammasomes PAMPs Periodontitis [[ 57 – 59 ] Porphyromonas gingivalis NLRP3, AIM2 Osteomyelitis [[ 60 – 62 ] Staphylococcus aureus NLRP3 Mutations CAPS [[ 63 – 79 ] Autosomal dominant NLRP3, NLRC4, NLRP12 MAS [[ 11 , 12 , 80 , 81 ] Autosomal dominant NLRC4 FMF [[ 82 , 83 ] Autosomal recessive Pyrin DAMPs Sterile CRMO [[ 22 , 23 ] Unknown NLRP3 Arthritis [[ 84 – 88 ] Self-DNA, other DAMPs? NLRP3, AIM2, others? Metabolic diseases, aging [[ 5 – 8 , 89 – 91 ] Purine metabolites, fatty acids, other DAMPs? NLRP3, NLRC4, AIM2, others? Wear debris osteolysis [[ 3 , 92 , 93 ] PMMA, CoCrMo, etc. NLRP3, AIM2 Crystal-induced arthropathies [[ 94 – 97 ] MSU crystals (gout), CPPD crystals (pseudogout), BCP crystals NLRP3 Cryopyrin-associated periodic syndromes Cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS), which include familial cold autoinflammatory syndrome (FCAS), Muckle–Wells syndrome (MWS), and neonatal-onset multisystem inflammatory disease (NOMID) are caused by autosomal dominant mutations in the NACHT domain of NLRP3 [ 63 – 65 , 98 ]. Additionally, myeloid-restricted somatic mosaicism and mutations in NLRP12 and NLRC4 may account for the inflammatory responses in CAPS patients negative for mutations in NLRP3 [ 66 ]. NLRP3 is believed to switch from a closed and inactive conformation to an open state in response to PAMP- or DAMP-induced cues; NLRP3 -activating mutations locked this protein in the active state, leading to the constitutive assembly of the inflammasome [ 67 ]. Common features of CAPS include recurring fever episodes, urticaria, conjunctivitis, and joint pain whereas central nervous system complications and arthropathies characterized by bone deformities, bulky epiphyses, leg length discrepancy, and short stature are hallmarks of NOMID, the most severe manifestation of these disorders [ 66 , 68 – 70 ]. Consistent with the tumor-like features of bony outgrowths, induced pluripotent stem cells from NOMID patients are more proliferative and exhibit higher differentiation potential than normal cells [ 71 ]. Epiphyseal abnormalities undoubtedly predispose NOMID patients to joint instability and subsequent development of osteoarthritis. It is worth noting that skeletal phenotyping is based on radiographic observations and limited histology that reveal heterogeneously calcified bone matrix, and severely disorganized and hypocellular growth plate [ 70 ]. Murine models of CAPS in which wild-type Nlrp3 alleles are replaced by murine or human alleles carrying mutations found in patients, reproduce several features of human disorders including early onset of systemic inflammation, skin and joint pathologies, and growth retardation. Cryopyrinopathies are in general more severe in rodents than in humans as mutant mice of all phenotypes (i.e., CAPS, MWS, and NOMID) exhibit short lifespan (3–4 weeks) [ 72 – 74 ]. NOMID mice in which NLRP3 is activated globally exhibit normal patterning of skeletal elements but display hypocellular epiphyses due to massive chondrocyte death, and disorganized growth plate matrix protruding towards the bone marrow cavity [ 73 ]. Unexpectedly, conditional activation of NLRP3 in myeloid cells but not in osteochondro-progenitors reproduces the abnormal cartilage features, suggesting that the phenotype is not chondrocyte autonomous [ 75 ]. CAPS mice also exhibit severe low bone mass, a phenotype that correlates with a massive expansion of osteoclast precursors, exuberant osteoclastogenesis, and increased osteoclast activity [ 41 , 73 , 75 – 77 ]. Thus, while the magnitude of bone resorption in CAPS patients is not known, this process is prominent and well characterized in mouse models. Systemic inflammation and multiple organ pathologies, including bone abnormalities, are entirely prevented in NOMID mice lacking IL-1 receptor [ 75 ]. However, persistent residual inflammation is reported in FCAS mice and MWS mice deficient in IL-1 and IL-18 signaling [ 78 , 79 ]. These findings align with clinical studies, which consistently show that epiphyseal lesions and outgrowths continue to expand for a significant number of NOMID patients on IL-1 biologics despite the resolution of disease-associated inflammatory symptoms [ 70 , 99 – 101 ]. Collectively, these observations suggest that IL-1β is not the primary driver of skeletal outcomes in CAPS, and that inflammasome-dependent responses other than IL-1β play a role in these disorders. This view is consistent with findings showing that levels of TNF-α remain elevated in certain CAPS patients on IL-1 blockers, and neutralization of TNF-α activity improves inflammatory endpoints in CAPS mice [ 78 ]. This view is further supported by recent evidence indicating that the pathogenesis of NOMID in mice is prevented by (i) genetic ablation of GSDMD and (ii) a novel inhibitor of the interactions of p38α MAPK and MAPK-activated kinase 2, which inhibits not only IL-1β, but also IL-6 and TNF-α [ 41 , 77 ]. Thus, multiple responses, including pyroptosis, contribute to inflammasomopathies. Macrophage activation syndrome The NLRC4 inflammasome senses bacterial type III and IV secretion systems and flagellin via NLR family apoptosis inhibitory proteins (NAIPs). As noted above, NLRC4 -activating mutations are found in certain FCAS patients. Moreover, recent evidence implicates the NLRC4 inflammasome in the pathogenesis of sterile inflammatory disorders as patients with NLRC4 gain-of-function mutations develop cytopenia, high ferritin levels, hemophagocytosis, and splenomegaly. These symptoms are associated with excessive levels of IL-18 and IL-1β, and recurring fever flares, a phenotype that is reminiscent of macrophage activation syndrome (MAS) [ 12 , 80 ]. MAS is a frequent complication of systemic juvenile idiopathic arthritis (sJIA), a disease that interferes with healthy skeletal development and bone mass acquisition [ 102 ]. Although IL-1β levels are in general lower in MAS compared with CAPS, IL-1 biologics are efficacious in the treatment of sJIA [ 103 , 104 ]. Consistent with the role of mutated NLRC4 in the development of joint pathologies, transgenic mice expressing constitutively active NLRC4 produce high levels of IL-1β and IL-18, and develop arthritis [ 81 ]. The NLRC4 inflammasome is also activated by nucleotide-derived metabolites (e.g., adenine and N-4-acetylcytidine) [ 6 ] and fatty acids (e.g., lysophosphatidylcholine and palmitate) [ 89 ] and is upregulated by bone-derived DAMPs during osteoclastogenesis [ 90 ]. An interplay between the NLRP3 and NLRC4 inflammasomes has been noted in these models of sterile inflammation as well as in response to Salmonella infection [ 105 , 106 ]. Familial Mediterranean fever MEFV encodes pyrin, which activates caspase-1 through ASC upon sensing post-translationally modified Rho GTPase [ 107 ]. These modifications include phosphorylation, ADP-ribosylation, and glycosylation and occur upon cell exposure to Clostridium toxins and in conditions of mevalonate kinase deficiency or proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 1 (PSTPIP1) gain-of-function [ 82 , 108 – 110 ]. Hyper-activation of the pyrin inflammasome by MEFV -activating mutations causes Familial Mediterranean fever (FMF), a disease that is characterized by high levels of IL-1β, IL-6, IL-8, and IL-12, recurring fever episodes, arthritis, and low bone mass [ 83 , 111 ]. FMF is the most prevalent monogenic autoinflammatory disorder; it affects over 100,000 persons worldwide and causes sporadic and chronic symptoms [ 98 ]. FMF mice develop severe systemic inflammation and exhibit massive cartilage and bone erosion [ 112 ]. These mice do not display systemic inflammatory symptoms upon deletion of GSDMD, IL-1 receptor, or ASC [ 112 , 113 ]. Arthritis Inflammasomes are activated in several autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis (RA) and ankylosing spondylitis (AS). Components of the NLRP3 inflammasomes and various cytokines including TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-7, and IL-17 are highly expressed in RA [ 84 , 114 ]. Specific interactions among these cytokines and other inflammatory mediators may drive systemic and focal osteolysis in arthritis [ 115 ]. Systemic arthritis and bone loss induced by TNF over-expression are abolished upon ablation of IL-1β signaling despite the presence of synovial inflammation, suggesting that the effects of TNF-α on bone are mediated by IL-1β [ 116 ]. These findings positioning IL-1β downstream of TNF-α are in line with the observation that TNF-α-induced RANKL production by murine stromal cells is dependent on IL-1β [ 85 , 117 ]. As noted above, the upregulation of TNF-α by IL-1β is also well known. Components of the inflammasomes, including NLRP3, ASC, and caspase-1 are upregulated in AS, a disease that is also associated with high levels of IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-23, and IL-17 [ 118 ]. Bone manifestations in AS include excessive focal bone formation in joints whereas pronounced trabecular bone loss occurs in vertebral bodies [ 119 ]. Various inflammasomes are assembled in mouse models of arthritis. For example, NLRP3 and AIM-2 are both upregulated in the synovium of IL-10-deficient mice exposed to antigen-induced arthritis, and osteoclast differentiation from bone marrow cells isolated from these mutant mice is blunted by the inhibitors of NLRP3 and AIM-2 inflammasomes [ 120 ]. Moreover, arthritis induced by DNase II deficiency, which is associated with accrual of self-DNA, is attenuated by AIM2 ablation [ 86 , 87 ]. The complexity of inflammasome functions is underscored by the observations that NLRP3, NLRP1, NLRC4, and caspase-1, but not ASC are dispensable for collagen-induced and antigen-induced arthritis [ 88 , 121 ]; yet NLRP3 is a key player in joint destruction in a mouse model of A20 deficiency, in which NLRC4 and AIM2 are expendable [ 122 ]. Thus, the role of the inflammasomes in experimental arthritis is mouse model-dependent. Osteomyelitis Defective innate immune defense mechanisms including the inflammasomes underlie the pathogenesis of periodontitis and osteomyelitis commonly caused by Porphyromonas gingivalis and Staphylococcus aureus , respectively. P. gingivalis –derived PAMPs such as LPS are potent activators of priming signals, which through TLR4 signaling drive the expression of several components of the inflammasomes including IL-1β, NLRP3, AIM2, and caspase-11 [ 57 , 58 ]. Accordingly, the massive alveolar bone destruction caused by P. gingivalis is attenuated upon loss of NLRP3 [ 59 ]. S. aureus bacterial products include peptidoglycans, hemolysins, bacterial lipoproteins, and Panton-Valentine leucocidin stimulate the inflammasomes through TLR2-mediated activation of NF-kB [ 123 ]. Moreover, some of these factors promote osteoclastogenesis [ 124 ]. The osteoblasts also express the NLRP3 inflammasome [ 60 ] though to lower levels compared with myeloid cells [ 73 ] and contribute to the pathogenesis of periodontitis and osteomyelitis [ 61 , 125 – 127 ]. Autoinflammatory reactions of unknown etiology causes confined chronic non-bacterial osteomyelitis (CNO) or systemic chronic recurrent multifocal osteomyelitis (CRMO). Components of the NLRP3 inflammasome are expressed in osteoclasts in bone specimens from CRMO patients [ 62 ]. Mice carrying an inactivating -mutation in the proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 2 gene ( Pstpip2 ) develop a phenotype reminiscent of CRMO, which is associated with over-production of IL-1β, enhanced osteoclastogenesis and bone resorption, responses that depend on IL-1 receptor and IL-1β, but not IL-1α, and are driven by neutrophils [ 21 , 22 ]. Neutrophils in CRMO mice over-produce IL-1β via redundant actions of caspase-8 and the NLRP3 inflammasome [ 23 ]. Metabolic bone diseases Inflammasomes have been linked to age- and menopause-related osteoporosis [ 6 , 90 , 91 ]. Estrogen profoundly affects the skeleton through various mechanisms including immunomodulation, suppressive effects on the expression of TNF-α and IL-1β, induction of osteoclast apoptosis through ERα, suppression of osteoclast differentiation, inhibition of RANKL production by osteoblasts, T and B cells, and stimulation of osteoprotegerin (OPG) expression [ 31 , 128 , 129 ]. Consistent with increased levels of pro-inflammatory cytokines in conditions of estrogen deficiency, blockade of TNF-α or IL-1β in post-menopausal patients leads to a decrease in the levels of bone resorption markers [ 130 ]. Accordingly, inhibition of TNF-α or deletion of NLRP3 protects against ovariectomy-induced bone loss in mice [ 90 , 131 ]. Aging is associated with low-grade chronic inflammation. This process is referred to as inflammaging and is associated with increased levels of circulating IL-18, IL-1 receptor antagonist, and IL-6 [ 132 ]. Inflammasome gene modules including NLRC4 and IL-1β are upregulated in older people compared with younger individuals; persistent expression of these genes correlates with the occurrence of age-related complications, including chronic production of inflammatory cytokines, metabolic dysfunction, and oxidative stress [ 6 ]. The NLRP3 inflammasome also modulates age-related inflammation in peripheral tissues and age-related bone loss in mice, though the underlying mechanisms are unknown [ 91 ]. The ability of the NLRP3 inflammasome to detect a wide variety of endogenous DAMPs is likely an important driver in the development of age- and metabolic-related pathologies. These DAMPs include crystalline cholesterol, extracellular ATP, purine and pyrimidine metabolites, and debris from damaged tissues [ 6 , 133 ]. For example, metabolites from the purine and pyrimidine pathways stimulate the NLRP3 and NLRC4 inflammasomes in THP-1 cells, activate human platelets and neutrophils in cultures, and promote hypertension and inflammation in mice [ 6 ]. The NLRP3 inflammasome may also be involved in hyper-multinucleation of murine osteoclasts caused by purinergic receptor P2X5 signaling [ 134 ]. We have shown that bone matrix degradation products regulate the NLRP3 and NLRC4 inflammasomes in cells of the osteoclast lineage [ 90 ]. Accordingly, Nlrp3 null mice are protected from bone loss induced by ovariectomy, sustained exposure to parathyroid hormone or RANKL. Treatment of mice with zoledronic acid inhibits inflammasome activation, thus reinforcing the view that endogenous DAMPs are released from the bone matrix during bone resorption, causing autocrine and paracrine effects on osteoclastogenesis [ 90 ]. Wear debris-induced osteolysis Wear particles from articulating prosthetic joint surfaces such as those from cobalt-chromium-molybdenum (CoCrMo) implants induce inflammatory responses that cause aseptic loosening as a result of uncontrolled osteolysis [ 135 ]. The osteolytic process is associated with the formation at the implant-bone interface of a cellular membrane enriched in cells of the monocyte-macrophage lineage [ 136 ]. Activation of the NF-kB pathway through TLR2 signaling by prosthetic debris promote not only the expression of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, but also priming signals for the NLRP3 and AIM2 inflammasomes. Macrophages can also phagocytose these particles; cellular accumulation of these non-degradable materials enhances the production of reactive oxygen species and the rupture of the phagosomes, which releases cathepsins in the cytoplasm, events that activate the inflammasomes [ 92 ]. The size and shape of CoCrMo alloys affect the amplitude of the inflammatory responses [ 93 ]. Thus, wear debris can provide both priming and assembly signals that lead to aberrant inflammasome activation. Consistent with the role of the NLRP3 inflammasome in bone damage induced by prosthetic particles, bone resorption induced by polymethylmethacrylate (PMMA) particles is reduced in the absence of caspase-1 [ 3 , 145 ]. Thus, both the metal and plastic components of the prostheses activate the inflammasomes. Crystal-induced arthropathies Endogenous crystalline particles are involved in the pathogenesis of arthropathies. For example, gouty arthritis is caused by precipitation of monosodium urate (MSU) crystals [ 94 ], calcium pyrophosphate deposition disease (CPDD) is driven by calcium pyrophosphate dihydrate (CPPD) crystals [ 94 ], and degenerative arthropathies such as osteoarthritis and Milwaukee shoulder are the result of abnormal accumulation of basic calcium phosphate (BCP) crystals [ 137 ]. Shared mechanisms among these diseases include phagocytosis of crystals by myeloid cells, an event that activates several inflammatory pathways including the inflammasomes, chondrocyte apoptosis, and matrix calcification [ 138 – 140 ]. Bone erosions in gout stems from continuous recruitment of macrophages to tophi [ 95 ]; sporadic CPDD is characterized by the presence of CPPD crystals in articular cartilage whereas patients with CPDD familial patterns have low bone mineral density though the extent to which bone resorption is impacted is not known [ 141 ]. BCP crystals, particularly hydroxyapatite crystals, promote osteoclast formation in vitro in NLRP3 inflammasome-dependent manner [ 90 , 96 , 142 ]. However, the actions of BCP on NLRP3 inflammasome-mediated skeletal pathology are controversial. Lack of components of the NLRP3 inflammasome prevents the development of neutrophil inflammation in the air-pouch model of synovitis and decreased pathology in the Ank-deficient model of arthritis [ 97 ]. By contrast, inflammatory responses induced by the injection of BCP crystals into the knees or intra-peritoneally are independent of the NLRP3 inflammasome [ 143 , 144 ]. Alternative processing of IL-1β by caspase-8 and pyroptosis may account for these discrepant observations. Cryopyrin-associated periodic syndromes Cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS), which include familial cold autoinflammatory syndrome (FCAS), Muckle–Wells syndrome (MWS), and neonatal-onset multisystem inflammatory disease (NOMID) are caused by autosomal dominant mutations in the NACHT domain of NLRP3 [ 63 – 65 , 98 ]. Additionally, myeloid-restricted somatic mosaicism and mutations in NLRP12 and NLRC4 may account for the inflammatory responses in CAPS patients negative for mutations in NLRP3 [ 66 ]. NLRP3 is believed to switch from a closed and inactive conformation to an open state in response to PAMP- or DAMP-induced cues; NLRP3 -activating mutations locked this protein in the active state, leading to the constitutive assembly of the inflammasome [ 67 ]. Common features of CAPS include recurring fever episodes, urticaria, conjunctivitis, and joint pain whereas central nervous system complications and arthropathies characterized by bone deformities, bulky epiphyses, leg length discrepancy, and short stature are hallmarks of NOMID, the most severe manifestation of these disorders [ 66 , 68 – 70 ]. Consistent with the tumor-like features of bony outgrowths, induced pluripotent stem cells from NOMID patients are more proliferative and exhibit higher differentiation potential than normal cells [ 71 ]. Epiphyseal abnormalities undoubtedly predispose NOMID patients to joint instability and subsequent development of osteoarthritis. It is worth noting that skeletal phenotyping is based on radiographic observations and limited histology that reveal heterogeneously calcified bone matrix, and severely disorganized and hypocellular growth plate [ 70 ]. Murine models of CAPS in which wild-type Nlrp3 alleles are replaced by murine or human alleles carrying mutations found in patients, reproduce several features of human disorders including early onset of systemic inflammation, skin and joint pathologies, and growth retardation. Cryopyrinopathies are in general more severe in rodents than in humans as mutant mice of all phenotypes (i.e., CAPS, MWS, and NOMID) exhibit short lifespan (3–4 weeks) [ 72 – 74 ]. NOMID mice in which NLRP3 is activated globally exhibit normal patterning of skeletal elements but display hypocellular epiphyses due to massive chondrocyte death, and disorganized growth plate matrix protruding towards the bone marrow cavity [ 73 ]. Unexpectedly, conditional activation of NLRP3 in myeloid cells but not in osteochondro-progenitors reproduces the abnormal cartilage features, suggesting that the phenotype is not chondrocyte autonomous [ 75 ]. CAPS mice also exhibit severe low bone mass, a phenotype that correlates with a massive expansion of osteoclast precursors, exuberant osteoclastogenesis, and increased osteoclast activity [ 41 , 73 , 75 – 77 ]. Thus, while the magnitude of bone resorption in CAPS patients is not known, this process is prominent and well characterized in mouse models. Systemic inflammation and multiple organ pathologies, including bone abnormalities, are entirely prevented in NOMID mice lacking IL-1 receptor [ 75 ]. However, persistent residual inflammation is reported in FCAS mice and MWS mice deficient in IL-1 and IL-18 signaling [ 78 , 79 ]. These findings align with clinical studies, which consistently show that epiphyseal lesions and outgrowths continue to expand for a significant number of NOMID patients on IL-1 biologics despite the resolution of disease-associated inflammatory symptoms [ 70 , 99 – 101 ]. Collectively, these observations suggest that IL-1β is not the primary driver of skeletal outcomes in CAPS, and that inflammasome-dependent responses other than IL-1β play a role in these disorders. This view is consistent with findings showing that levels of TNF-α remain elevated in certain CAPS patients on IL-1 blockers, and neutralization of TNF-α activity improves inflammatory endpoints in CAPS mice [ 78 ]. This view is further supported by recent evidence indicating that the pathogenesis of NOMID in mice is prevented by (i) genetic ablation of GSDMD and (ii) a novel inhibitor of the interactions of p38α MAPK and MAPK-activated kinase 2, which inhibits not only IL-1β, but also IL-6 and TNF-α [ 41 , 77 ]. Thus, multiple responses, including pyroptosis, contribute to inflammasomopathies. Macrophage activation syndrome The NLRC4 inflammasome senses bacterial type III and IV secretion systems and flagellin via NLR family apoptosis inhibitory proteins (NAIPs). As noted above, NLRC4 -activating mutations are found in certain FCAS patients. Moreover, recent evidence implicates the NLRC4 inflammasome in the pathogenesis of sterile inflammatory disorders as patients with NLRC4 gain-of-function mutations develop cytopenia, high ferritin levels, hemophagocytosis, and splenomegaly. These symptoms are associated with excessive levels of IL-18 and IL-1β, and recurring fever flares, a phenotype that is reminiscent of macrophage activation syndrome (MAS) [ 12 , 80 ]. MAS is a frequent complication of systemic juvenile idiopathic arthritis (sJIA), a disease that interferes with healthy skeletal development and bone mass acquisition [ 102 ]. Although IL-1β levels are in general lower in MAS compared with CAPS, IL-1 biologics are efficacious in the treatment of sJIA [ 103 , 104 ]. Consistent with the role of mutated NLRC4 in the development of joint pathologies, transgenic mice expressing constitutively active NLRC4 produce high levels of IL-1β and IL-18, and develop arthritis [ 81 ]. The NLRC4 inflammasome is also activated by nucleotide-derived metabolites (e.g., adenine and N-4-acetylcytidine) [ 6 ] and fatty acids (e.g., lysophosphatidylcholine and palmitate) [ 89 ] and is upregulated by bone-derived DAMPs during osteoclastogenesis [ 90 ]. An interplay between the NLRP3 and NLRC4 inflammasomes has been noted in these models of sterile inflammation as well as in response to Salmonella infection [ 105 , 106 ]. Familial Mediterranean fever MEFV encodes pyrin, which activates caspase-1 through ASC upon sensing post-translationally modified Rho GTPase [ 107 ]. These modifications include phosphorylation, ADP-ribosylation, and glycosylation and occur upon cell exposure to Clostridium toxins and in conditions of mevalonate kinase deficiency or proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 1 (PSTPIP1) gain-of-function [ 82 , 108 – 110 ]. Hyper-activation of the pyrin inflammasome by MEFV -activating mutations causes Familial Mediterranean fever (FMF), a disease that is characterized by high levels of IL-1β, IL-6, IL-8, and IL-12, recurring fever episodes, arthritis, and low bone mass [ 83 , 111 ]. FMF is the most prevalent monogenic autoinflammatory disorder; it affects over 100,000 persons worldwide and causes sporadic and chronic symptoms [ 98 ]. FMF mice develop severe systemic inflammation and exhibit massive cartilage and bone erosion [ 112 ]. These mice do not display systemic inflammatory symptoms upon deletion of GSDMD, IL-1 receptor, or ASC [ 112 , 113 ]. Arthritis Inflammasomes are activated in several autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis (RA) and ankylosing spondylitis (AS). Components of the NLRP3 inflammasomes and various cytokines including TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-7, and IL-17 are highly expressed in RA [ 84 , 114 ]. Specific interactions among these cytokines and other inflammatory mediators may drive systemic and focal osteolysis in arthritis [ 115 ]. Systemic arthritis and bone loss induced by TNF over-expression are abolished upon ablation of IL-1β signaling despite the presence of synovial inflammation, suggesting that the effects of TNF-α on bone are mediated by IL-1β [ 116 ]. These findings positioning IL-1β downstream of TNF-α are in line with the observation that TNF-α-induced RANKL production by murine stromal cells is dependent on IL-1β [ 85 , 117 ]. As noted above, the upregulation of TNF-α by IL-1β is also well known. Components of the inflammasomes, including NLRP3, ASC, and caspase-1 are upregulated in AS, a disease that is also associated with high levels of IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-23, and IL-17 [ 118 ]. Bone manifestations in AS include excessive focal bone formation in joints whereas pronounced trabecular bone loss occurs in vertebral bodies [ 119 ]. Various inflammasomes are assembled in mouse models of arthritis. For example, NLRP3 and AIM-2 are both upregulated in the synovium of IL-10-deficient mice exposed to antigen-induced arthritis, and osteoclast differentiation from bone marrow cells isolated from these mutant mice is blunted by the inhibitors of NLRP3 and AIM-2 inflammasomes [ 120 ]. Moreover, arthritis induced by DNase II deficiency, which is associated with accrual of self-DNA, is attenuated by AIM2 ablation [ 86 , 87 ]. The complexity of inflammasome functions is underscored by the observations that NLRP3, NLRP1, NLRC4, and caspase-1, but not ASC are dispensable for collagen-induced and antigen-induced arthritis [ 88 , 121 ]; yet NLRP3 is a key player in joint destruction in a mouse model of A20 deficiency, in which NLRC4 and AIM2 are expendable [ 122 ]. Thus, the role of the inflammasomes in experimental arthritis is mouse model-dependent. Osteomyelitis Defective innate immune defense mechanisms including the inflammasomes underlie the pathogenesis of periodontitis and osteomyelitis commonly caused by Porphyromonas gingivalis and Staphylococcus aureus , respectively. P. gingivalis –derived PAMPs such as LPS are potent activators of priming signals, which through TLR4 signaling drive the expression of several components of the inflammasomes including IL-1β, NLRP3, AIM2, and caspase-11 [ 57 , 58 ]. Accordingly, the massive alveolar bone destruction caused by P. gingivalis is attenuated upon loss of NLRP3 [ 59 ]. S. aureus bacterial products include peptidoglycans, hemolysins, bacterial lipoproteins, and Panton-Valentine leucocidin stimulate the inflammasomes through TLR2-mediated activation of NF-kB [ 123 ]. Moreover, some of these factors promote osteoclastogenesis [ 124 ]. The osteoblasts also express the NLRP3 inflammasome [ 60 ] though to lower levels compared with myeloid cells [ 73 ] and contribute to the pathogenesis of periodontitis and osteomyelitis [ 61 , 125 – 127 ]. Autoinflammatory reactions of unknown etiology causes confined chronic non-bacterial osteomyelitis (CNO) or systemic chronic recurrent multifocal osteomyelitis (CRMO). Components of the NLRP3 inflammasome are expressed in osteoclasts in bone specimens from CRMO patients [ 62 ]. Mice carrying an inactivating -mutation in the proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 2 gene ( Pstpip2 ) develop a phenotype reminiscent of CRMO, which is associated with over-production of IL-1β, enhanced osteoclastogenesis and bone resorption, responses that depend on IL-1 receptor and IL-1β, but not IL-1α, and are driven by neutrophils [ 21 , 22 ]. Neutrophils in CRMO mice over-produce IL-1β via redundant actions of caspase-8 and the NLRP3 inflammasome [ 23 ]. Metabolic bone diseases Inflammasomes have been linked to age- and menopause-related osteoporosis [ 6 , 90 , 91 ]. Estrogen profoundly affects the skeleton through various mechanisms including immunomodulation, suppressive effects on the expression of TNF-α and IL-1β, induction of osteoclast apoptosis through ERα, suppression of osteoclast differentiation, inhibition of RANKL production by osteoblasts, T and B cells, and stimulation of osteoprotegerin (OPG) expression [ 31 , 128 , 129 ]. Consistent with increased levels of pro-inflammatory cytokines in conditions of estrogen deficiency, blockade of TNF-α or IL-1β in post-menopausal patients leads to a decrease in the levels of bone resorption markers [ 130 ]. Accordingly, inhibition of TNF-α or deletion of NLRP3 protects against ovariectomy-induced bone loss in mice [ 90 , 131 ]. Aging is associated with low-grade chronic inflammation. This process is referred to as inflammaging and is associated with increased levels of circulating IL-18, IL-1 receptor antagonist, and IL-6 [ 132 ]. Inflammasome gene modules including NLRC4 and IL-1β are upregulated in older people compared with younger individuals; persistent expression of these genes correlates with the occurrence of age-related complications, including chronic production of inflammatory cytokines, metabolic dysfunction, and oxidative stress [ 6 ]. The NLRP3 inflammasome also modulates age-related inflammation in peripheral tissues and age-related bone loss in mice, though the underlying mechanisms are unknown [ 91 ]. The ability of the NLRP3 inflammasome to detect a wide variety of endogenous DAMPs is likely an important driver in the development of age- and metabolic-related pathologies. These DAMPs include crystalline cholesterol, extracellular ATP, purine and pyrimidine metabolites, and debris from damaged tissues [ 6 , 133 ]. For example, metabolites from the purine and pyrimidine pathways stimulate the NLRP3 and NLRC4 inflammasomes in THP-1 cells, activate human platelets and neutrophils in cultures, and promote hypertension and inflammation in mice [ 6 ]. The NLRP3 inflammasome may also be involved in hyper-multinucleation of murine osteoclasts caused by purinergic receptor P2X5 signaling [ 134 ]. We have shown that bone matrix degradation products regulate the NLRP3 and NLRC4 inflammasomes in cells of the osteoclast lineage [ 90 ]. Accordingly, Nlrp3 null mice are protected from bone loss induced by ovariectomy, sustained exposure to parathyroid hormone or RANKL. Treatment of mice with zoledronic acid inhibits inflammasome activation, thus reinforcing the view that endogenous DAMPs are released from the bone matrix during bone resorption, causing autocrine and paracrine effects on osteoclastogenesis [ 90 ]. Wear debris-induced osteolysis Wear particles from articulating prosthetic joint surfaces such as those from cobalt-chromium-molybdenum (CoCrMo) implants induce inflammatory responses that cause aseptic loosening as a result of uncontrolled osteolysis [ 135 ]. The osteolytic process is associated with the formation at the implant-bone interface of a cellular membrane enriched in cells of the monocyte-macrophage lineage [ 136 ]. Activation of the NF-kB pathway through TLR2 signaling by prosthetic debris promote not only the expression of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, but also priming signals for the NLRP3 and AIM2 inflammasomes. Macrophages can also phagocytose these particles; cellular accumulation of these non-degradable materials enhances the production of reactive oxygen species and the rupture of the phagosomes, which releases cathepsins in the cytoplasm, events that activate the inflammasomes [ 92 ]. The size and shape of CoCrMo alloys affect the amplitude of the inflammatory responses [ 93 ]. Thus, wear debris can provide both priming and assembly signals that lead to aberrant inflammasome activation. Consistent with the role of the NLRP3 inflammasome in bone damage induced by prosthetic particles, bone resorption induced by polymethylmethacrylate (PMMA) particles is reduced in the absence of caspase-1 [ 3 , 145 ]. Thus, both the metal and plastic components of the prostheses activate the inflammasomes. Crystal-induced arthropathies Endogenous crystalline particles are involved in the pathogenesis of arthropathies. For example, gouty arthritis is caused by precipitation of monosodium urate (MSU) crystals [ 94 ], calcium pyrophosphate deposition disease (CPDD) is driven by calcium pyrophosphate dihydrate (CPPD) crystals [ 94 ], and degenerative arthropathies such as osteoarthritis and Milwaukee shoulder are the result of abnormal accumulation of basic calcium phosphate (BCP) crystals [ 137 ]. Shared mechanisms among these diseases include phagocytosis of crystals by myeloid cells, an event that activates several inflammatory pathways including the inflammasomes, chondrocyte apoptosis, and matrix calcification [ 138 – 140 ]. Bone erosions in gout stems from continuous recruitment of macrophages to tophi [ 95 ]; sporadic CPDD is characterized by the presence of CPPD crystals in articular cartilage whereas patients with CPDD familial patterns have low bone mineral density though the extent to which bone resorption is impacted is not known [ 141 ]. BCP crystals, particularly hydroxyapatite crystals, promote osteoclast formation in vitro in NLRP3 inflammasome-dependent manner [ 90 , 96 , 142 ]. However, the actions of BCP on NLRP3 inflammasome-mediated skeletal pathology are controversial. Lack of components of the NLRP3 inflammasome prevents the development of neutrophil inflammation in the air-pouch model of synovitis and decreased pathology in the Ank-deficient model of arthritis [ 97 ]. By contrast, inflammatory responses induced by the injection of BCP crystals into the knees or intra-peritoneally are independent of the NLRP3 inflammasome [ 143 , 144 ]. Alternative processing of IL-1β by caspase-8 and pyroptosis may account for these discrepant observations. Therapeutic perspective Anti-resorptive drugs such as bisphosphonates and denosumab are efficacious in the prevention of inflammation-associated bone fractures, but they do not impact the course of inflammation (Fig. 2 ). Thus, inhibition of osteoclast differentiation and/or activity is not sufficient to arrest the damage to the bone surrounding soft tissues such as the synovium in conditions of high-grade inflammation. On the other hand, biologics are successfully used in the clinic to temper down inflammation (Fig. 2 ). However, biologics have their shortcomings such as high costs, the requirement for parenteral delivery, the development of resistance, and immunosuppression. In addition, the efficacy of these drugs is restrained by redundancy among signaling pathways as they target specific inflammatory instigators. Thus, there is still an unmet medical need for the development of adequate therapeutic strategies; in-depth understanding of the mechanism of action of key inflammatory pathways is required to achieve this goal. Recent breakthroughs revealing that aberrant activities of the inflammasomes cause pyroptosis, a lytic form of cell death that concomitantly unleashes several inflammatory mediators to the extracellular milieu offer novel perspectives for drug discovery. For example, strategies aimed at preventing pyroptosis through selective blockade of individual components of the inflammasomes such as caspase-1, NLRP3, or GSDMD or inhibiting signaling nodes that integrate several inflammatory cues such as p38 MAPK are being fiercely explored. Fig. 2 Inflammatory osteolysis and therapeutic interventions. Cytokines (e.g., IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17, and TNF-α) stimulate bone resorption directly, acting on the osteoclast lineage or indirectly by inducing RANKL expression by mesenchymal cells, T cells, and B cells. These cytokines also inhibit bone formation. Bone resorption is directly blocked by anti-resorptive drugs such as bisphosphonates and denosumab or indirectly by biologics targeting IL-1α/IL-1β, IL-6, IL-17, or TNF-α. In conditions of low-grade inflammation, bone resorption is amplified by DAMPs that are released from bone matrix

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2870264/

A model-adjusted space-time scan statistic with an application to syndromic surveillance.

The space-time scan statistic is often used to identify incident disease clusters. We introduce a method to adjust for naturally occurring temporal trends or geographical patterns in illness. The space-time scan statistic was applied to reports of lower respiratory complaints in a large group practice. We compared its performance with unadjusted populations from: (1) the census, (2) group-practice membership counts, and on adjustments incorporating (3) day of week, month, and holidays; and (4) additionally, local history of illness. Using a nominal false detection rate of 5%, incident clusters during 1 year were identified on 26, 22, 4 and 2% of days for the four populations respectively. We show that it is important to account for naturally occurring temporal and geographic trends when using the space-time scan statistic for surveillance. The large number of days with clusters renders the census and membership approaches impractical for public health surveillance. The proposed adjustment allows practical surveillance.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6485345/

The increasing value of plant-derived pharmaceutical proteins

The production of pharmaceutical proteins in plants is maturing, as shown by the recent approval of innovative products and the latest studies that showcase plant-based production systems using technologies and approaches that are well established in other fields. These include host cell genome engineering, medium optimization, scalable unit operations for downstream processing, bioprocess optimization and detailed cost analysis. Product-specific benefits of plant-based systems have also been exploited, including bioencapsulation and the mucosal delivery of minimally-processed topical and oral products with a lower entry barrier than pharmaceuticals for injection. Early success stories spearheaded by the FDA approval of Elelyso developed by Protalix have revitalized the field and further interest has been fueled by the production of experimental Ebola treatments in plants.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4514308/

Intradermal vaccination using the novel microneedle device MicronJet600: Past, present, and future

Intradermal immunization has become a forefront of vaccine improvement, both scientifically and commercially. Newer technologies are being developed to address the need to reduce the dose required for vaccination and to improve the reliability and ease of injection, which have been major hurdles in expanding the number of approved vaccines using this route of administration. In this review, 7 y of clinical experience with a novel intradermal delivery device, the MicronJet600, which is a registered hollow microneedle that simplifies the delivery of liquid vaccines, are summarized. This device has demonstrated both significant dose-sparing and superior immunogenicity in various vaccine categories, as well as in diverse subject populations and age groups. These studies have shown that intradermal delivery using this device is safe, effective, and preferred by the subjects. Comparison with other intradermal devices and potential new applications for intradermal delivery that could be pursued in the future are also discussed.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8285224/

Prophylactic vaccine delivery systems against epidemic infectious diseases

Graphical abstract 1 Introduction Epidemic infections, such as cholera, malaria, and the sudden outbreak of COVID-19, cause global life threats and socioeconomic recession. One of the most devastating pandemics was the Black Death, an infection caused by Yersinia pestis , which killed over 75 million people in 1350. At present, the world is still in the midst of the COVID-19 pandemic, with 3,398,302 COVID-19-related deaths recorded as of May 19, 2021 ( https://covid19.who.int/ ). Furthermore, antibiotic resistance leads to the ineffectiveness of traditional antibacterial treatments, and nearly half a million new cases of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) occur worldwide [1] . Among coping strategies for emerging infectious diseases, preventive vaccination is a crucial strategy [2] and the only one with wide and thorough effects on the public health. For example, since 2000, vaccination has reduced the reported incidence of measles by 83%, thereby preventing over 20 million deaths [3] . Vaccines work by training and utilizing the body's immune system to recognize and fight the pathogens. However, the high infection rates, widespread transmission, or high fatal ratio of certain epidemic germs raised huge challenges for the design of prophylactic vaccines. Vaccines have evolved from the live-attenuated or inactivated vaccines to the subunit/peptide vaccines. Regardless of the safety issues, the live-attenuated and inactivated vaccines, which are nanoparticles themselves [2] , are ready to be captured and processed by antigen-presenting cells (APCs), including dendritic cells (DCs), macrophages, and B cells, resulting in an efficient immune response. In contrast, subunit vaccines or recombinant vaccines are characterized by improved safety, but much weaker immunogenicity. To break the bottleneck of previous vaccine types, advanced delivery systems (e.g., micro/nano delivery) exhibiting both high efficacy and safety are greatly required. Such systems will likely help to catalyze novel candidate vaccines toward clinical testing at an unprecedented speed. For example, lipid nanoparticles dictated the success of the mRNA vaccines in 2020, making an enormous contribution to control the spread of COVID-19 at a global level. The advantages of vaccine delivery systems have been well documented in recent reviews. For example, Ding et al. [4] summarized the nanosystems with superior therapeutic or preventive effects, providing an important clue on maintenance of our well-being by exploiting the immunomodulatory property of nanomaterials. Other works also referred to using nanotechnology or materials science approaches with delivery systems [5] , [6] . In addition, vaccine delivery systems focusing on tackling a particular infectious disease (e.g., COVID-19) [7] or cancer [8] were reviewed. Nevertheless, there has been no systematic summary of advanced delivery systems and design concepts for prophylactic vaccines for a wide range of epidemic infectious diseases. Taking into account the diverse species and pathogenic mechanisms of infection pathogens, the protection efficacy of different systems against the same infection has not been sufficiently compared. In addition, the requirements and priorities of the delivery systems for different infectious diseases or stages are also case by case. Obtaining such data would greatly support designing the optimal delivery vectors for specific infectious diseases. In this review, we provide an overview of the major or epidemic infectious diseases (pneumonia, diarrhea, candidiasis, malaria, and others) caused by bacteria, viruses, fungi, and parasites. We also list advanced delivery systems against different infectious diseases and compare their protective efficacy from different aspects. Moreover, we include the current vaccines and vaccine delivery systems that are either newly licensed (e.g., COVID-19 vaccines) or close to licensure. In particular, we highlight the advanced delivery systems with high efficiency, cross-protection, or long-term protection against epidemic pathogens. 2 Bacterial infectious diseases and advanced delivery systems 2.1 Respiratory infectious diseases and advanced delivery systems Respiratory infections represent a serious health problem worldwide that mainly affects children, older people, and immunocompromised individuals. Pneumonia vaccines (e.g., 23-valent polysaccharide vaccines, 13-valent polysaccharide conjugate vaccines) have achieved great success worldwide. Nevertheless, the existence of a variety of serotypes (>95) of S. pneumoniae makes the capsular polysaccharide (CPS)-based vaccines unable to provide broad protection [9] , while the cost of preparing vaccines containing all serotypes is very high. In addition, there may still be undetected serotypes [10] . In this case, effective delivery systems of proteinaceous antigens have been developed for the prevention of pneumonia. In addition to the delivery efficacy, a combined mucosal and systemic immune response is also appreciated for pneumonia vaccines [11] , which not only requires novel delivery design but also a specific administration route (e.g., noninvasive mucosal routes). At present, there are a variety of delivery systems for pulmonary infectious diseases and they have shown good results ( Table 1 ). Table 1 Effect of vaccines with delivery systems against pulmonary infectious diseases. Pathogenic bacteria Delivery system Antigen(s) Adjuvants used Route Animal species Protection after challenge Ref. S. pneumoniae cCHP Nanogel PspA — i.n. Mice 100% of animals surviving [12] Hybrid biological-biomaterial vector (PBAE and bacterial core) PspA or PspA b — s.c. Mice 100% of animals surviving [13] Liposomes Polysaccharide (Serotypes 3) — i.n. Mice No results [14] LEPS PncO, GlpO, and polysaccharide (Serotypes 19F, 11A, and 35C) — s.c. Mice 100% of animals surviving [15] Chitosan PsaA — i.n. Mice 100% of animals surviving [16] Chitosan PsaA (DNA) — i.n. Mice Decreased bacterial colonization in nasopharynx [17] Polyanhydride nanoparticles PspA — s.c. Mice No results [18] PLA microparticles PspA — i.m. Mice No results [19] NP/NCMP PspA4Pro — PM Mice 67% of animals surviving [20] L. lactis , L. casei , L. plantarum , and L. helveticus PsaA (Surface) b — i.n. Mice Decreased bacterial colonization in the nasal mucosa [21] L. casei PspA b — i.n. Mice 33% of animals surviving [22] L. casei PspA5 (Cytoplasm) b or PspC (Cytoplasm) b — Mice PspA5: 40% of animals surviving; PspC: 20% of animals surviving [23] L. casei PspC (Surface or Cytoplasm) b — i.n. Mice Decreased bacterial colonization in the nasopharynx [24] L. lactis PspA b — i.n. Mice 40% of animals surviving [25] L. lactis PppA b — i.n. Mice 60% of adults and 70% of young mice surviving [26] L. lactis (GEM) or live L. lactis PppA or PppA b — i.n. or oral Mice Decreased bacterial number in the lungs and blood [27] L. lactis (GEM) IgA1p, PpmA, and SlrA — i.n. Mice Decreased bacterial number in the lungs, blood, and nose from trivalent vaccine and the divalent formulation containing SlrA and IgA1p [28] VLP (Qβ) TS3 and TS14 (chemically synthesized two kinds of capsular polysaccharides repeated units) — i.m. Mice TS14: 90% of animals surviving, compared with 66% of controls; TS3: 95% of animals surviving, compared with 40% of controls [29] VLP (HBsAg) Capsular polysaccharide 33F — s.c. Mice No results [30] K. pneumoniae OMVs OMV components — i.p. Mice 100% of animals surviving [31] BN-OMVs OMV components — s.c. Mice 100% of animals surviving [32] Alginate microparticles LPS of K. pneumoniae O1 serotype — i.m., i.t. a , or i.n. Mice Decreased bacterial loading in the lungs [33] B. pertussis OMVs OMV components — i.p. or i.n. a Mice Decreased bacterial colonization in the lungs [34] OMVs OMV components — s.c. Mice Decrease bacterial colonization in the lungs; slightly faster than that of wPV OMVs OMV components — PM a or s.c. Mice Decreased bacterial colonization in the lungs, trachea, and nose [35] OMVs deriving from B. parapertussis OMV components — i.p. Mice Cross-protection [36] Lipid A-modified OMVs OMV components — i.n. Mice Decreased bacterial counts in the lungs [37] L. acid bacteria (GEM) PTd, FHA, and PRN — i.p. or i.n. a Mice Decreased bacterial counts in the lungs and trachea (but not reaching statistical significance compared with antigen alone) [38] PLGA nano/microparticle PTd — s.c. Mice Decreased bacterial counts in the lungs [39] PLG nano or microparticle PTd and FHA — Oral, i.p. a , i.m. a , or s.c. Mice Decrease bacterial counts in the lungs [40] Haemophilus influenzae type b (Hib) Chitosan hydrogel (ViscoGel) a commercial Hib conjugate vaccine (Act-Hib) — s.c. or i.m. Mice No results [41] VLP (HBsAg) PRP polysaccharide — s.c. Mice No results [42] Mycobacterium tuberculosis Chitosan Esat-6 three T cell epitopes (Esat-6/3e) and fms-like tyrosine kinase 3 ligand (FL) genes (DNA) — i.m. prime (Esat-6/3e-FL) and i.n. boost (Esat-6/3e) Mice Decreased bacterial counts in the lungs and spleens [43] Chitosan Mycobacterium lipids — i.p. Mice No results [44] Mycobacterium bovis Liposome Fusion of antigen 85b and Esat-6 — s.c. Mice Decreased bacterial counts in the lungs and spleen [45] a. The better or the best route to achieve protection; b. Constructed in an expression vector; i.n., intranasal; s.c., subcutaneous; i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; i.t., intratracheal; PM, pulmonary; —, without added adjuvant. 2.1.1 S. pneumoniae S. pneumoniae is a global endemic pathogen causing a wide range of clinical diseases, such as pneumonia, meningitis, and sepsis, which frequently lead to death among children all over the world, especially in developing countries [46] . Colonization with S. pneumoniae in humans is universal [47] ; however, it provides an opportunity for the remaining serotypes to establish residence and progress to virulence [48] , [49] . In addition to direct infection, the bacteria usually exist in the form of biofilm, and some destructive events, such as viral infection, can prompt the release of a virulent subpopulation of bacteria to the lungs, blood, middle ear, and other parts of the body, causing the aforementioned diseases [50] , [51] . Therefore, high levels of IgG antibodies produced by humoral immunity are very important for invasive infections, and antigen-specific sIgA antibodies are the key to prevention of S. pneumoniae colonization of the upper respiratory tract. Various delivery vehicles (e.g., polymers, virus-like particles (VLPs), L. lactis , liposomes) have been used to deliver S. pneumoniae protein or glycan antigens, which showed a strong ability to prevent bacterial invasive infections and inhibit the colonization of the respiratory tract ( Table 1 ). Among them, some vaccine formulations offered universal pneumococcal disease prevention. For example, Jones et al. proposed a vaccine platform through the liposomal encapsulation of polysaccharides (LEPS) technology. The completed LEPS vehicle (about 300 nm in size) was coupled with the PncO and GlpO protein antigens (identified through an antigen discovery and validation model that selectively targeted pneumococci virulence transition [52] ) for the liposomal containment of polysaccharides (serotypes 19F, 11A, and 35C). Thus, this vaccine not only prevents the colonization of the most aggressive S. pneumoniae serotypes, but it also restricts virulence transition [15] . Since pneumonia vaccines are often used in children and older adults, the safety and immune activation ability of the delivery carriers need to be greater. Thus, we further focused on the latest several delivery systems that can produce the best protective effect. Nanogel It has been reported that a self-assembled nanosized hydrogel (nanogel) containing a cationic type of cholesteryl group-bearing pullulan (cCHP) can be used as a vaccine delivery system [53] , [54] , [55] . This nanogel could effectively transfer antigen to nasal epithelial cells and dendritic cells (DC) under the basement membrane and induce antigen-specific immune response as a non-adjuvanted vaccine ( Fig. 1 ). After loading with a single protein antigen PspA, both specific IgG levels in the serum and bronchial fluids and IgA levels in the nasal fluid were significantly elevated in nasally administered mice [12] , and all of the responses were involved in establishing protective immunity against pneumococci [56] , [57] , [58] , [59] . Further, a study in rhesus macaques revealed that the cCHP-based pneumococcal vaccine induced significantly elevated PspA-specific IgG and IgA levels and kept them for a long time [60] . Moreover, positron emission tomography (PET) analysis combined with magnetic resonance imaging (MRI) has confirmed that the cCHP nanogel vaccine is not deposited in the olfactory bulbs and brains in macaques [60] , suggesting that it is also safe to use as a nasal vaccine in humans. Fig. 1 Application of cCHP nanogel as nasal immune delivery system via nasal route [61] . cCHP is composed of a cholesteryl group-bearing pullulan (CHP) with a cationic amino group. cCHP nanogels can encapsulate proteins in the internal space through hydrophobic interactions and effectively retain them in the negatively charged nasal mucosa. Hybrid biological-biomaterial vector Yi et al. have reported a combined delivery device named hybrid biological-biomaterial vector, which consists of a bacterial core electrostatically coated with a cationic polymer (a mannosylated poly (β-amino ester) (PBAE)) [62] . The biological portion of the vector is a bacterial cell (live or dead), containing natural adjuvant properties, and it is beneficial for passive targeting of phagocytic APCs ( Fig. 2 ). The vector's composition and the surface characteristics endowed by the mannosylated PBAE engage APC receptors and enhance the uptake upon vector administration. After subcutaneous injection of the vector expressing pneumonia PspA protein antigen in mice, a strong specific immune response providing a wide range of protection against 10 different clinical S. pneumoniae was induced. Moreover, the localization of PspA in the cytoplasm could provide a stronger immune protection effect than that in the periplasm or on the surface of bacteria [13] . As for the combination of biomaterial and biological components, each has its own antigen delivery characteristics and plays a role in the immune process. Moreover, such synergy is conducive for obtaining the best immune effects. In addition, E. coli can be further modified by genetic engineering to be more suitable for antigen delivery. Because the antigen is loaded with bacterial vectors, it provides a variety of possibilities for using different antigen locations and different loading forms, such as proteins and nucleic acids. Fig. 2 Construction of a hybrid biological-biomaterial vector [62] . (A) Schematic diagram of the hybrid biological-biomaterial vector preparation. (B) Scanning electron microscopy image of the vector. 2.1.2 Klebsiella pneumoniae K. pneumoniae belongs to gram-negative family Enterobacteriaceae . It exists widely in the natural environment and acts as opportunistic pathogen, so serious infections may be induced in patients with severe infections and weakened immune system [63] . Klebsiella species remain the world's most common nosocomial pathogens [64] and the main cause of hospital-acquired pneumonia resulting in high mortality rate. Currently, the biggest challenge of K. pneumoniae treatment is drug resistance, which makes the use of common antibiotics ineffective. Indeed, the extended-spectrum β-lactam-producing and carbapenem-resistant K. pneumoniae (CRKP) has been recognized by the World Health Organization as a critical public health threat [65] . Outer membrane vesicles (OMVs) A large number of gram-negative bacteria can naturally produce extracellular OMVs, which have significant advantages in vaccine development. Compared with other lipid nanoparticles, OMVs contain toll-like receptor (TLR) agonists, such as outer membrane proteins, lipoproteins and lipopolysaccharides (LPS), and a variety of immunogenic endogenous antigens. Generally, the diameter range of OMVs is from 50 nm to 250 nm, which is suitable for targeting and being phagocytized by APCs [66] . The use of OMVs has become a very promising strategy of vaccination. K. pneumoniae -derived OMVs can induce strong humoral and cellular immunity response, preventing bacteria-induced lethality in intraperitoneally immunized mice [31] . Although natural OMVs are considered potential vaccine candidates, they have some shortcomings. One is a wide size range of OMVs naturally secreted by bacteria, which may complicate the vaccine dynamics in vivo , and the low stability of natural OMVs also profoundly affects the vaccine effect. To solve these problems, Wu et al. described a core-shell structure to reinforce the OMVs by depositing the hollow-structured OMVs onto bovine serum albumin nanoparticles (BN-OMVs). The size of the BN-OMVs was mostly between 70 and 90 nm, and the immune response and protection against CRKP were significantly improved after subcutaneous vaccination [32] . Alginate microparticles Microcapsules have been developed as a delivery vector for mucosal vaccines because they could improve the uptake into APCs and sustain the release of antigenic material . As polymers, alginate microparticles are easy to obtain and inexpensive and have several advantages in vaccines. Unlike the formation of (lactide-co-glycolide) PLG particles, which require harsh denaturation conditions, the conditions for alginate microparticles formation are mild [67] . Moreover, the mucoadhesive properties of alginate microparticles may prolong the contact time with the absorptive epithelium and the mucosa-associated lymphoid tissue M cells, thus promoting the uptake of the coated antigen. When LPS of K. pneumoniae O1 was loaded in alginate microparticles, the particle size was less than 5 μm. Both effective systemic and mucosal immune responses were induced following nasal and inhalation administration, which protected rodents against lobar pneumonia [33] . Although LPS encapsulation with microspheres or liposomes can reduce its pyrogenic and toxic properties and induce protective polysaccharide antibody [68] , the natural LPS can still cause severe inflammation. At present, many serotypes of K. pneumoniae have been identified, but only four of them (O1, O2, O3, and O5) can cause human diseases, indicating that O-polysaccharide-based vaccines could provide a high coverage. However, the O-polysaccharide has high specificity but low immunogenicity, which requires more efficient delivery systems. 2.1.3 Bordetella pertussis Pertussis is a serious childhood respiratory disease, with the main feature of a persistent and paroxysmal cough, accompanied by a typical inhalation "whooping" sound. A typical pertussis infection usually lasts 3 months. Therefore, it is also called "hundred-day cough" [69] . The disease is caused by B. pertussis, which mainly spreads through aerosols and may settle in the respiratory tract, thereby damaging epithelial cells and impairing normal respiratory function. Although acellular pertussis vaccines (aPVs) containing multiple antigen components can provide wider coverage [70] , there are still problems to be solved, such as poor immunization response and short-term protection. In addition, surveys in many countries have found that the incidence of pertussis is increasing, and there have even been pertussis outbreaks in many countries and regions in recent years [71] , [72] , [73] . This phenomenon is also known as the "Pertussis Resurgence" [74] , [75] . Therefore, pertussis still poses a threat to the health of children, and a safer and more protective vaccine is needed. Many delivery vehicles, such as OMVs, L. acid bacteria, and polymers have been developed against B. pertussis. Among them, OMVs have been most thoroughly studied. Many studies have demonstrated that OMVs derived from B. pertussis can protect mice from intranasal pertussis challenge through different immune routes, including intraperitoneal, subcutaneous, intranasal, and pulmonary (PM) [34] , [35] , [76] . The classical administration route of OMVs is subcutaneous or intraperitoneal, which does not cause an IgA reaction [77] . For respiratory diseases, mucosal immunity seems more important. By comparing the immune responses evoked by the PM and subcutaneous route, a distinct systemic and a stronger mucosal IgA and Th17 immune response were observed with PM immunization; the PM route also provided more effective inhibition of bacterial colonization in the respiratory tract [35] . Thus, mucosal immunization may be of great significance to improve protection against pertussis infection. Although the systemic proinflammatory cytokine responses have been greatly reduced compared with the whole-cell pertussis vaccine (wPV) [76] , a further detoxification is necessary considering that native B. pertussis OMVs contain a lot of lipooligosaccharide (LOS), which could induce strong host inflammatory responses. Asensio et al. developed a recombinant B. pertussis strain expressing the lipid A-modifying enzyme, PagL, which hydrolyzes the ester bond at the 3 position of lipid A, resulting in tetra- instead of penta-acylated LOS. The OMVs derived from the recombinant strain retained protective capacity against intranasal challenge in intranasally immunized mice [37] . In addition, a cross-protection study found that OMVs derived from B. parapertussis , a close relative of B. pertussis that can also cause pertussis, could provide protection from both B. pertussis and B. parapertussis infections [36] . Further, long-term protection from pertussis OMV-based vaccine is based on the induction of lung-resident CD4 + memory T cells (T RM ) [78] , suggesting that effectiveness may cover the entire period of childhood. Respiratory pathogenic bacterial infections involve colonization and invasion; therefore, mucosal immunity is considered an ideal choice for the prevention of respiratory diseases and blocking transmission because it involves both mucosal and humoral immune responses. Nasal mucosal immunity has the advantages of low response threshold, low antigen dosage, and no immune tolerance. However, under conventional conditions, antigens can only stay on the mucosal surface for a short time after entering the nasal cavity, and a small amount of proteolytic enzymes and mucus weaken the strength of the immune response. Therefore, the main requirement for a nasal mucosal immune delivery system is to enhance the adhesion and retention of antigens on the mucosal surface, enhance the immunogenicity of the antigens, and promote the effective uptake of antigens by DCs. In addition, polysaccharide antigens have strong specificity, and the produced antibodies are protective. The polysaccharide conjugate vaccine for S. pneumoniae has achieved great success. However, the current chemical preparation method is a time-consuming and multistep process, which makes the vaccine expensive and difficult to popularize in developing countries. In contrast, the current biotechnology of coupled bacterial polysaccharide and carrier protein based on protein glycosylation modification has achieved partial success and is expected to overcome the limitations of polysaccharide conjugate vaccine. The use of VLP to couple a single polysaccharide repeat unit of S. pneumoniae can also produce a protective effect, suggesting that nanocarriers have advantages in stimulating polysaccharide immune responses. Therefore, the combination of a nanodelivery carrier and glycosylation system is expected to prepare a new, low-cost, high-efficiency pneumonia polysaccharide conjugate vaccine. Although a variety of probiotic carriers were used in the research of pneumococcal vaccines, the final immune effect was not optimal. It may be that, compared with the intestine, the respiratory environment is not suitable for their survival, colonization, presentation, and antigen release. In addition, about 80% of clinical isolates of K. pneumoniae belong to one of four serotypes (O1, O2, O3, and O5), so polysaccharide antigens can be used to prepare multivalent vaccines. However, the immunogenicity of OPS is generally low, especially for O2 polysaccharide repeat units composed of two simple galactoses, which makes it difficult for O2 antigen to stimulate an effective immune response using traditional vaccine strategies. Therefore, delivery systems for weak polysaccharide antigens need further development. 2.2 Intestinal infectious diseases and advanced delivery systems Diarrhea, mainly manifested as watery and loose stools many times a day, is a major global health problem [79] . Bacterial diarrhea, specifically, is a more serious condition with severe symptoms. The most common microorganisms that cause bacterial diarrhea are Escherichia coli , Shigella , Salmonella , Yersinia, and Clostridium [80] . In bacterial diarrhea, pathogens attach to the epithelium, produce toxins, and increase intracellular cAMP or cGMP, ultimately accelerating the secretion process in the enterocytes [81] . Toxins may also induce the release of cytokines, leading to chemotaxis and eicosapentaenoic acid (prostaglandin) production, and aggravate the imbalance of water in the lumen. Excessive water and electrolytes in the intestinal cavity draw more fluid into the intestinal cavity, and the osmotic effect further worsens diarrhea [82] . Therefore, inhibiting bacterial colonization in the intestine can effectively prevent infection, and this ability often comes from IgA produced by mucosal immune response. It is an ideal way for antigens to directly act on the intestinal mucosal immune system to stimulate mucosal immune response. In addition, due to the higher safety of oral administration, some inorganic carriers have also been explored. However, unlike respiratory delivery, most vaccines need to overcome various difficulties to reach the intestinal tract, such as resistance to gastric acid and bile, ability to colonize the intestinal tract, and possible immune tolerance. The delivery systems for the prevention of bacterial diarrhea are summarized in Table 2 . Table 2 Effect of vaccines with delivery systems against intestinal infectious diseases. Pathogenic bacteria Delivery system Antigen(s) Adjuvants used Route Animal species Protection after challenge Ref. E. coli L. reuteri Fusion of ST and LTB b — Oral Mice Decreased gut/carcass weight (G/C) ratios [83] L. casei F41 or K99 fimbriae (Surface) b — Oral or i.n. Mice Over 80% of animals surviving with a high dose, 9 weeks after the last immunization; Passive protection (F41 fimbriae): 90% of pups surviving, oral; 80% of pups surviving, i.n. [84] , [85] , [86] L. casei β-Intimin fragment b — Oral or s.l. Mice Decreased bacterial recovery from feces [87] L. casei Fusion of K99, K88 fimbriae (Surface) b fuse expressing LTB Oral Mice Over 80% of animals surviving 3 weeks after the last immunization, and over 70% of animals surviving 9 weeks after the last immunization [88] L. casei FaeG b co-expressing or fuse expressing mutated LTA and LTB Oral Mice 100% of animals surviving [89] L. plantarum FaeG with DC-targeting peptide b — Oral Mice Inflammation of intestinal tissue prevented [90] L. acidophilus EspA and the Tir central domain (Secreted) b — Oral Mice 80% of animals surviving [91] L. acidophilus K99 (Surface) b — No results Pigs No results [92] L. reuteri PapG (Surface) b — No results No results [93] Detoxified OMVs OMV components — Eyedrop Mice 100% of animals surviving, compared with 20% of controls [94] Chitosan + Eudragit L-100 F4 fimbriae — Oral Reduction in excretion of bacteria [95] Chitosan + Eudragit L-100 + OMVs OMV components — Oral Mice No results [96] PLGA CS3, CS1, LTB, and chimeric CFA/I, CS2, CS3, and LTB — Oral, s.c., or i.p. Mice No results [97] , [98] PLG microspheres CS6 — i.n. Mice No results [99] Nano-multilamellar lipid vesicles (NMVs) Stx2B — s.c. Mice 60% of animals surviving [100] Oil-based Vaxcine TM Conjugation of O111 polysaccharide and EtxB — Oral Rabbits and mice No results [101] LDH and HEC nanoparticles IB — s.c. Mice No results [102] SBA-15 Int1b or O-polysaccharides — s.c. Rabbits and mice No results [101] , [103] Shigella OMVs of six strains — Oral Mice Neonatal mice were 100% passively protected against S. flexneri 2a and S. flexneri 6 , while the protective efficacies against S. dysenteriae 1 , S. flexneri 3a , S. boydii 2, and S. sonnei were ~90% [104] Detoxified OMVs OMV components Alhydrogel i.n., i.d., s.c., i.p., or i.m. Mice, rabbitsand human No results [105] , [106] , [107] OMVs or OMVs encapsulated in polyanhydride nanoparticles (OMV-NP) OMV components — i.d., i.n., eyedrop, or oral Mice OMVs: 100% of animals surviving by nasal and ocular route, and no animal surviving by intradermal route; OMV-NP: 100% of animals surviving by the nasal, oral, and intradermal route [108] , [109] OMVs encapsulated in CS-TPP particles and Eudragit L-100 OMV components — Oral or i.d. Mice passive immunity protection [110] Self-assembled proteinaceous nanoparticles O-polysaccharide — s.c. Mice 100% of animals surviving [111] Chitosan MxiH — i.n. Mice 60% of animals surviving, compared with 10% of controls [112] Chitosan NF N-IpaD — i.n. Guinea pigs 93.75% protective efficacy against ocular challenge in guinea pigs [113] TMC nanoparticles N-IpaD — Oral Guinea pigs 83.3% protection against ocular challenge in guinea pigs [114] V. cholerae OMVs OMV components — Oral, i.n., or i.p. Rabbits and mice 60%–100% protective from watery diarrhea from different V. cholerae strains in rabbit; 100% protection against colonization with V. cholerae in neonatal mice from immunized dams [115] , [116] L. casei or L. reuteri CTB (Cytoplasm or secretory) b — No results Mice No results [117] S. typhimurium OMVs OMV components — i.p. Mice Bacterial replication inhibited [118] S. typhi and paratyphi A Bivalent OMVs OMV components — Oral Mice 80% of animals surviving against S. typhi and 90% of animals surviving against S. paratyphi A [119] S. typhi VLP (HBsAg) Vi — s.c. Mice No results [42] S. enterica serovar Enteritidis L. casei FliC (Surface) b — Oral Mice Decreased bacterial counts in the spleen [120] S. enterica serovar Enteritidis L. casei FliC (Surface) b or fusion of FilC and SipC (Surface) b — No results Mice No results [121] b. Constructed in an expression vector; i.n., intranasal; s.c., subcutaneous; i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; i.d., intradermal; s.l., sublingual; —, without added adjuvant. 2.2.1 Pathogenic E. coli Enterotoxigenic E. coli (ETEC) is the most common cause of diarrhea in humans [81] . It has become a major global food and waterborne pathogen involved in outbreaks of bloody diarrhea and hemolytic–uremic syndrome (HUS) worldwide [122] . Colonization factors (CFs), produced in ETEC, were considered as targets for vaccine production [123] , [124] . Although about 25 different types of CFs have been identified [123] , [125] , naked CFs are not suitable for oral immunization because of their high sensitivity to the harsh environment of the gastrointestinal tract. Lactic acid bacteria Lactic acid bacteria are a safe and efficient mucosal delivery carrier, which is widely used in the prevention of gastrointestinal infectious diseases. Compared with some other carriers, lactic acid bacteria are more favorable for oral administration because they can pass through the extreme environment of the stomach and colonize the intestine. Moreover, both strong antigen-specific systemic and mucosal immune responses are induced by lactic acid bacteria through mucosal immunity. In the design of E. coli vaccine, antigens could be located on the surface, in the cytoplasm, or be secretions of lactic acid bacteria ( Fig. 3 ). At present, many lactic acid bacteria, such as L. reuteri , L. casei , L. plantarum , and L. plantarum, have been used to express a variety of antigens, but L. casei has been most studied [126] . For example, L. casei expressing F41 constructed by Liu et al. can stimulate strong systemic and local mucosal immune responses simultaneously after oral immunization, protecting mice from lethal challenge. It is worth noting that this immunization strategy can also stimulate long-term protection, considering that it can maintain more than 80% protection 9 weeks after the last immunization [84] , [85] . Another study also revealed the passive protection effects of L. casei expressing F41 antigen considering that the orally or intranasally immunized dams provided 90% protection against lethal challenge to their offspring [86] . Furthermore, Yu et al. found that immunization with L. casei co-expression or fusion expression of FaeG antigen and fusion protein (including LTB and mutated LTA) can stimulate a stronger mucosal immune response and provide 100% protection [89] . Since the intestinal epithelium contains a large number of M cells, which can bind B5 toxins (such as LTB and CTB) through the GM1 receptor [127] , B5 toxin proteins can be used as a mucosal adjuvant to further improve the mucosal immune response of the lactic acid bacteria-based delivery system. Fig. 3 Schematic diagram of construction of oral live lactic acid bacteria vector vaccine and its immune response. (A) Exogenous protein expression and localization in lactic acid bacteria. (B) Following oral vaccination, both systemic and local mucosal immune responses are induced simultaneously. OMV OMVs have been widely studied for the use in vaccines. Intranasal immunization with OMVs from ETEC was shown to induce antibodies against various virulence proteins and inhibit bacterial colonization in the small intestine [128] . However, due to the existence of shiga toxin (STx) and LPS endotoxins, the OMVs produced from EHEC O157: H7 have intrinsic toxicity with the possibility to develop HUS; thus, the preparation of E. coli O157: H7 OMV vaccine needs to overcome its toxicity. Kim et al. generated attenuated OMVs through the mutation of msbB (encoding an acyltransferase that catalyzes the final myristoylation step during lipid A biosynthesis) and A subunit of STx [129] , [130] ; after immunizing mice by eyedrops and confirming the safety, both humoral response and mucosal (in tears, saliva, and feces) immune response were induced, providing enough protection from the challenge by the lethal HUS-causative agent (wild-type OMVs) [94] . Although there is relatively poor lymphoid tissue in the eyes and there are a few reports on immunization via eyedrop route, the connection of lacrimal duct and nasal cavity may result in immunoactivities in both nasal and ocular mucosa. Moreover, the homing of lymphocytes can distribute the effect of mucosal immune response on each mucosal surface of the body; therefore, the intestinal IgA can be successfully induced through other mucosal pathways. Considering that the response at the immune location is still the strongest, the oral route of OMVs should be further tried. Compared with the application of OMVs-based vaccines in the prevention of respiratory diseases, OMVs delivery systems have more applications in intestinal diseases, and correspondingly, there are a series of successful modifications to OMVs. First, various methods can reduce the toxicity of OMV. The toxicity of OMVs can be reduced by deleting the lipid A modification gene msbB, htrB , or combined msbB and pagP [131] , [132] , [133] , [134] . Another method to reduce the toxicity of OMVs is to pre-treat them with all-trans retinoic acid, active metabolite of vitamin A, which has both anti-inflammatory and mucosal adjuvant properties [135] . Then, through some modifications, the OMV yield can be improved. Choi et al. produced OmpC-enriched OMVs through overexpression of small RNAs, MicA, in S. typhimurium . The yield of OMVs was strongly increased and the OmpC-enriched OMVs promoted Th1- and Th17-type immune responses, providing full protection against lethal challenge by Salmonella [136] . Furthermore, the yield can also be improved through the deletion of tolR gene to disrupt the Tol-Pal system on the cell wall. After immunization through the subcutaneous route, the protective effects of OMVs in mice were not inferior compared with those of polysaccharide conjugate vaccines [137] . In addition, by further optimizing the form of OMVs, immune response and protection can be additionally improved, namely, OMVs encapsulated in polyanhydride nanoparticles (OMV-NPs) can induce Th1 immune responses [109] , [138] , which is more suitable for intracellular bacteria, such as S. flexneri . The OMV-NPs formulation even provided full protection on day 56 after nasal immunization in mice, while the protection with OMVs alone was only 40% [108] . Thus, OMVs, which are easier to produce, have a great potential to become a candidate product for the application of vaccines against intestinal infectious diseases. Eudragit L-100/Chitosan Chitosan is a natural biodegradable polysaccharide derived from chitin, with good biocompatibility and adhesion properties. Although chitosan is capable of increasing transit time of antigens in the gastrointestinal tract and inducing mucosal immune response, its oral administration is limited by the low resistance to acidic pH [139] , [140] . To solve this problem, Eudragit L-100, a coating material soluble at pH above 6.0, was used to protect the antigens from detrimental effects in the upper gastrointestinal tract. As reported, Eudragit L-100-based oral delivery vehicle loading ETEC F4 or F18 antigen could induce higher antigen-specific IgG1 and IgG2a antibody responses in serum and antigen-specific IgA in saliva compared with those with antigen immunization alone [141] . To further improve the immune response, a combined delivery system was built by coating Eudragit L-100 on the chitosan nanoparticles which loaded protein antigens or OMVs from ETEC. Oral immunization of the formulations in animals elicited antibody response and inhibited the ETEC colonization in small intestine [95] , [96] . Thus, for some special delivery requirements, multiple delivery strategies can be used at the same time. In addition to the vehicles described above, some other polymers, inorganic materials, and lipid or oil-based vehicles have been explored to develop E. coli vaccines ( Table 2 ). Although strong immune response could be elicited in mice, most of the results lack the in vivo results about the protective effect, and therefore further confirmation is needed. 2.2.2 Shigella Shigella species are gram-negative bacteria belonging to the Enterobacteriaceae family. According to the serological type, they are divided into four categories: S. dysenteriae , S. boydii , S. flexneri , and S. sonnei . Shigella spp. are the main bacterial causes of persistent epidemic diarrhea and result in almost 125 million diarrheal episodes and around 160,000 deaths annually [142] . Usually, a low-dose inoculum can cause the disease, resulting in aggressive watery or mucous/bloody diarrhea. However, there is currently no licensed vaccine against Shigella , and the continuous emergence of drug-resistant strains makes antibiotic treatment difficult [143] . Self-assembled proteinaceous nanoparticles Recently, Pan et al. developed Nano-B5 platform to produce nanoscale bacterial polysaccharide conjugate vaccines in vivo . Proteinaceous nanoparticles were self-assembled via fusion of a natural adjuvant effective pentamer domain (bacterial B5 toxin) and an unnatural trimer domain. Then, O-polysaccharide of S. flexneri was conjugated to the nanoparticle through glycosylation system ( Fig. 4 ) [111] . The nanovaccine can significantly slow down its dissipation at the injection site and enhance lymph node drainage. This delivery vector contains B5 toxin protein module such as CTB, which can bind to GM1 receptor on the surface of APCs, thus promoting antigen endocytosis and presentation [144] . After confirming the safety, subsequent subcutaneous immunization in mice indicated that both strong antigen-specific humoral and cellular immunity were induced, providing complete protection against challenge with 5 × half-lethal dose. In addition, the safety and high efficiency of the delivery carrier were further proven in the cynomolgus monkey model [111] . Polysaccharide-conjugated vaccines are considered the most successful form of bacterial vaccines [145] . However, the traditional chemical method is a time-consuming and costly process [146] , so this biological method can solve this problem by one-step fermentation and one-step purification to obtain vaccine products [147] , [148] , [149] , [150] . This study is also the first study to use a fully biosynthetic method to prepare a nanoscale polysaccharide-conjugated vaccine, leading to a great improvement in the immune effect. Fig. 4 Self-assembled proteinaceous nanoparticles for antigen delivery [111] . (A) Schematic diagram of protein self-assembly and conjugation with bacterial polysaccharide antigen through glycosylation system. (B) Super-resolution structured illumination microscopy images of nanoparticle-expressing bacteria. (C) Transmission electron microscopy images of the nanoparticles conjugating polysaccharide and their size distribution. (D) The vaccine can rapidly enter the draining lymph nodes and simultaneously stimulate strong humoral and cellular immune responses. Chitosan-based delivery systems Chitosan particles are endowed with the properties to prevent encapsulated antigen degradation and extend antigen duration time on the mucosal surface [151] . As an alternative to the oral route for chitosan particles without an additional protection from acid degradation, direct nasal immunity may stimulate the systemic and intestinal IgA immune responses. A study showed that the loading of recombinant Shigella MxiH antigen into chitosan nanoparticles resulted in enhanced humoral and mucosal immune responses in intranasally immunized mice [112] . In addition, various chitosan-based delivery systems are available. For example, Jahantigh et al. described a chitosan nanofibrous membrane (NF) with a high surface area to volume ratio, which is more appropriate for nasal vaccine delivery. After loading N-terminal region of IpaD (N-IpaD) antigen of Shigella , the guinea pigs were intranasally administered, which resulted in induction of significant serum and mucosal antibody responses and protection [113] . Moreover, O-methylated free trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles, which have both mucoadhesive properties and excellent absorption-enhancing effects, even at neutral pH over a wide pH range for oral delivery [152] , or chitosan-tripolyphosphate (CS-TPP) nanoparticles coated with Eudragit L-100 [110] , were developed to further improve the immune response and protective effect of oral or intranasal routes ( Table 2 ). However, these immune effects do not seem to be as good as those of the two previous kinds of delivery systems; thus, further optimization of chitosan or combination with other systems should be explored to enhance immune response. Similar to the respiratory tract infections, digestive tract infections often involve bacterial colonization and invasion. Therefore, mucosal administration is also the first option for immune route, and many delivery systems such as probiotics and OMVs have shown ideal effects in protective. However, unlike the respiratory tract, mucosal delivery in the digestive tract faces more difficulties that need to be overcome, including the acidic environment in the stomach, hydrolysis by gastrointestinal proteases, immune tolerance, and intestinal microbes. In addition, the colonization of gastrointestinal pathogens does not cause easy spreading of the pathogens from person to person. Therefore, the choice of mucosal immunity or other immunization pathways should be specifically weighed. In the prevention of digestive tract infectious diseases, although there are not many studies on non-mucosal immune delivery systems, some have shown great potential, such as the latest bacterial B5 toxin-based protein nanocarriers. 2.3 Other pathogenic bacterial diseases and advanced delivery systems In addition to common pathogenic bacteria that cause respiratory tract infections and diarrhea, there are many bacteria that are highly pathogenic and have various infection methods and target organs, such as Bacillus anthracis , Staphylococcus aureus , and others. In addition, some pathogenic bacteria, such as Helicobacter pylori and Brucella , cause chronic infections that are easy to relapse or difficult to cure. For the prevention of diseases caused by these pathogenic bacteria, a series of efficient delivery systems have been developed ( Table 3 ). This section mainly focuses on the delivery systems of some important pathogenic bacteria. Table 3 Effect of vaccines with delivery systems against different bacterial challenges. Pathogenic bacteria Delivery system Antigen(s) Adjuvants used Route Animal species Protection after challenge Ref. B. anthracis Adenovirus PAD4 — i.m. Mice 100% of animals surviving after single immunization [153] SFV PA — s.c. Mice 100% of animals surviving [154] FHV VLP PA — s.c. Rats 100% of animals surviving after single immunization [155] Bacteriophage T4 nanoparticle PA — i.m. Mice, rats, and rabbits 100% of animals surviving [156] Live influenza virus prime and killed RV vector or the vaccinia virus vector boost PA — i.n. prime and i.m boost Mice No results [157] TMV PA 232–247 and PA 628–637 — i.p. Mice Almost no protection [158] Liposomes PA Monophosphoryl lipid A i.m. Rabbits and rhesus macaques 100% of animals surviving [159] , [160] Liposome-like vessels PAD4 Aluminium hydroxide i.p. Mice 70% of animals surviving [161] FUC-HTCC NPs Anthrax vaccine AVA — i.p. Mice 100% of animals surviving [162] Chitosan PA C48/80 i.n. Mice No results [163] Chitosan derivative TMC PA CpG or Poly I:C or not s.c. a , i.m. a , or i.p. Mice 83.3% of animals surviving in s.c. or i.m. route [164] CS-NH2 microparticles PA — s.c. Mice No results [165] Poly-l-lactide (PLLA) polylactide (PLA) microspheres PA — i.m prime and either i.m. or i.n. boost Mice 100% of animals surviving [166] Dendriplex PLGA nanoparticles PA (DNA) — i.m. Mice High antibody titer but without neutralizing activity [167] PLGA nanoparticles PAD4 — i.p. Mice 11% of animals surviving after single immunization [168] sucrose polymer Ficoll PA CpG-ODN i.m. Mice 100% of animals surviving after single immunization [169] Soybean oil-and-water nanoemulsion (NE) PA — i.n. Mice and guinea pigs 100% of animals surviving [170] L. acidophilus PA(Surface) b — No results No No results [171] L. casei PA b — Oral or i.n. Mice No results [172] L. acidophilus PA with DC-targeting peptide (Secretory) b — Oral Mice 75% of animals surviving [173] L. gasseri PA with DC-targeting peptide (Secretory) b — Oral Mice 100% of animals surviving and 30% of animals surviving without DC-targeting peptide [174] , [175] S. enterica PA, PAD1 and 4, and PAD4 — Oral Mice PA: 83% of animals surviving, PAD1 and 4: 25% of animals surviving, PAD4: no protection [176] Neisseria meningitidis group B E. coli OMV Glycan antigens (Polysialic acid (PSA) and T antigen) — s.c. Mice 50% SBA was observed at over 100-fold dilutions of the serum [177] Brucella SFV Cu-Zn SOD — i.p. Mice 1.52 (3.07–1.55) c [178] IF3 — i.p. Mice 1.09 (6.96–5.87) c [179] Influenza virus L7/L12 or Omp16 — i.n., eyedrop a , or s.c. Mice The best: Omp: 16: 3.78 (4.54–0.76) c , eyedrop; Bivalent: 3.9 (4.54–0.64) c , eyedrop [180] Influenza virus Tetravalent vaccine formulation expressing Omp16, L7/L12, Omp19, and Cu-Zn SOD — i.n. a , eyedrop, or s.l. Guinea pigs The best: 2.8 (2.86–0.06) c , i.n. [181] L. lactis L7/L12 (Cytoplasm) b — Oral Mice 0.57 (7–6.43) c [182] Cu-Zn SOD (secretory) b — Oral Mice 1.35 (7.1–5.75) c [183] L. lactis (Live or killed) Omp31 (Cell Wall-Anchored) b — Oral or i.p. Mice No results [184] Attenuated S. typhimurium Fusion of L7/L12 and BLS b — Oral Mice Secretory expression: 1.55 (4.44–2.89) c ; Intracellular expression: 1.32 (4.44–3.12) c [185] L7/L12 — i.m. Mice About 1.7 (3.4–1.7) c [186] Ochrobactrum anthropi Cu-Zn SOD CpG i.p. Mice 2.42 (5.30–2.88) c [187] TMC Omp19 — Oral a or i.p. Mice The best: against B. abortus : 2.46 (6.3–3.84) c , oral; against B. melitensis : 2.38 (6.14–3.76) c , oral [188] Mannosylated chitosan nanoparticles FliC — s.c. Mice Against B. melitensis : 1.34 (5.67–4.33) c ; against B. abortus : 1.22 (5.24–4.02) c [189] escheriosome L7/L12 — s.c. Mice 1.46 (4.58–2.93) c [190] Cu-Zn SOD IL-18 s.c. Mice 1.5 (5.2–3.7) c [191] PLGA L7/L12 — i.p. Mice 1.79 (5.94–4.15) c [192] CaPNs FliC, 7α-HSDH, BhuA and multi-epitopes (Poly B and poly T) — s.c. Mice The best: against B. melitensis : Poly B + T, 1.5 (5.77–4.27) c ; against B. abortus: Poly B + T, 1.37 (5.29–3.92) c [193] S. aureus OMV ( E. coli ) Hla H35L , SpA KKAA, FhuD2, Csa1A, and LukE Alum i.p. Mice 90% of animals surviving [194] PDNVs ( E. coli ) SAcoagulase — i.p. Mice 100% of animals surviving [195] extracellular vesicles (EVs) Hla H35L, LukE and EVs components — s.c. Mice About 70% and 50% of animals surviving after challenging with two S. aureus isolates [196] ICG-loaded MSNs EVs — s.c. Mice Decreased bacterial loading in skin and organs [197] PDNVs PDNVs components — s.c. Mice No results [198] L. lactis ClfA b and FnbpA b Freund's adjuvant Unknown Rats Less infected vegetations after challenging with S. aureus Newman in L. lactis ClfA-immunized animals; FnbpA did not have the same effect [199] PilVax B-cell epitope, D3, from FnbpA — i.n. Mice Decreased bacterial loading in intestine and nasal mucosa [200] Cowpea mosaic virus D2 domain of FnbpB — i.n. or oral Mice No results [201] Live attenuated S. typhimurium SaEsxA b and SaEsxB b — Oral Mice 22.2% and 44.4% of animals surviving after challenging with S. aureus USA 300 for SaEsxA and SaEsxB; no animals surviving after challenging with S. aureus Newman [202] Red blood cell membrane-coated PLGA Hla, α-toxin, PVL, and γ-toxin — s.c. Mice Decreased bacterial loading in skin, blood, and organs [203] , [204] PP7 (VLP) AIP1S — i.m. Mice Inhibiting abscess area and dermonecrotic; Decreased bacterial loading at the site of infection [205] PLGA CNA19 — s.c. or i.n. Mice No results [206] , [207] PLGA rSEA — i.p. Mice 100% of animals surviving [208] Chitosan rSEB — i.n. No results [209] Chitosan Ami No results No results No results [210] Liposome AdsA (mRNA) — i.m. or s.c. Mice No results [211] H. pylori L. lactis (GEM) CUE — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [212] , [213] L. acidophilus Hp0410 — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [214] L. plantarum Urease Bsubunit (UreB) (Cytoplasm) b — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [215] HP55/PLGA nanoparticles Recombinant antigen CCF — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [216] OMVs OMV components — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [217] liposomes Fusion of the urease linear epitope (19 amino acid residues) and CTB — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [218] Yersinia pestis Bacteriophage T4 nanoparticles Mutated capsular antigen F1 and low-calcium-response V antigen — i.m. Rats 100% of animals surviving [155] 20:80 CPTEG:CPH Fusion of F1 and V antigens Cyclic dinucleotides (CDNs) s.c. Mice 100% of animals surviving at 14 days and 75% at 182 days after single immunization [219] OMVs OMV components — i.m. Mice 100% of animals surviving in subcutaneous challenge; 100% and 50% of animals surviving in intranasal challenge with a median and a high dose [220] L. plantarum LcrV (Surface) b — Oral Mice No results [221] a. The better or the best route to achieve protection; b. Constructed in an expression vector; c. Log 10 units of protection, obtained by subtracting the mean log 10 CFU for the experimental group from the mean log 10 CFU for the corresponding control group; i.n., intranasal; s.c., subcutaneous; i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; s.l., sublingual; —, without added adjuvant. 2.3.1 B. anthracis B. anthracis is the causative agent of anthrax, an acute zoonotic disease. Humans can be infected through direct contact with broken skin, contaminated meat, or inhalation [222] . The spores of B. anthracis have strong survival ability and are resistant to sunlight, high temperature, and disinfectants. However, the spores are easy to prepare at low cost, so they are regarded as potential biological weapons [223] . Vaccines are an effective means to prevent anthrax; however, traditional attenuated live vaccines or adsorbed vaccines have a series of problems, such as side effects, short duration of protective effect, and complicated immune procedures. For example, anthrax vaccine absorbed (AVA), the only USFDA-approved anthrax vaccine, needs to be administered six times within 18 months and enhanced once each year [224] . Therefore, the development of a safe and effective human vaccine is of great significance for the prevention and control of anthrax. So far, various delivery carriers (e.g., viral vectors, bacterial vectors, liposomes, and polymers) have been developed ( Table 3 ). Because the main antigen of B. anthracis is protective antigen (PA) or its domain, it is easy to compare the effects of different delivery vehicles. Viral vector Viral vector vaccines consist of a nonreplicating virus that contains certain genetic material from the pathogen that needs to be immunized. It seems to be an ideal vaccine delivery vector because of its natural viral structure, which can be well recognized by the immune system [225] . Replication-incompetent adenovirus expressing domain 4 of PA (PAD4) could induce a stronger humoral and cellular immune responses than AVA and provide full protection against lethal spore or B. anthracis strain challenge in a single injection in intramuscularly immunized mice [153] . Such potent protection was also reported in Semliki forest virus (SFV) vector loading PA through the challenge with the B. anthracis strain [154] . However, some other viral vector vaccines, such as influenza viruses and rabies virus (RV) expressing PA, were unable to induce anthrax toxin neutralization antibodies, although the antibody titers against PA were high [157] , [226] . Interestingly, this situation could be solved by heterologous prime/boost immunization strategy, and the particularly effective program was an initial intranasal administration of a live influenza virus vector, followed by intramuscular boosting with either the killed RV vector or the vaccinia virus vector [157] . The mechanism of this phenomenon is still unclear and one possible explanation is that the combination of different heterologous vectors may affect B-cell affinity maturation and Ig gene high frequency mutation in germinal centers. In addition, some VLP (e.g. flock house virus (FHV) VLP and bacteriophage T4 nanoparticle) vaccine were also explored; they exhibited good protection against the challenge by anthrax lethal toxin in rats or inhalational anthrax in mice, rats, and rabbits [155] , [156] . Although the viral vector delivery system can achieve 100% protection, some viruses such as adenovirus need to be further modified to avoid possible pre-existing immunity in humans [227] . Liposomes and polymers Other potential delivery vehicles have also been used to study anthrax vaccines. For example, PA encapsulated in liposomes containing monophosphoryl lipid A could induce full protection from lethal pulmonary challenge with B. anthracis spores in rabbit and monkey models [159] , [160] . However, liposomes are prone to oxidative degradation, resulting in low stability and short shelf life when used as delivery systems [228] . This problem can be solved with liposome-like vessels prepared by nonionic surfactant [229] . These nonionic surfactant vesicles (NISV) are self-assembling lamellar structures; they resemble liposomes because they are biodegradable, nonimmunogenic, and capable of encapsulating biologically active cargo [161] , [230] . Another example is a kind of chitosan nanoparticle. Liu et al. described chitosan-based microparticles (CS-NH2 MPs) with abundant amino groups. After loading PA, the formulation induced the complement system activation and enhanced antibody response [165] . Recently, Chuang et al. reported a positively or negatively charged fucoidan-quaternary chitosan nanoparticle by conjugate fucoidan (FUC) and a chitosan derivative (N-(2-hydroxy)-propyl-3-trimethyl ammonium chitosan chloride, HTCC). The surface charge was adjusted by varying the mass ratio of two polyelectrolytes. After combining FUC-HTCC nanoparticles with the approved anthrax vaccine AVA, the novel anthrax nanovaccine significantly increased the IgG antibody titers and provided complete protection compared with CpG plus AVA (75%) or AVA alone (50%) in mice exposed to anthrax lethal toxin challenge [162] . However, some other polymer particles (e.g., sucrose polymer, chitosan or its derivative, and others) need an addition of an adjuvant (e.g., CpG, mast cell activator compound 48/80 (C48/80), Poly I:C) to elicit an enhanced immune response [163] , [164] , [231] . Although mice immunized with these liposomes or polymer-based vaccines can achieve a high protection rate after challenge, the use of adjuvants reduces their competitiveness compared with viral vectors. 2.3.2 Brucella Brucellosis is one of the five major zoonotic diseases in the world and seriously endangers public health. More than 500,000 new cases of brucellosis occur every year [232] . In the 21st century, brucellosis shows a rebound trend worldwide [233] . Brucella (the pathogen of brucellosis) is a kind of gram-negative, facultative intracellular proteus. It can be divided into more than 10 species. Among them, B. melitensis , B. abortus , and B. suis are the three most toxic species, which can infect both animals and humans. At present, there are no vaccines approved for human use. The animal vaccines against brucellosis are live attenuated vaccines, which still have potential serious safety risks in production and use [234] . Viral vectors Although DNA vaccines encoding B. abortus Cu-Zn superoxide dismutase (Cu-Zn SOD) or translation initiation factor 3 (IF3) could induce specific cellular immune response and provide protection against challenge with B. abortus virulent strain in mice [235] , [236] , high concentrations and repeated doses are needed to improve in vivo transfection efficiency. So far, some viral vectors (SFV vectors, and especially influenza viral vectors) have been developed, with high safety and immunogenicity demonstrated in various models (chicken, ferrets, rhesus macaques, and humans) [178] , [179] , [237] , [238] , [239] . Influenza viral vectors may be a promising candidate for human use because of the lack of pre-existing immunity in humans. After immunization with recombinant influenza A viruses of the subtypes H5N1 and H1N1 expressing Brucella protective antigen (ribosomal protein L7/L12 or Omp16), a strong cellular immune response and protective effect were induced, even comparable with those induced by a commercial B. abortus S19 vaccine [180] . Further, a tetravalent vaccine formulation (expressing Omp16, L7/L12, Omp19, and Cu-Zn SOD in recombinant influenza viral vector subtype H5N1 without an adjuvant) was developed to prevent human brucellosis [181] , [240] . In addition, because Brucella can infect people of any age, the long-term protection of this viral vector vaccine also needs to be considered. Bacterial vectors L. lactis can be used as a delivery system by expressing B. abortus antigen in the cytoplasm, cell wall, or extracellularly [241] . However, the final protective effect may be related to the antigen type and its location. For example, oral administration of L. lactis expressing L7/L12 in the cytoplasm only provided partial protection in mice [182] , while secretory expression of Cu-Zn SOD induced protective immunity similar to positive controls (immunized with B. abortus strain RB51) [183] . Studies on attenuated S. typhimurium vector indicated that secretory expressing Brucella L7/L12 or fusion antigen (fusing L7/L12 and lumazine synthase (BLS)) could induce stronger humoral and cellular immune responses and higher protection against Brucella infection than intracellular expressing vectors [185] , [186] . Thus, construction of L. lactic -based vaccines with secretory expressing Brucella antigens may be a more suitable way to induce protective immunization. Because Brucella is an intracellular bacterium, cellular immunity is relatively more important and this response could be strengthened through the addition of CpG adjuvants [187] . It was found that mucosal immunization could also provide protection from mucosal infection by B. abortus [185] . Therefore, the choice of appropriate adjuvants and mucosal route are beneficial for inducing the protective response against B. abortus infection. In addition, some other delivery systems, such as chitosan derivatives (TMC and mannosylated chitosan nanoparticles), liposomes, polymers, and inorganics were used for vaccine design [188] , [189] , [190] , [191] , [192] , [193] . Although there have been few reports about these delivery vehicles, some of them have shown promising application prospects. 2.3.3 S. aureus S. aureus is a pathogenic bacterium that causes a wide spectrum of human infections, inducing severe skin lesions, pneumonia, bacteremia, and meningitis. Overuse of antibiotic regimens has led to the emergence of resistance, which presents a great challenge to clinical treatment. OMVs have been widely explored for the development of vaccine against S. aureus . For example, OMVs from modified E. coli were decorated with five S. aureus protective antigens by fusion expression with lipoprotein leader sequence. The concentration of antigens reached 5%–20% of total OMV proteins, and great protection was demonstrated in three mouse infection models (a sepsis model, a renal abscess model, and a skin infection model) [194] . Generally, although the removal of LPS reduced the toxicity of OMVs, there are still many toxic proteins on the outer membrane [242] . Kim et al. designed bacterial protoplast-derived nanovesicles (PDNVs) by depleting toxic outer membrane components of E. coli to improve the security and productivity of OMVs. This delivery platform could load different antigens. In immunized mice, strong antigen-specific humoral and cellular immune responses were induced, and full protection from lethal challenge with S. aureus was observed [195] . In addition, the OMVs of S. aureus itself were also used to prepare vaccines because they contain a variety of antigen components. Wang et al. prepared engineered extracellular vesicles (EVs) by expressing non-toxic Hla H35L and LukE in a S. aureus mutant strain. The animal experiment results indicated that the engineered EVs could induce stronger specific antibody response and protect mice in a lethal sepsis model. Further, an array of bacterial antigens, such as lipoproteins, exotoxins, and cytoplasmic proteins, could also be encapsulated as a vaccine platform [196] . Since S. aureus can invade and survive inside host cells, cellular immunity is also needed. By coating EVs on the surface of indocyanine green (ICG)-loaded magnetic mesoporous silica nanoparticles (MSNs), endocytosis EVs can escape from lysosomes through their breaking by heating ICG with laser irradiation, and improved CD8 + T cell responses were induced to prevent and treat S. aureus infection [197] . Generally speaking, there are two main strategies to prepare S. aureus vaccines using microbial secreted vesicles. One is to express S. aureus antigen in E. coli and the other is to load the antigen in secreted OMVs. As an engineering strain, E. coli is more convenient for gene operation, and it can be easily optimized. For the other, the EVs of S. aureus itself contain a large number of antigen components, so they may also be a potential candidate. However, the main problem to be solved includes the safety of EVs because EVs contain biologically active toxins and induce a strong inflammatory response [243] , [244] , [245] . For some pathogenic bacteria with various infection forms and target organs, a variety of advanced delivery systems have been developed; among them, biological vectors such as viral vectors and probiotic vectors have been widely used. For a B. anthracis vaccine, the antigen is relatively unique, so different delivery systems are more comparable. It has been found that the immune effect of viral vectors from animal experiments is better than that of probiotic vectors, which was also revealed in the Brucella vaccines studies. For this phenomenon, in addition to the carrier itself, the immunization method and immunization dose may also be important factors. Furthermore, due to the variety of bacteria, the same delivery system in different pathogenic bacteria vaccine research will provide references for the general application of an advanced delivery system. 2.1 Respiratory infectious diseases and advanced delivery systems Respiratory infections represent a serious health problem worldwide that mainly affects children, older people, and immunocompromised individuals. Pneumonia vaccines (e.g., 23-valent polysaccharide vaccines, 13-valent polysaccharide conjugate vaccines) have achieved great success worldwide. Nevertheless, the existence of a variety of serotypes (>95) of S. pneumoniae makes the capsular polysaccharide (CPS)-based vaccines unable to provide broad protection [9] , while the cost of preparing vaccines containing all serotypes is very high. In addition, there may still be undetected serotypes [10] . In this case, effective delivery systems of proteinaceous antigens have been developed for the prevention of pneumonia. In addition to the delivery efficacy, a combined mucosal and systemic immune response is also appreciated for pneumonia vaccines [11] , which not only requires novel delivery design but also a specific administration route (e.g., noninvasive mucosal routes). At present, there are a variety of delivery systems for pulmonary infectious diseases and they have shown good results ( Table 1 ). Table 1 Effect of vaccines with delivery systems against pulmonary infectious diseases. Pathogenic bacteria Delivery system Antigen(s) Adjuvants used Route Animal species Protection after challenge Ref. S. pneumoniae cCHP Nanogel PspA — i.n. Mice 100% of animals surviving [12] Hybrid biological-biomaterial vector (PBAE and bacterial core) PspA or PspA b — s.c. Mice 100% of animals surviving [13] Liposomes Polysaccharide (Serotypes 3) — i.n. Mice No results [14] LEPS PncO, GlpO, and polysaccharide (Serotypes 19F, 11A, and 35C) — s.c. Mice 100% of animals surviving [15] Chitosan PsaA — i.n. Mice 100% of animals surviving [16] Chitosan PsaA (DNA) — i.n. Mice Decreased bacterial colonization in nasopharynx [17] Polyanhydride nanoparticles PspA — s.c. Mice No results [18] PLA microparticles PspA — i.m. Mice No results [19] NP/NCMP PspA4Pro — PM Mice 67% of animals surviving [20] L. lactis , L. casei , L. plantarum , and L. helveticus PsaA (Surface) b — i.n. Mice Decreased bacterial colonization in the nasal mucosa [21] L. casei PspA b — i.n. Mice 33% of animals surviving [22] L. casei PspA5 (Cytoplasm) b or PspC (Cytoplasm) b — Mice PspA5: 40% of animals surviving; PspC: 20% of animals surviving [23] L. casei PspC (Surface or Cytoplasm) b — i.n. Mice Decreased bacterial colonization in the nasopharynx [24] L. lactis PspA b — i.n. Mice 40% of animals surviving [25] L. lactis PppA b — i.n. Mice 60% of adults and 70% of young mice surviving [26] L. lactis (GEM) or live L. lactis PppA or PppA b — i.n. or oral Mice Decreased bacterial number in the lungs and blood [27] L. lactis (GEM) IgA1p, PpmA, and SlrA — i.n. Mice Decreased bacterial number in the lungs, blood, and nose from trivalent vaccine and the divalent formulation containing SlrA and IgA1p [28] VLP (Qβ) TS3 and TS14 (chemically synthesized two kinds of capsular polysaccharides repeated units) — i.m. Mice TS14: 90% of animals surviving, compared with 66% of controls; TS3: 95% of animals surviving, compared with 40% of controls [29] VLP (HBsAg) Capsular polysaccharide 33F — s.c. Mice No results [30] K. pneumoniae OMVs OMV components — i.p. Mice 100% of animals surviving [31] BN-OMVs OMV components — s.c. Mice 100% of animals surviving [32] Alginate microparticles LPS of K. pneumoniae O1 serotype — i.m., i.t. a , or i.n. Mice Decreased bacterial loading in the lungs [33] B. pertussis OMVs OMV components — i.p. or i.n. a Mice Decreased bacterial colonization in the lungs [34] OMVs OMV components — s.c. Mice Decrease bacterial colonization in the lungs; slightly faster than that of wPV OMVs OMV components — PM a or s.c. Mice Decreased bacterial colonization in the lungs, trachea, and nose [35] OMVs deriving from B. parapertussis OMV components — i.p. Mice Cross-protection [36] Lipid A-modified OMVs OMV components — i.n. Mice Decreased bacterial counts in the lungs [37] L. acid bacteria (GEM) PTd, FHA, and PRN — i.p. or i.n. a Mice Decreased bacterial counts in the lungs and trachea (but not reaching statistical significance compared with antigen alone) [38] PLGA nano/microparticle PTd — s.c. Mice Decreased bacterial counts in the lungs [39] PLG nano or microparticle PTd and FHA — Oral, i.p. a , i.m. a , or s.c. Mice Decrease bacterial counts in the lungs [40] Haemophilus influenzae type b (Hib) Chitosan hydrogel (ViscoGel) a commercial Hib conjugate vaccine (Act-Hib) — s.c. or i.m. Mice No results [41] VLP (HBsAg) PRP polysaccharide — s.c. Mice No results [42] Mycobacterium tuberculosis Chitosan Esat-6 three T cell epitopes (Esat-6/3e) and fms-like tyrosine kinase 3 ligand (FL) genes (DNA) — i.m. prime (Esat-6/3e-FL) and i.n. boost (Esat-6/3e) Mice Decreased bacterial counts in the lungs and spleens [43] Chitosan Mycobacterium lipids — i.p. Mice No results [44] Mycobacterium bovis Liposome Fusion of antigen 85b and Esat-6 — s.c. Mice Decreased bacterial counts in the lungs and spleen [45] a. The better or the best route to achieve protection; b. Constructed in an expression vector; i.n., intranasal; s.c., subcutaneous; i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; i.t., intratracheal; PM, pulmonary; —, without added adjuvant. 2.1.1 S. pneumoniae S. pneumoniae is a global endemic pathogen causing a wide range of clinical diseases, such as pneumonia, meningitis, and sepsis, which frequently lead to death among children all over the world, especially in developing countries [46] . Colonization with S. pneumoniae in humans is universal [47] ; however, it provides an opportunity for the remaining serotypes to establish residence and progress to virulence [48] , [49] . In addition to direct infection, the bacteria usually exist in the form of biofilm, and some destructive events, such as viral infection, can prompt the release of a virulent subpopulation of bacteria to the lungs, blood, middle ear, and other parts of the body, causing the aforementioned diseases [50] , [51] . Therefore, high levels of IgG antibodies produced by humoral immunity are very important for invasive infections, and antigen-specific sIgA antibodies are the key to prevention of S. pneumoniae colonization of the upper respiratory tract. Various delivery vehicles (e.g., polymers, virus-like particles (VLPs), L. lactis , liposomes) have been used to deliver S. pneumoniae protein or glycan antigens, which showed a strong ability to prevent bacterial invasive infections and inhibit the colonization of the respiratory tract ( Table 1 ). Among them, some vaccine formulations offered universal pneumococcal disease prevention. For example, Jones et al. proposed a vaccine platform through the liposomal encapsulation of polysaccharides (LEPS) technology. The completed LEPS vehicle (about 300 nm in size) was coupled with the PncO and GlpO protein antigens (identified through an antigen discovery and validation model that selectively targeted pneumococci virulence transition [52] ) for the liposomal containment of polysaccharides (serotypes 19F, 11A, and 35C). Thus, this vaccine not only prevents the colonization of the most aggressive S. pneumoniae serotypes, but it also restricts virulence transition [15] . Since pneumonia vaccines are often used in children and older adults, the safety and immune activation ability of the delivery carriers need to be greater. Thus, we further focused on the latest several delivery systems that can produce the best protective effect. Nanogel It has been reported that a self-assembled nanosized hydrogel (nanogel) containing a cationic type of cholesteryl group-bearing pullulan (cCHP) can be used as a vaccine delivery system [53] , [54] , [55] . This nanogel could effectively transfer antigen to nasal epithelial cells and dendritic cells (DC) under the basement membrane and induce antigen-specific immune response as a non-adjuvanted vaccine ( Fig. 1 ). After loading with a single protein antigen PspA, both specific IgG levels in the serum and bronchial fluids and IgA levels in the nasal fluid were significantly elevated in nasally administered mice [12] , and all of the responses were involved in establishing protective immunity against pneumococci [56] , [57] , [58] , [59] . Further, a study in rhesus macaques revealed that the cCHP-based pneumococcal vaccine induced significantly elevated PspA-specific IgG and IgA levels and kept them for a long time [60] . Moreover, positron emission tomography (PET) analysis combined with magnetic resonance imaging (MRI) has confirmed that the cCHP nanogel vaccine is not deposited in the olfactory bulbs and brains in macaques [60] , suggesting that it is also safe to use as a nasal vaccine in humans. Fig. 1 Application of cCHP nanogel as nasal immune delivery system via nasal route [61] . cCHP is composed of a cholesteryl group-bearing pullulan (CHP) with a cationic amino group. cCHP nanogels can encapsulate proteins in the internal space through hydrophobic interactions and effectively retain them in the negatively charged nasal mucosa. Hybrid biological-biomaterial vector Yi et al. have reported a combined delivery device named hybrid biological-biomaterial vector, which consists of a bacterial core electrostatically coated with a cationic polymer (a mannosylated poly (β-amino ester) (PBAE)) [62] . The biological portion of the vector is a bacterial cell (live or dead), containing natural adjuvant properties, and it is beneficial for passive targeting of phagocytic APCs ( Fig. 2 ). The vector's composition and the surface characteristics endowed by the mannosylated PBAE engage APC receptors and enhance the uptake upon vector administration. After subcutaneous injection of the vector expressing pneumonia PspA protein antigen in mice, a strong specific immune response providing a wide range of protection against 10 different clinical S. pneumoniae was induced. Moreover, the localization of PspA in the cytoplasm could provide a stronger immune protection effect than that in the periplasm or on the surface of bacteria [13] . As for the combination of biomaterial and biological components, each has its own antigen delivery characteristics and plays a role in the immune process. Moreover, such synergy is conducive for obtaining the best immune effects. In addition, E. coli can be further modified by genetic engineering to be more suitable for antigen delivery. Because the antigen is loaded with bacterial vectors, it provides a variety of possibilities for using different antigen locations and different loading forms, such as proteins and nucleic acids. Fig. 2 Construction of a hybrid biological-biomaterial vector [62] . (A) Schematic diagram of the hybrid biological-biomaterial vector preparation. (B) Scanning electron microscopy image of the vector. 2.1.2 Klebsiella pneumoniae K. pneumoniae belongs to gram-negative family Enterobacteriaceae . It exists widely in the natural environment and acts as opportunistic pathogen, so serious infections may be induced in patients with severe infections and weakened immune system [63] . Klebsiella species remain the world's most common nosocomial pathogens [64] and the main cause of hospital-acquired pneumonia resulting in high mortality rate. Currently, the biggest challenge of K. pneumoniae treatment is drug resistance, which makes the use of common antibiotics ineffective. Indeed, the extended-spectrum β-lactam-producing and carbapenem-resistant K. pneumoniae (CRKP) has been recognized by the World Health Organization as a critical public health threat [65] . Outer membrane vesicles (OMVs) A large number of gram-negative bacteria can naturally produce extracellular OMVs, which have significant advantages in vaccine development. Compared with other lipid nanoparticles, OMVs contain toll-like receptor (TLR) agonists, such as outer membrane proteins, lipoproteins and lipopolysaccharides (LPS), and a variety of immunogenic endogenous antigens. Generally, the diameter range of OMVs is from 50 nm to 250 nm, which is suitable for targeting and being phagocytized by APCs [66] . The use of OMVs has become a very promising strategy of vaccination. K. pneumoniae -derived OMVs can induce strong humoral and cellular immunity response, preventing bacteria-induced lethality in intraperitoneally immunized mice [31] . Although natural OMVs are considered potential vaccine candidates, they have some shortcomings. One is a wide size range of OMVs naturally secreted by bacteria, which may complicate the vaccine dynamics in vivo , and the low stability of natural OMVs also profoundly affects the vaccine effect. To solve these problems, Wu et al. described a core-shell structure to reinforce the OMVs by depositing the hollow-structured OMVs onto bovine serum albumin nanoparticles (BN-OMVs). The size of the BN-OMVs was mostly between 70 and 90 nm, and the immune response and protection against CRKP were significantly improved after subcutaneous vaccination [32] . Alginate microparticles Microcapsules have been developed as a delivery vector for mucosal vaccines because they could improve the uptake into APCs and sustain the release of antigenic material . As polymers, alginate microparticles are easy to obtain and inexpensive and have several advantages in vaccines. Unlike the formation of (lactide-co-glycolide) PLG particles, which require harsh denaturation conditions, the conditions for alginate microparticles formation are mild [67] . Moreover, the mucoadhesive properties of alginate microparticles may prolong the contact time with the absorptive epithelium and the mucosa-associated lymphoid tissue M cells, thus promoting the uptake of the coated antigen. When LPS of K. pneumoniae O1 was loaded in alginate microparticles, the particle size was less than 5 μm. Both effective systemic and mucosal immune responses were induced following nasal and inhalation administration, which protected rodents against lobar pneumonia [33] . Although LPS encapsulation with microspheres or liposomes can reduce its pyrogenic and toxic properties and induce protective polysaccharide antibody [68] , the natural LPS can still cause severe inflammation. At present, many serotypes of K. pneumoniae have been identified, but only four of them (O1, O2, O3, and O5) can cause human diseases, indicating that O-polysaccharide-based vaccines could provide a high coverage. However, the O-polysaccharide has high specificity but low immunogenicity, which requires more efficient delivery systems. 2.1.3 Bordetella pertussis Pertussis is a serious childhood respiratory disease, with the main feature of a persistent and paroxysmal cough, accompanied by a typical inhalation "whooping" sound. A typical pertussis infection usually lasts 3 months. Therefore, it is also called "hundred-day cough" [69] . The disease is caused by B. pertussis, which mainly spreads through aerosols and may settle in the respiratory tract, thereby damaging epithelial cells and impairing normal respiratory function. Although acellular pertussis vaccines (aPVs) containing multiple antigen components can provide wider coverage [70] , there are still problems to be solved, such as poor immunization response and short-term protection. In addition, surveys in many countries have found that the incidence of pertussis is increasing, and there have even been pertussis outbreaks in many countries and regions in recent years [71] , [72] , [73] . This phenomenon is also known as the "Pertussis Resurgence" [74] , [75] . Therefore, pertussis still poses a threat to the health of children, and a safer and more protective vaccine is needed. Many delivery vehicles, such as OMVs, L. acid bacteria, and polymers have been developed against B. pertussis. Among them, OMVs have been most thoroughly studied. Many studies have demonstrated that OMVs derived from B. pertussis can protect mice from intranasal pertussis challenge through different immune routes, including intraperitoneal, subcutaneous, intranasal, and pulmonary (PM) [34] , [35] , [76] . The classical administration route of OMVs is subcutaneous or intraperitoneal, which does not cause an IgA reaction [77] . For respiratory diseases, mucosal immunity seems more important. By comparing the immune responses evoked by the PM and subcutaneous route, a distinct systemic and a stronger mucosal IgA and Th17 immune response were observed with PM immunization; the PM route also provided more effective inhibition of bacterial colonization in the respiratory tract [35] . Thus, mucosal immunization may be of great significance to improve protection against pertussis infection. Although the systemic proinflammatory cytokine responses have been greatly reduced compared with the whole-cell pertussis vaccine (wPV) [76] , a further detoxification is necessary considering that native B. pertussis OMVs contain a lot of lipooligosaccharide (LOS), which could induce strong host inflammatory responses. Asensio et al. developed a recombinant B. pertussis strain expressing the lipid A-modifying enzyme, PagL, which hydrolyzes the ester bond at the 3 position of lipid A, resulting in tetra- instead of penta-acylated LOS. The OMVs derived from the recombinant strain retained protective capacity against intranasal challenge in intranasally immunized mice [37] . In addition, a cross-protection study found that OMVs derived from B. parapertussis , a close relative of B. pertussis that can also cause pertussis, could provide protection from both B. pertussis and B. parapertussis infections [36] . Further, long-term protection from pertussis OMV-based vaccine is based on the induction of lung-resident CD4 + memory T cells (T RM ) [78] , suggesting that effectiveness may cover the entire period of childhood. Respiratory pathogenic bacterial infections involve colonization and invasion; therefore, mucosal immunity is considered an ideal choice for the prevention of respiratory diseases and blocking transmission because it involves both mucosal and humoral immune responses. Nasal mucosal immunity has the advantages of low response threshold, low antigen dosage, and no immune tolerance. However, under conventional conditions, antigens can only stay on the mucosal surface for a short time after entering the nasal cavity, and a small amount of proteolytic enzymes and mucus weaken the strength of the immune response. Therefore, the main requirement for a nasal mucosal immune delivery system is to enhance the adhesion and retention of antigens on the mucosal surface, enhance the immunogenicity of the antigens, and promote the effective uptake of antigens by DCs. In addition, polysaccharide antigens have strong specificity, and the produced antibodies are protective. The polysaccharide conjugate vaccine for S. pneumoniae has achieved great success. However, the current chemical preparation method is a time-consuming and multistep process, which makes the vaccine expensive and difficult to popularize in developing countries. In contrast, the current biotechnology of coupled bacterial polysaccharide and carrier protein based on protein glycosylation modification has achieved partial success and is expected to overcome the limitations of polysaccharide conjugate vaccine. The use of VLP to couple a single polysaccharide repeat unit of S. pneumoniae can also produce a protective effect, suggesting that nanocarriers have advantages in stimulating polysaccharide immune responses. Therefore, the combination of a nanodelivery carrier and glycosylation system is expected to prepare a new, low-cost, high-efficiency pneumonia polysaccharide conjugate vaccine. Although a variety of probiotic carriers were used in the research of pneumococcal vaccines, the final immune effect was not optimal. It may be that, compared with the intestine, the respiratory environment is not suitable for their survival, colonization, presentation, and antigen release. In addition, about 80% of clinical isolates of K. pneumoniae belong to one of four serotypes (O1, O2, O3, and O5), so polysaccharide antigens can be used to prepare multivalent vaccines. However, the immunogenicity of OPS is generally low, especially for O2 polysaccharide repeat units composed of two simple galactoses, which makes it difficult for O2 antigen to stimulate an effective immune response using traditional vaccine strategies. Therefore, delivery systems for weak polysaccharide antigens need further development. 2.1.1 S. pneumoniae S. pneumoniae is a global endemic pathogen causing a wide range of clinical diseases, such as pneumonia, meningitis, and sepsis, which frequently lead to death among children all over the world, especially in developing countries [46] . Colonization with S. pneumoniae in humans is universal [47] ; however, it provides an opportunity for the remaining serotypes to establish residence and progress to virulence [48] , [49] . In addition to direct infection, the bacteria usually exist in the form of biofilm, and some destructive events, such as viral infection, can prompt the release of a virulent subpopulation of bacteria to the lungs, blood, middle ear, and other parts of the body, causing the aforementioned diseases [50] , [51] . Therefore, high levels of IgG antibodies produced by humoral immunity are very important for invasive infections, and antigen-specific sIgA antibodies are the key to prevention of S. pneumoniae colonization of the upper respiratory tract. Various delivery vehicles (e.g., polymers, virus-like particles (VLPs), L. lactis , liposomes) have been used to deliver S. pneumoniae protein or glycan antigens, which showed a strong ability to prevent bacterial invasive infections and inhibit the colonization of the respiratory tract ( Table 1 ). Among them, some vaccine formulations offered universal pneumococcal disease prevention. For example, Jones et al. proposed a vaccine platform through the liposomal encapsulation of polysaccharides (LEPS) technology. The completed LEPS vehicle (about 300 nm in size) was coupled with the PncO and GlpO protein antigens (identified through an antigen discovery and validation model that selectively targeted pneumococci virulence transition [52] ) for the liposomal containment of polysaccharides (serotypes 19F, 11A, and 35C). Thus, this vaccine not only prevents the colonization of the most aggressive S. pneumoniae serotypes, but it also restricts virulence transition [15] . Since pneumonia vaccines are often used in children and older adults, the safety and immune activation ability of the delivery carriers need to be greater. Thus, we further focused on the latest several delivery systems that can produce the best protective effect. Nanogel It has been reported that a self-assembled nanosized hydrogel (nanogel) containing a cationic type of cholesteryl group-bearing pullulan (cCHP) can be used as a vaccine delivery system [53] , [54] , [55] . This nanogel could effectively transfer antigen to nasal epithelial cells and dendritic cells (DC) under the basement membrane and induce antigen-specific immune response as a non-adjuvanted vaccine ( Fig. 1 ). After loading with a single protein antigen PspA, both specific IgG levels in the serum and bronchial fluids and IgA levels in the nasal fluid were significantly elevated in nasally administered mice [12] , and all of the responses were involved in establishing protective immunity against pneumococci [56] , [57] , [58] , [59] . Further, a study in rhesus macaques revealed that the cCHP-based pneumococcal vaccine induced significantly elevated PspA-specific IgG and IgA levels and kept them for a long time [60] . Moreover, positron emission tomography (PET) analysis combined with magnetic resonance imaging (MRI) has confirmed that the cCHP nanogel vaccine is not deposited in the olfactory bulbs and brains in macaques [60] , suggesting that it is also safe to use as a nasal vaccine in humans. Fig. 1 Application of cCHP nanogel as nasal immune delivery system via nasal route [61] . cCHP is composed of a cholesteryl group-bearing pullulan (CHP) with a cationic amino group. cCHP nanogels can encapsulate proteins in the internal space through hydrophobic interactions and effectively retain them in the negatively charged nasal mucosa. Hybrid biological-biomaterial vector Yi et al. have reported a combined delivery device named hybrid biological-biomaterial vector, which consists of a bacterial core electrostatically coated with a cationic polymer (a mannosylated poly (β-amino ester) (PBAE)) [62] . The biological portion of the vector is a bacterial cell (live or dead), containing natural adjuvant properties, and it is beneficial for passive targeting of phagocytic APCs ( Fig. 2 ). The vector's composition and the surface characteristics endowed by the mannosylated PBAE engage APC receptors and enhance the uptake upon vector administration. After subcutaneous injection of the vector expressing pneumonia PspA protein antigen in mice, a strong specific immune response providing a wide range of protection against 10 different clinical S. pneumoniae was induced. Moreover, the localization of PspA in the cytoplasm could provide a stronger immune protection effect than that in the periplasm or on the surface of bacteria [13] . As for the combination of biomaterial and biological components, each has its own antigen delivery characteristics and plays a role in the immune process. Moreover, such synergy is conducive for obtaining the best immune effects. In addition, E. coli can be further modified by genetic engineering to be more suitable for antigen delivery. Because the antigen is loaded with bacterial vectors, it provides a variety of possibilities for using different antigen locations and different loading forms, such as proteins and nucleic acids. Fig. 2 Construction of a hybrid biological-biomaterial vector [62] . (A) Schematic diagram of the hybrid biological-biomaterial vector preparation. (B) Scanning electron microscopy image of the vector. 2.1.2 Klebsiella pneumoniae K. pneumoniae belongs to gram-negative family Enterobacteriaceae . It exists widely in the natural environment and acts as opportunistic pathogen, so serious infections may be induced in patients with severe infections and weakened immune system [63] . Klebsiella species remain the world's most common nosocomial pathogens [64] and the main cause of hospital-acquired pneumonia resulting in high mortality rate. Currently, the biggest challenge of K. pneumoniae treatment is drug resistance, which makes the use of common antibiotics ineffective. Indeed, the extended-spectrum β-lactam-producing and carbapenem-resistant K. pneumoniae (CRKP) has been recognized by the World Health Organization as a critical public health threat [65] . Outer membrane vesicles (OMVs) A large number of gram-negative bacteria can naturally produce extracellular OMVs, which have significant advantages in vaccine development. Compared with other lipid nanoparticles, OMVs contain toll-like receptor (TLR) agonists, such as outer membrane proteins, lipoproteins and lipopolysaccharides (LPS), and a variety of immunogenic endogenous antigens. Generally, the diameter range of OMVs is from 50 nm to 250 nm, which is suitable for targeting and being phagocytized by APCs [66] . The use of OMVs has become a very promising strategy of vaccination. K. pneumoniae -derived OMVs can induce strong humoral and cellular immunity response, preventing bacteria-induced lethality in intraperitoneally immunized mice [31] . Although natural OMVs are considered potential vaccine candidates, they have some shortcomings. One is a wide size range of OMVs naturally secreted by bacteria, which may complicate the vaccine dynamics in vivo , and the low stability of natural OMVs also profoundly affects the vaccine effect. To solve these problems, Wu et al. described a core-shell structure to reinforce the OMVs by depositing the hollow-structured OMVs onto bovine serum albumin nanoparticles (BN-OMVs). The size of the BN-OMVs was mostly between 70 and 90 nm, and the immune response and protection against CRKP were significantly improved after subcutaneous vaccination [32] . Alginate microparticles Microcapsules have been developed as a delivery vector for mucosal vaccines because they could improve the uptake into APCs and sustain the release of antigenic material . As polymers, alginate microparticles are easy to obtain and inexpensive and have several advantages in vaccines. Unlike the formation of (lactide-co-glycolide) PLG particles, which require harsh denaturation conditions, the conditions for alginate microparticles formation are mild [67] . Moreover, the mucoadhesive properties of alginate microparticles may prolong the contact time with the absorptive epithelium and the mucosa-associated lymphoid tissue M cells, thus promoting the uptake of the coated antigen. When LPS of K. pneumoniae O1 was loaded in alginate microparticles, the particle size was less than 5 μm. Both effective systemic and mucosal immune responses were induced following nasal and inhalation administration, which protected rodents against lobar pneumonia [33] . Although LPS encapsulation with microspheres or liposomes can reduce its pyrogenic and toxic properties and induce protective polysaccharide antibody [68] , the natural LPS can still cause severe inflammation. At present, many serotypes of K. pneumoniae have been identified, but only four of them (O1, O2, O3, and O5) can cause human diseases, indicating that O-polysaccharide-based vaccines could provide a high coverage. However, the O-polysaccharide has high specificity but low immunogenicity, which requires more efficient delivery systems. 2.1.3 Bordetella pertussis Pertussis is a serious childhood respiratory disease, with the main feature of a persistent and paroxysmal cough, accompanied by a typical inhalation "whooping" sound. A typical pertussis infection usually lasts 3 months. Therefore, it is also called "hundred-day cough" [69] . The disease is caused by B. pertussis, which mainly spreads through aerosols and may settle in the respiratory tract, thereby damaging epithelial cells and impairing normal respiratory function. Although acellular pertussis vaccines (aPVs) containing multiple antigen components can provide wider coverage [70] , there are still problems to be solved, such as poor immunization response and short-term protection. In addition, surveys in many countries have found that the incidence of pertussis is increasing, and there have even been pertussis outbreaks in many countries and regions in recent years [71] , [72] , [73] . This phenomenon is also known as the "Pertussis Resurgence" [74] , [75] . Therefore, pertussis still poses a threat to the health of children, and a safer and more protective vaccine is needed. Many delivery vehicles, such as OMVs, L. acid bacteria, and polymers have been developed against B. pertussis. Among them, OMVs have been most thoroughly studied. Many studies have demonstrated that OMVs derived from B. pertussis can protect mice from intranasal pertussis challenge through different immune routes, including intraperitoneal, subcutaneous, intranasal, and pulmonary (PM) [34] , [35] , [76] . The classical administration route of OMVs is subcutaneous or intraperitoneal, which does not cause an IgA reaction [77] . For respiratory diseases, mucosal immunity seems more important. By comparing the immune responses evoked by the PM and subcutaneous route, a distinct systemic and a stronger mucosal IgA and Th17 immune response were observed with PM immunization; the PM route also provided more effective inhibition of bacterial colonization in the respiratory tract [35] . Thus, mucosal immunization may be of great significance to improve protection against pertussis infection. Although the systemic proinflammatory cytokine responses have been greatly reduced compared with the whole-cell pertussis vaccine (wPV) [76] , a further detoxification is necessary considering that native B. pertussis OMVs contain a lot of lipooligosaccharide (LOS), which could induce strong host inflammatory responses. Asensio et al. developed a recombinant B. pertussis strain expressing the lipid A-modifying enzyme, PagL, which hydrolyzes the ester bond at the 3 position of lipid A, resulting in tetra- instead of penta-acylated LOS. The OMVs derived from the recombinant strain retained protective capacity against intranasal challenge in intranasally immunized mice [37] . In addition, a cross-protection study found that OMVs derived from B. parapertussis , a close relative of B. pertussis that can also cause pertussis, could provide protection from both B. pertussis and B. parapertussis infections [36] . Further, long-term protection from pertussis OMV-based vaccine is based on the induction of lung-resident CD4 + memory T cells (T RM ) [78] , suggesting that effectiveness may cover the entire period of childhood. Respiratory pathogenic bacterial infections involve colonization and invasion; therefore, mucosal immunity is considered an ideal choice for the prevention of respiratory diseases and blocking transmission because it involves both mucosal and humoral immune responses. Nasal mucosal immunity has the advantages of low response threshold, low antigen dosage, and no immune tolerance. However, under conventional conditions, antigens can only stay on the mucosal surface for a short time after entering the nasal cavity, and a small amount of proteolytic enzymes and mucus weaken the strength of the immune response. Therefore, the main requirement for a nasal mucosal immune delivery system is to enhance the adhesion and retention of antigens on the mucosal surface, enhance the immunogenicity of the antigens, and promote the effective uptake of antigens by DCs. In addition, polysaccharide antigens have strong specificity, and the produced antibodies are protective. The polysaccharide conjugate vaccine for S. pneumoniae has achieved great success. However, the current chemical preparation method is a time-consuming and multistep process, which makes the vaccine expensive and difficult to popularize in developing countries. In contrast, the current biotechnology of coupled bacterial polysaccharide and carrier protein based on protein glycosylation modification has achieved partial success and is expected to overcome the limitations of polysaccharide conjugate vaccine. The use of VLP to couple a single polysaccharide repeat unit of S. pneumoniae can also produce a protective effect, suggesting that nanocarriers have advantages in stimulating polysaccharide immune responses. Therefore, the combination of a nanodelivery carrier and glycosylation system is expected to prepare a new, low-cost, high-efficiency pneumonia polysaccharide conjugate vaccine. Although a variety of probiotic carriers were used in the research of pneumococcal vaccines, the final immune effect was not optimal. It may be that, compared with the intestine, the respiratory environment is not suitable for their survival, colonization, presentation, and antigen release. In addition, about 80% of clinical isolates of K. pneumoniae belong to one of four serotypes (O1, O2, O3, and O5), so polysaccharide antigens can be used to prepare multivalent vaccines. However, the immunogenicity of OPS is generally low, especially for O2 polysaccharide repeat units composed of two simple galactoses, which makes it difficult for O2 antigen to stimulate an effective immune response using traditional vaccine strategies. Therefore, delivery systems for weak polysaccharide antigens need further development. 2.2 Intestinal infectious diseases and advanced delivery systems Diarrhea, mainly manifested as watery and loose stools many times a day, is a major global health problem [79] . Bacterial diarrhea, specifically, is a more serious condition with severe symptoms. The most common microorganisms that cause bacterial diarrhea are Escherichia coli , Shigella , Salmonella , Yersinia, and Clostridium [80] . In bacterial diarrhea, pathogens attach to the epithelium, produce toxins, and increase intracellular cAMP or cGMP, ultimately accelerating the secretion process in the enterocytes [81] . Toxins may also induce the release of cytokines, leading to chemotaxis and eicosapentaenoic acid (prostaglandin) production, and aggravate the imbalance of water in the lumen. Excessive water and electrolytes in the intestinal cavity draw more fluid into the intestinal cavity, and the osmotic effect further worsens diarrhea [82] . Therefore, inhibiting bacterial colonization in the intestine can effectively prevent infection, and this ability often comes from IgA produced by mucosal immune response. It is an ideal way for antigens to directly act on the intestinal mucosal immune system to stimulate mucosal immune response. In addition, due to the higher safety of oral administration, some inorganic carriers have also been explored. However, unlike respiratory delivery, most vaccines need to overcome various difficulties to reach the intestinal tract, such as resistance to gastric acid and bile, ability to colonize the intestinal tract, and possible immune tolerance. The delivery systems for the prevention of bacterial diarrhea are summarized in Table 2 . Table 2 Effect of vaccines with delivery systems against intestinal infectious diseases. Pathogenic bacteria Delivery system Antigen(s) Adjuvants used Route Animal species Protection after challenge Ref. E. coli L. reuteri Fusion of ST and LTB b — Oral Mice Decreased gut/carcass weight (G/C) ratios [83] L. casei F41 or K99 fimbriae (Surface) b — Oral or i.n. Mice Over 80% of animals surviving with a high dose, 9 weeks after the last immunization; Passive protection (F41 fimbriae): 90% of pups surviving, oral; 80% of pups surviving, i.n. [84] , [85] , [86] L. casei β-Intimin fragment b — Oral or s.l. Mice Decreased bacterial recovery from feces [87] L. casei Fusion of K99, K88 fimbriae (Surface) b fuse expressing LTB Oral Mice Over 80% of animals surviving 3 weeks after the last immunization, and over 70% of animals surviving 9 weeks after the last immunization [88] L. casei FaeG b co-expressing or fuse expressing mutated LTA and LTB Oral Mice 100% of animals surviving [89] L. plantarum FaeG with DC-targeting peptide b — Oral Mice Inflammation of intestinal tissue prevented [90] L. acidophilus EspA and the Tir central domain (Secreted) b — Oral Mice 80% of animals surviving [91] L. acidophilus K99 (Surface) b — No results Pigs No results [92] L. reuteri PapG (Surface) b — No results No results [93] Detoxified OMVs OMV components — Eyedrop Mice 100% of animals surviving, compared with 20% of controls [94] Chitosan + Eudragit L-100 F4 fimbriae — Oral Reduction in excretion of bacteria [95] Chitosan + Eudragit L-100 + OMVs OMV components — Oral Mice No results [96] PLGA CS3, CS1, LTB, and chimeric CFA/I, CS2, CS3, and LTB — Oral, s.c., or i.p. Mice No results [97] , [98] PLG microspheres CS6 — i.n. Mice No results [99] Nano-multilamellar lipid vesicles (NMVs) Stx2B — s.c. Mice 60% of animals surviving [100] Oil-based Vaxcine TM Conjugation of O111 polysaccharide and EtxB — Oral Rabbits and mice No results [101] LDH and HEC nanoparticles IB — s.c. Mice No results [102] SBA-15 Int1b or O-polysaccharides — s.c. Rabbits and mice No results [101] , [103] Shigella OMVs of six strains — Oral Mice Neonatal mice were 100% passively protected against S. flexneri 2a and S. flexneri 6 , while the protective efficacies against S. dysenteriae 1 , S. flexneri 3a , S. boydii 2, and S. sonnei were ~90% [104] Detoxified OMVs OMV components Alhydrogel i.n., i.d., s.c., i.p., or i.m. Mice, rabbitsand human No results [105] , [106] , [107] OMVs or OMVs encapsulated in polyanhydride nanoparticles (OMV-NP) OMV components — i.d., i.n., eyedrop, or oral Mice OMVs: 100% of animals surviving by nasal and ocular route, and no animal surviving by intradermal route; OMV-NP: 100% of animals surviving by the nasal, oral, and intradermal route [108] , [109] OMVs encapsulated in CS-TPP particles and Eudragit L-100 OMV components — Oral or i.d. Mice passive immunity protection [110] Self-assembled proteinaceous nanoparticles O-polysaccharide — s.c. Mice 100% of animals surviving [111] Chitosan MxiH — i.n. Mice 60% of animals surviving, compared with 10% of controls [112] Chitosan NF N-IpaD — i.n. Guinea pigs 93.75% protective efficacy against ocular challenge in guinea pigs [113] TMC nanoparticles N-IpaD — Oral Guinea pigs 83.3% protection against ocular challenge in guinea pigs [114] V. cholerae OMVs OMV components — Oral, i.n., or i.p. Rabbits and mice 60%–100% protective from watery diarrhea from different V. cholerae strains in rabbit; 100% protection against colonization with V. cholerae in neonatal mice from immunized dams [115] , [116] L. casei or L. reuteri CTB (Cytoplasm or secretory) b — No results Mice No results [117] S. typhimurium OMVs OMV components — i.p. Mice Bacterial replication inhibited [118] S. typhi and paratyphi A Bivalent OMVs OMV components — Oral Mice 80% of animals surviving against S. typhi and 90% of animals surviving against S. paratyphi A [119] S. typhi VLP (HBsAg) Vi — s.c. Mice No results [42] S. enterica serovar Enteritidis L. casei FliC (Surface) b — Oral Mice Decreased bacterial counts in the spleen [120] S. enterica serovar Enteritidis L. casei FliC (Surface) b or fusion of FilC and SipC (Surface) b — No results Mice No results [121] b. Constructed in an expression vector; i.n., intranasal; s.c., subcutaneous; i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; i.d., intradermal; s.l., sublingual; —, without added adjuvant. 2.2.1 Pathogenic E. coli Enterotoxigenic E. coli (ETEC) is the most common cause of diarrhea in humans [81] . It has become a major global food and waterborne pathogen involved in outbreaks of bloody diarrhea and hemolytic–uremic syndrome (HUS) worldwide [122] . Colonization factors (CFs), produced in ETEC, were considered as targets for vaccine production [123] , [124] . Although about 25 different types of CFs have been identified [123] , [125] , naked CFs are not suitable for oral immunization because of their high sensitivity to the harsh environment of the gastrointestinal tract. Lactic acid bacteria Lactic acid bacteria are a safe and efficient mucosal delivery carrier, which is widely used in the prevention of gastrointestinal infectious diseases. Compared with some other carriers, lactic acid bacteria are more favorable for oral administration because they can pass through the extreme environment of the stomach and colonize the intestine. Moreover, both strong antigen-specific systemic and mucosal immune responses are induced by lactic acid bacteria through mucosal immunity. In the design of E. coli vaccine, antigens could be located on the surface, in the cytoplasm, or be secretions of lactic acid bacteria ( Fig. 3 ). At present, many lactic acid bacteria, such as L. reuteri , L. casei , L. plantarum , and L. plantarum, have been used to express a variety of antigens, but L. casei has been most studied [126] . For example, L. casei expressing F41 constructed by Liu et al. can stimulate strong systemic and local mucosal immune responses simultaneously after oral immunization, protecting mice from lethal challenge. It is worth noting that this immunization strategy can also stimulate long-term protection, considering that it can maintain more than 80% protection 9 weeks after the last immunization [84] , [85] . Another study also revealed the passive protection effects of L. casei expressing F41 antigen considering that the orally or intranasally immunized dams provided 90% protection against lethal challenge to their offspring [86] . Furthermore, Yu et al. found that immunization with L. casei co-expression or fusion expression of FaeG antigen and fusion protein (including LTB and mutated LTA) can stimulate a stronger mucosal immune response and provide 100% protection [89] . Since the intestinal epithelium contains a large number of M cells, which can bind B5 toxins (such as LTB and CTB) through the GM1 receptor [127] , B5 toxin proteins can be used as a mucosal adjuvant to further improve the mucosal immune response of the lactic acid bacteria-based delivery system. Fig. 3 Schematic diagram of construction of oral live lactic acid bacteria vector vaccine and its immune response. (A) Exogenous protein expression and localization in lactic acid bacteria. (B) Following oral vaccination, both systemic and local mucosal immune responses are induced simultaneously. OMV OMVs have been widely studied for the use in vaccines. Intranasal immunization with OMVs from ETEC was shown to induce antibodies against various virulence proteins and inhibit bacterial colonization in the small intestine [128] . However, due to the existence of shiga toxin (STx) and LPS endotoxins, the OMVs produced from EHEC O157: H7 have intrinsic toxicity with the possibility to develop HUS; thus, the preparation of E. coli O157: H7 OMV vaccine needs to overcome its toxicity. Kim et al. generated attenuated OMVs through the mutation of msbB (encoding an acyltransferase that catalyzes the final myristoylation step during lipid A biosynthesis) and A subunit of STx [129] , [130] ; after immunizing mice by eyedrops and confirming the safety, both humoral response and mucosal (in tears, saliva, and feces) immune response were induced, providing enough protection from the challenge by the lethal HUS-causative agent (wild-type OMVs) [94] . Although there is relatively poor lymphoid tissue in the eyes and there are a few reports on immunization via eyedrop route, the connection of lacrimal duct and nasal cavity may result in immunoactivities in both nasal and ocular mucosa. Moreover, the homing of lymphocytes can distribute the effect of mucosal immune response on each mucosal surface of the body; therefore, the intestinal IgA can be successfully induced through other mucosal pathways. Considering that the response at the immune location is still the strongest, the oral route of OMVs should be further tried. Compared with the application of OMVs-based vaccines in the prevention of respiratory diseases, OMVs delivery systems have more applications in intestinal diseases, and correspondingly, there are a series of successful modifications to OMVs. First, various methods can reduce the toxicity of OMV. The toxicity of OMVs can be reduced by deleting the lipid A modification gene msbB, htrB , or combined msbB and pagP [131] , [132] , [133] , [134] . Another method to reduce the toxicity of OMVs is to pre-treat them with all-trans retinoic acid, active metabolite of vitamin A, which has both anti-inflammatory and mucosal adjuvant properties [135] . Then, through some modifications, the OMV yield can be improved. Choi et al. produced OmpC-enriched OMVs through overexpression of small RNAs, MicA, in S. typhimurium . The yield of OMVs was strongly increased and the OmpC-enriched OMVs promoted Th1- and Th17-type immune responses, providing full protection against lethal challenge by Salmonella [136] . Furthermore, the yield can also be improved through the deletion of tolR gene to disrupt the Tol-Pal system on the cell wall. After immunization through the subcutaneous route, the protective effects of OMVs in mice were not inferior compared with those of polysaccharide conjugate vaccines [137] . In addition, by further optimizing the form of OMVs, immune response and protection can be additionally improved, namely, OMVs encapsulated in polyanhydride nanoparticles (OMV-NPs) can induce Th1 immune responses [109] , [138] , which is more suitable for intracellular bacteria, such as S. flexneri . The OMV-NPs formulation even provided full protection on day 56 after nasal immunization in mice, while the protection with OMVs alone was only 40% [108] . Thus, OMVs, which are easier to produce, have a great potential to become a candidate product for the application of vaccines against intestinal infectious diseases. Eudragit L-100/Chitosan Chitosan is a natural biodegradable polysaccharide derived from chitin, with good biocompatibility and adhesion properties. Although chitosan is capable of increasing transit time of antigens in the gastrointestinal tract and inducing mucosal immune response, its oral administration is limited by the low resistance to acidic pH [139] , [140] . To solve this problem, Eudragit L-100, a coating material soluble at pH above 6.0, was used to protect the antigens from detrimental effects in the upper gastrointestinal tract. As reported, Eudragit L-100-based oral delivery vehicle loading ETEC F4 or F18 antigen could induce higher antigen-specific IgG1 and IgG2a antibody responses in serum and antigen-specific IgA in saliva compared with those with antigen immunization alone [141] . To further improve the immune response, a combined delivery system was built by coating Eudragit L-100 on the chitosan nanoparticles which loaded protein antigens or OMVs from ETEC. Oral immunization of the formulations in animals elicited antibody response and inhibited the ETEC colonization in small intestine [95] , [96] . Thus, for some special delivery requirements, multiple delivery strategies can be used at the same time. In addition to the vehicles described above, some other polymers, inorganic materials, and lipid or oil-based vehicles have been explored to develop E. coli vaccines ( Table 2 ). Although strong immune response could be elicited in mice, most of the results lack the in vivo results about the protective effect, and therefore further confirmation is needed. 2.2.2 Shigella Shigella species are gram-negative bacteria belonging to the Enterobacteriaceae family. According to the serological type, they are divided into four categories: S. dysenteriae , S. boydii , S. flexneri , and S. sonnei . Shigella spp. are the main bacterial causes of persistent epidemic diarrhea and result in almost 125 million diarrheal episodes and around 160,000 deaths annually [142] . Usually, a low-dose inoculum can cause the disease, resulting in aggressive watery or mucous/bloody diarrhea. However, there is currently no licensed vaccine against Shigella , and the continuous emergence of drug-resistant strains makes antibiotic treatment difficult [143] . Self-assembled proteinaceous nanoparticles Recently, Pan et al. developed Nano-B5 platform to produce nanoscale bacterial polysaccharide conjugate vaccines in vivo . Proteinaceous nanoparticles were self-assembled via fusion of a natural adjuvant effective pentamer domain (bacterial B5 toxin) and an unnatural trimer domain. Then, O-polysaccharide of S. flexneri was conjugated to the nanoparticle through glycosylation system ( Fig. 4 ) [111] . The nanovaccine can significantly slow down its dissipation at the injection site and enhance lymph node drainage. This delivery vector contains B5 toxin protein module such as CTB, which can bind to GM1 receptor on the surface of APCs, thus promoting antigen endocytosis and presentation [144] . After confirming the safety, subsequent subcutaneous immunization in mice indicated that both strong antigen-specific humoral and cellular immunity were induced, providing complete protection against challenge with 5 × half-lethal dose. In addition, the safety and high efficiency of the delivery carrier were further proven in the cynomolgus monkey model [111] . Polysaccharide-conjugated vaccines are considered the most successful form of bacterial vaccines [145] . However, the traditional chemical method is a time-consuming and costly process [146] , so this biological method can solve this problem by one-step fermentation and one-step purification to obtain vaccine products [147] , [148] , [149] , [150] . This study is also the first study to use a fully biosynthetic method to prepare a nanoscale polysaccharide-conjugated vaccine, leading to a great improvement in the immune effect. Fig. 4 Self-assembled proteinaceous nanoparticles for antigen delivery [111] . (A) Schematic diagram of protein self-assembly and conjugation with bacterial polysaccharide antigen through glycosylation system. (B) Super-resolution structured illumination microscopy images of nanoparticle-expressing bacteria. (C) Transmission electron microscopy images of the nanoparticles conjugating polysaccharide and their size distribution. (D) The vaccine can rapidly enter the draining lymph nodes and simultaneously stimulate strong humoral and cellular immune responses. Chitosan-based delivery systems Chitosan particles are endowed with the properties to prevent encapsulated antigen degradation and extend antigen duration time on the mucosal surface [151] . As an alternative to the oral route for chitosan particles without an additional protection from acid degradation, direct nasal immunity may stimulate the systemic and intestinal IgA immune responses. A study showed that the loading of recombinant Shigella MxiH antigen into chitosan nanoparticles resulted in enhanced humoral and mucosal immune responses in intranasally immunized mice [112] . In addition, various chitosan-based delivery systems are available. For example, Jahantigh et al. described a chitosan nanofibrous membrane (NF) with a high surface area to volume ratio, which is more appropriate for nasal vaccine delivery. After loading N-terminal region of IpaD (N-IpaD) antigen of Shigella , the guinea pigs were intranasally administered, which resulted in induction of significant serum and mucosal antibody responses and protection [113] . Moreover, O-methylated free trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles, which have both mucoadhesive properties and excellent absorption-enhancing effects, even at neutral pH over a wide pH range for oral delivery [152] , or chitosan-tripolyphosphate (CS-TPP) nanoparticles coated with Eudragit L-100 [110] , were developed to further improve the immune response and protective effect of oral or intranasal routes ( Table 2 ). However, these immune effects do not seem to be as good as those of the two previous kinds of delivery systems; thus, further optimization of chitosan or combination with other systems should be explored to enhance immune response. Similar to the respiratory tract infections, digestive tract infections often involve bacterial colonization and invasion. Therefore, mucosal administration is also the first option for immune route, and many delivery systems such as probiotics and OMVs have shown ideal effects in protective. However, unlike the respiratory tract, mucosal delivery in the digestive tract faces more difficulties that need to be overcome, including the acidic environment in the stomach, hydrolysis by gastrointestinal proteases, immune tolerance, and intestinal microbes. In addition, the colonization of gastrointestinal pathogens does not cause easy spreading of the pathogens from person to person. Therefore, the choice of mucosal immunity or other immunization pathways should be specifically weighed. In the prevention of digestive tract infectious diseases, although there are not many studies on non-mucosal immune delivery systems, some have shown great potential, such as the latest bacterial B5 toxin-based protein nanocarriers. 2.2.1 Pathogenic E. coli Enterotoxigenic E. coli (ETEC) is the most common cause of diarrhea in humans [81] . It has become a major global food and waterborne pathogen involved in outbreaks of bloody diarrhea and hemolytic–uremic syndrome (HUS) worldwide [122] . Colonization factors (CFs), produced in ETEC, were considered as targets for vaccine production [123] , [124] . Although about 25 different types of CFs have been identified [123] , [125] , naked CFs are not suitable for oral immunization because of their high sensitivity to the harsh environment of the gastrointestinal tract. Lactic acid bacteria Lactic acid bacteria are a safe and efficient mucosal delivery carrier, which is widely used in the prevention of gastrointestinal infectious diseases. Compared with some other carriers, lactic acid bacteria are more favorable for oral administration because they can pass through the extreme environment of the stomach and colonize the intestine. Moreover, both strong antigen-specific systemic and mucosal immune responses are induced by lactic acid bacteria through mucosal immunity. In the design of E. coli vaccine, antigens could be located on the surface, in the cytoplasm, or be secretions of lactic acid bacteria ( Fig. 3 ). At present, many lactic acid bacteria, such as L. reuteri , L. casei , L. plantarum , and L. plantarum, have been used to express a variety of antigens, but L. casei has been most studied [126] . For example, L. casei expressing F41 constructed by Liu et al. can stimulate strong systemic and local mucosal immune responses simultaneously after oral immunization, protecting mice from lethal challenge. It is worth noting that this immunization strategy can also stimulate long-term protection, considering that it can maintain more than 80% protection 9 weeks after the last immunization [84] , [85] . Another study also revealed the passive protection effects of L. casei expressing F41 antigen considering that the orally or intranasally immunized dams provided 90% protection against lethal challenge to their offspring [86] . Furthermore, Yu et al. found that immunization with L. casei co-expression or fusion expression of FaeG antigen and fusion protein (including LTB and mutated LTA) can stimulate a stronger mucosal immune response and provide 100% protection [89] . Since the intestinal epithelium contains a large number of M cells, which can bind B5 toxins (such as LTB and CTB) through the GM1 receptor [127] , B5 toxin proteins can be used as a mucosal adjuvant to further improve the mucosal immune response of the lactic acid bacteria-based delivery system. Fig. 3 Schematic diagram of construction of oral live lactic acid bacteria vector vaccine and its immune response. (A) Exogenous protein expression and localization in lactic acid bacteria. (B) Following oral vaccination, both systemic and local mucosal immune responses are induced simultaneously. OMV OMVs have been widely studied for the use in vaccines. Intranasal immunization with OMVs from ETEC was shown to induce antibodies against various virulence proteins and inhibit bacterial colonization in the small intestine [128] . However, due to the existence of shiga toxin (STx) and LPS endotoxins, the OMVs produced from EHEC O157: H7 have intrinsic toxicity with the possibility to develop HUS; thus, the preparation of E. coli O157: H7 OMV vaccine needs to overcome its toxicity. Kim et al. generated attenuated OMVs through the mutation of msbB (encoding an acyltransferase that catalyzes the final myristoylation step during lipid A biosynthesis) and A subunit of STx [129] , [130] ; after immunizing mice by eyedrops and confirming the safety, both humoral response and mucosal (in tears, saliva, and feces) immune response were induced, providing enough protection from the challenge by the lethal HUS-causative agent (wild-type OMVs) [94] . Although there is relatively poor lymphoid tissue in the eyes and there are a few reports on immunization via eyedrop route, the connection of lacrimal duct and nasal cavity may result in immunoactivities in both nasal and ocular mucosa. Moreover, the homing of lymphocytes can distribute the effect of mucosal immune response on each mucosal surface of the body; therefore, the intestinal IgA can be successfully induced through other mucosal pathways. Considering that the response at the immune location is still the strongest, the oral route of OMVs should be further tried. Compared with the application of OMVs-based vaccines in the prevention of respiratory diseases, OMVs delivery systems have more applications in intestinal diseases, and correspondingly, there are a series of successful modifications to OMVs. First, various methods can reduce the toxicity of OMV. The toxicity of OMVs can be reduced by deleting the lipid A modification gene msbB, htrB , or combined msbB and pagP [131] , [132] , [133] , [134] . Another method to reduce the toxicity of OMVs is to pre-treat them with all-trans retinoic acid, active metabolite of vitamin A, which has both anti-inflammatory and mucosal adjuvant properties [135] . Then, through some modifications, the OMV yield can be improved. Choi et al. produced OmpC-enriched OMVs through overexpression of small RNAs, MicA, in S. typhimurium . The yield of OMVs was strongly increased and the OmpC-enriched OMVs promoted Th1- and Th17-type immune responses, providing full protection against lethal challenge by Salmonella [136] . Furthermore, the yield can also be improved through the deletion of tolR gene to disrupt the Tol-Pal system on the cell wall. After immunization through the subcutaneous route, the protective effects of OMVs in mice were not inferior compared with those of polysaccharide conjugate vaccines [137] . In addition, by further optimizing the form of OMVs, immune response and protection can be additionally improved, namely, OMVs encapsulated in polyanhydride nanoparticles (OMV-NPs) can induce Th1 immune responses [109] , [138] , which is more suitable for intracellular bacteria, such as S. flexneri . The OMV-NPs formulation even provided full protection on day 56 after nasal immunization in mice, while the protection with OMVs alone was only 40% [108] . Thus, OMVs, which are easier to produce, have a great potential to become a candidate product for the application of vaccines against intestinal infectious diseases. Eudragit L-100/Chitosan Chitosan is a natural biodegradable polysaccharide derived from chitin, with good biocompatibility and adhesion properties. Although chitosan is capable of increasing transit time of antigens in the gastrointestinal tract and inducing mucosal immune response, its oral administration is limited by the low resistance to acidic pH [139] , [140] . To solve this problem, Eudragit L-100, a coating material soluble at pH above 6.0, was used to protect the antigens from detrimental effects in the upper gastrointestinal tract. As reported, Eudragit L-100-based oral delivery vehicle loading ETEC F4 or F18 antigen could induce higher antigen-specific IgG1 and IgG2a antibody responses in serum and antigen-specific IgA in saliva compared with those with antigen immunization alone [141] . To further improve the immune response, a combined delivery system was built by coating Eudragit L-100 on the chitosan nanoparticles which loaded protein antigens or OMVs from ETEC. Oral immunization of the formulations in animals elicited antibody response and inhibited the ETEC colonization in small intestine [95] , [96] . Thus, for some special delivery requirements, multiple delivery strategies can be used at the same time. In addition to the vehicles described above, some other polymers, inorganic materials, and lipid or oil-based vehicles have been explored to develop E. coli vaccines ( Table 2 ). Although strong immune response could be elicited in mice, most of the results lack the in vivo results about the protective effect, and therefore further confirmation is needed. 2.2.2 Shigella Shigella species are gram-negative bacteria belonging to the Enterobacteriaceae family. According to the serological type, they are divided into four categories: S. dysenteriae , S. boydii , S. flexneri , and S. sonnei . Shigella spp. are the main bacterial causes of persistent epidemic diarrhea and result in almost 125 million diarrheal episodes and around 160,000 deaths annually [142] . Usually, a low-dose inoculum can cause the disease, resulting in aggressive watery or mucous/bloody diarrhea. However, there is currently no licensed vaccine against Shigella , and the continuous emergence of drug-resistant strains makes antibiotic treatment difficult [143] . Self-assembled proteinaceous nanoparticles Recently, Pan et al. developed Nano-B5 platform to produce nanoscale bacterial polysaccharide conjugate vaccines in vivo . Proteinaceous nanoparticles were self-assembled via fusion of a natural adjuvant effective pentamer domain (bacterial B5 toxin) and an unnatural trimer domain. Then, O-polysaccharide of S. flexneri was conjugated to the nanoparticle through glycosylation system ( Fig. 4 ) [111] . The nanovaccine can significantly slow down its dissipation at the injection site and enhance lymph node drainage. This delivery vector contains B5 toxin protein module such as CTB, which can bind to GM1 receptor on the surface of APCs, thus promoting antigen endocytosis and presentation [144] . After confirming the safety, subsequent subcutaneous immunization in mice indicated that both strong antigen-specific humoral and cellular immunity were induced, providing complete protection against challenge with 5 × half-lethal dose. In addition, the safety and high efficiency of the delivery carrier were further proven in the cynomolgus monkey model [111] . Polysaccharide-conjugated vaccines are considered the most successful form of bacterial vaccines [145] . However, the traditional chemical method is a time-consuming and costly process [146] , so this biological method can solve this problem by one-step fermentation and one-step purification to obtain vaccine products [147] , [148] , [149] , [150] . This study is also the first study to use a fully biosynthetic method to prepare a nanoscale polysaccharide-conjugated vaccine, leading to a great improvement in the immune effect. Fig. 4 Self-assembled proteinaceous nanoparticles for antigen delivery [111] . (A) Schematic diagram of protein self-assembly and conjugation with bacterial polysaccharide antigen through glycosylation system. (B) Super-resolution structured illumination microscopy images of nanoparticle-expressing bacteria. (C) Transmission electron microscopy images of the nanoparticles conjugating polysaccharide and their size distribution. (D) The vaccine can rapidly enter the draining lymph nodes and simultaneously stimulate strong humoral and cellular immune responses. Chitosan-based delivery systems Chitosan particles are endowed with the properties to prevent encapsulated antigen degradation and extend antigen duration time on the mucosal surface [151] . As an alternative to the oral route for chitosan particles without an additional protection from acid degradation, direct nasal immunity may stimulate the systemic and intestinal IgA immune responses. A study showed that the loading of recombinant Shigella MxiH antigen into chitosan nanoparticles resulted in enhanced humoral and mucosal immune responses in intranasally immunized mice [112] . In addition, various chitosan-based delivery systems are available. For example, Jahantigh et al. described a chitosan nanofibrous membrane (NF) with a high surface area to volume ratio, which is more appropriate for nasal vaccine delivery. After loading N-terminal region of IpaD (N-IpaD) antigen of Shigella , the guinea pigs were intranasally administered, which resulted in induction of significant serum and mucosal antibody responses and protection [113] . Moreover, O-methylated free trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles, which have both mucoadhesive properties and excellent absorption-enhancing effects, even at neutral pH over a wide pH range for oral delivery [152] , or chitosan-tripolyphosphate (CS-TPP) nanoparticles coated with Eudragit L-100 [110] , were developed to further improve the immune response and protective effect of oral or intranasal routes ( Table 2 ). However, these immune effects do not seem to be as good as those of the two previous kinds of delivery systems; thus, further optimization of chitosan or combination with other systems should be explored to enhance immune response. Similar to the respiratory tract infections, digestive tract infections often involve bacterial colonization and invasion. Therefore, mucosal administration is also the first option for immune route, and many delivery systems such as probiotics and OMVs have shown ideal effects in protective. However, unlike the respiratory tract, mucosal delivery in the digestive tract faces more difficulties that need to be overcome, including the acidic environment in the stomach, hydrolysis by gastrointestinal proteases, immune tolerance, and intestinal microbes. In addition, the colonization of gastrointestinal pathogens does not cause easy spreading of the pathogens from person to person. Therefore, the choice of mucosal immunity or other immunization pathways should be specifically weighed. In the prevention of digestive tract infectious diseases, although there are not many studies on non-mucosal immune delivery systems, some have shown great potential, such as the latest bacterial B5 toxin-based protein nanocarriers. 2.3 Other pathogenic bacterial diseases and advanced delivery systems In addition to common pathogenic bacteria that cause respiratory tract infections and diarrhea, there are many bacteria that are highly pathogenic and have various infection methods and target organs, such as Bacillus anthracis , Staphylococcus aureus , and others. In addition, some pathogenic bacteria, such as Helicobacter pylori and Brucella , cause chronic infections that are easy to relapse or difficult to cure. For the prevention of diseases caused by these pathogenic bacteria, a series of efficient delivery systems have been developed ( Table 3 ). This section mainly focuses on the delivery systems of some important pathogenic bacteria. Table 3 Effect of vaccines with delivery systems against different bacterial challenges. Pathogenic bacteria Delivery system Antigen(s) Adjuvants used Route Animal species Protection after challenge Ref. B. anthracis Adenovirus PAD4 — i.m. Mice 100% of animals surviving after single immunization [153] SFV PA — s.c. Mice 100% of animals surviving [154] FHV VLP PA — s.c. Rats 100% of animals surviving after single immunization [155] Bacteriophage T4 nanoparticle PA — i.m. Mice, rats, and rabbits 100% of animals surviving [156] Live influenza virus prime and killed RV vector or the vaccinia virus vector boost PA — i.n. prime and i.m boost Mice No results [157] TMV PA 232–247 and PA 628–637 — i.p. Mice Almost no protection [158] Liposomes PA Monophosphoryl lipid A i.m. Rabbits and rhesus macaques 100% of animals surviving [159] , [160] Liposome-like vessels PAD4 Aluminium hydroxide i.p. Mice 70% of animals surviving [161] FUC-HTCC NPs Anthrax vaccine AVA — i.p. Mice 100% of animals surviving [162] Chitosan PA C48/80 i.n. Mice No results [163] Chitosan derivative TMC PA CpG or Poly I:C or not s.c. a , i.m. a , or i.p. Mice 83.3% of animals surviving in s.c. or i.m. route [164] CS-NH2 microparticles PA — s.c. Mice No results [165] Poly-l-lactide (PLLA) polylactide (PLA) microspheres PA — i.m prime and either i.m. or i.n. boost Mice 100% of animals surviving [166] Dendriplex PLGA nanoparticles PA (DNA) — i.m. Mice High antibody titer but without neutralizing activity [167] PLGA nanoparticles PAD4 — i.p. Mice 11% of animals surviving after single immunization [168] sucrose polymer Ficoll PA CpG-ODN i.m. Mice 100% of animals surviving after single immunization [169] Soybean oil-and-water nanoemulsion (NE) PA — i.n. Mice and guinea pigs 100% of animals surviving [170] L. acidophilus PA(Surface) b — No results No No results [171] L. casei PA b — Oral or i.n. Mice No results [172] L. acidophilus PA with DC-targeting peptide (Secretory) b — Oral Mice 75% of animals surviving [173] L. gasseri PA with DC-targeting peptide (Secretory) b — Oral Mice 100% of animals surviving and 30% of animals surviving without DC-targeting peptide [174] , [175] S. enterica PA, PAD1 and 4, and PAD4 — Oral Mice PA: 83% of animals surviving, PAD1 and 4: 25% of animals surviving, PAD4: no protection [176] Neisseria meningitidis group B E. coli OMV Glycan antigens (Polysialic acid (PSA) and T antigen) — s.c. Mice 50% SBA was observed at over 100-fold dilutions of the serum [177] Brucella SFV Cu-Zn SOD — i.p. Mice 1.52 (3.07–1.55) c [178] IF3 — i.p. Mice 1.09 (6.96–5.87) c [179] Influenza virus L7/L12 or Omp16 — i.n., eyedrop a , or s.c. Mice The best: Omp: 16: 3.78 (4.54–0.76) c , eyedrop; Bivalent: 3.9 (4.54–0.64) c , eyedrop [180] Influenza virus Tetravalent vaccine formulation expressing Omp16, L7/L12, Omp19, and Cu-Zn SOD — i.n. a , eyedrop, or s.l. Guinea pigs The best: 2.8 (2.86–0.06) c , i.n. [181] L. lactis L7/L12 (Cytoplasm) b — Oral Mice 0.57 (7–6.43) c [182] Cu-Zn SOD (secretory) b — Oral Mice 1.35 (7.1–5.75) c [183] L. lactis (Live or killed) Omp31 (Cell Wall-Anchored) b — Oral or i.p. Mice No results [184] Attenuated S. typhimurium Fusion of L7/L12 and BLS b — Oral Mice Secretory expression: 1.55 (4.44–2.89) c ; Intracellular expression: 1.32 (4.44–3.12) c [185] L7/L12 — i.m. Mice About 1.7 (3.4–1.7) c [186] Ochrobactrum anthropi Cu-Zn SOD CpG i.p. Mice 2.42 (5.30–2.88) c [187] TMC Omp19 — Oral a or i.p. Mice The best: against B. abortus : 2.46 (6.3–3.84) c , oral; against B. melitensis : 2.38 (6.14–3.76) c , oral [188] Mannosylated chitosan nanoparticles FliC — s.c. Mice Against B. melitensis : 1.34 (5.67–4.33) c ; against B. abortus : 1.22 (5.24–4.02) c [189] escheriosome L7/L12 — s.c. Mice 1.46 (4.58–2.93) c [190] Cu-Zn SOD IL-18 s.c. Mice 1.5 (5.2–3.7) c [191] PLGA L7/L12 — i.p. Mice 1.79 (5.94–4.15) c [192] CaPNs FliC, 7α-HSDH, BhuA and multi-epitopes (Poly B and poly T) — s.c. Mice The best: against B. melitensis : Poly B + T, 1.5 (5.77–4.27) c ; against B. abortus: Poly B + T, 1.37 (5.29–3.92) c [193] S. aureus OMV ( E. coli ) Hla H35L , SpA KKAA, FhuD2, Csa1A, and LukE Alum i.p. Mice 90% of animals surviving [194] PDNVs ( E. coli ) SAcoagulase — i.p. Mice 100% of animals surviving [195] extracellular vesicles (EVs) Hla H35L, LukE and EVs components — s.c. Mice About 70% and 50% of animals surviving after challenging with two S. aureus isolates [196] ICG-loaded MSNs EVs — s.c. Mice Decreased bacterial loading in skin and organs [197] PDNVs PDNVs components — s.c. Mice No results [198] L. lactis ClfA b and FnbpA b Freund's adjuvant Unknown Rats Less infected vegetations after challenging with S. aureus Newman in L. lactis ClfA-immunized animals; FnbpA did not have the same effect [199] PilVax B-cell epitope, D3, from FnbpA — i.n. Mice Decreased bacterial loading in intestine and nasal mucosa [200] Cowpea mosaic virus D2 domain of FnbpB — i.n. or oral Mice No results [201] Live attenuated S. typhimurium SaEsxA b and SaEsxB b — Oral Mice 22.2% and 44.4% of animals surviving after challenging with S. aureus USA 300 for SaEsxA and SaEsxB; no animals surviving after challenging with S. aureus Newman [202] Red blood cell membrane-coated PLGA Hla, α-toxin, PVL, and γ-toxin — s.c. Mice Decreased bacterial loading in skin, blood, and organs [203] , [204] PP7 (VLP) AIP1S — i.m. Mice Inhibiting abscess area and dermonecrotic; Decreased bacterial loading at the site of infection [205] PLGA CNA19 — s.c. or i.n. Mice No results [206] , [207] PLGA rSEA — i.p. Mice 100% of animals surviving [208] Chitosan rSEB — i.n. No results [209] Chitosan Ami No results No results No results [210] Liposome AdsA (mRNA) — i.m. or s.c. Mice No results [211] H. pylori L. lactis (GEM) CUE — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [212] , [213] L. acidophilus Hp0410 — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [214] L. plantarum Urease Bsubunit (UreB) (Cytoplasm) b — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [215] HP55/PLGA nanoparticles Recombinant antigen CCF — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [216] OMVs OMV components — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [217] liposomes Fusion of the urease linear epitope (19 amino acid residues) and CTB — Oral Mice Decreased bacterial loading in gastric tissue [218] Yersinia pestis Bacteriophage T4 nanoparticles Mutated capsular antigen F1 and low-calcium-response V antigen — i.m. Rats 100% of animals surviving [155] 20:80 CPTEG:CPH Fusion of F1 and V antigens Cyclic dinucleotides (CDNs) s.c. Mice 100% of animals surviving at 14 days and 75% at 182 days after single immunization [219] OMVs OMV components — i.m. Mice 100% of animals surviving in subcutaneous challenge; 100% and 50% of animals surviving in intranasal challenge with a median and a high dose [220] L. plantarum LcrV (Surface) b — Oral Mice No results [221] a. The better or the best route to achieve protection; b. Constructed in an expression vector; c. Log 10 units of protection, obtained by subtracting the mean log 10 CFU for the experimental group from the mean log 10 CFU for the corresponding control group; i.n., intranasal; s.c., subcutaneous; i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; s.l., sublingual; —, without added adjuvant. 2.3.1 B. anthracis B. anthracis is the causative agent of anthrax, an acute zoonotic disease. Humans can be infected through direct contact with broken skin, contaminated meat, or inhalation [222] . The spores of B. anthracis have strong survival ability and are resistant to sunlight, high temperature, and disinfectants. However, the spores are easy to prepare at low cost, so they are regarded as potential biological weapons [223] . Vaccines are an effective means to prevent anthrax; however, traditional attenuated live vaccines or adsorbed vaccines have a series of problems, such as side effects, short duration of protective effect, and complicated immune procedures. For example, anthrax vaccine absorbed (AVA), the only USFDA-approved anthrax vaccine, needs to be administered six times within 18 months and enhanced once each year [224] . Therefore, the development of a safe and effective human vaccine is of great significance for the prevention and control of anthrax. So far, various delivery carriers (e.g., viral vectors, bacterial vectors, liposomes, and polymers) have been developed ( Table 3 ). Because the main antigen of B. anthracis is protective antigen (PA) or its domain, it is easy to compare the effects of different delivery vehicles. Viral vector Viral vector vaccines consist of a nonreplicating virus that contains certain genetic material from the pathogen that needs to be immunized. It seems to be an ideal vaccine delivery vector because of its natural viral structure, which can be well recognized by the immune system [225] . Replication-incompetent adenovirus expressing domain 4 of PA (PAD4) could induce a stronger humoral and cellular immune responses than AVA and provide full protection against lethal spore or B. anthracis strain challenge in a single injection in intramuscularly immunized mice [153] . Such potent protection was also reported in Semliki forest virus (SFV) vector loading PA through the challenge with the B. anthracis strain [154] . However, some other viral vector vaccines, such as influenza viruses and rabies virus (RV) expressing PA, were unable to induce anthrax toxin neutralization antibodies, although the antibody titers against PA were high [157] , [226] . Interestingly, this situation could be solved by heterologous prime/boost immunization strategy, and the particularly effective program was an initial intranasal administration of a live influenza virus vector, followed by intramuscular boosting with either the killed RV vector or the vaccinia virus vector [157] . The mechanism of this phenomenon is still unclear and one possible explanation is that the combination of different heterologous vectors may affect B-cell affinity maturation and Ig gene high frequency mutation in germinal centers. In addition, some VLP (e.g. flock house virus (FHV) VLP and bacteriophage T4 nanoparticle) vaccine were also explored; they exhibited good protection against the challenge by anthrax lethal toxin in rats or inhalational anthrax in mice, rats, and rabbits [155] , [156] . Although the viral vector delivery system can achieve 100% protection, some viruses such as adenovirus need to be further modified to avoid possible pre-existing immunity in humans [227] . Liposomes and polymers Other potential delivery vehicles have also been used to study anthrax vaccines. For example, PA encapsulated in liposomes containing monophosphoryl lipid A could induce full protection from lethal pulmonary challenge with B. anthracis spores in rabbit and monkey models [159] , [160] . However, liposomes are prone to oxidative degradation, resulting in low stability and short shelf life when used as delivery systems [228] . This problem can be solved with liposome-like vessels prepared by nonionic surfactant [229] . These nonionic surfactant vesicles (NISV) are self-assembling lamellar structures; they resemble liposomes because they are biodegradable, nonimmunogenic, and capable of encapsulating biologically active cargo [161] , [230] . Another example is a kind of chitosan nanoparticle. Liu et al. described chitosan-based microparticles (CS-NH2 MPs) with abundant amino groups. After loading PA, the formulation induced the complement system activation and enhanced antibody response [165] . Recently, Chuang et al. reported a positively or negatively charged fucoidan-quaternary chitosan nanoparticle by conjugate fucoidan (FUC) and a chitosan derivative (N-(2-hydroxy)-propyl-3-trimethyl ammonium chitosan chloride, HTCC). The surface charge was adjusted by varying the mass ratio of two polyelectrolytes. After combining FUC-HTCC nanoparticles with the approved anthrax vaccine AVA, the novel anthrax nanovaccine significantly increased the IgG antibody titers and provided complete protection compared with CpG plus AVA (75%) or AVA alone (50%) in mice exposed to anthrax lethal toxin challenge [162] . However, some other polymer particles (e.g., sucrose polymer, chitosan or its derivative, and others) need an addition of an adjuvant (e.g., CpG, mast cell activator compound 48/80 (C48/80), Poly I:C) to elicit an enhanced immune response [163] , [164] , [231] . Although mice immunized with these liposomes or polymer-based vaccines can achieve a high protection rate after challenge, the use of adjuvants reduces their competitiveness compared with viral vectors. 2.3.2 Brucella Brucellosis is one of the five major zoonotic diseases in the world and seriously endangers public health. More than 500,000 new cases of brucellosis occur every year [232] . In the 21st century, brucellosis shows a rebound trend worldwide [233] . Brucella (the pathogen of brucellosis) is a kind of gram-negative, facultative intracellular proteus. It can be divided into more than 10 species. Among them, B. melitensis , B. abortus , and B. suis are the three most toxic species, which can infect both animals and humans. At present, there are no vaccines approved for human use. The animal vaccines against brucellosis are live attenuated vaccines, which still have potential serious safety risks in production and use [234] . Viral vectors Although DNA vaccines encoding B. abortus Cu-Zn superoxide dismutase (Cu-Zn SOD) or translation initiation factor 3 (IF3) could induce specific cellular immune response and provide protection against challenge with B. abortus virulent strain in mice [235] , [236] , high concentrations and repeated doses are needed to improve in vivo transfection efficiency. So far, some viral vectors (SFV vectors, and especially influenza viral vectors) have been developed, with high safety and immunogenicity demonstrated in various models (chicken, ferrets, rhesus macaques, and humans) [178] , [179] , [237] , [238] , [239] . Influenza viral vectors may be a promising candidate for human use because of the lack of pre-existing immunity in humans. After immunization with recombinant influenza A viruses of the subtypes H5N1 and H1N1 expressing Brucella protective antigen (ribosomal protein L7/L12 or Omp16), a strong cellular immune response and protective effect were induced, even comparable with those induced by a commercial B. abortus S19 vaccine [180] . Further, a tetravalent vaccine formulation (expressing Omp16, L7/L12, Omp19, and Cu-Zn SOD in recombinant influenza viral vector subtype H5N1 without an adjuvant) was developed to prevent human brucellosis [181] , [240] . In addition, because Brucella can infect people of any age, the long-term protection of this viral vector vaccine also needs to be considered. Bacterial vectors L. lactis can be used as a delivery system by expressing B. abortus antigen in the cytoplasm, cell wall, or extracellularly [241] . However, the final protective effect may be related to the antigen type and its location. For example, oral administration of L. lactis expressing L7/L12 in the cytoplasm only provided partial protection in mice [182] , while secretory expression of Cu-Zn SOD induced protective immunity similar to positive controls (immunized with B. abortus strain RB51) [183] . Studies on attenuated S. typhimurium vector indicated that secretory expressing Brucella L7/L12 or fusion antigen (fusing L7/L12 and lumazine synthase (BLS)) could induce stronger humoral and cellular immune responses and higher protection against Brucella infection than intracellular expressing vectors [185] , [186] . Thus, construction of L. lactic -based vaccines with secretory expressing Brucella antigens may be a more suitable way to induce protective immunization. Because Brucella is an intracellular bacterium, cellular immunity is relatively more important and this response could be strengthened through the addition of CpG adjuvants [187] . It was found that mucosal immunization could also provide protection from mucosal infection by B. abortus [185] . Therefore, the choice of appropriate adjuvants and mucosal route are beneficial for inducing the protective response against B. abortus infection. In addition, some other delivery systems, such as chitosan derivatives (TMC and mannosylated chitosan nanoparticles), liposomes, polymers, and inorganics were used for vaccine design [188] , [189] , [190] , [191] , [192] , [193] . Although there have been few reports about these delivery vehicles, some of them have shown promising application prospects. 2.3.3 S. aureus S. aureus is a pathogenic bacterium that causes a wide spectrum of human infections, inducing severe skin lesions, pneumonia, bacteremia, and meningitis. Overuse of antibiotic regimens has led to the emergence of resistance, which presents a great challenge to clinical treatment. OMVs have been widely explored for the development of vaccine against S. aureus . For example, OMVs from modified E. coli were decorated with five S. aureus protective antigens by fusion expression with lipoprotein leader sequence. The concentration of antigens reached 5%–20% of total OMV proteins, and great protection was demonstrated in three mouse infection models (a sepsis model, a renal abscess model, and a skin infection model) [194] . Generally, although the removal of LPS reduced the toxicity of OMVs, there are still many toxic proteins on the outer membrane [242] . Kim et al. designed bacterial protoplast-derived nanovesicles (PDNVs) by depleting toxic outer membrane components of E. coli to improve the security and productivity of OMVs. This delivery platform could load different antigens. In immunized mice, strong antigen-specific humoral and cellular immune responses were induced, and full protection from lethal challenge with S. aureus was observed [195] . In addition, the OMVs of S. aureus itself were also used to prepare vaccines because they contain a variety of antigen components. Wang et al. prepared engineered extracellular vesicles (EVs) by expressing non-toxic Hla H35L and LukE in a S. aureus mutant strain. The animal experiment results indicated that the engineered EVs could induce stronger specific antibody response and protect mice in a lethal sepsis model. Further, an array of bacterial antigens, such as lipoproteins, exotoxins, and cytoplasmic proteins, could also be encapsulated as a vaccine platform [196] . Since S. aureus can invade and survive inside host cells, cellular immunity is also needed. By coating EVs on the surface of indocyanine green (ICG)-loaded magnetic mesoporous silica nanoparticles (MSNs), endocytosis EVs can escape from lysosomes through their breaking by heating ICG with laser irradiation, and improved CD8 + T cell responses were induced to prevent and treat S. aureus infection [197] . Generally speaking, there are two main strategies to prepare S. aureus vaccines using microbial secreted vesicles. One is to express S. aureus antigen in E. coli and the other is to load the antigen in secreted OMVs. As an engineering strain, E. coli is more convenient for gene operation, and it can be easily optimized. For the other, the EVs of S. aureus itself contain a large number of antigen components, so they may also be a potential candidate. However, the main problem to be solved includes the safety of EVs because EVs contain biologically active toxins and induce a strong inflammatory response [243] , [244] , [245] . For some pathogenic bacteria with various infection forms and target organs, a variety of advanced delivery systems have been developed; among them, biological vectors such as viral vectors and probiotic vectors have been widely used. For a B. anthracis vaccine, the antigen is relatively unique, so different delivery systems are more comparable. It has been found that the immune effect of viral vectors from animal experiments is better than that of probiotic vectors, which was also revealed in the Brucella vaccines studies. For this phenomenon, in addition to the carrier itself, the immunization method and immunization dose may also be important factors. Furthermore, due to the variety of bacteria, the same delivery system in different pathogenic bacteria vaccine research will provide references for the general application of an advanced delivery system. 2.3.1 B. anthracis B. anthracis is the causative agent of anthrax, an acute zoonotic disease. Humans can be infected through direct contact with broken skin, contaminated meat, or inhalation [222] . The spores of B. anthracis have strong survival ability and are resistant to sunlight, high temperature, and disinfectants. However, the spores are easy to prepare at low cost, so they are regarded as potential biological weapons [223] . Vaccines are an effective means to prevent anthrax; however, traditional attenuated live vaccines or adsorbed vaccines have a series of problems, such as side effects, short duration of protective effect, and complicated immune procedures. For example, anthrax vaccine absorbed (AVA), the only USFDA-approved anthrax vaccine, needs to be administered six times within 18 months and enhanced once each year [224] . Therefore, the development of a safe and effective human vaccine is of great significance for the prevention and control of anthrax. So far, various delivery carriers (e.g., viral vectors, bacterial vectors, liposomes, and polymers) have been developed ( Table 3 ). Because the main antigen of B. anthracis is protective antigen (PA) or its domain, it is easy to compare the effects of different delivery vehicles. Viral vector Viral vector vaccines consist of a nonreplicating virus that contains certain genetic material from the pathogen that needs to be immunized. It seems to be an ideal vaccine delivery vector because of its natural viral structure, which can be well recognized by the immune system [225] . Replication-incompetent adenovirus expressing domain 4 of PA (PAD4) could induce a stronger humoral and cellular immune responses than AVA and provide full protection against lethal spore or B. anthracis strain challenge in a single injection in intramuscularly immunized mice [153] . Such potent protection was also reported in Semliki forest virus (SFV) vector loading PA through the challenge with the B. anthracis strain [154] . However, some other viral vector vaccines, such as influenza viruses and rabies virus (RV) expressing PA, were unable to induce anthrax toxin neutralization antibodies, although the antibody titers against PA were high [157] , [226] . Interestingly, this situation could be solved by heterologous prime/boost immunization strategy, and the particularly effective program was an initial intranasal administration of a live influenza virus vector, followed by intramuscular boosting with either the killed RV vector or the vaccinia virus vector [157] . The mechanism of this phenomenon is still unclear and one possible explanation is that the combination of different heterologous vectors may affect B-cell affinity maturation and Ig gene high frequency mutation in germinal centers. In addition, some VLP (e.g. flock house virus (FHV) VLP and bacteriophage T4 nanoparticle) vaccine were also explored; they exhibited good protection against the challenge by anthrax lethal toxin in rats or inhalational anthrax in mice, rats, and rabbits [155] , [156] . Although the viral vector delivery system can achieve 100% protection, some viruses such as adenovirus need to be further modified to avoid possible pre-existing immunity in humans [227] . Liposomes and polymers Other potential delivery vehicles have also been used to study anthrax vaccines. For example, PA encapsulated in liposomes containing monophosphoryl lipid A could induce full protection from lethal pulmonary challenge with B. anthracis spores in rabbit and monkey models [159] , [160] . However, liposomes are prone to oxidative degradation, resulting in low stability and short shelf life when used as delivery systems [228] . This problem can be solved with liposome-like vessels prepared by nonionic surfactant [229] . These nonionic surfactant vesicles (NISV) are self-assembling lamellar structures; they resemble liposomes because they are biodegradable, nonimmunogenic, and capable of encapsulating biologically active cargo [161] , [230] . Another example is a kind of chitosan nanoparticle. Liu et al. described chitosan-based microparticles (CS-NH2 MPs) with abundant amino groups. After loading PA, the formulation induced the complement system activation and enhanced antibody response [165] . Recently, Chuang et al. reported a positively or negatively charged fucoidan-quaternary chitosan nanoparticle by conjugate fucoidan (FUC) and a chitosan derivative (N-(2-hydroxy)-propyl-3-trimethyl ammonium chitosan chloride, HTCC). The surface charge was adjusted by varying the mass ratio of two polyelectrolytes. After combining FUC-HTCC nanoparticles with the approved anthrax vaccine AVA, the novel anthrax nanovaccine significantly increased the IgG antibody titers and provided complete protection compared with CpG plus AVA (75%) or AVA alone (50%) in mice exposed to anthrax lethal toxin challenge [162] . However, some other polymer particles (e.g., sucrose polymer, chitosan or its derivative, and others) need an addition of an adjuvant (e.g., CpG, mast cell activator compound 48/80 (C48/80), Poly I:C) to elicit an enhanced immune response [163] , [164] , [231] . Although mice immunized with these liposomes or polymer-based vaccines can achieve a high protection rate after challenge, the use of adjuvants reduces their competitiveness compared with viral vectors. 2.3.2 Brucella Brucellosis is one of the five major zoonotic diseases in the world and seriously endangers public health. More than 500,000 new cases of brucellosis occur every year [232] . In the 21st century, brucellosis shows a rebound trend worldwide [233] . Brucella (the pathogen of brucellosis) is a kind of gram-negative, facultative intracellular proteus. It can be divided into more than 10 species. Among them, B. melitensis , B. abortus , and B. suis are the three most toxic species, which can infect both animals and humans. At present, there are no vaccines approved for human use. The animal vaccines against brucellosis are live attenuated vaccines, which still have potential serious safety risks in production and use [234] . Viral vectors Although DNA vaccines encoding B. abortus Cu-Zn superoxide dismutase (Cu-Zn SOD) or translation initiation factor 3 (IF3) could induce specific cellular immune response and provide protection against challenge with B. abortus virulent strain in mice [235] , [236] , high concentrations and repeated doses are needed to improve in vivo transfection efficiency. So far, some viral vectors (SFV vectors, and especially influenza viral vectors) have been developed, with high safety and immunogenicity demonstrated in various models (chicken, ferrets, rhesus macaques, and humans) [178] , [179] , [237] , [238] , [239] . Influenza viral vectors may be a promising candidate for human use because of the lack of pre-existing immunity in humans. After immunization with recombinant influenza A viruses of the subtypes H5N1 and H1N1 expressing Brucella protective antigen (ribosomal protein L7/L12 or Omp16), a strong cellular immune response and protective effect were induced, even comparable with those induced by a commercial B. abortus S19 vaccine [180] . Further, a tetravalent vaccine formulation (expressing Omp16, L7/L12, Omp19, and Cu-Zn SOD in recombinant influenza viral vector subtype H5N1 without an adjuvant) was developed to prevent human brucellosis [181] , [240] . In addition, because Brucella can infect people of any age, the long-term protection of this viral vector vaccine also needs to be considered. Bacterial vectors L. lactis can be used as a delivery system by expressing B. abortus antigen in the cytoplasm, cell wall, or extracellularly [241] . However, the final protective effect may be related to the antigen type and its location. For example, oral administration of L. lactis expressing L7/L12 in the cytoplasm only provided partial protection in mice [182] , while secretory expression of Cu-Zn SOD induced protective immunity similar to positive controls (immunized with B. abortus strain RB51) [183] . Studies on attenuated S. typhimurium vector indicated that secretory expressing Brucella L7/L12 or fusion antigen (fusing L7/L12 and lumazine synthase (BLS)) could induce stronger humoral and cellular immune responses and higher protection against Brucella infection than intracellular expressing vectors [185] , [186] . Thus, construction of L. lactic -based vaccines with secretory expressing Brucella antigens may be a more suitable way to induce protective immunization. Because Brucella is an intracellular bacterium, cellular immunity is relatively more important and this response could be strengthened through the addition of CpG adjuvants [187] . It was found that mucosal immunization could also provide protection from mucosal infection by B. abortus [185] . Therefore, the choice of appropriate adjuvants and mucosal route are beneficial for inducing the protective response against B. abortus infection. In addition, some other delivery systems, such as chitosan derivatives (TMC and mannosylated chitosan nanoparticles), liposomes, polymers, and inorganics were used for vaccine design [188] , [189] , [190] , [191] , [192] , [193] . Although there have been few reports about these delivery vehicles, some of them have shown promising application prospects. 2.3.3 S. aureus S. aureus is a pathogenic bacterium that causes a wide spectrum of human infections, inducing severe skin lesions, pneumonia, bacteremia, and meningitis. Overuse of antibiotic regimens has led to the emergence of resistance, which presents a great challenge to clinical treatment. OMVs have been widely explored for the development of vaccine against S. aureus . For example, OMVs from modified E. coli were decorated with five S. aureus protective antigens by fusion expression with lipoprotein leader sequence. The concentration of antigens reached 5%–20% of total OMV proteins, and great protection was demonstrated in three mouse infection models (a sepsis model, a renal abscess model, and a skin infection model) [194] . Generally, although the removal of LPS reduced the toxicity of OMVs, there are still many toxic proteins on the outer membrane [242] . Kim et al. designed bacterial protoplast-derived nanovesicles (PDNVs) by depleting toxic outer membrane components of E. coli to improve the security and productivity of OMVs. This delivery platform could load different antigens. In immunized mice, strong antigen-specific humoral and cellular immune responses were induced, and full protection from lethal challenge with S. aureus was observed [195] . In addition, the OMVs of S. aureus itself were also used to prepare vaccines because they contain a variety of antigen components. Wang et al. prepared engineered extracellular vesicles (EVs) by expressing non-toxic Hla H35L and LukE in a S. aureus mutant strain. The animal experiment results indicated that the engineered EVs could induce stronger specific antibody response and protect mice in a lethal sepsis model. Further, an array of bacterial antigens, such as lipoproteins, exotoxins, and cytoplasmic proteins, could also be encapsulated as a vaccine platform [196] . Since S. aureus can invade and survive inside host cells, cellular immunity is also needed. By coating EVs on the surface of indocyanine green (ICG)-loaded magnetic mesoporous silica nanoparticles (MSNs), endocytosis EVs can escape from lysosomes through their breaking by heating ICG with laser irradiation, and improved CD8 + T cell responses were induced to prevent and treat S. aureus infection [197] . Generally speaking, there are two main strategies to prepare S. aureus vaccines using microbial secreted vesicles. One is to express S. aureus antigen in E. coli and the other is to load the antigen in secreted OMVs. As an engineering strain, E. coli is more convenient for gene operation, and it can be easily optimized. For the other, the EVs of S. aureus itself contain a large number of antigen components, so they may also be a potential candidate. However, the main problem to be solved includes the safety of EVs because EVs contain biologically active toxins and induce a strong inflammatory response [243] , [244] , [245] . For some pathogenic bacteria with various infection forms and target organs, a variety of advanced delivery systems have been developed; among them, biological vectors such as viral vectors and probiotic vectors have been widely used. For a B. anthracis vaccine, the antigen is relatively unique, so different delivery systems are more comparable. It has been found that the immune effect of viral vectors from animal experiments is better than that of probiotic vectors, which was also revealed in the Brucella vaccines studies. For this phenomenon, in addition to the carrier itself, the immunization method and immunization dose may also be important factors. Furthermore, due to the variety of bacteria, the same delivery system in different pathogenic bacteria vaccine research will provide references for the general application of an advanced delivery system. 3 Viral infection diseases and advanced delivery systems Among infectious diseases, viral infections are one of the leading causes of mortality worldwide. They usually evolve to cause a global life threat and socioeconomic recession. Despite the huge challenges of the ongoing COVID-19 pandemic, the achieved progress on the drug treatment of other viruses (e.g., Ebola viruses, human immunodeficiency virus (HIV), and hepatitis viruses) is impressive. To overcome this hurdle, advanced vaccine delivery systems are more urgently required. 3.1 Major epidemic viral infections and prevention challenges According to International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), there are 36 classes, 168 families, and 6590 species of viruses (Virus Taxonomy: 2019 Release) [246] . Among the infectious viruses, an overwhelming majority of the viral infections lack the specific drugs, and vaccines have historically been the foremost effective means to save people's lives. Recent epidemic virus diseases and major vaccine products or clinical candidates are listed in Table 4 . Table 4 The major virus-related diseases and vaccine development. Virus Remarkable vaccines Developer Adjuvants used Approval /Clinical Vaccine type/Reference HBV Recombivax HB Maurice Hilleman Alum 1986 Subunit [247] Influenza Virus Inflexal® V Crucell Berna Biotech Virosomal 1997 Inactivated [248] HPV Gardasil®/Gardasil® 9 Merck Alum 2006/2014 Recombinant [249] Cervarix®Cecolin Glaxo Smith KlineInnovax AS04Alum 2007 2019 Recombinant [249] Recombinant Ebola Ervebo®VSV-EBOV-GP Merck — 2019 Attenuated [250] , [251] SARS-CoV-2 mRNA-1273 Moderna Liposome 2020 mRNA vaccine [252] AZD1222 University Oxford/Astra Zeneca — 2020 Adenovirus vector [253] Tozinameran(BNT162b2) Pfizer & BioNTech Liposome 2020 mRNA vaccine [254] BBIBP-CorV Beijing Institute of Biological Products Alum 2021 Inactivated [255] Ad5-nCoV Beijing Institute of Biotechnology — 2021 Adenovirus vector [256] HIV ALVAC-HIV (vCP1521) prime, ALVAC-HIV /AIDSVAX gp120 boost Thai Component and U. S. Army Medical Component — Phase II RV306/NCT01931358 [257] Noroviruses GI.1/GII.4 Bivalent Virus like particle (VLP) Vaccine TAKEDA benchmark Alum Phase II NCT02153112 (Child); NCT02475278 (Adult) [258] Norwalk VLP Vaccine LigoCyte Pharmaceuticals Chitosan/ MPL Phase II NCT00806962 [259] MERS MVA-MERS-Sin escalating dose regimes Marylyn Addo — Phase I Attenuated [260] NCT03615911 3.1.1 Hepatitis B virus (HBV) Globally, more than 290 million people are living with HBV [261] . HBV attacks the liver and accounts for more than 900,000 deaths per year. Under the worst-case scenario, there will be a projected 5.3 million additional chronic HBV infections among children born between 2020 and 2030 and one million additional HBV-related deaths among those children. The next-generation HBV vaccination is expected not only to prevent the virus infection, but also to accelerate the elimination of viral hepatitis or even cancer. 3.1.2 Influenza virus During the 1918 influenza pandemic, 20–40 million deaths occurred in the second phase of the outbreak. Antigenic shifts and mutations of the genome between different species of influenza result in the high degree of variation, thereby enabling the emergence of novel influenza strains and drug resistance [262] . Every year, the WHO predicts the possible prevalent virus types and suggests the components for producing the influenza vaccines. However, the emergence of new strains continues to pose a public health threat. Therefore, an advanced vaccine delivery system with cross-protection efficacy would be very desirable. 3.1.3 Human papillomavirus (HPV) HPV is the most common sexually transmitted infection, with the lifetime probability of acquiring HPV ranging between 85% for women and 91% for men. HPV vaccination is an effective primary prevention strategy to reduce HPV infections that can lead to cancer (e.g. cervical, vaginal, anal, and penile cancer) [263] . Although clinical trials of Gardasil and Cervarix have been extremely promising, these first-generation vaccines are not ideal vaccine candidates. Researchers are actively working on the development of other HPV vaccines or delivery systems that may be more effective against a broader range of HPV types (e.g., Gardasil 9-valent vaccine), cheaper (e.g., Cecolin), easier, or even therapeutic. 3.1.4 Ebola virus Ebolavirus is a highly lethal viral pathogen that belongs to Filoviridae (filament-like viruses). It causes viral hemorrhagic fever. The 2014–2016 Ebola epidemic resulted in more than 28,000 cases and more than 11,000 deaths. Ervebo is the first vaccine licensed by FDA in 2019 for the prevention of Ebola virus disease [250] , and over 218,000 doses have been administered to individuals, as of 2020. The vaccine is a recombinant live-attenuated Vesicular stomatitis virus (rVSV) in which the VSV-G envelope glycoprotein (GP) has been completely replaced by the Zaire ebolavirus GP (rVSVΔG-ZEBOV-GP). The data on immunogenicity demonstrate that anti-GP antibodies are generally detectable by 14 days after vaccination, with up to 100% seroconversion observed by 28 days after the dose [264] . Nevertheless, vaccine candidates with relatively short time to immunity after antigen challenge are still under development for immediate public health responses. 3.1.5 SARS-CoV-2 The novel coronavirus SARS-CoV-2 causes coronavirus disease 2019 (COVID-19), which was declared a pandemic on March 11, 2020 by the WHO. Presently, COVID-19 affects most countries on our planet with the result of 163,869,893 confirmed cases, including 3,398,302 deaths, as of May 19, 2021 ( https://covid19.who.int/ ). The pandemic has been considered the worst crisis since the World War II. Vital organs including the heart, liver, kidneys, gastrointestinal tract, and the central nervous system can be affected, causing multiple organ complications [7] . Fortunately, under global efforts, 15 COVID-19 vaccines have been developed at an unprecedented speed (as of May 7, 2021, the main examples can be seen in Table 4 ). The protection rates (>90%) of the first COVID-19 vaccines are exciting [265] , and a reduction rate of 85% in BNT162b2 vaccine recipients has been newly reported [266] . 3.1.6 HIV The emergence of AIDS was first reported in 1981, followed by the identification of HIV as the cause of the disease. HIV/AIDS is now a global pandemic, and 32.7 million people have died from AIDS-related illnesses (as of 2019, according to the Global HIV & AIDS statistics-2020 fact sheet). Recently, an RV144 vaccine that contains canarypox vector ALVAC-HIV (vCP1521) prime and AIDSVAX®gp120 B/E protein boost advanced to phase III clinical trials in Thailand, which shed light on the recent progress. The protection rate was reported to be 31.2% [257] . However, several vaccine candidates (e.g., Env DNA-rAd5) failed to induce the antibodies with neutralization activity [267] , and the first licensed vaccine is long expected. 3.1.7 Norovirus Noroviruses are a major cause of acute gastroenteritis (AGE) around the world. They are transmitted through the fecal–oral route. This virus leads to 200,000 children deaths every year. Recently, the vaccine candidates have focused on the Norovirus VLP Vaccines. One of the most promising candidates is GI.1/GII.4 Bivalent VLP Vaccine with alum adjuvant in phase 2, from Takeda benchmark [258] . This formulation elicits robust immune responses, as Pan-IgG (>93%), IgA (>93%), and antigen-blocking antibodies (>83%) are already evident 8 days after vaccination. The other candidate is the intranasal Norwalk VLP Vaccine with chitosan/MPL adjuvants in phase 2 from Ligocytes [259] . IgG and IgA antibodies increased 4.8- and 9.1-fold, respectively, for the 100-μg dosage level. Although AGE is partially self-limited, it is also associated with a higher risk of severe or fatal consequences in vulnerable age and in the older persons with chronic diseases. In the near future, the development of norovirus vaccine should be expedited. 3.2 Delivery strategies against virus infection Despite the broad medical impact from the vaccination, there are numerous globally devastating virus diseases without fully protective vaccines. As shown in Table 4 , HIV vaccines are still restricted to the clinical trial phase. Even if the tested vaccine candidates help to produce antibodies, the protection (31.2%) may be inadequate. The poor efficacy is highly due to the lack of an efficient adjuvant/delivery system rather than the poor specificity of antigens. In this context, it is more important to develop a vaccine delivery system with high efficiency, long-term efficacy, or cross-protection. Efforts also include the material-based nano/microparticles, biological exosomes, or integrated vehicles, which are described in the section about prophylactic vaccines against bacterial diseases (2.1–2.3). In this section, we further highlighted the advanced vaccine delivery strategies that can meet the fundamental requirements for controlling the virus infections. 3.2.1 Advanced delivery strategy for robust/high protection efficiency For the sudden outbreaks of virus infection (e.g., COVID-19 and Ebola), there is an urgent need to provide robust/high preventive vaccination. Although a few vaccines were licensed in emergency, these first-generation vaccines still need to achieve a higher protective efficacy in a timely manner to end the pandemic. To obtain a similar rapid protection but a much better safety, advanced micro/nano delivery systems with safer antigens (subunit or peptide antigens) are being explored. These vaccine delivery platforms involve synthetic particles, proteinaceous particles, rebuilt particulate adjuvant, and an integrated device. i) Synthetic or proteinaceous micro/nano particles offer great utility in robust vaccine design. Ma's group has designed a series of micro/nanoparticle as "Chassis" to mimic natural pathogen (shape, fluidity, or other properties), and assembled antigen and other components (e.g., adjuvant) on/in it to obtain a synthetic vaccine [8] , [268] . For example, the polylactic-co-glycolic acid (PLGA) nanoparticles-stabilized Pickering emulsion (the core was liquid oil and the antigen was loaded in the nanoparticle gap among the oil surface) showed virus-mimicking deformability/mobility. In virtue of these advantages, the highest protection percentage of H1N1 vaccine was obtained with this chassis. The safety and efficacy were far better than those with commercial adjuvants (e.g., MF59). In another example, researchers developed a nanoparticle vaccine by covalently conjugating the self-assembled 24-mer ferritin (Ft) with the receptor binding domain (RBD) and/or heptad repeat (HR) subunits of SARS-CoV-2 S protein. The nanoparticle vaccination of rhesus macaques induced significantly higher neutralizing antibodies and T and B cell responses prior to boost immunization [269] . Since the components of Ft nanoparticles are from nature, this proteinaceous delivery system is of higher safety than the vaccines harboring artificial materials. However, the virus-mimicking system via the synthetic chassis (prepared of an FDA-approved material) also has translation merits, which facilitates the widespread vaccinations to curb the virus. ii) Incorporating traditional vaccines adjuvants with advantageous physicochemical properties (e.g., size and mobility) is an intelligent manner to develop safe and efficient vaccines within a short time frame. As the most accessible adjuvant, alum is still the sole employed adjuvant in most countries. However, it tends to attach on the membrane rather than to enter the DCs, leading to the absence of intracellular process of the antigens, and thus limits T cell-mediated immunity. Xia et al. packed alum on the squalene/water interphase, forming an alum-stabilized Pickering emulsion (PAPE) [270] . "Inheriting" from alum and squalene, PAPE demonstrated a good biosafety profile. With the dense array of alum on the oil/water interphase, PAPE not only adsorbed large quantities of SARS-CoV-2 antigens, but it also harbored a higher affinity for DC uptake, which provoked the uptake and cross-presentation of the delivered antigens. Compared with alum-treated groups, more than six times higher antigen-specific antibody and three-fold more IFN-γ-secreting T cells were induced, indicating the potent humoral and cellular immune activations ( Fig. 5 ). This work provided important insights towards a safe and efficient adjuvant platform for enhanced COVID-19 vaccines. Fig. 5 Particulate alum via Pickering emulsion as an enhanced COVID-19 vaccine adjuvant. (A) Schematic illustration of PAPE strategy. By "mirroring" clinically approved alum, PAPE "inherited" its acknowledged biosafety profile. (B) Efficient uptake of PAPE (red color in the left confocal images) and lysosomal escape (as indicated by the white arrow in the right penal) were acquired for the PAPE group. Scale bar = 10 µm. (C-D) Potent humoral and cellular response to SARS-CoV-2 RBD vaccinations. (C) Serum RBD-specific IgG titer. (D) ELISpot analysis of IFN-γ-spot-forming cells among splenocytes. Reprinted from [270] , Copyright 2020, with permission from WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.) iii) Novel administration route with integrated nanoparticles vaccines helped to catalyze vaccine candidates at a greater speed. Yang et al. described a method of Ebola vaccine using a DNA antigen coated on PLGA-polyl-lysine/poly-γ-glutamic acid (PLGA-PLL/γPGA) nanoparticle via a microneedle (MN) patch [271] . IgG1 subtype responses were significantly higher after immunization with nanoparticle (intramuscular injection) and still higher when administered by MN patch, while the MN patch showed the highest neutralizing activity, neutralizing over 50% of GP-pseudovirions. Chen et al. reported an influenza vaccination via sustained intradermal (ID) release of vaccines using implantable and patch-free chitosan MN. Chitosan MNs can be quickly and entirely implanted into the dermis to function as a depot and an immune-boosting agent for the extended release of vaccines and simultaneous activation of the immune system. The MN-induced immune-enhancing effect lasted for at least 16 weeks [272] . These integrated delivery systems enable precise vaccine administration by minimally trained personnel and even enhance the vaccine potency. In addition, the MN provides vaccine stability without refrigeration; it is expected to be manufactured at low cost to meet the needs of developing countries. 3.2.2 Advanced delivery strategy for long-term protection Persistent protection is required against the virus with long incubation periods (e.g., 5–10 years for HIV infection) or resultant chronic diseases/cancer (e.g., HBV-induced liver cancer). These diseases even pose fatal challenge for the infectors that have access to anti-virus drugs. In this case, a vaccine with long-term prophylactic efficacy or a therapeutic effect was appreciated. Therefore, vaccine delivery strategies for protecting the antigen (protein or RNA) payload from environmental enzyme degradation or inducing cytotoxic T-cell activity against the infected cells are highly appreciated. i) Advanced delivery systems (e.g., micro/nano formulation, hydrogel) are an important strategy for sustained antigen release. Protein/peptide/drugs are easily degraded by hydrolysis and enzymes in the human body, which results in their short half-life time and the need for frequent injections. Once loaded on micro/nano materials, physical protection or controllable release could be obtained with the material degradation for persistent outcome. Lipids or polymers with good biocompatibility or degradability are attracting a great deal of interest among vaccine delivery systems. The success of the COVID-19 RNA vaccines from either Pfizer or Moderna is highly dependent on the novel lipid delivery system. These lipid nanoparticles substantially improved the stability of the mRNA and facilitated the RNA transfection efficiency in vivo [6] . Tian et al. fabricated a nanovector composed of peptide-based nanofibrous hydrogel, which was able to condense DNA and result in strong immune responses against HIV [273] . This nanovector was able to strongly activate both humoral and cellular immune responses in a balanced way, a result rarely reported in previous studies, which is crucial for HIV prevention and therapy. The nanofibrous structure of the hydrogel is critical for the dramatically improved immune responses compared with the existing materials. A delivery system with the optimum size, structure, and properties could facilitate a long-acting antigen-specific response. Xi et al. reported a poly(lactide-co-glycolide) PLGA microcapsule-based formulation for high-performance vaccinations ( Fig. 6 ) [274] . The special self-healing feature provides a mild and efficient paradigm for antigen microencapsulation. Although without traditional molecular adjuvant, these microcapsules could still create in situ beneficial immunization microenvironments at the vaccination site, wherein sustained antigen release, constant APC recruitment, and favorable acidic surrounding collaborated effectively. As a result, effective T cell response and prevention of postsurgical recurrence were acquired with various types of antigens. Wu et al. developed a thermal-sensitive hydrogel (a formulation of chitosan derivate and glycerophosphate) as intranasal H5N1 vaccine delivery system [275] . In terms of the thermal sensitivity and intensive positive charge, this hydrogel efficiently extended the residence time of antigen in the nasal cavity and promoted the central/effector T RM . Although a wave of efforts have spurred to improve the vaccine effect, these delivery systems were endowed with controllable attributes along with a persistent performance, which is promising to encapsulate other virus antigens and avoid frequent vaccination. Fig. 6 Strategy of using self-healing microcapsules to modulate immunization microenvironments for vaccination [274] . The corresponding characterizations of gigaporous microspheres and antigen-loaded microcapsules are displayed below: (A and A′) Scanning electron microscopy (SEM) images in a magnified view. Scale bars, 10 μm. (B and B′) SEM images in a local feature. Scale bars, 1 μm. (C and C′) Confocal images in two-dimensional (2D) cut view. Scale bars, 5 μm. (D and D′) 3D reconstruction. Scale bars, 10 μm. ii) The enhanced antigen-specific cytotoxic T-cell (CTL) response is considered a promising strategy to prolong the vaccine efficacy. The sustained efficacy is possibly due to the repetitive antigenic surfaces that mimic influenza pathogenic structures, which activate the host immune system to fight against and finally cause the lysis of the pathogens. For example, Wang et al. fabricated double-layered protein nanoparticles via ethanol desolvation and chemical cross-linking of influenza matrix protein 2 ectodomain-neuraminidase (M2e-NA) recombinant proteins [276] . The layered M2e-NA nanoparticles induced a strong CTL response, contributing to long-lasting immune protection. In addition, extracellular vesicles (exosomes) released from CD8 + T cells contained antiviral membrane-bound factors that inhibited HIV-1 transcription in both acute and chronic infection models [277] . To achieve efficient CTL response, Ma's group has developed various particulate strategies for enhanced cross-presentation [8] , including positive charge, gas generating, ligand modification, and membrane fusion. For example, inspired by an important natural biological behavior, membrane fusion, Hu et al. constructed a pH-responsive nanocarrier (HBsAg&CpG@Lip) with a membrane fusion capacity for HBsAg intracellular delivery and subsequent processing by T cells ( Fig. 7 ). This nanoparticle not only elicited a higher anti-HBsAg IgG and IgG2c/IgG1 ratio, but it also augmented the strong CTL response [278] . Lu et al. integrated a physiochemical merit (positive charge) and an immunopotentiator property (stimulator of interferon genes (STING)) in poly (lactic acid) (PLA) microparticles. Such a microparticle-based vaccine achieved 50% HBsAg seroconversion rate, reduced HBcAg in the liver, and also produced higher amount of memory T/B cells to confer protection in a sustained manner [279] . Although a much longer protection efficacy was not monitored, these studies opened alternative avenues for potent therapeutic vaccines, which is particularly important for the chronic infectors without efficient drugs. Fig. 7 Immunological mechanism of the HBsAg&CpG@Lip vaccination. With the assistance of the membrane fusion property, the antigen uptake/activation, cytosolic antigen release, and activation of lymph nodes were induced, promoting a prolonged and efficient humoral/cellular response. Reprinted from [278] , Copyright (2020), with permission from Elsevier. 3.2.3 Advanced delivery strategy for cross-protection Viruses are able to adapt to the changing environment, demanding a cross-protection immune response for the evolved multiple strains. Such a merit is particularly important when the virus mutates annually (e.g., Influenza virus) or raises the risk of coinfection with other pathogens (e.g., HPV). For example, antibodies produced from most influenza vaccines are strain-specific and display poor cross-reactivity with virus hemagglutinins of alternative subtypes [280] . In addition, cross-neutralizing titers, when noted, tend to be at least 100 times lower than type-specific titers and, therefore, cross-protection might be less durable than type-specific protection [281] . Recently, the strategy for cross-protection has mainly focused on incorporating a high conservative virus subdomain or eliciting the CD8 + T cell immunity or T-follicular helper (Tfh) cell immunity. i) Utilizing the conservative virus subdomain is promising for achieving the cross-protection efficacy. Since HR is highly conservative in the coronaviruses evolution and harbors cross-reactive SARS-CoV-2 T-cell epitopes, the HR subdomain within S2 region of S protein is noticed. HR-containing nanoparticle vaccines were demonstrated to produce neutralizing antibodies against SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoVOC43, and RATG13 [269] . In addition, they induced higher percentages of Tfh and B cells within germinal centers, as well as IgG1 and IgG2b memory B cells. As B cell maturation relies on the coordination with Tfh, it is possible that CD4 + T epitopes within HR facilitate Tfh to recognize antigen-specific B cells with high affinity, thereby facilitating the maturation of plasma cells to cope with various virus subtypes. Similar strategy is also meaningful for HPV prevention. As 70%–80% of cases of cervical cancer are caused by HPV-16 and HPV-18, these two types are potential candidates to achieve broader protection through cross-reactivity or expansion of the range of VLP types [282] . In this sense, the qualities of local in vivo concentration and potential effector cells (such as phagocytes or local memory B cells) also shape the cross-protection and longevity, which should be well tuned. ii) Innovative delivery systems for CD8 + T cell-based cross-protection are another promising strategy that is being exploited. Chahal et al. developed an adjuvant-free mono-dispersed dendrimer nanoparticle (MDNP, ~100 nm) vaccine platform wherein antigens were encoded by multiple mRNA replicons. After a single immunization, it elicited vital CD8 + T and antibody responses that fully protected against lethal exposures to several deadly pathogens, including Ebola virus, H1N1 influenza, and Toxoplasma gondii [283] . This work may allow for rapid-response vaccines with broad efficacy, which could reduce the number and frequency of vaccinations and healthcare workers' burden. In another notable example, Wang et al. encapsulated a STING agonist with pulmonary surfactant-biomimetic liposomes (PS-GAMP) in an attempt to accelerate the breadth of nonreplicating influenza vaccines towards universality. This PS-biomimetic nanoparticle has generated wide-spectrum cross-protection against distant H1N1 and heterosubtypic H3N2, H5N1, and H7N9 viruses as early as 2 days after a single intranasal immunization. The adjuvant had potent effects on both primary and booster immune responses, raising serum Ag-specific IgG1 10-fold, IgG more than 100-fold, and IgG2c ~ 1000-fold compared with VN04 H5N1 vaccine alone. The cross-protection lasted for at least 6 months, concurrent with durable lung CD8 + resident T RM cells in mice. These CD8 + T RM cells, rather than circulating memory CD8 + T cells, contributed to the observed long-term protection as their function was not compromised by T cell egress inhibitor. That work strengthened the notion that even transient vaccine-activated innate immunity was sufficient to augment both humoral and cellular immune responses. The intracellular delivery sites (lysosomal or non-lysosomal) and antigen processing (MHC I- or MHC II-mediated presentation) are crucial for cell-mediated response against most vaccine antigens, especially for viral infections and intracellular bacterial infections. The traditional process for exogenous antigens involves lysosomal degradation route and subsequent MHC II-medicated CD4 + T cell priming (humoral response). Some extracellular bacteria (e.g., S. pneumoniae ) are not capable of entering the cells, which is indispensable to the intracellular delivery manner. To prevent such bacterial infections, a higher titer of antibodies that can neutralize the pathogens is needed. In this case, the aim of vaccine delivery systems mainly include eliciting efficient antibody response through a Th2-biased immune response mechanism. In contrast, to cope with the intracellular bacteria (e.g., S. typhi ) or most viruses (e.g., SARS-CoV-2, influenza) that are lethal or variable, cellular response (CD8 + T priming) is particularly important for long-term or cross-protection. Therefore, the aforementioned cross-presentation delivery strategies (e.g., lysosomal escape and biomimetic membrane fusion) or delivery systems (e.g., pH-sensitive or positively charged synthetic particles/liposomes) should be designed to tune the intracellular fate (distribution and presentation) of exogenous antigens for CD8 + T priming. 3.1 Major epidemic viral infections and prevention challenges According to International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), there are 36 classes, 168 families, and 6590 species of viruses (Virus Taxonomy: 2019 Release) [246] . Among the infectious viruses, an overwhelming majority of the viral infections lack the specific drugs, and vaccines have historically been the foremost effective means to save people's lives. Recent epidemic virus diseases and major vaccine products or clinical candidates are listed in Table 4 . Table 4 The major virus-related diseases and vaccine development. Virus Remarkable vaccines Developer Adjuvants used Approval /Clinical Vaccine type/Reference HBV Recombivax HB Maurice Hilleman Alum 1986 Subunit [247] Influenza Virus Inflexal® V Crucell Berna Biotech Virosomal 1997 Inactivated [248] HPV Gardasil®/Gardasil® 9 Merck Alum 2006/2014 Recombinant [249] Cervarix®Cecolin Glaxo Smith KlineInnovax AS04Alum 2007 2019 Recombinant [249] Recombinant Ebola Ervebo®VSV-EBOV-GP Merck — 2019 Attenuated [250] , [251] SARS-CoV-2 mRNA-1273 Moderna Liposome 2020 mRNA vaccine [252] AZD1222 University Oxford/Astra Zeneca — 2020 Adenovirus vector [253] Tozinameran(BNT162b2) Pfizer & BioNTech Liposome 2020 mRNA vaccine [254] BBIBP-CorV Beijing Institute of Biological Products Alum 2021 Inactivated [255] Ad5-nCoV Beijing Institute of Biotechnology — 2021 Adenovirus vector [256] HIV ALVAC-HIV (vCP1521) prime, ALVAC-HIV /AIDSVAX gp120 boost Thai Component and U. S. Army Medical Component — Phase II RV306/NCT01931358 [257] Noroviruses GI.1/GII.4 Bivalent Virus like particle (VLP) Vaccine TAKEDA benchmark Alum Phase II NCT02153112 (Child); NCT02475278 (Adult) [258] Norwalk VLP Vaccine LigoCyte Pharmaceuticals Chitosan/ MPL Phase II NCT00806962 [259] MERS MVA-MERS-Sin escalating dose regimes Marylyn Addo — Phase I Attenuated [260] NCT03615911 3.1.1 Hepatitis B virus (HBV) Globally, more than 290 million people are living with HBV [261] . HBV attacks the liver and accounts for more than 900,000 deaths per year. Under the worst-case scenario, there will be a projected 5.3 million additional chronic HBV infections among children born between 2020 and 2030 and one million additional HBV-related deaths among those children. The next-generation HBV vaccination is expected not only to prevent the virus infection, but also to accelerate the elimination of viral hepatitis or even cancer. 3.1.2 Influenza virus During the 1918 influenza pandemic, 20–40 million deaths occurred in the second phase of the outbreak. Antigenic shifts and mutations of the genome between different species of influenza result in the high degree of variation, thereby enabling the emergence of novel influenza strains and drug resistance [262] . Every year, the WHO predicts the possible prevalent virus types and suggests the components for producing the influenza vaccines. However, the emergence of new strains continues to pose a public health threat. Therefore, an advanced vaccine delivery system with cross-protection efficacy would be very desirable. 3.1.3 Human papillomavirus (HPV) HPV is the most common sexually transmitted infection, with the lifetime probability of acquiring HPV ranging between 85% for women and 91% for men. HPV vaccination is an effective primary prevention strategy to reduce HPV infections that can lead to cancer (e.g. cervical, vaginal, anal, and penile cancer) [263] . Although clinical trials of Gardasil and Cervarix have been extremely promising, these first-generation vaccines are not ideal vaccine candidates. Researchers are actively working on the development of other HPV vaccines or delivery systems that may be more effective against a broader range of HPV types (e.g., Gardasil 9-valent vaccine), cheaper (e.g., Cecolin), easier, or even therapeutic. 3.1.4 Ebola virus Ebolavirus is a highly lethal viral pathogen that belongs to Filoviridae (filament-like viruses). It causes viral hemorrhagic fever. The 2014–2016 Ebola epidemic resulted in more than 28,000 cases and more than 11,000 deaths. Ervebo is the first vaccine licensed by FDA in 2019 for the prevention of Ebola virus disease [250] , and over 218,000 doses have been administered to individuals, as of 2020. The vaccine is a recombinant live-attenuated Vesicular stomatitis virus (rVSV) in which the VSV-G envelope glycoprotein (GP) has been completely replaced by the Zaire ebolavirus GP (rVSVΔG-ZEBOV-GP). The data on immunogenicity demonstrate that anti-GP antibodies are generally detectable by 14 days after vaccination, with up to 100% seroconversion observed by 28 days after the dose [264] . Nevertheless, vaccine candidates with relatively short time to immunity after antigen challenge are still under development for immediate public health responses. 3.1.5 SARS-CoV-2 The novel coronavirus SARS-CoV-2 causes coronavirus disease 2019 (COVID-19), which was declared a pandemic on March 11, 2020 by the WHO. Presently, COVID-19 affects most countries on our planet with the result of 163,869,893 confirmed cases, including 3,398,302 deaths, as of May 19, 2021 ( https://covid19.who.int/ ). The pandemic has been considered the worst crisis since the World War II. Vital organs including the heart, liver, kidneys, gastrointestinal tract, and the central nervous system can be affected, causing multiple organ complications [7] . Fortunately, under global efforts, 15 COVID-19 vaccines have been developed at an unprecedented speed (as of May 7, 2021, the main examples can be seen in Table 4 ). The protection rates (>90%) of the first COVID-19 vaccines are exciting [265] , and a reduction rate of 85% in BNT162b2 vaccine recipients has been newly reported [266] . 3.1.6 HIV The emergence of AIDS was first reported in 1981, followed by the identification of HIV as the cause of the disease. HIV/AIDS is now a global pandemic, and 32.7 million people have died from AIDS-related illnesses (as of 2019, according to the Global HIV & AIDS statistics-2020 fact sheet). Recently, an RV144 vaccine that contains canarypox vector ALVAC-HIV (vCP1521) prime and AIDSVAX®gp120 B/E protein boost advanced to phase III clinical trials in Thailand, which shed light on the recent progress. The protection rate was reported to be 31.2% [257] . However, several vaccine candidates (e.g., Env DNA-rAd5) failed to induce the antibodies with neutralization activity [267] , and the first licensed vaccine is long expected. 3.1.7 Norovirus Noroviruses are a major cause of acute gastroenteritis (AGE) around the world. They are transmitted through the fecal–oral route. This virus leads to 200,000 children deaths every year. Recently, the vaccine candidates have focused on the Norovirus VLP Vaccines. One of the most promising candidates is GI.1/GII.4 Bivalent VLP Vaccine with alum adjuvant in phase 2, from Takeda benchmark [258] . This formulation elicits robust immune responses, as Pan-IgG (>93%), IgA (>93%), and antigen-blocking antibodies (>83%) are already evident 8 days after vaccination. The other candidate is the intranasal Norwalk VLP Vaccine with chitosan/MPL adjuvants in phase 2 from Ligocytes [259] . IgG and IgA antibodies increased 4.8- and 9.1-fold, respectively, for the 100-μg dosage level. Although AGE is partially self-limited, it is also associated with a higher risk of severe or fatal consequences in vulnerable age and in the older persons with chronic diseases. In the near future, the development of norovirus vaccine should be expedited. 3.1.1 Hepatitis B virus (HBV) Globally, more than 290 million people are living with HBV [261] . HBV attacks the liver and accounts for more than 900,000 deaths per year. Under the worst-case scenario, there will be a projected 5.3 million additional chronic HBV infections among children born between 2020 and 2030 and one million additional HBV-related deaths among those children. The next-generation HBV vaccination is expected not only to prevent the virus infection, but also to accelerate the elimination of viral hepatitis or even cancer. 3.1.2 Influenza virus During the 1918 influenza pandemic, 20–40 million deaths occurred in the second phase of the outbreak. Antigenic shifts and mutations of the genome between different species of influenza result in the high degree of variation, thereby enabling the emergence of novel influenza strains and drug resistance [262] . Every year, the WHO predicts the possible prevalent virus types and suggests the components for producing the influenza vaccines. However, the emergence of new strains continues to pose a public health threat. Therefore, an advanced vaccine delivery system with cross-protection efficacy would be very desirable. 3.1.3 Human papillomavirus (HPV) HPV is the most common sexually transmitted infection, with the lifetime probability of acquiring HPV ranging between 85% for women and 91% for men. HPV vaccination is an effective primary prevention strategy to reduce HPV infections that can lead to cancer (e.g. cervical, vaginal, anal, and penile cancer) [263] . Although clinical trials of Gardasil and Cervarix have been extremely promising, these first-generation vaccines are not ideal vaccine candidates. Researchers are actively working on the development of other HPV vaccines or delivery systems that may be more effective against a broader range of HPV types (e.g., Gardasil 9-valent vaccine), cheaper (e.g., Cecolin), easier, or even therapeutic. 3.1.4 Ebola virus Ebolavirus is a highly lethal viral pathogen that belongs to Filoviridae (filament-like viruses). It causes viral hemorrhagic fever. The 2014–2016 Ebola epidemic resulted in more than 28,000 cases and more than 11,000 deaths. Ervebo is the first vaccine licensed by FDA in 2019 for the prevention of Ebola virus disease [250] , and over 218,000 doses have been administered to individuals, as of 2020. The vaccine is a recombinant live-attenuated Vesicular stomatitis virus (rVSV) in which the VSV-G envelope glycoprotein (GP) has been completely replaced by the Zaire ebolavirus GP (rVSVΔG-ZEBOV-GP). The data on immunogenicity demonstrate that anti-GP antibodies are generally detectable by 14 days after vaccination, with up to 100% seroconversion observed by 28 days after the dose [264] . Nevertheless, vaccine candidates with relatively short time to immunity after antigen challenge are still under development for immediate public health responses. 3.1.5 SARS-CoV-2 The novel coronavirus SARS-CoV-2 causes coronavirus disease 2019 (COVID-19), which was declared a pandemic on March 11, 2020 by the WHO. Presently, COVID-19 affects most countries on our planet with the result of 163,869,893 confirmed cases, including 3,398,302 deaths, as of May 19, 2021 ( https://covid19.who.int/ ). The pandemic has been considered the worst crisis since the World War II. Vital organs including the heart, liver, kidneys, gastrointestinal tract, and the central nervous system can be affected, causing multiple organ complications [7] . Fortunately, under global efforts, 15 COVID-19 vaccines have been developed at an unprecedented speed (as of May 7, 2021, the main examples can be seen in Table 4 ). The protection rates (>90%) of the first COVID-19 vaccines are exciting [265] , and a reduction rate of 85% in BNT162b2 vaccine recipients has been newly reported [266] . 3.1.6 HIV The emergence of AIDS was first reported in 1981, followed by the identification of HIV as the cause of the disease. HIV/AIDS is now a global pandemic, and 32.7 million people have died from AIDS-related illnesses (as of 2019, according to the Global HIV & AIDS statistics-2020 fact sheet). Recently, an RV144 vaccine that contains canarypox vector ALVAC-HIV (vCP1521) prime and AIDSVAX®gp120 B/E protein boost advanced to phase III clinical trials in Thailand, which shed light on the recent progress. The protection rate was reported to be 31.2% [257] . However, several vaccine candidates (e.g., Env DNA-rAd5) failed to induce the antibodies with neutralization activity [267] , and the first licensed vaccine is long expected. 3.1.7 Norovirus Noroviruses are a major cause of acute gastroenteritis (AGE) around the world. They are transmitted through the fecal–oral route. This virus leads to 200,000 children deaths every year. Recently, the vaccine candidates have focused on the Norovirus VLP Vaccines. One of the most promising candidates is GI.1/GII.4 Bivalent VLP Vaccine with alum adjuvant in phase 2, from Takeda benchmark [258] . This formulation elicits robust immune responses, as Pan-IgG (>93%), IgA (>93%), and antigen-blocking antibodies (>83%) are already evident 8 days after vaccination. The other candidate is the intranasal Norwalk VLP Vaccine with chitosan/MPL adjuvants in phase 2 from Ligocytes [259] . IgG and IgA antibodies increased 4.8- and 9.1-fold, respectively, for the 100-μg dosage level. Although AGE is partially self-limited, it is also associated with a higher risk of severe or fatal consequences in vulnerable age and in the older persons with chronic diseases. In the near future, the development of norovirus vaccine should be expedited. 3.2 Delivery strategies against virus infection Despite the broad medical impact from the vaccination, there are numerous globally devastating virus diseases without fully protective vaccines. As shown in Table 4 , HIV vaccines are still restricted to the clinical trial phase. Even if the tested vaccine candidates help to produce antibodies, the protection (31.2%) may be inadequate. The poor efficacy is highly due to the lack of an efficient adjuvant/delivery system rather than the poor specificity of antigens. In this context, it is more important to develop a vaccine delivery system with high efficiency, long-term efficacy, or cross-protection. Efforts also include the material-based nano/microparticles, biological exosomes, or integrated vehicles, which are described in the section about prophylactic vaccines against bacterial diseases (2.1–2.3). In this section, we further highlighted the advanced vaccine delivery strategies that can meet the fundamental requirements for controlling the virus infections. 3.2.1 Advanced delivery strategy for robust/high protection efficiency For the sudden outbreaks of virus infection (e.g., COVID-19 and Ebola), there is an urgent need to provide robust/high preventive vaccination. Although a few vaccines were licensed in emergency, these first-generation vaccines still need to achieve a higher protective efficacy in a timely manner to end the pandemic. To obtain a similar rapid protection but a much better safety, advanced micro/nano delivery systems with safer antigens (subunit or peptide antigens) are being explored. These vaccine delivery platforms involve synthetic particles, proteinaceous particles, rebuilt particulate adjuvant, and an integrated device. i) Synthetic or proteinaceous micro/nano particles offer great utility in robust vaccine design. Ma's group has designed a series of micro/nanoparticle as "Chassis" to mimic natural pathogen (shape, fluidity, or other properties), and assembled antigen and other components (e.g., adjuvant) on/in it to obtain a synthetic vaccine [8] , [268] . For example, the polylactic-co-glycolic acid (PLGA) nanoparticles-stabilized Pickering emulsion (the core was liquid oil and the antigen was loaded in the nanoparticle gap among the oil surface) showed virus-mimicking deformability/mobility. In virtue of these advantages, the highest protection percentage of H1N1 vaccine was obtained with this chassis. The safety and efficacy were far better than those with commercial adjuvants (e.g., MF59). In another example, researchers developed a nanoparticle vaccine by covalently conjugating the self-assembled 24-mer ferritin (Ft) with the receptor binding domain (RBD) and/or heptad repeat (HR) subunits of SARS-CoV-2 S protein. The nanoparticle vaccination of rhesus macaques induced significantly higher neutralizing antibodies and T and B cell responses prior to boost immunization [269] . Since the components of Ft nanoparticles are from nature, this proteinaceous delivery system is of higher safety than the vaccines harboring artificial materials. However, the virus-mimicking system via the synthetic chassis (prepared of an FDA-approved material) also has translation merits, which facilitates the widespread vaccinations to curb the virus. ii) Incorporating traditional vaccines adjuvants with advantageous physicochemical properties (e.g., size and mobility) is an intelligent manner to develop safe and efficient vaccines within a short time frame. As the most accessible adjuvant, alum is still the sole employed adjuvant in most countries. However, it tends to attach on the membrane rather than to enter the DCs, leading to the absence of intracellular process of the antigens, and thus limits T cell-mediated immunity. Xia et al. packed alum on the squalene/water interphase, forming an alum-stabilized Pickering emulsion (PAPE) [270] . "Inheriting" from alum and squalene, PAPE demonstrated a good biosafety profile. With the dense array of alum on the oil/water interphase, PAPE not only adsorbed large quantities of SARS-CoV-2 antigens, but it also harbored a higher affinity for DC uptake, which provoked the uptake and cross-presentation of the delivered antigens. Compared with alum-treated groups, more than six times higher antigen-specific antibody and three-fold more IFN-γ-secreting T cells were induced, indicating the potent humoral and cellular immune activations ( Fig. 5 ). This work provided important insights towards a safe and efficient adjuvant platform for enhanced COVID-19 vaccines. Fig. 5 Particulate alum via Pickering emulsion as an enhanced COVID-19 vaccine adjuvant. (A) Schematic illustration of PAPE strategy. By "mirroring" clinically approved alum, PAPE "inherited" its acknowledged biosafety profile. (B) Efficient uptake of PAPE (red color in the left confocal images) and lysosomal escape (as indicated by the white arrow in the right penal) were acquired for the PAPE group. Scale bar = 10 µm. (C-D) Potent humoral and cellular response to SARS-CoV-2 RBD vaccinations. (C) Serum RBD-specific IgG titer. (D) ELISpot analysis of IFN-γ-spot-forming cells among splenocytes. Reprinted from [270] , Copyright 2020, with permission from WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.) iii) Novel administration route with integrated nanoparticles vaccines helped to catalyze vaccine candidates at a greater speed. Yang et al. described a method of Ebola vaccine using a DNA antigen coated on PLGA-polyl-lysine/poly-γ-glutamic acid (PLGA-PLL/γPGA) nanoparticle via a microneedle (MN) patch [271] . IgG1 subtype responses were significantly higher after immunization with nanoparticle (intramuscular injection) and still higher when administered by MN patch, while the MN patch showed the highest neutralizing activity, neutralizing over 50% of GP-pseudovirions. Chen et al. reported an influenza vaccination via sustained intradermal (ID) release of vaccines using implantable and patch-free chitosan MN. Chitosan MNs can be quickly and entirely implanted into the dermis to function as a depot and an immune-boosting agent for the extended release of vaccines and simultaneous activation of the immune system. The MN-induced immune-enhancing effect lasted for at least 16 weeks [272] . These integrated delivery systems enable precise vaccine administration by minimally trained personnel and even enhance the vaccine potency. In addition, the MN provides vaccine stability without refrigeration; it is expected to be manufactured at low cost to meet the needs of developing countries. 3.2.2 Advanced delivery strategy for long-term protection Persistent protection is required against the virus with long incubation periods (e.g., 5–10 years for HIV infection) or resultant chronic diseases/cancer (e.g., HBV-induced liver cancer). These diseases even pose fatal challenge for the infectors that have access to anti-virus drugs. In this case, a vaccine with long-term prophylactic efficacy or a therapeutic effect was appreciated. Therefore, vaccine delivery strategies for protecting the antigen (protein or RNA) payload from environmental enzyme degradation or inducing cytotoxic T-cell activity against the infected cells are highly appreciated. i) Advanced delivery systems (e.g., micro/nano formulation, hydrogel) are an important strategy for sustained antigen release. Protein/peptide/drugs are easily degraded by hydrolysis and enzymes in the human body, which results in their short half-life time and the need for frequent injections. Once loaded on micro/nano materials, physical protection or controllable release could be obtained with the material degradation for persistent outcome. Lipids or polymers with good biocompatibility or degradability are attracting a great deal of interest among vaccine delivery systems. The success of the COVID-19 RNA vaccines from either Pfizer or Moderna is highly dependent on the novel lipid delivery system. These lipid nanoparticles substantially improved the stability of the mRNA and facilitated the RNA transfection efficiency in vivo [6] . Tian et al. fabricated a nanovector composed of peptide-based nanofibrous hydrogel, which was able to condense DNA and result in strong immune responses against HIV [273] . This nanovector was able to strongly activate both humoral and cellular immune responses in a balanced way, a result rarely reported in previous studies, which is crucial for HIV prevention and therapy. The nanofibrous structure of the hydrogel is critical for the dramatically improved immune responses compared with the existing materials. A delivery system with the optimum size, structure, and properties could facilitate a long-acting antigen-specific response. Xi et al. reported a poly(lactide-co-glycolide) PLGA microcapsule-based formulation for high-performance vaccinations ( Fig. 6 ) [274] . The special self-healing feature provides a mild and efficient paradigm for antigen microencapsulation. Although without traditional molecular adjuvant, these microcapsules could still create in situ beneficial immunization microenvironments at the vaccination site, wherein sustained antigen release, constant APC recruitment, and favorable acidic surrounding collaborated effectively. As a result, effective T cell response and prevention of postsurgical recurrence were acquired with various types of antigens. Wu et al. developed a thermal-sensitive hydrogel (a formulation of chitosan derivate and glycerophosphate) as intranasal H5N1 vaccine delivery system [275] . In terms of the thermal sensitivity and intensive positive charge, this hydrogel efficiently extended the residence time of antigen in the nasal cavity and promoted the central/effector T RM . Although a wave of efforts have spurred to improve the vaccine effect, these delivery systems were endowed with controllable attributes along with a persistent performance, which is promising to encapsulate other virus antigens and avoid frequent vaccination. Fig. 6 Strategy of using self-healing microcapsules to modulate immunization microenvironments for vaccination [274] . The corresponding characterizations of gigaporous microspheres and antigen-loaded microcapsules are displayed below: (A and A′) Scanning electron microscopy (SEM) images in a magnified view. Scale bars, 10 μm. (B and B′) SEM images in a local feature. Scale bars, 1 μm. (C and C′) Confocal images in two-dimensional (2D) cut view. Scale bars, 5 μm. (D and D′) 3D reconstruction. Scale bars, 10 μm. ii) The enhanced antigen-specific cytotoxic T-cell (CTL) response is considered a promising strategy to prolong the vaccine efficacy. The sustained efficacy is possibly due to the repetitive antigenic surfaces that mimic influenza pathogenic structures, which activate the host immune system to fight against and finally cause the lysis of the pathogens. For example, Wang et al. fabricated double-layered protein nanoparticles via ethanol desolvation and chemical cross-linking of influenza matrix protein 2 ectodomain-neuraminidase (M2e-NA) recombinant proteins [276] . The layered M2e-NA nanoparticles induced a strong CTL response, contributing to long-lasting immune protection. In addition, extracellular vesicles (exosomes) released from CD8 + T cells contained antiviral membrane-bound factors that inhibited HIV-1 transcription in both acute and chronic infection models [277] . To achieve efficient CTL response, Ma's group has developed various particulate strategies for enhanced cross-presentation [8] , including positive charge, gas generating, ligand modification, and membrane fusion. For example, inspired by an important natural biological behavior, membrane fusion, Hu et al. constructed a pH-responsive nanocarrier (HBsAg&CpG@Lip) with a membrane fusion capacity for HBsAg intracellular delivery and subsequent processing by T cells ( Fig. 7 ). This nanoparticle not only elicited a higher anti-HBsAg IgG and IgG2c/IgG1 ratio, but it also augmented the strong CTL response [278] . Lu et al. integrated a physiochemical merit (positive charge) and an immunopotentiator property (stimulator of interferon genes (STING)) in poly (lactic acid) (PLA) microparticles. Such a microparticle-based vaccine achieved 50% HBsAg seroconversion rate, reduced HBcAg in the liver, and also produced higher amount of memory T/B cells to confer protection in a sustained manner [279] . Although a much longer protection efficacy was not monitored, these studies opened alternative avenues for potent therapeutic vaccines, which is particularly important for the chronic infectors without efficient drugs. Fig. 7 Immunological mechanism of the HBsAg&CpG@Lip vaccination. With the assistance of the membrane fusion property, the antigen uptake/activation, cytosolic antigen release, and activation of lymph nodes were induced, promoting a prolonged and efficient humoral/cellular response. Reprinted from [278] , Copyright (2020), with permission from Elsevier. 3.2.3 Advanced delivery strategy for cross-protection Viruses are able to adapt to the changing environment, demanding a cross-protection immune response for the evolved multiple strains. Such a merit is particularly important when the virus mutates annually (e.g., Influenza virus) or raises the risk of coinfection with other pathogens (e.g., HPV). For example, antibodies produced from most influenza vaccines are strain-specific and display poor cross-reactivity with virus hemagglutinins of alternative subtypes [280] . In addition, cross-neutralizing titers, when noted, tend to be at least 100 times lower than type-specific titers and, therefore, cross-protection might be less durable than type-specific protection [281] . Recently, the strategy for cross-protection has mainly focused on incorporating a high conservative virus subdomain or eliciting the CD8 + T cell immunity or T-follicular helper (Tfh) cell immunity. i) Utilizing the conservative virus subdomain is promising for achieving the cross-protection efficacy. Since HR is highly conservative in the coronaviruses evolution and harbors cross-reactive SARS-CoV-2 T-cell epitopes, the HR subdomain within S2 region of S protein is noticed. HR-containing nanoparticle vaccines were demonstrated to produce neutralizing antibodies against SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoVOC43, and RATG13 [269] . In addition, they induced higher percentages of Tfh and B cells within germinal centers, as well as IgG1 and IgG2b memory B cells. As B cell maturation relies on the coordination with Tfh, it is possible that CD4 + T epitopes within HR facilitate Tfh to recognize antigen-specific B cells with high affinity, thereby facilitating the maturation of plasma cells to cope with various virus subtypes. Similar strategy is also meaningful for HPV prevention. As 70%–80% of cases of cervical cancer are caused by HPV-16 and HPV-18, these two types are potential candidates to achieve broader protection through cross-reactivity or expansion of the range of VLP types [282] . In this sense, the qualities of local in vivo concentration and potential effector cells (such as phagocytes or local memory B cells) also shape the cross-protection and longevity, which should be well tuned. ii) Innovative delivery systems for CD8 + T cell-based cross-protection are another promising strategy that is being exploited. Chahal et al. developed an adjuvant-free mono-dispersed dendrimer nanoparticle (MDNP, ~100 nm) vaccine platform wherein antigens were encoded by multiple mRNA replicons. After a single immunization, it elicited vital CD8 + T and antibody responses that fully protected against lethal exposures to several deadly pathogens, including Ebola virus, H1N1 influenza, and Toxoplasma gondii [283] . This work may allow for rapid-response vaccines with broad efficacy, which could reduce the number and frequency of vaccinations and healthcare workers' burden. In another notable example, Wang et al. encapsulated a STING agonist with pulmonary surfactant-biomimetic liposomes (PS-GAMP) in an attempt to accelerate the breadth of nonreplicating influenza vaccines towards universality. This PS-biomimetic nanoparticle has generated wide-spectrum cross-protection against distant H1N1 and heterosubtypic H3N2, H5N1, and H7N9 viruses as early as 2 days after a single intranasal immunization. The adjuvant had potent effects on both primary and booster immune responses, raising serum Ag-specific IgG1 10-fold, IgG more than 100-fold, and IgG2c ~ 1000-fold compared with VN04 H5N1 vaccine alone. The cross-protection lasted for at least 6 months, concurrent with durable lung CD8 + resident T RM cells in mice. These CD8 + T RM cells, rather than circulating memory CD8 + T cells, contributed to the observed long-term protection as their function was not compromised by T cell egress inhibitor. That work strengthened the notion that even transient vaccine-activated innate immunity was sufficient to augment both humoral and cellular immune responses. The intracellular delivery sites (lysosomal or non-lysosomal) and antigen processing (MHC I- or MHC II-mediated presentation) are crucial for cell-mediated response against most vaccine antigens, especially for viral infections and intracellular bacterial infections. The traditional process for exogenous antigens involves lysosomal degradation route and subsequent MHC II-medicated CD4 + T cell priming (humoral response). Some extracellular bacteria (e.g., S. pneumoniae ) are not capable of entering the cells, which is indispensable to the intracellular delivery manner. To prevent such bacterial infections, a higher titer of antibodies that can neutralize the pathogens is needed. In this case, the aim of vaccine delivery systems mainly include eliciting efficient antibody response through a Th2-biased immune response mechanism. In contrast, to cope with the intracellular bacteria (e.g., S. typhi ) or most viruses (e.g., SARS-CoV-2, influenza) that are lethal or variable, cellular response (CD8 + T priming) is particularly important for long-term or cross-protection. Therefore, the aforementioned cross-presentation delivery strategies (e.g., lysosomal escape and biomimetic membrane fusion) or delivery systems (e.g., pH-sensitive or positively charged synthetic particles/liposomes) should be designed to tune the intracellular fate (distribution and presentation) of exogenous antigens for CD8 + T priming. 3.2.1 Advanced delivery strategy for robust/high protection efficiency For the sudden outbreaks of virus infection (e.g., COVID-19 and Ebola), there is an urgent need to provide robust/high preventive vaccination. Although a few vaccines were licensed in emergency, these first-generation vaccines still need to achieve a higher protective efficacy in a timely manner to end the pandemic. To obtain a similar rapid protection but a much better safety, advanced micro/nano delivery systems with safer antigens (subunit or peptide antigens) are being explored. These vaccine delivery platforms involve synthetic particles, proteinaceous particles, rebuilt particulate adjuvant, and an integrated device. i) Synthetic or proteinaceous micro/nano particles offer great utility in robust vaccine design. Ma's group has designed a series of micro/nanoparticle as "Chassis" to mimic natural pathogen (shape, fluidity, or other properties), and assembled antigen and other components (e.g., adjuvant) on/in it to obtain a synthetic vaccine [8] , [268] . For example, the polylactic-co-glycolic acid (PLGA) nanoparticles-stabilized Pickering emulsion (the core was liquid oil and the antigen was loaded in the nanoparticle gap among the oil surface) showed virus-mimicking deformability/mobility. In virtue of these advantages, the highest protection percentage of H1N1 vaccine was obtained with this chassis. The safety and efficacy were far better than those with commercial adjuvants (e.g., MF59). In another example, researchers developed a nanoparticle vaccine by covalently conjugating the self-assembled 24-mer ferritin (Ft) with the receptor binding domain (RBD) and/or heptad repeat (HR) subunits of SARS-CoV-2 S protein. The nanoparticle vaccination of rhesus macaques induced significantly higher neutralizing antibodies and T and B cell responses prior to boost immunization [269] . Since the components of Ft nanoparticles are from nature, this proteinaceous delivery system is of higher safety than the vaccines harboring artificial materials. However, the virus-mimicking system via the synthetic chassis (prepared of an FDA-approved material) also has translation merits, which facilitates the widespread vaccinations to curb the virus. ii) Incorporating traditional vaccines adjuvants with advantageous physicochemical properties (e.g., size and mobility) is an intelligent manner to develop safe and efficient vaccines within a short time frame. As the most accessible adjuvant, alum is still the sole employed adjuvant in most countries. However, it tends to attach on the membrane rather than to enter the DCs, leading to the absence of intracellular process of the antigens, and thus limits T cell-mediated immunity. Xia et al. packed alum on the squalene/water interphase, forming an alum-stabilized Pickering emulsion (PAPE) [270] . "Inheriting" from alum and squalene, PAPE demonstrated a good biosafety profile. With the dense array of alum on the oil/water interphase, PAPE not only adsorbed large quantities of SARS-CoV-2 antigens, but it also harbored a higher affinity for DC uptake, which provoked the uptake and cross-presentation of the delivered antigens. Compared with alum-treated groups, more than six times higher antigen-specific antibody and three-fold more IFN-γ-secreting T cells were induced, indicating the potent humoral and cellular immune activations ( Fig. 5 ). This work provided important insights towards a safe and efficient adjuvant platform for enhanced COVID-19 vaccines. Fig. 5 Particulate alum via Pickering emulsion as an enhanced COVID-19 vaccine adjuvant. (A) Schematic illustration of PAPE strategy. By "mirroring" clinically approved alum, PAPE "inherited" its acknowledged biosafety profile. (B) Efficient uptake of PAPE (red color in the left confocal images) and lysosomal escape (as indicated by the white arrow in the right penal) were acquired for the PAPE group. Scale bar = 10 µm. (C-D) Potent humoral and cellular response to SARS-CoV-2 RBD vaccinations. (C) Serum RBD-specific IgG titer. (D) ELISpot analysis of IFN-γ-spot-forming cells among splenocytes. Reprinted from [270] , Copyright 2020, with permission from WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.) iii) Novel administration route with integrated nanoparticles vaccines helped to catalyze vaccine candidates at a greater speed. Yang et al. described a method of Ebola vaccine using a DNA antigen coated on PLGA-polyl-lysine/poly-γ-glutamic acid (PLGA-PLL/γPGA) nanoparticle via a microneedle (MN) patch [271] . IgG1 subtype responses were significantly higher after immunization with nanoparticle (intramuscular injection) and still higher when administered by MN patch, while the MN patch showed the highest neutralizing activity, neutralizing over 50% of GP-pseudovirions. Chen et al. reported an influenza vaccination via sustained intradermal (ID) release of vaccines using implantable and patch-free chitosan MN. Chitosan MNs can be quickly and entirely implanted into the dermis to function as a depot and an immune-boosting agent for the extended release of vaccines and simultaneous activation of the immune system. The MN-induced immune-enhancing effect lasted for at least 16 weeks [272] . These integrated delivery systems enable precise vaccine administration by minimally trained personnel and even enhance the vaccine potency. In addition, the MN provides vaccine stability without refrigeration; it is expected to be manufactured at low cost to meet the needs of developing countries. 3.2.2 Advanced delivery strategy for long-term protection Persistent protection is required against the virus with long incubation periods (e.g., 5–10 years for HIV infection) or resultant chronic diseases/cancer (e.g., HBV-induced liver cancer). These diseases even pose fatal challenge for the infectors that have access to anti-virus drugs. In this case, a vaccine with long-term prophylactic efficacy or a therapeutic effect was appreciated. Therefore, vaccine delivery strategies for protecting the antigen (protein or RNA) payload from environmental enzyme degradation or inducing cytotoxic T-cell activity against the infected cells are highly appreciated. i) Advanced delivery systems (e.g., micro/nano formulation, hydrogel) are an important strategy for sustained antigen release. Protein/peptide/drugs are easily degraded by hydrolysis and enzymes in the human body, which results in their short half-life time and the need for frequent injections. Once loaded on micro/nano materials, physical protection or controllable release could be obtained with the material degradation for persistent outcome. Lipids or polymers with good biocompatibility or degradability are attracting a great deal of interest among vaccine delivery systems. The success of the COVID-19 RNA vaccines from either Pfizer or Moderna is highly dependent on the novel lipid delivery system. These lipid nanoparticles substantially improved the stability of the mRNA and facilitated the RNA transfection efficiency in vivo [6] . Tian et al. fabricated a nanovector composed of peptide-based nanofibrous hydrogel, which was able to condense DNA and result in strong immune responses against HIV [273] . This nanovector was able to strongly activate both humoral and cellular immune responses in a balanced way, a result rarely reported in previous studies, which is crucial for HIV prevention and therapy. The nanofibrous structure of the hydrogel is critical for the dramatically improved immune responses compared with the existing materials. A delivery system with the optimum size, structure, and properties could facilitate a long-acting antigen-specific response. Xi et al. reported a poly(lactide-co-glycolide) PLGA microcapsule-based formulation for high-performance vaccinations ( Fig. 6 ) [274] . The special self-healing feature provides a mild and efficient paradigm for antigen microencapsulation. Although without traditional molecular adjuvant, these microcapsules could still create in situ beneficial immunization microenvironments at the vaccination site, wherein sustained antigen release, constant APC recruitment, and favorable acidic surrounding collaborated effectively. As a result, effective T cell response and prevention of postsurgical recurrence were acquired with various types of antigens. Wu et al. developed a thermal-sensitive hydrogel (a formulation of chitosan derivate and glycerophosphate) as intranasal H5N1 vaccine delivery system [275] . In terms of the thermal sensitivity and intensive positive charge, this hydrogel efficiently extended the residence time of antigen in the nasal cavity and promoted the central/effector T RM . Although a wave of efforts have spurred to improve the vaccine effect, these delivery systems were endowed with controllable attributes along with a persistent performance, which is promising to encapsulate other virus antigens and avoid frequent vaccination. Fig. 6 Strategy of using self-healing microcapsules to modulate immunization microenvironments for vaccination [274] . The corresponding characterizations of gigaporous microspheres and antigen-loaded microcapsules are displayed below: (A and A′) Scanning electron microscopy (SEM) images in a magnified view. Scale bars, 10 μm. (B and B′) SEM images in a local feature. Scale bars, 1 μm. (C and C′) Confocal images in two-dimensional (2D) cut view. Scale bars, 5 μm. (D and D′) 3D reconstruction. Scale bars, 10 μm. ii) The enhanced antigen-specific cytotoxic T-cell (CTL) response is considered a promising strategy to prolong the vaccine efficacy. The sustained efficacy is possibly due to the repetitive antigenic surfaces that mimic influenza pathogenic structures, which activate the host immune system to fight against and finally cause the lysis of the pathogens. For example, Wang et al. fabricated double-layered protein nanoparticles via ethanol desolvation and chemical cross-linking of influenza matrix protein 2 ectodomain-neuraminidase (M2e-NA) recombinant proteins [276] . The layered M2e-NA nanoparticles induced a strong CTL response, contributing to long-lasting immune protection. In addition, extracellular vesicles (exosomes) released from CD8 + T cells contained antiviral membrane-bound factors that inhibited HIV-1 transcription in both acute and chronic infection models [277] . To achieve efficient CTL response, Ma's group has developed various particulate strategies for enhanced cross-presentation [8] , including positive charge, gas generating, ligand modification, and membrane fusion. For example, inspired by an important natural biological behavior, membrane fusion, Hu et al. constructed a pH-responsive nanocarrier (HBsAg&CpG@Lip) with a membrane fusion capacity for HBsAg intracellular delivery and subsequent processing by T cells ( Fig. 7 ). This nanoparticle not only elicited a higher anti-HBsAg IgG and IgG2c/IgG1 ratio, but it also augmented the strong CTL response [278] . Lu et al. integrated a physiochemical merit (positive charge) and an immunopotentiator property (stimulator of interferon genes (STING)) in poly (lactic acid) (PLA) microparticles. Such a microparticle-based vaccine achieved 50% HBsAg seroconversion rate, reduced HBcAg in the liver, and also produced higher amount of memory T/B cells to confer protection in a sustained manner [279] . Although a much longer protection efficacy was not monitored, these studies opened alternative avenues for potent therapeutic vaccines, which is particularly important for the chronic infectors without efficient drugs. Fig. 7 Immunological mechanism of the HBsAg&CpG@Lip vaccination. With the assistance of the membrane fusion property, the antigen uptake/activation, cytosolic antigen release, and activation of lymph nodes were induced, promoting a prolonged and efficient humoral/cellular response. Reprinted from [278] , Copyright (2020), with permission from Elsevier. 3.2.3 Advanced delivery strategy for cross-protection Viruses are able to adapt to the changing environment, demanding a cross-protection immune response for the evolved multiple strains. Such a merit is particularly important when the virus mutates annually (e.g., Influenza virus) or raises the risk of coinfection with other pathogens (e.g., HPV). For example, antibodies produced from most influenza vaccines are strain-specific and display poor cross-reactivity with virus hemagglutinins of alternative subtypes [280] . In addition, cross-neutralizing titers, when noted, tend to be at least 100 times lower than type-specific titers and, therefore, cross-protection might be less durable than type-specific protection [281] . Recently, the strategy for cross-protection has mainly focused on incorporating a high conservative virus subdomain or eliciting the CD8 + T cell immunity or T-follicular helper (Tfh) cell immunity. i) Utilizing the conservative virus subdomain is promising for achieving the cross-protection efficacy. Since HR is highly conservative in the coronaviruses evolution and harbors cross-reactive SARS-CoV-2 T-cell epitopes, the HR subdomain within S2 region of S protein is noticed. HR-containing nanoparticle vaccines were demonstrated to produce neutralizing antibodies against SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoVOC43, and RATG13 [269] . In addition, they induced higher percentages of Tfh and B cells within germinal centers, as well as IgG1 and IgG2b memory B cells. As B cell maturation relies on the coordination with Tfh, it is possible that CD4 + T epitopes within HR facilitate Tfh to recognize antigen-specific B cells with high affinity, thereby facilitating the maturation of plasma cells to cope with various virus subtypes. Similar strategy is also meaningful for HPV prevention. As 70%–80% of cases of cervical cancer are caused by HPV-16 and HPV-18, these two types are potential candidates to achieve broader protection through cross-reactivity or expansion of the range of VLP types [282] . In this sense, the qualities of local in vivo concentration and potential effector cells (such as phagocytes or local memory B cells) also shape the cross-protection and longevity, which should be well tuned. ii) Innovative delivery systems for CD8 + T cell-based cross-protection are another promising strategy that is being exploited. Chahal et al. developed an adjuvant-free mono-dispersed dendrimer nanoparticle (MDNP, ~100 nm) vaccine platform wherein antigens were encoded by multiple mRNA replicons. After a single immunization, it elicited vital CD8 + T and antibody responses that fully protected against lethal exposures to several deadly pathogens, including Ebola virus, H1N1 influenza, and Toxoplasma gondii [283] . This work may allow for rapid-response vaccines with broad efficacy, which could reduce the number and frequency of vaccinations and healthcare workers' burden. In another notable example, Wang et al. encapsulated a STING agonist with pulmonary surfactant-biomimetic liposomes (PS-GAMP) in an attempt to accelerate the breadth of nonreplicating influenza vaccines towards universality. This PS-biomimetic nanoparticle has generated wide-spectrum cross-protection against distant H1N1 and heterosubtypic H3N2, H5N1, and H7N9 viruses as early as 2 days after a single intranasal immunization. The adjuvant had potent effects on both primary and booster immune responses, raising serum Ag-specific IgG1 10-fold, IgG more than 100-fold, and IgG2c ~ 1000-fold compared with VN04 H5N1 vaccine alone. The cross-protection lasted for at least 6 months, concurrent with durable lung CD8 + resident T RM cells in mice. These CD8 + T RM cells, rather than circulating memory CD8 + T cells, contributed to the observed long-term protection as their function was not compromised by T cell egress inhibitor. That work strengthened the notion that even transient vaccine-activated innate immunity was sufficient to augment both humoral and cellular immune responses. The intracellular delivery sites (lysosomal or non-lysosomal) and antigen processing (MHC I- or MHC II-mediated presentation) are crucial for cell-mediated response against most vaccine antigens, especially for viral infections and intracellular bacterial infections. The traditional process for exogenous antigens involves lysosomal degradation route and subsequent MHC II-medicated CD4 + T cell priming (humoral response). Some extracellular bacteria (e.g., S. pneumoniae ) are not capable of entering the cells, which is indispensable to the intracellular delivery manner. To prevent such bacterial infections, a higher titer of antibodies that can neutralize the pathogens is needed. In this case, the aim of vaccine delivery systems mainly include eliciting efficient antibody response through a Th2-biased immune response mechanism. In contrast, to cope with the intracellular bacteria (e.g., S. typhi ) or most viruses (e.g., SARS-CoV-2, influenza) that are lethal or variable, cellular response (CD8 + T priming) is particularly important for long-term or cross-protection. Therefore, the aforementioned cross-presentation delivery strategies (e.g., lysosomal escape and biomimetic membrane fusion) or delivery systems (e.g., pH-sensitive or positively charged synthetic particles/liposomes) should be designed to tune the intracellular fate (distribution and presentation) of exogenous antigens for CD8 + T priming. 4 Parasitic infectious diseases and advanced delivery systems Parasitic infections are highly prevalent worldwide, and many parasitic infectious diseases (such as malaria, schistosomiasis, and African trypanosomiasis) seriously threaten human health, especially in poor countries and regions. However, most of these diseases have usually been neglected. Among them, malaria, caused by Plasmodium (including P . falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale, and P. knowlesi ), is associated with high morbidity and mortality worldwide. The most lethal is malaria caused by P. falciparum , which is mainly distributed in sub-Saharan Africa. Vaccines are important in the prevention of malaria; according to the life cycle of Plasmodium , there are three stages suitable for developing a potential malaria vaccine [284] . The first one is the pre-erythrocyte stage, which may involve antibody response to prevent sporozoites from invading hepatocytes [285] , [286] . The second one is the blood-stage of the parasite. In this stage, red blood cell invasion could be controlled, resulting in fewer disease symptoms or asymptomatic infections [287] , [288] . However, the immunogenicity of some high-conservation protein antigens is very low [289] , [290] , [291] . The third stage is the stage of sexual parasite forms or gametocytes. Vaccines designed for this stage are intended to block the spread of malaria. Many malaria vaccine delivery systems have been developed ( Fig. 8 ), and some of them have been tested in clinical trials, including two kinds of delivery vehicles ( Table 5 ). For example, vaccine based on VLP is the most advanced malaria vaccine in the pre-erythrocyte stage to date. By fusing a recombinant protein of the P. falciparum circumsporozoite protein (CSP) [286] , containing known B- and T-cell epitopes [292] , to the hepatitis B surface antigen (HBsAg), the expressed fusion protein could self-assemble into VLPs (designated RTS) that display the antigens on their surface [293] . A phase III study of the candidate vaccine RTS,S/AS01, which was studied from 2009 to 2014 in children in seven sub-Saharan African countries, revealed that vaccine efficacy against clinical malaria over 12 months after 3 doses was 56% in the 5–17 month age group and 31% in infants at the age of 6–12 weeks [294] . Although the efficacy against clinical malaria decreased over time and vaccinated children suffered increased risk of clinical malaria compared with controls after 5 years [294] , [295] , malaria was prevented in young children who are usually at a high risk for severe malaria complications, and a booster dose could slow down the attenuation [296] , [297] . Although these candidate vaccines are often unable to induce higher antibody titers, there is great hope to prevent malaria in countries with limited resources, especially in children. In addition, some other delivery carriers, such as self-assembling polypeptide [298] , self-assembled nanofibers [299] , or some novel adjuvants like AddaVax (a squalene-based oil-in-water nano-emulsion) [300] , have also been developed, which may provide more choices for the development of a malaria vaccine. Fig. 8 Malaria parasite life cycle and delivery systems for vaccine development. The life cycle of malaria parasite contains three stages, including pre-erythrocyte stage, blood stage, and sexual stage. Many kinds of delivery systems have been explored for malaria vaccine design and have been developed to potential malaria vaccine candidates. Table 5 Current malaria vaccines with delivery systems in clinical trials. Vaccine candidate Clinical trial registration number Stage Delivery system Antigen(s) Species and strain of malaria parasite Adjuvants used Pre-erythrocytic projects RTS,S/AS01E NCT00866619 Phase III VLP Pf CSP (207–395)& HBsAg P. falciparum AS01E RTS,S-AS01 fractional dose regimes NCT02992119 Phase II VLP Pf CSP (207–395)& HBsAg P. falciparum AS01B /AS01E ChAd63/MVA ME-TRAP NCT01635647 (VAC050) Phase I/IIb ChAd63, MVA TRAP + ME epitopes (CS, LSA1, LSA3, STARP, EXP1, pb9) P. falciparum ChAd63/MVA ME-TRAP +Matrix M™ NCT01669512 (VAC048) Phase I ChAd63, MVA TRAP + ME epitopes (CS, LSA1, LSA3, STARP, EXP1, pb9) P. falciparum Matrix M™ CSVAC NCT01450280 Phase I ChAd63, MVA CS P. falciparum R21/Matrix-M1 NCT04704830 Phase III VLP CSP less- HBsA P. falciparum Matrix-M1 adjuv R21 (RTS,S-biosimilar) with ME-TRAP combined NCT02905019 Phase I/IIa ChAd63, MVA CSP less- HBsA + MeTRAPg P. falciparum Matrix-M1 Blood stage projects ChAd63 RH5 +/- MVA RH5 NCT02181088 Phase Ia ChAd63, MVA RH5 P. falciparum ChAd63/MVA PvDBP NCT01816113 Phase Ia ChAd63, MVA PvDBP_RII P. vivax Sexual stage projects Pfs25 VLP NCT02013687 Phase I/IIa VLP Pfs25 P. falciparum Alhydrogel ChAd63 Pfs25-IMX313/MVA Pfs25-IMX313 NCT02532049 Phase Ia ChAd63, MVA Pfs25 P. falciparum 5 Fungal infectious diseases and advanced delivery systems Currently, the incidence rate of fungal infections is increasing [301] . They often occur in individuals with weakened immune functions; some fungi can induce invasive fungal infections, with mortality rates of about 30%–40% [302] . Many kinds of fungal vaccines have been developed, but none were approved by FDA because patients with fungal disease generally have low immunity and are often unable to achieve effective response after immunization [303] . The Th1/Th17 profiles immunity can effectively prevent fungal infections [304] . Various delivery systems have been applied in antibacterial and viral vaccine studies, as described above. However, only a few vehicles have been used in antifungal vaccine design. For example, Chauhan et al. described an Escheriosomes-based delivery system to enhance the immune response to cytosolic antigens (cAg) of Candida albicans, an opportunistic human pathogen and the most common cause of fungal invasive infections [305] . When mice were immunized subcutaneously, a strong cellular immune response was induced, generating protective immunity (75% mice survived) against systemic C. albicans infection [306] . Furthermore, Carneiro et al. described another liposome, dioctadecildimethylammonium bromide: monoolein (DODAB:MO), consisting of DODAB and a stabilizer MO [307] . DODAB induced stronger cellular immune responses and has been used as a carrier in drug delivery studies [308] , [309] , [310] . By incorporating the cell wall surface proteins (CWSP) from C. albicans and subcutaneous immunization in mice, the DODAB:MO loaded with CWSP induced a strong specific Th1 immune response and protected 62.5% of mice from death of intravenous C. albicans infection [307] . De Bernardis et al. described a C. albicans vaccine (PEV7) by incorporating a truncated, recombinant aspartyl proteinase-2 of C. albicans into influenza virosomes, which were assembled in vitro from synthetic lipids and purified influenza virus envelope components. Following intravaginal route of immunization, this vaccine provided local, long-lasting mucosal immunity and protection against candida vaginitis [311] . Although there have been no further explorations of delivery systems against fungal infections, some promising vehicles, such as L. lactis particles and polymer micro/nanoparticles, could be tried because of their ability to induce a strong Th1/Th17 immune response. 6 Conclusions Epidemic diseases have influenced the world throughout human civilization and even dictated the course of human history. Among treatment and prevention strategies, vaccination has played an irreplaceable role in saving people's lives. Nevertheless, high infection rates, widespread transmission, or high fatal ratio of outbreaks raise huge challenges for vaccine design. In this review, we summarized the major devastating issues of various epidemic pathogens (bacteria, viruses, fungi, and parasites), the latest clinical vaccine candidates (e.g., COVID-19 vaccine licensure), and the recent developments in antigen delivery systems for preventing infectious diseases. We particularly emphasized the design of the delivery systems for robust/high protection, long-term protection, or/and cross-protection. The corresponding delivery systems involve synthetic micro/nanoparticles (e.g., polymer and lipid particles), biological particles (e.g., exosomes and viral vectors), and integrated devices (microneedle patch), with a great potential to break through the barriers of traditional vaccines and adjuvants. These delivery concepts are not only adapted to the antiviral vaccines but are also applicable for the vaccines against bacterial infections and other infectious diseases. Although there have been few studies on fungal and parasite vaccine delivery systems, some exciting results about vaccine delivery encourage further research on that matter. These delivery materials, mainly including inorganic, polymers, liposomes, and protein carriers, have their own advantages for different types of diseases. Generally, the best immune route is often the one that is similar to the pathogen's route in natural infection; hence, for intestinal and respiratory bacteria, the development of delivery vehicles suitable for mucosal routes is more attractive because they would stimulate both local and systemic immune responses. For example, for prevention of respiratory diseases by achieving effective respiratory tract mucosal immunity, materials with retention capacity and resistance to easy dilution and degradation are required. In this context, some advanced nanogels and chitosan have suitable characteristics endowing them with very good immune response effects. In contrast, to reach the intestinal mucosa, a vaccine needs to pass through the extreme stomach environment, so additional protection of the delivery vehicle is often required. Probiotic carriers have unique advantages in this respect and can colonize the intestines; in addition, the protective effect of probiotic-based vaccine delivery systems against digestive tract diseases seems to be better than that against respiratory infections, which may not only be related to the characteristics of antigens but also to the fact that probiotic carriers are more suitable for the intestinal mucosa. Furthermore, compared with other immunization methods, oral vaccines have a higher safety threshold. Therefore, OMVs (containing lipid A and other components) of some digestive tract bacteria can also be used as oral vaccines, and they have shown good results in animal models. In addition to the above-mentioned mucosal immunity, for some invasive infectious diseases, delivery vehicles such as biomimetic carriers, liposomes, and proteinaceous particles have great potential because they can stimulate humoral immune responses stronger than those achieved from non-mucosal immune routes, thereby providing complete protection from the lethal challenges. However, many promising delivery systems are rarely further validated in other bacterial species, which also is a feature of bacterial research. The reason of this phenomenon may be the wide variety of infectious disease pathogens and the relatively scattered research in the prophylactic vaccine field. In addition, it is also due to the differences in the cultivation requirements and evaluation methods of different bacteria and restrictions on acquisition and permission. According to the existing data, vaccines can stimulate effective immune protection soon after vaccination. However, only a few carriers (such as probiotics and polyanhydride particles) have been studied for long-term immune protection. Some marketed vaccines, such as acellular pertussis vaccines, face the problem of a reduction in the protective effect over years, so it is necessary to further explore whether different delivery systems could help to overcome this issue. 7 Challenges and future directions Recent vaccine delivery systems have helped to catalyze a series of vaccine candidates. However, there are still some challenges in the delivery system design for prophylactic vaccines. The first one involves the vaccine delivery system against multidrug resistant opportunistic pathogens that may seriously threaten special populations, such as older individuals, immunosuppressed persons, or patients before surgery. Therefore, an optimal delivery system should meet some important additional requirements (such as higher safety, rapid onset with only one immunization needed, and adequate protection), and special animal models (e.g., older animals) should be used for evaluation. The second one is carrier-induced epitope suppression (CIES) by proteinaceous delivery carriers, such as self-assembled proteinaceous nanoparticles, VLP, and viral vectors. CIES has been a great concern because the same carrier may result in the dampening of the effect of subsequent vaccination. Although it has been shown that CIES could be overcome by high coupling densities, repeated injections, and/or higher doses, this problem has not yet been fully solved. The third one is the development of delivery systems that endow vaccines with therapeutic efficacy for chronic infections, such as hepatitis B, tuberculosis, and brucellosis. Therefore, a new balance between the Th1 and Th2 response needs to be established. Finally, the balance between the rational design for specific protection demands and the safety/feasibility requirements for clinical translation should not be overlooked. In response to the demand for targeted delivery, immune regulation, or specific population (e.g., children or older persons), complex design strategies (e.g., targeting peptides, adjuvants) are usually involved. When the delivery system includes multiple components, the difficulty of the quality control/process optimization and even the biosafety consideration is augmented, which decreases the chances for further application. In particular, the outbreak of epidemic disease unprecedentedly narrows the development period and requires delivery platforms that cater to fatal pathogens in a timely manner. In the future, the resolution of these challenges is indispensable to the renewal of biomaterials, the intelligent design of delivery systems, the exploration of immunological mechanisms, and the assistance of innovative technology. First, the renewal of biomaterials with intelligent design, especially for the pathogen-mimicking systems (e.g., biologically derived exosomes or synthetic chassis), will help to prevent vaccine resistance or endow vaccines with the expected immunological response. An optimum delivery system (e.g., temperature-sensitive hydrogels or hollow porous MPs) can be applied to extend the administration route (e.g., nasal or inhalation vaccination) and functions at the initial site of pathogen invasion. In particular, by mimicking the physiochemical properties (e.g., mobility and deformability) or intracellular behavior (e.g., lysosomal escape pathway) of microorganisms, robust immune response or high CTL cross-protection is realized. Second, to maximize protection and avoid ineffective responses, it is important to design individualized vaccine delivery systems depending on the pathogen's characteristics (invasive or noninvasive; intracellular or extracellular) and the underlying immunological mechanisms. The delivery system can be designed to activate local innate responses that translate into the mucosal immunity (e.g., generation of secretory IgA or high-avidity CTL at mucosal sites). In addition, efficient delivery systems can be developed upon the novel theoretical mechanisms to address specific demands (e.g., a decrease of the pre-existing immunity of adenovirus vaccination, or eliciting the protection rate among older individuals). Third, a combinatorial library of antigens, adjuvants, or delivery materials (e.g., lipids) is available, and the top candidate with specific merits can be screened promptly with the assistance of novel technology (e.g., nanotechnology and artificial intelligence). For example, the distribution route (e.g., cell membrane or acidic lysosome) and ultimate fate (e.g., enzyme degradation or ligand–receptor-based activation) of each component can be calculated and predicted. In this context, a delivery system can be designed for maximum immune efficiency in a coupled spatio-temporal manner. In addition, with the assistance of computers and artificial intelligence, more modules (even including special functions) will likely be designed to assemble a potentially enormous diversity of nanovaccine structures, which is expected to solve the problem of CIES of protein carrier vaccines. Epidemic diseases have influenced the world throughout human civilization and even dictated the course of human history. Vaccine delivery strategies have been deeply studied in many fields, and their importance in the prevention of infectious diseases has become increasingly prominent. Although most of the advanced delivery systems are still in the laboratory research stage, several products have entered clinical trials or helped to catalyze a series of vaccine candidates, which should lead to advanced prophylactic vaccination with balanced safety and efficacy in the future. Due to the unparalleled need for vaccines globally, this field will continue to blossom in the prevention of infectious diseases. Declaration of Competing Interest The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6803313/

Public Microbial Resource Centers: Key Hubs for Findable, Accessible, Interoperable, and Reusable (FAIR) Microorganisms and Genetic Materials

In the context of open science, the availability of research materials is essential for knowledge accumulation and to maximize the impact of scientific research. In microbiology, microbial domain biological resource centers (mBRCs) have long-standing experience in preserving and distributing authenticated microbial strains and genetic materials (e.g., recombinant plasmids and DNA libraries) to support new discoveries and follow-on studies.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3294549/

Wild Chimpanzees Infected with 5 Plasmodium Species

Data are missing on the diversity of Plasmodium spp. infecting apes that live in their natural habitat, with limited possibility of human-mosquito-ape exchange. We surveyed Plasmodium spp. diversity in wild chimpanzees living in an undisturbed tropical rainforest habitat and found 5 species: P. malariae , P. vivax, P. ovale , P. reichenowi , and P. gaboni. The Study To investigate the prevalence of different Plasmodium spp. in wild great apes living in their natural habitat (tropical rainforests), we analyzed tissue samples from 16 wild West African chimpanzees that died primarily of anthrax or respiratory disease in Taï National Park, Côte d'Ivoire. A generic real-time PCR that detects all known Plasmodium spp. was used to test all samples for the parasite. Sequence analysis of the CytB gene and small subunit rRNA genes was conducted for real-time PCR–positive samples to determine the strain present; 1,140 bp of the CytB gene and 765 bp of the 18S gene of the Plasmodium genome were amplified by classic PCR. Resulting products were sequenced either directly or after cloning for rRNA gene and when initial sequence information showed the possible presence of 2 different species ( Table ). Table Tissue and fecal samples from wild chimpanzees examined for Plasmodium species, Tai National Park, Cote d'Ivoire, and Budongo Forest, Uganda* Type of sample and name or species of chimpanzee Genetic sequence copies/mg tissue Plasmodium species detected GenBank accession nos. Necropsy Loukoum 530 P. gaboni GU815507 ( CytB ), GU815523 ( 18S ) Noah 50 P. gaboni GU815508 ( CytB ), GU815524 ( 18S ) Orest 2.2 x 10 P. gaboni GU815509 ( CytB ), GU815525 ( 18S ) Candy 65 P. reichenowi GU815510 ( CytB ), GU815526 ( 18S ) Atra 100 P. reichenowi GU815511 ( CytB ) Louise 160 P. reichenowi GU815512 ( CytB ), GU815527 ( 18S ) EastChip 06 105 P. reichenowi , P. gaboni GU815512–13 ( CytB ) Olduvai 130 P. reichenowi , P. malariae GU815514–15 ( CytB ), GU815528–29 ( 18S ) Leo 850 P. malariae GU815516 ( CytB ), GU815530 ( 18S ) Kady 105 P. ovale GU815517 ( CytB ), GU815531 ( 18S ) Sagu 760 P. vivax GU815518 ( CytB ), GU815532 ( 18S ) Dorry Neg Virunga Neg Ophelia Neg Akruba Neg Akwaba Neg Fecal samples, n = 30 Positive qPCR results P. t. verus 21 (2) P. gaboni GU815519 ( CytB ) P. t. schweinfuthii 12 (3) P. reichenowi P. gaboni GU815520–22 ( CytB ) *All chimpanzees were Pan troglodytes verus from Tai except P. t. schweinfuthii chimpanzees, which were from Budongo Forest. Parentheses indicate the number of samples for which sequences were obtained and used for phylogenetic tree analyses. Neg, negative; qPCR, quantitative PCR. Phylogenetic analyses of sequences obtained confirmed the presence of 5 species: P. reichenowi and P. gaboni , which had been found previously ( 2 , 3 ); but also P. vivax , P. ovale, and P. malariae –like strains ( Figure 1 , Figure 2 ). The most prevalent species was P. reichenowi (6/16), which had representatives in subclusters P. gaboni and P. reichenowi . The other species were rare, seen only 1 ( P. ovale and P. vivax ) or 2 ( P. malariae ) times. Two chimpanzees showed co-infections with multiple Plasmodium spp. ( Figure 1 , Figure 2 ), 1 infected with P. reichenowi and a P. malariae –like strain and the other with P. reichenowi and P. gaboni . Figure 1 Maximum-likelihood trees of Plasmodium spp. obtained from the analysis of a 1,087-bp CytB alignment. Blue indicates sequences determined from chimpanzee hosts; green, bonobos; gray, gorillas; and red, humans. Black indicates sequences obtained from nonprimate hosts. Plasmodium spp. sequences derived from chimpanzees in this study are marked with an asterisk. Bootstrap values are shown when > 70. The tree was rooted using avian plasmodium sequences. Accession numbers of all sequences used are shown in the Table. Scale bar indicates nucleotide substitutions per site. Figure 2 Maximum likelihood tree of Plasmodium spp. obtained from the analysis of a 621 bp–long 18S alignment. Blue indicates sequences determined from chimpanzee hosts; green, bonobos; gray, gorillas; and red, humans. Black indicates sequences obtained from nonprimate hosts. Plasmodium spp. sequences derived from chimpanzees in this study are marked with an asterisk. Bootstrap values are shown when > 70. The tree was rooted using avian plasmodium sequences. Accession numbers of all sequences used are shown in the Table. Scale bar indicates nucleotide substitutions per site. Is the observed high prevalence of Plasmodium s pp. typical for wild chimpanzees or related to reduced immune function associated with the severe infection that was the primary cause of death in each case? To investigate this question, we tested DNA extracted from fecal samples of apparently healthy chimpanzees collected over the past 8 years (n = 30) ( 11 ) of the same study population by using the generic real-time PCR followed by amplification of the CytB gene. Of these samples, 21 (70%) were positive for Plasmodium spp. by real-time PCR. Because of low copy numbers in feces, phylogentic analyses were limited to 2 samples in which P. reichenowi of the P. gaboni subcluster was confirmed. To determine if the observed high prevalence of plasmodia was a site- or chimpanzee subspecies–specific phenomenon, we tested 30 randomly selected fecal samples of individually known apparently healthy wild Eastern chimpanzees from the Budongo Forest in Uganda. Overall prevalence of Plasmodium spp. was lower than in West African chimpanzees but still relatively high (40%); P. reichenowi and P. gaboni were identified in 3 samples. Our results demonstrate that the prevalence of different Plasmodium spp. in wild chimpanzees is similar to that of untreated human populations in sub-Saharan Africa ( www.who.int/malaria ). Throughout sub-Saharan Africa, P. falciparum is more predominant in humans than are other Plasmodium spp. Considering the lack of clinical signs of malaria in chimpanzees from which fecal samples were collected and those that had died of respiratory disease or anthrax, Plasmodium spp. infections appear to be asymptomatic or at least nonlethal in wild chimpanzees. However, signs of illness are rarely observed in wild primates because infected animals often mask weakness to maintain social position and avoid attack by predators ( 12 ). Recently developed technologies for the noninvasive determination of temperature in wild chimpanzees may enable more effective examination of the relationship between the primary clinical feature of malaria (i.e., cyclical fevers) and Plasmodium spp. infection ( 13 ). P. ovale was previously described from captive chimpanzees and P. malariae from captive chimpanzees and captive bonobos have been described ( 5 – 8 ). Our study results demonstrate that P. malariae and P. ovale occur in wild chimpanzees that inhabit pristine contiguous forest with extremely limited exposure to humans, suggesting the natural existence of these parasites in wild great apes. Because of a Duffy-negative condition in 95%–99% of the human population in western and central continental Africa, transmission of P. vivax does not seem to occur. However, P. vivax infections are common in travelers returning from these areas ( 11 ). Even though we cannot totally exclude the possibility of introduction of P. vivax in the chimpanzee population through humans, our discovery of P. vivax in wild chimpanzees living exclusively within their natural habitat suggests that wild African apes may be a natural reservoir. Our study shows the existence of P. reichenowi and related strains in wild chimpanzees as described for chimpanzees and gorilla by others ( 2 – 4 , 6 ). Infections with strains of the P. reichenowi group (sometimes referred to as the species P. gaboni , P. billbrayi, and P. billcollinsi ) appear to occur widely in wild and captive great apes in Africa with some variation between chimpanzee subspecies from biogeographically distinct sites. The wild chimpanzees examined demonstrated no infections with classic human P. falciparum . This lack of infection is likely caused by low human presence in their habitat and, consequently, few or no infected vectors, low sample size, or a missing receptor in chimpanzees ( 14 ). More investigations are needed because recently P. falciparum infections have been described for 2 captive chimpanzees ( 6 ). The situation is clearer for captive and wild lowland gorillas ( Gorilla gorilla ) for which infections and receptors have recently been described ( 4 ). Infections have also been documented for captive bonobos ( 5 ). Conclusions Previous examination of the role of our closest phylogenetic relatives, the great apes, in the evolution and persistence of human plasmodia has been limited by a lack of data from wild ape populations where opportunities for human-mosquito-ape malaria exchange are minimal. Interpretation of patterns of malaria infection in captive ape populations, such as sanctuaries and zoos, must consider the ample opportunities for human-to-ape transmission of such parasites, negating the opportunity to investigate the evolutionary origins and public health–related risks of these parasites. Conversely, our examination of these parasites in wild chimpanzees with no contact to the periphery of the rainforest habitat ( Technical Appendix Figure ) demonstrates that these apes are most likely naturally infected with P. ovale , P. vivax, and P. malariae , 3 types of plasmodia rarely observed in humans of the region. Whether wild great apes are the origin or reservoirs of these Plasmodium types requires further investigation. These results may have implications for global efforts to eradicate malaria in humans, including vaccine development based on animal variants of human parasites. Supplementary Material Technical Appendix Methods used and Sequence Info Used from the Public Database.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8564391/

Daptomycin Resistance Occurs Predominantly in vanA -Type Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium in Australasia and Is Associated With Heterogeneous and Novel Mutations

Healthcare associated infections caused by vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VREfm) have a major impact on health outcomes. VREfm is difficult to treat because of intrinsic and acquired resistance to many clinically used antimicrobials, with daptomycin being one of the few last line therapeutic options for treating multidrug-resistant VREfm. The emergence of daptomycin-resistant VREfm is therefore of serious clinical concern. Despite this, the impact that daptomycin-resistant VREfm have on patient health outcomes is not clearly defined and knowledge on the mechanisms and genetic signatures linked with daptomycin resistance in VREfm remains incomplete. To address these knowledge gaps, phenotypic daptomycin susceptibility testing was undertaken on 324 E. faecium isolates from Australia and New Zealand. Approximately 15% of study isolates were phenotypically resistant to daptomycin. Whole genome sequencing revealed a strong association between vanA -VREfm and daptomycin resistance, with 95% of daptomycin-resistant study isolates harbouring vanA . Genomic analyses showed that daptomycin-resistant VREfm isolates were polyclonal and carried several previously characterised mutations in the liaR and liaS genes as well as several novel mutations within the rpoB, rpoC , and dltC genes. Overall, 70% of daptomycin-resistant study isolates were found to carry mutations within the liaR, rpoB, rpoC , or dltC genes. Finally, in a mouse model of VREfm bacteraemia, infection with the locally dominant daptomycin-resistant clone led to reduced daptomycin treatment efficacy in comparison to daptomycin-susceptible E. faecium . These findings have important implications for ongoing VREfm surveillance activities and the treatment of VREfm infections. Introduction Enterococcus faecium , in particular vancomycin-resistant E. faecium (VREfm) are important nosocomial pathogens. VREfm can be very difficult to treat, are easily transmitted within the hospital environment and have a high propensity for horizontal gene transfer and recombination, which has contributed to the emergence of multidrug-resistant (MDR) isolates ( Carter et al., 2016 ). VREfm is a World Health Organization (WHO) priority pathogen ( World Health Organization [WHO], 2017 ). Daptomycin is a lipopeptide antibiotic with potent bactericidal activity against E. faecium and is considered a last line treatment for VREfm ( Beriashvili et al., 2018 ), along with linezolid and tigecycline ( Gorrie et al., 2019 ). Recent reports documenting the emergence of daptomycin-resistant E. faecium are therefore of serious concern ( Kamboj et al., 2011 ; Munita et al., 2012 ; Douglas et al., 2019 ). Despite the importance of daptomycin as a therapeutic option for MDR isolates, the mechanisms associated with resistance in E. faecium are not completely defined, and the genetic signatures and clinical consequences associated with daptomycin-resistant E. faecium are not well understood. The best studied mechanism of daptomycin resistance in VREfm involves the LiaFSR three component regulatory system, with single nucleotide polymorphisms (SNPs) within the liaFSR genes identified in many daptomycin-resistant clinical isolates ( Munita et al., 2012 ). However, several studies have noted that liaFSR mutations do not always result in daptomycin resistance and many daptomycin-resistant isolates contain wild-type liaFSR genes ( Werth et al., 2014 ; Lellek et al., 2015 ), indicating that other molecular pathways might also be important. Here we report a strong association between vanA -type VREfm and daptomycin resistance, and the identification of several novel mutations potentially involved in the development of daptomycin resistance in E. faecium . Finally, in a murine model of VREfm bacteraemia, we show that daptomycin treatment efficacy is compromised in animals infected with daptomycin-resistant VREfm in comparison to daptomycin-susceptible VREfm. Materials and Methods Bacterial Strains and Growth Conditions A total of 324 clinical E. faecium isolates ( Supplementary Table 1 ) from the Microbiological Diagnostic Unit Public Health Laboratory (MDU PHL) culture collection were randomly selected from a list of anonymised isolate numbers with only the country of origin known. The isolates were part of a larger E. faecium collection of approximately 2000 isolates amassed by MDU PHL as part of ongoing Victorian public health surveillance activities and research activities that include isolates sent from Victoria, New Zealand, and New South Wales diagnostic laboratories. Isolates within the MDU PHL collection are both clinical and screening isolates. Individual patient information relating to the study isolates was not accessible. All study isolates were collected between 2007 and 2018, with 174 isolates originating in Australia and 150 isolates being from New Zealand. Study isolates were deemed to be representative of the broader MDU PHL VREfm collection in terms of collection year, van-status and ST types. Unless otherwise stated, isolates were maintained on horse blood agar and grown in brain heart infusion (BHI) broth at 37°C. Daptomycin (Cubicin) was purchased from Merck, Sharpe, and Dohme. Daptomycin Broth Microdilution Assay Daptomycin susceptibility testing was performed using broth microdilution minimum inhibitory concentration assays according to CLSI methods [ Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2015 ]. In a 96-well plate, a two-fold dilution series (from 32 to 0.5 mg/L) of daptomycin was made in 100 μL volumes of cation adjusted Mueller-Hinton w/TES broth (CAMHBT) (Thermo Fisher) additionally supplemented with 50 mg/L Ca 2+ . An inoculum of 100 μL overnight E. faecium broth culture adjusted to 1 × 10 6 cfu/mL in CAMHBT supplemented with 50 mg/L Ca 2+ was then added to each well. After 24 h incubation, the MIC was defined as the lowest antimicrobial concentration that inhibited visible growth. All assays were performed in biological triplicate, with the median MIC value reported. In accordance with recent guidelines ( Humphries, 2019 ) isolates with a daptomycin MIC of ≥8 mg/L were considered to be daptomycin-resistant. If there was a major MIC discrepancy within triplicate assays for an isolate whereby one or two repeats gave a susceptible MIC (≤4 mg/L) and the remaining repeat gave a resistant MIC (≥8 mg/L) (or vice versa), then an additional four biological replicates were performed with the median value of 7 independent repeats then reported. Note that a major discrepancy of this sort was only observed with five isolates, all of which were subsequently reported as susceptible after additional replicates were performed. Whole Genome Sequencing Bacterial genomic DNA was extracted using a JANUS automated workstation (PerkinElmer) and Chemagic magnetic bead technology (PerkinElmer). Genomic DNA libraries were prepared using the Nextera XT kit (Illumina Inc.). Whole genome sequencing (WGS) was performed on the Illumina NextSeq platform using 2 × 150 bp paired end chemistry as before ( Carter et al., 2016 ). The genomic dataset generated for this study can be found in the ENA repository associated with bioprojects PRJNA433676 , PRJNA565795 , PRJEB23767 , PRJNA565795 , and PRJEB47276 . Bioinformatic Analyses The genomes of daptomycin-resistant study isolates ( Supplementary Table 1 ) underwent de novo assembly using Shovill (v.1.0.1), 1 and genome annotation was achieved using Prokka (v. 1.13.3) ( Seemann, 2014 ). Short read sequence data from daptomycin-resistant isolates were mapped against the reference DO genome (TX16) ( Diaz et al., 2014 ) and SNPs identified with Snippy (v. 4.6.0). 2 The resulting alignment comprising 16,577 core SNP sites (core alignment length: 1,857,904), was used to infer the phylogeny using the maximum likelihood method with the general time reversible model using constant sites [IQtree (v.2.1.2) ( Nguyen et al., 2015 )]. Recombination masking [gubbins (v.2.4.1) ( Croucher et al., 2014 )] was performed however the resulting alignment was only made up of 983 core SNP sites and so was deemed too small to be used to build the phylogeny. A core SNP alignment, comprising 22,081 SNP sites (core alignment length: 1,373,512), was also generated for Australian study isolates and was used to build a phylogeny as above. Two outlier isolates (DMG1901764 and DMG1901754) were removed from the core alignment due to their abnormally large distance from the reference. This alignment was not masked for recombination. Phylogenetic trees were visualised using ggtree ( Yu et al., 2017 ) in R studio (v4.0.2). 3 In silico multi-locus sequence types (MLST) were determined using the mlst tool (v. 2.10) 4 and the E. faecium pubMLST database). 5 The vanA and vanB vancomycin resistance genes, were identified in silico using ABRicate (v. 1.0.1) 6 and the Resfinder database ( Zankari et al., 2012 ) using the default settings. Murine Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Bacteraemia Model Animal experimentation was carried out with approval from the University of Melbourne, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Dental Science, Medicine, Microbiology & Immunology, and Surgery Animal Ethics Committee. A total of 6–8 weeks old female C57BL/6 mice were infected with either the daptomycin-susceptible strain DMG1800332, or daptomycin-resistant clinical isolates DMG1901766, DMG1700661 ( Carter et al., 2018 ), or DMG1700787. Mice were infected via intraperitoneal injection with 10 9 CFU resuspended in sterile rat faecal extract (SRFE) ( Singh et al., 1998 ). Controls were mock infected with SRFE only. Each strain was used to infect two groups of animals. Two hours post-infection, one group of animals was administered daptomycin (50 mg/kg) by subcutaneous injection [this results in similar exposure (AUC 0 – 24 ) to that observed in humans receiving 8 mg/kg of daptomycin] ( Heine et al., 2010 ) and the other group received saline (vehicle) by subcutaneous injection. At 24 h post infection, mice were killed by CO 2 asphyxiation and blood collected by cardiac puncture into EDTA tubes before being washed and serially diluted in PBS. Dilutions were then plated onto ChromeID VRE agar (BioMerieux) for enumeration of VREfm in the blood. Statistical significance was calculated using a non-parametric Mann–Whitney U-test using GraphPad Prism 9.0.1. Bacterial Strains and Growth Conditions A total of 324 clinical E. faecium isolates ( Supplementary Table 1 ) from the Microbiological Diagnostic Unit Public Health Laboratory (MDU PHL) culture collection were randomly selected from a list of anonymised isolate numbers with only the country of origin known. The isolates were part of a larger E. faecium collection of approximately 2000 isolates amassed by MDU PHL as part of ongoing Victorian public health surveillance activities and research activities that include isolates sent from Victoria, New Zealand, and New South Wales diagnostic laboratories. Isolates within the MDU PHL collection are both clinical and screening isolates. Individual patient information relating to the study isolates was not accessible. All study isolates were collected between 2007 and 2018, with 174 isolates originating in Australia and 150 isolates being from New Zealand. Study isolates were deemed to be representative of the broader MDU PHL VREfm collection in terms of collection year, van-status and ST types. Unless otherwise stated, isolates were maintained on horse blood agar and grown in brain heart infusion (BHI) broth at 37°C. Daptomycin (Cubicin) was purchased from Merck, Sharpe, and Dohme. Daptomycin Broth Microdilution Assay Daptomycin susceptibility testing was performed using broth microdilution minimum inhibitory concentration assays according to CLSI methods [ Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2015 ]. In a 96-well plate, a two-fold dilution series (from 32 to 0.5 mg/L) of daptomycin was made in 100 μL volumes of cation adjusted Mueller-Hinton w/TES broth (CAMHBT) (Thermo Fisher) additionally supplemented with 50 mg/L Ca 2+ . An inoculum of 100 μL overnight E. faecium broth culture adjusted to 1 × 10 6 cfu/mL in CAMHBT supplemented with 50 mg/L Ca 2+ was then added to each well. After 24 h incubation, the MIC was defined as the lowest antimicrobial concentration that inhibited visible growth. All assays were performed in biological triplicate, with the median MIC value reported. In accordance with recent guidelines ( Humphries, 2019 ) isolates with a daptomycin MIC of ≥8 mg/L were considered to be daptomycin-resistant. If there was a major MIC discrepancy within triplicate assays for an isolate whereby one or two repeats gave a susceptible MIC (≤4 mg/L) and the remaining repeat gave a resistant MIC (≥8 mg/L) (or vice versa), then an additional four biological replicates were performed with the median value of 7 independent repeats then reported. Note that a major discrepancy of this sort was only observed with five isolates, all of which were subsequently reported as susceptible after additional replicates were performed. Whole Genome Sequencing Bacterial genomic DNA was extracted using a JANUS automated workstation (PerkinElmer) and Chemagic magnetic bead technology (PerkinElmer). Genomic DNA libraries were prepared using the Nextera XT kit (Illumina Inc.). Whole genome sequencing (WGS) was performed on the Illumina NextSeq platform using 2 × 150 bp paired end chemistry as before ( Carter et al., 2016 ). The genomic dataset generated for this study can be found in the ENA repository associated with bioprojects PRJNA433676 , PRJNA565795 , PRJEB23767 , PRJNA565795 , and PRJEB47276 . Bioinformatic Analyses The genomes of daptomycin-resistant study isolates ( Supplementary Table 1 ) underwent de novo assembly using Shovill (v.1.0.1), 1 and genome annotation was achieved using Prokka (v. 1.13.3) ( Seemann, 2014 ). Short read sequence data from daptomycin-resistant isolates were mapped against the reference DO genome (TX16) ( Diaz et al., 2014 ) and SNPs identified with Snippy (v. 4.6.0). 2 The resulting alignment comprising 16,577 core SNP sites (core alignment length: 1,857,904), was used to infer the phylogeny using the maximum likelihood method with the general time reversible model using constant sites [IQtree (v.2.1.2) ( Nguyen et al., 2015 )]. Recombination masking [gubbins (v.2.4.1) ( Croucher et al., 2014 )] was performed however the resulting alignment was only made up of 983 core SNP sites and so was deemed too small to be used to build the phylogeny. A core SNP alignment, comprising 22,081 SNP sites (core alignment length: 1,373,512), was also generated for Australian study isolates and was used to build a phylogeny as above. Two outlier isolates (DMG1901764 and DMG1901754) were removed from the core alignment due to their abnormally large distance from the reference. This alignment was not masked for recombination. Phylogenetic trees were visualised using ggtree ( Yu et al., 2017 ) in R studio (v4.0.2). 3 In silico multi-locus sequence types (MLST) were determined using the mlst tool (v. 2.10) 4 and the E. faecium pubMLST database). 5 The vanA and vanB vancomycin resistance genes, were identified in silico using ABRicate (v. 1.0.1) 6 and the Resfinder database ( Zankari et al., 2012 ) using the default settings. Murine Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Bacteraemia Model Animal experimentation was carried out with approval from the University of Melbourne, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Dental Science, Medicine, Microbiology & Immunology, and Surgery Animal Ethics Committee. A total of 6–8 weeks old female C57BL/6 mice were infected with either the daptomycin-susceptible strain DMG1800332, or daptomycin-resistant clinical isolates DMG1901766, DMG1700661 ( Carter et al., 2018 ), or DMG1700787. Mice were infected via intraperitoneal injection with 10 9 CFU resuspended in sterile rat faecal extract (SRFE) ( Singh et al., 1998 ). Controls were mock infected with SRFE only. Each strain was used to infect two groups of animals. Two hours post-infection, one group of animals was administered daptomycin (50 mg/kg) by subcutaneous injection [this results in similar exposure (AUC 0 – 24 ) to that observed in humans receiving 8 mg/kg of daptomycin] ( Heine et al., 2010 ) and the other group received saline (vehicle) by subcutaneous injection. At 24 h post infection, mice were killed by CO 2 asphyxiation and blood collected by cardiac puncture into EDTA tubes before being washed and serially diluted in PBS. Dilutions were then plated onto ChromeID VRE agar (BioMerieux) for enumeration of VREfm in the blood. Statistical significance was calculated using a non-parametric Mann–Whitney U-test using GraphPad Prism 9.0.1. Results Daptomycin Resistance Is Common in Clinical Australian Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Isolates A random selection of 324 isolates was made from a larger unbiased collection of Australian and New Zealand isolates stored at the MDU PHL. These isolates comprised vanB -VREfm ( n = 157), vanA- VREfm ( n = 129), and vancomycin-susceptible E. faecium (VSEfm) ( n = 38). All isolates underwent phenotypic daptomycin-susceptibility testing ( Figures 1A–D ). FIGURE 1 Daptomycin susceptibility of E. faecium study isolates. Daptomycin MIC distribution of (A) all study isolates ( n = 324); (B) VSEfm isolates ( n = 38); (C) vanA -VREfm isolates ( n = 129); and (D) vanB -VREfm isolates ( n = 157). Australian isolates are represented by dark grey and dark red blocks and New Zealand isolates are represented by light grey and light red blocks. Daptomycin-susceptible MICs are shown in grey (MIC < 8 mg/L) and daptomycin-resistant MICs are highlighted in red (MIC ≥ 8 mg/L). The number of isolates with each MIC value shown on the x -axis is displayed above the respective bars. Overall, the isolates displayed a unimodal wild-type MIC distribution ( Figure 1A ) with a mode MIC of 4 mg/L. When analysed by country, a unimodal MIC distribution was evident for both Australian and New Zealand isolates, with a mode MIC of 2 mg/L for Australian isolates and 4 mg/L for New Zealand isolates ( Figure 1A ). The MIC 50 and MIC 90 for Australian isolates was 4 and 8 mg/L, respectively, while New Zealand isolates had an MIC 50 and MIC 90 of 4 mg/L. In total 49 daptomycin-resistant E. faecium isolates were identified according to current guidelines ( Humphries, 2019 ) (MIC of ≥8 mg/L). This represents a resistance rate of 15.1% for the isolates tested. Although similar numbers of Australian and New Zealand E. faecium were tested (175 isolates from Australia and 150 isolates from New Zealand), the majority of daptomycin-resistant isolates were from Australia, with 39 isolates being from Australia and just 10 isolates from New Zealand. Daptomycin Resistance Is Strongly Associated With vanA -Type Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Strikingly, when analysed by E. faecium strain type (i.e. vanA -VREfm, vanB -VREfm, or VSEfm) a strong association between vanA -VREfm and daptomycin resistance was observed ( Figure 1 ), with 96% of daptomycin-resistant isolates being of the vanA -VREfm type and 4% being VSEfm. No daptomycin-resistant vanB -VREfm study isolates were identified. Statistical analysis showed that vanA -VREfm were significantly more daptomycin-resistant than vanB -VREfm ( p < 0.0001; Fisher's exact test) and VSEfm ( p < 0.0001; Fisher's exact test), with MIC 50 values of 4, 2, and 4 mg/L for vanA -VREfm, vanB -VREfm, and VSEfm, respectively, and MIC 90 values of 8, 4, and 4 mg/L, respectively. Country of origin did not influence the correlation between daptomycin resistance and vanA -VREfm ( Figure 1 ). Daptomycin Resistance Occurs in Phylogenetically Diverse Enterococcus faecium Clinical Isolates Given the strong association of vanA -VREfm and daptomycin-resistance it was important to determine whether the isolates were clonal. MLST analysis showed that daptomycin-resistance occurred in eight different sequence types (STs); ST203, ST80, ST1421, ST17, ST761, ST78, ST230, and ST22 ( Figure 2 ). Our analyses showed that each ST formed a monophyletic clade, with the exception of ST80 and ST17, which were paraphyletic. ST203 was the predominant type, comprising 47% ( n = 23/49) of daptomycin-resistant isolates. ST80 also accounted for a large proportion (29%, n = 14/49) of resistant isolates. The remaining daptomycin-resistant isolates consisted of four ST1421 isolates (8%), three ST17 isolates (6%), two ST761 isolates (4%), and a single isolate (2%) for each of ST78, ST230, and ST22. FIGURE 2 Maximum likelihood core-SNP phylogeny of 49 Australian and New Zealand daptomycin-resistant E. faecium isolates. Coloured blocks show the multi-locus sequence type (MLST), country of origin (country), year of isolation (year), van status (i.e., vanA , vanB , and VSE) and daptomycin MIC (8 and 16 mg/L) for each isolate within the phylogeny. Grey blocks show the presence of the RNAP β-subunit S494F mutation (RpoB S494F), the RNAP β′-subunit T641K mutation (RpoC T641K), the LiaR S19F mutation, the DltC S63C mutation, the LiaR W73C and LiaS T120A co-occurring mutations or mutations within ClsA previously associated with daptomycin resistance in VREfm (ClsA various). The vanA -VREfm strain D0 (TX16) ( Diaz et al., 2014 ) was used as the reference. To understand the phylogenetic relatedness of daptomycin-resistant study isolates, a maximum likelihood phylogeny was constructed ( Figure 2 ). Substantial genetic diversity was evident, with a mean core genome alignment pairwise SNP distance of 4,161 SNPs (range 0–9,231 SNPs). The population structure was polyphyletic, with multiple distinct clades evident, generally summarised by previously assigned multi-locus ST. Despite this overall level of diversity among resistant isolates, isolates from the predominant ST203 group displayed more restricted diversity, and had a mean pairwise SNP distance of 94 core genome SNPs (range 0–872 SNPs). There was evidence of clonal spread within the Australian ST203 clade, with 21 out of 23 isolates differing by no more than 39 core genome SNPs. In contrast, isolates within the second largest daptomycin-resistant group (ST80) were more genetically diverse, with a mean pairwise SNP distance of 3,600 SNPs (range 0–7178 SNPs). Notably, daptomycin-resistant ST80 isolates clustered throughout the tree within four distinct sub-clades, some containing both Australian and New Zealand isolates. These data collectively suggest that daptomycin resistance in Australian and New Zealand VREfm clinical isolates has arisen independently and is not the consequence of a recent clonal outbreak. Novel Mutations Are Associated With Daptomycin Resistance in Australian and New Zealand Clinical Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Isolates To understand the genetic changes associated with daptomycin resistance in the Australian and New Zealand study isolates, whole genome sequences from each resistant strain were analysed to identify any known E. faecium daptomycin resistance mutations. This analysis led to the identification of three isolates (6%) carrying the well-characterised W73C and T120A mutations in the LiaR and LiaS proteins respectively, and 22 isolates (44%) that harbour the less common S19F mutation in LiaR ( Sorlózano et al., 2015 ). The isolates carrying the T120A and W73C LiaSR mutations were all ST80, with 2 of the isolates being from New Zealand and 1 from Australia ( Figure 2 ). All 22 isolates carrying the S19F mutation in LiaR clustered within the ST203 clade and were of Australian origin ( Figure 2 ). No other mutations previously linked with daptomycin resistance in E. faecium (shown in Supplementary Table 2 ) were identified, including within the clsA gene ( Humphries et al., 2012 ; Tran et al., 2013 ; Lellek et al., 2015 ; Wang et al., 2018 ; Prater et al., 2019 ). Three novel SNPs (relative to the reference strain E. faecium D0) in genes associated with daptomycin resistance in Staphylococcus aureus were however identified. These mutations were S63C in DltC, which plays a role in D -alanylation of teichoic acid, a T641K mutation in the RNA polymerase (RNAP) β′-subunit, encoded by rpoC and a S494F mutation in the RNAP β-subunit, encoded by rpoB . These mutations were present in 22 (45%), 30 (61%), and 31 (63%) daptomycin-resistant isolates, respectively. The DltC and LiaR mutations were found exclusively in Australian ST203 isolates, where they co-occurred with each other as well as the S494F and T641K mutations in RNAP ( Figure 2 ). The RNAP mutations were more widespread and were present in both Australian and New Zealand isolates and from four different STs (ST203, ST80, ST17, and ST761). Notably, the RNAP mutations co-occurred in all but one isolate (AUSMDU00004090) irrespective of lineage. Given the high proportion of daptomycin-resistance among Australian VREfm isolates, a phylogenetic reconstruction of just Australian VREfm study isolates was made ( Figure 3 ). Two daptomycin-susceptible isolates (DMG1901764 and DMG1901754) were excluded from this analysis as outliers (SNP distance from reference 58,442 and 53,355, respectively). This phylogenetic reconstruction showed that daptomycin-resistant isolates were distributed throughout the phylogeny and were generally interspersed with daptomycin-susceptible isolates of the same ST, providing further support for the hypothesis that daptomycin resistance may have emerged independently on multiple occasions within Australia. Daptomycin-resistant ST203 isolates were an exception to this general observation, with daptomycin-resistant ST203 isolates appearing to form a monophyletic clade that was separated for daptomycin-susceptible ST203 study isolates. With this in mind, it is perhaps noteworthy that all daptomycin-resistant ST203 study isolates carried vanA , while all susceptible isolates, with one exception (AUSMDU00012789), were either VSEfm or carried vanB. FIGURE 3 Maximum likelihood core-SNP phylogeny of 173 Australian E. faecium study isolates. Coloured blocks show the multi-locus sequence type (MLST), country of origin (country), year of isolation (year), van status (i.e., vanA , vanB , and VSE) and daptomycin status (resistant or susceptible) for each isolate within the phylogeny. Grey blocks show the presence of the RNAP β-subunit S494F mutation (RpoB S494F), the RNAP β′-subunit T641K mutation (RpoC T641K), the LiaR S19F mutation, the DltC S63C mutation, the LiaR W73C and LiaS T120A co-occurring mutations or mutations within ClsA previously associated with daptomycin resistance in VREfm (ClsA various) for each isolate within the phylogeny. The vanA -VREfm strain D0 (TX16) ( Diaz et al., 2014 ) was used as the reference. The genomes of each Australian isolate (both daptomycin-resistant and -susceptible) were then interrogated for the presence of the RNAP β-subunit S494F, RNAP β′-subunit T641K, DltC S63C, and LiaR S19F mutations. There was a clear correlation between the presence of these mutations and daptomycin-resistance, as shown in Figure 3 , with comparatively few daptomycin-susceptible isolates identified that carried these mutations. Overall, the S494F and T641K mutations in RNAP β- and β′-subunits respectively were found in 75% (29 out of 39 isolates) and 71% (28 out of 39 isolates) of daptomycin-resistant isolates respectively, compared to just 4.5% of daptomycin-susceptible isolates (6 out of 136 isolates). Similarly, the S19F mutation in LiaR and S63C mutations in DltC were identified in a high proportion (56 and 53%, respectively) of daptomycin-resistant isolates, but both mutations were much less abundant (3%; 4 of 136 isolates) in daptomycin-susceptible isolates. In comparison, the LiaR W73C and LiaS T120A mutations were identified in just 2.5% of daptomycin-resistant isolates (1 out of 39 isolates) and 0.73% of daptomycin-susceptible VREfm isolates (1 out of 136 isolates). Overall, approximately 77% (30 of 39 isolates) of Australian daptomycin-resistant VREfm study isolates carried mutations within the liaR, rpoB, rpoC , or dltC genes compared to 6% (8 or 136 isolates) of daptomycin-susceptible isolates. Spearman's correlation test confirmed a significant correlation between daptomycin-resistant VREfm and the presence of the S494F RNAP β-subunit mutation ( p < 0.0001), the T641K RNAP β′-subunit mutation ( p < 0.0001), the S19F LiaR mutation ( p < 0.0001) and the S63F DltC mutation ( p < 0.0001). Given the low number of isolates carrying the LiaR W73C and LiaS T120A co-mutations it was not possible to determine whether they were significantly correlated with daptomycin-resistance or not. Collectively these data suggest that specific mutations in LiaR, DltC, and RNAP, which are not commonly seen overseas, might play an important role in daptomycin resistance in Australian VREfm. Infection With the Dominant Australian Daptomycin-Resistant Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Clone Is Associated With Reduced Daptomycin Treatment Efficacy in a Murine Bacteraemia Model The clinical impact of daptomycin-resistant VREfm on daptomycin treatment efficacy is currently not well defined. A murine model of VREfm bacteraemia was therefore used to determine whether infection with the predominant daptomycin-resistant clone identified in this study (ST203) would lead to reduced daptomycin treatment efficacy. Three ST203 daptomycin-resistant isolates (DMG1901766, DMG1700787, and DMG1700661), as well as a daptomycin-susceptible control strain (DMG1800332) were used to infect separate groups of mice. The daptomycin-susceptible control strain had a daptomycin MIC of 4 mg/L, while DMG1901766 had an MIC of 8 mg/L and DMG1700787 and DMG1700661 both had daptomycin MICs of 16 mg/L. There was no significant difference in the level of each isolate in the blood of saline treated mice, with infected animals displaying a profound bacteraemia (bacterial counts ranging from 10 7 to 10 12 CFU/mL of blood) regardless of the infecting isolate ( Figure 4 ). As expected, a reduced level of VREfm was observed in the blood of animals treated with daptomycin in comparison to saline treated mice. Notably, under the conditions tested, there was more VREfm in the blood of daptomycin treated animals infected with daptomycin-resistant isolates than in animals infected with the daptomycin-susceptible control isolate, with mean values of 7.5 × 10 5 , 1.3 × 10 6 , 4.5 × 10 7 , and 2.6 × 10 7 CFU/mL of blood in mice infected with DMG1800332 (MIC = 4 mg/L), DMG1901766 (MIC = 8 mg/L), DMG1700661 (MIC = 16 mg/L), and DMG1700787 (MIC = 16 mg/L), respectively ( Figure 4 ). While the level of VREfm in the blood of daptomycin treated animals infected with DMG1901766 and DMG1800332 was not significantly different, there was significantly higher levels of DMG1700661 and DMG1700787 in the blood of infected mice compared with the control isolate ( Figure 4 ). Based on the mean levels of VREfm in the blood of daptomycin treated mice compared to saline treated control animals there was a 6-fold, 95-fold, and 185-fold reduction in VREfm clearance from the blood of animals infected with DMG1901766, DMG1700787, and DMG1700661, respectively, compared to the daptomycin-susceptible DMG1800332 control isolate. These data indicate that infection with daptomycin-resistant E. faecium can compromise the efficacy of daptomycin treatment in the context of bloodstream infections. FIGURE 4 Efficacy of daptomycin treatment in a mouse model of VREfm bacteraemia. VREfm blood counts in uninfected mice administered sterile rate faecal extract (SRFE) or in mice infected with the daptomycin-susceptible isolate DMG1800332 (green) or daptomycin-resistant isolates DMG1901766 (orange), DMG1700661 (blue), or DMG1700787 (purple), and treated with either saline (untreated) or 50 mg/kg of daptomycin (DAP treated). Each coloured circle represents one animal ( n = 10–15 mice), with the median value displayed by the horizontal black line. Error bars represent the 95% CI. p -Values were calculated using a Mann–Whitney non-parametric test and are shown for the indicated groups; ns indicates no significant difference between groups ( p ≥ 0.05). Daptomycin Resistance Is Common in Clinical Australian Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Isolates A random selection of 324 isolates was made from a larger unbiased collection of Australian and New Zealand isolates stored at the MDU PHL. These isolates comprised vanB -VREfm ( n = 157), vanA- VREfm ( n = 129), and vancomycin-susceptible E. faecium (VSEfm) ( n = 38). All isolates underwent phenotypic daptomycin-susceptibility testing ( Figures 1A–D ). FIGURE 1 Daptomycin susceptibility of E. faecium study isolates. Daptomycin MIC distribution of (A) all study isolates ( n = 324); (B) VSEfm isolates ( n = 38); (C) vanA -VREfm isolates ( n = 129); and (D) vanB -VREfm isolates ( n = 157). Australian isolates are represented by dark grey and dark red blocks and New Zealand isolates are represented by light grey and light red blocks. Daptomycin-susceptible MICs are shown in grey (MIC < 8 mg/L) and daptomycin-resistant MICs are highlighted in red (MIC ≥ 8 mg/L). The number of isolates with each MIC value shown on the x -axis is displayed above the respective bars. Overall, the isolates displayed a unimodal wild-type MIC distribution ( Figure 1A ) with a mode MIC of 4 mg/L. When analysed by country, a unimodal MIC distribution was evident for both Australian and New Zealand isolates, with a mode MIC of 2 mg/L for Australian isolates and 4 mg/L for New Zealand isolates ( Figure 1A ). The MIC 50 and MIC 90 for Australian isolates was 4 and 8 mg/L, respectively, while New Zealand isolates had an MIC 50 and MIC 90 of 4 mg/L. In total 49 daptomycin-resistant E. faecium isolates were identified according to current guidelines ( Humphries, 2019 ) (MIC of ≥8 mg/L). This represents a resistance rate of 15.1% for the isolates tested. Although similar numbers of Australian and New Zealand E. faecium were tested (175 isolates from Australia and 150 isolates from New Zealand), the majority of daptomycin-resistant isolates were from Australia, with 39 isolates being from Australia and just 10 isolates from New Zealand. Daptomycin Resistance Is Strongly Associated With vanA -Type Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Strikingly, when analysed by E. faecium strain type (i.e. vanA -VREfm, vanB -VREfm, or VSEfm) a strong association between vanA -VREfm and daptomycin resistance was observed ( Figure 1 ), with 96% of daptomycin-resistant isolates being of the vanA -VREfm type and 4% being VSEfm. No daptomycin-resistant vanB -VREfm study isolates were identified. Statistical analysis showed that vanA -VREfm were significantly more daptomycin-resistant than vanB -VREfm ( p < 0.0001; Fisher's exact test) and VSEfm ( p < 0.0001; Fisher's exact test), with MIC 50 values of 4, 2, and 4 mg/L for vanA -VREfm, vanB -VREfm, and VSEfm, respectively, and MIC 90 values of 8, 4, and 4 mg/L, respectively. Country of origin did not influence the correlation between daptomycin resistance and vanA -VREfm ( Figure 1 ). Daptomycin Resistance Occurs in Phylogenetically Diverse Enterococcus faecium Clinical Isolates Given the strong association of vanA -VREfm and daptomycin-resistance it was important to determine whether the isolates were clonal. MLST analysis showed that daptomycin-resistance occurred in eight different sequence types (STs); ST203, ST80, ST1421, ST17, ST761, ST78, ST230, and ST22 ( Figure 2 ). Our analyses showed that each ST formed a monophyletic clade, with the exception of ST80 and ST17, which were paraphyletic. ST203 was the predominant type, comprising 47% ( n = 23/49) of daptomycin-resistant isolates. ST80 also accounted for a large proportion (29%, n = 14/49) of resistant isolates. The remaining daptomycin-resistant isolates consisted of four ST1421 isolates (8%), three ST17 isolates (6%), two ST761 isolates (4%), and a single isolate (2%) for each of ST78, ST230, and ST22. FIGURE 2 Maximum likelihood core-SNP phylogeny of 49 Australian and New Zealand daptomycin-resistant E. faecium isolates. Coloured blocks show the multi-locus sequence type (MLST), country of origin (country), year of isolation (year), van status (i.e., vanA , vanB , and VSE) and daptomycin MIC (8 and 16 mg/L) for each isolate within the phylogeny. Grey blocks show the presence of the RNAP β-subunit S494F mutation (RpoB S494F), the RNAP β′-subunit T641K mutation (RpoC T641K), the LiaR S19F mutation, the DltC S63C mutation, the LiaR W73C and LiaS T120A co-occurring mutations or mutations within ClsA previously associated with daptomycin resistance in VREfm (ClsA various). The vanA -VREfm strain D0 (TX16) ( Diaz et al., 2014 ) was used as the reference. To understand the phylogenetic relatedness of daptomycin-resistant study isolates, a maximum likelihood phylogeny was constructed ( Figure 2 ). Substantial genetic diversity was evident, with a mean core genome alignment pairwise SNP distance of 4,161 SNPs (range 0–9,231 SNPs). The population structure was polyphyletic, with multiple distinct clades evident, generally summarised by previously assigned multi-locus ST. Despite this overall level of diversity among resistant isolates, isolates from the predominant ST203 group displayed more restricted diversity, and had a mean pairwise SNP distance of 94 core genome SNPs (range 0–872 SNPs). There was evidence of clonal spread within the Australian ST203 clade, with 21 out of 23 isolates differing by no more than 39 core genome SNPs. In contrast, isolates within the second largest daptomycin-resistant group (ST80) were more genetically diverse, with a mean pairwise SNP distance of 3,600 SNPs (range 0–7178 SNPs). Notably, daptomycin-resistant ST80 isolates clustered throughout the tree within four distinct sub-clades, some containing both Australian and New Zealand isolates. These data collectively suggest that daptomycin resistance in Australian and New Zealand VREfm clinical isolates has arisen independently and is not the consequence of a recent clonal outbreak. Novel Mutations Are Associated With Daptomycin Resistance in Australian and New Zealand Clinical Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Isolates To understand the genetic changes associated with daptomycin resistance in the Australian and New Zealand study isolates, whole genome sequences from each resistant strain were analysed to identify any known E. faecium daptomycin resistance mutations. This analysis led to the identification of three isolates (6%) carrying the well-characterised W73C and T120A mutations in the LiaR and LiaS proteins respectively, and 22 isolates (44%) that harbour the less common S19F mutation in LiaR ( Sorlózano et al., 2015 ). The isolates carrying the T120A and W73C LiaSR mutations were all ST80, with 2 of the isolates being from New Zealand and 1 from Australia ( Figure 2 ). All 22 isolates carrying the S19F mutation in LiaR clustered within the ST203 clade and were of Australian origin ( Figure 2 ). No other mutations previously linked with daptomycin resistance in E. faecium (shown in Supplementary Table 2 ) were identified, including within the clsA gene ( Humphries et al., 2012 ; Tran et al., 2013 ; Lellek et al., 2015 ; Wang et al., 2018 ; Prater et al., 2019 ). Three novel SNPs (relative to the reference strain E. faecium D0) in genes associated with daptomycin resistance in Staphylococcus aureus were however identified. These mutations were S63C in DltC, which plays a role in D -alanylation of teichoic acid, a T641K mutation in the RNA polymerase (RNAP) β′-subunit, encoded by rpoC and a S494F mutation in the RNAP β-subunit, encoded by rpoB . These mutations were present in 22 (45%), 30 (61%), and 31 (63%) daptomycin-resistant isolates, respectively. The DltC and LiaR mutations were found exclusively in Australian ST203 isolates, where they co-occurred with each other as well as the S494F and T641K mutations in RNAP ( Figure 2 ). The RNAP mutations were more widespread and were present in both Australian and New Zealand isolates and from four different STs (ST203, ST80, ST17, and ST761). Notably, the RNAP mutations co-occurred in all but one isolate (AUSMDU00004090) irrespective of lineage. Given the high proportion of daptomycin-resistance among Australian VREfm isolates, a phylogenetic reconstruction of just Australian VREfm study isolates was made ( Figure 3 ). Two daptomycin-susceptible isolates (DMG1901764 and DMG1901754) were excluded from this analysis as outliers (SNP distance from reference 58,442 and 53,355, respectively). This phylogenetic reconstruction showed that daptomycin-resistant isolates were distributed throughout the phylogeny and were generally interspersed with daptomycin-susceptible isolates of the same ST, providing further support for the hypothesis that daptomycin resistance may have emerged independently on multiple occasions within Australia. Daptomycin-resistant ST203 isolates were an exception to this general observation, with daptomycin-resistant ST203 isolates appearing to form a monophyletic clade that was separated for daptomycin-susceptible ST203 study isolates. With this in mind, it is perhaps noteworthy that all daptomycin-resistant ST203 study isolates carried vanA , while all susceptible isolates, with one exception (AUSMDU00012789), were either VSEfm or carried vanB. FIGURE 3 Maximum likelihood core-SNP phylogeny of 173 Australian E. faecium study isolates. Coloured blocks show the multi-locus sequence type (MLST), country of origin (country), year of isolation (year), van status (i.e., vanA , vanB , and VSE) and daptomycin status (resistant or susceptible) for each isolate within the phylogeny. Grey blocks show the presence of the RNAP β-subunit S494F mutation (RpoB S494F), the RNAP β′-subunit T641K mutation (RpoC T641K), the LiaR S19F mutation, the DltC S63C mutation, the LiaR W73C and LiaS T120A co-occurring mutations or mutations within ClsA previously associated with daptomycin resistance in VREfm (ClsA various) for each isolate within the phylogeny. The vanA -VREfm strain D0 (TX16) ( Diaz et al., 2014 ) was used as the reference. The genomes of each Australian isolate (both daptomycin-resistant and -susceptible) were then interrogated for the presence of the RNAP β-subunit S494F, RNAP β′-subunit T641K, DltC S63C, and LiaR S19F mutations. There was a clear correlation between the presence of these mutations and daptomycin-resistance, as shown in Figure 3 , with comparatively few daptomycin-susceptible isolates identified that carried these mutations. Overall, the S494F and T641K mutations in RNAP β- and β′-subunits respectively were found in 75% (29 out of 39 isolates) and 71% (28 out of 39 isolates) of daptomycin-resistant isolates respectively, compared to just 4.5% of daptomycin-susceptible isolates (6 out of 136 isolates). Similarly, the S19F mutation in LiaR and S63C mutations in DltC were identified in a high proportion (56 and 53%, respectively) of daptomycin-resistant isolates, but both mutations were much less abundant (3%; 4 of 136 isolates) in daptomycin-susceptible isolates. In comparison, the LiaR W73C and LiaS T120A mutations were identified in just 2.5% of daptomycin-resistant isolates (1 out of 39 isolates) and 0.73% of daptomycin-susceptible VREfm isolates (1 out of 136 isolates). Overall, approximately 77% (30 of 39 isolates) of Australian daptomycin-resistant VREfm study isolates carried mutations within the liaR, rpoB, rpoC , or dltC genes compared to 6% (8 or 136 isolates) of daptomycin-susceptible isolates. Spearman's correlation test confirmed a significant correlation between daptomycin-resistant VREfm and the presence of the S494F RNAP β-subunit mutation ( p < 0.0001), the T641K RNAP β′-subunit mutation ( p < 0.0001), the S19F LiaR mutation ( p < 0.0001) and the S63F DltC mutation ( p < 0.0001). Given the low number of isolates carrying the LiaR W73C and LiaS T120A co-mutations it was not possible to determine whether they were significantly correlated with daptomycin-resistance or not. Collectively these data suggest that specific mutations in LiaR, DltC, and RNAP, which are not commonly seen overseas, might play an important role in daptomycin resistance in Australian VREfm. Infection With the Dominant Australian Daptomycin-Resistant Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Clone Is Associated With Reduced Daptomycin Treatment Efficacy in a Murine Bacteraemia Model The clinical impact of daptomycin-resistant VREfm on daptomycin treatment efficacy is currently not well defined. A murine model of VREfm bacteraemia was therefore used to determine whether infection with the predominant daptomycin-resistant clone identified in this study (ST203) would lead to reduced daptomycin treatment efficacy. Three ST203 daptomycin-resistant isolates (DMG1901766, DMG1700787, and DMG1700661), as well as a daptomycin-susceptible control strain (DMG1800332) were used to infect separate groups of mice. The daptomycin-susceptible control strain had a daptomycin MIC of 4 mg/L, while DMG1901766 had an MIC of 8 mg/L and DMG1700787 and DMG1700661 both had daptomycin MICs of 16 mg/L. There was no significant difference in the level of each isolate in the blood of saline treated mice, with infected animals displaying a profound bacteraemia (bacterial counts ranging from 10 7 to 10 12 CFU/mL of blood) regardless of the infecting isolate ( Figure 4 ). As expected, a reduced level of VREfm was observed in the blood of animals treated with daptomycin in comparison to saline treated mice. Notably, under the conditions tested, there was more VREfm in the blood of daptomycin treated animals infected with daptomycin-resistant isolates than in animals infected with the daptomycin-susceptible control isolate, with mean values of 7.5 × 10 5 , 1.3 × 10 6 , 4.5 × 10 7 , and 2.6 × 10 7 CFU/mL of blood in mice infected with DMG1800332 (MIC = 4 mg/L), DMG1901766 (MIC = 8 mg/L), DMG1700661 (MIC = 16 mg/L), and DMG1700787 (MIC = 16 mg/L), respectively ( Figure 4 ). While the level of VREfm in the blood of daptomycin treated animals infected with DMG1901766 and DMG1800332 was not significantly different, there was significantly higher levels of DMG1700661 and DMG1700787 in the blood of infected mice compared with the control isolate ( Figure 4 ). Based on the mean levels of VREfm in the blood of daptomycin treated mice compared to saline treated control animals there was a 6-fold, 95-fold, and 185-fold reduction in VREfm clearance from the blood of animals infected with DMG1901766, DMG1700787, and DMG1700661, respectively, compared to the daptomycin-susceptible DMG1800332 control isolate. These data indicate that infection with daptomycin-resistant E. faecium can compromise the efficacy of daptomycin treatment in the context of bloodstream infections. FIGURE 4 Efficacy of daptomycin treatment in a mouse model of VREfm bacteraemia. VREfm blood counts in uninfected mice administered sterile rate faecal extract (SRFE) or in mice infected with the daptomycin-susceptible isolate DMG1800332 (green) or daptomycin-resistant isolates DMG1901766 (orange), DMG1700661 (blue), or DMG1700787 (purple), and treated with either saline (untreated) or 50 mg/kg of daptomycin (DAP treated). Each coloured circle represents one animal ( n = 10–15 mice), with the median value displayed by the horizontal black line. Error bars represent the 95% CI. p -Values were calculated using a Mann–Whitney non-parametric test and are shown for the indicated groups; ns indicates no significant difference between groups ( p ≥ 0.05). Discussion Healthcare-associated infections caused by VREfm are a major public health issue globally, with daptomycin being one of the only therapeutic options for treating these infections. Despite this, our understanding of daptomycin resistance in VREfm is incomplete. A global surveillance study has suggested that the proportion of daptomycin-resistant isolates among VREfm globally may be as low as 0.18% ( Sader et al., 2014 ). However, a meta-analysis of 23 international studies found that the prevalence of daptomycin-resistant VREfm was variable with a range of 0.6–19.5% depending on the study ( Kelesidis et al., 2011 ). In keeping with this, our results suggest that daptomycin-resistant VREfm might be common on the Australasian continent, particularly in Australia where approximately 22% of study isolates were phenotypically resistant to daptomycin. It should be noted that although our study suggests a high rate of daptomycin-resistant VREfm in Australia, the proportion of daptomycin resistance can be influenced by testing method. Further, the non-uniform nature in which isolates were collected means it is not possible to determine an epidemiologically meaningful prevalence rate. As such, future studies should be carried out with isolates that have been collected in an unbiased manner, from multiple sites and over strictly defined timeframes. Our study identified a previously unreported link between daptomycin resistance and vanA -VREfm, with 95% of resistant isolates carrying the vanA gene. This finding is of particular concern given the dramatic increase in recent years of vanA -VREfm in Australia, where vanB -VREfm has traditionally been the most prevalent type ( Coombs et al., 2014 ). Surprisingly, despite the predominance of vanB -VREfm in Australia and New Zealand, we did not find any vanB -VREfm isolates that displayed a daptomycin-resistant phenotype. Daptomycin-resistant vanA -VREfm were polyclonal, with eight different STs represented. Overall, daptomycin-resistant isolates were phylogenetically diverse, indicating that daptomycin resistance in Australia and New Zealand has not arisen as a consequence of a recent clonal outbreak and has likely emerged independently in multiple VREfm lineages. More in depth sampling and bioinformatics analyses are however needed to confirm this hypothesis. Of note, isolates within the largest clade of daptomycin-resistant study isolates (ST203) were closely related and displayed clear evidence of clonal spread. It is not clear why vanA -VREfm are so strongly associated with daptomycin resistance in our study isolates, especially given the well documented dominance of vanB -VREfm in Australia and New Zealand ( Lee et al., 2018 ). It seems unlikely that the vanA operon would contribute directly to daptomycin resistance, given the different mechanisms and sites of action of vancomycin and daptomycin. As such, we speculate that different selective pressures may exist for vanA- VREfm compared to vanB -VREfm, which lead to the selection of daptomycin-resistant vanA -VREfm more commonly than vanB- VREfm. One possibility is that vanA -VREfm are more often exposed to daptomycin, since patients infected with vanB -VREfm would likely receive teicoplanin as a first-line therapy in preference to daptomycin. Previous studies have suggested that liaFSR mutations are the dominant mechanism associated with daptomycin resistance in E. faecium ( Casapao et al., 2013 ; Diaz et al., 2014 ). In agreement with this, we identified mutations within liaSR in approximately 50% of the daptomycin-resistant study isolates. The co-occurring W73C and T120A mutations in LiaR and LiaS, respectively are arguably the most commonly reported mutations associated with daptomycin-resistance in E. faecium , particularly in the United States ( Diaz et al., 2014 ; Davlieva et al., 2018 ). These mutations were however poorly represented in our isolate collection and were only identified in three isolates. More common amongst our E. faecium isolates was the S19F mutation in LiaR, which was identified in 45% of daptomycin-resistant study isolates. Although less common than the W73C LiaR mutation in overseas isolates, the S19F mutation has previously been linked with daptomycin-resistance in an E. faecium isolate collected from an immunocompromised patient in Spain ( Sorlózano et al., 2015 ). Our findings suggest that in Australia this mutation may be more dominant than other LiaSR mutations commonly seen overseas. In addition to mutations in the liaFSR system, we identified several mutations that were over-represented in our daptomycin-resistant Australian study isolates compared to Australian daptomycin-susceptible study isolates. These were a S63C mutation in DltC, which encodes a D -alanyl carrier protein involved in the D -alanylation of lipoteichoic acid, a S494F mutation in the β-subunit of the RNAP complex and a T641K mutation in the β′-subunit of the RNAP complex. Although these mutations have not previously been linked with daptomycin resistance in E. faecium , changes within the dlt operon and the RNAP complex have previously been linked with daptomycin-resistance in S. aureus ( Friedman et al., 2006 ; Cui et al., 2010 ; Mishra et al., 2014 ), providing support for our hypothesis that these mutations might play a role in the emergence of daptomycin resistance in E. faecium . The mutations in the β- and β′-subunits of the RNAP complex were most strongly associated with daptomycin resistance, being present in over 60% of daptomycin-resistant study isolates. The co-occurrence of RNAP mutations with the S63C mutation in DltC and the S19F mutation in LiaR in isolates within the ST203 clade raises the possibility of cooperativity between these mutations. Further molecular studies using isogenic mutants are however needed to conclusively determine the role that these individual and combined mutations play in daptomycin resistance in E. faecium. Nevertheless, our study adds to a growing body of work suggesting that daptomycin resistance in E. faecium is heterogeneous and involves multiple different genes and cellular pathways. Previous reports have suggested that daptomycin-resistant VREfm can lead to daptomycin treatment failure ( Munita et al., 2014 ), however, there remains a level of uncertainty around the clinical consequences associated with infection by these isolates. To determine whether infection with the predominant daptomycin-resistant clone identified here might impact on daptomycin treatment efficacy, we used a murine VREfm bacteraemia model. These experiments showed that daptomycin treatment was compromised in animals infected with this clone, with the effect being most pronounced in isolates that displayed a daptomycin MIC of 16 mg/L. This is in agreement with some clinical studies that have shown decreased rates of clinical success as the daptomycin MIC increased ( Casapao et al., 2013 ). A recent report documenting the isolation of clinical vanA -VREfm isolates possessing daptomycin MICs in the range of 16–32 mg/L are therefore of particular concern ( Wang et al., 2018 ). The daptomycin dose used in our mouse bacteraemia model has previously been shown to give a level of exposure within the range observed in humans treated with 8 mg/kg/day daptomycin ( Heine et al., 2010 ). This is a commonly used dose in humans infected with VREfm ( Casapao et al., 2013 ; Britt et al., 2017 ), however, a recent study suggested that high dose daptomycin (≥10 mg/kg/day) might be more effective in treating enterococcal infections ( Britt et al., 2017 ). Further studies on the efficacy of high dose daptomycin for treating infections caused by daptomycin-resistant VREfm are therefore warranted. Conclusion In summary, we have identified a strong association between vanA -VREfm and daptomycin resistance. Further, we have identified a number of novel mutations that are over-represented in Australian daptomycin-resistant VREfm compared to daptomycin-susceptible isolates. Finally, using a murine model of VREfm infection, we have shown that infection with the predominant Australian daptomycin-resistant clone significantly impacts on daptomycin treatment efficacy in the context of VREfm bloodstream infections. These findings suggest that clinical decision making regarding the use of daptomycin for infections caused by vanA -VREfm should be carefully guided by knowledge of local resistance patterns and supported by phenotypic susceptibility testing of individual vanA -VREfm isolates. Data Availability Statement The data presented in the study are deposited in the ENA repository under bioprojects PRJNA433676 , PRJNA565795 , PRJEB23767 , PRJNA565795 , and PRJEB47276 . Ethics Statement The animal study was reviewed and approved by The University of Melbourne, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Dental Science, Medicine, Microbiology & Immunology, and Surgery Animal Ethics Committee. Author Contributions GC and BH conceived and planned the experiments. LL, CH, AT, and YN performed the planned experiments. CG, TS, and TPS provided critical insights into the bioinformatic analyses performed in the study. KD, NS, and DW isolated the VREfm isolates used. LL and GC co-wrote the manuscript with critical feedback and input from all authors. Conflict of Interest The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest. Publisher's Note All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher. Funding The project was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia funding (GNT1185213, GNT1160745, and GNT1105905). MDU PHL was funded by the Victorian Government, Australia and ESR was funded by the New Zealand Ministry of Health, who funded the collection of New Zealand isolates. A subgroup of isolates was collected as part of a project funded by Melbourne Genomics Health Alliance. Supplementary Material The Supplementary Material for this article can be found online at: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.749935/full#supplementary-material Click here for additional data file.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7155535/

Palaeognathae: Apterygiformes, Casuariiformes, Rheiformes, Struthioniformes; Tinamiformes

The infraclass Palaeognathae includes the flightless ratites (ostrich, emu, rhea, cassowary, kiwi) and the tinamous, a group of related, flighted birds. This chapter focuses on unique anatomy and important non-infectious and infectious diseases of these groups of birds. Notable among these are management-related diseases such as gastrointestinal tract impactions, OIE reportable viral diseases including those cause by the avian influenza and eastern equine encephalitis viruses, and a range of species-specific endo- and ectoparasites virus infections. Introduction The infraclass Palaeognathae includes ratites (ostrich, emu, rhea, cassowary, kiwi), and tinamous, a group of related but flighted birds (see Supplemental Table e1 for a list of the members of the Infraclass [Clade] Palaeognathae). Commercial ratite production for meat and leather (ostrich, emu, rhea), feathers (ostrich) and oil (emu) occurs worldwide. The management and diseases of the large ratites are similar. Information on the kiwi and tinamou derives primarily from in situ conservation programs and zoological collections (see the Supplemental Materials for a list of general resources related to ratite husbandry and health). Unique features The basic principles of avian hematology and biochemistry are applicable to ratites. Reference intervals have been published and summarized for commercially raised species, particularly for ostriches. Several papers provide detailed descriptions of the composition of naturally voided ostrich urine and a few reports provide preliminary information on clinical pathology of the cassowary (see the Supplemental Materials for notable clinical pathology information and reference material). Large and small ratites have several unique characteristic anatomic features. Some of the most notable are described later and shown in Figure 26.1 , Figure 26.2 , Figure 26.3 , Figure 26.4 . Additional details and comparative anatomy across ratites are outlined in the Supplemental Materials Table e2 . Figure 26.1 Normal eyes in an ostrich. The larger ratites have extremely large eyes. Note the relative sizes of the normal brain and eye of an adult ostrich. Figure 26.2 Normal trachea in an emu. A unique feature of the trachea is a series of approximately 5–7 incomplete cartilage rings on the anterior aspect that creates a cleft. The cleft is covered by a thin membrane (removed here) that is continuous with the tracheal mucosa and forms a sac in the ventral neck that is used to make characteristic drumming noises during the breeding season. Figure 26.3 Normal egg size in a North Island brown kiwi. Among birds, kiwis have the largest egg to body size ratio. This radiograph shows the size of a normal, shelled egg, which fills the coelomic cavity and accounts for up to 20% of the body weight of the bird. (Photo Courtesy of Massey University) Figure 26.4 Normal ceca in an elegant crested tinamou. Prominent sacculations are a normal feature of the ceca in tinamou species. (Photo Courtesy of G. Dorrestein, Diagnostisch Pathologie Laboratorium NOIVBD) Relative to other avian species and small ratites, large ratites have several anatomic modifications related to flightlessness: a flat keel with minimal pectoral musculature, poorly developed wings with modifications of the thoracic girdle, proportionately over developed legs, and elongated necks ( Fowler, 1991 ). The ilia form an inverted bony shield dorsal to the synsacrum. Feathers lack barbules and hence have a fluffy appearance. There is no uropygial gland ( Bezuidenhout, 1999 ). All male ratites have a phallus in the proctodeum and the females of most species have a smaller analogous structure referred to as either a phallus or a clitoris. Ostriches must stand to urinate, thus birds recumbent for some time may have a coprodeum full of urine. Due to the common occurrences of yolk sac retention in ostriches, an understanding of normal is critical. A microscopic description of the normal and abnormal yolk sac of the ostrich has been published by Dzoma and Dorrestein (2001) . A predictive curve for yolk sac size was developed, with the amount of yolk predicted to be 33% of chick weight on day 1 after hatching, as compared to 4% at 14 days posthatch. The mucosa of the yolk sac is initially composed of long villi lined by large vacuolated epithelial cells. These villi disappear by day 14, leaving a layer of single or stratified vacuolated epithelial cells. In ostrich, emu, and rhea chicks, an important feature of the developing long bones is the presence of long medial and lateral cartilaginous cones composed of a solid sheet of chondrocytes with intervening blood vessels ( Reece and Butler, 1984 , Shivaprasad, 1995 ). These cones extend from the growth plates and are surrounded by a thin osseous rim at the time of hatching. They gradually become separated from the growth plate, surviving as a central cartilaginous core until becoming fully remodelled into trabecular bone 6–8 weeks after hatching. In ostriches, the morphology and amount of cartilage varies among the long bones and among birds ( Shivaprasad, 1995 ). Ossification at the growth plates occurs in the normal manner. Kiwis have vestigial wings with a curved claw on the major digit. Feathers are long and hair-like at the tips, without interlinking barbules. The beak is elongated and ventrally curved with slit-like nostrils at the tip; it is longer in the female than the male. Identifying earthworms and invertebrates in the soil is assisted by a sensory region at the tip of the beak that contains large numbers of Herbst and Grandry-like mechanoreceptors ( Bang, 1971 ). Female kiwis have two fully functional ovaries that can ovulate alternately, but only the left oviduct is functional ( Kinsky, 1971 ). The follicle of the kiwi can attain 80 mm in diameter prior to ovulation; egg size would be more appropriate for a bird 6 times greater in weight ( Fig. 26.3 ). The yolk comprises 61% of initial egg weight, with 48% of yolk mass still present at hatching and that can provide nutrition to the chick for up to approximately 14–17 days ( Prinzinger and Dietz, 2002 ). The tinamous are a large group of flighted, partridge-like birds. Although their wings are small, they have well-developed pectoral musculature and a highly pneumatized skeleton. Tinamous have well-developed ceca ( Fig. 26.4 ), which vary considerably in appearance among species ( McLelland, 1989 ). They are sacculated in the red-winged tinamou, and in the elegant crested tinamou are very unusual with numerous prominent external diverticula and a mucosa that resembles the reticulum of a ruminant. Non-infectious diseases Nutritional Sudden death due to a dissecting aortic aneurysm in ostriches and in a single emu has been suggested as being related to copper deficiency ( Ferreras et al., 2001 , Vanhooser et al., 1994 ). Histologic aortic lesions include fragmentation and disruption of the elastic laminae, cystic extracellular spaces, and an accumulation of what have been interpreted to be strongly sulfated acid mucopolysaccharides based on staining with Alcian blue and periodic acid Schiff (PAS). Copper deficiency is suspected based both on the character of the aortic lesions and the findings of low liver copper levels in a number of affected birds. A copper-dependent enzyme, lysyl oxidase, is required for the cross-linking of collagen and elastin fibres that provides strength to the vascular wall. Liver copper levels in affected birds are frequently below 3.5 ppm, in comparison to above 5 ppm in unaffected birds. Developmental angular limb deformities are a significant cause of mortality in ratite chicks ( Bezuidenhout and Burger, 1993 , Huchzermeyer, 1998 ). These abnormalities are undoubtedly multifactorial, with nutritional and management factors intricately intertwined in the pathogenesis. Imbalances of Vitamin D 3 , calcium, phosphorus, manganese, zinc, copper, and selenium; riboflavin deficiency; and excess protein have all been implicated in disease pathogenesis. The most commonly described syndromes include unilateral or bilateral bowing or twisting of the leg bones, particularly of the tibiotarsus and/or tarsometatarsus ( Fig. 26.5 ). Associated sequelae can include dislocation of the gastrocnemius tendon over the hock joint and lateral rotation of the major toe of the ostrich. Figure 26.5 Angular limb deformity in an ostrich. Radiographs of the legs of a 1-month-old ostrich chick. Torsional and angular deformity of the distal tibiotarsus and the tarsometatarsus. The normal (right) leg is on the left side of the image for comparison. Rickets in ratite chicks has most often been associated with hypophosphatemia. The pathologic features have been described in affected rheas (rubber rhea syndrome) and ostriches ( Gröne et al., 1995 , Morrow et al., 1997 ). Characteristic lesions are pliability of long bones, angular limb deformities ( Fig. 26.6 A), and folding fractures. Also seen are enlargement and thickening of the metaphyseal plates due to elongation of the zone of hypertrophic cartilage ( Fig. 26.6 B), retained cartilage cores (to be differentiated from normal cartilage cones present in birds up to 6–8 weeks of age), subchondral microfractures ( Fig. 26.6 C), and reduced metaphyseal osteoid. Figure 26.6 Phosphorus-deficiency rickets in young common rhea. Characteristic features include (A) Tibiotarsal curvature and thickening at the proximal growth plate, (B) enlargement of the metaphyseal plates, elongation of the zone of hypertrophic cartilage, and pathologic fractures in the underlying metaphyseal bone (arrow) , and (C) pathologic fractures characterized by irregular, jagged edged clefts in the bone surrounded by irregular rests of hypertrophic cartilage. (Part B: Photo Courtesy of H.L. Shivaprasad, University of California Davis (UC Davis), California Animal Health & Food Safety Laboratory [CAHFS]) Atherosclerosis can develop in emu as a sequela to feeding a ration high in eggs (high cholesterol content) and fat for an extended period of time ( Tomimura et al., 1970 ). Histologic lesions include partial arterial occlusion by large confluent atherosclerotic plaques containing cholesterol clefts, lipid, and lipid-laden macrophages, fatty degeneration and calcium deposition in the media, fragmentation of the internal elastic membrane, and musculoelastic thickening. In a described case, the abdominal aorta and coronary arteries were the most severely affected. Marked pansteatitis associated with low liver Vitamin E levels has been seen in adult kiwi ( Boardman, 1998 ). Toxic Monensin toxicity in ostriches has occurred due to errors in feed formulation. It presents clinically as anorexia, ataxia, loss of control of the neck, recumbency, and dyspnea prior to death. Expected elevations in creatine kinase, aspartate aminotransferase and lactate dehydrogenase, and classic histopathologic lesions of acute to subacute skeletal myodegeneration are seen ( Baird et al., 2000 ). Botulism due to Clostridium botulinum and associated with toxin types C and D has been described in ostriches and, presumptively, in a cassowary ( Romer, 1997 ). Diagnosis in these cases is related to clinical history and identifying toxins via mouse bioassay. Affected ostriches may be acutely ataxic, paretic, or completely paralyzed ( Huchzermeyer, 1998 ). The larger ratites are indiscriminate eaters, and ingestion of metallic foreign bodies has resulted in absorption of toxic levels of iron, lead, copper, and zinc. Pancreatic exocrine atrophy and fibrosis accompanied by the presence of regenerative ducts has been described ostriches due to zinc toxicity ( Carreira et al., 2011 ). Toxicity associated with ingestion of certain plants and plant toxins within pasture is reported for: parsley ( Petroselinum sativa , ostrich, photosensitization); avocado ( Persea americana ; ostrich; myocardial degeneration); oak leaves ( Querca agrifolia ; double wattled cassowary; enteritis and nephrosis); wilted grass sprouts (ostrich; prussic acid poisoning); yew ( Taxus baccata ; emu; gastroenteritis and pulmonary edema); and a number of toxic southern African plant species (including ragwort [ Senecio scleratus ] and lantana [ Lantana camara ]; ostrich) ( Cooper, 2007a ; Huchzermeyer, 1998 ). Mortality occurred in a flock of young emu chicks that ingested large numbers of blister beetles ( Pyrota insulata ) containing cantharidin , a vesicant. Resulting lesions included esophageal congestion and ulceration, submucosal vascular thrombosis and necrosis, and sloughing of the lining of the ventriculus ( Barr et al., 1998 ). Levamisole toxicity in kiwi resulted in acute bronchopneumonia with severe pulmonary edema and death in five of six affected birds, as well as hepatocellular degeneration, and vascular thrombosis and multifocal hepatic necrosis, each in one bird ( Gartrell et al., 2005 ). A list of several additional toxins described as causes of clinical disease and death in the larger ratite species is included in the Supplemental Materials. There are frequently minimal details on associated pathologic findings in these reports. Congenital/Genetic A form of mucopolysaccharidosis type IIIB , an autosomal recessive, inherited lysosomal storage disease caused by a deficiency of lysosomal alpha- N -acetylglucosaminidase (NAGLU) and subsequent intracellular accumulation of heparan sulfate, has been described in emus ( Palmieri et al., 2015 ). Juvenile birds develop progressive neurological signs; acute death due to abdominal hemorrhage is also described. Characteristic histologic lesions include widespread neuronal swelling and fine, intracellular vacuolation in the brain, spinal cord, retina, and autonomic ganglia ( Fig. 26.7 A). Material in vacuoles stains variably positive with PAS and strongly positive with Luxol fast blue. Foamy macrophages may also be present in a variety of tissues including liver, spleen, intestine, and the tunica media of the aorta. On transmission electron microscopy (TEM), membrane bound, electron-dense, lamellated cytoplasmic material (consistent with "zebra bodies") is seen in neurons and ganglial cells ( Fig. 26.7 B). Storage material in retinal cells may differ and consist of a central granular, highly electron-dense core surrounded by membranous whorls, while in macrophages it may appear as well-circumscribed, electron-dense, homogenous circular bodies surrounded by stacks of rough endoplasmic reticulum. Figure 26.7 Lysosomal storage disease in the brain of an emu. A form of mucopolysaccharidosis IIIB occurs in emus. (A) Characteristic features are diffuse cytoplasmic vacuolization and cell swelling, both of which are seen in this cerebral neuron, (B) storage material consists of accumulations of electron dense, lamellar, membrane-bound cytoplasmic storage material due to defective enzymatic activity, TEM. (Photos Courtesy of H.L. Shivaprasad, UC Davis) A mechanobullous skin condition with low prevalence occurred in ostrich chicks on a large farm in Israel over a 2-year period ( Perelman et al., 1995 ). Lesions, present only in skin, consisted of dermolytic blistering, skin peeling, and feather loss. Disease resulted in death or euthanasia of affected chicks by 14 weeks of age. Microscopic and TEM examination of skin showed epidermolysis bullosa-like lesions, including subepidermal bullae, splitting of the sublamina densa, dermal edema, and with time, inflammation and crusting. Lesions were considered likely to be inherited, but the parentage of the affected birds could not be traced. Trauma Trauma , misadventure , and capture myopathy are leading causes of death in adult age group ratites. In the wild, the most commonly recognized causes of mortality for cassowaries and kiwis are trauma, and trauma and predation, respectively. Tinamous are prone to injury and trauma when startled or frightened and must be handled carefully to avoid fractures. Inflammatory Non-infectious Amyloidosis has been reported in rhea and in the liver and/or spleen in young ostriches with mycotic airsacculitis and pneumonia ( Akkoç et al., 2009 , Cowan, 1968 ). Histologically, eosinophilic homogenous material positive with Congo red staining expands sinusoids and is associated with hepatocyte degeneration and atrophy. In the spleen, the material is within the tunica media of and surrounds splenic blood vessels. The presence of amyloid A type fibrils has been confirmed using immunohistochemistry ( Akkoç et al., 2009 ). Miscellaneous Management-related factors are a major cause of mortality in captive ratite systems. In the hands of inexperienced ratite farmers, hatching, and neonatal chick survival rates can be abysmal. Improper egg collection and storage, incubation, and hatching parameters result in embryonic mortality and failure to hatch, weak and edematous hatched chicks, and poor chick viability. Acute generalized skeletal myopathy involving the complexus (pipping), hind limb, and costo-pulmonaris muscles has been described in newly hatched chicks and may be a result of exertion or physiologic difficulty at hatching ( Philbey et al., 1991 ). " Fading syndrome " and " gastric stasis " are major causes of stunted growth, wasting, and mortality in ostrich chicks up to 6 months of age; up to 70% of can be chicks affected to varying degrees. The cause is not fully understood but environmental parameters, maladaptation, and increased susceptibility to infectious agents are likely important factors ( Button et al., 1996; Huchzermeyer, 1998 , Ocal et al., 2006 ). Necropsy lesions are nonspecific but include emaciation and proventricular and ventricular changes including either lack of contents or distension without impaction, and mucosal hyperplasia and degeneration. Ratites are indiscriminate eaters and gastrointestinal impaction and gastrointestinal foreign bodies are; therefore, important causes of anorexia, wasting, and death in birds of all ages ( Reissig and Robles, 2001 ). Impaction with straw, shavings, coarse grass, and virtually any other ingestible substrate have been reported ( Fig. 26.8 A, B). Figure 26.8 Impaction in an ostrich. The proventriculus and ventriculus are markedly distended and filled with coarse roughage—unopened (A) and opened (B). (Photos Courtesy of M. Brash, Animal Health Laboratory [AHL], University of Guelph) Pneumoconiosis is common in captive kiwi and lesions can be marked. The condition is thought to be associated with dry, dusty substrates and enhanced by the birds' sniffing behavior during feeding and substrate investigation ( Smith et al., 1973 ). Miscellaneous conditions identified in tinamous held in zoos include a myocardial infarct, aortic and carotid atherosclerosis, vegetative valvular endocarditis associated with chronic sinus infection, oviductal egg impaction, and nephritis ( Griner, 1983 ). The pathologies in birds raised under more intensive conditions are somewhat different with uric acid nephrosis, amyloidosis, gastrointestinal foreign bodies, and the presence of the renal trematode Paratanaisia confusa and of Capillaria penidoi in the upper digestive tract as the most significant findings in one study of red-winged tinamous ( Momo, 2007 ). Neoplastic Neoplastic diseases have rarely been reported in Struthioniformes, with multicentric lymphoid neoplasia in ostriches most commonly described. Single cases of lymphoid leukemia and a monoclonal gammopathy also exist (additional descriptive details for lymphoid neoplasia in ratites can be found in the Supplemental Materials Table e3 ). There are no reports of immunohistochemical or other typing of neoplastic lymphocytes. Additionally, single cases of intrathoracic hemangiosarcoma ( Headley, 2005 ) and capillary-type pulmonary hemangioma ( Shathele et al., 2009 ) have been reported in young ostriches. Other neoplastic conditions undoubtedly exist but have not been formally described. Nutritional Sudden death due to a dissecting aortic aneurysm in ostriches and in a single emu has been suggested as being related to copper deficiency ( Ferreras et al., 2001 , Vanhooser et al., 1994 ). Histologic aortic lesions include fragmentation and disruption of the elastic laminae, cystic extracellular spaces, and an accumulation of what have been interpreted to be strongly sulfated acid mucopolysaccharides based on staining with Alcian blue and periodic acid Schiff (PAS). Copper deficiency is suspected based both on the character of the aortic lesions and the findings of low liver copper levels in a number of affected birds. A copper-dependent enzyme, lysyl oxidase, is required for the cross-linking of collagen and elastin fibres that provides strength to the vascular wall. Liver copper levels in affected birds are frequently below 3.5 ppm, in comparison to above 5 ppm in unaffected birds. Developmental angular limb deformities are a significant cause of mortality in ratite chicks ( Bezuidenhout and Burger, 1993 , Huchzermeyer, 1998 ). These abnormalities are undoubtedly multifactorial, with nutritional and management factors intricately intertwined in the pathogenesis. Imbalances of Vitamin D 3 , calcium, phosphorus, manganese, zinc, copper, and selenium; riboflavin deficiency; and excess protein have all been implicated in disease pathogenesis. The most commonly described syndromes include unilateral or bilateral bowing or twisting of the leg bones, particularly of the tibiotarsus and/or tarsometatarsus ( Fig. 26.5 ). Associated sequelae can include dislocation of the gastrocnemius tendon over the hock joint and lateral rotation of the major toe of the ostrich. Figure 26.5 Angular limb deformity in an ostrich. Radiographs of the legs of a 1-month-old ostrich chick. Torsional and angular deformity of the distal tibiotarsus and the tarsometatarsus. The normal (right) leg is on the left side of the image for comparison. Rickets in ratite chicks has most often been associated with hypophosphatemia. The pathologic features have been described in affected rheas (rubber rhea syndrome) and ostriches ( Gröne et al., 1995 , Morrow et al., 1997 ). Characteristic lesions are pliability of long bones, angular limb deformities ( Fig. 26.6 A), and folding fractures. Also seen are enlargement and thickening of the metaphyseal plates due to elongation of the zone of hypertrophic cartilage ( Fig. 26.6 B), retained cartilage cores (to be differentiated from normal cartilage cones present in birds up to 6–8 weeks of age), subchondral microfractures ( Fig. 26.6 C), and reduced metaphyseal osteoid. Figure 26.6 Phosphorus-deficiency rickets in young common rhea. Characteristic features include (A) Tibiotarsal curvature and thickening at the proximal growth plate, (B) enlargement of the metaphyseal plates, elongation of the zone of hypertrophic cartilage, and pathologic fractures in the underlying metaphyseal bone (arrow) , and (C) pathologic fractures characterized by irregular, jagged edged clefts in the bone surrounded by irregular rests of hypertrophic cartilage. (Part B: Photo Courtesy of H.L. Shivaprasad, University of California Davis (UC Davis), California Animal Health & Food Safety Laboratory [CAHFS]) Atherosclerosis can develop in emu as a sequela to feeding a ration high in eggs (high cholesterol content) and fat for an extended period of time ( Tomimura et al., 1970 ). Histologic lesions include partial arterial occlusion by large confluent atherosclerotic plaques containing cholesterol clefts, lipid, and lipid-laden macrophages, fatty degeneration and calcium deposition in the media, fragmentation of the internal elastic membrane, and musculoelastic thickening. In a described case, the abdominal aorta and coronary arteries were the most severely affected. Marked pansteatitis associated with low liver Vitamin E levels has been seen in adult kiwi ( Boardman, 1998 ). Toxic Monensin toxicity in ostriches has occurred due to errors in feed formulation. It presents clinically as anorexia, ataxia, loss of control of the neck, recumbency, and dyspnea prior to death. Expected elevations in creatine kinase, aspartate aminotransferase and lactate dehydrogenase, and classic histopathologic lesions of acute to subacute skeletal myodegeneration are seen ( Baird et al., 2000 ). Botulism due to Clostridium botulinum and associated with toxin types C and D has been described in ostriches and, presumptively, in a cassowary ( Romer, 1997 ). Diagnosis in these cases is related to clinical history and identifying toxins via mouse bioassay. Affected ostriches may be acutely ataxic, paretic, or completely paralyzed ( Huchzermeyer, 1998 ). The larger ratites are indiscriminate eaters, and ingestion of metallic foreign bodies has resulted in absorption of toxic levels of iron, lead, copper, and zinc. Pancreatic exocrine atrophy and fibrosis accompanied by the presence of regenerative ducts has been described ostriches due to zinc toxicity ( Carreira et al., 2011 ). Toxicity associated with ingestion of certain plants and plant toxins within pasture is reported for: parsley ( Petroselinum sativa , ostrich, photosensitization); avocado ( Persea americana ; ostrich; myocardial degeneration); oak leaves ( Querca agrifolia ; double wattled cassowary; enteritis and nephrosis); wilted grass sprouts (ostrich; prussic acid poisoning); yew ( Taxus baccata ; emu; gastroenteritis and pulmonary edema); and a number of toxic southern African plant species (including ragwort [ Senecio scleratus ] and lantana [ Lantana camara ]; ostrich) ( Cooper, 2007a ; Huchzermeyer, 1998 ). Mortality occurred in a flock of young emu chicks that ingested large numbers of blister beetles ( Pyrota insulata ) containing cantharidin , a vesicant. Resulting lesions included esophageal congestion and ulceration, submucosal vascular thrombosis and necrosis, and sloughing of the lining of the ventriculus ( Barr et al., 1998 ). Levamisole toxicity in kiwi resulted in acute bronchopneumonia with severe pulmonary edema and death in five of six affected birds, as well as hepatocellular degeneration, and vascular thrombosis and multifocal hepatic necrosis, each in one bird ( Gartrell et al., 2005 ). A list of several additional toxins described as causes of clinical disease and death in the larger ratite species is included in the Supplemental Materials. There are frequently minimal details on associated pathologic findings in these reports. Congenital/Genetic A form of mucopolysaccharidosis type IIIB , an autosomal recessive, inherited lysosomal storage disease caused by a deficiency of lysosomal alpha- N -acetylglucosaminidase (NAGLU) and subsequent intracellular accumulation of heparan sulfate, has been described in emus ( Palmieri et al., 2015 ). Juvenile birds develop progressive neurological signs; acute death due to abdominal hemorrhage is also described. Characteristic histologic lesions include widespread neuronal swelling and fine, intracellular vacuolation in the brain, spinal cord, retina, and autonomic ganglia ( Fig. 26.7 A). Material in vacuoles stains variably positive with PAS and strongly positive with Luxol fast blue. Foamy macrophages may also be present in a variety of tissues including liver, spleen, intestine, and the tunica media of the aorta. On transmission electron microscopy (TEM), membrane bound, electron-dense, lamellated cytoplasmic material (consistent with "zebra bodies") is seen in neurons and ganglial cells ( Fig. 26.7 B). Storage material in retinal cells may differ and consist of a central granular, highly electron-dense core surrounded by membranous whorls, while in macrophages it may appear as well-circumscribed, electron-dense, homogenous circular bodies surrounded by stacks of rough endoplasmic reticulum. Figure 26.7 Lysosomal storage disease in the brain of an emu. A form of mucopolysaccharidosis IIIB occurs in emus. (A) Characteristic features are diffuse cytoplasmic vacuolization and cell swelling, both of which are seen in this cerebral neuron, (B) storage material consists of accumulations of electron dense, lamellar, membrane-bound cytoplasmic storage material due to defective enzymatic activity, TEM. (Photos Courtesy of H.L. Shivaprasad, UC Davis) A mechanobullous skin condition with low prevalence occurred in ostrich chicks on a large farm in Israel over a 2-year period ( Perelman et al., 1995 ). Lesions, present only in skin, consisted of dermolytic blistering, skin peeling, and feather loss. Disease resulted in death or euthanasia of affected chicks by 14 weeks of age. Microscopic and TEM examination of skin showed epidermolysis bullosa-like lesions, including subepidermal bullae, splitting of the sublamina densa, dermal edema, and with time, inflammation and crusting. Lesions were considered likely to be inherited, but the parentage of the affected birds could not be traced. Trauma Trauma , misadventure , and capture myopathy are leading causes of death in adult age group ratites. In the wild, the most commonly recognized causes of mortality for cassowaries and kiwis are trauma, and trauma and predation, respectively. Tinamous are prone to injury and trauma when startled or frightened and must be handled carefully to avoid fractures. Inflammatory Non-infectious Amyloidosis has been reported in rhea and in the liver and/or spleen in young ostriches with mycotic airsacculitis and pneumonia ( Akkoç et al., 2009 , Cowan, 1968 ). Histologically, eosinophilic homogenous material positive with Congo red staining expands sinusoids and is associated with hepatocyte degeneration and atrophy. In the spleen, the material is within the tunica media of and surrounds splenic blood vessels. The presence of amyloid A type fibrils has been confirmed using immunohistochemistry ( Akkoç et al., 2009 ). Miscellaneous Management-related factors are a major cause of mortality in captive ratite systems. In the hands of inexperienced ratite farmers, hatching, and neonatal chick survival rates can be abysmal. Improper egg collection and storage, incubation, and hatching parameters result in embryonic mortality and failure to hatch, weak and edematous hatched chicks, and poor chick viability. Acute generalized skeletal myopathy involving the complexus (pipping), hind limb, and costo-pulmonaris muscles has been described in newly hatched chicks and may be a result of exertion or physiologic difficulty at hatching ( Philbey et al., 1991 ). " Fading syndrome " and " gastric stasis " are major causes of stunted growth, wasting, and mortality in ostrich chicks up to 6 months of age; up to 70% of can be chicks affected to varying degrees. The cause is not fully understood but environmental parameters, maladaptation, and increased susceptibility to infectious agents are likely important factors ( Button et al., 1996; Huchzermeyer, 1998 , Ocal et al., 2006 ). Necropsy lesions are nonspecific but include emaciation and proventricular and ventricular changes including either lack of contents or distension without impaction, and mucosal hyperplasia and degeneration. Ratites are indiscriminate eaters and gastrointestinal impaction and gastrointestinal foreign bodies are; therefore, important causes of anorexia, wasting, and death in birds of all ages ( Reissig and Robles, 2001 ). Impaction with straw, shavings, coarse grass, and virtually any other ingestible substrate have been reported ( Fig. 26.8 A, B). Figure 26.8 Impaction in an ostrich. The proventriculus and ventriculus are markedly distended and filled with coarse roughage—unopened (A) and opened (B). (Photos Courtesy of M. Brash, Animal Health Laboratory [AHL], University of Guelph) Pneumoconiosis is common in captive kiwi and lesions can be marked. The condition is thought to be associated with dry, dusty substrates and enhanced by the birds' sniffing behavior during feeding and substrate investigation ( Smith et al., 1973 ). Miscellaneous conditions identified in tinamous held in zoos include a myocardial infarct, aortic and carotid atherosclerosis, vegetative valvular endocarditis associated with chronic sinus infection, oviductal egg impaction, and nephritis ( Griner, 1983 ). The pathologies in birds raised under more intensive conditions are somewhat different with uric acid nephrosis, amyloidosis, gastrointestinal foreign bodies, and the presence of the renal trematode Paratanaisia confusa and of Capillaria penidoi in the upper digestive tract as the most significant findings in one study of red-winged tinamous ( Momo, 2007 ). Neoplastic Neoplastic diseases have rarely been reported in Struthioniformes, with multicentric lymphoid neoplasia in ostriches most commonly described. Single cases of lymphoid leukemia and a monoclonal gammopathy also exist (additional descriptive details for lymphoid neoplasia in ratites can be found in the Supplemental Materials Table e3 ). There are no reports of immunohistochemical or other typing of neoplastic lymphocytes. Additionally, single cases of intrathoracic hemangiosarcoma ( Headley, 2005 ) and capillary-type pulmonary hemangioma ( Shathele et al., 2009 ) have been reported in young ostriches. Other neoplastic conditions undoubtedly exist but have not been formally described. Infectious diseases Infectious diseases, particularly as caused by "garden-variety" bacterial and fungal agents, are significant causes of embryonic death, poor hatchability, and deaths in neonatal and growing chicks. Deficiencies in hygiene during incubation and hatching, suboptimal incubation and hatching parameters leading to weak chicks and failure of the umbilicus to close, retained yolk sacs, and immunosuppression resulting from environmental stress predispose to infections. This is exemplified by a summation of pathologic findings in 59 tinamous of eight species in a North American zoo: bacterial infections, most commonly omphalitis with Escherichia coli and Pseudomonas spp., pneumonia and pulmonary aspergillosis, and esophageal candidiasis were among the noted conditions ( Griner, 1983 ). Viruses reported as frequent or significant causes of infection and/or disease are described later; brief descriptions of additional viral agents affecting ratites are listed in the Supplemental Materials Table e4 . DNA Viruses In 1992, an adenovirus outbreak caused 90%–100% mortality in ostrich chicks less than 2 months of age in Oklahoma, United States ( Raines and Meridian, 1993 ). Egg transmission was highly suspected. The most unique clinical symptom was foul smelling, gray chalky feces. Gross necropsy findings were nonspecific, including pulmonary congestion, pale foci in the liver, a pale spleen and airsacculitis. On microscopic examination, the most consistent lesions in chicks were splenic and bursal lymphoid depletion, hepatic necrosis, necrotic enteritis, and pulmonary congestion; adult hens laid chalky or wrinkled eggs ( Fig. 26.9 ) and one had evidence of hepatitis. An adenovirus was isolated from dead chicks, the yolk sac of a dead in-shell chick, and the trachea of healthy adult birds. Inclusion bodies consistent with adenovirus were not seen and the virus was not further characterized. Figure 26.9 Shell abnormalities in ostrich eggs. Malformed, wrinkled egg shells. The causes of this nonspecific change are poorly understood but are postulated to include viral infection, particularly with adenovirus and Newcastle disease virus, bacterial salpingitis, nutritional deficiencies or imbalances, and other abnormalities of the oviduct. In the United Kingdom, six adenoviruses similar to fowl adenovirus serotype 8 have been isolated from ostriches. The sources were the tracheas of an adult hen that laid eggs with chalky ridged shells and her mate, and the intestines of chicks with diarrhea ( Gough et al., 1997 ). In Italy, an adenovirus isolated from a 4-month-old ostrich chick was associated with an enlarged, nodular pancreas and hemorrhagic enteritis. Inoculation studies in young guinea fowl chicks produced severe pancreatic lesions, including tissue swelling and hardening, loss of acini and inflammation, and death. Intranuclear viral inclusions were present in surviving and regenerating cells. Restriction endonuclease analysis showed the virus to be similar to fowl adenovirus serotype 1 ( Capua et al., 1994 ). An avian pox virus was identified histologically and by sequencing as the cause of transient nodular cutaneous lesions in the skin of the legs of two immature North Island brown kiwi and near the beak in one of these ( Ha et al., 2013 ). The histopathologic lesions were classical, with epidermal hyperplasia, epithelial swelling, and eosinophilic intracytoplasmic viral inclusions (Bollinger bodies). RNA Viruses Several of the RNA viruses that affect ratites cause OIE listed reportable diseases. These are avian influenza virus ( AIV ), Newcastle disease virus ( Avian paramyxovirus 1 ), and eastern and western equine encephalitis viruses. Avian influenza virus infection has been reported in ostriches, emus, rheas, and a cassowary. Infection with a variety of viral strains including those of both high (H5 and H7; HPAI) and low pathogenicity occur frequently in farmed ostriches in South Africa ( Abolnik et al., 2016 ). Outbreaks are thought to result from exposure to wild birds. Clinical signs and pathology associated with AIV in ostriches in natural outbreaks and with experimental infection are variable. Mortality can be up to 100% and is dependent on age, virus strain, and secondary infections ( Allwright, 1996 , Capua et al., 2000 , Cooper et al., 2007 ). Chicks and juvenile birds are more susceptible to infection and develop more significant clinical disease than adults, who frequently appear unaffected. Clinical signs include anorexia, depression, and poor growth rates as well as green discoloration of the urine (biliverdinuria), swelling of the throat and neck, ocular discharge and sneezing and evidence of respiratory difficulty. Gross necropsy findings are nonspecific and can include serous atrophy of fat and muscle atrophy; luminal bile and bile staining of the upper gastrointestinal tract; hepatic bile stasis; congestion and mottling of the liver, spleen, kidneys, trachea and lungs; epicardial hemorrhages; and intestinal congestion to severe hemorrhagic enteritis. Histologic lesions also vary and include multifocal to diffuse necrosis of liver, spleen, and kidneys with a heterophilic response; pancreatic hemorrhage and necrosis with mononuclear cell inflammation; fibrinoid arteriolar necrosis and inflammation, particularly in spleen and brain; interstitial pneumonia; mild to marked air sacculitis; multifocal malacia and neuronophagia in the brain; and necrosis and hemorrhage in the intestine, particularly in the duodenum. Both gross and histologic lesions are affected by the presence of secondary infections, which have been prevalent in several reports. Infection with low pathogenic avian influenza viruses results in primarily a mild respiratory disease, with a reduction in egg production ( Cooper et al., 2007 ). In emus and rheas, respiratory disease is the predominant clinical presentation with HPAI H5N2 and H7N1 subtypes in the United States. Lesions are present in both the upper and lower respiratory tracts ( Panigrahy et al., 1995 , Woolcock et al., 2000 ). In China, an outbreak of low pathogenicity H9N2 influenza in emus was associated with 60% morbidity and 12.5% mortality ( Kang et al., 2006 ). Gross lesions included hyperemia and hemorrhage in the mucous membranes, edema and congestion of the lungs and cloaca, epicardial hemorrhage, hepatic and renal swelling, and widespread gastrointestinal hemorrhage. Histologic lesions included desquamation of the bronchial mucous membrane; myocardial necrosis; and local liquefactive necrosis, satellitosis and neuronophagia, perivascular cuffing, and hemorrhage in the brain. Standard methods of diagnosing AIV infection in ratites include PCR, virus isolation and typing, testing for pathogenicity in chickens, and standard serologic surveys. Tracheal swabs may be positive for virus earlier in disease than cloacal swabs ( Allwright, 1996 ). Newcastle disease virus ( Avian paramyxovirus 1 ) has been identified in ostriches in zoos and commercial operations in several countries. Like avian influenza viruses, this is an OIE listed reportable disease. Virus has been isolated from tissues of birds with and without a history of clinical disease, and there are no pathognomonic gross or microscopic lesions. Chicks and juveniles appear most susceptible to disease development, with sudden death as the most common presentation. In adult birds, the predominant clinical signs and lesions include edema of the head; mucoid sinusitis, tracheitis and air sacculitis; splenomegaly; epicardial petechial hemorrhages; and neurologic abnormalities. Histologic lesions include neuronal chromatolysis, endothelial cell hyperplasia, perivascular round cell cuffing, and multifocal gliosis, generally limited to the brainstem, and less frequently, splenic vascular necrosis with fibrin exudation or lymphoplasmacytic pancreatitis ( Huchzermeyer and Gerdes, 1993 ). Cerebrospinal fluid has been suggested as a source of material for direct EM, hemagglutination inhibition, and virus isolation, although this last can be difficult ( Allwright, 1996 ). Western equine encephalitis ( WEE ) is also an OIE listed reportable disease. Infection in emus is predominantly a neurologic disease with a reported morbidity of 10%–50% and mortality of approximately 10% ( Ayers et al., 1994 ; Randolph et al., 1994 ). Birds as young as 3 months of age can be affected. Clinical signs include depression, anorexia, and evidence of weakness and/or ataxia including muscle tremors, recumbency, and unnatural positioning of the head on the back (opisthotonus). Watery diarrhea, green urates, and pericardial effusion may also be present ( Ayers et al., 1994 ). Microscopic lesions in the brain include mild to moderate infiltrates of lymphocytes, plasma cells, heterophils, and/or histiocytic cells perivascularly and in the meninges. Neuronal satellitosis, increased numbers of oligodendroglia, and axonal degeneration and empty axon sheaths can also occur ( Randolph et al., 1994 ). Extensive vasculitis with necrosis and inflammation in a wide range of tissues is common. Diagnosis can be made by virus isolation and PCR. A single outbreak of WEE in rheas in the United States has been described. Diagnosis was based on seroconversion and response to vaccination ( Randolph, 1995 ). Clinical signs were generally non-specific and included anorexia, drowsiness, stupor, ataxia, hyperpnea, and loose stool for a period of 48–72 h prior to death. Twenty two of 90 birds died; at least 30 showed mild illness and recovered. Gross findings were restricted to mild hepato- and splenomegaly. On microscopic examination, there was mild multifocal subacute pericholangitis, diffuse hepatic sinusoidal leukocytosis and moderate diffuse splenic histiocytosis and plasmacytosis. Eastern equine encephalitis ( EEE ) is primarily a disease of emus. It can affect all ages of birds and has a mortality rate up to 87% in juveniles and adults. Death is frequently acute, but reported clinical signs include marked depression and bloody vomitus and diarrhea. The predominant gross necropsy findings include large amounts of blood in the small and large intestines and systemic serosal petechiation to ecchymoses ( Fig. 26.10 ). Histologically, consistent lesions include fibrinoid degeneration of splenic sheathed arterioles with necrosis of endothelial macrophages and diffuse lymphoid necrosis; hepatic congestion and hemorrhage with widespread hepatocellular necrosis; and changes in the intestinal lamina propria including the presence of large amounts of necrotic cellular debris, hemorrhage, a mild heterophilic infiltrate, and necrosis of lymphoid follicles. It is notable that lesions are not present in the central nervous system ( Brown et al., 1993 , Veazey et al., 1994 ). Emus experimentally infected as part of a vaccine trial developed severe clinical signs and shed virus in feces, oral secretions and regurgitated material; infection spread horizontally in the absence of mosquito vectors ( Tengelsen et al., 2001 ). Figure 26.10 Eastern equine encephalitis virus in an emu. Vasculitis resulting in multifocal petechial and ecchymotic hemorrhages is present along the serosal surfaces of the intestinal tract. (Photo Courtesy of L. Farina, College of Veterinary Medicine, University of Florida) Naturally occurring EEE infection has also been described in six captive cassowaries in the United States ( Guthrie et al., 2016 ). Both juvenile and adult birds were affected. Clinical signs included sudden death, lethargy, weakness, and ataxia and convulsions. Gross necropsy lesions included coelomitis and diarrhea. The most consistent histologic lesion was vasculitis in the liver and spleen. Mild lymphocytic encephalitis and hepatitis, splenitis, pneumonia, and nephritis were also seen. The presence of a number of intercurrent diseases had an impact on the range of pathologic changes. Notably, the affected cassowaries did not develop hemorrhagic enteritis. The diagnosis of EEE can be confirmed by virus isolation from tissues including liver, spleen, blood and brain; TEM; and PCR. Surviving birds develop both hemagglutinating and neutralizing antibodies; however, antibodies can also result from maternal transfer, inapparent infection, and vaccination ( Day and Stark, 1996 ). A prolonged outbreak of borna virus-associated neurologic disease occurred in ostrich chicks on a series of farms in Israel between 1988 and approximately 1993. Clinical signs included a brief period of incoordination followed by spastic paresis and eventually death due to secondary complications. Mortality varied but was up to 20%. There were no consistent gross lesions. Histologic lesions were restricted to the lumbosacral spinal cord and included neuronal degeneration and neuronophagia, infiltrating glial cells (satellitosis), and the formation of glial nodules. The disease was experimentally transmitted to ostrich chicks using the brains of infected chicks and on microscopic examination notable perivascular cuffing developed. Extensive laboratory investigation into the cause of the syndrome provided convincing evidence of infection by Borna disease virus ( Malkinson et al., 1995 ). Aquatic bird bornavirus-1 was identified as the cause of prolonged, subtle gastrointestinal, and neurologic clinical signs in an emu in a zoological park. Histopathologic lesions included marked lymphoplasmacytic encephalomyelitis with prominent perivascular cuffing, and multifocal neuritis associated with the gastrointestinal tract. The disease was assumed to have been transmitted from wild Canada geese ( Neilsen et al., 2017 ). Bacteria Bacterial infection is a common cause of embryonic death and of disease and mortality in young hatched ratite chicks. Yolk sac infection, generally due to ascending infection through an open umbilicus, is common in incubated chicks and can lead to bacteremia. Bacteria that cause localized (particularly respiratory and conjunctival), enteric, and systemic infection in ratites are no different from those that affect other species of birds and include a variety of Gram positive and Gram negative environmental and opportunistic organisms. Select bacterial diseases that are frequently reported in ratites or are of particular note are described in the Supplemental Materials Table e5 . These include diseases due to Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, C. difficile, C. chauvoei, Erysipelothrix rhusiopathiae, Brachyspira hyodysenteriae (also see Fig. 26.11 ) , Bordetella avium, B. bronchiseptica, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci, Lawsonia intracellularis, Hemophilus spp., Salmonella spp., and mycobacterial (also see Fig. 26.12 ) and mycoplasmal infections. Figure 26.11 Typhlitis in a common rhea. Fibrinous and necrotizing typhlitis is a common cause of mortality in young rheas in this age-group. It is associated with Brachyspira hyodysenteriae infection. (Photo Courtesy of M. Brash, AHL, University of Guelph) Figure 26.12 Mycobacteriosis in an ostrich. Esophageal and periesophageal granulomatous lesions are present in the thoracic region (heart on the left side of the image, esophagus centrally and on the right side). Large, caseous masses are seen more commonly with mycobacteriosis in ratites than in other frequently affected avian taxa. (Photo Courtesy of M. Brash, AHL, University of Guelph) Fungi Infection of the upper and lower respiratory systems with Aspergillus spp ., particularly A. fumigatus and A. niger , is a common cause of disease in captive ostriches, emus, and rhea ( Huchzermeyer, 1998 ). Outbreaks are frequent in young chicks (e.g., brooder pneumonia). Clinical signs and gross and pathologic lesions are similar to those in any avian species and include pale gray to yellow nodules and plaques in the lungs and air sacs ( Fig. 26.13 ). Histopathologic lesions are typical for avian aspergillosis, with central areas of necrosis that contain parallel-walled, dichotomously branching, fungal hyphae and conidia (at air interfaces) and are surrounded by heterophilic and granulomatous inflammation with multinucleate giant cells and (in chronic lesions) an outer layer of fibroblasts or granulation tissue. Fungal elements are often easily identified with routine hematoxylin and eosin staining; silver or PAS stains highlight the organisms. Aspergillus spp . have also been reported as the cause of dermatitis in ostriches. Lesions can be localized or extensive ( Kuttin and Perelman, 1996 ). Regardless of site, fungal culture is confirmatory and PCR can be used for additional characterization and differentiation of species. Predisposing factors to infection include contamination of eggs and hatcheries, overwhelming exposure to fungal spores through contaminated feed and bedding, and immunosuppression; high humidity and/or poor hygiene were associated husbandry conditions in cutaneous aspergillosis. Figure 26.13 Mycotic air sacculitis in an emu. Opaque nodular and plaque-like thickenings are present on serosal and air sac surfaces. Surrounding and underlying regions are covered by blue-green fungal growth. Infection of the upper digestive tract; the oral cavity, pharynx, and esophagus, by opportunistic yeasts is reported frequently in ostrich chicks and is primarily associated with Candida spp . Proliferative and necrotizing lesions containing intralesional 3–5 μm diameter yeast and interspersed nonseptate pseudohyphae or hyphae are characteristic. Organisms can be highlighted in histologic section with either silver or PAS staining. Overuse of antibiotics is a suspected predisposing factor ( Huchzermeyer, 1998 ) but infections can occur with no associated antibiotic administration. Lesions of proventricular and ventricular zygomycosis in ostrich chicks include mucosal erosion and ulceration, subserosal edema, hemorrhage, and intralesional fungus. A thick layer of mucus covering the lining of the ventriculus, a result of mucosal mucous cell hyperplasia, appears to be a characteristic finding ( Jeffrey et al., 1994; Kuttin and Perelman, 1996 ). Fungal hyphae are broad (6–20 μm diameter), irregular in appearance, pauciseptate, and branch at 45–90 degrees. As with other fungal organisms, the fungi can be highlighted with silver or PAS staining. Infection is considered opportunistic or secondary to lesions from proventricular and/or ventricular impaction. Macrorhabdus ornithogaster is an ascomycete yeast that is found in ostriches and common rhea and is associated with a clinical syndrome of failure to thrive and progressive emaciation despite an initially good appetite ( Huchzermeyer, 1998 , Martins et al., 2006 ). Mortality can be up to 100%. Gross necropsy findings include emaciation, a dilated but not impacted proventriculus, reduced digesta in the remainder of the gastrointestinal tract and, in some cases, erosion and ulceration of proventricular and ventricular mucosa. Organisms can be seen on fecal smears or proventricular or ventricular scrapings where they resemble oversized, elongate, rod-shaped bacteria. Histologically, they are present in the koilin where they appear as rigid, parallel, stacked rectangular structures. The organisms are Gram variable. Giemsa staining highlights the nuclei on cytology, and PAS and silver staining highlight the organisms in histologic sections. Associated inflammation is generally minimal. Fungal dermatitis has been infrequently reported in ratites. A dermatophyte with an endothrix pattern in feather shafts, possibly a Trichophyton sp ., resulted in feather loss and proliferative crusting lesions on the head and upper neck in several ostrich chicks ( Onderka and Doornenbal, 1992 ). Microsporum gypseum was described as a cause of rows of small cutaneous lesions that resulted in downgrading of skins from commercially raised ostriches in South Africa ( Huchzermeyer, 1998 ). Four cases of infection with Cryptococcus bacillisporus (previously C. neoformans var. gatti ) have been reported in North Island brown kiwi ( Hill et al., 1995 , Malik et al., 2003 ). Disease was limited to the respiratory tract in two cases and was disseminated in two. Multifocal to diffuse necrosis, hemorrhage, and histiocytic inflammation with intralesional fungus was present in affected organs, which included the heart, liver, kidney, oviduct, pancreas, proventriculus, and intestinal serosa. Organisms were spherical, 8 μm in diameter, and surrounded by a 1.6 μm capsule that could be highlighted by staining with PAS or Best's mucicarmine. Narrow-necked budding, a characteristic feature of Cryptococcus spp., was present. The low body temperature of the kiwi, the use of eucalyptus mulch, and the species' habit of sniffing while probing, were all considered as predisposing factors. Metazoa A small number of parasitic diseases are or have been associated with substantial morbidity and or mortality in ratites. As in any other species, intensive rearing of birds and environmental contamination increase the prevalence and severity of disease. Ratites will ingest the feces of other species, thus the presence of parasite eggs in their feces can reflect pseudoparasitism rather than true infection. Supplemental Table e6 contains a list of the major metazoan endoparasites that affect larger ratites along with their host/s, geographic distribution, and associated disease. Parasites of particular significance include: Libyostrongylus douglassii , Deletrocephalus dimidiatus , Codiostomum struthionis , and Houttuynia struthionis . The endoparasites of the kiwi were tabulated by McKenna (2010) ; additional details are provided later. The ingestion of earthworms, which serve as intermediate and paratenic hosts for many nematode parasites, may predispose to the range of helminth infections described in kiwi ( Clark, 1981 ). A variety of helminth parasites have also been recorded in both captive and free-ranging tinamous; thickened oral and esophageal mucosa and fetid diarrhea being the most common associated pathologic changes/signs ( Marques et al., 2012 , Silveira et al., 2001 ). Migration of aberrant parasites is a concern in all ratite species ( Fig. 26.14 A, B). Visceral larval migrans is frequently described in kiwi, most often in the North Island brown kiwi and most often as an incidental finding with granulomas containing fragments of or intact nematode larvae particularly in lung and liver ( van Zyl, 2014 ). Neural larval migrans has also been reported in the North Island brown kiwi, and is likely of greater clinical significance. The species of nematode(s) causing these lesions is unknown, but does not appear to be T. canis or T. cati . Figure 26.14 Larval migrans and associated encephalitis in the brain of an elegant crested tinamou. This is a common condition where raccoons have access to ratite food and bedding supplies. (A) Multiple cross sections of nematode larvae consistent with Baylisascaris procyonis (the enteric ascarid of the raccoon). Notable features in cross section include large body size (60–80 μm diameter), a prominent intestine with paired triangular lateral excretory columns, and paired lateral cuticular alae. (B) Perivascular lymphoplasmacytic infiltrates, gliosis, axonal degeneration, and neuropil vacuolation aretypical sequela to neural larval migrans. Lesions are most commonly present in the brainstem and central cerebellar white matter. Cutaneous larval migrans has been described in brown kiwi chicks held on a crèche island as part of a captive propagation program ( Gartrell et al., 2015 ). Infection was associated with feather loss, and a "scurfy" dermatitis was present in the abdominal area and along the vent margin. Histologically, there was mild to moderate epidermal hyperplasia and hyperkeratosis with perivascular and nodular lymphoid infiltrates; lower numbers of heterophils and eosinophils; and in some cases the presence of intraepithelial pustules, granulomas, and necrotic debris. Intralesional nematode larvae were identified, and were closely related to Trichostrongylus axei using DNA sequencing. It was speculated that the parasites might be of sea bird or marine mammal origin. Intraventricular Cyrnea apterycis (a spirurid nematode) and colonic Heterakis apterycis appear to be common incidental findings in kiwi ( Clark and McKenzie, 2009 ). Adult Toxocara cati have been identified in the small intestine of a North Island brown kiwi (this is the only report of adult worms of this species in an avian host) ( Clark and McKenzie, 2009 ). Protozoa The majority of information pertaining to enteric protozoa in ratites derives from the results of fecal examinations. In the absence of correlation to clinical signs or histologic lesions, it is difficult to associate these findings with disease. As well, the use of molecular techniques has shown that the morphologic identification of this group of parasites is often unreliable. Notable protozoal infections of ratites are described below (also see Supplemental Table e7 for a list of intestinal coccidia identified in the feces of large ratites). Intestinal and extraintestinal coccidia cause significant disease in both free-ranging and captive kiwi. Birds are commonly simultaneously infected with more than one species of parasite. Four Eimeria species have been described and additional species are suspected to occur in the North Island brown kiwi ( Morgan et al., 2017 ). One species, Eimeria kiwi is present in the intestinal epithelium. An unusual feature of infection is the presence of large macromeronts ( Morgan et al., 2012 ) ( Fig. 26.15 ). Other identified species include E. parairii (suspected to play a role in the development of colorectal polyps), E. mantelli (has been identified in feces but has not yet been associated with clinical disease), and E. apteryxii (causes renal coccidiosis in the North Island brown kiwi, rowi, and tokoeka) ( Morgan et al., 2012 , Morgan et al., 2017 , Thompson and Wright, 1978 ). Additionally, asexual stages of unknown coccidial species have been found in the liver, spleen, lung, and pancreas. Periodic acid Schiff staining of kidney to enhance parasite recognition is recommended as part of routine histopathologic examination ( Morgan et al., 2013 ). Eimeriosis has also been described in red-winged tinamous. Infection with the causative agent, E. rhynchoti , caused apathy and maldigested, fetid, pasty feces as well as duodenal hemorrhage and thickening ( Freitas et al., 2006 , Marques et al., 2012 ). Experimentally infected birds died between 1 and 6 days of patent infection. Figure 26.15 Enteric coccidiosis in a North Island brown kiwi. An Eimeria megalomerozoite (macromeront) is present in the villar lamina propria of the small intestine. Coccidiosis is an important cause of morbidity and mortality in young kiwi, with a number of incompletely described Eimeria species occurring intra- and extraintestinally. Macromeronts are an uncommon feature of avian coccidiosis. (Photo Courtesy of K. Morgan, Massey University) Cryptosporidia are frequent, incidental findings in the feces of apparently healthy ostriches, with greater prevalence in chicks and juvenile birds ( Wang et al., 2011 ). However, an associated syndrome of cloacal prolapse is well recognized in ostrich chicks, particularly males. Infection of epithelial cells in the distal rectum and cloaca results in mucosal swelling, epithelial hyperplasia, and mixed heterophilic and mononuclear cell inflammation in the lamina propria ( Penrith et al., 1994 , Santos et al., 2005 ). Infection with necrosis and inflammation may also occur in the pancreatic ductal epithelium ( Jardine and Verwoerd, 1997 ). Molecular investigations have identified Cryptosporidium baileyi and Cryptosporidium avian genotype II in ostriches ( Meireles et al., 2006; Wang et al., 2011 ). Disease has, thus far, only been associated with the latter organism; however, much of the literature predates the development of molecular methods for parasite identification. Histomonas meleagridis is a cause of severe necrotizing typhlitis, localized peritonitis, and focal hepatic necrosis in ostrich and rhea chicks. Lesions mimic those seen in domestic chickens (see Chapter 31) ( Borst and Lambers, 1985 , McMillan and Zellen, 1991 ). A wide variety of amoebae, ciliates, and flagellates have been identified in the feces and, less often, in intestinal smears from ratites without and occasionally with clinical enteric disease. Recent work has shown that Balantidium struthionis , originally described in a captive ostrich, is morphologically identical to B. coli with only minor differences in 18s-rRNA sequences; it should therefore more correctly be described as " B. coli -like" until further characterized ( Ponce-Gordo et al., 2008 ). These organisms have been associated with typhlitis and colitis in ostrich chicks in South Africa ( Huchzermeyer, 1998 ), but also appear to be part of the normal lower gastrointestinal tract fauna in healthy ratites. Leukocytozoon struthionis infection is common in young ostriches in South Africa. Myocarditis has been described in association with the presence of megaloschizonts, and initial infection can lead to anemia prior to the development of stable low level parasitemia. Plasmodium spp . have been identified in ratites without associated disease. Several protozoal hemoparasites have also been identified in kiwi. The death of a single wild-born juvenile North Island brown kiwi due to disseminated protozoal infection led to the identification of Plasmodium elongatum in North Island brown kiwi and rowi that were part of captive breeding and captive-rearing crèche programs ( Banda et al., 2013 ). Early trophozoites were present in blood smears collected at the time, with a prevalence of 68% by microscopy and 78% by PCR. Parasitemias were low, and subsequent testing did not show the continuing presence of the parasite. The most severe histologic lesion in the sentinel bird was severe interstitial pneumonia, with congestion, edema, and small blood vessel thrombosis. Hypertrophied pulmonary endothelial cells, hepatic Kupffer cells, and macrophages in the lung, liver, and spleen contained intracytoplasmic merozoites or hemozoin (hemoglobin breakdown product). Babesia kiwiensis , a novel, intraerythrocytic parasite, has been identified in both captive and free-living North Island brown kiwi chicks ( Jefferies et al., 2008 , Peirce et al., 2003 ). Parasites were present as ring forms, schizonts, and merozoites within erythrocyte cytoplasm, without displacing the host nucleus. Single birds were coinfected with Hepatozoon kiwii , also a new species. The oval or elongated gametocytes of H. kiwii were present in the cytoplasm of monocytes and, less frequently, lymphocytes, where they distorted and compressed the nucleus of the host cell. Ixodes anatis , also known as the kiwi tick, is commonly found on kiwi and is postulated as a vector for these organisms. The significance of these infections is currently unknown. Ectoparasites Lice and mites are common ectoparasites of ostriches and rheas worldwide ( Craig and Diamond, 1996 , Huchzermeyer, 1998 , Mohammed and Malang, 2015 ). Struthiolipeurus struthionis , the ostrich louse , feeds on the body scales and feather debris of ostriches and causes irritation and pruritis. Adult lice are 3–4 mm long and readily visible; eggs (nits) can be found on the underside of feathers attached to the barbs near the shaft. They live in the groove of the shaft and feed on the pulp of growing feathers. Parasite feeding and excessive grooming can lead to feather damage and loss. Acute parasitic, cystic, lymphoplasmacytic dermatitis, nodular trombiculinosis , has been described in a juvenile ostrich in Brazil as a result of infestation with the trombiculinid mite Apolonia tigipioensis ( Ornelas-Almeida et al., 2007 ) (also see Supplemental Table e8 for a list of additional select lice and mites of large ratites). In addition to lice and mites, international importations of ostriches and in-contact birds should be examined for the presence of ticks as a range of species of ectoparasitic arthropods have been identified on birds imported from Africa and Europe ( Mertins and Schlater, 1991 ). Feeding by hippoboscid flies and black flies ( Simulium spp .) can cause irritation and anemia, and severe dermatitis and conjunctivitis has been described in ostriches swarmed by thrips ( Limothrips denticornis ) ( Cooper, 2007b; Huchzermeyer, 1998 ). Tinamous are commonly infected by one or more species of ectoparasite, with up to 15 species reported from a single great tinamou ( Marques et al., 2012 ). Kiwi can host several species of ticks; eight species of chewing lice and five species of feather mites have also been identified ( Heath, 2010 ). The significance of ectoparasitism in these two groups of birds is unclear. Prions A spongiform encephalopathy similar to that seen with prion disease has been described in ostriches and emus in Germany. Neurological signs were present in most, but not all birds. Lesions included marked vacuolation of the neuropil in the brain stem and medulla, as well as neuronal cytoplasmic vacuolation, particularly in the red and vestibular nuclei and the reticular formation. Mild gliosis, isolated necrotic neurons, and neuronophagia were present in the anterior brainstem. The prion protein PrP was not identified in these cases using IHC labeling ( Bello et al., 2017 ). DNA Viruses In 1992, an adenovirus outbreak caused 90%–100% mortality in ostrich chicks less than 2 months of age in Oklahoma, United States ( Raines and Meridian, 1993 ). Egg transmission was highly suspected. The most unique clinical symptom was foul smelling, gray chalky feces. Gross necropsy findings were nonspecific, including pulmonary congestion, pale foci in the liver, a pale spleen and airsacculitis. On microscopic examination, the most consistent lesions in chicks were splenic and bursal lymphoid depletion, hepatic necrosis, necrotic enteritis, and pulmonary congestion; adult hens laid chalky or wrinkled eggs ( Fig. 26.9 ) and one had evidence of hepatitis. An adenovirus was isolated from dead chicks, the yolk sac of a dead in-shell chick, and the trachea of healthy adult birds. Inclusion bodies consistent with adenovirus were not seen and the virus was not further characterized. Figure 26.9 Shell abnormalities in ostrich eggs. Malformed, wrinkled egg shells. The causes of this nonspecific change are poorly understood but are postulated to include viral infection, particularly with adenovirus and Newcastle disease virus, bacterial salpingitis, nutritional deficiencies or imbalances, and other abnormalities of the oviduct. In the United Kingdom, six adenoviruses similar to fowl adenovirus serotype 8 have been isolated from ostriches. The sources were the tracheas of an adult hen that laid eggs with chalky ridged shells and her mate, and the intestines of chicks with diarrhea ( Gough et al., 1997 ). In Italy, an adenovirus isolated from a 4-month-old ostrich chick was associated with an enlarged, nodular pancreas and hemorrhagic enteritis. Inoculation studies in young guinea fowl chicks produced severe pancreatic lesions, including tissue swelling and hardening, loss of acini and inflammation, and death. Intranuclear viral inclusions were present in surviving and regenerating cells. Restriction endonuclease analysis showed the virus to be similar to fowl adenovirus serotype 1 ( Capua et al., 1994 ). An avian pox virus was identified histologically and by sequencing as the cause of transient nodular cutaneous lesions in the skin of the legs of two immature North Island brown kiwi and near the beak in one of these ( Ha et al., 2013 ). The histopathologic lesions were classical, with epidermal hyperplasia, epithelial swelling, and eosinophilic intracytoplasmic viral inclusions (Bollinger bodies). RNA Viruses Several of the RNA viruses that affect ratites cause OIE listed reportable diseases. These are avian influenza virus ( AIV ), Newcastle disease virus ( Avian paramyxovirus 1 ), and eastern and western equine encephalitis viruses. Avian influenza virus infection has been reported in ostriches, emus, rheas, and a cassowary. Infection with a variety of viral strains including those of both high (H5 and H7; HPAI) and low pathogenicity occur frequently in farmed ostriches in South Africa ( Abolnik et al., 2016 ). Outbreaks are thought to result from exposure to wild birds. Clinical signs and pathology associated with AIV in ostriches in natural outbreaks and with experimental infection are variable. Mortality can be up to 100% and is dependent on age, virus strain, and secondary infections ( Allwright, 1996 , Capua et al., 2000 , Cooper et al., 2007 ). Chicks and juvenile birds are more susceptible to infection and develop more significant clinical disease than adults, who frequently appear unaffected. Clinical signs include anorexia, depression, and poor growth rates as well as green discoloration of the urine (biliverdinuria), swelling of the throat and neck, ocular discharge and sneezing and evidence of respiratory difficulty. Gross necropsy findings are nonspecific and can include serous atrophy of fat and muscle atrophy; luminal bile and bile staining of the upper gastrointestinal tract; hepatic bile stasis; congestion and mottling of the liver, spleen, kidneys, trachea and lungs; epicardial hemorrhages; and intestinal congestion to severe hemorrhagic enteritis. Histologic lesions also vary and include multifocal to diffuse necrosis of liver, spleen, and kidneys with a heterophilic response; pancreatic hemorrhage and necrosis with mononuclear cell inflammation; fibrinoid arteriolar necrosis and inflammation, particularly in spleen and brain; interstitial pneumonia; mild to marked air sacculitis; multifocal malacia and neuronophagia in the brain; and necrosis and hemorrhage in the intestine, particularly in the duodenum. Both gross and histologic lesions are affected by the presence of secondary infections, which have been prevalent in several reports. Infection with low pathogenic avian influenza viruses results in primarily a mild respiratory disease, with a reduction in egg production ( Cooper et al., 2007 ). In emus and rheas, respiratory disease is the predominant clinical presentation with HPAI H5N2 and H7N1 subtypes in the United States. Lesions are present in both the upper and lower respiratory tracts ( Panigrahy et al., 1995 , Woolcock et al., 2000 ). In China, an outbreak of low pathogenicity H9N2 influenza in emus was associated with 60% morbidity and 12.5% mortality ( Kang et al., 2006 ). Gross lesions included hyperemia and hemorrhage in the mucous membranes, edema and congestion of the lungs and cloaca, epicardial hemorrhage, hepatic and renal swelling, and widespread gastrointestinal hemorrhage. Histologic lesions included desquamation of the bronchial mucous membrane; myocardial necrosis; and local liquefactive necrosis, satellitosis and neuronophagia, perivascular cuffing, and hemorrhage in the brain. Standard methods of diagnosing AIV infection in ratites include PCR, virus isolation and typing, testing for pathogenicity in chickens, and standard serologic surveys. Tracheal swabs may be positive for virus earlier in disease than cloacal swabs ( Allwright, 1996 ). Newcastle disease virus ( Avian paramyxovirus 1 ) has been identified in ostriches in zoos and commercial operations in several countries. Like avian influenza viruses, this is an OIE listed reportable disease. Virus has been isolated from tissues of birds with and without a history of clinical disease, and there are no pathognomonic gross or microscopic lesions. Chicks and juveniles appear most susceptible to disease development, with sudden death as the most common presentation. In adult birds, the predominant clinical signs and lesions include edema of the head; mucoid sinusitis, tracheitis and air sacculitis; splenomegaly; epicardial petechial hemorrhages; and neurologic abnormalities. Histologic lesions include neuronal chromatolysis, endothelial cell hyperplasia, perivascular round cell cuffing, and multifocal gliosis, generally limited to the brainstem, and less frequently, splenic vascular necrosis with fibrin exudation or lymphoplasmacytic pancreatitis ( Huchzermeyer and Gerdes, 1993 ). Cerebrospinal fluid has been suggested as a source of material for direct EM, hemagglutination inhibition, and virus isolation, although this last can be difficult ( Allwright, 1996 ). Western equine encephalitis ( WEE ) is also an OIE listed reportable disease. Infection in emus is predominantly a neurologic disease with a reported morbidity of 10%–50% and mortality of approximately 10% ( Ayers et al., 1994 ; Randolph et al., 1994 ). Birds as young as 3 months of age can be affected. Clinical signs include depression, anorexia, and evidence of weakness and/or ataxia including muscle tremors, recumbency, and unnatural positioning of the head on the back (opisthotonus). Watery diarrhea, green urates, and pericardial effusion may also be present ( Ayers et al., 1994 ). Microscopic lesions in the brain include mild to moderate infiltrates of lymphocytes, plasma cells, heterophils, and/or histiocytic cells perivascularly and in the meninges. Neuronal satellitosis, increased numbers of oligodendroglia, and axonal degeneration and empty axon sheaths can also occur ( Randolph et al., 1994 ). Extensive vasculitis with necrosis and inflammation in a wide range of tissues is common. Diagnosis can be made by virus isolation and PCR. A single outbreak of WEE in rheas in the United States has been described. Diagnosis was based on seroconversion and response to vaccination ( Randolph, 1995 ). Clinical signs were generally non-specific and included anorexia, drowsiness, stupor, ataxia, hyperpnea, and loose stool for a period of 48–72 h prior to death. Twenty two of 90 birds died; at least 30 showed mild illness and recovered. Gross findings were restricted to mild hepato- and splenomegaly. On microscopic examination, there was mild multifocal subacute pericholangitis, diffuse hepatic sinusoidal leukocytosis and moderate diffuse splenic histiocytosis and plasmacytosis. Eastern equine encephalitis ( EEE ) is primarily a disease of emus. It can affect all ages of birds and has a mortality rate up to 87% in juveniles and adults. Death is frequently acute, but reported clinical signs include marked depression and bloody vomitus and diarrhea. The predominant gross necropsy findings include large amounts of blood in the small and large intestines and systemic serosal petechiation to ecchymoses ( Fig. 26.10 ). Histologically, consistent lesions include fibrinoid degeneration of splenic sheathed arterioles with necrosis of endothelial macrophages and diffuse lymphoid necrosis; hepatic congestion and hemorrhage with widespread hepatocellular necrosis; and changes in the intestinal lamina propria including the presence of large amounts of necrotic cellular debris, hemorrhage, a mild heterophilic infiltrate, and necrosis of lymphoid follicles. It is notable that lesions are not present in the central nervous system ( Brown et al., 1993 , Veazey et al., 1994 ). Emus experimentally infected as part of a vaccine trial developed severe clinical signs and shed virus in feces, oral secretions and regurgitated material; infection spread horizontally in the absence of mosquito vectors ( Tengelsen et al., 2001 ). Figure 26.10 Eastern equine encephalitis virus in an emu. Vasculitis resulting in multifocal petechial and ecchymotic hemorrhages is present along the serosal surfaces of the intestinal tract. (Photo Courtesy of L. Farina, College of Veterinary Medicine, University of Florida) Naturally occurring EEE infection has also been described in six captive cassowaries in the United States ( Guthrie et al., 2016 ). Both juvenile and adult birds were affected. Clinical signs included sudden death, lethargy, weakness, and ataxia and convulsions. Gross necropsy lesions included coelomitis and diarrhea. The most consistent histologic lesion was vasculitis in the liver and spleen. Mild lymphocytic encephalitis and hepatitis, splenitis, pneumonia, and nephritis were also seen. The presence of a number of intercurrent diseases had an impact on the range of pathologic changes. Notably, the affected cassowaries did not develop hemorrhagic enteritis. The diagnosis of EEE can be confirmed by virus isolation from tissues including liver, spleen, blood and brain; TEM; and PCR. Surviving birds develop both hemagglutinating and neutralizing antibodies; however, antibodies can also result from maternal transfer, inapparent infection, and vaccination ( Day and Stark, 1996 ). A prolonged outbreak of borna virus-associated neurologic disease occurred in ostrich chicks on a series of farms in Israel between 1988 and approximately 1993. Clinical signs included a brief period of incoordination followed by spastic paresis and eventually death due to secondary complications. Mortality varied but was up to 20%. There were no consistent gross lesions. Histologic lesions were restricted to the lumbosacral spinal cord and included neuronal degeneration and neuronophagia, infiltrating glial cells (satellitosis), and the formation of glial nodules. The disease was experimentally transmitted to ostrich chicks using the brains of infected chicks and on microscopic examination notable perivascular cuffing developed. Extensive laboratory investigation into the cause of the syndrome provided convincing evidence of infection by Borna disease virus ( Malkinson et al., 1995 ). Aquatic bird bornavirus-1 was identified as the cause of prolonged, subtle gastrointestinal, and neurologic clinical signs in an emu in a zoological park. Histopathologic lesions included marked lymphoplasmacytic encephalomyelitis with prominent perivascular cuffing, and multifocal neuritis associated with the gastrointestinal tract. The disease was assumed to have been transmitted from wild Canada geese ( Neilsen et al., 2017 ). Bacteria Bacterial infection is a common cause of embryonic death and of disease and mortality in young hatched ratite chicks. Yolk sac infection, generally due to ascending infection through an open umbilicus, is common in incubated chicks and can lead to bacteremia. Bacteria that cause localized (particularly respiratory and conjunctival), enteric, and systemic infection in ratites are no different from those that affect other species of birds and include a variety of Gram positive and Gram negative environmental and opportunistic organisms. Select bacterial diseases that are frequently reported in ratites or are of particular note are described in the Supplemental Materials Table e5 . These include diseases due to Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, C. difficile, C. chauvoei, Erysipelothrix rhusiopathiae, Brachyspira hyodysenteriae (also see Fig. 26.11 ) , Bordetella avium, B. bronchiseptica, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci, Lawsonia intracellularis, Hemophilus spp., Salmonella spp., and mycobacterial (also see Fig. 26.12 ) and mycoplasmal infections. Figure 26.11 Typhlitis in a common rhea. Fibrinous and necrotizing typhlitis is a common cause of mortality in young rheas in this age-group. It is associated with Brachyspira hyodysenteriae infection. (Photo Courtesy of M. Brash, AHL, University of Guelph) Figure 26.12 Mycobacteriosis in an ostrich. Esophageal and periesophageal granulomatous lesions are present in the thoracic region (heart on the left side of the image, esophagus centrally and on the right side). Large, caseous masses are seen more commonly with mycobacteriosis in ratites than in other frequently affected avian taxa. (Photo Courtesy of M. Brash, AHL, University of Guelph) Fungi Infection of the upper and lower respiratory systems with Aspergillus spp ., particularly A. fumigatus and A. niger , is a common cause of disease in captive ostriches, emus, and rhea ( Huchzermeyer, 1998 ). Outbreaks are frequent in young chicks (e.g., brooder pneumonia). Clinical signs and gross and pathologic lesions are similar to those in any avian species and include pale gray to yellow nodules and plaques in the lungs and air sacs ( Fig. 26.13 ). Histopathologic lesions are typical for avian aspergillosis, with central areas of necrosis that contain parallel-walled, dichotomously branching, fungal hyphae and conidia (at air interfaces) and are surrounded by heterophilic and granulomatous inflammation with multinucleate giant cells and (in chronic lesions) an outer layer of fibroblasts or granulation tissue. Fungal elements are often easily identified with routine hematoxylin and eosin staining; silver or PAS stains highlight the organisms. Aspergillus spp . have also been reported as the cause of dermatitis in ostriches. Lesions can be localized or extensive ( Kuttin and Perelman, 1996 ). Regardless of site, fungal culture is confirmatory and PCR can be used for additional characterization and differentiation of species. Predisposing factors to infection include contamination of eggs and hatcheries, overwhelming exposure to fungal spores through contaminated feed and bedding, and immunosuppression; high humidity and/or poor hygiene were associated husbandry conditions in cutaneous aspergillosis. Figure 26.13 Mycotic air sacculitis in an emu. Opaque nodular and plaque-like thickenings are present on serosal and air sac surfaces. Surrounding and underlying regions are covered by blue-green fungal growth. Infection of the upper digestive tract; the oral cavity, pharynx, and esophagus, by opportunistic yeasts is reported frequently in ostrich chicks and is primarily associated with Candida spp . Proliferative and necrotizing lesions containing intralesional 3–5 μm diameter yeast and interspersed nonseptate pseudohyphae or hyphae are characteristic. Organisms can be highlighted in histologic section with either silver or PAS staining. Overuse of antibiotics is a suspected predisposing factor ( Huchzermeyer, 1998 ) but infections can occur with no associated antibiotic administration. Lesions of proventricular and ventricular zygomycosis in ostrich chicks include mucosal erosion and ulceration, subserosal edema, hemorrhage, and intralesional fungus. A thick layer of mucus covering the lining of the ventriculus, a result of mucosal mucous cell hyperplasia, appears to be a characteristic finding ( Jeffrey et al., 1994; Kuttin and Perelman, 1996 ). Fungal hyphae are broad (6–20 μm diameter), irregular in appearance, pauciseptate, and branch at 45–90 degrees. As with other fungal organisms, the fungi can be highlighted with silver or PAS staining. Infection is considered opportunistic or secondary to lesions from proventricular and/or ventricular impaction. Macrorhabdus ornithogaster is an ascomycete yeast that is found in ostriches and common rhea and is associated with a clinical syndrome of failure to thrive and progressive emaciation despite an initially good appetite ( Huchzermeyer, 1998 , Martins et al., 2006 ). Mortality can be up to 100%. Gross necropsy findings include emaciation, a dilated but not impacted proventriculus, reduced digesta in the remainder of the gastrointestinal tract and, in some cases, erosion and ulceration of proventricular and ventricular mucosa. Organisms can be seen on fecal smears or proventricular or ventricular scrapings where they resemble oversized, elongate, rod-shaped bacteria. Histologically, they are present in the koilin where they appear as rigid, parallel, stacked rectangular structures. The organisms are Gram variable. Giemsa staining highlights the nuclei on cytology, and PAS and silver staining highlight the organisms in histologic sections. Associated inflammation is generally minimal. Fungal dermatitis has been infrequently reported in ratites. A dermatophyte with an endothrix pattern in feather shafts, possibly a Trichophyton sp ., resulted in feather loss and proliferative crusting lesions on the head and upper neck in several ostrich chicks ( Onderka and Doornenbal, 1992 ). Microsporum gypseum was described as a cause of rows of small cutaneous lesions that resulted in downgrading of skins from commercially raised ostriches in South Africa ( Huchzermeyer, 1998 ). Four cases of infection with Cryptococcus bacillisporus (previously C. neoformans var. gatti ) have been reported in North Island brown kiwi ( Hill et al., 1995 , Malik et al., 2003 ). Disease was limited to the respiratory tract in two cases and was disseminated in two. Multifocal to diffuse necrosis, hemorrhage, and histiocytic inflammation with intralesional fungus was present in affected organs, which included the heart, liver, kidney, oviduct, pancreas, proventriculus, and intestinal serosa. Organisms were spherical, 8 μm in diameter, and surrounded by a 1.6 μm capsule that could be highlighted by staining with PAS or Best's mucicarmine. Narrow-necked budding, a characteristic feature of Cryptococcus spp., was present. The low body temperature of the kiwi, the use of eucalyptus mulch, and the species' habit of sniffing while probing, were all considered as predisposing factors. Metazoa A small number of parasitic diseases are or have been associated with substantial morbidity and or mortality in ratites. As in any other species, intensive rearing of birds and environmental contamination increase the prevalence and severity of disease. Ratites will ingest the feces of other species, thus the presence of parasite eggs in their feces can reflect pseudoparasitism rather than true infection. Supplemental Table e6 contains a list of the major metazoan endoparasites that affect larger ratites along with their host/s, geographic distribution, and associated disease. Parasites of particular significance include: Libyostrongylus douglassii , Deletrocephalus dimidiatus , Codiostomum struthionis , and Houttuynia struthionis . The endoparasites of the kiwi were tabulated by McKenna (2010) ; additional details are provided later. The ingestion of earthworms, which serve as intermediate and paratenic hosts for many nematode parasites, may predispose to the range of helminth infections described in kiwi ( Clark, 1981 ). A variety of helminth parasites have also been recorded in both captive and free-ranging tinamous; thickened oral and esophageal mucosa and fetid diarrhea being the most common associated pathologic changes/signs ( Marques et al., 2012 , Silveira et al., 2001 ). Migration of aberrant parasites is a concern in all ratite species ( Fig. 26.14 A, B). Visceral larval migrans is frequently described in kiwi, most often in the North Island brown kiwi and most often as an incidental finding with granulomas containing fragments of or intact nematode larvae particularly in lung and liver ( van Zyl, 2014 ). Neural larval migrans has also been reported in the North Island brown kiwi, and is likely of greater clinical significance. The species of nematode(s) causing these lesions is unknown, but does not appear to be T. canis or T. cati . Figure 26.14 Larval migrans and associated encephalitis in the brain of an elegant crested tinamou. This is a common condition where raccoons have access to ratite food and bedding supplies. (A) Multiple cross sections of nematode larvae consistent with Baylisascaris procyonis (the enteric ascarid of the raccoon). Notable features in cross section include large body size (60–80 μm diameter), a prominent intestine with paired triangular lateral excretory columns, and paired lateral cuticular alae. (B) Perivascular lymphoplasmacytic infiltrates, gliosis, axonal degeneration, and neuropil vacuolation aretypical sequela to neural larval migrans. Lesions are most commonly present in the brainstem and central cerebellar white matter. Cutaneous larval migrans has been described in brown kiwi chicks held on a crèche island as part of a captive propagation program ( Gartrell et al., 2015 ). Infection was associated with feather loss, and a "scurfy" dermatitis was present in the abdominal area and along the vent margin. Histologically, there was mild to moderate epidermal hyperplasia and hyperkeratosis with perivascular and nodular lymphoid infiltrates; lower numbers of heterophils and eosinophils; and in some cases the presence of intraepithelial pustules, granulomas, and necrotic debris. Intralesional nematode larvae were identified, and were closely related to Trichostrongylus axei using DNA sequencing. It was speculated that the parasites might be of sea bird or marine mammal origin. Intraventricular Cyrnea apterycis (a spirurid nematode) and colonic Heterakis apterycis appear to be common incidental findings in kiwi ( Clark and McKenzie, 2009 ). Adult Toxocara cati have been identified in the small intestine of a North Island brown kiwi (this is the only report of adult worms of this species in an avian host) ( Clark and McKenzie, 2009 ). Protozoa The majority of information pertaining to enteric protozoa in ratites derives from the results of fecal examinations. In the absence of correlation to clinical signs or histologic lesions, it is difficult to associate these findings with disease. As well, the use of molecular techniques has shown that the morphologic identification of this group of parasites is often unreliable. Notable protozoal infections of ratites are described below (also see Supplemental Table e7 for a list of intestinal coccidia identified in the feces of large ratites). Intestinal and extraintestinal coccidia cause significant disease in both free-ranging and captive kiwi. Birds are commonly simultaneously infected with more than one species of parasite. Four Eimeria species have been described and additional species are suspected to occur in the North Island brown kiwi ( Morgan et al., 2017 ). One species, Eimeria kiwi is present in the intestinal epithelium. An unusual feature of infection is the presence of large macromeronts ( Morgan et al., 2012 ) ( Fig. 26.15 ). Other identified species include E. parairii (suspected to play a role in the development of colorectal polyps), E. mantelli (has been identified in feces but has not yet been associated with clinical disease), and E. apteryxii (causes renal coccidiosis in the North Island brown kiwi, rowi, and tokoeka) ( Morgan et al., 2012 , Morgan et al., 2017 , Thompson and Wright, 1978 ). Additionally, asexual stages of unknown coccidial species have been found in the liver, spleen, lung, and pancreas. Periodic acid Schiff staining of kidney to enhance parasite recognition is recommended as part of routine histopathologic examination ( Morgan et al., 2013 ). Eimeriosis has also been described in red-winged tinamous. Infection with the causative agent, E. rhynchoti , caused apathy and maldigested, fetid, pasty feces as well as duodenal hemorrhage and thickening ( Freitas et al., 2006 , Marques et al., 2012 ). Experimentally infected birds died between 1 and 6 days of patent infection. Figure 26.15 Enteric coccidiosis in a North Island brown kiwi. An Eimeria megalomerozoite (macromeront) is present in the villar lamina propria of the small intestine. Coccidiosis is an important cause of morbidity and mortality in young kiwi, with a number of incompletely described Eimeria species occurring intra- and extraintestinally. Macromeronts are an uncommon feature of avian coccidiosis. (Photo Courtesy of K. Morgan, Massey University) Cryptosporidia are frequent, incidental findings in the feces of apparently healthy ostriches, with greater prevalence in chicks and juvenile birds ( Wang et al., 2011 ). However, an associated syndrome of cloacal prolapse is well recognized in ostrich chicks, particularly males. Infection of epithelial cells in the distal rectum and cloaca results in mucosal swelling, epithelial hyperplasia, and mixed heterophilic and mononuclear cell inflammation in the lamina propria ( Penrith et al., 1994 , Santos et al., 2005 ). Infection with necrosis and inflammation may also occur in the pancreatic ductal epithelium ( Jardine and Verwoerd, 1997 ). Molecular investigations have identified Cryptosporidium baileyi and Cryptosporidium avian genotype II in ostriches ( Meireles et al., 2006; Wang et al., 2011 ). Disease has, thus far, only been associated with the latter organism; however, much of the literature predates the development of molecular methods for parasite identification. Histomonas meleagridis is a cause of severe necrotizing typhlitis, localized peritonitis, and focal hepatic necrosis in ostrich and rhea chicks. Lesions mimic those seen in domestic chickens (see Chapter 31) ( Borst and Lambers, 1985 , McMillan and Zellen, 1991 ). A wide variety of amoebae, ciliates, and flagellates have been identified in the feces and, less often, in intestinal smears from ratites without and occasionally with clinical enteric disease. Recent work has shown that Balantidium struthionis , originally described in a captive ostrich, is morphologically identical to B. coli with only minor differences in 18s-rRNA sequences; it should therefore more correctly be described as " B. coli -like" until further characterized ( Ponce-Gordo et al., 2008 ). These organisms have been associated with typhlitis and colitis in ostrich chicks in South Africa ( Huchzermeyer, 1998 ), but also appear to be part of the normal lower gastrointestinal tract fauna in healthy ratites. Leukocytozoon struthionis infection is common in young ostriches in South Africa. Myocarditis has been described in association with the presence of megaloschizonts, and initial infection can lead to anemia prior to the development of stable low level parasitemia. Plasmodium spp . have been identified in ratites without associated disease. Several protozoal hemoparasites have also been identified in kiwi. The death of a single wild-born juvenile North Island brown kiwi due to disseminated protozoal infection led to the identification of Plasmodium elongatum in North Island brown kiwi and rowi that were part of captive breeding and captive-rearing crèche programs ( Banda et al., 2013 ). Early trophozoites were present in blood smears collected at the time, with a prevalence of 68% by microscopy and 78% by PCR. Parasitemias were low, and subsequent testing did not show the continuing presence of the parasite. The most severe histologic lesion in the sentinel bird was severe interstitial pneumonia, with congestion, edema, and small blood vessel thrombosis. Hypertrophied pulmonary endothelial cells, hepatic Kupffer cells, and macrophages in the lung, liver, and spleen contained intracytoplasmic merozoites or hemozoin (hemoglobin breakdown product). Babesia kiwiensis , a novel, intraerythrocytic parasite, has been identified in both captive and free-living North Island brown kiwi chicks ( Jefferies et al., 2008 , Peirce et al., 2003 ). Parasites were present as ring forms, schizonts, and merozoites within erythrocyte cytoplasm, without displacing the host nucleus. Single birds were coinfected with Hepatozoon kiwii , also a new species. The oval or elongated gametocytes of H. kiwii were present in the cytoplasm of monocytes and, less frequently, lymphocytes, where they distorted and compressed the nucleus of the host cell. Ixodes anatis , also known as the kiwi tick, is commonly found on kiwi and is postulated as a vector for these organisms. The significance of these infections is currently unknown. Ectoparasites Lice and mites are common ectoparasites of ostriches and rheas worldwide ( Craig and Diamond, 1996 , Huchzermeyer, 1998 , Mohammed and Malang, 2015 ). Struthiolipeurus struthionis , the ostrich louse , feeds on the body scales and feather debris of ostriches and causes irritation and pruritis. Adult lice are 3–4 mm long and readily visible; eggs (nits) can be found on the underside of feathers attached to the barbs near the shaft. They live in the groove of the shaft and feed on the pulp of growing feathers. Parasite feeding and excessive grooming can lead to feather damage and loss. Acute parasitic, cystic, lymphoplasmacytic dermatitis, nodular trombiculinosis , has been described in a juvenile ostrich in Brazil as a result of infestation with the trombiculinid mite Apolonia tigipioensis ( Ornelas-Almeida et al., 2007 ) (also see Supplemental Table e8 for a list of additional select lice and mites of large ratites). In addition to lice and mites, international importations of ostriches and in-contact birds should be examined for the presence of ticks as a range of species of ectoparasitic arthropods have been identified on birds imported from Africa and Europe ( Mertins and Schlater, 1991 ). Feeding by hippoboscid flies and black flies ( Simulium spp .) can cause irritation and anemia, and severe dermatitis and conjunctivitis has been described in ostriches swarmed by thrips ( Limothrips denticornis ) ( Cooper, 2007b; Huchzermeyer, 1998 ). Tinamous are commonly infected by one or more species of ectoparasite, with up to 15 species reported from a single great tinamou ( Marques et al., 2012 ). Kiwi can host several species of ticks; eight species of chewing lice and five species of feather mites have also been identified ( Heath, 2010 ). The significance of ectoparasitism in these two groups of birds is unclear. Prions A spongiform encephalopathy similar to that seen with prion disease has been described in ostriches and emus in Germany. Neurological signs were present in most, but not all birds. Lesions included marked vacuolation of the neuropil in the brain stem and medulla, as well as neuronal cytoplasmic vacuolation, particularly in the red and vestibular nuclei and the reticular formation. Mild gliosis, isolated necrotic neurons, and neuronophagia were present in the anterior brainstem. The prion protein PrP was not identified in these cases using IHC labeling ( Bello et al., 2017 ). E-Slides 26.e1 Avian bornavirus encephalitis, emu, brain. There is widespread lymphoplasmacytic perivascular cuffing, most severe at the level of the cerebellar peduncle at the junction of the grey and white matter, accompanied by endothelial hyperplasia and numerous reactive astrocytes. eSlide: VM05216 26.e2 Avian bornavirus encephalitis, emu, brain. IHC. Immunohistochemistry (rabbit polyclonal antiserum against parrot bornavirus 2 (Psittaciform 1 bornavirus) nucleocapsid protein) is positive with nuclear, and to a much lesser degree cytoplasmic, staining in neurons and glial cells. Staining was present in moderate intensity in the cerebellar peduncle and brainstem, and was sporadically positive in the granular layer of the cerebellum and in the cerebral cortex. eSlide: VM05217 26.e3 Clostridial typhlitis (Clostridium perfringens), ostrich, cecum. There are multifocal to coalescing areas of severe mucosal necrosis with a marked accumulation of cellular debris, heterophils, and bacteria (bacilli) over the surface and in the cecal lumen. eSlide: VM05231 26.e4 Clostridial enteritis, ostrich, cecum. Brown and Hopps. There are multifocal to coalescing areas of severe mucosal necrosis with a marked accumulation of cellular debris, heterophils, and bacteria (bacilli) over the surface and in the cecal lumen. The positively staining bacilli are highlighted within a mixed bacterial population with Brown and Hopps staining. Brown and Hopps. eSlide: VM05232 26.e5 Normal yolk sac, ostrich, yolk sac. The yolk sac is normal, and shows the long mucosal villi lined by large vacuolated epithelial cells. These villi are present in the yolk sacs of ostrich chicks until approximately day 14 of age. eSlide: VM05233 26.e6 Rickets, rhea, bone. The zones of proliferation and prehypertrophy are unremarkable, but the zone of hypertrophy has multiple thick bands of cartilage alternating with thin spicules of bone that extend deep into the diaphysis. There is thin calcification of the cartilaginous matrix, the osteoblast population is poor and there are multifocal clusters of osteoclasts. (see Fig. 26.6 ). eSlide: VM05236 26.e7 Baylisascaris larval migrans, tinamou, brain. Randomly affecting predominantly the white matter tracts are multifocal, variably sized areas of vacuolation and cavitation, with variable, predominantly, histiocytic infiltrates. Within these foci are three cross-sections of nematode larvae, 75 μm in diameter, with a smooth cuticle, lateral alae, platymyarian musculature and prominent lateral cords (consistent with Baylisascaris sp.). Axonal swelling and degeneration are contained within dilated myelin sheaths. (see Fig. 26.14 ). eSlide: VM05234 26.e8 Bacterial yolk sacculitis, emu, yolk sac. The yolk sac is surrounded by a fibrous wall containing scattered heterophils. Centrally, there are regions of mineralization and of vacuolated material in the epithelial cells, as well as clusters of small coccoid bacilli and rare globules and clusters of amphophilic yolk droplets. eSlide: VM05237 26.e9 Myodegeneration and myonecrosis, ostrich, pipping muscle. There is edema of the peri- and epimysium, and mild to moderate infiltration of the interstitium with heterophils. There is severe multifocal necrosis of myofibres with increased eosinophilia, contraction bands, fibre fragmentation, and mineralization of the degenerate sarcolemma. On cross section, swelling of myofibres and empty endomysial sheaths are also seen. eSlide: VM05245 General ratite management and health reference materials Information on ratites can be found in the biology/ecology, animal management, and veterinary databases and literature. The South African ostrich industry is historic and legendary, and the source of considerable veterinary literature. Many texts and detailed conference proceedings were produced in North America in the 1990s, a time when there was an explosive increase in the breeding of ostriches, emus and, to a lesser extent, common rheas on this continent. The product markets did not; however, expand at the same rate as the breeding programs and the heyday of the North American ratite industry ended within a decade or so. A scan through the more recent literature reveals an increase in publications concerning diseases of ratites emerging from South America and Asia. The following information is intended to provide the reader with a list of the major texts to act as additional sources of information on the management and diseases of a variety of ratite species: Basic ornithological information: Cabot, J., 2012. Family Tinamidae (Tinamous). In: del Hoyo, J., Elliot, A., Sargatal, J, (Eds.), Handbook of the Birds of the World, Vol. 1. Lynx Edicions, Barcelona, Spain, pp. 112–139. Folch, A., 2012. Family Apterygidae (Kiwis). In: del Hoyo, J., Elliot, A., Sargatal, J, (Eds), Handbook of the Birds of the World, Vol. 1. Lynx Edicions, Barcelona, Spain, pp. 104–108. Folch, A., 2012. Family Casuaridae (Cassowaries). In: del Hoyo, J., Elliot, A., Sargatal, J, (Eds.), Handbook of the Birds of the World, Vol. 1. Lynx Edicions, Barcelona, Spain, pp. 90–97. Folch, A., 2012. Family Dromaiidae (Emu). In: del Hoyo, J., Elliot, A., Sargatal, J, (Eds.): Handbook of the Birds of the World, Vol. 1. Lynx Edicions, Barcelona, Spain, pp. 98–102. Folch, A., 2012. Family Rheidae (Rheas). In: del Hoyo, J., Elliot, A., Sargatal, J, (Eds.), Handbook of the Birds of the World, Vol. 1. Lynx Edicions, Barcelona, Spain, pp. 84–88. Folch, A., 2012. Family Struthionidae (Ostrich). In: del Hoyo, J., Elliot, A., Sargatal, J, (Eds.), Handbook of the Birds of the World, Vol. 1. Lynx Edicions, Barcelona, Spain, pp. 76–82. Sources of Information: Ostrich, emu, rhea Deeming, D.C. (Ed), 1999. The Ostrich. Biology, Production and Health. CABI Publishing, Wallingford, Oxon, UK, 358 pp. Hallam, M.G., 1992. The Topaz Introduction to Practical Ostrich Farming. M.G Hallam, Harare, Zimbabwe, 142 pp. Huchzermeyer, F.W., 1998. Diseases of Ostriches and Other Ratites. Agricultural Research Council, Onderstepoort Veterinary Institute, Onderstepoort, Republic of South Africa, 296 pp. Jensen, J., Johnson, J.H., Weiner, S.T., 1992. Husbandry and Medical Management of Ostriches, Emus, and Rheas. Wildlife and Exotic TeleConsultants, College Station, Texas, USA, 129 pp. Kummrow, M.S., 2014. Ratites or Struthioniformes: Struthiones, Rheae, Cassuarii, Apteryges (Ostriches, Rheas, Emus, Cassowaries, and Kiwis), and Tinamiformes (Tinamous). In: Miller, R.E., Fowler, M. (Eds.), Fowler's Zoo and Wild Animal Medicine, Vol. 8., Elsevier Health Sciences, St. Louis, Missouri, USA, pp. 75–82. Minnaar, M., 1998. The Emu Farmer's Handbook, vol. 2. Nyoni Publishing, Groveton, Texas, USA, 285 pp. Minnaar, P., Minnaar. M., 1992. The Emu Farmer's Handbook. Induna Co., Groveton, Texas, USA. 177 pp. Scataglini, A., Torti, M.V., Arantes, I.G., 2001. Order Rheiformes (Rheas). In: Fowler, M.E., Cubas, Z.S. (Eds.), Biology, Medicine, and Surgery of South American Wild Animals. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, pp. 65–71. Tully, T.N.J., Shane, S.M. (Eds.), 1996. Ratite Management, Medicine and Surgery. Krieger Publishing Company, Malabar, Florida, 188 pp. Tully, T.N.J., Shane, S.M. (Eds.), 1998. The Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice (Ratites), vol. 14(3), 550 pp. Sources of Information: Cassowaries Biggs., J.R. (Ed.), 2013. Captive Management Guidelines for the Southern Cassowary Casuarius casuarius johnsonii. Cairns Tropical Zoo, Cairns, Australia. Available from: http://aszk.org.au/wp-content/uploads/2015/05/2013_FINAL_bird_hm_casso_COMPLETE.pdf Latch,P., 2007. National recovery plan for the southern cassowary Casuarius casuarius johnsonii . Report to Department of the Environment, Water, Heritage and the Arts, Canberra, Australia. Environmental Protection Agency, 38 pp. Available from: http://www.environment.gov.au/system/files/resources/79235f07-9c32-45fa-b868-eb248691e945/files/sth-cassowary.pdf Sources of Information: Tinamous Silveira, L.F., Höfling, E., Gaglianone Moro, M.E., do Nascimento, A.A., Gouveia Arantes, I.M., 2001. Order Tinamiformes (Tinamous). In: Fowler, M.E., Cubas, Z.S. (Eds.), Biology, Medicine and Surgery of South American Wild Animals. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, pp. 72–80. Sources of Information: Kiwis Fraser, I., Johnson, T. with updates by Barlow, S., Travers, C., 2015. Brown Kiwi ( Apteryx mantelli ) Husbandry Manual, Version 3. Zoo and Aquarium Association, Aukland, New Zealand, 46 pp. Morgan, K.J., 2008. Kiwi First Aid and Veterinary Care. Science and Technical Publishing, Department of Conservation, Wellington, New Zealand, 103 pp. Available from: http://www.doc.govt.nz/documents/science-and-technical/sap245entire.pdf. Notable clinical pathology information and reference materials in ratites Variably detailed information on the hematology and serum or plasma biochemistry of ostriches, emus and, to a lesser extent, rheas, is included in specific ratite texts and general veterinary clinical pathology reference texts that may also include tables of reference intervals. a–e Only a limited amount of the primary literature is summarized. A small number of original research investigations evaluate the effects of blood collection or storage techniques. f–h A variety of anticoagulants have been recommended for hematology samples in ratites, including lithium heparin, EDTA (preferably in liquid form), and sodium citrate for laser flow cytometry. However, a direct comparison on ostrich blood suggested that heparin resulted in less hemolysis than EDTA. g Biochemistry is often performed on plasma rather than serum, in part due to the development of large gelatinous clots from which serum can be difficult to extract. Information on the hematology and biochemistry of cassowary, kiwi, and tinamou species is scant and available through the Species360 Zoological Information Management System ( https://www.species360.org ) and in the primary literature or in conservation workshop proceedings. i–l Lithium heparin should be used for both hematology and biochemistry in the kiwi. j Urine composition has been described for the ostrich. m–o References a Blue-McLendon, A., Green, R.A., 2010. Hematology of Ratities. In: Weiss, D.J., Wardrop, J.K. (Eds.), Schalm's Veterinary Hematology, sixth ed., John Wiley & Sons Inc, Ames, Iowa, USA, pp. 987–993. b Clark, P., Boardman, W., Raidal, S., 2009. Atlas of Clinical Avian Hematology. John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey, USA, 200 pp. c Fudge, A.M., 1996. Clinical hematology and chemistry of ratites. In: Tully, T.N., Shane, S.M. (Eds.), Ratite Management, Medicine, and Surgery. Krieger Publishing Company, Malabar, Florida, pp. 105–114. d Huchzermeyer, F.W., 1998. Diseases of Ostriches and Other Ratites. Agricultural Research Council, Onderstepoort Veterinary Institute, Onderstepoort, Republic of South Africa, 296 pp. e Jensen, J., Johnson, J.H., Weiner, S.T., 1992. Husbandry and Medical Management of Ostriches, Emus, and Rheas. Wildlife and Exotic TeleConsultants, College Station, Texas, 129 pp. f Andreasen, C.B., Andreasen, J.R., Thomas, J.S., 1997. Effects of hemolysis on serum chemistry analytes in ratites. Vet. Clin. Pathol. 26(4), 165–171. g Mafuvadze, B., Erlwanger, K.H., Haratt, P., 2007. The effect of EDTA, heparin and storage on the erythrocyte osmotic fragility, plasma osmolality, and haematocrit of adult ostriches ( Struthio camelus ). Veterinarskiarhiv 77, 427–434. h Verstappen, F.A., Lumeij, J.T., Bronneberg, R.G., 2002. Plasma chemistry reference values in ostriches. J. Wildl. Dis. 38(1), 154–159. i Stoskopf, A.M.J., Beall, F.B., Ensley, P.K., Neely, E., 1982. Immobilization of large ratites: blue necked ostrich ( Struthio camelus austrealis ) and double-wattled cassowary ( Casuarius casuarius ): With hematologic and serum chemistry data. J. Zoo Anim. Med. 13(4), 160–168. j Morgan, K.J. 2008. Kiwi First Aid and Veterinary Care. Science and Technical Publishing, Department of Conservation, Wellington, New Zealand, 103 pp. Available from: http://www.doc.govt.nz/documents/science-and-technical/sap245entire.pdf. k Black, P.A., Macek, M., Tieber, A., Weber, M., 2013. Reference values for hematology, plasma biochemical analysis, plasma protein electrophoresis, and aspergillus serology in elegant-crested tinamou ( Eudromia elegans ). J. Avian Med. Surg. 27, 1–6. l Moro, M.E., Giannoni, M.L., 1994. Estudo da Rhynchotus rufescens —perdiz (Aves: Tinamiformes) em cativeiro. III. Hematimetria. Ars Veterinaria, 10, 50–53. m Levy, A., Perelman, B., Grevenbroek, M., Creveld, C. V, Agbaria, R., Yagil, R., 1990. Effect of water restriction on renal function in ostriches ( Struthio camelus ). Avian Pathol. 19(2), 385–393. n Mushi, E.Z., Binta, M.G., Isa, J.W., 2001. Biochemical composition of urine from farmed ostriches ( Struthio camelus ) in Botswana. J. South Afr. Vet. Assoc. 72(1), 46–48. o Schütte, K., 1973. The composition of ostrich urine. South Afr. J. Sci. 69(2), 56–57. Toxic elements described as causes of clinical disease and death in large ratite species Therapeutic/pest control compounds: colistin, dynamulin, furazolidone, lincomycin, lindane, mineral oil, morantel, furan, thiabendazole, streptomycin, warfarin. Feed-related compounds and forage: gizzerosine (causing erosion of the gizzard), mycotoxins (aflatoxin, ochratoxin, T2 toxin, sporodesmin, zearalenone), salt, selenium. References Foggin C.M. Veterinary problems of ostriches Hallam M.G. The Topaz Introduction to Practical Ostrich Farming 1992 M.G. Hallam Harare, Zimbabwe 61 96 Huchzermeyer, F.W., 1998. Diseases of Ostriches and Other Ratites. Agricultural Research Council, Onderstepoort Veterinary Institute, Onderstepoort, Republic of South Africa, 296 pp. Jensen, J., Johnson, J.H., Weiner, S.T., 1992. Husbandry and Medical Management of Ostriches, Emus, and Rheas. Wildlife and Exotic TeleConsultants, College Station, Texas, 129 pp. Kinder L.L. Angel C.R. Anthony N.B. Apparent selenium toxicity in emus ( Dromaius novaehollandiae ) Avian Dis 39 3 1995 652 657 8561756 Shivaprasad, H.L., 1993. Neonatal mortality in ostriches: an overview of possible causes. Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, Nashville, Tennessee, USA, 282–293. Table e1 The Infraclass (Clade) Palaeognathae a Order Family Geographic Origin Common Names Genus and Species Apterygiformes b Apterygidae New Zealand Great spotted kiwi Apteryx haastii Little spotted kiwi Apteryx owenii North Island brown kiwi Apteryx mantelli Okarito kiwi (rowi) Apteryx rowi Southern brown kiwi (tokoeka) Apteryx australis Casuariiformes Casuariidae Australasia Dwarf cassowary Casuarius bennetti Northern cassowary Casuarius unappendiculatus Southern cassowary Casuarius casuarius Casuariiformes Casuariidae Australia Emu Dromaius novaehollandiae Struthioniformes Struthionidae Africa Common ostrich Struthio camelus Somali ostrich Struthio molybdophanes Rheiformes Rheidae South America Lesser rhea Rhea pennata Greater rhea Rhea americana Tinamiformes Tinamidae South America Tawny-breasted tinamou Nothocercus julius ( Nothocercus ) Highland tinamou Nothocercus bonapartei Hooded tinamou Nothocercus nigrocapillus ( Tinamus ) Gray tinamou Tinamus tao Solitary tinamou Tinamus solitarius Black tinamou Tinamus osgoodi Great tinamou Tinamus major White-throated tinamou Tinamus guttatus ( Crypturellus ) Berlepsch's tinamou Crypturellus berlepschi Cinereous tinamou Crypturellus cinereus Little tinamou Crypturellus soui Tepui tinamou Crypturellus ptaritepui Brown tinamou Crypturellus obsoletus Undulated tinamou Crypturellus undulatus Pale-browed tinamou Crypturellus transfasciatus Brazilian tinamou Crypturellus strigulosus Grey-legged tinamou Crypturellus duidae Red-legged tinamou Crypturellus erythropus Yellow-legged tinamou Crypturellus noctivagus Black-capped tinamou Crypturellus atrocapillus Thicket tinamou Crypturellus cinnamomeus Slaty-breasted tinamou Crypturellus boucardi Choco tinamou Crypturellus kerriae Variegated tinamou Crypturellus variegatus Rusty tinamou Crypturellus brevirostris Bartlett's tinamou Crypturellus bartletti Small-billed tinamou Crypturellus parvirostris Barred tinamou Crypturellus casiquiare Tataupa tinamou Crypturellus tataupa ( Rhynchotus ) Red-winged tinamou Rhynchotus rufescens Huayco tinamou Rhynchotus maculicollis ( Nothoprocta ) Taczanowski's tinamou Nothoprocta taczanowskii Ornate tinamou Nothoprocta ornata Chilean tinamou Nothoprocta perdicaria Brushland tinamou Nothoprocta cinerascens Andean tinamou Nothoprocta pentlandii Curve-billed tinamou Nothoprocta curvirostris ( Nothura ) White-bellied nothura Nothura boraquira Lesser nothura Nothura minor Darwin's nothura Nothura darwinii Spotted nothura Nothura maculosa Chaco nothura Nothura chacoensis ( Taoniscus ) Dwarf tinamou Taoniscus nanus ( Eudromia ) Elegant crested tinamou Eudromia elegans Quebracho crested tinamou Eudromia formosa ( Tinamotis ) Puna tinamou Tinamotis pentlandii Patagonian tinamou Tinamotis ingoufi a Gill, F.B., Donsker, D.B. (Eds.), 2018. IOC World Bird List (v 8.1), doi:10.14344/10C.ML.8.1. b Sales, J., 2005. The endangered kiwi: a review. Folia Zool. 54, 1–20. Table e2 Comparison of Select Anatomic Features Among Large Ratites a , b , c , d Anatomic features Ostrich e , f Emu m , n Rhea Cassowary Wing structure Large wing, three digits, cornified hooks on tips of alula- and distal phalanx of two anterior digits. Scapula, coracoid and clavicle fused in adult. Vestigial wing, single clawed digit. Medium sized wing, claw on alular digit and sometimes other two digits. Small wing, curved claw on major digit. Pelvic and leg structure Large digit three with strong toenail, smaller digit four with or without toenail. Ischial and pubic bones form a pubic symphysis. Unfused tarsal bone could be mistaken for the patella, which is absent. g Digits two, three, and four with strong toenails. Unfused tarsal bone could be mistaken for the patella, which is absent. Digits two, three, and four with strong toenails. Digits two, three, and four with strong toenails. Nail on digit two is an elongated sharp spike. Gastrointestinal system Oral cavity and esophagus Smooth, blunt, U-shaped tongue and well-developed pharyngeal tonsils with crypts. Taste buds not evident. h Tongue has a serrated edge. Lateral projections of the pharyngeal folds form pharyngeal tonsils. Taste buds present. Tongue and tonsils have pointed V-shaped tips. Proventriculus Large, curves over ventriculus, thin walled or saccular with small glandular patch on greater curvature (dorsal and caudal walls). Large proventricular-ventricular opening. Frequently contains large amounts of water. Large, thick walled, spindle shaped with entire surface glandular. Small, thin walled with glandular patch on the greater curvature. Large, spindle shaped. Ventriculus Heavily muscled. Ventriculus larger than proventriculus, muscling of wall varies with diet. Large, sac-like. Elongated, moderate muscling. Gall bladder Not present Present Present Present Liver Left lobe subdivided into three smaller lobes, larger right lobe undivided. Intestines Unique secondary duodenal loop. Hepato-enteric duct opens into the descending loop of the duodenum; the pancreatic duct opens into the ascending loop near the jejunal junction. Coiled jejunum and ileum. Elongated ceca with a sacculated appearance except at the thick-walled apices, complex frilled internal spiral fold. Right cecum is generally longer than the left, single blended opening to the intestinal tract. Voluminous large intestine: proximal thin walled sacculated portion; narrow thin-walled distal portion. Dilation of a sac-like area with feces proximal to rectocoprodeal fold is described. I Small intestine, cecum, and colon form 36, 7, and 57% of the total length of the gastrointestinal tract, respectively. Elongated small intestine, muscularis progressively thins from the jejunum to the distal ileum. Short tubular ceca with longitudinal rugae and villi extending most of the length. Small ceca and proportionally short large intestine with mucosal folds. Large rectal villi. Small intestine, cecum, and colon form 90, 3, and 7% of the total length of the gastrointestinal tract, respectively. Proportionally longest ceca, sacculated with a valvular transverse fold in two alternating longitudinal layers. Small intestine, cecum, and colon form 61, 21, and 17% of the total length of the gastrointestinal tract, respectively. Short to vestigial nonfunctional ceca. Short large intestine. Cloaca The coprodeum or proctodeum (depending on author) stores urine like a bladder; a well-developed rectoproctodeal fold prevents retrograde flow of urine and urates. Urodeum may or may not be present (depending on author). Well-developed coproproctodeal fold. Bursa of Fabricius is an integral part of dorsal and lateral walls of the proctodeum. j , k Bursa of Fabricius is an integral part of dorsal and lateral walls of the proctodeum. Bursa of Fabricius is a cranial appendix of the proctodeum. Urogenital system Phallus with a phallic sulcus (no internal cavity) that folds on ventrum of proctodeum. L Testes are black. Spiral phallus has cavity which gives appearance of urethra but does not communicate to urinary tract, much of phallus lies like an inverted glove finger in a pocket below the mucosa of the proctodeum. Dilated pouch of ureter stores urine. Ureters are described as opening into the coprodeum, rather than the urodeum, in an adult male (as compared to an adult female and a juvenile male). Spiral phallus has cavity which gives appearance of urethra but does not communicate to urinary tract, much of phallus lies like an inverted glove finger in a pocket below the mucosa of the proctodeum. Phallus has cavity which gives appearance of urethra but does not communicate to urinary tract, much of phallus lies like an inverted glove finger in a pocket below the mucosa of the proctodeum. Female cassowary has no phallus Respiratory system Femur is the only pneumatized bone. Femur is the only pneumatized bone. Prominent discontinuity in the ventral tracheal rings cranial to the thoracic inlet that communicates with a large subcutaneous membrane lined pouch in adult birds. Information on bone pneumatization not available. Information on bone pneumatization not available. Integumentary system Prominent cutaneous callosities on ventral pressure points: sternum, plantar metatarsal pad, below the prominences of the pubic bones. Large featherless areas (apteria). Feathers have a double rachis. Sternal callosity. Firm, keratinized casque, or helmet, on the top of the head. Feathers appear to have a double rachis due to large hypopenna. Flight feathers are thin rods of solid keratin. Thymus Varies, may be rounded or longer and lobulated, at base of the neck cranial to first ribs. Long, flat, J-shaped, and multilobulated. Flattened hemisphere. No published description. Spleen Oval and bean-shaped to elongated or sausage-shaped and triangular on transverse section. Long and cylindrical. Cylindrical, bean-shaped. Flattened, irregularly polygonal in section. a Cho, P., Brown, R., Anderson, M., 1984. Comparative gross anatomy of ratites. Zoo Biol. 3(2), 133–144. b Fowler, M.E., 1991. Comparative clinical anatomy of ratites. J. Zoo Wildl. Med. 22(2), 204–227. c McLelland, J., 1989. Anatomy of the avian cecum. J. Exp. Zool. 252(S3), 2–9. d Berens Von Rautenfeld, D., Budras, K.-D., 1982. The bursa cloacae (Fabricii) of struthioniforms in comparison with the bursa of other birds. J. Morphol. 172(1), 123–138. e Bezuidenhout A.J., 1986. The topography of the thoraco-abdominal viscera in the ostrich ( Struthio camelus ). Onderstepoort J. Vet. Res. 53(2), 111. f Bezuidenhout, A.J., 1999. Anatomy. In: Deeming, D.C. (Ed.), The Ostrich. Biology, Production and Health. CABI Publishing, Wallingford, UK, pp. 13–49. g Bezuidenhout, A., Burger, W.P., 1993. The incidence of tibiotarsal rotation in the ostrich ( Struthio camelus ). J. South Afr. Vet. Assoc. 64(4), 159–161. h Tivane, C., 2008. The morphology of the oral cavity, pharynx and oesophagus of the ostrich ( Struthio camelus ). MSc thesis, University of Pretoria, Pretoria, Republic of South Africa. i Skadhauge, E., Warüi, C.N., Kamau, J.M.Z., Maloiy, G.M.O., 1984. Function of the lower intestine and osmoregulation in the ostrich: Preliminary anatomical and physiological observations. Q. J. Exp. Physiol. 69(4), 809–818. j Duke, G.E., Degen, A.A., Reynhout, J.K., 1995. Movement of urine in the lower colon and cloaca of ostriches. Condor, 97(1), 165–173. k Skadhauge, E., Erlwanger, K.H., Ruziwa, S.D., Dantzer, V., Elbrønd, V.S., Chamunorwa, J.P., 2003. Does the ostrich ( Struthio camelus ) coprodeum have the electrophysiological properties and microstructure of other birds? Comp. Biochem. Physiol. Part A Mol. Integr. Physiol. 134(4), 749–755. l Gandini, G.C.M., Keffen, R.H., 1985. Sex determination of the South African ostrich ( Struthio camelus ). J. South Afr. Vet. Assoc. 56(4), 209–210. m Herd, R.M., 1985. Anatomy and histology of the gut of the emu ( Dromaius novaehollandiae ). Emu, 85(1), 43–46. n Herd, R.M., Dawson, T.J., 1984. Fiber digestion in the emu, Dromaius novaehollandiae , a large bird with a simple gut and high rates of passage. Physiol. Zool. 57(1), 70–84. Table e3 Lymphoid Neoplasia in Large Ratites Species Age Sex Published Diagnosis Description Ostrich 7 years F Lymphosarcoma a 4 cm firm ulcerated mass partially occluding cloacal lumen and resulting in clitoral prolapse. Resembled lymphoid leucosis in poultry in that there was "lymphatic spread." Ostrich 20 months M Lymphoma a Multilobulated subcutaneous mass at the base of the neck cranial to the thoracic inlet. Similar nodules throughout lung, liver, and spleen. Ostrich 3 years F Lymphoid leukosis b Ascites and hepatomegaly with whitish tumor nodules in spleen, large intestine, kidney and cloacal region. On histopathology, the lesions consisted of coalescing foci and diffuse infiltrates of immature lymphoid cells. Cells had large uniform nuclei, a thin rim of basophilic cytoplasm, and little pleomorphism. Mitotic figures were scanty. The enteric nervous system was not affected. Ostrich 3 years F Multicentric, diffuse lymphoma of intermediate differentiation in the leukemic phase c 3 × 5 cm bilobed mass in the right atrium and immediately cranial and caudal to the thoracic inlet, hepatomegaly with 3–5 mm random white firm masses on capsule and in section. Neoplastic tissue consisted of sheets of small lymphocytes with oval nuclei, small amounts of clumped chromatin, scant eosinophilic cytoplasm. Diffuse bone marrow effacement was present. The ostrich also had a lymphocytic leukocytosis and monoclonal gammopathy in the late beta to early gamma ranges,with a faint trailing oligoclonal peak in the late gamma range. Ostrich Unknown F Lymphoid leukemia d Affecting reproductive tract, abdominal viscera, and mediastinal "nodes." Emu 6 months Lymphosarcoma a Skin lump highly suggestive of lymphosarcoma on cytological examination. Emu Unknown F Lymphoma e No details provided. a Cook, 2008. Disease entities of farmed ratites in New Zealand. Surveillance 24(8), 10–12. b Garcia-Fernandez, R.A., Perez-Martinez, C., Espinosa-Alvarez, J., Escudero-Diez, A., Garcia-Marin, J.F., Nunez, A., Garcia-Iglesias, M.J., 2000. Lymphoid leukosis in an ostrich ( Struthio camelus ). Vet. Rec. 146(23), 676. c VanDer Heyden, N., Fulton, R.M., DeNicola, D.B., Hicks, K., 1992. Lymphoma in an ostrich ( Struthio camelus ). Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, New Orleans, Louisiana, USA, pp. 310–312. d Hicks, K.D., 1993. Ostrich reproduction. J. Zoo Wild Anim. Med. 3, 203–206. e Adby, M.J., Howerth, E.W. 1995. Zinc levels in ratites in the southeastern United States. Proceedings of Joint Conference of the American Association of Zoo Veterinarians, Wildlife Disease Association, and American Association of Wildlife Veterinarians. East Lansing, Michigan, USA, pp. 428–429. Table e4 Viral Infections in the Large Ratites DNA Viruses Adenoviridae Presumptive Aviadenoviruses Adenovirus infection Ostrich (Italy, UK, USA); emu (USA) Untyped adenoviruses and adenoviruses related to Fowl Adenoviruses 1 and 8 have been associated with diarrhea and high mortality in ostrich chicks and with the laying of chalky shelled eggs by female ostriches. See text chapter for additional details and references. Circoviridae a Gyrovirus; Chicken anemia virus Ostrich (Spain) Virus was identified by immunohistochemistry in ostrich chicks with anorexia, diarrhea and dyspnea and 100% mortality. There was severe splenic lymphoid depletion with eosinophilic inclusions in macrophages. Herpesviridae b Ostrich (South Africa) Virus was isolated from the livers of 3-week-old ostrich chicks during a brief mortality event. Gross lesions included pale friable livers; on histology there was severe biliary hyperplasia and hepatocellular necrosis. Disease could not be experimentally reproduced. The results of microneutralization tests suggested the presence of a novel avian herpesvirus. Poxviridae b , c , d , e , f , g Avipox, Fowlpox virus Avian pox Ostrich (Australia, Israel, South Africa, USA) Dry form affecting the head is most common. Gross and histopathologic lesions are characteristic for the disease with cytoplasmic inclusion bodies generally present. Mortality can be high as a result of blindness and secondary infection. Domestic poultry are most probably the source of infection; however, in one South African report chickens could not be infected with ostrich origin virus. RNA viruses Birnaviridae h , i , j Avibirnavirus; Infectious bursal disease virus Infectious bursal disease (OIE reportable) Ostrich (South Africa, UK, USA); rhea (USA) Birna-like viruses have been isolated or visualized by EM from: the bursa of Fabricius of an ostrich chick with ulcerative cloacitis deriving from a group of 8–to–25–day–old chicks that died with severe fibrinonecrotic ulcerative cloacitis and colitis and bursal lymphoid necrosis; intestinal contents of rhea chicks with enteritis and lymphoid necrosis in the bursa of Fabricius; intestinal contents and liver and pancreas of an impacted ostrich chick; and intestinal contents of adult ostriches. Mean seropositivity was 15% in 149 juvenile farmed ostriches from Zimbabwe by ELISA, and 61% positive by VN in 74 breeding ostriches from the UK. Virus cultured from two ostrich chicks in the UK had a close relationship with IBD type 2 virus. Bornaviridae Bornavirus; Mammalian 1 bornavirus Borna disease Ostrich (Israel) An approximately five year outbreak of neurologic disease affected ostrich chicks in Israel. Laboratory investigation indicated the cause as being infection with Borna Disease virus. See text chapter for additional details and references Bornaviridae Bornavirus; Waterbird 1 bornavirus Avian bornavirus/Aquatic bird bornavirus 1 Emu (Canada) A prolonged clinical course involving gastrointestinal and neurological signs preceded a necropsy diagnosis of infection with an avian bornavirus in a captive emu. See text chapter for additional details and reference. Bunyaviridae a , k Nairovirus; Crimean-Congo hemorrhagic fever virus Crimean-Congo hemorrhagic fever (OIE reportable) Ostrich (South Africa) Ostriches become viremic for 1–4 days after experimental infection, and can become naturally infected through bites of infected tick vectors. The birds do not develop disease but can seroconvert, and can act as a source of infection to humans at slaughter. Coronaviridae b , l , m Presumptive coronavirinae Enteric coronavirus Ostrich (South Africa), rhea (USA) Particles resembling coronaviruses have been seen on transmission EM from intestinal contents or enterocytes in sick or dead young chicks with histologic lesions consistent with those seen with coronaviral enteritis in other species (flattening and loss of superficial villar epithelium, villar atrophy and fusion, cryptal epithelial necrosis and hyperplasia). Hemorrhagic typhlitis has also been associated with coronaviral presence. Both explosive outbreaks and more chronic "fading chick" syndrome have been seen. The frequent occurrence of secondary clostridial-associated necrotizing enteritis was described from South Africa. There are no reports of viral isolation. Flaviviridae b , n Flavivirus; Wesselsbron virus Wesselsbron disease Ostrich (South Africa) Virus was isolated from the spleens of 4-month-old ostrich chicks undergoing an outbreak of high mortality. Subsequent inoculation of 1-day-old, 6-month-old, and adult birds did not result in illness or mortality. Seropositivity in tested slaughter birds was up to 50%. In retrospect, the mortality outbreak was considered likely not to be the result of Wesselsbron virus infection. Flaviviridae (unconfirmed) b Ostrich (South Africa) Virus was isolated, but not fully characterized, from young ostriches with cholangiohepatitis characterized by nonspecific clinical signs, high morbidity but low mortality, and necrosis of biliary epithelium and a mild round cell infiltrate. Orthomyxoviridae o , p Orthomyxovirus; Influenza virus A Avian influenza (OIE reportable) Ostrich (Italy, South Africa, Zimbabwe); emu (China, Israel, USA); rhea (Canada, USA) Avian influenza has been diagnosed in all the large ratite species, with a range of high and low pathogenic strains identified. Disease ranges from subclinical to 100% mortality, with the respiratory system frequently affected. Wild birds are generally the initial source of infection. See text chapter for additional details and references Paramyxoviridae Avulavirus; Newcastle disease virus Avian paramyxovirus-1 (OIE reportable) Ostrich (South Africa, Israel) Newcastle disease virus has been isolated from ostriches with and without associated disease; there are no pathognomonic lesions in this species. Sudden death is the most common presentation in chicks and juveniles. See text chapter for additional details and references. Paramyxoviridae b Ostrich (South Africa) Paramyxoviral particles have been seen in the feces of 2– to 3-month-old ostriches with enteritis. The virus has been cultured and experimental vaccination reduced clinical disease, implying causality. Other enteric pathogens are frequently also present and thus lesions vary. Picornaviridae b Enterovirus Ostrich (South Africa, USA) An enterovirus was identified by electron microscopy in the feces of ostrich chicks less than one week of age that had diarrhea and nervous signs. Catarrhal enteritis was seen on gross and microscopic examination. The virus could not be cultured. Reoviridae b , q Enteric reovirus Ostrich (South Africa, USA) Reoviruses have been isolated from ostrich chicks with enteritis, including an outbreak with high mortality in South Africa. Chicks also had necrotic enteritis with Clostridium sp. isolated. The significance of these reoviruses is unknown. Togaviridae Alphavirus; Eastern and Western encephalitis viruses Eastern (EEE) and western (WEE) equine encephalitis. (both OIE reportable) Emu, cassowary (EEE, USA) Emu, rhea (WEE, USA) EEE causes high mortality in emus; disease has also been described in cassowaries. Pathologic findings primarily reflect vascular damage. WEE also primarily affects emus, but has been described in rheas. Disease is predominantly neurological. Both viruses are arthropod borne. See text chapter for additional details and reference. a Huchzermeyer, F.W., 1998. Diseases of Ostriches and Other Ratites. Agricultural Research Council, Onderstepoort Veterinary Institute, Onderstepoort, Republic of South Africa, 296 pp. b Allwright, D., 1996. Viruses encountered in intensively reared ostriches in Southern Africa. In: Deeming, D.C. (Ed.), Improving Our Understanding of Ratites in a Farming Environment. Ratite Conference, Manchester, England, pp. 27–33. c Allwright, J., Burger, W. P., Geyer, A., Wessels, J.1994. Avian pox in ostriches. J. South Afr. Vet. Assoc. 65(1), 23–25. d Perelman, B., Gur-Lavie, A., Samberg, Y., 1988. Pox in ostriches. Avian Pathol. 17(3), 735–739. e Raidal, S.R., Gill, J.H., Cross, G.M., 1996. Pox in ostrich chicks. Austr. Vet. J. 73(1), 32–33. f Shivaprasad, H.L., Kim, T.-J., Woolcock, P.R., Tripathy, D.N., 2002. Genetic and antigenic characterization of a poxvirus isolate from ostriches. Avian Dis. 46(2), 429–436. g Stewart, J.S., 1989. Husbandry and medical management of ostriches. Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, Seattle, Washington, USA, pp. 208–212. h Cadman, H.F., Kelly, P.J., Zhou, R., Davelaar, F., Mason, P.R., 1994. A serosurvey using enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies against poultry pathogens in ostriches ( Struthio camelus ) from Zimbabwe. Avian Dis. 38(3), 621–625. i Gough, R.E., Drury, S.E., Cox, W.J., Johnson, C.T., Courtenay, A.E., 1998. Isolation and identification of birnaviruses from ostriches ( Struthio camelus ). Vet. Rec. 142(5), 115–116. j Shivaprasad, H.L., Woolcock, P.R., Chin, R.P., Meteyer, C.U., Jeffey, J.S., Droual, R., Castro, A.E., Nordhausen, R.W., Barr, B.C., 1994. Identification of viruses from the intestine of ostriches. Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, Reno, Nevada, USA, pp. 442–443. k Shepherd, A.J., Swanepoel, R., Leman, P.A., Shepherd, S.P., 1987. Field and laboratory investigation of Crimean-Congo haemorrhagic fever virus ( Nairovirus , family Bunyaviridae) infection in birds. Trans. R Soc. Trop. Med. Hyg. 81(6), 1004–1007. l Frank, R.K., Carpenter, J.W., 1992. Coronaviral enteritis in an ostrich ( Struthio camelus ) chick. J. Zoo Wildl. Med. 23(1), 103–107. m Kennedy, M.A., Brenneman, K.A., 1995. Enteritis associated with a coronavirus-like agent in a rhea ( Rhea americana ) chick. J. Avian Med. Surg. 9(2), 138–140. n Allwright, D.M., Geyer, A., Burger, W.P., Williams, R., Gerdes, G.H., Barnard, B.J., 1995. Isolation of Wesselsbron virus from ostriches. Vet. Rec. 136(4), 99. o Amnon, I., Shkoda, I., Lapin, E., Raibstein, I., Rosenbluth, E., Nagar, S., Perk, S., Bellaiche, M., Davidson, I., 2011. Isolation and identification of highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 from emus from the Ein Gedi Oasis by the Dead Sea. Avian Dis. 55, 499–502. p Rich, P., Hampson, R. J., 1992. Influenza in rhea. In: Proceedings of the 45th Avian Disease Conference, Nepean, Ontario, Canada, p. 14. q Jensen, J., Johnson, J.H., Weiner, S.T., 1992. Husbandry and Medical Management of Ostriches, Emus, and Rheas. Wildlife and Exotic TeleConsultants, College Station, Texas, 129 pp. Table e5 Select Bacterial Diseases in Large Ratites Gram-positive Bacteria Bacillus anthracis a , b , c Ostrich (South Africa, Namibia) Ostriches are believed to be the avian species most susceptible to anthrax, possibly due to their lower body temperature. Individual cases and outbreaks of sudden death were reported from farmed ostriches in the late 1800s and early 1900s in South Africa, in wild ostriches in Etosha National Park, Namibia as part of a large outbreak between 1966 and 1974 (associated with overuse of contaminated artificial waterholes) and in an outbreak in farmed ostriches in Indonesia in 2001. As in mammals, diagnosis has been based on visualization of B. anthraci s in blood smears. Classical necropsy findings; generalized congestion, hemorrhages, and poorly coagulated blood, are also seen in ostriches. Clostridium perfringens d , e , f , g , h Ostrich, lesser rhea (single outbreak), emu (single case) (worldwide) Clostridium perfringens in an important cause of necrotizing enteritis in ostrich chicks, with mortality approaching 100% in some outbreaks. Diagnosis is based on the presence of characteristic gross and microscopic lesions in the small intestines, including the finding of Gram-positive rod-shaped bacteria on intestinal smears or in section in association with necrotic tissue; C. perfringens isolation from intestinal content or tissue; and toxin typing using multiplex PCR. C. perfringens toxin type A is most common, with genes for the alpha and beta toxins, enterotoxin, and netB identified. Surveys have not shown a difference in the isolates from ostriches with and without intestinal disease; carriage is common in healthy birds. Clostridium difficile i , j Ostrich, common rhea, emu (South Africa, USA) C. difficile infection has been the cause of outbreaks of severe acute necrotizing typhlitis and colitis, and a cause of necrotizing and granulomatous hepatitis in young ostrich chicks. Toxins A and B have both been identified. Clostridium chauvoei k Ostrich (Israel) C. chauvoei was cultured and identified using fluorescein-labeled antiserum in association with recumbency, toxemia, and acute mortality in two adult ostriches in Israel. Lesions included hemorrhagic enteritis, multifocal necrosis in liver and kidney, and fibrinous exudation into the pericardial sac. Clostridium sordelli h , l Ostrich, emu, lesser rhea (USA) C. sordelli has been reported as a cause of acute necrotizing hepatitis in a group of young ostrich chicks, and as well was cultured in combination with C. perfringens from an emu and a lesser rhea with necrotizing enteritis and typhlocolitis, respectively. Erysipelothrix rhusiopathiae m , n , o , p Emu (worldwide) The majority of reported cases are of sudden death as a result of septicemia in juvenile emu up to approximately 1-year of age. Serotypes 1b, 5 and 21 have been identified. Most prevalent lesions include widespread congestion, cardiac and serosal petechiation, multifocal parenchymal necrosis with colonies of bacteria, and thromboemboli. Poor environmental conditions may predispose to disease, and vaccination can be protective. Gram-negative bacteria Brachyspira hyodysenteriae, (known also as Serpulina sp., Treponema sp., intestinal spirochetosis), rarely B. pilosicoli q , r , s , t , u Common rhea (predominantly USA, probably worldwide) p An important cause of high mortality in common rhea, particularly chicks and juvenile birds, as a result of fibrino-necrotizing typhlocolitis. Cecal cores and mucosal ulceration with pseudomembranes are characteristic; histologic changes vary but include heterophilic to granulomatous inflammation associated with necrosis and the presence of spirochetes. Tentative diagnosis can be made by finding spirochetes on cecal or intestinal wet mounts or smears, or in silver-stained microscopic sections. Laboratory confirmation by standard means (PCR, immunofluorescence, etc.). Earlier reports described coinfection with Trichomonas -like protozoa. Bordetella avium Bordetella bronchiseptica e , v , w Ostrich (worldwide) Causes of upper respiratory infection and pseudomembranous tracheitis in ostrich chicks. Campylobacter jejuni jejuni C. coli c , x , y , z , aa , bb Ostrich, common rhea, emu (bacterial isolation only) (worldwide) Campylobacter sp. organisms have been frequently identified from the intestinal (in particular cecal and colonic) contents, cloacal swabs, and feces of healthy ostriches on the farm or at slaughter, and at necropsy have been isolated from the intestines of birds with and without pathologic lesions. Disease states linked with Campylobacter sp. infection include sudden death in ostrich chicks and young rheas as a result of typhlocolitis and/or multifocal necrotizing or granulomatous hepatitis. Affected livers were swollen with variably sized pale foci on the surface and cut section. Histologically, there was acute to chronic multifocal hepatic necrosis with lesions particularly around portal tracts, cholangitis, bile duct proliferation, periportal fibrosis, and portal vein thrombosis. Infiltrating inflammatory cells included heterophils, lymphocytes and plasma cells; in some birds, granulomatous inflammation was the striking finding. Argyrophilic curved and serpentine bacilli may be noted in smears or section. C. jejuni was also isolated from the yolk sacs of neonatal ostrich chicks with granulomatous yolk sacculitis. Chlamydia psittaci c , cc Ostrich, rhea (worldwide) Clinical presentation and pathology are similar to those in any avian species; including sudden death with high mortality, systemic evidence of inflammation and necrosis, and conjunctivitis. Diagnosis is performed using standard techniques. The sources of infection for ratites are thought be local wild birds, particularly Columbiformes. Seropositivity has been identified in apparently healthy captive and wild (common rhea, Argentina) birds. Lawsonia intracellularis dd , ee , ff , gg Ostrich, common rhea, emu (USA and Germany) Initially reported from a group of emu chicks with 23% morbidity and 16% mortality associated with rectal prolapse due to cloacitis. The distal rectal mucosa was thickened and hyperplastic with dilated glands full of mucus and large numbers of intracellular, silver-staining, comma-shaped bacteria. Necrotizing lesions were also present in the rectal mucosa and cloaca. Diagnosis was based on TEM and indirect immunofluorescence staining. Proliferative enteritis was described in an ostrich and a rhea - the ileal mucosa was thickened with cryptal hyperplasia and large numbers of curved intracellular silver-staining bacteria in the proliferative epithelial cells. PCR was used to confirm the diagnosis in both cases. Hemophilus spp. hh , ii Ostrich (Israel, probably USA) Serous to purulent rhinitis, sinusitis, and conjunctivitis are described in ostrich chicks. The disease can be highly contagious. Salmonella spp. jj , kk , ll , mm , nn , oo , pp , qq , rr , ss Ostrich, emu, common and lesser rhea, southern cassowary. (worldwide) There are two separate bodies of information on Salmonella spp. infections in ratites—one relating to clinical disease and the second to carriage and shedding rates, seropositivity, and the public health risk in slaughter birds. A wide range of Salmonella spp. has been identified in or from ratites, likely reflecting local sources of infection. Description of disease resulting from S. pullorum is notable by its absence, although seropositivity has been identified. Experimental infection of emu with S. pullorum resulted in seroconversion but no evidence of organ infection or shedding. Seroconversion also occurred in experimentally infected ostriches, with 1/8 birds developing lesions from which S. pullorum was reisolated. Salmonella spp. can be important causes of embryo death. Clinical and pathologic scenarios associated with salmonellosis include acute death and more chronic disability; omphalitis; yolk sacculitis; oophoritis ( S. arizonae ); necrotizing enteritis, typhlitis, and colitis; hepatitis; and pneumonia. A rectal stricture, identical to the lesion associated with salmonellosis in pigs, was described in an adult ostrich; however, no Salmonella sp. was isolated. Non-gram staining Mycobacterium spp. ( M. avium avium, M. intracellulare, M. bovis -single case) tt , uu , vv , ww , xx , yy Ostrich, common rhea, lesser rhea, emu, southern cassowary (captive and free-ranging), kiwi. (worldwide) Although frequently described as an uncommon disease, the frequently of description makes one wonder whether the condition is particularly uncommon. Disease reports involve captive animals, with the exception of diagnoses in wild southern cassowary in Australia. Gross lesions are as per other avian species: granulomatous nodules particularly in spleen, liver, abdominal serosa, and intestine and cloaca that frequently have an ulcerated mucosal surface. Areas of predilection also appear to be the ocular conjunctiva, the oropharynx in association with the pharyngeal tonsils, and subcutaneously at the base of the neck. Granulomatous nodules can be very large, for example, 30 cm in diameter or 2 kg in mass. The microscopic appearance is consistent with that in most avian species, small lesions are frequently composed of solid sheets of epithelioid macrophages whereas in larger lesions a central, caseonecrotic core without mineralization, and surrounded by fibrous connective tissue is more common. Langhan's type multinucleated giant cells, macrophages, heterophils, lymphocytes, and plasma cells can all be present in varying combinations. The number of acid-fast organisms present can vary tremendously. Standard methods of culture and molecular characterization of organisms are appropriate. Mycobacterium avium is the most commonly identified species; however, a single case of M. bovis was identified in an ostrich. Mycoplasma struthionis sp. nov., M. nasistruthionis sp. nov. Mycoplasma sp. Ms02. zz , aaa Ostrich (Republic of Africa) In 2004, three novel species of mycoplasma were identified from ostriches in South Africa. M. nasistruthionis sp. nov. and Mycoplasma sp. Ms02 are closely related to M. synoviae . Mycoplasmosis has a significant economic impact on the ostrich industry with losses resulting from upper respiratory (rhinotracheitis) and air sac infections, particularly in feedlot birds, and with exacerbation by extreme weather and possibly other stressors. Considerable research has been undertaken towards molecular characterization of these mycoplasmas and to develop an effective vaccine. Mycoplasma spp. bbb , ccc , ddd , eee Ostrich, emu, common rhea (USA, Iran) Information on, and particularly pathogenicity of, other mycoplasmal infections in ratites is sporadic and frequently without detailed characterization of any organisms identified. Initial, non-molecular characterization of some isolates may not have been accurate. M. synoviae was identified by PCR from lung samples taken from slaughter ostriches in Iran. M. cloacale has been identified from tracheal or air sac swabs from ratites, a mycoplasma that reacted with M. synoviae antibody was present in the joint of an emu with polyarthritis, M. synoviae was isolated from tracheal samples from juvenile common rheas with upper respiratory infection and sinusitis, and colonization of the trachea can occur in young ostriches experimentally infected with M. gallisepticum . Disease as a result of the major poultry mycoplasmoses has not been diagnosed in ratites. a Ebedes, H., 1976. Anthrax epizootics in wildlife in the Etosha National Park. Madoqua, 10(2), 99–118. b Hardjoutomo, S., Poerwadikarta, M.B., Barkah, K., 2002. Anthrax outbreak of ostrich farm in the regency of Purwakarta, West Java, Indonesia. WARTAZOA. Indo. Bull. Anim. Vet. Sci. 12(3), 114–120. c Verwoerd, D.J., 2000. Ostrich diseases. Scientific and Technical Review of the Office International des Epizooties, 19(2), 638–661. d Alimolaei, M., Ezatkhah, M., Bafti, M.S., 2014. Genetic and antigenic typing of Clostridium perfringens isolates from ostriches. Infection, Genet. Evol. 28, 210–213. e Huchzermeyer, F.W., 1998. Diseases of Ostriches and Other Ratites. Agricultural Research Council, Onderstepoort Veterinary Institute, Onderstepoort, Republic of South Africa, 296 pp. f Kwon, Y.-K., Lee, Y.-J., Mo, I.-P., 2004. An outbreak of necrotic enteritis in the ostrich farm in Korea. J. Vet. Med. Sci. 66(12), 1613–1615. g Razmyar, J., Kalidari, G.A., Tolooe, A., Rad, M., Movassaghi, A.R., 2014. Genotyping of Clostridium perfringens isolated from healthy and diseased ostriches ( Struthio camelus ). Iran. J. Microbiol. 6(1), 31–36. h Smith J.S., Glisson, J.R., Page, R.K., Rowland, G.N,. 1991. Necrotic enteritis and colitis in ratite birds. Proceedings of the Western Poultry Disease Conference, Acupulco, Guerrero, Mexico, pp. 258–260. i Frazier, K.S., Herron, A.J., Hines II, M.E., Gaskin, J.M., Altman, N.H., 1993. Diagnosis of enteritis and enterotoxemia due to Clostridium difficile in captive ostriches ( Struthio camelus ). J. Vet. Diagn. Invest. 5(4), 623–625. j Shivaprasad, H.L., 2003. Hepatitis associated with Clostridium difficile in an ostrich chick. Avian Pathol. 32(1), 57–62. k Lublin, A., Mechani, S., Horowitz, H.I., Weisman, Y., 1993. A paralytic-like disease of the ostrich ( Struthio camelus masaicus ) associated with Clostridium chauvoei infection. Vet. Rec. 132(11), 273–275. l Poonacha, K.B., Donahue, J.M., 1997. Acute clostridial hepatitis in an ostrich. J. Vet. Diagn. Invest. 9(2), 208–210. m Brash, M.L., 1993. Erysipelas in emus. Anim. Health News Ceptor 1(3), 5. n Eriksson, H., Jansson, D.S., Johansson, K.-E., Båverud, V., Chirico, J., Aspán, A., 2009. Characterization of Erysipelothrix rhusiopathiae isolates from poultry, pigs, emus, the poultry red mite and other animals. Vet. Microbiol. 137(1), 98–104. o Griffiths, G.L., Buller, N., 1991. Erysipelothrix rhusiopathiae infection in semi-intensively farmed emus. Austr. Vet. J. 68(3), 121–122. p Swan, R.A., Lindsey, M.J., 1998. Treatment and control by vaccination of erysipelas in farmed emus ( Dromaius novohollandiae ). Austr. Vet. J. 76(5), 325–327. q Buckles, E.L., Eaton, K.A., Swayne, D.E., 1997. Cases of spirochete-associated necrotizing typhlitis in captive common rheas ( Rhea americana ). Avian Dis. 41(1), 144–148. r Hanley, R.S., Woods, L.W., Stillian, D.J., Dumonceaux, G.A.,1994. Serpulina-like spirochetes and flagellated protozoa associated with a necrotizing typhlitis in the rhea ( Rhea americana ). Proceedings of the Association of Avian Veterinarians, Reno, Nevada, USA, 157–162 s Jensen, N.S., Stanton, T.B., Swayne, D.E., 1996. Identification of the swine pathogen Serpulina hyodysenteriae in rheas ( Rhea americana ). Vet. Microbiol. 52(3–4), 259–269. t Mappley, L.J., La Ragione, R.M., Woodward, M.J., 2014. Brachyspira and its role in avian intestinal spirochaetosis. Vet. Microbiol. 168(2), 245–260. u Sagartz, J.E., Swayne, D.E., Eaton, K.A., Hayes, J.R., Amass, K.D., Wack, R., Kramer, L., 1992. Necrotizing typhlocolitis associated with a spirochete in rheas ( Rhea americana ). Avian Dis. 36(2), 282–289. v Clubb, S.L., Homer, B.L., Pisani, J., Head, C., 1994. Outbreaks of bordetellosis in psittacines and ostriches. Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, Reno, Nevada, USA, pp. 63–68. w Yousseff, F.M., El-Genaidy, H.M., 2008. Studies on the bacterial septicemia and cestode ( Houttynia struthionis ) on ostriches at Ismailia Province. Egypt. J. Comp. Pathol. Clin. Pathol. 21(1), 240–258 x Oyarzabal, O.A., Conner, D.E., Hoerr, F.J., 1995. Incidence of campylobacters in the intestine of avian species in Alabama. Avian Dis. 39(1), 147–151. y Perelman, B., Grieff, M., Kuttin, E.S., Rogol, M., 1992. Campylobacteriosis in ostriches. Israel J. Vet. Med. 47, 116–119. z Post, K., Ayers, J.R., Gilmore, W.C., Raleigh, R.H., 1992. Campylobacter jejuni isolated from ratites. J. Vet. Diagn. Invest. 4(3), 345–347. aa Shivaprasad, H.L., 1993. Neonatal mortality in ostriches: an overview of possible causes. Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, Nashville, Tennessee, USA, pp. 282–293. bb Stephens, C.P., On, S.L.W., Gibson, J.A., 1998. An outbreak of infectious hepatitis in commercially reared ostriches associated with Campylobacter coli and Campylobacter jejuni . Vet. Microbiol. 61(3), 183–190. cc Uhart, M., Aprile, G., Beldomenico, P., Solís, G., Marull, C., Beade, M., Carminati, A., Moreno, D., 2006. Evaluation of the health of free-ranging greater rheas ( Rhea americana ) in Argentina. Vet. Rec. 158(9), 297–303. dd Bello, A., Frei, S., Peters, M., Balkema-Buschmann, A., Baumgärtner, W., Wohlsein, P., 2017. Spontaneous diseases in captive ratites (Struthioniformes) in northwestern Germany: a retrospective study. PloS One 12(4), e0173873. ee Cooper, D.M., Swanson, D.L., Barns, S.M., Gebhart, C.J., 1997. Comparison of the 16S ribosomal DNA sequences from the intracellular agents of proliferative enteritis in a hamster, deer, and ostrich with the sequence of a porcine isolate of Lawsonia intracellularis . Int. J. Syst. Bacteriol. 47(3), 635–639. ff Cooper, D.M., Swanson, D.L., Gebhart, C.J., 1997. Diagnosis of proliferative enteritis in frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tissues from a hamster, horse, deer and ostrich using a Lawsonia intracellularis -specific multiplex PCR assay. Vet. Microbiol. 54(1), 47–62. gg Lemarchand, T.X., Tully Jr, T.N., Shane, S.M., Duncan, D.E., 1997. Intracellular Campylobacter -like organisms associated with rectal prolapse and proliferative enteroproctitis in emus ( Dromaius novaehollandiae ). Vet. Pathol. 34(2), 152–156. hh Jensen, J., Johnson, J.H., Weiner, S.T., 1992. Husbandry and Medical Management of Ostriches, Emus, and Rheas. Wildlife and Exotic TeleConsultants, College Station, Texas, 129 pp. ii Shane, S.M., Tully, T.N.J., 1996. Infectious Diseases, in: Tully, T.N.J., Shane, S.M. (Eds.), Ratite Management, Medicine and Surgery. Krieger Publishing Company, Malabar, Florida, pp. 127–146. jj Berridge, B.R., Hague, B.A., Barthel, R., Storts, R.W., 1998. Rectal stricture in an ostrich ( Struthio camelus ). J. Zoo Wildl. Med. 29(3), 341–343. kk Cadman, H.F., Kelly, P.J., Zhou, R., Davelaar, F., Mason, P.R., 1994. A serosurvey using enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies against poultry pathogens in ostriches ( Struthio camelus ) from Zimbabwe. Avian Dis. 38(3), 621–625. ll Speer, B.L., 1997. A summary of recent American Ostrich Research Foundation funded research projects and their findings. Citing: Dempsey, T.J., Corsiglia, C.M., Christenberry, S.P., Thayer, S.G., Buhr, J.R., Rowland, G.: Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum in ostriches. Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, Reno Nevada, USA, pp. 151–165. mm de Freitas Neto, O.C., Lages, S.L.S., Carrasco, A.O.T., Berchieri Júnior, A., 2009. Search for Salmonella spp. in ostrich productive chain of Brazilian southeast region. Trop. Anim. Health Produc. 41(8), 1607–1614. nn deFreitas Neto, O.C., Carrasco, A.D.O.T., Raso, T.D.F., Sousa, R.L.M.D., Berchieri Júnior, A., Pinto, A.A., 2009. Serosurvey of selected avian pathogens in Brazilian commercial rheas ( Rhea americana ) and ostriches ( Struthio camelus ). Revista Brasileira de Ciência Avícola, 11(4), 277–282. oo Keokilwe, L., Olivier, A., Burger, W.P., Joubert, H., Venter, E.H., Morar-Leather, D., 2015. Bacterial enteritis in ostrich ( Struthio camelus ) chicks in the Western Cape Province, South Africa. Poult. Sci. 94(6), 1177–1183. pp Khafagy, A.A.R., Kamel, A.M., 2003. Microbial contamination and other hatching problems causing dead-in shell in ostrich, Struthio camelus eggs during artificial incubation. Vet. Med. J. 49(3), 401–411. qq Tully, T. N. Jr, Shane, S. M., 1993. Salmonella pullorum seroconversion in emus ( Dromaius novaehollandiae ). Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, Nashville, Tennessee, USA, pp. 315–317. rr Vanhooser, S.L.,Welsh, R.D., 1995. Isolation of Salmonella species from ratites. J. Vet. Diagn. Invest. 7(2), 268–269. ss Welsh, R.D., Vanhooser, S.L., Dye, L.B., Nieman, R.W., 1997. Salmonella infection in ratites: diagnosis, epidemiology, and clinical significance. Vet. Med. 92(2), 193–198. tt Crole, M.R., Soley, J.T., Clift, S.J., 2013. Incidental Mycobacterium -induced granulomatous inflammation of the follicular pharyngeal tonsils in a South African farmed ostrich ( Struthio camelus ). J. South Afr. Vet. Assoc. 84(1), 1–9. uu García, A., LeClear, C.T., Gaskin, J.M., 2001. Mycobacterium avium infection in an ostrich ( Struthio camelus ). J. Zoo Wildl. Med. 32(1), 96–100. vv Kelly, P., Jahns, H., Power, E., Bainbridge, J., Kenny, K., Corpa, J.M., Cassidy, J.P., Callanan, J.J., 2013. Mycobacteriosis in ostriches (Struthio camelus ) due to infection with Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium complex. Avian Dis. 57(4), 808–811. ww Latch, P., 2007. National recovery plan for the southern cassowary Casuarius casuarius johnsonii . Report to Department of the Environment, Water, Heritage and the Arts, Canberra, Australia. Environmental Protection Agency, 38 pp. Available from: http://www.environment.gov.au/system/files/resources/79235f07-9c32-45fa-b868-eb248691e945/files/sth-cassowary.pdf xx Pocknell, A.M., Miller, B.J., Neufeld, J.L., Grahn, B.H., 1996. Conjunctival mycobacteriosis in two emus ( Dromaius novaehollandiae ). Vet. Pathol. 33(3), 346–348. yy Sanford, S.E., Rehmtulla, A.J., Josephson, G.K., 1994. Tuberculosis in farmed rheas ( Rhea americana ). Avian Dis. 38(1), 193–196. zz Botes, A., Peyrot, B.M., Olivier, A.J., Burger, W.P., Bellstedt, D.U., 2005. Identification of three novel mycoplasma species from ostriches in South Africa. Vet. Microbiol. 111(3–4), 159–169. aaa Wium, M., 2015. The development of a DNA vaccine against Mycoplasma nasistruthionis sp. nov. for use in ostriches. Doctoral dissertation, Stellenbosch University, Stellenbosch, Republic of South Africa, 259 pp. bbb Mohan, R., 1993. Mycoplasma in ratites. Proceedings of the Annual Meeting of the Association of Avian Veterinarians, Nashville, Tennessee, USA, pp. 294–296. ccc Speer, B.L., 1997. A summary of recent American Ostrich Research Foundation funded research projects and their findings. Citing: Cline, J.L., Turner, K.S., O'Connor, L.B., Gomez, L.B., Kleven, S.H., Rowland, G.N.: Mycoplasma synoviae in ostriches. Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians, Reno Nevada, USA, pp. 151–165. ddd Tebyanian, H., Mirhosseiny, S.H., Kheirkhah, B., Hassanshahian, M., 2014. Isolation and identification of Mycoplasma synoviae from suspected ostriches by polymerase chain reaction, in Kerman Province, Iran. Jundishapur J. Microbiol. 7(9), e19262. eee Wissman, M.A., Parsons, B., 1996. Mycoplasmosis in the common rhea ( Rhea americana ). J. Avian Med. Surg. 10(2), 28–30. Table e6 Select Helminth Infections and Disease in Large Ratites Proventricular/Ventricular Nematodes Libyostrongylus douglassii Libyostrongylus dentatus (Trichostrongyloidea) a , b , c , d , e , f Proventriculus and gizzard Ostrich (likely southern African origin, widespread distribution with animal movement) Blood feeding nematodes that burrow into the proventricular glands and under the koilin layer causing inflammation, which can be diptheritic. Red worms may be visible on necropsy. L douglassi (4–6 mm in length) is found on the mucosal surface, below the koilin layer. L. dentatus (6–12 mm in length) is most frequently within the koilin layer, but can also be found underneath it. Strongylid-type eggs are passed in feces. Wasting, anorexia, gastric stasis, proventricular impaction, fermentation of proventricular contents, and anemia may result. Mortality rates in chicks can be over 50%. In North and South America combined infections with L. dentatus occur, thus attribution of relative pathogenicity is impossible and many reports of disease cause by L. douglassii may in fact reflect mixed infections.Morphologic features of adults or infective larvae, and sequences of ITS1 and ITS2 regions can be used for separation of Libyostrongylus spp. from each other as well as from C. struthioni s. Libyostrongylus magnus (Trichostrongyloidea) g Proventriculus and gizzard Ostrich (identified in specimens from Ethiopia and possibly Sudan) Unlikely to be widely distributed as not identified in recent literature. Pathogenicity not known. Spirura (Sicarius) uncinipenis (Spiruroidea) h , i , j , k , m Proventriculus and ventriculus Common rhea (Brazil) Reddish hematophagous spirurid nematodes 18–30 mm in length located primarily below and within the koilin layer, may also be found in proventricular glands and proximal duodenum. Ulceration and detachment of koilin, ventricular mucosal thickening, congestion, hemorrhagic foci, and nematode migration tracts are present. On histologic examination, mild to moderate lymphocytic, histiocytic and heterophilic infiltrate in the mucosa, particularly surrounding parasites or free eggs. Increased parasite numbers and severity of lesions occurs in high density captive situations. Sicarius waltoni (Spiruroidea) d , m Ventriculus Common rhea (Brazil) Spirurid, 20–25 mm length. Spirura (Vaznema) zschokkei (Spiruroidea) j , l , m Proventriculus Common rhea Spirurid, 16–25 mm in length. Present in the submucosa. Odontospirura cetiopenis (Spiruroidea) j , l , n Proventriculus and ventriculus Rhea (South America) Spirurid, 15–23 mm in length. Intestinal Nematodes Deletrocephalus dimidiatus Deletrocephalus cesarpintoi Paradeletrocephalus minor (Strongyloidea) h , j , k , o , p , q Distal small and proximal large intestines ( D. dimiatus, D. minor ); cecum, large intestine, rectum ( D. minor ); large intestine and rectum ( D. cesarpintoi ) Rhea americana ( D. dimiatus —South America, North America, UK; D. cesarpintoi —South America; P. minor —South America), Rhea pennata ( D. dimidiatus —USA, P. minor —South America) Most reports concern D. dimiatus, other species are likely similar in behavior. Filiform white or pale yellow worms 11–24 mm in length. Blood feeder resulting in anemia, weakness, diarrhea in chicks; can cause high mortality in heavy infestations. Hemorrhage may be present in mucosa. Strongyle-type eggs. Both D. minor and D. dimiatus are also described from free-living birds. Codiostomum struthionis (Strongyloidea) d , j , r , s Cecum, large intestine Ostrich (likely southern African origin and widespread distribution with animal movement) Family Strongylidae. Large nematode of the cecum, found primarily in the distal third, 13–17 mm in length. Considered by some to be apathogenic but has been associated with mucosal edema and thickening, nodules filled with "purulent mucus," petechiae and small ulcers. On histology, villar atrophy, cryptal epithelial flattening and squamous metaplasia, and increased mononuclear cells in the submucosa may be present. Pathogenicity is not well determined; anemia or impaired growth may result. Morphologic keys are available to distinguish from the trichostrongylid nematodes. Eggs are indistinguishable from those of Libyostrongylus spp. Ascaridia orthocerca, Ascaridia sp. l , n , t Small intestine Common rhea (Brazil, USA) Worms 30–40 mm length. Dromaeostrongylus bicuspis l , n , t , u Small intestine Emu Australia, Russia, (USA) Moderate load of Dromaeostrongylus sp. was seen as an incidental finding in a farmed emu in Australia. Also seen in an emu in the Moscow zoo. Eggs similar to those of Trichostrongylus tenuis . Worms 6–8 mm in length. Trichostrongylus tenuis (Trichostrongyloidea) l Cecum Emu (USA) Incidental finding, worms 8–10 mm in length. Diagnosis was made by feeding eggs to chickens and identifying adult worms in their intestines. Tracheal/pulmonary nematodes Cyathostoma variegatum, Cyathostoma sp. (Strongyloidea) v , w Trachea and bronchi Emu (USA) Infection can be subclinical or result in respiratory disease; reported from young and juvenile birds. Infection assumed to result from exposure to waterfowl. Syngamus trachea (Strongyloidea) j , l , x Trachea Emu, rhea, ostrich (USA); emu (Germany) Especially problematic in young birds, clinical signs include gasping, head shaking, and expulsion of froth and blood from trachea. Filarial Nematodes (rare) Paronchocerca struthionis (Filarioidea) y Lungs, pulmonary arteries Ostrich (West Africa) Single description from nematode specimens, adults 31–45 mm in length. Microfilaria 100–123 mm in length. Dicheilonema spicularia (Filarioidea) t , z Peritoneal cavity, air sacs, retroperitoneal Ostrich (Southern Africa) Adult worms not described, microfilaria not identified from blood. Struthiofilaria megalocephala z Peritoneal cavity, air sacs Ostrich (Japan—imported) Identified as an incidental finding in the body cavity of an adult ostrich in Japan that had been imported from South Africa. Numerous worms were present, and ranged from 35 to 75.5 mm in length. Versternema struthionis t , aa Peritoneal cavity, air sacs Ostrich (Southern Africa) Adult worms 32.5–55 mm in length, microfilaria not identified from blood. Dicheilonema rheae (Filarioidea) k , l , t Peritoneal cavity, air sacs, between fascial planes including legs Rhea (Tadzikstan, Ukraine), common rhea (Brazil, USA, Uruguay) Worms can be 65 cm or more in length. Mortality reported but large numbers can be present in healthy birds. Contortospiculum rhea x Air sacs, abdominal cavity, subserosal surfaces Rhea Worms can be 80 cm in length. Mortality can occur with massive infestations; seen in birds newly imported into German zoos. Abberant Nematode Migration Chandlerella quiscali (Filarioidea) bb , cc Spinal cord and brain Emu (southeastern USA) Parasite migration through the brain and spinal cord results in severe neurological signs and high mortality in chicks. Disease outbreaks associated with increased presence of vector Culicoides crepuscularis (and possibly others). Passerine birds are the usual definitive hosts. Baylisascaris spp. (Ascaridoidea) dd , ee , ff Brain > spinal cord Emu, ostrich > rhea (North America) Migration of B. procyonis (natural host, raccoon) or, less likely, B. columnaris (natural host, skunk) larvae resulting in severe neurological signs. Nonsuppurative meningoencephalitis characterized by lymphoplasmacytic perivascular cuffing, myelin degeneration, focal malacia (parasitic tracts). Cerebellar white matter often particularly affected. Definitive diagnosis requires identification of nematode larvae in section but they are often not found, and are not necessarily adjacent to lesions. Cestodes Houttuynia struthionis (Davaineidae) k , l , n , t , gg , hh , ii Small intestine Ostrich (South Africa, has radiated with species), common rhea (Brazil, free ranging) Large, white, flat, segmented cestode, 30 cm–1 m in length. Can cause ill-thrift, mild diarrhea, enteritis, and possibly intestinal obstruction in ostrich chicks. Houttuynia struthionis var neogaeae jj Rhea (South America) Described from a single historical sample. Cittotaenia rhea n Intestine Rhea, (Brazil) 5–9 cm in length Intestine Cotugnia collini n Emu (Australia) 5–7 cm in length Raillietina australis, Raillietina beveridgei, Raillietina chiltoni, Raillietina dromaius, Raillietina mitchelli n , u , jj , kk Small intestine Emu (Australia) R. australis - 40 cm in length, R. beveridgei - up to 600 cm (relaxed), R. chiltoni - up to 90 cm (relaxed), R. dromaius - up to 200 cm (relaxed), R. mitchelli - up to 120 cm (relaxed). Units of cm are assumed, not specified in source. Prevalence varies regionally with very high burdens possible. No identified effect on host. Raillietina casuarii, Raillietina infrequens, Raillietina geraldschmidti n , u , jj , kk Intestine Southern cassowary ( R. casuarii , R. infrequens - Australia, New Guinea, R. geraldschmidti - Australia); Dwarf cassowary ( R. casuarii , R. infrequens - New Guinea) R. casuarii - up to 35 cm in length, R. infrequens - up to 8 cm in length, R. geraldschmidti - up to 4 cm in length. Chapmania tauricollis n Rhea (Brazil) No additional description provided. Trematodes Philophthalmus gralli (oriental eye fluke), Philophthalmus aweerensis (Philophthmidae) ll , mm , nn , oo Conjunctival sac Ostrich ( P. gralli ; Brazil, USA, Zimbabwe), rhea ( P. aweerensi s; UAE) Ratites are an unusual host. Ingested metacercaria excyst, migrate up the esophagus to the pharynx or directly enter the nasal passages and lacrimal ducts where they develop. Adults attach to the outside of the nictitating membrane, resulting in severe conjunctivitis and secondary loss of body condition. Blood tinged fluid, miracidia, and parasite eggs will be present. A freshwater snail is the intermediate host. Fasciola hepatica (presumptive) u Liver Emu (Australia) Discovered incidentally in two emus on pasture in an area where the parasite was endemic. Gross and histologic lesions were consistent with subacute to chronic fascioliasis, and included linear hemorrhagic and necrotic tracks, nonsuppurative portal hepatitis and fibrosis with cholangiolar hyperplasia, and the presence of dense brown/black pigment. Parasites and operculated eggs were seen in bile ducts on one animal. Three of 10 other emus in the flock passed trematode eggs resembling those of Fasciola hepatica . Acanthocephala Prosthorhynchus rhea l Intestine Rhea (South America) Life cycle unknown, may cause local inflammation and possibly peritonitis. Echinorhynchus reticulatus n Intestine Rhea (South America) Adult worms 1–1.7 cm in length, from a single sample. a Andrade, J.G.D., Carvalho, E.C.Q.D., Santos, C.D.P., DaMatta, R.A., 2011. Mixed infection with Libyostrongylus dentatus and Libyostrongylus douglassii induces a heterophilic inflammatory infiltrate in the proventriculus of ostriches. Avian Pathol. 40(4), 367–370. b Andrade, J.G., Iñiguez, A.M., Souza, A.N., Marques, V.C.L., de Souza Filho, G.A., Santos, C.P., DaMatta, R.A., 2013. Genetic characterization of the blood-sucking nematodes Libyostrongylus dentatus and Libyostrongylus douglassii supports their different evolutionary history. Vet. Parasitol. 193(1), 193–199. c de Paula Santos, C., de Andrade, J.G. and DaMatta, R.A., 2010. An update on Libyostrongylus : a gastro-intestinal nematode of ostriches. In: LaMann, G.V. (Ed.), Veterinary Parasitology. Nova Science Publishers Inc., Hauppage, New York, USA, pp. 179–192. d Ederli, N.B., de Oliveira, F.C.R., 2014. Comparative morphology of the species of Libyostrongylus and Codiostomum , parasites from ostriches, Struthio camelus , with a identification key to the species. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 23(3), 291–300. e Ederli, N.B., de Oliveira, F.C.R., 2009. Differential localization of Libyostrongylus douglassii (Cobbold, 1882) Lane, 1923 and L. dentatus Hoberg, Lloyd, and Omar, 1995 (Nematoda: Trichostrongylidae) in ostrich ( Struthio camelus Linnaeus, 1758) proventriculi. J. Parasitol. 95(3), 757–759. f Ederli, N.B., de Oliveira, F.C.R., Lopes, C.W.G., DaMatta, R.A., de Paula Santos, C., de Azevedo Rodrigues, M.D.L., 2008. Morphological diagnosis of infective larvae of Libyostrongylus douglassii (Cobbold, 1882) Lane, 1923 and L. dentatus Hoberg, Lloyd and Omar, 1995 (Nematoda: Trichostrongylidae) of ostriches. Vet. Parasitol. 155(3–4), 323–327. g Hoberg, E.P., Lloyd, S., Omar, H., 1995. Libyostrongylus dentatus n. sp. (Nematoda: Trichostrongylidae) from ostriches in North America, with comments on the genera Libyostrongylus and Paralibyostrongylus . J. Parasitol. 81(1), 85–93. h de Oliveira Avelar, I., de Almeida, L.R., dos Santos, H.A., dos Santos Lima, W, Lara, L.B., Ecco, R., 2014. Sicarius uncinipenis and Deletrocephalus cesarpintoi in captive greater rheas of Minas Gerais State, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 23(3), 355–359. i Ederli, N.B., de Oliveira, F.C.R., 2014. Macroscopic lesions of the ventriculus of Rhea americana , Linnaeus, 1758 (Aves: Rheidae) naturally infected by Sicarius uncinipenis (Molin, 1860)(Nematoda: Habronematidae). J. Parasitol. 100(6), 860–863. j Taylor, M.A., Coop, R.L., Wall, R.L., 2016. Parasites of Exotics. In: Veterinary Parasitology, fourth ed. Wiley Blackwell, West Sussex, UK, pp. 893–920. k Zettermann, C.D., Nascimento, A.A., Tebaldi, J.A., Szabó, M.J.P., 2005. Observations on helminth infections of free-living and captive rheas ( Rhea americana ) in Brazil. Vet. Parasitol. 129(1), 169–172. l Craig, T.M., Diamond, P.L., 1996. Parasites of Ratites. In: Tully, T.N.J., Shane, S.M. (Eds.), Ratite Management, Medicine and Surgery. Krieger Publishing Company, Malabar, Florida, pp. 115–126. m Teixeira de Freitas, J.F., Lent, H., 1947. "Spiruroidea" parasitos de "Rheiformes" (Nematoda). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 45 (4), 743–760. n Lesbouyries G., 1941. La pathologie des oiseaux. Vigot Frères, Paris, France, pp. 709–710. o Acomolli, J., Ocayo, D., Santa Cruz, A.C., Milan, F., Roux, J.P., 2006. Aspectos morfológicos de Paradeletrocephalus minor (Molin, 1861) Freitas & Lent, 1947, en ñandu ( Rhea americana ), por medio de miscroscopio de luz y microscopioelectrónico de barrido. Parasitología Latinoamericana, 61(3–4), 183–187. p Ederli, N.B., Oliveira, F.C.R., 2017. Morphology of the nematode Deletrocephalus dimidiatus Diesing, 1851 from the rhea, Rhea americana Linnaeus, 1758, together with a key to species of Deletrocephalinae. J. Helminthol. 91(2), 244–254. q Ewing, M.L., Yonzon, M.E., Page, R.K., Brown, T.P., Davidson, W.R., 1995. Deletrocephalus dimidiatus infestation in an adult rhea ( Pterocnemia pennata ). Avian Dis. 39(2), 441–443. r de Oliveira, F.C.R., Ederli, N.B., Lopes, C.W.G., de Azevedo Rodrigues, M. de L., 2009. Pathological findings in the caeca of naturally infected ostriches, Struthio camelus Linnaeus, 1758 (Aves, Struthionidae) parasitized by Codiostomum struthionis (Horst, 1885) Railliet and Henry, 1911 (Nematoda, Strongylidae). Vet. Parasitol. 165(1), 175–178. s Ederli, N.B., de Oliveira, F.C.R., de Azevedo Rodrigues, M. de L., 2008. Further study of Codiostomum struthionis (Horst, 1885) Railliet and Henry, 1911 (Nematoda, Strongylidae) parasite of ostriches ( Struthio camelus Linnaeus, 1758)(Aves, Struthioniformes). Vet. Parasitol. 157(3), 275–283. t Huchzermeyer, F.W., 1998. Diseases of Ostriches and Other Ratites. Agricultural Research Council, Onderstepoort Veterinary Institute, Onderstepoort, Republic of South Africa, 296 pp. u Vaughan, J.L., Charles, J.A., Boray, J.C., 1997. Fasciola hepatica infection in farmed emus ( Dromaius novaehollandiae ). Austr. Vet. J. 75(11), 811–813. v Rickard, L.G., Steinohrt, L.A., Black, S.S., 1997. Subclinical cyathostomiasis and unidentified helminthiasis in a juvenile emu ( Dromaius novaehollandiae ). Avian Dis. 41(4), 993–996. w Watters, C.E., Joyce, K.L., Heath, S.E., Kazacos, K.R., 1994. Cyathostoma infection as the cause of respiratory distress in emus ( Dromaius novaehollandiae ). Proceedings of the Annual Conference of the Assocation of Avian Veterinarians, Reno, Nevada, USA, pp. 151–155. x Goltenboth, R., 1982. Birds. In: Klos, H.-G., Lang, E.M. (Eds.), Handbook of Zoo Medicine, Van Nostrand Reinhold Company, New York, New York, USA, pp. 325–355. y Bartlett, C.M., Anderson, R.C., 1986. Paronchocerca struthionus n. sp. (Nematoda: Filarioidea) from ostriches ( Struthio camelus ), with a redescription of Paronchocerca ciconiarum Peters, 1936 and a review of the genus. Can. J. Zool. 64(11), 2480–2491. z Noda, R., Nagata, S., 1976. Struthiofilaria megalocephala gen. et sp. n. (Nematoda: Filarioidea) from the body cavity of an ostrich. Bulletin of the University of Osaka Prefecture. Series B. Agriculture and Biology, 28, 1–4. aa Bain, O., Chabaud, A.G., Burger, W.P., 1992. Versternema struthionis N. Gen., N. Sp., filaire archaique à morphologie peu spécialisée. Ann. Parasitol. Hum. Comp. 67 (5),141–143. bb Blue-McLendon, A., Graham, D.L., Ambrus, S.I., Craig, T.M., 1992. Cerebrospinal nematodiasis in emus. Proceedings of the Annual Meeting of the Association of Avian Veterinarians, New Orleans, Louisiana, USA, pp. 326–327. cc Law, J.M., Tully, T.N., Stewart, T.B., 1993. Verminous encephalitis apparently caused by the filarioid nematode Chandlerella quiscali in emus ( Dromaius novaehollandiae ). Avian Dis. 37(2), 597–601. dd Kazacos, K.R., Fitzgerald, S.D., Reed, W.M., 1991. Baylisascaris procyonis as a cause of cerebrospinal nematodiasis in ratites. J. Zoo Wildl. Med. 22(4), 460–465. ee Kazacos, K.R., Winterfield, R.W., Thacker, H.L., 1982. Etiology and epidemiology of verminous encephalitis in an emu. Avian Dis. 26(2), 389–391. ff Kwiecien, J.M., Smith, D.A., Key, D.W., Swinton, J., Smith-Maxie, L., 1993. Encephalitis attributed to larval migration of Baylisascaris sp. in emus. Can. Vet. J. 34(3), 176–178. gg Fockema, A., Malan, F.S., Cooper, G.G., Visser, E., 1985. Anthelmintic efficacy of fenbendazole against Libyostrongylus douglassi and Houttuynia struthionis in ostriches. J. South Afr. Vet. Assoc. 56(1), 47–48. hh Gruss, B., Malan, F.S., Roper, N.A., Du Plessis, C.A., Ashburner, A.J., 1988. The anthelmintic efficacy of resorantel against Houttuynia struthionis in ostriches. J. South Afr. Vet. Assoc. 59(4), 207–208. ii Ponce Gordo, F., Corraleche, L., García Durán, B., Martínez Díaz, R., 2001. First findings of Houttuynia struthionis (Cestoda: Davaineidae) in ostriches ( Struthio camelus ) hatched and raised in Spain. RevistaIbérica de Parasitología, 61(3–4), 79–82. jj Baer, J.-G., 1928. Note sur les ténias des autruches. Bulletin de la Société Neuchâteloise des Sciences Naturelles, 52, 7–13. kk O'Callaghan, M., 2004. Studies on the systematics of the cestodes infecting the emu, Dromaius novaehollandiae (Lathan, 1790) (Thesis). The University of Adelaide, Adelaide, Australia, 236 pp. ll Greve, J.H., Harrison, G.J., 1980. Conjunctivitis caused by eye flukes in captive-reared ostriches. J. Am. Vet. Med. Assoc. 177(9), 909–910. mm Mukaratirwa, S., Hove, T., Cindzi, Z.M., Maononga, D.B., Taruvinga, M., Matenga, E., 2005. First report of an outbreak of the oriental eye-fluke, Philophthalmus gralli (Mathis & Leger 1910), in commercially reared ostriches ( Struthio camelus ) in Zimbabwe. Onderstepoort J. Vet. Res. 72(3), 203–206. nn Schuster, R.K., 2011. Philophthalmus aweerensis n. sp. (Trematoda: Philophthalmidae) found in a rhea ( Rhea americana ) in the United Arab Emirates. Parasitol. Res. 109(4), 1029–1033. oo Verocai, G.G., Lopes, L.N., Burlini, L., Correia, T.R., de Souza, C.P., Coumendouros, K., 2009. Occurrence of Philophthalmus gralli (Trematoda: Philophthalmidae) in farmed ostriches in Brazil. Trop. Anim. Health Prod. 41(7), 1241–1242. Table e7 Select Intestinal Coccidia of Large Ratites Ratite Group Coccidial Entity Comments Ostrich a , b , c Isospora struthionis , Isospora sp., enteric "coccidia" I. struthionis n. sp. was identified from coccidial oocysts (sporulated—2 sporocysts/oocyst, each with four sporozoites) in the feces of an ostrich from a zoo in Turkmenistan. Sotiraki et al. (2001) later identified an Eimeria sp. coccidia (sporulated—4 sporocysts/oocyst) in the feces of ostriches in Greece. Coccidia are commonly described as being present in ostrich feces, and their presence was specifically evaluated by Mushi et al. (1998) in ostrich chicks in Botswana, but descriptions of organisms in histologic sections of intestine and substantiated evidence of clinical disease have not been presented. Emu d Isospora dromaii, enteric "coccidia" I. dromaii n. sp. was described based on morphologic criteria, including observation of sporulated oocysts, from fecal samples from farmed emu in Brazil. Coccidial oocysts have been identified in the feces of emus less frequently than in ostriches. Common rhea e Isospora sp., enteric "coccidia" Coccidial oocysts are infrequently identified in the feces of the common rhea. In one report these were further characterized as Isospora sp., but no descriptive data was provided. a Yakimoff, W.L., 1940. Isospora struthionis n. sp., coccidie de l'autruche africaine. Annales de la Société Belge de Médecine Tropicale, 20, 137–138. b Mushi, E.Z., Isa, J.F.W., Chabo, R.G., Binta, M.G., 1998. Coccidia oocysts in the faeces of farmed ostrich ( Struthio camelus ) chicks in Botswana. Onderstepoort J. Vet. Res. 65(4), 281–284. c Sotiraki, S.T., Georgiades, G., Antoniadou-Sotiriadou, K., Himonas, C.A., 2001. Gastrointestinal parasites in ostriches ( Struthio camelus ). Vet. Rec. 148(3), 84–86. d dos Santos Teixeira, C., Gallo, S.S.M., Ederli, N.B., Berto, B.P., de Oliveira, F.C.R., 2014. Isospora dromaii n. sp. (Apicomplexa, Eimeriidae) isolated from emus, Dromaius novaehollandiae (Casuariiformes, Casuariidae). Parasitol. Res. 113(11), 3953–3955. e Faust, B.S., Pappas, P.W., 1977. A survey of coccidia and helminth parasites of birds at the Columbus (Ohio) zoo. J. Zoo Anim. Med. 8(1), 18–23. Table e8 Select Louse and Mite Infestations in Large Ratites Parasite Group Host Species of Parasite Comment * Mallophaga (chewing lice) Ostrich Struthiolipeurus struthionis a , b Common. Feeds on the body scales and feather debris of ostriches and causes irritation and excessive grooming resulting in feather damage and loss. Adult lice are 3–4 mm long and readily visible, and eggs (nits) can be found on the underside of feathers attached to the barbs near the shaft. Ostrich Struthiolipeurus rheae c Identified from ostriches in Brazil. Ostrich Struthiolipeurus nandu a , d Identified from an ostrich in a Spanish zoo. Ostrich Struthiolipeurus rheae e Heavy infestation can result in pruritis and feather damage or loss. Common rhea Struthiolipeurus nandu, Struthiolipeurus rheae, Struthiolipeurus renschi, Struthiolipeurus stresemanni, Meinertzhageniella (Lipeurus) lata a , e , f , g Heavy infestation can result in pruritis and feather damage or loss. Lesser rhea Struthiolipeurus andinus, Meinertzhageniella schubarti a Disease not described. Emu Dahlemhornia asymmetrica a Disease not described. Acari (feather mites) Ostrich Gabucinia sculptura ( Struthiopterolichus sculpturatus ), Gabucinia abbreviata a , c Heavy infestation can result in feather damage. Ostrich Gabucinia nouveli h Identified from an ostrich in a French zoo that had been imported from central Africa, unusually, lesions were present on the skin rather than on the feathers. Ostrich, common rhea Gabucinia bicaudata ( Struthiopterolichus bicaudatus ) a , b , h , e Heavy infestation can result in pruritis and feather damage or loss. Ostrich, common rhea Paralges (Dermoglyphus) pachycnemis e Disease not described. Southern cassowary Hexacaudalges casuaricolus i Single identification from a wild cassowary in Australia. a Huchzermeyer, F.W., 1998. Diseases of Ostriches and other Ratites. Agricultural Research Council, Onderstepoort Veterinary Institute, Onderstepoort, Republic of South Africa. b Mohammed, B.R., Malang, S.K., 2015. Common ectoparasites of ostrich (Struthio camelus ) and their control - A review. Research J. Anim. Vet. Fish. Sci. 3(10), 23–29. c Pesenti, T.C., da Silva, D.S., Bertacco, L.L., Brum, J.G.W., Müller, G., 2009. Record of Struthiopterolichus sculpturatus and Struthiolipeurus rheae in Struthio camelus in the Rio Grande do Sul State, Brazil. Ciência Rural, 39(8), 2546–2549. d Dominguez de Tena, M., Hernández Rodriguez, S., Becerra Martell, C., Calero Carretero, R., Moreno Montañez, T., Martinez Gómez, F., 1976. Struthiolipeurus nandu 1950 (Mallophaga: Philopteridae) parásito del avestruz ( Struthio camelus ) en el parque zoológico de Córdoba. Revista iberica de parasitologia (36), 167–173. e Ponce Gordo, F., Herrera, S., Castro, A.T., García Durán, B., Martínez Díaz, R.A., 2002. Parasites from farmed ostriches ( Struthio camelus ) and rheas ( Rhea americana ) in Europe. Vet. Parasitol. 107(1–2), 137–160. f Weisbroth, S. H., Seelig, A. W., 1974. Struthiolipeurus rheae (Mallophaga: Philopteridae), an ectoparasite of the common rhea ( Rhea americana ). J. Parasitol. 60(5), 892–894. g Sinkoc, A.L., Muller, G., Brum, J.G.W., Soares, M.P., Oliveira, L.T. and Gonçalves, I.P.D., 2005. Ocorrência de Struthiolipeurus rheae (Phthiraptera: Ischnocera, Philopteridae) em Rhea americana (Rheiformes: Rheidae) no Brasil. Arquivos do Instituto Biológico, 72(4), 535–538. h André, M., 1960. Sarcoptides plumicoles parasites des autruches. Acarologia, 2, 556–567. i Mironov, S.V., Proctor, H.C., 2005. A new feather mite genus of the family Psoroptoididae (Acari: Analgoidea) from cassowaries. J. Nat. Hist. 39(37), 3297–3304. * Many reports simply identify the presence of the above ectoparasites, often in the absence of clinical signs or pathologic changes. It is supposed that pruritis and feather loss and damage can occur with sufficient intensity of infection of any of the above species.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9217952/

Participatory mapping identifies risk areas and environmental predictors of endemic anthrax in rural Africa

Disease mapping reveals geographical variability in incidence, which can help to prioritise control efforts. However, in areas where this is most needed, resources to generate the required data are often lacking. Participatory mapping, which makes use of indigenous knowledge, is a potential approach to identify risk areas for endemic diseases in low- and middle-income countries. Here we combine this method with Geographical Information System-based analyses of environmental variables as a novel approach to study endemic anthrax, caused by the spore-forming bacterium Bacillus anthracis , in rural Africa. Our aims were to: (1) identify high-risk anthrax areas using community knowledge; (2) enhance our understanding of the environmental characteristics associated with these areas; and (3) make spatial predictions of anthrax risk. Community members from the Ngorongoro Conservation Area (NCA), northern Tanzania, where anthrax is highly prevalent in both animals and humans, were asked to draw areas they perceived to pose anthrax risks to their livestock on geo-referenced maps. After digitisation, random points were generated within and outside the defined areas to represent high- and low-risk areas, respectively. Regression analyses were used to identify environmental variables that may predict anthrax risk. Results were combined to predict how the probability of being a high-risk area for anthrax varies across space. Participatory mapping identified fourteen discrete high-risk areas ranging from 0.2 to 212.9 km 2 in size and occupying 8.4% of the NCA. Areas that pose a high risk of anthrax were positively associated with factors that increase contact with Bacillus anthracis spores rather than those associated with the pathogen's survival: close proximity to inland water bodies, where wildlife and livestock congregate, and low organic carbon content, which may indicate an increased likelihood of animals grazing close to soil surface and ingesting spores. Predicted high-risk areas were located in the centre of the NCA, which is likely to be encountered by most herds during movements in search for resources. We demonstrate that participatory mapping combined with spatial analyses can provide novel insights into the geography of disease risk. This approach can be used to prioritise areas for control in low-resource settings, especially for diseases with environmental transmission. Introduction Understanding the spatial distribution of infectious diseases and the factors driving geographical heterogeneities in their incidence is fundamental to epidemiology 1 . However, in many low- and middle-income countries where disease burdens are high, our ability to map diseases and unravel their underlying processes is compromised by limited infrastructure and resources for surveillance. This is especially the case in the most remote areas where systems for disease surveillance are typically lacking and are beyond the means of local health budgets. Economic constraints also adversely affect the ability of local governments to implement appropriate disease prevention and control strategies to respond to disease threats. To enable prioritisation of areas for targeted interventions, low-cost approaches for mapping areas of disease occurrence and risk are therefore required. A number of methods may be employed to map spatial patterns of disease, including those that utilise incidence data from passive surveillance, active surveillance and surveys 2 – 6 . However, these methods may provide an incomplete picture (e.g. passive surveillance) or may be impractical and costly to implement in remote areas with limited infrastructure (e.g. active surveillance and targeted surveys) 7 . In addition, depending on the nature of the pathogen under investigation, sampling for disease confirmation may pose health risks to operators on the ground. An alternative approach that offers promise is the use of participatory mapping. This is a form of participatory research, reliant on the generation of research data through consultations with relevant local communities, thereby making use of indigenous knowledge 8 . For example, pastoralists of East Africa are renowned for their understanding of their environment, and their ability to recall incidents relating to their livestock's health and productivity even over long periods of time 9 , 10 . Participatory mapping tools are increasingly being used for disease surveillance; successful examples include applications to vector-borne disease control such as mapping mosquito abundance to understand risk areas for dengue 11 or malaria 12 . Moreover, where these approaches can be integrated with Geographic Information System (GIS) and spatial analyses, they have strong potential to generate more quantitative and mechanistic information about disease risk 13 . One pathogen that typifies many of the surveillance challenges discussed above in low- resource settings is Bacillus anthracis . B. anthracis is a spore-forming bacterium that causes anthrax, a zoonotic disease (i.e. a disease that can be transmitted between animals and humans) that remains endemic in many developing countries. Anthrax leads to sudden death in herbivorous animals (both livestock and wildlife) and is potentially fatal in humans who contract infection from handling or eating carcasses, animal products or biological materials contaminated with B. anthracis spores. Once spores enter the host, they germinate into vegetative forms capable of replicating and producing toxins that are the eventual cause of death 14 . Upon death of the host, the vegetative forms are released into the environment where they sporulate, hence perpetuating the cycle. Anthrax spores may persist for decades in contaminated soil 14 , presenting a long-lasting risk of infection to susceptible hosts. Anthrax endemic areas are often located in remote settings which makes surveillance problematic. Therefore, data on human anthrax cases tend to be patchy and insufficient to reflect distribution of disease. Case under-reporting and under-/mis-diagnosis are important reasons for the limited data available. For example, affected individuals are often unable to access medical facilities due to poor infrastructure (e.g. roads) or the high costs involved 15 , and therefore medical records poorly reflect disease incidence. Limited awareness of the clinical presentation of the disease may also be responsible for poor reporting. This is especially the case for the forms of the disease characterised by less specific clinical signs and symptoms, or by diagnostic challenges, for example gastrointestinal anthrax 16 . Our earlier studies in Tanzania highlighted that existing medical records are insufficient to reflect disease incidence, but that case-fatality rates are as high as 50% when cases are actively investigated 4 . Official data on anthrax in animals are equally patchy. An additional challenge to anthrax surveillance is that its detection involves the collection of highly infectious diagnostic samples from animal or human hosts or the environment. The resulting biosafety hazards lead to reluctance to engage in field surveillance, and therefore a general lack of data on fine-scale disease patterns. In addition, in most anthrax-endemic areas, animal carcass survival is challenged by high ambient temperatures, and presence and activity of local scavenger populations. Even when samples are collected, poor diagnostic expertise and infrastructure limit their use for diagnostic confirmation 17 . The spatial risk of anthrax has never been studied using participatory mapping methods, yet much can be gained from local communities' knowledge of the disease and of the environments that may pose the greatest risks to their animals. To address this gap, our study focuses on anthrax in hyper-endemic settings of northern Tanzania, to identify and characterize areas of risk using participatory mapping as a safe alternative to traditional surveillance. For pathogens with an environmental phase, like B. anthracis, information on areas of risk as determined through participatory mapping can be combined with environmental data to understand factors that make these areas suitable for pathogen persistence. Factors associated with the survival of B. anthracis in the environment include temperature, pH, nutrient and oxygen availability, all thought to also influence sporulation 18 , as well as precipitation and moisture, organic matter, inorganic calcium, vegetation and soil topography 19 . Since anthrax occurrence is often localised, geographical areas affected by the disease may be characterised by distinct environmental features, but these heterogeneities are not well understood 2 . Factors that promote the occurrence of anthrax can be grouped into conditions that are associated with the survival of B. anthracis in the environment (spore survival) and/or the likelihood of spores coming in contact with a suitable host (exposure). For instance, soil alkalinity and both extreme drought and rainfall have been associated with anthrax occurrence in some parts of Africa 20 – 22 . While dry conditions (e.g. caused by lack of rainfall) and alkaline soil promote spore formation and survival, heavy rainfall and close proximity to water bodies may facilitate transmission to animals by the action of water unearthing spores and washing them into water bodies where animals congregate. Arguably, spore survival and transmission are both critical, however it is unclear whether both drive the risk of anthrax to the same extent. A participatory mapping approach is particularly well suited to the study of anthrax in pastoral communities, who typically move their livestock in search of resources (e.g. grazing and watering). Since the incubation period for animal anthrax can range from a few hours to 21 days 14 , an infected animal may travel a long distance before clinical signs appear or death occurs. This means that environmental characteristics of the place where an animal became infected might differ from those where it succumbed to the disease. However, livestock owners will know where their animals had been at the likely time of infection and thus develop knowledge about potential risk areas over time. Participatory mapping allows us to tap into this knowledge and thus to acquire epidemiologically relevant information that is not available from mapping disease cases based on the location of occurrence. In this study, we mapped animal anthrax-risk areas as defined by livestock-owning communities during participatory mapping sessions in an anthrax-endemic region of Tanzania, the Ngorongoro Conservation Area (NCA). We subsequently tested whether areas of risk were linked with environmental factors that had been previously shown to be associated with anthrax occurrence. These analyses enabled us to enhance our understanding of environmental characteristics that might explain why perceived risk areas are likely to be favourable for anthrax occurrence, in terms of spore survival and/or transmission to animals. We used this information to predict the risk of anthrax across the NCA. Methods Study area The NCA encompasses an area of 8292 km 2 and in 2020 had approximately 87,000 inhabitants 23 , who are primarily dependent on livestock for their livelihoods. It is a multiple-use area where people coexist with wildlife and livestock, and practise pastoralism with transhumance, characterised by seasonal movements of livestock for accessing resources such as grazing areas and water. The NCA comprises eleven administrative wards: Alailelai, Endulen, Eyasi, Laitole, Kakesio, Misigiyo, Ngorongoro, Naiyobi, Nainokanoka, Ngoile and Olbalbal (Fig. 1 ). The NCA was chosen for our study as it is known to be hyperendemic for anthrax 4 , 17 , 20 . In addition, informal consultations we held prior to the study, as well as tailored data collection at the community and household level, indicated that local communities have a good understanding of the disease in humans and animals, and of practices around carcass and livestock management that increase risks, particularly in certain locations and periods of the year 24 . Figure 1 Locations of participatory mapping. Map showing the 11 administrative wards of the Ngorongoro Conservation Area in northern Tanzania and the locations where participatory mapping sessions took place (red dots). The maps were produced in QGIS 2.18.2 using data from the National Bureau of Statistics, Tanzania ( http://www.nbs.go.tz/ ). Ethics approval and consent to participate The study received approval from the National Institute for Medical Research, Tanzania, with reference number NIMRJHQ/R.8a/Vol. IX/2660; the Tanzania Commission for Science and Technology (numbers 2016-94-NA-2016-88 (O. R. Aminu), 2016-95-NA-2016-45 (T. L. Forde) and 2018-377-NA-2016-45 (T. Lembo)); Kilimanjaro Christian Medical University College Ethics Review Committee (certificate No. 2050); and the University of Glasgow College of Medical Veterinary & Life Sciences Ethics Committee (application number 200150152). Approval and permission to access communities and participants were also obtained from relevant local authorities. Written informed consent was obtained from all participants involved in the study. All data collected were analysed anonymously, ensuring the confidentiality of participants. All research activities were performed in accordance with relevant guidelines and regulations. Participatory mapping A participatory mapping approach based on methodology previously tested in East Africa 25 was employed to define areas of anthrax risk for animals in the NCA based on community knowledge. Georeferenced maps of the NCA were produced using data from Google and DigitalGlobe (2016). The maps used datum Arc 1960/UTM zone 36S and grid intervals of 1000 km and were produced at 1:10,000 and 1:50,000 scales, in order to provide participants with a choice. Ten participatory mapping focus groups were held at ward administrative level (Fig. 1 ) in order to identify areas in the NCA that communities perceive as posing a high risk of anthrax. One mapping exercise was held in each ward. Ngoile and Olbalbal wards were covered at the same time and treated as one, as they had only recently (in 2015) been split from one ward (Olbalbal). Each session had between ten and thirteen participants, who consisted of village and ward administrators, animal health professionals (including community animal health workers and livestock field officers), community leaders, and selected community members. These participants represented members of the community concerned with animal health and owning livestock and, as such, were likely to hold in-depth knowledge relating to community experience of animal health and disease, including anthrax. Participants were recruited by consulting with animal health professionals as well as village and ward administrators, who gave permission to conduct the mapping sessions. The mapping sessions were conducted in Swahili and translated into English by an interpreter. Participants' general knowledge of the area was first verified by testing whether they could correctly identify popular locations such as health centres, places of worship, markets and schools. Subsequently, participants discussed among themselves and came to a consensus about areas they considered to be at high risk of anthrax. Specifically, we asked them to identify locations they perceived as areas where they considered their animals to be at risk of being exposed to anthrax. These areas were drawn on the maps provided (Fig. 2 ). While they did not locate areas where the animals had succumbed to disease, we also asked for generic information on locations where anthrax outbreaks had occurred in the past to define areas that could be targeted for active surveillance of cases. In order to improve the fidelity of the data, participants defined risk areas in relation to their own locality (ward) and locations where their animals access resources. Therefore, the areas were not defined by administrative boundaries, as communities may access locations outside their wards, for instance for grazing or watering. The resulting maps were scanned, digitised and analysed as detailed in the following sections. Further detail on the participatory mapping process is provided in the Supplementary Methods (Additional File 1 ). Figure 2 Participatory mapping of anthrax risk areas in the Ngorongoro Conservation Area. Images show ( A ) the set-up of a mapping session, ( B ) participants engaged during a session and ( C ) an example of a 1:50,000 scale map annotated by participants. The map was created with QGIS opensource mapping software. The basemap used was a scanned and geo-referenced full colour 1:50,000 scale topographic map produced by the Surveys & Mapping Division, Ministry of Lands, Housing & Human Settlements, Dar es Salaam, Tanzania. The grid is based on the Arc1960 UTM 36S projection and datum. The map was exported from QGIS in Acrobat Pdf format to enable it to be printed at suitable sizes for using in the fieldwork and to be manually annotated during the participatory mapping. Digitisation of maps and generation of random points Scanned maps were saved as PDF files and converted to high resolution TIFF files for digitisation in QGIS 2.18.2-Las Palmas free OpenSource software 26 . All maps were georeferenced with geographical coordinates during production and reference points were available to enable the precise mapping of all locations. The digitization was carried out using the QGIS digitizing tools and by creating polygon layers of the defined risk areas. Sourcing data on the environmental predictors of anthrax Available soil and environmental data (250 m grid) for Tanzania were obtained from various sources (Table 1 ). From the available data, we selected the following seven variables which have previously been shown to contribute to or explain the risk of anthrax based on the biology of B. anthracis (Table 1 ). Table 1 Environmental factors with potential to influence anthrax occurrence. Variable Source (website) Research evidence associated with variable Predicted association with high-risk areas Cation exchange capacity (CEC) SoilGrids ( https://soilgrids.org ) 19 , 22 Positive. CEC is used as a proxy for soil calcium. High calcium promotes anthrax persistence pH SoilGrids ( https://soilgrids.org ) 19 Positive. B. anthracis spores have been shown to survive best in alkaline soils (pH > 6) Distance to inland water bodies (DOWS) SurfaceWater ( https://global-surface-water.appspot.com/ ) 18 , 20 , 22 Unknown. Anthrax has been shown to occur in dry areas but has also been reported to occur near water sources Average enhanced vegetation index (EVI), 2000–2016 Africa Soil Information Service ( http://africasoils.net/ ) 19 , 20 Unknown. Higher or lower EVI may promote the risk of anthrax Average daytime land surface temperature (LSTD), 2001–2015 Africa Soil Information Service ( http://africasoils.net/ ) 19 Positive. Anthrax occurrence is associated with places having elevated temperature Slope Open Topography ( http://opentopo.sdsc.edu ) 19 Negative. Anthrax has been observed more often in flat topography Predicted topsoil organic carbon content (SOC) SoilGrids ( https://soilgrids.org ) 18 Positive. Soils with high organic matter may retain spores more readily Data were obtained for Tanzania in 2017. Cation exchange capacity (CEC) Measured in cmol/kg, CEC is the total capacity of the soil to retain exchangeable cations such as Ca 2+ , Mg 2+ etc. It is an inherent soil characteristic and is difficult to alter significantly. It influences the soil's ability to hold on to essential nutrients and provides a buffer against soil acidification 27 . CEC has been reported to be positively correlated with anthrax risk. In addition, CEC is a proxy for calcium content, which may contribute to anthrax risk in a pH-dependent manner as explained below 19 , 22 . Predicted topsoil pH (pH) Soil pH below 6.0 (acidic soil) is thought to inhibit the viability of spores 19 thus a positive effect of higher pH on the risk of anthrax is expected. It has been suggested that the exosporium of B. anthracis is negatively charged in soils with neutral to slightly alkaline pH. This negative charge attracts positively charged cations in soil, mainly calcium, enabling the spores to be firmly attached to soil particles and calcium to be maintained within the spore core, thereby promoting the viability of B. anthracis 19 , 28 . Distance to inland water bodies (DOWS) Both the distance from water and proximity to water may increase anthrax risk. Distance to inland water may indicate the degree to which an area is dry/arid. Anthrax outbreaks have been shown to occur in areas with very dry conditions 19 . Although anthrax occurrence has also been associated with high soil moisture, this relates more to the spore germination in the environment (a mechanism that is disputed) and the concentration of spores in moist humus that amount to an infectious dose 18 , 29 . Spores will survive much longer in soils with low moisture content 19 . Low moisture may also be associated with low vegetation which results in animals grazing close to the soil, increasing the risk of ingesting soil with spores. Hampson et al . reported that anthrax outbreaks occurred close to water sources in the Serengeti ecosystem of Tanzania in periods of heavy rainfall 20 , and Steenkamp et al. found that close proximity to water bodies was key to the transmission of B. anthracis spores in Kruger National Park, South Africa 22 . Water is an important resource for livestock and a large number of animals may congregate at water sources during dry seasons. The close proximity of a water source to a risk area may increase the chance of infection, particularly during periods of high precipitation which might unearth buried spores. Average enhanced vegetation index (EVI) Vegetation density may influence the likelihood of an animal ingesting soil or inhaling dust that may be contaminated with spores. Grazing animals are more likely to encounter bacteria in soil with low vegetation density 20 , although there is a possibility that spores can be washed onto higher vegetation by the action of water 19 . Vegetation index may also reflect the moisture content of soil. Arid/dry conditions favour the formation and resistance of spores in the environment, thus lower vegetation may be associated with the occurrence of anthrax. Average daytime land surface temperature (LSTD) Anthrax has been more commonly reported to occur in regions with warmer climates worldwide. Minett observed that under generally favourable conditions and at 32 °C to 37 °C, sporulation of B. anthracis occurs readily but vegetative cells are more likely to disintegrate at temperatures below 21 °C 30 . Another hypothesis for the association of high temperature with anthrax occurrence is altered host immune response to disease due to stress caused by elevated temperatures 19 . In addition, elevated temperatures are usually associated with arid areas where vegetation is low, limiting access to adequate nutrition, which in turn affects immunity. Similarly, in hotter climates where infectious diseases occur more often, host interactions with other pathogens may modulate immune response to anthrax 31 . In this case, a lower infectious and lethal dose of spores would be sufficient to cause infection and death, respectively 19 . Contact with and ingestion of soil, spores and abrasive pasture is also higher with low vegetation in hot and arid areas 19 , 32 . In boreal regions such as in northern Canada, where anthrax occurs in wood bison, and Siberia, the disease is more commonly reported in the summer 19 . We therefore hypothesised a positive effect of LSTD on the risk of anthrax. Slope Spores of B. anthracis are hypothesized to persist more easily in flat landscapes that are characterised by shallow slopes 19 , as it is thought that wind and water may disperse spores more easily along areas with a higher slope gradient, thereby decreasing the density of spores to levels that may be insufficient to cause infection in a susceptible host. Therefore, we expected a negative relationship between slope and the risk of anthrax. Predicted topsoil organic carbon content (SOC) Organic matter (g/kg) may aid spore persistence by providing mechanical support. The negatively charged exosporium of spores is attracted to the positive charges on hummus-rich soil, thus anthrax is thought to persist in soil rich in organic matter 18 . Based on available evidence, we expected a positive effect of SOC on the risk of anthrax. Creating the dataset The annotated and digitised maps yielded polygons of high-risk areas within the NCA (Fig. 3 ). After digitization, 5000 random points were generated 33 to cover the 8292 km 2 area of the NCA. This enabled us to obtain distinct points allowed by the 250 m grid resolution of the environmental variables. Points falling within the defined risk areas were selected to represent risk areas while those falling outside represented low-risk areas. Measures of the environmental characteristics associated with individual points were obtained with the 'add Raster data to points' feature in QGIS. Figure 3 Ngorongoro Conservation Area map showing ( A ) defined risk areas (in red) and ( B ) distance to settlements. For analysis, 5000 random points were generated throughout the area; points falling within 4.26 km of human settlements (the average distance herds are moved from settlements in a day as determined through interviews of resident livestock owners) were retained for analysis (n = 2173, shown in blue in 3a). The maps were created in QGIS 2.18.2 using data from the National Bureau of Statistics, Tanzania ( http://www.nbs.go.tz/ ). In order to focus on areas of greatest risk to humans and livestock and to exclude locations that are not accessible, only points within a certain range of distance from settlements were included (Fig. 3 ). On average, herders in the NCA move their livestock 4.26 km away from settlements for grazing and watering during the day (unpublished data obtained through a cross-sectional survey of 209 households). Thus, only points falling within this distance from settlements were selected, providing us with data on areas where infection is most likely to occur. Data on locations of settlements were obtained from satellite imagery and included permanent residences as well as temporary settlements (e.g. seasonal camps set up after long distance movement away from permanent settlements, typically in the dry season, in search of pasture and water). These data were collated from the Center for International Earth Science Information Network (CIESIN). After adjusting for accessibility of resource locations using the average distance moved by livestock, 2173 points were retained for analysis, of which 239 (11%) fell within high-risk areas. Data analysis All statistical analyses were carried out in R (v 4.1.0) within the RStudio environment 34 . The aims of the statistical analysis were to infer the relationship between anthrax risk areas as determined through participatory mapping and the environmental factors identified in Table 1 , and to use this relationship to make spatial predictions of anthrax risk across the study area. We achieved both aims by modelling the binary risk status (high or low) of the randomly generated points as a function of their environmental characteristics in a Bayesian spatial logit-binomial generalised linear mixed-effects model (GLMM), implemented in the package glmmfields 35 . Spatial autocorrelation (residual non-independence between nearby points) was accounted for by including spatial random effects in the GLMM. We chose relatively non-informative priors for the intercept and the covariates, using Student's t-distributions centred at 0 and wide variances (intercept: df = 3, location = 0, scale = 10; betas: df = 3, location = 0, scale = 3). For the spatial Gaussian Process and the observation process scale parameters, we adopted the default glmmfields settings and used half-t priors (both gp_theta and gp_sigma: df = 3, location = 0, scale = 5), and 12 knots. To achieve convergence, the models were run for 5000 iterations 35 . First, univariable models were fitted to estimate unadjusted associations between each environmental factor (CEC, pH, DOWS, EVI, LSTD, slope, and SOC; Table 1 ; Supplementary Table S1 ) and high- and low-risk areas. Second, we constructed multivariable models by fitting multiple environmental variables (Supplementary Table S2 ). Three variables, SOC, slope and EVI showed a strongly right-skewed distribution and were therefore log-transformed prior to GLMM analysis to prevent excessive influence of outliers. All predictor variables were centred to zero mean and scaled to unit standard deviation for analysis, and odds ratios were rescaled back to the original units for ease of interpretation. Prior to fitting the multivariable GLMM, the presence of collinearity among the predictor variables—which were all continuous—was assessed using variance inflation factors (VIFs) 36 , calculated with the car package and illustrated using scatter plots (Supplementary Fig. S1 ) 36 . Three predictor variables showed a VIF greater than 3 (LSTD, ln EVI and pH with VIFs of 6.8, 4.2 and 3.5, respectively). Removal of LSTD and ln EVI reduced all VIFs to below 3, therefore these two variables were excluded from the multivariable regression analysis 37 . The model performance was assessed by calculating the area under the receiver operating characteristic curve. The predicted probability of being an anthrax high-risk area was determined and depicted on a map of the NCA using a regular grid of points generated throughout the NCA with one point sampled every 500 m. Consent for publication Permission to publish was granted by the National Institute for Medical Research, Tanzania. Study area The NCA encompasses an area of 8292 km 2 and in 2020 had approximately 87,000 inhabitants 23 , who are primarily dependent on livestock for their livelihoods. It is a multiple-use area where people coexist with wildlife and livestock, and practise pastoralism with transhumance, characterised by seasonal movements of livestock for accessing resources such as grazing areas and water. The NCA comprises eleven administrative wards: Alailelai, Endulen, Eyasi, Laitole, Kakesio, Misigiyo, Ngorongoro, Naiyobi, Nainokanoka, Ngoile and Olbalbal (Fig. 1 ). The NCA was chosen for our study as it is known to be hyperendemic for anthrax 4 , 17 , 20 . In addition, informal consultations we held prior to the study, as well as tailored data collection at the community and household level, indicated that local communities have a good understanding of the disease in humans and animals, and of practices around carcass and livestock management that increase risks, particularly in certain locations and periods of the year 24 . Figure 1 Locations of participatory mapping. Map showing the 11 administrative wards of the Ngorongoro Conservation Area in northern Tanzania and the locations where participatory mapping sessions took place (red dots). The maps were produced in QGIS 2.18.2 using data from the National Bureau of Statistics, Tanzania ( http://www.nbs.go.tz/ ). Ethics approval and consent to participate The study received approval from the National Institute for Medical Research, Tanzania, with reference number NIMRJHQ/R.8a/Vol. IX/2660; the Tanzania Commission for Science and Technology (numbers 2016-94-NA-2016-88 (O. R. Aminu), 2016-95-NA-2016-45 (T. L. Forde) and 2018-377-NA-2016-45 (T. Lembo)); Kilimanjaro Christian Medical University College Ethics Review Committee (certificate No. 2050); and the University of Glasgow College of Medical Veterinary & Life Sciences Ethics Committee (application number 200150152). Approval and permission to access communities and participants were also obtained from relevant local authorities. Written informed consent was obtained from all participants involved in the study. All data collected were analysed anonymously, ensuring the confidentiality of participants. All research activities were performed in accordance with relevant guidelines and regulations. Participatory mapping A participatory mapping approach based on methodology previously tested in East Africa 25 was employed to define areas of anthrax risk for animals in the NCA based on community knowledge. Georeferenced maps of the NCA were produced using data from Google and DigitalGlobe (2016). The maps used datum Arc 1960/UTM zone 36S and grid intervals of 1000 km and were produced at 1:10,000 and 1:50,000 scales, in order to provide participants with a choice. Ten participatory mapping focus groups were held at ward administrative level (Fig. 1 ) in order to identify areas in the NCA that communities perceive as posing a high risk of anthrax. One mapping exercise was held in each ward. Ngoile and Olbalbal wards were covered at the same time and treated as one, as they had only recently (in 2015) been split from one ward (Olbalbal). Each session had between ten and thirteen participants, who consisted of village and ward administrators, animal health professionals (including community animal health workers and livestock field officers), community leaders, and selected community members. These participants represented members of the community concerned with animal health and owning livestock and, as such, were likely to hold in-depth knowledge relating to community experience of animal health and disease, including anthrax. Participants were recruited by consulting with animal health professionals as well as village and ward administrators, who gave permission to conduct the mapping sessions. The mapping sessions were conducted in Swahili and translated into English by an interpreter. Participants' general knowledge of the area was first verified by testing whether they could correctly identify popular locations such as health centres, places of worship, markets and schools. Subsequently, participants discussed among themselves and came to a consensus about areas they considered to be at high risk of anthrax. Specifically, we asked them to identify locations they perceived as areas where they considered their animals to be at risk of being exposed to anthrax. These areas were drawn on the maps provided (Fig. 2 ). While they did not locate areas where the animals had succumbed to disease, we also asked for generic information on locations where anthrax outbreaks had occurred in the past to define areas that could be targeted for active surveillance of cases. In order to improve the fidelity of the data, participants defined risk areas in relation to their own locality (ward) and locations where their animals access resources. Therefore, the areas were not defined by administrative boundaries, as communities may access locations outside their wards, for instance for grazing or watering. The resulting maps were scanned, digitised and analysed as detailed in the following sections. Further detail on the participatory mapping process is provided in the Supplementary Methods (Additional File 1 ). Figure 2 Participatory mapping of anthrax risk areas in the Ngorongoro Conservation Area. Images show ( A ) the set-up of a mapping session, ( B ) participants engaged during a session and ( C ) an example of a 1:50,000 scale map annotated by participants. The map was created with QGIS opensource mapping software. The basemap used was a scanned and geo-referenced full colour 1:50,000 scale topographic map produced by the Surveys & Mapping Division, Ministry of Lands, Housing & Human Settlements, Dar es Salaam, Tanzania. The grid is based on the Arc1960 UTM 36S projection and datum. The map was exported from QGIS in Acrobat Pdf format to enable it to be printed at suitable sizes for using in the fieldwork and to be manually annotated during the participatory mapping. Digitisation of maps and generation of random points Scanned maps were saved as PDF files and converted to high resolution TIFF files for digitisation in QGIS 2.18.2-Las Palmas free OpenSource software 26 . All maps were georeferenced with geographical coordinates during production and reference points were available to enable the precise mapping of all locations. The digitization was carried out using the QGIS digitizing tools and by creating polygon layers of the defined risk areas. Sourcing data on the environmental predictors of anthrax Available soil and environmental data (250 m grid) for Tanzania were obtained from various sources (Table 1 ). From the available data, we selected the following seven variables which have previously been shown to contribute to or explain the risk of anthrax based on the biology of B. anthracis (Table 1 ). Table 1 Environmental factors with potential to influence anthrax occurrence. Variable Source (website) Research evidence associated with variable Predicted association with high-risk areas Cation exchange capacity (CEC) SoilGrids ( https://soilgrids.org ) 19 , 22 Positive. CEC is used as a proxy for soil calcium. High calcium promotes anthrax persistence pH SoilGrids ( https://soilgrids.org ) 19 Positive. B. anthracis spores have been shown to survive best in alkaline soils (pH > 6) Distance to inland water bodies (DOWS) SurfaceWater ( https://global-surface-water.appspot.com/ ) 18 , 20 , 22 Unknown. Anthrax has been shown to occur in dry areas but has also been reported to occur near water sources Average enhanced vegetation index (EVI), 2000–2016 Africa Soil Information Service ( http://africasoils.net/ ) 19 , 20 Unknown. Higher or lower EVI may promote the risk of anthrax Average daytime land surface temperature (LSTD), 2001–2015 Africa Soil Information Service ( http://africasoils.net/ ) 19 Positive. Anthrax occurrence is associated with places having elevated temperature Slope Open Topography ( http://opentopo.sdsc.edu ) 19 Negative. Anthrax has been observed more often in flat topography Predicted topsoil organic carbon content (SOC) SoilGrids ( https://soilgrids.org ) 18 Positive. Soils with high organic matter may retain spores more readily Data were obtained for Tanzania in 2017. Cation exchange capacity (CEC) Measured in cmol/kg, CEC is the total capacity of the soil to retain exchangeable cations such as Ca 2+ , Mg 2+ etc. It is an inherent soil characteristic and is difficult to alter significantly. It influences the soil's ability to hold on to essential nutrients and provides a buffer against soil acidification 27 . CEC has been reported to be positively correlated with anthrax risk. In addition, CEC is a proxy for calcium content, which may contribute to anthrax risk in a pH-dependent manner as explained below 19 , 22 . Predicted topsoil pH (pH) Soil pH below 6.0 (acidic soil) is thought to inhibit the viability of spores 19 thus a positive effect of higher pH on the risk of anthrax is expected. It has been suggested that the exosporium of B. anthracis is negatively charged in soils with neutral to slightly alkaline pH. This negative charge attracts positively charged cations in soil, mainly calcium, enabling the spores to be firmly attached to soil particles and calcium to be maintained within the spore core, thereby promoting the viability of B. anthracis 19 , 28 . Distance to inland water bodies (DOWS) Both the distance from water and proximity to water may increase anthrax risk. Distance to inland water may indicate the degree to which an area is dry/arid. Anthrax outbreaks have been shown to occur in areas with very dry conditions 19 . Although anthrax occurrence has also been associated with high soil moisture, this relates more to the spore germination in the environment (a mechanism that is disputed) and the concentration of spores in moist humus that amount to an infectious dose 18 , 29 . Spores will survive much longer in soils with low moisture content 19 . Low moisture may also be associated with low vegetation which results in animals grazing close to the soil, increasing the risk of ingesting soil with spores. Hampson et al . reported that anthrax outbreaks occurred close to water sources in the Serengeti ecosystem of Tanzania in periods of heavy rainfall 20 , and Steenkamp et al. found that close proximity to water bodies was key to the transmission of B. anthracis spores in Kruger National Park, South Africa 22 . Water is an important resource for livestock and a large number of animals may congregate at water sources during dry seasons. The close proximity of a water source to a risk area may increase the chance of infection, particularly during periods of high precipitation which might unearth buried spores. Average enhanced vegetation index (EVI) Vegetation density may influence the likelihood of an animal ingesting soil or inhaling dust that may be contaminated with spores. Grazing animals are more likely to encounter bacteria in soil with low vegetation density 20 , although there is a possibility that spores can be washed onto higher vegetation by the action of water 19 . Vegetation index may also reflect the moisture content of soil. Arid/dry conditions favour the formation and resistance of spores in the environment, thus lower vegetation may be associated with the occurrence of anthrax. Average daytime land surface temperature (LSTD) Anthrax has been more commonly reported to occur in regions with warmer climates worldwide. Minett observed that under generally favourable conditions and at 32 °C to 37 °C, sporulation of B. anthracis occurs readily but vegetative cells are more likely to disintegrate at temperatures below 21 °C 30 . Another hypothesis for the association of high temperature with anthrax occurrence is altered host immune response to disease due to stress caused by elevated temperatures 19 . In addition, elevated temperatures are usually associated with arid areas where vegetation is low, limiting access to adequate nutrition, which in turn affects immunity. Similarly, in hotter climates where infectious diseases occur more often, host interactions with other pathogens may modulate immune response to anthrax 31 . In this case, a lower infectious and lethal dose of spores would be sufficient to cause infection and death, respectively 19 . Contact with and ingestion of soil, spores and abrasive pasture is also higher with low vegetation in hot and arid areas 19 , 32 . In boreal regions such as in northern Canada, where anthrax occurs in wood bison, and Siberia, the disease is more commonly reported in the summer 19 . We therefore hypothesised a positive effect of LSTD on the risk of anthrax. Slope Spores of B. anthracis are hypothesized to persist more easily in flat landscapes that are characterised by shallow slopes 19 , as it is thought that wind and water may disperse spores more easily along areas with a higher slope gradient, thereby decreasing the density of spores to levels that may be insufficient to cause infection in a susceptible host. Therefore, we expected a negative relationship between slope and the risk of anthrax. Predicted topsoil organic carbon content (SOC) Organic matter (g/kg) may aid spore persistence by providing mechanical support. The negatively charged exosporium of spores is attracted to the positive charges on hummus-rich soil, thus anthrax is thought to persist in soil rich in organic matter 18 . Based on available evidence, we expected a positive effect of SOC on the risk of anthrax. Cation exchange capacity (CEC) Measured in cmol/kg, CEC is the total capacity of the soil to retain exchangeable cations such as Ca 2+ , Mg 2+ etc. It is an inherent soil characteristic and is difficult to alter significantly. It influences the soil's ability to hold on to essential nutrients and provides a buffer against soil acidification 27 . CEC has been reported to be positively correlated with anthrax risk. In addition, CEC is a proxy for calcium content, which may contribute to anthrax risk in a pH-dependent manner as explained below 19 , 22 . Predicted topsoil pH (pH) Soil pH below 6.0 (acidic soil) is thought to inhibit the viability of spores 19 thus a positive effect of higher pH on the risk of anthrax is expected. It has been suggested that the exosporium of B. anthracis is negatively charged in soils with neutral to slightly alkaline pH. This negative charge attracts positively charged cations in soil, mainly calcium, enabling the spores to be firmly attached to soil particles and calcium to be maintained within the spore core, thereby promoting the viability of B. anthracis 19 , 28 . Distance to inland water bodies (DOWS) Both the distance from water and proximity to water may increase anthrax risk. Distance to inland water may indicate the degree to which an area is dry/arid. Anthrax outbreaks have been shown to occur in areas with very dry conditions 19 . Although anthrax occurrence has also been associated with high soil moisture, this relates more to the spore germination in the environment (a mechanism that is disputed) and the concentration of spores in moist humus that amount to an infectious dose 18 , 29 . Spores will survive much longer in soils with low moisture content 19 . Low moisture may also be associated with low vegetation which results in animals grazing close to the soil, increasing the risk of ingesting soil with spores. Hampson et al . reported that anthrax outbreaks occurred close to water sources in the Serengeti ecosystem of Tanzania in periods of heavy rainfall 20 , and Steenkamp et al. found that close proximity to water bodies was key to the transmission of B. anthracis spores in Kruger National Park, South Africa 22 . Water is an important resource for livestock and a large number of animals may congregate at water sources during dry seasons. The close proximity of a water source to a risk area may increase the chance of infection, particularly during periods of high precipitation which might unearth buried spores. Average enhanced vegetation index (EVI) Vegetation density may influence the likelihood of an animal ingesting soil or inhaling dust that may be contaminated with spores. Grazing animals are more likely to encounter bacteria in soil with low vegetation density 20 , although there is a possibility that spores can be washed onto higher vegetation by the action of water 19 . Vegetation index may also reflect the moisture content of soil. Arid/dry conditions favour the formation and resistance of spores in the environment, thus lower vegetation may be associated with the occurrence of anthrax. Average daytime land surface temperature (LSTD) Anthrax has been more commonly reported to occur in regions with warmer climates worldwide. Minett observed that under generally favourable conditions and at 32 °C to 37 °C, sporulation of B. anthracis occurs readily but vegetative cells are more likely to disintegrate at temperatures below 21 °C 30 . Another hypothesis for the association of high temperature with anthrax occurrence is altered host immune response to disease due to stress caused by elevated temperatures 19 . In addition, elevated temperatures are usually associated with arid areas where vegetation is low, limiting access to adequate nutrition, which in turn affects immunity. Similarly, in hotter climates where infectious diseases occur more often, host interactions with other pathogens may modulate immune response to anthrax 31 . In this case, a lower infectious and lethal dose of spores would be sufficient to cause infection and death, respectively 19 . Contact with and ingestion of soil, spores and abrasive pasture is also higher with low vegetation in hot and arid areas 19 , 32 . In boreal regions such as in northern Canada, where anthrax occurs in wood bison, and Siberia, the disease is more commonly reported in the summer 19 . We therefore hypothesised a positive effect of LSTD on the risk of anthrax. Slope Spores of B. anthracis are hypothesized to persist more easily in flat landscapes that are characterised by shallow slopes 19 , as it is thought that wind and water may disperse spores more easily along areas with a higher slope gradient, thereby decreasing the density of spores to levels that may be insufficient to cause infection in a susceptible host. Therefore, we expected a negative relationship between slope and the risk of anthrax. Predicted topsoil organic carbon content (SOC) Organic matter (g/kg) may aid spore persistence by providing mechanical support. The negatively charged exosporium of spores is attracted to the positive charges on hummus-rich soil, thus anthrax is thought to persist in soil rich in organic matter 18 . Based on available evidence, we expected a positive effect of SOC on the risk of anthrax. Creating the dataset The annotated and digitised maps yielded polygons of high-risk areas within the NCA (Fig. 3 ). After digitization, 5000 random points were generated 33 to cover the 8292 km 2 area of the NCA. This enabled us to obtain distinct points allowed by the 250 m grid resolution of the environmental variables. Points falling within the defined risk areas were selected to represent risk areas while those falling outside represented low-risk areas. Measures of the environmental characteristics associated with individual points were obtained with the 'add Raster data to points' feature in QGIS. Figure 3 Ngorongoro Conservation Area map showing ( A ) defined risk areas (in red) and ( B ) distance to settlements. For analysis, 5000 random points were generated throughout the area; points falling within 4.26 km of human settlements (the average distance herds are moved from settlements in a day as determined through interviews of resident livestock owners) were retained for analysis (n = 2173, shown in blue in 3a). The maps were created in QGIS 2.18.2 using data from the National Bureau of Statistics, Tanzania ( http://www.nbs.go.tz/ ). In order to focus on areas of greatest risk to humans and livestock and to exclude locations that are not accessible, only points within a certain range of distance from settlements were included (Fig. 3 ). On average, herders in the NCA move their livestock 4.26 km away from settlements for grazing and watering during the day (unpublished data obtained through a cross-sectional survey of 209 households). Thus, only points falling within this distance from settlements were selected, providing us with data on areas where infection is most likely to occur. Data on locations of settlements were obtained from satellite imagery and included permanent residences as well as temporary settlements (e.g. seasonal camps set up after long distance movement away from permanent settlements, typically in the dry season, in search of pasture and water). These data were collated from the Center for International Earth Science Information Network (CIESIN). After adjusting for accessibility of resource locations using the average distance moved by livestock, 2173 points were retained for analysis, of which 239 (11%) fell within high-risk areas. Data analysis All statistical analyses were carried out in R (v 4.1.0) within the RStudio environment 34 . The aims of the statistical analysis were to infer the relationship between anthrax risk areas as determined through participatory mapping and the environmental factors identified in Table 1 , and to use this relationship to make spatial predictions of anthrax risk across the study area. We achieved both aims by modelling the binary risk status (high or low) of the randomly generated points as a function of their environmental characteristics in a Bayesian spatial logit-binomial generalised linear mixed-effects model (GLMM), implemented in the package glmmfields 35 . Spatial autocorrelation (residual non-independence between nearby points) was accounted for by including spatial random effects in the GLMM. We chose relatively non-informative priors for the intercept and the covariates, using Student's t-distributions centred at 0 and wide variances (intercept: df = 3, location = 0, scale = 10; betas: df = 3, location = 0, scale = 3). For the spatial Gaussian Process and the observation process scale parameters, we adopted the default glmmfields settings and used half-t priors (both gp_theta and gp_sigma: df = 3, location = 0, scale = 5), and 12 knots. To achieve convergence, the models were run for 5000 iterations 35 . First, univariable models were fitted to estimate unadjusted associations between each environmental factor (CEC, pH, DOWS, EVI, LSTD, slope, and SOC; Table 1 ; Supplementary Table S1 ) and high- and low-risk areas. Second, we constructed multivariable models by fitting multiple environmental variables (Supplementary Table S2 ). Three variables, SOC, slope and EVI showed a strongly right-skewed distribution and were therefore log-transformed prior to GLMM analysis to prevent excessive influence of outliers. All predictor variables were centred to zero mean and scaled to unit standard deviation for analysis, and odds ratios were rescaled back to the original units for ease of interpretation. Prior to fitting the multivariable GLMM, the presence of collinearity among the predictor variables—which were all continuous—was assessed using variance inflation factors (VIFs) 36 , calculated with the car package and illustrated using scatter plots (Supplementary Fig. S1 ) 36 . Three predictor variables showed a VIF greater than 3 (LSTD, ln EVI and pH with VIFs of 6.8, 4.2 and 3.5, respectively). Removal of LSTD and ln EVI reduced all VIFs to below 3, therefore these two variables were excluded from the multivariable regression analysis 37 . The model performance was assessed by calculating the area under the receiver operating characteristic curve. The predicted probability of being an anthrax high-risk area was determined and depicted on a map of the NCA using a regular grid of points generated throughout the NCA with one point sampled every 500 m. Consent for publication Permission to publish was granted by the National Institute for Medical Research, Tanzania. Results Fourteen discrete high-risk areas ranging from 0.2 to 212.9 km 2 in size and with a total area of 695.3 km 2 were identified through the participatory mapping sessions. These high-risk areas occupy 8.4% of the total area in the NCA. The environmental covariates are described and depicted in Table 2 , Figs. 4 and 5 . Table 2 Descriptive characteristics of the environmental covariates used to investigate the risk of anthrax in the Ngorongoro Conservation Area. Variable Range Median (interquartile range) in high-risk areas Median (interquartile range) in low-risk areas Cation exchange capacity (CEC) cmol/kg 9.75–47.25 32.00 (13.00) 29.30 (8.00) pH 5.32–8.70 7.58 (0.60) 6.95 (1.45) Distance to inland water bodies (DOWS) km 0.25–48.84 19.10 (11.04) 13.58 (12.85) Average enhanced vegetation index (EVI) 934.00–6261.00 1750.00 (851.00) 2330.00 (1541.50) Average daytime land surface temperature (LSTD) °C 14.94–46.79 42.67 (8.18) 36.02 (11.85) Slope % 0.04–38.12 2.06 (2.85) 3.12 (6.04) Predicted topsoil organic carbon content (SOC) g/kg 3.75–88.00 17.00 (4.75) 23.50 (18.75) Figure 4 Boxplots of environmental variables. Data values, median, lower and upper quartiles are shown for points falling in both anthrax high- (red) and low-risk (blue) areas as defined through participatory mapping in the Ngorongoro Conservation Area. Plots are shown for ( a ) cation exchange capacity, ( b ) pH, ( c ) distance to inland water bodies, ( d ) average enhanced vegetation index, ( e ) average daytime land surface temperature, ( f ) slope and ( g ) predicted topsoil organic carbon content. This visual exploration does not account for spatial autocorrelation of points. Figure 5 Hypothetical environmental predictors of anthrax in the Ngorongoro Conservation Area, Tanzania. ( a ) cation exchange capacity, ( b ) pH, ( c ) distance to water bodies, ( d ) enhanced vegetation index, ( e ) daytime temperature, ( f ) slope and ( g ) topsoil organic carbon content. Based on available scientific evidence (Table 1 ), areas with warm colours (red, orange and yellow) have environmental conditions favourable to a high risk of anthrax, while areas with cool colours (blue) have conditions associated with a low risk. Perceived risk areas identified using participatory mapping exercises with indigenous communities are enclosed by black lines. The maps were created in QGIS 2.18.2 using data obtained from the Center for International Earth Science Information Network (CIESIN). Maps of the Ngorongoro Conservation Area were sourced from the National Bureau of Statistics, Tanzania ( http://www.nbs.go.tz/ ). The univariable GLMM analysis indicated that high-risk areas were closer to permanent water bodies (DOWS), had higher pH, lower organic carbon content (SOC), lower vegetation density (EVI) and higher daytime temperatures (LSTD) (Table 3 ). There was no evidence that cation exchange capacity (CEC) or slope were associated with the high-risk areas. The result observed for DOWS after taking spatial autocorrelation into account was inconsistent with descriptive data analysis where the mean DOWS was higher for points falling in high-risk areas. Table 3 The odds ratio of points falling into defined risk areas as explained by environmental variables. Variable Odds ratio for univariable analysis (95% credible interval) Odds ratio for multivariable analysis (95% credible interval) Cation exchange capacity (CEC) cmol/kg 0.980 (0.932–1.002) 1.002 (0.953–1.053) pH 2.51 (1.336–4.572)* 1.695 (0.806–3.528) Distance to inland water bodies (DOWS) km 0.878 (0.810–0.951)* 0.907 (0.833–0.987)* Average enhanced vegetation index (EVI) 0.963 (0.950–0.975)* – Average day time land surface temperature (LSTD) °C 1.093 (1.059–1.130)* – Slope % 1.002 (0.999–1.004) 1.003 (1.001–1.006) Predicted topsoil organic carbon content (SOC) g/kg 0.973 (0.963–0.982)* 0.975 (0.963–0.986)* Results of univariable and multivariable analysis showing the association between the probability of high anthrax risk and environmental variables in the Ngorongoro Conservation Area. EVI and LSTD were excluded from the multivariable model due to a high degree of collinearity as indicated by a variance inflation factor > 3. (*) gives indication of an association (i.e. credible intervals excluding 1). The multivariable GLMM showed that the probability of points falling in high-risk areas did not depend on pH or CEC (Table 3 ). However, proximity to water bodies (DOWS), and low organic carbon content (SOC) were clearly associated with high-risk areas (odds ratios 0.907 and 0.975, respectively; Table 3 ). Using the area under the receiver operating characteristic curve as a metric for assessing within-sample predictive performance of the multivariable model, the area under the curve (AUC) of 0.94 obtained indicates a high ability of the model to distinguish high-risk areas from low-risk areas (Supplementary Fig. S2 ). The level of risk predicted by the model indicated that areas with the greatest risks of anthrax in the NCA are in Olbalbal ward extending into Alailelai, Endulen, Kakesio and Ngoile wards (Fig. 6 ). Figure 6 Predicted probability of being an anthrax-risk area in the Ngorongoro Conservation Area. The predicted probability of risk is based on data defining high-risk areas, generated through participatory mapping, and explained by environmental variables associated with the risk of anthrax. The map was created in QGIS 2.18.2; the Ngorongoro Conservation Area was sourced from the National Bureau of Statistics, Tanzania ( http://www.nbs.go.tz/ ). Discussion The occurrence of endemic diseases such as anthrax in rural and remote low-resource settings necessitates practical solutions for prioritization and targeted control. This study demonstrates that participatory mapping approaches reliant on indigenous knowledge of disease and the environment have the potential to be used as a surveillance tool for anthrax in areas where traditional methods may be challenging to implement due to infrastructural and financial constraints, as well as animal management practices. We applied GIS technologies to environmental data and data on anthrax risk gathered through participatory mapping in an endemic setting of rural Africa. Our analyses enhanced our understanding of the underlying environmental factors associated with areas of perceived risk, for example proximity to water bodies and low organic carbon content. We were also able to make predictions regarding the spatial distribution of risk. These findings suggest that in the NCA, factors that enable contact with B. anthracis spores are more important drivers of anthrax risk, compared to those that support spore survival. Participatory mapping, which has long been applied to aid decision making for resource management, can also support epidemiological studies 11 , 12 , 25 as it captures data that are difficult to obtain using standard methods 38 because of underreporting. In addition, in the case of anthrax, locations of cases or sampling may not represent actual risk areas, due to the nomadic lifestyle of affected communities. In line with other studies, here we show that maps produced through participatory methods can help identify priority areas for intervention 12 , 39 , 40 . The additional application of GIS and statistical methodology 25 provides further opportunities to study environmental conditions that influence disease occurrence, similarly to research on malaria vector control 13 . Here we combine these methods to improve our understanding of anthrax risk areas and environmental drivers of risk as an alternative to incidence data 2 , 20 , 22 . The association between proximity to water bodies and high anthrax risk suggested by initial data exploration that ignored spatial autocorrelation gave potentially misleading results—high-risk areas were farther from water bodies compared to low-risk areas (Fig. 4 ). In contrast, statistical analyses that accounted for this autocorrelation showed that perceived high-risk areas were closer to water sources, a finding consistent with previous studies 20 , 22 . Such risk is likely driven by contamination with carcasses of infected animals seeking water during the late stages of the disease 14 that contributes to spore accumulation. Dry periods typified by the congregation of large numbers of animals at watering points pose additional risks. Anthrax outbreaks occurring close to water sources have indeed been documented extensively 20 , 22 , 41 , 42 . Previous studies have found soils with high organic content to be associated with anthrax spore persistence 19 , 43 , 44 . SOC is usually determined by a combination of organic matter from plant and animal tissue residues and microbial biomass 45 . Organic matter is thought to promote anthrax risk in two ways. Firstly, it favours cycles of germination and sporulation—the disputed "incubator area" hypothesis put forward by Van Ness 43 , 46 . Secondly, it may attract and sequester spores, shielding them from environmental damage 19 , creating a high concentration of spores (at sufficient infectious doses) in particular locations. However, in our study, we found high risk of anthrax to be associated with lower soil organic matter. Since plant biomass is a major contributor to SOC 45 , it is likely to be related to vegetation index, and low SOC might mean low vegetation in high-risk areas as observed in our univariable analysis with EVI (Table 3 ). The relationship between SOC and anthrax risk may suggest a meaningful association with EVI, which was removed from the multivariable analysis for statistical reasons. In areas where vegetation height is low, animals may ingest soil with spores more easily 47 , and this could potentially explain our results. Taken together with proximity to water bodies, this suggests that in the NCA, and possibly ecologically similar areas in sub-Saharan Africa, the risk of anthrax is associated with factors that promote host contact with B. anthracis spores rather than spore survival. While CEC, pH and slope were not clearly associated with the probability of points falling in high-risk areas, based on previous studies, these factors are likely to contribute to anthrax risk in certain environments by facilitating spore persistence. Higher soil calcium levels and alkaline pH have been previously associated with high-risk areas in larger geographical locations in Tanzania 20 , 48 and elsewhere 43 , 44 , 49 . Steenkamp et al . found no association of anthrax occurrence with pH in the Kruger National Park 22 . With regards to slope, anthrax has been found to occur more frequently in steppe areas 19 which are characterised by large arid and flat grasslands. There is a possibility that run-off on higher slope may help to concentrate spores in water holes or depressions, which provides an additional explanation for increased anthrax risk closer to water bodies. The lack of non-ambiguous support for these particular factors in this study may be due to (1) the use of CEC as a proxy for calcium; (2) the small spatial scale of the study (i.e. focusing on the NCA only) which may have led to limited variation in the environmental conditions across the area; and/or (3) variability in the environmental conditions and patterns associated with anthrax occurrence in endemic versus sporadic outbreak situations or long-term versus short-term survival of spores, both of which are poorly understood. It could be hypothesized that the environmental conditions in a locality may select for B. anthracis spores that survive and persist in such conditions, if facilitated by other risk factors that promote high occurrence and sustain endemicity. A long history of anthrax occurrence might indicate that B. anthracis can survive in local environmental conditions that differ from those that are putatively associated with the pathogen (or disease). Spore persistence may therefore mask environmental effects if these change over time. Varying climatic conditions may prevail in different locations affected by the same disease. For instance, a previous study suggested diverse ecological factors may be associated with anthrax risk, presenting a challenge in predicting the risk of disease in new locations using models of previously known high-risk areas 50 . In northern Tanzania, the study by Hampson et al . 20 , found that anthrax can be frequently observed in a number of habitats. Across the NCA, a diversity of climatic conditions can be observed at a given timepoint 51 . This may make it difficult to generalise findings across different locations and may explain why in our study some of the variables were not statistically different between high- and low-risk areas. Historically (before the mid-twentieth century), anthrax was observed frequently (and is still sporadically reported) in temperate 52 and boreal regions such as in Scandinavia, Russia and North America 53 , 54 , areas with ecological characteristics distinct from those in tropical Africa. It is therefore plausible that B. anthracis spores evolved to survive in a wide range of environments and that local conditions that facilitate transmission to suitable hosts are more important than factors affecting spore survival. The AUC of 94% suggests that the fitted model accurately predicts high- and low-risk areas. However, we caution that impressive predictive accuracy based on within-sample prediction can result from overfitting (inclusion of spurious predictors in the model), especially where spatial autocorrelation is strong. We guarded against this source of overfitting by accounting for spatial autocorrelation in the regression model, and we therefore have confidence in the significant associations with DOWS and SOC. We explored using out-of-sample prediction to estimate AUC by fitting the model after leaving out 25% of the study area, but found that model fitting was unstable when a reduced study area was used. Strong validation of the predictive accuracy of the model would therefore require new data from a similar area, or from an extension of this study to a larger study area with more independent risk areas. Further data currently being collected regionally promise to provide such opportunities. The data obtained using participatory mapping provided descriptive as well as inferential information about the pattern of environmental factors present in high-risk areas. However, this type of data reliant on local knowledge may be limited by subjectivity. Our participatory mapping approach could be refined and improved. For example, conducting participatory mapping a number of times and combining the resulting data would reduce the effect of subjectivity and would enable a better understanding of the uncertainty to be expected. Another improvement we propose relates to the use of other criteria to exclude locations not accessed by livestock. While an alternative criterion such as elevation could be used, it is difficult to define a threshold which excludes animals. In addition, the strategy may not take into account other criteria, for example inaccessible forested areas at 'accessible' elevations, or areas with accessible elevation but made inaccessible by surrounding areas. Overall, because the data on settlements we used to exclude inaccessible locations comprised temporary settlements set up in the dry season after long distance movements, we expect that areas most likely to pose a risk to livestock have been identified. Overall, our approach can help guide the selection of geographical locations and strategies for prioritisation of anthrax control. This is of particular importance in settings where the disease burden is high, but resources to address the problem are limited. However, strategies would need to be tailored to the specific needs of the communities residing in this and similar areas. For example, we show that high-risk areas for anthrax occupy central parts of the NCA where key livestock resource areas such as water holes are located. Depending on the direction of movements, this makes it challenging to traverse the NCA without encountering a high-risk area, with particular implications for seasonal north–south movements in search for pasture and water, characteristic of the pastoral livestock management system in the NCA. Animal movement restriction is often recommended as an effective strategy for the control of anthrax 55 , 56 and infectious diseases more generally. However, in most of Africa, livestock-keeping communities depend on movements to resource areas (particularly grazing and watering points) to ensure the survival of their animals and this would need to be taken into account in any management recommendations. Therefore, vaccination-based strategies prioritising high-risk areas and herds making use of these resources appear to be the most viable approaches for reducing the burden of anthrax in these communities. Conclusions This study demonstrates the value of participatory mapping techniques for understanding disease distribution and identifying priority areas for control in low-resource areas that would ultimately benefit public health. GIS technologies are increasingly becoming available in developing countries and can be combined with participatory approaches to generate useful data. A combination of GIS tools and participatory approaches yielded information about risk areas and the environmental conditions associated with those areas in a setting hyper-endemic for anthrax. In our study, anthrax occurs mostly in areas characterised by low organic matter and in proximity to water bodies. This suggests that the transmission of B. anthracis to animals likely drives the risk of disease, more than factors that favour the survival of spores in the environment. Interventions for local anthrax control may thus be most effective if targeted towards at-risk areas and livestock management practices that limit transmission to animals. Our general approach may be of value to the surveillance and control of anthrax and other diseases in other contexts under similar constraints. Supplementary Information Supplementary Information. Supplementary Information. Supplementary Information The online version contains supplementary material available at 10.1038/s41598-022-14081-5.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6560410/

MAV_4644 Interaction with the Host Cathepsin Z Protects Mycobacterium avium subsp. hominissuis from Rapid Macrophage Killing

Mycobacterium avium subspecies hominissuis (MAH) is an opportunistic pathogen that is ubiquitous in the environment and often isolated from faucets and showerheads. MAH mostly infects humans with an underlying disease, such as chronic pulmonary disorder, cystic fibrosis, or individuals that are immunocompromised. In recent years, MAH infections in patients without concurrent disease are increasing in prevalence as well. This pathogen is resistant to many antibiotics due to the impermeability of its envelope and due to the phenotypic resistance established within the host macrophages, making difficult to treat MAH infections. By screening a MAH transposon library for mutants that are susceptible to killing by reactive nitrogen intermediaries, we identified the MAV _4644 ( MAV _4644:Tn) gene knockout clone that was also significantly attenuated in growth within the host macrophages. Complementation of the mutant restored the wild-type phenotype. The MAV _4644 gene encodes a dual-function protein with a putative pore-forming function and ADP-ribosyltransferase activity. Protein binding assay suggests that MAV_4644 interacts with the host lysosomal peptidase cathepsin Z (CTSZ), a key regulator of the cell signaling and inflammation. Pathogenic mycobacteria have been shown to suppress the action of many cathepsins to establish their intracellular niche. Our results demonstrate that knocking-down the cathepsin Z in human macrophages rescues the attenuated phenotype of MAV _4644:Tn clone. Although, the purified cathepsin Z by itself does not have any killing effect on MAH, it contributes to bacterial killing in the presence of the nitric oxide (NO). Our data suggest that the cathepsin Z is involved in early macrophage killing of MAH, and the virulence factor MAV_4644 protects the pathogen from this process. 1. Introduction Mycobacterium avium subspecies hominissuis (MAH) is a ubiquitous environmental saprophyte capable of infecting a broad host range of animals, including humans [ 1 ]. MAH creates robust biofilms and is often isolated from outputs of modern chlorinated drinking water distribution systems, such as showerheads and faucets [ 2 , 3 ]. While MAH mainly infects immunocompromised individuals and patients with an underlying lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disorder, cystic fibrosis, it is now evident that MAH can also cause progressive lung infections in patients without underlying lung disease [ 4 ]. The gut is also a route of MAH entry, and the increasing prevalence of MAH is apparent in both respiratory and gastrointestinal infections [ 5 , 6 , 7 ]. Patients with MAH infections are typically given a combination therapy with two or three antimicrobial agents for one year, increasing chances of development of drug-resistance. Among many factors including the bacterial intrinsic resistance makes MAH infection difficult to treat [ 8 ]. This intrinsic resistance in part is attributed to the impermeability of the mycobacterial envelope, which is rich in hydrophobic mycolic acids [ 9 ]. In addition, MAH resides and replicates within the host macrophages, further isolating the bacteria from effective levels of circulating antibiotic [ 10 ]. Overcoming the bactericidal properties of macrophage is a key factor for successful survival of intracellular pathogens such as mycobacteria [ 11 ]. One principal mode of circumventing the MAH killing by macrophages is to arrest the phagosome maturation. Following phagocytosis, MAH resides in a non-acidified phagosome, denoted the mycobacteria containing phagosome (MCP) [ 2 ]. The MCP fuses with early endosomes, making MAH phagosome accessible to some endosomal proteins; however, the pathogen restricts accumulation of proton-ATPases, halting acidification [ 12 ]. The MCP also co-localizes with cathepsin D, a mediator in apoptosis and in antigen presentation mechanisms as an immature proenzyme [ 12 , 13 ]. Cathepsins play a major role as lysozyme proteases as well as in cell signaling and inflammation, and their importance to control mycobacterial infections has been shown [ 14 ]. By manipulating the function of cathepsins, the infecting organism is able to successfully establish the intracellular niche in phagocytic cells. In addition, pathogenic mycobacteria secrete at least two highly conserved superoxide dismutase enzymes, which confer protection from oxidative stress and this is required for full virulence [ 15 , 16 , 17 ]. Virulence factors of pathogenic mycobacteria are either secreted or expressed on the bacterial outer cell envelope [ 18 ]. In addition to the housekeeping Sec and Tat transport systems, mycobacteria utilize a type VII secretion (T7S) system to secrete proteins [ 19 ]. T7S systems of mycobacteria are encoded by 5 separate esx gene clusters, denoted ESX 1-5 [ 20 ]. ESX1 required for Mycobacterium tuberculosis virulence secretes ESAT-6 protein, which open pores in the MCP envelope allowing the pathogen access the host cytosol [ 21 ]. Interestingly, two species of virulent mycobacteria, M. ulcerans and MAH, have lost ESX1 to a deletion event [ 19 , 22 ]. While M. ulcerans retains virulence by secreting a plasma-encoded polyketide toxin, causing macrophage cytotoxicity [ 23 ], no toxins have been described in MAH. To identify the virulent-related genes of MAH associated with the resistance to oxidative killing mechanism of macrophages, we screened a transposon library and identified the MAV_4644 gene knockout clone susceptible to nitric oxide. MAV_4644 was computationally identified as a putative pore-forming protein with ADP-ribosyltransferase (ADPRT) activities [ 24 ]. ADPRT proteins comprise a family of toxins which add ADP-ribose from NAD to host proteins, halting key cellular processes. Its known that Cholera and pertussis toxins, responsible for thousands of annual deaths, are members of the ADPRT family [ 25 ]. In this study, we focused on functionally characterizing the MAV_4644 protein that could potentially act as a pore and a toxin, and discovered the novel virulence mechanism of MAH. 2. Materials and Methods 2.1. Bacterial Strain Mycobacterium avium subsp. hominissuis strain 104 (MAC104) was originally isolated from the blood of an AIDS patient and has been shown to be virulent in mice infected by IV or respiratory routes. MAC104 were cultured on Middlebrook 7H10 agar supplemented with 10% oleic acid, albumin, dextrose and catalase (OADC) (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA, USA) to mid log-phase at 37 °C. Growth curves were conducted in Middlebrook 7H9 broth with 10% OADC and with and without glycerol supplement. The optical density at 600 nm was periodically measured with a spectrophotometer. 2.2. Host Cells The human monocyte THP-1 cell line (ATCC, Manassas, VA, USA) was cultured in RPMI-1640 (Corning, Teksbury, MA, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gemini, Bridgewater, OR, USA) at 37 °C with 5% CO 2 as suspension cells. Cells were counted with a hemocytometer, seeded at 80% confluency into 48-well plates and supplemented with 20 ng/mL of phorbol 12-myrisate 13-acetate (PMA, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) to differentiate into adherent macrophages [ 26 ]. After 24 h, the culture media were replaced and cells were allowed to rest an additional 24 h before infection assays. The murine RAW 264.7 cell line (ATCC) was cultured in DMEM (Corning) supplemented with 10% FBS at 37 °C with 5% CO2. RAW264.7 macrophages were treated for 10 min at 37 °C with 5 mM EDTA in phosphate buffered saline (PBS) and harvested by gentle washing with a serological pipette. Cells were pelleted by centrifugation to remove the EDTA, resuspended in fresh culture media and counted with a hemocytometer to seed at 80% confluence at the time of infection. 2.3. MycoMarT7 Transposon Library Screening for Nitric Oxide Susceptibility MycoMarT7 (Mmt7) is a phagemid with a kanamycin resistance gene under the control of T7 promoter [ 27 ]. MAC104 was transduced with MmT7 as previously described [ 28 ]. A total of 930 MAH Mmt7 transposon mutant (Mmt7:Tn) individual colonies were each grown in 96-deep-well plates for 5 days in 300 µL of 7H9 broth supplemented with 10% OADC (Hardy Diagnostics) and 400 µg/mL of kanamycin (Sigma) at 37 °C with 210 rpm shaking. Two wells in each plate were inoculated with MAC104 without kanamycin as a positive control and one well filled with just media alone served as a blank. After 5 days of growth, 150 µL of bacterial cultures were transferred to 96-well flat bottom plates and pelleted by centrifugation. The supernatant was removed and bacteria were carefully resuspended in fresh 7H9 broth supplemented with 10% OADC, 400 μg/mL of kanamycin and 100 µmol of spermine NONOate, a nitric oxide donor (Calbiochem, San Mateo, CA, USA. The optical density was measured at 600 nm in a plate-reading spectrophotometer (Biotek, Shoreline, WA, USA) and recorded as time 0. The plates were placed at 37 °C with 210 rpm shaking for 3 h, then moved to a 37 °C incubator for an additional 2 days. The optical density was read at 600 nm and the percent of bacterial increase was determined. Mutants with increased susceptibility to nitric oxide were identified as those with 50% or less optical density when compared to the wild type. Identified mutants were cherry-picked from the library and results were confirmed by repeating the assay. 2.4. Sequencing of Mmt7 Gene Knockout Clones Mmt7 transposon insertion sites were identified via ligation-mediated PCR (LMPCR) as previously reported [ 28 ]. Briefly, genomic DNA was isolated, digested with restriction enzyme, and ligated with custom adapters complementary to the cut sites. Resulting products were used as templates for the LMPCR reaction with primer sets designed to amplify a 150-bp segment of the transposon and the region of interrupted gene at the insertion site. Amplicons were submitted to the Center for Genome Research and Biocomputing at Oregon State University for Sanger sequencing. 2.5. Complementation of MAV_4644 Gene Knockout Clone The 2478-bp coding fragment of MAV _4644 was PCR amplified from the genomic DNA of M. avium 104 strain, and cloned into HindIII and NotI restriction sites of the mycobacterium chromosomal integration vector pMV306 containing the apramycin resistance marker. The resulting vector was electroporated into MAV_4644 gene deficient transposon clone, and M. avium transformants were plated on 7H10 Middlebrook agar plates containing 400 µg/mL of apramycin. The positive M. avium complemented clone was identified by PCR using MAV_4644 gene-specific primers, where MAV _4644 gene knockout clone served as a negative control. 2.6. Uptake and Survival Assays A single cell suspension of the wild-type MAH, MAV _4644:Tn mutant and complemented clone was created in phosphate buffered saline (PBS) to adjust to a McFarland standard #2 (3 × 10 8 cells/mL). Inoculums were also plated for the colony forming unit (CFU) counts. The bacterial suspension was left still for 5 min to allow bacterial aggregates to settle and the top half volume was used for infection assays. Host cells were seeded in either 24-well or 48-well flat bottom plates and inoculated at a multiplicity of infection of 10 bacteria to 1 host cell, and centrifuged for 10 min at 800 rpm to synchronize the infections. The chasing was allowed to proceed for 2 h at 37 °C and 5% CO 2 . Infected cells were then gently washed twice with HBSS and refreshed with the appropriate culture medium supplemented with 200 µg/mL of gentamicin (Sigma) for 2 h to eliminate extracellular bacteria. The cells were then washed twice with HBSS (Corning). At this point, the wells denoted time 0 were lysed by adding 0.1% Triton X-100 (VWR) for 10 minutes and disrupted with twenty pipette strokes, while the remaining wells were replenished with culture medium supplemented with 10 ng/mL of murine IFN-γ (Invitrogen) for collection at subsequent time-points. Cell lysates were serially diluted in PBS and plated onto Middlebrook 7H10 agar supplemented with 10% OADC (Hardy Diagnostics). Colonies were counted after ten days of incubation at 37 °C and results were compared between the control (wild-type MAH) and MAV_4644 gene knockout and complemented strains. 2.7. In Silico Analysis The National Center for Biotechnology (NCBI) web server was utilized for conserved protein domain searches. The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) was utilized for nucleotide and protein alignment analysis. A search for homologous proteins was performed on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) web server using the Sequence Similarity Database (SSDB), which ranks all possible pairwise protein alignments based on the Smith–Waterman similarity score. The dendogram was created based on the total scores [ 29 ]. The Constraint-Based Local Alignment Tool (COBALT) was utilized to visualize primary protein sequence alignments [ 30 ]. The association of genes in an operon was investigated on the Database of Prokaryotic Operons (DOOR2) web server [ 31 ]. 2.8. Expression of MAV_4644, MAV_4643, and MAV_4642 Recombinant Proteins and Immunoprecipitation Assays The C-terminal sequence of MAV _4644 corresponding to the VIP2 ADP-ribosyltransferase domain, denoted MAV_4644_CTD, as well as MAV _4643 and MAV _4642 were cloned into the pET6xHN-C vector (Clontech, San Francisco, CA, USA). The recombinant protein products were expressed in BL21 (DE3) competent E. coli (Invitrogen, Calsbed, CA, USA) and purified with the His-60 Ni Superflow Gravity Column Purification Kit (Takara, Salem, OR, USA following the manufacturer's recommendations. The expression and purification of the recombinant proteins were confirmed by SDS_PAGE and Western blot using an anti-6xHN antibody (Takara). For the immunoprecipitation assay, the recombinant MAV _4644_CTD, MAV _4643 and MAV _4642 protein purifications were arrested before elution. The cleared THP-1 macrophage lysate was added to the columns, and incubated at 4 °C for 24 h with gentle inversion. The next day, columns were drained, washed with 5 mL of equilibration buffer and then 5 mL of wash buffer. The host bound proteins to the recombinant protein were eluted into 1-mL fractions with elution buffer. The total protein concentration in each fraction was assessed by SDS-PAGE and Coomassie staining. The second fraction was identified to contain the highest concentration of total protein in each pull-down assay. These fractions were concentrated to 50 µL using a Nanosep 3K centrifugal filter device (VWR) and sequenced at the Oregon State University Mass Spectrometry Center following the standard protocols. Protein samples were Proteome Discoverer v 1.3.0, Mascot v 2.3 and Scaffold were used for data analysis. The Uniprot Homo sapien database was used to identify host proteins. A lysate of un-induced E. coli DE3 was used as a negative control in place of the recombinant MAH proteins. The proteins identified in the negative sample were subtracted and the CRAPome database was used to filter out nonspecific interactions [ 32 ]. 2.9. The siRNA Knock-Down of Cathepsin Z THP-1 cells were seeded to 60% confluency in 48-well plates and differentiated with 20 ng/mL of PMA in RPMI-1640 (Corning) supplemented with 10% FBS (Gemini, New York, NY, USA) for 24 h, at which point the medium was replenished. Cells were rested an additional 24 h. The culture medium was refreshed again just before adding the freshly prepared transfection complex. The transfection complex was prepared with either cathepsin Z interfering RNA designed at Custom Dicer-Substrate siRNA (Integrative DNA Technologies, IDT, Coralville, IA, USA) or non-targeting interfering RNA (IDT) and Viromer ® Green transfection reagent (Lipocalyx, Houston, TX, USA) following the manufacturer's protocol and with the following specifications: the working volume per well was 500 mL and each transfection complex was made at 100 nM siRNA in 50 µL of Viromer Green buffer. The uptake of transfection complex was verified with the TYE 563 Transfection Control (IDT). The transfection medium was replaced at 24 h with RPMI-1640 supplemented with 10% FBS (Gemini) and refreshed in 24 h intervals for 3 days. Cells were then infected with the wild-type MAC104 and MAV_4644:Tn. At each time points, cells were lysed to examine bacterial survival and assess CTSZ protein levels. The cell lysates were resolved with SDS-PAGE, transferred to a nitrocellulose membrane, probed with cathepsin Z (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA, USA) and B-actin (Abcam, Boston, MA, USA) antibodies and visualized with a LI-COR imaging system (Lincoln, NE, USA). 2.10. Cathepsin Z Activity against MAC104 and MAV_4644:Tn To determine whether purified cathepsin Z was able to kill MAC104, in vitro culture of MAC104 or MAV_4644:Tn at concentrations of 10 5 , 10 4 , and 10 3 /mL were incubated with cathepsin Z (0.5 M and 2 M; ThermoFisher) for 30 min and CFUs/mL of viable bacteria were determined on 7H10 agar plates. In subsequent experiments, cathepsin Z was added to the bacteria culture in the presence of 100 µmol of spermine NONOate, as described above, and bacterial CFUs were determined at the same time points. 2.11. Statistical Analysis Experiments were repeated at least 2 times. Data is displayed as the means of replicates ± standard error. The Student's t -test, ANOVA and Mann–Whitney tests were used to compare experimental and control groups. Differences were considered significant when p < 0.05. The Holm–Sidak approach (GraphPad Prism version 7.0 software, San Diego, CA, USA) was used for multiple comparisons. 2.1. Bacterial Strain Mycobacterium avium subsp. hominissuis strain 104 (MAC104) was originally isolated from the blood of an AIDS patient and has been shown to be virulent in mice infected by IV or respiratory routes. MAC104 were cultured on Middlebrook 7H10 agar supplemented with 10% oleic acid, albumin, dextrose and catalase (OADC) (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA, USA) to mid log-phase at 37 °C. Growth curves were conducted in Middlebrook 7H9 broth with 10% OADC and with and without glycerol supplement. The optical density at 600 nm was periodically measured with a spectrophotometer. 2.2. Host Cells The human monocyte THP-1 cell line (ATCC, Manassas, VA, USA) was cultured in RPMI-1640 (Corning, Teksbury, MA, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gemini, Bridgewater, OR, USA) at 37 °C with 5% CO 2 as suspension cells. Cells were counted with a hemocytometer, seeded at 80% confluency into 48-well plates and supplemented with 20 ng/mL of phorbol 12-myrisate 13-acetate (PMA, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) to differentiate into adherent macrophages [ 26 ]. After 24 h, the culture media were replaced and cells were allowed to rest an additional 24 h before infection assays. The murine RAW 264.7 cell line (ATCC) was cultured in DMEM (Corning) supplemented with 10% FBS at 37 °C with 5% CO2. RAW264.7 macrophages were treated for 10 min at 37 °C with 5 mM EDTA in phosphate buffered saline (PBS) and harvested by gentle washing with a serological pipette. Cells were pelleted by centrifugation to remove the EDTA, resuspended in fresh culture media and counted with a hemocytometer to seed at 80% confluence at the time of infection. 2.3. MycoMarT7 Transposon Library Screening for Nitric Oxide Susceptibility MycoMarT7 (Mmt7) is a phagemid with a kanamycin resistance gene under the control of T7 promoter [ 27 ]. MAC104 was transduced with MmT7 as previously described [ 28 ]. A total of 930 MAH Mmt7 transposon mutant (Mmt7:Tn) individual colonies were each grown in 96-deep-well plates for 5 days in 300 µL of 7H9 broth supplemented with 10% OADC (Hardy Diagnostics) and 400 µg/mL of kanamycin (Sigma) at 37 °C with 210 rpm shaking. Two wells in each plate were inoculated with MAC104 without kanamycin as a positive control and one well filled with just media alone served as a blank. After 5 days of growth, 150 µL of bacterial cultures were transferred to 96-well flat bottom plates and pelleted by centrifugation. The supernatant was removed and bacteria were carefully resuspended in fresh 7H9 broth supplemented with 10% OADC, 400 μg/mL of kanamycin and 100 µmol of spermine NONOate, a nitric oxide donor (Calbiochem, San Mateo, CA, USA. The optical density was measured at 600 nm in a plate-reading spectrophotometer (Biotek, Shoreline, WA, USA) and recorded as time 0. The plates were placed at 37 °C with 210 rpm shaking for 3 h, then moved to a 37 °C incubator for an additional 2 days. The optical density was read at 600 nm and the percent of bacterial increase was determined. Mutants with increased susceptibility to nitric oxide were identified as those with 50% or less optical density when compared to the wild type. Identified mutants were cherry-picked from the library and results were confirmed by repeating the assay. 2.4. Sequencing of Mmt7 Gene Knockout Clones Mmt7 transposon insertion sites were identified via ligation-mediated PCR (LMPCR) as previously reported [ 28 ]. Briefly, genomic DNA was isolated, digested with restriction enzyme, and ligated with custom adapters complementary to the cut sites. Resulting products were used as templates for the LMPCR reaction with primer sets designed to amplify a 150-bp segment of the transposon and the region of interrupted gene at the insertion site. Amplicons were submitted to the Center for Genome Research and Biocomputing at Oregon State University for Sanger sequencing. 2.5. Complementation of MAV_4644 Gene Knockout Clone The 2478-bp coding fragment of MAV _4644 was PCR amplified from the genomic DNA of M. avium 104 strain, and cloned into HindIII and NotI restriction sites of the mycobacterium chromosomal integration vector pMV306 containing the apramycin resistance marker. The resulting vector was electroporated into MAV_4644 gene deficient transposon clone, and M. avium transformants were plated on 7H10 Middlebrook agar plates containing 400 µg/mL of apramycin. The positive M. avium complemented clone was identified by PCR using MAV_4644 gene-specific primers, where MAV _4644 gene knockout clone served as a negative control. 2.6. Uptake and Survival Assays A single cell suspension of the wild-type MAH, MAV _4644:Tn mutant and complemented clone was created in phosphate buffered saline (PBS) to adjust to a McFarland standard #2 (3 × 10 8 cells/mL). Inoculums were also plated for the colony forming unit (CFU) counts. The bacterial suspension was left still for 5 min to allow bacterial aggregates to settle and the top half volume was used for infection assays. Host cells were seeded in either 24-well or 48-well flat bottom plates and inoculated at a multiplicity of infection of 10 bacteria to 1 host cell, and centrifuged for 10 min at 800 rpm to synchronize the infections. The chasing was allowed to proceed for 2 h at 37 °C and 5% CO 2 . Infected cells were then gently washed twice with HBSS and refreshed with the appropriate culture medium supplemented with 200 µg/mL of gentamicin (Sigma) for 2 h to eliminate extracellular bacteria. The cells were then washed twice with HBSS (Corning). At this point, the wells denoted time 0 were lysed by adding 0.1% Triton X-100 (VWR) for 10 minutes and disrupted with twenty pipette strokes, while the remaining wells were replenished with culture medium supplemented with 10 ng/mL of murine IFN-γ (Invitrogen) for collection at subsequent time-points. Cell lysates were serially diluted in PBS and plated onto Middlebrook 7H10 agar supplemented with 10% OADC (Hardy Diagnostics). Colonies were counted after ten days of incubation at 37 °C and results were compared between the control (wild-type MAH) and MAV_4644 gene knockout and complemented strains. 2.7. In Silico Analysis The National Center for Biotechnology (NCBI) web server was utilized for conserved protein domain searches. The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) was utilized for nucleotide and protein alignment analysis. A search for homologous proteins was performed on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) web server using the Sequence Similarity Database (SSDB), which ranks all possible pairwise protein alignments based on the Smith–Waterman similarity score. The dendogram was created based on the total scores [ 29 ]. The Constraint-Based Local Alignment Tool (COBALT) was utilized to visualize primary protein sequence alignments [ 30 ]. The association of genes in an operon was investigated on the Database of Prokaryotic Operons (DOOR2) web server [ 31 ]. 2.8. Expression of MAV_4644, MAV_4643, and MAV_4642 Recombinant Proteins and Immunoprecipitation Assays The C-terminal sequence of MAV _4644 corresponding to the VIP2 ADP-ribosyltransferase domain, denoted MAV_4644_CTD, as well as MAV _4643 and MAV _4642 were cloned into the pET6xHN-C vector (Clontech, San Francisco, CA, USA). The recombinant protein products were expressed in BL21 (DE3) competent E. coli (Invitrogen, Calsbed, CA, USA) and purified with the His-60 Ni Superflow Gravity Column Purification Kit (Takara, Salem, OR, USA following the manufacturer's recommendations. The expression and purification of the recombinant proteins were confirmed by SDS_PAGE and Western blot using an anti-6xHN antibody (Takara). For the immunoprecipitation assay, the recombinant MAV _4644_CTD, MAV _4643 and MAV _4642 protein purifications were arrested before elution. The cleared THP-1 macrophage lysate was added to the columns, and incubated at 4 °C for 24 h with gentle inversion. The next day, columns were drained, washed with 5 mL of equilibration buffer and then 5 mL of wash buffer. The host bound proteins to the recombinant protein were eluted into 1-mL fractions with elution buffer. The total protein concentration in each fraction was assessed by SDS-PAGE and Coomassie staining. The second fraction was identified to contain the highest concentration of total protein in each pull-down assay. These fractions were concentrated to 50 µL using a Nanosep 3K centrifugal filter device (VWR) and sequenced at the Oregon State University Mass Spectrometry Center following the standard protocols. Protein samples were Proteome Discoverer v 1.3.0, Mascot v 2.3 and Scaffold were used for data analysis. The Uniprot Homo sapien database was used to identify host proteins. A lysate of un-induced E. coli DE3 was used as a negative control in place of the recombinant MAH proteins. The proteins identified in the negative sample were subtracted and the CRAPome database was used to filter out nonspecific interactions [ 32 ]. 2.9. The siRNA Knock-Down of Cathepsin Z THP-1 cells were seeded to 60% confluency in 48-well plates and differentiated with 20 ng/mL of PMA in RPMI-1640 (Corning) supplemented with 10% FBS (Gemini, New York, NY, USA) for 24 h, at which point the medium was replenished. Cells were rested an additional 24 h. The culture medium was refreshed again just before adding the freshly prepared transfection complex. The transfection complex was prepared with either cathepsin Z interfering RNA designed at Custom Dicer-Substrate siRNA (Integrative DNA Technologies, IDT, Coralville, IA, USA) or non-targeting interfering RNA (IDT) and Viromer ® Green transfection reagent (Lipocalyx, Houston, TX, USA) following the manufacturer's protocol and with the following specifications: the working volume per well was 500 mL and each transfection complex was made at 100 nM siRNA in 50 µL of Viromer Green buffer. The uptake of transfection complex was verified with the TYE 563 Transfection Control (IDT). The transfection medium was replaced at 24 h with RPMI-1640 supplemented with 10% FBS (Gemini) and refreshed in 24 h intervals for 3 days. Cells were then infected with the wild-type MAC104 and MAV_4644:Tn. At each time points, cells were lysed to examine bacterial survival and assess CTSZ protein levels. The cell lysates were resolved with SDS-PAGE, transferred to a nitrocellulose membrane, probed with cathepsin Z (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA, USA) and B-actin (Abcam, Boston, MA, USA) antibodies and visualized with a LI-COR imaging system (Lincoln, NE, USA). 2.10. Cathepsin Z Activity against MAC104 and MAV_4644:Tn To determine whether purified cathepsin Z was able to kill MAC104, in vitro culture of MAC104 or MAV_4644:Tn at concentrations of 10 5 , 10 4 , and 10 3 /mL were incubated with cathepsin Z (0.5 M and 2 M; ThermoFisher) for 30 min and CFUs/mL of viable bacteria were determined on 7H10 agar plates. In subsequent experiments, cathepsin Z was added to the bacteria culture in the presence of 100 µmol of spermine NONOate, as described above, and bacterial CFUs were determined at the same time points. 2.11. Statistical Analysis Experiments were repeated at least 2 times. Data is displayed as the means of replicates ± standard error. The Student's t -test, ANOVA and Mann–Whitney tests were used to compare experimental and control groups. Differences were considered significant when p < 0.05. The Holm–Sidak approach (GraphPad Prism version 7.0 software, San Diego, CA, USA) was used for multiple comparisons. 3. Results 3.1. Nitric Oxide Susceptibility of MAH A dose response effect of MAC104 growth inhibition was investigated for a 0 to 5000 μmol concentration range of the spermine NONOate ( Figure 1 ). While we found that 250–5000 μmol spermine NONOate similarly inhibited the bacterial growth during 48 h of incubation, 100 μmol concentration was near the threshold of sensitivity and, thus, this concentration was used in the transposon library screen to isolate nitric oxide sensitive mutants. 3.2. Isolation of MAH Mmt7 Transposon Mutants Susceptible to Low Bacteriostatic Concentration of Nitric Oxide To identify the molecular mechanisms of nitric oxide resistance, 930 individual transposon mutants of MAC104 were screened for susceptibility to a sub-bacteriostatic level of nitric oxide. A total of 46 mutants displayed increased susceptibility when compared to the wild-type control. The transposon insertion site was determined to be located within a putative coding sequence in 34 of the susceptible mutants ( Table 1 ). Gene ontology analysis, shown in the Figure 2 , identified 24% involved in catalytic activity, 18% in metabolism, 13% in oxidoreductase activity and 7% part of the membrane. 3.3. MAV_4644:Tn Is Attenuated in Murine Macrophages Because murine macrophages respond to Interferon gamma (IFNγ) by producing NO without log of time, we decided to investigate the intracellular growth phenotype using Raw 264.7 macrophages. Thirty-four nitric oxide susceptible transposon clones were tested for survival in an activated murine macrophage infection model for 7 days, and MAV _4644:Tn mutant was selected to be significantly deficient to grow within RAW264.7 cells. While in vitro studies revealed no difference between growth of wild-type MAC104, MAV _4644 gene knockout and complemented strains in the liquid culture medium ( Figure 3 A); the MAV _4644:Tn mutant was attenuated with approximately 1.5 log to grow within IFN-γ stimulated RAW264.7 macrophages when compared to the wild-type MAC104 infection ( Figure 3 B). Complementation of the MAV _4644 gene abolished the defect, and the clone grew in macrophages similar to the wild-type bacteria. 3.4. In Silico Analysis of MAV_4644 MAV_4644 is a dual-function protein with putative pore-forming and ADP-ribosyltransferase activities (NCBI Ref.Seq. WP_011726171.1). The conserved domain analysis of MAV_4644 protein in the Table 2 displays a WXG100 motif, a membrane translocation signal for type VII secretion systems [ 33 ], at the N-terminus of the protein (7 through 92 amino acids). Amino acid region 97 to 439 is predicted to be α-helical with putative pore-forming activity [ 24 ]. We also identified is a proline-rich disordered region within 455–655 amino acid sequence. The amino acid sequence at 675–822 corresponds to VIP2, a protein family of actin-ADP-ribosylating toxins. A protein similarity search, performed on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG, 30) recognized the top ranked homologs as putative ADP-ribosyltransferases, conserved hypothetical proteins or putative alanine and proline rich proteins. MAV_4644 resides in a three-gene operon with MAV_4642 and MAV_4643 ( Figure 4 A). MAV_4642 protein (GenBank: ABK64648.1) and MAV_4643 protein (GenBank: ABK68102.1) are annotated as conserved hypothetical secretion proteins and they both contain the WXG100 motif, characteristic for type VII secretion targets [ 33 ]. A similarity search on KEGG-identified M. tuberculosis ESAT-6-like esxF and esxE proteins as homologues to MAV_4642 and MAV_4643 respectively. A comparison of the complete operons between two strains reveals syntenic conservation of gene order, though the immunizing factor encoded by Rv3902 is lacking in MAH [ 34 ]. MAV_4644 homologue protein in M. tuberculosis was identified as Rv3903c ( Figure 4 A,B). This protein is well characterized as a channel protein with necrosis-inducing toxin function (CpnT) [ 35 ]. The N-terminal domain of CpnT (NTD: amino acid 1–443) is an outer membrane channel protein required for the uptake of glycerol. The C-terminal domain (amino acids 720–846) is released from the cell surface by proteolytic cleavage [ 35 ]. The released toxin, denoted TNT hydrolyzes NAD+, completely depleting this essential coenzyme and leading to necrotic cell death of the infected host cell [ 34 ]. Figure 4 B shows the protein BLAST (pBLAST) alignment on the National Center for Biotechnology (NCBI) web server of the N-terminal domains CpnT and MAV_4644 protein along amino acid 1 to 435. Both proteins yield 100% query coverage with an E-value of 1 × 10 −166 . The pBLAST alignment of the whole proteins as well as the disordered region also shows considerable conservation through amino acid 546. However, the C-terminal regions of both proteins have divergent primary sequences, as pBLAST was only able to align 10% of these domains ( Figure 4 B). Using the Iterative Threading ASSEmbly Refinement (I-TASSER) software [ 36 ], the predictive model of MAV_4644 has been generated based on the protein structure and function shown in the Figure 4 C. The assay was performed as described in the materials and methods. MAH was grown in 7H9 broth with OADC. Spermine NONOate (100 µmol) was used as a source of NO. The data represent the findings of two independent experiments, at 30 min of bacterial incubation with cathepsin Z and/or NO. * p < 0.05, when MAV_4644:Tn clone compared with the wild-type MAC104 CFU counts. 3.5. Complementation of the MAV_4644:Tn Mutant Restores the Bacterial Survivability Phenotype To determine whether the complementation of The MAV_4644:Tn would recover the function of the wild-type bacteria, we inserted the functional MAV_4644 gene into the chromosome of MAH mutant and examined intracellular bacterial growth within murine macrophages in comparison with the wild-type bacteria as well as the MAV_4644:Tn mutant growth. As shown in the Table 3 , the MAV_4644:Tn complemented clone was able to survive in macrophages in a similar way as the wild-type bacteria recorded by intracellular bacterial colony forming units. 3.6. MAV_4644 Is Not Required for Growth in Defined Medium To determine whether the observed attenuation of MAV _4644:Tn in murine macrophages can be attributed to differences in growth rate, growth curves were ran in rich media. MAV_4644:Tn displayed the same growth kinetics as MAC104 in 7H9 broth supplemented with 10% OADC ( Figure 5 ). Furthermore, to investigate whether MAV_4644 protein is required for MAH growth on glycerol, similar to CpnT in M. tuberculosis H37Rv, 7H9 broth was prepared without OADC, which removes the dextrose and leaves only glycerol as an energy and carbon source. The comparative growth curves ran in this media revealed that MAV_4644 is not required for the uptake of glycerol ( Figure 5 ). 3.7. MAV_4644_CTD, MAV_4643, and MAV_4642 Recombinant Proteins Interact with the Cathepsin Z Due to the nearly identical N-terminal regions of MAV_4644 protein and CpnT, we hypothesized that the CTD of MAV_4644 also undergoes proteolytic cleavage before secretion or is present on the outer membrane of MAH and is capable to interact with host proteins [ 35 ]. The MAV_4643 and MAV_4642 proteins, highly similar to esat6-like secreted proteins of M. tuberculosis , are most likely exported by the oligimerized MAV_4644 NTD pore [ 34 ]. To investigate potential host-binding partners for MAV_4644, MAV_4643, and MAV_4642 proteins, immunoprecipitation assays were performed with THP-1 clarified lysates. The MAV_4644 protein C-terminal region, corresponding to the VIP2 domain, was expressed and denoted MAV_4644_CTD. The pull-down assay with MAV_4644_CTD displayed interaction with three host proteins ( Supplemental Table S1 ). The most noteworthy is the lysosomal peptidase cathepsin Z, which was also identified in pull-down assays with MAV_4643 and MAV_4642 proteins. In addition, six additional host proteins, including complement component 1 and cadherin 4, were identified during MAV_4643 interaction assay, whereas, MAV_4642 resulted in pulling 145 host proteins, including cathepsin S and beta-2-microglubulin ( Supplemental Table S1 ). 3.8. MAV_4644:Tn Is Rapidly Killed in THP-1 Macrophages Due to the fact that cathepsins are proteolytic enzymes of lysosomes that function in the endocytic pathway and directly contribute to the pathogen killing during very early stages of mycobacterial infection, we investigated in more depth the differences in the intracellular bacterial number at 0 time point between the wild-type, MAV_4644:Tn, and the complemented strain that is demonstrated by the colony formic units in the Figure 1 , and by the percentage of invasion by the wildtype and the mutant MAV_4644:Tn strains in the Figure 6 A for RAW264.7 macrophages. In addition, to validate whether MAV_4644 protein is relevant in human pathogenesis, in vitro infection assays were performed in THP-1 human macrophages. We have to highlight that time 0 in our infection model is about 4 h post infection, which includes two hours of bacterial internalization to the host cells and then two hours of antibiotic treatment necessary to clear any extracellular bacteria. It was hypothesized that this observed difference ( Figure 6 A) is more likely a reflection of rapid killing by the macrophage instead of an impaired ability by MAV_4644:Tn to be phagocytosed by the host cell. To determine whether this was indeed the case, short-term infections were run in THP-1 cells ( Figure 6 B). The mycobacteria were allowed to invade for 0.5 h and cfu/ml were assayed up to 4 h. At 0.5 h post infection MAC104 and MAV_4644:Tn had been taken up at comparable levels. However, by 1 h post infection, about 60% of MAV_4644:Tn had been cleared by the host cells, while the MAC104 intracellular population remained constant throughout the duration of the experiment ( Figure 6 B). These data suggest the function of MAV_4644 protein serves to protect MAH from rapid killing in host macrophage and is not involved in invasion of macrophages. 3.9. MAV_4644 Interferes with the Cathepsin Z Function The cathepsin Z gene silencing of THP-1 macrophages was performed using Dicer-substrate short interfering RNAs. As the Figure 7 A indicates, the cathepsin Z protein levels were significantly diminished at four days post transfection when compared to the negative control. Due to the fact that major killing of MAV_4644:Tn was observed at 1 h post infection of macrophages, we performed the survival assay at 1 h post infection in knock-down and control THP-1 cells. In cathepsin Z-silenced cells, MAV_4644:Tn survival rate was similar to the wild-type bacteria ( Figure 7 B). While MAC104 survival did not change in the knock-down control and was slightly more in untreated cells, MAV_4644:Tn colony forming units significantly decreased in both control groups ( Figure 7 B). Our data suggest that CTSZ is involved in early mycobacterial killing, and MAV-4644 protein plays role in suppressing of this process. 3.10. Effect of Cathepsin Z and NO on MAH To determine whether cathepsin Z would have a direct bactericidal effect on bacterial killing in vitro, different MAH inoculums were exposed to up to 2 mM concentrations of CTSZ with or without the presence of 100 µmol of spermine NONOate, and bacterial CFUs were determined after 30 min incubation. As shown in the Table 4 , while the cathepsin Z has no bactericidal effect on either the wild-type or MAV_4644:Tn clone, interestingly, the fast killing of knockout clone by cathepsin Z is only observed when a nitric oxide donor is added. Contrary, the wild-type MAC104 is resistant to CTSZ in the presence of NO. 3.1. Nitric Oxide Susceptibility of MAH A dose response effect of MAC104 growth inhibition was investigated for a 0 to 5000 μmol concentration range of the spermine NONOate ( Figure 1 ). While we found that 250–5000 μmol spermine NONOate similarly inhibited the bacterial growth during 48 h of incubation, 100 μmol concentration was near the threshold of sensitivity and, thus, this concentration was used in the transposon library screen to isolate nitric oxide sensitive mutants. 3.2. Isolation of MAH Mmt7 Transposon Mutants Susceptible to Low Bacteriostatic Concentration of Nitric Oxide To identify the molecular mechanisms of nitric oxide resistance, 930 individual transposon mutants of MAC104 were screened for susceptibility to a sub-bacteriostatic level of nitric oxide. A total of 46 mutants displayed increased susceptibility when compared to the wild-type control. The transposon insertion site was determined to be located within a putative coding sequence in 34 of the susceptible mutants ( Table 1 ). Gene ontology analysis, shown in the Figure 2 , identified 24% involved in catalytic activity, 18% in metabolism, 13% in oxidoreductase activity and 7% part of the membrane. 3.3. MAV_4644:Tn Is Attenuated in Murine Macrophages Because murine macrophages respond to Interferon gamma (IFNγ) by producing NO without log of time, we decided to investigate the intracellular growth phenotype using Raw 264.7 macrophages. Thirty-four nitric oxide susceptible transposon clones were tested for survival in an activated murine macrophage infection model for 7 days, and MAV _4644:Tn mutant was selected to be significantly deficient to grow within RAW264.7 cells. While in vitro studies revealed no difference between growth of wild-type MAC104, MAV _4644 gene knockout and complemented strains in the liquid culture medium ( Figure 3 A); the MAV _4644:Tn mutant was attenuated with approximately 1.5 log to grow within IFN-γ stimulated RAW264.7 macrophages when compared to the wild-type MAC104 infection ( Figure 3 B). Complementation of the MAV _4644 gene abolished the defect, and the clone grew in macrophages similar to the wild-type bacteria. 3.4. In Silico Analysis of MAV_4644 MAV_4644 is a dual-function protein with putative pore-forming and ADP-ribosyltransferase activities (NCBI Ref.Seq. WP_011726171.1). The conserved domain analysis of MAV_4644 protein in the Table 2 displays a WXG100 motif, a membrane translocation signal for type VII secretion systems [ 33 ], at the N-terminus of the protein (7 through 92 amino acids). Amino acid region 97 to 439 is predicted to be α-helical with putative pore-forming activity [ 24 ]. We also identified is a proline-rich disordered region within 455–655 amino acid sequence. The amino acid sequence at 675–822 corresponds to VIP2, a protein family of actin-ADP-ribosylating toxins. A protein similarity search, performed on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG, 30) recognized the top ranked homologs as putative ADP-ribosyltransferases, conserved hypothetical proteins or putative alanine and proline rich proteins. MAV_4644 resides in a three-gene operon with MAV_4642 and MAV_4643 ( Figure 4 A). MAV_4642 protein (GenBank: ABK64648.1) and MAV_4643 protein (GenBank: ABK68102.1) are annotated as conserved hypothetical secretion proteins and they both contain the WXG100 motif, characteristic for type VII secretion targets [ 33 ]. A similarity search on KEGG-identified M. tuberculosis ESAT-6-like esxF and esxE proteins as homologues to MAV_4642 and MAV_4643 respectively. A comparison of the complete operons between two strains reveals syntenic conservation of gene order, though the immunizing factor encoded by Rv3902 is lacking in MAH [ 34 ]. MAV_4644 homologue protein in M. tuberculosis was identified as Rv3903c ( Figure 4 A,B). This protein is well characterized as a channel protein with necrosis-inducing toxin function (CpnT) [ 35 ]. The N-terminal domain of CpnT (NTD: amino acid 1–443) is an outer membrane channel protein required for the uptake of glycerol. The C-terminal domain (amino acids 720–846) is released from the cell surface by proteolytic cleavage [ 35 ]. The released toxin, denoted TNT hydrolyzes NAD+, completely depleting this essential coenzyme and leading to necrotic cell death of the infected host cell [ 34 ]. Figure 4 B shows the protein BLAST (pBLAST) alignment on the National Center for Biotechnology (NCBI) web server of the N-terminal domains CpnT and MAV_4644 protein along amino acid 1 to 435. Both proteins yield 100% query coverage with an E-value of 1 × 10 −166 . The pBLAST alignment of the whole proteins as well as the disordered region also shows considerable conservation through amino acid 546. However, the C-terminal regions of both proteins have divergent primary sequences, as pBLAST was only able to align 10% of these domains ( Figure 4 B). Using the Iterative Threading ASSEmbly Refinement (I-TASSER) software [ 36 ], the predictive model of MAV_4644 has been generated based on the protein structure and function shown in the Figure 4 C. The assay was performed as described in the materials and methods. MAH was grown in 7H9 broth with OADC. Spermine NONOate (100 µmol) was used as a source of NO. The data represent the findings of two independent experiments, at 30 min of bacterial incubation with cathepsin Z and/or NO. * p < 0.05, when MAV_4644:Tn clone compared with the wild-type MAC104 CFU counts. 3.5. Complementation of the MAV_4644:Tn Mutant Restores the Bacterial Survivability Phenotype To determine whether the complementation of The MAV_4644:Tn would recover the function of the wild-type bacteria, we inserted the functional MAV_4644 gene into the chromosome of MAH mutant and examined intracellular bacterial growth within murine macrophages in comparison with the wild-type bacteria as well as the MAV_4644:Tn mutant growth. As shown in the Table 3 , the MAV_4644:Tn complemented clone was able to survive in macrophages in a similar way as the wild-type bacteria recorded by intracellular bacterial colony forming units. 3.6. MAV_4644 Is Not Required for Growth in Defined Medium To determine whether the observed attenuation of MAV _4644:Tn in murine macrophages can be attributed to differences in growth rate, growth curves were ran in rich media. MAV_4644:Tn displayed the same growth kinetics as MAC104 in 7H9 broth supplemented with 10% OADC ( Figure 5 ). Furthermore, to investigate whether MAV_4644 protein is required for MAH growth on glycerol, similar to CpnT in M. tuberculosis H37Rv, 7H9 broth was prepared without OADC, which removes the dextrose and leaves only glycerol as an energy and carbon source. The comparative growth curves ran in this media revealed that MAV_4644 is not required for the uptake of glycerol ( Figure 5 ). 3.7. MAV_4644_CTD, MAV_4643, and MAV_4642 Recombinant Proteins Interact with the Cathepsin Z Due to the nearly identical N-terminal regions of MAV_4644 protein and CpnT, we hypothesized that the CTD of MAV_4644 also undergoes proteolytic cleavage before secretion or is present on the outer membrane of MAH and is capable to interact with host proteins [ 35 ]. The MAV_4643 and MAV_4642 proteins, highly similar to esat6-like secreted proteins of M. tuberculosis , are most likely exported by the oligimerized MAV_4644 NTD pore [ 34 ]. To investigate potential host-binding partners for MAV_4644, MAV_4643, and MAV_4642 proteins, immunoprecipitation assays were performed with THP-1 clarified lysates. The MAV_4644 protein C-terminal region, corresponding to the VIP2 domain, was expressed and denoted MAV_4644_CTD. The pull-down assay with MAV_4644_CTD displayed interaction with three host proteins ( Supplemental Table S1 ). The most noteworthy is the lysosomal peptidase cathepsin Z, which was also identified in pull-down assays with MAV_4643 and MAV_4642 proteins. In addition, six additional host proteins, including complement component 1 and cadherin 4, were identified during MAV_4643 interaction assay, whereas, MAV_4642 resulted in pulling 145 host proteins, including cathepsin S and beta-2-microglubulin ( Supplemental Table S1 ). 3.8. MAV_4644:Tn Is Rapidly Killed in THP-1 Macrophages Due to the fact that cathepsins are proteolytic enzymes of lysosomes that function in the endocytic pathway and directly contribute to the pathogen killing during very early stages of mycobacterial infection, we investigated in more depth the differences in the intracellular bacterial number at 0 time point between the wild-type, MAV_4644:Tn, and the complemented strain that is demonstrated by the colony formic units in the Figure 1 , and by the percentage of invasion by the wildtype and the mutant MAV_4644:Tn strains in the Figure 6 A for RAW264.7 macrophages. In addition, to validate whether MAV_4644 protein is relevant in human pathogenesis, in vitro infection assays were performed in THP-1 human macrophages. We have to highlight that time 0 in our infection model is about 4 h post infection, which includes two hours of bacterial internalization to the host cells and then two hours of antibiotic treatment necessary to clear any extracellular bacteria. It was hypothesized that this observed difference ( Figure 6 A) is more likely a reflection of rapid killing by the macrophage instead of an impaired ability by MAV_4644:Tn to be phagocytosed by the host cell. To determine whether this was indeed the case, short-term infections were run in THP-1 cells ( Figure 6 B). The mycobacteria were allowed to invade for 0.5 h and cfu/ml were assayed up to 4 h. At 0.5 h post infection MAC104 and MAV_4644:Tn had been taken up at comparable levels. However, by 1 h post infection, about 60% of MAV_4644:Tn had been cleared by the host cells, while the MAC104 intracellular population remained constant throughout the duration of the experiment ( Figure 6 B). These data suggest the function of MAV_4644 protein serves to protect MAH from rapid killing in host macrophage and is not involved in invasion of macrophages. 3.9. MAV_4644 Interferes with the Cathepsin Z Function The cathepsin Z gene silencing of THP-1 macrophages was performed using Dicer-substrate short interfering RNAs. As the Figure 7 A indicates, the cathepsin Z protein levels were significantly diminished at four days post transfection when compared to the negative control. Due to the fact that major killing of MAV_4644:Tn was observed at 1 h post infection of macrophages, we performed the survival assay at 1 h post infection in knock-down and control THP-1 cells. In cathepsin Z-silenced cells, MAV_4644:Tn survival rate was similar to the wild-type bacteria ( Figure 7 B). While MAC104 survival did not change in the knock-down control and was slightly more in untreated cells, MAV_4644:Tn colony forming units significantly decreased in both control groups ( Figure 7 B). Our data suggest that CTSZ is involved in early mycobacterial killing, and MAV-4644 protein plays role in suppressing of this process. 3.10. Effect of Cathepsin Z and NO on MAH To determine whether cathepsin Z would have a direct bactericidal effect on bacterial killing in vitro, different MAH inoculums were exposed to up to 2 mM concentrations of CTSZ with or without the presence of 100 µmol of spermine NONOate, and bacterial CFUs were determined after 30 min incubation. As shown in the Table 4 , while the cathepsin Z has no bactericidal effect on either the wild-type or MAV_4644:Tn clone, interestingly, the fast killing of knockout clone by cathepsin Z is only observed when a nitric oxide donor is added. Contrary, the wild-type MAC104 is resistant to CTSZ in the presence of NO. 4. Discussion The mycobacterial response to nitric oxide within the host macrophage plays an important role in the survival and replication of these intracellular pathogens. MAH has been shown to require nitric oxide production by host cells for virulence in a murine model of infection [ 37 ]; however, an understanding of how the nitric oxide aids MAH success in intracellular survival is still unclear. Many bacterial pathogens, such as P. aeruginosa , E. coli , S. aureus , S. typhimurium , express nitrate, nitrite and nitric oxide reductases as virulence factors to metabolize these products into energy and to detoxify their niche [ 38 ]. Similar observations have been made with pathogenic mycobacteria, positing that the organisms are capable of nitrogen metabolism as an energy source and correlate with a positive effect on bacterial survival [ 39 , 40 ]. Furthermore, a bacterial genetics study proved that the nitrate reductase gene narG was required by MTB for intracellular growth. Nitric oxide serves as a potent signaling molecule and bactericidal effector within host macrophages and is required for intracellular growth of MAH. Nitric oxide could signal the macrophage to a more permissive state, serve as a virulence activator for the bacteria or be metabolized into energy. To investigate virulent-related genes of MAH associated with the resistance to oxidative killing mechanism of macrophages, we screened a transposon library and identified MAV_4644:Tn nitric oxide susceptible clone also attenuated in growth within host macrophages. MAV_4644 is a putative ADP-ribosyltransferase (ADPRT), which is highly conserved throughout pathogenic mycobacteria and homologous to M. tuberculosis dual function channel protein with necrosis inducing toxin, Cpnt (Rv3903c). The homologous N-terminal domains (NTDs) are highly conserved in their primary sequences and the NTD of Cpnt has been shown to be a channel protein required for the uptake of glycerol [ 34 , 35 ]. MAV_4644:Tn displayed similar growth kinetics to wild-type MAH in media with glycerol as the sole carbon source, which could indicate a different function for this protein in MAH. However, a search for paralogous genes to MAV_4644 in the genome of MAC104 revealed MAV_2415, which could be a channel protein for glycerol uptake. There are no paralogous genes to Rv3903c in the genome of M. tuberculosis H37Rv. These findings could explain the differing phenotypes in the face of obvious identity. Interestingly, MAV_2415 does not share operonic conservation with MAV_4644 or Rv3903c. The CTD of MAV_4644 is an ADPRT of the VIP2 super family. This family consists of toxins of pathogenic bacteria such as, Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S (ExoS), Vibrio cholerae cholera toxin, Bordetella pertussis pertussis toxin, and Corynebacterium diphtheriae diphtheria toxin. In general, these proteins transfer ADP-ribose from NAD to host proteins, halting key cellular processes and intoxicating the host cell [ 26 ]. A pairwise alignment analysis in pBLAST of the primary protein sequences between the VIP2 domains of MAV_4644 and other known toxins revealed considerable conservation between MAV_4644 and ExoS of P. aeruginosa , as they aligned over 92% of the domain with an E-value of 2 × 10 −16 . In addition, Fieldhouse et al. identified MAV_4644 as an ExoS-like toxin utilizing computational tools to discover novel ADPRT toxins in bacterial pathogens [ 24 ]. ExoS is a type III secretion effector with a GTPase activating domain and an ADPRT domain required for P. aeruginosa virulence [ 41 , 42 ]. ExoS ADP-ribosylates Rab4 plays role in membrane trafficking and greatly inhibits the transferrin recycling [ 41 ]. ExoS also intoxicates cells by ribosylating Rab5 with ADP and interrupts the endosome fusion [ 43 ]. It has also been shown that the ADPRT activity of ExoS is required for P. aeruginosa to disrupt the pulmonary vascular barrier during pneumonic infection and to disseminate into the blood [ 44 ]. Interestingly, there is evidence for this family of toxins to spread between bacterial species by horizontal gene transfer [ 45 ]. Many ADPRT genes are encoded by mobile genetic elements such as bacteriophages, pathogenicity islands and plasmids, enabling promiscuity of this gene family [ 46 ]. In fact, the ADPRT domain of MAV_4644 is 53% GC, while the rest of the gene is 74%, which could be explained by horizontal gene transfer. MAV_4644 is in an operon with MAV_4643 and MAV_4642, which are Esat-6 and CFP-10-like, and homologs of MTB esxE and esxF, respectively. Esat-6 and CFP-10 are a pair of sequential effector proteins secreted by the ESX-1 type VII secretion system of M. tuberculosis and are required for virulence [ 21 , 47 , 48 , 49 ]. All other Esat-6 and CFP-10-like gene pairs in both MAH and M. tuberculosis are associated with a gene clusters in ESX type VII secretion systems [ 33 ]. The fact that MAV_4643, MAV_4642 and their homologs esxE and esxF are upstream of a channel forming protein adds considerable weight to the MAV_4644 operon to be a secretion system of mycobacteria. MAV_4644:Tn is attenuated in macrophages and displayed a rapid decline in the intracellular population in the first hour following macrophage infection. The function of MAV_4644 protein and/or operonic partners appears to protect the bacteria from early macrophage killing. MAV_4644_CTD, MAV_4643 and MAV_4642 recombinant proteins interact with cathepsin Z in an immunoprecipitation assay, which could indicate that all three proteins function together in complex to interfere with the host protein function. Cathepsins are lysosomal peptidases, which act as important regulators of inflammation and cell death within macrophages [ 50 ]. There are 11 human cysteine cathepsins and many are involved in pathogenic mycobacterial infections [ 14 , 51 ]. Infection with MAH and M. tuberculosis inhibits the maturation of cathepsin L, while infection with M. bovis BCG inhibits expression of cathepsin S [ 52 , 53 ]. Most importantly, independent studies have associated single nucleotide polymorphisms in Cathepsin Z with increased susceptibility to tuberculosis [ 54 , 55 ]. CTSZ is a lysosomal cysteine peptidase [ 56 ]. It has been identified as a protein of the early endosome and such proteins are accessible to the mycobacterial vacuole [ 12 , 57 ]. Cathepsin Z has also been reported to be critical for degrading polyglutamine-containing proteins within lysosomes. The cell membranes of pathogenic mycobacteria have numerous polyglutamine stretches [ 58 , 59 , 60 ]. We propose that CTSZ possibly acts on the mycobacterial membrane early in infection, killing a subset of the phagocytosed bacteria ( Figure 8 ). The secreted gene products of the MAV_4644 operon may serve to protect MAH from the peptidase, explaining the attenuation of the MAV_4644:Tn mutant. In the proposed model, MAV_4644 could ADP-ribosylate and inactivate cathepsin Z or MAV_4643 protein and MAV_4642 protein might interact with the active site or induce allosteric changes through protein-protein interactions. To investigate this hypothesis, the CTSZ gene was silenced in THP-1 macrophages, and subsequent infection with MAV_4644:Tn and MAC104 were monitored. We could demonstrate that the knocking-down of cathepsin Z rescues the attenuation phenotype of MAV_4644:Tn to near wild-type levels of survival. The data suggest that CTSZ is involved in early mycobacterial killing of host macrophages and virulence factor MAV_4644 protein abrogates this process. Moreover, an evaluation of recombinant cathepsin Z shows that the protein exhibits the anti-MAH effect in conjunction with nitric oxide, even when the bactericidal activity is evaluated very early (only at 30 min). Our finding advances the knowledge on MAH pathogenesis mechanisms used to survive the action of macrophages. This study identified MAV_4644 as a one of important virulence factors for MAH. In addition, we demonstrated that the lysosomal peptidase cathepsin Z is involved in the early macrophage killing of mycobacteria by facilitating the function of NO. Further studies may identify the molecular relationship between cathepsin Z and NO controlling the macrophage killing method.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8972907/

Designing bioresponsive nanomaterials for intracellular self-assembly

Supramolecular assemblies are essential components of living organisms. Cellular scaffolds, such as the cytoskeleton or the cell membrane, are formed via secondary interactions between proteins or lipids and direct biological processes such as metabolism, proliferation and transport. Inspired by nature's evolution of function through structure formation, a range of synthetic nanomaterials has been developed in the past decade, with the goal of creating non-natural supramolecular assemblies inside living mammalian cells. Given the intricacy of biological pathways and the compartmentalization of the cell, different strategies can be employed to control the assembly formation within the highly crowded, dynamic cellular environment. In this Review, we highlight emerging molecular design concepts aimed at creating precursors that respond to endogenous stimuli to build nanostructures within the cell. We describe the underlying reaction mechanisms that can provide spatial and temporal control over the subcellular formation of synthetic nanostructures. Showcasing recent advances in the development of bioresponsive nanomaterials for intracellular self-assembly, we also discuss their impact on cellular function and the challenges associated with establishing structure–bioactivity relationships, as well as their relevance for the discovery of novel drugs and imaging agents, to address the shortfall of current solutions to pressing health issues. Introduction In nature, the formation of functional structures through the assembly of smaller units can be observed over several structural hierarchies at the macroscopic, microscopic and nanoscopic scales. While spiderwebs are tangible examples of natural constructs built for specific function, eukaryotic cells reveal that similar phenomena also exist on a molecular level: for instance, the cytoskeleton is made from various dynamic protein assemblies that form intricate networks inside the cell, ensuring cellular stability, motility and division 1 . Mimicking these naturally occurring structures by integrating synthetic self-assembled nanostructures in a biological context is an important milestone in supramolecular chemistry, as these systems expand the boundaries of both nanomedicine and synthetic biology. Additionally, the bottom-up approach of creating non-natural assemblies inside cells could help elucidate molecular mechanisms of naturally occurring cellular processes and provide the foundation to unravel the origin of life 2 . Regarding the potential of synthetic supramolecular nanostructures for therapeutic applications 3 , a major appeal is the circumvention of limitations that small molecule drugs face, such as drug resistance in cancer cells 4 . In contrast to small molecules, systems capable of intracellular self-assembly can form large aggregates inside cells, which forces their accumulation at the target site 5 , resulting in improved pharmacokinetics. Additionally, the process of self-assembly can cause mechanical stress due to the disruption of cellular structures, thus, triggering cell death 6 . By instilling bioresponsiveness — in which molecules react to physiological cues — in the design of the assembly precursor, its conversion to an active self-assembling monomer can be precisely tailored to a specific nanoenvironment or microenvironment in the cell. Targeted intracellular stimuli include those that have been widely exploited in state-of-the-art prodrugs and delivery systems, such as pH (refs 7 – 11 ), redox 6 , 12 – 15 or enzymes 16 – 22 , in which the respective stimulus is often characteristic for a certain subcellular location (Fig. 1 ). As the considerations to program nanostructure formation within cells are multifaceted, we aim to streamline the design concepts to create greater accessibility and understanding for the scientific community. In this Review, we showcase successful molecular design principles to control the assembly of functional nanostructures within mammalian cells, which are triggered by endogenous stimuli. Assemblies in bacteria are excluded, as the conditions of transport and the available physiological stimuli are different, thus, requiring a distinct set of molecular considerations 23 , 24 . Recent advances in this field have been summarized in other review articles 25 , 26 . Fig. 1 The eukaryotic cell and its compartments as interconnected reaction vessels. The conditions for chemical transformation of bioresponsive nanomaterials in terms of pH, redox environment and enzyme catalysis differ widely, depending on the subcellular location. While reactive oxygen species (ROS) are mainly generated in the mitochondria 103 , as well as, to a lesser degree, by the membrane-bound NADPH oxidase (NOX) 96 , the cellular reducing agent glutathione is present in high concentration (10 mM) throughout the cytosol 55 . During the endocytic pathway, the pH inside the vesicles decreases significantly from 6.3 in the early endosomes to 5.5 in the late endosomes to 4.7 in the lysosomes, whereas the cytosolic pH is typically neutral, at around 7.2 (ref. 83 ). The localization of enzymes within the cells depends on their respective biocatalytic function, meaning that they are often associated with specific organelles. Furthermore, while other reviews on synthetic assemblies inside mammalian cells have focused more on potential biological applications for bioimaging or chemotherapy 27 – 30 , our main goal is to examine the underlying design principles, considerations and challenges of creating bioresponsive precursors for the formation of supramolecular nanostructures, with an emphasis on the spatiotemporal control over the intracellular assembly. Cellular compartments as reaction vessels The eukaryotic cell is an intricate machinery made of lipids, proteins and genetic material, all forming supramolecular structures in an aqueous environment, while dynamic chemical crosstalk between organelles and the extracellular space governs internal processes 31 . The living cell is a non-equilibrium system characterized by compartmentalization and the energy-dependent maintenance of concentration gradients that are essential for proliferation and function 32 . As cellular compartments fulfil different tasks within the cell, they often provide distinct (bio)chemical environments, such as a certain pH, redox environment, level of molecular crowding or the presence of specific enzymes 31 (Fig. 1 ). From a chemist's perspective, cellular compartments with their distinct characteristics are analogous to a system of interconnected reaction vessels, each offering different reaction conditions for chemical transformations. When designing synthetic materials for intracellular self-assembly, a knowledge of cell biology is essential to understand and exploit structure–(bio)activity relationships. In terms of molecular design, this means carefully choosing the respective functional groups and other elements, such as enzyme recognition sites, to implement selectivity towards a biological or chemical stimulus associated with a target subcellular location. For example, the decrease in pH associated with the endocytic pathway can be exploited by using pH-sensitive materials that can undergo supramolecular transformations inside the acidic endosomal or lysosomal environments due to protonation or isomerization 7 – 11 . Similarly, the reducing medium of the cytosol can induce the chemical conversion of reduction-sensitive precursors into active monomers upon cell entry 12 , 15 , while the higher concentration of reactive oxygen species (ROS) near the mitochondria can lead to oxidation-driven self-assembly in the vicinity of these organelles 14 . Besides the influence of different reaction conditions associated with intracellular location, the cell type also affects the efficiency of chemical transformations, as cells from different tissues have evolved to behave in specific ways that contribute to the survival of the whole organism. For example, liver cells, which are in charge of detoxification, display a comparatively high cytosolic concentration of glutathione, a cellular antioxidant and nucleophile essential for scavenging harmful electrophilic compounds and ROS 33 . Moreover, the gene expression profile of cells also varies depending on the tissue, which includes the expression levels of certain enzymes, such as proteases, that catalyse biochemical transformations. Alterations in the genetic code can cause cells to cease following expected patterns and instead start displaying an opportunistic, self-serving behaviour targeted at sustained growth and evasion of cell death 34 . These cancerous cells can emerge from different tissues and often show an upregulation of pro-proliferative and pro-angiogenic factors, as well as an elevated cellular metabolism 35 . While cancer cells are not uniform in their biological and chemical characteristics, there are some common properties of aggressively growing cancers, for example: the acidification of the tumour extracellular microenvironment because of their enhanced glycolytic rate, a tendency to develop low oxygen level in tissue, called hypoxia, due to limited oxygen supply inside the tumour and the overexpression of certain proteases that aid cell invasion and metastasis 34 . Regarding the great challenges associated with drug-resistant cancers, upregulated efflux pumps , such as P-glycoprotein 36 , and elevated glutathione levels in the cytosol 37 play critical roles in treatment failure due to drug inactivation and efficient removal. Therefore, in addition to using targeting moieties that are recognized by specific cell surface receptors, the aforementioned distinct features of cancerous cells can facilitate the design of novel cancer-specific drugs or imaging agents with less toxic side effects on healthy cells or tissue 38 . Consequently, these considerations are also relevant for controlling the bioresponsive formation of synthetic nanostructures within cancer cells, which offers entirely new avenues to potentially revolutionize bioimaging and cancer therapy. Nanomaterials for intracellular self-assembly Creating synthetic supramolecular assemblies in a biological environment requires molecular design strategies that fulfil necessary criteria regarding biocompatibility, environmental responsiveness and the propensity for self-assembly within crowded and complex environments. For instance, the assembly precursor must enter cells without premature disruption of cellular functions or causing cell death, since a lack of biocompatibility at this stage would impede the formation of nanostructures at the desired cellular location. Efficient cell uptake of the precursor can be achieved by including structural elements that promote cell entry in the molecular design, such as cell-penetrating peptides (CPPs) 6 , 8 or ligands of certain cell surface receptors 5 , 39 , 40 . CPPs comprise 40 or less amino acids and they can be conjugated covalently or non-covalently to cargo to facilitate their delivery into the cell 41 , 42 . Besides direct translocation into the cytosol as a result of attractive electrostatic interaction with the negatively charged plasma membrane 42 , CPPs and their conjugates can also be internalized through various endocytic pathways 43 . While some aspects of the cell uptake mechanisms remain elusive, prominent examples of cationic CPPs such as the HIV-derived peptide transactivator of transcription or polyarginine peptides have been shown to enter cells through a variety of pathways, depending on the cell type and the conjugated cargo 44 – 46 . However, using CPPs for intracellular delivery of assembly precursors can come with the limitation of lacking cell selectivity, whereas the introduction of certain ligands for receptor-mediated endocytosis can tailor the system towards a more targeted effect 5 , 39 , 40 . For example, the tripeptide RGD serves as a recognition motif for integrin cell surface receptors, such as αvβ3, which are overexpressed in many cancer cells 47 . Therefore, assembly precursors that are modified with the linear or cyclic version of the targeting peptide have been employed for cancer-specific targeting both in vitro 10 , 39 , 40 and in vivo 5 . For the in vivo application of nanomaterials for intracellular structure formation, achieving tissue selectivity by active or passive targeting is one of the key objectives. Besides the use of tumour-specific recognition motifs 48 , the so-called enhanced permeability and retention effect in solid tumours with high vascular density and high endothelial permeability 49 contributes to the passive accumulation of macromolecular precursors at the desired location 12 . In general, the administration of compounds for intracellular self-assembly comes with similar challenges in terms of pharmacokinetics and immunogenicity as observed for small molecule drugs 48 ; however, these pro-assembling systems can possess greater selectivity and avoid affecting healthy cells. This is due to the bioresponsive mode of action of the assembly precursors, which require the presence of a specific stimulus inside the cells and confines the assembly formation to the intracellular space 48 , 50 . Within the cell, the activated self-assembling monomer resulting from intracellular chemical conversion needs to display a critical aggregation concentration that is sufficiently low for self-assembly under physiological conditions, which is usually in the micromolar range 9 , 51 . The critical aggregation concentration of the active monomer is determined by the self-assembly propensity of the material, which is based on attractive intermolecular interactions. Since the intracellular environment displays a high degree of macromolecular crowding due to, for example, soluble proteins, densely packed filamentous structures and phase-separated components, this increases diffusional obstacles and further enhances the inherent aggregation tendency of the monomers 52 , 53 . However, this abundance of biomacromolecules with reactive groups, such as proteins with surface-exposed cysteines 54 , as well as other ubiquitous molecules such as glutathione 55 or ROS 56 , mandates the need for biorthogonality of the assembly precursor to prevent unwanted interactions. This biorthogonality is also important for achieving spatial control over the subcellular structure formation, which can additionally be aided by introducing organelle-specific targeting groups to the precursor that ferry the pro-assembling material through the cellular environment to the desired compartment 57 . Generally, there are four material classes that are commonly used for intracellular self-assembly: peptides, polyaromatic compounds, polymers and metal nanoparticles (Fig. 2 ). While there are only a few examples of polymers 14 , 58 or metal nanoparticles 59 – 61 that have shown intracellular structure formation, many peptide-based and polyaromatic materials readily undergo stimuli-responsive self-assembly in cellular environments, providing new perspectives for diagnostic or therapeutic applications. Fig. 2 Material classes for intracellular self-assembly. Peptides represent the largest subset of nanomaterials for intracellular structure formation and can self-assemble into peptide nanofibres due to hydrogen bonding and π–π stacking caused by aromatic amino acid residues 39 . In the case of peptide amphiphiles, hydrophobic interactions of alkyl chains also contribute to the self-assembly propensity 67 , 68 . Polyaromatic compounds form fibrous structures or nanoparticles because of aromatic interactions between the monomers 9 , 69 – 74 . Polymers, such as polyvinyl alcohol, transform into spherical aggregates or fibres 14 , 58 , whereas metal nanoparticles can aggregate into larger assemblies due to covalent crosslinking of their coating 59 – 61 . Peptides, more specifically, β-sheet forming so-called amyloid-like peptides, constitute one of the most popular scaffold materials: they are characterized by amphiphilicity caused by an alternating sequence pattern of polar and nonpolar amino acids, which supports the intermolecular hydrogen bonding necessary for adopting β-sheet secondary structures 62 . Moreover, they usually display a high content of aromatic amino acids, such as phenylalanine, required for self-assembly due to π–π stacking and van der Waals interactions 53 , 63 . Often, an aromatic moiety or fluorophore at the amino terminus further adds to their π–π stacking tendency, supporting their assembly into stable nanostructures 62 . For instance, certain peptides can form ordered β-sheet-rich nanofibres of a few nanometres in width and micrometres in length that show similarities to naturally occurring β-amyloid aggregates present in various neurodegenerative illnesses, such as Alzheimer disease 62 . Amphiphilic peptide conjugates are another subcategory of peptide-based nanomaterials consisting of a peptide sequence prone to hydrogen bonding and a nonpolar alkyl chain (fatty acid) engaging in hydrophobic interactions. Because of their fast assembly into dynamic but stable nanostructures and their gelation propensity 64 , these biocompatible amphiphilic conjugates have been studied extensively for various medical applications, including tissue regeneration 65 and wound healing 66 . Besides extracellular applications, their potential for intracellular structure formation and gelation has been used for enzyme-responsive and pH-responsive self-assembly inside cancer cells 67 , 68 . Polyaromatic compounds can form intracellular aggregates because of π–π aromatic interactions within the aqueous cytoplasm, which has been exploited for the creation of supramolecular imaging agents 15 and drugs for photodynamic therapy 40 . Prominent examples include bispyrene-based systems that rely on the formation of highly fluorescent J -aggregates 69 , 70 and luminogens that display aggregation-induced emission (AIE) properties 71 – 74 . Aside from fluorophores and AIE luminogens that display a constant number of aromatic rings both in the precursor and in the self-assembling monomer, there are also systems that rely on the intracellular formation of new aromatic units due to chemical transformation. For instance, the intracellular condensation reaction between a deprotected aminothiol and an aromatic nitrile can be used to generate self-assembling aminoluciferin-based macrocycles inside cells 9 , 75 . This approach relies on the intracellular creation of polyaromatic cyclic oligomers that can self-assemble into fluorescent nanoaggregates via π–π stacking 9 . Stimuli-induced chemical transformations yielding a self-assembling monomer can be grouped by different levels of complexity, depending on the length of the reaction sequence (Fig. 3 ). Generally, the molecular design concepts for bioresponsive self-assembly can be divided into three categories: structures that undergo a purely morphological transformation (Fig. 3a ), pro-assembling monomers that transform into active monomers due to the removal of a hydrophilic group (Fig. 3b ) and molecules that rely on the bioresponsive deprotection of reactive groups causing a multistep reaction cascade (Fig. 3c ). While the macrocyclization-based systems fit the last category, the most common strategy for controlled intracellular self-assembly uses the chemical or enzymatic removal of a hydrophilic unit to trigger the aggregation of the remaining less polar fragment. By contrast, purely morphological transformations comprise systems that do not require the breakage of chemical bonds to transform into active monomers but instead rely on pH-induced isomerization or protonation. Fig. 3 Differences in complexity of the chemical transformation for intracellular self-assembly. a | Morphology transformation due to trans / cis -amide isomerization 84 . b | Removal of a hydrophilic group in a phospho-tyrosine-containing peptide 18 . c | Deprotection of a bioresponsive cyclization precursor and following reaction cascade 9 . FITC, fluorescein isothiocyanate. Apart from materials that rely on bioresponsive transformations for self-assembly, local accumulation can also lead to aggregation, which does not depend on any specific endogenous stimulus 76 . A subcellular accumulation occurs by integrating organelle-specific targeting groups into the nanomaterial design, which can be exploited to locally exceed the critical aggregation concentration. For example, the positively charged targeting group triphenylphosphonium (TPP) has been used to induce the mitochondria-specific accumulation of short aromatic peptides, which leads to cellular dysfunction and cancer cell death 77 – 79 . Besides TPP, methylpyridinium-substituted materials also target the mitochondria: a methylpyridinium-containing oligothiophene conjugate revealed time-dependent and temperature-dependent accumulation and self-assembly first in the mitochondria, followed by the perinuclear region. The aggregation process was indicated by changes in fluorescence due to a bathochromic shift upon formation of superstructures 80 . For targeting the nucleus, lysine-rich peptides that bind to RNA can direct the self-assembling material to the desired organelle 81 . Physiological stimuli Although a high local concentration of active monomers is the basis for assembly, the specificity and control over structure formation can be enhanced by leveraging physiological cues. The next sections are dedicated to the exploration of strategies for bioresponsive stimuli-induced self-assembly and the ways in which it allows for spatiotemporal control over the formation of intracellular nanostructures. Thus, the following sections are divided according to the respective chemical or biological stimulus that triggers the conversion of a pro-assembling precursor into an active monomer that can form supramolecular structures inside living cells. pH The physiological pH in tissues and inside cellular organelles depends on a multitude of factors and represents an important parameter for biological processes. Moreover, compared with healthy tissue, the tumour microenvironment is often characterized by a slightly acidic pH (6.7–7.1), which is attributed to the enhanced glycolytic rate of cancer cells that results in hypoxia and acidification of the immediate extracellular matrix 82 . Inside cells, the endocytic pathway is accompanied by a pH gradient ranging from 6.3 in the early endosomes to 5.5 in the late endosomes and 4.7 in the lysosome 83 . In these cellular vesicles, a unique acidic environment is created, in which proteolysis and recycling of unneeded cellular components and waste take place. These changes in pH during the entry of a certain cellular compartment can serve as an endogenous trigger for the self-assembly or the morphological transformation of a pH-responsive nanomaterial 8 , 10 , 11 , 84 . Functional groups that are susceptible to protonation or deprotonation within physiological pH ranges can be found in the side chain residues of amino acids, making peptides a suitable platform for controlling pH-driven self-assembly. For example, a block co-polypeptide composed of a hydrophilic oligoarginine (R 12 ) and an amphiphilic peptide with a repeating FKFE motif undergoes a morphological transformation upon endocytosis 8 . Inside the acidic late endosomes and lysosomes (pH ≤ 5), the protonation of glutamic acid residues (E) increases the hydrophobicity of the β-sheet-forming peptide and, therefore, its propensity for self-assembly. This causes a pH-driven morphology transition of the amphiphilic peptide — from unstable aggregates outside of the cell to defined vesicular structures inside the acidic compartments. As this supramolecular process correlates with a spatially confined increase in positive surface charge density of the nanostructures only within the acidic endosomal and lysosomal environments, the pH-responsive peptide exhibits a low cytotoxicity 8 . The high positive surface charge density of the locally formed vesicles is also responsible for the therapeutic effect of the nanomaterial as a supramolecular anti-prion drug because it suppresses the misfolding of proteins through electrostatic interactions. While the acidification of extracellular pH and a slightly elevated cytosolic pH are seen as typical for metastatic cancer cells 82 , the core of solid tumours usually displays hypoxic cells with a slightly lowered intracellular pH caused by the accumulation of acidic metabolites such as lactate 85 . To exploit this particular phenomenon of pH dysregulation, a peptide amphiphile was designed that can self-assemble below pH 7 (ref. 68 ) (Fig. 4a ). The palmitoylated hexapeptide contains three carboxy-terminal glutamic acid residues that render the molecule sensitive to protonation-induced transformation at only slightly acidic pH levels, which is likely due to p K a variations of the side chain carboxylic acids 86 . Consequently, the formation of cytotoxic fibres of the peptide amphiphile was observed exclusively inside cells with decreased intracellular pH, for example, HeLa cervical cancer cells (in vitro and in vivo) or HEK293 cells at the core of spheroids 68 . Fig. 4 pH as stimulus for intracellular self-assembly or morphology transformation. a | Protonation of glutamate residues due to the acidification inside cancer cells with abnormally low cytosolic pH induces supramolecular assembly of a peptide amphiphile, as shown by the transmission electron microscopy images at pH 7.4 and 6.8 (ref. 68 ). b | trans / cis -Isomerization of pH-sensitive 4-amino proline causes the morphology transformation of a pentapeptide during cell entry. The transmission electron microscopy images show a transition from nanoparticles at pH 6.5 to nanofibres at pH 7.4 (ref. 84 ). Part a (right) is adapted with permission from ref. 68 , American Chemical Society. Part b (right) is adapted with permission from ref. 84 , American Chemical Society. Besides incorporating ionizable groups into the chemical design of a bioresponsive material, the use of structural elements prone to pH-dependent isomerization can also lead to the controlled formation of intracellular assemblies 11 , 84 . The relationship between bioactivity and pH-dependent morphology transformation is exemplified by a self-assembling pentapeptide with a central 4-amino proline capable of pH-sensitive cis / trans -amide isomerization in a physiological environment (Fig. 4b ). Without the need for enzyme catalysis, which is a prerequisite for the isomerization of proline in native proteins 87 , the 4-amino-proline-based scaffold can switch from β-sheet-dominated helices at neutral pH to random-coil peptide nanoparticles at pH 6.5. Acidification inside the tumour microenvironment causes the dominance of the trans -isomer and, therefore, the formation of globular assemblies, whereas endocytosis and endosomal escape into the neutral cytosol triggers a trans – cis isomerization, resulting in a second morphology transformation to superhelical structures inside the cell 11 , 84 . Glutathione Glutathione is the most abundant low-molecular-weight peptide in eukaryotic cells and consists of three amino acids: glutamate, cysteine and glycine 37 . Due to the reactive thiol group of its cysteinyl moiety, it acts as a reducing agent, a nucleophile and a cell-protective antioxidant, ensuring redox homeostasis by scavenging free radicals, such as ROS, lipid peroxides and heavy metals 88 . Normal levels of glutathione in human tissues range from 0.1 mM to 10 mM (ref. 55 ), in which 85% to 90% of reduced glutathione is localized in the cytosolic–nuclear compartment 89 , transforming it into a reducing environment for both endogenous compounds and xenobiotics . Many cancers exhibit elevated levels of intracellular glutathione that correlate with higher cellular proliferation and metastatic activity 90 , 91 , as well as multidrug resistance caused by an increased efflux of glutathionylated chemotherapeutics 92 . Glutathione, therefore, constitutes an attractive endogenous stimulus for controlled intracellular self-assembly, due to its ubiquity in cells, its capability of efficiently reducing disulfide bonds and the significant difference in its distribution inside and outside of the cell 93 . The reduction and cleavage of a disulfide bond by glutathione can cause the removal of a hydrophilic aggregation-inhibitive unit, thereby, releasing the self-assembling component to form the designated nanostructures inside the cell 12 , 15 , 58 , 94 . An example for this strategy is the glutathione-responsive fluorescence probe that is composed of a bispyrene linked to a positively charged cyanine dye via a disulfide bridge 15 . Glutathione-induced cleavage of the disulfide in the cytosol causes the separation of the two fluorophores, thereby, allowing the free bispyrene to form large, highly fluorescent J -aggregates 69 in vitro and in vivo 15 . Aside from this small molecule probe for the imaging of glutathione levels, glutathione-responsive polymer–peptide conjugates have also been synthesized 58 . These conjugates consist of a thermoresponsive poly( N -isopropylacrylamide) backbone covalently linked to a hydrophilic cell-penetrating peptide by a disulfide bond (Fig. 5a ). Upon glutathione-induced cleavage, the polymer conjugate exhibits a decrease in lower critical solution temperature to below 37 °C, which causes a transition from a random-coil state into spherical aggregates inside the cell. In addition, this system can be tuned to respond to different endogenous stimuli, including the proteolytic cleavage of the hydrophilic peptide by various enzymes, for example, caspase-3 (ref. 58 ). Fig. 5 Redox-induced intracellular self-assembly. a | Glutathione-induced cleavage of a disulfide bond changes the lower critical solution temperature (LCST) behaviour of a polymer conjugate, causing it to form intracellular nanoaggregates 58 . Bio-transmission electron microscopy of MC7 cells shows the presence of intracellular nanoparticle. b | Cleavage of a reactive oxygen species (ROS)-sensitive thioketal group induces fibre formation 14 . Transmission electron microscopy images show ROS-induced transformation from nanoparticles to nanofibres in hydrogen-peroxide-containing phosphate buffer. KLAK, mitochondria-targeting peptide; P 18 , purpurin 18; PNIPAm, poly( N -isopropylacrylamide); PVA, polyvinyl alcohol. Part a (right) is adapted with permission from ref. 58 , American Chemical Society. Part b (bottom left and right) is adapted with permission from ref. 14 , American Chemical Society. Reactive oxygen species ROS are generated during mitochondrial oxidative metabolism 56 and as a cellular response to xenobiotics, cytokines and bacterial invasion 95 , 96 . Controlled ROS production inside the cell fulfils many biological purposes, such as the regulation of signal transduction 56 , 97 with regards to angiogenesis 96 and insulin metabolism 98 . However, overproduction of ROS leads to oxidative stress and is linked to various pathological phenomena 99 , including abnormal cell growth that can perpetuate cancer initiation and progression 100 , 101 . Targeting cancer cells with high levels of ROS 102 for oxidation-driven self-assembly is a relatively new strategy to create supramolecular architectures inside cells 6 , 14 . The mitochondria produce ROS by means of the electron transport chain 103 , thereby, influencing the immediate redox environment of the organelle and making it an attractive subcellular target for ROS-sensitive materials. Thioketals are an example of a ROS-sensitive functionality that can be degraded in the presence of sufficient amounts of cellular oxidants 104 . For instance, using a thioketal linker to attach a hydrophilic polyethylene glycol (PEG) chain to a self-assembling peptide on a polymer backbone, that is also decorated with a mitochondria-targeting peptide (KLAK), gives rise to a multifunctional platform for mitochondria-specific accumulation, morphology transformation and assembly 14 (Fig. 5b ). This polymer–peptide conjugate consisting of two different polymers (PEG side chain and polyvinyl alcohol backbone), as well as two different peptides (KLAK and β-sheet-forming peptide), can enter the cells as a nanoparticle and undergoes a transformation into a fibrous network in the proximity of ROS-overproducing mitochondria. The morphological transformation is designed in a way that a lipophilic β-sheet-forming sequence is flanked by two hydrophilic polymers, KLAK-functionalized polyvinyl alcohol and PEG. In this initial state, the chains collapse into spherical aggregates, where the steric component of two bulky hydrophilic polymers prevents molecular interaction between the β-sheet peptides. Upon oxidation by high amounts (μM) of ROS, the PEG segment is cleaved, transforming the molecule into an amphiphilic structure. Hence, the steric hindrance is relieved and chain flexibility promotes intermolecular interactions between interchain β-sheet peptides to afford a fibrillar morphology. The ROS-sensitive supramolecular system exhibits significantly higher cytotoxicity towards HeLa cervical cancer cells than towards normal cells, both in vitro and in vivo 14 . Enzymes Biocatalytic reactions carried out by enzymes enrich the chemical depth of cellular pathways, allowing molecules and biopolymers to be processed within the environmental limitations of a living system. Besides converting natural substrates, many enzymes have also been exploited for the intracellular transformation of synthetic precursors into self-assembling monomers 18 , 50 , 105 , 106 (Table 1 ). For this purpose, enzyme-specific recognition motifs can be included in the molecular design of the precursor to tailor its bioresponsiveness towards a certain enzyme within the cell (Fig. 6 ). The following sections highlight the use of various types of intracellular enzymes, namely, proteases, phosphatases and other kinds of enzymes, to instruct targeted structure formation at different subcellular locations. Table 1 Enzyme-instructed intracellular self-assembly Enzyme Transformation site Cellular localization Refs Furin RVRR_ Golgi 9 , 21 , 60 , 61 , 113 – 118 , 183 Caspase-3/7 DEVD_ Cytosol 16 , 22 , 39 , 48 , 50 , 58 , 59 , 123 , 125 ENTK DYKDDDDK_ Mitochondria 106 , 133 – 135 ATG4B TFG_F Cytosol 58 , 157 Cathepsin B GF_LG Lysosome 5 , 40 ALP Yp Cell membrane 17 , 18 , 20 , 53 , 57 , 163 , 164 , 167 , 180 , 184 – 189 PTP1B Yp ER 17 , 18 , 163 , 164 , 166 , 186 β-Galactosidase β-Gal-aromatic Lysosome 16 , 171 γGT γ-E_ Cell membrane 190 Nitroreductase -NO 2 → -NH 2 Cytosol 178 Transglutaminase → ε-(γ-Q)-K Cytosol, ER, mitochondria 105 Carboxylesterase Ester bond ER 51 , 173 – 176 γGT, γ-glutamyltransferase; ALP, alkaline phosphatase; ATG4B, autophagy-related 4B cysteine peptidase; ENTK, enterokinase; ER, endoplasmic reticulum; PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B. Fig. 6 Cellular localization of enzymes for self-assembly and their respective recognition and transformation sites. γGT, γ-glutamyltransferase; ALP, alkaline phosphatase; ATG4B, autophagy-related 4B cysteine peptidase; ENTK, enterokinase; ER, endoplasmic reticulum; PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B. Proteases Proteolytic enzymes catalyse the hydrolysis of peptide bonds 107 , making them an attractive biological tool for the activation of bioresponsive nanomaterials. The diversity of proteases in terms of their subcellular localization, level of expression in different cell types, as well as their specificity for a certain cleavage site, facilitates spatiotemporal programming of enzyme-instructed self-assembly. Furin is an endoprotease that is associated with the Golgi apparatus in eukaryotic cells. Belonging to the enzyme family of proprotein convertases, it catalyses downstream peptide cleavage of the polybasic motif RX(R/K)R for the bioactivation of certain proteins 108 . This enzymatic cleavage reaction plays an essential role in pathogenesis, as the enzyme activity of furin has been linked to cancer progression 109 , 110 , as well as viral diseases 111 , including SARS-CoV-2 infection 112 . Therefore, the imaging of furin activity inside cells or tumour tissue is an attractive target that can be addressed using bioresponsive supramolecular chemistry. For example, the intracellular condensation reaction between an aminothiol and a cyanobenzothiazole for the formation of self-assembling macrocyclic dimers was first realized using a furin-sensitive precursor (Fig. 3c ). By adding the four amino acids RVRR to the amino-terminal cysteine, they serve not only as an enzyme-cleavable protecting group (Fig. 7a ) for the amino function but also facilitate cell entry of the precursor due to the positively charged side chain residues 9 . Further investigation of the intracellular reaction cascade showed that the furin-induced proteolytic cleavage near the Golgi apparatus constitutes the rate-limiting step for the formation of active monomers, which correlates to the subcellular localization of the resulting nanostructures at this site 21 . This enzyme-instructed intracellular aggregation also enables in vivo imaging of furin activity inside furin-overexpressing tumour tissue, since it can promote the accumulation and retention of an imaging agent that is covalently linked to the self-assembling monomer. A variety of techniques that exploit this effect have been applied for diagnostic purposes, such as photoacoustic imaging 113 , micro-positron emission tomography 114 , use of radiotracers 115 , Raman imaging 116 and magnetic resonance imaging 117 . In all these studies, the imaging agent was introduced to the precursor molecule via side chain modification of a lysine positioned between the cyanobenzothiazole and the cysteine. The use of this strategy for the chemical modification of the condensation precursor has also been used for the conjugation of the chemotherapeutic drug, Taxol, which helps to prevent undesired drug efflux and promotes sustained drug release due to the furin-induced self-assembly of Taxol nanoparticles 118 . Aside from the attachment of small organic molecules, metal-based nanoparticles can also be decorated with the bioresponsive precursor by using the amino group of the lysine side chain for amide coupling reactions on a carboxyl-modified particle surface 60 , 61 . The resulting metal-based pro-assembling nanomaterials can form aggregates of gold or iron oxide nanoparticles inside furin-overexpressing cells as a result of particle crosslinking caused by enzyme-triggered condensation reactions. Fig. 7 Multistep transformation for intracellular self-assembly. a | Structures of assembly precursors for macrocyclization-based self-assembly. The amino protecting group determines the sensitivity to a specific enzyme, such as furin 9 , 21 , 113 , caspase-3/7 (refs 16 , 50 , 125 ), β-galactosidase 16 or nitroreductase 178 . The peptide-based spacer R 2 between the reactive functionalities can contain fluorophores, drugs or other bioactive compounds. b | Multistep reaction sequence of intracellular conversion pH-sensitive and reactive oxygen species (ROS)-sensitive isopeptides into linear co-assembling peptides. The targeting group contains cell-penetrating peptide TAT (transactivator of transcription) and enables cell entry, upon which the acid-labile dynamic covalent bond between the salicyl hydroxamate of targeting peptide and the phenylboronic acid group of the isopeptides is hydrolysed in the endosomes. The hydrogen-peroxide-induced deprotection via self-immolation of the phenylboronic acid group reveals a reactive amino group that can attack the adjacent ester bond. This rearrangement due to an O , N acyl shift results in the linearized co-assembling peptides. The formation of peptide nanofibres inside A549 cells can be visualized with bio-transmission electron microscopy. Part b (bottom left) is adapted with permission from ref. 6 , American Chemical Society. Caspases are proteolytic enzymes that play an essential role in the initiation and execution of apoptosis, a mode of programmed cell death 119 . These endoproteases contain a characteristic nucleophilic cysteine as a central part of a polybasic substrate-binding pocket 120 . The chemical structure of their active site enables them to catalyse the hydrolytic cleavage of proteins for the controlled dismantling of the cell. Within the intricate activation cascade of different caspases, the so-called 'effector' caspases-3, 6 and 7 carry out most of the proteolysis during apoptosis and can, therefore, be considered biomarkers for programmed cell death 121 . Since caspase-3 and caspase-7 both exhibit similar preferential downstream cleavage of the motif DEVD in synthetic substrates 122 , many supramolecular systems have been designed to include this sequence as a bioresponsive moiety for intracellular self-assembly 16 , 22 , 39 , 48 , 50 , 58 , 59 , 123 – 125 (Fig. 6 ). For example, a fluorescent probe for the real-time imaging of apoptosis in drug-treated cancer cells was combined with the hydrophobic tetraphenylethene (TPE) with the hydrophilic peptide motif DEVD_K via azide–alkyne click chemistry 123 . After enzymatic cleavage by caspase-3/7, the polyaromatic fragment TPE-K can self-assemble inside cells, which results in AIE caused by the restriction of intramolecular rotation of its phenyl rings 126 . These so-called AIE luminogens 127 — which exhibit a turn-on fluorescence upon aggregation — can be useful reporters of enzyme activity in cancer cells, especially when they are part of a multifunctional theranostic nanomaterial 39 . A sequential approach to the caspase-induced formation of intracellular nanostructures uses systems containing tumour-specific recognition motifs able to trigger apoptosis 22 , 48 . A peptide-based precursor, containing a biomimetic sequence that can bind and inactivate the X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) 128 , promotes the activation of caspase-3/7 through the manipulation of intracellular signal transduction 129 . The activated pro-apoptotic proteases can then remove the non-assembling XIAP-recognition motif, thereby, inducing the self-assembly of the remaining β-sheet-forming peptide–drug conjugate 48 or peptide–cyanine dye conjugate 22 . This sophisticated system selectively causes assembly formation in cancerous tissue both in animal models and in ex vivo human bladders that were taken from patients with late-stage bladder cancer 48 . The latter experiment shows the potential clinical use of the caspase-sensitive assembly precursor, as it could help detect tumour boundaries during image-guided surgery. For quantitative imaging of caspase-3/7 activity in live animals, a condensation-driven system was developed, in which the enzymatic activation of the precursor is decoupled from a subsequent imaging tag immobilization 50 . The pro-assembling molecule consists of the amino-terminal protecting group DEVD (Fig. 7a ) linked to a cysteine, a lysine with a clickable trans -cyclooctene (TCO) on its side chain, as well as a pyrimidinecarbonitrile as the aromatic nitrile for the enzyme-instructed macrocyclization. Since this caspase-3/7-responsive molecule can form stable intracellular nanoaggregates, subsequent addition or injection of a tetrazine-functionalized fluorophore leads to an immobilization of the imaging probe due to inverse electron demand Diels–Alder reactions between the tetrazine and the aggregated TCO-bearing monomers. Enterokinase (ENTK) (also known as enteropeptidase) 130 is a membrane-bound protease that is essential for digestion 131 . Its main physiological purpose is the cleavage of the acidic motif DDDDK in the pancreatic proenzyme trypsinogen, which leads to the activation of trypsin 132 . There are multiple reasons as to why ENTK is an interesting enzyme candidate for programming cell-specific and organelle-specific self-assembly 106 , 133 – 135 : firstly, its role in the activation of trypsin has been linked to matrix degradation and migration of lung, colorectal and glioblastoma cancer cells 136 ; secondly, it allows cell-specific targeting of the mitochondria in cancer cell lines, such as HeLa (cervical cancer), Saos-2 (bone cancer) and HepG2 (liver cancer) 134 ; and, thirdly, it enables the enzyme-driven release of cargo from a supramolecular vehicle at the organelle surface 133 . The ENTK-sensitive systems consist of the cleavable FLAG-tag DYKDDDDK covalently linked to a self-assembling peptide sequence 106 , 133 , 134 or a lipid-like moiety 135 . The chemical design of the peptide-based precursor is a branched structure that is important for mitochondria targeting 133 . After entering the cell in a micellar form by clathrin-mediated endocytosis 134 , the supramolecular precursors escape the endosome facilitated by pH buffering of the carboxylic acid groups 135 . The subsequent subcellular accumulation at the mitochondria is promoted by the increased mitochondrial membrane potential in cancer cells and the electrostatic interaction between the negatively charged FLAG-tag and voltage-dependent anion channels at the organelle surface 135 . The enzymatic cleavage of the hydrophilic tag by ENTK initiates the local conversion from micelles to peptide nanofibres 106 , 133 , 134 (or more lipophilic micelles in the case of the peptide–lipid conjugates) 135 . This supramolecular transformation causes an increase in perimitochondrial viscosity and enables the organelle-specific delivery of drugs 133 , 135 , proteins 106 or gene vectors 134 . Trypsin is a potent serine protease that has been the subject of ongoing biomedical research due to its role in the invasion and metastasis of various cancers, such as ovarian 137 , colorectal 138 , 139 , lung 140 and prostate cancer 141 . The overexpression of different trypsin isoforms by tumours leads to the amplified degradation of extracellular proteins 142 and the increased activation of other matrix-associated proteases 137 , 143 , 144 . The preferential cleavage of trypsin at the carboxy terminal of lysine or arginine can be exploited as an enzymatic trigger for the self-assembly of synthetic monomers, as shown by a trypsin-responsive precursor molecule 19 . Similar to the ENTK-responsive systems, the branched pro-assembling peptide consists of an aromatic tetrapeptide backbone and a hydrophilic lysine-rich sequence KYDKKKKDG that can be cleaved in trypsin 1-overexpressing ovarian cancer cells (OVSAHO). As these particular cells exhibit an abnormally high activity of the protease at the endoplasmic reticulum (ER), the resulting formation of cytotoxic nanofibres is not only cell specific but also organelle specific, despite high concentrations of the supramolecular precursor being necessary. Cathepsin B is a lysosomal protease that has been linked to the invasiveness of several types of cancer 145 , including colorectal 146 and breast cancer 147 . This pro-angiogenic enzyme 148 recognizes and cleaves the sequence GFLG in synthetic substrates, which has made it a useful biological tool for cancer-specific drug delivery 149 . Combining the technology of AIE luminogens with a cathepsin B-cleavable peptide led to a light-up imaging probe and photosensitizer for the detection and ablation of breast cancer cells 40 . The precursor consists of a tetraphenylethylene derivative with two azido groups that are each 'clicked' to a bioactive peptide composed of the cathepsin B-responsive sequence GFLG, a hydrophilic linker (DDD) and the targeting moiety cyclo-RGD. The double-substituted AIE imaging probe can form fluorescent aggregates in the lysosomes of breast cancer cells (MDA-MB 231), which facilitates the quantification of enzyme activity, as well as photodynamic therapy 40 . To study the autocatalytic growth of intracellular nanofibres, a cathepsin B-responsive prodrug was developed that could undergo a morphology transformation from nanoparticles to fibrous networks in vitro and in vivo: after shedding a hydrophilic PEG-RGD unit, the remaining self-assembling peptide–drug conjugate undergoes β-sheet-driven fibrillation inside HeLa cells, which is accelerated by the presence of previously formed fibrils 5 . Matrix metalloproteinase 7 (MMP7) is a protease involved in the degradation of extracellular matrix proteins 150 , contributing to cancer cell migration 151 . To initiate cancer cell death by intracellular self-assembly, a peptide–lipid conjugate susceptible to cleavage by MMP7 was developed, an enzyme that is secreted by HeLa cells 67 . The palmitoylated peptide consists of a glycine-rich nonpolar sequence, an MMP7 cleavage site (PLG_L) and a hydrophilic carboxy-terminal fragment (_LARK) that inhibits unspecific aggregation before enzymatic conversion. After incubation with the precursor, HeLa cells exhibited decreased viability caused by the cancer-cell-specific formation of intracellular peptide–lipid nanofibres 67 . ATG4B is a cysteine protease that contributes to autophagy , during which protein aggregates and damaged organelles are digested and recycled 152 . While it is essential for homeostasis in healthy tissue, dysregulated autophagy is associated with pathogenesis, such as tumorigenesis 153 , 154 and neurodegeneration 155 . Since ATG4B is crucial for the formation of autophagosomes 156 , its activity was monitored using a bioresponsive supramolecular probe 157 . The chemical design of this imaging agent combines a self-assembling bispyrene with a peptide displaying the ATG4B cleavage site TFG_F 157 , as well as a highly cationic poly(amidoamine) dendrimer that enables cell entry and provides water solubility. After the enzymatic cleavage in MCF-7 breast cancer cells, the free bispyrene units self-assemble into fluorescent nanoparticles due to the formation of J -aggregates 69 , before transforming into cytosolic nanofibres over time 157 . Phosphatases Phosphorylation and dephosphorylation of protein substrates play a vital role in signal transduction and the regulation of enzyme and receptor activity 158 . Since dysregulation of these processes is associated with cellular dysfunction and tumorigenesis, phosphatases, which are the enzyme family responsible for the removal of phosphate groups 159 , are interesting candidates for controlling enzyme-instructed intracellular self-assembly. Alkaline phosphatase (ALP) is a prominent example of a ubiquitous enzyme that catalyses dephosphorylation 160 . Regarding subcellular localization, ALP as a membrane-bound phosphatase is associated with the cell membrane 160 , while PTP1B, another important protein tyrosine phosphatase, is located at the surface of the ER 161 . By exploiting the overexpression of both ALP and PTP1B as known tumour markers, phosphatase-instructed self-assembly of short phospho-tyrosine (Yp)-containing peptides can be used for bioimaging 18 and combinational cancer therapy 162 . A general structure of the precursor for phosphatase-instructed self-assembly was established: a tetrapeptide containing two phenylalanines, one Yp that can be dephosphorylated, as well as a basic amino acid, such as lysine, which can be coupled to a fluorophore or a targeting unit. The amino terminus of the short peptide is substituted with an additional aromatic moiety, for example, a naphthyl group, that contributes to the propensity for self-assembly due to intermolecular aromatic interactions of the dephosphorylated monomer. For example, the fluorescent aromatic tetrapeptide naphthyl-FFK(nitrobenzoxadiazole (NBD)) Yp was used as a phosphatase-sensitive precursor for the formation of fluorescent nanofibres inside HeLa cells 18 (Fig. 3b ). Interestingly, the fibrous structures were observed to grow within minutes from the ER towards the cell membrane, which can be explained by the high enzymatic activity of PTP1B at the surface of the organelle 18 . Besides using NBD as the dye, introducing other fluorophores revealed that the supramolecular behaviour and the spatial distribution of the intracellular assemblies vary drastically depending on the fluorescent unit 163 , 164 ; NBD-containing monomers can form intracellular nanofibres that protect the cell and its cytoskeleton against an F-actin toxin, whereas dansyl-substituted peptide localizes in the cell membrane and exhibits a cytotoxic effect after dephosphorylation 124 . These differences in the bioactivity of the precursors and the respective activated monomers can be explained by variations in hydrophobicity of the fluorophore dictating both their interactions with cellular membranes and their self-assembly propensity. For example, the dansyl group exhibits a higher solubility in phospholipid membranes, partly due to its compatibility with the headgroup of phosphatidylcholine 165 , while the peptide precursor substituted with positively charged rhodamine cannot produce a hydrogel even after dephosphorylation by ALP, leading to an unspecific fluorescence distribution inside and outside of the cells 124 . Aside from modulating the intracellular assembly behaviour by changing the fluorophore, exchanging amino acids with different stereochemical properties in the precursor can also change the morphology of the nanostructures resulting from dephosphorylation 17 . By attaching an l -homoarginine ( L hR) at the carboxyl terminus of the d -tripeptides, naphthyl- D F D F D Yp and NBD- D F D F D Yp precursors were generated for phosphatase-instructed self-assembly that, after dephosphorylation, could form cytotoxic crescent-shaped assemblies targeted for accumulation at the ER. The toxic effect of the crescent-shaped structures seemed to be cell specific, as it was limited to cancerous cells with high levels of ALP at their cell membrane, such as HeLa cervical cancer cells and OVSAHO ovarian cancer cells, while normal stromal cells (HS-5) were not affected 17 . To further control and exploit the subcellular localization of phosphatase-instructed assemblies, the structure of the precursor can be adapted for organelle-specific targeting 57 , 166 , 167 . Integrating positively charged TPP via lysine side chain modification gives rise to mitochondria-targeted tetrapeptides that can undergo dephosphorylation by ALP at the cell membrane of Saos-2 osteosarcoma cells 57 . The resulting polymorphic aggregates can enter the cells and trigger the release of cytochrome c from the mitochondria, causing cell death only in ALP-overexpressing cancer cells. The in situ generation of the self-assembling monomers seems to be essential for the toxicity towards the cells, since incubating them directly with the final product of the enzymatic conversion has no effect on their viability 57 . Aside from the use of well-known targeting moieties such as TPP, incorporating ligands of enzymes that are specific for a certain organelle can also influence the accumulation and structure formation at the desired subcellular location. An example for this is the naproxen (Npx)-substituted tetrapeptide Npx- D F D F D Yp L hR used for intracellular enzyme sequestration on the surface of the ER 166 . Npx is a nonsteroidal anti-inflammatory drug and a ligand of COX2, which is an enzyme located at the surface of the ER. By binding to COX2 via Npx and to PTP1B via Yp, the precursor and the resulting fibrous assemblies can sequester the two enzymes on the organelle surface, thereby, inducing their co-localization and potential protein–protein interaction. Another recent discovery regarding organelle-specific phosphatase-instructed self-assembly was that short thiophosphopeptides can form nanofibres specifically at the Golgi apparatus 167 . This phenomenon seems to be due to the rapid conversion of thiophosphopeptides into thiopeptides by Golgi-associated ALP followed by disulfide bond formation with cysteine-rich proteins in the oxidative environment of the organelle. Other enzymes β-Galactosidase is a lysosomal sugar hydrolase that is overexpressed in senescent cells 168 . As the accumulation of non-proliferating cells can negatively impact tissue function 169 , detecting and clearing senescent cells is of therapeutic interest, especially for age-related diseases such as atherosclerosis 170 . For this reason, a short aromatic peptide was designed with a β-galactose-functionalized tyrosine (NBD-FFY(β-Gal)G) that is susceptible to enzymatic cleavage inside senescent endothelial cells and HeLa cells 171 . While the viability of non-senescent cells was only slightly affected by the administration of the enzyme-responsive precursor, it caused the β-galactosidase-instructed formation of cytotoxic nanofibres in senescent cells due to intermolecular aromatic interaction. A different approach to implement β-galactosidase sensitivity into a precursor for condensation-driven self-assembly used a benzyl carbamate amino protecting group with a β-galactose substituent on the aromatic ring that could undergo self-immolative degradation upon enzymatic removal of the sugar 16 (Fig. 7a ). This β-galactosidase-induced deprotection of a reactive amino thiol triggers a subsequent condensation reaction with an aromatic nitrile that results in the intracellular formation of self-assembling macrocycles. Carboxylesterases (CES) are essential for the cleavage of endogenous and xenobiotic esters 172 . Aside from their general importance for lipid homeostasis and drug metabolism, CES were also the first enzymes to be exploited for the intracellular self-assembly of synthetic nanomaterials 173 . The CES-responsive precursors generally consist of a diphenylalanine, an amino-terminal naphthyl group or aromatic fluorophore, and a carboxy-terminal ethanolamine offering a hydroxyl group for the esterification of a hydrophilic unit (for example, butyric acid or taurine) that prevents aggregation 51 , 173 – 176 . Inside cells with high CES activity, such as certain ovarian and cervical cancer cells, the enzymatic cleavage of the ester bond leads to the formation of nanofibres that can disrupt actin filaments 175 and boost the activity of the anticancer drug cisplatin 51 . While the enzymes mentioned so far in this Review are all hydrolases, meaning that they catalyse the breakage of chemical bonds using water, there are also enzymes that create new bonds and that can be used for the programming of nanomaterial aggregation inside cells. Transglutaminase is an enzyme that catalyses the amide bond formation between glutamine and lysine side chains 177 . This biocatalytic condensation reaction can be exploited for the intracellular polymerization of short peptide monomers into elastin-like polypeptides (ELPs) 105 . The topology and the thermoresponsive properties of these ELPs is predetermined by the number of lysines and glutamines in the polymerizable monomer: while peptide monomers with only one lysine and glutamine each yield linear ELPs with upper or lower critical solution temperature behaviour to form globular aggregates, monomers containing more than one lysine and glutamine yield a three-dimensional gel-like ELP network inside the cell. The latter exhibits a dose-dependent cytotoxicity, whereas linear ELPs forming random coils or aggregates are biocompatible 105 . pH The physiological pH in tissues and inside cellular organelles depends on a multitude of factors and represents an important parameter for biological processes. Moreover, compared with healthy tissue, the tumour microenvironment is often characterized by a slightly acidic pH (6.7–7.1), which is attributed to the enhanced glycolytic rate of cancer cells that results in hypoxia and acidification of the immediate extracellular matrix 82 . Inside cells, the endocytic pathway is accompanied by a pH gradient ranging from 6.3 in the early endosomes to 5.5 in the late endosomes and 4.7 in the lysosome 83 . In these cellular vesicles, a unique acidic environment is created, in which proteolysis and recycling of unneeded cellular components and waste take place. These changes in pH during the entry of a certain cellular compartment can serve as an endogenous trigger for the self-assembly or the morphological transformation of a pH-responsive nanomaterial 8 , 10 , 11 , 84 . Functional groups that are susceptible to protonation or deprotonation within physiological pH ranges can be found in the side chain residues of amino acids, making peptides a suitable platform for controlling pH-driven self-assembly. For example, a block co-polypeptide composed of a hydrophilic oligoarginine (R 12 ) and an amphiphilic peptide with a repeating FKFE motif undergoes a morphological transformation upon endocytosis 8 . Inside the acidic late endosomes and lysosomes (pH ≤ 5), the protonation of glutamic acid residues (E) increases the hydrophobicity of the β-sheet-forming peptide and, therefore, its propensity for self-assembly. This causes a pH-driven morphology transition of the amphiphilic peptide — from unstable aggregates outside of the cell to defined vesicular structures inside the acidic compartments. As this supramolecular process correlates with a spatially confined increase in positive surface charge density of the nanostructures only within the acidic endosomal and lysosomal environments, the pH-responsive peptide exhibits a low cytotoxicity 8 . The high positive surface charge density of the locally formed vesicles is also responsible for the therapeutic effect of the nanomaterial as a supramolecular anti-prion drug because it suppresses the misfolding of proteins through electrostatic interactions. While the acidification of extracellular pH and a slightly elevated cytosolic pH are seen as typical for metastatic cancer cells 82 , the core of solid tumours usually displays hypoxic cells with a slightly lowered intracellular pH caused by the accumulation of acidic metabolites such as lactate 85 . To exploit this particular phenomenon of pH dysregulation, a peptide amphiphile was designed that can self-assemble below pH 7 (ref. 68 ) (Fig. 4a ). The palmitoylated hexapeptide contains three carboxy-terminal glutamic acid residues that render the molecule sensitive to protonation-induced transformation at only slightly acidic pH levels, which is likely due to p K a variations of the side chain carboxylic acids 86 . Consequently, the formation of cytotoxic fibres of the peptide amphiphile was observed exclusively inside cells with decreased intracellular pH, for example, HeLa cervical cancer cells (in vitro and in vivo) or HEK293 cells at the core of spheroids 68 . Fig. 4 pH as stimulus for intracellular self-assembly or morphology transformation. a | Protonation of glutamate residues due to the acidification inside cancer cells with abnormally low cytosolic pH induces supramolecular assembly of a peptide amphiphile, as shown by the transmission electron microscopy images at pH 7.4 and 6.8 (ref. 68 ). b | trans / cis -Isomerization of pH-sensitive 4-amino proline causes the morphology transformation of a pentapeptide during cell entry. The transmission electron microscopy images show a transition from nanoparticles at pH 6.5 to nanofibres at pH 7.4 (ref. 84 ). Part a (right) is adapted with permission from ref. 68 , American Chemical Society. Part b (right) is adapted with permission from ref. 84 , American Chemical Society. Besides incorporating ionizable groups into the chemical design of a bioresponsive material, the use of structural elements prone to pH-dependent isomerization can also lead to the controlled formation of intracellular assemblies 11 , 84 . The relationship between bioactivity and pH-dependent morphology transformation is exemplified by a self-assembling pentapeptide with a central 4-amino proline capable of pH-sensitive cis / trans -amide isomerization in a physiological environment (Fig. 4b ). Without the need for enzyme catalysis, which is a prerequisite for the isomerization of proline in native proteins 87 , the 4-amino-proline-based scaffold can switch from β-sheet-dominated helices at neutral pH to random-coil peptide nanoparticles at pH 6.5. Acidification inside the tumour microenvironment causes the dominance of the trans -isomer and, therefore, the formation of globular assemblies, whereas endocytosis and endosomal escape into the neutral cytosol triggers a trans – cis isomerization, resulting in a second morphology transformation to superhelical structures inside the cell 11 , 84 . Glutathione Glutathione is the most abundant low-molecular-weight peptide in eukaryotic cells and consists of three amino acids: glutamate, cysteine and glycine 37 . Due to the reactive thiol group of its cysteinyl moiety, it acts as a reducing agent, a nucleophile and a cell-protective antioxidant, ensuring redox homeostasis by scavenging free radicals, such as ROS, lipid peroxides and heavy metals 88 . Normal levels of glutathione in human tissues range from 0.1 mM to 10 mM (ref. 55 ), in which 85% to 90% of reduced glutathione is localized in the cytosolic–nuclear compartment 89 , transforming it into a reducing environment for both endogenous compounds and xenobiotics . Many cancers exhibit elevated levels of intracellular glutathione that correlate with higher cellular proliferation and metastatic activity 90 , 91 , as well as multidrug resistance caused by an increased efflux of glutathionylated chemotherapeutics 92 . Glutathione, therefore, constitutes an attractive endogenous stimulus for controlled intracellular self-assembly, due to its ubiquity in cells, its capability of efficiently reducing disulfide bonds and the significant difference in its distribution inside and outside of the cell 93 . The reduction and cleavage of a disulfide bond by glutathione can cause the removal of a hydrophilic aggregation-inhibitive unit, thereby, releasing the self-assembling component to form the designated nanostructures inside the cell 12 , 15 , 58 , 94 . An example for this strategy is the glutathione-responsive fluorescence probe that is composed of a bispyrene linked to a positively charged cyanine dye via a disulfide bridge 15 . Glutathione-induced cleavage of the disulfide in the cytosol causes the separation of the two fluorophores, thereby, allowing the free bispyrene to form large, highly fluorescent J -aggregates 69 in vitro and in vivo 15 . Aside from this small molecule probe for the imaging of glutathione levels, glutathione-responsive polymer–peptide conjugates have also been synthesized 58 . These conjugates consist of a thermoresponsive poly( N -isopropylacrylamide) backbone covalently linked to a hydrophilic cell-penetrating peptide by a disulfide bond (Fig. 5a ). Upon glutathione-induced cleavage, the polymer conjugate exhibits a decrease in lower critical solution temperature to below 37 °C, which causes a transition from a random-coil state into spherical aggregates inside the cell. In addition, this system can be tuned to respond to different endogenous stimuli, including the proteolytic cleavage of the hydrophilic peptide by various enzymes, for example, caspase-3 (ref. 58 ). Fig. 5 Redox-induced intracellular self-assembly. a | Glutathione-induced cleavage of a disulfide bond changes the lower critical solution temperature (LCST) behaviour of a polymer conjugate, causing it to form intracellular nanoaggregates 58 . Bio-transmission electron microscopy of MC7 cells shows the presence of intracellular nanoparticle. b | Cleavage of a reactive oxygen species (ROS)-sensitive thioketal group induces fibre formation 14 . Transmission electron microscopy images show ROS-induced transformation from nanoparticles to nanofibres in hydrogen-peroxide-containing phosphate buffer. KLAK, mitochondria-targeting peptide; P 18 , purpurin 18; PNIPAm, poly( N -isopropylacrylamide); PVA, polyvinyl alcohol. Part a (right) is adapted with permission from ref. 58 , American Chemical Society. Part b (bottom left and right) is adapted with permission from ref. 14 , American Chemical Society. Reactive oxygen species ROS are generated during mitochondrial oxidative metabolism 56 and as a cellular response to xenobiotics, cytokines and bacterial invasion 95 , 96 . Controlled ROS production inside the cell fulfils many biological purposes, such as the regulation of signal transduction 56 , 97 with regards to angiogenesis 96 and insulin metabolism 98 . However, overproduction of ROS leads to oxidative stress and is linked to various pathological phenomena 99 , including abnormal cell growth that can perpetuate cancer initiation and progression 100 , 101 . Targeting cancer cells with high levels of ROS 102 for oxidation-driven self-assembly is a relatively new strategy to create supramolecular architectures inside cells 6 , 14 . The mitochondria produce ROS by means of the electron transport chain 103 , thereby, influencing the immediate redox environment of the organelle and making it an attractive subcellular target for ROS-sensitive materials. Thioketals are an example of a ROS-sensitive functionality that can be degraded in the presence of sufficient amounts of cellular oxidants 104 . For instance, using a thioketal linker to attach a hydrophilic polyethylene glycol (PEG) chain to a self-assembling peptide on a polymer backbone, that is also decorated with a mitochondria-targeting peptide (KLAK), gives rise to a multifunctional platform for mitochondria-specific accumulation, morphology transformation and assembly 14 (Fig. 5b ). This polymer–peptide conjugate consisting of two different polymers (PEG side chain and polyvinyl alcohol backbone), as well as two different peptides (KLAK and β-sheet-forming peptide), can enter the cells as a nanoparticle and undergoes a transformation into a fibrous network in the proximity of ROS-overproducing mitochondria. The morphological transformation is designed in a way that a lipophilic β-sheet-forming sequence is flanked by two hydrophilic polymers, KLAK-functionalized polyvinyl alcohol and PEG. In this initial state, the chains collapse into spherical aggregates, where the steric component of two bulky hydrophilic polymers prevents molecular interaction between the β-sheet peptides. Upon oxidation by high amounts (μM) of ROS, the PEG segment is cleaved, transforming the molecule into an amphiphilic structure. Hence, the steric hindrance is relieved and chain flexibility promotes intermolecular interactions between interchain β-sheet peptides to afford a fibrillar morphology. The ROS-sensitive supramolecular system exhibits significantly higher cytotoxicity towards HeLa cervical cancer cells than towards normal cells, both in vitro and in vivo 14 . Enzymes Biocatalytic reactions carried out by enzymes enrich the chemical depth of cellular pathways, allowing molecules and biopolymers to be processed within the environmental limitations of a living system. Besides converting natural substrates, many enzymes have also been exploited for the intracellular transformation of synthetic precursors into self-assembling monomers 18 , 50 , 105 , 106 (Table 1 ). For this purpose, enzyme-specific recognition motifs can be included in the molecular design of the precursor to tailor its bioresponsiveness towards a certain enzyme within the cell (Fig. 6 ). The following sections highlight the use of various types of intracellular enzymes, namely, proteases, phosphatases and other kinds of enzymes, to instruct targeted structure formation at different subcellular locations. Table 1 Enzyme-instructed intracellular self-assembly Enzyme Transformation site Cellular localization Refs Furin RVRR_ Golgi 9 , 21 , 60 , 61 , 113 – 118 , 183 Caspase-3/7 DEVD_ Cytosol 16 , 22 , 39 , 48 , 50 , 58 , 59 , 123 , 125 ENTK DYKDDDDK_ Mitochondria 106 , 133 – 135 ATG4B TFG_F Cytosol 58 , 157 Cathepsin B GF_LG Lysosome 5 , 40 ALP Yp Cell membrane 17 , 18 , 20 , 53 , 57 , 163 , 164 , 167 , 180 , 184 – 189 PTP1B Yp ER 17 , 18 , 163 , 164 , 166 , 186 β-Galactosidase β-Gal-aromatic Lysosome 16 , 171 γGT γ-E_ Cell membrane 190 Nitroreductase -NO 2 → -NH 2 Cytosol 178 Transglutaminase → ε-(γ-Q)-K Cytosol, ER, mitochondria 105 Carboxylesterase Ester bond ER 51 , 173 – 176 γGT, γ-glutamyltransferase; ALP, alkaline phosphatase; ATG4B, autophagy-related 4B cysteine peptidase; ENTK, enterokinase; ER, endoplasmic reticulum; PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B. Fig. 6 Cellular localization of enzymes for self-assembly and their respective recognition and transformation sites. γGT, γ-glutamyltransferase; ALP, alkaline phosphatase; ATG4B, autophagy-related 4B cysteine peptidase; ENTK, enterokinase; ER, endoplasmic reticulum; PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B. Proteases Proteolytic enzymes catalyse the hydrolysis of peptide bonds 107 , making them an attractive biological tool for the activation of bioresponsive nanomaterials. The diversity of proteases in terms of their subcellular localization, level of expression in different cell types, as well as their specificity for a certain cleavage site, facilitates spatiotemporal programming of enzyme-instructed self-assembly. Furin is an endoprotease that is associated with the Golgi apparatus in eukaryotic cells. Belonging to the enzyme family of proprotein convertases, it catalyses downstream peptide cleavage of the polybasic motif RX(R/K)R for the bioactivation of certain proteins 108 . This enzymatic cleavage reaction plays an essential role in pathogenesis, as the enzyme activity of furin has been linked to cancer progression 109 , 110 , as well as viral diseases 111 , including SARS-CoV-2 infection 112 . Therefore, the imaging of furin activity inside cells or tumour tissue is an attractive target that can be addressed using bioresponsive supramolecular chemistry. For example, the intracellular condensation reaction between an aminothiol and a cyanobenzothiazole for the formation of self-assembling macrocyclic dimers was first realized using a furin-sensitive precursor (Fig. 3c ). By adding the four amino acids RVRR to the amino-terminal cysteine, they serve not only as an enzyme-cleavable protecting group (Fig. 7a ) for the amino function but also facilitate cell entry of the precursor due to the positively charged side chain residues 9 . Further investigation of the intracellular reaction cascade showed that the furin-induced proteolytic cleavage near the Golgi apparatus constitutes the rate-limiting step for the formation of active monomers, which correlates to the subcellular localization of the resulting nanostructures at this site 21 . This enzyme-instructed intracellular aggregation also enables in vivo imaging of furin activity inside furin-overexpressing tumour tissue, since it can promote the accumulation and retention of an imaging agent that is covalently linked to the self-assembling monomer. A variety of techniques that exploit this effect have been applied for diagnostic purposes, such as photoacoustic imaging 113 , micro-positron emission tomography 114 , use of radiotracers 115 , Raman imaging 116 and magnetic resonance imaging 117 . In all these studies, the imaging agent was introduced to the precursor molecule via side chain modification of a lysine positioned between the cyanobenzothiazole and the cysteine. The use of this strategy for the chemical modification of the condensation precursor has also been used for the conjugation of the chemotherapeutic drug, Taxol, which helps to prevent undesired drug efflux and promotes sustained drug release due to the furin-induced self-assembly of Taxol nanoparticles 118 . Aside from the attachment of small organic molecules, metal-based nanoparticles can also be decorated with the bioresponsive precursor by using the amino group of the lysine side chain for amide coupling reactions on a carboxyl-modified particle surface 60 , 61 . The resulting metal-based pro-assembling nanomaterials can form aggregates of gold or iron oxide nanoparticles inside furin-overexpressing cells as a result of particle crosslinking caused by enzyme-triggered condensation reactions. Fig. 7 Multistep transformation for intracellular self-assembly. a | Structures of assembly precursors for macrocyclization-based self-assembly. The amino protecting group determines the sensitivity to a specific enzyme, such as furin 9 , 21 , 113 , caspase-3/7 (refs 16 , 50 , 125 ), β-galactosidase 16 or nitroreductase 178 . The peptide-based spacer R 2 between the reactive functionalities can contain fluorophores, drugs or other bioactive compounds. b | Multistep reaction sequence of intracellular conversion pH-sensitive and reactive oxygen species (ROS)-sensitive isopeptides into linear co-assembling peptides. The targeting group contains cell-penetrating peptide TAT (transactivator of transcription) and enables cell entry, upon which the acid-labile dynamic covalent bond between the salicyl hydroxamate of targeting peptide and the phenylboronic acid group of the isopeptides is hydrolysed in the endosomes. The hydrogen-peroxide-induced deprotection via self-immolation of the phenylboronic acid group reveals a reactive amino group that can attack the adjacent ester bond. This rearrangement due to an O , N acyl shift results in the linearized co-assembling peptides. The formation of peptide nanofibres inside A549 cells can be visualized with bio-transmission electron microscopy. Part b (bottom left) is adapted with permission from ref. 6 , American Chemical Society. Caspases are proteolytic enzymes that play an essential role in the initiation and execution of apoptosis, a mode of programmed cell death 119 . These endoproteases contain a characteristic nucleophilic cysteine as a central part of a polybasic substrate-binding pocket 120 . The chemical structure of their active site enables them to catalyse the hydrolytic cleavage of proteins for the controlled dismantling of the cell. Within the intricate activation cascade of different caspases, the so-called 'effector' caspases-3, 6 and 7 carry out most of the proteolysis during apoptosis and can, therefore, be considered biomarkers for programmed cell death 121 . Since caspase-3 and caspase-7 both exhibit similar preferential downstream cleavage of the motif DEVD in synthetic substrates 122 , many supramolecular systems have been designed to include this sequence as a bioresponsive moiety for intracellular self-assembly 16 , 22 , 39 , 48 , 50 , 58 , 59 , 123 – 125 (Fig. 6 ). For example, a fluorescent probe for the real-time imaging of apoptosis in drug-treated cancer cells was combined with the hydrophobic tetraphenylethene (TPE) with the hydrophilic peptide motif DEVD_K via azide–alkyne click chemistry 123 . After enzymatic cleavage by caspase-3/7, the polyaromatic fragment TPE-K can self-assemble inside cells, which results in AIE caused by the restriction of intramolecular rotation of its phenyl rings 126 . These so-called AIE luminogens 127 — which exhibit a turn-on fluorescence upon aggregation — can be useful reporters of enzyme activity in cancer cells, especially when they are part of a multifunctional theranostic nanomaterial 39 . A sequential approach to the caspase-induced formation of intracellular nanostructures uses systems containing tumour-specific recognition motifs able to trigger apoptosis 22 , 48 . A peptide-based precursor, containing a biomimetic sequence that can bind and inactivate the X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) 128 , promotes the activation of caspase-3/7 through the manipulation of intracellular signal transduction 129 . The activated pro-apoptotic proteases can then remove the non-assembling XIAP-recognition motif, thereby, inducing the self-assembly of the remaining β-sheet-forming peptide–drug conjugate 48 or peptide–cyanine dye conjugate 22 . This sophisticated system selectively causes assembly formation in cancerous tissue both in animal models and in ex vivo human bladders that were taken from patients with late-stage bladder cancer 48 . The latter experiment shows the potential clinical use of the caspase-sensitive assembly precursor, as it could help detect tumour boundaries during image-guided surgery. For quantitative imaging of caspase-3/7 activity in live animals, a condensation-driven system was developed, in which the enzymatic activation of the precursor is decoupled from a subsequent imaging tag immobilization 50 . The pro-assembling molecule consists of the amino-terminal protecting group DEVD (Fig. 7a ) linked to a cysteine, a lysine with a clickable trans -cyclooctene (TCO) on its side chain, as well as a pyrimidinecarbonitrile as the aromatic nitrile for the enzyme-instructed macrocyclization. Since this caspase-3/7-responsive molecule can form stable intracellular nanoaggregates, subsequent addition or injection of a tetrazine-functionalized fluorophore leads to an immobilization of the imaging probe due to inverse electron demand Diels–Alder reactions between the tetrazine and the aggregated TCO-bearing monomers. Enterokinase (ENTK) (also known as enteropeptidase) 130 is a membrane-bound protease that is essential for digestion 131 . Its main physiological purpose is the cleavage of the acidic motif DDDDK in the pancreatic proenzyme trypsinogen, which leads to the activation of trypsin 132 . There are multiple reasons as to why ENTK is an interesting enzyme candidate for programming cell-specific and organelle-specific self-assembly 106 , 133 – 135 : firstly, its role in the activation of trypsin has been linked to matrix degradation and migration of lung, colorectal and glioblastoma cancer cells 136 ; secondly, it allows cell-specific targeting of the mitochondria in cancer cell lines, such as HeLa (cervical cancer), Saos-2 (bone cancer) and HepG2 (liver cancer) 134 ; and, thirdly, it enables the enzyme-driven release of cargo from a supramolecular vehicle at the organelle surface 133 . The ENTK-sensitive systems consist of the cleavable FLAG-tag DYKDDDDK covalently linked to a self-assembling peptide sequence 106 , 133 , 134 or a lipid-like moiety 135 . The chemical design of the peptide-based precursor is a branched structure that is important for mitochondria targeting 133 . After entering the cell in a micellar form by clathrin-mediated endocytosis 134 , the supramolecular precursors escape the endosome facilitated by pH buffering of the carboxylic acid groups 135 . The subsequent subcellular accumulation at the mitochondria is promoted by the increased mitochondrial membrane potential in cancer cells and the electrostatic interaction between the negatively charged FLAG-tag and voltage-dependent anion channels at the organelle surface 135 . The enzymatic cleavage of the hydrophilic tag by ENTK initiates the local conversion from micelles to peptide nanofibres 106 , 133 , 134 (or more lipophilic micelles in the case of the peptide–lipid conjugates) 135 . This supramolecular transformation causes an increase in perimitochondrial viscosity and enables the organelle-specific delivery of drugs 133 , 135 , proteins 106 or gene vectors 134 . Trypsin is a potent serine protease that has been the subject of ongoing biomedical research due to its role in the invasion and metastasis of various cancers, such as ovarian 137 , colorectal 138 , 139 , lung 140 and prostate cancer 141 . The overexpression of different trypsin isoforms by tumours leads to the amplified degradation of extracellular proteins 142 and the increased activation of other matrix-associated proteases 137 , 143 , 144 . The preferential cleavage of trypsin at the carboxy terminal of lysine or arginine can be exploited as an enzymatic trigger for the self-assembly of synthetic monomers, as shown by a trypsin-responsive precursor molecule 19 . Similar to the ENTK-responsive systems, the branched pro-assembling peptide consists of an aromatic tetrapeptide backbone and a hydrophilic lysine-rich sequence KYDKKKKDG that can be cleaved in trypsin 1-overexpressing ovarian cancer cells (OVSAHO). As these particular cells exhibit an abnormally high activity of the protease at the endoplasmic reticulum (ER), the resulting formation of cytotoxic nanofibres is not only cell specific but also organelle specific, despite high concentrations of the supramolecular precursor being necessary. Cathepsin B is a lysosomal protease that has been linked to the invasiveness of several types of cancer 145 , including colorectal 146 and breast cancer 147 . This pro-angiogenic enzyme 148 recognizes and cleaves the sequence GFLG in synthetic substrates, which has made it a useful biological tool for cancer-specific drug delivery 149 . Combining the technology of AIE luminogens with a cathepsin B-cleavable peptide led to a light-up imaging probe and photosensitizer for the detection and ablation of breast cancer cells 40 . The precursor consists of a tetraphenylethylene derivative with two azido groups that are each 'clicked' to a bioactive peptide composed of the cathepsin B-responsive sequence GFLG, a hydrophilic linker (DDD) and the targeting moiety cyclo-RGD. The double-substituted AIE imaging probe can form fluorescent aggregates in the lysosomes of breast cancer cells (MDA-MB 231), which facilitates the quantification of enzyme activity, as well as photodynamic therapy 40 . To study the autocatalytic growth of intracellular nanofibres, a cathepsin B-responsive prodrug was developed that could undergo a morphology transformation from nanoparticles to fibrous networks in vitro and in vivo: after shedding a hydrophilic PEG-RGD unit, the remaining self-assembling peptide–drug conjugate undergoes β-sheet-driven fibrillation inside HeLa cells, which is accelerated by the presence of previously formed fibrils 5 . Matrix metalloproteinase 7 (MMP7) is a protease involved in the degradation of extracellular matrix proteins 150 , contributing to cancer cell migration 151 . To initiate cancer cell death by intracellular self-assembly, a peptide–lipid conjugate susceptible to cleavage by MMP7 was developed, an enzyme that is secreted by HeLa cells 67 . The palmitoylated peptide consists of a glycine-rich nonpolar sequence, an MMP7 cleavage site (PLG_L) and a hydrophilic carboxy-terminal fragment (_LARK) that inhibits unspecific aggregation before enzymatic conversion. After incubation with the precursor, HeLa cells exhibited decreased viability caused by the cancer-cell-specific formation of intracellular peptide–lipid nanofibres 67 . ATG4B is a cysteine protease that contributes to autophagy , during which protein aggregates and damaged organelles are digested and recycled 152 . While it is essential for homeostasis in healthy tissue, dysregulated autophagy is associated with pathogenesis, such as tumorigenesis 153 , 154 and neurodegeneration 155 . Since ATG4B is crucial for the formation of autophagosomes 156 , its activity was monitored using a bioresponsive supramolecular probe 157 . The chemical design of this imaging agent combines a self-assembling bispyrene with a peptide displaying the ATG4B cleavage site TFG_F 157 , as well as a highly cationic poly(amidoamine) dendrimer that enables cell entry and provides water solubility. After the enzymatic cleavage in MCF-7 breast cancer cells, the free bispyrene units self-assemble into fluorescent nanoparticles due to the formation of J -aggregates 69 , before transforming into cytosolic nanofibres over time 157 . Proteases Proteolytic enzymes catalyse the hydrolysis of peptide bonds 107 , making them an attractive biological tool for the activation of bioresponsive nanomaterials. The diversity of proteases in terms of their subcellular localization, level of expression in different cell types, as well as their specificity for a certain cleavage site, facilitates spatiotemporal programming of enzyme-instructed self-assembly. Furin is an endoprotease that is associated with the Golgi apparatus in eukaryotic cells. Belonging to the enzyme family of proprotein convertases, it catalyses downstream peptide cleavage of the polybasic motif RX(R/K)R for the bioactivation of certain proteins 108 . This enzymatic cleavage reaction plays an essential role in pathogenesis, as the enzyme activity of furin has been linked to cancer progression 109 , 110 , as well as viral diseases 111 , including SARS-CoV-2 infection 112 . Therefore, the imaging of furin activity inside cells or tumour tissue is an attractive target that can be addressed using bioresponsive supramolecular chemistry. For example, the intracellular condensation reaction between an aminothiol and a cyanobenzothiazole for the formation of self-assembling macrocyclic dimers was first realized using a furin-sensitive precursor (Fig. 3c ). By adding the four amino acids RVRR to the amino-terminal cysteine, they serve not only as an enzyme-cleavable protecting group (Fig. 7a ) for the amino function but also facilitate cell entry of the precursor due to the positively charged side chain residues 9 . Further investigation of the intracellular reaction cascade showed that the furin-induced proteolytic cleavage near the Golgi apparatus constitutes the rate-limiting step for the formation of active monomers, which correlates to the subcellular localization of the resulting nanostructures at this site 21 . This enzyme-instructed intracellular aggregation also enables in vivo imaging of furin activity inside furin-overexpressing tumour tissue, since it can promote the accumulation and retention of an imaging agent that is covalently linked to the self-assembling monomer. A variety of techniques that exploit this effect have been applied for diagnostic purposes, such as photoacoustic imaging 113 , micro-positron emission tomography 114 , use of radiotracers 115 , Raman imaging 116 and magnetic resonance imaging 117 . In all these studies, the imaging agent was introduced to the precursor molecule via side chain modification of a lysine positioned between the cyanobenzothiazole and the cysteine. The use of this strategy for the chemical modification of the condensation precursor has also been used for the conjugation of the chemotherapeutic drug, Taxol, which helps to prevent undesired drug efflux and promotes sustained drug release due to the furin-induced self-assembly of Taxol nanoparticles 118 . Aside from the attachment of small organic molecules, metal-based nanoparticles can also be decorated with the bioresponsive precursor by using the amino group of the lysine side chain for amide coupling reactions on a carboxyl-modified particle surface 60 , 61 . The resulting metal-based pro-assembling nanomaterials can form aggregates of gold or iron oxide nanoparticles inside furin-overexpressing cells as a result of particle crosslinking caused by enzyme-triggered condensation reactions. Fig. 7 Multistep transformation for intracellular self-assembly. a | Structures of assembly precursors for macrocyclization-based self-assembly. The amino protecting group determines the sensitivity to a specific enzyme, such as furin 9 , 21 , 113 , caspase-3/7 (refs 16 , 50 , 125 ), β-galactosidase 16 or nitroreductase 178 . The peptide-based spacer R 2 between the reactive functionalities can contain fluorophores, drugs or other bioactive compounds. b | Multistep reaction sequence of intracellular conversion pH-sensitive and reactive oxygen species (ROS)-sensitive isopeptides into linear co-assembling peptides. The targeting group contains cell-penetrating peptide TAT (transactivator of transcription) and enables cell entry, upon which the acid-labile dynamic covalent bond between the salicyl hydroxamate of targeting peptide and the phenylboronic acid group of the isopeptides is hydrolysed in the endosomes. The hydrogen-peroxide-induced deprotection via self-immolation of the phenylboronic acid group reveals a reactive amino group that can attack the adjacent ester bond. This rearrangement due to an O , N acyl shift results in the linearized co-assembling peptides. The formation of peptide nanofibres inside A549 cells can be visualized with bio-transmission electron microscopy. Part b (bottom left) is adapted with permission from ref. 6 , American Chemical Society. Caspases are proteolytic enzymes that play an essential role in the initiation and execution of apoptosis, a mode of programmed cell death 119 . These endoproteases contain a characteristic nucleophilic cysteine as a central part of a polybasic substrate-binding pocket 120 . The chemical structure of their active site enables them to catalyse the hydrolytic cleavage of proteins for the controlled dismantling of the cell. Within the intricate activation cascade of different caspases, the so-called 'effector' caspases-3, 6 and 7 carry out most of the proteolysis during apoptosis and can, therefore, be considered biomarkers for programmed cell death 121 . Since caspase-3 and caspase-7 both exhibit similar preferential downstream cleavage of the motif DEVD in synthetic substrates 122 , many supramolecular systems have been designed to include this sequence as a bioresponsive moiety for intracellular self-assembly 16 , 22 , 39 , 48 , 50 , 58 , 59 , 123 – 125 (Fig. 6 ). For example, a fluorescent probe for the real-time imaging of apoptosis in drug-treated cancer cells was combined with the hydrophobic tetraphenylethene (TPE) with the hydrophilic peptide motif DEVD_K via azide–alkyne click chemistry 123 . After enzymatic cleavage by caspase-3/7, the polyaromatic fragment TPE-K can self-assemble inside cells, which results in AIE caused by the restriction of intramolecular rotation of its phenyl rings 126 . These so-called AIE luminogens 127 — which exhibit a turn-on fluorescence upon aggregation — can be useful reporters of enzyme activity in cancer cells, especially when they are part of a multifunctional theranostic nanomaterial 39 . A sequential approach to the caspase-induced formation of intracellular nanostructures uses systems containing tumour-specific recognition motifs able to trigger apoptosis 22 , 48 . A peptide-based precursor, containing a biomimetic sequence that can bind and inactivate the X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) 128 , promotes the activation of caspase-3/7 through the manipulation of intracellular signal transduction 129 . The activated pro-apoptotic proteases can then remove the non-assembling XIAP-recognition motif, thereby, inducing the self-assembly of the remaining β-sheet-forming peptide–drug conjugate 48 or peptide–cyanine dye conjugate 22 . This sophisticated system selectively causes assembly formation in cancerous tissue both in animal models and in ex vivo human bladders that were taken from patients with late-stage bladder cancer 48 . The latter experiment shows the potential clinical use of the caspase-sensitive assembly precursor, as it could help detect tumour boundaries during image-guided surgery. For quantitative imaging of caspase-3/7 activity in live animals, a condensation-driven system was developed, in which the enzymatic activation of the precursor is decoupled from a subsequent imaging tag immobilization 50 . The pro-assembling molecule consists of the amino-terminal protecting group DEVD (Fig. 7a ) linked to a cysteine, a lysine with a clickable trans -cyclooctene (TCO) on its side chain, as well as a pyrimidinecarbonitrile as the aromatic nitrile for the enzyme-instructed macrocyclization. Since this caspase-3/7-responsive molecule can form stable intracellular nanoaggregates, subsequent addition or injection of a tetrazine-functionalized fluorophore leads to an immobilization of the imaging probe due to inverse electron demand Diels–Alder reactions between the tetrazine and the aggregated TCO-bearing monomers. Enterokinase (ENTK) (also known as enteropeptidase) 130 is a membrane-bound protease that is essential for digestion 131 . Its main physiological purpose is the cleavage of the acidic motif DDDDK in the pancreatic proenzyme trypsinogen, which leads to the activation of trypsin 132 . There are multiple reasons as to why ENTK is an interesting enzyme candidate for programming cell-specific and organelle-specific self-assembly 106 , 133 – 135 : firstly, its role in the activation of trypsin has been linked to matrix degradation and migration of lung, colorectal and glioblastoma cancer cells 136 ; secondly, it allows cell-specific targeting of the mitochondria in cancer cell lines, such as HeLa (cervical cancer), Saos-2 (bone cancer) and HepG2 (liver cancer) 134 ; and, thirdly, it enables the enzyme-driven release of cargo from a supramolecular vehicle at the organelle surface 133 . The ENTK-sensitive systems consist of the cleavable FLAG-tag DYKDDDDK covalently linked to a self-assembling peptide sequence 106 , 133 , 134 or a lipid-like moiety 135 . The chemical design of the peptide-based precursor is a branched structure that is important for mitochondria targeting 133 . After entering the cell in a micellar form by clathrin-mediated endocytosis 134 , the supramolecular precursors escape the endosome facilitated by pH buffering of the carboxylic acid groups 135 . The subsequent subcellular accumulation at the mitochondria is promoted by the increased mitochondrial membrane potential in cancer cells and the electrostatic interaction between the negatively charged FLAG-tag and voltage-dependent anion channels at the organelle surface 135 . The enzymatic cleavage of the hydrophilic tag by ENTK initiates the local conversion from micelles to peptide nanofibres 106 , 133 , 134 (or more lipophilic micelles in the case of the peptide–lipid conjugates) 135 . This supramolecular transformation causes an increase in perimitochondrial viscosity and enables the organelle-specific delivery of drugs 133 , 135 , proteins 106 or gene vectors 134 . Trypsin is a potent serine protease that has been the subject of ongoing biomedical research due to its role in the invasion and metastasis of various cancers, such as ovarian 137 , colorectal 138 , 139 , lung 140 and prostate cancer 141 . The overexpression of different trypsin isoforms by tumours leads to the amplified degradation of extracellular proteins 142 and the increased activation of other matrix-associated proteases 137 , 143 , 144 . The preferential cleavage of trypsin at the carboxy terminal of lysine or arginine can be exploited as an enzymatic trigger for the self-assembly of synthetic monomers, as shown by a trypsin-responsive precursor molecule 19 . Similar to the ENTK-responsive systems, the branched pro-assembling peptide consists of an aromatic tetrapeptide backbone and a hydrophilic lysine-rich sequence KYDKKKKDG that can be cleaved in trypsin 1-overexpressing ovarian cancer cells (OVSAHO). As these particular cells exhibit an abnormally high activity of the protease at the endoplasmic reticulum (ER), the resulting formation of cytotoxic nanofibres is not only cell specific but also organelle specific, despite high concentrations of the supramolecular precursor being necessary. Cathepsin B is a lysosomal protease that has been linked to the invasiveness of several types of cancer 145 , including colorectal 146 and breast cancer 147 . This pro-angiogenic enzyme 148 recognizes and cleaves the sequence GFLG in synthetic substrates, which has made it a useful biological tool for cancer-specific drug delivery 149 . Combining the technology of AIE luminogens with a cathepsin B-cleavable peptide led to a light-up imaging probe and photosensitizer for the detection and ablation of breast cancer cells 40 . The precursor consists of a tetraphenylethylene derivative with two azido groups that are each 'clicked' to a bioactive peptide composed of the cathepsin B-responsive sequence GFLG, a hydrophilic linker (DDD) and the targeting moiety cyclo-RGD. The double-substituted AIE imaging probe can form fluorescent aggregates in the lysosomes of breast cancer cells (MDA-MB 231), which facilitates the quantification of enzyme activity, as well as photodynamic therapy 40 . To study the autocatalytic growth of intracellular nanofibres, a cathepsin B-responsive prodrug was developed that could undergo a morphology transformation from nanoparticles to fibrous networks in vitro and in vivo: after shedding a hydrophilic PEG-RGD unit, the remaining self-assembling peptide–drug conjugate undergoes β-sheet-driven fibrillation inside HeLa cells, which is accelerated by the presence of previously formed fibrils 5 . Matrix metalloproteinase 7 (MMP7) is a protease involved in the degradation of extracellular matrix proteins 150 , contributing to cancer cell migration 151 . To initiate cancer cell death by intracellular self-assembly, a peptide–lipid conjugate susceptible to cleavage by MMP7 was developed, an enzyme that is secreted by HeLa cells 67 . The palmitoylated peptide consists of a glycine-rich nonpolar sequence, an MMP7 cleavage site (PLG_L) and a hydrophilic carboxy-terminal fragment (_LARK) that inhibits unspecific aggregation before enzymatic conversion. After incubation with the precursor, HeLa cells exhibited decreased viability caused by the cancer-cell-specific formation of intracellular peptide–lipid nanofibres 67 . ATG4B is a cysteine protease that contributes to autophagy , during which protein aggregates and damaged organelles are digested and recycled 152 . While it is essential for homeostasis in healthy tissue, dysregulated autophagy is associated with pathogenesis, such as tumorigenesis 153 , 154 and neurodegeneration 155 . Since ATG4B is crucial for the formation of autophagosomes 156 , its activity was monitored using a bioresponsive supramolecular probe 157 . The chemical design of this imaging agent combines a self-assembling bispyrene with a peptide displaying the ATG4B cleavage site TFG_F 157 , as well as a highly cationic poly(amidoamine) dendrimer that enables cell entry and provides water solubility. After the enzymatic cleavage in MCF-7 breast cancer cells, the free bispyrene units self-assemble into fluorescent nanoparticles due to the formation of J -aggregates 69 , before transforming into cytosolic nanofibres over time 157 . Phosphatases Phosphorylation and dephosphorylation of protein substrates play a vital role in signal transduction and the regulation of enzyme and receptor activity 158 . Since dysregulation of these processes is associated with cellular dysfunction and tumorigenesis, phosphatases, which are the enzyme family responsible for the removal of phosphate groups 159 , are interesting candidates for controlling enzyme-instructed intracellular self-assembly. Alkaline phosphatase (ALP) is a prominent example of a ubiquitous enzyme that catalyses dephosphorylation 160 . Regarding subcellular localization, ALP as a membrane-bound phosphatase is associated with the cell membrane 160 , while PTP1B, another important protein tyrosine phosphatase, is located at the surface of the ER 161 . By exploiting the overexpression of both ALP and PTP1B as known tumour markers, phosphatase-instructed self-assembly of short phospho-tyrosine (Yp)-containing peptides can be used for bioimaging 18 and combinational cancer therapy 162 . A general structure of the precursor for phosphatase-instructed self-assembly was established: a tetrapeptide containing two phenylalanines, one Yp that can be dephosphorylated, as well as a basic amino acid, such as lysine, which can be coupled to a fluorophore or a targeting unit. The amino terminus of the short peptide is substituted with an additional aromatic moiety, for example, a naphthyl group, that contributes to the propensity for self-assembly due to intermolecular aromatic interactions of the dephosphorylated monomer. For example, the fluorescent aromatic tetrapeptide naphthyl-FFK(nitrobenzoxadiazole (NBD)) Yp was used as a phosphatase-sensitive precursor for the formation of fluorescent nanofibres inside HeLa cells 18 (Fig. 3b ). Interestingly, the fibrous structures were observed to grow within minutes from the ER towards the cell membrane, which can be explained by the high enzymatic activity of PTP1B at the surface of the organelle 18 . Besides using NBD as the dye, introducing other fluorophores revealed that the supramolecular behaviour and the spatial distribution of the intracellular assemblies vary drastically depending on the fluorescent unit 163 , 164 ; NBD-containing monomers can form intracellular nanofibres that protect the cell and its cytoskeleton against an F-actin toxin, whereas dansyl-substituted peptide localizes in the cell membrane and exhibits a cytotoxic effect after dephosphorylation 124 . These differences in the bioactivity of the precursors and the respective activated monomers can be explained by variations in hydrophobicity of the fluorophore dictating both their interactions with cellular membranes and their self-assembly propensity. For example, the dansyl group exhibits a higher solubility in phospholipid membranes, partly due to its compatibility with the headgroup of phosphatidylcholine 165 , while the peptide precursor substituted with positively charged rhodamine cannot produce a hydrogel even after dephosphorylation by ALP, leading to an unspecific fluorescence distribution inside and outside of the cells 124 . Aside from modulating the intracellular assembly behaviour by changing the fluorophore, exchanging amino acids with different stereochemical properties in the precursor can also change the morphology of the nanostructures resulting from dephosphorylation 17 . By attaching an l -homoarginine ( L hR) at the carboxyl terminus of the d -tripeptides, naphthyl- D F D F D Yp and NBD- D F D F D Yp precursors were generated for phosphatase-instructed self-assembly that, after dephosphorylation, could form cytotoxic crescent-shaped assemblies targeted for accumulation at the ER. The toxic effect of the crescent-shaped structures seemed to be cell specific, as it was limited to cancerous cells with high levels of ALP at their cell membrane, such as HeLa cervical cancer cells and OVSAHO ovarian cancer cells, while normal stromal cells (HS-5) were not affected 17 . To further control and exploit the subcellular localization of phosphatase-instructed assemblies, the structure of the precursor can be adapted for organelle-specific targeting 57 , 166 , 167 . Integrating positively charged TPP via lysine side chain modification gives rise to mitochondria-targeted tetrapeptides that can undergo dephosphorylation by ALP at the cell membrane of Saos-2 osteosarcoma cells 57 . The resulting polymorphic aggregates can enter the cells and trigger the release of cytochrome c from the mitochondria, causing cell death only in ALP-overexpressing cancer cells. The in situ generation of the self-assembling monomers seems to be essential for the toxicity towards the cells, since incubating them directly with the final product of the enzymatic conversion has no effect on their viability 57 . Aside from the use of well-known targeting moieties such as TPP, incorporating ligands of enzymes that are specific for a certain organelle can also influence the accumulation and structure formation at the desired subcellular location. An example for this is the naproxen (Npx)-substituted tetrapeptide Npx- D F D F D Yp L hR used for intracellular enzyme sequestration on the surface of the ER 166 . Npx is a nonsteroidal anti-inflammatory drug and a ligand of COX2, which is an enzyme located at the surface of the ER. By binding to COX2 via Npx and to PTP1B via Yp, the precursor and the resulting fibrous assemblies can sequester the two enzymes on the organelle surface, thereby, inducing their co-localization and potential protein–protein interaction. Another recent discovery regarding organelle-specific phosphatase-instructed self-assembly was that short thiophosphopeptides can form nanofibres specifically at the Golgi apparatus 167 . This phenomenon seems to be due to the rapid conversion of thiophosphopeptides into thiopeptides by Golgi-associated ALP followed by disulfide bond formation with cysteine-rich proteins in the oxidative environment of the organelle. Other enzymes β-Galactosidase is a lysosomal sugar hydrolase that is overexpressed in senescent cells 168 . As the accumulation of non-proliferating cells can negatively impact tissue function 169 , detecting and clearing senescent cells is of therapeutic interest, especially for age-related diseases such as atherosclerosis 170 . For this reason, a short aromatic peptide was designed with a β-galactose-functionalized tyrosine (NBD-FFY(β-Gal)G) that is susceptible to enzymatic cleavage inside senescent endothelial cells and HeLa cells 171 . While the viability of non-senescent cells was only slightly affected by the administration of the enzyme-responsive precursor, it caused the β-galactosidase-instructed formation of cytotoxic nanofibres in senescent cells due to intermolecular aromatic interaction. A different approach to implement β-galactosidase sensitivity into a precursor for condensation-driven self-assembly used a benzyl carbamate amino protecting group with a β-galactose substituent on the aromatic ring that could undergo self-immolative degradation upon enzymatic removal of the sugar 16 (Fig. 7a ). This β-galactosidase-induced deprotection of a reactive amino thiol triggers a subsequent condensation reaction with an aromatic nitrile that results in the intracellular formation of self-assembling macrocycles. Carboxylesterases (CES) are essential for the cleavage of endogenous and xenobiotic esters 172 . Aside from their general importance for lipid homeostasis and drug metabolism, CES were also the first enzymes to be exploited for the intracellular self-assembly of synthetic nanomaterials 173 . The CES-responsive precursors generally consist of a diphenylalanine, an amino-terminal naphthyl group or aromatic fluorophore, and a carboxy-terminal ethanolamine offering a hydroxyl group for the esterification of a hydrophilic unit (for example, butyric acid or taurine) that prevents aggregation 51 , 173 – 176 . Inside cells with high CES activity, such as certain ovarian and cervical cancer cells, the enzymatic cleavage of the ester bond leads to the formation of nanofibres that can disrupt actin filaments 175 and boost the activity of the anticancer drug cisplatin 51 . While the enzymes mentioned so far in this Review are all hydrolases, meaning that they catalyse the breakage of chemical bonds using water, there are also enzymes that create new bonds and that can be used for the programming of nanomaterial aggregation inside cells. Transglutaminase is an enzyme that catalyses the amide bond formation between glutamine and lysine side chains 177 . This biocatalytic condensation reaction can be exploited for the intracellular polymerization of short peptide monomers into elastin-like polypeptides (ELPs) 105 . The topology and the thermoresponsive properties of these ELPs is predetermined by the number of lysines and glutamines in the polymerizable monomer: while peptide monomers with only one lysine and glutamine each yield linear ELPs with upper or lower critical solution temperature behaviour to form globular aggregates, monomers containing more than one lysine and glutamine yield a three-dimensional gel-like ELP network inside the cell. The latter exhibits a dose-dependent cytotoxicity, whereas linear ELPs forming random coils or aggregates are biocompatible 105 . Other enzymes β-Galactosidase is a lysosomal sugar hydrolase that is overexpressed in senescent cells 168 . As the accumulation of non-proliferating cells can negatively impact tissue function 169 , detecting and clearing senescent cells is of therapeutic interest, especially for age-related diseases such as atherosclerosis 170 . For this reason, a short aromatic peptide was designed with a β-galactose-functionalized tyrosine (NBD-FFY(β-Gal)G) that is susceptible to enzymatic cleavage inside senescent endothelial cells and HeLa cells 171 . While the viability of non-senescent cells was only slightly affected by the administration of the enzyme-responsive precursor, it caused the β-galactosidase-instructed formation of cytotoxic nanofibres in senescent cells due to intermolecular aromatic interaction. A different approach to implement β-galactosidase sensitivity into a precursor for condensation-driven self-assembly used a benzyl carbamate amino protecting group with a β-galactose substituent on the aromatic ring that could undergo self-immolative degradation upon enzymatic removal of the sugar 16 (Fig. 7a ). This β-galactosidase-induced deprotection of a reactive amino thiol triggers a subsequent condensation reaction with an aromatic nitrile that results in the intracellular formation of self-assembling macrocycles. Carboxylesterases (CES) are essential for the cleavage of endogenous and xenobiotic esters 172 . Aside from their general importance for lipid homeostasis and drug metabolism, CES were also the first enzymes to be exploited for the intracellular self-assembly of synthetic nanomaterials 173 . The CES-responsive precursors generally consist of a diphenylalanine, an amino-terminal naphthyl group or aromatic fluorophore, and a carboxy-terminal ethanolamine offering a hydroxyl group for the esterification of a hydrophilic unit (for example, butyric acid or taurine) that prevents aggregation 51 , 173 – 176 . Inside cells with high CES activity, such as certain ovarian and cervical cancer cells, the enzymatic cleavage of the ester bond leads to the formation of nanofibres that can disrupt actin filaments 175 and boost the activity of the anticancer drug cisplatin 51 . While the enzymes mentioned so far in this Review are all hydrolases, meaning that they catalyse the breakage of chemical bonds using water, there are also enzymes that create new bonds and that can be used for the programming of nanomaterial aggregation inside cells. Transglutaminase is an enzyme that catalyses the amide bond formation between glutamine and lysine side chains 177 . This biocatalytic condensation reaction can be exploited for the intracellular polymerization of short peptide monomers into elastin-like polypeptides (ELPs) 105 . The topology and the thermoresponsive properties of these ELPs is predetermined by the number of lysines and glutamines in the polymerizable monomer: while peptide monomers with only one lysine and glutamine each yield linear ELPs with upper or lower critical solution temperature behaviour to form globular aggregates, monomers containing more than one lysine and glutamine yield a three-dimensional gel-like ELP network inside the cell. The latter exhibits a dose-dependent cytotoxicity, whereas linear ELPs forming random coils or aggregates are biocompatible 105 . Multistep conversion for self-assembly The most common chemical design strategy for bioresponsive molecules for supramolecular assembly focuses on the combination of a cleavable hydrophilic unit with a more hydrophobic self-assembling moiety, such as a β-sheet-forming peptide or a polyaromatic group. In this general approach, the stimulus-induced separation of the two building blocks directly triggers the formation of synthetic structures inside cells (Fig. 3b ). However, given the complexity of the cellular environment and the many potential endogenous stimuli, systems for intracellular self-assembly can also be made to undergo a more complex multistep transformation to the final monomer. The idea of having a reaction sequence or cascade rather than a single transformative step also offers the opportunity to implement more than one bioresponsive element into the chemical design of the precursor, which can increase spatial control over the assembly formation. The latter can be achieved, for example, by combining an enzyme-responsive unit on one part of the molecule with a redox-sensitive group on another part of the molecule (Fig. 7a ). This combination has been used for the condensation reaction between a deprotected aminothiol and a cyanobenzothiazole for the formation of self-assembling macrocycles 75 . As both the amino group and the thiol group of the amino - terminal aminothiol are necessary for condensation and self-assembly, choosing complementary bioresponsive protecting groups helps to tailor the system towards a specific intracellular behaviour. For example, the amino group of the aminothiol can be attached to an enzyme-responsive peptide sequence that is cleavable by a protease (for example, furin 9 , 21 , 113 or caspase-3/7 (refs 16 , 50 , 125 )), while the thiol group can be protected via a disulfide bond to a small molecule such as ethanethiol (Fig. 7a ). Upon cell entry, this disulfide bond is cleaved by intracellular glutathione in the reducing environment of the cytosol. Consequently, the determining step for the formation of the reactive intermediate, which can transform into the self-assembling monomer, is the final deprotection of the N -terminal amino group. As this can only occur at the subcellular localization of the targeted enzyme, spatial control over the structure formation is achieved by careful selection of the enzyme-responsive moiety in the precursor. This strategy is not only applicable to proteases but also works for other enzymes such as β-galactosidase 16 or nitroreductase 178 if a self-immolative benzyl-carbamate-derived protecting group is chosen for the amino terminus (Fig. 7a ). The cyanobenzothiazole moiety can also be substituted for other less electrophilic aromatic nitriles, which lowers the risk of potential side reactions with endogenous aminothiols 16 . Aside from implementing bioresponsive groups that control self-assembly, additional enzyme cleavage sites can be included in the centre of the molecule that allow the programmed disassembly of intracellularly formed nanostructures by proteolysis later on 16 , 17 . For biomedical purposes, the cyclization precursor can be modified to include photothermal agents that are activated by condensation-mediated and assembly-mediated quenching 13 or chemotherapeutic drugs that can slowly be released inside tumour cells 118 . For programming peptide fibre formation inside cancer cells, a multiresponsive system was designed that is pH sensitive and ROS sensitive 6 . The peptide-based precursors contain a phenylboronic acid trigger group, which serves as both a ROS-sensitive cage for the amino group of an esterified serine and as a handle for the attachment of a cell-penetrating peptide via an acid-labile dynamic covalent bond (Fig. 7b ). In the acidic environment of the endosome, the cell-penetrating peptide is removed. After endosomal escape, cytosolic ROS causes the degradation of the self-immolative phenylboronic acid group, revealing a free reactive amine. In the neutral pH of the cytosol, the nucleophilic amino group can perform an intramolecular attack on the adjacent ester bond of the serine side chain, yielding linearized peptides that can co-assemble into cytotoxic peptide fibres inside ROS-overproducing cancer cells 6 . These decoupled steps of the reaction cascade — the initial activation by deprotection and the following transformation to the monomer — take place under different chemical conditions and display individual reaction kinetics. Therefore, the multistep approach offers more opportunities to modulate the speed of the transformation of a precursor into a self-assembling monomer, in contrast to most systems for intracellular self-assembly that rely on a singular transformative step. Conclusions and outlook Synthetic supramolecular chemistry in a cellular environment uses a strategic implementation of bioresponsiveness in chemical design to achieve control over the formation of nanoscale architectures. In this Review, we discuss various chemical scaffolds, such as peptides, polyaromatic molecules and polymers, that can undergo a triggered transformation into assemblies due to endogenous stimuli. Tailoring the reactivity of the nanomaterial towards a specific intracellular cue can be realized by incorporating redox-sensitive or pH-sensitive groups, as well as enzyme recognition motifs that allow biocatalytic transformations. These stimulus-dependent mechanisms of self-assembly come with numerous advantages for therapeutic or diagnostic application. For example, the bioresponsive properties of the materials contribute to cell and tissue specificity in vivo, while also allowing for spatial control over the structure formation inside cells by targeting organelle-specific enzymes. Another therapeutic advantage of systems for intracellular self-assembly is the circumvention of multidrug resistance in certain cancers due to an impaired efflux of the intracellularly formed nanostructures compared with small molecules. Moreover, this accumulation effect can also contribute to the concentration of fluorescent agents inside the targeted cells, enabling more efficient bioimaging. Compared with ex situ self-assembled materials, such as therapeutic nanoparticles, the monomeric assembly precursors generally display an easier clearance from the liver, spleen or kidneys, thereby, reducing their systemic toxicity 179 . However, there are also several challenges regarding the potential clinical translation that need to be addressed. For example, a detailed pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of nanomaterials for intracellular self-assembly is necessary to ensure a favourable biodistribution and circulation time of precursors, as well as low immunogenicity. The chemical stability of the precursor molecule is crucial for its in vivo application, as, for instance, the proteolysis of peptide-based materials prior to cell entry and self-assembly needs to be avoided. Additionally, the eventual clearance of the in situ-formed nanostructures must be considered thoroughly, since stable assemblies, particularly amyloid-like β-sheet peptide assemblies, could potentially cause negative side effects over time as a result of their systemic accumulation. Generally, the morphology, stability and overall physiological impact of synthetic nanostructures need to be closely monitored and evaluated, which is still a challenge for current methods of in vivo analysis. In the future, further exploration of the existing toolbox of functionalities that can be reduced by glutathione, oxidized by ROS or that are labile to acidification could broaden the scope of potential precursors for intracellular self-assembly. With systems for enzyme-instructed self-assembly being prominent in recent years, the investigation of other enzymes beyond the commonly used phosphatases and proteases could not only help to diversify strategies but also contribute to a more cell-specific approach that could benefit the targeted therapy of cancer or other diseases with a characteristic dysregulation of enzyme expression. For this purpose, the study of molecular pathology is essential to lay the foundations for the design of novel enzyme-responsive materials. Moreover, including more than one bioresponsive group can increase the spatial control over the structure formation, as well as cell specificity, since multiple endogenous stimuli need to be present for assembly to occur. Adding other bioactive components to the molecular design, such as signalling peptides 48 , 180 or small molecule drugs 162 , can further enhance the impact of the system on cellular processes leading to potentially synergistic therapeutic effects. Many existing systems rely on thermodynamic control as the primary driving force to construct the intracellular architectures. Advanced methodologies involving non-equilibrium assemblies 181 , 182 coupled to cellular feedback dynamics would be highly attractive to induce reversible changes in cellular behaviour, as cell death is not always the desired outcome. From this perspective, there is also room to explore intracellular structures that boost cellular functions, possibly to address cell senescence (ageing) and environmental adaptation. The creation of such biomimetic materials that imitate reversibly formed biological supramolecular assemblies would be a milestone in synthetic biology and challenge frontiers in biomedical science. In the upcoming years, we expect the exploration of bioresponsive materials for intracellular assembly to give rise to new sophisticated approaches to create nanostructures in complex biological environments. We hope that the design concepts presented in this Review contribute to these efforts. Peer review information Nature Reviews Chemistry thanks J. Shen (who co-reviewed with R. Liu) and the other, anonymous, reviewers for their contribution to the peer review of this work.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4007686/

CIPROFLOXACIN INCREASES SURVIVAL AFTER IONIZING IRRADIATION COMBINED INJURY: γ-H2AX FORMATION, CYTOKINE/CHEMOKINE, AND RED BLOOD CELLS

Exposure to ionizing radiation alone (radiation injury, as abbreviated RI) or combined with traumatic tissue injury (radiation combined injury, as abbreviated CI) is a crucial life-threatening factor in nuclear and radiological accidents. It is well-documented that RI and CI occur at the molecular, cellular, tissue, and system levels. However, their mechanisms remain largely unclear. It has been observed in dogs, pigs, rats, guinea pigs, and mice that radiation exposure combined with burns, wounds, or bacterial infection results in greater mortality than radiation exposure alone. In our laboratory, we found that B6D2F1/J female mice exposed to 9.75 Gy 60 Co-γ photon radiation followed by 15% total body surface area wounds experienced 50% higher mortality (over 30-day observation period) compared to irradiation alone. CI enhanced DNA damages, amplified iNOS activation, induced massive release of pro-inflammatory cytokines, overexpressed MMPs and TLRs and aggravated sepsis that led to cell death. In the present study, B6D2F1/J mice received CI were treated with ciprofloxacin (CIP, 90 mg/kg p.o., q.d. within 2h after CI through day 21). At day 1, CIP treatment significantly reduced CI-induced γ-H2AX formation. At day 10, CIP treatment not only significantly reduced cytokine/chemokine concentrations, including IL-6 and KC (i.e., IL-8 in human), but also enhanced IL-3 production compared to vehicle-treated controls. CIP also elevated red blood cell counts, hemoglobin levels and hematocrits. At day 30, CIP treatment increased 45% survival after CI ( i.e ., 2.3-fold increase over vehicle treatment). The results suggest that CIP may prove to be an effective therapeutic drug for CI.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3702287/

Three-dimensional structure of Bax-mediated pores in membrane bilayers

B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)-associated X protein (Bax) is a member of the Bcl-2 protein family having a pivotal role in triggering cell commitment to apoptosis. Bax is latent and monomeric in the cytosol but transforms into its lethal, mitochondria-embedded oligomeric form in response to cell stress, leading to the release of apoptogenic factors such as cytochrome C. Here, we dissected the structural correlates of Bax membrane insertion while oligomerization is halted. This strategy was enabled through the use of nanometer-scale phospholipid bilayer islands (nanodiscs) the size of which restricts the reconstituted system to single Bax-molecule activity. Using this minimal reconstituted system, we captured structural correlates that precede Bax homo-oligomerization elucidating previously inaccessible steps of the core molecular mechanism by which Bcl-2 family proteins regulate membrane permeabilization. We observe that, in the presence of BH3 interacting domain death agonist (Bid) BH3 peptide, Bax monomers induce the formation of ∼3.5-nm diameter pores and significantly distort the phospholipid bilayer. These pores are compatible with promoting release of ions as well as proteinaceous components, suggesting that membrane-integrated Bax monomers in the presence of Bid BH3 peptides are key functional units for the activation of the cell demolition machinery. Results Minimal reconstituted systems that included lipid membrane (liposomes), activator protein (truncated Bid, tBid) or Bid BH3 peptides, as well as pro-survival protein (Bcl-xL) served as powerful systems to study Bax activation and membrane permeabilization. 6 , 8 , 9 , 13 , 15 , 16 , 17 These studies allowed unraveling some of the critical steps involved in the mechanism of Bax-mediated MOMP and provided the first observations for the existence of Bax-induced pores. Here we used a platform technology that allows dissection of the structural correlates of Bax membrane insertion while oligomerization is halted. To achieve this feat, we used nanometer-scale, protein-supported phospholipid particles (nanodiscs). 14 These nanodiscs are of defined size small enough to prevent incorporation of Bax oligomers. As importantly these bilayers also recapitulate the properties of biological membranes more closely than liposomes. 18 The biophysical properties of nanodiscs have been extensively characterized and it was shown that they have a very narrow size distribution (±2 to 3% variation in phospholipid content), 14 making them ideal candidates for structure determination by cryo-EM and single particle analysis. As Bid BH3 peptides and phospholipid bilayer are reported to activate Bax at a membrane interface, 9 the system used in this study represents a minimal system for reconstituting activation and membrane insertion of soluble full-length human Bax monomers. Bax monomers integrate into nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptide but not when Bcl-xL is present To ensure incorporation of Bax monomers only, we first established a biochemical assay to assess and optimize integration of soluble Bax into nanodiscs. We took advantage of the fact that, consistent with their narrow size distribution, nanodiscs migrate into native gels as a prominent band (∼220 kDa marker, Figure 1a ). Aided by Coomassie staining, western blotting and labeling with fluorescent markers, we were then able to follow colocalization of the respective proteins with the characteristic nanodisc band. If nanodiscs are mixed with fluorescently labeled Bax, no shifts or extra bands occur and the absence of fluorescence showed that Bax by itself does not associate with nanodiscs ( Figure 1a ). However, when fluorescently labeled Bax and nanodiscs were incubated together with Bid BH3 peptide, then an additional clear, single band appeared by Coomassie staining at ∼250 kDa marker ( Figure 1a , left), above the bare nanodisc band. The corresponding fluorescence signal shows a clear and sharp band at the position of the additional Coomassie band, indicating that it represents nanodiscs with incorporated Bax molecules ( Figure 1a , right). These findings were fully confirmed using unlabeled Bax and immunoblotting ( Figure 1c ). Bax incorporation into nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptide was observed to occur at the full range of pH 4.0–8.0, with the most efficient incorporation occurring at pH 4 as judged by the shift in intensities to the stained band ( Supplementary Figure S1B ). The existence of two bands, the bare nanodisc and Bax-nanodisc assembly bands, occur at substoichiometric Bax concentration and persist at increasing Bax concentrations. In difference to Bax, fluorescent labeling of Bid BH3 peptide indicates that the peptide associates with nanodiscs without other factors ( Figure 1b ). Consistent with its low molecular weight Bid BH3 peptide association does not significantly shift the nanodisc band position. The Bid BH3 peptide fluorescence signal was also detected in the additional, second band, which forms when Bax is added to the reconstituted system ( Figure 1b , right). Supporting the specificity of the reconstituted system, addition of Bid BH3 peptide carrying a single point mutation (G/A) that abolishes Bax binding of Bid in vivo 8 did not support Bax integration into the lipid bilayer ( Figure 1c ). Furthermore, the anti-apoptotic protein Bcl-xL abolished Bax integration in the presence of Bid BH3 peptide ( Figure 1d ). Altogether, these results indicate that a specific complex between Bax monomers, Bid BH3 peptide and phospholipids is formed. Bcl-xL inhibits the formation of this assembly. Nanodiscs form elliptical lipid bilayers delimited by a protein belt Next, we used a combination of cryo-EM imaging and several image analysis approaches to derive 3D reconstructions of bare nanodiscs and various nanodisc-Bax assemblies characterized by the above-mentioned biochemical assays ( Figures 2 and 3 ). We used cryo-EM conditions to guarantee that the samples are captured while fully hydrated and suspended in buffer, thus closely capturing their physiological environment. Carrying out the analysis in 3D allows efficient distinction between prolate and disc-like geometries of the nanodiscs. All 3D structures were generated and quantified using unbiased iterative multi-reference single-particle 3D reconstruction techniques. 19 , 20 Sorting as well as reference-free classification protocols were used throughout to ascertain the inclusion of homogenous populations into the relevant 3D reconstruction and to test for size variations. For each reconstruction, several starting models as well as cross-validation protocols were used to ensure the absence of model bias ( Supplementary Figure S2 ). Despite of clear indications of symmetry, all reconstructions were performed without imposing symmetry. Bare nanodiscs were reconstructed independently from data sets collected at pH 4 or at pH 7. Consistent with the previous biophysical analyses, 14 we did not find discernible variations in size or shape of the bare nanodisc samples ( Figures 2b and 3b , Supplementary Figure S1 ). No significant difference was observed in the 3D structures of nanodiscs obtained at either pH 4 or pH 7 ( Supplementary Figure S1 ). In the 3D reconstructions, bare nanodiscs adopt an elliptical configuration measuring 15 × 11 × 5.5 nm ( Figure 2a ). This shape is compatible with an elliptical-shaped lipid bilayer delimited by a protein belt ( Figure 3a ), and is similar to the shape and size derived by small angle X-ray scattering or neutron scattering. 21 The shape is not compatible the previously proposed super-helical prolate configuration 22 or with the circular 2D projection images seen in negative stain electron microscopy, 23 where samples are absorbed on carbon films, subjected to fixation with high heavy-metal salt concentrations, and air dried. Bax-monomer integration in the presence of Bid BH3 peptide generates ∼3.5-nm diameter pores in nanodisc membranes In addition to the analysis of bare nanodiscs, image processing was performed independently for nanodiscs with Bid BH3 peptide ( Figure 3c ), and with Bid BH3 peptide and full-length Bax (pH 4 and 7, Figures 2b and 3d , Supplementary Figure S1 ). All experiments were conducted at substoichiometric concentrations of Bax and excess of nanodiscs to further disfavor the formation of oligomeric Bax species in the nanodiscs. For each condition, two to three independent biochemical preparations were used to minimize experimental bias. In total, >11 000 images of individual particles, selected from 287 micrographs, were used for the analysis ( Supplementary Figure S2 ). The reconstructions of nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptide are very similar to bare nanodiscs, indicating that the presence of the peptides does not alter the structure of the membrane bilayer ( Figures 3b and c ). As for bare nanodiscs, the sorting and reference-free alignment protocols did not indicate the presence of sub-populations for nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptides, which is consistent with the existence of a single band in the native gels for these experimental conditions. In contrast, the nanodisc samples containing Bid BH3 peptide and Bax monomers segregated readily into two sub-populations. The existence of two structural conformers for these samples correlates with the existence of the two bands in the native gels ( Figure 1 ), in which only one of the nanodisc bands colocalized with the Bax fluorescence or immunoblotting band but both bands contain fluorescent Bid peptide. Approximately, one-third (37%) of the processed particles converged into a reconstruction virtually identical to those of bare nanodiscs or nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptide ( Supplementary Figure S2 ). However, the more prominent conformer (63%) shows a clear hole of ∼3.5-nm diameter in the fully hydrated phospholipid bilayer ( Figures 2b , Supplementary Figure S1 ) and a significant distortion of the bilayer ( Figure 4b ). The error margin for the hole size, as determined by comparing independently derived reconstructions, is ∼0.3 nm. These 3.5-nm diameter Bax-mediated pores are large enough to allow release of ions and of small proteins such as cytochrome c, one of the hallmarks of apoptosis. The total volume of the reconstruction, which gives an estimate of the complete phospholoipid and protein content of the reconstructed structure, reconfirms the single fluorescence band gel observation that only Bax monomers can be present while higher-order Bax oligomers cannot be accommodated. Interestingly, our reconstructions contained no discernible compact extra globular density that would account for the folded Bax-monomer solution structure, 12 which is in stark contrast with other recent nanodisc studies where integrated proteins such as integrin receptors, anthrax toxin or soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) proteins are clearly visible. 23 , 24 , 25 This observation suggests that Bax is unfolded on top of the nanodisc, with its amphiphilic portions inserted into the nanodiscs in a similar way to what was proposed for colicin. 26 Such unfolding of Bax is consistent with the finding that a substantial structural reorganization of Bax occurs during BH3-triggered activation. 27 Bax monomers integrate into nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptide but not when Bcl-xL is present To ensure incorporation of Bax monomers only, we first established a biochemical assay to assess and optimize integration of soluble Bax into nanodiscs. We took advantage of the fact that, consistent with their narrow size distribution, nanodiscs migrate into native gels as a prominent band (∼220 kDa marker, Figure 1a ). Aided by Coomassie staining, western blotting and labeling with fluorescent markers, we were then able to follow colocalization of the respective proteins with the characteristic nanodisc band. If nanodiscs are mixed with fluorescently labeled Bax, no shifts or extra bands occur and the absence of fluorescence showed that Bax by itself does not associate with nanodiscs ( Figure 1a ). However, when fluorescently labeled Bax and nanodiscs were incubated together with Bid BH3 peptide, then an additional clear, single band appeared by Coomassie staining at ∼250 kDa marker ( Figure 1a , left), above the bare nanodisc band. The corresponding fluorescence signal shows a clear and sharp band at the position of the additional Coomassie band, indicating that it represents nanodiscs with incorporated Bax molecules ( Figure 1a , right). These findings were fully confirmed using unlabeled Bax and immunoblotting ( Figure 1c ). Bax incorporation into nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptide was observed to occur at the full range of pH 4.0–8.0, with the most efficient incorporation occurring at pH 4 as judged by the shift in intensities to the stained band ( Supplementary Figure S1B ). The existence of two bands, the bare nanodisc and Bax-nanodisc assembly bands, occur at substoichiometric Bax concentration and persist at increasing Bax concentrations. In difference to Bax, fluorescent labeling of Bid BH3 peptide indicates that the peptide associates with nanodiscs without other factors ( Figure 1b ). Consistent with its low molecular weight Bid BH3 peptide association does not significantly shift the nanodisc band position. The Bid BH3 peptide fluorescence signal was also detected in the additional, second band, which forms when Bax is added to the reconstituted system ( Figure 1b , right). Supporting the specificity of the reconstituted system, addition of Bid BH3 peptide carrying a single point mutation (G/A) that abolishes Bax binding of Bid in vivo 8 did not support Bax integration into the lipid bilayer ( Figure 1c ). Furthermore, the anti-apoptotic protein Bcl-xL abolished Bax integration in the presence of Bid BH3 peptide ( Figure 1d ). Altogether, these results indicate that a specific complex between Bax monomers, Bid BH3 peptide and phospholipids is formed. Bcl-xL inhibits the formation of this assembly. Nanodiscs form elliptical lipid bilayers delimited by a protein belt Next, we used a combination of cryo-EM imaging and several image analysis approaches to derive 3D reconstructions of bare nanodiscs and various nanodisc-Bax assemblies characterized by the above-mentioned biochemical assays ( Figures 2 and 3 ). We used cryo-EM conditions to guarantee that the samples are captured while fully hydrated and suspended in buffer, thus closely capturing their physiological environment. Carrying out the analysis in 3D allows efficient distinction between prolate and disc-like geometries of the nanodiscs. All 3D structures were generated and quantified using unbiased iterative multi-reference single-particle 3D reconstruction techniques. 19 , 20 Sorting as well as reference-free classification protocols were used throughout to ascertain the inclusion of homogenous populations into the relevant 3D reconstruction and to test for size variations. For each reconstruction, several starting models as well as cross-validation protocols were used to ensure the absence of model bias ( Supplementary Figure S2 ). Despite of clear indications of symmetry, all reconstructions were performed without imposing symmetry. Bare nanodiscs were reconstructed independently from data sets collected at pH 4 or at pH 7. Consistent with the previous biophysical analyses, 14 we did not find discernible variations in size or shape of the bare nanodisc samples ( Figures 2b and 3b , Supplementary Figure S1 ). No significant difference was observed in the 3D structures of nanodiscs obtained at either pH 4 or pH 7 ( Supplementary Figure S1 ). In the 3D reconstructions, bare nanodiscs adopt an elliptical configuration measuring 15 × 11 × 5.5 nm ( Figure 2a ). This shape is compatible with an elliptical-shaped lipid bilayer delimited by a protein belt ( Figure 3a ), and is similar to the shape and size derived by small angle X-ray scattering or neutron scattering. 21 The shape is not compatible the previously proposed super-helical prolate configuration 22 or with the circular 2D projection images seen in negative stain electron microscopy, 23 where samples are absorbed on carbon films, subjected to fixation with high heavy-metal salt concentrations, and air dried. Bax-monomer integration in the presence of Bid BH3 peptide generates ∼3.5-nm diameter pores in nanodisc membranes In addition to the analysis of bare nanodiscs, image processing was performed independently for nanodiscs with Bid BH3 peptide ( Figure 3c ), and with Bid BH3 peptide and full-length Bax (pH 4 and 7, Figures 2b and 3d , Supplementary Figure S1 ). All experiments were conducted at substoichiometric concentrations of Bax and excess of nanodiscs to further disfavor the formation of oligomeric Bax species in the nanodiscs. For each condition, two to three independent biochemical preparations were used to minimize experimental bias. In total, >11 000 images of individual particles, selected from 287 micrographs, were used for the analysis ( Supplementary Figure S2 ). The reconstructions of nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptide are very similar to bare nanodiscs, indicating that the presence of the peptides does not alter the structure of the membrane bilayer ( Figures 3b and c ). As for bare nanodiscs, the sorting and reference-free alignment protocols did not indicate the presence of sub-populations for nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptides, which is consistent with the existence of a single band in the native gels for these experimental conditions. In contrast, the nanodisc samples containing Bid BH3 peptide and Bax monomers segregated readily into two sub-populations. The existence of two structural conformers for these samples correlates with the existence of the two bands in the native gels ( Figure 1 ), in which only one of the nanodisc bands colocalized with the Bax fluorescence or immunoblotting band but both bands contain fluorescent Bid peptide. Approximately, one-third (37%) of the processed particles converged into a reconstruction virtually identical to those of bare nanodiscs or nanodiscs in the presence of Bid BH3 peptide ( Supplementary Figure S2 ). However, the more prominent conformer (63%) shows a clear hole of ∼3.5-nm diameter in the fully hydrated phospholipid bilayer ( Figures 2b , Supplementary Figure S1 ) and a significant distortion of the bilayer ( Figure 4b ). The error margin for the hole size, as determined by comparing independently derived reconstructions, is ∼0.3 nm. These 3.5-nm diameter Bax-mediated pores are large enough to allow release of ions and of small proteins such as cytochrome c, one of the hallmarks of apoptosis. The total volume of the reconstruction, which gives an estimate of the complete phospholoipid and protein content of the reconstructed structure, reconfirms the single fluorescence band gel observation that only Bax monomers can be present while higher-order Bax oligomers cannot be accommodated. Interestingly, our reconstructions contained no discernible compact extra globular density that would account for the folded Bax-monomer solution structure, 12 which is in stark contrast with other recent nanodisc studies where integrated proteins such as integrin receptors, anthrax toxin or soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) proteins are clearly visible. 23 , 24 , 25 This observation suggests that Bax is unfolded on top of the nanodisc, with its amphiphilic portions inserted into the nanodiscs in a similar way to what was proposed for colicin. 26 Such unfolding of Bax is consistent with the finding that a substantial structural reorganization of Bax occurs during BH3-triggered activation. 27 Discussion Here, we present the first 3D structures of Bax membrane assemblies. We used biochemical, cell-free assays, cryo-electron microscopy and image processing to characterize full-length Bax, Bid BH3 peptides and Bcl-xL incorporation into nanometer-scale, protein-supported phospholipid bilayer discs. 14 These nanodiscs have been shown to provide the means to study integral membrane proteins such as receptors, transporters and enzymes in a native-like bilayer environment. 28 The ability of this bilayer system to maintain the functional activity of proteins was also shown by recent studies investigating, for example, the binding of ligands to the extracellular and cytoplasmic faces of cell membrane receptors. 23 We harnessed the nanodisc system and cryo-EM to derive molecular-resolution details of fully hydrated membrane phospholipid systems in the presence of Bax monomers activated by Bid BH3 peptides. Our studies showed that, as captured by native gels and direct imaging, monomeric Bax in the presence of Bid BH3 peptide induces the formation of 3.5-nm pores in the membrane. Our studies provide the molecular basis for the recently reported kinetic uncoupling of Bax oligomerization and pore formation in mitochondrial outer membrane vesicles. 29 The structural insights described here provide evidence that BH3-peptide activation and membrane insertion of monomeric Bax are sufficient, at least in principle, to allow the initial release of ions and proteinaceous content from the outer mitrochondrial membrane, suggesting that Bax monomers are key functional units associated with the onset of Bax-mediated MOMP. In our system, Bid BH3 peptide alone was found associated with nanodiscs while Bax alone was not. However, in the presence of Bid BH3 peptide, Bax readily integrated into the lipid bilayer and caused the formation of a pore. In the cell or in cell-free assays with cellular extracts, Bax can reversibly bind to the mitochondrial membranes without fully integrating or pore formation. 5 , 30 As full-length Bax does not associate with nanodiscs by itself, these findings indicate that other regulatory elements contribute to the control of membrane association of Bax monomers. Indeed, the composition of the phospholipid bilayer was shown previously to have profound effects on the kinetics and functionality of Bax-mediated pore formation. 5 , 31 , 32 Other regulatory proteins and trafficking mechanisms may also be involved in facilitating Bax activation. 12 , 33 The limited number of Bax helices that can be inserted in the nanodisc membrane (a maximum of four) cannot support a 3.5-nm pore that is fully lined by protein in the traditional transmembrane helix configuration. Thus, the latter indicates that the observed Bax-monomer-mediated pores are of mixed protein-lipidic nature, consistent with the fact that some Bax-derived peptides can also mediate the formation of protein-lipidic pores. 34 , 35 , 36 , 37 The data presented here does not contain information about the actual flux of material through the initial, Bax-monomer-mediated pore. As the size of this initial pore and the size of cytochrome C are approximately the same and the charge of the lipidic head groups lining the pore may interfere with protein release, it is possible that the postulated flux of cytochrome C through this pore could be rather slow, with only occasional molecules finding their way through the membrane. However, once larger amounts of membrane-integrated Bax become concentrated in a membrane region, oligomerization would trigger an increase in membrane permeability by local membrane destabilization, leading to large protein-lipidic pores as observed previously by cryo-EM of large unilamellar vesicles. 13 An initially slow flux would be consistent with the observation that permeabilization initially appears to be significantly slower than either Bax integration or oligomerization. 6 A slow flux through the monomer pore would also explain why measurements based on continuous release kinetics from liposomes generally indicate that pore formation requires oligomerization. 38 , 39 The measurements would be dominated by the oligomerization-triggered fast release mode and the initial slow release mode would be masked. The formation of Bax - monomer-induced lipidic pores in the initial stage of MOMP is attractive for several reasons. First, the minimal protein requirement favors faster induction of the pro-death signaling cascade, similar to the efficient process implemented by bacterial toxins. Second, the model explains catastrophic propagation. Once self-association and oligomerization proceed, the joining of lipidic pores can be achieved with far less conformational adaptation than pores requiring adjoining protein-lined pores. The latter has been associated with the formation of gate-selective pore size, which also maintains cell survival, whereas the lipidic pores in the case of Bax or toxins were observed to adopt a large, inhomogeneous range of pore sizes, 25–100 nm, which promote cell death. Third, the model also justifies the prominent role of Bcl-xL in dysregulating apoptosis by preventing Bax insertion into the membrane. Our studies provide a new set of tools and previously not accessible data to gain new understanding of the molecular basis of MOMP, suggesting that the minimal requirement for initiation of MOMP requires Bax, a phospholipid bilayer and Bid BH3 peptide. Subsequent oligomerization could provide the driving force for Bax-mediated cytochrome C release while the lipidic nature of the pores is maintained. 13 Materials and Methods Bax, Bcl-xL, tBid and lipid nanodiscs Recombinant human full-length Bax, tBid and Bcl-xL with transmembrane domain removed (Bcl-xLΔTM) – (ΔTM, lacking the c-terminal transmembrane domain) proteins were expressed and purified as N-terminal His-tagged fusion proteins in E. coli and their biochemical activities were characterized as was previously described. 12 , 15 , 40 For fluorescence experiments, Bax was subsequently incubated with two molar excess of fluorescein-maleimide in 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 8.0, overnight at 4 °C (Molecular Probes Kit #F6433, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Bid peptides (#2036A – EDIIRNIARHLAQV G DSMDR) or fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled Bid BH3 peptide (#2076B – FITCAhx; #2036A) and control 8 (#2102 – EDIIRNIARHLAQV A DSMDR) were provided by Dr. Satterthwait (Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA, USA). Phospholipid membrane scaffold protein 1 (MSP1)/dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) nanodiscs were generated as previously described. 14 Incorporation of Bax into nanodiscs Proteins and nanodiscs were mixed to the following final reaction concentrations: 1 μ g Bax, 20 μ g MSP1/DPPC nanodiscs, 20 μ M Bid peptide (or control peptide) and 50 μ g Bcl-xL, 70 mM citrate-phosphate buffers (pH 4.0–8.0). Reactions were incubated at room temperature for 30 min and analyzed on 4–20% Tris-glycine native PAGE gels (Invitrogen), or the entire reaction mixture was directly processed for cryo-EM. Western blotting and native PAGE Blue native gel electrophoresis was performed using the native PAGE system by Invitrogen, according to the manufacturer's instructions. Briefly, purified recombinant Bax (1 μ g), Bcl-xL (50 μ g), Bid BH3 peptides (50 μ M) and nanodiscs (20 μ g) were mixed at room temperature for 30 min and analyzed by 4–16% Tris-Bis native PAGE gel. The gel sections that contained nanodiscs were excised and soaked overnight, then briefly boiled in 10% SDS (5 min) before transferred to PVDF membrane. Both sample buffer and gel were loaded into denaturating gels for SDS-PAGE and followed by detection of Bax by immunoblotting using Bax antibody N20 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA). Electron cryo-microscopy Samples from reaction mixtures described above were applied to a holey carbon film 400 mesh copper grid (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Germany) and manually plunge-frozen in liquid-nitrogen-cooled liquified ethane. Images of the vitrified nanodisc samples suspended over holes were obtained under low-dose conditions using a 626 single tilt liquid nitrogen cryo transfer holder (Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA) and either a Tecnai G2 T12 Twin transmission electron microscope (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) equipped with a Lab6 filament (Kimball Physics Inc., Wilton, NH, USA) operated at 120 kV or a Tecnai F20 Twin transmission electron microscope (FEI Company) equipped with an FEG operated at 200 kV. Micrographs were recorded on Kodak ISO-163 plates (Eastman Kodak Co., Rochester, NY, USA) with a total dose of 20–50e − /à 2 and under defocus ranging between 1.5 and 2.5 μ m. The micrographs were developed in full-strength Kodak D19 developer, digitized using a SCAI scanner (Integraph, Leica Geosystems Inc., Norcross, GA, USA) at 7- μ m raster and binned to a final pixel size of 0.6 nm. Image processing A total of 11 306 particles were interactively selected from 287 micrographs. The particles were processed and analyzed using the EMAN2, 41 SPARX, 42 XMIPP 20 and CoAn 43 software packages. Phase correction for the contrast transfer function was applied for all images using EMAN2. All data sets were subjected to reference-free classification where images were sorted according to self-similarity. This strategy does not only potentially detect sub-classes caused by changes in morphology but also sub-classes caused by differences in size. The reference-free classification did not indicate sub-classes because of size differences but did indicate two sub-classes with different morphology for the data sets containing Bax and Bid BH3 peptides. Thus, each of the experimental data sets was initially sorted into two classes using models produced directly from the data using common lines. Model independence of the reconstructions obtained from the respective classes was tested by using the opposite model as a reference ( Supplementary Figure S2 ). If model bias was detected, new references were generated from common lines of the subsets until stable, model independent reconstructions were obtained. Subdivision into two classes yielded optimal results in terms of model independence over all nanodisc-Bid-peptide-Bax data sets. For all other data, subdivision did not yield significantly different reconstructions than those obtained with the entire data sets. In order to obtain the highest possible quality and resolution, reference-based iterative refinement was performed using the consensus references for these conformations on the respective data subsets once model independence was confirmed. Convergence was achieved within 8–25 iterations. The resolution of the final reconstructions is between 2 and 3 nm according to the 0.5 Fourier shell correlation cutoff criterion ( Figure 2a ). The somewhat restricted resolution is consistent with the dynamic nature of nanodiscs in solution. 44 The fact that the addition of particle images during the data analysis did not significantly improve the resolution at some point is also consistent with a dynamic mixture of slightly different nanodisc conformations as well as the small size of the samples by EM standards. For visualization purposes, a 2-nm low-pass filter was applied to the reconstructions. This cutoff was judged to provide the best balance between spurious high-frequency details and preservation of edge crispness at the borders of the nanodiscs. Bax, Bcl-xL, tBid and lipid nanodiscs Recombinant human full-length Bax, tBid and Bcl-xL with transmembrane domain removed (Bcl-xLΔTM) – (ΔTM, lacking the c-terminal transmembrane domain) proteins were expressed and purified as N-terminal His-tagged fusion proteins in E. coli and their biochemical activities were characterized as was previously described. 12 , 15 , 40 For fluorescence experiments, Bax was subsequently incubated with two molar excess of fluorescein-maleimide in 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 8.0, overnight at 4 °C (Molecular Probes Kit #F6433, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Bid peptides (#2036A – EDIIRNIARHLAQV G DSMDR) or fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled Bid BH3 peptide (#2076B – FITCAhx; #2036A) and control 8 (#2102 – EDIIRNIARHLAQV A DSMDR) were provided by Dr. Satterthwait (Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA, USA). Phospholipid membrane scaffold protein 1 (MSP1)/dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) nanodiscs were generated as previously described. 14 Incorporation of Bax into nanodiscs Proteins and nanodiscs were mixed to the following final reaction concentrations: 1 μ g Bax, 20 μ g MSP1/DPPC nanodiscs, 20 μ M Bid peptide (or control peptide) and 50 μ g Bcl-xL, 70 mM citrate-phosphate buffers (pH 4.0–8.0). Reactions were incubated at room temperature for 30 min and analyzed on 4–20% Tris-glycine native PAGE gels (Invitrogen), or the entire reaction mixture was directly processed for cryo-EM. Western blotting and native PAGE Blue native gel electrophoresis was performed using the native PAGE system by Invitrogen, according to the manufacturer's instructions. Briefly, purified recombinant Bax (1 μ g), Bcl-xL (50 μ g), Bid BH3 peptides (50 μ M) and nanodiscs (20 μ g) were mixed at room temperature for 30 min and analyzed by 4–16% Tris-Bis native PAGE gel. The gel sections that contained nanodiscs were excised and soaked overnight, then briefly boiled in 10% SDS (5 min) before transferred to PVDF membrane. Both sample buffer and gel were loaded into denaturating gels for SDS-PAGE and followed by detection of Bax by immunoblotting using Bax antibody N20 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA). Electron cryo-microscopy Samples from reaction mixtures described above were applied to a holey carbon film 400 mesh copper grid (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Germany) and manually plunge-frozen in liquid-nitrogen-cooled liquified ethane. Images of the vitrified nanodisc samples suspended over holes were obtained under low-dose conditions using a 626 single tilt liquid nitrogen cryo transfer holder (Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA) and either a Tecnai G2 T12 Twin transmission electron microscope (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) equipped with a Lab6 filament (Kimball Physics Inc., Wilton, NH, USA) operated at 120 kV or a Tecnai F20 Twin transmission electron microscope (FEI Company) equipped with an FEG operated at 200 kV. Micrographs were recorded on Kodak ISO-163 plates (Eastman Kodak Co., Rochester, NY, USA) with a total dose of 20–50e − /à 2 and under defocus ranging between 1.5 and 2.5 μ m. The micrographs were developed in full-strength Kodak D19 developer, digitized using a SCAI scanner (Integraph, Leica Geosystems Inc., Norcross, GA, USA) at 7- μ m raster and binned to a final pixel size of 0.6 nm. Image processing A total of 11 306 particles were interactively selected from 287 micrographs. The particles were processed and analyzed using the EMAN2, 41 SPARX, 42 XMIPP 20 and CoAn 43 software packages. Phase correction for the contrast transfer function was applied for all images using EMAN2. All data sets were subjected to reference-free classification where images were sorted according to self-similarity. This strategy does not only potentially detect sub-classes caused by changes in morphology but also sub-classes caused by differences in size. The reference-free classification did not indicate sub-classes because of size differences but did indicate two sub-classes with different morphology for the data sets containing Bax and Bid BH3 peptides. Thus, each of the experimental data sets was initially sorted into two classes using models produced directly from the data using common lines. Model independence of the reconstructions obtained from the respective classes was tested by using the opposite model as a reference ( Supplementary Figure S2 ). If model bias was detected, new references were generated from common lines of the subsets until stable, model independent reconstructions were obtained. Subdivision into two classes yielded optimal results in terms of model independence over all nanodisc-Bid-peptide-Bax data sets. For all other data, subdivision did not yield significantly different reconstructions than those obtained with the entire data sets. In order to obtain the highest possible quality and resolution, reference-based iterative refinement was performed using the consensus references for these conformations on the respective data subsets once model independence was confirmed. Convergence was achieved within 8–25 iterations. The resolution of the final reconstructions is between 2 and 3 nm according to the 0.5 Fourier shell correlation cutoff criterion ( Figure 2a ). The somewhat restricted resolution is consistent with the dynamic nature of nanodiscs in solution. 44 The fact that the addition of particle images during the data analysis did not significantly improve the resolution at some point is also consistent with a dynamic mixture of slightly different nanodisc conformations as well as the small size of the samples by EM standards. For visualization purposes, a 2-nm low-pass filter was applied to the reconstructions. This cutoff was judged to provide the best balance between spurious high-frequency details and preservation of edge crispness at the borders of the nanodiscs. Supplementary Material Supplementary Information Click here for additional data file.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9837758/

Monkeypox epidemic at the door: should we remain idly by or prepare strongly?

Monkeypox (MPX) is a common zoonotic disease caused by a double-strand DNA MPX virus (MPXV). MPX was considered a sporadic rare disease causing a mild disease with a low capacity to spread among humans. The clinical picture of human MPX highly resembles smallpox, though early lymphadenopathy in human MPX is the distinguishing sign not present in smallpox. The incubation period is 1–3 weeks, and fever, headache, joint pain, myalgia, and nausea for about 3 days. Skin lesions that appear 1–3 days following fever and lymphadenopathy usually appear simultaneously on the face and periphery. By cross-reactivity and protection, the smallpox vaccine produced 85% protection against infection with Orthopoxviruses, including MPX. Antiviral drugs like tecovirimate and brincidofovir could be effective agents against the development of MPX. MPX epidemics are less reported and described as other life-threatening epidemics, leading to an unclear picture of this disease's pathogenesis, epidemiology, and management. With the recent wide range of MPX outbreaks, immense research is mandatory to revise the importance of MPX pathogenesis and risk for epidemic development worldwide. Therefore, this critical study aimed to review MPX's pathogenesis, epidemiology, and management with possible repurposed drugs. Introduction Monkeypox (MPX) is a common zoonotic disease caused by a double strand DNA MPX virus (MPXV) belonging to the Orthopoxvirus genus/ Poxviridae family.MPXV is highly pathogenic for humans and is recognized as the most important orthopoxvirus infection after the eradication of smallpox in 1980 (Alkhalil et al. 2010 ; Di Giulio and Eckburg 2004 ). However, the final and natural host of MPXV is unrecognized, though it infects a wide spectrum of animal and mammalian species. MPX is mainly endemic in the Democratic Republic of Congo (DRC) and some areas of the Ivory Coast (Alkhalil et al. 2010 ; Di Giulio and Eckburg 2004 ). Notably, there are two clades of MPXV that differ clinically and epidemiologically. Central African clade (Congo Basin clade) is characterized by a high case fatality rate (CFR) of about 11% with a confirmed person-to-person transmission. Though, West African clade is characterized by low CFR about 1% without person- to-person transmission(Likos et al. 2005 ). MPX was considered a sporadic rare disease causing a mild disease with a low capacity to spread among humans. Though, in DRC, it may cause life-threatening complications due to frequent alteration of viral genetic (Yinka-Ogunleye et al. 2018 ). Albeit, the importance of MPX was less presented previously in the scientific community when it was limited to Central and West Africa. Later on, when MPX was documented outside Africa, a large number of published articles had been increased concerning epidemiology, clinical importance, and risk of epidemics (Sklenovska and Van Ranst 2018 ). Moreover, MPX epidemics are less reported and described as other life-threatening epidemics, leading to an unclear picture of the disease's pathogenesis, epidemiology, and management. With the recent wide range of MPX outbreaks, immense research is mandatory to revise the importance of MPX pathogenesis and risk for epidemic development worldwide. Therefore, this mini-review aimed to review MPX's pathogenesis, epidemiology, and management with possible repurposed drugs. Epidemiology of MPX MPX was first recognized in 1958 as a smallpox-like disease in laboratory monkeys in Denmark by Preben von Magnus (Minhaj et al. 2022 ). The first reported case of human MPX was in 1970, and in 1972 a case of human MPX was identified as a 9-month neonate in DRC (Minhaj et al. 2022 ). A total of 50 reported cases of human MPX were confirmed between 1970 and 1979, two-thirds of these cases being from DRC (Breman et al. 1980 ). Meyer et al. reported that by the end of 1986, more than 400 cases of human MPX characterized by 10% CFR were identified in West and Central Africa, which was designed as the first outbreak (Meyer et al. 2002 ). The second outbreak of human MPX was identified in DRC in a period between 1996 and 1997(Sklenovska and Van Ranst 2018 ). From 1991 to 1999 a 511 reported cases of human MPX were celebrated in DRC (Sklenovska and Van Ranst 2018 ). Notably, MPX is conventionally limited to the tropical rainforest; this pattern was changed in 2003 and 2005 when many cases were recognized in South Sudan and USA that were imported from DRC (Nakazawa et al. 2013 ). Between 2011 to 2014, about 2000 cases were reported annually in DRC (Sklenovska and Van Ranst 2018 ). In addition, many interrupted outbreaks were reported from 2014 till the end of 2017. In 2018, an increasing number of suspected cases of human MPX in DRC were reported officially (Sklenovska and Van Ranst 2018 ). In early May 2022, the first reported case of human MPX was identified in the UK (Nia et al. 2022 ). Further, many cases are increased in Europe, Australia, and the USA (Bunge et al. 2022 ). An updated systematic review illustrated that human MPX endemic in DRC spread and resurged worldwide due to the stopping of smallpox vaccination and increasing rate of person-to-person transmission (Bunge et al. 2022 ). In addition, an up-to-date human MPX outbreak affects children and young adults compared to the affection of children in early outbreaks (Bunge et al. 2022 ). These recent observations suggest that human MPX is evolved gradually to become of international relevance. Clinical presentation The clinical picture of human MPX highly resembles smallpox, though early lymphadenopathy in human MPX is the distinguishing sign not present in smallpox. The incubation period is 1–3 weeks, and fever, headache, joint pain, myalgia, and nausea for about 3 days (Minhaj et al. 2022 ). Skin lesions that appear 1–3 days following fever and lymphadenopathy usually appear at the same time on the face and periphery (Minhaj et al. 2022 ; Weinstein et al. 2005 ). Lymphadenopathy is mainly characterized by lymph node enlargement in the neck, groin, and submandibular area. The skin lesions cover the body in severe cases. The skin lesions start as small flat spots that become small bumps (papules) that are filled with clear fluid and then with yellow fluid, sometimes merging to form large lesions. The lesions progress simultaneously, identical to smallpox; after healing, the lesions leave pale marks, which finally become darks (Adler et al. 2022 ). Human MPX in severe conditions may lead to various complications, including bronchopneumonia, acute respiratory distress, sepsis, gastrointestinal complications, dehydration, encephalitis, and visual loss due to the involvement of the cornea. Human MPX may be misdiagnosed with chickenpox, smallpox, anthrax and HIV-induced skin lesion (Adler et al. 2022 ; Adalja and Inglesby 2022 ). Transmission of MPXV commonly occurs through direct contact and respiratory droplets. Sexual contact with animals could be a possible cause. Skin rashes go in various stages before forming a scab, finally falling out. Two third of patients have skin lesions on the palms and soles (Adalja and Inglesby 2022 ; World health organization 2022 ). Diagnosis of human MPX depends on the clinical features and history of contact with animals. Polymerase chain reaction (PCR) of samples from skin lesions is definitive for the final diagnosis. However, blood PCR is not definitive since MPXV no longer persists in the blood (World health organization 2022 ). Pathogenesis of human MPX Human MPX is caused by an enveloped dsDNA MPXV which has 250 nm width and 170–250 kb in size of DNA genome. MPXV consists of surface tubules, the outer envelope of the extracellular virion, lateral bodies, the plasid layer, core fibrils, and the outer membrane of intracellular and extracellular virions (Fig. 1 ). Fig. 1 Structure of monkeypox virus MPXV enters the mouth, eye, and respiratory tract's mucous membrane (Guarner et al. 2004 ). Like other Orthopoxviruses , entry of MPXV into host cells is achieved by binding glycosaminoglycans (GAGs) on the cell membrane, which mediates viral endocytosis (Kabuga and El Zowalaty 2019 ). Viral RNA polymerase is expressed within 30 min following infection with this virus. In the cytoplasm, the viral core and genomes are released with subsequent replication of viral proteins by viral DNA polymerase. Viral structural proteins are produced within 48 h post-infection with subsequent assembly into mature virions in the Golgi apparatus. From the Golgi apparatus, the mature virions are transported by microtubules to the plasma membrane and released outside the infected cells to infect other cells similarly (Likos et al. 2005 ). There are four types of GAGs, including heparin sulfate, chondroitin/dermatan sulfate, keratin sulfate, and hyaluronic acid (Gandhi and Mancera 2008 ). Heparin sulfate is present in the mast cell granules and is involved in regulating cell growth and proliferation, viral invasion angiogenesis, and tumor metastasis. Keratin sulfate maintains tissue hydration and regulation of macrophage functions. Other types of GAGs are found in the connective tissues and synovial membranes (Gandhi and Mancera 2008 ; Sodhi and Panitch 2020 ) GAGs are complex carbohydrates ubiquitously expressed on the cell surface and extracellular matrix. The interactions between GAGs and microbial pathogens represent a defense line against invasion (Lin et al. 2020 ). Several pathogens, including MPXV, induce the release of GAGs with the formation of soluble GAGs, which coat the pathogen to escape immune detection (Akhtar and Shukla 2009 ). Heparin sulfate acts as an entry and attachment site in the respiratory tract for many viruses, such as human meta-pneumonia, respiratory syncytial, and coronaviruses (Akhtar and Shukla 2009 ). GAGs and heparin sulfate, together with sialic acid, are abundantly expressed in dermal and epidermal cells that facilitate binding and entry of MPXV to the skin (Hughes et al. 2014 ). In MPXV, like other Orthopoxviruses there is noteworthy activation of genes involved in the activation expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines like IL-6 and CCL-2, respectively (Bourquain et al. 2013 ). Besides, mitogen-activated protein kinase (MAPK) and extracellular signal-regulated kinase (ERK) are induced by MPXV, which promote viral entry, viral replication and increased expression of viral proteins needed for viral replication (DuShane and Maginnis 2019 ). Moreover, heat shock protein 1 (HSP-1) is necessary for replicating MPXV, so it is highly induced during infection with MPXV (Filone et al. 2014 ). Of note, MPXV induces activation of nuclear factor kappa B (NF-κB) via suppression of signal transducer and activator of transcription (STAT), which has antiviral effects (Filone et al. 2014 ). In addition, MPXV activates natural killer cells to release interferon-gamma (INF-γ) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), which induce T-helper immune response type 1 (Th1) (Townsend et al. 2013 ). Overall, due to the selective tropism of lymphoid tissues, MPXV can induce lymphopenia and lymphadenopathy (Townsend et al. 2013 ). Inhibition of CD4 and CD8 and retaining of major histocompatibility complex 1 (MHC1) could be the possible mechanism for immune evasion of MPXV (Hammarlund et al. 2008 ). MPXV can evade the immune response by releasing receptors and virokines identical to the host cytokines. Viroceptors and virokines interfere with the intracellular signaling pathways of infected cells (Fig. 2 ) (Hammarlund et al. 2008 ). Fig. 2 Viroceptors and virokines of poxvirus These observations may explain the immunosuppressive effect of MPXV, as evidenced by the reduction of T lymphocytes in MPX (Hammarlund et al. 2008 ). Therefore, unlike other viral infections, the immune response is complex and needs further attention. Management of MPX Antiviral agents Tecovirimate is approved in the USA and the European Union for treating various types of poxviruses, including MPXV (Adler et al. 2022 ). Tecovirimate inhibits virus release from infected cells by inhibiting envelop proteins required for virion release. This antiviral drug was first used in 2018 for vaccinia. According to many clinical trials, it has proven to be more effective against MPXV. This drug is safe and well-tolerable (Grosenbach et al. 2018 ). As well brincidofovir is also recommended as a first-line antiviral drug together with supportive treatment in the management of MPX (Adler et al. 2022 ). Brincidofovir is a prodrug of cidofovir, conjugated with lipids designed to release cidofovir within the cells allowing higher intracellular concentration. Brincidofovir inhibits the DNA polymerase of MPXV and the production of extracellular viruses (Ho et al. 2022 ). It was approved in the USA in 2021 for treating poxviruses like adenoviruses, Ebola, and cytomegalovirus (Ho et al. 2022 ). The most common adverse effects of brincidofovir are nausea, vomiting and abdominal pain (Ho et al. 2022 ). Brincidofovir has greater efficacy than cidofovir by about 25 folds (Ho et al. 2022 ; Hutson et al. 2021 ). Other possible antiviral drugs for treating MPX are tricyclodicarboxylic acid (a derivative of tecovirimat), ribavirin, tiazofurin, protease inhibitors and hydrolase inhibitors could be effective in the management of MPX (Hutson et al. 2021 ; Lal et al. 2021 ). Vaccination It has been shown that the smallpox vaccine produced 85% protection against infection with Orthopoxviruses, including MPX, by cross-reactivity and protection (Yoshikawa 2021 ). Therefore, vaccinated individuals with the smallpox vaccine are more protected against the development of MPX. The smallpox vaccine was recommended in the 2003 MPX outbreak in the USA to reduce the risk of disease transmission (Choi et al. 2021 ). However, propaganda against the smallpox vaccine was high in 2003 due to the development of uncertain adverse effects like hiccup, mainly in immune-compromised patients (Kaynarcalidan et al. 2021 ). Later, IVAMUNE and ACAM2000 smallpox vaccines were developed and were shown to be not contraindicated in immune-compromised patients (Nalca and Zumbrun 2010 ). Till now, a specific vaccine for MPX is not developing, decussating findings of specific antiviral drugs or drugs with a potential effect on the development of MPX from repurposed ones. We learned many lessons from the Covid-19 pandemic, like the rapid involvement of repurposed FDA-approved drugs like ivermectin and doxycycline in managing Covid-19 (Al-Kuraishy et al. 2020 ; Al-Kuraishy et al. 2021a , b ; Al-Kuraishy et al. 2021a , b ). In addition, lymphopenia and abnormal immune response in Covid-19 may increase the risk for the development of MPX. In this regard, many safe drugs should be tested in silico and experimental studies when preparing preclinical studies. In conclusion, Monkeypox (MPX) is a common zoonotic disease caused by a double-strand DNA MPXV. MPX was considered a sporadic rare disease causing a mild disease with a low capacity to spread among humans. With the recent wide range of MPX outbreaks, immense research is mandatory to revise the importance of MPX pathogenesis and risk for epidemic development worldwide. By cross-reactivity and protection, the smallpox vaccine produced 85% protection against infection with Orthopoxviruses, including MPX. Antiviral drugs like tecovirimate and brincidofovir could be effective agents against the development of MPX. Till now, a specific vaccine for MPX is not developing, a decussating finding of specific antiviral drugs or drugs with a potential effect on the development of MPX from repurposed one. Antiviral agents Tecovirimate is approved in the USA and the European Union for treating various types of poxviruses, including MPXV (Adler et al. 2022 ). Tecovirimate inhibits virus release from infected cells by inhibiting envelop proteins required for virion release. This antiviral drug was first used in 2018 for vaccinia. According to many clinical trials, it has proven to be more effective against MPXV. This drug is safe and well-tolerable (Grosenbach et al. 2018 ). As well brincidofovir is also recommended as a first-line antiviral drug together with supportive treatment in the management of MPX (Adler et al. 2022 ). Brincidofovir is a prodrug of cidofovir, conjugated with lipids designed to release cidofovir within the cells allowing higher intracellular concentration. Brincidofovir inhibits the DNA polymerase of MPXV and the production of extracellular viruses (Ho et al. 2022 ). It was approved in the USA in 2021 for treating poxviruses like adenoviruses, Ebola, and cytomegalovirus (Ho et al. 2022 ). The most common adverse effects of brincidofovir are nausea, vomiting and abdominal pain (Ho et al. 2022 ). Brincidofovir has greater efficacy than cidofovir by about 25 folds (Ho et al. 2022 ; Hutson et al. 2021 ). Other possible antiviral drugs for treating MPX are tricyclodicarboxylic acid (a derivative of tecovirimat), ribavirin, tiazofurin, protease inhibitors and hydrolase inhibitors could be effective in the management of MPX (Hutson et al. 2021 ; Lal et al. 2021 ). Vaccination It has been shown that the smallpox vaccine produced 85% protection against infection with Orthopoxviruses, including MPX, by cross-reactivity and protection (Yoshikawa 2021 ). Therefore, vaccinated individuals with the smallpox vaccine are more protected against the development of MPX. The smallpox vaccine was recommended in the 2003 MPX outbreak in the USA to reduce the risk of disease transmission (Choi et al. 2021 ). However, propaganda against the smallpox vaccine was high in 2003 due to the development of uncertain adverse effects like hiccup, mainly in immune-compromised patients (Kaynarcalidan et al. 2021 ). Later, IVAMUNE and ACAM2000 smallpox vaccines were developed and were shown to be not contraindicated in immune-compromised patients (Nalca and Zumbrun 2010 ). Till now, a specific vaccine for MPX is not developing, decussating findings of specific antiviral drugs or drugs with a potential effect on the development of MPX from repurposed ones. We learned many lessons from the Covid-19 pandemic, like the rapid involvement of repurposed FDA-approved drugs like ivermectin and doxycycline in managing Covid-19 (Al-Kuraishy et al. 2020 ; Al-Kuraishy et al. 2021a , b ; Al-Kuraishy et al. 2021a , b ). In addition, lymphopenia and abnormal immune response in Covid-19 may increase the risk for the development of MPX. In this regard, many safe drugs should be tested in silico and experimental studies when preparing preclinical studies. In conclusion, Monkeypox (MPX) is a common zoonotic disease caused by a double-strand DNA MPXV. MPX was considered a sporadic rare disease causing a mild disease with a low capacity to spread among humans. With the recent wide range of MPX outbreaks, immense research is mandatory to revise the importance of MPX pathogenesis and risk for epidemic development worldwide. By cross-reactivity and protection, the smallpox vaccine produced 85% protection against infection with Orthopoxviruses, including MPX. Antiviral drugs like tecovirimate and brincidofovir could be effective agents against the development of MPX. Till now, a specific vaccine for MPX is not developing, a decussating finding of specific antiviral drugs or drugs with a potential effect on the development of MPX from repurposed one.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3010057/

Massive calcium–activated endocytosis without involvement of classical endocytic proteins

We describe rapid massive endocytosis (MEND) of >50% of the plasmalemma in baby hamster kidney (BHK) and HEK293 cells in response to large Ca transients. Constitutively expressed Na/Ca exchangers (NCX1) are used to generate Ca transients, whereas capacitance recording and a membrane tracer dye, FM 4–64, are used to monitor endocytosis. With high cytoplasmic adenosine triphosphate (ATP; >5 mM), Ca influx causes exocytosis followed by MEND. Without ATP, Ca transients cause only exocytosis. MEND can then be initiated by pipette perfusion of ATP, and multiple results indicate that ATP acts via phosphatidylinositol-bis 4,5-phosphate (PIP 2 ) synthesis: PIP 2 substitutes for ATP to induce MEND. ATP-activated MEND is blocked by an inositol 5-phosphatase and by guanosine 5′-[γ-thio]triphosphate (GTPγS). Block by GTPγS is overcome by the phospholipase C inhibitor, U73122, and PIP 2 induces MEND in the presence of GTPγS. MEND can occur in the absence of ATP and PIP 2 when cytoplasmic free Ca is clamped to 10 µM or more by Ca-buffered solutions. ATP-independent MEND occurs within seconds during Ca transients when cytoplasmic solutions contain polyamines (e.g., spermidine) or the membrane is enriched in cholesterol. Although PIP 2 and cholesterol can induce MEND minutes after Ca transients have subsided, polyamines must be present during Ca transients. MEND can reverse over minutes in an ATP-dependent fashion. It is blocked by brief β-methylcyclodextrin treatments, and tests for involvement of clathrin, dynamins, calcineurin, and actin cytoskeleton were negative. Therefore, we turned to the roles of lipids. Bacterial sphingomyelinases (SMases) cause similar MEND responses within seconds, suggesting that ceramide may be important. However, Ca-activated MEND is not blocked by reagents that inhibit SMases. MEND is abolished by the alkylating phospholipase A 2 inhibitor, bromoenol lactone, whereas exocytosis remains robust, and Ca influx causes MEND in cardiac myocytes without preceding exocytosis. Thus, exocytosis is not prerequisite for MEND. From these results and two companion studies, we suggest that Ca promotes the formation of membrane domains that spontaneously vesiculate to the cytoplasmic side. INTRODUCTION Experiments demonstrating that Ca influx triggers exocytosis of neurotransmitters are a cornerstone of modern physiology ( Katz, 1996 ). Recently, the regulatory roles of Ca in endocytic responses, occurring subsequent to exocytosis, have gained attention. One common observation is that progressively larger Ca transients trigger progressively larger endocytic responses, resulting in "excessive" endocytosis, such that cell area decreases below basal levels ( Thomas et al., 1994 ; Smith and Neher, 1997 ; Engisch and Nowycky, 1998 ). In melanotrophs, 25% of the cell surface can be internalized in a few seconds after release of caged Ca ( Thomas et al., 1994 ). These responses occur in the absence of cytoplasmic potassium, a condition in which clathrin-dependent endocytosis is blocked ( Ivanov, 2008 ) by disruption of adapter protein 2 (AP2) complexes ( Altankov and Grinnell, 1995 ). Furthermore, the vesicles generated can be larger than expected for clathrin-mediated endocytosis ( Thomas et al., 1994 ). In synapses, endocytic mechanisms that appear to be related to "excessive" endocytosis become dominant as synaptic activity increases. Dubbed "bulk endocytosis," this form of scaffold-independent endocytosis is evidently controlled and/or driven by dynamins ( Clayton and Cousin, 2009 ). That Ca influx through Ca channels can trigger endocytosis is also well established in non-excitable cells, such as oocytes ( Vogel et al., 1999 ). A general biological response involving Ca-activated endocytosis is the response of cells to membrane ruptures or "wounding" ( Idone et al., 2008 ). In brief, punctures of the cell surface flood cells with Ca, and such membrane wounds are closed by fusion of internal membranes with the cell surface, followed by removal of "lesion" membrane by endocytosis ( Idone et al., 2008 ) to non-acidified membrane compartments ( Cocucci et al., 2004 ). Calmodulin and Ca/calmodulin-dependent phosphatases have been suggested repeatedly to play crucial roles in the actions of Ca to promote endocytosis in secretory cells ( Artalejo et al., 1996 ; Engisch and Nowycky, 1998 ; Marks and McMahon, 1998 ; Chan and Smith, 2001 ; Wu et al., 2009 ). Inhibition by specific inhibitors of calcineurin ( Engisch and Nowycky, 1998 ; Marks and McMahon, 1998 ) provides clear evidence for a role of this phosphatase, a role that may reflect regulation of dynamin 1 by its dephosphorylation ( Smillie and Cousin, 2005 ). However, other reagents used to implicate calmodulin are less specific. Cationic peptides used to "block calmodulin" ( Wu et al., 2009 ) bind phosphatidylinositol-bis 4,5-phosphate (PIP 2 ) with high affinity ( de Haro et al., 2004 ), and the use of calmodulin antibodies to define calmodulin-dependent processes ( Artalejo et al., 1996 ) has not yet been demonstrated to be reliable or specific. We describe here efforts over several years to understand how large Ca transients cause massive endocytosis (MEND) responses in baby hamster kidney (BHK) fibroblasts, HEK293 cells, and cardiac myocytes. During these studies, it became apparent that Ca promotes MEND by long-term effects that can accumulate over multiple Ca transients, as well as by short-term mechanisms that require the immediate presence of cytoplasmic Ca. To our surprise, we were not able to implicate any classical endocytic protein in MEND, including clathrin, dynamins, and actin cytoskeleton, whereas it became increasingly clear that the membrane itself (e.g., its cholesterol content) strongly influences MEND. Thus, we were forced to consider how mechanisms inherent to the membrane itself might be important. From several possibilities, ceramide metabolism appeared of interest. Bacterial sphingomyelinases (SMases), which generate ceramide from sphingomyelin, cause large endocytic responses in ATP-depleted macrophages and fibroblasts ( Zha et al., 1998 ) and cause giant liposomes to bud vesicles to the membrane side opposite to which they are applied ( Holopainen et al., 2000 ). This type of endocytosis reflects the formation of ceramide domains that develop high inward curvature and undergo spontaneous budding and fission ( Goñi and Alonso, 2009 ; Staneva et al., 2009 ). As described here, exogenous SMases can indeed cause MEND within seconds. However, Ca-activated MEND is not caused by the exocytosis of SMases and ceramides, as suggested in a study published since this article was first submitted ( Tam et al., 2010 ). Rather, MEND can be dissociated from exocytosis by pharmacological means, and MEND occurs in some cell types without detectable exocytosis. Furthermore, MEND is not blocked by cell treatments that are described to disrupt acid SMase activities. We suggest that Ca-activated MEND may rather reflect the coalescence of previously existing lipid domains, followed by their spontaneous budding and fission to the cytoplasmic side. As an orientation to our presentation of Results, we describe first electrical and optical data demonstrating that MEND represents endocytosis rather than membrane shedding, and that membrane proteins are internalized. Equivalent results are presented as supporting data for two other MEND protocols. Second, we describe the existence of two different forms of Ca-activated MEND. Third, we describe five different protocols that induce Ca-dependent MEND, followed by salient observations made with each protocol. Fourth, we describe MEND responses induced by bacterial SMases and evidence that the exocytosis of SMases does not mediate Ca-activated MEND. Finally, we describe Ca-activated MEND that occurs in cardiac myocytes without preceding exocytosis. MATERIALS AND METHODS Cell culture, NCX1–pHluorin fusion, and myocyte BHK cells expressing NCX1.1 ( Linck et al., 1998 ) were maintained as described previously ( Yaradanakul et al., 2007 ). T-REx-293 cells (Invitrogen) were stably transfected with pcDNA3.1 (+) to express an NCX1.1 fusion with a pH-sensitive green protein, pHluorin ( Miesenböck et al., 1998 ), near the NCX1 glycosylation site ( Hryshko et al., 1993 ). Cells were grown in DMEM (Mediatech, Inc.) with 10% (wt/vol) FBS, 2 mM l -glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 µg/ml streptomycin. T-REx-293 cells were selected with G418, Zeocin, and Blasticidine, and transfections were with Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cells were harvested at 80–90% confluency with trypsin (0.25%). Cardiac myocytes were isolated as described previously ( Yaradanakul et al., 2007 ) and used within 3 h. Generation of the NCX1–pHluorin fusion near the NCX1 glycosylation site The pcDNA3.1 (+) NCX1.1 (available from GenBank/EMBL/DDBJ under accession no. L06438) plasmid (provided by J.P. Reeves, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark, NJ) was mutagenized using a QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent Technologies) to include a novel ClaI restriction site near to the glycosylation site, using the primers 5′-GCTCTCTTGT­TTTCCCATATC­GATGTGGACCA­TATAAGTGC-3′ and 5′-GCACTTATAT­GGTCCACATCG­ATATGGGAAAA­CAAGAGAGC-3′. pHluorin cDNA flanked with ClaI restriction sites was generated by PCR from a Vamp2-pHluorin plasmid (provided by R.H. Edwards, University of California, San Francisco, San Francisco, CA) and the following oligonucleotide primers: 5′-ATCGATAGCGGCGGAAGCGG-3′ and 5′-ATCGATTCCG­CCGGTTTTGTA­TAGTTCATCC-3′. The ClaI-pHluorin-ClaI cDNA PCR product was then cloned into the modified pcDNA3.1 (+) NCX1.1 plasmid at its new ClaI site to create the final pcDNA3.1-NCX1.1-pHluorin. Stable cells were screened and selected according to the supplier's protocols. Cell preparation and selection, patch clamp, and Cm recording and imaging All BHK and T-REx-293 cells were removed from dishes by trypsin and allowed to recover in suspension for 20 min before experiments. In general, relatively large cells were selected for experiments because results were less variable from cell to cell, and our methods to perfuse pipettes are more facile because larger pipettes can be used with larger cells. Patch clamp with on-line recording of cell electrical parameters and pipette perfusion was performed as described previously ( Yaradanakul et al., 2007 ; Wang and Hilgemann, 2008 ). The temperature was 35–37°C, and input resistances were 2–8 MΩ. Unless stated otherwise, square wave voltage perturbation (20 mV; 0.2–1 kHz) was used for Cm measurements. During patch clamp recording without imaging, solution switches were made by rapidly moving the microscope platform by hand so that the cell being monitored was placed directly in front of the solution outlet of interest. The height of solution reservoirs was adjusted to generate flow speeds of at least 2 mm/s in the center of solution streams. Currents that respond immediately to solution changes typically came to >80% of steady state within 100 to 150 ms upon changing solutions. The apparent cell resistances were 0.05–3 GΩ. BHK cells usually had lower resistances than T-REx-293 cells. In our experience, this "resting" resistance reflects mostly the seal–leak pathway in BHK cells. Because the seal resistance pathway does not pass through the entire cell access resistance pathway ( Lindau and Neher, 1988 ), it is impossible to calculate Cm changes accurately when conductance changes may reflect either seal or cell resistance changes. Nevertheless, it can be determined to what extent Cm changes may be misrepresented if exclusively seal or membrane resistance changes are occurring. On this basis, we have discarded all results in which conductance changes potentially affect Cm measurements. For confocal imaging, a microscope (TE2000-U; 60× oil immersion, 1.45-NA objective; Nikon; RC-26 recording chamber; Warner Instruments) was used with a 40-mW 163-CO 2 laser (Spectra Physics; Newport Corporation) operating at 488 nm and a 1.5 mW Melles Griot cylindrical HeNe laser at 543 nm at 3 and 7% of maximum capacity for pHlourin and FM 4–64 recordings, respectively. Resolution was set to 256 × 256, yielding 30%. This internalized pH-insensitive florescence corresponds to the percentage of NCX1 exchangers internalized during MEND, as internalized membrane does not enter acidified compartments. Online supplemental material Complete video recordings of the experiments presented in Fig. 2 (A and B) are provided as part of the online supplemental material. Also, a video record of the myocyte experiment presented in Fig. 11 D is provided. In addition, the following experimental data are provided: Optical measurements of membrane and NCX1 internalization during Ca/polyamine- and SMase-induced MEND (Figs. S1 and S2); control experiments for FM 4–64 and NCX1–pHluorin experiments demonstrating repeatability of protocols without MEND (Fig. S3); experiments demonstrating that MEND results in a loss of inward exchange current (Fig. S4); description of polyamine/Ca-induced MEND in a cell population (Fig. S5); internalization of NCX1 in response to SMase treatment in coverslip-attached cells (Fig. S6); analysis of the ATP dependence of ATP-dependent MEND (Fig. S7); evidence that β-methylcyclodextrin (BMCD)-induced reductions of membrane area (i.e., Cm) result mostly from extraction of cholesterol and phospholipids, rather than endocytosis (Figs. S8 and S9); activation of MEND by multiple SMases, but not by other phospholipases (Fig. S10); experiments demonstrating the long-lived nature of MEND facilitation by Ca (Fig. S11); and description of large capacitance steps often observed during MEND when induced by pipette perfusion of PIP 2 (Fig. S12). The online supplemental material is available at http://www.jgp.org/cgi/content/full/jgp.201010468/DC1 . Cell culture, NCX1–pHluorin fusion, and myocyte BHK cells expressing NCX1.1 ( Linck et al., 1998 ) were maintained as described previously ( Yaradanakul et al., 2007 ). T-REx-293 cells (Invitrogen) were stably transfected with pcDNA3.1 (+) to express an NCX1.1 fusion with a pH-sensitive green protein, pHluorin ( Miesenböck et al., 1998 ), near the NCX1 glycosylation site ( Hryshko et al., 1993 ). Cells were grown in DMEM (Mediatech, Inc.) with 10% (wt/vol) FBS, 2 mM l -glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 µg/ml streptomycin. T-REx-293 cells were selected with G418, Zeocin, and Blasticidine, and transfections were with Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cells were harvested at 80–90% confluency with trypsin (0.25%). Cardiac myocytes were isolated as described previously ( Yaradanakul et al., 2007 ) and used within 3 h. Generation of the NCX1–pHluorin fusion near the NCX1 glycosylation site The pcDNA3.1 (+) NCX1.1 (available from GenBank/EMBL/DDBJ under accession no. L06438) plasmid (provided by J.P. Reeves, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark, NJ) was mutagenized using a QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent Technologies) to include a novel ClaI restriction site near to the glycosylation site, using the primers 5′-GCTCTCTTGT­TTTCCCATATC­GATGTGGACCA­TATAAGTGC-3′ and 5′-GCACTTATAT­GGTCCACATCG­ATATGGGAAAA­CAAGAGAGC-3′. pHluorin cDNA flanked with ClaI restriction sites was generated by PCR from a Vamp2-pHluorin plasmid (provided by R.H. Edwards, University of California, San Francisco, San Francisco, CA) and the following oligonucleotide primers: 5′-ATCGATAGCGGCGGAAGCGG-3′ and 5′-ATCGATTCCG­CCGGTTTTGTA­TAGTTCATCC-3′. The ClaI-pHluorin-ClaI cDNA PCR product was then cloned into the modified pcDNA3.1 (+) NCX1.1 plasmid at its new ClaI site to create the final pcDNA3.1-NCX1.1-pHluorin. Stable cells were screened and selected according to the supplier's protocols. Cell preparation and selection, patch clamp, and Cm recording and imaging All BHK and T-REx-293 cells were removed from dishes by trypsin and allowed to recover in suspension for 20 min before experiments. In general, relatively large cells were selected for experiments because results were less variable from cell to cell, and our methods to perfuse pipettes are more facile because larger pipettes can be used with larger cells. Patch clamp with on-line recording of cell electrical parameters and pipette perfusion was performed as described previously ( Yaradanakul et al., 2007 ; Wang and Hilgemann, 2008 ). The temperature was 35–37°C, and input resistances were 2–8 MΩ. Unless stated otherwise, square wave voltage perturbation (20 mV; 0.2–1 kHz) was used for Cm measurements. During patch clamp recording without imaging, solution switches were made by rapidly moving the microscope platform by hand so that the cell being monitored was placed directly in front of the solution outlet of interest. The height of solution reservoirs was adjusted to generate flow speeds of at least 2 mm/s in the center of solution streams. Currents that respond immediately to solution changes typically came to >80% of steady state within 100 to 150 ms upon changing solutions. The apparent cell resistances were 0.05–3 GΩ. BHK cells usually had lower resistances than T-REx-293 cells. In our experience, this "resting" resistance reflects mostly the seal–leak pathway in BHK cells. Because the seal resistance pathway does not pass through the entire cell access resistance pathway ( Lindau and Neher, 1988 ), it is impossible to calculate Cm changes accurately when conductance changes may reflect either seal or cell resistance changes. Nevertheless, it can be determined to what extent Cm changes may be misrepresented if exclusively seal or membrane resistance changes are occurring. On this basis, we have discarded all results in which conductance changes potentially affect Cm measurements. For confocal imaging, a microscope (TE2000-U; 60× oil immersion, 1.45-NA objective; Nikon; RC-26 recording chamber; Warner Instruments) was used with a 40-mW 163-CO 2 laser (Spectra Physics; Newport Corporation) operating at 488 nm and a 1.5 mW Melles Griot cylindrical HeNe laser at 543 nm at 3 and 7% of maximum capacity for pHlourin and FM 4–64 recordings, respectively. Resolution was set to 256 × 256, yielding 30%. This internalized pH-insensitive florescence corresponds to the percentage of NCX1 exchangers internalized during MEND, as internalized membrane does not enter acidified compartments. Online supplemental material Complete video recordings of the experiments presented in Fig. 2 (A and B) are provided as part of the online supplemental material. Also, a video record of the myocyte experiment presented in Fig. 11 D is provided. In addition, the following experimental data are provided: Optical measurements of membrane and NCX1 internalization during Ca/polyamine- and SMase-induced MEND (Figs. S1 and S2); control experiments for FM 4–64 and NCX1–pHluorin experiments demonstrating repeatability of protocols without MEND (Fig. S3); experiments demonstrating that MEND results in a loss of inward exchange current (Fig. S4); description of polyamine/Ca-induced MEND in a cell population (Fig. S5); internalization of NCX1 in response to SMase treatment in coverslip-attached cells (Fig. S6); analysis of the ATP dependence of ATP-dependent MEND (Fig. S7); evidence that β-methylcyclodextrin (BMCD)-induced reductions of membrane area (i.e., Cm) result mostly from extraction of cholesterol and phospholipids, rather than endocytosis (Figs. S8 and S9); activation of MEND by multiple SMases, but not by other phospholipases (Fig. S10); experiments demonstrating the long-lived nature of MEND facilitation by Ca (Fig. S11); and description of large capacitance steps often observed during MEND when induced by pipette perfusion of PIP 2 (Fig. S12). The online supplemental material is available at http://www.jgp.org/cgi/content/full/jgp.201010468/DC1 . RESULTS Measurement of membrane and NCX1 internalization To facilitate and abbreviate the subsequent presentation and descriptions of MEND, we describe first our methods to monitor the internalization of membrane per se and of cardiac Na/Ca exchangers using one of the MEND protocols described subsequently. Equivalent data are presented in Figs. S1 and S2 for two other MEND protocols. Full-length videos of the experiments shown in Fig. 2 are available as part of the online supplemental material . In each case, the magnitudes of MEND determined by capacitance recording are verified by optical measurements of FM 4–64 dye uptake into vesicles below the cell surface, and nearly equivalent fractions of Na/Ca exchangers are internalized. In the protocol described in Fig. 2 , a large Ca transient is induced by the activation of reverse Na/Ca exchange in the absence of ATP, and MEND is subsequently activated by pipette perfusion of ATP (2 mM) into the cell. Results for the membrane tracer dye, FM 4–64, use BHK cells, and results for NCX1 use the T-REx-293 cell line expressing the pHluorin–NCX1 fusion protein described above. As illustrated in Fig. 2 A , FM 4–64 binds and unbinds rapidly from BHK cells when applied and removed, thereby defining fluorescence contributed by dye in the outer plasmalemma monolayer. In Fig. S3 , we show that, even after prolonged incubation without activating Ca influx, FM 4–64 dissociates nearly completely from BHK cells within seconds. As indicated in Fig. 2 A , the application of Ca for 10 s causes substantial exocytosis. During exocytosis, FM fluorescence increases by 140%, whereas Cm increases by only 59%. Thereafter, fluorescence declines by 73% when dye is washed off, and the presence of a residual fluorescence rim indicates that significant endocytosis occurred during fusion. In all experiments with large exocytic responses, the magnitude of FM fluorescence that washed off within a few seconds was markedly increased, and the reapplication of FM dye then caused a clearly detectable capacitive signal. This capacitive signal is described in more detail in the online supplemental material of a companion article ( Hilgemann and Fine, 2011 ). Quantitatively, the fluorescence signal corresponding to rapid FM dye binding–unbinding increased on average 30% more than expected from Cm changes during membrane fusion. Thus, FM dye binds more avidly to the cell surface after a large Ca transient. During MEND in Fig. 2 A , FM fluorescence grows by 15% over 2 min. Thereafter, FM fluorescence decreases by only 35% upon washout of dye, and the response to applying and removing dye is then reduced by 60% compared with the rapid response before MEND. The FM signal that does not wash off amounts to 60% of the rapid response before MEND. Thus, the optical signals are closely consistent with the 65% decline of Cm, reflecting an endocytic response rather than membrane shedding. After the final dye washout, the retained fluorescence ( Fig. 2 A , inset) reveals many large vacuoles up to 2.5 µm in diameter. These vacuoles presumably form by the fusion of small vesicles subsequent to their endocytosis, as we do not routinely observe in this protocol capacitance steps that would account for vacuoles being generated in single endocytic steps. We note that the formation of vacuoles during MEND was a variable observation, and that in a majority of cases, the vesicles in the retained fluorescence rim were too small to accurately determine their size optically. Internalization of NCX1 transporters during MEND is documented in Fig. 2 B using the extracellular NCX1 fusion with the pH-sensitive green fluorescent protein, pHluorin ( Miesenböck et al., 1998 ), which is constitutively expressed in T-REx-293 cells. As evident from the electrical records, Cm responses in T-REx-293 cells were very similar to those of BHK cells. In these experiments, fluorescence corresponding to NCX1 on the cell surface was rapidly determined by switching extracellular solutions from pH 7.0 to 6 to 8. At pH 6, fluorescence of pHluorin is negligible, and the jump on switching from pH 6.0 to 8 defines fluorescence from NCX1 at the cell surface. After one Ca influx episode and perfusion of ATP, Cm declines by >50% from its peak value, and the fluorescence jump from pH 6.0 to 8.0 decreases by 36%. Thus, only ∼36% of exchangers are internalized when ∼50% of the plasmalemma is internalized. Analysis of inward NCX1 currents, shown in Fig. S4 , quantitatively supports the conclusion that NCX1 is not preferentially internalized during MEND. Because fluorescence is increased at pH 6, after Cm has decreased, and fluorescence at pH 8.0 is decreased, NCX1 must enter an intracellular membrane compartment that does not acidify quickly. In the further presentation of our results, we assume that the Cm changes described reflect the changes of cell surface area as a result of exocytic and endocytic responses with minimal membrane shedding. Besides the optical measurements presented above, which support this interpretation, Figs. S1 and S2 provide similar evidence for two other MEND protocols. Two forms of Ca-activated MEND and membrane cycling in BHK cells under control of a polyamine switch Fig. 3 (A and B) describes two different Ca-activated MEND responses that occur in BHK cells: one that is highly ATP/PIP 2 dependent and one that has no requirement for either ATP or PIP 2 . As described in a previous study ( Yaradanakul et al., 2008 ), Ca influx in BHK cells causes exocytic responses that are compensated by approximately equal endocytic responses when cytoplasmic solutions contain 2 mM ATP. As shown in Fig. 3 A , much larger, "excessive" endocytic responses occur when higher, more physiological ATP concentrations are used. With 8 mM ATP, as shown in Fig. 3 A , Cm increases in a few seconds by ∼20% during Ca influx and remains stable as long as Ca influx continues. When Ca influx is terminated, Cm remains stable for 10–20 s and then falls over 2 min by nearly 50% from its peak value. As shown in the remainder of the record, these responses can be repeated multiple times with exocytosis and endocytosis amounting to 50% of the cell surface. We note that these exocytic responses decrease only partially with extended exposure to ATP-free solutions ( Yaradanakul et al., 2008 ). Figure 3. Two types of Ca-activated MEND responses in BHK cells, resulting in membrane recycling by different mechanisms. (A) Using standard cytoplasmic solution with 8 mM ATP and 0.2 mM GTP, the activation of Ca influx by NCX1 for 20 s causes an immediate exocytic response followed by a delayed MEND response that amounts to >50% of the cell surface over 2 min. Cycles of large exocytic responses followed by MEND can then be repeated multiple times in the same cell. (B) Using the same cytoplasmic solution as in A, with an additional 1 mM spermidine, large endocytic responses are initiated during Ca transients, rather than after Ca transients, as in A. Over the course of multiple Ca influx episodes, recovery from MEND becomes more pronounced, and MEND responses amounting to >50% of the cell surface can be repeated multiple times with recovery taking place over several minutes. Polyamines (i.e., putrescine, spermidine, and spermine) are ubiquitously present in eukaryotic cells at high concentrations. The free concentration of spermidine, which has gained much recent interest as a promoter of longevity ( Kaeberlein, 2009 ), is in the range of several hundred micromolars ( Igarashi and Kashiwagi, 2000 ). Relevant to this study, polyamines modulate the function of lipid kinases ( Coburn et al., 2002 ), the cytoskeleton ( Grant and Oriol-Audit, 1985 ), and the membrane itself ( Schuber et al., 1983 ). As shown in Fig. 3 B , the presence of 1 mM spermidine in the cytoplasmic solution causes a drastic change of the membrane cycling pattern. Ca influx initially still activates exocytic responses, but exocytosis is rapidly overcome by endocytic responses that decrease Cm by large fractions of total Cm. As illustrated in Fig. 3 B , Cm can recover completely after an endocytic response, and the endocytic responses become larger at subsequent Ca influx episodes. After multiple cycles of endocytosis and exocytosis, one half of cell area is lost in a few seconds during relatively small exchange currents, and Cm recovers over a time course of several minutes. As described later, these endocytic responses do not require ATP, whereas recovery from endocytosis (i.e., exocytosis) is strongly dependent on ATP in cytoplasmic solutions under these conditions. We note that recovery of Cm without ATP was occasionally observed when MEND was initiated 80%. Figure 6. Salient features of polyamine/Ca-activated MEND using nucleotide-free standard cytoplasmic solutions. (A) In contrast to other MEND-promoting agents, spermidine does not cause MEND after a Ca transient has occurred; it must be present in the cytoplasm during the Ca transient. (B) Ca-activated MEND with spermidine is often small at the first Ca influx episode but large and rapid at a second Ca transient. Thus, MEND undergoes long-term facilitation by a mechanism that does not involve phosphorylation. (C) The occurrence of MEND at the first Ca influx episode is more reliable using 2 mM EDA as polyamine in both intracellular and extracellular solutions ( n = 6). (D) Whereas 0.5 mM GTPγS blocks ATP-dependent MEND (Fig. 5 A), EDA/Ca-activated MEND is unaffected ( n = 7). Results in C and D are paired experiments from one batch of BHK cells. Figure 7. Cholesterol enrichment enables fast Ca-activated MEND without polyamines. All results use BHK cells with ATP-, GTP-, and polyamine-free cytoplasmic solution. Composite Cm changes from multiple experiments ( n = 4–6) are plotted by normalizing Cm after an intervention (open squares with standard errors) to Cm values before the intervention (filled squares). (A) Treatment of BHK cells with 10 mM HPCD for 5 min does not affect in an evident manner NCX1 currents or membrane fusion responses evoked by outward NCX1 current. Cm decreases by 100 recordings. Although exocytic responses are similar to control records (∼60% increase of Cm), the decline of Cm is small or absent. As indicated in Fig. 4 A , we estimate that the half-maximal ATP concentration is ∼4 mM to support this type of delayed Ca-activated MEND. 2. ATP perfusion after a Ca transient The second protocol, described in Fig. 4 B , is the same as used in Fig. 2 . Experiments are initiated without nucleotides in the cytoplasmic solution. Ca-containing extracellular solution is then applied for 2–4 s to enable reverse Na/Ca exchange, and after a delay of 20 s to 2 min, nucleotides are introduced into the cytoplasm by pipette perfusion. In this example, 2 mM ATP and 0.2 mM GTP were used, and the ensuing MEND amounts to >50% of Cm during the plateau that occurs after Ca influx. Cm begins to recover during this 300-s observation period. Ca transients evoked by reverse exchange current can cause Cm to recover above previous peak values in seconds, reflecting a nearly threefold increase of cell area. An ATP concentration of 0.5 mM was adequate to cause maximal MEND responses in this protocol. However, as described in Fig. S7 , the rate of MEND development increases almost linearly with ATP concentration up to 5 mM. Fig. S11 documents that MEND can be initiated several minutes after the Ca transient, indicating that the effect of Ca to promote MEND is long-lived. 3. Pipette perfusion of Ca-buffered solutions Because Na/Ca exchangers inactivate, cytoplasmic Ca transients caused by reverse exchange current are transient. Therefore, in a third protocol described in Fig. 4 C , Ca-buffered solutions were perfused into cells by pipette perfusion to maintain a high free cytoplasmic Ca concentration. As evident in Fig. 1 , high free cytoplasmic Ca can cause an apparent endocytic response over times of 2–3 min. Fig. 4 C shows the more rapid response that occurs when cytoplasmic solutions are heavily buffered to 200 µM of free Ca with nitrilotriacetic acid (NTA; 10 plus 3.5 mM Ca), and the cytoplasmic solution contains 40 mM Cs instead of 40 mM Na. With 0.5 mM ATP, Cm rose on average by 15% within 30 s upon perfusion of Ca and then declined by >40% over 20–80 s. The average fall was 35 ± 3% for eight experiments. Fig. 4 D shows composite results for a series of experiments using five Ca concentrations ( n = 4–8 for each group) in the presence of Cs. Fitting the data to a sum of two opposing rectangular hyperbolae, the half-maximal Cm decline occurs at 9 µM of free Ca ( Fig. 4 D , solid line). When all data points are fitted to a single hyperbola ( Fig. 4 D , gray line), the half-maximum is 26 µM. These characteristics were nearly unchanged when cytoplasmic solutions contained no ATP and a nonhydrolyzable ATP analogue (adenylyl imidodiphosphate [AMP-PNP]; 2 mM), or when they contained no ATP and apyrase (3.5 U/ml) to hydrolyze residual nucleotides. Thus, sustained high cytoplasmic Ca can support a form of MEND that is distinct from ATP-dependent MEND. As described next, polyamines also promote an ATP-independent MEND. 4. Polyamine/Ca-activated MEND The fourth protocol, described in Fig. 4 E , is to activate Ca influx by NCX1 in the presence of 1 mM of cytoplasmic spermidine, as in Fig. 3 B . In Fig. 4 E , the cytoplasmic solution contains no ATP or GTP, but a profound endocytic response begins within 1–3 s after the initial rise of Cm caused by exocytosis. These MEND responses often exceed 50% of the cell surface in 3 s. We note that MEND responses at a first Ca transient were sometimes small, or even absent, but a second Ca transient usually evoked a rapid MEND. As indicated by a dotted line, MEND responses in this protocol terminated rapidly upon termination of Ca influx and could be reinitiated by reactivating Ca influx. Thus, MEND in this protocol has an immediate requirement for cytoplasmic Ca. 5. Ca influx after plasmalemma enrichment with cholesterol Clathrin-independent endocytic processes are often inhibited by cholesterol extraction with β-cyclodextrins ( Sandvig et al., 2008 ). As described subsequently, the use of β-cyclodextrins to deplete and enrich membrane cholesterol results in profound inhibition and stimulation of MEND. However, β-cyclodextrins, especially BMCD, can cause substantial decreases of Cm that do not reflect endocytosis (see Figs. S8 and S9 ). Therefore, we developed another approach to enrich the surface membrane with cholesterol. Using giant excised membrane patches, we previously coated patch pipette tips with inert hydrocarbon mixtures containing lipids of interest and found that some phospholipids incorporated well into the plasmalemma ( Hilgemann and Collins, 1992 ). As a similar approach for cholesterol, we dissolved 100 mg/ml cholesterol in light mineral oil containing 10% ethanol at 60°C. Pipette tips with thick walls (>5 µm at the pipette opening) were then dipped into this mixture before back-filling. The coating did not hinder giga-seal formation or cell opening; it remained adherent during experiments, and recordings without cholesterol (i.e., after coating with the mineral oil/10% ethanol mix) were indistinguishable from recordings with tips without coating. As shown in Fig. 4 F , using cholesterol-coated pipettes and no spermidine, Ca influx by NCX1 activated MEND within a few seconds in the absence of cytoplasmic ATP and spermidine. As evident in the record, endocytic responses were then often so fast that exocytic responses were not evident. On average (>10 observations), MEND in the absence of ATP and polyamines amounted to >50% of the initial Cm of cells. Detailed studies of Ca-activated MEND subtypes Figs. 5 – 8 describe basic properties of the MEND subtypes, and the online supplemental material provides the following additional relevant information: optical measurements of MEND for multiple protocols (Figs. S1 and S2) with control measurements (Fig. S3); documentation that inward Na/Ca exchange currents are down-regulated by ATP-dependent MEND (Fig. S4); an ultrastructural study of MEND using a protocol to induce MEND in cell populations ( Fig. S5 ; in brief, a polyamine that can cross cell membranes [EDA] and enables MEND in response to Ca influx, as verified by uptake of horseradish peroxidase [HRP] into vesicles and vacuoles below the cell surface); demonstration that Na/Ca exchangers are internalized in response to SMase treatment of cells growing on coverslips ( Fig. S6 ); further electrophysiological studies of MEND (Figs. S4, S7, and S10–S12 ; from several phospholipase types tested, only SMases cause MEND, and PLC activation via overexpressed M1 receptors neither causes nor inhibits Ca/polyamine-dependent MEND); the nucleotide dependence of ATP-dependent MEND; and substantial reductions of Cm induced by BMCD without internalization of Na/Ca exchangers. Figure 8. Composite results of experiments characterizing MEND in five protocols. Bar graphs represent the peak Cm occurring in an experiment, during or shortly after a Ca transient, in relation to Cm after the occurrence of MEND. Each dataset reflects five or more observations. (A) MEND occurring with the indicated cytoplasmic ATP concentrations in response to a single Ca influx episode of 12–16 s. (B) MEND occurring upon pipette perfusion of an NTA-buffered solution with 0.2 mM of free Ca. (C) MEND occurring upon pipette perfusion of 2 mM ATP and 0.2 mM GTP after the cells were opened and maintained without nucleotides for 3 min and exposed to one Ca influx episode for 2 s. (D) MEND occurring during a single Ca influx episode for 15 s in the presence of cytoplasmic spermidine (1 mM). (E) MEND occurring over two Ca influx episodes of 15-s duration, separated by 2 min, in the presence of cytoplasmic spermidine (1 mM). See Results for complete details. Activation of MEND by ATP reflects generation of PIP 2 Fig. 5 presents evidence that ATP promotes MEND via the generation of PIP 2 . As shown in Fig. 5 A , ATP-dependent MEND is completely blocked by a high cytoplasmic concentration (0.5 mM) of the nonhydrolyzable GTP analogue, GTPγS. This blockade might reflect the function of many different G proteins, including dynamins. However, as shown in Fig. 5 B , the blockade is fully relieved by including the PLC inhibitor, U73122 (10 µM), in the pipette solution. This reagent, although not specific, powerfully blocks PIP 2 cleavage by PLCs that can be activated by receptor-mediated ( Horowitz et al., 2005 ) and GTPγS-mediated activation of Gq ( Camps et al., 1990 ; Chidiac et al., 1999 ). To test whether PIP 2 synthesis indeed underlies the activation of MEND by PIP 2 , we first examined the effects of pipette perfusion of PIP 2 into cells in >50 experiments. Under the usual initial conditions of experiments, PIP 2 caused 5–20% declines of Cm ( Yaradanakul et al., 2007 ). Much larger responses were obtained when PIP 2 was perfused into cells after a Ca influx episode with nucleotide-free cytoplasmic solutions. Fig. 5 D shows the composite data for PIP 2 perfusion after one Ca influx episode without ATP. The average Cm decrease was 43 ± 8%. As shown in Fig. 5 C , PIP 2 was also highly effective in the presence of GTPγS (0.5 mM) to block dynamin cycling. In this example, the initial cytoplasmic solution contained, as usual, 0.5 mM EGTA and 0.25 mM Ca. 50 µM PIP 2 was then perfused into the pipette in Ca-free standard solution (3 mM EGTA and no Ca) to block Ca-dependent PLC cleavage of PIP 2 . The endocytic response amounts to 65% of peak Cm. An example without GTPγS is provided in Fig. S12. To determine more directly if PIP 2 plays a role in ATP-activated MEND, we tested whether ATP could be effective in cells perfused with a recombinant phosphoinositol 5-phosphatase, IPP5c (0.1 mg/ml) ( Chi et al., 2004 ). Results are summarized in Fig. 5 E . Using cells that were pre-perfused with cytoplasmic solutions with or without IPP5c, Ca influx by NCX1 was activated for 8 s, and 2 mM ATP was introduced after a delay of 20 s. After ATP, Cm decreased on average 37% in control cells, but only 9% in cells with IPP5c. As described previously ( Yaradanakul et al., 2007 ), peak outward NCX1 currents were nearly unaffected by PIP 2 depletion, although steady-state NCX1 current is PIP 2 sensitive. Collectively, the experiments described in Fig. 5 make a strong case that the generation of PIP 2 is crucial for ATP to induce MEND. Additionally, it is established that both Ca transients and ATP depletion facilitate PIP 2 -induced MEND. Three features of polyamine/Ca-activated MEND Fig. 6 illustrates three characteristics of polyamine-dependent MEND. The experiments described use nucleotide-free solutions, but these same features were also routinely observed with ATP. As documented both here and in a companion article ( Hilgemann and Fine, 2011 ), MEND can be triggered by many different means after a Ca influx episode. Triggers include perfusion of ATP or PIP 2 , cholesterol enrichment, and a second Ca influx episode. However, as shown in Fig. 6 A , polyamines must be present during the Ca transient to promote MEND. Perfusion of 1 mM spermidine into a BHK cell 30 s after inducing a Ca transient, associated with a 40% increase of Cm, causes no MEND (four similar observations). The second feature highlighted is that Ca-activated MEND can facilitate strongly from one Ca transient to the next. Using 1 mM cytoplasmic spermidine, Fig. 6 B shows a common observation that MEND is very small at the first Ca influx episode, whereas a large MEND response occurs at the second and/or third Ca influx episode. Thus, some process set in motion by the first Ca transient enables MEND at a second Ca transient: Ca clearly has long-term and short-term effects. We note also the complete absence of recovery of Cm after MEND in this record without ATP or GTP. Under these conditions, recovery of Cm was invariably negligible when MEND occurred >100 s after opening cells (>50 observations). The third notable feature of polyamine/Ca-activated MEND, shown in Fig. 6 (C and D) , is its insensitivity to high concentrations of GTPγS (0.5 mM), similar to MEND induced by PIP 2 perfusion. In this set of experiments, we used the unnatural polyamine, EDA (2 mM), because occurrence of MEND at the first Ca influx episode was more reliable than with spermidine. Because EDA can cross membranes, we use it on both membrane sides. As shown in Fig. 6 (C and D) , the average MEND amounted to 24% of Cm during a single Ca influx episode without GTPγS versus 32% with GTPγS. Thus, neither G protein cycling nor PIP 2 is required for the occurrence of polyamine/Ca-activated MEND. Cholesterol can activate MEND long after Ca transients subside As described in Fig. 4 F , a direct method to apply lipids to cells suggests that cholesterol enrichment strongly promotes Ca-activated MEND with no ATP requirement. Fig. 7 extends those results to cholesterol enrichment with β-cyclodextrin–cholesterol complexes. To do so, we used HPCD, which extracts phospholipids less potently than the β-methyl form ( Ohtani et al., 1989 ) and therefore is less membrane disruptive. For results in Fig. 7 , ATP-, GTP-, and polyamine-free cytoplasmic solutions were used. As shown in Fig. 7 A , exposure of a cell to 10 mM HPCD causes only a small reduction of Cm over 5 min, whereas BMCD often caused decreases of >20% (see also Figs. S8 and S9). After the HPCD treatment, exchange currents and exocytic responses induced by Ca influx are of normal magnitudes for these cells. In contrast to results for free HPCD, Fig. 7 B demonstrates that 10 mM HPCD loaded with 0.8 mM cholesterol causes a small (∼10%) increase of Cm over 5 min (eight similar observations). Thereafter, activation of outward NCX1 current generates large, rapid MEND responses within seconds with almost no exocytic phase. As shown in Fig. 7 C , cholesterol–HPCD complexes evoke large MEND responses (67 ± 9%; n = 7) when applied after large Ca transients have primed the membrane for MEND. HPCD complexes themselves caused a smaller, significant decrease (25 ± 5%; n = 6), which is described in Fig. S2 of a companion article ( Hilgemann and Fine, 2011 ). Summary of Ca-activated MEND characteristics Fig. 8 summarizes extensive experiments suggesting that classical endocytic proteins are not involved in any of the MEND responses described in this paper. In all cases, Cm at the end of the indicated MEND protocol is normalized to peak Cm, whether the peak occurred during or immediately after activation of Ca influx. Group A presents results for Ca-activated MEND in the presence of high (8 mM) ATP, as in Fig. 3 A . MEND was negligible without ATP and amounted on average to only 10% of Cm with 2 mM ATP. A high concentration (5 µM) of the calcineurin inhibitor, FK506, did not alter these responses, whereas BMCD (12 mM for 2 min) effectively blocked the decline of Cm. Fig. 8 B shows composite Cm results for pipette perfusion of solutions with 0.2 mM of free Ca to induce MEND, as in Fig. 4 C , in the presence of 40 mM Cs. MEND was equally large when 2 mM ATP was omitted and cytoplasmic solutions contained 2 mM of nonhydrolyzable ATP (AMP-PNP) or 3.5 U/ml apyrase to hydrolyze residual nucleotides. Fig. 8 C shows composite Cm results for pipette perfusion of ATP to induce MEND, as in Figs. 2 and 4 B . The average response for perfusion of 2 mM ATP was a 50% decline of Cm. Perfusion of ATP had no effect if the Ca transient was omitted in the protocol. An amphiphysin sequence, INFFEDNFVPEI (37 µM), which binds AP2 with high affinity (K d = 2.5 µM) and blocks coat assembly ( Gallop et al., 2006 ), was without effect when included in cytoplasmic solutions. Pipette perfusion of dominant-negative K44A dynamin 2 (0.5 µM) for 5 min did not affect the subsequent response to perfusing ATP. Similar to results with continuous ATP, shown in Fig. 5 A , the nonhydrolyzable GTP analogue, GTPγS (0.2 mM), blocks MEND in this protocol. Deletion of GTP from cytoplasmic solutions can also substantially blunt these MEND responses, perhaps because G proteins such as ARF regulate PIP 2 synthesis ( Brown et al., 2001 ). F-actin disruption with 1 µM latrunculin A in the pipette solution, which results in blatant membrane blebbing, did not block MEND. And finally, the ATP analogue, ATPγS (0.5 mM), did not substitute for ATP in activating MEND, verifying that conventional protein kinases do not mediate the activation of MEND by ATP. Fig. 8 D shows composite Cm results for Ca-activated MEND in the presence of 1 mM spermidine, as in Fig. 3 B , evaluating MEND after one Ca influx episode of 20-s duration. Omission of ATP and inclusion of 2 mM AMP-PNP did not significantly change the MEND response. As described above, 2 mM EDA can substitute for spermidine to promote MEND, whereas pentalysine (Lys5) cannot. The inclusion of 0.5 mM GTPγS resulted in a partial inhibition of the MEND response to one Ca transient, as verified by two sets of experiments with seven and eight observations in the presence of GTPγS. For three reasons, we conclude that GTPγS specifically increases the variability of MEND occurrence with spermidine at a first Ca transient, noted in connection with Fig. 6 B . First, GTPγS does not blunt MEND in the presence of EDA ( Fig. 6 D ). Second, individual MEND responses in the presence of GTPγS amounted to >60% of the cell surface. And third, as described next, MEND responses at a second Ca transient brought Cm closer to the "control" MEND values. Fig. 8 E describes further experiments using two Ca influx episodes of 15 s separated by 2 min to induce MEND. All agents tested were added to pipette solutions. Cytoskeleton modifiers (3 µM latrunculin A, 10 µM phalloidin, and 30 µM colchicine) were without a significant effect, as were cyclosporin (CsA; 5 µM); FK506 (10 µM); calmidazolium (CALMZ; 12 µM); overexpression of dominant-negative K44A dynamin 2 with GFP to identify transfected cells; the dynamin inhibitor, dynasore (200 µM) ( Newton et al., 2006 ); and an unmyristolated dynamin inhibitor peptide (50 µM; DynPep; Tocris Bioscience). As noted above, MEND was less affected by GTPγS (0.5 mM) using two Ca influx episodes than with one episode. We tested for a role of Ca-activated transglutaminases because polyaminylation was suggested earlier to play a role in endocytosis ( Davies et al., 1980 ). Inhibitors of transglutaminases (e.g., dansylcadaverine [ Davies et al., 1980 ] and Z-DON-Val-Pro-Leu-OMe; Zedira) and amino oxidases (1 mM; aminoguanidine [AG]) ( Brunton et al., 1991 ) had small inhibitory effects, equivalent to GTPγS. We turn now to the membrane itself. As noted in the Introduction, a role for SMases and ceramide generated by SMases appeared attractive, because exocytic events might bring both SMases and ceramide into the extracellular membrane surface. Figs. 9 – 11 document the potential of SMases to generate MEND as well as arguments against a major role for SMases and ceramide in Ca-activated MEND. Figure 9. Activation of MEND by the extracellular application of 1 U/ml Bacillus cereus SMase in BHK fibroblasts with Na-free solutions. (A) BHK cell perfused for >2 min with Na-, ATP-, and GTP-free cytoplasmic solution. The application of 1 mM Ca from outside has no effect on Cm, whereas the application of Ca with SMase causes a 54% drop of Cm at a peak rate of 12% per second. Membrane current (I m ) shows no response, access resistance (R a ) increases by 10%, and membrane conductance increases transiently by 0.8 nS in parallel with the first derivative of Cm (−dC m /dt). (B) Cytoplasmic application of SMases does not cause MEND. Perfusion of purified SMase into the cytoplasm of a BHK cell causes at most 12% decline of Cm at the same concentration that causes >50% decline of Cm from outside within seconds. (C) Reversal of SMase-induced MEND. SMase application as in A caused on average a 53% fall of Cm within 15 s. With 6 mM ATP in the cytoplasmic solution (left), Cm recovered toward baseline by 60% over 5 min, whereas Cm did not recover in the absence of nucleotides (right). MEND induced by extracellular SMases Fig. 9 describes MEND induced within seconds in BHK cells by the extracellular application of SMase from Bacillus cereus . Results in Fig. 9 (A and C) are with the commercial preparation (1 U/ml; Sigma-Aldrich), and results in B are with a purified enzyme ( Ago et al., 2006 ). Although the commercial preparation contains additional enzymatic activities ( Ramu et al., 2007 ), results for the two preparations were indistinguishable. Further, we demonstrate in Fig. S10 that recombinant bacterial SMase from Bacillus anthrax is similarly effective to induce MEND. Bacillus cereus SMase requires Ca (or manganese) to adsorb to the surface of cells ( Tomita et al., 1983 ). Therefore, solutions with 0.5 mM of free extracellular Ca (0.5 mM EGTA with 1.0 mM of added Ca) were used. When using cells that expressed cardiac NCX1, we used Na-free, Li-based cytosolic solutions to avoid Ca influx. Fig. 9 A shows records of cell electrical parameters determined by square wave voltage perturbation. In this experiment, the cytoplasmic solution contained no ATP or GTP to mimic ATP-depleted conditions of the previous cellular study ( Zha et al., 1998 ). As shown first, the application and removal of 2 mM Ca have no effect under these Na-free conditions. Upon applying SMase, together with Ca, Cm (46 pF) begins to decrease within a few seconds, achieves a maximal rate of decline of >12% per second, and stabilizes at about one half of the initial value. A small, transient rise of cell conductance mirrors the rate of change of Cm (dC m /dt), whereas membrane current (I m ) and access resistance (R a ) do not change. Because sphingomyelin is present mostly in the outer plasmalemma monolayer, we tested whether SMase has any effect from the cytoplasmic side. Representative for five similar experiments, Fig. 9 B shows that perfusion of purified SMase (5 µg/ml) into the cytoplasm of BHK cells in the presence of 5 µM of free Ca (5 mM EGTA with 4.5 mM Ca) caused at most a 12% decrease of Cm over 4 min, whereas the application of the same enzyme concentration to the outside causes a MEND response amounting to 65% of the cell surface in a few seconds. Fig. 9 C shows one Cm record of SMase-induced MEND with high ATP and GTP concentrations (8 and 0.2 mM, respectively) and one without nucleotides, whereby Cm is normalized to its value at the start of the experiments. Composite results for four and five observations, respectively, are given as data points with error bars. In the presence of ATP, Cm recovered for the most part over several minutes after MEND, whereas there was no recovery in the absence of ATP. Membrane internalized with SMase treatment was found previously to recycle back to the cell surface by following transferrin receptor trafficking ( Zha et al., 1998 ). Using the optical approaches described in Materials and methods, Fig. S2 shows that SMase-induced MEND internalizes membrane and Na/Ca exchangers in equivalent fractional amounts. Failure to confirm a role for secreted acid SMase in Ca-activated MEND In the recent article by Tam et al. (2010) , a role for acid SMases in Ca-activated endocytosis was supported by multiple experimental approaches. We describe here equivalent experiments with BHK cells using chemical probes that provided arguments for SMase involvement in endocytosis. Our results for both probes are inconsistent with the involvement of secreted SMases in MEND. Desipramine treatments do not block MEND The amphipathic drug, desipramine, is considered to be a powerful reagent to displace acid SMases from membranes and over time to promote its degradation ( Tam et al., 2010 ). In the study of Tam et al., cells were treated with 50 µM desipramine for 1 h. Thereafter, endocytosis in response to cell wounding appears to be blocked because FM dye uptake in the protocol used is blocked. Using equivalent desipramine treatments, we do not find significant inhibition of MEND responses in our protocols. To ensure that desipramine treatment was adequate, we incubated BHK cells with 100 µM desipramine for 1 h before removing them from dishes, and thereafter we incubated cells again for 1 h at 37°C with 100 µM desipramine in the absence of serum. In some experiments, we also added 100 µM desipramine to both cytoplasmic and extracellular solutions to promote the loss of SMase activities. As described in Fig. 10 A , MEND responses to Ca influx in the presence of high ATP (8 mM, as in Fig. 3 A ) were entirely normal, amounting to >50% of the cell surface on average ( n = 7). As shown in Fig. 10 B , MEND responses to Ca influx in the presence of 1 mM spermidine (i.e., as in Fig. 3 B ) were entirely normal, amounting to loss of ∼50% of the cell surface on average ( n = 7) within a few seconds. Figure 10. Desipramine treatment does not block MEND, whereas BEL treatment blocks MEND but not exocytosis. (A) ATP-dependent MEND in response to a Ca transient is unchanged by the pretreatment of cells with 100 µM desipramine for 1 h in serum-free media, followed by further incubation with 100 µM desipramine for 1 h and execution of experiments with 100 µM desipramine in both cytoplasmic and extracellular solutions. (B) Similar treatment with desipramine fails to inhibit spermidine-dependent MEND in the absence of ATP. (C) Same solutions as in A. BHK-NCX1 cells, which were pretreated with 50 µM BEL for 1 h in serum-free media, show robust Ca-activated exocytosis, with Cm doubling over three Ca influx episodes while endocytic responses are potently inhibited. (D) Same solutions as in B, with BEL treatment as in C. BEL treatment does not block exocytic responses that occur in the absence of ATP and presence of cytoplasmic spermidine (1 mM). However, endocytic responses are completely suppressed. MEND and Ca-activated exocytosis can occur independently A second argument of Tam et al. (2010) for a role of secreted SMase in endocytic responses, subsequent to cell wounding, is that endocytosis was blocked when exocytosis was blocked, thereby establishing a causal relationship. As a means to block exocytosis, cells were treated with a high concentration (50 µM) of the alkylating "active site" reagent, bromoenol lactone (BEL), which was suggested to block exocytosis. As described in Fig. 10 C , we find that the equivalent BEL treatments of BHK cells indeed fully block endocytic responses, subsequent to Ca influx. However, we find that exocytic responses continue robustly with multiple Ca influx cycles, resulting in a doubling of membrane area in response to multiple Ca transients. We note that the conditions of experiments presented in Fig. 10 C are otherwise identical to those used in Fig. 10 A (i.e., with 8 mM of cytoplasmic ATP). Similarly, as described in Fig. 10 D , we find that exocytic responses continue robustly in the equivalent protocols with 1 mM of cytoplasmic spermidine and no ATP. Over several cycles of Ca influx, exocytosis results in a full doubling membrane area, whereas endocytosis is entirely blocked. Thus, the reagents used by Tam et al. (2010) provide no evidence in our hands for the hypothesis that acid SMase might be involved in Ca-activated MEND responses. MEND occurs in cardiac myocytes without exocytosis and can be initiated by spontaneous Ca release Also relevant to the conclusions of Tam et al. (2010) is that MEND occurs in cardiac myocytes without preceding exocytosis, as we describe in Fig. 11 . Because BHK and HEK293 cells are highly proliferative and do not exhibit global Ca transients, we tested for the existence of MEND in adult mouse and rat cardiac myocytes, using native NCX1 to generate Ca influx and to initiate cycles of spontaneous Ca release. Indeed, outward NCX1 currents (0.2–0.5-nA peaks) caused large declines of Cm in both mouse and rat myocytes. Experiments described in Fig. 11 use the modified standard solution, described in Materials and methods, with 6 mM ATP and no polyamines. Fig. 11 A shows an example from a rat myocyte. Activation of reverse exchange current for just 2 s initiates a reversible endocytic response. Cm declines rapidly during Ca influx and then more slowly as spontaneous contractile activity initiated by Ca influx declines. We stress the time course of MEND in relation to the second and third Ca influx episodes: MEND clearly continues after Ca influx is terminated, suggesting that internal Ca release can drive MEND. Typical for all myocytes studied, Cm recovers progressively more slowly after each MEND response. Figure 11. MEND occurs in cardiac myocytes without preceding exocytic responses and can be induced by spontaneous cycles of Ca release. (A) Rat cardiac myocyte with 6 mM of cytoplasmic ATP. MEND develops rapidly during activation of NCX1 and continues for several seconds after terminating Ca influx as cells continued to contract spontaneously. MEND reversal in myocytes is labile, becoming substantially slower from one MEND cycle to the next. Reversal was negligible when MEND was allowed to proceed to a final loss of >30% of the cell surface. (B–D) Different patterns of MEND responses observed in mouse cardiac myocytes. (B) Mouse myocyte with contraction blocked by 17 µM blebbistatin. Na/Ca exchange current is relatively large. MEND begins within 3 s of activating Ca influx, and MEND terminates when exchange current is deactivated. (C) Mouse myocyte without blebbistatin. Brief activation of reverse exchange current promotes spontaneous cycles of Ca release, accompanied by transient current changes that are evident in the current record. MEND begins with no exocytic response and terminates spontaneously as spontaneous contractile activity terminates. (D) Mouse myocyte without blebbistatin. Exchange current is negligibly small. The application of Ca activates spontaneous cycles of Ca release accompanied by transient current changes. MEND begins after extracellular Ca has been removed and during spontaneous contractile activity, and it terminates spontaneously with no evident relationship to the termination of spontaneous activity. The bright field record of this experiment is provided as Video 3. Because myocytes contract vigorously in this protocol, we tested the possibility that contraction might cause T-tubules to be physically pinched off by contractile activity. To do so, we used high concentrations of the myosin 2 inhibitor, blebbistatin (17 µM), in both cytoplasmic and extracellular solutions to block contraction ( Farman et al., 2008 ). In >20 observations, MEND remained robust when contraction was abolished in both rat and mouse myocytes. As shown in Fig. 11 B for a mouse myocyte, activation of exchange current for 10 s resulted in Cm declines of >25% after a 2–3-s delay with no preceding exocytic response. Thus, it is unlikely that MEND is caused by contractile activity or by the exocytosis of ceramide/SMase-rich membrane. Depending on myocyte batch and time after isolation, exchange currents can be very small or negligible in mouse myocytes. Fig. 11 (C and D) illustrates that in such myocytes, the application of extracellular Ca initiated cycles of spontaneous Ca release and contraction that were accompanied by MEND, which occurred after termination of Ca influx. Spontaneous activity in these myocytes can be followed electrophysiologically via transient current changes that occur synchronously with contraction. In Fig. 11 C , spontaneous activity occurs during the application of Ca and terminates synchronously with MEND after Ca influx is deactivated. In Fig. 11 D , Ca was applied twice for just 3 s. On the first Ca application, a single cycle of Ca release was evoked. The second application of Ca, however, caused a prolonged train of Ca release cycles. MEND both begins and terminates after the removal of extracellular Ca, demonstrating that MEND can be initiated by internal Ca release in myocytes. A bright field optical record of this experiment, provided as Video 3, documents that MEND is occurring with modest contractile activity that does not cause prolonged myocyte shortening. Measurement of membrane and NCX1 internalization To facilitate and abbreviate the subsequent presentation and descriptions of MEND, we describe first our methods to monitor the internalization of membrane per se and of cardiac Na/Ca exchangers using one of the MEND protocols described subsequently. Equivalent data are presented in Figs. S1 and S2 for two other MEND protocols. Full-length videos of the experiments shown in Fig. 2 are available as part of the online supplemental material . In each case, the magnitudes of MEND determined by capacitance recording are verified by optical measurements of FM 4–64 dye uptake into vesicles below the cell surface, and nearly equivalent fractions of Na/Ca exchangers are internalized. In the protocol described in Fig. 2 , a large Ca transient is induced by the activation of reverse Na/Ca exchange in the absence of ATP, and MEND is subsequently activated by pipette perfusion of ATP (2 mM) into the cell. Results for the membrane tracer dye, FM 4–64, use BHK cells, and results for NCX1 use the T-REx-293 cell line expressing the pHluorin–NCX1 fusion protein described above. As illustrated in Fig. 2 A , FM 4–64 binds and unbinds rapidly from BHK cells when applied and removed, thereby defining fluorescence contributed by dye in the outer plasmalemma monolayer. In Fig. S3 , we show that, even after prolonged incubation without activating Ca influx, FM 4–64 dissociates nearly completely from BHK cells within seconds. As indicated in Fig. 2 A , the application of Ca for 10 s causes substantial exocytosis. During exocytosis, FM fluorescence increases by 140%, whereas Cm increases by only 59%. Thereafter, fluorescence declines by 73% when dye is washed off, and the presence of a residual fluorescence rim indicates that significant endocytosis occurred during fusion. In all experiments with large exocytic responses, the magnitude of FM fluorescence that washed off within a few seconds was markedly increased, and the reapplication of FM dye then caused a clearly detectable capacitive signal. This capacitive signal is described in more detail in the online supplemental material of a companion article ( Hilgemann and Fine, 2011 ). Quantitatively, the fluorescence signal corresponding to rapid FM dye binding–unbinding increased on average 30% more than expected from Cm changes during membrane fusion. Thus, FM dye binds more avidly to the cell surface after a large Ca transient. During MEND in Fig. 2 A , FM fluorescence grows by 15% over 2 min. Thereafter, FM fluorescence decreases by only 35% upon washout of dye, and the response to applying and removing dye is then reduced by 60% compared with the rapid response before MEND. The FM signal that does not wash off amounts to 60% of the rapid response before MEND. Thus, the optical signals are closely consistent with the 65% decline of Cm, reflecting an endocytic response rather than membrane shedding. After the final dye washout, the retained fluorescence ( Fig. 2 A , inset) reveals many large vacuoles up to 2.5 µm in diameter. These vacuoles presumably form by the fusion of small vesicles subsequent to their endocytosis, as we do not routinely observe in this protocol capacitance steps that would account for vacuoles being generated in single endocytic steps. We note that the formation of vacuoles during MEND was a variable observation, and that in a majority of cases, the vesicles in the retained fluorescence rim were too small to accurately determine their size optically. Internalization of NCX1 transporters during MEND is documented in Fig. 2 B using the extracellular NCX1 fusion with the pH-sensitive green fluorescent protein, pHluorin ( Miesenböck et al., 1998 ), which is constitutively expressed in T-REx-293 cells. As evident from the electrical records, Cm responses in T-REx-293 cells were very similar to those of BHK cells. In these experiments, fluorescence corresponding to NCX1 on the cell surface was rapidly determined by switching extracellular solutions from pH 7.0 to 6 to 8. At pH 6, fluorescence of pHluorin is negligible, and the jump on switching from pH 6.0 to 8 defines fluorescence from NCX1 at the cell surface. After one Ca influx episode and perfusion of ATP, Cm declines by >50% from its peak value, and the fluorescence jump from pH 6.0 to 8.0 decreases by 36%. Thus, only ∼36% of exchangers are internalized when ∼50% of the plasmalemma is internalized. Analysis of inward NCX1 currents, shown in Fig. S4 , quantitatively supports the conclusion that NCX1 is not preferentially internalized during MEND. Because fluorescence is increased at pH 6, after Cm has decreased, and fluorescence at pH 8.0 is decreased, NCX1 must enter an intracellular membrane compartment that does not acidify quickly. In the further presentation of our results, we assume that the Cm changes described reflect the changes of cell surface area as a result of exocytic and endocytic responses with minimal membrane shedding. Besides the optical measurements presented above, which support this interpretation, Figs. S1 and S2 provide similar evidence for two other MEND protocols. Two forms of Ca-activated MEND and membrane cycling in BHK cells under control of a polyamine switch Fig. 3 (A and B) describes two different Ca-activated MEND responses that occur in BHK cells: one that is highly ATP/PIP 2 dependent and one that has no requirement for either ATP or PIP 2 . As described in a previous study ( Yaradanakul et al., 2008 ), Ca influx in BHK cells causes exocytic responses that are compensated by approximately equal endocytic responses when cytoplasmic solutions contain 2 mM ATP. As shown in Fig. 3 A , much larger, "excessive" endocytic responses occur when higher, more physiological ATP concentrations are used. With 8 mM ATP, as shown in Fig. 3 A , Cm increases in a few seconds by ∼20% during Ca influx and remains stable as long as Ca influx continues. When Ca influx is terminated, Cm remains stable for 10–20 s and then falls over 2 min by nearly 50% from its peak value. As shown in the remainder of the record, these responses can be repeated multiple times with exocytosis and endocytosis amounting to 50% of the cell surface. We note that these exocytic responses decrease only partially with extended exposure to ATP-free solutions ( Yaradanakul et al., 2008 ). Figure 3. Two types of Ca-activated MEND responses in BHK cells, resulting in membrane recycling by different mechanisms. (A) Using standard cytoplasmic solution with 8 mM ATP and 0.2 mM GTP, the activation of Ca influx by NCX1 for 20 s causes an immediate exocytic response followed by a delayed MEND response that amounts to >50% of the cell surface over 2 min. Cycles of large exocytic responses followed by MEND can then be repeated multiple times in the same cell. (B) Using the same cytoplasmic solution as in A, with an additional 1 mM spermidine, large endocytic responses are initiated during Ca transients, rather than after Ca transients, as in A. Over the course of multiple Ca influx episodes, recovery from MEND becomes more pronounced, and MEND responses amounting to >50% of the cell surface can be repeated multiple times with recovery taking place over several minutes. Polyamines (i.e., putrescine, spermidine, and spermine) are ubiquitously present in eukaryotic cells at high concentrations. The free concentration of spermidine, which has gained much recent interest as a promoter of longevity ( Kaeberlein, 2009 ), is in the range of several hundred micromolars ( Igarashi and Kashiwagi, 2000 ). Relevant to this study, polyamines modulate the function of lipid kinases ( Coburn et al., 2002 ), the cytoskeleton ( Grant and Oriol-Audit, 1985 ), and the membrane itself ( Schuber et al., 1983 ). As shown in Fig. 3 B , the presence of 1 mM spermidine in the cytoplasmic solution causes a drastic change of the membrane cycling pattern. Ca influx initially still activates exocytic responses, but exocytosis is rapidly overcome by endocytic responses that decrease Cm by large fractions of total Cm. As illustrated in Fig. 3 B , Cm can recover completely after an endocytic response, and the endocytic responses become larger at subsequent Ca influx episodes. After multiple cycles of endocytosis and exocytosis, one half of cell area is lost in a few seconds during relatively small exchange currents, and Cm recovers over a time course of several minutes. As described later, these endocytic responses do not require ATP, whereas recovery from endocytosis (i.e., exocytosis) is strongly dependent on ATP in cytoplasmic solutions under these conditions. We note that recovery of Cm without ATP was occasionally observed when MEND was initiated 80%. Figure 6. Salient features of polyamine/Ca-activated MEND using nucleotide-free standard cytoplasmic solutions. (A) In contrast to other MEND-promoting agents, spermidine does not cause MEND after a Ca transient has occurred; it must be present in the cytoplasm during the Ca transient. (B) Ca-activated MEND with spermidine is often small at the first Ca influx episode but large and rapid at a second Ca transient. Thus, MEND undergoes long-term facilitation by a mechanism that does not involve phosphorylation. (C) The occurrence of MEND at the first Ca influx episode is more reliable using 2 mM EDA as polyamine in both intracellular and extracellular solutions ( n = 6). (D) Whereas 0.5 mM GTPγS blocks ATP-dependent MEND (Fig. 5 A), EDA/Ca-activated MEND is unaffected ( n = 7). Results in C and D are paired experiments from one batch of BHK cells. Figure 7. Cholesterol enrichment enables fast Ca-activated MEND without polyamines. All results use BHK cells with ATP-, GTP-, and polyamine-free cytoplasmic solution. Composite Cm changes from multiple experiments ( n = 4–6) are plotted by normalizing Cm after an intervention (open squares with standard errors) to Cm values before the intervention (filled squares). (A) Treatment of BHK cells with 10 mM HPCD for 5 min does not affect in an evident manner NCX1 currents or membrane fusion responses evoked by outward NCX1 current. Cm decreases by 100 recordings. Although exocytic responses are similar to control records (∼60% increase of Cm), the decline of Cm is small or absent. As indicated in Fig. 4 A , we estimate that the half-maximal ATP concentration is ∼4 mM to support this type of delayed Ca-activated MEND. 2. ATP perfusion after a Ca transient The second protocol, described in Fig. 4 B , is the same as used in Fig. 2 . Experiments are initiated without nucleotides in the cytoplasmic solution. Ca-containing extracellular solution is then applied for 2–4 s to enable reverse Na/Ca exchange, and after a delay of 20 s to 2 min, nucleotides are introduced into the cytoplasm by pipette perfusion. In this example, 2 mM ATP and 0.2 mM GTP were used, and the ensuing MEND amounts to >50% of Cm during the plateau that occurs after Ca influx. Cm begins to recover during this 300-s observation period. Ca transients evoked by reverse exchange current can cause Cm to recover above previous peak values in seconds, reflecting a nearly threefold increase of cell area. An ATP concentration of 0.5 mM was adequate to cause maximal MEND responses in this protocol. However, as described in Fig. S7 , the rate of MEND development increases almost linearly with ATP concentration up to 5 mM. Fig. S11 documents that MEND can be initiated several minutes after the Ca transient, indicating that the effect of Ca to promote MEND is long-lived. 3. Pipette perfusion of Ca-buffered solutions Because Na/Ca exchangers inactivate, cytoplasmic Ca transients caused by reverse exchange current are transient. Therefore, in a third protocol described in Fig. 4 C , Ca-buffered solutions were perfused into cells by pipette perfusion to maintain a high free cytoplasmic Ca concentration. As evident in Fig. 1 , high free cytoplasmic Ca can cause an apparent endocytic response over times of 2–3 min. Fig. 4 C shows the more rapid response that occurs when cytoplasmic solutions are heavily buffered to 200 µM of free Ca with nitrilotriacetic acid (NTA; 10 plus 3.5 mM Ca), and the cytoplasmic solution contains 40 mM Cs instead of 40 mM Na. With 0.5 mM ATP, Cm rose on average by 15% within 30 s upon perfusion of Ca and then declined by >40% over 20–80 s. The average fall was 35 ± 3% for eight experiments. Fig. 4 D shows composite results for a series of experiments using five Ca concentrations ( n = 4–8 for each group) in the presence of Cs. Fitting the data to a sum of two opposing rectangular hyperbolae, the half-maximal Cm decline occurs at 9 µM of free Ca ( Fig. 4 D , solid line). When all data points are fitted to a single hyperbola ( Fig. 4 D , gray line), the half-maximum is 26 µM. These characteristics were nearly unchanged when cytoplasmic solutions contained no ATP and a nonhydrolyzable ATP analogue (adenylyl imidodiphosphate [AMP-PNP]; 2 mM), or when they contained no ATP and apyrase (3.5 U/ml) to hydrolyze residual nucleotides. Thus, sustained high cytoplasmic Ca can support a form of MEND that is distinct from ATP-dependent MEND. As described next, polyamines also promote an ATP-independent MEND. 4. Polyamine/Ca-activated MEND The fourth protocol, described in Fig. 4 E , is to activate Ca influx by NCX1 in the presence of 1 mM of cytoplasmic spermidine, as in Fig. 3 B . In Fig. 4 E , the cytoplasmic solution contains no ATP or GTP, but a profound endocytic response begins within 1–3 s after the initial rise of Cm caused by exocytosis. These MEND responses often exceed 50% of the cell surface in 3 s. We note that MEND responses at a first Ca transient were sometimes small, or even absent, but a second Ca transient usually evoked a rapid MEND. As indicated by a dotted line, MEND responses in this protocol terminated rapidly upon termination of Ca influx and could be reinitiated by reactivating Ca influx. Thus, MEND in this protocol has an immediate requirement for cytoplasmic Ca. 5. Ca influx after plasmalemma enrichment with cholesterol Clathrin-independent endocytic processes are often inhibited by cholesterol extraction with β-cyclodextrins ( Sandvig et al., 2008 ). As described subsequently, the use of β-cyclodextrins to deplete and enrich membrane cholesterol results in profound inhibition and stimulation of MEND. However, β-cyclodextrins, especially BMCD, can cause substantial decreases of Cm that do not reflect endocytosis (see Figs. S8 and S9 ). Therefore, we developed another approach to enrich the surface membrane with cholesterol. Using giant excised membrane patches, we previously coated patch pipette tips with inert hydrocarbon mixtures containing lipids of interest and found that some phospholipids incorporated well into the plasmalemma ( Hilgemann and Collins, 1992 ). As a similar approach for cholesterol, we dissolved 100 mg/ml cholesterol in light mineral oil containing 10% ethanol at 60°C. Pipette tips with thick walls (>5 µm at the pipette opening) were then dipped into this mixture before back-filling. The coating did not hinder giga-seal formation or cell opening; it remained adherent during experiments, and recordings without cholesterol (i.e., after coating with the mineral oil/10% ethanol mix) were indistinguishable from recordings with tips without coating. As shown in Fig. 4 F , using cholesterol-coated pipettes and no spermidine, Ca influx by NCX1 activated MEND within a few seconds in the absence of cytoplasmic ATP and spermidine. As evident in the record, endocytic responses were then often so fast that exocytic responses were not evident. On average (>10 observations), MEND in the absence of ATP and polyamines amounted to >50% of the initial Cm of cells. Detailed studies of Ca-activated MEND subtypes Figs. 5 – 8 describe basic properties of the MEND subtypes, and the online supplemental material provides the following additional relevant information: optical measurements of MEND for multiple protocols (Figs. S1 and S2) with control measurements (Fig. S3); documentation that inward Na/Ca exchange currents are down-regulated by ATP-dependent MEND (Fig. S4); an ultrastructural study of MEND using a protocol to induce MEND in cell populations ( Fig. S5 ; in brief, a polyamine that can cross cell membranes [EDA] and enables MEND in response to Ca influx, as verified by uptake of horseradish peroxidase [HRP] into vesicles and vacuoles below the cell surface); demonstration that Na/Ca exchangers are internalized in response to SMase treatment of cells growing on coverslips ( Fig. S6 ); further electrophysiological studies of MEND (Figs. S4, S7, and S10–S12 ; from several phospholipase types tested, only SMases cause MEND, and PLC activation via overexpressed M1 receptors neither causes nor inhibits Ca/polyamine-dependent MEND); the nucleotide dependence of ATP-dependent MEND; and substantial reductions of Cm induced by BMCD without internalization of Na/Ca exchangers. Figure 8. Composite results of experiments characterizing MEND in five protocols. Bar graphs represent the peak Cm occurring in an experiment, during or shortly after a Ca transient, in relation to Cm after the occurrence of MEND. Each dataset reflects five or more observations. (A) MEND occurring with the indicated cytoplasmic ATP concentrations in response to a single Ca influx episode of 12–16 s. (B) MEND occurring upon pipette perfusion of an NTA-buffered solution with 0.2 mM of free Ca. (C) MEND occurring upon pipette perfusion of 2 mM ATP and 0.2 mM GTP after the cells were opened and maintained without nucleotides for 3 min and exposed to one Ca influx episode for 2 s. (D) MEND occurring during a single Ca influx episode for 15 s in the presence of cytoplasmic spermidine (1 mM). (E) MEND occurring over two Ca influx episodes of 15-s duration, separated by 2 min, in the presence of cytoplasmic spermidine (1 mM). See Results for complete details. Activation of MEND by ATP reflects generation of PIP 2 Fig. 5 presents evidence that ATP promotes MEND via the generation of PIP 2 . As shown in Fig. 5 A , ATP-dependent MEND is completely blocked by a high cytoplasmic concentration (0.5 mM) of the nonhydrolyzable GTP analogue, GTPγS. This blockade might reflect the function of many different G proteins, including dynamins. However, as shown in Fig. 5 B , the blockade is fully relieved by including the PLC inhibitor, U73122 (10 µM), in the pipette solution. This reagent, although not specific, powerfully blocks PIP 2 cleavage by PLCs that can be activated by receptor-mediated ( Horowitz et al., 2005 ) and GTPγS-mediated activation of Gq ( Camps et al., 1990 ; Chidiac et al., 1999 ). To test whether PIP 2 synthesis indeed underlies the activation of MEND by PIP 2 , we first examined the effects of pipette perfusion of PIP 2 into cells in >50 experiments. Under the usual initial conditions of experiments, PIP 2 caused 5–20% declines of Cm ( Yaradanakul et al., 2007 ). Much larger responses were obtained when PIP 2 was perfused into cells after a Ca influx episode with nucleotide-free cytoplasmic solutions. Fig. 5 D shows the composite data for PIP 2 perfusion after one Ca influx episode without ATP. The average Cm decrease was 43 ± 8%. As shown in Fig. 5 C , PIP 2 was also highly effective in the presence of GTPγS (0.5 mM) to block dynamin cycling. In this example, the initial cytoplasmic solution contained, as usual, 0.5 mM EGTA and 0.25 mM Ca. 50 µM PIP 2 was then perfused into the pipette in Ca-free standard solution (3 mM EGTA and no Ca) to block Ca-dependent PLC cleavage of PIP 2 . The endocytic response amounts to 65% of peak Cm. An example without GTPγS is provided in Fig. S12. To determine more directly if PIP 2 plays a role in ATP-activated MEND, we tested whether ATP could be effective in cells perfused with a recombinant phosphoinositol 5-phosphatase, IPP5c (0.1 mg/ml) ( Chi et al., 2004 ). Results are summarized in Fig. 5 E . Using cells that were pre-perfused with cytoplasmic solutions with or without IPP5c, Ca influx by NCX1 was activated for 8 s, and 2 mM ATP was introduced after a delay of 20 s. After ATP, Cm decreased on average 37% in control cells, but only 9% in cells with IPP5c. As described previously ( Yaradanakul et al., 2007 ), peak outward NCX1 currents were nearly unaffected by PIP 2 depletion, although steady-state NCX1 current is PIP 2 sensitive. Collectively, the experiments described in Fig. 5 make a strong case that the generation of PIP 2 is crucial for ATP to induce MEND. Additionally, it is established that both Ca transients and ATP depletion facilitate PIP 2 -induced MEND. Three features of polyamine/Ca-activated MEND Fig. 6 illustrates three characteristics of polyamine-dependent MEND. The experiments described use nucleotide-free solutions, but these same features were also routinely observed with ATP. As documented both here and in a companion article ( Hilgemann and Fine, 2011 ), MEND can be triggered by many different means after a Ca influx episode. Triggers include perfusion of ATP or PIP 2 , cholesterol enrichment, and a second Ca influx episode. However, as shown in Fig. 6 A , polyamines must be present during the Ca transient to promote MEND. Perfusion of 1 mM spermidine into a BHK cell 30 s after inducing a Ca transient, associated with a 40% increase of Cm, causes no MEND (four similar observations). The second feature highlighted is that Ca-activated MEND can facilitate strongly from one Ca transient to the next. Using 1 mM cytoplasmic spermidine, Fig. 6 B shows a common observation that MEND is very small at the first Ca influx episode, whereas a large MEND response occurs at the second and/or third Ca influx episode. Thus, some process set in motion by the first Ca transient enables MEND at a second Ca transient: Ca clearly has long-term and short-term effects. We note also the complete absence of recovery of Cm after MEND in this record without ATP or GTP. Under these conditions, recovery of Cm was invariably negligible when MEND occurred >100 s after opening cells (>50 observations). The third notable feature of polyamine/Ca-activated MEND, shown in Fig. 6 (C and D) , is its insensitivity to high concentrations of GTPγS (0.5 mM), similar to MEND induced by PIP 2 perfusion. In this set of experiments, we used the unnatural polyamine, EDA (2 mM), because occurrence of MEND at the first Ca influx episode was more reliable than with spermidine. Because EDA can cross membranes, we use it on both membrane sides. As shown in Fig. 6 (C and D) , the average MEND amounted to 24% of Cm during a single Ca influx episode without GTPγS versus 32% with GTPγS. Thus, neither G protein cycling nor PIP 2 is required for the occurrence of polyamine/Ca-activated MEND. Cholesterol can activate MEND long after Ca transients subside As described in Fig. 4 F , a direct method to apply lipids to cells suggests that cholesterol enrichment strongly promotes Ca-activated MEND with no ATP requirement. Fig. 7 extends those results to cholesterol enrichment with β-cyclodextrin–cholesterol complexes. To do so, we used HPCD, which extracts phospholipids less potently than the β-methyl form ( Ohtani et al., 1989 ) and therefore is less membrane disruptive. For results in Fig. 7 , ATP-, GTP-, and polyamine-free cytoplasmic solutions were used. As shown in Fig. 7 A , exposure of a cell to 10 mM HPCD causes only a small reduction of Cm over 5 min, whereas BMCD often caused decreases of >20% (see also Figs. S8 and S9). After the HPCD treatment, exchange currents and exocytic responses induced by Ca influx are of normal magnitudes for these cells. In contrast to results for free HPCD, Fig. 7 B demonstrates that 10 mM HPCD loaded with 0.8 mM cholesterol causes a small (∼10%) increase of Cm over 5 min (eight similar observations). Thereafter, activation of outward NCX1 current generates large, rapid MEND responses within seconds with almost no exocytic phase. As shown in Fig. 7 C , cholesterol–HPCD complexes evoke large MEND responses (67 ± 9%; n = 7) when applied after large Ca transients have primed the membrane for MEND. HPCD complexes themselves caused a smaller, significant decrease (25 ± 5%; n = 6), which is described in Fig. S2 of a companion article ( Hilgemann and Fine, 2011 ). Summary of Ca-activated MEND characteristics Fig. 8 summarizes extensive experiments suggesting that classical endocytic proteins are not involved in any of the MEND responses described in this paper. In all cases, Cm at the end of the indicated MEND protocol is normalized to peak Cm, whether the peak occurred during or immediately after activation of Ca influx. Group A presents results for Ca-activated MEND in the presence of high (8 mM) ATP, as in Fig. 3 A . MEND was negligible without ATP and amounted on average to only 10% of Cm with 2 mM ATP. A high concentration (5 µM) of the calcineurin inhibitor, FK506, did not alter these responses, whereas BMCD (12 mM for 2 min) effectively blocked the decline of Cm. Fig. 8 B shows composite Cm results for pipette perfusion of solutions with 0.2 mM of free Ca to induce MEND, as in Fig. 4 C , in the presence of 40 mM Cs. MEND was equally large when 2 mM ATP was omitted and cytoplasmic solutions contained 2 mM of nonhydrolyzable ATP (AMP-PNP) or 3.5 U/ml apyrase to hydrolyze residual nucleotides. Fig. 8 C shows composite Cm results for pipette perfusion of ATP to induce MEND, as in Figs. 2 and 4 B . The average response for perfusion of 2 mM ATP was a 50% decline of Cm. Perfusion of ATP had no effect if the Ca transient was omitted in the protocol. An amphiphysin sequence, INFFEDNFVPEI (37 µM), which binds AP2 with high affinity (K d = 2.5 µM) and blocks coat assembly ( Gallop et al., 2006 ), was without effect when included in cytoplasmic solutions. Pipette perfusion of dominant-negative K44A dynamin 2 (0.5 µM) for 5 min did not affect the subsequent response to perfusing ATP. Similar to results with continuous ATP, shown in Fig. 5 A , the nonhydrolyzable GTP analogue, GTPγS (0.2 mM), blocks MEND in this protocol. Deletion of GTP from cytoplasmic solutions can also substantially blunt these MEND responses, perhaps because G proteins such as ARF regulate PIP 2 synthesis ( Brown et al., 2001 ). F-actin disruption with 1 µM latrunculin A in the pipette solution, which results in blatant membrane blebbing, did not block MEND. And finally, the ATP analogue, ATPγS (0.5 mM), did not substitute for ATP in activating MEND, verifying that conventional protein kinases do not mediate the activation of MEND by ATP. Fig. 8 D shows composite Cm results for Ca-activated MEND in the presence of 1 mM spermidine, as in Fig. 3 B , evaluating MEND after one Ca influx episode of 20-s duration. Omission of ATP and inclusion of 2 mM AMP-PNP did not significantly change the MEND response. As described above, 2 mM EDA can substitute for spermidine to promote MEND, whereas pentalysine (Lys5) cannot. The inclusion of 0.5 mM GTPγS resulted in a partial inhibition of the MEND response to one Ca transient, as verified by two sets of experiments with seven and eight observations in the presence of GTPγS. For three reasons, we conclude that GTPγS specifically increases the variability of MEND occurrence with spermidine at a first Ca transient, noted in connection with Fig. 6 B . First, GTPγS does not blunt MEND in the presence of EDA ( Fig. 6 D ). Second, individual MEND responses in the presence of GTPγS amounted to >60% of the cell surface. And third, as described next, MEND responses at a second Ca transient brought Cm closer to the "control" MEND values. Fig. 8 E describes further experiments using two Ca influx episodes of 15 s separated by 2 min to induce MEND. All agents tested were added to pipette solutions. Cytoskeleton modifiers (3 µM latrunculin A, 10 µM phalloidin, and 30 µM colchicine) were without a significant effect, as were cyclosporin (CsA; 5 µM); FK506 (10 µM); calmidazolium (CALMZ; 12 µM); overexpression of dominant-negative K44A dynamin 2 with GFP to identify transfected cells; the dynamin inhibitor, dynasore (200 µM) ( Newton et al., 2006 ); and an unmyristolated dynamin inhibitor peptide (50 µM; DynPep; Tocris Bioscience). As noted above, MEND was less affected by GTPγS (0.5 mM) using two Ca influx episodes than with one episode. We tested for a role of Ca-activated transglutaminases because polyaminylation was suggested earlier to play a role in endocytosis ( Davies et al., 1980 ). Inhibitors of transglutaminases (e.g., dansylcadaverine [ Davies et al., 1980 ] and Z-DON-Val-Pro-Leu-OMe; Zedira) and amino oxidases (1 mM; aminoguanidine [AG]) ( Brunton et al., 1991 ) had small inhibitory effects, equivalent to GTPγS. We turn now to the membrane itself. As noted in the Introduction, a role for SMases and ceramide generated by SMases appeared attractive, because exocytic events might bring both SMases and ceramide into the extracellular membrane surface. Figs. 9 – 11 document the potential of SMases to generate MEND as well as arguments against a major role for SMases and ceramide in Ca-activated MEND. Figure 9. Activation of MEND by the extracellular application of 1 U/ml Bacillus cereus SMase in BHK fibroblasts with Na-free solutions. (A) BHK cell perfused for >2 min with Na-, ATP-, and GTP-free cytoplasmic solution. The application of 1 mM Ca from outside has no effect on Cm, whereas the application of Ca with SMase causes a 54% drop of Cm at a peak rate of 12% per second. Membrane current (I m ) shows no response, access resistance (R a ) increases by 10%, and membrane conductance increases transiently by 0.8 nS in parallel with the first derivative of Cm (−dC m /dt). (B) Cytoplasmic application of SMases does not cause MEND. Perfusion of purified SMase into the cytoplasm of a BHK cell causes at most 12% decline of Cm at the same concentration that causes >50% decline of Cm from outside within seconds. (C) Reversal of SMase-induced MEND. SMase application as in A caused on average a 53% fall of Cm within 15 s. With 6 mM ATP in the cytoplasmic solution (left), Cm recovered toward baseline by 60% over 5 min, whereas Cm did not recover in the absence of nucleotides (right). MEND induced by extracellular SMases Fig. 9 describes MEND induced within seconds in BHK cells by the extracellular application of SMase from Bacillus cereus . Results in Fig. 9 (A and C) are with the commercial preparation (1 U/ml; Sigma-Aldrich), and results in B are with a purified enzyme ( Ago et al., 2006 ). Although the commercial preparation contains additional enzymatic activities ( Ramu et al., 2007 ), results for the two preparations were indistinguishable. Further, we demonstrate in Fig. S10 that recombinant bacterial SMase from Bacillus anthrax is similarly effective to induce MEND. Bacillus cereus SMase requires Ca (or manganese) to adsorb to the surface of cells ( Tomita et al., 1983 ). Therefore, solutions with 0.5 mM of free extracellular Ca (0.5 mM EGTA with 1.0 mM of added Ca) were used. When using cells that expressed cardiac NCX1, we used Na-free, Li-based cytosolic solutions to avoid Ca influx. Fig. 9 A shows records of cell electrical parameters determined by square wave voltage perturbation. In this experiment, the cytoplasmic solution contained no ATP or GTP to mimic ATP-depleted conditions of the previous cellular study ( Zha et al., 1998 ). As shown first, the application and removal of 2 mM Ca have no effect under these Na-free conditions. Upon applying SMase, together with Ca, Cm (46 pF) begins to decrease within a few seconds, achieves a maximal rate of decline of >12% per second, and stabilizes at about one half of the initial value. A small, transient rise of cell conductance mirrors the rate of change of Cm (dC m /dt), whereas membrane current (I m ) and access resistance (R a ) do not change. Because sphingomyelin is present mostly in the outer plasmalemma monolayer, we tested whether SMase has any effect from the cytoplasmic side. Representative for five similar experiments, Fig. 9 B shows that perfusion of purified SMase (5 µg/ml) into the cytoplasm of BHK cells in the presence of 5 µM of free Ca (5 mM EGTA with 4.5 mM Ca) caused at most a 12% decrease of Cm over 4 min, whereas the application of the same enzyme concentration to the outside causes a MEND response amounting to 65% of the cell surface in a few seconds. Fig. 9 C shows one Cm record of SMase-induced MEND with high ATP and GTP concentrations (8 and 0.2 mM, respectively) and one without nucleotides, whereby Cm is normalized to its value at the start of the experiments. Composite results for four and five observations, respectively, are given as data points with error bars. In the presence of ATP, Cm recovered for the most part over several minutes after MEND, whereas there was no recovery in the absence of ATP. Membrane internalized with SMase treatment was found previously to recycle back to the cell surface by following transferrin receptor trafficking ( Zha et al., 1998 ). Using the optical approaches described in Materials and methods, Fig. S2 shows that SMase-induced MEND internalizes membrane and Na/Ca exchangers in equivalent fractional amounts. Failure to confirm a role for secreted acid SMase in Ca-activated MEND In the recent article by Tam et al. (2010) , a role for acid SMases in Ca-activated endocytosis was supported by multiple experimental approaches. We describe here equivalent experiments with BHK cells using chemical probes that provided arguments for SMase involvement in endocytosis. Our results for both probes are inconsistent with the involvement of secreted SMases in MEND. Desipramine treatments do not block MEND The amphipathic drug, desipramine, is considered to be a powerful reagent to displace acid SMases from membranes and over time to promote its degradation ( Tam et al., 2010 ). In the study of Tam et al., cells were treated with 50 µM desipramine for 1 h. Thereafter, endocytosis in response to cell wounding appears to be blocked because FM dye uptake in the protocol used is blocked. Using equivalent desipramine treatments, we do not find significant inhibition of MEND responses in our protocols. To ensure that desipramine treatment was adequate, we incubated BHK cells with 100 µM desipramine for 1 h before removing them from dishes, and thereafter we incubated cells again for 1 h at 37°C with 100 µM desipramine in the absence of serum. In some experiments, we also added 100 µM desipramine to both cytoplasmic and extracellular solutions to promote the loss of SMase activities. As described in Fig. 10 A , MEND responses to Ca influx in the presence of high ATP (8 mM, as in Fig. 3 A ) were entirely normal, amounting to >50% of the cell surface on average ( n = 7). As shown in Fig. 10 B , MEND responses to Ca influx in the presence of 1 mM spermidine (i.e., as in Fig. 3 B ) were entirely normal, amounting to loss of ∼50% of the cell surface on average ( n = 7) within a few seconds. Figure 10. Desipramine treatment does not block MEND, whereas BEL treatment blocks MEND but not exocytosis. (A) ATP-dependent MEND in response to a Ca transient is unchanged by the pretreatment of cells with 100 µM desipramine for 1 h in serum-free media, followed by further incubation with 100 µM desipramine for 1 h and execution of experiments with 100 µM desipramine in both cytoplasmic and extracellular solutions. (B) Similar treatment with desipramine fails to inhibit spermidine-dependent MEND in the absence of ATP. (C) Same solutions as in A. BHK-NCX1 cells, which were pretreated with 50 µM BEL for 1 h in serum-free media, show robust Ca-activated exocytosis, with Cm doubling over three Ca influx episodes while endocytic responses are potently inhibited. (D) Same solutions as in B, with BEL treatment as in C. BEL treatment does not block exocytic responses that occur in the absence of ATP and presence of cytoplasmic spermidine (1 mM). However, endocytic responses are completely suppressed. MEND and Ca-activated exocytosis can occur independently A second argument of Tam et al. (2010) for a role of secreted SMase in endocytic responses, subsequent to cell wounding, is that endocytosis was blocked when exocytosis was blocked, thereby establishing a causal relationship. As a means to block exocytosis, cells were treated with a high concentration (50 µM) of the alkylating "active site" reagent, bromoenol lactone (BEL), which was suggested to block exocytosis. As described in Fig. 10 C , we find that the equivalent BEL treatments of BHK cells indeed fully block endocytic responses, subsequent to Ca influx. However, we find that exocytic responses continue robustly with multiple Ca influx cycles, resulting in a doubling of membrane area in response to multiple Ca transients. We note that the conditions of experiments presented in Fig. 10 C are otherwise identical to those used in Fig. 10 A (i.e., with 8 mM of cytoplasmic ATP). Similarly, as described in Fig. 10 D , we find that exocytic responses continue robustly in the equivalent protocols with 1 mM of cytoplasmic spermidine and no ATP. Over several cycles of Ca influx, exocytosis results in a full doubling membrane area, whereas endocytosis is entirely blocked. Thus, the reagents used by Tam et al. (2010) provide no evidence in our hands for the hypothesis that acid SMase might be involved in Ca-activated MEND responses. MEND occurs in cardiac myocytes without exocytosis and can be initiated by spontaneous Ca release Also relevant to the conclusions of Tam et al. (2010) is that MEND occurs in cardiac myocytes without preceding exocytosis, as we describe in Fig. 11 . Because BHK and HEK293 cells are highly proliferative and do not exhibit global Ca transients, we tested for the existence of MEND in adult mouse and rat cardiac myocytes, using native NCX1 to generate Ca influx and to initiate cycles of spontaneous Ca release. Indeed, outward NCX1 currents (0.2–0.5-nA peaks) caused large declines of Cm in both mouse and rat myocytes. Experiments described in Fig. 11 use the modified standard solution, described in Materials and methods, with 6 mM ATP and no polyamines. Fig. 11 A shows an example from a rat myocyte. Activation of reverse exchange current for just 2 s initiates a reversible endocytic response. Cm declines rapidly during Ca influx and then more slowly as spontaneous contractile activity initiated by Ca influx declines. We stress the time course of MEND in relation to the second and third Ca influx episodes: MEND clearly continues after Ca influx is terminated, suggesting that internal Ca release can drive MEND. Typical for all myocytes studied, Cm recovers progressively more slowly after each MEND response. Figure 11. MEND occurs in cardiac myocytes without preceding exocytic responses and can be induced by spontaneous cycles of Ca release. (A) Rat cardiac myocyte with 6 mM of cytoplasmic ATP. MEND develops rapidly during activation of NCX1 and continues for several seconds after terminating Ca influx as cells continued to contract spontaneously. MEND reversal in myocytes is labile, becoming substantially slower from one MEND cycle to the next. Reversal was negligible when MEND was allowed to proceed to a final loss of >30% of the cell surface. (B–D) Different patterns of MEND responses observed in mouse cardiac myocytes. (B) Mouse myocyte with contraction blocked by 17 µM blebbistatin. Na/Ca exchange current is relatively large. MEND begins within 3 s of activating Ca influx, and MEND terminates when exchange current is deactivated. (C) Mouse myocyte without blebbistatin. Brief activation of reverse exchange current promotes spontaneous cycles of Ca release, accompanied by transient current changes that are evident in the current record. MEND begins with no exocytic response and terminates spontaneously as spontaneous contractile activity terminates. (D) Mouse myocyte without blebbistatin. Exchange current is negligibly small. The application of Ca activates spontaneous cycles of Ca release accompanied by transient current changes. MEND begins after extracellular Ca has been removed and during spontaneous contractile activity, and it terminates spontaneously with no evident relationship to the termination of spontaneous activity. The bright field record of this experiment is provided as Video 3. Because myocytes contract vigorously in this protocol, we tested the possibility that contraction might cause T-tubules to be physically pinched off by contractile activity. To do so, we used high concentrations of the myosin 2 inhibitor, blebbistatin (17 µM), in both cytoplasmic and extracellular solutions to block contraction ( Farman et al., 2008 ). In >20 observations, MEND remained robust when contraction was abolished in both rat and mouse myocytes. As shown in Fig. 11 B for a mouse myocyte, activation of exchange current for 10 s resulted in Cm declines of >25% after a 2–3-s delay with no preceding exocytic response. Thus, it is unlikely that MEND is caused by contractile activity or by the exocytosis of ceramide/SMase-rich membrane. Depending on myocyte batch and time after isolation, exchange currents can be very small or negligible in mouse myocytes. Fig. 11 (C and D) illustrates that in such myocytes, the application of extracellular Ca initiated cycles of spontaneous Ca release and contraction that were accompanied by MEND, which occurred after termination of Ca influx. Spontaneous activity in these myocytes can be followed electrophysiologically via transient current changes that occur synchronously with contraction. In Fig. 11 C , spontaneous activity occurs during the application of Ca and terminates synchronously with MEND after Ca influx is deactivated. In Fig. 11 D , Ca was applied twice for just 3 s. On the first Ca application, a single cycle of Ca release was evoked. The second application of Ca, however, caused a prolonged train of Ca release cycles. MEND both begins and terminates after the removal of extracellular Ca, demonstrating that MEND can be initiated by internal Ca release in myocytes. A bright field optical record of this experiment, provided as Video 3, documents that MEND is occurring with modest contractile activity that does not cause prolonged myocyte shortening. DISCUSSION Large Ca transients promote large endocytic responses in BHK cells enriched in ATP, polyamines, or cholesterol. As summarized in cartoon form in Fig. 12 , the underlying mechanisms appear to be "non-canonical." Ca acts via multiple calmodulin-independent mechanisms, whereas ATP acts via generation of PIP 2 without classical adapters or dynamins. Membrane recycling can occur in two different ways. Ca influx can cause ATP-independent membrane fusion followed by ATP-dependent endocytosis ( Fig. 3 A ), or Ca influx can cause ATP-independent endocytosis followed by ATP-dependent vesicle recycling to the cell surface ( Fig. 3 B ). Thus, these protocols should facilitate analysis of multiple partial reactions of membrane recycling. We discuss first the relevance of Ca-activated MEND described here to previous work and then the mechanisms by which Ca promotes MEND, bringing results from companion articles ( Fine et al., 2011 ; Hilgemann and Fine, 2011 ) to bear on this study. Finally, we discuss how Ca-activated MEND may be promoted by PIP 2 , polyamines, and cholesterol. Figure 12. Ca-activated endocytosis involves three distinct processes. (1) Large Ca transients cause long-term changes of the outer plasmalemma monolayer that promote endocytosis ( Hilgemann and Fine, 2011 ). Possible mechanisms include the generation of lipids that promote the growth of lipid domains (i.e., the coalescence of small domains to large domains) and/or the translocation of such lipids to the outer monolayer. (2) In synergy with spermidine, high cytoplasmic Ca causes inner monolayer changes that promote endocytosis. One possible mechanism is the coalescence of lipid domains by Ca- and lipid-binding proteins (e.g., annexins) ( Chasserot-Golaz et al., 2005 ). (3) After membrane modification by Ca, the ATP-dependent synthesis of PIP 2 promotes MEND by Ca-independent mechanisms. The clustering of PIP 2 and PIP 2 -binding proteins may promote transbilayer domain coupling and membrane buckling that in turn drives endocytosis. The physiological relevance of Ca-activated MEND Ca transients used to trigger MEND in this study usually exceed 100 µM of free Ca ( Fig. 1 ). Thus, the results are clearly relevant to cell wounds that flood cells with Ca ( Idone et al., 2008 ). As noted in the Introduction, such wounds are closed by fusion of internal membranes to the cell surface, followed by endocytosis of plasmalemma into compartments that do not acidify ( Cocucci et al., 2004 ). Besides having relatively high Ca requirements, similar to cell wound–induced endocytosis, the vesicles formed during MEND also do not readily acidify upon internalization ( Figs. 2 B and S1 B). The relevance of Ca-activated MEND to other physiological endocytic mechanisms studied previously is less secure. MEND can clearly be triggered by smaller Ca transients when multiple Ca transients occur (e.g., Fig. 3 B ). In myocytes, MEND can be induced by cycles of spontaneous Ca release initiated by "trigger" amounts of Ca influx ( Fig. 11 A ). Thus, it is established that physiological Ca signals can initiate MEND. When cytoplasmic free Ca is clamped by Ca buffers, MEND develops over the free Ca range of 10 to 35 µM ( Fig. 4 D ). With the exception of skeletal muscle, this represents a range that may occur locally at Ca influx and release sites, but not globally ( Clapham, 2007 ). "Excessive endocytosis" in secretory cells ( Thomas et al., 1994 ; Smith and Neher, 1997 ; Engisch and Nowycky, 1998 ) and "bulk endocytosis" in synapses ( Clayton et al., 2009 ) are both clathrin independent, consistent with a mechanistic relationship to Ca-activated MEND described here. However, dynamin 1 is implicated to trigger and/or drive bulk endocytosis ( Clayton et al., 2009 ), whereas dynamins appear to play no role in MEND. Recent knockout studies in mice show that dynamin 1 ( Ferguson et al., 2007 ) and AP2 ( Kim and Ryan, 2009 ) are in fact not required for basal neuronal function (i.e., membrane cycling). Possibly therefore, mechanisms related to MEND maintain basal membrane recycling in those animal models. In this context, MEND might represent a core endocytic mechanism that becomes exploited, modified, and/or regulated by dynamins and other classical endocytic proteins. Recently, fast Ca-activated, clathrin/dynamin-independent endocytosis has been described in astrocytes ( Jiang and Chen, 2009 ), reminiscent of Ca-activated MEND. In skeletal muscle, intense activity promotes the reversible formation of vacuoles from transverse tubules ( Lännergren et al., 2002 ), and the MEND responses described here in cardiac myocytes ( Fig. 11 ) may be related. Ca-activated MEND could play many roles in cardiac myocytes. In pathological circumstances, the removal of Na/Ca exchangers from the plasma membrane would protect from Ca overload ( Shen et al., 2007 ). Toward a mechanistic understanding of MEND Our initial goal was to determine which classical endocytic proteins control and/or drive Ca-activated MEND. However, no positive outcomes emerged. We first addressed clathrin; to our knowledge, it has never been questioned that clathrin-dependent endocytic processes require cytoplasmic potassium, and our experiments all use potassium-free solutions. Second, in the case of ATP-dependent MEND, a clathrin-binding domain of amphiphysin at a high concentration had no disrupting effect ( Fig. 8 C ). Third, the formation and fission of large vesicles (Fig. S12) are not consistent with clathrin involvement, and rapid formation of vacuoles ( Fig. 2 A ) seems questionable for clathrin-dependent endocytosis. In protocols that induce MEND under ATP-free conditions, PIP 2 will be depleted by lipid phosphatases ( Hilgemann, 2007 ; Falkenburger et al., 2010 ). If not immediately depleted, Ca transients will rapidly deplete PIP 2 by PLC activation ( Yaradanakul et al., 2007 ). However, MEND still occurs, often at a second or third Ca transient (e.g., Fig. 6 B ), as well as in the presence of a high GTPγS concentration ( Figs. 5, B and D , and 6 D ). Thus, polyamine-dependent MEND clearly does not require PIP 2 and might even be inhibited by PIP 2 . Therewith, a role for adapters and G proteins that use PH domains is eliminated. In no protocol did dynamin inhibitory peptides or dominant-negative dynamins effectively block MEND ( Fig. 8 ). Dynamin cycling requires GTP hydrolysis ( Song et al., 2004 ). However, GTPγS at high concentrations does not block ATP-dependent MEND when PLCs are simultaneously inhibited and thereby PIP 2 hydrolysis is blocked ( Fig. 5 B ). GTPγS does not block PIP 2 -activated MEND in the presence of Ca chelators ( Fig. 5 D ), and it does not block polyamine-dependent MEND effectively ( Figs. 6 D and 8, D and E). Furthermore, reagents that inhibit calmodulin-dependent processes and disrupt actin cytoskeleton had no clear effect on MEND ( Fig. 8 ). In summary, we have uncovered no evidence that Ca-activated MEND in BHK and HEK293 cells involves adapters, dynamins, or actin cytoskeleton. The mechanisms of Ca action in MEND Ca-activated MEND is strongly dependent on physical properties of the membrane itself. It is blocked by brief β-cyclodextrin treatments ( Fig. 8 A ). It is drastically promoted by cholesterol enrichment by either a direct method ( Fig. 4 F ) or by cholesterol–HPCD complexes ( Fig. 7 ). Exocytosis is then overwhelmed by MEND with >50% of the cell surface internalized within a few seconds. Several observations suggest that exocytosis is not a prerequisite for the occurrence of MEND. First, MEND responses in the presence of spermidine or after cholesterol enrichment are extremely fast and large, and they can occur with almost no preceding exocytic phase. Second, spermidine-dependent MEND facilitates from one Ca transient to the next, so that exocytic responses nearly exhaust the supply of vesicles before MEND occurs. Third, fast Ca-activated MEND occurs in ventricular cardiac myocytes that do not display Ca-activated exocytic responses ( Fig. 11 ). Ca appears to act by both long-term and immediate mechanisms. Regarding the long-term effect, our central observation is that large Ca transients facilitate subsequent MEND responses for several minutes after Ca transients subside. Triggers for a subsequent MEND response include a rise of cytoplasmic PIP 2 ( Fig. 5, C and D ), a second Ca transient ( Fig. 6 B ), membrane enrichment with cholesterol ( Fig. 7 C ), and the extracellular application of certain detergents ( Hilgemann and Fine, 2011 ). Given that rather low concentrations of nonionic detergents cause MEND that is similar to Ca-activated MEND ( Fine et al., 2011 ), the long-term effect of Ca may be the generation of MEND-promoting lipids. Ca-binding proteins of an unknown identity, dubbed "scramblases," facilitate movement of lipids between monolayers in all eukaryotic cells when free Ca rises into the range of tens of micromolars ( Bevers and Williamson, 2010 ). Thus, the immediate effect of Ca could be to promote the translocation of a MEND-promoting lipid from the cytoplasmic to the extracellular monolayer, independent of membrane fusion–derived lipids. An alternative hypothesis arises from the fact that Ca-activated MEND internalizes primarily membrane with a high content of liquid-ordered ( Lo ) membrane ( Hilgemann and Fine, 2011 ). According to one theoretical model, nano- to microscopic membrane buckling can cause the coalescence of extracellular Lo domains into buds ( Minami and Yamada, 2007 ). In this context, Ca might act primarily through transmembrane or membrane-binding proteins that upon binding Ca induce the formation of membrane "caps" and "valleys," followed by domain coalescence, budding, and vesiculation. Failure to implicate ceramide or phospholipases in Ca-activated MEND Phospholipases provide a plethora of mechanisms that might generate MEND-promoting lipids. We find up to now that PLCs and PLA 2 s do not promote endocytic responses, whereas extracellularly applied bacterial SMases are very effective ( Figs. 9 , S2, and S10), consistent with a previous report for ATP-depleted fibroblasts ( Zha et al., 1998 ). The generation of ceramide is relevant because large Ca transients ( Babiychuk et al., 2008 ) and metabolic stress ( Pavoine and Pecker, 2009 ) can both promote sphingomyelin breakdown. In giant liposomes, ceramide generated by SMases coalesces into domains that rapidly vesiculate to the opposite membrane side ( Bollinger et al., 2005 ). Thus, accumulation of ceramide during ATP depletion ( Fig. 3 ) and over multiple Ca-transient cycles ( Figs. 9 and 10 ) might facilitate MEND. Nevertheless, using the same interventions that Tam et al. (2010) used with positive outcomes, we find no support for SMase and/or ceramide involvement in Ca-activated MEND. In this regard, it is not certain that the assays used by Tam et al. monitor the same exocytic and endocytic responses occurring in our experiments. Ca-activated exocytosis is not blocked by tetanus toxin light chain in the cells used by us ( Wang and Hilgemann, 2008 ), although tetanus toxins block membrane resealing after cell wounding in 3T3 cells ( Togo et al., 1999 ) and in sea urchin eggs and embryos ( Bi et al., 1995 ). On the one hand, exocytosis in our experiments may be mechanistically different from exocytosis during cell wound responses. On the other hand, different sensitivities to tetanus toxins may reflect differences in the SNAREs expressed in different cell types ( Wang and Hilgemann, 2008 ). Neither ATP-dependent nor polyamine-dependent MEND is suppressed by prolonged exposure to high concentrations of desipramine and/or its acute application on both membrane sides ( Fig. 10 ), suggested to suppress acid SMase activities ( Tam et al., 2010 ). The reagent used by Tam et al. to block exocytosis, BEL, does not do so in our protocols ( Fig. 10, C and D ). Rather, it powerfully blocks endocytosis while allowing Ca-activated exocytosis to occur unabated. Unusually, exocytosis continues for prolonged periods after Ca influx is terminated ( Fig. 10, C and D ). This may reflect an unbridling of the exocytic mechanism, but alternatively a very effective blockade of endocytosis may reveal "hidden," opposing exocytic events. Clearly, the hypothesis of Tam et al. now requires support by other lines of evidence that Niemann-Pick type A mutations cause defects in endocytic pathways. The blockade of both ATP- and polyamine-promoted MEND by BEL opens a new pathway to elucidate the molecular basis of Ca-activated MEND. The iPLA 2 s that BEL inhibits most potently act as either mixed or selective PLA1/PLA 2 s ( Yan et al., 2005 ; Cedars et al., 2009 ), whereby the generation of 2-arachidonoyl lysophosphatidylcholine and its metabolites would be inhibited. From a companion study ( Fine et al., 2011 ), it is known that lysophospholipids can induce MEND, similar to detergents. A caveat is that exogenous lysolipids dissociate rapidly from cell membranes, whereas the action of Ca to promote MEND is long-lived. We stress for now, therefore, that BEL may well be acting nonspecifically at the concentrations used here, and that cysteines, serines, and amines can all potentially be covalently modified. The mechanisms by which PIP 2 , polyamines, and cholesterol promote MEND Given that classical endocytic proteins and actin cytoskeleton are not involved in MEND and that MEND internalizes selectively ordered membrane domains ( Fine et al., 2011 ; Hilgemann and Fine, 2011 ), PIP 2 , polyamines, and cholesterol enrichment must all act in pathways that lead to domain coalescence, budding, and fission. PIP 2 synthesis is coupled to the organization of most endocytic processes described to date ( Doherty and McMahon, 2009 ), and PIP 2 must be cleaved or dephosphorylated for fission to proceed in multiple cases, including actin-dependent endocytosis in yeast ( Stefan et al., 2002 ) and phagocytosis in macrophages ( Botelho et al., 2000 ). It has long been suggested that "lipid rafts," which are enriched in sphingomyelin and cholesterol on the extracellular side, are enriched in PIP 2 on the cytoplasmic side ( Liu et al., 1998 ). Although the biophysical basis for coupling across monolayers remains enigmatic, our data forces us to suggest that PIP 2 on the cytoplasmic side organizes the membrane for endocytosis by promoting the coalescence of membrane domains on the extracellular side. We can neither support nor contradict an involvement of membrane proteins at this time: PIP 2 might promote the association of PIP 2 -binding proteins into complexes or promote conformational changes of membrane proteins that cause domain coalescence via membrane buckling. In either case, it will be of great interest to determine whether PIP 2 must be dephosphorylated before fission proceeds in delayed PIP 2 -dependent MEND. From the extracellular side, it is described in a companion article ( Fine et al., 2011 ) that certain amphipathic compounds (e.g., dodecylsulfate) promote a reorganization of membrane domains that predisposes them to internalize while blocking the final fission event until they are washed away. By a similar principle, PIP 2 on the cytoplasmic side might promote membrane reorganization that supports endocytosis but still hinder the final fission events, a hindrance that might be overcome by local activity of either phosphatases or dynamins. In this connection, we note that "excessive" endocytosis in chromaffin cells may be inhibited by PIP 2 because it is enhanced by overexpression of the inositol 5-phosphatase domain of synaptojanin 1 (Milosevic, I., personal communication). Polyamine/Ca-activated MEND may be similar because multiple Ca transients in ATP-depleted cells, which progressively deplete PIP 2 ( Yaradanakul et al., 2007 ), cause progressively larger Ca/polyamine-activated MEND responses ( Fig. 6 B ). Spermidine overcomes the requirement for PIP 2 in Ca-activated MEND. Up to now, we have only been able to negate prominent candidate mechanisms in this effect ( Fig. 8 D ). These include actin bundling, Ca-activated transglutaminases, and amino oxidases. Direct effects of Ca and polyamines on the membrane require further attention. Polyamines might promote anionic lipids, especially phosphatidylserine, to form domains that substitute for PIP 2 -containing domains in promoting MEND. Both old and new studies provide a reminder that the Ca-binding sites that activate MEND can potentially be anionic phospholipids: Micromolar polyamine concentrations greatly reduce Ca requirements for aggregation and fusion of vesicles containing acidic phospholipids and cholesterol ( Schuber et al., 1983 ). In membranes containing zwitterionic lipids, PIP 2 , and cholesterol, Ca at concentrations of 2–10 µM can cause the formation of PIP 2 -rich domains ( Levental et al., 2009 ). From many possible protein effectors, Ca/lipid-binding annexins are clearly attractive candidates, as individual annexins have been shown to promote the formation of membrane domains ( Chasserot-Golaz et al., 2005 ). Cholesterol may facilitate both domain coalescence and membrane bending ( Groves, 2007 ; Sarasij et al., 2007 ). The remarkable dependence of Ca-activated MEND on the membrane cholesterol content ( Figs. 4 F and 7 ) underscores that endocytosis may potentially regulate the cholesterol content of the membrane. In this connection, we note the probable explanation for one confusing experimental result related to cholesterol studies: Cyclodextrins used to extract cholesterol can cause substantial declines of membrane capacitance primarily by extracting membrane constituents, rather than by promoting endocytosis (see Figs. S10 and S11). In summary, Ca promotes MEND by two mechanisms that do not appear to require clathrin, dynamins, or F-actin turnover. ATP promotes MEND by supporting the synthesis of PIP 2 . Ca promotes polyamine-dependent MEND by one mechanism that requires the immediate presence of Ca and another mechanism that accumulates over multiple Ca transients, separated by many seconds and even minutes. Calmodulin does not appear to be involved in either of these actions. Cholesterol content of the membrane is a strong determinant of the occurrence and extent of Ca-activated MEND. The physiological relevance of Ca-activated MEND Ca transients used to trigger MEND in this study usually exceed 100 µM of free Ca ( Fig. 1 ). Thus, the results are clearly relevant to cell wounds that flood cells with Ca ( Idone et al., 2008 ). As noted in the Introduction, such wounds are closed by fusion of internal membranes to the cell surface, followed by endocytosis of plasmalemma into compartments that do not acidify ( Cocucci et al., 2004 ). Besides having relatively high Ca requirements, similar to cell wound–induced endocytosis, the vesicles formed during MEND also do not readily acidify upon internalization ( Figs. 2 B and S1 B). The relevance of Ca-activated MEND to other physiological endocytic mechanisms studied previously is less secure. MEND can clearly be triggered by smaller Ca transients when multiple Ca transients occur (e.g., Fig. 3 B ). In myocytes, MEND can be induced by cycles of spontaneous Ca release initiated by "trigger" amounts of Ca influx ( Fig. 11 A ). Thus, it is established that physiological Ca signals can initiate MEND. When cytoplasmic free Ca is clamped by Ca buffers, MEND develops over the free Ca range of 10 to 35 µM ( Fig. 4 D ). With the exception of skeletal muscle, this represents a range that may occur locally at Ca influx and release sites, but not globally ( Clapham, 2007 ). "Excessive endocytosis" in secretory cells ( Thomas et al., 1994 ; Smith and Neher, 1997 ; Engisch and Nowycky, 1998 ) and "bulk endocytosis" in synapses ( Clayton et al., 2009 ) are both clathrin independent, consistent with a mechanistic relationship to Ca-activated MEND described here. However, dynamin 1 is implicated to trigger and/or drive bulk endocytosis ( Clayton et al., 2009 ), whereas dynamins appear to play no role in MEND. Recent knockout studies in mice show that dynamin 1 ( Ferguson et al., 2007 ) and AP2 ( Kim and Ryan, 2009 ) are in fact not required for basal neuronal function (i.e., membrane cycling). Possibly therefore, mechanisms related to MEND maintain basal membrane recycling in those animal models. In this context, MEND might represent a core endocytic mechanism that becomes exploited, modified, and/or regulated by dynamins and other classical endocytic proteins. Recently, fast Ca-activated, clathrin/dynamin-independent endocytosis has been described in astrocytes ( Jiang and Chen, 2009 ), reminiscent of Ca-activated MEND. In skeletal muscle, intense activity promotes the reversible formation of vacuoles from transverse tubules ( Lännergren et al., 2002 ), and the MEND responses described here in cardiac myocytes ( Fig. 11 ) may be related. Ca-activated MEND could play many roles in cardiac myocytes. In pathological circumstances, the removal of Na/Ca exchangers from the plasma membrane would protect from Ca overload ( Shen et al., 2007 ). Toward a mechanistic understanding of MEND Our initial goal was to determine which classical endocytic proteins control and/or drive Ca-activated MEND. However, no positive outcomes emerged. We first addressed clathrin; to our knowledge, it has never been questioned that clathrin-dependent endocytic processes require cytoplasmic potassium, and our experiments all use potassium-free solutions. Second, in the case of ATP-dependent MEND, a clathrin-binding domain of amphiphysin at a high concentration had no disrupting effect ( Fig. 8 C ). Third, the formation and fission of large vesicles (Fig. S12) are not consistent with clathrin involvement, and rapid formation of vacuoles ( Fig. 2 A ) seems questionable for clathrin-dependent endocytosis. In protocols that induce MEND under ATP-free conditions, PIP 2 will be depleted by lipid phosphatases ( Hilgemann, 2007 ; Falkenburger et al., 2010 ). If not immediately depleted, Ca transients will rapidly deplete PIP 2 by PLC activation ( Yaradanakul et al., 2007 ). However, MEND still occurs, often at a second or third Ca transient (e.g., Fig. 6 B ), as well as in the presence of a high GTPγS concentration ( Figs. 5, B and D , and 6 D ). Thus, polyamine-dependent MEND clearly does not require PIP 2 and might even be inhibited by PIP 2 . Therewith, a role for adapters and G proteins that use PH domains is eliminated. In no protocol did dynamin inhibitory peptides or dominant-negative dynamins effectively block MEND ( Fig. 8 ). Dynamin cycling requires GTP hydrolysis ( Song et al., 2004 ). However, GTPγS at high concentrations does not block ATP-dependent MEND when PLCs are simultaneously inhibited and thereby PIP 2 hydrolysis is blocked ( Fig. 5 B ). GTPγS does not block PIP 2 -activated MEND in the presence of Ca chelators ( Fig. 5 D ), and it does not block polyamine-dependent MEND effectively ( Figs. 6 D and 8, D and E). Furthermore, reagents that inhibit calmodulin-dependent processes and disrupt actin cytoskeleton had no clear effect on MEND ( Fig. 8 ). In summary, we have uncovered no evidence that Ca-activated MEND in BHK and HEK293 cells involves adapters, dynamins, or actin cytoskeleton. The mechanisms of Ca action in MEND Ca-activated MEND is strongly dependent on physical properties of the membrane itself. It is blocked by brief β-cyclodextrin treatments ( Fig. 8 A ). It is drastically promoted by cholesterol enrichment by either a direct method ( Fig. 4 F ) or by cholesterol–HPCD complexes ( Fig. 7 ). Exocytosis is then overwhelmed by MEND with >50% of the cell surface internalized within a few seconds. Several observations suggest that exocytosis is not a prerequisite for the occurrence of MEND. First, MEND responses in the presence of spermidine or after cholesterol enrichment are extremely fast and large, and they can occur with almost no preceding exocytic phase. Second, spermidine-dependent MEND facilitates from one Ca transient to the next, so that exocytic responses nearly exhaust the supply of vesicles before MEND occurs. Third, fast Ca-activated MEND occurs in ventricular cardiac myocytes that do not display Ca-activated exocytic responses ( Fig. 11 ). Ca appears to act by both long-term and immediate mechanisms. Regarding the long-term effect, our central observation is that large Ca transients facilitate subsequent MEND responses for several minutes after Ca transients subside. Triggers for a subsequent MEND response include a rise of cytoplasmic PIP 2 ( Fig. 5, C and D ), a second Ca transient ( Fig. 6 B ), membrane enrichment with cholesterol ( Fig. 7 C ), and the extracellular application of certain detergents ( Hilgemann and Fine, 2011 ). Given that rather low concentrations of nonionic detergents cause MEND that is similar to Ca-activated MEND ( Fine et al., 2011 ), the long-term effect of Ca may be the generation of MEND-promoting lipids. Ca-binding proteins of an unknown identity, dubbed "scramblases," facilitate movement of lipids between monolayers in all eukaryotic cells when free Ca rises into the range of tens of micromolars ( Bevers and Williamson, 2010 ). Thus, the immediate effect of Ca could be to promote the translocation of a MEND-promoting lipid from the cytoplasmic to the extracellular monolayer, independent of membrane fusion–derived lipids. An alternative hypothesis arises from the fact that Ca-activated MEND internalizes primarily membrane with a high content of liquid-ordered ( Lo ) membrane ( Hilgemann and Fine, 2011 ). According to one theoretical model, nano- to microscopic membrane buckling can cause the coalescence of extracellular Lo domains into buds ( Minami and Yamada, 2007 ). In this context, Ca might act primarily through transmembrane or membrane-binding proteins that upon binding Ca induce the formation of membrane "caps" and "valleys," followed by domain coalescence, budding, and vesiculation. Failure to implicate ceramide or phospholipases in Ca-activated MEND Phospholipases provide a plethora of mechanisms that might generate MEND-promoting lipids. We find up to now that PLCs and PLA 2 s do not promote endocytic responses, whereas extracellularly applied bacterial SMases are very effective ( Figs. 9 , S2, and S10), consistent with a previous report for ATP-depleted fibroblasts ( Zha et al., 1998 ). The generation of ceramide is relevant because large Ca transients ( Babiychuk et al., 2008 ) and metabolic stress ( Pavoine and Pecker, 2009 ) can both promote sphingomyelin breakdown. In giant liposomes, ceramide generated by SMases coalesces into domains that rapidly vesiculate to the opposite membrane side ( Bollinger et al., 2005 ). Thus, accumulation of ceramide during ATP depletion ( Fig. 3 ) and over multiple Ca-transient cycles ( Figs. 9 and 10 ) might facilitate MEND. Nevertheless, using the same interventions that Tam et al. (2010) used with positive outcomes, we find no support for SMase and/or ceramide involvement in Ca-activated MEND. In this regard, it is not certain that the assays used by Tam et al. monitor the same exocytic and endocytic responses occurring in our experiments. Ca-activated exocytosis is not blocked by tetanus toxin light chain in the cells used by us ( Wang and Hilgemann, 2008 ), although tetanus toxins block membrane resealing after cell wounding in 3T3 cells ( Togo et al., 1999 ) and in sea urchin eggs and embryos ( Bi et al., 1995 ). On the one hand, exocytosis in our experiments may be mechanistically different from exocytosis during cell wound responses. On the other hand, different sensitivities to tetanus toxins may reflect differences in the SNAREs expressed in different cell types ( Wang and Hilgemann, 2008 ). Neither ATP-dependent nor polyamine-dependent MEND is suppressed by prolonged exposure to high concentrations of desipramine and/or its acute application on both membrane sides ( Fig. 10 ), suggested to suppress acid SMase activities ( Tam et al., 2010 ). The reagent used by Tam et al. to block exocytosis, BEL, does not do so in our protocols ( Fig. 10, C and D ). Rather, it powerfully blocks endocytosis while allowing Ca-activated exocytosis to occur unabated. Unusually, exocytosis continues for prolonged periods after Ca influx is terminated ( Fig. 10, C and D ). This may reflect an unbridling of the exocytic mechanism, but alternatively a very effective blockade of endocytosis may reveal "hidden," opposing exocytic events. Clearly, the hypothesis of Tam et al. now requires support by other lines of evidence that Niemann-Pick type A mutations cause defects in endocytic pathways. The blockade of both ATP- and polyamine-promoted MEND by BEL opens a new pathway to elucidate the molecular basis of Ca-activated MEND. The iPLA 2 s that BEL inhibits most potently act as either mixed or selective PLA1/PLA 2 s ( Yan et al., 2005 ; Cedars et al., 2009 ), whereby the generation of 2-arachidonoyl lysophosphatidylcholine and its metabolites would be inhibited. From a companion study ( Fine et al., 2011 ), it is known that lysophospholipids can induce MEND, similar to detergents. A caveat is that exogenous lysolipids dissociate rapidly from cell membranes, whereas the action of Ca to promote MEND is long-lived. We stress for now, therefore, that BEL may well be acting nonspecifically at the concentrations used here, and that cysteines, serines, and amines can all potentially be covalently modified. The mechanisms by which PIP 2 , polyamines, and cholesterol promote MEND Given that classical endocytic proteins and actin cytoskeleton are not involved in MEND and that MEND internalizes selectively ordered membrane domains ( Fine et al., 2011 ; Hilgemann and Fine, 2011 ), PIP 2 , polyamines, and cholesterol enrichment must all act in pathways that lead to domain coalescence, budding, and fission. PIP 2 synthesis is coupled to the organization of most endocytic processes described to date ( Doherty and McMahon, 2009 ), and PIP 2 must be cleaved or dephosphorylated for fission to proceed in multiple cases, including actin-dependent endocytosis in yeast ( Stefan et al., 2002 ) and phagocytosis in macrophages ( Botelho et al., 2000 ). It has long been suggested that "lipid rafts," which are enriched in sphingomyelin and cholesterol on the extracellular side, are enriched in PIP 2 on the cytoplasmic side ( Liu et al., 1998 ). Although the biophysical basis for coupling across monolayers remains enigmatic, our data forces us to suggest that PIP 2 on the cytoplasmic side organizes the membrane for endocytosis by promoting the coalescence of membrane domains on the extracellular side. We can neither support nor contradict an involvement of membrane proteins at this time: PIP 2 might promote the association of PIP 2 -binding proteins into complexes or promote conformational changes of membrane proteins that cause domain coalescence via membrane buckling. In either case, it will be of great interest to determine whether PIP 2 must be dephosphorylated before fission proceeds in delayed PIP 2 -dependent MEND. From the extracellular side, it is described in a companion article ( Fine et al., 2011 ) that certain amphipathic compounds (e.g., dodecylsulfate) promote a reorganization of membrane domains that predisposes them to internalize while blocking the final fission event until they are washed away. By a similar principle, PIP 2 on the cytoplasmic side might promote membrane reorganization that supports endocytosis but still hinder the final fission events, a hindrance that might be overcome by local activity of either phosphatases or dynamins. In this connection, we note that "excessive" endocytosis in chromaffin cells may be inhibited by PIP 2 because it is enhanced by overexpression of the inositol 5-phosphatase domain of synaptojanin 1 (Milosevic, I., personal communication). Polyamine/Ca-activated MEND may be similar because multiple Ca transients in ATP-depleted cells, which progressively deplete PIP 2 ( Yaradanakul et al., 2007 ), cause progressively larger Ca/polyamine-activated MEND responses ( Fig. 6 B ). Spermidine overcomes the requirement for PIP 2 in Ca-activated MEND. Up to now, we have only been able to negate prominent candidate mechanisms in this effect ( Fig. 8 D ). These include actin bundling, Ca-activated transglutaminases, and amino oxidases. Direct effects of Ca and polyamines on the membrane require further attention. Polyamines might promote anionic lipids, especially phosphatidylserine, to form domains that substitute for PIP 2 -containing domains in promoting MEND. Both old and new studies provide a reminder that the Ca-binding sites that activate MEND can potentially be anionic phospholipids: Micromolar polyamine concentrations greatly reduce Ca requirements for aggregation and fusion of vesicles containing acidic phospholipids and cholesterol ( Schuber et al., 1983 ). In membranes containing zwitterionic lipids, PIP 2 , and cholesterol, Ca at concentrations of 2–10 µM can cause the formation of PIP 2 -rich domains ( Levental et al., 2009 ). From many possible protein effectors, Ca/lipid-binding annexins are clearly attractive candidates, as individual annexins have been shown to promote the formation of membrane domains ( Chasserot-Golaz et al., 2005 ). Cholesterol may facilitate both domain coalescence and membrane bending ( Groves, 2007 ; Sarasij et al., 2007 ). The remarkable dependence of Ca-activated MEND on the membrane cholesterol content ( Figs. 4 F and 7 ) underscores that endocytosis may potentially regulate the cholesterol content of the membrane. In this connection, we note the probable explanation for one confusing experimental result related to cholesterol studies: Cyclodextrins used to extract cholesterol can cause substantial declines of membrane capacitance primarily by extracting membrane constituents, rather than by promoting endocytosis (see Figs. S10 and S11). In summary, Ca promotes MEND by two mechanisms that do not appear to require clathrin, dynamins, or F-actin turnover. ATP promotes MEND by supporting the synthesis of PIP 2 . Ca promotes polyamine-dependent MEND by one mechanism that requires the immediate presence of Ca and another mechanism that accumulates over multiple Ca transients, separated by many seconds and even minutes. Calmodulin does not appear to be involved in either of these actions. Cholesterol content of the membrane is a strong determinant of the occurrence and extent of Ca-activated MEND.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7186848/

Cardiovascular System and Lymphatic Vessels 1

Key Readings Index Structure, 561 Function, 565 Dysfunction/Responses to Injury, 566 Portals of Entry/Pathways of Spread, 580 Defense Mechanisms/Barrier Systems, 581 Disorders of Domestic Animals, 582 Disorders of Horses, 603 Disorders of Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats), 604 Disorders of Pigs, 606 Disorders of Dogs, 609 Disorders of Cats, 615 E-Glossary 10-1 Glossary of Abbreviations and Terms ABP —Arterial blood pressure ADH —Antidiuretic hormone AGII —Angiotensin-2 ANP —Atrial natriuretic peptide ARVC —Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy AS —Aortic stenosis ASD —Atrial Septal Defect AST —Aspartate aminotransferase ATE —Arterial thromboembolus AV —Atrioventricular AVN —Atrioventricular node AVVs —Atrioventricular valves BB —Bundle branch BH —Bundle of His BNP —Brain natriuretic peptide CFB —Central fibrous body CHF —Congestive heart failure CK —Creatine kinase CNP —C-type natriuretic peptide CO —Cardiac output CTD —Cor triatriatum dexter DCM —Dilated cardiomyopathy DIC —Disseminated intravascular coagulation DNP —Dendraspis natriuretic peptides ESR —Erythrocyte sedimentation rate EDV —End diastolic volume HCM —Hypertrophic cardiomyopathy HR —Heart rate HSA —Hemangiosarcoma LDH —Lactate dehydrogenase LV —Left ventricle LVOT —Left ventricular outflow tract MiVD —Mitral valve dysplasia MVO 2 —Myocardial oxygen consumption MVD —Myxomatous valvular degeneration MYBPC —Myosin-binding protein NE —Norepinephrine NO —Nitric oxide PPDH —Peritoneopericardial diaphragmatic hernias PDA —Persistent ductus arteriosus PRAA —Persistent right aortic arch RAAS —Renin-angiotensin-aldosterone system RCM —Restrictive cardiomyopathy RV —Right ventricle SAM —Systolic anterior motion SAN —Sinoatrial node SV —Stroke volume TnT —Troponin T TnT1 —Troponin 1 TOF —Tetralogy of Fallot TVD —Tricuspid valve dysplasia UCM —Unclassified cardiomyopathy VSD —Ventricular septal defect Structure Development of the Heart and Great Vessels The heart is a conical, muscular organ that in mammals has evolved into a four-chambered pump with four valves. During early fetal development, it is converted from an elongated muscular tube into a C-shaped structure by a process termed looping ( E-Fig. 10-1 ). Subsequently, septation occurs to produce the right and left atrial and ventricular chambers and separation of the common truncus arteriosus into the aorta and pulmonary artery, respectively. The heart is interposed as a pump into the vascular system, with the right side supplying the pulmonary circulation and the left side the systemic circulation ( E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). The vascular system is subdivided into arterial, capillary, venous, and lymphatic segments. The arteries are classified into three types: elastic arteries, muscular arteries, and arterioles. The venous vessels are termed venules and veins. The lymphatic vasculature includes lymphatic capillaries and lymphatic vessels. Interposed between the arterial and venous segments are the capillary beds. A vascular segment termed the microcirculation (systemic capillary beds) includes arterioles, capillaries, and venules and is the major area of exchange between the circulating blood and the peripheral tissue (see E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). E-Figure 10-1 Development of the Heart. A, Ventral and left aspects of the segmentation and loop formation of the heart at progressive stages of development ( A to D ). Truncus arteriosus (1) , bulbus cordis (2) , ventricle (3) , atrium (4) , pericardial cavity (5) , sinus venosus (6) , septum transversus (7) , aortic arches (8) , and dorsal aortae (9) . B , Partitioning of the mammalian heart into chambers. (A from Hyttel P: Essentials of domestic animal embryology , St. Louis, 2010, Saunders. B courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College; and Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-2 Pulmonary and Systemic Circulatory Systems. Schematic diagram showing serially connected pulmonary and systemic circulatory systems and how to trace the flow of blood. A, Right heart chambers propel unoxygenated blood through the pulmonary circulation, and the left heart propels oxygenated blood through the systemic circulation. B, The direction of blood flow begins at the left ventricle of the heart; flows to the arteries, arterioles, capillaries of each body organ, venules, veins, right atrium, right ventricle, pulmonary artery, lung capillaries, pulmonary veins, and left atrium; and then goes back to the left ventricle. RA, Right atrium; RV, right ventricle; LA, left atrium, LV, left ventricle. (From McCance, K: Pathophysiology: The biologic basis for disease in adults and children, ed 6, St. Louis, 2009, Mosby.) Macroscopic Structure The heart lies within a fibroelastic sac called the pericardium , and the wall of the heart is composed of three layers: the epicardium, the myocardium, and the endocardium ( Fig. 10-1 ). Structurally, the heart contains in order of blood flow four major blood vessels (vena cava, pulmonary artery, pulmonary vein, and aorta), four chambers (right atrium/auricle, right ventricle, left atrium/auricle, and left ventricle), and four valves (tricuspid, pulmonic semilunar, mitral, and aortic semilunar) ( Fig. 10-2 ). Figure 10-1 Structure of the Wall of the Heart. Figure 10-2 Normal Heart, Pig. A, Aorta; LA, left atrium; LV, left ventricle; PA, pulmonary artery; RA, right atrium; RV, right ventricle. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Myocardium The myocardium is the muscular layer of the heart. It consists of cardiac muscle cells (cardiac myocytes [also known as cardiac rhabdomyocytes ] or cardiomyocytes) arranged in overlapping spiral patterns. These sheets of cells are anchored to the fibrous skeleton of the heart, which surrounds the atrioventricular valves and the origins of the aorta and pulmonary artery. The myocardial thickness is related to the pressure present in each chamber; thus the atria are thin walled and the ventricles are thicker. In adult animals, the thickness of the left ventricular free wall is approximately threefold that of the right ventricle, measured in a transverse section across the middle of the ventricles, because the pressure is greater in the systemic circulation than in the pulmonary circuit. The arterial supply to the heart is the left and right coronary arteries, which arise from the aorta at the sinus of Valsalva behind the left and right cusps of the aortic valves. The arteries course over the heart in the subepicardium and give off perforating intramyocardial arteries that supply a rich capillary bed throughout the myocardium. Extensive anastomoses occur between the capillaries that tend to run parallel to the elongated cardiac muscle cells. The ratio of the area of capillaries to that of muscle cells is approximately 1 : 1, a fact evident when the myocardium is viewed histologically in cross section. Cardiac myocytes are dependent on oxidative phosphorylation for energy requirements. This requires a constant supply of oxygen delivered by coronary arteries. Cardiac Conduction System The heart is a muscular four-chamber pump that simultaneously supplies blood to the pulmonary and systemic circulatory beds (see E-Fig. 10-2 ). Mechanical pumping is composed of sequential contraction (systole) and relaxation (diastole) that must be preceded by an electrophysiologic process that triggers a coordinated chronologic sequence of electrical events that result in muscle contractions. This electrophysiologic process is made possible by a network of special conducting fibers that are collectively referred to as the cardiac conduction system. The cardiac conduction system is infrequently examined in animals because it is a labor-intensive process. Exceptions are cases with documented electrocardiographic alterations of undetermined origin. Components include (1) the sinoatrial node (SAN) at the junction of the cranial vena cava and the right atrium, (2) the atrioventricular node (AVN) located above the septal leaflet of the tricuspid valve and the atrioventricular (AV) bundle traversing the lower atrial septum onto the dorsal portion of the muscular interventricular septum, and (3) the right and left bundle branches that descend on each side of the muscular interventricular septum and eventually ramify in the ventricular myocardium as the Purkinje fiber network. The major pacemaker of the cardiac conduction system is the SAN. This disk-shaped structure lies between the wall of the cranial vena cava and the external wall of the right auricular appendage. Four internodal pathways connect the SAN with the AVN. The AVN is present in the wall of the right atrium dorsal to the septal cusp of the tricuspid valve. For the atria to be electrically insulated from the ventricles so that an unwarranted ectopic conduction wave will not activate the ventricles (or vice versa) and disrupt the synchronous events of the cardiac cycle, a fibrous cardiac skeleton composed of a layer of dense collagen (central fibrous body [CFB]), as well as occasional plates of chondroid and osseous metaplasia, separates the atrial from the ventricular myocardium. This skeleton forms two fibrous rings around the AV orifices and the aortic and pulmonic orifices. Conduction fibers arising from the AVN, known as the bundle of His or AV bundle , pierce through the CFB into the ventricles and continue along the subendocardium of the interventricular septum. The AV bundle then splits into the right and left bundle branches, which further split and ramify into many other smaller branches that blend into the ventricular myocardium. Purkinje fibers constitute the AV bundle and downstream conduction pathways. Endocardium and Heart Valves The endocardium is the innermost layer of the heart and lines the chambers and extends over projecting structures such as the valves, chordae tendineae, and papillary muscles. The endocardium of the atria is thicker than that of the ventricles and thus normally appears white to gray on gross examination. The surface of the endocardium is endothelium that lies on a thin layer of vascularized connective tissue; the subendocardial layer contains blood vessels, nerves, and connective tissue. Purkinje fibers are distributed in the subendocardium throughout both ventricles. The heart valves (tricuspid valve [right AV valve], mitral valve [left AV valve], aortic valve, and pulmonary valve) are attached to fibrous rings and have thin avascular cusps. The valves open and close to regulate blood flow through the heart. During embryogenesis, endocardial cushions (mesenchymal tissue covered by endothelium) are precursors of the valve cusps. By remodeling, growth, and elongation, the cushions become thin mature cusps composed of connective tissue with an endothelial covering. Pericardium and Epicardium The pericardium, which normally contains a small amount of clear, serous fluid, is composed of an outer fibrous component and an inner serous layer, which form the sac surrounding the heart. The outer component is continuous with the mediastinal pleura. The base of the fibrous pericardium surrounds and blends with the adventitia of the greater arteries and veins exiting and entering the heart. The serous pericardium forms a closed sac surrounding the heart and the roots of the great vessels. The epicardium (also known as visceral pericardium ), the outermost layer of the heart, is continuous at the cardiac base with the parietal pericardium. The parietal pericardium is fused with the fibrous pericardium. The entire inner surface of the pericardial cavity is covered by mesothelium. The subepicardial layer is attached to the myocardium and consists of a thin layer of fibrous connective tissue, variable but generally abundant amounts (in well-nourished animals) of adipose tissue, and numerous blood vessels, lymphatic vessels, and nerves. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels. The aorta originates from the left ventricle and provides oxygenated blood to the entire body via arteries. In a treelike manner, arteries branch and become smaller arterioles as they approach capillary beds (see E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). These beds and postcapillary venules provide the site for exchange of oxygen, carbon dioxide, nutrients, and waste. Small venules return the exchanged fluid and blood to larger veins, and eventually the postcava and precava drain into the right atrium. The poorly oxygenated blood enters the pulmonary artery from the right ventricle. Oxygen exchange occurs in the capillaries of the lung, and oxygenated blood is returned to the heart via the pulmonary veins into the left atrium. Lymphatic Vessels. Lymphatic vessels are thin-walled, endothelial-lined channels that originate near the capillary beds and serve as a drainage system for returning interstitial tissue fluid and inflammatory cells to the blood. Afferent lymphatic vessels drain lymph into regional lymph nodes, which then filter and provide immunologic surveillance of the lymph, its cells, and the foreign matter it contains. The filtered lymph continues into larger efferent lymphatic vessels, which eventually drain into the caval blood via the thoracic duct. Both lymphatic vessels and veins have valves to prevent backflow of fluid. A more complete description can be found in Chapter 2. Microscopic Structure Myocardium The myocardium consists of cardiac muscle cells surrounded by interstitial components that include blood and lymphatic vessels, nerves, and connective tissue cells, such as fibroblasts, histiocytes, mast cells, pericytes, primitive mesenchymal stem cells, and extracellular matrix elements of connective tissue, including collagen fibrils, elastic fibers, and acid mucopolysaccharides. Cardiac muscle cells can be divided into two populations: the contracting myocytes and the specialized fibers of the conduction system. The contracting myocyte is a cross-striated branching fiber of an irregular cylindric shape that measures 60 to 100 µm in length and 10 to 20 µm in diameter, with centrally located, elongated nuclei. Myocytes in young animals are smaller and have less sarcoplasm. Atrial myocytes are smaller than ventricular myocytes. Adjacent myocytes are joined end-to-end by specialized junctions known as intercalated disks and less frequently by side-to-side connections termed lateral junctions. Multinucleated fibers with nuclei arranged in central rows are frequently seen in hearts of young pigs ( Fig. 10-3 ). The myocytes of old animals commonly have large polyploid nuclei. The cytoplasm (sarcoplasm) of myocytes is largely occupied by the contractile proteins that are highly organized into sarcomeres, the repeating contractile units of the myofibril (see Figs. 15-3 and 15-8). Myofibrils are formed by end-to-end attachment of many sarcomeres. The cross-striated or banded appearance of myocytes is the result of sarcomere organization into A bands composed of myosin in the form of "thick" filaments (12 to 16 nm in diameter), I bands composed of actin in the form of "thin" filaments (5 to 8 nm in diameter), and dense Z bands at the end of each sarcomere. Thick and thin filaments interdigitate and provide the basis for the sliding mechanism of muscle contraction. Myocytes are enclosed by the sarcolemma, which consists of the plasma membrane and the covering basal lamina (external lamina). Other important components of cardiac muscle cells are generally only apparent in electron micrographs and include abundant mitochondria, a highly organized network of intracellular tubules termed the sarcoplasmic reticulum , cylindric invaginations of the plasma membrane called T tubules , ribosomes, cytoskeletal filaments, glycogen particles, lipid droplets, Golgi complexes, atrial granules (contain atrial natriuretic factor), lysosomes, and residual bodies ( E-Fig. 10-3 ). Figure 10-3 Normal Cardiac Muscle. Left ventricular myocardium, longitudinal section, normal young pig. The multiple nuclei in a myocyte are readily seen and evaluated in a longitudinal section. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-3 Normal Cardiac Muscle. Heart, left ventricular myocytes, longitudinal section, normal rat. Numerous dense mitochondria (arrows) lie between myofibrils, which have prominent bands. N, Nucleus. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Cardiac Conduction System The morphologic features of the cardiac muscle cells that form specialized conduction tissues, including the SAN, AVN, AV bundle (bundle of His), and bundle branches, vary greatly at different sites and among animal species but generally are thin, branching nodal muscle cells with scarce myofibrils separated by highly vascularized connective tissue ( Fig. 10-4 ; E-Fig. 10-4 ). Autonomic nerve fibers are contained within the SAN. The Purkinje fibers (cardiac conduction fibers) are distinguished by their large diameters (in horse and ox) and abundant pale eosinophilic sarcoplasm rich in glycogen and poor in myofibrils. Figure 10-4 Cardiac Conduction System. A, Sinoatrial (SA) node, foal. The center of the SA node (1) contains a nodal artery (2). H&E stain. A1, Higher magnification. Haphazardly oriented myofibers are embedded within abundant loose collagenous and elastic connective tissue. H&E stain. A2, Higher magnification. Nodal myofibers have discrete cell borders, a moderate amount of wavy sarcoplasm, and an elongated nucleus. H&E stain. B, Atrioventricular (AV) node, goat. The AV node (1) is composed of interconnecting nodal myofibers that are supported by loose collagenous and elastic fibrous stroma. The node is embedded in adipose tissue (2). Note that in this illustration the AV node (1) is a poorly demarcated region (see B1 for greater detail) that is elongated (flattened) from top to bottom and that it and its surrounding adipose tissue are positioned adjacent to the cardiac fibrous skeleton (arrows) that has undergone focal chondroid metaplasia (3). The position and overall shape of the AV node in a histologic section is dependent on the plane of section. Endocardium (arrowhead). H&E stain. B1, AV node, goat. In this higher magnification of B, AV nodal myofibers have a characteristic pale eosinophilic and thin sarcoplasm, with abundance of distinct striations and a short oval to elongated nucleus with dispersed chromatin. An autonomic myelinated nerve is present in the AV node (arrow). H&E stain. C, AV bundle, goat. The AV bundle (1) travels diagonally through the center of the figure from the lower left to the upper right margins. It is formed by an interweaving pseudosyncytium of cardiac myofibers supported by a loose to dense intervening collagenous stroma (see C1 for greater detail) and may be surrounded by adipose tissue (2). Cardiac cartilaginous skeleton (3). H&E stain. C1, Higher magnification. The AV bundle myofibers of the pseudosyncytium have moderate to large, pale eosinophilic sarcoplasm with prominent striations and large nuclei with fine stippled chromatin. H&E stain. (Courtesy Dr. A. Gal, Institute of Veterinary, Animal and Biomedical Sciences, Massey University; and Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-4 Heart, Fibrous Stroma of the Cardiac Conduction System, Goat. A, Atrioventricular (AV) node. The AV node (1) is composed of interconnecting nodal myofibers that are supported by loose collagenous and elastic fibrous stroma. The node is embedded in adipose tissue (2) that is adjacent to the cardiac fibrous skeleton (arrows) that has undergone focal chondroid metaplasia (3). Endocardium (arrowhead). H&E stain. A1, AV node, goat. Serial section of A . Note the overall deposition of collagen fibers (blue) in the structures labeled 1 and 3 in A. Masson's trichrome stain. B, AV bundle. In this illustration, the AV bundle (1) travels diagonally through the center of the image from the lower left to the upper right margins. It is supported by a loose to dense intervening interstitial collagenous stroma and is surrounded by adipose tissue (2). Cardiac cartilaginous skeleton (3). H&E stain. B1, AV bundle, goat. Serial section of B . Note the overall deposition of collagen fibers (blue) in the structures labeled in B. Masson's trichrome stain. (Courtesy Dr. A. Gal and Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Sinoatrial Node. The SAN is positioned adjacent to the epicardial adipose tissue and is often centered around a branch of the right coronary artery ( Fig. 10-4, A ). Several large autonomic nervous system ganglions can occasionally be seen clustering in the epicardium adjacent to the node. The SAN lacks discrete structure, and its ill-defined borders merge with the adjacent atrial wall. It structurally consists of a collection of haphazardly oriented myofibers that appear as a pseudosyncytium and are embedded within abundant loose collagenous and elastic connective tissue, with rare cores of epicardially oriented dense collagen fibers ( Fig. 10-4 , A1 ). The nodal myofibers have discrete cell borders, a moderate amount of wavy sarcoplasm with sparse myofibrils, and an elongated nucleus that contains clumps of coarse chromatin ( Fig. 10-4 , A2 ). Atrioventricular Node, Atrioventricular Bundle, and Bundle Branches. The AVN lies within the right atrial subendocardium and consists of a discrete, compact to loose mass of interconnecting myofibers that are often embedded within adipose tissue. A small nodal artery, parasympathetic ganglia, and large myelinated autonomic nerves are often present adjacent to the AVN. The nodal myofibers that have characteristic pale eosinophilic and thin sarcoplasm generally run parallel to each other but occasionally have an interweaving pattern with intervening loose collagen fibers. These myofibers contain a moderate amount of sarcoplasm with abundance of distinct striations and a short oval to elongated nucleus with dispersed chromatin. The AV bundle ( Fig. 10-4, B ) emerges from the cranial pole of the AVN ( Fig. 10-4 , B1 ) and pierces through the CFB, approximately at the level of the annuli of the aortic and mitral valves ( Fig. 10-4 , B2 ), to become the left and right bundle branches. The size of an AV bundle myofiber progressively enlarges, and its cytomorphology transitions from a pale eosinophilic, small and thin (AVN-like morphology) myofiber to a pale eosinophilic, foamy to waxy, large, and somewhat rectangular myofiber that lacks cross-striations (a Purkinje-like cellular morphology) ( Fig. 10-4, C ). Autonomic Nervous System. The nerve supply to the heart is autonomic and includes sympathetic, parasympathetic, and nonadrenergic noncholinergic innervation. Histologically, large nerves can be seen in the epicardium and adjacent to the coronary blood vessels, whereas special staining techniques are required for demonstration of neural tissue elsewhere. Electron microscopy and immunohistochemistry allow differentiation between sympathetic and parasympathetic nerves that are otherwise indistinguishable with H&E stain. Preganglionic parasympathetic fibers pass to the heart through the cardiac branch of the vagal nerve and synapse with parasympathetic ganglionic neurons. Postganglionic neurons are distributed to the SAN and AVN, as well as to atrial and, to a much lesser extent, ventricular myocardium (however, the ventricular conduction system is well supplied by cholinergic innervation). Postganglionic sympathetic fibers arising from the cervicothoracic and middle cervical ganglia intensely innervate the SAN and AVN and, to a lesser extent, the AV bundle. The atrial endocardium, myocardium, and epicardium are evenly innervated, whereas the ventricles are considerably less innervated, with epicardium more densely populated by neural tissue than the endocardium. Endocardium and Heart Valves The endocardium, lining the atrium and ventricles, consists of a continuous endothelium, subendothelium, and subendocardium. The subendothelial layer contains dense irregular fibroblasts intermixed with collagen and elastic fibers and occasional smooth muscle cells. Elastic fibers are abundant within the subendocardium of the atria. The subendocardial layer contains vascular structures, elastic and collagen bands, and fibroblasts and is continuous with the myocardium. Purkinje fibers are located in the subendocardium. The heart valves are poorly vascularized, endocardial folds covered by endothelium. The subendothelial layer is composed of fibroblasts with abundant elastic and collagen fibers. The AV valves (AVVs) consist of a layer of stratum spongiosum and stratum fibrosum. The stratum spongiosum consists of loosely arranged fibroblasts with moderate amounts of collagen and elastin fibers and vascular structures. The stratum fibrosis contains fibroblasts and collagen, which are continuous with the annulus fibrosis and chordae tendineae. Pericardium and Epicardium The pericardial sac is composed of parietal and visceral pericardium, both of which are covered by mesothelium. Beneath the visceral mesothelium is a thin layer of fibrous connective tissue, adipocytes, and vascular structures. This organization forms the subepicardium and interdigitates with the myocardium. The parietal pericardium is composed of an inner layer of mesothelium that interdigitates with the dense connective tissue forming the outer pericardial sac. Blood and Lymphatic Vascular Systems The overall design of the blood and lymphatic vessels is similar, except that luminal diameter, wall thickness, and the presence of other anatomic features, such as valves, vary between the different segments. The luminal surface of all vessels is lined by longitudinally aligned endothelial cells covering a basal lamina. Vessel walls are divided into three layers or tunics: intima, media, and adventitia. However, some of the layers can be absent or all of the layers can be thinned in some segments of the vascular system, depending on the intravascular pressures. The large elastic arteries such as the aorta have (1) an intima composed of endothelium and subendothelial connective tissue; (2) a very thick tunica media composed of fenestrated elastic laminae with interposed smooth muscle cells and ground substance and bordered internally by the internal elastic lamina and externally by the external elastic lamina; and (3) an outer tunica adventitia layer composed of collagen and elastic fibers and connective tissue cells with penetrating blood vessels, termed the vasa vasorum , supplying nutrients to the adventitia and the outer half of the media. In muscular arteries and arterioles, the tunica media is largely composed of smooth muscle cells arranged in a circumferential pattern. Arterioles are the smallest arterial channels and are generally less than 100 µm in diameter and with one to three layers of smooth muscle cells in the tunica media. Capillaries are 5 to 10 µm in diameter, and their endothelium is one of three types: (1) continuous, (2) fenestrated (as in the endocrine glands), or (3) porous (as in renal glomeruli). The endothelium rests on an external lamina surrounded by pericytes. Pericytes are located abluminally to capillaries and postcapillary venules and because of their location, contractility, and cytoskeletal proteins may play a role in regulating capillary and venular blood flow. Lesions of the endothelium might not be evident by light microscopy, and electron microscopy is required for characterization. Veins have thin walls in relation to their luminal size compared with those of arteries, in which blood pressure is greater. The adventitia is the thickest layer. Valves are present to prevent retrograde blood flow (i.e., away from the heart). Lymphatic capillaries lack a basal lamina. Large lymphatic vessels are similar in structure to veins and generally have large lumina, thin walls, and a greater number of intimal valves but contain lymph. The morphology of large arteries, veins, microvasculature, and lymphatic vessels is described in Chapter 2 and is not discussed further in this chapter. Necropsy Assessment of Heart and Vascular Structures E-Figure 10-5 Postmortem "Chicken Fat" Arterial Cast, Dog. Note how the clot conforms to the shape of the lumens of the vessels from which it was removed. Chicken fat clots consist primarily of clotted plasma and fibrin and other proteins of the coagulation cascade. They are often indicative of anemia; however, in all animals their formation by the separation of the red blood cells from the rest of the components of blood depends on the erythrocyte sedimentation rate (ESR). Separation can occur in all animals in response to systemic inflammation, which increases the ESR, but the horse normally has a high ESR because equine erythrocytes clump together in rouleau formation, which increases the ESR. Thus, depending on the ESR, postmortem clots may be pale white to yellow ("chicken fat" clot) or shiny red ("currant jelly" clot) or sometimes a mixture. (Courtesy Dr. R.K. Myers, College of Veterinary Medicine, Iowa State University.) E-Figure 10-6 Focal Hemorrhage and Discoloration, Intracardiac Injection, Euthanasia Solution, Left Ventricle, Dog. Euthanasia solution is often injected into the left ventricle. In this case, solution was injected into the myocardium and caused a localized area of hemorrhage and discoloration. A mixture of euthanasia solution and blood often form a brownish sludge in the ventricle. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Examination of the Cardiovascular System and Lymphatic Vessels at Necropsy and Tissue Sampling for Histopathologic Evaluation E-Figure 10-7 Gross and Microscopic Examination of the Heart. Diagrams A to D illustrate the heart opened. The numbers indicate the area and the shape of the blocks of tissue removed for histopathology. A, Right ventricle and right atrium. B, Right ventricular cavity and pulmonary outflow tract. C, Left ventricle and left atrium. D, Left ventricle and aortic outflow tract. 1, Right ventricular free wall, atrioventricular valve, and atrium. 2, Pulmonic valve, right ventricular outflow tract, and pulmonary artery. 3, Right auricular appendage. 4, Sinoatrial node. 5, Left auricular appendage. 6, Left atrioventricular valve, ventricle, and atrium. 7 and 8, Left ventricular free wall and papillary muscles. 9, Atrioventricular node, right atrioventricular valve, and atrium. 10, Interventricular septum. 11, Aortic valve, left aortic outflow tract, and aorta. (From Bishop SP: Necropsy techniques for the heart and great vessels. In Fox P, Sisson D, Moise N, editors: Textbook of canine and feline cardiology , ed 2, Philadelphia, 1999, Saunders.) Development of the Heart and Great Vessels The heart is a conical, muscular organ that in mammals has evolved into a four-chambered pump with four valves. During early fetal development, it is converted from an elongated muscular tube into a C-shaped structure by a process termed looping ( E-Fig. 10-1 ). Subsequently, septation occurs to produce the right and left atrial and ventricular chambers and separation of the common truncus arteriosus into the aorta and pulmonary artery, respectively. The heart is interposed as a pump into the vascular system, with the right side supplying the pulmonary circulation and the left side the systemic circulation ( E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). The vascular system is subdivided into arterial, capillary, venous, and lymphatic segments. The arteries are classified into three types: elastic arteries, muscular arteries, and arterioles. The venous vessels are termed venules and veins. The lymphatic vasculature includes lymphatic capillaries and lymphatic vessels. Interposed between the arterial and venous segments are the capillary beds. A vascular segment termed the microcirculation (systemic capillary beds) includes arterioles, capillaries, and venules and is the major area of exchange between the circulating blood and the peripheral tissue (see E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). E-Figure 10-1 Development of the Heart. A, Ventral and left aspects of the segmentation and loop formation of the heart at progressive stages of development ( A to D ). Truncus arteriosus (1) , bulbus cordis (2) , ventricle (3) , atrium (4) , pericardial cavity (5) , sinus venosus (6) , septum transversus (7) , aortic arches (8) , and dorsal aortae (9) . B , Partitioning of the mammalian heart into chambers. (A from Hyttel P: Essentials of domestic animal embryology , St. Louis, 2010, Saunders. B courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College; and Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-2 Pulmonary and Systemic Circulatory Systems. Schematic diagram showing serially connected pulmonary and systemic circulatory systems and how to trace the flow of blood. A, Right heart chambers propel unoxygenated blood through the pulmonary circulation, and the left heart propels oxygenated blood through the systemic circulation. B, The direction of blood flow begins at the left ventricle of the heart; flows to the arteries, arterioles, capillaries of each body organ, venules, veins, right atrium, right ventricle, pulmonary artery, lung capillaries, pulmonary veins, and left atrium; and then goes back to the left ventricle. RA, Right atrium; RV, right ventricle; LA, left atrium, LV, left ventricle. (From McCance, K: Pathophysiology: The biologic basis for disease in adults and children, ed 6, St. Louis, 2009, Mosby.) Macroscopic Structure The heart lies within a fibroelastic sac called the pericardium , and the wall of the heart is composed of three layers: the epicardium, the myocardium, and the endocardium ( Fig. 10-1 ). Structurally, the heart contains in order of blood flow four major blood vessels (vena cava, pulmonary artery, pulmonary vein, and aorta), four chambers (right atrium/auricle, right ventricle, left atrium/auricle, and left ventricle), and four valves (tricuspid, pulmonic semilunar, mitral, and aortic semilunar) ( Fig. 10-2 ). Figure 10-1 Structure of the Wall of the Heart. Figure 10-2 Normal Heart, Pig. A, Aorta; LA, left atrium; LV, left ventricle; PA, pulmonary artery; RA, right atrium; RV, right ventricle. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Myocardium The myocardium is the muscular layer of the heart. It consists of cardiac muscle cells (cardiac myocytes [also known as cardiac rhabdomyocytes ] or cardiomyocytes) arranged in overlapping spiral patterns. These sheets of cells are anchored to the fibrous skeleton of the heart, which surrounds the atrioventricular valves and the origins of the aorta and pulmonary artery. The myocardial thickness is related to the pressure present in each chamber; thus the atria are thin walled and the ventricles are thicker. In adult animals, the thickness of the left ventricular free wall is approximately threefold that of the right ventricle, measured in a transverse section across the middle of the ventricles, because the pressure is greater in the systemic circulation than in the pulmonary circuit. The arterial supply to the heart is the left and right coronary arteries, which arise from the aorta at the sinus of Valsalva behind the left and right cusps of the aortic valves. The arteries course over the heart in the subepicardium and give off perforating intramyocardial arteries that supply a rich capillary bed throughout the myocardium. Extensive anastomoses occur between the capillaries that tend to run parallel to the elongated cardiac muscle cells. The ratio of the area of capillaries to that of muscle cells is approximately 1 : 1, a fact evident when the myocardium is viewed histologically in cross section. Cardiac myocytes are dependent on oxidative phosphorylation for energy requirements. This requires a constant supply of oxygen delivered by coronary arteries. Cardiac Conduction System The heart is a muscular four-chamber pump that simultaneously supplies blood to the pulmonary and systemic circulatory beds (see E-Fig. 10-2 ). Mechanical pumping is composed of sequential contraction (systole) and relaxation (diastole) that must be preceded by an electrophysiologic process that triggers a coordinated chronologic sequence of electrical events that result in muscle contractions. This electrophysiologic process is made possible by a network of special conducting fibers that are collectively referred to as the cardiac conduction system. The cardiac conduction system is infrequently examined in animals because it is a labor-intensive process. Exceptions are cases with documented electrocardiographic alterations of undetermined origin. Components include (1) the sinoatrial node (SAN) at the junction of the cranial vena cava and the right atrium, (2) the atrioventricular node (AVN) located above the septal leaflet of the tricuspid valve and the atrioventricular (AV) bundle traversing the lower atrial septum onto the dorsal portion of the muscular interventricular septum, and (3) the right and left bundle branches that descend on each side of the muscular interventricular septum and eventually ramify in the ventricular myocardium as the Purkinje fiber network. The major pacemaker of the cardiac conduction system is the SAN. This disk-shaped structure lies between the wall of the cranial vena cava and the external wall of the right auricular appendage. Four internodal pathways connect the SAN with the AVN. The AVN is present in the wall of the right atrium dorsal to the septal cusp of the tricuspid valve. For the atria to be electrically insulated from the ventricles so that an unwarranted ectopic conduction wave will not activate the ventricles (or vice versa) and disrupt the synchronous events of the cardiac cycle, a fibrous cardiac skeleton composed of a layer of dense collagen (central fibrous body [CFB]), as well as occasional plates of chondroid and osseous metaplasia, separates the atrial from the ventricular myocardium. This skeleton forms two fibrous rings around the AV orifices and the aortic and pulmonic orifices. Conduction fibers arising from the AVN, known as the bundle of His or AV bundle , pierce through the CFB into the ventricles and continue along the subendocardium of the interventricular septum. The AV bundle then splits into the right and left bundle branches, which further split and ramify into many other smaller branches that blend into the ventricular myocardium. Purkinje fibers constitute the AV bundle and downstream conduction pathways. Endocardium and Heart Valves The endocardium is the innermost layer of the heart and lines the chambers and extends over projecting structures such as the valves, chordae tendineae, and papillary muscles. The endocardium of the atria is thicker than that of the ventricles and thus normally appears white to gray on gross examination. The surface of the endocardium is endothelium that lies on a thin layer of vascularized connective tissue; the subendocardial layer contains blood vessels, nerves, and connective tissue. Purkinje fibers are distributed in the subendocardium throughout both ventricles. The heart valves (tricuspid valve [right AV valve], mitral valve [left AV valve], aortic valve, and pulmonary valve) are attached to fibrous rings and have thin avascular cusps. The valves open and close to regulate blood flow through the heart. During embryogenesis, endocardial cushions (mesenchymal tissue covered by endothelium) are precursors of the valve cusps. By remodeling, growth, and elongation, the cushions become thin mature cusps composed of connective tissue with an endothelial covering. Pericardium and Epicardium The pericardium, which normally contains a small amount of clear, serous fluid, is composed of an outer fibrous component and an inner serous layer, which form the sac surrounding the heart. The outer component is continuous with the mediastinal pleura. The base of the fibrous pericardium surrounds and blends with the adventitia of the greater arteries and veins exiting and entering the heart. The serous pericardium forms a closed sac surrounding the heart and the roots of the great vessels. The epicardium (also known as visceral pericardium ), the outermost layer of the heart, is continuous at the cardiac base with the parietal pericardium. The parietal pericardium is fused with the fibrous pericardium. The entire inner surface of the pericardial cavity is covered by mesothelium. The subepicardial layer is attached to the myocardium and consists of a thin layer of fibrous connective tissue, variable but generally abundant amounts (in well-nourished animals) of adipose tissue, and numerous blood vessels, lymphatic vessels, and nerves. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels. The aorta originates from the left ventricle and provides oxygenated blood to the entire body via arteries. In a treelike manner, arteries branch and become smaller arterioles as they approach capillary beds (see E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). These beds and postcapillary venules provide the site for exchange of oxygen, carbon dioxide, nutrients, and waste. Small venules return the exchanged fluid and blood to larger veins, and eventually the postcava and precava drain into the right atrium. The poorly oxygenated blood enters the pulmonary artery from the right ventricle. Oxygen exchange occurs in the capillaries of the lung, and oxygenated blood is returned to the heart via the pulmonary veins into the left atrium. Lymphatic Vessels. Lymphatic vessels are thin-walled, endothelial-lined channels that originate near the capillary beds and serve as a drainage system for returning interstitial tissue fluid and inflammatory cells to the blood. Afferent lymphatic vessels drain lymph into regional lymph nodes, which then filter and provide immunologic surveillance of the lymph, its cells, and the foreign matter it contains. The filtered lymph continues into larger efferent lymphatic vessels, which eventually drain into the caval blood via the thoracic duct. Both lymphatic vessels and veins have valves to prevent backflow of fluid. A more complete description can be found in Chapter 2. Myocardium The myocardium is the muscular layer of the heart. It consists of cardiac muscle cells (cardiac myocytes [also known as cardiac rhabdomyocytes ] or cardiomyocytes) arranged in overlapping spiral patterns. These sheets of cells are anchored to the fibrous skeleton of the heart, which surrounds the atrioventricular valves and the origins of the aorta and pulmonary artery. The myocardial thickness is related to the pressure present in each chamber; thus the atria are thin walled and the ventricles are thicker. In adult animals, the thickness of the left ventricular free wall is approximately threefold that of the right ventricle, measured in a transverse section across the middle of the ventricles, because the pressure is greater in the systemic circulation than in the pulmonary circuit. The arterial supply to the heart is the left and right coronary arteries, which arise from the aorta at the sinus of Valsalva behind the left and right cusps of the aortic valves. The arteries course over the heart in the subepicardium and give off perforating intramyocardial arteries that supply a rich capillary bed throughout the myocardium. Extensive anastomoses occur between the capillaries that tend to run parallel to the elongated cardiac muscle cells. The ratio of the area of capillaries to that of muscle cells is approximately 1 : 1, a fact evident when the myocardium is viewed histologically in cross section. Cardiac myocytes are dependent on oxidative phosphorylation for energy requirements. This requires a constant supply of oxygen delivered by coronary arteries. Cardiac Conduction System The heart is a muscular four-chamber pump that simultaneously supplies blood to the pulmonary and systemic circulatory beds (see E-Fig. 10-2 ). Mechanical pumping is composed of sequential contraction (systole) and relaxation (diastole) that must be preceded by an electrophysiologic process that triggers a coordinated chronologic sequence of electrical events that result in muscle contractions. This electrophysiologic process is made possible by a network of special conducting fibers that are collectively referred to as the cardiac conduction system. The cardiac conduction system is infrequently examined in animals because it is a labor-intensive process. Exceptions are cases with documented electrocardiographic alterations of undetermined origin. Components include (1) the sinoatrial node (SAN) at the junction of the cranial vena cava and the right atrium, (2) the atrioventricular node (AVN) located above the septal leaflet of the tricuspid valve and the atrioventricular (AV) bundle traversing the lower atrial septum onto the dorsal portion of the muscular interventricular septum, and (3) the right and left bundle branches that descend on each side of the muscular interventricular septum and eventually ramify in the ventricular myocardium as the Purkinje fiber network. The major pacemaker of the cardiac conduction system is the SAN. This disk-shaped structure lies between the wall of the cranial vena cava and the external wall of the right auricular appendage. Four internodal pathways connect the SAN with the AVN. The AVN is present in the wall of the right atrium dorsal to the septal cusp of the tricuspid valve. For the atria to be electrically insulated from the ventricles so that an unwarranted ectopic conduction wave will not activate the ventricles (or vice versa) and disrupt the synchronous events of the cardiac cycle, a fibrous cardiac skeleton composed of a layer of dense collagen (central fibrous body [CFB]), as well as occasional plates of chondroid and osseous metaplasia, separates the atrial from the ventricular myocardium. This skeleton forms two fibrous rings around the AV orifices and the aortic and pulmonic orifices. Conduction fibers arising from the AVN, known as the bundle of His or AV bundle , pierce through the CFB into the ventricles and continue along the subendocardium of the interventricular septum. The AV bundle then splits into the right and left bundle branches, which further split and ramify into many other smaller branches that blend into the ventricular myocardium. Purkinje fibers constitute the AV bundle and downstream conduction pathways. Endocardium and Heart Valves The endocardium is the innermost layer of the heart and lines the chambers and extends over projecting structures such as the valves, chordae tendineae, and papillary muscles. The endocardium of the atria is thicker than that of the ventricles and thus normally appears white to gray on gross examination. The surface of the endocardium is endothelium that lies on a thin layer of vascularized connective tissue; the subendocardial layer contains blood vessels, nerves, and connective tissue. Purkinje fibers are distributed in the subendocardium throughout both ventricles. The heart valves (tricuspid valve [right AV valve], mitral valve [left AV valve], aortic valve, and pulmonary valve) are attached to fibrous rings and have thin avascular cusps. The valves open and close to regulate blood flow through the heart. During embryogenesis, endocardial cushions (mesenchymal tissue covered by endothelium) are precursors of the valve cusps. By remodeling, growth, and elongation, the cushions become thin mature cusps composed of connective tissue with an endothelial covering. Pericardium and Epicardium The pericardium, which normally contains a small amount of clear, serous fluid, is composed of an outer fibrous component and an inner serous layer, which form the sac surrounding the heart. The outer component is continuous with the mediastinal pleura. The base of the fibrous pericardium surrounds and blends with the adventitia of the greater arteries and veins exiting and entering the heart. The serous pericardium forms a closed sac surrounding the heart and the roots of the great vessels. The epicardium (also known as visceral pericardium ), the outermost layer of the heart, is continuous at the cardiac base with the parietal pericardium. The parietal pericardium is fused with the fibrous pericardium. The entire inner surface of the pericardial cavity is covered by mesothelium. The subepicardial layer is attached to the myocardium and consists of a thin layer of fibrous connective tissue, variable but generally abundant amounts (in well-nourished animals) of adipose tissue, and numerous blood vessels, lymphatic vessels, and nerves. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels. The aorta originates from the left ventricle and provides oxygenated blood to the entire body via arteries. In a treelike manner, arteries branch and become smaller arterioles as they approach capillary beds (see E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). These beds and postcapillary venules provide the site for exchange of oxygen, carbon dioxide, nutrients, and waste. Small venules return the exchanged fluid and blood to larger veins, and eventually the postcava and precava drain into the right atrium. The poorly oxygenated blood enters the pulmonary artery from the right ventricle. Oxygen exchange occurs in the capillaries of the lung, and oxygenated blood is returned to the heart via the pulmonary veins into the left atrium. Lymphatic Vessels. Lymphatic vessels are thin-walled, endothelial-lined channels that originate near the capillary beds and serve as a drainage system for returning interstitial tissue fluid and inflammatory cells to the blood. Afferent lymphatic vessels drain lymph into regional lymph nodes, which then filter and provide immunologic surveillance of the lymph, its cells, and the foreign matter it contains. The filtered lymph continues into larger efferent lymphatic vessels, which eventually drain into the caval blood via the thoracic duct. Both lymphatic vessels and veins have valves to prevent backflow of fluid. A more complete description can be found in Chapter 2. Blood Vessels. The aorta originates from the left ventricle and provides oxygenated blood to the entire body via arteries. In a treelike manner, arteries branch and become smaller arterioles as they approach capillary beds (see E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). These beds and postcapillary venules provide the site for exchange of oxygen, carbon dioxide, nutrients, and waste. Small venules return the exchanged fluid and blood to larger veins, and eventually the postcava and precava drain into the right atrium. The poorly oxygenated blood enters the pulmonary artery from the right ventricle. Oxygen exchange occurs in the capillaries of the lung, and oxygenated blood is returned to the heart via the pulmonary veins into the left atrium. Lymphatic Vessels. Lymphatic vessels are thin-walled, endothelial-lined channels that originate near the capillary beds and serve as a drainage system for returning interstitial tissue fluid and inflammatory cells to the blood. Afferent lymphatic vessels drain lymph into regional lymph nodes, which then filter and provide immunologic surveillance of the lymph, its cells, and the foreign matter it contains. The filtered lymph continues into larger efferent lymphatic vessels, which eventually drain into the caval blood via the thoracic duct. Both lymphatic vessels and veins have valves to prevent backflow of fluid. A more complete description can be found in Chapter 2. Microscopic Structure Myocardium The myocardium consists of cardiac muscle cells surrounded by interstitial components that include blood and lymphatic vessels, nerves, and connective tissue cells, such as fibroblasts, histiocytes, mast cells, pericytes, primitive mesenchymal stem cells, and extracellular matrix elements of connective tissue, including collagen fibrils, elastic fibers, and acid mucopolysaccharides. Cardiac muscle cells can be divided into two populations: the contracting myocytes and the specialized fibers of the conduction system. The contracting myocyte is a cross-striated branching fiber of an irregular cylindric shape that measures 60 to 100 µm in length and 10 to 20 µm in diameter, with centrally located, elongated nuclei. Myocytes in young animals are smaller and have less sarcoplasm. Atrial myocytes are smaller than ventricular myocytes. Adjacent myocytes are joined end-to-end by specialized junctions known as intercalated disks and less frequently by side-to-side connections termed lateral junctions. Multinucleated fibers with nuclei arranged in central rows are frequently seen in hearts of young pigs ( Fig. 10-3 ). The myocytes of old animals commonly have large polyploid nuclei. The cytoplasm (sarcoplasm) of myocytes is largely occupied by the contractile proteins that are highly organized into sarcomeres, the repeating contractile units of the myofibril (see Figs. 15-3 and 15-8). Myofibrils are formed by end-to-end attachment of many sarcomeres. The cross-striated or banded appearance of myocytes is the result of sarcomere organization into A bands composed of myosin in the form of "thick" filaments (12 to 16 nm in diameter), I bands composed of actin in the form of "thin" filaments (5 to 8 nm in diameter), and dense Z bands at the end of each sarcomere. Thick and thin filaments interdigitate and provide the basis for the sliding mechanism of muscle contraction. Myocytes are enclosed by the sarcolemma, which consists of the plasma membrane and the covering basal lamina (external lamina). Other important components of cardiac muscle cells are generally only apparent in electron micrographs and include abundant mitochondria, a highly organized network of intracellular tubules termed the sarcoplasmic reticulum , cylindric invaginations of the plasma membrane called T tubules , ribosomes, cytoskeletal filaments, glycogen particles, lipid droplets, Golgi complexes, atrial granules (contain atrial natriuretic factor), lysosomes, and residual bodies ( E-Fig. 10-3 ). Figure 10-3 Normal Cardiac Muscle. Left ventricular myocardium, longitudinal section, normal young pig. The multiple nuclei in a myocyte are readily seen and evaluated in a longitudinal section. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-3 Normal Cardiac Muscle. Heart, left ventricular myocytes, longitudinal section, normal rat. Numerous dense mitochondria (arrows) lie between myofibrils, which have prominent bands. N, Nucleus. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Cardiac Conduction System The morphologic features of the cardiac muscle cells that form specialized conduction tissues, including the SAN, AVN, AV bundle (bundle of His), and bundle branches, vary greatly at different sites and among animal species but generally are thin, branching nodal muscle cells with scarce myofibrils separated by highly vascularized connective tissue ( Fig. 10-4 ; E-Fig. 10-4 ). Autonomic nerve fibers are contained within the SAN. The Purkinje fibers (cardiac conduction fibers) are distinguished by their large diameters (in horse and ox) and abundant pale eosinophilic sarcoplasm rich in glycogen and poor in myofibrils. Figure 10-4 Cardiac Conduction System. A, Sinoatrial (SA) node, foal. The center of the SA node (1) contains a nodal artery (2). H&E stain. A1, Higher magnification. Haphazardly oriented myofibers are embedded within abundant loose collagenous and elastic connective tissue. H&E stain. A2, Higher magnification. Nodal myofibers have discrete cell borders, a moderate amount of wavy sarcoplasm, and an elongated nucleus. H&E stain. B, Atrioventricular (AV) node, goat. The AV node (1) is composed of interconnecting nodal myofibers that are supported by loose collagenous and elastic fibrous stroma. The node is embedded in adipose tissue (2). Note that in this illustration the AV node (1) is a poorly demarcated region (see B1 for greater detail) that is elongated (flattened) from top to bottom and that it and its surrounding adipose tissue are positioned adjacent to the cardiac fibrous skeleton (arrows) that has undergone focal chondroid metaplasia (3). The position and overall shape of the AV node in a histologic section is dependent on the plane of section. Endocardium (arrowhead). H&E stain. B1, AV node, goat. In this higher magnification of B, AV nodal myofibers have a characteristic pale eosinophilic and thin sarcoplasm, with abundance of distinct striations and a short oval to elongated nucleus with dispersed chromatin. An autonomic myelinated nerve is present in the AV node (arrow). H&E stain. C, AV bundle, goat. The AV bundle (1) travels diagonally through the center of the figure from the lower left to the upper right margins. It is formed by an interweaving pseudosyncytium of cardiac myofibers supported by a loose to dense intervening collagenous stroma (see C1 for greater detail) and may be surrounded by adipose tissue (2). Cardiac cartilaginous skeleton (3). H&E stain. C1, Higher magnification. The AV bundle myofibers of the pseudosyncytium have moderate to large, pale eosinophilic sarcoplasm with prominent striations and large nuclei with fine stippled chromatin. H&E stain. (Courtesy Dr. A. Gal, Institute of Veterinary, Animal and Biomedical Sciences, Massey University; and Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-4 Heart, Fibrous Stroma of the Cardiac Conduction System, Goat. A, Atrioventricular (AV) node. The AV node (1) is composed of interconnecting nodal myofibers that are supported by loose collagenous and elastic fibrous stroma. The node is embedded in adipose tissue (2) that is adjacent to the cardiac fibrous skeleton (arrows) that has undergone focal chondroid metaplasia (3). Endocardium (arrowhead). H&E stain. A1, AV node, goat. Serial section of A . Note the overall deposition of collagen fibers (blue) in the structures labeled 1 and 3 in A. Masson's trichrome stain. B, AV bundle. In this illustration, the AV bundle (1) travels diagonally through the center of the image from the lower left to the upper right margins. It is supported by a loose to dense intervening interstitial collagenous stroma and is surrounded by adipose tissue (2). Cardiac cartilaginous skeleton (3). H&E stain. B1, AV bundle, goat. Serial section of B . Note the overall deposition of collagen fibers (blue) in the structures labeled in B. Masson's trichrome stain. (Courtesy Dr. A. Gal and Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Sinoatrial Node. The SAN is positioned adjacent to the epicardial adipose tissue and is often centered around a branch of the right coronary artery ( Fig. 10-4, A ). Several large autonomic nervous system ganglions can occasionally be seen clustering in the epicardium adjacent to the node. The SAN lacks discrete structure, and its ill-defined borders merge with the adjacent atrial wall. It structurally consists of a collection of haphazardly oriented myofibers that appear as a pseudosyncytium and are embedded within abundant loose collagenous and elastic connective tissue, with rare cores of epicardially oriented dense collagen fibers ( Fig. 10-4 , A1 ). The nodal myofibers have discrete cell borders, a moderate amount of wavy sarcoplasm with sparse myofibrils, and an elongated nucleus that contains clumps of coarse chromatin ( Fig. 10-4 , A2 ). Atrioventricular Node, Atrioventricular Bundle, and Bundle Branches. The AVN lies within the right atrial subendocardium and consists of a discrete, compact to loose mass of interconnecting myofibers that are often embedded within adipose tissue. A small nodal artery, parasympathetic ganglia, and large myelinated autonomic nerves are often present adjacent to the AVN. The nodal myofibers that have characteristic pale eosinophilic and thin sarcoplasm generally run parallel to each other but occasionally have an interweaving pattern with intervening loose collagen fibers. These myofibers contain a moderate amount of sarcoplasm with abundance of distinct striations and a short oval to elongated nucleus with dispersed chromatin. The AV bundle ( Fig. 10-4, B ) emerges from the cranial pole of the AVN ( Fig. 10-4 , B1 ) and pierces through the CFB, approximately at the level of the annuli of the aortic and mitral valves ( Fig. 10-4 , B2 ), to become the left and right bundle branches. The size of an AV bundle myofiber progressively enlarges, and its cytomorphology transitions from a pale eosinophilic, small and thin (AVN-like morphology) myofiber to a pale eosinophilic, foamy to waxy, large, and somewhat rectangular myofiber that lacks cross-striations (a Purkinje-like cellular morphology) ( Fig. 10-4, C ). Autonomic Nervous System. The nerve supply to the heart is autonomic and includes sympathetic, parasympathetic, and nonadrenergic noncholinergic innervation. Histologically, large nerves can be seen in the epicardium and adjacent to the coronary blood vessels, whereas special staining techniques are required for demonstration of neural tissue elsewhere. Electron microscopy and immunohistochemistry allow differentiation between sympathetic and parasympathetic nerves that are otherwise indistinguishable with H&E stain. Preganglionic parasympathetic fibers pass to the heart through the cardiac branch of the vagal nerve and synapse with parasympathetic ganglionic neurons. Postganglionic neurons are distributed to the SAN and AVN, as well as to atrial and, to a much lesser extent, ventricular myocardium (however, the ventricular conduction system is well supplied by cholinergic innervation). Postganglionic sympathetic fibers arising from the cervicothoracic and middle cervical ganglia intensely innervate the SAN and AVN and, to a lesser extent, the AV bundle. The atrial endocardium, myocardium, and epicardium are evenly innervated, whereas the ventricles are considerably less innervated, with epicardium more densely populated by neural tissue than the endocardium. Endocardium and Heart Valves The endocardium, lining the atrium and ventricles, consists of a continuous endothelium, subendothelium, and subendocardium. The subendothelial layer contains dense irregular fibroblasts intermixed with collagen and elastic fibers and occasional smooth muscle cells. Elastic fibers are abundant within the subendocardium of the atria. The subendocardial layer contains vascular structures, elastic and collagen bands, and fibroblasts and is continuous with the myocardium. Purkinje fibers are located in the subendocardium. The heart valves are poorly vascularized, endocardial folds covered by endothelium. The subendothelial layer is composed of fibroblasts with abundant elastic and collagen fibers. The AV valves (AVVs) consist of a layer of stratum spongiosum and stratum fibrosum. The stratum spongiosum consists of loosely arranged fibroblasts with moderate amounts of collagen and elastin fibers and vascular structures. The stratum fibrosis contains fibroblasts and collagen, which are continuous with the annulus fibrosis and chordae tendineae. Pericardium and Epicardium The pericardial sac is composed of parietal and visceral pericardium, both of which are covered by mesothelium. Beneath the visceral mesothelium is a thin layer of fibrous connective tissue, adipocytes, and vascular structures. This organization forms the subepicardium and interdigitates with the myocardium. The parietal pericardium is composed of an inner layer of mesothelium that interdigitates with the dense connective tissue forming the outer pericardial sac. Blood and Lymphatic Vascular Systems The overall design of the blood and lymphatic vessels is similar, except that luminal diameter, wall thickness, and the presence of other anatomic features, such as valves, vary between the different segments. The luminal surface of all vessels is lined by longitudinally aligned endothelial cells covering a basal lamina. Vessel walls are divided into three layers or tunics: intima, media, and adventitia. However, some of the layers can be absent or all of the layers can be thinned in some segments of the vascular system, depending on the intravascular pressures. The large elastic arteries such as the aorta have (1) an intima composed of endothelium and subendothelial connective tissue; (2) a very thick tunica media composed of fenestrated elastic laminae with interposed smooth muscle cells and ground substance and bordered internally by the internal elastic lamina and externally by the external elastic lamina; and (3) an outer tunica adventitia layer composed of collagen and elastic fibers and connective tissue cells with penetrating blood vessels, termed the vasa vasorum , supplying nutrients to the adventitia and the outer half of the media. In muscular arteries and arterioles, the tunica media is largely composed of smooth muscle cells arranged in a circumferential pattern. Arterioles are the smallest arterial channels and are generally less than 100 µm in diameter and with one to three layers of smooth muscle cells in the tunica media. Capillaries are 5 to 10 µm in diameter, and their endothelium is one of three types: (1) continuous, (2) fenestrated (as in the endocrine glands), or (3) porous (as in renal glomeruli). The endothelium rests on an external lamina surrounded by pericytes. Pericytes are located abluminally to capillaries and postcapillary venules and because of their location, contractility, and cytoskeletal proteins may play a role in regulating capillary and venular blood flow. Lesions of the endothelium might not be evident by light microscopy, and electron microscopy is required for characterization. Veins have thin walls in relation to their luminal size compared with those of arteries, in which blood pressure is greater. The adventitia is the thickest layer. Valves are present to prevent retrograde blood flow (i.e., away from the heart). Lymphatic capillaries lack a basal lamina. Large lymphatic vessels are similar in structure to veins and generally have large lumina, thin walls, and a greater number of intimal valves but contain lymph. The morphology of large arteries, veins, microvasculature, and lymphatic vessels is described in Chapter 2 and is not discussed further in this chapter. Myocardium The myocardium consists of cardiac muscle cells surrounded by interstitial components that include blood and lymphatic vessels, nerves, and connective tissue cells, such as fibroblasts, histiocytes, mast cells, pericytes, primitive mesenchymal stem cells, and extracellular matrix elements of connective tissue, including collagen fibrils, elastic fibers, and acid mucopolysaccharides. Cardiac muscle cells can be divided into two populations: the contracting myocytes and the specialized fibers of the conduction system. The contracting myocyte is a cross-striated branching fiber of an irregular cylindric shape that measures 60 to 100 µm in length and 10 to 20 µm in diameter, with centrally located, elongated nuclei. Myocytes in young animals are smaller and have less sarcoplasm. Atrial myocytes are smaller than ventricular myocytes. Adjacent myocytes are joined end-to-end by specialized junctions known as intercalated disks and less frequently by side-to-side connections termed lateral junctions. Multinucleated fibers with nuclei arranged in central rows are frequently seen in hearts of young pigs ( Fig. 10-3 ). The myocytes of old animals commonly have large polyploid nuclei. The cytoplasm (sarcoplasm) of myocytes is largely occupied by the contractile proteins that are highly organized into sarcomeres, the repeating contractile units of the myofibril (see Figs. 15-3 and 15-8). Myofibrils are formed by end-to-end attachment of many sarcomeres. The cross-striated or banded appearance of myocytes is the result of sarcomere organization into A bands composed of myosin in the form of "thick" filaments (12 to 16 nm in diameter), I bands composed of actin in the form of "thin" filaments (5 to 8 nm in diameter), and dense Z bands at the end of each sarcomere. Thick and thin filaments interdigitate and provide the basis for the sliding mechanism of muscle contraction. Myocytes are enclosed by the sarcolemma, which consists of the plasma membrane and the covering basal lamina (external lamina). Other important components of cardiac muscle cells are generally only apparent in electron micrographs and include abundant mitochondria, a highly organized network of intracellular tubules termed the sarcoplasmic reticulum , cylindric invaginations of the plasma membrane called T tubules , ribosomes, cytoskeletal filaments, glycogen particles, lipid droplets, Golgi complexes, atrial granules (contain atrial natriuretic factor), lysosomes, and residual bodies ( E-Fig. 10-3 ). Figure 10-3 Normal Cardiac Muscle. Left ventricular myocardium, longitudinal section, normal young pig. The multiple nuclei in a myocyte are readily seen and evaluated in a longitudinal section. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-3 Normal Cardiac Muscle. Heart, left ventricular myocytes, longitudinal section, normal rat. Numerous dense mitochondria (arrows) lie between myofibrils, which have prominent bands. N, Nucleus. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Cardiac Conduction System The morphologic features of the cardiac muscle cells that form specialized conduction tissues, including the SAN, AVN, AV bundle (bundle of His), and bundle branches, vary greatly at different sites and among animal species but generally are thin, branching nodal muscle cells with scarce myofibrils separated by highly vascularized connective tissue ( Fig. 10-4 ; E-Fig. 10-4 ). Autonomic nerve fibers are contained within the SAN. The Purkinje fibers (cardiac conduction fibers) are distinguished by their large diameters (in horse and ox) and abundant pale eosinophilic sarcoplasm rich in glycogen and poor in myofibrils. Figure 10-4 Cardiac Conduction System. A, Sinoatrial (SA) node, foal. The center of the SA node (1) contains a nodal artery (2). H&E stain. A1, Higher magnification. Haphazardly oriented myofibers are embedded within abundant loose collagenous and elastic connective tissue. H&E stain. A2, Higher magnification. Nodal myofibers have discrete cell borders, a moderate amount of wavy sarcoplasm, and an elongated nucleus. H&E stain. B, Atrioventricular (AV) node, goat. The AV node (1) is composed of interconnecting nodal myofibers that are supported by loose collagenous and elastic fibrous stroma. The node is embedded in adipose tissue (2). Note that in this illustration the AV node (1) is a poorly demarcated region (see B1 for greater detail) that is elongated (flattened) from top to bottom and that it and its surrounding adipose tissue are positioned adjacent to the cardiac fibrous skeleton (arrows) that has undergone focal chondroid metaplasia (3). The position and overall shape of the AV node in a histologic section is dependent on the plane of section. Endocardium (arrowhead). H&E stain. B1, AV node, goat. In this higher magnification of B, AV nodal myofibers have a characteristic pale eosinophilic and thin sarcoplasm, with abundance of distinct striations and a short oval to elongated nucleus with dispersed chromatin. An autonomic myelinated nerve is present in the AV node (arrow). H&E stain. C, AV bundle, goat. The AV bundle (1) travels diagonally through the center of the figure from the lower left to the upper right margins. It is formed by an interweaving pseudosyncytium of cardiac myofibers supported by a loose to dense intervening collagenous stroma (see C1 for greater detail) and may be surrounded by adipose tissue (2). Cardiac cartilaginous skeleton (3). H&E stain. C1, Higher magnification. The AV bundle myofibers of the pseudosyncytium have moderate to large, pale eosinophilic sarcoplasm with prominent striations and large nuclei with fine stippled chromatin. H&E stain. (Courtesy Dr. A. Gal, Institute of Veterinary, Animal and Biomedical Sciences, Massey University; and Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-4 Heart, Fibrous Stroma of the Cardiac Conduction System, Goat. A, Atrioventricular (AV) node. The AV node (1) is composed of interconnecting nodal myofibers that are supported by loose collagenous and elastic fibrous stroma. The node is embedded in adipose tissue (2) that is adjacent to the cardiac fibrous skeleton (arrows) that has undergone focal chondroid metaplasia (3). Endocardium (arrowhead). H&E stain. A1, AV node, goat. Serial section of A . Note the overall deposition of collagen fibers (blue) in the structures labeled 1 and 3 in A. Masson's trichrome stain. B, AV bundle. In this illustration, the AV bundle (1) travels diagonally through the center of the image from the lower left to the upper right margins. It is supported by a loose to dense intervening interstitial collagenous stroma and is surrounded by adipose tissue (2). Cardiac cartilaginous skeleton (3). H&E stain. B1, AV bundle, goat. Serial section of B . Note the overall deposition of collagen fibers (blue) in the structures labeled in B. Masson's trichrome stain. (Courtesy Dr. A. Gal and Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Sinoatrial Node. The SAN is positioned adjacent to the epicardial adipose tissue and is often centered around a branch of the right coronary artery ( Fig. 10-4, A ). Several large autonomic nervous system ganglions can occasionally be seen clustering in the epicardium adjacent to the node. The SAN lacks discrete structure, and its ill-defined borders merge with the adjacent atrial wall. It structurally consists of a collection of haphazardly oriented myofibers that appear as a pseudosyncytium and are embedded within abundant loose collagenous and elastic connective tissue, with rare cores of epicardially oriented dense collagen fibers ( Fig. 10-4 , A1 ). The nodal myofibers have discrete cell borders, a moderate amount of wavy sarcoplasm with sparse myofibrils, and an elongated nucleus that contains clumps of coarse chromatin ( Fig. 10-4 , A2 ). Atrioventricular Node, Atrioventricular Bundle, and Bundle Branches. The AVN lies within the right atrial subendocardium and consists of a discrete, compact to loose mass of interconnecting myofibers that are often embedded within adipose tissue. A small nodal artery, parasympathetic ganglia, and large myelinated autonomic nerves are often present adjacent to the AVN. The nodal myofibers that have characteristic pale eosinophilic and thin sarcoplasm generally run parallel to each other but occasionally have an interweaving pattern with intervening loose collagen fibers. These myofibers contain a moderate amount of sarcoplasm with abundance of distinct striations and a short oval to elongated nucleus with dispersed chromatin. The AV bundle ( Fig. 10-4, B ) emerges from the cranial pole of the AVN ( Fig. 10-4 , B1 ) and pierces through the CFB, approximately at the level of the annuli of the aortic and mitral valves ( Fig. 10-4 , B2 ), to become the left and right bundle branches. The size of an AV bundle myofiber progressively enlarges, and its cytomorphology transitions from a pale eosinophilic, small and thin (AVN-like morphology) myofiber to a pale eosinophilic, foamy to waxy, large, and somewhat rectangular myofiber that lacks cross-striations (a Purkinje-like cellular morphology) ( Fig. 10-4, C ). Autonomic Nervous System. The nerve supply to the heart is autonomic and includes sympathetic, parasympathetic, and nonadrenergic noncholinergic innervation. Histologically, large nerves can be seen in the epicardium and adjacent to the coronary blood vessels, whereas special staining techniques are required for demonstration of neural tissue elsewhere. Electron microscopy and immunohistochemistry allow differentiation between sympathetic and parasympathetic nerves that are otherwise indistinguishable with H&E stain. Preganglionic parasympathetic fibers pass to the heart through the cardiac branch of the vagal nerve and synapse with parasympathetic ganglionic neurons. Postganglionic neurons are distributed to the SAN and AVN, as well as to atrial and, to a much lesser extent, ventricular myocardium (however, the ventricular conduction system is well supplied by cholinergic innervation). Postganglionic sympathetic fibers arising from the cervicothoracic and middle cervical ganglia intensely innervate the SAN and AVN and, to a lesser extent, the AV bundle. The atrial endocardium, myocardium, and epicardium are evenly innervated, whereas the ventricles are considerably less innervated, with epicardium more densely populated by neural tissue than the endocardium. Sinoatrial Node. The SAN is positioned adjacent to the epicardial adipose tissue and is often centered around a branch of the right coronary artery ( Fig. 10-4, A ). Several large autonomic nervous system ganglions can occasionally be seen clustering in the epicardium adjacent to the node. The SAN lacks discrete structure, and its ill-defined borders merge with the adjacent atrial wall. It structurally consists of a collection of haphazardly oriented myofibers that appear as a pseudosyncytium and are embedded within abundant loose collagenous and elastic connective tissue, with rare cores of epicardially oriented dense collagen fibers ( Fig. 10-4 , A1 ). The nodal myofibers have discrete cell borders, a moderate amount of wavy sarcoplasm with sparse myofibrils, and an elongated nucleus that contains clumps of coarse chromatin ( Fig. 10-4 , A2 ). Atrioventricular Node, Atrioventricular Bundle, and Bundle Branches. The AVN lies within the right atrial subendocardium and consists of a discrete, compact to loose mass of interconnecting myofibers that are often embedded within adipose tissue. A small nodal artery, parasympathetic ganglia, and large myelinated autonomic nerves are often present adjacent to the AVN. The nodal myofibers that have characteristic pale eosinophilic and thin sarcoplasm generally run parallel to each other but occasionally have an interweaving pattern with intervening loose collagen fibers. These myofibers contain a moderate amount of sarcoplasm with abundance of distinct striations and a short oval to elongated nucleus with dispersed chromatin. The AV bundle ( Fig. 10-4, B ) emerges from the cranial pole of the AVN ( Fig. 10-4 , B1 ) and pierces through the CFB, approximately at the level of the annuli of the aortic and mitral valves ( Fig. 10-4 , B2 ), to become the left and right bundle branches. The size of an AV bundle myofiber progressively enlarges, and its cytomorphology transitions from a pale eosinophilic, small and thin (AVN-like morphology) myofiber to a pale eosinophilic, foamy to waxy, large, and somewhat rectangular myofiber that lacks cross-striations (a Purkinje-like cellular morphology) ( Fig. 10-4, C ). Autonomic Nervous System. The nerve supply to the heart is autonomic and includes sympathetic, parasympathetic, and nonadrenergic noncholinergic innervation. Histologically, large nerves can be seen in the epicardium and adjacent to the coronary blood vessels, whereas special staining techniques are required for demonstration of neural tissue elsewhere. Electron microscopy and immunohistochemistry allow differentiation between sympathetic and parasympathetic nerves that are otherwise indistinguishable with H&E stain. Preganglionic parasympathetic fibers pass to the heart through the cardiac branch of the vagal nerve and synapse with parasympathetic ganglionic neurons. Postganglionic neurons are distributed to the SAN and AVN, as well as to atrial and, to a much lesser extent, ventricular myocardium (however, the ventricular conduction system is well supplied by cholinergic innervation). Postganglionic sympathetic fibers arising from the cervicothoracic and middle cervical ganglia intensely innervate the SAN and AVN and, to a lesser extent, the AV bundle. The atrial endocardium, myocardium, and epicardium are evenly innervated, whereas the ventricles are considerably less innervated, with epicardium more densely populated by neural tissue than the endocardium. Endocardium and Heart Valves The endocardium, lining the atrium and ventricles, consists of a continuous endothelium, subendothelium, and subendocardium. The subendothelial layer contains dense irregular fibroblasts intermixed with collagen and elastic fibers and occasional smooth muscle cells. Elastic fibers are abundant within the subendocardium of the atria. The subendocardial layer contains vascular structures, elastic and collagen bands, and fibroblasts and is continuous with the myocardium. Purkinje fibers are located in the subendocardium. The heart valves are poorly vascularized, endocardial folds covered by endothelium. The subendothelial layer is composed of fibroblasts with abundant elastic and collagen fibers. The AV valves (AVVs) consist of a layer of stratum spongiosum and stratum fibrosum. The stratum spongiosum consists of loosely arranged fibroblasts with moderate amounts of collagen and elastin fibers and vascular structures. The stratum fibrosis contains fibroblasts and collagen, which are continuous with the annulus fibrosis and chordae tendineae. Pericardium and Epicardium The pericardial sac is composed of parietal and visceral pericardium, both of which are covered by mesothelium. Beneath the visceral mesothelium is a thin layer of fibrous connective tissue, adipocytes, and vascular structures. This organization forms the subepicardium and interdigitates with the myocardium. The parietal pericardium is composed of an inner layer of mesothelium that interdigitates with the dense connective tissue forming the outer pericardial sac. Blood and Lymphatic Vascular Systems The overall design of the blood and lymphatic vessels is similar, except that luminal diameter, wall thickness, and the presence of other anatomic features, such as valves, vary between the different segments. The luminal surface of all vessels is lined by longitudinally aligned endothelial cells covering a basal lamina. Vessel walls are divided into three layers or tunics: intima, media, and adventitia. However, some of the layers can be absent or all of the layers can be thinned in some segments of the vascular system, depending on the intravascular pressures. The large elastic arteries such as the aorta have (1) an intima composed of endothelium and subendothelial connective tissue; (2) a very thick tunica media composed of fenestrated elastic laminae with interposed smooth muscle cells and ground substance and bordered internally by the internal elastic lamina and externally by the external elastic lamina; and (3) an outer tunica adventitia layer composed of collagen and elastic fibers and connective tissue cells with penetrating blood vessels, termed the vasa vasorum , supplying nutrients to the adventitia and the outer half of the media. In muscular arteries and arterioles, the tunica media is largely composed of smooth muscle cells arranged in a circumferential pattern. Arterioles are the smallest arterial channels and are generally less than 100 µm in diameter and with one to three layers of smooth muscle cells in the tunica media. Capillaries are 5 to 10 µm in diameter, and their endothelium is one of three types: (1) continuous, (2) fenestrated (as in the endocrine glands), or (3) porous (as in renal glomeruli). The endothelium rests on an external lamina surrounded by pericytes. Pericytes are located abluminally to capillaries and postcapillary venules and because of their location, contractility, and cytoskeletal proteins may play a role in regulating capillary and venular blood flow. Lesions of the endothelium might not be evident by light microscopy, and electron microscopy is required for characterization. Veins have thin walls in relation to their luminal size compared with those of arteries, in which blood pressure is greater. The adventitia is the thickest layer. Valves are present to prevent retrograde blood flow (i.e., away from the heart). Lymphatic capillaries lack a basal lamina. Large lymphatic vessels are similar in structure to veins and generally have large lumina, thin walls, and a greater number of intimal valves but contain lymph. The morphology of large arteries, veins, microvasculature, and lymphatic vessels is described in Chapter 2 and is not discussed further in this chapter. Necropsy Assessment of Heart and Vascular Structures E-Figure 10-5 Postmortem "Chicken Fat" Arterial Cast, Dog. Note how the clot conforms to the shape of the lumens of the vessels from which it was removed. Chicken fat clots consist primarily of clotted plasma and fibrin and other proteins of the coagulation cascade. They are often indicative of anemia; however, in all animals their formation by the separation of the red blood cells from the rest of the components of blood depends on the erythrocyte sedimentation rate (ESR). Separation can occur in all animals in response to systemic inflammation, which increases the ESR, but the horse normally has a high ESR because equine erythrocytes clump together in rouleau formation, which increases the ESR. Thus, depending on the ESR, postmortem clots may be pale white to yellow ("chicken fat" clot) or shiny red ("currant jelly" clot) or sometimes a mixture. (Courtesy Dr. R.K. Myers, College of Veterinary Medicine, Iowa State University.) E-Figure 10-6 Focal Hemorrhage and Discoloration, Intracardiac Injection, Euthanasia Solution, Left Ventricle, Dog. Euthanasia solution is often injected into the left ventricle. In this case, solution was injected into the myocardium and caused a localized area of hemorrhage and discoloration. A mixture of euthanasia solution and blood often form a brownish sludge in the ventricle. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Examination of the Cardiovascular System and Lymphatic Vessels at Necropsy and Tissue Sampling for Histopathologic Evaluation E-Figure 10-7 Gross and Microscopic Examination of the Heart. Diagrams A to D illustrate the heart opened. The numbers indicate the area and the shape of the blocks of tissue removed for histopathology. A, Right ventricle and right atrium. B, Right ventricular cavity and pulmonary outflow tract. C, Left ventricle and left atrium. D, Left ventricle and aortic outflow tract. 1, Right ventricular free wall, atrioventricular valve, and atrium. 2, Pulmonic valve, right ventricular outflow tract, and pulmonary artery. 3, Right auricular appendage. 4, Sinoatrial node. 5, Left auricular appendage. 6, Left atrioventricular valve, ventricle, and atrium. 7 and 8, Left ventricular free wall and papillary muscles. 9, Atrioventricular node, right atrioventricular valve, and atrium. 10, Interventricular septum. 11, Aortic valve, left aortic outflow tract, and aorta. (From Bishop SP: Necropsy techniques for the heart and great vessels. In Fox P, Sisson D, Moise N, editors: Textbook of canine and feline cardiology , ed 2, Philadelphia, 1999, Saunders.) Function The primary function of the cardiovascular and lymphatic systems is to maintain an adequate and steady supply of nutrients to and facilitate the removal of waste products from all organs and tissues of the body. Cardiac myocytes provide the force of contraction; the conduction system and the nervous system control the flow and volume. Myocardium The results of normal cardiac function include the maintenance of adequate blood flow, called cardiac output, to peripheral tissues that provide delivery of oxygen and nutrients, the removal of carbon dioxide and other metabolic waste products, the distribution of hormones and other cellular regulators, and the maintenance of adequate thermoregulation and glomerular filtration pressure (urine output). The normal heart has a threefold to fivefold functional reserve capacity, but this capacity can eventually be lost in cardiac disease and the result is impaired function. Cardiac Conduction System Cells of the cardiac conduction system are modified cardiac myofibers that are able to spontaneously depolarize, which is also called autoexcitation , and function to (1) coordinate the sequence of events required for efficient ventricular filling during diastole and ejection during systole and (2) maintain the pressure in the pulmonary and systemic circuits (see E-Fig. 10-2 ). Depolarization of the membrane of these pacemaker cells is due to a transiently increased rapid permeability to sodium ions and a slightly longer lasting increase in permeability to calcium ions that results in their influx into the myofiber sarcoplasm, thus changing the membrane potential (see Chapter 14). As this transient permeability is lost, membranal potassium channels open, and rapid outward potassium flux results in myofiber membranal hyperpolarization (along with sodium and calcium efflux), ultimately bringing the membrane potential back to a "normal" steady state (resting potential). During this period of time (refractory period), the myocyte cannot depolarize again because of a special conformation of membrane sodium channels that is transiently lost with depolarization and regained only with hyperpolarization. Intrinsically, the resting membrane potential of pacemaker cells is more positive than that of contracting cardiomyocytes and slightly more negative than the membrane threshold potential. This difference is due to leakiness of the pacemaker cell membrane to sodium and calcium ions and a steady low-grade influx of these ions. Once one pacemaker cell depolarizes, a wave of depolarization propagates through the surrounding myocytes because these cells are connected to each other by special membranal pores (gap junctions), which allow for ionic exchange between adjacent cells. The number of gap junctions between cells of the conduction system is therefore a property that affects conduction velocity. Because the heart cycle must be strictly coordinated so that both atria and both ventricles contract and relax at the same time, and atrial contraction occurs simultaneous to the late ventricular relaxation, the depolarization wave has to be conducted fast at certain points along the conduction pathway and slower at others. Therefore, at different anatomic regions along the conduction pathway, the degree of cell-to-cell interaction dictates a slightly different cellular morphology. When an electric signal (a propagating depolarization front) is generated in the sinoatrial node (SAN) and spreads throughout the atria from cell to cell and eventually reaches the atrioventricular node (AVN), it is also conveyed through the specialized internodal conducting fibers. The conduction in these fibers is approximately three times faster than that of the atrial myofibers. By conveying the signal through these fibers, both atria can contract simultaneously and in a coordinated manner that allows the process of pushing of blood into the ventricles. Correlating with their special fast conducting function, these cells have a Purkinje-like morphology. The conduction velocity is then slowed down when propagating through the AVN. The time it takes to conduct the signal through the AVN and penetrating AV bundles is approximately four times longer than the time it takes for it to be conducted from the SAN to the AVN. This delay in conduction serves to empty the atria from blood before the ventricles start to contract. It also contributes to the unidirectional blood flow between the atria and the ventricles, above and beyond the similar role played by the atrioventricular valves (AVVs). Finally, the signal is delivered through the AV bundle, bundle branches, and Purkinje fibers in a velocity approximately 150 times faster than that of the AVN. The bundle branches run along the subendocardium of the interventricular septum and free ventricular walls and give rise to Purkinje fibers that supply the myocardium in a subendocardial-to-epicardial direction. This organization allows for a rapid and synchronous contraction of both ventricles at an order that ultimately enables blood to be "squeezed" from apex to base, toward both outflow tracts. Cardiac myofibers have a unique property of intrinsic coupling of the electrical stimulation with mechanical contraction, which is fundamental for cardiac function. Diastole starts immediately at the end of ventricular contraction, as the cardiac muscle (myocardium) starts to relax. For a brief moment, relaxation leads to a rapid fall in ventricular pressure, without change in ventricular volume as the AVVs are still sealed off (isovolumetric relaxation). Because of the fall in ventricular pressure, the blood that has pooled in the atria during systole, along with incoming blood that constantly flows from systemic and pulmonary veins through the atria, pushes the AVV open and rapidly and passively fills the ventricles (rapid-filling phase). Next, because of the resultant pressure rise in the ventricles, the flow of blood that continues to enter the ventricles through the atria abruptly ends (diastasis phase). The last phase of diastole is active contraction of the atria, which pushes blood into the (now somewhat less compliant) ventricles and further raises their pressure ("atrial kick"). In systole, the myocardium contracts, leading to a rapid increase in intraventricular pressure. Because the aortic and pulmonary valves are shut during diastole, the sudden rise in pressure leads to closure of the AVVs. In this brief period, which is termed isovolumetric contraction , the change in ventricular pressure has not led to a change in ventricular volume because the blood had not yet been ejected into the aorta and pulmonary arteries. When the pressure in the ventricles exceeds the pressure in the great arteries, the aortic and pulmonary valves (semilunar valves) open and the ejection of the blood through the right and left side outflow tracts ensues (ejection phase). Simultaneously with the ejection phase, the atria relax, atrial pressure falls, and blood enters the atria and pools within it passively. An additional level of complexity is brought about by the innervation of the autonomous nervous system (ANS). In general, the ANS influences heart rate (chronotropy), alters the rate of conduction (dromotropy), and controls myocardial contractility (inotropy) and the rate of mechanical relaxation (lusitropy). Parasympathetic postganglionic nerve terminals secrete acetylcholine that affects muscarinic (M2) receptors, whereas sympathetic postganglionic nerve terminals secrete norepinephrine that predominantly acts on the β 1 -adrenergic receptors. The latter, when stimulated by catecholamines, lead to a chain of intracellular events that increases calcium influx, increases the magnitude of potassium and chloride repolarization, and shortens the refractory period. Therefore adrenergic agonists are said to be positive chronotropes, inotropes, dromotropes, and lusitropes, whereas parasympathetic agonists have the opposite effects. Heart rate is primarily regulated by opposing effects of adrenergic and cholinergic nerve terminals on the SAN and at the same time by modulation of conduction velocity of the AVN and AV bundle. Physiologically, the force of contraction represents the sum of interactions between myocardial contractility, which is positively modulated by adrenergic nerve terminals that act on β 1 receptors on ventricular myocardial myofibers (positive inotropic effect), and by the volume of blood that is present in the ventricles just before contraction (preload), as well as by the resistance in front of which contraction actually takes place (afterload). Endocardium and Heart Valves The endocardium lines the myocardium and contains Purkinje nerve fibers, which transmit a rhythmic action potential throughout the myocardium leading to contraction. The endocardium is lined by endothelial cells, which modulate many aspects of normal hemostasis. In normal states, the endothelial cells are antithrombotic, preventing circulating cells from attaching and thus allowing normal flow of blood through the heart and blood vessels. The endocardium is continuous with the endothelium of blood and lymphatic vessels. Normal flow of blood through the heart depends on functional valves (see Chapter 2). Properly functioning valves serve as one-way valves, allowing blood either to flow from one chamber to another (through AVVs) or to exit from the heart and enter either the pulmonary circulation (pulmonic valve) or the systemic circulation (aortic valve). Pericardium and Epicardium The pericardium contains a small amount of serous fluid, which allows frictionless cardiac movement of the mesothelial surfaces of the pericardium and epicardium on each other. The pericardial sac can adapt to changes in the heart size provided adequate time. The pericardium functions to provide a protective environment for cardiac function. Rapid, abnormal filling with blood (hemopericardium), fluid (hydropericardium), or exudate (suppurative pericarditis) can result in compression of the heart (cardiac tamponade), particularly the large veins, right atrium, and right ventricle. Animals can survive without a pericardial sac. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood and lymphatic vessels have several important functions. Blood vessels regulate the differential distribution of blood flow to tissues. Blood vessels actively synthesize and secrete vasoactive substances that regulate vascular tone and antithrombotic substances, which maintain the fluidity of the blood. Blood and lymphatic vessels play an important role in transporting and controlling inflammation and thrombosis. Blood and lymphatic vessels also constitute an important pathway for disease dissemination through transport of bacteria and tumor cells to distant sites. Myocardium The results of normal cardiac function include the maintenance of adequate blood flow, called cardiac output, to peripheral tissues that provide delivery of oxygen and nutrients, the removal of carbon dioxide and other metabolic waste products, the distribution of hormones and other cellular regulators, and the maintenance of adequate thermoregulation and glomerular filtration pressure (urine output). The normal heart has a threefold to fivefold functional reserve capacity, but this capacity can eventually be lost in cardiac disease and the result is impaired function. Cardiac Conduction System Cells of the cardiac conduction system are modified cardiac myofibers that are able to spontaneously depolarize, which is also called autoexcitation , and function to (1) coordinate the sequence of events required for efficient ventricular filling during diastole and ejection during systole and (2) maintain the pressure in the pulmonary and systemic circuits (see E-Fig. 10-2 ). Depolarization of the membrane of these pacemaker cells is due to a transiently increased rapid permeability to sodium ions and a slightly longer lasting increase in permeability to calcium ions that results in their influx into the myofiber sarcoplasm, thus changing the membrane potential (see Chapter 14). As this transient permeability is lost, membranal potassium channels open, and rapid outward potassium flux results in myofiber membranal hyperpolarization (along with sodium and calcium efflux), ultimately bringing the membrane potential back to a "normal" steady state (resting potential). During this period of time (refractory period), the myocyte cannot depolarize again because of a special conformation of membrane sodium channels that is transiently lost with depolarization and regained only with hyperpolarization. Intrinsically, the resting membrane potential of pacemaker cells is more positive than that of contracting cardiomyocytes and slightly more negative than the membrane threshold potential. This difference is due to leakiness of the pacemaker cell membrane to sodium and calcium ions and a steady low-grade influx of these ions. Once one pacemaker cell depolarizes, a wave of depolarization propagates through the surrounding myocytes because these cells are connected to each other by special membranal pores (gap junctions), which allow for ionic exchange between adjacent cells. The number of gap junctions between cells of the conduction system is therefore a property that affects conduction velocity. Because the heart cycle must be strictly coordinated so that both atria and both ventricles contract and relax at the same time, and atrial contraction occurs simultaneous to the late ventricular relaxation, the depolarization wave has to be conducted fast at certain points along the conduction pathway and slower at others. Therefore, at different anatomic regions along the conduction pathway, the degree of cell-to-cell interaction dictates a slightly different cellular morphology. When an electric signal (a propagating depolarization front) is generated in the sinoatrial node (SAN) and spreads throughout the atria from cell to cell and eventually reaches the atrioventricular node (AVN), it is also conveyed through the specialized internodal conducting fibers. The conduction in these fibers is approximately three times faster than that of the atrial myofibers. By conveying the signal through these fibers, both atria can contract simultaneously and in a coordinated manner that allows the process of pushing of blood into the ventricles. Correlating with their special fast conducting function, these cells have a Purkinje-like morphology. The conduction velocity is then slowed down when propagating through the AVN. The time it takes to conduct the signal through the AVN and penetrating AV bundles is approximately four times longer than the time it takes for it to be conducted from the SAN to the AVN. This delay in conduction serves to empty the atria from blood before the ventricles start to contract. It also contributes to the unidirectional blood flow between the atria and the ventricles, above and beyond the similar role played by the atrioventricular valves (AVVs). Finally, the signal is delivered through the AV bundle, bundle branches, and Purkinje fibers in a velocity approximately 150 times faster than that of the AVN. The bundle branches run along the subendocardium of the interventricular septum and free ventricular walls and give rise to Purkinje fibers that supply the myocardium in a subendocardial-to-epicardial direction. This organization allows for a rapid and synchronous contraction of both ventricles at an order that ultimately enables blood to be "squeezed" from apex to base, toward both outflow tracts. Cardiac myofibers have a unique property of intrinsic coupling of the electrical stimulation with mechanical contraction, which is fundamental for cardiac function. Diastole starts immediately at the end of ventricular contraction, as the cardiac muscle (myocardium) starts to relax. For a brief moment, relaxation leads to a rapid fall in ventricular pressure, without change in ventricular volume as the AVVs are still sealed off (isovolumetric relaxation). Because of the fall in ventricular pressure, the blood that has pooled in the atria during systole, along with incoming blood that constantly flows from systemic and pulmonary veins through the atria, pushes the AVV open and rapidly and passively fills the ventricles (rapid-filling phase). Next, because of the resultant pressure rise in the ventricles, the flow of blood that continues to enter the ventricles through the atria abruptly ends (diastasis phase). The last phase of diastole is active contraction of the atria, which pushes blood into the (now somewhat less compliant) ventricles and further raises their pressure ("atrial kick"). In systole, the myocardium contracts, leading to a rapid increase in intraventricular pressure. Because the aortic and pulmonary valves are shut during diastole, the sudden rise in pressure leads to closure of the AVVs. In this brief period, which is termed isovolumetric contraction , the change in ventricular pressure has not led to a change in ventricular volume because the blood had not yet been ejected into the aorta and pulmonary arteries. When the pressure in the ventricles exceeds the pressure in the great arteries, the aortic and pulmonary valves (semilunar valves) open and the ejection of the blood through the right and left side outflow tracts ensues (ejection phase). Simultaneously with the ejection phase, the atria relax, atrial pressure falls, and blood enters the atria and pools within it passively. An additional level of complexity is brought about by the innervation of the autonomous nervous system (ANS). In general, the ANS influences heart rate (chronotropy), alters the rate of conduction (dromotropy), and controls myocardial contractility (inotropy) and the rate of mechanical relaxation (lusitropy). Parasympathetic postganglionic nerve terminals secrete acetylcholine that affects muscarinic (M2) receptors, whereas sympathetic postganglionic nerve terminals secrete norepinephrine that predominantly acts on the β 1 -adrenergic receptors. The latter, when stimulated by catecholamines, lead to a chain of intracellular events that increases calcium influx, increases the magnitude of potassium and chloride repolarization, and shortens the refractory period. Therefore adrenergic agonists are said to be positive chronotropes, inotropes, dromotropes, and lusitropes, whereas parasympathetic agonists have the opposite effects. Heart rate is primarily regulated by opposing effects of adrenergic and cholinergic nerve terminals on the SAN and at the same time by modulation of conduction velocity of the AVN and AV bundle. Physiologically, the force of contraction represents the sum of interactions between myocardial contractility, which is positively modulated by adrenergic nerve terminals that act on β 1 receptors on ventricular myocardial myofibers (positive inotropic effect), and by the volume of blood that is present in the ventricles just before contraction (preload), as well as by the resistance in front of which contraction actually takes place (afterload). Endocardium and Heart Valves The endocardium lines the myocardium and contains Purkinje nerve fibers, which transmit a rhythmic action potential throughout the myocardium leading to contraction. The endocardium is lined by endothelial cells, which modulate many aspects of normal hemostasis. In normal states, the endothelial cells are antithrombotic, preventing circulating cells from attaching and thus allowing normal flow of blood through the heart and blood vessels. The endocardium is continuous with the endothelium of blood and lymphatic vessels. Normal flow of blood through the heart depends on functional valves (see Chapter 2). Properly functioning valves serve as one-way valves, allowing blood either to flow from one chamber to another (through AVVs) or to exit from the heart and enter either the pulmonary circulation (pulmonic valve) or the systemic circulation (aortic valve). Pericardium and Epicardium The pericardium contains a small amount of serous fluid, which allows frictionless cardiac movement of the mesothelial surfaces of the pericardium and epicardium on each other. The pericardial sac can adapt to changes in the heart size provided adequate time. The pericardium functions to provide a protective environment for cardiac function. Rapid, abnormal filling with blood (hemopericardium), fluid (hydropericardium), or exudate (suppurative pericarditis) can result in compression of the heart (cardiac tamponade), particularly the large veins, right atrium, and right ventricle. Animals can survive without a pericardial sac. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood and lymphatic vessels have several important functions. Blood vessels regulate the differential distribution of blood flow to tissues. Blood vessels actively synthesize and secrete vasoactive substances that regulate vascular tone and antithrombotic substances, which maintain the fluidity of the blood. Blood and lymphatic vessels play an important role in transporting and controlling inflammation and thrombosis. Blood and lymphatic vessels also constitute an important pathway for disease dissemination through transport of bacteria and tumor cells to distant sites. Dysfunction/Responses to Injury Common pathophysiologic responses of the cardiovascular system to injury are listed in Box 10-1 and shown in E-Fig. 10-8 . The key characteristics of these responses are summarized here. The specific diseases that result from these responses are discussed in greater detail in the sections covering diseases that occur in all domestic animal species or that are unique to one species. Box 10-1 Pathophysiologic Mechanisms of Cardiovascular Dysfunction • Pump failure: Weak contractility and emptying of chambers, impaired filling of chambers • Obstruction to forward blood flow: Valvular stenosis, vascular narrowing, systemic or pulmonary hypertension • Regurgitant blood flow: Volume overload of chamber behind failing affected valve • Shunted blood flows from congenital defects: Septal defects in heart, shunts between blood vessels • Rupture of the heart or a major vessel: Cardiac tamponade, massive internal hemorrhage • Cardiac conduction disorders (arrhythmias): Failure of synchronized cardiac contraction E-Figure 10-8 Types of Myocardial Hypertrophy and Dilation. Left lateral view and midventricular cross section (not drawn to same scale). A, Aorta; LA, left atrium; LV, left ventricle; PA, pulmonary artery; RA, right atrium; RV, right ventricle. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Dysfunction: Heart Failure Pathophysiology of Heart Failure Heart failure is a progressive clinical syndrome in which impaired pumping decreases ventricular ejection and impedes venous return. The heart fails either by decreased blood pumping into the aorta and/or pulmonary artery to maintain arterial pressure (low-output heart failure) or by an inability to adequately empty the venous reservoirs (congestive heart failure) (see Box 10-1 ). Anamnestic signs of low cardiac output include depression, lethargy, syncope, and hypotension, and those of congestion include ascites, pleural effusion, and pulmonary edema. Syndromes of Cardiac Failure or Decompensation: Congestive Heart Failure Congestive heart failure can be right-sided, left-sided, or bilateral and can occur with cardiac dilation and/or hypertrophy ( Fig. 10-5 ). Right-sided congestive heart failure is associated with signs of congestion in the systemic circulation (i.e., ascites and peripheral edema [ Figs. 10-6 and 10-7 ]), whereas left-sided congestive heart failure causes signs of congestion in the pulmonary circulation (i.e., pulmonary edema and dyspnea). In small animals, pleural effusion is usually associated with bilateral congestive heart failure. Figure 10-5 Cardiac Dilation and Hypertrophy, Heart, Transected Ventricles, Dog. A, Cardiac dilation. Note the thin walls of both dilated ventricles. LV, Left ventricle. B, Cardiac hypertrophy (fixed tissue). Note that the right ventricular and left ventricular (LV) walls are approximately the same thickness, indicating that there is right ventricular hypertrophy. ( A courtesy Dr. Y. Niyo, College of Veterinary Medicine, Iowa State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy College of Veterinary Medicine, University of Florida; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Figure 10-6 Ascites, Congestive Heart Failure, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart and Liver, Duckling. Note prominent accumulations of serous fluid in the coelomic cavity and fibrin deposits over the surface of the liver. The heart (H) is dilated. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-7 Subcutaneous Edema, High-Altitude Disease with Congestive Heart Failure ("Brisket Disease"), Presternal, Sternal, and Caudal Sternocephalic Regions (Brisket), Cow. The extensive subcutaneous edema is the result of chronic congestive heart failure. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Heart failure may result from an inability of the heart to eject blood adequately (systolic failure), from inadequate ventricular filling (diastolic failure), or both. The resultant reduction in stroke volume (SV) leads to a decrease in cardiac output (CO) and a decrease in arterial blood pressure. Indices of Cardiac Function Arterial blood pressure (ABP) ~ CO × Z (where Z is the aortic input impedance ) and CO = SV × heart rate (HR). Increases in HR increase CO linearly until a plateau is reached, at which point further increases in HR will decrease CO because of decreased diastolic filling (the Frank-Starling law of the heart). Contractility and the two coupling factors, preload and afterload, primarily determine SV. The latter increases with increases in preload and contractility and decreases in afterload. Preload reflects the degree of ventricular filling just before contraction. End diastolic volume (EDV) can estimate preload. The force opposing ventricular ejection is termed afterload . Aortic input impedance best describes the opposition that the ventricle encounters at the time of ejection. An increase in afterload communicates itself to the ventricles during systole by increasing wall stress. Contractility is a change in the heart's ability to do work when the preload, afterload, and HR are kept constant. Diastolic ventricular filling, ventricular wall motion abnormalities, space-occupying lesions, and arrhythmias also affect SV. The properties of the arterial system can be described by the total arterial compliance, the peripheral resistance, and the characteristic impedance. Total arterial compliance corresponds to the elastic properties of arteries (i.e., aorta) and reflects change in volume from a given change in pressure. Peripheral resistance is largely determined by small arteries and arterioles and involves steady (nonpulsatile) flow. Characteristic impedance is the opposition to pulsatile flow. Left ventricular (LV) afterload is increased by an increase in peripheral resistance and characteristic impedance and a decrease in total arterial compliance. Subsequently, the left ventricle ejects into a stiff vasculature, increasing both the energetic cost to maintain blood flow and myocardial oxygen consumption (MVO 2 ). Characteristic impedance, a property of the proximal aorta, increases whenever the stiffness of the aorta increases or its radius becomes smaller. Peripheral resistance has a greater effect on ventricular performance than does characteristic impedance or compliance. Systolic and Diastolic Heart Failure Systolic heart failure is characterized by normal filling of the ventricle and a decrease in the forward stroke volume (SV). The decrease in SV may result from a decreased contractility ( myocardial failure ), from a primary increase in ventricular pressure ( pressure overload ), or or from an increase in ventricular volume ( volume overload ) ( Box 10-2 ). Myocardial failure may be primary (e.g., dilated cardiomyopathy) or may occur secondary to chronic volume or pressure overload. The most common causes for pressure overload in domestic animals are subaortic stenosis and hypertension (left-sided congestive heart failure) and heartworm disease ( E-Fig. 10-9 ), pulmonic stenosis (see Fig. 10-32 ), "brisket disease" ("high-altitude disease") in cattle (see Fig. 10-7 ), and chronic alveolar emphysema ("heaves") in horses (see Fig. 9-13) (right-sided congestive heart failure). Leaking valves, an abnormal communication between the systemic and pulmonary circulations, or high-output states (e.g., hyperthyroidism) usually result in increased ventricular volume (increased preload). Decrease in contractility lowers the SV, CO, and ABP and negates the heart's ability to compensate for the decrease in CO. Diastolic heart failure is characterized by improper filling of ventricles. This dysfunction may be caused by an impaired energy ventricular relaxation, myocardial dysfunction, obstruction to ventricular filling, or pericardial abnormalities ( Box 10-3 ). Box 10-2 Mechanisms Leading to Systolic Heart Failure Myocardial Failure • Dilated cardiomyopathy • Infectious myocarditis • Doxorubicin toxicity • Cardiomyopathy of overload (pressure/volume) • Myocardial infarcts • Right ventricular cardiomyopathy Volume Overload • Valvular diseases • Myxomatous endocardial degeneration • Endocarditis • Rupture of mitral chordae tendineae • Valvular dysplasia • PDA/VSD/ASD • Thyrotoxicosis • Chronic anemia • Peripheral arteriovenous fistula Pressure Overload • Subaortic stenosis • Pulmonic stenosis • Systemic hypertension • Pulmonary hypertension • Primary • Pulmonary embolism • Heartworm disease ASD, Atrial septal defect; PDA, patent ductus arteriosus; VSD, ventricular septal defect. Box 10-3 Mechanisms Leading to Diastolic Heart Failure Impaired Energy-Dependent Ventricular Relaxation or Abnormal Ventricular Chamber or Muscle Properties • Ventricular hypertrophy • Hypertrophic cardiomyopathy • Subaortic stenosis • Pulmonic stenosis • Heartworm disease • Systemic hypertension • Dilated cardiomyopathy • Myocardial infarct • Restrictive cardiomyopathy Obstruction to Ventricular Filling at Veins, Atria, and Atrioventricular Valves • Mitral stenosis • Tricuspid stenosis • Intracardiac obstruction by neoplasia • Cor triatriatum Pericardial Abnormalities • Constrictive disease • Cardiac tamponade E-Figure 10-9 Dirofilariasis, Heart, Dog. Note the hypertrophy of the right ventricle (RV) and adult Dirofilaria immitis in the pulmonary artery and its branches (PA). LV, Left ventricle. (Courtesy Dr. K. Read, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Concentric Hypertrophy In pressure overload states, the increase in resistance to ejected blood leads to compensatory dilation ( concentric hypertrophy ). Chamber dilation in turn helps to overcome the increased resistance and to maintain SV at the expense of MVO 2 , which eventually will lead to myocardial failure. LV wall stress = LV pressure LV radius 2 × LV wall thickness From the previous equation, it can be depicted that decreased wall stress can be achieved by decreasing LV radius and/or by increasing LV wall thickness . With a sustained pressure overload, the ventricular muscle adapts by undergoing concentric hypertrophy, which leads to an increase in wall thickness at the expense of a decrease in chamber size (decrease in ventricular radius), thus returning ventricular wall stress toward normal and increasing contractility. The hypertrophied ventricle is prone to ischemia, which leads to fibrosis and an increase in collagen content that interferes with diastolic filling, decreasing preload and SV. Therefore, in the end both systolic and diastolic dysfunction occur. Eccentric Hypertrophy In volume overload, the increase in chamber size occurs as a result of the need to accommodate a large ventricular EDV. Dilation of the ventricle by increasing the EDV leads to a lesser increase in wall stress than in pressure overload, and it subsequently results in ventricular eccentric hypertrophy in order to normalize wall stress. Volume overload is marked by an eccentric hypertrophy with a mild increase in wall thickness in the face of a large increase in LV radius. Diastole can be divided into four phases: (1) isovolumic relaxation (aortic valve closure to mitral valve opening), (2) rapid early mitral inflow (rapid filling phase during which most of ventricular filling occurs), (3) diastasis (slow filling phase during which little change occurs in ventricular volume and pressure), and (4) atrial contraction (atrial systole that actively pumps blood to the ventricle). Diastolic ventricular filling takes place during the second through fourth phases. Relaxation (phase 1) is a dynamic, energy-dependent process. β-Adrenergic stimulation improves relaxation, whereas ischemia, asynchrony of relaxation, an increase in afterload, ventricular hypertrophy, and abnormal calcium fluxes in the myocardial cells delay relaxation . Ventricular compliance (phases 2 through 4) is the ability of the heart to fill passively. Ventricular compliance is determined by volume, geometry, and the tissue characteristics of the ventricular wall. Ventricular compliance decreases with an increase in filling pressure and intrinsic myocardial stiffness (e.g., infiltrative diseases, fibrosis, and ischemia), with hypertrophy and cardiac tamponade. Lusitropy comprises the relaxation and filling phases. Ventricular filling may be affected by several factors, including isovolumic relaxation rate, synchrony between atrial kick and ventricular relaxation, compliance, and atrioventricular pressure gradient. The latter is the driving force for ventricular filling (which is mostly affected by intravascular volume and the degree of vasodilatation). The isovolumic relaxation rate is also an important determinant of early ventricular filling; adrenergic stimulation increases the rate of relaxation, improving relaxation to a greater extent than it improves contractility. Tachycardia shortens the duration of the diastasis. Loss of atrial contraction is one reason why dogs with dilated cardiomyopathy or myxomatous valvular degeneration develop heart failure when the atria start to fibrillate. Asynchronous relaxation (decrease in the uniformity of relaxation) of the left ventricle may be observed in cats with restrictive cardiomyopathy. LV hypertrophy decreases LV compliance and leads to poor diastolic function because of an increase in cardiomyocyte size, collagen formation, and wall thickening. Constrictive pericardial disease or cardiac tamponade impose their mechanical properties on those of the ventricle during the final phases of diastole. Hence, diastolic dysfunction results from abnormal relaxation (early diastole), abnormal compliance (early to late diastole), or external constraint by the pericardium (tamponade). Neuroendocrine Compensatory Mechanisms in Heart Failure Heart failure results in chronic activation of neuroendocrine compensatory mechanisms to restore and maintain ABP. High-pressure baroreceptors in the aortic arch and carotid sinus, mechanoreceptors in the ventricular myocardium, volume receptors in the atria and great veins, and the juxtaglomerular apparatus in the kidneys can sense alteration in ABP that results from a diminished CO. A reactive neuroendocrine activation decreases parasympathetic drive (immediate and short-lived) and increases sympathetic drive (slow but long-lasting), causing vasoconstriction (increasing arterial impedance) and tachycardia. A decrease in renal blood flow leads to renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) activation, contributing to vasoconstriction and sodium and water retention (increases the circulating volume). To maintain ABP, the cardiovascular system allows the venous pressure to increase and redistributes CO, maintaining blood flow mostly to essential organs. The cardiomyocytes also undergo changes to adapt to ventricular dysfunction, initially by performing extra work (stable hyperfunction) but over a long period these cardiomyocytes die (exhaustion and progressive cardiosclerosis phase). The net effect of neuroendocrine activation is vasoconstriction, sodium and water retention, LV hypertrophy, and coronary and peripheral vessel remodeling. Role of Catecholamines in the Progression of Heart Failure Dogs with congestive heart failure have increased norepinephrine (NE) concentrations secondary to NE "spillover" into plasma, and they have decreased uptake by adrenergic nerve endings. Despite the increase in the plasma concentration of NE, there is depletion of NE from the atria and ventricles (secondary to β-adrenoreceptor downregulation), which blunts the response to sympathetic activation. In normal hearts, the ratio of β 1 to β 2 receptors is approximately 80 : 20, whereas in failing hearts, it approaches 60 : 40. The decrease in NE stores and the changes in adrenoreceptors lead to a decrease in the contractile response of the myocardial cells and in a positive chronotropic response (increased HR). Chronic adrenergic stimulation also leads to an increase in afterload and MVO 2 , development of ventricular arrhythmias, and progression to left ventricular dysfunction. Role of Baroreceptors in the Progression of Heart Failure Baroreflex control is altered during congestive heart failure. Normally, an increase in atrial pressure (volume overload) stimulates atrial stretch receptors, inhibits the release of antidiuretic hormone (ADH), decreases sympathetic activity, and increases renal blood flow and the glomerular filtration rate. During congestive heart failure, atrial and arterial receptors have a decreased response to stimulation, and baroreceptor function is impaired. The overall effect is a decrease in parasympathetic activity and subsequent impaired restraint on the SAN, which results in a higher HR and decreased HR variability. Role of Renin-Angiotensin-Aldosterone System in the Progression of Heart Failure In congestive heart failure, renin is continuously released in the juxtaglomerular apparatus of the kidneys secondary to the low CO. Consequently, perpetuation of angiotensin II (AGII) effects leads to a vicious cycle that contributes to further declines in ventricular function. These include AGII-mediated increase in afterload, increase in MVO 2 , and increase in preload (through a decrease in venous capacity). AGII also stimulates the release of ADH and aldosterone (both contribute to total body water retention); the latter contributes to baroreceptor dysfunction, increased stiffness and decreased compliance of the arterial system, and increased Mg and K excretion. Increases in plasma aldosterone are associated with an inflammatory response that is thought to lead to intramural coronary artery remodeling and fibrosis. AGII stimulates growth factors, promoting remodeling in the vessels and myocardium (reduced NO synthesis or by increasing local angiotensin-converting enzyme breakdown of bradykinin). Consequently, vascular remodeling (i.e., smooth muscle hyperplasia, hypertrophy, and apoptosis) results in structural changes that further decrease the compliance of the arterial system. AGII has a key role in the development of pathologic hypertrophy, exerting cytotoxic effects on the myocardium, causing myocyte necrosis, and contributing to myocardial loss. Role of Natriuretic Peptides and Nitric Oxide in the Progression of Heart Failure The natriuretic peptides are counterregulatory hormones involved in volume homeostasis and cardiovascular remodeling, and they promote natriuresis, diuresis, peripheral vasodilatation, and inhibition of the RAAS. They consist of atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), C-type natriuretic peptide (CNP), dendraspis natriuretic peptides (DNP), and urodilatin. Despite the natriuretic peptides' beneficial effects during congestive heart failure, their release is overridden by the release of agents that cause vasoconstriction and sodium and water retention. NO regulates cardiac function through both vascular-dependent (coronary vessel tone, thrombogenicity, proliferative and inflammatory properties, and cellular cross-talk that supports angiogenesis) and vascular-independent (effects on several aspects of cardiomyocyte contractility, from the fine regulation of excitation-contraction coupling to modulation of autonomic signaling and mitochondrial respiration) effects. Overall, NO may play an important compensatory role in congestive heart failure during resting conditions by antagonizing neuroendocrine vasoconstrictive forces. Summary of Pathophysiology of Heart Failure In summary, long-term overload-induced cardiac hypertrophy is accompanied by myocardial cell death and cardiac fibrosis (i.e., cardiomyopathy of overload). The hypertrophied ventricle outstrips its blood supply. The relative decrease in oxygen delivery worsens the increased MVO 2 demand. The ischemia resulting from hypertrophy and stretching beyond certain limits decreases contractile strength and eventually leads to loss of contractile proteins within these cells or loss of these cells. These processes result in atrophy of the affected myocardium and lead to the development of multifocal myocardial fibrosis and atrophy, which consequently interferes with diastolic function. When early interstitial fibrosis progresses to individuation of cardiac myocytes (with progression of hypertrophy), both systolic and diastolic functions are impaired. Therefore congestive heart failure is a progressive and irreversible disease with myocardial cell death and functional myocardial failure that ultimately leads to death. The cycles resulting in progressive left heart failure are detailed in Fig. 10-8 . Figure 10-8 Pathophysiology of Left Heart Failure. Pathophysiologic cycles that lead to progressive left heart failure. Cycle 1: Increased total vascular resistance increases myocardial wall stress that induces myocardial hypertrophy. Cycle 2: Water and sodium retention leads to increased preload and vascular congestion. Cycle 3: Neuroendocrine activation leads to myocardial and vascular remodeling. All cycles contribute to further myocardial dysfunction and neuroendocrine activation. (Adapted from Ettinger SJ, Feldman EC: Textbook of veterinary internal medicine, ed 6, St. Louis, 2005, Saunders.) Cardiac Syncope Cardiac syncope, an acute expression of cardiac disease, is characterized clinically by collapse, loss of consciousness, and extreme changes in heart rate and blood pressure, and with or without demonstrable lesions. Syncope can be caused by massive myocardial necrosis, ventricular fibrillation, heart block, arrhythmias, and reflex cardiac inhibition (e.g., that associated with high intestinal blockage). Types of Heart Failure A wide variety of experimental animal models of heart failure exist ( E-Table 10-1 ). The models have been used to develop an understanding of human cardiac disease. E-Table 10-1 Experimental Models of Heart Failure Experimental Model Experimental Method Species Pressure loading Pulmonary artery banding Rat, dog, pig, sheep, pony Aortic constriction Rat, rabbit, dog, sheep Supravalvular aortic constriction Dog Aortic valve stenosis Rabbit, dog Pulmonary valve stenosis Dog Experimental hypertension Rat, dog Volume loading Fluid overload Baboon Aorta-to-vena cava fistula Rat, dog Aortic valve incompetence Rat, rabbit Atrial septal defect Cat Myocardial infarction Sustained atrial pacing Dog Coronary ligation Dog, pig Controlled occlusion—subclavian-to-carotid shunt Dog Coronary embolism Dog, calf, pig Thrombus generation Dog Chronic hypoxia Rat Cardiomyopathy and other conditions Left ventricular Dacron patch Dog Spontaneous cardiomyopathy Hamster, mouse, cattle, rat, turkey, cat, dog Barbiturate overdose Dog Furazolidone cardiomyopathy Turkey, duckling Adriamycin cardiomyopathy Rat, dog, mouse, pig Isoprenaline Rat Noradrenaline Dog Amphetamine Rat Cobalt chloride Rat, pig Vitamin E deficiency Rat, mouse, calf, lamb Alcohol intoxication Rat Coxsackie viral myocarditis Mouse Viral encephalomyocarditis Mouse Altered cardiac development and/or function Transgenic mice Modified from Smith HJ, Nuttall A: Cardiovasc Res 19:181-186, 1985. Clinical Diagnostic Procedures For information on this topic, see E-Appendix 10-3 at www.expertconsult.com . Responses to Injury: Myocardium Common responses of the myocardium to injury are listed in Box 10-4 . Box 10-4 Responses of the Myocardium to Injury Disturbances of Circulation Hemorrhage Effusions Thrombosis and embolism Disturbances of Growth Atrophy (dilation) Hypertrophy Agenesis (aplasia), hypoplasia, dysplasia (dysgenesis) Developmental errors, congenital anomalies Neoplasia (neoplastic transformation) Cell Degeneration and Death Cell and metabolic dysfunction Oncotic necrosis Apoptosis INFLAMMATION Disturbances of Circulation Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). See section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Circulation , Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). Disturbances of Growth Myocardial Hypertrophy. See the discussion on hypertrophy in Chapter 1. Hypertrophy of the myocardium represents an increase in muscle mass, which is the result of an increase in the size of cardiac muscle cells ( Fig. 10-9 ; also see Fig. 10-5, B and E-Fig. 10-9 ). Two anatomic forms of hypertrophy are recognized. Eccentric hypertrophy results in a heart with enlarged ventricular chambers and walls of normal to somewhat decreased thickness. Volume-overload hypertrophy is characterized by new sarcomeres being assembled in series within sarcomeres resulting in increased length of myofibers. In concentric hypertrophy, the heart is characterized by small ventricular chambers and thick walls. Pressure-overload hypertrophy is the result of the formation of new sarcomeres assembled predominantly in parallel to the long axes of cells resulting in an increase in thickness of the myofiber. Some cats with hyperthyroidism have a cardiac hypertrophy that is mediated by enhanced production of myocardial contractile proteins under the influence of increased concentration of circulating thyroid hormones ( Fig. 10-10 ). The hypertrophy is reversible on return to euthyroidism. Figure 10-9 Cardiac Muscle Cells. Growth disturbances of atrophy and hypertrophy. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-10 Left Ventricular Hypertrophy, Hyperthyroidism, Heart, Bisected, Cat. Note prominent thickening of the left ventricular (LV) free wall. The ventricular septum (VS) is also thickened. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Three stages of myocardial hypertrophy are recognizable: (1) initiation, (2) stable hyperfunction, and (3) deterioration of function associated with degeneration of hypertrophied myocytes. Microscopically, in myocardial hypertrophy, the myocytes are enlarged and have large nuclei ( Fig. 10-11 ). Figure 10-11 Hypertrophic Cardiomyopathy, Myocyte Hypertrophy, Heart, Myocardium, Cat. Cardiac myocytes are hypertrophied, and there is an increase in interstitial fibroblasts. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Physiologic Atrophy. Physiologic atrophy of heart muscle may occur in confined animals and also occurs as a result of decompensation of cardiac myocytes in chronic congestive heart failure (see Fig. 10-5, A ). Initially, these myocytes respond through hypertrophy with increased contractile force according to the Frank-Starling phenomenon. However, stretching beyond certain limits decreases contractile strength and eventually leads to loss of contractile proteins within these cells or loss of these cells resulting in atrophy of the affected myocardium (see Fig. 10-9 ). Neoplastic Transformation. See Chapter 6 for a discussion of the mechanisms involved in neoplastic transformation. Rhabdomyomas and rhabdomyosarcomas are primary tumors that originate from the myocardium in domestic animals. Fibrosarcomas also occur rarely. Numerous types of secondary tumors, such as lymphosarcomas, metastasize to the myocardium and are discussed in this chapter and other chapters of this book. Hemangiosarcomas are tumors of blood vessels of the myocardium of the right atrium and are discussed later. Cell Degeneration and Death Sublethal cardiac muscle cell injuries include lipofuscinosis, fatty degeneration, myocytolysis, and vacuolar degeneration ( Fig. 10-12 ; see Chapter 1). Histopathologic study of sections of the myocardium is substantially limited with respect to specific diagnoses and only rarely can an etiologic diagnosis be made from the morphologic alterations. This inadequacy exists because the spectrum of pathologic reactions is limited, and many agents that damage the heart produce similar lesions. Myocardial necrosis can be confused with myocardial inflammation with secondary necrosis because both lesions have substantial leukocytic infiltration. Some animals that die peracutely from cardiac failure lack detectable microscopic alterations and are presumed to have suffered from an arrhythmic episode resulting in syncope. Hearts with long-standing myocardial damage have foci of fibrosis, regardless of the cause of the loss of myocytes. Correlation between the severity of clinical cardiac disease and the severity of myocardial injury can be poor: A small lesion at a critical site, such as a portion of the conduction system, can be fatal, whereas a widespread myocardial lesion, such as myocarditis, can be asymptomatic. Figure 10-12 Various Sublethal Cardiac Muscle Cell Injuries. A, Lipofuscinosis. B, Fatty degeneration. C, Myocytolysis. D, Vacuolar degeneration. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Cardiac myofibers can respond to toxins in a variety of ways—apoptosis, myofibrillar lysis, and coagulation necrosis are but a few mechanisms that may result from toxic exposure. A long list of toxins are responsible for causing myocardial injury; some of the most frequently observed current examples are ionophore toxicity in horses and ruminants, vitamin E–selenium deficiency in the young of many species, "heart-brain syndrome" of dogs (see Fig. 10-82 ), anthracycline toxicity in dogs, and gossypol toxicosis in pigs ( Box 10-5 ). In various localized areas throughout the world, numerous deaths in ruminants have resulted from consumption of poisonous plants such as Acacia georginae and Dichapetalum cymosum . Box 10-5 Causes of Myocardial Necrosis in Animals Nutritional Deficiencies Vitamin E–selenium, potassium, copper, thiamine, magnesium Toxicities Cobalt, catecholamines, vasodilator antihypertensive drugs, methylxanthines (theobromine, theophylline, caffeine), ionophores (monensin, lasalocid, salinomycin, maduramicin, narasin), vitamin D and calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , Solanum torvum ), other poisonous plants ( Acacia georginae , Gastrolobium spp., Oxylobium spp., Dichapetalum cymosum , Persea americana , Cassia occidentalis , Cassia obtusifolia , Karwinskia humboldtiana , Ateleia glazioviana , Eupatorium rugosum , Adonis aestivalis , Pachystigma pygmaeum , Fadogia homblei , Pavetta harborii , Tetrapterys multiglandulosa ), blister beetles ( Epicauta ), high-erucic-acid rapeseed oil, brominated vegetable oils, gossypol, T-2 mycotoxin, sodium fluoracetate (compound 1080), selenium, uremia Physical Injuries and Shock Central nervous system lesions and trauma ("heart-brain syndrome"), gastric dilation and volvulus, stress, overexertion, electrical defibrillation, hemorrhagic shock Cardiotoxicity has emerged as a significant clinical entity in veterinary medicine in recent years with the growing use of antineoplastic drugs in small animal practice and the widespread use of growth promotants in ruminants (see Fig. 10-49 ). The mechanisms of cardiotoxicities include (1) exaggerated pharmacologic action of drugs acting on cardiovascular tissues, (2) exposure to substances that depress myocardial function, (3) direct injury of cardiac muscle cells by chemicals, and (4) hypersensitivity reactions. Oncotic Necrosis. Necrosis of cardiac muscle cells is generally followed by leukocytic invasion and phagocytosis of sarcoplasmic debris ( Fig. 10-13 ; also see Figs. 15-13 and 15-14). The end result is persistence of collapsed sarcolemmal "tubes" of basal lamina surrounded by condensed interstitial stroma and vessels. Lesions with severe disruption of the myocardium have residual changes of fibroblastic proliferation and collagen deposition to form scar tissue. Regeneration of cardiac muscle cells generally does not occur, except in less evolved animals, such as amphibians and fish, and in certain inbred mouse strains. The continual contraction of intact cardiac muscle cells impairs the mechanisms for regeneration. Also, in hearts of neonatal animals and more often in avian hearts, a limited amount of myocyte regeneration has been reported. Hyperplasia of myocytes is a normal component of cardiac growth in fetal development and during the first few weeks of life. Thereafter, proliferation ceases and "normal growth" is the result of hypertrophy until cell size normal for each species is reached. Recent studies indicate that stem cells exist in adult animal and human hearts, and with myocardial injury, these cells may differentiate into cardiac muscle cells. However, the extent of myocyte regeneration is probably minimal. Figure 10-13 Sequential Events in Myocardial Necrosis. A, Various injuries lead to (B1) hyaline necrosis or (B2) apoptosis membrane blebbing . C, Healing with phagocytosis of cellular debris by macrophages, and (D) subsequent healing with fibrosis, rather than by regeneration. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Apoptosis. Apoptosis (programmed cell death of cardiac myocytes) is increasingly recognized for its role in the development of various myocardial lesions and cardiac diseases (see Chapter 1). These conditions include cardiac development, ischemic injury, several types of experimentally induced heart failure (ischemia-reperfusion, hypoxia, and pressure-overload hypertrophy), and cardiotoxicity. In some cell systems, apoptosis can be triggered by the presence of excessive amounts of oxygen free radicals. Cells dying by apoptosis shrink and form apoptotic bodies. In contrast to cell death by necrosis, apoptosis is not accompanied by an inflammatory reaction and fibrosis. Fatty Infiltration. Fatty infiltration is the presence of increased numbers of lipocytes interposed between myocardial fibers. The lesion is associated with obesity and age and appears as abundant epicardial and myocardial deposits of adipose tissue. Grossly, the myocardium has irregular layers of adipose tissue infiltrating normal myocardium. The atria and right ventricle are most often affected. Fatty Degeneration. Fatty degeneration (fatty change) is the accumulation of abundant lipid droplets in the sarcoplasm of myocytes. Microscopically, affected myocytes have numerous variably sized spherical droplets that appear as empty vacuoles in paraffin sections but stain positively for lipids with lipid-soluble stains in frozen sections. This lesion occurs with systemic disorders, such as severe anemia, toxemia, and copper deficiency, but is seen much less often in the heart than in the liver and kidneys (also see Chapter 1). Hydropic Degeneration. Hydropic degeneration, a distinctive microscopic alteration in cardiac muscle cells, is associated with chronic administration of anthracyclines, a group of antineoplastic drugs. Chronic passive congestion with ascites and cardiac dilation may result ( E-Figs. 10-10 and 10-11 ); see Figs. 10-5, A and 10-6 ). Affected fibers have extensive vacuolization of sarcoplasm that is initiated by distention of elements of sarcoplasmic reticulum and eventually ends in lysis of contractile material ( E-Figs. 10-12 and 10-13 ). E-Figure 10-10 Chronic Passive Congestion, Doxorubicin Cardiotoxicity, Congestive Heart Failure, Liver, Ascites, Rabbit. Note the light-red-stained transparent fluid in the peritoneal cavity (ascites) and the mottled liver (L) characteristic of chronic passive congestion. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-11 Cardiac Dilation, Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Rabbit. All cardiac chambers are dilated. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-12 Myocardial Vacuolar Degeneration, Chronic Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Section of Myocardium, Dog. The affected myocytes have prominent sarcoplasmic vacuolation (arrows). Plastic-embedded, toluidine blue–stained section. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-13 Sarcoplasmic Vacuolation, Chronic Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Section of Myocardium, Dog. The prominent sarcoplasmic vacuolation (V) is produced by distention of elements of sarcoplasmic reticulum. Even though the myofibrils have extensive lysis, mitochondria (arrowheads) are intact. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hydropic degeneration of cardiac muscle cells may also result from drug-induced injury to mitochondria. Antiretroviral drugs, such as nucleoside reverse transcriptase inhibitors (zidovudine or AZT), are linked to this distinctive lesion. Scattered cardiac muscle cells appear swollen with pale sarcoplasm by light microscopy. Electron microscopy reveals extensive mitochondrial swelling and disruption of cristae with subsequent formation of myelin figures from the membrane debris of damaged mitochondria. Myofibrillar Degeneration. Myofibrillar degeneration (myocytolysis) represents a distinctive sublethal injury of cardiac muscle cells. Affected fibers have pale eosinophilic sarcoplasm and lack cross-striations. Ultrastructurally, myofibrils have a variable extent of dissolution (myofibrillar lysis). This lesion has been described in furazolidone cardiotoxicity in birds ( Fig. 10-14 ; E-Fig. 10-14 ) and potassium deficiency in rats. Figure 10-14 Ventricular Dilation, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart, Duckling. Note that the dilated ventricles have collapsed once the blood was removed. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-14 Myofibrillar Lysis, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart, Ventricular Myocardium, Duckling. Affected myocytes have extensive dissolution of myofibrils with scattered free myofilaments and dense clumps of Z-band material (arrowheads). Other organelles appear normal. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Lipofuscinosis. Lipofuscinosis (brown atrophy) of the myocardium occurs in aged animals and in animals with severe cachexia, but it also has been described as a hereditary lesion in healthy Ayrshire cattle. Severely affected hearts appear brown and microscopically have clusters of yellow-brown granules at the nuclear poles of myocytes. These granules represent intralysosomal accumulation of membranous and amorphous debris (residual bodies). Mineralization. Myocardial mineralization (calcium) is a prominent feature in several diseases, such as hereditary calcinosis in mice, cardiomyopathy in hamsters, vitamin E–selenium deficiency in sheep and cattle ( Fig. 10-15 ), vitamin D toxicity in several species, calcinogenic plant toxicosis in cattle ("Manchester wasting disease"), and spontaneous myocardial calcification in aged rats and guinea pigs. Figure 10-15 Calcification, Vitamin E–Selenium Deficiency, Myocardial Necrosis, Heart, Right Ventricle, Lamb. The multiple white (W) subendocardial lesions are areas of calcified necrotic cardiac myocytes. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Myocardial Necrosis. Myocardial necrosis can result from a number of causes, including nutritional deficiencies, chemical and plant toxins, ischemia, metabolic disorders, heritable diseases, and physical injuries (see Box 10-5 ). Grossly, affected areas appear pale initially, and some progress to prominent yellow to white (see Fig. 10-49 ), dry areas made gritty by dystrophic mineralization. The lesions are focal, multifocal, or diffuse. The most frequent sites of focal lesions are the left ventricular papillary muscles and the subendocardial myocardium, especially when such lesions are related to transient reduction of vascular perfusion. These lesions can be overlooked at necropsy unless multiple incisions are made in the ventricular myocardium. In diseases with diffuse cardiac necrosis, such as white muscle disease of calves and lambs due to vitamin E–selenium deficiency, the discrete white lesions can be readily observed beneath the epicardial and endocardial surfaces ( Fig. 10-16 ). Figure 10-16 Myocardial Necrosis, Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Left Ventricular Myocardium, Calf. A, Note the prominent white chalky areas of necrosis with mineralization (arrows) of the myocardium. B, Similar necrosis is subepicardially and subendocardially in the sectioned free walls of the left ventricle and subendocardially in the myocardium of the ventricular septum (center). ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B courtesy Dr. P.N. Nation, Animal Pathology Services; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Microscopically, the appearance depends on the age of the lesions. Fibers in areas of recent necrosis often appear swollen and hypereosinophilic (hyaline necrosis). Striations are indistinct, and nuclei are pyknotic. Necrotic fibers often have scattered basophilic granules ( Fig. 10-17 ) that represent calcified mitochondria and can be confirmed by electron microscopy ( E-Fig. 10-15 ). In a second pattern of necrosis, affected myocytes have a "shredded" appearance because of hypercontraction and the formation of multiple transversely oriented bars of disrupted contractile material (often termed contraction band necrosis ) ( E-Fig. 10-16 ). A third pattern is seen in necrotic myocytes in large areas of ischemic necrosis (infarcts). These myocytes have features of coagulation necrosis and have relaxed rather than hypercontracted contractile elements. Figure 10-17 Acute Myocardial Necrosis with Mineralization, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Ventricular Myocardium, Pig. The darker red myocytes are necrotic, and some are mineralized (purplish areas). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-15 Myocardial Necrosis, Monensin Toxicosis, Necrotic Myocyte, Heart, Longitudinal Section, Calf. The necrotic myocyte (center) has disrupted myofibrils, damaged mitochondria with matrical densities, and several invading macrophages (M). F, Fibrin. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-16 Myocardial Necrosis, Electric Shock Overdose by Defibrillator, Heart, Dog. The dark shredded segments of myocytes are due to acute contraction band necrosis. The time interval between defibrillation and the fixation of the heart was 24 hours. Plastic-embedded, toluidine blue–stained section. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Within 24 to 48 hours after injury, necrotic areas are infiltrated by inflammatory cells, mainly macrophages and a few neutrophils; these phagocytose and lyse the necrotic cellular debris ( E-Fig. 10-17 ). In early stages of healing of necrosis, it is often difficult to distinguish the lesions from those found in some types of myocarditis (see later discussion). Later, when necrosis has progressed somewhat, lesions consist of persistent stromal tissue (interstitial fibroblasts, collagen, and capillaries) and empty "tubes" of basal laminae formerly occupied by necrotic myocytes (see Chapter 15). The healing phase is characterized by proliferation of connective tissue cells (fibroblasts) ( Fig. 10-18 ) and by deposition of connective tissue products (collagen and elastic tissue and acid mucopolysaccharides). Grossly, these areas with healing of myocardial necrosis appear as white, firm, contracted scars. Figure 10-18 Healing, Postmyocardial Necrosis, Heart, Ventricle, Dog. The necrotic myocytes have been removed by phagocytosis by macrophages (not seen here) , and the area is now undergoing fibrosis. H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-17 Myocardial Necrosis, Monensin Toxicosis, Heart, Section of Myocardium, Calf. Necrotic myocyte has disrupted contractile material invaded by a macrophage (M). The basal lamina of the necrotic myocyte is noted by arrowheads . TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The outcome of myocardial necrosis varies, depending on the extent of the damage: • Many animals die unexpectedly of acute cardiac failure if the myocardial damage is extensive. • Early deaths from necrosis-related arrhythmias also occur when cardiac conduction is disrupted. • Some cases eventually develop cardiac decompensation and die with cardiac dilation, scarring, and lesions of chronic congestive failure. Hearts with minimal damage have only microscopically detectable myocardial fibrosis when death eventually occurs from other diseases. Inflammation Myocarditis. The various infectious diseases that cause myocarditis in animals are summarized in Box 10-6 . Myocarditis generally is the result of infections spread hematogenously to the myocardium and occurs in various systemic diseases. Infrequently, the heart is the primary location in affected animals and responsible for death. Types of inflammation provoked by infectious agents that produce myocarditis include suppurative, necrotizing, hemorrhagic, lymphocytic, and eosinophilic. Suppurative myocarditis results from localization of pyogenic bacteria in the myocardium ( Fig. 10-19 ) that are trapped in thromboemboli most commonly originating from vegetative valvular endocarditis on the mitral and aortic valves. Septic infarcts with pale, disseminated lesions may be grossly evident in the myocardium. These foci consist of neutrophils and necrotic myocytes that form abscesses. Box 10-6 Diseases that Cause Myocarditis in Animals Viral Canine parvovirus, encephalomyocarditis, foot-and-mouth disease, pseudorabies, canine distemper, cytomegalovirus, Newcastle disease, avian encephalomyelitis, eastern and western equine encephalomyelitis, West Nile virus Bacterial Blackleg ( Clostridium chauvoei ), listeriosis ( Listeria monocytogenes ), Tyzzer's disease ( Clostridium piliforme , formerly Bacillus piliformis ), necrobacillosis ( Fusobacterium necrophorum ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), caseous lymphadenitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ), disseminated infections by Actinobacillus equuli , Staphylococcus sp., Corynebacterium kutscheri , Trueperella ( Arcanobacter ) pyogenes , Histophilus somni , Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus equi , and Streptococcus pneumoniae Protozoan Toxoplasmosis ( Toxoplasma gondii ), sarcocystosis ( Sarcocystis sp.), neosporosis ( Neospora caninum ), encephalitozoonosis ( Encephalitozoon cuniculi ), trypanosomiasis (Chagas' disease [ Trypanosoma cruzi ]), East Coast fever ( Theileria parva ) Parasitic Cysticercosis ( Cysticercus cellulosae ), trichinosis ( Trichinella spiralis ) Idiopathic Eosinophilic myocarditis Figure 10-19 Acute Myocarditis, Horse. A, The parallel arrays of myofibers are disrupted by acute inflammatory cells, edema fluid, and fibrin. B, Higher magnification of A. Note the myocardial fiber degeneration and necrosis with loss of cross striations (arrows) ; fragmentation of cardiac rhabdomyocytes (cardiomyocytes); and hypereosinophilia, coagulation, and clumping of the sarcoplasm. Neutrophils are the predominant inflammatory cell in the exudate. H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) The pathogenesis and expected outcome of cases of myocarditis remain an important area of research because of the severity of this lesion in cardiac failure in human beings. The sequelae to myocarditis include (1) complete resolution of lesions, (2) scattered residual myocardial scars, or (3) progressive myocardial damage with acute or, in some cases, chronic cardiac failure as secondary dilated (congestive) cardiomyopathy. In experimental studies of myocarditis induced in mice by coxsackie B virus, the severity of myocarditis was influenced by the virulence of the virus and mouse strain and was enhanced by host factors such as young age, male sex, pregnancy, poor nutrition, whole-body ionizing radiation, cold environmental temperatures, alcohol ingestion, exercise, and cortisone administration. Much of the myocardial damage in coxsackie B virus infection is induced by immunologic reactions (with T lymphocyte involvement) rather than by direct viral injury. Responses to Injury: Cardiac Conduction System In domestic animals, injury of the cardiac conduction system involves forms of cell degeneration and death, inflammation, and fibrosis. The response to injury of the conduction system is poorly documented because histopathology of the conduction system is labor-intensive and rarely performed. In rare cases in which histopathology and electrocardiographic studies were available, atrial and/or ventricular origin of arrhythmia was associated with inflammation, degeneration, and fibrosis along the cardiac conduction system ( Fig. 10-20 ). Figure 10-20 Inflammation in the Conduction System From a Dog. A, Sinoatrial node (SAN) . Moderate numbers of lymphocytes and plasma cells (arrow) multifocally infiltrate the interstitial spaces between cardiomyocytes. H&E stain. B, Atrioventricular node (AVN) . Small numbers of lymphocytes and plasma cells (arrow) multifocally infiltrate the interstitial spaces between cardiomyocytes. H&E stain. C, Bundle of His (BH) . Small numbers of lymphocytes and plasma cells (arrow) multifocally infiltrate the interstitial spaces between cardiomyocytes; fibrous connective tissue (arrowhead) multifocally replaces lost cardiomyocytes. H&E stain. D, Bundle of His (BH) and bundle branch (BB) . Small numbers of lymphocytes and plasma cells (arrow) multifocally infiltrate the interstitial spaces between cardiomyocytes; fibrous connective tissue (arrowhead) multifocally replaces lost cardiomyocytes. H&E stain. (Courtesy Dr. A. Gal, Institute of Veterinary, Animal and Biomedical Sciences, Massey University and Drs. M. Bates and P. Roady, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Responses to Injury: Endocardium and Heart Valves Disturbances of Circulation Hemorrhage. Endocardial hemorrhages are commonly seen and may be the result of trauma or septicemias, especially those with endotoxins, or can occur agonally at death ( Fig. 10-21 ). See the previous sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium , Myocardium and Box 10-4 and also Chapter 2. Figure 10-21 Endocardial Suffusive Hemorrhage, Heart, Left Ventricle, Calf. A red to dark-red sheet of suffusive hemorrhage is present in the endocardium of the left ventricle and left atrium. Suffusive hemorrhage is often attributed to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Cellular Degeneration and Death See Chapter 1 for discussion of the causes of cell injury, irreversible cell injury and cell death, and chronic cell injury and cell adaptations. Myxomatous Valvular Degeneration (Endocardiosis). See the discussion on myxomatous valvular degeneration (endocardiosis) in the section on Disorders of Dogs and Fig. 10-83 . Mineralization. Mineralization of the endocardium is seen with vitamin D toxicity, calcinogenic plant toxicosis in cattle, and calcium phosphorus imbalance, as well as in Johne's disease ( Fig. 10-22 ; see Chapter 7). The endocardium and large elastic arteries are prone to mineralization because of their abundant elastic fibers. Figure 10-22 Endocardial Mineralization, Johne's Disease, Heart, Left Atrial Endocardium, Cow. The left atrial (LA) endocardium is white, thick, and wrinkled from mineralization. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation See Chapters 3 and 5 for discussion of the processes and mechanisms of acute and chronic inflammation. Responses to Injury: Pericardium and Epicardium Disturbances of Circulation Hemorrhage. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemorrhage. Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Serous Atrophy. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Growth, Serous Atrophy. Inflammation Pericarditis. See section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation, Pericarditis. Responses to Injury: Blood and Lymphatic Vascular Systems The responses of blood and lymphatic vessels to injury involve a complex interaction among the cellular and noncellular elements of the vessel wall and the cellular and noncellular elements of the blood. The key cells of vessels in these reactions are endothelial cells and smooth muscle cells. Endothelial cells are metabolically active and provide a thromboresistant monolayer at the interface of blood and the vessel wall unless damaged. Endothelial cells play an important role in fluid distribution, inflammation, angiogenesis, and hemostasis (see Chapters 2 and 3). Responses of blood vessels to a variety of toxins are listed in E-Box 10-1 . E-Box 10-1 Toxicants Affecting Blood Vessels Arteries Toxicants that produce arterial medial smooth muscle proliferation • Ergot ( Claviceps purpurea ), ergotamine • Fescue ( Festuca arundinacea ) parasitized by endophytic fungi ( Epichloe typhina , Acremonium coenophialum ) Toxicants that induce arterial medial calcification • Vitamin D (dietary excess or cholecalciferol-containing rodenticides) • Calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , Solanum torvum ) Toxicants that induce necrosis of arterial medial smooth muscle and medial hemorrhage • Epinephrine, norepinephrine, digoxin, theobromine, minoxidil, hydralazine, fenoldopam mesylate, phosphodiesterase inhibitors, endothelin receptor antagonists, dopamine receptor agonists, others Toxicants that alter arterial connective tissue to produce aneurysms • β-Aminopropionitrile ( Lathyrus sp. product) • Penicillamine, aminoacetonitrile Toxicants that induce arterial intimal proliferation • Ergotamine, methylsergide, estrogen and/or progesterone-containing oral contraceptives, others Toxicants that induce arterial fibrinoid necrosis • Organic mercury, lead Veins Toxicants that induce venous hyaline degeneration • Phenylbutazone Capillaries Toxicants that incite microangiopathy • Cadmium, cyclophosphamide Key functions of endothelial cells include prostacyclin production, macromolecular transport, and recruitment of inflammatory cells. Injury of endothelial cells is followed by separation from the underlying basement membrane and increased permeability to movement of plasma proteins into the subendothelium. Necrosis of endothelium exposes subendothelial collagen and elicits thrombus formation. Endothelial cells at the margin of denuded areas proliferate and re-endothelialize the damaged area. The arterial intima has regional differences in the uptake of macromolecules, as well as other unique structural and functional features that result in lesion-prone areas of the vasculature. Bilirubin staining of the intima results in yellow discoloration in jaundiced animals ( Fig. 10-23 ). Figure 10-23 Jaundice, Heart, Aorta, Dog. Note yellow discoloration of the aortic intima. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The other major cellular component of vessels involved in reaction to injury is the smooth muscle cell. These cells have important functions, including production of extracellular components, such as collagen, elastin, and proteoglycans; maintenance of vascular tone; monocyte recruitment; lipoprotein metabolism; production of bioactive lipids, such as prostaglandins; and formation of oxygen-free radicals. These functions are regulated by a wide variety of biochemical mediators, such as various growth factors, cytokines, and inflammatory mediators. Blood Vessels Disturbances of Circulation Hemorrhage. Hemorrhage resulting from vascular injury is a frequent lesion of the epicardium, endocardium, and myocardium. Hemorrhages vary in size from petechiae (1- to 2-mm diameter) to ecchymoses (2- to 10-mm diameter) to suffusive (diffuse). Animals dying from septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution often have prominent epicardial ( Fig. 10-24 ; E-Fig. 10-18 and endocardial (see Fig. 10-21 ) hemorrhages. Horses dying of any cause usually have agonal hemorrhages on the epicardial and endocardial surfaces. A distinctive example of a specific disease with cardiac hemorrhage is mulberry heart disease, associated with vitamin E–selenium deficiency in growing pigs. In these pigs, hydropericardium accompanies severe myocardial hemorrhage that results in a red, mottled (mulberry-like) appearance of the heart. Also see the previous discussions on disturbances of circulation in the sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium in the Responses to Injury section. Figure 10-24 Epicardial Hemorrhage, Petechiae and Ecchymoses, Endotoxemia, Heart, Cow. Note the epicardial and subepicardial hemorrhages in the fat of the coronary groove (a common site). Petechiae and ecchymoses are often attributable to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. In this case, the hemorrhage resulted from injury to the endothelium from endotoxin (component of the cell wall of Gram-negative bacteria). The smaller, pinpoint hemorrhages (1 to 2 mm) are petechiae. The larger hemorrhages (3 to 5 mm) are ecchymoses. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-18 Epicardial Hemorrhage, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Left Atrium, Pig. Note epicardial hemorrhage (upper left) and prominent small blood vessels with swollen endothelial cells (arrows) . H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Disturbances of Growth. See Chapter 1 for discussion of the causes of disturbances of cell growth (see cell adaptations). Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Hypertrophy. Arterial hypertrophy is a response to sustained increases in pressure or volume loads. Affected vessels are generally muscular arteries, and the increase in wall thickness is predominantly caused by hypertrophy (and, to some degree, hyperplasia) of smooth muscle cells of the tunica media. Muscular pulmonary arteries of cats are frequently affected, and the lesion has been associated with infection by several parasites, including Aelurostrongylus abstrusus (the lungworm of cats), Toxocara sp., and Dirofilaria immitis ( Fig. 10-25 ). However, the lesions often occur in the absence of parasitic infections ( Fig. 10-26 ). Often, no clinical disease is associated with the lesion in cats, but asthmatic signs have been seen in cats with these parasitic infections. Similar hypertrophy of muscular pulmonary arteries occurs in cattle with hypoxia-induced pulmonary arterial vasoconstriction and subsequent pulmonary hypertension associated with right-sided heart failure from exposure to high altitudes (so-called high-altitude disease or "brisket disease") (see section on the stages of myocardial hypertrophy). Also, cardiovascular anomalies that shunt blood left to right in animals result in pulmonary hypertension; these animals may have hypertrophy of the muscular pulmonary arteries, which can result in plexogenic pulmonary arteriopathy. Uterine arteries in pregnant animals are hypertrophic. Figure 10-25 Medial Hypertrophy, Periarteritis, Dirofilariasis, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Note the massively thickened tunica media (T) of the small branches of the pulmonary arteries and their periarterial cuff of chronic inflammatory cells and some eosinophils. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-26 Medial Hypertrophy, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Proliferation of smooth muscle cells (arrows) has resulted in marked thickening of the tunica media. Note luminal narrowing. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation. See Chapters 3 and 5 for discussion of the processes and mechanisms of acute and chronic inflammation. Arteritis and Vasculitis. Arteritis occurs as a feature of many infectious and immune-mediated diseases ( Box 10-7 ). Often, all types of vessels are affected rather than only arteries, and then vasculitis or angiitis (a term that includes blood and lymphatic vessels) is the term applied to the lesions. The vascular system serves as the major mechanisms for transport of organisms—for example, Bacillus anthracis. In inflamed vessels, leukocytes are present within and surrounding the walls, and damage to the vessel wall is evident as fibrin deposits or necrotic endothelial and smooth muscle cells. As a result of endothelial damage, thrombosis, which can result in ischemic injury or infarction in the circulatory field, may be present. Arteritis and vasculitis can develop from endothelial injury caused by either infectious agents or immune-mediated mechanisms or may be caused by local extension of suppurative and necrotizing inflammatory processes in adjacent tissues. Arteritis is a prominent feature of several parasitic diseases. Box 10-7 Diseases that Cause Arteritis in Animals Viral Equine viral arteritis, African horse sickness, equine infectious anemia, equine morbillivirus, malignant catarrhal fever, bovine virus diarrhea, bovine ephemeral fever, bluetongue, hog cholera, African swine fever, feline infectious peritonitis, Aleutian mink disease Bacterial Bartonella henselae , leptospirosis, Salmonellosis, erysipelas ( Erysipelothrix rhusiopathiae ), Haemophilus spp. infections ( Haemophilus suis , Haemophilus somnus , Haemophilus parasuis ), heartwater ( Ehrlichia ruminantium ), Rocky Mountain spotted fever ( Rickettsia rickettsii ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ) Mycotic Phycomycosis, aspergillosis Parasitic Equine strongylosis ( Strongylus vulgaris ), dirofilariasis ( Dirofilaria immitis ), French heartworm ( Angiostrongylus vasorum ), spirocercosis ( Spirocerca lupi ), onchocerciasis, elaeophoriasis ( Elaeophora sp.), filariasis in primates, aelurostrongylosis Immune-Mediated Canine systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, polyarteritis nodosa, lymphocytic choriomeningitis, drug-induced hypersensitivity Systemic infections with phlebitis as a lesion include salmonellosis in several species and feline infectious peritonitis. In pigs with various septicemias, such as salmonellosis and colibacillosis, the gastric fundic mucosa is often severely congested and hemorrhagic because of venous endothelial damage and thrombosis. In severe local infections, such as in metritis or hepatic abscesses, inflammation extends into the walls of adjacent veins and produces phlebitis, with or without thrombosis. Intravenous injections of irritant solutions, injecting solutions into the vascular wall, or intimal trauma produced by indwelling venous catheters result in vascular damage and create an opportunity for localization and proliferation of infectious agents and development of phlebitis and thrombosis ( Fig. 10-27 ). Animals with phlebitis complicated by thrombosis have the additional risk of septic embolism, which can cause endocarditis and pulmonary abscesses or pulmonary infarcts. Figure 10-27 Thrombus (Mural), Jugular Vein (Opened), Dog. Note the nodular mural thrombus (left [arrow]) in the jugular vein. This thrombus likely occurred at a site of venipuncture and a subsequent phlebitis. The smooth-surfaced red-tan thrombus (right [arrowhead]) extending toward the heart is a trailing thrombus, a continuation of the mural thrombus. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Many reportable foreign animal diseases are viral diseases, which are endotheliotropic and result in vasculitis; examples include classic swine fever (hog cholera), African horse sickness, and African swine fever (see the sections on disorders of specific animal species). Thrombosis and Embolism Coronary and Other Arteries. Thrombosis or embolism of the coronary arteries can result in myocardial infarction ( Fig. 10-28 ) and cardiac failure. These lesions are much less common in animals than in human beings. Affected animals generally have one of several types of coronary arterial disease, including atherosclerosis, arteriosclerosis, or periarteritis. In atherosclerosis associated with hypothyroidism or diabetes mellitus (discussed previously), severe lesions are present in the extramural (epicardial) coronary arteries of dogs, but this only rarely leads to thrombosis and myocardial infarction. In contrast, severe arteriosclerosis of intramural cardiac arteries in aged dogs can cause small multifocal myocardial infarcts (see Fig. 10-28 ). Affected dogs often also have myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis), which is also an age-related disease. Thrombosis of or embolism to other large arteries, such as the interlobular artery of the kidney, can lead to infarction of the tissue supplied by the artery ( E-Fig. 10-19 ; also see Chapter 2). Figure 10-28 Myocardial Infarction, Heart, Left and Right Ventricles, Dog. Pale, necrotic, circumscribed areas (arrows) are present in the ventricular walls and are most prominent at the apex. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-19 Arterial Thrombosis, Subacute, Interlobular Artery, Kidney, Dog. An interlobular artery contains a thromboembolus, which has firmly attached to the vessel wall. Note the large size of the thromboembolus compared to the luminal diameter (see bottom left corner) of the artery. This finding suggests that it is "growing" in size via the mechanisms of Virchow's triad and the adherence of platelets and fibrin to the initial embolus. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Lymphatic Vessels Inflammation. The endothelial cells lining the lymphatic vessels are subject to the same reactions to injury and inflammation as the vascular system. Inflammation of the lymphatic vessels is called lymphangitis and may be seen with specific diseases such as septicemias caused by bacteria like Salmonella spp. ( Box 10-8 ). Lymphangitis may be acute, subacute, granulomatous, or chronic resulting in lymphedema. See Chapters 3 and 5, and also see the discussion on Glanders disease and other cutaneous lymphangitides in the section on Disorders of Horses . Box 10-8 Diseases that Cause Lymphangitis in Animals Bacterial Porcine anthrax ( Bacillus anthracis ), Johne's disease ( Mycobacterium paratuberculosis ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), actinobacillosis ( Actinobacillus lignieresii ), glanders (farcy) ( Burkholderia mallei ), cutaneous streptothricosis ( Dermatophilus congolensis ), bovine farcy, ulcerative lymphangitis of horses, sporadic lymphangitis of horses, ulcerative lymphangitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis , Pseudomonas aeruginosa ) Mycotic Epizootic lymphangitis of horses ( Histoplasma farciminosum ), sporotrichosis ( Sporothrix schenckii ) Parasitic Brugia spp. infection of dogs and cats Aging Aging changes are evident in the cardiovascular system. Lipofuscin granules, primarily perinuclear, increase in number with age of cardiac myocytes (see sections on Lipofuscinosis , Cell Degeneration and Death, Disturbances of Growth, and Responses to Injury: Myocardium ). Fatty infiltration of the pericardium and myocardium increases with the age of the animal. Hearts from aged sheep often have abundant amounts of adipose tissue, particularly within the right ventricle (see sections on Fatty Degeneration , Cell Degeneration and Death, Disturbances of Growth, and Responses to Injury: Myocardium ). Myxomatous valvular disease increases in incidence with age in small breed dogs (see section on Disorders of Dogs ; also see Fig. 10-83 ). Degenerative vascular disease associated with aging includes arteriosclerosis, amyloidosis, and hyaline degeneration of cardiac arteries (see section on Hyaline Degeneration, Fibrinoid Necrosis, and Amyloidosis and section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular System ). The incidence of neoplastic disease increases with age in the cardiovascular and lymphatic system. Dysfunction: Heart Failure Pathophysiology of Heart Failure Heart failure is a progressive clinical syndrome in which impaired pumping decreases ventricular ejection and impedes venous return. The heart fails either by decreased blood pumping into the aorta and/or pulmonary artery to maintain arterial pressure (low-output heart failure) or by an inability to adequately empty the venous reservoirs (congestive heart failure) (see Box 10-1 ). Anamnestic signs of low cardiac output include depression, lethargy, syncope, and hypotension, and those of congestion include ascites, pleural effusion, and pulmonary edema. Syndromes of Cardiac Failure or Decompensation: Congestive Heart Failure Congestive heart failure can be right-sided, left-sided, or bilateral and can occur with cardiac dilation and/or hypertrophy ( Fig. 10-5 ). Right-sided congestive heart failure is associated with signs of congestion in the systemic circulation (i.e., ascites and peripheral edema [ Figs. 10-6 and 10-7 ]), whereas left-sided congestive heart failure causes signs of congestion in the pulmonary circulation (i.e., pulmonary edema and dyspnea). In small animals, pleural effusion is usually associated with bilateral congestive heart failure. Figure 10-5 Cardiac Dilation and Hypertrophy, Heart, Transected Ventricles, Dog. A, Cardiac dilation. Note the thin walls of both dilated ventricles. LV, Left ventricle. B, Cardiac hypertrophy (fixed tissue). Note that the right ventricular and left ventricular (LV) walls are approximately the same thickness, indicating that there is right ventricular hypertrophy. ( A courtesy Dr. Y. Niyo, College of Veterinary Medicine, Iowa State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy College of Veterinary Medicine, University of Florida; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Figure 10-6 Ascites, Congestive Heart Failure, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart and Liver, Duckling. Note prominent accumulations of serous fluid in the coelomic cavity and fibrin deposits over the surface of the liver. The heart (H) is dilated. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-7 Subcutaneous Edema, High-Altitude Disease with Congestive Heart Failure ("Brisket Disease"), Presternal, Sternal, and Caudal Sternocephalic Regions (Brisket), Cow. The extensive subcutaneous edema is the result of chronic congestive heart failure. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Heart failure may result from an inability of the heart to eject blood adequately (systolic failure), from inadequate ventricular filling (diastolic failure), or both. The resultant reduction in stroke volume (SV) leads to a decrease in cardiac output (CO) and a decrease in arterial blood pressure. Indices of Cardiac Function Arterial blood pressure (ABP) ~ CO × Z (where Z is the aortic input impedance ) and CO = SV × heart rate (HR). Increases in HR increase CO linearly until a plateau is reached, at which point further increases in HR will decrease CO because of decreased diastolic filling (the Frank-Starling law of the heart). Contractility and the two coupling factors, preload and afterload, primarily determine SV. The latter increases with increases in preload and contractility and decreases in afterload. Preload reflects the degree of ventricular filling just before contraction. End diastolic volume (EDV) can estimate preload. The force opposing ventricular ejection is termed afterload . Aortic input impedance best describes the opposition that the ventricle encounters at the time of ejection. An increase in afterload communicates itself to the ventricles during systole by increasing wall stress. Contractility is a change in the heart's ability to do work when the preload, afterload, and HR are kept constant. Diastolic ventricular filling, ventricular wall motion abnormalities, space-occupying lesions, and arrhythmias also affect SV. The properties of the arterial system can be described by the total arterial compliance, the peripheral resistance, and the characteristic impedance. Total arterial compliance corresponds to the elastic properties of arteries (i.e., aorta) and reflects change in volume from a given change in pressure. Peripheral resistance is largely determined by small arteries and arterioles and involves steady (nonpulsatile) flow. Characteristic impedance is the opposition to pulsatile flow. Left ventricular (LV) afterload is increased by an increase in peripheral resistance and characteristic impedance and a decrease in total arterial compliance. Subsequently, the left ventricle ejects into a stiff vasculature, increasing both the energetic cost to maintain blood flow and myocardial oxygen consumption (MVO 2 ). Characteristic impedance, a property of the proximal aorta, increases whenever the stiffness of the aorta increases or its radius becomes smaller. Peripheral resistance has a greater effect on ventricular performance than does characteristic impedance or compliance. Systolic and Diastolic Heart Failure Systolic heart failure is characterized by normal filling of the ventricle and a decrease in the forward stroke volume (SV). The decrease in SV may result from a decreased contractility ( myocardial failure ), from a primary increase in ventricular pressure ( pressure overload ), or or from an increase in ventricular volume ( volume overload ) ( Box 10-2 ). Myocardial failure may be primary (e.g., dilated cardiomyopathy) or may occur secondary to chronic volume or pressure overload. The most common causes for pressure overload in domestic animals are subaortic stenosis and hypertension (left-sided congestive heart failure) and heartworm disease ( E-Fig. 10-9 ), pulmonic stenosis (see Fig. 10-32 ), "brisket disease" ("high-altitude disease") in cattle (see Fig. 10-7 ), and chronic alveolar emphysema ("heaves") in horses (see Fig. 9-13) (right-sided congestive heart failure). Leaking valves, an abnormal communication between the systemic and pulmonary circulations, or high-output states (e.g., hyperthyroidism) usually result in increased ventricular volume (increased preload). Decrease in contractility lowers the SV, CO, and ABP and negates the heart's ability to compensate for the decrease in CO. Diastolic heart failure is characterized by improper filling of ventricles. This dysfunction may be caused by an impaired energy ventricular relaxation, myocardial dysfunction, obstruction to ventricular filling, or pericardial abnormalities ( Box 10-3 ). Box 10-2 Mechanisms Leading to Systolic Heart Failure Myocardial Failure • Dilated cardiomyopathy • Infectious myocarditis • Doxorubicin toxicity • Cardiomyopathy of overload (pressure/volume) • Myocardial infarcts • Right ventricular cardiomyopathy Volume Overload • Valvular diseases • Myxomatous endocardial degeneration • Endocarditis • Rupture of mitral chordae tendineae • Valvular dysplasia • PDA/VSD/ASD • Thyrotoxicosis • Chronic anemia • Peripheral arteriovenous fistula Pressure Overload • Subaortic stenosis • Pulmonic stenosis • Systemic hypertension • Pulmonary hypertension • Primary • Pulmonary embolism • Heartworm disease ASD, Atrial septal defect; PDA, patent ductus arteriosus; VSD, ventricular septal defect. Box 10-3 Mechanisms Leading to Diastolic Heart Failure Impaired Energy-Dependent Ventricular Relaxation or Abnormal Ventricular Chamber or Muscle Properties • Ventricular hypertrophy • Hypertrophic cardiomyopathy • Subaortic stenosis • Pulmonic stenosis • Heartworm disease • Systemic hypertension • Dilated cardiomyopathy • Myocardial infarct • Restrictive cardiomyopathy Obstruction to Ventricular Filling at Veins, Atria, and Atrioventricular Valves • Mitral stenosis • Tricuspid stenosis • Intracardiac obstruction by neoplasia • Cor triatriatum Pericardial Abnormalities • Constrictive disease • Cardiac tamponade E-Figure 10-9 Dirofilariasis, Heart, Dog. Note the hypertrophy of the right ventricle (RV) and adult Dirofilaria immitis in the pulmonary artery and its branches (PA). LV, Left ventricle. (Courtesy Dr. K. Read, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Concentric Hypertrophy In pressure overload states, the increase in resistance to ejected blood leads to compensatory dilation ( concentric hypertrophy ). Chamber dilation in turn helps to overcome the increased resistance and to maintain SV at the expense of MVO 2 , which eventually will lead to myocardial failure. LV wall stress = LV pressure LV radius 2 × LV wall thickness From the previous equation, it can be depicted that decreased wall stress can be achieved by decreasing LV radius and/or by increasing LV wall thickness . With a sustained pressure overload, the ventricular muscle adapts by undergoing concentric hypertrophy, which leads to an increase in wall thickness at the expense of a decrease in chamber size (decrease in ventricular radius), thus returning ventricular wall stress toward normal and increasing contractility. The hypertrophied ventricle is prone to ischemia, which leads to fibrosis and an increase in collagen content that interferes with diastolic filling, decreasing preload and SV. Therefore, in the end both systolic and diastolic dysfunction occur. Eccentric Hypertrophy In volume overload, the increase in chamber size occurs as a result of the need to accommodate a large ventricular EDV. Dilation of the ventricle by increasing the EDV leads to a lesser increase in wall stress than in pressure overload, and it subsequently results in ventricular eccentric hypertrophy in order to normalize wall stress. Volume overload is marked by an eccentric hypertrophy with a mild increase in wall thickness in the face of a large increase in LV radius. Diastole can be divided into four phases: (1) isovolumic relaxation (aortic valve closure to mitral valve opening), (2) rapid early mitral inflow (rapid filling phase during which most of ventricular filling occurs), (3) diastasis (slow filling phase during which little change occurs in ventricular volume and pressure), and (4) atrial contraction (atrial systole that actively pumps blood to the ventricle). Diastolic ventricular filling takes place during the second through fourth phases. Relaxation (phase 1) is a dynamic, energy-dependent process. β-Adrenergic stimulation improves relaxation, whereas ischemia, asynchrony of relaxation, an increase in afterload, ventricular hypertrophy, and abnormal calcium fluxes in the myocardial cells delay relaxation . Ventricular compliance (phases 2 through 4) is the ability of the heart to fill passively. Ventricular compliance is determined by volume, geometry, and the tissue characteristics of the ventricular wall. Ventricular compliance decreases with an increase in filling pressure and intrinsic myocardial stiffness (e.g., infiltrative diseases, fibrosis, and ischemia), with hypertrophy and cardiac tamponade. Lusitropy comprises the relaxation and filling phases. Ventricular filling may be affected by several factors, including isovolumic relaxation rate, synchrony between atrial kick and ventricular relaxation, compliance, and atrioventricular pressure gradient. The latter is the driving force for ventricular filling (which is mostly affected by intravascular volume and the degree of vasodilatation). The isovolumic relaxation rate is also an important determinant of early ventricular filling; adrenergic stimulation increases the rate of relaxation, improving relaxation to a greater extent than it improves contractility. Tachycardia shortens the duration of the diastasis. Loss of atrial contraction is one reason why dogs with dilated cardiomyopathy or myxomatous valvular degeneration develop heart failure when the atria start to fibrillate. Asynchronous relaxation (decrease in the uniformity of relaxation) of the left ventricle may be observed in cats with restrictive cardiomyopathy. LV hypertrophy decreases LV compliance and leads to poor diastolic function because of an increase in cardiomyocyte size, collagen formation, and wall thickening. Constrictive pericardial disease or cardiac tamponade impose their mechanical properties on those of the ventricle during the final phases of diastole. Hence, diastolic dysfunction results from abnormal relaxation (early diastole), abnormal compliance (early to late diastole), or external constraint by the pericardium (tamponade). Neuroendocrine Compensatory Mechanisms in Heart Failure Heart failure results in chronic activation of neuroendocrine compensatory mechanisms to restore and maintain ABP. High-pressure baroreceptors in the aortic arch and carotid sinus, mechanoreceptors in the ventricular myocardium, volume receptors in the atria and great veins, and the juxtaglomerular apparatus in the kidneys can sense alteration in ABP that results from a diminished CO. A reactive neuroendocrine activation decreases parasympathetic drive (immediate and short-lived) and increases sympathetic drive (slow but long-lasting), causing vasoconstriction (increasing arterial impedance) and tachycardia. A decrease in renal blood flow leads to renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) activation, contributing to vasoconstriction and sodium and water retention (increases the circulating volume). To maintain ABP, the cardiovascular system allows the venous pressure to increase and redistributes CO, maintaining blood flow mostly to essential organs. The cardiomyocytes also undergo changes to adapt to ventricular dysfunction, initially by performing extra work (stable hyperfunction) but over a long period these cardiomyocytes die (exhaustion and progressive cardiosclerosis phase). The net effect of neuroendocrine activation is vasoconstriction, sodium and water retention, LV hypertrophy, and coronary and peripheral vessel remodeling. Role of Catecholamines in the Progression of Heart Failure Dogs with congestive heart failure have increased norepinephrine (NE) concentrations secondary to NE "spillover" into plasma, and they have decreased uptake by adrenergic nerve endings. Despite the increase in the plasma concentration of NE, there is depletion of NE from the atria and ventricles (secondary to β-adrenoreceptor downregulation), which blunts the response to sympathetic activation. In normal hearts, the ratio of β 1 to β 2 receptors is approximately 80 : 20, whereas in failing hearts, it approaches 60 : 40. The decrease in NE stores and the changes in adrenoreceptors lead to a decrease in the contractile response of the myocardial cells and in a positive chronotropic response (increased HR). Chronic adrenergic stimulation also leads to an increase in afterload and MVO 2 , development of ventricular arrhythmias, and progression to left ventricular dysfunction. Role of Baroreceptors in the Progression of Heart Failure Baroreflex control is altered during congestive heart failure. Normally, an increase in atrial pressure (volume overload) stimulates atrial stretch receptors, inhibits the release of antidiuretic hormone (ADH), decreases sympathetic activity, and increases renal blood flow and the glomerular filtration rate. During congestive heart failure, atrial and arterial receptors have a decreased response to stimulation, and baroreceptor function is impaired. The overall effect is a decrease in parasympathetic activity and subsequent impaired restraint on the SAN, which results in a higher HR and decreased HR variability. Role of Renin-Angiotensin-Aldosterone System in the Progression of Heart Failure In congestive heart failure, renin is continuously released in the juxtaglomerular apparatus of the kidneys secondary to the low CO. Consequently, perpetuation of angiotensin II (AGII) effects leads to a vicious cycle that contributes to further declines in ventricular function. These include AGII-mediated increase in afterload, increase in MVO 2 , and increase in preload (through a decrease in venous capacity). AGII also stimulates the release of ADH and aldosterone (both contribute to total body water retention); the latter contributes to baroreceptor dysfunction, increased stiffness and decreased compliance of the arterial system, and increased Mg and K excretion. Increases in plasma aldosterone are associated with an inflammatory response that is thought to lead to intramural coronary artery remodeling and fibrosis. AGII stimulates growth factors, promoting remodeling in the vessels and myocardium (reduced NO synthesis or by increasing local angiotensin-converting enzyme breakdown of bradykinin). Consequently, vascular remodeling (i.e., smooth muscle hyperplasia, hypertrophy, and apoptosis) results in structural changes that further decrease the compliance of the arterial system. AGII has a key role in the development of pathologic hypertrophy, exerting cytotoxic effects on the myocardium, causing myocyte necrosis, and contributing to myocardial loss. Role of Natriuretic Peptides and Nitric Oxide in the Progression of Heart Failure The natriuretic peptides are counterregulatory hormones involved in volume homeostasis and cardiovascular remodeling, and they promote natriuresis, diuresis, peripheral vasodilatation, and inhibition of the RAAS. They consist of atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), C-type natriuretic peptide (CNP), dendraspis natriuretic peptides (DNP), and urodilatin. Despite the natriuretic peptides' beneficial effects during congestive heart failure, their release is overridden by the release of agents that cause vasoconstriction and sodium and water retention. NO regulates cardiac function through both vascular-dependent (coronary vessel tone, thrombogenicity, proliferative and inflammatory properties, and cellular cross-talk that supports angiogenesis) and vascular-independent (effects on several aspects of cardiomyocyte contractility, from the fine regulation of excitation-contraction coupling to modulation of autonomic signaling and mitochondrial respiration) effects. Overall, NO may play an important compensatory role in congestive heart failure during resting conditions by antagonizing neuroendocrine vasoconstrictive forces. Summary of Pathophysiology of Heart Failure In summary, long-term overload-induced cardiac hypertrophy is accompanied by myocardial cell death and cardiac fibrosis (i.e., cardiomyopathy of overload). The hypertrophied ventricle outstrips its blood supply. The relative decrease in oxygen delivery worsens the increased MVO 2 demand. The ischemia resulting from hypertrophy and stretching beyond certain limits decreases contractile strength and eventually leads to loss of contractile proteins within these cells or loss of these cells. These processes result in atrophy of the affected myocardium and lead to the development of multifocal myocardial fibrosis and atrophy, which consequently interferes with diastolic function. When early interstitial fibrosis progresses to individuation of cardiac myocytes (with progression of hypertrophy), both systolic and diastolic functions are impaired. Therefore congestive heart failure is a progressive and irreversible disease with myocardial cell death and functional myocardial failure that ultimately leads to death. The cycles resulting in progressive left heart failure are detailed in Fig. 10-8 . Figure 10-8 Pathophysiology of Left Heart Failure. Pathophysiologic cycles that lead to progressive left heart failure. Cycle 1: Increased total vascular resistance increases myocardial wall stress that induces myocardial hypertrophy. Cycle 2: Water and sodium retention leads to increased preload and vascular congestion. Cycle 3: Neuroendocrine activation leads to myocardial and vascular remodeling. All cycles contribute to further myocardial dysfunction and neuroendocrine activation. (Adapted from Ettinger SJ, Feldman EC: Textbook of veterinary internal medicine, ed 6, St. Louis, 2005, Saunders.) Cardiac Syncope Cardiac syncope, an acute expression of cardiac disease, is characterized clinically by collapse, loss of consciousness, and extreme changes in heart rate and blood pressure, and with or without demonstrable lesions. Syncope can be caused by massive myocardial necrosis, ventricular fibrillation, heart block, arrhythmias, and reflex cardiac inhibition (e.g., that associated with high intestinal blockage). Types of Heart Failure A wide variety of experimental animal models of heart failure exist ( E-Table 10-1 ). The models have been used to develop an understanding of human cardiac disease. E-Table 10-1 Experimental Models of Heart Failure Experimental Model Experimental Method Species Pressure loading Pulmonary artery banding Rat, dog, pig, sheep, pony Aortic constriction Rat, rabbit, dog, sheep Supravalvular aortic constriction Dog Aortic valve stenosis Rabbit, dog Pulmonary valve stenosis Dog Experimental hypertension Rat, dog Volume loading Fluid overload Baboon Aorta-to-vena cava fistula Rat, dog Aortic valve incompetence Rat, rabbit Atrial septal defect Cat Myocardial infarction Sustained atrial pacing Dog Coronary ligation Dog, pig Controlled occlusion—subclavian-to-carotid shunt Dog Coronary embolism Dog, calf, pig Thrombus generation Dog Chronic hypoxia Rat Cardiomyopathy and other conditions Left ventricular Dacron patch Dog Spontaneous cardiomyopathy Hamster, mouse, cattle, rat, turkey, cat, dog Barbiturate overdose Dog Furazolidone cardiomyopathy Turkey, duckling Adriamycin cardiomyopathy Rat, dog, mouse, pig Isoprenaline Rat Noradrenaline Dog Amphetamine Rat Cobalt chloride Rat, pig Vitamin E deficiency Rat, mouse, calf, lamb Alcohol intoxication Rat Coxsackie viral myocarditis Mouse Viral encephalomyocarditis Mouse Altered cardiac development and/or function Transgenic mice Modified from Smith HJ, Nuttall A: Cardiovasc Res 19:181-186, 1985. Clinical Diagnostic Procedures For information on this topic, see E-Appendix 10-3 at www.expertconsult.com . Pathophysiology of Heart Failure Heart failure is a progressive clinical syndrome in which impaired pumping decreases ventricular ejection and impedes venous return. The heart fails either by decreased blood pumping into the aorta and/or pulmonary artery to maintain arterial pressure (low-output heart failure) or by an inability to adequately empty the venous reservoirs (congestive heart failure) (see Box 10-1 ). Anamnestic signs of low cardiac output include depression, lethargy, syncope, and hypotension, and those of congestion include ascites, pleural effusion, and pulmonary edema. Syndromes of Cardiac Failure or Decompensation: Congestive Heart Failure Congestive heart failure can be right-sided, left-sided, or bilateral and can occur with cardiac dilation and/or hypertrophy ( Fig. 10-5 ). Right-sided congestive heart failure is associated with signs of congestion in the systemic circulation (i.e., ascites and peripheral edema [ Figs. 10-6 and 10-7 ]), whereas left-sided congestive heart failure causes signs of congestion in the pulmonary circulation (i.e., pulmonary edema and dyspnea). In small animals, pleural effusion is usually associated with bilateral congestive heart failure. Figure 10-5 Cardiac Dilation and Hypertrophy, Heart, Transected Ventricles, Dog. A, Cardiac dilation. Note the thin walls of both dilated ventricles. LV, Left ventricle. B, Cardiac hypertrophy (fixed tissue). Note that the right ventricular and left ventricular (LV) walls are approximately the same thickness, indicating that there is right ventricular hypertrophy. ( A courtesy Dr. Y. Niyo, College of Veterinary Medicine, Iowa State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy College of Veterinary Medicine, University of Florida; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Figure 10-6 Ascites, Congestive Heart Failure, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart and Liver, Duckling. Note prominent accumulations of serous fluid in the coelomic cavity and fibrin deposits over the surface of the liver. The heart (H) is dilated. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-7 Subcutaneous Edema, High-Altitude Disease with Congestive Heart Failure ("Brisket Disease"), Presternal, Sternal, and Caudal Sternocephalic Regions (Brisket), Cow. The extensive subcutaneous edema is the result of chronic congestive heart failure. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Heart failure may result from an inability of the heart to eject blood adequately (systolic failure), from inadequate ventricular filling (diastolic failure), or both. The resultant reduction in stroke volume (SV) leads to a decrease in cardiac output (CO) and a decrease in arterial blood pressure. Indices of Cardiac Function Arterial blood pressure (ABP) ~ CO × Z (where Z is the aortic input impedance ) and CO = SV × heart rate (HR). Increases in HR increase CO linearly until a plateau is reached, at which point further increases in HR will decrease CO because of decreased diastolic filling (the Frank-Starling law of the heart). Contractility and the two coupling factors, preload and afterload, primarily determine SV. The latter increases with increases in preload and contractility and decreases in afterload. Preload reflects the degree of ventricular filling just before contraction. End diastolic volume (EDV) can estimate preload. The force opposing ventricular ejection is termed afterload . Aortic input impedance best describes the opposition that the ventricle encounters at the time of ejection. An increase in afterload communicates itself to the ventricles during systole by increasing wall stress. Contractility is a change in the heart's ability to do work when the preload, afterload, and HR are kept constant. Diastolic ventricular filling, ventricular wall motion abnormalities, space-occupying lesions, and arrhythmias also affect SV. The properties of the arterial system can be described by the total arterial compliance, the peripheral resistance, and the characteristic impedance. Total arterial compliance corresponds to the elastic properties of arteries (i.e., aorta) and reflects change in volume from a given change in pressure. Peripheral resistance is largely determined by small arteries and arterioles and involves steady (nonpulsatile) flow. Characteristic impedance is the opposition to pulsatile flow. Left ventricular (LV) afterload is increased by an increase in peripheral resistance and characteristic impedance and a decrease in total arterial compliance. Subsequently, the left ventricle ejects into a stiff vasculature, increasing both the energetic cost to maintain blood flow and myocardial oxygen consumption (MVO 2 ). Characteristic impedance, a property of the proximal aorta, increases whenever the stiffness of the aorta increases or its radius becomes smaller. Peripheral resistance has a greater effect on ventricular performance than does characteristic impedance or compliance. Systolic and Diastolic Heart Failure Systolic heart failure is characterized by normal filling of the ventricle and a decrease in the forward stroke volume (SV). The decrease in SV may result from a decreased contractility ( myocardial failure ), from a primary increase in ventricular pressure ( pressure overload ), or or from an increase in ventricular volume ( volume overload ) ( Box 10-2 ). Myocardial failure may be primary (e.g., dilated cardiomyopathy) or may occur secondary to chronic volume or pressure overload. The most common causes for pressure overload in domestic animals are subaortic stenosis and hypertension (left-sided congestive heart failure) and heartworm disease ( E-Fig. 10-9 ), pulmonic stenosis (see Fig. 10-32 ), "brisket disease" ("high-altitude disease") in cattle (see Fig. 10-7 ), and chronic alveolar emphysema ("heaves") in horses (see Fig. 9-13) (right-sided congestive heart failure). Leaking valves, an abnormal communication between the systemic and pulmonary circulations, or high-output states (e.g., hyperthyroidism) usually result in increased ventricular volume (increased preload). Decrease in contractility lowers the SV, CO, and ABP and negates the heart's ability to compensate for the decrease in CO. Diastolic heart failure is characterized by improper filling of ventricles. This dysfunction may be caused by an impaired energy ventricular relaxation, myocardial dysfunction, obstruction to ventricular filling, or pericardial abnormalities ( Box 10-3 ). Box 10-2 Mechanisms Leading to Systolic Heart Failure Myocardial Failure • Dilated cardiomyopathy • Infectious myocarditis • Doxorubicin toxicity • Cardiomyopathy of overload (pressure/volume) • Myocardial infarcts • Right ventricular cardiomyopathy Volume Overload • Valvular diseases • Myxomatous endocardial degeneration • Endocarditis • Rupture of mitral chordae tendineae • Valvular dysplasia • PDA/VSD/ASD • Thyrotoxicosis • Chronic anemia • Peripheral arteriovenous fistula Pressure Overload • Subaortic stenosis • Pulmonic stenosis • Systemic hypertension • Pulmonary hypertension • Primary • Pulmonary embolism • Heartworm disease ASD, Atrial septal defect; PDA, patent ductus arteriosus; VSD, ventricular septal defect. Box 10-3 Mechanisms Leading to Diastolic Heart Failure Impaired Energy-Dependent Ventricular Relaxation or Abnormal Ventricular Chamber or Muscle Properties • Ventricular hypertrophy • Hypertrophic cardiomyopathy • Subaortic stenosis • Pulmonic stenosis • Heartworm disease • Systemic hypertension • Dilated cardiomyopathy • Myocardial infarct • Restrictive cardiomyopathy Obstruction to Ventricular Filling at Veins, Atria, and Atrioventricular Valves • Mitral stenosis • Tricuspid stenosis • Intracardiac obstruction by neoplasia • Cor triatriatum Pericardial Abnormalities • Constrictive disease • Cardiac tamponade E-Figure 10-9 Dirofilariasis, Heart, Dog. Note the hypertrophy of the right ventricle (RV) and adult Dirofilaria immitis in the pulmonary artery and its branches (PA). LV, Left ventricle. (Courtesy Dr. K. Read, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Myocardial Failure • Dilated cardiomyopathy • Infectious myocarditis • Doxorubicin toxicity • Cardiomyopathy of overload (pressure/volume) • Myocardial infarcts • Right ventricular cardiomyopathy Volume Overload • Valvular diseases • Myxomatous endocardial degeneration • Endocarditis • Rupture of mitral chordae tendineae • Valvular dysplasia • PDA/VSD/ASD • Thyrotoxicosis • Chronic anemia • Peripheral arteriovenous fistula Pressure Overload • Subaortic stenosis • Pulmonic stenosis • Systemic hypertension • Pulmonary hypertension • Primary • Pulmonary embolism • Heartworm disease ASD, Atrial septal defect; PDA, patent ductus arteriosus; VSD, ventricular septal defect. Impaired Energy-Dependent Ventricular Relaxation or Abnormal Ventricular Chamber or Muscle Properties • Ventricular hypertrophy • Hypertrophic cardiomyopathy • Subaortic stenosis • Pulmonic stenosis • Heartworm disease • Systemic hypertension • Dilated cardiomyopathy • Myocardial infarct • Restrictive cardiomyopathy Obstruction to Ventricular Filling at Veins, Atria, and Atrioventricular Valves • Mitral stenosis • Tricuspid stenosis • Intracardiac obstruction by neoplasia • Cor triatriatum Pericardial Abnormalities • Constrictive disease • Cardiac tamponade Concentric Hypertrophy In pressure overload states, the increase in resistance to ejected blood leads to compensatory dilation ( concentric hypertrophy ). Chamber dilation in turn helps to overcome the increased resistance and to maintain SV at the expense of MVO 2 , which eventually will lead to myocardial failure. LV wall stress = LV pressure LV radius 2 × LV wall thickness From the previous equation, it can be depicted that decreased wall stress can be achieved by decreasing LV radius and/or by increasing LV wall thickness . With a sustained pressure overload, the ventricular muscle adapts by undergoing concentric hypertrophy, which leads to an increase in wall thickness at the expense of a decrease in chamber size (decrease in ventricular radius), thus returning ventricular wall stress toward normal and increasing contractility. The hypertrophied ventricle is prone to ischemia, which leads to fibrosis and an increase in collagen content that interferes with diastolic filling, decreasing preload and SV. Therefore, in the end both systolic and diastolic dysfunction occur. Eccentric Hypertrophy In volume overload, the increase in chamber size occurs as a result of the need to accommodate a large ventricular EDV. Dilation of the ventricle by increasing the EDV leads to a lesser increase in wall stress than in pressure overload, and it subsequently results in ventricular eccentric hypertrophy in order to normalize wall stress. Volume overload is marked by an eccentric hypertrophy with a mild increase in wall thickness in the face of a large increase in LV radius. Diastole can be divided into four phases: (1) isovolumic relaxation (aortic valve closure to mitral valve opening), (2) rapid early mitral inflow (rapid filling phase during which most of ventricular filling occurs), (3) diastasis (slow filling phase during which little change occurs in ventricular volume and pressure), and (4) atrial contraction (atrial systole that actively pumps blood to the ventricle). Diastolic ventricular filling takes place during the second through fourth phases. Relaxation (phase 1) is a dynamic, energy-dependent process. β-Adrenergic stimulation improves relaxation, whereas ischemia, asynchrony of relaxation, an increase in afterload, ventricular hypertrophy, and abnormal calcium fluxes in the myocardial cells delay relaxation . Ventricular compliance (phases 2 through 4) is the ability of the heart to fill passively. Ventricular compliance is determined by volume, geometry, and the tissue characteristics of the ventricular wall. Ventricular compliance decreases with an increase in filling pressure and intrinsic myocardial stiffness (e.g., infiltrative diseases, fibrosis, and ischemia), with hypertrophy and cardiac tamponade. Lusitropy comprises the relaxation and filling phases. Ventricular filling may be affected by several factors, including isovolumic relaxation rate, synchrony between atrial kick and ventricular relaxation, compliance, and atrioventricular pressure gradient. The latter is the driving force for ventricular filling (which is mostly affected by intravascular volume and the degree of vasodilatation). The isovolumic relaxation rate is also an important determinant of early ventricular filling; adrenergic stimulation increases the rate of relaxation, improving relaxation to a greater extent than it improves contractility. Tachycardia shortens the duration of the diastasis. Loss of atrial contraction is one reason why dogs with dilated cardiomyopathy or myxomatous valvular degeneration develop heart failure when the atria start to fibrillate. Asynchronous relaxation (decrease in the uniformity of relaxation) of the left ventricle may be observed in cats with restrictive cardiomyopathy. LV hypertrophy decreases LV compliance and leads to poor diastolic function because of an increase in cardiomyocyte size, collagen formation, and wall thickening. Constrictive pericardial disease or cardiac tamponade impose their mechanical properties on those of the ventricle during the final phases of diastole. Hence, diastolic dysfunction results from abnormal relaxation (early diastole), abnormal compliance (early to late diastole), or external constraint by the pericardium (tamponade). Neuroendocrine Compensatory Mechanisms in Heart Failure Heart failure results in chronic activation of neuroendocrine compensatory mechanisms to restore and maintain ABP. High-pressure baroreceptors in the aortic arch and carotid sinus, mechanoreceptors in the ventricular myocardium, volume receptors in the atria and great veins, and the juxtaglomerular apparatus in the kidneys can sense alteration in ABP that results from a diminished CO. A reactive neuroendocrine activation decreases parasympathetic drive (immediate and short-lived) and increases sympathetic drive (slow but long-lasting), causing vasoconstriction (increasing arterial impedance) and tachycardia. A decrease in renal blood flow leads to renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) activation, contributing to vasoconstriction and sodium and water retention (increases the circulating volume). To maintain ABP, the cardiovascular system allows the venous pressure to increase and redistributes CO, maintaining blood flow mostly to essential organs. The cardiomyocytes also undergo changes to adapt to ventricular dysfunction, initially by performing extra work (stable hyperfunction) but over a long period these cardiomyocytes die (exhaustion and progressive cardiosclerosis phase). The net effect of neuroendocrine activation is vasoconstriction, sodium and water retention, LV hypertrophy, and coronary and peripheral vessel remodeling. Role of Catecholamines in the Progression of Heart Failure Dogs with congestive heart failure have increased norepinephrine (NE) concentrations secondary to NE "spillover" into plasma, and they have decreased uptake by adrenergic nerve endings. Despite the increase in the plasma concentration of NE, there is depletion of NE from the atria and ventricles (secondary to β-adrenoreceptor downregulation), which blunts the response to sympathetic activation. In normal hearts, the ratio of β 1 to β 2 receptors is approximately 80 : 20, whereas in failing hearts, it approaches 60 : 40. The decrease in NE stores and the changes in adrenoreceptors lead to a decrease in the contractile response of the myocardial cells and in a positive chronotropic response (increased HR). Chronic adrenergic stimulation also leads to an increase in afterload and MVO 2 , development of ventricular arrhythmias, and progression to left ventricular dysfunction. Role of Baroreceptors in the Progression of Heart Failure Baroreflex control is altered during congestive heart failure. Normally, an increase in atrial pressure (volume overload) stimulates atrial stretch receptors, inhibits the release of antidiuretic hormone (ADH), decreases sympathetic activity, and increases renal blood flow and the glomerular filtration rate. During congestive heart failure, atrial and arterial receptors have a decreased response to stimulation, and baroreceptor function is impaired. The overall effect is a decrease in parasympathetic activity and subsequent impaired restraint on the SAN, which results in a higher HR and decreased HR variability. Role of Renin-Angiotensin-Aldosterone System in the Progression of Heart Failure In congestive heart failure, renin is continuously released in the juxtaglomerular apparatus of the kidneys secondary to the low CO. Consequently, perpetuation of angiotensin II (AGII) effects leads to a vicious cycle that contributes to further declines in ventricular function. These include AGII-mediated increase in afterload, increase in MVO 2 , and increase in preload (through a decrease in venous capacity). AGII also stimulates the release of ADH and aldosterone (both contribute to total body water retention); the latter contributes to baroreceptor dysfunction, increased stiffness and decreased compliance of the arterial system, and increased Mg and K excretion. Increases in plasma aldosterone are associated with an inflammatory response that is thought to lead to intramural coronary artery remodeling and fibrosis. AGII stimulates growth factors, promoting remodeling in the vessels and myocardium (reduced NO synthesis or by increasing local angiotensin-converting enzyme breakdown of bradykinin). Consequently, vascular remodeling (i.e., smooth muscle hyperplasia, hypertrophy, and apoptosis) results in structural changes that further decrease the compliance of the arterial system. AGII has a key role in the development of pathologic hypertrophy, exerting cytotoxic effects on the myocardium, causing myocyte necrosis, and contributing to myocardial loss. Role of Natriuretic Peptides and Nitric Oxide in the Progression of Heart Failure The natriuretic peptides are counterregulatory hormones involved in volume homeostasis and cardiovascular remodeling, and they promote natriuresis, diuresis, peripheral vasodilatation, and inhibition of the RAAS. They consist of atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), C-type natriuretic peptide (CNP), dendraspis natriuretic peptides (DNP), and urodilatin. Despite the natriuretic peptides' beneficial effects during congestive heart failure, their release is overridden by the release of agents that cause vasoconstriction and sodium and water retention. NO regulates cardiac function through both vascular-dependent (coronary vessel tone, thrombogenicity, proliferative and inflammatory properties, and cellular cross-talk that supports angiogenesis) and vascular-independent (effects on several aspects of cardiomyocyte contractility, from the fine regulation of excitation-contraction coupling to modulation of autonomic signaling and mitochondrial respiration) effects. Overall, NO may play an important compensatory role in congestive heart failure during resting conditions by antagonizing neuroendocrine vasoconstrictive forces. Summary of Pathophysiology of Heart Failure In summary, long-term overload-induced cardiac hypertrophy is accompanied by myocardial cell death and cardiac fibrosis (i.e., cardiomyopathy of overload). The hypertrophied ventricle outstrips its blood supply. The relative decrease in oxygen delivery worsens the increased MVO 2 demand. The ischemia resulting from hypertrophy and stretching beyond certain limits decreases contractile strength and eventually leads to loss of contractile proteins within these cells or loss of these cells. These processes result in atrophy of the affected myocardium and lead to the development of multifocal myocardial fibrosis and atrophy, which consequently interferes with diastolic function. When early interstitial fibrosis progresses to individuation of cardiac myocytes (with progression of hypertrophy), both systolic and diastolic functions are impaired. Therefore congestive heart failure is a progressive and irreversible disease with myocardial cell death and functional myocardial failure that ultimately leads to death. The cycles resulting in progressive left heart failure are detailed in Fig. 10-8 . Figure 10-8 Pathophysiology of Left Heart Failure. Pathophysiologic cycles that lead to progressive left heart failure. Cycle 1: Increased total vascular resistance increases myocardial wall stress that induces myocardial hypertrophy. Cycle 2: Water and sodium retention leads to increased preload and vascular congestion. Cycle 3: Neuroendocrine activation leads to myocardial and vascular remodeling. All cycles contribute to further myocardial dysfunction and neuroendocrine activation. (Adapted from Ettinger SJ, Feldman EC: Textbook of veterinary internal medicine, ed 6, St. Louis, 2005, Saunders.) Cardiac Syncope Cardiac syncope, an acute expression of cardiac disease, is characterized clinically by collapse, loss of consciousness, and extreme changes in heart rate and blood pressure, and with or without demonstrable lesions. Syncope can be caused by massive myocardial necrosis, ventricular fibrillation, heart block, arrhythmias, and reflex cardiac inhibition (e.g., that associated with high intestinal blockage). Types of Heart Failure A wide variety of experimental animal models of heart failure exist ( E-Table 10-1 ). The models have been used to develop an understanding of human cardiac disease. E-Table 10-1 Experimental Models of Heart Failure Experimental Model Experimental Method Species Pressure loading Pulmonary artery banding Rat, dog, pig, sheep, pony Aortic constriction Rat, rabbit, dog, sheep Supravalvular aortic constriction Dog Aortic valve stenosis Rabbit, dog Pulmonary valve stenosis Dog Experimental hypertension Rat, dog Volume loading Fluid overload Baboon Aorta-to-vena cava fistula Rat, dog Aortic valve incompetence Rat, rabbit Atrial septal defect Cat Myocardial infarction Sustained atrial pacing Dog Coronary ligation Dog, pig Controlled occlusion—subclavian-to-carotid shunt Dog Coronary embolism Dog, calf, pig Thrombus generation Dog Chronic hypoxia Rat Cardiomyopathy and other conditions Left ventricular Dacron patch Dog Spontaneous cardiomyopathy Hamster, mouse, cattle, rat, turkey, cat, dog Barbiturate overdose Dog Furazolidone cardiomyopathy Turkey, duckling Adriamycin cardiomyopathy Rat, dog, mouse, pig Isoprenaline Rat Noradrenaline Dog Amphetamine Rat Cobalt chloride Rat, pig Vitamin E deficiency Rat, mouse, calf, lamb Alcohol intoxication Rat Coxsackie viral myocarditis Mouse Viral encephalomyocarditis Mouse Altered cardiac development and/or function Transgenic mice Modified from Smith HJ, Nuttall A: Cardiovasc Res 19:181-186, 1985. Clinical Diagnostic Procedures For information on this topic, see E-Appendix 10-3 at www.expertconsult.com . Responses to Injury: Myocardium Common responses of the myocardium to injury are listed in Box 10-4 . Box 10-4 Responses of the Myocardium to Injury Disturbances of Circulation Hemorrhage Effusions Thrombosis and embolism Disturbances of Growth Atrophy (dilation) Hypertrophy Agenesis (aplasia), hypoplasia, dysplasia (dysgenesis) Developmental errors, congenital anomalies Neoplasia (neoplastic transformation) Cell Degeneration and Death Cell and metabolic dysfunction Oncotic necrosis Apoptosis INFLAMMATION Disturbances of Circulation Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). See section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Circulation , Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). Disturbances of Growth Myocardial Hypertrophy. See the discussion on hypertrophy in Chapter 1. Hypertrophy of the myocardium represents an increase in muscle mass, which is the result of an increase in the size of cardiac muscle cells ( Fig. 10-9 ; also see Fig. 10-5, B and E-Fig. 10-9 ). Two anatomic forms of hypertrophy are recognized. Eccentric hypertrophy results in a heart with enlarged ventricular chambers and walls of normal to somewhat decreased thickness. Volume-overload hypertrophy is characterized by new sarcomeres being assembled in series within sarcomeres resulting in increased length of myofibers. In concentric hypertrophy, the heart is characterized by small ventricular chambers and thick walls. Pressure-overload hypertrophy is the result of the formation of new sarcomeres assembled predominantly in parallel to the long axes of cells resulting in an increase in thickness of the myofiber. Some cats with hyperthyroidism have a cardiac hypertrophy that is mediated by enhanced production of myocardial contractile proteins under the influence of increased concentration of circulating thyroid hormones ( Fig. 10-10 ). The hypertrophy is reversible on return to euthyroidism. Figure 10-9 Cardiac Muscle Cells. Growth disturbances of atrophy and hypertrophy. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-10 Left Ventricular Hypertrophy, Hyperthyroidism, Heart, Bisected, Cat. Note prominent thickening of the left ventricular (LV) free wall. The ventricular septum (VS) is also thickened. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Three stages of myocardial hypertrophy are recognizable: (1) initiation, (2) stable hyperfunction, and (3) deterioration of function associated with degeneration of hypertrophied myocytes. Microscopically, in myocardial hypertrophy, the myocytes are enlarged and have large nuclei ( Fig. 10-11 ). Figure 10-11 Hypertrophic Cardiomyopathy, Myocyte Hypertrophy, Heart, Myocardium, Cat. Cardiac myocytes are hypertrophied, and there is an increase in interstitial fibroblasts. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Physiologic Atrophy. Physiologic atrophy of heart muscle may occur in confined animals and also occurs as a result of decompensation of cardiac myocytes in chronic congestive heart failure (see Fig. 10-5, A ). Initially, these myocytes respond through hypertrophy with increased contractile force according to the Frank-Starling phenomenon. However, stretching beyond certain limits decreases contractile strength and eventually leads to loss of contractile proteins within these cells or loss of these cells resulting in atrophy of the affected myocardium (see Fig. 10-9 ). Neoplastic Transformation. See Chapter 6 for a discussion of the mechanisms involved in neoplastic transformation. Rhabdomyomas and rhabdomyosarcomas are primary tumors that originate from the myocardium in domestic animals. Fibrosarcomas also occur rarely. Numerous types of secondary tumors, such as lymphosarcomas, metastasize to the myocardium and are discussed in this chapter and other chapters of this book. Hemangiosarcomas are tumors of blood vessels of the myocardium of the right atrium and are discussed later. Cell Degeneration and Death Sublethal cardiac muscle cell injuries include lipofuscinosis, fatty degeneration, myocytolysis, and vacuolar degeneration ( Fig. 10-12 ; see Chapter 1). Histopathologic study of sections of the myocardium is substantially limited with respect to specific diagnoses and only rarely can an etiologic diagnosis be made from the morphologic alterations. This inadequacy exists because the spectrum of pathologic reactions is limited, and many agents that damage the heart produce similar lesions. Myocardial necrosis can be confused with myocardial inflammation with secondary necrosis because both lesions have substantial leukocytic infiltration. Some animals that die peracutely from cardiac failure lack detectable microscopic alterations and are presumed to have suffered from an arrhythmic episode resulting in syncope. Hearts with long-standing myocardial damage have foci of fibrosis, regardless of the cause of the loss of myocytes. Correlation between the severity of clinical cardiac disease and the severity of myocardial injury can be poor: A small lesion at a critical site, such as a portion of the conduction system, can be fatal, whereas a widespread myocardial lesion, such as myocarditis, can be asymptomatic. Figure 10-12 Various Sublethal Cardiac Muscle Cell Injuries. A, Lipofuscinosis. B, Fatty degeneration. C, Myocytolysis. D, Vacuolar degeneration. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Cardiac myofibers can respond to toxins in a variety of ways—apoptosis, myofibrillar lysis, and coagulation necrosis are but a few mechanisms that may result from toxic exposure. A long list of toxins are responsible for causing myocardial injury; some of the most frequently observed current examples are ionophore toxicity in horses and ruminants, vitamin E–selenium deficiency in the young of many species, "heart-brain syndrome" of dogs (see Fig. 10-82 ), anthracycline toxicity in dogs, and gossypol toxicosis in pigs ( Box 10-5 ). In various localized areas throughout the world, numerous deaths in ruminants have resulted from consumption of poisonous plants such as Acacia georginae and Dichapetalum cymosum . Box 10-5 Causes of Myocardial Necrosis in Animals Nutritional Deficiencies Vitamin E–selenium, potassium, copper, thiamine, magnesium Toxicities Cobalt, catecholamines, vasodilator antihypertensive drugs, methylxanthines (theobromine, theophylline, caffeine), ionophores (monensin, lasalocid, salinomycin, maduramicin, narasin), vitamin D and calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , Solanum torvum ), other poisonous plants ( Acacia georginae , Gastrolobium spp., Oxylobium spp., Dichapetalum cymosum , Persea americana , Cassia occidentalis , Cassia obtusifolia , Karwinskia humboldtiana , Ateleia glazioviana , Eupatorium rugosum , Adonis aestivalis , Pachystigma pygmaeum , Fadogia homblei , Pavetta harborii , Tetrapterys multiglandulosa ), blister beetles ( Epicauta ), high-erucic-acid rapeseed oil, brominated vegetable oils, gossypol, T-2 mycotoxin, sodium fluoracetate (compound 1080), selenium, uremia Physical Injuries and Shock Central nervous system lesions and trauma ("heart-brain syndrome"), gastric dilation and volvulus, stress, overexertion, electrical defibrillation, hemorrhagic shock Cardiotoxicity has emerged as a significant clinical entity in veterinary medicine in recent years with the growing use of antineoplastic drugs in small animal practice and the widespread use of growth promotants in ruminants (see Fig. 10-49 ). The mechanisms of cardiotoxicities include (1) exaggerated pharmacologic action of drugs acting on cardiovascular tissues, (2) exposure to substances that depress myocardial function, (3) direct injury of cardiac muscle cells by chemicals, and (4) hypersensitivity reactions. Oncotic Necrosis. Necrosis of cardiac muscle cells is generally followed by leukocytic invasion and phagocytosis of sarcoplasmic debris ( Fig. 10-13 ; also see Figs. 15-13 and 15-14). The end result is persistence of collapsed sarcolemmal "tubes" of basal lamina surrounded by condensed interstitial stroma and vessels. Lesions with severe disruption of the myocardium have residual changes of fibroblastic proliferation and collagen deposition to form scar tissue. Regeneration of cardiac muscle cells generally does not occur, except in less evolved animals, such as amphibians and fish, and in certain inbred mouse strains. The continual contraction of intact cardiac muscle cells impairs the mechanisms for regeneration. Also, in hearts of neonatal animals and more often in avian hearts, a limited amount of myocyte regeneration has been reported. Hyperplasia of myocytes is a normal component of cardiac growth in fetal development and during the first few weeks of life. Thereafter, proliferation ceases and "normal growth" is the result of hypertrophy until cell size normal for each species is reached. Recent studies indicate that stem cells exist in adult animal and human hearts, and with myocardial injury, these cells may differentiate into cardiac muscle cells. However, the extent of myocyte regeneration is probably minimal. Figure 10-13 Sequential Events in Myocardial Necrosis. A, Various injuries lead to (B1) hyaline necrosis or (B2) apoptosis membrane blebbing . C, Healing with phagocytosis of cellular debris by macrophages, and (D) subsequent healing with fibrosis, rather than by regeneration. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Apoptosis. Apoptosis (programmed cell death of cardiac myocytes) is increasingly recognized for its role in the development of various myocardial lesions and cardiac diseases (see Chapter 1). These conditions include cardiac development, ischemic injury, several types of experimentally induced heart failure (ischemia-reperfusion, hypoxia, and pressure-overload hypertrophy), and cardiotoxicity. In some cell systems, apoptosis can be triggered by the presence of excessive amounts of oxygen free radicals. Cells dying by apoptosis shrink and form apoptotic bodies. In contrast to cell death by necrosis, apoptosis is not accompanied by an inflammatory reaction and fibrosis. Fatty Infiltration. Fatty infiltration is the presence of increased numbers of lipocytes interposed between myocardial fibers. The lesion is associated with obesity and age and appears as abundant epicardial and myocardial deposits of adipose tissue. Grossly, the myocardium has irregular layers of adipose tissue infiltrating normal myocardium. The atria and right ventricle are most often affected. Fatty Degeneration. Fatty degeneration (fatty change) is the accumulation of abundant lipid droplets in the sarcoplasm of myocytes. Microscopically, affected myocytes have numerous variably sized spherical droplets that appear as empty vacuoles in paraffin sections but stain positively for lipids with lipid-soluble stains in frozen sections. This lesion occurs with systemic disorders, such as severe anemia, toxemia, and copper deficiency, but is seen much less often in the heart than in the liver and kidneys (also see Chapter 1). Hydropic Degeneration. Hydropic degeneration, a distinctive microscopic alteration in cardiac muscle cells, is associated with chronic administration of anthracyclines, a group of antineoplastic drugs. Chronic passive congestion with ascites and cardiac dilation may result ( E-Figs. 10-10 and 10-11 ); see Figs. 10-5, A and 10-6 ). Affected fibers have extensive vacuolization of sarcoplasm that is initiated by distention of elements of sarcoplasmic reticulum and eventually ends in lysis of contractile material ( E-Figs. 10-12 and 10-13 ). E-Figure 10-10 Chronic Passive Congestion, Doxorubicin Cardiotoxicity, Congestive Heart Failure, Liver, Ascites, Rabbit. Note the light-red-stained transparent fluid in the peritoneal cavity (ascites) and the mottled liver (L) characteristic of chronic passive congestion. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-11 Cardiac Dilation, Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Rabbit. All cardiac chambers are dilated. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-12 Myocardial Vacuolar Degeneration, Chronic Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Section of Myocardium, Dog. The affected myocytes have prominent sarcoplasmic vacuolation (arrows). Plastic-embedded, toluidine blue–stained section. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-13 Sarcoplasmic Vacuolation, Chronic Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Section of Myocardium, Dog. The prominent sarcoplasmic vacuolation (V) is produced by distention of elements of sarcoplasmic reticulum. Even though the myofibrils have extensive lysis, mitochondria (arrowheads) are intact. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hydropic degeneration of cardiac muscle cells may also result from drug-induced injury to mitochondria. Antiretroviral drugs, such as nucleoside reverse transcriptase inhibitors (zidovudine or AZT), are linked to this distinctive lesion. Scattered cardiac muscle cells appear swollen with pale sarcoplasm by light microscopy. Electron microscopy reveals extensive mitochondrial swelling and disruption of cristae with subsequent formation of myelin figures from the membrane debris of damaged mitochondria. Myofibrillar Degeneration. Myofibrillar degeneration (myocytolysis) represents a distinctive sublethal injury of cardiac muscle cells. Affected fibers have pale eosinophilic sarcoplasm and lack cross-striations. Ultrastructurally, myofibrils have a variable extent of dissolution (myofibrillar lysis). This lesion has been described in furazolidone cardiotoxicity in birds ( Fig. 10-14 ; E-Fig. 10-14 ) and potassium deficiency in rats. Figure 10-14 Ventricular Dilation, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart, Duckling. Note that the dilated ventricles have collapsed once the blood was removed. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-14 Myofibrillar Lysis, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart, Ventricular Myocardium, Duckling. Affected myocytes have extensive dissolution of myofibrils with scattered free myofilaments and dense clumps of Z-band material (arrowheads). Other organelles appear normal. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Lipofuscinosis. Lipofuscinosis (brown atrophy) of the myocardium occurs in aged animals and in animals with severe cachexia, but it also has been described as a hereditary lesion in healthy Ayrshire cattle. Severely affected hearts appear brown and microscopically have clusters of yellow-brown granules at the nuclear poles of myocytes. These granules represent intralysosomal accumulation of membranous and amorphous debris (residual bodies). Mineralization. Myocardial mineralization (calcium) is a prominent feature in several diseases, such as hereditary calcinosis in mice, cardiomyopathy in hamsters, vitamin E–selenium deficiency in sheep and cattle ( Fig. 10-15 ), vitamin D toxicity in several species, calcinogenic plant toxicosis in cattle ("Manchester wasting disease"), and spontaneous myocardial calcification in aged rats and guinea pigs. Figure 10-15 Calcification, Vitamin E–Selenium Deficiency, Myocardial Necrosis, Heart, Right Ventricle, Lamb. The multiple white (W) subendocardial lesions are areas of calcified necrotic cardiac myocytes. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Myocardial Necrosis. Myocardial necrosis can result from a number of causes, including nutritional deficiencies, chemical and plant toxins, ischemia, metabolic disorders, heritable diseases, and physical injuries (see Box 10-5 ). Grossly, affected areas appear pale initially, and some progress to prominent yellow to white (see Fig. 10-49 ), dry areas made gritty by dystrophic mineralization. The lesions are focal, multifocal, or diffuse. The most frequent sites of focal lesions are the left ventricular papillary muscles and the subendocardial myocardium, especially when such lesions are related to transient reduction of vascular perfusion. These lesions can be overlooked at necropsy unless multiple incisions are made in the ventricular myocardium. In diseases with diffuse cardiac necrosis, such as white muscle disease of calves and lambs due to vitamin E–selenium deficiency, the discrete white lesions can be readily observed beneath the epicardial and endocardial surfaces ( Fig. 10-16 ). Figure 10-16 Myocardial Necrosis, Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Left Ventricular Myocardium, Calf. A, Note the prominent white chalky areas of necrosis with mineralization (arrows) of the myocardium. B, Similar necrosis is subepicardially and subendocardially in the sectioned free walls of the left ventricle and subendocardially in the myocardium of the ventricular septum (center). ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B courtesy Dr. P.N. Nation, Animal Pathology Services; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Microscopically, the appearance depends on the age of the lesions. Fibers in areas of recent necrosis often appear swollen and hypereosinophilic (hyaline necrosis). Striations are indistinct, and nuclei are pyknotic. Necrotic fibers often have scattered basophilic granules ( Fig. 10-17 ) that represent calcified mitochondria and can be confirmed by electron microscopy ( E-Fig. 10-15 ). In a second pattern of necrosis, affected myocytes have a "shredded" appearance because of hypercontraction and the formation of multiple transversely oriented bars of disrupted contractile material (often termed contraction band necrosis ) ( E-Fig. 10-16 ). A third pattern is seen in necrotic myocytes in large areas of ischemic necrosis (infarcts). These myocytes have features of coagulation necrosis and have relaxed rather than hypercontracted contractile elements. Figure 10-17 Acute Myocardial Necrosis with Mineralization, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Ventricular Myocardium, Pig. The darker red myocytes are necrotic, and some are mineralized (purplish areas). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-15 Myocardial Necrosis, Monensin Toxicosis, Necrotic Myocyte, Heart, Longitudinal Section, Calf. The necrotic myocyte (center) has disrupted myofibrils, damaged mitochondria with matrical densities, and several invading macrophages (M). F, Fibrin. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-16 Myocardial Necrosis, Electric Shock Overdose by Defibrillator, Heart, Dog. The dark shredded segments of myocytes are due to acute contraction band necrosis. The time interval between defibrillation and the fixation of the heart was 24 hours. Plastic-embedded, toluidine blue–stained section. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Within 24 to 48 hours after injury, necrotic areas are infiltrated by inflammatory cells, mainly macrophages and a few neutrophils; these phagocytose and lyse the necrotic cellular debris ( E-Fig. 10-17 ). In early stages of healing of necrosis, it is often difficult to distinguish the lesions from those found in some types of myocarditis (see later discussion). Later, when necrosis has progressed somewhat, lesions consist of persistent stromal tissue (interstitial fibroblasts, collagen, and capillaries) and empty "tubes" of basal laminae formerly occupied by necrotic myocytes (see Chapter 15). The healing phase is characterized by proliferation of connective tissue cells (fibroblasts) ( Fig. 10-18 ) and by deposition of connective tissue products (collagen and elastic tissue and acid mucopolysaccharides). Grossly, these areas with healing of myocardial necrosis appear as white, firm, contracted scars. Figure 10-18 Healing, Postmyocardial Necrosis, Heart, Ventricle, Dog. The necrotic myocytes have been removed by phagocytosis by macrophages (not seen here) , and the area is now undergoing fibrosis. H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-17 Myocardial Necrosis, Monensin Toxicosis, Heart, Section of Myocardium, Calf. Necrotic myocyte has disrupted contractile material invaded by a macrophage (M). The basal lamina of the necrotic myocyte is noted by arrowheads . TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The outcome of myocardial necrosis varies, depending on the extent of the damage: • Many animals die unexpectedly of acute cardiac failure if the myocardial damage is extensive. • Early deaths from necrosis-related arrhythmias also occur when cardiac conduction is disrupted. • Some cases eventually develop cardiac decompensation and die with cardiac dilation, scarring, and lesions of chronic congestive failure. Hearts with minimal damage have only microscopically detectable myocardial fibrosis when death eventually occurs from other diseases. Inflammation Myocarditis. The various infectious diseases that cause myocarditis in animals are summarized in Box 10-6 . Myocarditis generally is the result of infections spread hematogenously to the myocardium and occurs in various systemic diseases. Infrequently, the heart is the primary location in affected animals and responsible for death. Types of inflammation provoked by infectious agents that produce myocarditis include suppurative, necrotizing, hemorrhagic, lymphocytic, and eosinophilic. Suppurative myocarditis results from localization of pyogenic bacteria in the myocardium ( Fig. 10-19 ) that are trapped in thromboemboli most commonly originating from vegetative valvular endocarditis on the mitral and aortic valves. Septic infarcts with pale, disseminated lesions may be grossly evident in the myocardium. These foci consist of neutrophils and necrotic myocytes that form abscesses. Box 10-6 Diseases that Cause Myocarditis in Animals Viral Canine parvovirus, encephalomyocarditis, foot-and-mouth disease, pseudorabies, canine distemper, cytomegalovirus, Newcastle disease, avian encephalomyelitis, eastern and western equine encephalomyelitis, West Nile virus Bacterial Blackleg ( Clostridium chauvoei ), listeriosis ( Listeria monocytogenes ), Tyzzer's disease ( Clostridium piliforme , formerly Bacillus piliformis ), necrobacillosis ( Fusobacterium necrophorum ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), caseous lymphadenitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ), disseminated infections by Actinobacillus equuli , Staphylococcus sp., Corynebacterium kutscheri , Trueperella ( Arcanobacter ) pyogenes , Histophilus somni , Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus equi , and Streptococcus pneumoniae Protozoan Toxoplasmosis ( Toxoplasma gondii ), sarcocystosis ( Sarcocystis sp.), neosporosis ( Neospora caninum ), encephalitozoonosis ( Encephalitozoon cuniculi ), trypanosomiasis (Chagas' disease [ Trypanosoma cruzi ]), East Coast fever ( Theileria parva ) Parasitic Cysticercosis ( Cysticercus cellulosae ), trichinosis ( Trichinella spiralis ) Idiopathic Eosinophilic myocarditis Figure 10-19 Acute Myocarditis, Horse. A, The parallel arrays of myofibers are disrupted by acute inflammatory cells, edema fluid, and fibrin. B, Higher magnification of A. Note the myocardial fiber degeneration and necrosis with loss of cross striations (arrows) ; fragmentation of cardiac rhabdomyocytes (cardiomyocytes); and hypereosinophilia, coagulation, and clumping of the sarcoplasm. Neutrophils are the predominant inflammatory cell in the exudate. H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) The pathogenesis and expected outcome of cases of myocarditis remain an important area of research because of the severity of this lesion in cardiac failure in human beings. The sequelae to myocarditis include (1) complete resolution of lesions, (2) scattered residual myocardial scars, or (3) progressive myocardial damage with acute or, in some cases, chronic cardiac failure as secondary dilated (congestive) cardiomyopathy. In experimental studies of myocarditis induced in mice by coxsackie B virus, the severity of myocarditis was influenced by the virulence of the virus and mouse strain and was enhanced by host factors such as young age, male sex, pregnancy, poor nutrition, whole-body ionizing radiation, cold environmental temperatures, alcohol ingestion, exercise, and cortisone administration. Much of the myocardial damage in coxsackie B virus infection is induced by immunologic reactions (with T lymphocyte involvement) rather than by direct viral injury. Disturbances of Circulation Hemorrhage Effusions Thrombosis and embolism Disturbances of Growth Atrophy (dilation) Hypertrophy Agenesis (aplasia), hypoplasia, dysplasia (dysgenesis) Developmental errors, congenital anomalies Neoplasia (neoplastic transformation) Cell Degeneration and Death Cell and metabolic dysfunction Oncotic necrosis Apoptosis INFLAMMATION Disturbances of Circulation Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). See section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Circulation , Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). See section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Circulation , Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). Disturbances of Growth Myocardial Hypertrophy. See the discussion on hypertrophy in Chapter 1. Hypertrophy of the myocardium represents an increase in muscle mass, which is the result of an increase in the size of cardiac muscle cells ( Fig. 10-9 ; also see Fig. 10-5, B and E-Fig. 10-9 ). Two anatomic forms of hypertrophy are recognized. Eccentric hypertrophy results in a heart with enlarged ventricular chambers and walls of normal to somewhat decreased thickness. Volume-overload hypertrophy is characterized by new sarcomeres being assembled in series within sarcomeres resulting in increased length of myofibers. In concentric hypertrophy, the heart is characterized by small ventricular chambers and thick walls. Pressure-overload hypertrophy is the result of the formation of new sarcomeres assembled predominantly in parallel to the long axes of cells resulting in an increase in thickness of the myofiber. Some cats with hyperthyroidism have a cardiac hypertrophy that is mediated by enhanced production of myocardial contractile proteins under the influence of increased concentration of circulating thyroid hormones ( Fig. 10-10 ). The hypertrophy is reversible on return to euthyroidism. Figure 10-9 Cardiac Muscle Cells. Growth disturbances of atrophy and hypertrophy. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-10 Left Ventricular Hypertrophy, Hyperthyroidism, Heart, Bisected, Cat. Note prominent thickening of the left ventricular (LV) free wall. The ventricular septum (VS) is also thickened. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Three stages of myocardial hypertrophy are recognizable: (1) initiation, (2) stable hyperfunction, and (3) deterioration of function associated with degeneration of hypertrophied myocytes. Microscopically, in myocardial hypertrophy, the myocytes are enlarged and have large nuclei ( Fig. 10-11 ). Figure 10-11 Hypertrophic Cardiomyopathy, Myocyte Hypertrophy, Heart, Myocardium, Cat. Cardiac myocytes are hypertrophied, and there is an increase in interstitial fibroblasts. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Physiologic Atrophy. Physiologic atrophy of heart muscle may occur in confined animals and also occurs as a result of decompensation of cardiac myocytes in chronic congestive heart failure (see Fig. 10-5, A ). Initially, these myocytes respond through hypertrophy with increased contractile force according to the Frank-Starling phenomenon. However, stretching beyond certain limits decreases contractile strength and eventually leads to loss of contractile proteins within these cells or loss of these cells resulting in atrophy of the affected myocardium (see Fig. 10-9 ). Neoplastic Transformation. See Chapter 6 for a discussion of the mechanisms involved in neoplastic transformation. Rhabdomyomas and rhabdomyosarcomas are primary tumors that originate from the myocardium in domestic animals. Fibrosarcomas also occur rarely. Numerous types of secondary tumors, such as lymphosarcomas, metastasize to the myocardium and are discussed in this chapter and other chapters of this book. Hemangiosarcomas are tumors of blood vessels of the myocardium of the right atrium and are discussed later. Myocardial Hypertrophy. See the discussion on hypertrophy in Chapter 1. Hypertrophy of the myocardium represents an increase in muscle mass, which is the result of an increase in the size of cardiac muscle cells ( Fig. 10-9 ; also see Fig. 10-5, B and E-Fig. 10-9 ). Two anatomic forms of hypertrophy are recognized. Eccentric hypertrophy results in a heart with enlarged ventricular chambers and walls of normal to somewhat decreased thickness. Volume-overload hypertrophy is characterized by new sarcomeres being assembled in series within sarcomeres resulting in increased length of myofibers. In concentric hypertrophy, the heart is characterized by small ventricular chambers and thick walls. Pressure-overload hypertrophy is the result of the formation of new sarcomeres assembled predominantly in parallel to the long axes of cells resulting in an increase in thickness of the myofiber. Some cats with hyperthyroidism have a cardiac hypertrophy that is mediated by enhanced production of myocardial contractile proteins under the influence of increased concentration of circulating thyroid hormones ( Fig. 10-10 ). The hypertrophy is reversible on return to euthyroidism. Figure 10-9 Cardiac Muscle Cells. Growth disturbances of atrophy and hypertrophy. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-10 Left Ventricular Hypertrophy, Hyperthyroidism, Heart, Bisected, Cat. Note prominent thickening of the left ventricular (LV) free wall. The ventricular septum (VS) is also thickened. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Three stages of myocardial hypertrophy are recognizable: (1) initiation, (2) stable hyperfunction, and (3) deterioration of function associated with degeneration of hypertrophied myocytes. Microscopically, in myocardial hypertrophy, the myocytes are enlarged and have large nuclei ( Fig. 10-11 ). Figure 10-11 Hypertrophic Cardiomyopathy, Myocyte Hypertrophy, Heart, Myocardium, Cat. Cardiac myocytes are hypertrophied, and there is an increase in interstitial fibroblasts. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Physiologic Atrophy. Physiologic atrophy of heart muscle may occur in confined animals and also occurs as a result of decompensation of cardiac myocytes in chronic congestive heart failure (see Fig. 10-5, A ). Initially, these myocytes respond through hypertrophy with increased contractile force according to the Frank-Starling phenomenon. However, stretching beyond certain limits decreases contractile strength and eventually leads to loss of contractile proteins within these cells or loss of these cells resulting in atrophy of the affected myocardium (see Fig. 10-9 ). Neoplastic Transformation. See Chapter 6 for a discussion of the mechanisms involved in neoplastic transformation. Rhabdomyomas and rhabdomyosarcomas are primary tumors that originate from the myocardium in domestic animals. Fibrosarcomas also occur rarely. Numerous types of secondary tumors, such as lymphosarcomas, metastasize to the myocardium and are discussed in this chapter and other chapters of this book. Hemangiosarcomas are tumors of blood vessels of the myocardium of the right atrium and are discussed later. Cell Degeneration and Death Sublethal cardiac muscle cell injuries include lipofuscinosis, fatty degeneration, myocytolysis, and vacuolar degeneration ( Fig. 10-12 ; see Chapter 1). Histopathologic study of sections of the myocardium is substantially limited with respect to specific diagnoses and only rarely can an etiologic diagnosis be made from the morphologic alterations. This inadequacy exists because the spectrum of pathologic reactions is limited, and many agents that damage the heart produce similar lesions. Myocardial necrosis can be confused with myocardial inflammation with secondary necrosis because both lesions have substantial leukocytic infiltration. Some animals that die peracutely from cardiac failure lack detectable microscopic alterations and are presumed to have suffered from an arrhythmic episode resulting in syncope. Hearts with long-standing myocardial damage have foci of fibrosis, regardless of the cause of the loss of myocytes. Correlation between the severity of clinical cardiac disease and the severity of myocardial injury can be poor: A small lesion at a critical site, such as a portion of the conduction system, can be fatal, whereas a widespread myocardial lesion, such as myocarditis, can be asymptomatic. Figure 10-12 Various Sublethal Cardiac Muscle Cell Injuries. A, Lipofuscinosis. B, Fatty degeneration. C, Myocytolysis. D, Vacuolar degeneration. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Cardiac myofibers can respond to toxins in a variety of ways—apoptosis, myofibrillar lysis, and coagulation necrosis are but a few mechanisms that may result from toxic exposure. A long list of toxins are responsible for causing myocardial injury; some of the most frequently observed current examples are ionophore toxicity in horses and ruminants, vitamin E–selenium deficiency in the young of many species, "heart-brain syndrome" of dogs (see Fig. 10-82 ), anthracycline toxicity in dogs, and gossypol toxicosis in pigs ( Box 10-5 ). In various localized areas throughout the world, numerous deaths in ruminants have resulted from consumption of poisonous plants such as Acacia georginae and Dichapetalum cymosum . Box 10-5 Causes of Myocardial Necrosis in Animals Nutritional Deficiencies Vitamin E–selenium, potassium, copper, thiamine, magnesium Toxicities Cobalt, catecholamines, vasodilator antihypertensive drugs, methylxanthines (theobromine, theophylline, caffeine), ionophores (monensin, lasalocid, salinomycin, maduramicin, narasin), vitamin D and calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , Solanum torvum ), other poisonous plants ( Acacia georginae , Gastrolobium spp., Oxylobium spp., Dichapetalum cymosum , Persea americana , Cassia occidentalis , Cassia obtusifolia , Karwinskia humboldtiana , Ateleia glazioviana , Eupatorium rugosum , Adonis aestivalis , Pachystigma pygmaeum , Fadogia homblei , Pavetta harborii , Tetrapterys multiglandulosa ), blister beetles ( Epicauta ), high-erucic-acid rapeseed oil, brominated vegetable oils, gossypol, T-2 mycotoxin, sodium fluoracetate (compound 1080), selenium, uremia Physical Injuries and Shock Central nervous system lesions and trauma ("heart-brain syndrome"), gastric dilation and volvulus, stress, overexertion, electrical defibrillation, hemorrhagic shock Cardiotoxicity has emerged as a significant clinical entity in veterinary medicine in recent years with the growing use of antineoplastic drugs in small animal practice and the widespread use of growth promotants in ruminants (see Fig. 10-49 ). The mechanisms of cardiotoxicities include (1) exaggerated pharmacologic action of drugs acting on cardiovascular tissues, (2) exposure to substances that depress myocardial function, (3) direct injury of cardiac muscle cells by chemicals, and (4) hypersensitivity reactions. Oncotic Necrosis. Necrosis of cardiac muscle cells is generally followed by leukocytic invasion and phagocytosis of sarcoplasmic debris ( Fig. 10-13 ; also see Figs. 15-13 and 15-14). The end result is persistence of collapsed sarcolemmal "tubes" of basal lamina surrounded by condensed interstitial stroma and vessels. Lesions with severe disruption of the myocardium have residual changes of fibroblastic proliferation and collagen deposition to form scar tissue. Regeneration of cardiac muscle cells generally does not occur, except in less evolved animals, such as amphibians and fish, and in certain inbred mouse strains. The continual contraction of intact cardiac muscle cells impairs the mechanisms for regeneration. Also, in hearts of neonatal animals and more often in avian hearts, a limited amount of myocyte regeneration has been reported. Hyperplasia of myocytes is a normal component of cardiac growth in fetal development and during the first few weeks of life. Thereafter, proliferation ceases and "normal growth" is the result of hypertrophy until cell size normal for each species is reached. Recent studies indicate that stem cells exist in adult animal and human hearts, and with myocardial injury, these cells may differentiate into cardiac muscle cells. However, the extent of myocyte regeneration is probably minimal. Figure 10-13 Sequential Events in Myocardial Necrosis. A, Various injuries lead to (B1) hyaline necrosis or (B2) apoptosis membrane blebbing . C, Healing with phagocytosis of cellular debris by macrophages, and (D) subsequent healing with fibrosis, rather than by regeneration. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Apoptosis. Apoptosis (programmed cell death of cardiac myocytes) is increasingly recognized for its role in the development of various myocardial lesions and cardiac diseases (see Chapter 1). These conditions include cardiac development, ischemic injury, several types of experimentally induced heart failure (ischemia-reperfusion, hypoxia, and pressure-overload hypertrophy), and cardiotoxicity. In some cell systems, apoptosis can be triggered by the presence of excessive amounts of oxygen free radicals. Cells dying by apoptosis shrink and form apoptotic bodies. In contrast to cell death by necrosis, apoptosis is not accompanied by an inflammatory reaction and fibrosis. Fatty Infiltration. Fatty infiltration is the presence of increased numbers of lipocytes interposed between myocardial fibers. The lesion is associated with obesity and age and appears as abundant epicardial and myocardial deposits of adipose tissue. Grossly, the myocardium has irregular layers of adipose tissue infiltrating normal myocardium. The atria and right ventricle are most often affected. Fatty Degeneration. Fatty degeneration (fatty change) is the accumulation of abundant lipid droplets in the sarcoplasm of myocytes. Microscopically, affected myocytes have numerous variably sized spherical droplets that appear as empty vacuoles in paraffin sections but stain positively for lipids with lipid-soluble stains in frozen sections. This lesion occurs with systemic disorders, such as severe anemia, toxemia, and copper deficiency, but is seen much less often in the heart than in the liver and kidneys (also see Chapter 1). Hydropic Degeneration. Hydropic degeneration, a distinctive microscopic alteration in cardiac muscle cells, is associated with chronic administration of anthracyclines, a group of antineoplastic drugs. Chronic passive congestion with ascites and cardiac dilation may result ( E-Figs. 10-10 and 10-11 ); see Figs. 10-5, A and 10-6 ). Affected fibers have extensive vacuolization of sarcoplasm that is initiated by distention of elements of sarcoplasmic reticulum and eventually ends in lysis of contractile material ( E-Figs. 10-12 and 10-13 ). E-Figure 10-10 Chronic Passive Congestion, Doxorubicin Cardiotoxicity, Congestive Heart Failure, Liver, Ascites, Rabbit. Note the light-red-stained transparent fluid in the peritoneal cavity (ascites) and the mottled liver (L) characteristic of chronic passive congestion. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-11 Cardiac Dilation, Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Rabbit. All cardiac chambers are dilated. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-12 Myocardial Vacuolar Degeneration, Chronic Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Section of Myocardium, Dog. The affected myocytes have prominent sarcoplasmic vacuolation (arrows). Plastic-embedded, toluidine blue–stained section. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-13 Sarcoplasmic Vacuolation, Chronic Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Section of Myocardium, Dog. The prominent sarcoplasmic vacuolation (V) is produced by distention of elements of sarcoplasmic reticulum. Even though the myofibrils have extensive lysis, mitochondria (arrowheads) are intact. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hydropic degeneration of cardiac muscle cells may also result from drug-induced injury to mitochondria. Antiretroviral drugs, such as nucleoside reverse transcriptase inhibitors (zidovudine or AZT), are linked to this distinctive lesion. Scattered cardiac muscle cells appear swollen with pale sarcoplasm by light microscopy. Electron microscopy reveals extensive mitochondrial swelling and disruption of cristae with subsequent formation of myelin figures from the membrane debris of damaged mitochondria. Myofibrillar Degeneration. Myofibrillar degeneration (myocytolysis) represents a distinctive sublethal injury of cardiac muscle cells. Affected fibers have pale eosinophilic sarcoplasm and lack cross-striations. Ultrastructurally, myofibrils have a variable extent of dissolution (myofibrillar lysis). This lesion has been described in furazolidone cardiotoxicity in birds ( Fig. 10-14 ; E-Fig. 10-14 ) and potassium deficiency in rats. Figure 10-14 Ventricular Dilation, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart, Duckling. Note that the dilated ventricles have collapsed once the blood was removed. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-14 Myofibrillar Lysis, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart, Ventricular Myocardium, Duckling. Affected myocytes have extensive dissolution of myofibrils with scattered free myofilaments and dense clumps of Z-band material (arrowheads). Other organelles appear normal. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Lipofuscinosis. Lipofuscinosis (brown atrophy) of the myocardium occurs in aged animals and in animals with severe cachexia, but it also has been described as a hereditary lesion in healthy Ayrshire cattle. Severely affected hearts appear brown and microscopically have clusters of yellow-brown granules at the nuclear poles of myocytes. These granules represent intralysosomal accumulation of membranous and amorphous debris (residual bodies). Mineralization. Myocardial mineralization (calcium) is a prominent feature in several diseases, such as hereditary calcinosis in mice, cardiomyopathy in hamsters, vitamin E–selenium deficiency in sheep and cattle ( Fig. 10-15 ), vitamin D toxicity in several species, calcinogenic plant toxicosis in cattle ("Manchester wasting disease"), and spontaneous myocardial calcification in aged rats and guinea pigs. Figure 10-15 Calcification, Vitamin E–Selenium Deficiency, Myocardial Necrosis, Heart, Right Ventricle, Lamb. The multiple white (W) subendocardial lesions are areas of calcified necrotic cardiac myocytes. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Myocardial Necrosis. Myocardial necrosis can result from a number of causes, including nutritional deficiencies, chemical and plant toxins, ischemia, metabolic disorders, heritable diseases, and physical injuries (see Box 10-5 ). Grossly, affected areas appear pale initially, and some progress to prominent yellow to white (see Fig. 10-49 ), dry areas made gritty by dystrophic mineralization. The lesions are focal, multifocal, or diffuse. The most frequent sites of focal lesions are the left ventricular papillary muscles and the subendocardial myocardium, especially when such lesions are related to transient reduction of vascular perfusion. These lesions can be overlooked at necropsy unless multiple incisions are made in the ventricular myocardium. In diseases with diffuse cardiac necrosis, such as white muscle disease of calves and lambs due to vitamin E–selenium deficiency, the discrete white lesions can be readily observed beneath the epicardial and endocardial surfaces ( Fig. 10-16 ). Figure 10-16 Myocardial Necrosis, Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Left Ventricular Myocardium, Calf. A, Note the prominent white chalky areas of necrosis with mineralization (arrows) of the myocardium. B, Similar necrosis is subepicardially and subendocardially in the sectioned free walls of the left ventricle and subendocardially in the myocardium of the ventricular septum (center). ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B courtesy Dr. P.N. Nation, Animal Pathology Services; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Microscopically, the appearance depends on the age of the lesions. Fibers in areas of recent necrosis often appear swollen and hypereosinophilic (hyaline necrosis). Striations are indistinct, and nuclei are pyknotic. Necrotic fibers often have scattered basophilic granules ( Fig. 10-17 ) that represent calcified mitochondria and can be confirmed by electron microscopy ( E-Fig. 10-15 ). In a second pattern of necrosis, affected myocytes have a "shredded" appearance because of hypercontraction and the formation of multiple transversely oriented bars of disrupted contractile material (often termed contraction band necrosis ) ( E-Fig. 10-16 ). A third pattern is seen in necrotic myocytes in large areas of ischemic necrosis (infarcts). These myocytes have features of coagulation necrosis and have relaxed rather than hypercontracted contractile elements. Figure 10-17 Acute Myocardial Necrosis with Mineralization, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Ventricular Myocardium, Pig. The darker red myocytes are necrotic, and some are mineralized (purplish areas). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-15 Myocardial Necrosis, Monensin Toxicosis, Necrotic Myocyte, Heart, Longitudinal Section, Calf. The necrotic myocyte (center) has disrupted myofibrils, damaged mitochondria with matrical densities, and several invading macrophages (M). F, Fibrin. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-16 Myocardial Necrosis, Electric Shock Overdose by Defibrillator, Heart, Dog. The dark shredded segments of myocytes are due to acute contraction band necrosis. The time interval between defibrillation and the fixation of the heart was 24 hours. Plastic-embedded, toluidine blue–stained section. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Within 24 to 48 hours after injury, necrotic areas are infiltrated by inflammatory cells, mainly macrophages and a few neutrophils; these phagocytose and lyse the necrotic cellular debris ( E-Fig. 10-17 ). In early stages of healing of necrosis, it is often difficult to distinguish the lesions from those found in some types of myocarditis (see later discussion). Later, when necrosis has progressed somewhat, lesions consist of persistent stromal tissue (interstitial fibroblasts, collagen, and capillaries) and empty "tubes" of basal laminae formerly occupied by necrotic myocytes (see Chapter 15). The healing phase is characterized by proliferation of connective tissue cells (fibroblasts) ( Fig. 10-18 ) and by deposition of connective tissue products (collagen and elastic tissue and acid mucopolysaccharides). Grossly, these areas with healing of myocardial necrosis appear as white, firm, contracted scars. Figure 10-18 Healing, Postmyocardial Necrosis, Heart, Ventricle, Dog. The necrotic myocytes have been removed by phagocytosis by macrophages (not seen here) , and the area is now undergoing fibrosis. H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-17 Myocardial Necrosis, Monensin Toxicosis, Heart, Section of Myocardium, Calf. Necrotic myocyte has disrupted contractile material invaded by a macrophage (M). The basal lamina of the necrotic myocyte is noted by arrowheads . TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The outcome of myocardial necrosis varies, depending on the extent of the damage: • Many animals die unexpectedly of acute cardiac failure if the myocardial damage is extensive. • Early deaths from necrosis-related arrhythmias also occur when cardiac conduction is disrupted. • Some cases eventually develop cardiac decompensation and die with cardiac dilation, scarring, and lesions of chronic congestive failure. Hearts with minimal damage have only microscopically detectable myocardial fibrosis when death eventually occurs from other diseases. Nutritional Deficiencies Vitamin E–selenium, potassium, copper, thiamine, magnesium Toxicities Cobalt, catecholamines, vasodilator antihypertensive drugs, methylxanthines (theobromine, theophylline, caffeine), ionophores (monensin, lasalocid, salinomycin, maduramicin, narasin), vitamin D and calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , Solanum torvum ), other poisonous plants ( Acacia georginae , Gastrolobium spp., Oxylobium spp., Dichapetalum cymosum , Persea americana , Cassia occidentalis , Cassia obtusifolia , Karwinskia humboldtiana , Ateleia glazioviana , Eupatorium rugosum , Adonis aestivalis , Pachystigma pygmaeum , Fadogia homblei , Pavetta harborii , Tetrapterys multiglandulosa ), blister beetles ( Epicauta ), high-erucic-acid rapeseed oil, brominated vegetable oils, gossypol, T-2 mycotoxin, sodium fluoracetate (compound 1080), selenium, uremia Physical Injuries and Shock Central nervous system lesions and trauma ("heart-brain syndrome"), gastric dilation and volvulus, stress, overexertion, electrical defibrillation, hemorrhagic shock Oncotic Necrosis. Necrosis of cardiac muscle cells is generally followed by leukocytic invasion and phagocytosis of sarcoplasmic debris ( Fig. 10-13 ; also see Figs. 15-13 and 15-14). The end result is persistence of collapsed sarcolemmal "tubes" of basal lamina surrounded by condensed interstitial stroma and vessels. Lesions with severe disruption of the myocardium have residual changes of fibroblastic proliferation and collagen deposition to form scar tissue. Regeneration of cardiac muscle cells generally does not occur, except in less evolved animals, such as amphibians and fish, and in certain inbred mouse strains. The continual contraction of intact cardiac muscle cells impairs the mechanisms for regeneration. Also, in hearts of neonatal animals and more often in avian hearts, a limited amount of myocyte regeneration has been reported. Hyperplasia of myocytes is a normal component of cardiac growth in fetal development and during the first few weeks of life. Thereafter, proliferation ceases and "normal growth" is the result of hypertrophy until cell size normal for each species is reached. Recent studies indicate that stem cells exist in adult animal and human hearts, and with myocardial injury, these cells may differentiate into cardiac muscle cells. However, the extent of myocyte regeneration is probably minimal. Figure 10-13 Sequential Events in Myocardial Necrosis. A, Various injuries lead to (B1) hyaline necrosis or (B2) apoptosis membrane blebbing . C, Healing with phagocytosis of cellular debris by macrophages, and (D) subsequent healing with fibrosis, rather than by regeneration. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Apoptosis. Apoptosis (programmed cell death of cardiac myocytes) is increasingly recognized for its role in the development of various myocardial lesions and cardiac diseases (see Chapter 1). These conditions include cardiac development, ischemic injury, several types of experimentally induced heart failure (ischemia-reperfusion, hypoxia, and pressure-overload hypertrophy), and cardiotoxicity. In some cell systems, apoptosis can be triggered by the presence of excessive amounts of oxygen free radicals. Cells dying by apoptosis shrink and form apoptotic bodies. In contrast to cell death by necrosis, apoptosis is not accompanied by an inflammatory reaction and fibrosis. Fatty Infiltration. Fatty infiltration is the presence of increased numbers of lipocytes interposed between myocardial fibers. The lesion is associated with obesity and age and appears as abundant epicardial and myocardial deposits of adipose tissue. Grossly, the myocardium has irregular layers of adipose tissue infiltrating normal myocardium. The atria and right ventricle are most often affected. Fatty Degeneration. Fatty degeneration (fatty change) is the accumulation of abundant lipid droplets in the sarcoplasm of myocytes. Microscopically, affected myocytes have numerous variably sized spherical droplets that appear as empty vacuoles in paraffin sections but stain positively for lipids with lipid-soluble stains in frozen sections. This lesion occurs with systemic disorders, such as severe anemia, toxemia, and copper deficiency, but is seen much less often in the heart than in the liver and kidneys (also see Chapter 1). Hydropic Degeneration. Hydropic degeneration, a distinctive microscopic alteration in cardiac muscle cells, is associated with chronic administration of anthracyclines, a group of antineoplastic drugs. Chronic passive congestion with ascites and cardiac dilation may result ( E-Figs. 10-10 and 10-11 ); see Figs. 10-5, A and 10-6 ). Affected fibers have extensive vacuolization of sarcoplasm that is initiated by distention of elements of sarcoplasmic reticulum and eventually ends in lysis of contractile material ( E-Figs. 10-12 and 10-13 ). E-Figure 10-10 Chronic Passive Congestion, Doxorubicin Cardiotoxicity, Congestive Heart Failure, Liver, Ascites, Rabbit. Note the light-red-stained transparent fluid in the peritoneal cavity (ascites) and the mottled liver (L) characteristic of chronic passive congestion. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-11 Cardiac Dilation, Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Rabbit. All cardiac chambers are dilated. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-12 Myocardial Vacuolar Degeneration, Chronic Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Section of Myocardium, Dog. The affected myocytes have prominent sarcoplasmic vacuolation (arrows). Plastic-embedded, toluidine blue–stained section. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-13 Sarcoplasmic Vacuolation, Chronic Doxorubicin Cardiotoxicity, Heart, Section of Myocardium, Dog. The prominent sarcoplasmic vacuolation (V) is produced by distention of elements of sarcoplasmic reticulum. Even though the myofibrils have extensive lysis, mitochondria (arrowheads) are intact. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hydropic degeneration of cardiac muscle cells may also result from drug-induced injury to mitochondria. Antiretroviral drugs, such as nucleoside reverse transcriptase inhibitors (zidovudine or AZT), are linked to this distinctive lesion. Scattered cardiac muscle cells appear swollen with pale sarcoplasm by light microscopy. Electron microscopy reveals extensive mitochondrial swelling and disruption of cristae with subsequent formation of myelin figures from the membrane debris of damaged mitochondria. Myofibrillar Degeneration. Myofibrillar degeneration (myocytolysis) represents a distinctive sublethal injury of cardiac muscle cells. Affected fibers have pale eosinophilic sarcoplasm and lack cross-striations. Ultrastructurally, myofibrils have a variable extent of dissolution (myofibrillar lysis). This lesion has been described in furazolidone cardiotoxicity in birds ( Fig. 10-14 ; E-Fig. 10-14 ) and potassium deficiency in rats. Figure 10-14 Ventricular Dilation, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart, Duckling. Note that the dilated ventricles have collapsed once the blood was removed. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-14 Myofibrillar Lysis, Furazolidone Cardiotoxicity, Heart, Ventricular Myocardium, Duckling. Affected myocytes have extensive dissolution of myofibrils with scattered free myofilaments and dense clumps of Z-band material (arrowheads). Other organelles appear normal. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Lipofuscinosis. Lipofuscinosis (brown atrophy) of the myocardium occurs in aged animals and in animals with severe cachexia, but it also has been described as a hereditary lesion in healthy Ayrshire cattle. Severely affected hearts appear brown and microscopically have clusters of yellow-brown granules at the nuclear poles of myocytes. These granules represent intralysosomal accumulation of membranous and amorphous debris (residual bodies). Mineralization. Myocardial mineralization (calcium) is a prominent feature in several diseases, such as hereditary calcinosis in mice, cardiomyopathy in hamsters, vitamin E–selenium deficiency in sheep and cattle ( Fig. 10-15 ), vitamin D toxicity in several species, calcinogenic plant toxicosis in cattle ("Manchester wasting disease"), and spontaneous myocardial calcification in aged rats and guinea pigs. Figure 10-15 Calcification, Vitamin E–Selenium Deficiency, Myocardial Necrosis, Heart, Right Ventricle, Lamb. The multiple white (W) subendocardial lesions are areas of calcified necrotic cardiac myocytes. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Myocardial Necrosis. Myocardial necrosis can result from a number of causes, including nutritional deficiencies, chemical and plant toxins, ischemia, metabolic disorders, heritable diseases, and physical injuries (see Box 10-5 ). Grossly, affected areas appear pale initially, and some progress to prominent yellow to white (see Fig. 10-49 ), dry areas made gritty by dystrophic mineralization. The lesions are focal, multifocal, or diffuse. The most frequent sites of focal lesions are the left ventricular papillary muscles and the subendocardial myocardium, especially when such lesions are related to transient reduction of vascular perfusion. These lesions can be overlooked at necropsy unless multiple incisions are made in the ventricular myocardium. In diseases with diffuse cardiac necrosis, such as white muscle disease of calves and lambs due to vitamin E–selenium deficiency, the discrete white lesions can be readily observed beneath the epicardial and endocardial surfaces ( Fig. 10-16 ). Figure 10-16 Myocardial Necrosis, Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Left Ventricular Myocardium, Calf. A, Note the prominent white chalky areas of necrosis with mineralization (arrows) of the myocardium. B, Similar necrosis is subepicardially and subendocardially in the sectioned free walls of the left ventricle and subendocardially in the myocardium of the ventricular septum (center). ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B courtesy Dr. P.N. Nation, Animal Pathology Services; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Microscopically, the appearance depends on the age of the lesions. Fibers in areas of recent necrosis often appear swollen and hypereosinophilic (hyaline necrosis). Striations are indistinct, and nuclei are pyknotic. Necrotic fibers often have scattered basophilic granules ( Fig. 10-17 ) that represent calcified mitochondria and can be confirmed by electron microscopy ( E-Fig. 10-15 ). In a second pattern of necrosis, affected myocytes have a "shredded" appearance because of hypercontraction and the formation of multiple transversely oriented bars of disrupted contractile material (often termed contraction band necrosis ) ( E-Fig. 10-16 ). A third pattern is seen in necrotic myocytes in large areas of ischemic necrosis (infarcts). These myocytes have features of coagulation necrosis and have relaxed rather than hypercontracted contractile elements. Figure 10-17 Acute Myocardial Necrosis with Mineralization, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Ventricular Myocardium, Pig. The darker red myocytes are necrotic, and some are mineralized (purplish areas). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-15 Myocardial Necrosis, Monensin Toxicosis, Necrotic Myocyte, Heart, Longitudinal Section, Calf. The necrotic myocyte (center) has disrupted myofibrils, damaged mitochondria with matrical densities, and several invading macrophages (M). F, Fibrin. TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-16 Myocardial Necrosis, Electric Shock Overdose by Defibrillator, Heart, Dog. The dark shredded segments of myocytes are due to acute contraction band necrosis. The time interval between defibrillation and the fixation of the heart was 24 hours. Plastic-embedded, toluidine blue–stained section. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Within 24 to 48 hours after injury, necrotic areas are infiltrated by inflammatory cells, mainly macrophages and a few neutrophils; these phagocytose and lyse the necrotic cellular debris ( E-Fig. 10-17 ). In early stages of healing of necrosis, it is often difficult to distinguish the lesions from those found in some types of myocarditis (see later discussion). Later, when necrosis has progressed somewhat, lesions consist of persistent stromal tissue (interstitial fibroblasts, collagen, and capillaries) and empty "tubes" of basal laminae formerly occupied by necrotic myocytes (see Chapter 15). The healing phase is characterized by proliferation of connective tissue cells (fibroblasts) ( Fig. 10-18 ) and by deposition of connective tissue products (collagen and elastic tissue and acid mucopolysaccharides). Grossly, these areas with healing of myocardial necrosis appear as white, firm, contracted scars. Figure 10-18 Healing, Postmyocardial Necrosis, Heart, Ventricle, Dog. The necrotic myocytes have been removed by phagocytosis by macrophages (not seen here) , and the area is now undergoing fibrosis. H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-17 Myocardial Necrosis, Monensin Toxicosis, Heart, Section of Myocardium, Calf. Necrotic myocyte has disrupted contractile material invaded by a macrophage (M). The basal lamina of the necrotic myocyte is noted by arrowheads . TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The outcome of myocardial necrosis varies, depending on the extent of the damage: • Many animals die unexpectedly of acute cardiac failure if the myocardial damage is extensive. • Early deaths from necrosis-related arrhythmias also occur when cardiac conduction is disrupted. • Some cases eventually develop cardiac decompensation and die with cardiac dilation, scarring, and lesions of chronic congestive failure. Hearts with minimal damage have only microscopically detectable myocardial fibrosis when death eventually occurs from other diseases. Inflammation Myocarditis. The various infectious diseases that cause myocarditis in animals are summarized in Box 10-6 . Myocarditis generally is the result of infections spread hematogenously to the myocardium and occurs in various systemic diseases. Infrequently, the heart is the primary location in affected animals and responsible for death. Types of inflammation provoked by infectious agents that produce myocarditis include suppurative, necrotizing, hemorrhagic, lymphocytic, and eosinophilic. Suppurative myocarditis results from localization of pyogenic bacteria in the myocardium ( Fig. 10-19 ) that are trapped in thromboemboli most commonly originating from vegetative valvular endocarditis on the mitral and aortic valves. Septic infarcts with pale, disseminated lesions may be grossly evident in the myocardium. These foci consist of neutrophils and necrotic myocytes that form abscesses. Box 10-6 Diseases that Cause Myocarditis in Animals Viral Canine parvovirus, encephalomyocarditis, foot-and-mouth disease, pseudorabies, canine distemper, cytomegalovirus, Newcastle disease, avian encephalomyelitis, eastern and western equine encephalomyelitis, West Nile virus Bacterial Blackleg ( Clostridium chauvoei ), listeriosis ( Listeria monocytogenes ), Tyzzer's disease ( Clostridium piliforme , formerly Bacillus piliformis ), necrobacillosis ( Fusobacterium necrophorum ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), caseous lymphadenitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ), disseminated infections by Actinobacillus equuli , Staphylococcus sp., Corynebacterium kutscheri , Trueperella ( Arcanobacter ) pyogenes , Histophilus somni , Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus equi , and Streptococcus pneumoniae Protozoan Toxoplasmosis ( Toxoplasma gondii ), sarcocystosis ( Sarcocystis sp.), neosporosis ( Neospora caninum ), encephalitozoonosis ( Encephalitozoon cuniculi ), trypanosomiasis (Chagas' disease [ Trypanosoma cruzi ]), East Coast fever ( Theileria parva ) Parasitic Cysticercosis ( Cysticercus cellulosae ), trichinosis ( Trichinella spiralis ) Idiopathic Eosinophilic myocarditis Figure 10-19 Acute Myocarditis, Horse. A, The parallel arrays of myofibers are disrupted by acute inflammatory cells, edema fluid, and fibrin. B, Higher magnification of A. Note the myocardial fiber degeneration and necrosis with loss of cross striations (arrows) ; fragmentation of cardiac rhabdomyocytes (cardiomyocytes); and hypereosinophilia, coagulation, and clumping of the sarcoplasm. Neutrophils are the predominant inflammatory cell in the exudate. H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) The pathogenesis and expected outcome of cases of myocarditis remain an important area of research because of the severity of this lesion in cardiac failure in human beings. The sequelae to myocarditis include (1) complete resolution of lesions, (2) scattered residual myocardial scars, or (3) progressive myocardial damage with acute or, in some cases, chronic cardiac failure as secondary dilated (congestive) cardiomyopathy. In experimental studies of myocarditis induced in mice by coxsackie B virus, the severity of myocarditis was influenced by the virulence of the virus and mouse strain and was enhanced by host factors such as young age, male sex, pregnancy, poor nutrition, whole-body ionizing radiation, cold environmental temperatures, alcohol ingestion, exercise, and cortisone administration. Much of the myocardial damage in coxsackie B virus infection is induced by immunologic reactions (with T lymphocyte involvement) rather than by direct viral injury. Myocarditis. The various infectious diseases that cause myocarditis in animals are summarized in Box 10-6 . Myocarditis generally is the result of infections spread hematogenously to the myocardium and occurs in various systemic diseases. Infrequently, the heart is the primary location in affected animals and responsible for death. Types of inflammation provoked by infectious agents that produce myocarditis include suppurative, necrotizing, hemorrhagic, lymphocytic, and eosinophilic. Suppurative myocarditis results from localization of pyogenic bacteria in the myocardium ( Fig. 10-19 ) that are trapped in thromboemboli most commonly originating from vegetative valvular endocarditis on the mitral and aortic valves. Septic infarcts with pale, disseminated lesions may be grossly evident in the myocardium. These foci consist of neutrophils and necrotic myocytes that form abscesses. Box 10-6 Diseases that Cause Myocarditis in Animals Viral Canine parvovirus, encephalomyocarditis, foot-and-mouth disease, pseudorabies, canine distemper, cytomegalovirus, Newcastle disease, avian encephalomyelitis, eastern and western equine encephalomyelitis, West Nile virus Bacterial Blackleg ( Clostridium chauvoei ), listeriosis ( Listeria monocytogenes ), Tyzzer's disease ( Clostridium piliforme , formerly Bacillus piliformis ), necrobacillosis ( Fusobacterium necrophorum ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), caseous lymphadenitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ), disseminated infections by Actinobacillus equuli , Staphylococcus sp., Corynebacterium kutscheri , Trueperella ( Arcanobacter ) pyogenes , Histophilus somni , Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus equi , and Streptococcus pneumoniae Protozoan Toxoplasmosis ( Toxoplasma gondii ), sarcocystosis ( Sarcocystis sp.), neosporosis ( Neospora caninum ), encephalitozoonosis ( Encephalitozoon cuniculi ), trypanosomiasis (Chagas' disease [ Trypanosoma cruzi ]), East Coast fever ( Theileria parva ) Parasitic Cysticercosis ( Cysticercus cellulosae ), trichinosis ( Trichinella spiralis ) Idiopathic Eosinophilic myocarditis Figure 10-19 Acute Myocarditis, Horse. A, The parallel arrays of myofibers are disrupted by acute inflammatory cells, edema fluid, and fibrin. B, Higher magnification of A. Note the myocardial fiber degeneration and necrosis with loss of cross striations (arrows) ; fragmentation of cardiac rhabdomyocytes (cardiomyocytes); and hypereosinophilia, coagulation, and clumping of the sarcoplasm. Neutrophils are the predominant inflammatory cell in the exudate. H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) The pathogenesis and expected outcome of cases of myocarditis remain an important area of research because of the severity of this lesion in cardiac failure in human beings. The sequelae to myocarditis include (1) complete resolution of lesions, (2) scattered residual myocardial scars, or (3) progressive myocardial damage with acute or, in some cases, chronic cardiac failure as secondary dilated (congestive) cardiomyopathy. In experimental studies of myocarditis induced in mice by coxsackie B virus, the severity of myocarditis was influenced by the virulence of the virus and mouse strain and was enhanced by host factors such as young age, male sex, pregnancy, poor nutrition, whole-body ionizing radiation, cold environmental temperatures, alcohol ingestion, exercise, and cortisone administration. Much of the myocardial damage in coxsackie B virus infection is induced by immunologic reactions (with T lymphocyte involvement) rather than by direct viral injury. Viral Canine parvovirus, encephalomyocarditis, foot-and-mouth disease, pseudorabies, canine distemper, cytomegalovirus, Newcastle disease, avian encephalomyelitis, eastern and western equine encephalomyelitis, West Nile virus Bacterial Blackleg ( Clostridium chauvoei ), listeriosis ( Listeria monocytogenes ), Tyzzer's disease ( Clostridium piliforme , formerly Bacillus piliformis ), necrobacillosis ( Fusobacterium necrophorum ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), caseous lymphadenitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ), disseminated infections by Actinobacillus equuli , Staphylococcus sp., Corynebacterium kutscheri , Trueperella ( Arcanobacter ) pyogenes , Histophilus somni , Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus equi , and Streptococcus pneumoniae Protozoan Toxoplasmosis ( Toxoplasma gondii ), sarcocystosis ( Sarcocystis sp.), neosporosis ( Neospora caninum ), encephalitozoonosis ( Encephalitozoon cuniculi ), trypanosomiasis (Chagas' disease [ Trypanosoma cruzi ]), East Coast fever ( Theileria parva ) Parasitic Cysticercosis ( Cysticercus cellulosae ), trichinosis ( Trichinella spiralis ) Idiopathic Eosinophilic myocarditis Responses to Injury: Cardiac Conduction System In domestic animals, injury of the cardiac conduction system involves forms of cell degeneration and death, inflammation, and fibrosis. The response to injury of the conduction system is poorly documented because histopathology of the conduction system is labor-intensive and rarely performed. In rare cases in which histopathology and electrocardiographic studies were available, atrial and/or ventricular origin of arrhythmia was associated with inflammation, degeneration, and fibrosis along the cardiac conduction system ( Fig. 10-20 ). Figure 10-20 Inflammation in the Conduction System From a Dog. A, Sinoatrial node (SAN) . Moderate numbers of lymphocytes and plasma cells (arrow) multifocally infiltrate the interstitial spaces between cardiomyocytes. H&E stain. B, Atrioventricular node (AVN) . Small numbers of lymphocytes and plasma cells (arrow) multifocally infiltrate the interstitial spaces between cardiomyocytes. H&E stain. C, Bundle of His (BH) . Small numbers of lymphocytes and plasma cells (arrow) multifocally infiltrate the interstitial spaces between cardiomyocytes; fibrous connective tissue (arrowhead) multifocally replaces lost cardiomyocytes. H&E stain. D, Bundle of His (BH) and bundle branch (BB) . Small numbers of lymphocytes and plasma cells (arrow) multifocally infiltrate the interstitial spaces between cardiomyocytes; fibrous connective tissue (arrowhead) multifocally replaces lost cardiomyocytes. H&E stain. (Courtesy Dr. A. Gal, Institute of Veterinary, Animal and Biomedical Sciences, Massey University and Drs. M. Bates and P. Roady, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Responses to Injury: Endocardium and Heart Valves Disturbances of Circulation Hemorrhage. Endocardial hemorrhages are commonly seen and may be the result of trauma or septicemias, especially those with endotoxins, or can occur agonally at death ( Fig. 10-21 ). See the previous sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium , Myocardium and Box 10-4 and also Chapter 2. Figure 10-21 Endocardial Suffusive Hemorrhage, Heart, Left Ventricle, Calf. A red to dark-red sheet of suffusive hemorrhage is present in the endocardium of the left ventricle and left atrium. Suffusive hemorrhage is often attributed to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Cellular Degeneration and Death See Chapter 1 for discussion of the causes of cell injury, irreversible cell injury and cell death, and chronic cell injury and cell adaptations. Myxomatous Valvular Degeneration (Endocardiosis). See the discussion on myxomatous valvular degeneration (endocardiosis) in the section on Disorders of Dogs and Fig. 10-83 . Mineralization. Mineralization of the endocardium is seen with vitamin D toxicity, calcinogenic plant toxicosis in cattle, and calcium phosphorus imbalance, as well as in Johne's disease ( Fig. 10-22 ; see Chapter 7). The endocardium and large elastic arteries are prone to mineralization because of their abundant elastic fibers. Figure 10-22 Endocardial Mineralization, Johne's Disease, Heart, Left Atrial Endocardium, Cow. The left atrial (LA) endocardium is white, thick, and wrinkled from mineralization. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation See Chapters 3 and 5 for discussion of the processes and mechanisms of acute and chronic inflammation. Disturbances of Circulation Hemorrhage. Endocardial hemorrhages are commonly seen and may be the result of trauma or septicemias, especially those with endotoxins, or can occur agonally at death ( Fig. 10-21 ). See the previous sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium , Myocardium and Box 10-4 and also Chapter 2. Figure 10-21 Endocardial Suffusive Hemorrhage, Heart, Left Ventricle, Calf. A red to dark-red sheet of suffusive hemorrhage is present in the endocardium of the left ventricle and left atrium. Suffusive hemorrhage is often attributed to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hemorrhage. Endocardial hemorrhages are commonly seen and may be the result of trauma or septicemias, especially those with endotoxins, or can occur agonally at death ( Fig. 10-21 ). See the previous sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium , Myocardium and Box 10-4 and also Chapter 2. Figure 10-21 Endocardial Suffusive Hemorrhage, Heart, Left Ventricle, Calf. A red to dark-red sheet of suffusive hemorrhage is present in the endocardium of the left ventricle and left atrium. Suffusive hemorrhage is often attributed to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Cellular Degeneration and Death See Chapter 1 for discussion of the causes of cell injury, irreversible cell injury and cell death, and chronic cell injury and cell adaptations. Myxomatous Valvular Degeneration (Endocardiosis). See the discussion on myxomatous valvular degeneration (endocardiosis) in the section on Disorders of Dogs and Fig. 10-83 . Mineralization. Mineralization of the endocardium is seen with vitamin D toxicity, calcinogenic plant toxicosis in cattle, and calcium phosphorus imbalance, as well as in Johne's disease ( Fig. 10-22 ; see Chapter 7). The endocardium and large elastic arteries are prone to mineralization because of their abundant elastic fibers. Figure 10-22 Endocardial Mineralization, Johne's Disease, Heart, Left Atrial Endocardium, Cow. The left atrial (LA) endocardium is white, thick, and wrinkled from mineralization. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Myxomatous Valvular Degeneration (Endocardiosis). See the discussion on myxomatous valvular degeneration (endocardiosis) in the section on Disorders of Dogs and Fig. 10-83 . Mineralization. Mineralization of the endocardium is seen with vitamin D toxicity, calcinogenic plant toxicosis in cattle, and calcium phosphorus imbalance, as well as in Johne's disease ( Fig. 10-22 ; see Chapter 7). The endocardium and large elastic arteries are prone to mineralization because of their abundant elastic fibers. Figure 10-22 Endocardial Mineralization, Johne's Disease, Heart, Left Atrial Endocardium, Cow. The left atrial (LA) endocardium is white, thick, and wrinkled from mineralization. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation See Chapters 3 and 5 for discussion of the processes and mechanisms of acute and chronic inflammation. Responses to Injury: Pericardium and Epicardium Disturbances of Circulation Hemorrhage. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemorrhage. Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Serous Atrophy. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Growth, Serous Atrophy. Inflammation Pericarditis. See section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation, Pericarditis. Disturbances of Circulation Hemorrhage. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemorrhage. Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Hemorrhage. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemorrhage. Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Serous Atrophy. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Growth, Serous Atrophy. Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Serous Atrophy. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Growth, Serous Atrophy. Inflammation Pericarditis. See section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation, Pericarditis. Pericarditis. See section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation, Pericarditis. Responses to Injury: Blood and Lymphatic Vascular Systems The responses of blood and lymphatic vessels to injury involve a complex interaction among the cellular and noncellular elements of the vessel wall and the cellular and noncellular elements of the blood. The key cells of vessels in these reactions are endothelial cells and smooth muscle cells. Endothelial cells are metabolically active and provide a thromboresistant monolayer at the interface of blood and the vessel wall unless damaged. Endothelial cells play an important role in fluid distribution, inflammation, angiogenesis, and hemostasis (see Chapters 2 and 3). Responses of blood vessels to a variety of toxins are listed in E-Box 10-1 . E-Box 10-1 Toxicants Affecting Blood Vessels Arteries Toxicants that produce arterial medial smooth muscle proliferation • Ergot ( Claviceps purpurea ), ergotamine • Fescue ( Festuca arundinacea ) parasitized by endophytic fungi ( Epichloe typhina , Acremonium coenophialum ) Toxicants that induce arterial medial calcification • Vitamin D (dietary excess or cholecalciferol-containing rodenticides) • Calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , Solanum torvum ) Toxicants that induce necrosis of arterial medial smooth muscle and medial hemorrhage • Epinephrine, norepinephrine, digoxin, theobromine, minoxidil, hydralazine, fenoldopam mesylate, phosphodiesterase inhibitors, endothelin receptor antagonists, dopamine receptor agonists, others Toxicants that alter arterial connective tissue to produce aneurysms • β-Aminopropionitrile ( Lathyrus sp. product) • Penicillamine, aminoacetonitrile Toxicants that induce arterial intimal proliferation • Ergotamine, methylsergide, estrogen and/or progesterone-containing oral contraceptives, others Toxicants that induce arterial fibrinoid necrosis • Organic mercury, lead Veins Toxicants that induce venous hyaline degeneration • Phenylbutazone Capillaries Toxicants that incite microangiopathy • Cadmium, cyclophosphamide Key functions of endothelial cells include prostacyclin production, macromolecular transport, and recruitment of inflammatory cells. Injury of endothelial cells is followed by separation from the underlying basement membrane and increased permeability to movement of plasma proteins into the subendothelium. Necrosis of endothelium exposes subendothelial collagen and elicits thrombus formation. Endothelial cells at the margin of denuded areas proliferate and re-endothelialize the damaged area. The arterial intima has regional differences in the uptake of macromolecules, as well as other unique structural and functional features that result in lesion-prone areas of the vasculature. Bilirubin staining of the intima results in yellow discoloration in jaundiced animals ( Fig. 10-23 ). Figure 10-23 Jaundice, Heart, Aorta, Dog. Note yellow discoloration of the aortic intima. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The other major cellular component of vessels involved in reaction to injury is the smooth muscle cell. These cells have important functions, including production of extracellular components, such as collagen, elastin, and proteoglycans; maintenance of vascular tone; monocyte recruitment; lipoprotein metabolism; production of bioactive lipids, such as prostaglandins; and formation of oxygen-free radicals. These functions are regulated by a wide variety of biochemical mediators, such as various growth factors, cytokines, and inflammatory mediators. Blood Vessels Disturbances of Circulation Hemorrhage. Hemorrhage resulting from vascular injury is a frequent lesion of the epicardium, endocardium, and myocardium. Hemorrhages vary in size from petechiae (1- to 2-mm diameter) to ecchymoses (2- to 10-mm diameter) to suffusive (diffuse). Animals dying from septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution often have prominent epicardial ( Fig. 10-24 ; E-Fig. 10-18 and endocardial (see Fig. 10-21 ) hemorrhages. Horses dying of any cause usually have agonal hemorrhages on the epicardial and endocardial surfaces. A distinctive example of a specific disease with cardiac hemorrhage is mulberry heart disease, associated with vitamin E–selenium deficiency in growing pigs. In these pigs, hydropericardium accompanies severe myocardial hemorrhage that results in a red, mottled (mulberry-like) appearance of the heart. Also see the previous discussions on disturbances of circulation in the sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium in the Responses to Injury section. Figure 10-24 Epicardial Hemorrhage, Petechiae and Ecchymoses, Endotoxemia, Heart, Cow. Note the epicardial and subepicardial hemorrhages in the fat of the coronary groove (a common site). Petechiae and ecchymoses are often attributable to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. In this case, the hemorrhage resulted from injury to the endothelium from endotoxin (component of the cell wall of Gram-negative bacteria). The smaller, pinpoint hemorrhages (1 to 2 mm) are petechiae. The larger hemorrhages (3 to 5 mm) are ecchymoses. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-18 Epicardial Hemorrhage, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Left Atrium, Pig. Note epicardial hemorrhage (upper left) and prominent small blood vessels with swollen endothelial cells (arrows) . H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Disturbances of Growth. See Chapter 1 for discussion of the causes of disturbances of cell growth (see cell adaptations). Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Hypertrophy. Arterial hypertrophy is a response to sustained increases in pressure or volume loads. Affected vessels are generally muscular arteries, and the increase in wall thickness is predominantly caused by hypertrophy (and, to some degree, hyperplasia) of smooth muscle cells of the tunica media. Muscular pulmonary arteries of cats are frequently affected, and the lesion has been associated with infection by several parasites, including Aelurostrongylus abstrusus (the lungworm of cats), Toxocara sp., and Dirofilaria immitis ( Fig. 10-25 ). However, the lesions often occur in the absence of parasitic infections ( Fig. 10-26 ). Often, no clinical disease is associated with the lesion in cats, but asthmatic signs have been seen in cats with these parasitic infections. Similar hypertrophy of muscular pulmonary arteries occurs in cattle with hypoxia-induced pulmonary arterial vasoconstriction and subsequent pulmonary hypertension associated with right-sided heart failure from exposure to high altitudes (so-called high-altitude disease or "brisket disease") (see section on the stages of myocardial hypertrophy). Also, cardiovascular anomalies that shunt blood left to right in animals result in pulmonary hypertension; these animals may have hypertrophy of the muscular pulmonary arteries, which can result in plexogenic pulmonary arteriopathy. Uterine arteries in pregnant animals are hypertrophic. Figure 10-25 Medial Hypertrophy, Periarteritis, Dirofilariasis, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Note the massively thickened tunica media (T) of the small branches of the pulmonary arteries and their periarterial cuff of chronic inflammatory cells and some eosinophils. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-26 Medial Hypertrophy, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Proliferation of smooth muscle cells (arrows) has resulted in marked thickening of the tunica media. Note luminal narrowing. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation. See Chapters 3 and 5 for discussion of the processes and mechanisms of acute and chronic inflammation. Arteritis and Vasculitis. Arteritis occurs as a feature of many infectious and immune-mediated diseases ( Box 10-7 ). Often, all types of vessels are affected rather than only arteries, and then vasculitis or angiitis (a term that includes blood and lymphatic vessels) is the term applied to the lesions. The vascular system serves as the major mechanisms for transport of organisms—for example, Bacillus anthracis. In inflamed vessels, leukocytes are present within and surrounding the walls, and damage to the vessel wall is evident as fibrin deposits or necrotic endothelial and smooth muscle cells. As a result of endothelial damage, thrombosis, which can result in ischemic injury or infarction in the circulatory field, may be present. Arteritis and vasculitis can develop from endothelial injury caused by either infectious agents or immune-mediated mechanisms or may be caused by local extension of suppurative and necrotizing inflammatory processes in adjacent tissues. Arteritis is a prominent feature of several parasitic diseases. Box 10-7 Diseases that Cause Arteritis in Animals Viral Equine viral arteritis, African horse sickness, equine infectious anemia, equine morbillivirus, malignant catarrhal fever, bovine virus diarrhea, bovine ephemeral fever, bluetongue, hog cholera, African swine fever, feline infectious peritonitis, Aleutian mink disease Bacterial Bartonella henselae , leptospirosis, Salmonellosis, erysipelas ( Erysipelothrix rhusiopathiae ), Haemophilus spp. infections ( Haemophilus suis , Haemophilus somnus , Haemophilus parasuis ), heartwater ( Ehrlichia ruminantium ), Rocky Mountain spotted fever ( Rickettsia rickettsii ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ) Mycotic Phycomycosis, aspergillosis Parasitic Equine strongylosis ( Strongylus vulgaris ), dirofilariasis ( Dirofilaria immitis ), French heartworm ( Angiostrongylus vasorum ), spirocercosis ( Spirocerca lupi ), onchocerciasis, elaeophoriasis ( Elaeophora sp.), filariasis in primates, aelurostrongylosis Immune-Mediated Canine systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, polyarteritis nodosa, lymphocytic choriomeningitis, drug-induced hypersensitivity Systemic infections with phlebitis as a lesion include salmonellosis in several species and feline infectious peritonitis. In pigs with various septicemias, such as salmonellosis and colibacillosis, the gastric fundic mucosa is often severely congested and hemorrhagic because of venous endothelial damage and thrombosis. In severe local infections, such as in metritis or hepatic abscesses, inflammation extends into the walls of adjacent veins and produces phlebitis, with or without thrombosis. Intravenous injections of irritant solutions, injecting solutions into the vascular wall, or intimal trauma produced by indwelling venous catheters result in vascular damage and create an opportunity for localization and proliferation of infectious agents and development of phlebitis and thrombosis ( Fig. 10-27 ). Animals with phlebitis complicated by thrombosis have the additional risk of septic embolism, which can cause endocarditis and pulmonary abscesses or pulmonary infarcts. Figure 10-27 Thrombus (Mural), Jugular Vein (Opened), Dog. Note the nodular mural thrombus (left [arrow]) in the jugular vein. This thrombus likely occurred at a site of venipuncture and a subsequent phlebitis. The smooth-surfaced red-tan thrombus (right [arrowhead]) extending toward the heart is a trailing thrombus, a continuation of the mural thrombus. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Many reportable foreign animal diseases are viral diseases, which are endotheliotropic and result in vasculitis; examples include classic swine fever (hog cholera), African horse sickness, and African swine fever (see the sections on disorders of specific animal species). Thrombosis and Embolism Coronary and Other Arteries. Thrombosis or embolism of the coronary arteries can result in myocardial infarction ( Fig. 10-28 ) and cardiac failure. These lesions are much less common in animals than in human beings. Affected animals generally have one of several types of coronary arterial disease, including atherosclerosis, arteriosclerosis, or periarteritis. In atherosclerosis associated with hypothyroidism or diabetes mellitus (discussed previously), severe lesions are present in the extramural (epicardial) coronary arteries of dogs, but this only rarely leads to thrombosis and myocardial infarction. In contrast, severe arteriosclerosis of intramural cardiac arteries in aged dogs can cause small multifocal myocardial infarcts (see Fig. 10-28 ). Affected dogs often also have myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis), which is also an age-related disease. Thrombosis of or embolism to other large arteries, such as the interlobular artery of the kidney, can lead to infarction of the tissue supplied by the artery ( E-Fig. 10-19 ; also see Chapter 2). Figure 10-28 Myocardial Infarction, Heart, Left and Right Ventricles, Dog. Pale, necrotic, circumscribed areas (arrows) are present in the ventricular walls and are most prominent at the apex. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-19 Arterial Thrombosis, Subacute, Interlobular Artery, Kidney, Dog. An interlobular artery contains a thromboembolus, which has firmly attached to the vessel wall. Note the large size of the thromboembolus compared to the luminal diameter (see bottom left corner) of the artery. This finding suggests that it is "growing" in size via the mechanisms of Virchow's triad and the adherence of platelets and fibrin to the initial embolus. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Lymphatic Vessels Inflammation. The endothelial cells lining the lymphatic vessels are subject to the same reactions to injury and inflammation as the vascular system. Inflammation of the lymphatic vessels is called lymphangitis and may be seen with specific diseases such as septicemias caused by bacteria like Salmonella spp. ( Box 10-8 ). Lymphangitis may be acute, subacute, granulomatous, or chronic resulting in lymphedema. See Chapters 3 and 5, and also see the discussion on Glanders disease and other cutaneous lymphangitides in the section on Disorders of Horses . Box 10-8 Diseases that Cause Lymphangitis in Animals Bacterial Porcine anthrax ( Bacillus anthracis ), Johne's disease ( Mycobacterium paratuberculosis ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), actinobacillosis ( Actinobacillus lignieresii ), glanders (farcy) ( Burkholderia mallei ), cutaneous streptothricosis ( Dermatophilus congolensis ), bovine farcy, ulcerative lymphangitis of horses, sporadic lymphangitis of horses, ulcerative lymphangitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis , Pseudomonas aeruginosa ) Mycotic Epizootic lymphangitis of horses ( Histoplasma farciminosum ), sporotrichosis ( Sporothrix schenckii ) Parasitic Brugia spp. infection of dogs and cats Arteries Toxicants that produce arterial medial smooth muscle proliferation • Ergot ( Claviceps purpurea ), ergotamine • Fescue ( Festuca arundinacea ) parasitized by endophytic fungi ( Epichloe typhina , Acremonium coenophialum ) Toxicants that induce arterial medial calcification • Vitamin D (dietary excess or cholecalciferol-containing rodenticides) • Calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , Solanum torvum ) Toxicants that induce necrosis of arterial medial smooth muscle and medial hemorrhage • Epinephrine, norepinephrine, digoxin, theobromine, minoxidil, hydralazine, fenoldopam mesylate, phosphodiesterase inhibitors, endothelin receptor antagonists, dopamine receptor agonists, others Toxicants that alter arterial connective tissue to produce aneurysms • β-Aminopropionitrile ( Lathyrus sp. product) • Penicillamine, aminoacetonitrile Toxicants that induce arterial intimal proliferation • Ergotamine, methylsergide, estrogen and/or progesterone-containing oral contraceptives, others Toxicants that induce arterial fibrinoid necrosis • Organic mercury, lead Veins Toxicants that induce venous hyaline degeneration • Phenylbutazone Capillaries Toxicants that incite microangiopathy • Cadmium, cyclophosphamide Blood Vessels Disturbances of Circulation Hemorrhage. Hemorrhage resulting from vascular injury is a frequent lesion of the epicardium, endocardium, and myocardium. Hemorrhages vary in size from petechiae (1- to 2-mm diameter) to ecchymoses (2- to 10-mm diameter) to suffusive (diffuse). Animals dying from septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution often have prominent epicardial ( Fig. 10-24 ; E-Fig. 10-18 and endocardial (see Fig. 10-21 ) hemorrhages. Horses dying of any cause usually have agonal hemorrhages on the epicardial and endocardial surfaces. A distinctive example of a specific disease with cardiac hemorrhage is mulberry heart disease, associated with vitamin E–selenium deficiency in growing pigs. In these pigs, hydropericardium accompanies severe myocardial hemorrhage that results in a red, mottled (mulberry-like) appearance of the heart. Also see the previous discussions on disturbances of circulation in the sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium in the Responses to Injury section. Figure 10-24 Epicardial Hemorrhage, Petechiae and Ecchymoses, Endotoxemia, Heart, Cow. Note the epicardial and subepicardial hemorrhages in the fat of the coronary groove (a common site). Petechiae and ecchymoses are often attributable to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. In this case, the hemorrhage resulted from injury to the endothelium from endotoxin (component of the cell wall of Gram-negative bacteria). The smaller, pinpoint hemorrhages (1 to 2 mm) are petechiae. The larger hemorrhages (3 to 5 mm) are ecchymoses. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-18 Epicardial Hemorrhage, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Left Atrium, Pig. Note epicardial hemorrhage (upper left) and prominent small blood vessels with swollen endothelial cells (arrows) . H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Disturbances of Growth. See Chapter 1 for discussion of the causes of disturbances of cell growth (see cell adaptations). Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Hypertrophy. Arterial hypertrophy is a response to sustained increases in pressure or volume loads. Affected vessels are generally muscular arteries, and the increase in wall thickness is predominantly caused by hypertrophy (and, to some degree, hyperplasia) of smooth muscle cells of the tunica media. Muscular pulmonary arteries of cats are frequently affected, and the lesion has been associated with infection by several parasites, including Aelurostrongylus abstrusus (the lungworm of cats), Toxocara sp., and Dirofilaria immitis ( Fig. 10-25 ). However, the lesions often occur in the absence of parasitic infections ( Fig. 10-26 ). Often, no clinical disease is associated with the lesion in cats, but asthmatic signs have been seen in cats with these parasitic infections. Similar hypertrophy of muscular pulmonary arteries occurs in cattle with hypoxia-induced pulmonary arterial vasoconstriction and subsequent pulmonary hypertension associated with right-sided heart failure from exposure to high altitudes (so-called high-altitude disease or "brisket disease") (see section on the stages of myocardial hypertrophy). Also, cardiovascular anomalies that shunt blood left to right in animals result in pulmonary hypertension; these animals may have hypertrophy of the muscular pulmonary arteries, which can result in plexogenic pulmonary arteriopathy. Uterine arteries in pregnant animals are hypertrophic. Figure 10-25 Medial Hypertrophy, Periarteritis, Dirofilariasis, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Note the massively thickened tunica media (T) of the small branches of the pulmonary arteries and their periarterial cuff of chronic inflammatory cells and some eosinophils. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-26 Medial Hypertrophy, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Proliferation of smooth muscle cells (arrows) has resulted in marked thickening of the tunica media. Note luminal narrowing. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation. See Chapters 3 and 5 for discussion of the processes and mechanisms of acute and chronic inflammation. Arteritis and Vasculitis. Arteritis occurs as a feature of many infectious and immune-mediated diseases ( Box 10-7 ). Often, all types of vessels are affected rather than only arteries, and then vasculitis or angiitis (a term that includes blood and lymphatic vessels) is the term applied to the lesions. The vascular system serves as the major mechanisms for transport of organisms—for example, Bacillus anthracis. In inflamed vessels, leukocytes are present within and surrounding the walls, and damage to the vessel wall is evident as fibrin deposits or necrotic endothelial and smooth muscle cells. As a result of endothelial damage, thrombosis, which can result in ischemic injury or infarction in the circulatory field, may be present. Arteritis and vasculitis can develop from endothelial injury caused by either infectious agents or immune-mediated mechanisms or may be caused by local extension of suppurative and necrotizing inflammatory processes in adjacent tissues. Arteritis is a prominent feature of several parasitic diseases. Box 10-7 Diseases that Cause Arteritis in Animals Viral Equine viral arteritis, African horse sickness, equine infectious anemia, equine morbillivirus, malignant catarrhal fever, bovine virus diarrhea, bovine ephemeral fever, bluetongue, hog cholera, African swine fever, feline infectious peritonitis, Aleutian mink disease Bacterial Bartonella henselae , leptospirosis, Salmonellosis, erysipelas ( Erysipelothrix rhusiopathiae ), Haemophilus spp. infections ( Haemophilus suis , Haemophilus somnus , Haemophilus parasuis ), heartwater ( Ehrlichia ruminantium ), Rocky Mountain spotted fever ( Rickettsia rickettsii ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ) Mycotic Phycomycosis, aspergillosis Parasitic Equine strongylosis ( Strongylus vulgaris ), dirofilariasis ( Dirofilaria immitis ), French heartworm ( Angiostrongylus vasorum ), spirocercosis ( Spirocerca lupi ), onchocerciasis, elaeophoriasis ( Elaeophora sp.), filariasis in primates, aelurostrongylosis Immune-Mediated Canine systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, polyarteritis nodosa, lymphocytic choriomeningitis, drug-induced hypersensitivity Systemic infections with phlebitis as a lesion include salmonellosis in several species and feline infectious peritonitis. In pigs with various septicemias, such as salmonellosis and colibacillosis, the gastric fundic mucosa is often severely congested and hemorrhagic because of venous endothelial damage and thrombosis. In severe local infections, such as in metritis or hepatic abscesses, inflammation extends into the walls of adjacent veins and produces phlebitis, with or without thrombosis. Intravenous injections of irritant solutions, injecting solutions into the vascular wall, or intimal trauma produced by indwelling venous catheters result in vascular damage and create an opportunity for localization and proliferation of infectious agents and development of phlebitis and thrombosis ( Fig. 10-27 ). Animals with phlebitis complicated by thrombosis have the additional risk of septic embolism, which can cause endocarditis and pulmonary abscesses or pulmonary infarcts. Figure 10-27 Thrombus (Mural), Jugular Vein (Opened), Dog. Note the nodular mural thrombus (left [arrow]) in the jugular vein. This thrombus likely occurred at a site of venipuncture and a subsequent phlebitis. The smooth-surfaced red-tan thrombus (right [arrowhead]) extending toward the heart is a trailing thrombus, a continuation of the mural thrombus. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Many reportable foreign animal diseases are viral diseases, which are endotheliotropic and result in vasculitis; examples include classic swine fever (hog cholera), African horse sickness, and African swine fever (see the sections on disorders of specific animal species). Thrombosis and Embolism Coronary and Other Arteries. Thrombosis or embolism of the coronary arteries can result in myocardial infarction ( Fig. 10-28 ) and cardiac failure. These lesions are much less common in animals than in human beings. Affected animals generally have one of several types of coronary arterial disease, including atherosclerosis, arteriosclerosis, or periarteritis. In atherosclerosis associated with hypothyroidism or diabetes mellitus (discussed previously), severe lesions are present in the extramural (epicardial) coronary arteries of dogs, but this only rarely leads to thrombosis and myocardial infarction. In contrast, severe arteriosclerosis of intramural cardiac arteries in aged dogs can cause small multifocal myocardial infarcts (see Fig. 10-28 ). Affected dogs often also have myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis), which is also an age-related disease. Thrombosis of or embolism to other large arteries, such as the interlobular artery of the kidney, can lead to infarction of the tissue supplied by the artery ( E-Fig. 10-19 ; also see Chapter 2). Figure 10-28 Myocardial Infarction, Heart, Left and Right Ventricles, Dog. Pale, necrotic, circumscribed areas (arrows) are present in the ventricular walls and are most prominent at the apex. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-19 Arterial Thrombosis, Subacute, Interlobular Artery, Kidney, Dog. An interlobular artery contains a thromboembolus, which has firmly attached to the vessel wall. Note the large size of the thromboembolus compared to the luminal diameter (see bottom left corner) of the artery. This finding suggests that it is "growing" in size via the mechanisms of Virchow's triad and the adherence of platelets and fibrin to the initial embolus. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Disturbances of Circulation Hemorrhage. Hemorrhage resulting from vascular injury is a frequent lesion of the epicardium, endocardium, and myocardium. Hemorrhages vary in size from petechiae (1- to 2-mm diameter) to ecchymoses (2- to 10-mm diameter) to suffusive (diffuse). Animals dying from septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution often have prominent epicardial ( Fig. 10-24 ; E-Fig. 10-18 and endocardial (see Fig. 10-21 ) hemorrhages. Horses dying of any cause usually have agonal hemorrhages on the epicardial and endocardial surfaces. A distinctive example of a specific disease with cardiac hemorrhage is mulberry heart disease, associated with vitamin E–selenium deficiency in growing pigs. In these pigs, hydropericardium accompanies severe myocardial hemorrhage that results in a red, mottled (mulberry-like) appearance of the heart. Also see the previous discussions on disturbances of circulation in the sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium in the Responses to Injury section. Figure 10-24 Epicardial Hemorrhage, Petechiae and Ecchymoses, Endotoxemia, Heart, Cow. Note the epicardial and subepicardial hemorrhages in the fat of the coronary groove (a common site). Petechiae and ecchymoses are often attributable to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. In this case, the hemorrhage resulted from injury to the endothelium from endotoxin (component of the cell wall of Gram-negative bacteria). The smaller, pinpoint hemorrhages (1 to 2 mm) are petechiae. The larger hemorrhages (3 to 5 mm) are ecchymoses. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-18 Epicardial Hemorrhage, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Left Atrium, Pig. Note epicardial hemorrhage (upper left) and prominent small blood vessels with swollen endothelial cells (arrows) . H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Hemorrhage. Hemorrhage resulting from vascular injury is a frequent lesion of the epicardium, endocardium, and myocardium. Hemorrhages vary in size from petechiae (1- to 2-mm diameter) to ecchymoses (2- to 10-mm diameter) to suffusive (diffuse). Animals dying from septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution often have prominent epicardial ( Fig. 10-24 ; E-Fig. 10-18 and endocardial (see Fig. 10-21 ) hemorrhages. Horses dying of any cause usually have agonal hemorrhages on the epicardial and endocardial surfaces. A distinctive example of a specific disease with cardiac hemorrhage is mulberry heart disease, associated with vitamin E–selenium deficiency in growing pigs. In these pigs, hydropericardium accompanies severe myocardial hemorrhage that results in a red, mottled (mulberry-like) appearance of the heart. Also see the previous discussions on disturbances of circulation in the sections on the Pericardium and Epicardium and the Myocardium in the Responses to Injury section. Figure 10-24 Epicardial Hemorrhage, Petechiae and Ecchymoses, Endotoxemia, Heart, Cow. Note the epicardial and subepicardial hemorrhages in the fat of the coronary groove (a common site). Petechiae and ecchymoses are often attributable to severe septicemia, endotoxemia, anoxia, or electrocution. In this case, the hemorrhage resulted from injury to the endothelium from endotoxin (component of the cell wall of Gram-negative bacteria). The smaller, pinpoint hemorrhages (1 to 2 mm) are petechiae. The larger hemorrhages (3 to 5 mm) are ecchymoses. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-18 Epicardial Hemorrhage, Minoxidil Cardiotoxicity, Heart, Left Atrium, Pig. Note epicardial hemorrhage (upper left) and prominent small blood vessels with swollen endothelial cells (arrows) . H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Effusions. See section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Disturbances of Growth. See Chapter 1 for discussion of the causes of disturbances of cell growth (see cell adaptations). Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Hypertrophy. Arterial hypertrophy is a response to sustained increases in pressure or volume loads. Affected vessels are generally muscular arteries, and the increase in wall thickness is predominantly caused by hypertrophy (and, to some degree, hyperplasia) of smooth muscle cells of the tunica media. Muscular pulmonary arteries of cats are frequently affected, and the lesion has been associated with infection by several parasites, including Aelurostrongylus abstrusus (the lungworm of cats), Toxocara sp., and Dirofilaria immitis ( Fig. 10-25 ). However, the lesions often occur in the absence of parasitic infections ( Fig. 10-26 ). Often, no clinical disease is associated with the lesion in cats, but asthmatic signs have been seen in cats with these parasitic infections. Similar hypertrophy of muscular pulmonary arteries occurs in cattle with hypoxia-induced pulmonary arterial vasoconstriction and subsequent pulmonary hypertension associated with right-sided heart failure from exposure to high altitudes (so-called high-altitude disease or "brisket disease") (see section on the stages of myocardial hypertrophy). Also, cardiovascular anomalies that shunt blood left to right in animals result in pulmonary hypertension; these animals may have hypertrophy of the muscular pulmonary arteries, which can result in plexogenic pulmonary arteriopathy. Uterine arteries in pregnant animals are hypertrophic. Figure 10-25 Medial Hypertrophy, Periarteritis, Dirofilariasis, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Note the massively thickened tunica media (T) of the small branches of the pulmonary arteries and their periarterial cuff of chronic inflammatory cells and some eosinophils. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-26 Medial Hypertrophy, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Proliferation of smooth muscle cells (arrows) has resulted in marked thickening of the tunica media. Note luminal narrowing. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Anomalies and Dysplasia. See section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Hypertrophy. Arterial hypertrophy is a response to sustained increases in pressure or volume loads. Affected vessels are generally muscular arteries, and the increase in wall thickness is predominantly caused by hypertrophy (and, to some degree, hyperplasia) of smooth muscle cells of the tunica media. Muscular pulmonary arteries of cats are frequently affected, and the lesion has been associated with infection by several parasites, including Aelurostrongylus abstrusus (the lungworm of cats), Toxocara sp., and Dirofilaria immitis ( Fig. 10-25 ). However, the lesions often occur in the absence of parasitic infections ( Fig. 10-26 ). Often, no clinical disease is associated with the lesion in cats, but asthmatic signs have been seen in cats with these parasitic infections. Similar hypertrophy of muscular pulmonary arteries occurs in cattle with hypoxia-induced pulmonary arterial vasoconstriction and subsequent pulmonary hypertension associated with right-sided heart failure from exposure to high altitudes (so-called high-altitude disease or "brisket disease") (see section on the stages of myocardial hypertrophy). Also, cardiovascular anomalies that shunt blood left to right in animals result in pulmonary hypertension; these animals may have hypertrophy of the muscular pulmonary arteries, which can result in plexogenic pulmonary arteriopathy. Uterine arteries in pregnant animals are hypertrophic. Figure 10-25 Medial Hypertrophy, Periarteritis, Dirofilariasis, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Note the massively thickened tunica media (T) of the small branches of the pulmonary arteries and their periarterial cuff of chronic inflammatory cells and some eosinophils. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-26 Medial Hypertrophy, Lung, Small Pulmonary Arteries, Cat. Proliferation of smooth muscle cells (arrows) has resulted in marked thickening of the tunica media. Note luminal narrowing. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation. See Chapters 3 and 5 for discussion of the processes and mechanisms of acute and chronic inflammation. Arteritis and Vasculitis. Arteritis occurs as a feature of many infectious and immune-mediated diseases ( Box 10-7 ). Often, all types of vessels are affected rather than only arteries, and then vasculitis or angiitis (a term that includes blood and lymphatic vessels) is the term applied to the lesions. The vascular system serves as the major mechanisms for transport of organisms—for example, Bacillus anthracis. In inflamed vessels, leukocytes are present within and surrounding the walls, and damage to the vessel wall is evident as fibrin deposits or necrotic endothelial and smooth muscle cells. As a result of endothelial damage, thrombosis, which can result in ischemic injury or infarction in the circulatory field, may be present. Arteritis and vasculitis can develop from endothelial injury caused by either infectious agents or immune-mediated mechanisms or may be caused by local extension of suppurative and necrotizing inflammatory processes in adjacent tissues. Arteritis is a prominent feature of several parasitic diseases. Box 10-7 Diseases that Cause Arteritis in Animals Viral Equine viral arteritis, African horse sickness, equine infectious anemia, equine morbillivirus, malignant catarrhal fever, bovine virus diarrhea, bovine ephemeral fever, bluetongue, hog cholera, African swine fever, feline infectious peritonitis, Aleutian mink disease Bacterial Bartonella henselae , leptospirosis, Salmonellosis, erysipelas ( Erysipelothrix rhusiopathiae ), Haemophilus spp. infections ( Haemophilus suis , Haemophilus somnus , Haemophilus parasuis ), heartwater ( Ehrlichia ruminantium ), Rocky Mountain spotted fever ( Rickettsia rickettsii ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ) Mycotic Phycomycosis, aspergillosis Parasitic Equine strongylosis ( Strongylus vulgaris ), dirofilariasis ( Dirofilaria immitis ), French heartworm ( Angiostrongylus vasorum ), spirocercosis ( Spirocerca lupi ), onchocerciasis, elaeophoriasis ( Elaeophora sp.), filariasis in primates, aelurostrongylosis Immune-Mediated Canine systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, polyarteritis nodosa, lymphocytic choriomeningitis, drug-induced hypersensitivity Systemic infections with phlebitis as a lesion include salmonellosis in several species and feline infectious peritonitis. In pigs with various septicemias, such as salmonellosis and colibacillosis, the gastric fundic mucosa is often severely congested and hemorrhagic because of venous endothelial damage and thrombosis. In severe local infections, such as in metritis or hepatic abscesses, inflammation extends into the walls of adjacent veins and produces phlebitis, with or without thrombosis. Intravenous injections of irritant solutions, injecting solutions into the vascular wall, or intimal trauma produced by indwelling venous catheters result in vascular damage and create an opportunity for localization and proliferation of infectious agents and development of phlebitis and thrombosis ( Fig. 10-27 ). Animals with phlebitis complicated by thrombosis have the additional risk of septic embolism, which can cause endocarditis and pulmonary abscesses or pulmonary infarcts. Figure 10-27 Thrombus (Mural), Jugular Vein (Opened), Dog. Note the nodular mural thrombus (left [arrow]) in the jugular vein. This thrombus likely occurred at a site of venipuncture and a subsequent phlebitis. The smooth-surfaced red-tan thrombus (right [arrowhead]) extending toward the heart is a trailing thrombus, a continuation of the mural thrombus. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Many reportable foreign animal diseases are viral diseases, which are endotheliotropic and result in vasculitis; examples include classic swine fever (hog cholera), African horse sickness, and African swine fever (see the sections on disorders of specific animal species). Thrombosis and Embolism Coronary and Other Arteries. Thrombosis or embolism of the coronary arteries can result in myocardial infarction ( Fig. 10-28 ) and cardiac failure. These lesions are much less common in animals than in human beings. Affected animals generally have one of several types of coronary arterial disease, including atherosclerosis, arteriosclerosis, or periarteritis. In atherosclerosis associated with hypothyroidism or diabetes mellitus (discussed previously), severe lesions are present in the extramural (epicardial) coronary arteries of dogs, but this only rarely leads to thrombosis and myocardial infarction. In contrast, severe arteriosclerosis of intramural cardiac arteries in aged dogs can cause small multifocal myocardial infarcts (see Fig. 10-28 ). Affected dogs often also have myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis), which is also an age-related disease. Thrombosis of or embolism to other large arteries, such as the interlobular artery of the kidney, can lead to infarction of the tissue supplied by the artery ( E-Fig. 10-19 ; also see Chapter 2). Figure 10-28 Myocardial Infarction, Heart, Left and Right Ventricles, Dog. Pale, necrotic, circumscribed areas (arrows) are present in the ventricular walls and are most prominent at the apex. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-19 Arterial Thrombosis, Subacute, Interlobular Artery, Kidney, Dog. An interlobular artery contains a thromboembolus, which has firmly attached to the vessel wall. Note the large size of the thromboembolus compared to the luminal diameter (see bottom left corner) of the artery. This finding suggests that it is "growing" in size via the mechanisms of Virchow's triad and the adherence of platelets and fibrin to the initial embolus. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Arteritis and Vasculitis. Arteritis occurs as a feature of many infectious and immune-mediated diseases ( Box 10-7 ). Often, all types of vessels are affected rather than only arteries, and then vasculitis or angiitis (a term that includes blood and lymphatic vessels) is the term applied to the lesions. The vascular system serves as the major mechanisms for transport of organisms—for example, Bacillus anthracis. In inflamed vessels, leukocytes are present within and surrounding the walls, and damage to the vessel wall is evident as fibrin deposits or necrotic endothelial and smooth muscle cells. As a result of endothelial damage, thrombosis, which can result in ischemic injury or infarction in the circulatory field, may be present. Arteritis and vasculitis can develop from endothelial injury caused by either infectious agents or immune-mediated mechanisms or may be caused by local extension of suppurative and necrotizing inflammatory processes in adjacent tissues. Arteritis is a prominent feature of several parasitic diseases. Box 10-7 Diseases that Cause Arteritis in Animals Viral Equine viral arteritis, African horse sickness, equine infectious anemia, equine morbillivirus, malignant catarrhal fever, bovine virus diarrhea, bovine ephemeral fever, bluetongue, hog cholera, African swine fever, feline infectious peritonitis, Aleutian mink disease Bacterial Bartonella henselae , leptospirosis, Salmonellosis, erysipelas ( Erysipelothrix rhusiopathiae ), Haemophilus spp. infections ( Haemophilus suis , Haemophilus somnus , Haemophilus parasuis ), heartwater ( Ehrlichia ruminantium ), Rocky Mountain spotted fever ( Rickettsia rickettsii ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ) Mycotic Phycomycosis, aspergillosis Parasitic Equine strongylosis ( Strongylus vulgaris ), dirofilariasis ( Dirofilaria immitis ), French heartworm ( Angiostrongylus vasorum ), spirocercosis ( Spirocerca lupi ), onchocerciasis, elaeophoriasis ( Elaeophora sp.), filariasis in primates, aelurostrongylosis Immune-Mediated Canine systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, polyarteritis nodosa, lymphocytic choriomeningitis, drug-induced hypersensitivity Systemic infections with phlebitis as a lesion include salmonellosis in several species and feline infectious peritonitis. In pigs with various septicemias, such as salmonellosis and colibacillosis, the gastric fundic mucosa is often severely congested and hemorrhagic because of venous endothelial damage and thrombosis. In severe local infections, such as in metritis or hepatic abscesses, inflammation extends into the walls of adjacent veins and produces phlebitis, with or without thrombosis. Intravenous injections of irritant solutions, injecting solutions into the vascular wall, or intimal trauma produced by indwelling venous catheters result in vascular damage and create an opportunity for localization and proliferation of infectious agents and development of phlebitis and thrombosis ( Fig. 10-27 ). Animals with phlebitis complicated by thrombosis have the additional risk of septic embolism, which can cause endocarditis and pulmonary abscesses or pulmonary infarcts. Figure 10-27 Thrombus (Mural), Jugular Vein (Opened), Dog. Note the nodular mural thrombus (left [arrow]) in the jugular vein. This thrombus likely occurred at a site of venipuncture and a subsequent phlebitis. The smooth-surfaced red-tan thrombus (right [arrowhead]) extending toward the heart is a trailing thrombus, a continuation of the mural thrombus. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Many reportable foreign animal diseases are viral diseases, which are endotheliotropic and result in vasculitis; examples include classic swine fever (hog cholera), African horse sickness, and African swine fever (see the sections on disorders of specific animal species). Viral Equine viral arteritis, African horse sickness, equine infectious anemia, equine morbillivirus, malignant catarrhal fever, bovine virus diarrhea, bovine ephemeral fever, bluetongue, hog cholera, African swine fever, feline infectious peritonitis, Aleutian mink disease Bacterial Bartonella henselae , leptospirosis, Salmonellosis, erysipelas ( Erysipelothrix rhusiopathiae ), Haemophilus spp. infections ( Haemophilus suis , Haemophilus somnus , Haemophilus parasuis ), heartwater ( Ehrlichia ruminantium ), Rocky Mountain spotted fever ( Rickettsia rickettsii ), Lyme disease ( Borrelia burgdorferi ) Mycotic Phycomycosis, aspergillosis Parasitic Equine strongylosis ( Strongylus vulgaris ), dirofilariasis ( Dirofilaria immitis ), French heartworm ( Angiostrongylus vasorum ), spirocercosis ( Spirocerca lupi ), onchocerciasis, elaeophoriasis ( Elaeophora sp.), filariasis in primates, aelurostrongylosis Immune-Mediated Canine systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, polyarteritis nodosa, lymphocytic choriomeningitis, drug-induced hypersensitivity Thrombosis and Embolism Coronary and Other Arteries. Thrombosis or embolism of the coronary arteries can result in myocardial infarction ( Fig. 10-28 ) and cardiac failure. These lesions are much less common in animals than in human beings. Affected animals generally have one of several types of coronary arterial disease, including atherosclerosis, arteriosclerosis, or periarteritis. In atherosclerosis associated with hypothyroidism or diabetes mellitus (discussed previously), severe lesions are present in the extramural (epicardial) coronary arteries of dogs, but this only rarely leads to thrombosis and myocardial infarction. In contrast, severe arteriosclerosis of intramural cardiac arteries in aged dogs can cause small multifocal myocardial infarcts (see Fig. 10-28 ). Affected dogs often also have myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis), which is also an age-related disease. Thrombosis of or embolism to other large arteries, such as the interlobular artery of the kidney, can lead to infarction of the tissue supplied by the artery ( E-Fig. 10-19 ; also see Chapter 2). Figure 10-28 Myocardial Infarction, Heart, Left and Right Ventricles, Dog. Pale, necrotic, circumscribed areas (arrows) are present in the ventricular walls and are most prominent at the apex. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-19 Arterial Thrombosis, Subacute, Interlobular Artery, Kidney, Dog. An interlobular artery contains a thromboembolus, which has firmly attached to the vessel wall. Note the large size of the thromboembolus compared to the luminal diameter (see bottom left corner) of the artery. This finding suggests that it is "growing" in size via the mechanisms of Virchow's triad and the adherence of platelets and fibrin to the initial embolus. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Coronary and Other Arteries. Thrombosis or embolism of the coronary arteries can result in myocardial infarction ( Fig. 10-28 ) and cardiac failure. These lesions are much less common in animals than in human beings. Affected animals generally have one of several types of coronary arterial disease, including atherosclerosis, arteriosclerosis, or periarteritis. In atherosclerosis associated with hypothyroidism or diabetes mellitus (discussed previously), severe lesions are present in the extramural (epicardial) coronary arteries of dogs, but this only rarely leads to thrombosis and myocardial infarction. In contrast, severe arteriosclerosis of intramural cardiac arteries in aged dogs can cause small multifocal myocardial infarcts (see Fig. 10-28 ). Affected dogs often also have myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis), which is also an age-related disease. Thrombosis of or embolism to other large arteries, such as the interlobular artery of the kidney, can lead to infarction of the tissue supplied by the artery ( E-Fig. 10-19 ; also see Chapter 2). Figure 10-28 Myocardial Infarction, Heart, Left and Right Ventricles, Dog. Pale, necrotic, circumscribed areas (arrows) are present in the ventricular walls and are most prominent at the apex. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-19 Arterial Thrombosis, Subacute, Interlobular Artery, Kidney, Dog. An interlobular artery contains a thromboembolus, which has firmly attached to the vessel wall. Note the large size of the thromboembolus compared to the luminal diameter (see bottom left corner) of the artery. This finding suggests that it is "growing" in size via the mechanisms of Virchow's triad and the adherence of platelets and fibrin to the initial embolus. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Lymphatic Vessels Inflammation. The endothelial cells lining the lymphatic vessels are subject to the same reactions to injury and inflammation as the vascular system. Inflammation of the lymphatic vessels is called lymphangitis and may be seen with specific diseases such as septicemias caused by bacteria like Salmonella spp. ( Box 10-8 ). Lymphangitis may be acute, subacute, granulomatous, or chronic resulting in lymphedema. See Chapters 3 and 5, and also see the discussion on Glanders disease and other cutaneous lymphangitides in the section on Disorders of Horses . Box 10-8 Diseases that Cause Lymphangitis in Animals Bacterial Porcine anthrax ( Bacillus anthracis ), Johne's disease ( Mycobacterium paratuberculosis ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), actinobacillosis ( Actinobacillus lignieresii ), glanders (farcy) ( Burkholderia mallei ), cutaneous streptothricosis ( Dermatophilus congolensis ), bovine farcy, ulcerative lymphangitis of horses, sporadic lymphangitis of horses, ulcerative lymphangitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis , Pseudomonas aeruginosa ) Mycotic Epizootic lymphangitis of horses ( Histoplasma farciminosum ), sporotrichosis ( Sporothrix schenckii ) Parasitic Brugia spp. infection of dogs and cats Inflammation. The endothelial cells lining the lymphatic vessels are subject to the same reactions to injury and inflammation as the vascular system. Inflammation of the lymphatic vessels is called lymphangitis and may be seen with specific diseases such as septicemias caused by bacteria like Salmonella spp. ( Box 10-8 ). Lymphangitis may be acute, subacute, granulomatous, or chronic resulting in lymphedema. See Chapters 3 and 5, and also see the discussion on Glanders disease and other cutaneous lymphangitides in the section on Disorders of Horses . Box 10-8 Diseases that Cause Lymphangitis in Animals Bacterial Porcine anthrax ( Bacillus anthracis ), Johne's disease ( Mycobacterium paratuberculosis ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), actinobacillosis ( Actinobacillus lignieresii ), glanders (farcy) ( Burkholderia mallei ), cutaneous streptothricosis ( Dermatophilus congolensis ), bovine farcy, ulcerative lymphangitis of horses, sporadic lymphangitis of horses, ulcerative lymphangitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis , Pseudomonas aeruginosa ) Mycotic Epizootic lymphangitis of horses ( Histoplasma farciminosum ), sporotrichosis ( Sporothrix schenckii ) Parasitic Brugia spp. infection of dogs and cats Bacterial Porcine anthrax ( Bacillus anthracis ), Johne's disease ( Mycobacterium paratuberculosis ), tuberculosis ( Mycobacterium spp.), actinobacillosis ( Actinobacillus lignieresii ), glanders (farcy) ( Burkholderia mallei ), cutaneous streptothricosis ( Dermatophilus congolensis ), bovine farcy, ulcerative lymphangitis of horses, sporadic lymphangitis of horses, ulcerative lymphangitis ( Corynebacterium pseudotuberculosis , Pseudomonas aeruginosa ) Mycotic Epizootic lymphangitis of horses ( Histoplasma farciminosum ), sporotrichosis ( Sporothrix schenckii ) Parasitic Brugia spp. infection of dogs and cats Aging Aging changes are evident in the cardiovascular system. Lipofuscin granules, primarily perinuclear, increase in number with age of cardiac myocytes (see sections on Lipofuscinosis , Cell Degeneration and Death, Disturbances of Growth, and Responses to Injury: Myocardium ). Fatty infiltration of the pericardium and myocardium increases with the age of the animal. Hearts from aged sheep often have abundant amounts of adipose tissue, particularly within the right ventricle (see sections on Fatty Degeneration , Cell Degeneration and Death, Disturbances of Growth, and Responses to Injury: Myocardium ). Myxomatous valvular disease increases in incidence with age in small breed dogs (see section on Disorders of Dogs ; also see Fig. 10-83 ). Degenerative vascular disease associated with aging includes arteriosclerosis, amyloidosis, and hyaline degeneration of cardiac arteries (see section on Hyaline Degeneration, Fibrinoid Necrosis, and Amyloidosis and section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular System ). The incidence of neoplastic disease increases with age in the cardiovascular and lymphatic system. Portals of Entry/Pathways of Spread Routes used to enter the cardiovascular system and lymphatic vessels are numerous and listed in Box 10-9 . Toxic chemicals and pathogenic organisms can enter via ingestion, inhalation, cutaneous contact, trauma, or iatrogenic injection and gain access to the cardiovascular system. Microorganisms and toxins penetrate and enter deeper tissues, dermis, lamina propria, subcutis, or submucosa, triggering an acute inflammatory reaction. All three of the major components of acute inflammation may be responsible for entry of the toxin or organism into the vascular or lymphatic system. The increase in the vascular caliber increasing blood flow increases the number of capillary beds exposed to the agent. Changes in the microvasculature that allow the exit of plasma proteins and leukocytes also increase the entry of an agent. Finally, the increase in leukocytes can result in vascular injury and phagocytosis of material. Organisms that are not diluted, but are denatured by molecules from lysosomes of neutrophils, or restricted in movement by being trapped in fibrin at the site of inflammation can gain entry into the lymphatic vessels, thin-walled capillaries, or venules. Entry into lymphatic vessels allows invading microorganisms to be carried in lymph to draining regional and systemic lymph nodes and eventually via the thoracic duct to the circulatory system. Microorganisms that gain access to veins spread with the circulation and can localize in the lungs. In occurrences in which severe pulmonary inflammation leads to the formation of AV fistulas, microorganisms can gain access to pulmonary veins, be pumped through the left heart, and enter the systemic arterial circulation. The circulatory system can distribute organisms and materials to other organs and tissues (see E-Fig. 10-2 ; also see Chapter 2). Box 10-9 Portals of Entry for the Cardiovascular System Pericardium Hematogenous dissemination Foreign body penetration most commonly from reticulum (cattle) Direct extension from pleural cavity or mediastinum Endocardium Hematogenous dissemination Parasitic migration (direct or hematogenous) Intravenous and intracardiac catheters (long-term placement) Uremia-induced vascular damage and secondary endocardial ulceration (dog, left atrium) Myocardium Hematogenous dissemination Embolic dissemination of infective material fragments from vegetative endocarditis lesions into coronary arterial tree Direct extension from endocardium or pericardium Arteries Hematogenous dissemination Local extension of suppurative and necrotizing inflammatory processes Immune-mediated arterial injury Parasitic migration Veins Hematogenous dissemination Local extension of severe inflammatory processes Intravenous injections and indwelling catheters Parasitic migration Immune-mediated venous injury Lymphatic Vessels Hematogenous dissemination Local extension of severe inflammatory processes Parasitic migration Myocardium Pathogens gain entry to the myocardium through the vascular system from the coronary arteries, which provide blood flow to the myocardium. Coronary arteries originate in the sinus of Valsalva at the origin of the aorta and travel in the coronary grooves to the apex of the heart supplying blood to both ventricles. Branches of the coronary arteries bifurcate and send smaller arteries on the outer surface of the heart within the visceral pericardium. These smaller arteries then penetrate the myocardium, becoming arterioles and finally a rich network of capillaries in which there is nearly one vessel adjacent to each cardiac muscle cell. This rich network of capillaries provides an opportunity for bacteria or virus to gain entrance into the myocardium once they have entered the circulatory system. As a result, many bacterial and viral infections may result in myocarditis. Bacteria within fibrin and inflammatory debris loosely attached to affected valves (bacterial valvular endocarditis) may detach and lodge in coronary arteries. This septic emboli damages endothelial cells and initiates acute inflammation resulting in myocarditis. Toxins or toxic by-products can directly damage endothelial cells or diffuse through the endothelium to affect myocardial fibers. In addition, the myocardium is susceptible to direct extension of pathogens located within the endocardium or pericardium. Endocardium and Heart Valves The endocardium and the cardiac valves are in direct contact with any pathogen that enters the circulatory system, including parasites, bacterial and viral pathogens, and toxins. The endocardium, especially the left atrial endocardium, is particularly susceptible to toxins resulting from renal failure in the dog. Epicardium and Pericardium Bacteria and viruses can enter the pericardial sac via endothelial damage to capillaries on visceral (epicardium) and parietal (pericardium) surfaces. Bacteria can enter by direct penetration. In cattle, foreign bodies exiting the reticulum and penetrating the diaphragm carry bacterial pathogens into the pericardial cavity. Direct entry from bacterial or viral infections in the pleural cavity or mediastinum can also occur. Blood and Lymphatic Vascular Systems The circulatory systems are intrinsically susceptible to microbial organisms and toxins because of the primary role of providing oxygen and nutrients to and removing waste from tissues. Hematogenous and lymphogenous dissemination of microbial pathogens and toxins directly exposes the corresponding vasculature to these hazards. Parasitic migration and local extension of an inflammatory process can directly result in entry into the circulatory or lymphatic system and directly damage these tissues. Pericardium Hematogenous dissemination Foreign body penetration most commonly from reticulum (cattle) Direct extension from pleural cavity or mediastinum Endocardium Hematogenous dissemination Parasitic migration (direct or hematogenous) Intravenous and intracardiac catheters (long-term placement) Uremia-induced vascular damage and secondary endocardial ulceration (dog, left atrium) Myocardium Hematogenous dissemination Embolic dissemination of infective material fragments from vegetative endocarditis lesions into coronary arterial tree Direct extension from endocardium or pericardium Arteries Hematogenous dissemination Local extension of suppurative and necrotizing inflammatory processes Immune-mediated arterial injury Parasitic migration Veins Hematogenous dissemination Local extension of severe inflammatory processes Intravenous injections and indwelling catheters Parasitic migration Immune-mediated venous injury Lymphatic Vessels Hematogenous dissemination Local extension of severe inflammatory processes Parasitic migration Myocardium Pathogens gain entry to the myocardium through the vascular system from the coronary arteries, which provide blood flow to the myocardium. Coronary arteries originate in the sinus of Valsalva at the origin of the aorta and travel in the coronary grooves to the apex of the heart supplying blood to both ventricles. Branches of the coronary arteries bifurcate and send smaller arteries on the outer surface of the heart within the visceral pericardium. These smaller arteries then penetrate the myocardium, becoming arterioles and finally a rich network of capillaries in which there is nearly one vessel adjacent to each cardiac muscle cell. This rich network of capillaries provides an opportunity for bacteria or virus to gain entrance into the myocardium once they have entered the circulatory system. As a result, many bacterial and viral infections may result in myocarditis. Bacteria within fibrin and inflammatory debris loosely attached to affected valves (bacterial valvular endocarditis) may detach and lodge in coronary arteries. This septic emboli damages endothelial cells and initiates acute inflammation resulting in myocarditis. Toxins or toxic by-products can directly damage endothelial cells or diffuse through the endothelium to affect myocardial fibers. In addition, the myocardium is susceptible to direct extension of pathogens located within the endocardium or pericardium. Endocardium and Heart Valves The endocardium and the cardiac valves are in direct contact with any pathogen that enters the circulatory system, including parasites, bacterial and viral pathogens, and toxins. The endocardium, especially the left atrial endocardium, is particularly susceptible to toxins resulting from renal failure in the dog. Epicardium and Pericardium Bacteria and viruses can enter the pericardial sac via endothelial damage to capillaries on visceral (epicardium) and parietal (pericardium) surfaces. Bacteria can enter by direct penetration. In cattle, foreign bodies exiting the reticulum and penetrating the diaphragm carry bacterial pathogens into the pericardial cavity. Direct entry from bacterial or viral infections in the pleural cavity or mediastinum can also occur. Blood and Lymphatic Vascular Systems The circulatory systems are intrinsically susceptible to microbial organisms and toxins because of the primary role of providing oxygen and nutrients to and removing waste from tissues. Hematogenous and lymphogenous dissemination of microbial pathogens and toxins directly exposes the corresponding vasculature to these hazards. Parasitic migration and local extension of an inflammatory process can directly result in entry into the circulatory or lymphatic system and directly damage these tissues. Defense Mechanisms/Barrier Systems Defense mechanisms used by the cardiovascular system and lymphatic vessels are listed in Box 10-10 . These structures are fortunate in that most of the components of the innate and humoral immunity are present within the lumen. A review of inflammation (see Chapter 3), immune function (see Chapter 5), and circulatory disturbances (see Chapter 2) is invaluable in understanding the defense mechanisms of the cardiovascular and lymphatic systems. The constant flow of blood and lymph through intact circulatory and lymphatic systems, respectively, provides the surface endothelium of the chambers and vessels with constant exposure to nutrients, plasma proteins such as immunoglobulins, preformed chemical mediators, and circulating leukocytes. Box 10-10 Defense Mechanisms Constant Blood Flow Endocardium, blood and lymphatic vascular components Endothelium-facilitated barrier systems (see Chapters 2 and 4) Innate Responses Inflammation Complement Chemical mediators of inflammation Phagocytosis Monocyte-macrophage system Intravascular macrophages Adaptive immune system Humoral Responses CELL-MEDIATED RESPONSES Constant Blood Flow Endocardium, blood and lymphatic vascular components Endothelium-facilitated barrier systems (see Chapters 2 and 4) Innate Responses Inflammation Complement Chemical mediators of inflammation Phagocytosis Monocyte-macrophage system Intravascular macrophages Adaptive immune system Humoral Responses CELL-MEDIATED RESPONSES Disorders of Domestic Animals Developmental Errors/Congenital Anomalies 2 The complex events involved in the embryologic development of the heart and great vessels allow substantial opportunities for congenital anomalies to develop (see E-Fig. 10-1 ). The functional significance of these anomalies varies widely. Animals with the most extreme defects are unable to survive in utero, and those with the mildest lesions could have no clinical signs of disease during life. However, animals with defects of intermediate severity are most likely to be presented to a veterinarian because of gradually developing signs of cardiac failure, including poor exercise tolerance, cyanosis, and stunted body growth. Ectopia cordis is a congenital development of the heart at an abnormal site outside of the thoracic cavity. In cattle, cases in healthy adult animals have been described in which the heart was located subcutaneously in the caudoventral neck area. The most frequently observed cardiovascular anomalies in domestic animals are listed in Box 10-11 . Box 10-11 Most Common Cardiovascular Anomalies in Domestic Animal Species Horses Ventricular septal defect Patent ductus arteriosus Persistent truncus arteriosus Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) Valvular hematomas Patent foramen ovale Ventricular septal defect Transposition of aorta and pulmonary artery Pigs Endocardial cushion defects Dysplasia of the tricuspid valve Subaortic stenosis Dogs Patent ductus arteriosus Pulmonic stenosis Subaortic stenosis Persistent right aortic arch Ventricular septal defect Cats Endocardial cushion defects Mitral malformation Ventricular septal defect Endocardial fibroelastosis Patent ductus arteriosus The causes of congenital cardiovascular anomalies are varied. Most animal species have a low background frequency of spontaneous cardiac malformations. In many species, especially in dogs, these defects are heritable and can be attributed to either single or multiple gene effects. Under experimental conditions, cardiovascular congenital defects can be elicited by exposure of pregnant dams to various chemicals and drugs, physical agents, toxins, or nutritional deficiencies. Chemical compounds implicated include thalidomide, ethanol, salicylates, griseofulvin, and cortisone. Prenatal exposure to x-irradiation or fetal hypoxia can induce defects. Maternal nutritional deficiencies of vitamin A, pantothenic acid, riboflavin, or zinc and excess intake of vitamin A, retinoic acid, or copper can result in cardiovascular anomalies in newborn animals. Infectious diseases have been incriminated, but not confirmed, in cardiovascular defects; they include bluetongue infections in sheep, bovine virus diarrhea in cattle, and parvoviral infections in dogs and cats. Congenital cardiac malformations may be grouped into four large categories according to their pathophysiology: (1) defects that cause volume overload (with subcategories of systemic to pulmonary shunting [left to right shunt] and valvular regurgitation), (2) defects that cause pressure overload, (3) defects that cause cyanosis, and (4) miscellaneous cardiac and vascular defects. Anomalies in the first category that lead to left to right shunting include patent ductus arteriosus (PDA), ventricular septal defect (VSD), atrial septal defect (ASD), and endocardial cushion defects. In this category, a defect between the right and left cardiac compartments leads to flow of cardiac blood according to a pressure gradient from the left side (systemic circulation, high pressure) to the right side (pulmonic circulation, low pressure). The consequence of blood shunting is overloading of the low-pressured pulmonary circulation, which results in increased volume of blood that enters the left cardiac compartment after returning from the lungs. This in turn leads to eccentric hypertrophy of the left ventricle and atrium to accommodate the increased volume of blood. Anomalies in the first category that lead to valvular regurgitation include mitral and tricuspid dysplasia and aortic and pulmonic insufficiency. The regurgitated blood from the ventricles to the atria leads to progressive atrial dilation and eccentric ventricular dilation. Anomalies in the second category that cause pressure overload include pulmonic and aortic stenosis and coarctation and interruption of the aorta. In these anomalies, ventricular outflow obstructions result in progressive and chronic increase in intraventricular pressure. The increased intraventricular pressure induces concentric ventricular hypertrophy that eventually results in a diastolic failure. Anomalies in the third category that cause cyanotic heart disease include tetralogy of Fallot, pulmonary to systemic (right to left) blood shunting (some VSD and PDA), tricuspid atresia/right ventricular hypoplasia, double-outlet right ventricle, transposition of the great vessels, truncus arteriosus, and aorticopulmonary window (see Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies ). In these anomalies, nonoxygenated blood from the right cardiac compartment flows to the left compartment or bypasses the left compartment and flows directly into the systemic circulation. This portion of nonoxygenated blood mixes and dilutes the oxygenated blood in the systemic circulation and induces cyanosis in multiple tissues. Anomalies in the fourth category include peritoneopericardial diaphragmatic hernias (PPDHs), persistent right aortic arch (PRAA), endocardial fibroelastosis, anomalous pulmonary venous return, double aortic arch, retroesophageal left subclavian artery, valvular hematomas, and situs inversus. Sites of the major cardiovascular anomalies in the dog are shown in Fig. 10-29 . Figure 10-29 Sites of the Major Cardiovascular Anomalies of the Dog. AS, Aortic stenosis; ASD, atrial septal defect; PDA, patent ductus arteriosus; PS, pulmonic stenosis; VSD, ventricular septal defect. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Developmental Errors/Congenital Anomalies: Myocardium See the following section on Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Interventricular Septal Defect. A ventricular septal defect indicates failure of complete development of the interventricular septum and allows the shunting of blood between the ventricles ( Fig. 10-30 ). The defect occurs in many species and more commonly in the upper interventricular septum—below the aortic valves (on the left), proximal to the crista supraventricularis (near the septal tricuspid valve leaflet), or distal to the crista supraventricularis (below the pulmonic valve). Figure 10-30 Ventricular Septal Defect (High Defect), Heart, Opened Left Side, Calf. Note the large opening in the basal portion of the ventricular septum (arrow) immediately below the aortic valve through which the tube has been passed. A, Aorta; LV, left ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Among breeds of dogs, the greatest frequency has been observed in the English bulldog, English springer spaniel, and West Highland white terrier. Atrial Septal Defect. An atrial septal defect could represent the failure of closure of the foramen ovale, which is an interatrial septal shunt that allows blood to bypass the lungs of the fetus, or it can be the result of true septal defects at another site because of faulty development of the interatrial septum. Although this defect occurs in all domestic animal species, dog breeds with greatest frequency of this defect are the boxer, Doberman pinscher, and Samoyed. Tetralogy of Fallot. Tetralogy of Fallot is a complicated cardiac anomaly seen in all animal species with four lesions ( Fig. 10-31 ). The three primary defects are a ventricular septal defect located high in the septum, pulmonic stenosis (see later discussion), and dextroposition of the aorta (see later discussion). The fourth defect, which develops secondarily, is hypertrophy of the right ventricular myocardium. The major pathophysiologic significance in this condition is the increased pressure in the right side that shunts unoxygenated blood from the hypertrophic right side to the underdeveloped left side (systemic circulation) and results in systemic hypoxemia and secondary polycythemia. Cyanosis is often an associated clinical sign. The anomaly is one of the most common cardiac abnormalities seen in hearts of human beings (so-called blue babies). This complex anomaly is inherited in keeshond dogs and is frequent in English bulldogs. In genetic and pathologic studies of keeshond dogs, the basic defect has been determined to be hypoplasia and malpositioning of the conotruncal septum. Wide variability in the severity of the lesions has been observed. The inheritance pattern in keeshonds is a simple autosomal locus with partial penetration in heterozygotes and complete penetrance in homozygotes. Figure 10-31 Tetralogy of Fallot, Heart, Dissected, Dog. Above the large membranous ventricular septal defect is an overlying, straddling aorta (A). There is also severe pulmonic stenosis (arrow) with massive right ventricular hypertrophy. LV, Left ventricle; RV, right ventricle. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Failure of Normal Valvular Development Pulmonic Stenosis. Pulmonic stenosis has been recognized as a frequently occurring anomaly in dogs and is inherited in the beagle ( Fig. 10-32 ). Other breeds in which this lesion is frequent are basset hound, boxer, Chihuahua, Chow Chow, cocker spaniel, English bulldog, Labrador retriever, mastiff, Newfoundland, Samoyed, schnauzer, and terrier. Several types of valvular lesions have been described and include formation of a circumferential band of fibrous or muscular tissue beneath the valve (subvalvular stenosis) or malformation of the valve (valvular stenosis), with a small central orifice in a dome of thickened valvular tissue. A unique form of subvalvular pulmonic stenosis has been described in English bulldogs and boxers in which an anomalous development of a coronary artery obstructs the right ventricular outflow tract. Notable concentric hypertrophy (see the discussion on hypertrophy in the section on Responses to Injury: Myocardium , Disturbances of Growth ) of the right ventricle develops from the resulting pressure overload. Figure 10-32 Pulmonic Stenosis, Heart, Pulmonary Artery, Dog. A, Closed heart, and B, sectioned heart. Note the prominent concentric right ventricular (RV) hypertrophy resulting from pressure overload. The orifice of the pulmonic valve (arrows) is markedly narrowed. C, Sectioned heart, there is poststenotic dilation (D) of the pulmonary artery with irregular intimal thickenings (jet lesions). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) Aortic and Subaortic Stenoses. True stenoses of the aortic valve are uncommon. Subaortic stenosis is a cardiac anomaly frequently observed in pigs and dogs. Subvalvular aortic stenosis is the most common congenital cardiac anomaly of large-breed dogs. Bull terriers and boxers are predisposed, and a genetic basis is present in the Newfoundland dog, in which subvalvular aortic stenosis is inherited in an autosomal dominant pattern. Obstruction of the left ventricular outflow tract (LVOT) results from a raised, partial or complete fibrous ring that arises from the endocardium below the aortic valve and may extend to involve the cranioventral leaflet of the mitral valve and the base of the aortic valve ( Fig. 10-33 ). The lesion is also observed in the German shorthair pointer, golden retriever, Great Dane, Rottweiler, Samoyed, and bull terrier breeds. In clinical cases, the stenosis is produced by the presence of a thick zone of endocardial fibrous tissue that encircles the LVOT below the valve. In mild cases, often subclinical, the lesion is limited to white nodules on the ventricular septum immediately below the valve. Microscopically, the altered endocardial tissue contains loosely arranged elastic fibers, mucopolysaccharide ground substance, and collagen fibers admixed with fibroblasts and chondrocyte-like cells. Other cardiac lesions develop as a result of the altered left ventricular outflow; these include left ventricular concentric hypertrophy, disseminated foci of myocardial necrosis, fibrosis in the inner left ventricular wall, and thickening of the walls of intramyocardial arteries. Figure 10-33 Subaortic Stenosis, Heart, Opened Left Side, Dog. A thick, white, broad band of fibrous connective tissue (arrows) encircles the left ventricular outflow tract below the aortic valve. The force of the blood ejected through the stenotic lesion is responsible for the "jet lesions" in the overlying aorta (A). (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Valvular Dysplasias: Endocardial Cushion Defects. Other valvular developmental anomalies include endocardial cushion defects (persistent AV canal and atrioventricular canal defect) in pigs, sheep, and cats; mitral dysplasia in cats and dogs; and tricuspid dysplasia in cats and dogs ( Fig. 10-34 ). Endocardial cushion defects are the most common congenital cardiac anomaly seen in cats. Figure 10-34 Endocardial Cushion Defect and Tricuspid Dysplasia, Heart, Opened Right Side, Pig. The endocardial cushion defect (prominent opening [arrow] ) can be mistaken as an atrial septal defect but not the location and presence of abnormal valves incorporated in the defect. AS, Atrial septum; VS, ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Tricuspid Valve Dysplasia. Tricuspid valve dysplasia has a genetic basis in the Labrador retriever dog, in which it is an autosomal dominant trait with reduced penetrance that is mapped to chromosome 9. There is a wide spectrum of morphologic abnormalities that may include (1) shortening, rolling, notching, and thickening of leaflets; (2) incomplete separation of valvular components from the ventricular wall; (3) elongation, shortening, fusion, and thickening of chordae tendineae; (4) direct insertion of the valve edges into a papillary muscle; or (5) atrophy, fusion, and malpositioning of the papillary muscles and chordae tendineae. Mitral Valve Dysplasia. Mitral valve dysplasia is often associated with other anomalies, such as ASD/VSD and tricuspid valve dysplasia. A similar spectrum of morphological valvular abnormalities is present in mitral valve dysplasia as described previously for tricuspid valve dysplasia. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular insufficiency lead to volume overload with resultant atrial dilation and to eccentric ventricular hypertrophy. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular stenosis lead to reduced ventricular filling with subsequent low cardiac output (history of syncope, collapse, and hypotension) and increased atrial pressure; in the case of mitral stenosis, increased atrial pressure can lead to pulmonary edema initially and dilation of the right ventricle (right-sided heart failure) from prolonged pulmonary hypertension. Developmental Errors/Congenital Anomalies: Pericardium and Epicardium Peritoneopericardial Diaphragmatic Hernias. Peritoneopericardial diaphragmatic hernias (PPDHs) occur in cats and dogs with incomplete development of the diaphragm. PPDHs are rare, but they are the most common congenital pericardial anomaly in cats; Persian and domestic longhair cats were overrepresented in two studies. PPDHs result from defective separation of the developing liver and septum transversum during embryogenesis that allows the peritoneal and pericardial cavities to communicate. Hence, abdominal organs including omental fat may fill the pericardial sac and compress the heart. Parts of the liver are often incarcerated in the pericardial sac and may develop intrahepatic myelolipomas. Partial/Complete Absence (Agenesis) of the Pericardial Sac. Partial or complete absence of the pericardial sac is an incidental lesion that is rarely found during necropsy and has not been reported to have clinical significance during life. However, there is one report of a dog with a partial tear in the pericardium that was associated with episodes of syncope. Intrapericardial Cysts. Benign intrapericardial cysts are rare, large fluid-filled masses within the pericardial space that originate from the pericardium and consist of encapsulated and hemorrhagic adipose tissue that possibly originated from congenital entrapment of the omentum or falciform ligament. In other cases, these rare lesions are associated with PPDH. Developmental Errors/Congenital Anomalies: Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Portacaval Shunts. Portacaval shunts occur in animals, particularly in the dog. The normal flow from the portal vein is diverted, either partially or completely, to the systemic circulation, thus bypassing the liver ( Fig. 10-35 ). Normal hepatic detoxification of portal flow is incomplete and may result in neurologic signs and elevated circulating bile acids. The resulting nervous system syndrome is termed hepatic encephalopathy. Specifically, the shunts represent retained fetal vascular structures, as in persistent ductus venosus, or arise from prominent dilation of various portosystemic shunts that normally are quite small vessels. See Chapter 8 on diseases of the liver for further details. Figure 10-35 Portacaval Shunt, Dog. Note that the branch of the portal vein (arrowhead 1) passes under the caudal vena cava (arrow) and anastomoses with the azygous vein (arrowhead 2). The azygous vein returns the blood to the caudal vena cava near the heart and thus this blood and its ammoniacal and protein metabolites are shunted away from processing to blood urea nitrogen (BUN) in the liver. The liver is normal color but extremely small, which is typical of these types of shunts (see Chapter 8). (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Tetralogy of Fallot. See Disorders of Domestic Animals; Developmental Errors/Congenital Anomalies; Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves, Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts, Tetralogy of Fallot . Patent Ductus Arteriosus. Patent ductus arteriosus is a frequent anomaly in poodle, collie, Pomeranian, Chihuahua, cocker spaniel, English springer spaniel, German shepherd, keeshond, Maltese, Yorkshire terrier, bichon frise, and Shetland sheepdog breeds ( Fig. 10-36 ). In poodles, it is an inherited polygenic trait. Female dogs have a greater incidence. The ductus arteriosus is a fetal communication between the aorta and pulmonary artery that serves to divert blood from the right cardiac chamber to the fetal circulation in order to bypass the collapsed fetal lungs. Following parturition, the smooth muscle in the ductus arteriosus contracts, which results in its occlusion within 7 to 10 days after birth in the dog. When this mechanism fails, the ductus arteriosus remains patent and allows for a portion of the blood from the left cardiac chamber to flow from the aorta into the pulmonary artery and results in overcirculation to the lungs, leading to pulmonary hypertension and increased preload to the left ventricle. Grossly, patent ductus arteriosus is a dilated funnel-shaped communication between the descending aorta and the main pulmonary artery. This vascular channel between the pulmonary artery and aorta allows blood to bypass the lungs during fetal life. Normally, the ductus arteriosus is converted to the solid ligamentum arteriosum postnatally. Figure 10-36 Patent Ductus Arteriosus, Heart, Young Dog. Note the prominent ductus arteriosus (arrow) between the pulmonary artery (PA) and the aorta (A) in the undissected (left) and dissected vessels (right). (Courtesy Dr. D.D. Harrington, School of Veterinary Medicine, Purdue University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Malpositioning of Great Vessels Persistent Right Aortic Arch. Persistent right aortic arch occurs in dogs; German shepherd, Irish setter, and Great Dane dogs are predisposed ( Fig. 10-37 ). This defect arises because the right fourth aortic arch, rather than the normal left fourth aortic arch, develops and ascends on the right side of the midline so that the ligamentum arteriosum forms a vascular ring over the esophagus and trachea. This arrangement eventually results in esophageal obstruction and proximal dilation (megaesophagus), which often results in aspiration pneumonia as the animal matures and consumes solid feed. Figure 10-37 Persistent Right Aortic Arch, Ligamentum Arteriosum, Megaesophagus, Calf. During embryogenesis, the aorta was formed from the right aortic arch instead of the left one; thus the aorta is now on the right. For the ligamentum arteriosum (arrow) to connect the aorta with the pulmonary artery, it has to pass dorsally over the esophagus and trachea. The ligamentum, together with the aorta and pulmonary artery, form a vascular ring that constricts the esophagus (E), which is dilated cranial to the constriction. (Courtesy Dr. S. Snyder, College of Veterinary Medicine, Colorado State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Transposition of the Aorta and Pulmonary Artery. Transposition of the aorta and pulmonary artery are severe anomalies, of which there are several types. In complete transposition, the aorta serves as the outflow from the right ventricle and the pulmonary artery is the left ventricle primary outflow. Other congenital anomalies, including ventricular septal defect, often accompany this anomaly. Truncus Arteriosus. In this lesion, there is a large VSD that allows blood flow between the ventricles and a single large vessel that originates above the VSD. Hypoxemia and cyanosis develop, depending on the amount of mixture of nonoxygenated and oxygenated blood. Lymphatic Vessels Lymphangiectasia. Lymphangiectasia is dilation of lymphatic vessels. The cause may be a congenital anomaly ( Fig. 10-38 ) or obstruction of lymph drainage by invading masses of malignant neoplasms or inflammation ( Fig. 10-39 ). Figure 10-38 Congenital Lymphangiectasia, Epicardium, Young Horse. Note the tortuous appearance of the epicardial lymphatic vessel (arrow). In congenital lymphangiectasia, lymphatic vessels fail to make connections with other vessels or are obstructed because of anomalous development. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-39 Acquired Lymphangiectasia, Lymphoma (Lymphosarcoma), Mesocolon, Horse. Note the distended lymphatic vessels on the serosal surface of the large colon, the result of impeded lymph flow through the colic lymph nodes, caused by compression of their cortical and medullary sinuses by proliferating neoplastic lymphocytes. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hereditary Lymphedema. Hereditary lymphedema has been described in dogs, Ayrshire and Angus calves, and pigs. Affected animals have prominent subcutaneous edema that, in calves, often causes severe swelling of the tips of the ears. Interference with lymph drainage results from defective development of the lymphatic vessels that are aplastic or hypoplastic. Disorders of Domestic Animals: Myocardium The most common cardiac diseases in horses, ruminants, pigs, dogs, and cats are summarized in Boxes 10-12 and 10-13 . The most common locations of major neoplastic diseases in the heart are illustrated in Fig. 10-40 . Cardiovascular diseases with known or suspected heritability are listed in E-Boxes 10-2 and 10-3 . Box 10-12 Most Common Cardiac Diseases of Horses and Production Animals Horses Fibrinous pericarditis Toxic cardiomyopathy (ionophores, white snakeroot) Endocardial fibrosis and calcification Endocarditis Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) White muscle disease (vitamin E–selenium deficiency) Cardiotoxicity (ionophores, gossypol, Cassia occidentalis , Karwinskia humboldtiana ) Brisket disease (high-altitude disease) Pericarditis Endocarditis Malignant lymphoma Pigs Mulberry heart disease (vitamin E–selenium deficiency) Pericarditis Endocarditis Box 10-13 Most Common Cardiac Diseases in Dogs and Cats Dogs Myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis) Congenital heart disease Dilated cardiomyopathy Hemorrhagic pericardial effusion Cardiac neoplasia Dirofilariasis Cats Hypertrophic cardiomyopathy Dilated cardiomyopathy Hyperthyroidism-associated hypertrophy Congenital heart disease Figure 10-40 Locations of the Major Cardiac Neoplasms. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Box 10-2 Inherited Cardiovascular Diseases of Animals (Also See E-Box 1-1 ) Hypertrophic Cardiomyopathy: Cats Maine coon cats: Autosomal dominant Ragdoll cat: Autosomal dominant (?) British shorthair cat: Autosomal dominant (?) Dilated Cardiomyopathy: Dogs Portuguese water dog: Autosomal recessive Doberman pinscher dog: Autosomal dominant Irish wolfhound dog: Autosomal dominant (recessive?) Newfoundland dog: Autosomal dominant Great Dane dog: X-linked recessive (?) Cardiomyopathy with X-Linked Muscular Dystrophy: Dogs Irish terrier, golden retriever, Dalmatian, Shetland sheepdog, Samoyed, Pembroke Welsh corgi, Japanese spitz, Alaskan malamute dog: X-linked recessive Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy: Dog Boxer dog: Autosomal dominant Cardiomyopathy with Curly Haircoat: Cow Poll Hereford cow: Autosomal recessive Dilated Cardiomyopathy: Cow Holstein-Friesian cow: Autosomal recessive with X-linked muscular dystrophy Cardiomyopathy with Muscular Dystrophy: Hamster Syrian golden hamster: Autosomal recessive Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis) Cavalier King Charles spaniel: Polygenic trait Dachshund: Polygenic trait Aortic Stenosis (Subvalvular) Newfoundland: Polygenic trait Tetralogy of Fallot: Conotruncal Defects Keeshond: Simple autosomal locus with partial penetration in heterozygous and complete penetrance in homozygotes Patent Ductus Arteriosus Poodle: Polygenic trait Pulmonic Stenosis Beagle: Polygenic trait Tricuspid Dysplasia Labrador retriever: Autosomal dominant with reduced penetrance E-Box 10-3 Canine Breed Predilections for Congenital Cardiac Anomalies Breed Defect Basset hound PS Beagle PS Bichon frise PDA Boxer SAS, PS, ASD Boykin spaniel PS Bull terrier MiVD, AS Chihuahua PDA, PS Chow Chow PS, CTD Cocker spaniel PDA, PS Collie PDA Doberman pinscher ASD English bulldog PS, VSD, TOF English springer spaniel PDA, VSD German shepherd SAS, PDA, TVD, MiVD German shorthaired pointer SAS Golden retriever SAS, TVD, MiVD Great Dane TVD, MiVD, SAS Keeshond TOF, PDA Labrador retriever TVD, PDA, PS Maltese PDA Mastiff PS, MiVD Newfoundland SAS, MiVD, PS Pomeranian PDA Poodle PDA Rottweiler SAS Samoyed PS, SAS, ASD Schnauzer PS Shetland sheepdog PDA Terrier breeds PS Weimaraner TVD, PPDH Welsh corgi PDA West Highland white terrier PS, VSD Yorkshire terrier PDA AS, aortic stenosis; ASD, atrial septal defect; CTD, cor triatriatum dexter; MiVD, mitral valve dysplasia; PDA, patent ductus arteriosus; PPDH, peritoneopericardial diaphragmatic hernia; PS, pulmonic stenosis; SAS, subaortic stenosis; TOF, tetralogy of Fallot; TVD, tricuspid valve dysplasia; VSD, ventral septal defect. Adapted from Oyama MA, Sisson DD, Thomas WP, et al: Congenital heart disease. In Ettinger SJ, Feldman EC, editors: Textbook of veterinary internal medicine , ed 7, St. Louis, 2010, Saunders; 1250-1298. Disturbances of Circulation Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). Blunt chest trauma may result in myocardial hemorrhage, which can lead to serious clinical consequences. Tears and rupture of tissue resulting from loss of structural integrity attributable to invasive and destructive properties of neoplasms may result in myocardial hemorrhage. See discussion on hemorrhage in Chapter 2. Disturbances of Growth See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Hypertrophy and Atrophy Cardiomyopathies. Categorization and causes of primary and secondary cardiomyopathies are listed in Box 10-14 . These diseases are divided into five morphologic types: hypertrophic, dilated (congestive), restrictive, arrhythmogenic right ventricular, and unclassified cardiomyopathies. Secondary cardiomyopathies (also termed specific heart muscle diseases ) are generalized myocardial diseases of known cause. Box 10-14 Cardiomyopathies in Animals Primary Cardiomyopathies (Idiopathic) Hypertrophic: Cat, dog, rat, pig Dilated (congestive): Cat, dog, hamster, turkey, pig, cow, sea otters, sea lions, cynomolgus monkeys Restrictive: Cat Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy: Dog, cat Secondary Cardiomyopathies (Specific Heart Muscle Diseases) Heritable (known or suspected): Hereditary cardiomyopathy of hamsters, mice, rats, turkeys, and cattle; Duchenne's type, X-linked muscular dystrophy of golden retriever dogs with dystrophin deficiency; glycogenoses Nutritional deficiencies: See list in Box 10-5 ; other examples include taurine deficiency in cats and foxes Toxic: See list in Box 10-5 ; other examples include anthracycline toxicity, furazolidone toxicity, NaCl toxicity Physical injuries and shock: See list in Box 10-5 Endocrine disorders: Hyperthyroidism, acromegaly (hypersomatotropism), hypothyroidism, glucocorticoid excess, functional pheochromocytoma, diabetes mellitus Infections: See lists in Box 10-6 , Box 10-7 , Box 10-8 Neoplastic infiltration: Malignant lymphoma Systemic hypertension in cats and dogs: Spontaneous or associated with chronic renal disease, hyperthyroidism, diabetes mellitus, acromegaly, primary aldosteronism Hypertrophic Cardiomyopathy. Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) occurs frequently in cats, especially in young adult to middle-aged males (1 to 3 years old), and is seen infrequently in dogs, usually affecting males of large breeds. Hypertrophic cardiomyopathy is the most common feline primary myocardial disease, and it occurs frequently in cats (58% to 68% of all cardiomyopathy cases). There is familial heritability in Maine coon, ragdoll, and American shorthaired cats (in which it is transmitted in an autosomal dominant pattern) and breed predisposition in British shorthair, Norwegian forest, Turkish Van, Scottish fold, Bengal, Siberian, and Rex cats. Young adult to middle-aged males (1 to 3 years old) are often affected. Hypertrophic cardiomyopathy is caused by sarcomeric defects in cardiomyocytes, of which two mutations in cardiac myosin-binding protein C (MYBPC) have been identified in Maine coon and ragdoll cats. Altered sarcomeric function ultimately results in myocytes hypertrophy, collagen synthesis, and myocytes disarray (defined as cellular disorientation of cardiomyocytes in which cardiomyocytes are oriented perpendicular or obliquely to each other forming tangled patterns and/or pinwheel configurations). The left ventricle wall progressively thickens ( Fig. 10-41 ), and its lumen narrows (nondilated concentric hypertrophy) (heart weight to body weight ratio of 7.0 ± 0.3 g/kg compared to normal cats' heart weight to body weight ratio of 3.83 ± 0.2 g/kg). In addition, mild right ventricular enlargement is occasionally present. Left ventricular concentric enlargement results in impairment of the left ventricle's ability to relax during diastole (diastolic failure). Increased left ventricular diastolic filling pressure leads to enlargement of the left atrium with subsequent blood backing up to the lungs, resulting in congestive heart failure with pulmonary edema and/or pleural effusion. In a subset of cases, in addition to concentric hypertrophy of the left ventricle, the interventricular septum contains hypertrophied, anteriorly displaced papillary muscles that pull the chordae tendineae and the anterior leaflet of the mitral valve into the left ventricular outflow tract (LVOT), resulting in a dynamic LVOT obstruction during systole (systolic anterior motion [SAM] of the mitral valve). Therefore a unique kissing lesion forms in the LVOT, which has a diagnostic significance because it is seen only in this subset of cats with hypertrophic cardiomyopathy. In addition, the systolic obstruction in the LVOT causes further increase in the left ventricular pressure that worsens its hypertrophy. Approximately 10% to 20% of cats with hypertrophic cardiomyopathy have a state of increased coagulability and develop posterior paresis from concurrent thromboembolism of the caudal abdominal aorta ("saddle thrombosis") (see Fig. 10-91 ). The aortic thrombus is first formed in the stagnant blood flow of the enlarged left atrium and is subsequently launched into the aorta. Some cats with hypertrophic cardiomyopathy die unexpectedly without premonitory clinical signs. Microscopically, the lesions of the myocardium are prominent disarray or disorganizations of myocytes, with interweaving rather than parallel arrangement of fibers ( Fig. 10-42 ). Myocyte hypertrophy, various degenerative alterations in myocytes, and interstitial fibrosis are present. A second common histologic lesion includes remodeling of the coronary microcirculation associated with arteriosclerosis ("small vessel disease"). The lumen of small coronary vessels is severely narrowed due to smooth muscle proliferation and increased connective tissue elements. Replacement fibrosis due to myocardial infarction/necrosis is occasionally found in regions of remodeled coronary arterioles, implying a probable causal relationship (see Figs. 10-41 and 10-42 ; E-Fig. 10-20 ). Figure 10-41 Hypertrophic Cardiomyopathy, Heart, Cats. A, Note the thickened left ventricular wall (LV). B, The thickened left ventricular free wall and septum have markedly reduced the lumen of the left ventricle (LV). C, There is severe diffuse concentric hypertrophy of the left ventricular free wall, interventricular septum, and papillary muscles. Left atrial dilation is present and a large thrombus (arrow) arises from and extends through the left atrioventricular valve. ( A and B courtesy Dr. W. Crowell, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. C courtesy Ettinger SJ, Feldman EC (editors): Textbook of veterinary internal medicine. Diseases of the dog and cat , vol 2, ed 7, Philadelphia, 2010, Saunders.) Figure 10-42 Hypertrophic Cardiomyopathy, Heart, Ventricular Myocardium, Cat. A, Cardiac myocytes are hypertrophied and in disarray. H&E stain. B, Masson's trichrome stain demonstrates abundant amounts of interstitial collagen (blue) produced by fibroblasts. C, Normal cardiac myocytes arranged in parallel bundles. H&E stain. ( A and B courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island. C courtesy Dr. L. Borst, College of Veterinary Medicine.) E-Figure 10-20 Hypertrophic Cardiomyopathy, Heart, Ventricular Myocardium, Cat. A, Note the pattern of interwoven cardiac myocytes, indicating myofiber disarray, and the hypertrophic myocytes (compare with Figs. 10-20 and 10-42 ). The number of fibroblasts is increased in the interstitium. H&E stain. B, Normal cardiac myocytes arranged in parallel bundles. (Courtesy Dr. L. Borst, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Idiopathic hypertrophic cardiomyopathy in dogs is an infrequent pathology, unlike in cats. It is defined as inappropriate concentric myocardial hypertrophy of a nondilated left ventricle in the absence of an identifiable stimulus for the hypertrophy. Most reported cases have been in young males ( aortic > tricuspid > pulmonary. Figure 10-54 Vegetative Valvular Endocarditis. A, Mitral valve, heart, calf. Multiple, large, raised, friable, yellow-red thrombotic masses are attached to cusps of the mitral valve. The roughened and granular surface of the valve leaflets is attributable to fibrin, platelets, and trapped bacteria and erythrocytes. B, Bacterial infection, heart, tricuspid valve, cow. Note abundant masses of fibrin and bacterial colonies (arrow). H&E stain. ( A courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island. B courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-55 Valvular Endocarditis, Streptococcus Suis , Heart Mitral and Pulmonic Valves, Pig. Note the friable, yellow material adhering to and replacing some of the normal left atrioventricular valve. The left ventricular chamber is dilated due to failure of normal function of the valve (eccentric hypertrophy). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) The pathogenesis of endocarditis is complicated and incompletely understood, but the components of Virchow's triad in thrombogenesis—endothelial injury, turbulence, and hypercoagulability—are involved. Affected animals often have preexisting extracardiac infections, such as gingivitis, mastitis, hepatic abscesses, or dermatitis, resulting in one or more bouts of bacteremia. Turbulent intracardiac blood flow associated with congenital anomalies or the presence of intracardiac and vasculature devices, such as catheters, may contribute to initiation of the lesion. Focal trauma–induced endothelial disruption on the surface of the normally avascular valves allows bacteria to adhere, proliferate, and initiate an inflammatory reaction that results in subsequent deposition of masses of fibrin. Death is the result of cardiac failure from valvular dysfunction or the effects of bacteremia. In some animals, septic emboli lodge in organs such as the heart, synovium, bone, liver, kidneys, and meninges, leading to infarction and/or localized inflammation or abscess formation. See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation and also Chapter 3. Atrial Thrombosis. Atrial thrombi may occur with valvular or myocardial disease and are the result of hemostatic abnormalities resulting from stasis or turbulence. Endothelial injury, turbulence, and hypercoagulability are involved in the pathogenesis of atrial thrombi. Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium Disturbances of Circulation Hemorrhage. Hemorrhage involving the pericardium and epicardium (see Fig. 10-24 ; see E-Fig. 10-18 ) results from stretching, tearing, lacerating, or crushing blood vessels in these structures and may be caused by penetrating wounds (foreign objects, bullets, or knives), lacerations from fractured bone, shear forces that stretch and ultimately tear vessels in tissues (blunt force trauma), and tears and rupture of tissue resulting from loss of structural integrity attributable to invasive and destructive properties of neoplasms such as hemangiosarcomas (see Chapters 2 and 6). Effusions. See the discussions on the mechanisms of edema formation and Figs. 2-6 through 2-10Fig. 2-6Fig. 2-7Fig. 2-8Fig. 2-9Fig. 2-10 in Chapter 2 and on the formation of transudates and exudates and Fig. 3-3 in Chapter 3. Pericardial Dilatation. The pericardium responds to excess fluid in the pericardial space by dilation. However, this outcome requires adequate time to allow adjustments in size. In hemopericardium, blood rapidly fills the pericardial cavity and death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition with compression of the heart caused by blood accumulation leading to reduced cardiac output. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( Fig. 10-56 ). In cases associated with vascular injury, a few fibrin strands are present, and the fluid could clot after exposure to air. Figure 10-56 Hydropericardium, Pericardial Sac, Pig. The thin-walled dilated pericardial sac contains serous fluid that has accumulated secondary to alterations in hydrostatic pressure between the pericardial cavity, circulatory system, and lymphatic system. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hydropericardium. Hydropericardium occurs in those diseases that have generalized edema (see Fig. 10-56 ). Thus ascites and hydrothorax often occur concurrently with hydropericardium. Congestive heart failure is an important mechanism of hydropericardium and is usually the result of primary myocardial, valvular, congenital, or neoplastic diseases. Common specific diseases include dilated cardiomyopathy of dogs and cats and "ascites syndrome" of poultry. Hydropericardium can also accompany pulmonary hypertension (e.g., "brisket disease" or "high-altitude disease" of cattle), renal failure, and hypoproteinemia from various chronic debilitating diseases. Hydropericardium can also occur in various systemic diseases with vascular injury, such as septicemia in pigs, "heartwater" ( Cowdria ruminantium infection) in small ruminants, African horse sickness, and bovine ephemeral fever. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( E-Fig. 10-21 ; also see Fig. 10-56 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). As examples, hydropericardium can occur in animals with (1) hypoproteinemia (decreased colloid osmotic pressure) caused by liver disease or protein-losing nephropathy/enteropathy; (2) heart failure (increased hydrostatic pressure) where there is poor venous return to the heart; and (3) vascular injury, where damage to the barrier function of the vascular wall can result in leakage of small quantities of plasma proteins. In this latter example, a few fibrin strands can be present and the fluid could clot after exposure to air. The pericardial surfaces are smooth and glistening in acute cases, but in chronic cases, the epicardium becomes opaque because of mild fibrous thickening and can appear roughened and granular when there is villous proliferation of fibrous tissue, especially over the atria. The mechanisms involved in these fluid shifts are discussed in Chapters 2 and 3. E-Figure 10-21 Hydropericardium, Chicken. Note the accumulation of clear yellow fluid (transudate) in the pericardial cavity. This fluid may occur as a result of hypoproteinemia, heart failure, and vascular injury. If this accumulation is rapid, it compresses the heart (H) and great vessels, leading to a condition known as "cardiac tamponade," which restricts venous return to the heart and reduces the end diastolic pumping volume of the heart. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hemopericardium. Hemopericardium is an accumulation of whole blood in the pericardial sac ( Figs. 10-57 and 10-58 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). Death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition in which the compression of the heart caused by the accumulation of blood in the pericardial sac leads to reduced cardiac output and poor perfusion of vascular beds in all organ systems. As examples, hemopericardium may be caused by blunt force trauma (impact with an automobile) or from rupture of the wall of the right atrium after invasion by a hemangiosarcoma. Figure 10-57 Hemopericardium (Cardiac Tamponade), Right Atrium, Hemangiosarcoma, Heart, Dog. The pericardium is distended and dark blue because it contains whole blood secondary to rupture of an atrial hemangiosarcoma. Hemopericardium can cause death if it is sudden and is of sufficient volume to compress the heart and thus reduce cardiac output, a condition known as cardiac tamponade. On clinical examination, heart sounds are muffled. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-58 Hemopericardium, Pericardial Sac (Opened), Dog. The pericardial sac is filled with clotted blood. Hemorrhage into a body cavity results in pooling of coagulated or uncoagulated blood within that cavity. (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Bleeding into the pericardial sac can result from spontaneous atrial rupture in dogs, atrial rupture in dogs with hemangiosarcoma, rupture of the intrapericardial aorta or pulmonary artery in horses, or as a complication of intracardiac injections (see Figs. 10-57 and 10-58 ). Disturbances of Growth Serous Atrophy. Serous atrophy of fat is readily identified by the gray gelatinous appearance of epicardial fat deposits ( Fig. 10-59 ). Healthy animals normally have abundant white or yellow epicardial fat deposits, especially along the AV junction. Microscopically, lipocytes are atrophic, and edema is present in the interstitial tissue. Serous atrophy of epicardial fat occurs rapidly during anorexia, starvation, or cachexia because fat is catabolized to maintain energy balance. Figure 10-59 Serous Atrophy of Fat, Heart, Epicardium, Cow. The epicardial fat deposits are gray and gelatinous (arrows) , indicating that fat has been catabolized, for example, as in the early stages of starvation. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Cell Degeneration and Death Epicardial Calcification. Epicardial calcification is a feature in hereditary calcinosis in mice and cardiomyopathy in hamsters ( E-Fig. 10-22 ). Myocardial mineralization (discussed later) may be visible on the epicardial surface in vitamin E–selenium deficiency in sheep and cattle, vitamin D toxicity in several species, calcinogenic plant toxicosis in cattle ("Manchester wasting disease"), and spontaneous myocardial calcification in aged rats and guinea pigs. E-Figure 10-22 Epicardial Calcification, Heart, Right Ventricle, Mouse. A, Note the prominent white mineral deposits over the right ventricle (RV). B, The basophilic mineral deposits are present epicardially and in the outer myocardium (left). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Gout. Visceral gout has not been reported in domestic animals but does occur in birds and reptiles ( E-Fig. 10-23 ; see Chapter 1). E-Figure 10-23 Visceral Gout, Heart, Pericardium, Chicken. White urate deposits are present on the epicardial surface. (Courtesy College of Veterinary Medicine, The Ohio State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Inflammation Pericarditis. Inflammation of the pericardium is frequently seen with bacterial septicemias and typically results in fibrinous pericarditis. Grossly, both the visceral and parietal pericardial surfaces are covered by variable amounts of yellow fibrin deposits, which can result in adherence between the parietal and visceral layers. When the pericardial sac is opened, the attachments are torn away (so-called bread-and-butter heart) ( Fig. 10-60 ). Microscopically, an eosinophilic layer of fibrin with admixed neutrophils lies over a congested epicardium ( Fig. 10-61 ). Figure 10-60 Fibrinous Pericarditis, Heart, Epicardium, Horse. The epicardium is covered dorsally by a thick, yellow layer of fibrin (arrows) and ventrally by granulation tissue (finely granular surface) , thus indicating the chronicity of the inflammatory process. The apposing parietal pericardium (not shown) was also covered with fibrin. This lesion commonly occurs in horses with Streptococcus equi subsp. zooepidemicus septicemia causing vasculitis. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-61 Fibrinous Pericarditis, Heart, Epicardium, Pig. Note eosinophilic fibrin deposits (E) (left) on the epicardial surface. This lesion commonly occurs with septicemias by bacteria that cause vasculitis. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The outcome of fibrinous pericarditis varies. Early death is frequent because many of these lesions result from infection by highly virulent bacteria and concurrent septicemia. When survival is prolonged, adhesions form between the pericardial surfaces after fibrous organization of the exudate. Suppurative pericarditis is seen mainly in cattle as a complication of traumatic reticuloperitonitis ("hardware disease"). Foreign bodies, such as nails or pieces of wire that accumulate in the reticulum, occasionally penetrate the reticular wall and diaphragm, enter the adjacent pericardial sac, and introduce infection. Some affected cattle survive for weeks to months until death ensues from congestive heart failure or septicemia. Grossly, the pericardial surfaces are notably thickened by white, often rough, shaggy-appearing masses of fibrous connective tissue that enclose an accumulation of white to gray, thick, foul-smelling, purulent exudate ( Fig. 10-62 ). Figure 10-62 Chronic Suppurative (Active) Pericarditis, Traumatic Reticuloperitonitis ("Hardware Disease"), Heart, Pericardial Sac (Opened), Cow. The exposed epicardial and parietal surfaces are notably thickened by fibrous connective tissue and covered by a fibrinopurulent exudate. On clinical examination, heart sounds are muffled. P, Reflected parietal pericardium. (Courtesy Dr. J. King, College of Veterinary Medicine, Cornell University.) Constrictive pericarditis is a chronic inflammatory lesion of the pericardium accompanied by extensive fibrous proliferation and eventual formation of fibrous adhesions between the surfaces of the visceral and parietal pericardium. The condition is seen in some cases of suppurative pericarditis in cattle and pigs with chronic fibrinous pericarditis. Severe lesions obliterate the pericardial sac and constrict the heart with fibrous tissue and can interfere with cardiac filling and thus cardiac output. Compensatory myocardial hypertrophy can result in diminished ventricular chamber volumes and contribute to the eventual development of heart failure. Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems See the discussion on blood and lymphatic vascular systems in the section on Responses to Injury: Blood and Lymphatic Vascular Systems . The major arterial diseases are shown in Fig. 10-63 . Figure 10-63 Major Arterial Diseases. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Blood Vessels Disturbances of Circulation Effusions. See the previous discussion on disturbances of circulation in the sections on Pericardium and Epicardium. Hemopericardium. See the later discussion on the hemopericardium under Effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium; Disturbances of Circulation . Hemothorax and Hemoabdomen. Hemothorax and hemoabdomen arise from spontaneous or traumatic rupture of large arteries or veins or from rupture of aneurysms located in the thoracic or abdominal cavity, respectively. An aneurysm is a localized dilation or outpouching of a thinned and weakened portion of a vessel. Usually, arteries are affected, especially large elastic arteries, but the lesion can also occur in veins. Known causes include copper deficiency in pigs ( Fig. 10-64 ) because copper is necessary for normal development of elastic tissue and damage from infection with Spirocerca lupi in dogs or Strongylus vulgaris in horses. Most cases are idiopathic. Dissecting aneurysms are infrequent but have been seen in birds, most notably turkeys ( Fig. 10-65 ). They result from disruption of the intima, which allows entry of blood into the media, and this dissects along the wall. Aneurysms can rupture. Usually the consequences are rapidly fatal because rather large arteries typically are involved. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-64 Dissecting Aneurysm, Copper Deficiency, Heart, Pulmonary Artery, Right Ventricle (RV), Pig. The dark, blood-filled, bulging segment of the wall of the pulmonary artery (arrows) has resulted from disruption of elastic fibers. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-65 Dissecting Aneurysm, Aorta, Turkey. Blood has dissected through the tunica media (in a nearby section of the aorta) and in this section has come to lie in the outer layers of the tunica media and adventitia. L, Vessel lumen. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Aortic Rupture and Rupture of Large Arteries. Aortic rupture and rupture of large arteries can be the sequela of severe trauma or occur spontaneously (see Figs. 10-64 and 10-65 ). Sudden rupture of the ascending aorta or pulmonary artery near the pulmonic valve in horses is associated with notable exertion and severe trauma to the ventral thorax from falling. Death ensues rapidly from cardiac tamponade because the tear is in that portion of the aorta or pulmonary artery within the pericardial sac. In horses, the internal carotid artery can rupture into the adjacent guttural pouch, with subsequent epistaxis. This is a consequence of deep mycotic infection of the guttural pouch. Rupture of the middle uterine artery may occur during parturition in mares and with uterine torsion or prolapse in cows. Aortic rupture, with or without dissection, is an important cause of death in male turkeys. The most common vascular diseases with rupture are listed in Box 10-15 . Box 10-15 Most Common Vascular Diseases with Rupture Aortic rupture: Horse, turkey Carotid artery rupture: Horse Thoracic duct rupture: Dog, cat Gastric Dilation and Volvulus. See the discussion on gastric dilation and volvulus in Chapter 7. Disturbances of Growth Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma. Cardiac hemangiosarcoma is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or by metastasis (secondary) from sites such as the spleen. This neoplasm is usually seen in the wall of the right atrium and only occasionally involves the right ventricle. The tumor arises from neoplastic transformation of vascular endothelium. Also see Disorders of Dogs , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth, Neoplastic Transformation, Hemangiosarcoma and Hemangioma. Vascular Melanosis. See the discussion on vascular melanosis in Chapters 1 and 2. Cell Degeneration and Death. Toxicants that affect vessels are listed in E-Box 10-1 . See Chapter 1. Generalized vascular degenerative diseases in animals are classified into the following three principal groups: • Arteriosclerosis • Atherosclerosis • Arterial medial calcification Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis also occur in all animal species. Arteriosclerosis. Arteriosclerosis is characterized by intimal fibrosis of large elastic arteries, atherosclerosis is characterized by intimal and medial lipid deposits in elastic and muscular arteries, and arterial medial calcification has characteristic mineralization of the walls of elastic and muscular arteries. Arteriosclerosis is an age-related disease that occurs frequently in many animal species but rarely causes clinical signs. The disease develops as chronic degenerative and proliferative responses in the arterial wall and results in loss of elasticity ("hardening of the arteries") and, less often, luminal narrowing. The abdominal aorta is most frequently affected, but other elastic arteries and peripheral large muscular vessels may be involved. Lesions are often localized around the orifices of arterial branches. Etiologic factors in the development of arteriosclerosis are not well defined, but the significant role of hemodynamic influences is suggested by the frequent involvement at arterial branching sites, in which blood flow is turbulent. Grossly, the lesions are seen as slightly raised, firm, white plaques. Microscopically, initially the intima is thickened by accumulation of mucopolysaccharides and later by the proliferation of smooth muscle cells in the tunica media and fibrous tissue infiltration into the intima. Splitting and fragmentation of the internal elastic lamina are common Atherosclerosis. Atherosclerosis, the vascular disease of greatest importance in human beings, occurs only infrequently in animals and rarely leads to clinical disease such as infarction of the heart or brain. The principal alteration is accumulation of deposits (atheroma) of lipid, fibrous tissue, and calcium in vessel walls, which eventually results in luminal narrowing. Many studies have established that the pig, rabbit, and chicken are susceptible to the experimental disease produced by the feeding of a high-cholesterol diet; the dog, cat, cow, goat, and rat are resistant. Lesions of the naturally occurring disease have been detected in aged pigs and birds (especially parrots) and in dogs with hypothyroidism and diabetes mellitus that develop an accompanying hypercholesterolemia. Arteries of the heart, mesentery, and kidneys are prominently thickened, firm, and yellow-white ( Fig. 10-66, A ). Microscopically, lipid globules accumulate in the cytoplasm of smooth muscle cells and macrophages, often termed foam cells , in the media and intima (see Fig. 10-66, B and C ). Necrosis and fibrosis develop in some arterial lesions. The pathogenesis of atherosclerosis has been extensively studied in human beings. The vascular response-to-injury hypothesis is the current proposed mechanism of injury. The dyslipoproteinemia associated with diabetes or hypothyroidism in the dog results in endothelial injury. A variety of mechanisms, including oxygen free radical production, increase the decay of nitric oxide and decrease its vasodilator activity. The damaged endothelial cell allows lipoproteins to accumulate within the intima, where they are oxidized by free radicals generated by macrophages and endothelial cells. The oxidized products are directly toxic to endothelium and smooth muscle cells. Cellular debris is ingested by macrophages and smooth muscle cells, resulting in the formation of "foam cells." The lesion in dogs differs from that of human beings with respect to the location of lipid, which is abundant throughout the wall of the artery in contrast to human beings, who have lipid accumulation in the tunica intima. The chronic progression of atherosclerosis may result in narrowing of the lumen, ulceration and thrombosis, and hemorrhage or aneurysmal dilation. Figure 10-66 Coronary Atherosclerosis, Hypothyroidism, Heart, Left Ventricle, Dog. A, The affected coronary arteries are prominent and cordlike (arrows) with thickened walls. The diffuse and focal yellow areas in the walls of the arteries are the sites of atheromatous deposits. B, Note the extensive accumulation of lipid-laden (clear vacuoles) macrophages termed "foam cells" throughout the thickened tunica intima and media of this branch of the coronary artery. H&E stain. C, Higher magnification of B. The tunica intima contains abundant lipid-laden macrophages (arrows). Note the disruption of the endothelium with fibrin on the exposed luminal surface. This condition is highly unstable and is prone to activation of Virchow's triad and the coagulation cascade with the formation of mural thrombi and infarction of myocardium supplied by this artery. The arrowheads identify the internal elastic lamina of the tunica intima. H&E stain. ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B and C courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Arterial Medial Calcification. Arterial medial calcification is a frequent lesion in animals that often have concurrent endocardial mineralization and involves both elastic and muscular arteries. The causes of arterial medial calcification include calcinogenic plant toxicosis, vitamin D toxicosis, renal insufficiency, and severe debilitation, as seen in cattle with Johne's disease (see Fig. 10-53 ). Medial calcification occurs spontaneously in horses, rabbits, aged guinea pigs, and in rats with chronic renal disease. Affected arteries, such as the aorta, have a unique gross appearance; they appear as solid, dense, pipelike structures with raised, white, solid intimal plaques ( Fig. 10-67 ). Microscopically, in elastic arteries, prominent basophilic granular mineral deposits are present on elastic fibers of the media, but in muscular arteries, they can form a complete ring of mineralization in the tunica media ( Fig. 10-68 ). Siderocalcinosis (so-called iron rings), the result of deposition of both iron and calcium salts, occurs in the cerebral arteries of aged horses. Lesions in the surrounding brain tissue are generally absent. Siderocalcinosis lesions are considered incidental. Figure 10-67 Calcification, Vitamin D Toxicosis, Aorta, Rabbit. The aorta is firm and inelastic because of the calcium deposits in the tunica intima and media. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-68 Medial Calcification, Aorta, Cow. Note the layer of mineralization (between arrows) in the middle of the tunica media. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Hyaline Degeneration, Fibrinoid Necrosis, and Amyloidosis. Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis are vascular lesions of small muscular arteries and arterioles and occur in all animal species. These lesions are generally not detected grossly, but in some diseases with fibrinoid necrosis of vessels, hemorrhages and edema are seen in affected organs at necropsy. The microscopic feature shared by these lesions is the formation of a homogeneous eosinophilic zone in the vessel wall ( Fig. 10-69 ; also see Fig. 10-78 ). Special stains allow differentiation into three types: (1) amyloid confirmed by Congo red and methyl violet; (2) fibrinoid deposits, positive by the periodic acid–Schiff technique; and (3) negative staining of hyaline deposits by these stains. Amyloidosis and hyaline degeneration are often observed in small muscular arteries of the myocardium, lungs, and spleen of old dogs. Lesions in the intramyocardial arteries can cause small foci of myocardial infarction. Figure 10-69 Fibrinoid Necrosis of Small Arteries, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. Note the circumferential eosinophilic (arrows) material in the walls of the arterioles and the extensive edema and mild hemorrhage in surrounding submucosa. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid necrosis of arteries is associated with endothelial damage and is characterized by entry and accumulation of serum proteins followed by fibrin polymerization in the vessel wall. These materials form an intensely eosinophilic collar that obliterates cellular detail. This lesion is frequent in many acute degenerative and inflammatory diseases of small arteries and arterioles. Fibrinoid necrosis is seen frequently in dogs with uremia and in dogs with hypertension, although hypertension is an uncommon finding in animals. Vitamin E–Selenium Deficiency. See the discussion on vitamin E–selenium deficiency in the section on Disorders of Pigs . Inflammation Omphalophlebitis ("Navel Ill"). Omphalophlebitis ("navel ill") is inflammation of the umbilical vein that often occurs in neonatal farm animals because of bacterial contamination of the umbilicus immediately after parturition. Bacteria from this site can cause septicemia, suppurative polyarthritis, hepatic abscesses (the umbilical vein drains into the liver), and umbilical abscesses. Jugular Thrombophlebitis. Jugular thrombophlebitis may be associated with indwelling jugular catheters and is reported to be increased with several concurrent disease conditions, such as hypoproteinemia, salmonellosis, endotoxemia, and large intestinal disease (see Fig. 10-27 ). The most common diseases with thrombosis and embolism are listed in Box 10-16 . Box 10-16 Most Common Diseases with Thrombosis and/or Embolism in Animals Pulmonary thromboembolism: Dogs, cats Aortic thromboembolism in cats and dogs with cardiomyopathy: "Saddle" thrombi Aortoiliac thrombosis in horses: Verminous or idiopathic Verminous arteritis in horses: Strongylus vulgaris Septic embolism from lesions of vegetative endocarditis Fibrocartilaginous emboli: Dogs Conditions accompanied by DIC (e.g., hog cholera, ICH, FIP, Gram-negative endotoxemia) Thrombosis of caudal vena cava: Cattle DIC, Disseminated intravascular coagulation; FIP, feline infectious peritonitis; ICH, infectious canine hepatitis. Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Effusions Rupture of the Thoracic Duct. Rupture of the thoracic duct, either as a result of trauma or from spontaneous disruption, causes chylothorax in dogs and cats (see Fig. 9-116). However, many cases of chylothorax occur without injury to the thoracic duct and have been attributed to lesions that interfere with central venous return or produce obstruction of the thoracic duct (right-sided heart failure, neoplasms, granulomas, cranial vena cava thrombosis, or dirofilariasis) or that are idiopathic. Lymphedema. Lymphedema specifically refers to accumulation of fluid in interstitial space secondary to abnormal lymphatic absorption and should be differentiated from other causes of edema, such as hypoproteinemia, vasculitis, and increased hydrostatic pressure. Lymphatic fluid contains a variable amount of protein that may have an osmotic pressure that allows fluid to be drawn into the interstitial compartment from tissues with a lower osmotic gradient (protein concentration). Lymphedema can be divided into six etiologic categories: overload, inadequate collection, abnormal lymphatic contractility, insufficient lymphatic vessels, lymph node obstruction, and structural defects in lymphatic vessels. Primary lymphedema is caused by aplasia, hypoplasia, or dysplasia of lymphatic ducts, vessels, and/or lymph nodes, whereas secondary lymphedema is an acquired defect due to various disease processes (e.g., neoplasia, radiation, parasites). Primary lymphedema is rare in both dogs and cats, but it is more common in dogs. It can be temporary or permanent, and it usually affects the distal extremities, mainly of the hindlimbs. Secondary lymphedema due to lymphatic filariasis in cats is common in tropical countries and is caused by Brugia spp., such as Brugia malayi and Brugia pahangi . Chronic lymphedema, regardless of its etiology, results in secondary fibrosis, which worsens edema and creates a vicious cycle that leads to chronic progressive lymphedema. Disturbances of Growth. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Blood and Lymphatic Vascular Systems . Neoplastic Transformation. Lymphangioma is a rare benign neoplasm composed of lymphatic channels. Lymphangiosarcoma, the malignant counterpart, occurs more often than the benign neoplasm. Vascular spaces formed by neoplastic lymphatic endothelial cells contain lymph rather than blood. Lymphatic vessels are frequently invaded by primary carcinomas and are a common route of metastasis (see the section on Disorders of Dogs ). Inflammation Lymphangitis. Lymphangitis is a feature of many diseases (see Box 10-8 ). The affected vessels are often located in the distal limbs and are thick, cordlike structures ( Fig. 10-70 ). Lymphedema can be present. Nodular suppurative lesions of lymphangitis often ulcerate and discharge pus onto the surface of the skin. In Johne's disease, the mesenteric lymphatic vessels are often prominent because of granulomatous lymphangitis, an extension of the enteric infection producing a granulomatous enteritis and lymphangitis ( Fig. 10-71 ). Figure 10-70 Lymphangitis, Forelimb, Lymphatic Vessels, Horse. Note the multiple swellings (cordlike) of the afferent lymphatic vessels in the skin. These lymphatic vessels lie in the subcutis and empty into the caudal superficial cervical (prescapular) lymph node. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-71 Granulomatous Lymphangitis, Johne's Disease, Mesenteric Lymphatic Vessel, Sheep. The lymphatic is occluded by a fibrinous thrombus secondary to the destruction of the endothelium by inflammatory cells including macrophages. Early proliferating fibrous tissue and extensive edema (E) surround the lymphatic vessel. The adjacent artery (upper right) and vein (V) are unaffected. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Developmental Errors/Congenital Anomalies 2 The complex events involved in the embryologic development of the heart and great vessels allow substantial opportunities for congenital anomalies to develop (see E-Fig. 10-1 ). The functional significance of these anomalies varies widely. Animals with the most extreme defects are unable to survive in utero, and those with the mildest lesions could have no clinical signs of disease during life. However, animals with defects of intermediate severity are most likely to be presented to a veterinarian because of gradually developing signs of cardiac failure, including poor exercise tolerance, cyanosis, and stunted body growth. Ectopia cordis is a congenital development of the heart at an abnormal site outside of the thoracic cavity. In cattle, cases in healthy adult animals have been described in which the heart was located subcutaneously in the caudoventral neck area. The most frequently observed cardiovascular anomalies in domestic animals are listed in Box 10-11 . Box 10-11 Most Common Cardiovascular Anomalies in Domestic Animal Species Horses Ventricular septal defect Patent ductus arteriosus Persistent truncus arteriosus Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) Valvular hematomas Patent foramen ovale Ventricular septal defect Transposition of aorta and pulmonary artery Pigs Endocardial cushion defects Dysplasia of the tricuspid valve Subaortic stenosis Dogs Patent ductus arteriosus Pulmonic stenosis Subaortic stenosis Persistent right aortic arch Ventricular septal defect Cats Endocardial cushion defects Mitral malformation Ventricular septal defect Endocardial fibroelastosis Patent ductus arteriosus The causes of congenital cardiovascular anomalies are varied. Most animal species have a low background frequency of spontaneous cardiac malformations. In many species, especially in dogs, these defects are heritable and can be attributed to either single or multiple gene effects. Under experimental conditions, cardiovascular congenital defects can be elicited by exposure of pregnant dams to various chemicals and drugs, physical agents, toxins, or nutritional deficiencies. Chemical compounds implicated include thalidomide, ethanol, salicylates, griseofulvin, and cortisone. Prenatal exposure to x-irradiation or fetal hypoxia can induce defects. Maternal nutritional deficiencies of vitamin A, pantothenic acid, riboflavin, or zinc and excess intake of vitamin A, retinoic acid, or copper can result in cardiovascular anomalies in newborn animals. Infectious diseases have been incriminated, but not confirmed, in cardiovascular defects; they include bluetongue infections in sheep, bovine virus diarrhea in cattle, and parvoviral infections in dogs and cats. Congenital cardiac malformations may be grouped into four large categories according to their pathophysiology: (1) defects that cause volume overload (with subcategories of systemic to pulmonary shunting [left to right shunt] and valvular regurgitation), (2) defects that cause pressure overload, (3) defects that cause cyanosis, and (4) miscellaneous cardiac and vascular defects. Anomalies in the first category that lead to left to right shunting include patent ductus arteriosus (PDA), ventricular septal defect (VSD), atrial septal defect (ASD), and endocardial cushion defects. In this category, a defect between the right and left cardiac compartments leads to flow of cardiac blood according to a pressure gradient from the left side (systemic circulation, high pressure) to the right side (pulmonic circulation, low pressure). The consequence of blood shunting is overloading of the low-pressured pulmonary circulation, which results in increased volume of blood that enters the left cardiac compartment after returning from the lungs. This in turn leads to eccentric hypertrophy of the left ventricle and atrium to accommodate the increased volume of blood. Anomalies in the first category that lead to valvular regurgitation include mitral and tricuspid dysplasia and aortic and pulmonic insufficiency. The regurgitated blood from the ventricles to the atria leads to progressive atrial dilation and eccentric ventricular dilation. Anomalies in the second category that cause pressure overload include pulmonic and aortic stenosis and coarctation and interruption of the aorta. In these anomalies, ventricular outflow obstructions result in progressive and chronic increase in intraventricular pressure. The increased intraventricular pressure induces concentric ventricular hypertrophy that eventually results in a diastolic failure. Anomalies in the third category that cause cyanotic heart disease include tetralogy of Fallot, pulmonary to systemic (right to left) blood shunting (some VSD and PDA), tricuspid atresia/right ventricular hypoplasia, double-outlet right ventricle, transposition of the great vessels, truncus arteriosus, and aorticopulmonary window (see Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies ). In these anomalies, nonoxygenated blood from the right cardiac compartment flows to the left compartment or bypasses the left compartment and flows directly into the systemic circulation. This portion of nonoxygenated blood mixes and dilutes the oxygenated blood in the systemic circulation and induces cyanosis in multiple tissues. Anomalies in the fourth category include peritoneopericardial diaphragmatic hernias (PPDHs), persistent right aortic arch (PRAA), endocardial fibroelastosis, anomalous pulmonary venous return, double aortic arch, retroesophageal left subclavian artery, valvular hematomas, and situs inversus. Sites of the major cardiovascular anomalies in the dog are shown in Fig. 10-29 . Figure 10-29 Sites of the Major Cardiovascular Anomalies of the Dog. AS, Aortic stenosis; ASD, atrial septal defect; PDA, patent ductus arteriosus; PS, pulmonic stenosis; VSD, ventricular septal defect. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Developmental Errors/Congenital Anomalies: Myocardium See the following section on Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Interventricular Septal Defect. A ventricular septal defect indicates failure of complete development of the interventricular septum and allows the shunting of blood between the ventricles ( Fig. 10-30 ). The defect occurs in many species and more commonly in the upper interventricular septum—below the aortic valves (on the left), proximal to the crista supraventricularis (near the septal tricuspid valve leaflet), or distal to the crista supraventricularis (below the pulmonic valve). Figure 10-30 Ventricular Septal Defect (High Defect), Heart, Opened Left Side, Calf. Note the large opening in the basal portion of the ventricular septum (arrow) immediately below the aortic valve through which the tube has been passed. A, Aorta; LV, left ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Among breeds of dogs, the greatest frequency has been observed in the English bulldog, English springer spaniel, and West Highland white terrier. Atrial Septal Defect. An atrial septal defect could represent the failure of closure of the foramen ovale, which is an interatrial septal shunt that allows blood to bypass the lungs of the fetus, or it can be the result of true septal defects at another site because of faulty development of the interatrial septum. Although this defect occurs in all domestic animal species, dog breeds with greatest frequency of this defect are the boxer, Doberman pinscher, and Samoyed. Tetralogy of Fallot. Tetralogy of Fallot is a complicated cardiac anomaly seen in all animal species with four lesions ( Fig. 10-31 ). The three primary defects are a ventricular septal defect located high in the septum, pulmonic stenosis (see later discussion), and dextroposition of the aorta (see later discussion). The fourth defect, which develops secondarily, is hypertrophy of the right ventricular myocardium. The major pathophysiologic significance in this condition is the increased pressure in the right side that shunts unoxygenated blood from the hypertrophic right side to the underdeveloped left side (systemic circulation) and results in systemic hypoxemia and secondary polycythemia. Cyanosis is often an associated clinical sign. The anomaly is one of the most common cardiac abnormalities seen in hearts of human beings (so-called blue babies). This complex anomaly is inherited in keeshond dogs and is frequent in English bulldogs. In genetic and pathologic studies of keeshond dogs, the basic defect has been determined to be hypoplasia and malpositioning of the conotruncal septum. Wide variability in the severity of the lesions has been observed. The inheritance pattern in keeshonds is a simple autosomal locus with partial penetration in heterozygotes and complete penetrance in homozygotes. Figure 10-31 Tetralogy of Fallot, Heart, Dissected, Dog. Above the large membranous ventricular septal defect is an overlying, straddling aorta (A). There is also severe pulmonic stenosis (arrow) with massive right ventricular hypertrophy. LV, Left ventricle; RV, right ventricle. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Failure of Normal Valvular Development Pulmonic Stenosis. Pulmonic stenosis has been recognized as a frequently occurring anomaly in dogs and is inherited in the beagle ( Fig. 10-32 ). Other breeds in which this lesion is frequent are basset hound, boxer, Chihuahua, Chow Chow, cocker spaniel, English bulldog, Labrador retriever, mastiff, Newfoundland, Samoyed, schnauzer, and terrier. Several types of valvular lesions have been described and include formation of a circumferential band of fibrous or muscular tissue beneath the valve (subvalvular stenosis) or malformation of the valve (valvular stenosis), with a small central orifice in a dome of thickened valvular tissue. A unique form of subvalvular pulmonic stenosis has been described in English bulldogs and boxers in which an anomalous development of a coronary artery obstructs the right ventricular outflow tract. Notable concentric hypertrophy (see the discussion on hypertrophy in the section on Responses to Injury: Myocardium , Disturbances of Growth ) of the right ventricle develops from the resulting pressure overload. Figure 10-32 Pulmonic Stenosis, Heart, Pulmonary Artery, Dog. A, Closed heart, and B, sectioned heart. Note the prominent concentric right ventricular (RV) hypertrophy resulting from pressure overload. The orifice of the pulmonic valve (arrows) is markedly narrowed. C, Sectioned heart, there is poststenotic dilation (D) of the pulmonary artery with irregular intimal thickenings (jet lesions). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) Aortic and Subaortic Stenoses. True stenoses of the aortic valve are uncommon. Subaortic stenosis is a cardiac anomaly frequently observed in pigs and dogs. Subvalvular aortic stenosis is the most common congenital cardiac anomaly of large-breed dogs. Bull terriers and boxers are predisposed, and a genetic basis is present in the Newfoundland dog, in which subvalvular aortic stenosis is inherited in an autosomal dominant pattern. Obstruction of the left ventricular outflow tract (LVOT) results from a raised, partial or complete fibrous ring that arises from the endocardium below the aortic valve and may extend to involve the cranioventral leaflet of the mitral valve and the base of the aortic valve ( Fig. 10-33 ). The lesion is also observed in the German shorthair pointer, golden retriever, Great Dane, Rottweiler, Samoyed, and bull terrier breeds. In clinical cases, the stenosis is produced by the presence of a thick zone of endocardial fibrous tissue that encircles the LVOT below the valve. In mild cases, often subclinical, the lesion is limited to white nodules on the ventricular septum immediately below the valve. Microscopically, the altered endocardial tissue contains loosely arranged elastic fibers, mucopolysaccharide ground substance, and collagen fibers admixed with fibroblasts and chondrocyte-like cells. Other cardiac lesions develop as a result of the altered left ventricular outflow; these include left ventricular concentric hypertrophy, disseminated foci of myocardial necrosis, fibrosis in the inner left ventricular wall, and thickening of the walls of intramyocardial arteries. Figure 10-33 Subaortic Stenosis, Heart, Opened Left Side, Dog. A thick, white, broad band of fibrous connective tissue (arrows) encircles the left ventricular outflow tract below the aortic valve. The force of the blood ejected through the stenotic lesion is responsible for the "jet lesions" in the overlying aorta (A). (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Valvular Dysplasias: Endocardial Cushion Defects. Other valvular developmental anomalies include endocardial cushion defects (persistent AV canal and atrioventricular canal defect) in pigs, sheep, and cats; mitral dysplasia in cats and dogs; and tricuspid dysplasia in cats and dogs ( Fig. 10-34 ). Endocardial cushion defects are the most common congenital cardiac anomaly seen in cats. Figure 10-34 Endocardial Cushion Defect and Tricuspid Dysplasia, Heart, Opened Right Side, Pig. The endocardial cushion defect (prominent opening [arrow] ) can be mistaken as an atrial septal defect but not the location and presence of abnormal valves incorporated in the defect. AS, Atrial septum; VS, ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Tricuspid Valve Dysplasia. Tricuspid valve dysplasia has a genetic basis in the Labrador retriever dog, in which it is an autosomal dominant trait with reduced penetrance that is mapped to chromosome 9. There is a wide spectrum of morphologic abnormalities that may include (1) shortening, rolling, notching, and thickening of leaflets; (2) incomplete separation of valvular components from the ventricular wall; (3) elongation, shortening, fusion, and thickening of chordae tendineae; (4) direct insertion of the valve edges into a papillary muscle; or (5) atrophy, fusion, and malpositioning of the papillary muscles and chordae tendineae. Mitral Valve Dysplasia. Mitral valve dysplasia is often associated with other anomalies, such as ASD/VSD and tricuspid valve dysplasia. A similar spectrum of morphological valvular abnormalities is present in mitral valve dysplasia as described previously for tricuspid valve dysplasia. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular insufficiency lead to volume overload with resultant atrial dilation and to eccentric ventricular hypertrophy. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular stenosis lead to reduced ventricular filling with subsequent low cardiac output (history of syncope, collapse, and hypotension) and increased atrial pressure; in the case of mitral stenosis, increased atrial pressure can lead to pulmonary edema initially and dilation of the right ventricle (right-sided heart failure) from prolonged pulmonary hypertension. Developmental Errors/Congenital Anomalies: Pericardium and Epicardium Peritoneopericardial Diaphragmatic Hernias. Peritoneopericardial diaphragmatic hernias (PPDHs) occur in cats and dogs with incomplete development of the diaphragm. PPDHs are rare, but they are the most common congenital pericardial anomaly in cats; Persian and domestic longhair cats were overrepresented in two studies. PPDHs result from defective separation of the developing liver and septum transversum during embryogenesis that allows the peritoneal and pericardial cavities to communicate. Hence, abdominal organs including omental fat may fill the pericardial sac and compress the heart. Parts of the liver are often incarcerated in the pericardial sac and may develop intrahepatic myelolipomas. Partial/Complete Absence (Agenesis) of the Pericardial Sac. Partial or complete absence of the pericardial sac is an incidental lesion that is rarely found during necropsy and has not been reported to have clinical significance during life. However, there is one report of a dog with a partial tear in the pericardium that was associated with episodes of syncope. Intrapericardial Cysts. Benign intrapericardial cysts are rare, large fluid-filled masses within the pericardial space that originate from the pericardium and consist of encapsulated and hemorrhagic adipose tissue that possibly originated from congenital entrapment of the omentum or falciform ligament. In other cases, these rare lesions are associated with PPDH. Developmental Errors/Congenital Anomalies: Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Portacaval Shunts. Portacaval shunts occur in animals, particularly in the dog. The normal flow from the portal vein is diverted, either partially or completely, to the systemic circulation, thus bypassing the liver ( Fig. 10-35 ). Normal hepatic detoxification of portal flow is incomplete and may result in neurologic signs and elevated circulating bile acids. The resulting nervous system syndrome is termed hepatic encephalopathy. Specifically, the shunts represent retained fetal vascular structures, as in persistent ductus venosus, or arise from prominent dilation of various portosystemic shunts that normally are quite small vessels. See Chapter 8 on diseases of the liver for further details. Figure 10-35 Portacaval Shunt, Dog. Note that the branch of the portal vein (arrowhead 1) passes under the caudal vena cava (arrow) and anastomoses with the azygous vein (arrowhead 2). The azygous vein returns the blood to the caudal vena cava near the heart and thus this blood and its ammoniacal and protein metabolites are shunted away from processing to blood urea nitrogen (BUN) in the liver. The liver is normal color but extremely small, which is typical of these types of shunts (see Chapter 8). (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Tetralogy of Fallot. See Disorders of Domestic Animals; Developmental Errors/Congenital Anomalies; Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves, Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts, Tetralogy of Fallot . Patent Ductus Arteriosus. Patent ductus arteriosus is a frequent anomaly in poodle, collie, Pomeranian, Chihuahua, cocker spaniel, English springer spaniel, German shepherd, keeshond, Maltese, Yorkshire terrier, bichon frise, and Shetland sheepdog breeds ( Fig. 10-36 ). In poodles, it is an inherited polygenic trait. Female dogs have a greater incidence. The ductus arteriosus is a fetal communication between the aorta and pulmonary artery that serves to divert blood from the right cardiac chamber to the fetal circulation in order to bypass the collapsed fetal lungs. Following parturition, the smooth muscle in the ductus arteriosus contracts, which results in its occlusion within 7 to 10 days after birth in the dog. When this mechanism fails, the ductus arteriosus remains patent and allows for a portion of the blood from the left cardiac chamber to flow from the aorta into the pulmonary artery and results in overcirculation to the lungs, leading to pulmonary hypertension and increased preload to the left ventricle. Grossly, patent ductus arteriosus is a dilated funnel-shaped communication between the descending aorta and the main pulmonary artery. This vascular channel between the pulmonary artery and aorta allows blood to bypass the lungs during fetal life. Normally, the ductus arteriosus is converted to the solid ligamentum arteriosum postnatally. Figure 10-36 Patent Ductus Arteriosus, Heart, Young Dog. Note the prominent ductus arteriosus (arrow) between the pulmonary artery (PA) and the aorta (A) in the undissected (left) and dissected vessels (right). (Courtesy Dr. D.D. Harrington, School of Veterinary Medicine, Purdue University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Malpositioning of Great Vessels Persistent Right Aortic Arch. Persistent right aortic arch occurs in dogs; German shepherd, Irish setter, and Great Dane dogs are predisposed ( Fig. 10-37 ). This defect arises because the right fourth aortic arch, rather than the normal left fourth aortic arch, develops and ascends on the right side of the midline so that the ligamentum arteriosum forms a vascular ring over the esophagus and trachea. This arrangement eventually results in esophageal obstruction and proximal dilation (megaesophagus), which often results in aspiration pneumonia as the animal matures and consumes solid feed. Figure 10-37 Persistent Right Aortic Arch, Ligamentum Arteriosum, Megaesophagus, Calf. During embryogenesis, the aorta was formed from the right aortic arch instead of the left one; thus the aorta is now on the right. For the ligamentum arteriosum (arrow) to connect the aorta with the pulmonary artery, it has to pass dorsally over the esophagus and trachea. The ligamentum, together with the aorta and pulmonary artery, form a vascular ring that constricts the esophagus (E), which is dilated cranial to the constriction. (Courtesy Dr. S. Snyder, College of Veterinary Medicine, Colorado State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Transposition of the Aorta and Pulmonary Artery. Transposition of the aorta and pulmonary artery are severe anomalies, of which there are several types. In complete transposition, the aorta serves as the outflow from the right ventricle and the pulmonary artery is the left ventricle primary outflow. Other congenital anomalies, including ventricular septal defect, often accompany this anomaly. Truncus Arteriosus. In this lesion, there is a large VSD that allows blood flow between the ventricles and a single large vessel that originates above the VSD. Hypoxemia and cyanosis develop, depending on the amount of mixture of nonoxygenated and oxygenated blood. Lymphatic Vessels Lymphangiectasia. Lymphangiectasia is dilation of lymphatic vessels. The cause may be a congenital anomaly ( Fig. 10-38 ) or obstruction of lymph drainage by invading masses of malignant neoplasms or inflammation ( Fig. 10-39 ). Figure 10-38 Congenital Lymphangiectasia, Epicardium, Young Horse. Note the tortuous appearance of the epicardial lymphatic vessel (arrow). In congenital lymphangiectasia, lymphatic vessels fail to make connections with other vessels or are obstructed because of anomalous development. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-39 Acquired Lymphangiectasia, Lymphoma (Lymphosarcoma), Mesocolon, Horse. Note the distended lymphatic vessels on the serosal surface of the large colon, the result of impeded lymph flow through the colic lymph nodes, caused by compression of their cortical and medullary sinuses by proliferating neoplastic lymphocytes. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hereditary Lymphedema. Hereditary lymphedema has been described in dogs, Ayrshire and Angus calves, and pigs. Affected animals have prominent subcutaneous edema that, in calves, often causes severe swelling of the tips of the ears. Interference with lymph drainage results from defective development of the lymphatic vessels that are aplastic or hypoplastic. Horses Ventricular septal defect Patent ductus arteriosus Persistent truncus arteriosus Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) Valvular hematomas Patent foramen ovale Ventricular septal defect Transposition of aorta and pulmonary artery Pigs Endocardial cushion defects Dysplasia of the tricuspid valve Subaortic stenosis Dogs Patent ductus arteriosus Pulmonic stenosis Subaortic stenosis Persistent right aortic arch Ventricular septal defect Cats Endocardial cushion defects Mitral malformation Ventricular septal defect Endocardial fibroelastosis Patent ductus arteriosus Developmental Errors/Congenital Anomalies: Myocardium See the following section on Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Interventricular Septal Defect. A ventricular septal defect indicates failure of complete development of the interventricular septum and allows the shunting of blood between the ventricles ( Fig. 10-30 ). The defect occurs in many species and more commonly in the upper interventricular septum—below the aortic valves (on the left), proximal to the crista supraventricularis (near the septal tricuspid valve leaflet), or distal to the crista supraventricularis (below the pulmonic valve). Figure 10-30 Ventricular Septal Defect (High Defect), Heart, Opened Left Side, Calf. Note the large opening in the basal portion of the ventricular septum (arrow) immediately below the aortic valve through which the tube has been passed. A, Aorta; LV, left ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Among breeds of dogs, the greatest frequency has been observed in the English bulldog, English springer spaniel, and West Highland white terrier. Atrial Septal Defect. An atrial septal defect could represent the failure of closure of the foramen ovale, which is an interatrial septal shunt that allows blood to bypass the lungs of the fetus, or it can be the result of true septal defects at another site because of faulty development of the interatrial septum. Although this defect occurs in all domestic animal species, dog breeds with greatest frequency of this defect are the boxer, Doberman pinscher, and Samoyed. Tetralogy of Fallot. Tetralogy of Fallot is a complicated cardiac anomaly seen in all animal species with four lesions ( Fig. 10-31 ). The three primary defects are a ventricular septal defect located high in the septum, pulmonic stenosis (see later discussion), and dextroposition of the aorta (see later discussion). The fourth defect, which develops secondarily, is hypertrophy of the right ventricular myocardium. The major pathophysiologic significance in this condition is the increased pressure in the right side that shunts unoxygenated blood from the hypertrophic right side to the underdeveloped left side (systemic circulation) and results in systemic hypoxemia and secondary polycythemia. Cyanosis is often an associated clinical sign. The anomaly is one of the most common cardiac abnormalities seen in hearts of human beings (so-called blue babies). This complex anomaly is inherited in keeshond dogs and is frequent in English bulldogs. In genetic and pathologic studies of keeshond dogs, the basic defect has been determined to be hypoplasia and malpositioning of the conotruncal septum. Wide variability in the severity of the lesions has been observed. The inheritance pattern in keeshonds is a simple autosomal locus with partial penetration in heterozygotes and complete penetrance in homozygotes. Figure 10-31 Tetralogy of Fallot, Heart, Dissected, Dog. Above the large membranous ventricular septal defect is an overlying, straddling aorta (A). There is also severe pulmonic stenosis (arrow) with massive right ventricular hypertrophy. LV, Left ventricle; RV, right ventricle. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Failure of Normal Valvular Development Pulmonic Stenosis. Pulmonic stenosis has been recognized as a frequently occurring anomaly in dogs and is inherited in the beagle ( Fig. 10-32 ). Other breeds in which this lesion is frequent are basset hound, boxer, Chihuahua, Chow Chow, cocker spaniel, English bulldog, Labrador retriever, mastiff, Newfoundland, Samoyed, schnauzer, and terrier. Several types of valvular lesions have been described and include formation of a circumferential band of fibrous or muscular tissue beneath the valve (subvalvular stenosis) or malformation of the valve (valvular stenosis), with a small central orifice in a dome of thickened valvular tissue. A unique form of subvalvular pulmonic stenosis has been described in English bulldogs and boxers in which an anomalous development of a coronary artery obstructs the right ventricular outflow tract. Notable concentric hypertrophy (see the discussion on hypertrophy in the section on Responses to Injury: Myocardium , Disturbances of Growth ) of the right ventricle develops from the resulting pressure overload. Figure 10-32 Pulmonic Stenosis, Heart, Pulmonary Artery, Dog. A, Closed heart, and B, sectioned heart. Note the prominent concentric right ventricular (RV) hypertrophy resulting from pressure overload. The orifice of the pulmonic valve (arrows) is markedly narrowed. C, Sectioned heart, there is poststenotic dilation (D) of the pulmonary artery with irregular intimal thickenings (jet lesions). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) Aortic and Subaortic Stenoses. True stenoses of the aortic valve are uncommon. Subaortic stenosis is a cardiac anomaly frequently observed in pigs and dogs. Subvalvular aortic stenosis is the most common congenital cardiac anomaly of large-breed dogs. Bull terriers and boxers are predisposed, and a genetic basis is present in the Newfoundland dog, in which subvalvular aortic stenosis is inherited in an autosomal dominant pattern. Obstruction of the left ventricular outflow tract (LVOT) results from a raised, partial or complete fibrous ring that arises from the endocardium below the aortic valve and may extend to involve the cranioventral leaflet of the mitral valve and the base of the aortic valve ( Fig. 10-33 ). The lesion is also observed in the German shorthair pointer, golden retriever, Great Dane, Rottweiler, Samoyed, and bull terrier breeds. In clinical cases, the stenosis is produced by the presence of a thick zone of endocardial fibrous tissue that encircles the LVOT below the valve. In mild cases, often subclinical, the lesion is limited to white nodules on the ventricular septum immediately below the valve. Microscopically, the altered endocardial tissue contains loosely arranged elastic fibers, mucopolysaccharide ground substance, and collagen fibers admixed with fibroblasts and chondrocyte-like cells. Other cardiac lesions develop as a result of the altered left ventricular outflow; these include left ventricular concentric hypertrophy, disseminated foci of myocardial necrosis, fibrosis in the inner left ventricular wall, and thickening of the walls of intramyocardial arteries. Figure 10-33 Subaortic Stenosis, Heart, Opened Left Side, Dog. A thick, white, broad band of fibrous connective tissue (arrows) encircles the left ventricular outflow tract below the aortic valve. The force of the blood ejected through the stenotic lesion is responsible for the "jet lesions" in the overlying aorta (A). (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Valvular Dysplasias: Endocardial Cushion Defects. Other valvular developmental anomalies include endocardial cushion defects (persistent AV canal and atrioventricular canal defect) in pigs, sheep, and cats; mitral dysplasia in cats and dogs; and tricuspid dysplasia in cats and dogs ( Fig. 10-34 ). Endocardial cushion defects are the most common congenital cardiac anomaly seen in cats. Figure 10-34 Endocardial Cushion Defect and Tricuspid Dysplasia, Heart, Opened Right Side, Pig. The endocardial cushion defect (prominent opening [arrow] ) can be mistaken as an atrial septal defect but not the location and presence of abnormal valves incorporated in the defect. AS, Atrial septum; VS, ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Tricuspid Valve Dysplasia. Tricuspid valve dysplasia has a genetic basis in the Labrador retriever dog, in which it is an autosomal dominant trait with reduced penetrance that is mapped to chromosome 9. There is a wide spectrum of morphologic abnormalities that may include (1) shortening, rolling, notching, and thickening of leaflets; (2) incomplete separation of valvular components from the ventricular wall; (3) elongation, shortening, fusion, and thickening of chordae tendineae; (4) direct insertion of the valve edges into a papillary muscle; or (5) atrophy, fusion, and malpositioning of the papillary muscles and chordae tendineae. Mitral Valve Dysplasia. Mitral valve dysplasia is often associated with other anomalies, such as ASD/VSD and tricuspid valve dysplasia. A similar spectrum of morphological valvular abnormalities is present in mitral valve dysplasia as described previously for tricuspid valve dysplasia. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular insufficiency lead to volume overload with resultant atrial dilation and to eccentric ventricular hypertrophy. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular stenosis lead to reduced ventricular filling with subsequent low cardiac output (history of syncope, collapse, and hypotension) and increased atrial pressure; in the case of mitral stenosis, increased atrial pressure can lead to pulmonary edema initially and dilation of the right ventricle (right-sided heart failure) from prolonged pulmonary hypertension. Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Interventricular Septal Defect. A ventricular septal defect indicates failure of complete development of the interventricular septum and allows the shunting of blood between the ventricles ( Fig. 10-30 ). The defect occurs in many species and more commonly in the upper interventricular septum—below the aortic valves (on the left), proximal to the crista supraventricularis (near the septal tricuspid valve leaflet), or distal to the crista supraventricularis (below the pulmonic valve). Figure 10-30 Ventricular Septal Defect (High Defect), Heart, Opened Left Side, Calf. Note the large opening in the basal portion of the ventricular septum (arrow) immediately below the aortic valve through which the tube has been passed. A, Aorta; LV, left ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Among breeds of dogs, the greatest frequency has been observed in the English bulldog, English springer spaniel, and West Highland white terrier. Atrial Septal Defect. An atrial septal defect could represent the failure of closure of the foramen ovale, which is an interatrial septal shunt that allows blood to bypass the lungs of the fetus, or it can be the result of true septal defects at another site because of faulty development of the interatrial septum. Although this defect occurs in all domestic animal species, dog breeds with greatest frequency of this defect are the boxer, Doberman pinscher, and Samoyed. Tetralogy of Fallot. Tetralogy of Fallot is a complicated cardiac anomaly seen in all animal species with four lesions ( Fig. 10-31 ). The three primary defects are a ventricular septal defect located high in the septum, pulmonic stenosis (see later discussion), and dextroposition of the aorta (see later discussion). The fourth defect, which develops secondarily, is hypertrophy of the right ventricular myocardium. The major pathophysiologic significance in this condition is the increased pressure in the right side that shunts unoxygenated blood from the hypertrophic right side to the underdeveloped left side (systemic circulation) and results in systemic hypoxemia and secondary polycythemia. Cyanosis is often an associated clinical sign. The anomaly is one of the most common cardiac abnormalities seen in hearts of human beings (so-called blue babies). This complex anomaly is inherited in keeshond dogs and is frequent in English bulldogs. In genetic and pathologic studies of keeshond dogs, the basic defect has been determined to be hypoplasia and malpositioning of the conotruncal septum. Wide variability in the severity of the lesions has been observed. The inheritance pattern in keeshonds is a simple autosomal locus with partial penetration in heterozygotes and complete penetrance in homozygotes. Figure 10-31 Tetralogy of Fallot, Heart, Dissected, Dog. Above the large membranous ventricular septal defect is an overlying, straddling aorta (A). There is also severe pulmonic stenosis (arrow) with massive right ventricular hypertrophy. LV, Left ventricle; RV, right ventricle. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Interventricular Septal Defect. A ventricular septal defect indicates failure of complete development of the interventricular septum and allows the shunting of blood between the ventricles ( Fig. 10-30 ). The defect occurs in many species and more commonly in the upper interventricular septum—below the aortic valves (on the left), proximal to the crista supraventricularis (near the septal tricuspid valve leaflet), or distal to the crista supraventricularis (below the pulmonic valve). Figure 10-30 Ventricular Septal Defect (High Defect), Heart, Opened Left Side, Calf. Note the large opening in the basal portion of the ventricular septum (arrow) immediately below the aortic valve through which the tube has been passed. A, Aorta; LV, left ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Among breeds of dogs, the greatest frequency has been observed in the English bulldog, English springer spaniel, and West Highland white terrier. Atrial Septal Defect. An atrial septal defect could represent the failure of closure of the foramen ovale, which is an interatrial septal shunt that allows blood to bypass the lungs of the fetus, or it can be the result of true septal defects at another site because of faulty development of the interatrial septum. Although this defect occurs in all domestic animal species, dog breeds with greatest frequency of this defect are the boxer, Doberman pinscher, and Samoyed. Tetralogy of Fallot. Tetralogy of Fallot is a complicated cardiac anomaly seen in all animal species with four lesions ( Fig. 10-31 ). The three primary defects are a ventricular septal defect located high in the septum, pulmonic stenosis (see later discussion), and dextroposition of the aorta (see later discussion). The fourth defect, which develops secondarily, is hypertrophy of the right ventricular myocardium. The major pathophysiologic significance in this condition is the increased pressure in the right side that shunts unoxygenated blood from the hypertrophic right side to the underdeveloped left side (systemic circulation) and results in systemic hypoxemia and secondary polycythemia. Cyanosis is often an associated clinical sign. The anomaly is one of the most common cardiac abnormalities seen in hearts of human beings (so-called blue babies). This complex anomaly is inherited in keeshond dogs and is frequent in English bulldogs. In genetic and pathologic studies of keeshond dogs, the basic defect has been determined to be hypoplasia and malpositioning of the conotruncal septum. Wide variability in the severity of the lesions has been observed. The inheritance pattern in keeshonds is a simple autosomal locus with partial penetration in heterozygotes and complete penetrance in homozygotes. Figure 10-31 Tetralogy of Fallot, Heart, Dissected, Dog. Above the large membranous ventricular septal defect is an overlying, straddling aorta (A). There is also severe pulmonic stenosis (arrow) with massive right ventricular hypertrophy. LV, Left ventricle; RV, right ventricle. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Failure of Normal Valvular Development Pulmonic Stenosis. Pulmonic stenosis has been recognized as a frequently occurring anomaly in dogs and is inherited in the beagle ( Fig. 10-32 ). Other breeds in which this lesion is frequent are basset hound, boxer, Chihuahua, Chow Chow, cocker spaniel, English bulldog, Labrador retriever, mastiff, Newfoundland, Samoyed, schnauzer, and terrier. Several types of valvular lesions have been described and include formation of a circumferential band of fibrous or muscular tissue beneath the valve (subvalvular stenosis) or malformation of the valve (valvular stenosis), with a small central orifice in a dome of thickened valvular tissue. A unique form of subvalvular pulmonic stenosis has been described in English bulldogs and boxers in which an anomalous development of a coronary artery obstructs the right ventricular outflow tract. Notable concentric hypertrophy (see the discussion on hypertrophy in the section on Responses to Injury: Myocardium , Disturbances of Growth ) of the right ventricle develops from the resulting pressure overload. Figure 10-32 Pulmonic Stenosis, Heart, Pulmonary Artery, Dog. A, Closed heart, and B, sectioned heart. Note the prominent concentric right ventricular (RV) hypertrophy resulting from pressure overload. The orifice of the pulmonic valve (arrows) is markedly narrowed. C, Sectioned heart, there is poststenotic dilation (D) of the pulmonary artery with irregular intimal thickenings (jet lesions). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) Aortic and Subaortic Stenoses. True stenoses of the aortic valve are uncommon. Subaortic stenosis is a cardiac anomaly frequently observed in pigs and dogs. Subvalvular aortic stenosis is the most common congenital cardiac anomaly of large-breed dogs. Bull terriers and boxers are predisposed, and a genetic basis is present in the Newfoundland dog, in which subvalvular aortic stenosis is inherited in an autosomal dominant pattern. Obstruction of the left ventricular outflow tract (LVOT) results from a raised, partial or complete fibrous ring that arises from the endocardium below the aortic valve and may extend to involve the cranioventral leaflet of the mitral valve and the base of the aortic valve ( Fig. 10-33 ). The lesion is also observed in the German shorthair pointer, golden retriever, Great Dane, Rottweiler, Samoyed, and bull terrier breeds. In clinical cases, the stenosis is produced by the presence of a thick zone of endocardial fibrous tissue that encircles the LVOT below the valve. In mild cases, often subclinical, the lesion is limited to white nodules on the ventricular septum immediately below the valve. Microscopically, the altered endocardial tissue contains loosely arranged elastic fibers, mucopolysaccharide ground substance, and collagen fibers admixed with fibroblasts and chondrocyte-like cells. Other cardiac lesions develop as a result of the altered left ventricular outflow; these include left ventricular concentric hypertrophy, disseminated foci of myocardial necrosis, fibrosis in the inner left ventricular wall, and thickening of the walls of intramyocardial arteries. Figure 10-33 Subaortic Stenosis, Heart, Opened Left Side, Dog. A thick, white, broad band of fibrous connective tissue (arrows) encircles the left ventricular outflow tract below the aortic valve. The force of the blood ejected through the stenotic lesion is responsible for the "jet lesions" in the overlying aorta (A). (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Valvular Dysplasias: Endocardial Cushion Defects. Other valvular developmental anomalies include endocardial cushion defects (persistent AV canal and atrioventricular canal defect) in pigs, sheep, and cats; mitral dysplasia in cats and dogs; and tricuspid dysplasia in cats and dogs ( Fig. 10-34 ). Endocardial cushion defects are the most common congenital cardiac anomaly seen in cats. Figure 10-34 Endocardial Cushion Defect and Tricuspid Dysplasia, Heart, Opened Right Side, Pig. The endocardial cushion defect (prominent opening [arrow] ) can be mistaken as an atrial septal defect but not the location and presence of abnormal valves incorporated in the defect. AS, Atrial septum; VS, ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Tricuspid Valve Dysplasia. Tricuspid valve dysplasia has a genetic basis in the Labrador retriever dog, in which it is an autosomal dominant trait with reduced penetrance that is mapped to chromosome 9. There is a wide spectrum of morphologic abnormalities that may include (1) shortening, rolling, notching, and thickening of leaflets; (2) incomplete separation of valvular components from the ventricular wall; (3) elongation, shortening, fusion, and thickening of chordae tendineae; (4) direct insertion of the valve edges into a papillary muscle; or (5) atrophy, fusion, and malpositioning of the papillary muscles and chordae tendineae. Mitral Valve Dysplasia. Mitral valve dysplasia is often associated with other anomalies, such as ASD/VSD and tricuspid valve dysplasia. A similar spectrum of morphological valvular abnormalities is present in mitral valve dysplasia as described previously for tricuspid valve dysplasia. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular insufficiency lead to volume overload with resultant atrial dilation and to eccentric ventricular hypertrophy. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular stenosis lead to reduced ventricular filling with subsequent low cardiac output (history of syncope, collapse, and hypotension) and increased atrial pressure; in the case of mitral stenosis, increased atrial pressure can lead to pulmonary edema initially and dilation of the right ventricle (right-sided heart failure) from prolonged pulmonary hypertension. Pulmonic Stenosis. Pulmonic stenosis has been recognized as a frequently occurring anomaly in dogs and is inherited in the beagle ( Fig. 10-32 ). Other breeds in which this lesion is frequent are basset hound, boxer, Chihuahua, Chow Chow, cocker spaniel, English bulldog, Labrador retriever, mastiff, Newfoundland, Samoyed, schnauzer, and terrier. Several types of valvular lesions have been described and include formation of a circumferential band of fibrous or muscular tissue beneath the valve (subvalvular stenosis) or malformation of the valve (valvular stenosis), with a small central orifice in a dome of thickened valvular tissue. A unique form of subvalvular pulmonic stenosis has been described in English bulldogs and boxers in which an anomalous development of a coronary artery obstructs the right ventricular outflow tract. Notable concentric hypertrophy (see the discussion on hypertrophy in the section on Responses to Injury: Myocardium , Disturbances of Growth ) of the right ventricle develops from the resulting pressure overload. Figure 10-32 Pulmonic Stenosis, Heart, Pulmonary Artery, Dog. A, Closed heart, and B, sectioned heart. Note the prominent concentric right ventricular (RV) hypertrophy resulting from pressure overload. The orifice of the pulmonic valve (arrows) is markedly narrowed. C, Sectioned heart, there is poststenotic dilation (D) of the pulmonary artery with irregular intimal thickenings (jet lesions). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) Aortic and Subaortic Stenoses. True stenoses of the aortic valve are uncommon. Subaortic stenosis is a cardiac anomaly frequently observed in pigs and dogs. Subvalvular aortic stenosis is the most common congenital cardiac anomaly of large-breed dogs. Bull terriers and boxers are predisposed, and a genetic basis is present in the Newfoundland dog, in which subvalvular aortic stenosis is inherited in an autosomal dominant pattern. Obstruction of the left ventricular outflow tract (LVOT) results from a raised, partial or complete fibrous ring that arises from the endocardium below the aortic valve and may extend to involve the cranioventral leaflet of the mitral valve and the base of the aortic valve ( Fig. 10-33 ). The lesion is also observed in the German shorthair pointer, golden retriever, Great Dane, Rottweiler, Samoyed, and bull terrier breeds. In clinical cases, the stenosis is produced by the presence of a thick zone of endocardial fibrous tissue that encircles the LVOT below the valve. In mild cases, often subclinical, the lesion is limited to white nodules on the ventricular septum immediately below the valve. Microscopically, the altered endocardial tissue contains loosely arranged elastic fibers, mucopolysaccharide ground substance, and collagen fibers admixed with fibroblasts and chondrocyte-like cells. Other cardiac lesions develop as a result of the altered left ventricular outflow; these include left ventricular concentric hypertrophy, disseminated foci of myocardial necrosis, fibrosis in the inner left ventricular wall, and thickening of the walls of intramyocardial arteries. Figure 10-33 Subaortic Stenosis, Heart, Opened Left Side, Dog. A thick, white, broad band of fibrous connective tissue (arrows) encircles the left ventricular outflow tract below the aortic valve. The force of the blood ejected through the stenotic lesion is responsible for the "jet lesions" in the overlying aorta (A). (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Valvular Dysplasias: Endocardial Cushion Defects. Other valvular developmental anomalies include endocardial cushion defects (persistent AV canal and atrioventricular canal defect) in pigs, sheep, and cats; mitral dysplasia in cats and dogs; and tricuspid dysplasia in cats and dogs ( Fig. 10-34 ). Endocardial cushion defects are the most common congenital cardiac anomaly seen in cats. Figure 10-34 Endocardial Cushion Defect and Tricuspid Dysplasia, Heart, Opened Right Side, Pig. The endocardial cushion defect (prominent opening [arrow] ) can be mistaken as an atrial septal defect but not the location and presence of abnormal valves incorporated in the defect. AS, Atrial septum; VS, ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Tricuspid Valve Dysplasia. Tricuspid valve dysplasia has a genetic basis in the Labrador retriever dog, in which it is an autosomal dominant trait with reduced penetrance that is mapped to chromosome 9. There is a wide spectrum of morphologic abnormalities that may include (1) shortening, rolling, notching, and thickening of leaflets; (2) incomplete separation of valvular components from the ventricular wall; (3) elongation, shortening, fusion, and thickening of chordae tendineae; (4) direct insertion of the valve edges into a papillary muscle; or (5) atrophy, fusion, and malpositioning of the papillary muscles and chordae tendineae. Mitral Valve Dysplasia. Mitral valve dysplasia is often associated with other anomalies, such as ASD/VSD and tricuspid valve dysplasia. A similar spectrum of morphological valvular abnormalities is present in mitral valve dysplasia as described previously for tricuspid valve dysplasia. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular insufficiency lead to volume overload with resultant atrial dilation and to eccentric ventricular hypertrophy. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular stenosis lead to reduced ventricular filling with subsequent low cardiac output (history of syncope, collapse, and hypotension) and increased atrial pressure; in the case of mitral stenosis, increased atrial pressure can lead to pulmonary edema initially and dilation of the right ventricle (right-sided heart failure) from prolonged pulmonary hypertension. Tricuspid Valve Dysplasia. Tricuspid valve dysplasia has a genetic basis in the Labrador retriever dog, in which it is an autosomal dominant trait with reduced penetrance that is mapped to chromosome 9. There is a wide spectrum of morphologic abnormalities that may include (1) shortening, rolling, notching, and thickening of leaflets; (2) incomplete separation of valvular components from the ventricular wall; (3) elongation, shortening, fusion, and thickening of chordae tendineae; (4) direct insertion of the valve edges into a papillary muscle; or (5) atrophy, fusion, and malpositioning of the papillary muscles and chordae tendineae. Mitral Valve Dysplasia. Mitral valve dysplasia is often associated with other anomalies, such as ASD/VSD and tricuspid valve dysplasia. A similar spectrum of morphological valvular abnormalities is present in mitral valve dysplasia as described previously for tricuspid valve dysplasia. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular insufficiency lead to volume overload with resultant atrial dilation and to eccentric ventricular hypertrophy. Dysplastic malformations in the atrioventricular valves that result in valvular stenosis lead to reduced ventricular filling with subsequent low cardiac output (history of syncope, collapse, and hypotension) and increased atrial pressure; in the case of mitral stenosis, increased atrial pressure can lead to pulmonary edema initially and dilation of the right ventricle (right-sided heart failure) from prolonged pulmonary hypertension. Developmental Errors/Congenital Anomalies: Pericardium and Epicardium Peritoneopericardial Diaphragmatic Hernias. Peritoneopericardial diaphragmatic hernias (PPDHs) occur in cats and dogs with incomplete development of the diaphragm. PPDHs are rare, but they are the most common congenital pericardial anomaly in cats; Persian and domestic longhair cats were overrepresented in two studies. PPDHs result from defective separation of the developing liver and septum transversum during embryogenesis that allows the peritoneal and pericardial cavities to communicate. Hence, abdominal organs including omental fat may fill the pericardial sac and compress the heart. Parts of the liver are often incarcerated in the pericardial sac and may develop intrahepatic myelolipomas. Partial/Complete Absence (Agenesis) of the Pericardial Sac. Partial or complete absence of the pericardial sac is an incidental lesion that is rarely found during necropsy and has not been reported to have clinical significance during life. However, there is one report of a dog with a partial tear in the pericardium that was associated with episodes of syncope. Intrapericardial Cysts. Benign intrapericardial cysts are rare, large fluid-filled masses within the pericardial space that originate from the pericardium and consist of encapsulated and hemorrhagic adipose tissue that possibly originated from congenital entrapment of the omentum or falciform ligament. In other cases, these rare lesions are associated with PPDH. Peritoneopericardial Diaphragmatic Hernias. Peritoneopericardial diaphragmatic hernias (PPDHs) occur in cats and dogs with incomplete development of the diaphragm. PPDHs are rare, but they are the most common congenital pericardial anomaly in cats; Persian and domestic longhair cats were overrepresented in two studies. PPDHs result from defective separation of the developing liver and septum transversum during embryogenesis that allows the peritoneal and pericardial cavities to communicate. Hence, abdominal organs including omental fat may fill the pericardial sac and compress the heart. Parts of the liver are often incarcerated in the pericardial sac and may develop intrahepatic myelolipomas. Partial/Complete Absence (Agenesis) of the Pericardial Sac. Partial or complete absence of the pericardial sac is an incidental lesion that is rarely found during necropsy and has not been reported to have clinical significance during life. However, there is one report of a dog with a partial tear in the pericardium that was associated with episodes of syncope. Intrapericardial Cysts. Benign intrapericardial cysts are rare, large fluid-filled masses within the pericardial space that originate from the pericardium and consist of encapsulated and hemorrhagic adipose tissue that possibly originated from congenital entrapment of the omentum or falciform ligament. In other cases, these rare lesions are associated with PPDH. Developmental Errors/Congenital Anomalies: Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Portacaval Shunts. Portacaval shunts occur in animals, particularly in the dog. The normal flow from the portal vein is diverted, either partially or completely, to the systemic circulation, thus bypassing the liver ( Fig. 10-35 ). Normal hepatic detoxification of portal flow is incomplete and may result in neurologic signs and elevated circulating bile acids. The resulting nervous system syndrome is termed hepatic encephalopathy. Specifically, the shunts represent retained fetal vascular structures, as in persistent ductus venosus, or arise from prominent dilation of various portosystemic shunts that normally are quite small vessels. See Chapter 8 on diseases of the liver for further details. Figure 10-35 Portacaval Shunt, Dog. Note that the branch of the portal vein (arrowhead 1) passes under the caudal vena cava (arrow) and anastomoses with the azygous vein (arrowhead 2). The azygous vein returns the blood to the caudal vena cava near the heart and thus this blood and its ammoniacal and protein metabolites are shunted away from processing to blood urea nitrogen (BUN) in the liver. The liver is normal color but extremely small, which is typical of these types of shunts (see Chapter 8). (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Tetralogy of Fallot. See Disorders of Domestic Animals; Developmental Errors/Congenital Anomalies; Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves, Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts, Tetralogy of Fallot . Patent Ductus Arteriosus. Patent ductus arteriosus is a frequent anomaly in poodle, collie, Pomeranian, Chihuahua, cocker spaniel, English springer spaniel, German shepherd, keeshond, Maltese, Yorkshire terrier, bichon frise, and Shetland sheepdog breeds ( Fig. 10-36 ). In poodles, it is an inherited polygenic trait. Female dogs have a greater incidence. The ductus arteriosus is a fetal communication between the aorta and pulmonary artery that serves to divert blood from the right cardiac chamber to the fetal circulation in order to bypass the collapsed fetal lungs. Following parturition, the smooth muscle in the ductus arteriosus contracts, which results in its occlusion within 7 to 10 days after birth in the dog. When this mechanism fails, the ductus arteriosus remains patent and allows for a portion of the blood from the left cardiac chamber to flow from the aorta into the pulmonary artery and results in overcirculation to the lungs, leading to pulmonary hypertension and increased preload to the left ventricle. Grossly, patent ductus arteriosus is a dilated funnel-shaped communication between the descending aorta and the main pulmonary artery. This vascular channel between the pulmonary artery and aorta allows blood to bypass the lungs during fetal life. Normally, the ductus arteriosus is converted to the solid ligamentum arteriosum postnatally. Figure 10-36 Patent Ductus Arteriosus, Heart, Young Dog. Note the prominent ductus arteriosus (arrow) between the pulmonary artery (PA) and the aorta (A) in the undissected (left) and dissected vessels (right). (Courtesy Dr. D.D. Harrington, School of Veterinary Medicine, Purdue University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Malpositioning of Great Vessels Persistent Right Aortic Arch. Persistent right aortic arch occurs in dogs; German shepherd, Irish setter, and Great Dane dogs are predisposed ( Fig. 10-37 ). This defect arises because the right fourth aortic arch, rather than the normal left fourth aortic arch, develops and ascends on the right side of the midline so that the ligamentum arteriosum forms a vascular ring over the esophagus and trachea. This arrangement eventually results in esophageal obstruction and proximal dilation (megaesophagus), which often results in aspiration pneumonia as the animal matures and consumes solid feed. Figure 10-37 Persistent Right Aortic Arch, Ligamentum Arteriosum, Megaesophagus, Calf. During embryogenesis, the aorta was formed from the right aortic arch instead of the left one; thus the aorta is now on the right. For the ligamentum arteriosum (arrow) to connect the aorta with the pulmonary artery, it has to pass dorsally over the esophagus and trachea. The ligamentum, together with the aorta and pulmonary artery, form a vascular ring that constricts the esophagus (E), which is dilated cranial to the constriction. (Courtesy Dr. S. Snyder, College of Veterinary Medicine, Colorado State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Transposition of the Aorta and Pulmonary Artery. Transposition of the aorta and pulmonary artery are severe anomalies, of which there are several types. In complete transposition, the aorta serves as the outflow from the right ventricle and the pulmonary artery is the left ventricle primary outflow. Other congenital anomalies, including ventricular septal defect, often accompany this anomaly. Truncus Arteriosus. In this lesion, there is a large VSD that allows blood flow between the ventricles and a single large vessel that originates above the VSD. Hypoxemia and cyanosis develop, depending on the amount of mixture of nonoxygenated and oxygenated blood. Lymphatic Vessels Lymphangiectasia. Lymphangiectasia is dilation of lymphatic vessels. The cause may be a congenital anomaly ( Fig. 10-38 ) or obstruction of lymph drainage by invading masses of malignant neoplasms or inflammation ( Fig. 10-39 ). Figure 10-38 Congenital Lymphangiectasia, Epicardium, Young Horse. Note the tortuous appearance of the epicardial lymphatic vessel (arrow). In congenital lymphangiectasia, lymphatic vessels fail to make connections with other vessels or are obstructed because of anomalous development. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-39 Acquired Lymphangiectasia, Lymphoma (Lymphosarcoma), Mesocolon, Horse. Note the distended lymphatic vessels on the serosal surface of the large colon, the result of impeded lymph flow through the colic lymph nodes, caused by compression of their cortical and medullary sinuses by proliferating neoplastic lymphocytes. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hereditary Lymphedema. Hereditary lymphedema has been described in dogs, Ayrshire and Angus calves, and pigs. Affected animals have prominent subcutaneous edema that, in calves, often causes severe swelling of the tips of the ears. Interference with lymph drainage results from defective development of the lymphatic vessels that are aplastic or hypoplastic. Blood Vessels Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Portacaval Shunts. Portacaval shunts occur in animals, particularly in the dog. The normal flow from the portal vein is diverted, either partially or completely, to the systemic circulation, thus bypassing the liver ( Fig. 10-35 ). Normal hepatic detoxification of portal flow is incomplete and may result in neurologic signs and elevated circulating bile acids. The resulting nervous system syndrome is termed hepatic encephalopathy. Specifically, the shunts represent retained fetal vascular structures, as in persistent ductus venosus, or arise from prominent dilation of various portosystemic shunts that normally are quite small vessels. See Chapter 8 on diseases of the liver for further details. Figure 10-35 Portacaval Shunt, Dog. Note that the branch of the portal vein (arrowhead 1) passes under the caudal vena cava (arrow) and anastomoses with the azygous vein (arrowhead 2). The azygous vein returns the blood to the caudal vena cava near the heart and thus this blood and its ammoniacal and protein metabolites are shunted away from processing to blood urea nitrogen (BUN) in the liver. The liver is normal color but extremely small, which is typical of these types of shunts (see Chapter 8). (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Tetralogy of Fallot. See Disorders of Domestic Animals; Developmental Errors/Congenital Anomalies; Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves, Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts, Tetralogy of Fallot . Patent Ductus Arteriosus. Patent ductus arteriosus is a frequent anomaly in poodle, collie, Pomeranian, Chihuahua, cocker spaniel, English springer spaniel, German shepherd, keeshond, Maltese, Yorkshire terrier, bichon frise, and Shetland sheepdog breeds ( Fig. 10-36 ). In poodles, it is an inherited polygenic trait. Female dogs have a greater incidence. The ductus arteriosus is a fetal communication between the aorta and pulmonary artery that serves to divert blood from the right cardiac chamber to the fetal circulation in order to bypass the collapsed fetal lungs. Following parturition, the smooth muscle in the ductus arteriosus contracts, which results in its occlusion within 7 to 10 days after birth in the dog. When this mechanism fails, the ductus arteriosus remains patent and allows for a portion of the blood from the left cardiac chamber to flow from the aorta into the pulmonary artery and results in overcirculation to the lungs, leading to pulmonary hypertension and increased preload to the left ventricle. Grossly, patent ductus arteriosus is a dilated funnel-shaped communication between the descending aorta and the main pulmonary artery. This vascular channel between the pulmonary artery and aorta allows blood to bypass the lungs during fetal life. Normally, the ductus arteriosus is converted to the solid ligamentum arteriosum postnatally. Figure 10-36 Patent Ductus Arteriosus, Heart, Young Dog. Note the prominent ductus arteriosus (arrow) between the pulmonary artery (PA) and the aorta (A) in the undissected (left) and dissected vessels (right). (Courtesy Dr. D.D. Harrington, School of Veterinary Medicine, Purdue University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Malpositioning of Great Vessels Persistent Right Aortic Arch. Persistent right aortic arch occurs in dogs; German shepherd, Irish setter, and Great Dane dogs are predisposed ( Fig. 10-37 ). This defect arises because the right fourth aortic arch, rather than the normal left fourth aortic arch, develops and ascends on the right side of the midline so that the ligamentum arteriosum forms a vascular ring over the esophagus and trachea. This arrangement eventually results in esophageal obstruction and proximal dilation (megaesophagus), which often results in aspiration pneumonia as the animal matures and consumes solid feed. Figure 10-37 Persistent Right Aortic Arch, Ligamentum Arteriosum, Megaesophagus, Calf. During embryogenesis, the aorta was formed from the right aortic arch instead of the left one; thus the aorta is now on the right. For the ligamentum arteriosum (arrow) to connect the aorta with the pulmonary artery, it has to pass dorsally over the esophagus and trachea. The ligamentum, together with the aorta and pulmonary artery, form a vascular ring that constricts the esophagus (E), which is dilated cranial to the constriction. (Courtesy Dr. S. Snyder, College of Veterinary Medicine, Colorado State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Transposition of the Aorta and Pulmonary Artery. Transposition of the aorta and pulmonary artery are severe anomalies, of which there are several types. In complete transposition, the aorta serves as the outflow from the right ventricle and the pulmonary artery is the left ventricle primary outflow. Other congenital anomalies, including ventricular septal defect, often accompany this anomaly. Truncus Arteriosus. In this lesion, there is a large VSD that allows blood flow between the ventricles and a single large vessel that originates above the VSD. Hypoxemia and cyanosis develop, depending on the amount of mixture of nonoxygenated and oxygenated blood. Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts Portacaval Shunts. Portacaval shunts occur in animals, particularly in the dog. The normal flow from the portal vein is diverted, either partially or completely, to the systemic circulation, thus bypassing the liver ( Fig. 10-35 ). Normal hepatic detoxification of portal flow is incomplete and may result in neurologic signs and elevated circulating bile acids. The resulting nervous system syndrome is termed hepatic encephalopathy. Specifically, the shunts represent retained fetal vascular structures, as in persistent ductus venosus, or arise from prominent dilation of various portosystemic shunts that normally are quite small vessels. See Chapter 8 on diseases of the liver for further details. Figure 10-35 Portacaval Shunt, Dog. Note that the branch of the portal vein (arrowhead 1) passes under the caudal vena cava (arrow) and anastomoses with the azygous vein (arrowhead 2). The azygous vein returns the blood to the caudal vena cava near the heart and thus this blood and its ammoniacal and protein metabolites are shunted away from processing to blood urea nitrogen (BUN) in the liver. The liver is normal color but extremely small, which is typical of these types of shunts (see Chapter 8). (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Tetralogy of Fallot. See Disorders of Domestic Animals; Developmental Errors/Congenital Anomalies; Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves, Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts, Tetralogy of Fallot . Patent Ductus Arteriosus. Patent ductus arteriosus is a frequent anomaly in poodle, collie, Pomeranian, Chihuahua, cocker spaniel, English springer spaniel, German shepherd, keeshond, Maltese, Yorkshire terrier, bichon frise, and Shetland sheepdog breeds ( Fig. 10-36 ). In poodles, it is an inherited polygenic trait. Female dogs have a greater incidence. The ductus arteriosus is a fetal communication between the aorta and pulmonary artery that serves to divert blood from the right cardiac chamber to the fetal circulation in order to bypass the collapsed fetal lungs. Following parturition, the smooth muscle in the ductus arteriosus contracts, which results in its occlusion within 7 to 10 days after birth in the dog. When this mechanism fails, the ductus arteriosus remains patent and allows for a portion of the blood from the left cardiac chamber to flow from the aorta into the pulmonary artery and results in overcirculation to the lungs, leading to pulmonary hypertension and increased preload to the left ventricle. Grossly, patent ductus arteriosus is a dilated funnel-shaped communication between the descending aorta and the main pulmonary artery. This vascular channel between the pulmonary artery and aorta allows blood to bypass the lungs during fetal life. Normally, the ductus arteriosus is converted to the solid ligamentum arteriosum postnatally. Figure 10-36 Patent Ductus Arteriosus, Heart, Young Dog. Note the prominent ductus arteriosus (arrow) between the pulmonary artery (PA) and the aorta (A) in the undissected (left) and dissected vessels (right). (Courtesy Dr. D.D. Harrington, School of Veterinary Medicine, Purdue University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Portacaval Shunts. Portacaval shunts occur in animals, particularly in the dog. The normal flow from the portal vein is diverted, either partially or completely, to the systemic circulation, thus bypassing the liver ( Fig. 10-35 ). Normal hepatic detoxification of portal flow is incomplete and may result in neurologic signs and elevated circulating bile acids. The resulting nervous system syndrome is termed hepatic encephalopathy. Specifically, the shunts represent retained fetal vascular structures, as in persistent ductus venosus, or arise from prominent dilation of various portosystemic shunts that normally are quite small vessels. See Chapter 8 on diseases of the liver for further details. Figure 10-35 Portacaval Shunt, Dog. Note that the branch of the portal vein (arrowhead 1) passes under the caudal vena cava (arrow) and anastomoses with the azygous vein (arrowhead 2). The azygous vein returns the blood to the caudal vena cava near the heart and thus this blood and its ammoniacal and protein metabolites are shunted away from processing to blood urea nitrogen (BUN) in the liver. The liver is normal color but extremely small, which is typical of these types of shunts (see Chapter 8). (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Tetralogy of Fallot. See Disorders of Domestic Animals; Developmental Errors/Congenital Anomalies; Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves, Failure of Closure of Fetal Cardiovascular Shunts, Tetralogy of Fallot . Patent Ductus Arteriosus. Patent ductus arteriosus is a frequent anomaly in poodle, collie, Pomeranian, Chihuahua, cocker spaniel, English springer spaniel, German shepherd, keeshond, Maltese, Yorkshire terrier, bichon frise, and Shetland sheepdog breeds ( Fig. 10-36 ). In poodles, it is an inherited polygenic trait. Female dogs have a greater incidence. The ductus arteriosus is a fetal communication between the aorta and pulmonary artery that serves to divert blood from the right cardiac chamber to the fetal circulation in order to bypass the collapsed fetal lungs. Following parturition, the smooth muscle in the ductus arteriosus contracts, which results in its occlusion within 7 to 10 days after birth in the dog. When this mechanism fails, the ductus arteriosus remains patent and allows for a portion of the blood from the left cardiac chamber to flow from the aorta into the pulmonary artery and results in overcirculation to the lungs, leading to pulmonary hypertension and increased preload to the left ventricle. Grossly, patent ductus arteriosus is a dilated funnel-shaped communication between the descending aorta and the main pulmonary artery. This vascular channel between the pulmonary artery and aorta allows blood to bypass the lungs during fetal life. Normally, the ductus arteriosus is converted to the solid ligamentum arteriosum postnatally. Figure 10-36 Patent Ductus Arteriosus, Heart, Young Dog. Note the prominent ductus arteriosus (arrow) between the pulmonary artery (PA) and the aorta (A) in the undissected (left) and dissected vessels (right). (Courtesy Dr. D.D. Harrington, School of Veterinary Medicine, Purdue University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Malpositioning of Great Vessels Persistent Right Aortic Arch. Persistent right aortic arch occurs in dogs; German shepherd, Irish setter, and Great Dane dogs are predisposed ( Fig. 10-37 ). This defect arises because the right fourth aortic arch, rather than the normal left fourth aortic arch, develops and ascends on the right side of the midline so that the ligamentum arteriosum forms a vascular ring over the esophagus and trachea. This arrangement eventually results in esophageal obstruction and proximal dilation (megaesophagus), which often results in aspiration pneumonia as the animal matures and consumes solid feed. Figure 10-37 Persistent Right Aortic Arch, Ligamentum Arteriosum, Megaesophagus, Calf. During embryogenesis, the aorta was formed from the right aortic arch instead of the left one; thus the aorta is now on the right. For the ligamentum arteriosum (arrow) to connect the aorta with the pulmonary artery, it has to pass dorsally over the esophagus and trachea. The ligamentum, together with the aorta and pulmonary artery, form a vascular ring that constricts the esophagus (E), which is dilated cranial to the constriction. (Courtesy Dr. S. Snyder, College of Veterinary Medicine, Colorado State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Transposition of the Aorta and Pulmonary Artery. Transposition of the aorta and pulmonary artery are severe anomalies, of which there are several types. In complete transposition, the aorta serves as the outflow from the right ventricle and the pulmonary artery is the left ventricle primary outflow. Other congenital anomalies, including ventricular septal defect, often accompany this anomaly. Truncus Arteriosus. In this lesion, there is a large VSD that allows blood flow between the ventricles and a single large vessel that originates above the VSD. Hypoxemia and cyanosis develop, depending on the amount of mixture of nonoxygenated and oxygenated blood. Persistent Right Aortic Arch. Persistent right aortic arch occurs in dogs; German shepherd, Irish setter, and Great Dane dogs are predisposed ( Fig. 10-37 ). This defect arises because the right fourth aortic arch, rather than the normal left fourth aortic arch, develops and ascends on the right side of the midline so that the ligamentum arteriosum forms a vascular ring over the esophagus and trachea. This arrangement eventually results in esophageal obstruction and proximal dilation (megaesophagus), which often results in aspiration pneumonia as the animal matures and consumes solid feed. Figure 10-37 Persistent Right Aortic Arch, Ligamentum Arteriosum, Megaesophagus, Calf. During embryogenesis, the aorta was formed from the right aortic arch instead of the left one; thus the aorta is now on the right. For the ligamentum arteriosum (arrow) to connect the aorta with the pulmonary artery, it has to pass dorsally over the esophagus and trachea. The ligamentum, together with the aorta and pulmonary artery, form a vascular ring that constricts the esophagus (E), which is dilated cranial to the constriction. (Courtesy Dr. S. Snyder, College of Veterinary Medicine, Colorado State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Transposition of the Aorta and Pulmonary Artery. Transposition of the aorta and pulmonary artery are severe anomalies, of which there are several types. In complete transposition, the aorta serves as the outflow from the right ventricle and the pulmonary artery is the left ventricle primary outflow. Other congenital anomalies, including ventricular septal defect, often accompany this anomaly. Truncus Arteriosus. In this lesion, there is a large VSD that allows blood flow between the ventricles and a single large vessel that originates above the VSD. Hypoxemia and cyanosis develop, depending on the amount of mixture of nonoxygenated and oxygenated blood. Lymphatic Vessels Lymphangiectasia. Lymphangiectasia is dilation of lymphatic vessels. The cause may be a congenital anomaly ( Fig. 10-38 ) or obstruction of lymph drainage by invading masses of malignant neoplasms or inflammation ( Fig. 10-39 ). Figure 10-38 Congenital Lymphangiectasia, Epicardium, Young Horse. Note the tortuous appearance of the epicardial lymphatic vessel (arrow). In congenital lymphangiectasia, lymphatic vessels fail to make connections with other vessels or are obstructed because of anomalous development. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-39 Acquired Lymphangiectasia, Lymphoma (Lymphosarcoma), Mesocolon, Horse. Note the distended lymphatic vessels on the serosal surface of the large colon, the result of impeded lymph flow through the colic lymph nodes, caused by compression of their cortical and medullary sinuses by proliferating neoplastic lymphocytes. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hereditary Lymphedema. Hereditary lymphedema has been described in dogs, Ayrshire and Angus calves, and pigs. Affected animals have prominent subcutaneous edema that, in calves, often causes severe swelling of the tips of the ears. Interference with lymph drainage results from defective development of the lymphatic vessels that are aplastic or hypoplastic. Lymphangiectasia. Lymphangiectasia is dilation of lymphatic vessels. The cause may be a congenital anomaly ( Fig. 10-38 ) or obstruction of lymph drainage by invading masses of malignant neoplasms or inflammation ( Fig. 10-39 ). Figure 10-38 Congenital Lymphangiectasia, Epicardium, Young Horse. Note the tortuous appearance of the epicardial lymphatic vessel (arrow). In congenital lymphangiectasia, lymphatic vessels fail to make connections with other vessels or are obstructed because of anomalous development. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-39 Acquired Lymphangiectasia, Lymphoma (Lymphosarcoma), Mesocolon, Horse. Note the distended lymphatic vessels on the serosal surface of the large colon, the result of impeded lymph flow through the colic lymph nodes, caused by compression of their cortical and medullary sinuses by proliferating neoplastic lymphocytes. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hereditary Lymphedema. Hereditary lymphedema has been described in dogs, Ayrshire and Angus calves, and pigs. Affected animals have prominent subcutaneous edema that, in calves, often causes severe swelling of the tips of the ears. Interference with lymph drainage results from defective development of the lymphatic vessels that are aplastic or hypoplastic. Disorders of Domestic Animals: Myocardium The most common cardiac diseases in horses, ruminants, pigs, dogs, and cats are summarized in Boxes 10-12 and 10-13 . The most common locations of major neoplastic diseases in the heart are illustrated in Fig. 10-40 . Cardiovascular diseases with known or suspected heritability are listed in E-Boxes 10-2 and 10-3 . Box 10-12 Most Common Cardiac Diseases of Horses and Production Animals Horses Fibrinous pericarditis Toxic cardiomyopathy (ionophores, white snakeroot) Endocardial fibrosis and calcification Endocarditis Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) White muscle disease (vitamin E–selenium deficiency) Cardiotoxicity (ionophores, gossypol, Cassia occidentalis , Karwinskia humboldtiana ) Brisket disease (high-altitude disease) Pericarditis Endocarditis Malignant lymphoma Pigs Mulberry heart disease (vitamin E–selenium deficiency) Pericarditis Endocarditis Box 10-13 Most Common Cardiac Diseases in Dogs and Cats Dogs Myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis) Congenital heart disease Dilated cardiomyopathy Hemorrhagic pericardial effusion Cardiac neoplasia Dirofilariasis Cats Hypertrophic cardiomyopathy Dilated cardiomyopathy Hyperthyroidism-associated hypertrophy Congenital heart disease Figure 10-40 Locations of the Major Cardiac Neoplasms. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Box 10-2 Inherited Cardiovascular Diseases of Animals (Also See E-Box 1-1 ) Hypertrophic Cardiomyopathy: Cats Maine coon cats: Autosomal dominant Ragdoll cat: Autosomal dominant (?) British shorthair cat: Autosomal dominant (?) Dilated Cardiomyopathy: Dogs Portuguese water dog: Autosomal recessive Doberman pinscher dog: Autosomal dominant Irish wolfhound dog: Autosomal dominant (recessive?) Newfoundland dog: Autosomal dominant Great Dane dog: X-linked recessive (?) Cardiomyopathy with X-Linked Muscular Dystrophy: Dogs Irish terrier, golden retriever, Dalmatian, Shetland sheepdog, Samoyed, Pembroke Welsh corgi, Japanese spitz, Alaskan malamute dog: X-linked recessive Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy: Dog Boxer dog: Autosomal dominant Cardiomyopathy with Curly Haircoat: Cow Poll Hereford cow: Autosomal recessive Dilated Cardiomyopathy: Cow Holstein-Friesian cow: Autosomal recessive with X-linked muscular dystrophy Cardiomyopathy with Muscular Dystrophy: Hamster Syrian golden hamster: Autosomal recessive Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis) Cavalier King Charles spaniel: Polygenic trait Dachshund: Polygenic trait Aortic Stenosis (Subvalvular) Newfoundland: Polygenic trait Tetralogy of Fallot: Conotruncal Defects Keeshond: Simple autosomal locus with partial penetration in heterozygous and complete penetrance in homozygotes Patent Ductus Arteriosus Poodle: Polygenic trait Pulmonic Stenosis Beagle: Polygenic trait Tricuspid Dysplasia Labrador retriever: Autosomal dominant with reduced penetrance E-Box 10-3 Canine Breed Predilections for Congenital Cardiac Anomalies Breed Defect Basset hound PS Beagle PS Bichon frise PDA Boxer SAS, PS, ASD Boykin spaniel PS Bull terrier MiVD, AS Chihuahua PDA, PS Chow Chow PS, CTD Cocker spaniel PDA, PS Collie PDA Doberman pinscher ASD English bulldog PS, VSD, TOF English springer spaniel PDA, VSD German shepherd SAS, PDA, TVD, MiVD German shorthaired pointer SAS Golden retriever SAS, TVD, MiVD Great Dane TVD, MiVD, SAS Keeshond TOF, PDA Labrador retriever TVD, PDA, PS Maltese PDA Mastiff PS, MiVD Newfoundland SAS, MiVD, PS Pomeranian PDA Poodle PDA Rottweiler SAS Samoyed PS, SAS, ASD Schnauzer PS Shetland sheepdog PDA Terrier breeds PS Weimaraner TVD, PPDH Welsh corgi PDA West Highland white terrier PS, VSD Yorkshire terrier PDA AS, aortic stenosis; ASD, atrial septal defect; CTD, cor triatriatum dexter; MiVD, mitral valve dysplasia; PDA, patent ductus arteriosus; PPDH, peritoneopericardial diaphragmatic hernia; PS, pulmonic stenosis; SAS, subaortic stenosis; TOF, tetralogy of Fallot; TVD, tricuspid valve dysplasia; VSD, ventral septal defect. Adapted from Oyama MA, Sisson DD, Thomas WP, et al: Congenital heart disease. In Ettinger SJ, Feldman EC, editors: Textbook of veterinary internal medicine , ed 7, St. Louis, 2010, Saunders; 1250-1298. Disturbances of Circulation Hemorrhage: Trauma (Physical Injury). Blunt chest trauma may result in myocardial hemorrhage, which can lead to serious clinical consequences. Tears and rupture of tissue resulting from loss of structural integrity attributable to invasive and destructive properties of neoplasms may result in myocardial hemorrhage. See discussion on hemorrhage in Chapter 2. Disturbances of Growth See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Hypertrophy and Atrophy Cardiomyopathies. Categorization and causes of primary and secondary cardiomyopathies are listed in Box 10-14 . These diseases are divided into five morphologic types: hypertrophic, dilated (congestive), restrictive, arrhythmogenic right ventricular, and unclassified cardiomyopathies. Secondary cardiomyopathies (also termed specific heart muscle diseases ) are generalized myocardial diseases of known cause. Box 10-14 Cardiomyopathies in Animals Primary Cardiomyopathies (Idiopathic) Hypertrophic: Cat, dog, rat, pig Dilated (congestive): Cat, dog, hamster, turkey, pig, cow, sea otters, sea lions, cynomolgus monkeys Restrictive: Cat Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy: Dog, cat Secondary Cardiomyopathies (Specific Heart Muscle Diseases) Heritable (known or suspected): Hereditary cardiomyopathy of hamsters, mice, rats, turkeys, and cattle; Duchenne's type, X-linked muscular dystrophy of golden retriever dogs with dystrophin deficiency; glycogenoses Nutritional deficiencies: See list in Box 10-5 ; other examples include taurine deficiency in cats and foxes Toxic: See list in Box 10-5 ; other examples include anthracycline toxicity, furazolidone toxicity, NaCl toxicity Physical injuries and shock: See list in Box 10-5 Endocrine disorders: Hyperthyroidism, acromegaly (hypersomatotropism), hypothyroidism, glucocorticoid excess, functional pheochromocytoma, diabetes mellitus Infections: See lists in Box 10-6 , Box 10-7 , Box 10-8 Neoplastic infiltration: Malignant lymphoma Systemic hypertension in cats and dogs: Spontaneous or associated with chronic renal disease, hyperthyroidism, diabetes mellitus, acromegaly, primary aldosteronism Hypertrophic Cardiomyopathy. Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) occurs frequently in cats, especially in young adult to middle-aged males (1 to 3 years old), and is seen infrequently in dogs, usually affecting males of large breeds. Hypertrophic cardiomyopathy is the most common feline primary myocardial disease, and it occurs frequently in cats (58% to 68% of all cardiomyopathy cases). There is familial heritability in Maine coon, ragdoll, and American shorthaired cats (in which it is transmitted in an autosomal dominant pattern) and breed predisposition in British shorthair, Norwegian forest, Turkish Van, Scottish fold, Bengal, Siberian, and Rex cats. Young adult to middle-aged males (1 to 3 years old) are often affected. Hypertrophic cardiomyopathy is caused by sarcomeric defects in cardiomyocytes, of which two mutations in cardiac myosin-binding protein C (MYBPC) have been identified in Maine coon and ragdoll cats. Altered sarcomeric function ultimately results in myocytes hypertrophy, collagen synthesis, and myocytes disarray (defined as cellular disorientation of cardiomyocytes in which cardiomyocytes are oriented perpendicular or obliquely to each other forming tangled patterns and/or pinwheel configurations). The left ventricle wall progressively thickens ( Fig. 10-41 ), and its lumen narrows (nondilated concentric hypertrophy) (heart weight to body weight ratio of 7.0 ± 0.3 g/kg compared to normal cats' heart weight to body weight ratio of 3.83 ± 0.2 g/kg). In addition, mild right ventricular enlargement is occasionally present. Left ventricular concentric enlargement results in impairment of the left ventricle's ability to relax during diastole (diastolic failure). Increased left ventricular diastolic filling pressure leads to enlargement of the left atrium with subsequent blood backing up to the lungs, resulting in congestive heart failure with pulmonary edema and/or pleural effusion. In a subset of cases, in addition to concentric hypertrophy of the left ventricle, the interventricular septum contains hypertrophied, anteriorly displaced papillary muscles that pull the chordae tendineae and the anterior leaflet of the mitral valve into the left ventricular outflow tract (LVOT), resulting in a dynamic LVOT obstruction during systole (systolic anterior motion [SAM] of the mitral valve). Therefore a unique kissing lesion forms in the LVOT, which has a diagnostic significance because it is seen only in this subset of cats with hypertrophic cardiomyopathy. In addition, the systolic obstruction in the LVOT causes further increase in the left ventricular pressure that worsens its hypertrophy. Approximately 10% to 20% of cats with hypertrophic cardiomyopathy have a state of increased coagulability and develop posterior paresis from concurrent thromboembolism of the caudal abdominal aorta ("saddle thrombosis") (see Fig. 10-91 ). The aortic thrombus is first formed in the stagnant blood flow of the enlarged left atrium and is subsequently launched into the aorta. Some cats with hypertrophic cardiomyopathy die unexpectedly without premonitory clinical signs. Microscopically, the lesions of the myocardium are prominent disarray or disorganizations of myocytes, with interweaving rather than parallel arrangement of fibers ( Fig. 10-42 ). Myocyte hypertrophy, various degenerative alterations in myocytes, and interstitial fibrosis are present. A second common histologic lesion includes remodeling of the coronary microcirculation associated with arteriosclerosis ("small vessel disease"). The lumen of small coronary vessels is severely narrowed due to smooth muscle proliferation and increased connective tissue elements. Replacement fibrosis due to myocardial infarction/necrosis is occasionally found in regions of remodeled coronary arterioles, implying a probable causal relationship (see Figs. 10-41 and 10-42 ; E-Fig. 10-20 ). Figure 10-41 Hypertrophic Cardiomyopathy, Heart, Cats. A, Note the thickened left ventricular wall (LV). B, The thickened left ventricular free wall and septum have markedly reduced the lumen of the left ventricle (LV). C, There is severe diffuse concentric hypertrophy of the left ventricular free wall, interventricular septum, and papillary muscles. Left atrial dilation is present and a large thrombus (arrow) arises from and extends through the left atrioventricular valve. ( A and B courtesy Dr. W. Crowell, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. C courtesy Ettinger SJ, Feldman EC (editors): Textbook of veterinary internal medicine. Diseases of the dog and cat , vol 2, ed 7, Philadelphia, 2010, Saunders.) Figure 10-42 Hypertrophic Cardiomyopathy, Heart, Ventricular Myocardium, Cat. A, Cardiac myocytes are hypertrophied and in disarray. H&E stain. B, Masson's trichrome stain demonstrates abundant amounts of interstitial collagen (blue) produced by fibroblasts. C, Normal cardiac myocytes arranged in parallel bundles. H&E stain. ( A and B courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island. C courtesy Dr. L. Borst, College of Veterinary Medicine.) E-Figure 10-20 Hypertrophic Cardiomyopathy, Heart, Ventricular Myocardium, Cat. A, Note the pattern of interwoven cardiac myocytes, indicating myofiber disarray, and the hypertrophic myocytes (compare with Figs. 10-20 and 10-42 ). The number of fibroblasts is increased in the interstitium. H&E stain. B, Normal cardiac myocytes arranged in parallel bundles. (Courtesy Dr. L. Borst, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Idiopathic hypertrophic cardiomyopathy in dogs is an infrequent pathology, unlike in cats. It is defined as inappropriate concentric myocardial hypertrophy of a nondilated left ventricle in the absence of an identifiable stimulus for the hypertrophy. Most reported cases have been in young males ( aortic > tricuspid > pulmonary. Figure 10-54 Vegetative Valvular Endocarditis. A, Mitral valve, heart, calf. Multiple, large, raised, friable, yellow-red thrombotic masses are attached to cusps of the mitral valve. The roughened and granular surface of the valve leaflets is attributable to fibrin, platelets, and trapped bacteria and erythrocytes. B, Bacterial infection, heart, tricuspid valve, cow. Note abundant masses of fibrin and bacterial colonies (arrow). H&E stain. ( A courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island. B courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-55 Valvular Endocarditis, Streptococcus Suis , Heart Mitral and Pulmonic Valves, Pig. Note the friable, yellow material adhering to and replacing some of the normal left atrioventricular valve. The left ventricular chamber is dilated due to failure of normal function of the valve (eccentric hypertrophy). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) The pathogenesis of endocarditis is complicated and incompletely understood, but the components of Virchow's triad in thrombogenesis—endothelial injury, turbulence, and hypercoagulability—are involved. Affected animals often have preexisting extracardiac infections, such as gingivitis, mastitis, hepatic abscesses, or dermatitis, resulting in one or more bouts of bacteremia. Turbulent intracardiac blood flow associated with congenital anomalies or the presence of intracardiac and vasculature devices, such as catheters, may contribute to initiation of the lesion. Focal trauma–induced endothelial disruption on the surface of the normally avascular valves allows bacteria to adhere, proliferate, and initiate an inflammatory reaction that results in subsequent deposition of masses of fibrin. Death is the result of cardiac failure from valvular dysfunction or the effects of bacteremia. In some animals, septic emboli lodge in organs such as the heart, synovium, bone, liver, kidneys, and meninges, leading to infarction and/or localized inflammation or abscess formation. See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation and also Chapter 3. Atrial Thrombosis. Atrial thrombi may occur with valvular or myocardial disease and are the result of hemostatic abnormalities resulting from stasis or turbulence. Endothelial injury, turbulence, and hypercoagulability are involved in the pathogenesis of atrial thrombi. Disturbances of Growth Endocardial Fibroelastosis. Endocardial fibroelastosis in animals was historically recognized as a primary cardiac defect in Burmese and Siamese cats. Affected animals had prominent, white, thickened endocardium, especially of the left ventricle, because of the proliferation of fibroelastic tissue (see Fig. 10-45 ). Endocardial fibroelastosis is a reaction of the endocardium to hypoxia and often associated with heart disease, which results in dilated cardiac chambers. It is unclear whether this is a true congenital anomaly or a response to left atrial dilation. Miscellaneous Valvular Anomalies Valvular Hematomas. Valvular hematomas (hematocysts, valvular telangiectasia) frequently are observed on the AV valves of many species but are common in postnatal ruminants ( Fig. 10-51, A ). These lesions may regress and do not produce any functional abnormalities. Lesions are bulging, blood-filled cysts, several millimeters in diameter, on the AV valves. Figure 10-51 Hematocysts and Lymphocysts, Calf. A, Valvular hematocyst, heart, opened left side, mitral valve, postnatal calf. A dark, blood-filled cyst protrudes from a cusp of the mitral valve. Arrows indicate chordae tendineae. Hematocysts usually occur in ruminants, do not cause any functional abnormality, and usually regress within a few months of birth. B, Valvular lymphocyst, heart. A lymph-filled cyst is on a cusp of the atrioventricular valve. Like hematocysts, lymphocysts usually occur in ruminants, do not cause any functional abnormality, and usually regress within a few months of birth. ( A courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee. B courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Valvular Lymphocysts. Valvular lymphocysts may also occur and appear as yellow serum-filled cysts on the AV valve cusps ( Fig. 10-51, B ). Endocardial Fibroelastosis. Endocardial fibroelastosis in animals was historically recognized as a primary cardiac defect in Burmese and Siamese cats. Affected animals had prominent, white, thickened endocardium, especially of the left ventricle, because of the proliferation of fibroelastic tissue (see Fig. 10-45 ). Endocardial fibroelastosis is a reaction of the endocardium to hypoxia and often associated with heart disease, which results in dilated cardiac chambers. It is unclear whether this is a true congenital anomaly or a response to left atrial dilation. Miscellaneous Valvular Anomalies Valvular Hematomas. Valvular hematomas (hematocysts, valvular telangiectasia) frequently are observed on the AV valves of many species but are common in postnatal ruminants ( Fig. 10-51, A ). These lesions may regress and do not produce any functional abnormalities. Lesions are bulging, blood-filled cysts, several millimeters in diameter, on the AV valves. Figure 10-51 Hematocysts and Lymphocysts, Calf. A, Valvular hematocyst, heart, opened left side, mitral valve, postnatal calf. A dark, blood-filled cyst protrudes from a cusp of the mitral valve. Arrows indicate chordae tendineae. Hematocysts usually occur in ruminants, do not cause any functional abnormality, and usually regress within a few months of birth. B, Valvular lymphocyst, heart. A lymph-filled cyst is on a cusp of the atrioventricular valve. Like hematocysts, lymphocysts usually occur in ruminants, do not cause any functional abnormality, and usually regress within a few months of birth. ( A courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee. B courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Valvular Lymphocysts. Valvular lymphocysts may also occur and appear as yellow serum-filled cysts on the AV valve cusps ( Fig. 10-51, B ). Valvular Hematomas. Valvular hematomas (hematocysts, valvular telangiectasia) frequently are observed on the AV valves of many species but are common in postnatal ruminants ( Fig. 10-51, A ). These lesions may regress and do not produce any functional abnormalities. Lesions are bulging, blood-filled cysts, several millimeters in diameter, on the AV valves. Figure 10-51 Hematocysts and Lymphocysts, Calf. A, Valvular hematocyst, heart, opened left side, mitral valve, postnatal calf. A dark, blood-filled cyst protrudes from a cusp of the mitral valve. Arrows indicate chordae tendineae. Hematocysts usually occur in ruminants, do not cause any functional abnormality, and usually regress within a few months of birth. B, Valvular lymphocyst, heart. A lymph-filled cyst is on a cusp of the atrioventricular valve. Like hematocysts, lymphocysts usually occur in ruminants, do not cause any functional abnormality, and usually regress within a few months of birth. ( A courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee. B courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Valvular Lymphocysts. Valvular lymphocysts may also occur and appear as yellow serum-filled cysts on the AV valve cusps ( Fig. 10-51, B ). Cell Degeneration and Death Ulcerative Endocarditis (Uremic Endocarditis). Uremic endocarditis is most commonly a disorder in dogs that follows acute or repeated episodes of uremia. These episodes cause ulcerative endocarditis (injury of the endothelium) of the left atrium that is resolved via healing characterized by fibrosis, with or without mineralization and chronically dilated atria ( Fig. 10-52 ). Figure 10-52 Ulcerative Endocarditis (Uremia), Heart, Endocardium of Left Atrium, Dog. Note the white-red, thick, wrinkled area (arrows) of endocarditis, mineralization, and fibrous tissue (scar) formation caused by uremia in this dog with chronic renal failure. (Courtesy Dr. K. Read, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis). Degenerative changes in the valves are frequently seen in older dogs, and the process that leads to this lesion is termed myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis). Also see the section on Disorders of Dogs (also see Fig. 10-83 ). Endocardial Mineralization. Endocardial mineralization occurs from intake of excessive amounts of vitamin D and from intoxication by calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , and Solanum torvum ) that contain vitamin D analogs. These plant-induced syndromes of cattle have been called by different names in various areas of the world, such as "Manchester wasting disease" in Jamaica, "enzootic calcinosis" in Europe, "Naalehu disease" in Hawaii, "enteque seco" in Argentina, and "espichamento" in Brazil. Multiple, large, white, rough, firm plaques of mineralized fibroelastic tissue are present in the endocardium and intima of large elastic arteries. Fibrosis, with or without mineralization, occurs in chronically dilated hearts, in hearts of debilitated cattle with Johne's disease ( Fig. 10-53 ; also see Fig. 10-22 ), in dogs with healed lesions of left atrial ulcerative endocarditis associated with a prior uremic episode (see Fig. 10-52 ), and in the so-called jet lesions produced by the trauma of refluxed blood in valvular insufficiencies. Figure 10-53 Johne's Disease, Arteriosclerosis, Aorta, Cow. Multiple prominent, white, mineralized foci are in the tunica intima and media (arrows). (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Ulcerative Endocarditis (Uremic Endocarditis). Uremic endocarditis is most commonly a disorder in dogs that follows acute or repeated episodes of uremia. These episodes cause ulcerative endocarditis (injury of the endothelium) of the left atrium that is resolved via healing characterized by fibrosis, with or without mineralization and chronically dilated atria ( Fig. 10-52 ). Figure 10-52 Ulcerative Endocarditis (Uremia), Heart, Endocardium of Left Atrium, Dog. Note the white-red, thick, wrinkled area (arrows) of endocarditis, mineralization, and fibrous tissue (scar) formation caused by uremia in this dog with chronic renal failure. (Courtesy Dr. K. Read, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis). Degenerative changes in the valves are frequently seen in older dogs, and the process that leads to this lesion is termed myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis). Also see the section on Disorders of Dogs (also see Fig. 10-83 ). Endocardial Mineralization. Endocardial mineralization occurs from intake of excessive amounts of vitamin D and from intoxication by calcinogenic plants ( Cestrum diurnum , Trisetum flavescens , Solanum malacoxylon , and Solanum torvum ) that contain vitamin D analogs. These plant-induced syndromes of cattle have been called by different names in various areas of the world, such as "Manchester wasting disease" in Jamaica, "enzootic calcinosis" in Europe, "Naalehu disease" in Hawaii, "enteque seco" in Argentina, and "espichamento" in Brazil. Multiple, large, white, rough, firm plaques of mineralized fibroelastic tissue are present in the endocardium and intima of large elastic arteries. Fibrosis, with or without mineralization, occurs in chronically dilated hearts, in hearts of debilitated cattle with Johne's disease ( Fig. 10-53 ; also see Fig. 10-22 ), in dogs with healed lesions of left atrial ulcerative endocarditis associated with a prior uremic episode (see Fig. 10-52 ), and in the so-called jet lesions produced by the trauma of refluxed blood in valvular insufficiencies. Figure 10-53 Johne's Disease, Arteriosclerosis, Aorta, Cow. Multiple prominent, white, mineralized foci are in the tunica intima and media (arrows). (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Inflammation Vegetative Valvular and Mural Endocarditis. Endocarditis is usually the result of bacterial infections, except for lesions produced by migrating Strongylus vulgaris larvae in horses and rarely in mycotic infections. The lesions are often very large by the time of death and are present on the valves (valvular endocarditis), although some lesions originate from the underlying myocardium or extend from the affected valve to the adjacent wall (mural endocarditis). Grossly, the affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can occlude the valvular orifice ( Figs. 10-54, A , and 10-55 ). In chronic lesions, the fibrin deposits are organized by fibrous connective tissue to produce irregular nodular masses termed verrucae (wartlike lesions). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). The relative frequency of valvular involvement with endocarditis in animals is mitral > aortic > tricuspid > pulmonary. Figure 10-54 Vegetative Valvular Endocarditis. A, Mitral valve, heart, calf. Multiple, large, raised, friable, yellow-red thrombotic masses are attached to cusps of the mitral valve. The roughened and granular surface of the valve leaflets is attributable to fibrin, platelets, and trapped bacteria and erythrocytes. B, Bacterial infection, heart, tricuspid valve, cow. Note abundant masses of fibrin and bacterial colonies (arrow). H&E stain. ( A courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island. B courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-55 Valvular Endocarditis, Streptococcus Suis , Heart Mitral and Pulmonic Valves, Pig. Note the friable, yellow material adhering to and replacing some of the normal left atrioventricular valve. The left ventricular chamber is dilated due to failure of normal function of the valve (eccentric hypertrophy). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) The pathogenesis of endocarditis is complicated and incompletely understood, but the components of Virchow's triad in thrombogenesis—endothelial injury, turbulence, and hypercoagulability—are involved. Affected animals often have preexisting extracardiac infections, such as gingivitis, mastitis, hepatic abscesses, or dermatitis, resulting in one or more bouts of bacteremia. Turbulent intracardiac blood flow associated with congenital anomalies or the presence of intracardiac and vasculature devices, such as catheters, may contribute to initiation of the lesion. Focal trauma–induced endothelial disruption on the surface of the normally avascular valves allows bacteria to adhere, proliferate, and initiate an inflammatory reaction that results in subsequent deposition of masses of fibrin. Death is the result of cardiac failure from valvular dysfunction or the effects of bacteremia. In some animals, septic emboli lodge in organs such as the heart, synovium, bone, liver, kidneys, and meninges, leading to infarction and/or localized inflammation or abscess formation. See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation and also Chapter 3. Atrial Thrombosis. Atrial thrombi may occur with valvular or myocardial disease and are the result of hemostatic abnormalities resulting from stasis or turbulence. Endothelial injury, turbulence, and hypercoagulability are involved in the pathogenesis of atrial thrombi. Vegetative Valvular and Mural Endocarditis. Endocarditis is usually the result of bacterial infections, except for lesions produced by migrating Strongylus vulgaris larvae in horses and rarely in mycotic infections. The lesions are often very large by the time of death and are present on the valves (valvular endocarditis), although some lesions originate from the underlying myocardium or extend from the affected valve to the adjacent wall (mural endocarditis). Grossly, the affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can occlude the valvular orifice ( Figs. 10-54, A , and 10-55 ). In chronic lesions, the fibrin deposits are organized by fibrous connective tissue to produce irregular nodular masses termed verrucae (wartlike lesions). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). The relative frequency of valvular involvement with endocarditis in animals is mitral > aortic > tricuspid > pulmonary. Figure 10-54 Vegetative Valvular Endocarditis. A, Mitral valve, heart, calf. Multiple, large, raised, friable, yellow-red thrombotic masses are attached to cusps of the mitral valve. The roughened and granular surface of the valve leaflets is attributable to fibrin, platelets, and trapped bacteria and erythrocytes. B, Bacterial infection, heart, tricuspid valve, cow. Note abundant masses of fibrin and bacterial colonies (arrow). H&E stain. ( A courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island. B courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-55 Valvular Endocarditis, Streptococcus Suis , Heart Mitral and Pulmonic Valves, Pig. Note the friable, yellow material adhering to and replacing some of the normal left atrioventricular valve. The left ventricular chamber is dilated due to failure of normal function of the valve (eccentric hypertrophy). (Courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) The pathogenesis of endocarditis is complicated and incompletely understood, but the components of Virchow's triad in thrombogenesis—endothelial injury, turbulence, and hypercoagulability—are involved. Affected animals often have preexisting extracardiac infections, such as gingivitis, mastitis, hepatic abscesses, or dermatitis, resulting in one or more bouts of bacteremia. Turbulent intracardiac blood flow associated with congenital anomalies or the presence of intracardiac and vasculature devices, such as catheters, may contribute to initiation of the lesion. Focal trauma–induced endothelial disruption on the surface of the normally avascular valves allows bacteria to adhere, proliferate, and initiate an inflammatory reaction that results in subsequent deposition of masses of fibrin. Death is the result of cardiac failure from valvular dysfunction or the effects of bacteremia. In some animals, septic emboli lodge in organs such as the heart, synovium, bone, liver, kidneys, and meninges, leading to infarction and/or localized inflammation or abscess formation. See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation and also Chapter 3. Atrial Thrombosis. Atrial thrombi may occur with valvular or myocardial disease and are the result of hemostatic abnormalities resulting from stasis or turbulence. Endothelial injury, turbulence, and hypercoagulability are involved in the pathogenesis of atrial thrombi. Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium Disturbances of Circulation Hemorrhage. Hemorrhage involving the pericardium and epicardium (see Fig. 10-24 ; see E-Fig. 10-18 ) results from stretching, tearing, lacerating, or crushing blood vessels in these structures and may be caused by penetrating wounds (foreign objects, bullets, or knives), lacerations from fractured bone, shear forces that stretch and ultimately tear vessels in tissues (blunt force trauma), and tears and rupture of tissue resulting from loss of structural integrity attributable to invasive and destructive properties of neoplasms such as hemangiosarcomas (see Chapters 2 and 6). Effusions. See the discussions on the mechanisms of edema formation and Figs. 2-6 through 2-10Fig. 2-6Fig. 2-7Fig. 2-8Fig. 2-9Fig. 2-10 in Chapter 2 and on the formation of transudates and exudates and Fig. 3-3 in Chapter 3. Pericardial Dilatation. The pericardium responds to excess fluid in the pericardial space by dilation. However, this outcome requires adequate time to allow adjustments in size. In hemopericardium, blood rapidly fills the pericardial cavity and death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition with compression of the heart caused by blood accumulation leading to reduced cardiac output. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( Fig. 10-56 ). In cases associated with vascular injury, a few fibrin strands are present, and the fluid could clot after exposure to air. Figure 10-56 Hydropericardium, Pericardial Sac, Pig. The thin-walled dilated pericardial sac contains serous fluid that has accumulated secondary to alterations in hydrostatic pressure between the pericardial cavity, circulatory system, and lymphatic system. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hydropericardium. Hydropericardium occurs in those diseases that have generalized edema (see Fig. 10-56 ). Thus ascites and hydrothorax often occur concurrently with hydropericardium. Congestive heart failure is an important mechanism of hydropericardium and is usually the result of primary myocardial, valvular, congenital, or neoplastic diseases. Common specific diseases include dilated cardiomyopathy of dogs and cats and "ascites syndrome" of poultry. Hydropericardium can also accompany pulmonary hypertension (e.g., "brisket disease" or "high-altitude disease" of cattle), renal failure, and hypoproteinemia from various chronic debilitating diseases. Hydropericardium can also occur in various systemic diseases with vascular injury, such as septicemia in pigs, "heartwater" ( Cowdria ruminantium infection) in small ruminants, African horse sickness, and bovine ephemeral fever. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( E-Fig. 10-21 ; also see Fig. 10-56 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). As examples, hydropericardium can occur in animals with (1) hypoproteinemia (decreased colloid osmotic pressure) caused by liver disease or protein-losing nephropathy/enteropathy; (2) heart failure (increased hydrostatic pressure) where there is poor venous return to the heart; and (3) vascular injury, where damage to the barrier function of the vascular wall can result in leakage of small quantities of plasma proteins. In this latter example, a few fibrin strands can be present and the fluid could clot after exposure to air. The pericardial surfaces are smooth and glistening in acute cases, but in chronic cases, the epicardium becomes opaque because of mild fibrous thickening and can appear roughened and granular when there is villous proliferation of fibrous tissue, especially over the atria. The mechanisms involved in these fluid shifts are discussed in Chapters 2 and 3. E-Figure 10-21 Hydropericardium, Chicken. Note the accumulation of clear yellow fluid (transudate) in the pericardial cavity. This fluid may occur as a result of hypoproteinemia, heart failure, and vascular injury. If this accumulation is rapid, it compresses the heart (H) and great vessels, leading to a condition known as "cardiac tamponade," which restricts venous return to the heart and reduces the end diastolic pumping volume of the heart. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hemopericardium. Hemopericardium is an accumulation of whole blood in the pericardial sac ( Figs. 10-57 and 10-58 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). Death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition in which the compression of the heart caused by the accumulation of blood in the pericardial sac leads to reduced cardiac output and poor perfusion of vascular beds in all organ systems. As examples, hemopericardium may be caused by blunt force trauma (impact with an automobile) or from rupture of the wall of the right atrium after invasion by a hemangiosarcoma. Figure 10-57 Hemopericardium (Cardiac Tamponade), Right Atrium, Hemangiosarcoma, Heart, Dog. The pericardium is distended and dark blue because it contains whole blood secondary to rupture of an atrial hemangiosarcoma. Hemopericardium can cause death if it is sudden and is of sufficient volume to compress the heart and thus reduce cardiac output, a condition known as cardiac tamponade. On clinical examination, heart sounds are muffled. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-58 Hemopericardium, Pericardial Sac (Opened), Dog. The pericardial sac is filled with clotted blood. Hemorrhage into a body cavity results in pooling of coagulated or uncoagulated blood within that cavity. (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Bleeding into the pericardial sac can result from spontaneous atrial rupture in dogs, atrial rupture in dogs with hemangiosarcoma, rupture of the intrapericardial aorta or pulmonary artery in horses, or as a complication of intracardiac injections (see Figs. 10-57 and 10-58 ). Disturbances of Growth Serous Atrophy. Serous atrophy of fat is readily identified by the gray gelatinous appearance of epicardial fat deposits ( Fig. 10-59 ). Healthy animals normally have abundant white or yellow epicardial fat deposits, especially along the AV junction. Microscopically, lipocytes are atrophic, and edema is present in the interstitial tissue. Serous atrophy of epicardial fat occurs rapidly during anorexia, starvation, or cachexia because fat is catabolized to maintain energy balance. Figure 10-59 Serous Atrophy of Fat, Heart, Epicardium, Cow. The epicardial fat deposits are gray and gelatinous (arrows) , indicating that fat has been catabolized, for example, as in the early stages of starvation. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Cell Degeneration and Death Epicardial Calcification. Epicardial calcification is a feature in hereditary calcinosis in mice and cardiomyopathy in hamsters ( E-Fig. 10-22 ). Myocardial mineralization (discussed later) may be visible on the epicardial surface in vitamin E–selenium deficiency in sheep and cattle, vitamin D toxicity in several species, calcinogenic plant toxicosis in cattle ("Manchester wasting disease"), and spontaneous myocardial calcification in aged rats and guinea pigs. E-Figure 10-22 Epicardial Calcification, Heart, Right Ventricle, Mouse. A, Note the prominent white mineral deposits over the right ventricle (RV). B, The basophilic mineral deposits are present epicardially and in the outer myocardium (left). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Gout. Visceral gout has not been reported in domestic animals but does occur in birds and reptiles ( E-Fig. 10-23 ; see Chapter 1). E-Figure 10-23 Visceral Gout, Heart, Pericardium, Chicken. White urate deposits are present on the epicardial surface. (Courtesy College of Veterinary Medicine, The Ohio State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Inflammation Pericarditis. Inflammation of the pericardium is frequently seen with bacterial septicemias and typically results in fibrinous pericarditis. Grossly, both the visceral and parietal pericardial surfaces are covered by variable amounts of yellow fibrin deposits, which can result in adherence between the parietal and visceral layers. When the pericardial sac is opened, the attachments are torn away (so-called bread-and-butter heart) ( Fig. 10-60 ). Microscopically, an eosinophilic layer of fibrin with admixed neutrophils lies over a congested epicardium ( Fig. 10-61 ). Figure 10-60 Fibrinous Pericarditis, Heart, Epicardium, Horse. The epicardium is covered dorsally by a thick, yellow layer of fibrin (arrows) and ventrally by granulation tissue (finely granular surface) , thus indicating the chronicity of the inflammatory process. The apposing parietal pericardium (not shown) was also covered with fibrin. This lesion commonly occurs in horses with Streptococcus equi subsp. zooepidemicus septicemia causing vasculitis. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-61 Fibrinous Pericarditis, Heart, Epicardium, Pig. Note eosinophilic fibrin deposits (E) (left) on the epicardial surface. This lesion commonly occurs with septicemias by bacteria that cause vasculitis. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The outcome of fibrinous pericarditis varies. Early death is frequent because many of these lesions result from infection by highly virulent bacteria and concurrent septicemia. When survival is prolonged, adhesions form between the pericardial surfaces after fibrous organization of the exudate. Suppurative pericarditis is seen mainly in cattle as a complication of traumatic reticuloperitonitis ("hardware disease"). Foreign bodies, such as nails or pieces of wire that accumulate in the reticulum, occasionally penetrate the reticular wall and diaphragm, enter the adjacent pericardial sac, and introduce infection. Some affected cattle survive for weeks to months until death ensues from congestive heart failure or septicemia. Grossly, the pericardial surfaces are notably thickened by white, often rough, shaggy-appearing masses of fibrous connective tissue that enclose an accumulation of white to gray, thick, foul-smelling, purulent exudate ( Fig. 10-62 ). Figure 10-62 Chronic Suppurative (Active) Pericarditis, Traumatic Reticuloperitonitis ("Hardware Disease"), Heart, Pericardial Sac (Opened), Cow. The exposed epicardial and parietal surfaces are notably thickened by fibrous connective tissue and covered by a fibrinopurulent exudate. On clinical examination, heart sounds are muffled. P, Reflected parietal pericardium. (Courtesy Dr. J. King, College of Veterinary Medicine, Cornell University.) Constrictive pericarditis is a chronic inflammatory lesion of the pericardium accompanied by extensive fibrous proliferation and eventual formation of fibrous adhesions between the surfaces of the visceral and parietal pericardium. The condition is seen in some cases of suppurative pericarditis in cattle and pigs with chronic fibrinous pericarditis. Severe lesions obliterate the pericardial sac and constrict the heart with fibrous tissue and can interfere with cardiac filling and thus cardiac output. Compensatory myocardial hypertrophy can result in diminished ventricular chamber volumes and contribute to the eventual development of heart failure. Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Disturbances of Circulation Hemorrhage. Hemorrhage involving the pericardium and epicardium (see Fig. 10-24 ; see E-Fig. 10-18 ) results from stretching, tearing, lacerating, or crushing blood vessels in these structures and may be caused by penetrating wounds (foreign objects, bullets, or knives), lacerations from fractured bone, shear forces that stretch and ultimately tear vessels in tissues (blunt force trauma), and tears and rupture of tissue resulting from loss of structural integrity attributable to invasive and destructive properties of neoplasms such as hemangiosarcomas (see Chapters 2 and 6). Effusions. See the discussions on the mechanisms of edema formation and Figs. 2-6 through 2-10Fig. 2-6Fig. 2-7Fig. 2-8Fig. 2-9Fig. 2-10 in Chapter 2 and on the formation of transudates and exudates and Fig. 3-3 in Chapter 3. Pericardial Dilatation. The pericardium responds to excess fluid in the pericardial space by dilation. However, this outcome requires adequate time to allow adjustments in size. In hemopericardium, blood rapidly fills the pericardial cavity and death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition with compression of the heart caused by blood accumulation leading to reduced cardiac output. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( Fig. 10-56 ). In cases associated with vascular injury, a few fibrin strands are present, and the fluid could clot after exposure to air. Figure 10-56 Hydropericardium, Pericardial Sac, Pig. The thin-walled dilated pericardial sac contains serous fluid that has accumulated secondary to alterations in hydrostatic pressure between the pericardial cavity, circulatory system, and lymphatic system. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hydropericardium. Hydropericardium occurs in those diseases that have generalized edema (see Fig. 10-56 ). Thus ascites and hydrothorax often occur concurrently with hydropericardium. Congestive heart failure is an important mechanism of hydropericardium and is usually the result of primary myocardial, valvular, congenital, or neoplastic diseases. Common specific diseases include dilated cardiomyopathy of dogs and cats and "ascites syndrome" of poultry. Hydropericardium can also accompany pulmonary hypertension (e.g., "brisket disease" or "high-altitude disease" of cattle), renal failure, and hypoproteinemia from various chronic debilitating diseases. Hydropericardium can also occur in various systemic diseases with vascular injury, such as septicemia in pigs, "heartwater" ( Cowdria ruminantium infection) in small ruminants, African horse sickness, and bovine ephemeral fever. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( E-Fig. 10-21 ; also see Fig. 10-56 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). As examples, hydropericardium can occur in animals with (1) hypoproteinemia (decreased colloid osmotic pressure) caused by liver disease or protein-losing nephropathy/enteropathy; (2) heart failure (increased hydrostatic pressure) where there is poor venous return to the heart; and (3) vascular injury, where damage to the barrier function of the vascular wall can result in leakage of small quantities of plasma proteins. In this latter example, a few fibrin strands can be present and the fluid could clot after exposure to air. The pericardial surfaces are smooth and glistening in acute cases, but in chronic cases, the epicardium becomes opaque because of mild fibrous thickening and can appear roughened and granular when there is villous proliferation of fibrous tissue, especially over the atria. The mechanisms involved in these fluid shifts are discussed in Chapters 2 and 3. E-Figure 10-21 Hydropericardium, Chicken. Note the accumulation of clear yellow fluid (transudate) in the pericardial cavity. This fluid may occur as a result of hypoproteinemia, heart failure, and vascular injury. If this accumulation is rapid, it compresses the heart (H) and great vessels, leading to a condition known as "cardiac tamponade," which restricts venous return to the heart and reduces the end diastolic pumping volume of the heart. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hemopericardium. Hemopericardium is an accumulation of whole blood in the pericardial sac ( Figs. 10-57 and 10-58 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). Death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition in which the compression of the heart caused by the accumulation of blood in the pericardial sac leads to reduced cardiac output and poor perfusion of vascular beds in all organ systems. As examples, hemopericardium may be caused by blunt force trauma (impact with an automobile) or from rupture of the wall of the right atrium after invasion by a hemangiosarcoma. Figure 10-57 Hemopericardium (Cardiac Tamponade), Right Atrium, Hemangiosarcoma, Heart, Dog. The pericardium is distended and dark blue because it contains whole blood secondary to rupture of an atrial hemangiosarcoma. Hemopericardium can cause death if it is sudden and is of sufficient volume to compress the heart and thus reduce cardiac output, a condition known as cardiac tamponade. On clinical examination, heart sounds are muffled. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-58 Hemopericardium, Pericardial Sac (Opened), Dog. The pericardial sac is filled with clotted blood. Hemorrhage into a body cavity results in pooling of coagulated or uncoagulated blood within that cavity. (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Bleeding into the pericardial sac can result from spontaneous atrial rupture in dogs, atrial rupture in dogs with hemangiosarcoma, rupture of the intrapericardial aorta or pulmonary artery in horses, or as a complication of intracardiac injections (see Figs. 10-57 and 10-58 ). Hemorrhage. Hemorrhage involving the pericardium and epicardium (see Fig. 10-24 ; see E-Fig. 10-18 ) results from stretching, tearing, lacerating, or crushing blood vessels in these structures and may be caused by penetrating wounds (foreign objects, bullets, or knives), lacerations from fractured bone, shear forces that stretch and ultimately tear vessels in tissues (blunt force trauma), and tears and rupture of tissue resulting from loss of structural integrity attributable to invasive and destructive properties of neoplasms such as hemangiosarcomas (see Chapters 2 and 6). Effusions. See the discussions on the mechanisms of edema formation and Figs. 2-6 through 2-10Fig. 2-6Fig. 2-7Fig. 2-8Fig. 2-9Fig. 2-10 in Chapter 2 and on the formation of transudates and exudates and Fig. 3-3 in Chapter 3. Pericardial Dilatation. The pericardium responds to excess fluid in the pericardial space by dilation. However, this outcome requires adequate time to allow adjustments in size. In hemopericardium, blood rapidly fills the pericardial cavity and death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition with compression of the heart caused by blood accumulation leading to reduced cardiac output. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( Fig. 10-56 ). In cases associated with vascular injury, a few fibrin strands are present, and the fluid could clot after exposure to air. Figure 10-56 Hydropericardium, Pericardial Sac, Pig. The thin-walled dilated pericardial sac contains serous fluid that has accumulated secondary to alterations in hydrostatic pressure between the pericardial cavity, circulatory system, and lymphatic system. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hydropericardium. Hydropericardium occurs in those diseases that have generalized edema (see Fig. 10-56 ). Thus ascites and hydrothorax often occur concurrently with hydropericardium. Congestive heart failure is an important mechanism of hydropericardium and is usually the result of primary myocardial, valvular, congenital, or neoplastic diseases. Common specific diseases include dilated cardiomyopathy of dogs and cats and "ascites syndrome" of poultry. Hydropericardium can also accompany pulmonary hypertension (e.g., "brisket disease" or "high-altitude disease" of cattle), renal failure, and hypoproteinemia from various chronic debilitating diseases. Hydropericardium can also occur in various systemic diseases with vascular injury, such as septicemia in pigs, "heartwater" ( Cowdria ruminantium infection) in small ruminants, African horse sickness, and bovine ephemeral fever. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( E-Fig. 10-21 ; also see Fig. 10-56 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). As examples, hydropericardium can occur in animals with (1) hypoproteinemia (decreased colloid osmotic pressure) caused by liver disease or protein-losing nephropathy/enteropathy; (2) heart failure (increased hydrostatic pressure) where there is poor venous return to the heart; and (3) vascular injury, where damage to the barrier function of the vascular wall can result in leakage of small quantities of plasma proteins. In this latter example, a few fibrin strands can be present and the fluid could clot after exposure to air. The pericardial surfaces are smooth and glistening in acute cases, but in chronic cases, the epicardium becomes opaque because of mild fibrous thickening and can appear roughened and granular when there is villous proliferation of fibrous tissue, especially over the atria. The mechanisms involved in these fluid shifts are discussed in Chapters 2 and 3. E-Figure 10-21 Hydropericardium, Chicken. Note the accumulation of clear yellow fluid (transudate) in the pericardial cavity. This fluid may occur as a result of hypoproteinemia, heart failure, and vascular injury. If this accumulation is rapid, it compresses the heart (H) and great vessels, leading to a condition known as "cardiac tamponade," which restricts venous return to the heart and reduces the end diastolic pumping volume of the heart. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hemopericardium. Hemopericardium is an accumulation of whole blood in the pericardial sac ( Figs. 10-57 and 10-58 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). Death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition in which the compression of the heart caused by the accumulation of blood in the pericardial sac leads to reduced cardiac output and poor perfusion of vascular beds in all organ systems. As examples, hemopericardium may be caused by blunt force trauma (impact with an automobile) or from rupture of the wall of the right atrium after invasion by a hemangiosarcoma. Figure 10-57 Hemopericardium (Cardiac Tamponade), Right Atrium, Hemangiosarcoma, Heart, Dog. The pericardium is distended and dark blue because it contains whole blood secondary to rupture of an atrial hemangiosarcoma. Hemopericardium can cause death if it is sudden and is of sufficient volume to compress the heart and thus reduce cardiac output, a condition known as cardiac tamponade. On clinical examination, heart sounds are muffled. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-58 Hemopericardium, Pericardial Sac (Opened), Dog. The pericardial sac is filled with clotted blood. Hemorrhage into a body cavity results in pooling of coagulated or uncoagulated blood within that cavity. (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Bleeding into the pericardial sac can result from spontaneous atrial rupture in dogs, atrial rupture in dogs with hemangiosarcoma, rupture of the intrapericardial aorta or pulmonary artery in horses, or as a complication of intracardiac injections (see Figs. 10-57 and 10-58 ). Pericardial Dilatation. The pericardium responds to excess fluid in the pericardial space by dilation. However, this outcome requires adequate time to allow adjustments in size. In hemopericardium, blood rapidly fills the pericardial cavity and death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition with compression of the heart caused by blood accumulation leading to reduced cardiac output. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( Fig. 10-56 ). In cases associated with vascular injury, a few fibrin strands are present, and the fluid could clot after exposure to air. Figure 10-56 Hydropericardium, Pericardial Sac, Pig. The thin-walled dilated pericardial sac contains serous fluid that has accumulated secondary to alterations in hydrostatic pressure between the pericardial cavity, circulatory system, and lymphatic system. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hydropericardium. Hydropericardium occurs in those diseases that have generalized edema (see Fig. 10-56 ). Thus ascites and hydrothorax often occur concurrently with hydropericardium. Congestive heart failure is an important mechanism of hydropericardium and is usually the result of primary myocardial, valvular, congenital, or neoplastic diseases. Common specific diseases include dilated cardiomyopathy of dogs and cats and "ascites syndrome" of poultry. Hydropericardium can also accompany pulmonary hypertension (e.g., "brisket disease" or "high-altitude disease" of cattle), renal failure, and hypoproteinemia from various chronic debilitating diseases. Hydropericardium can also occur in various systemic diseases with vascular injury, such as septicemia in pigs, "heartwater" ( Cowdria ruminantium infection) in small ruminants, African horse sickness, and bovine ephemeral fever. Hydropericardium is the accumulation of clear, light yellow, watery, serous fluid (i.e., transudate) in the pericardial sac ( E-Fig. 10-21 ; also see Fig. 10-56 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). As examples, hydropericardium can occur in animals with (1) hypoproteinemia (decreased colloid osmotic pressure) caused by liver disease or protein-losing nephropathy/enteropathy; (2) heart failure (increased hydrostatic pressure) where there is poor venous return to the heart; and (3) vascular injury, where damage to the barrier function of the vascular wall can result in leakage of small quantities of plasma proteins. In this latter example, a few fibrin strands can be present and the fluid could clot after exposure to air. The pericardial surfaces are smooth and glistening in acute cases, but in chronic cases, the epicardium becomes opaque because of mild fibrous thickening and can appear roughened and granular when there is villous proliferation of fibrous tissue, especially over the atria. The mechanisms involved in these fluid shifts are discussed in Chapters 2 and 3. E-Figure 10-21 Hydropericardium, Chicken. Note the accumulation of clear yellow fluid (transudate) in the pericardial cavity. This fluid may occur as a result of hypoproteinemia, heart failure, and vascular injury. If this accumulation is rapid, it compresses the heart (H) and great vessels, leading to a condition known as "cardiac tamponade," which restricts venous return to the heart and reduces the end diastolic pumping volume of the heart. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Hemopericardium. Hemopericardium is an accumulation of whole blood in the pericardial sac ( Figs. 10-57 and 10-58 ; also see section on Disorders of Domestic Animals ). Death often occurs unexpectedly from cardiac tamponade, a condition in which the compression of the heart caused by the accumulation of blood in the pericardial sac leads to reduced cardiac output and poor perfusion of vascular beds in all organ systems. As examples, hemopericardium may be caused by blunt force trauma (impact with an automobile) or from rupture of the wall of the right atrium after invasion by a hemangiosarcoma. Figure 10-57 Hemopericardium (Cardiac Tamponade), Right Atrium, Hemangiosarcoma, Heart, Dog. The pericardium is distended and dark blue because it contains whole blood secondary to rupture of an atrial hemangiosarcoma. Hemopericardium can cause death if it is sudden and is of sufficient volume to compress the heart and thus reduce cardiac output, a condition known as cardiac tamponade. On clinical examination, heart sounds are muffled. (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-58 Hemopericardium, Pericardial Sac (Opened), Dog. The pericardial sac is filled with clotted blood. Hemorrhage into a body cavity results in pooling of coagulated or uncoagulated blood within that cavity. (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Bleeding into the pericardial sac can result from spontaneous atrial rupture in dogs, atrial rupture in dogs with hemangiosarcoma, rupture of the intrapericardial aorta or pulmonary artery in horses, or as a complication of intracardiac injections (see Figs. 10-57 and 10-58 ). Disturbances of Growth Serous Atrophy. Serous atrophy of fat is readily identified by the gray gelatinous appearance of epicardial fat deposits ( Fig. 10-59 ). Healthy animals normally have abundant white or yellow epicardial fat deposits, especially along the AV junction. Microscopically, lipocytes are atrophic, and edema is present in the interstitial tissue. Serous atrophy of epicardial fat occurs rapidly during anorexia, starvation, or cachexia because fat is catabolized to maintain energy balance. Figure 10-59 Serous Atrophy of Fat, Heart, Epicardium, Cow. The epicardial fat deposits are gray and gelatinous (arrows) , indicating that fat has been catabolized, for example, as in the early stages of starvation. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Serous Atrophy. Serous atrophy of fat is readily identified by the gray gelatinous appearance of epicardial fat deposits ( Fig. 10-59 ). Healthy animals normally have abundant white or yellow epicardial fat deposits, especially along the AV junction. Microscopically, lipocytes are atrophic, and edema is present in the interstitial tissue. Serous atrophy of epicardial fat occurs rapidly during anorexia, starvation, or cachexia because fat is catabolized to maintain energy balance. Figure 10-59 Serous Atrophy of Fat, Heart, Epicardium, Cow. The epicardial fat deposits are gray and gelatinous (arrows) , indicating that fat has been catabolized, for example, as in the early stages of starvation. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Cell Degeneration and Death Epicardial Calcification. Epicardial calcification is a feature in hereditary calcinosis in mice and cardiomyopathy in hamsters ( E-Fig. 10-22 ). Myocardial mineralization (discussed later) may be visible on the epicardial surface in vitamin E–selenium deficiency in sheep and cattle, vitamin D toxicity in several species, calcinogenic plant toxicosis in cattle ("Manchester wasting disease"), and spontaneous myocardial calcification in aged rats and guinea pigs. E-Figure 10-22 Epicardial Calcification, Heart, Right Ventricle, Mouse. A, Note the prominent white mineral deposits over the right ventricle (RV). B, The basophilic mineral deposits are present epicardially and in the outer myocardium (left). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Gout. Visceral gout has not been reported in domestic animals but does occur in birds and reptiles ( E-Fig. 10-23 ; see Chapter 1). E-Figure 10-23 Visceral Gout, Heart, Pericardium, Chicken. White urate deposits are present on the epicardial surface. (Courtesy College of Veterinary Medicine, The Ohio State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Epicardial Calcification. Epicardial calcification is a feature in hereditary calcinosis in mice and cardiomyopathy in hamsters ( E-Fig. 10-22 ). Myocardial mineralization (discussed later) may be visible on the epicardial surface in vitamin E–selenium deficiency in sheep and cattle, vitamin D toxicity in several species, calcinogenic plant toxicosis in cattle ("Manchester wasting disease"), and spontaneous myocardial calcification in aged rats and guinea pigs. E-Figure 10-22 Epicardial Calcification, Heart, Right Ventricle, Mouse. A, Note the prominent white mineral deposits over the right ventricle (RV). B, The basophilic mineral deposits are present epicardially and in the outer myocardium (left). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Gout. Visceral gout has not been reported in domestic animals but does occur in birds and reptiles ( E-Fig. 10-23 ; see Chapter 1). E-Figure 10-23 Visceral Gout, Heart, Pericardium, Chicken. White urate deposits are present on the epicardial surface. (Courtesy College of Veterinary Medicine, The Ohio State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia.) Inflammation Pericarditis. Inflammation of the pericardium is frequently seen with bacterial septicemias and typically results in fibrinous pericarditis. Grossly, both the visceral and parietal pericardial surfaces are covered by variable amounts of yellow fibrin deposits, which can result in adherence between the parietal and visceral layers. When the pericardial sac is opened, the attachments are torn away (so-called bread-and-butter heart) ( Fig. 10-60 ). Microscopically, an eosinophilic layer of fibrin with admixed neutrophils lies over a congested epicardium ( Fig. 10-61 ). Figure 10-60 Fibrinous Pericarditis, Heart, Epicardium, Horse. The epicardium is covered dorsally by a thick, yellow layer of fibrin (arrows) and ventrally by granulation tissue (finely granular surface) , thus indicating the chronicity of the inflammatory process. The apposing parietal pericardium (not shown) was also covered with fibrin. This lesion commonly occurs in horses with Streptococcus equi subsp. zooepidemicus septicemia causing vasculitis. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-61 Fibrinous Pericarditis, Heart, Epicardium, Pig. Note eosinophilic fibrin deposits (E) (left) on the epicardial surface. This lesion commonly occurs with septicemias by bacteria that cause vasculitis. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The outcome of fibrinous pericarditis varies. Early death is frequent because many of these lesions result from infection by highly virulent bacteria and concurrent septicemia. When survival is prolonged, adhesions form between the pericardial surfaces after fibrous organization of the exudate. Suppurative pericarditis is seen mainly in cattle as a complication of traumatic reticuloperitonitis ("hardware disease"). Foreign bodies, such as nails or pieces of wire that accumulate in the reticulum, occasionally penetrate the reticular wall and diaphragm, enter the adjacent pericardial sac, and introduce infection. Some affected cattle survive for weeks to months until death ensues from congestive heart failure or septicemia. Grossly, the pericardial surfaces are notably thickened by white, often rough, shaggy-appearing masses of fibrous connective tissue that enclose an accumulation of white to gray, thick, foul-smelling, purulent exudate ( Fig. 10-62 ). Figure 10-62 Chronic Suppurative (Active) Pericarditis, Traumatic Reticuloperitonitis ("Hardware Disease"), Heart, Pericardial Sac (Opened), Cow. The exposed epicardial and parietal surfaces are notably thickened by fibrous connective tissue and covered by a fibrinopurulent exudate. On clinical examination, heart sounds are muffled. P, Reflected parietal pericardium. (Courtesy Dr. J. King, College of Veterinary Medicine, Cornell University.) Constrictive pericarditis is a chronic inflammatory lesion of the pericardium accompanied by extensive fibrous proliferation and eventual formation of fibrous adhesions between the surfaces of the visceral and parietal pericardium. The condition is seen in some cases of suppurative pericarditis in cattle and pigs with chronic fibrinous pericarditis. Severe lesions obliterate the pericardial sac and constrict the heart with fibrous tissue and can interfere with cardiac filling and thus cardiac output. Compensatory myocardial hypertrophy can result in diminished ventricular chamber volumes and contribute to the eventual development of heart failure. Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Pericarditis. Inflammation of the pericardium is frequently seen with bacterial septicemias and typically results in fibrinous pericarditis. Grossly, both the visceral and parietal pericardial surfaces are covered by variable amounts of yellow fibrin deposits, which can result in adherence between the parietal and visceral layers. When the pericardial sac is opened, the attachments are torn away (so-called bread-and-butter heart) ( Fig. 10-60 ). Microscopically, an eosinophilic layer of fibrin with admixed neutrophils lies over a congested epicardium ( Fig. 10-61 ). Figure 10-60 Fibrinous Pericarditis, Heart, Epicardium, Horse. The epicardium is covered dorsally by a thick, yellow layer of fibrin (arrows) and ventrally by granulation tissue (finely granular surface) , thus indicating the chronicity of the inflammatory process. The apposing parietal pericardium (not shown) was also covered with fibrin. This lesion commonly occurs in horses with Streptococcus equi subsp. zooepidemicus septicemia causing vasculitis. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-61 Fibrinous Pericarditis, Heart, Epicardium, Pig. Note eosinophilic fibrin deposits (E) (left) on the epicardial surface. This lesion commonly occurs with septicemias by bacteria that cause vasculitis. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) The outcome of fibrinous pericarditis varies. Early death is frequent because many of these lesions result from infection by highly virulent bacteria and concurrent septicemia. When survival is prolonged, adhesions form between the pericardial surfaces after fibrous organization of the exudate. Suppurative pericarditis is seen mainly in cattle as a complication of traumatic reticuloperitonitis ("hardware disease"). Foreign bodies, such as nails or pieces of wire that accumulate in the reticulum, occasionally penetrate the reticular wall and diaphragm, enter the adjacent pericardial sac, and introduce infection. Some affected cattle survive for weeks to months until death ensues from congestive heart failure or septicemia. Grossly, the pericardial surfaces are notably thickened by white, often rough, shaggy-appearing masses of fibrous connective tissue that enclose an accumulation of white to gray, thick, foul-smelling, purulent exudate ( Fig. 10-62 ). Figure 10-62 Chronic Suppurative (Active) Pericarditis, Traumatic Reticuloperitonitis ("Hardware Disease"), Heart, Pericardial Sac (Opened), Cow. The exposed epicardial and parietal surfaces are notably thickened by fibrous connective tissue and covered by a fibrinopurulent exudate. On clinical examination, heart sounds are muffled. P, Reflected parietal pericardium. (Courtesy Dr. J. King, College of Veterinary Medicine, Cornell University.) Constrictive pericarditis is a chronic inflammatory lesion of the pericardium accompanied by extensive fibrous proliferation and eventual formation of fibrous adhesions between the surfaces of the visceral and parietal pericardium. The condition is seen in some cases of suppurative pericarditis in cattle and pigs with chronic fibrinous pericarditis. Severe lesions obliterate the pericardial sac and constrict the heart with fibrous tissue and can interfere with cardiac filling and thus cardiac output. Compensatory myocardial hypertrophy can result in diminished ventricular chamber volumes and contribute to the eventual development of heart failure. Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems See the discussion on blood and lymphatic vascular systems in the section on Responses to Injury: Blood and Lymphatic Vascular Systems . The major arterial diseases are shown in Fig. 10-63 . Figure 10-63 Major Arterial Diseases. (Redrawn with permission from School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Blood Vessels Disturbances of Circulation Effusions. See the previous discussion on disturbances of circulation in the sections on Pericardium and Epicardium. Hemopericardium. See the later discussion on the hemopericardium under Effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium; Disturbances of Circulation . Hemothorax and Hemoabdomen. Hemothorax and hemoabdomen arise from spontaneous or traumatic rupture of large arteries or veins or from rupture of aneurysms located in the thoracic or abdominal cavity, respectively. An aneurysm is a localized dilation or outpouching of a thinned and weakened portion of a vessel. Usually, arteries are affected, especially large elastic arteries, but the lesion can also occur in veins. Known causes include copper deficiency in pigs ( Fig. 10-64 ) because copper is necessary for normal development of elastic tissue and damage from infection with Spirocerca lupi in dogs or Strongylus vulgaris in horses. Most cases are idiopathic. Dissecting aneurysms are infrequent but have been seen in birds, most notably turkeys ( Fig. 10-65 ). They result from disruption of the intima, which allows entry of blood into the media, and this dissects along the wall. Aneurysms can rupture. Usually the consequences are rapidly fatal because rather large arteries typically are involved. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-64 Dissecting Aneurysm, Copper Deficiency, Heart, Pulmonary Artery, Right Ventricle (RV), Pig. The dark, blood-filled, bulging segment of the wall of the pulmonary artery (arrows) has resulted from disruption of elastic fibers. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-65 Dissecting Aneurysm, Aorta, Turkey. Blood has dissected through the tunica media (in a nearby section of the aorta) and in this section has come to lie in the outer layers of the tunica media and adventitia. L, Vessel lumen. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Aortic Rupture and Rupture of Large Arteries. Aortic rupture and rupture of large arteries can be the sequela of severe trauma or occur spontaneously (see Figs. 10-64 and 10-65 ). Sudden rupture of the ascending aorta or pulmonary artery near the pulmonic valve in horses is associated with notable exertion and severe trauma to the ventral thorax from falling. Death ensues rapidly from cardiac tamponade because the tear is in that portion of the aorta or pulmonary artery within the pericardial sac. In horses, the internal carotid artery can rupture into the adjacent guttural pouch, with subsequent epistaxis. This is a consequence of deep mycotic infection of the guttural pouch. Rupture of the middle uterine artery may occur during parturition in mares and with uterine torsion or prolapse in cows. Aortic rupture, with or without dissection, is an important cause of death in male turkeys. The most common vascular diseases with rupture are listed in Box 10-15 . Box 10-15 Most Common Vascular Diseases with Rupture Aortic rupture: Horse, turkey Carotid artery rupture: Horse Thoracic duct rupture: Dog, cat Gastric Dilation and Volvulus. See the discussion on gastric dilation and volvulus in Chapter 7. Disturbances of Growth Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma. Cardiac hemangiosarcoma is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or by metastasis (secondary) from sites such as the spleen. This neoplasm is usually seen in the wall of the right atrium and only occasionally involves the right ventricle. The tumor arises from neoplastic transformation of vascular endothelium. Also see Disorders of Dogs , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth, Neoplastic Transformation, Hemangiosarcoma and Hemangioma. Vascular Melanosis. See the discussion on vascular melanosis in Chapters 1 and 2. Cell Degeneration and Death. Toxicants that affect vessels are listed in E-Box 10-1 . See Chapter 1. Generalized vascular degenerative diseases in animals are classified into the following three principal groups: • Arteriosclerosis • Atherosclerosis • Arterial medial calcification Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis also occur in all animal species. Arteriosclerosis. Arteriosclerosis is characterized by intimal fibrosis of large elastic arteries, atherosclerosis is characterized by intimal and medial lipid deposits in elastic and muscular arteries, and arterial medial calcification has characteristic mineralization of the walls of elastic and muscular arteries. Arteriosclerosis is an age-related disease that occurs frequently in many animal species but rarely causes clinical signs. The disease develops as chronic degenerative and proliferative responses in the arterial wall and results in loss of elasticity ("hardening of the arteries") and, less often, luminal narrowing. The abdominal aorta is most frequently affected, but other elastic arteries and peripheral large muscular vessels may be involved. Lesions are often localized around the orifices of arterial branches. Etiologic factors in the development of arteriosclerosis are not well defined, but the significant role of hemodynamic influences is suggested by the frequent involvement at arterial branching sites, in which blood flow is turbulent. Grossly, the lesions are seen as slightly raised, firm, white plaques. Microscopically, initially the intima is thickened by accumulation of mucopolysaccharides and later by the proliferation of smooth muscle cells in the tunica media and fibrous tissue infiltration into the intima. Splitting and fragmentation of the internal elastic lamina are common Atherosclerosis. Atherosclerosis, the vascular disease of greatest importance in human beings, occurs only infrequently in animals and rarely leads to clinical disease such as infarction of the heart or brain. The principal alteration is accumulation of deposits (atheroma) of lipid, fibrous tissue, and calcium in vessel walls, which eventually results in luminal narrowing. Many studies have established that the pig, rabbit, and chicken are susceptible to the experimental disease produced by the feeding of a high-cholesterol diet; the dog, cat, cow, goat, and rat are resistant. Lesions of the naturally occurring disease have been detected in aged pigs and birds (especially parrots) and in dogs with hypothyroidism and diabetes mellitus that develop an accompanying hypercholesterolemia. Arteries of the heart, mesentery, and kidneys are prominently thickened, firm, and yellow-white ( Fig. 10-66, A ). Microscopically, lipid globules accumulate in the cytoplasm of smooth muscle cells and macrophages, often termed foam cells , in the media and intima (see Fig. 10-66, B and C ). Necrosis and fibrosis develop in some arterial lesions. The pathogenesis of atherosclerosis has been extensively studied in human beings. The vascular response-to-injury hypothesis is the current proposed mechanism of injury. The dyslipoproteinemia associated with diabetes or hypothyroidism in the dog results in endothelial injury. A variety of mechanisms, including oxygen free radical production, increase the decay of nitric oxide and decrease its vasodilator activity. The damaged endothelial cell allows lipoproteins to accumulate within the intima, where they are oxidized by free radicals generated by macrophages and endothelial cells. The oxidized products are directly toxic to endothelium and smooth muscle cells. Cellular debris is ingested by macrophages and smooth muscle cells, resulting in the formation of "foam cells." The lesion in dogs differs from that of human beings with respect to the location of lipid, which is abundant throughout the wall of the artery in contrast to human beings, who have lipid accumulation in the tunica intima. The chronic progression of atherosclerosis may result in narrowing of the lumen, ulceration and thrombosis, and hemorrhage or aneurysmal dilation. Figure 10-66 Coronary Atherosclerosis, Hypothyroidism, Heart, Left Ventricle, Dog. A, The affected coronary arteries are prominent and cordlike (arrows) with thickened walls. The diffuse and focal yellow areas in the walls of the arteries are the sites of atheromatous deposits. B, Note the extensive accumulation of lipid-laden (clear vacuoles) macrophages termed "foam cells" throughout the thickened tunica intima and media of this branch of the coronary artery. H&E stain. C, Higher magnification of B. The tunica intima contains abundant lipid-laden macrophages (arrows). Note the disruption of the endothelium with fibrin on the exposed luminal surface. This condition is highly unstable and is prone to activation of Virchow's triad and the coagulation cascade with the formation of mural thrombi and infarction of myocardium supplied by this artery. The arrowheads identify the internal elastic lamina of the tunica intima. H&E stain. ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B and C courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Arterial Medial Calcification. Arterial medial calcification is a frequent lesion in animals that often have concurrent endocardial mineralization and involves both elastic and muscular arteries. The causes of arterial medial calcification include calcinogenic plant toxicosis, vitamin D toxicosis, renal insufficiency, and severe debilitation, as seen in cattle with Johne's disease (see Fig. 10-53 ). Medial calcification occurs spontaneously in horses, rabbits, aged guinea pigs, and in rats with chronic renal disease. Affected arteries, such as the aorta, have a unique gross appearance; they appear as solid, dense, pipelike structures with raised, white, solid intimal plaques ( Fig. 10-67 ). Microscopically, in elastic arteries, prominent basophilic granular mineral deposits are present on elastic fibers of the media, but in muscular arteries, they can form a complete ring of mineralization in the tunica media ( Fig. 10-68 ). Siderocalcinosis (so-called iron rings), the result of deposition of both iron and calcium salts, occurs in the cerebral arteries of aged horses. Lesions in the surrounding brain tissue are generally absent. Siderocalcinosis lesions are considered incidental. Figure 10-67 Calcification, Vitamin D Toxicosis, Aorta, Rabbit. The aorta is firm and inelastic because of the calcium deposits in the tunica intima and media. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-68 Medial Calcification, Aorta, Cow. Note the layer of mineralization (between arrows) in the middle of the tunica media. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Hyaline Degeneration, Fibrinoid Necrosis, and Amyloidosis. Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis are vascular lesions of small muscular arteries and arterioles and occur in all animal species. These lesions are generally not detected grossly, but in some diseases with fibrinoid necrosis of vessels, hemorrhages and edema are seen in affected organs at necropsy. The microscopic feature shared by these lesions is the formation of a homogeneous eosinophilic zone in the vessel wall ( Fig. 10-69 ; also see Fig. 10-78 ). Special stains allow differentiation into three types: (1) amyloid confirmed by Congo red and methyl violet; (2) fibrinoid deposits, positive by the periodic acid–Schiff technique; and (3) negative staining of hyaline deposits by these stains. Amyloidosis and hyaline degeneration are often observed in small muscular arteries of the myocardium, lungs, and spleen of old dogs. Lesions in the intramyocardial arteries can cause small foci of myocardial infarction. Figure 10-69 Fibrinoid Necrosis of Small Arteries, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. Note the circumferential eosinophilic (arrows) material in the walls of the arterioles and the extensive edema and mild hemorrhage in surrounding submucosa. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid necrosis of arteries is associated with endothelial damage and is characterized by entry and accumulation of serum proteins followed by fibrin polymerization in the vessel wall. These materials form an intensely eosinophilic collar that obliterates cellular detail. This lesion is frequent in many acute degenerative and inflammatory diseases of small arteries and arterioles. Fibrinoid necrosis is seen frequently in dogs with uremia and in dogs with hypertension, although hypertension is an uncommon finding in animals. Vitamin E–Selenium Deficiency. See the discussion on vitamin E–selenium deficiency in the section on Disorders of Pigs . Inflammation Omphalophlebitis ("Navel Ill"). Omphalophlebitis ("navel ill") is inflammation of the umbilical vein that often occurs in neonatal farm animals because of bacterial contamination of the umbilicus immediately after parturition. Bacteria from this site can cause septicemia, suppurative polyarthritis, hepatic abscesses (the umbilical vein drains into the liver), and umbilical abscesses. Jugular Thrombophlebitis. Jugular thrombophlebitis may be associated with indwelling jugular catheters and is reported to be increased with several concurrent disease conditions, such as hypoproteinemia, salmonellosis, endotoxemia, and large intestinal disease (see Fig. 10-27 ). The most common diseases with thrombosis and embolism are listed in Box 10-16 . Box 10-16 Most Common Diseases with Thrombosis and/or Embolism in Animals Pulmonary thromboembolism: Dogs, cats Aortic thromboembolism in cats and dogs with cardiomyopathy: "Saddle" thrombi Aortoiliac thrombosis in horses: Verminous or idiopathic Verminous arteritis in horses: Strongylus vulgaris Septic embolism from lesions of vegetative endocarditis Fibrocartilaginous emboli: Dogs Conditions accompanied by DIC (e.g., hog cholera, ICH, FIP, Gram-negative endotoxemia) Thrombosis of caudal vena cava: Cattle DIC, Disseminated intravascular coagulation; FIP, feline infectious peritonitis; ICH, infectious canine hepatitis. Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Effusions Rupture of the Thoracic Duct. Rupture of the thoracic duct, either as a result of trauma or from spontaneous disruption, causes chylothorax in dogs and cats (see Fig. 9-116). However, many cases of chylothorax occur without injury to the thoracic duct and have been attributed to lesions that interfere with central venous return or produce obstruction of the thoracic duct (right-sided heart failure, neoplasms, granulomas, cranial vena cava thrombosis, or dirofilariasis) or that are idiopathic. Lymphedema. Lymphedema specifically refers to accumulation of fluid in interstitial space secondary to abnormal lymphatic absorption and should be differentiated from other causes of edema, such as hypoproteinemia, vasculitis, and increased hydrostatic pressure. Lymphatic fluid contains a variable amount of protein that may have an osmotic pressure that allows fluid to be drawn into the interstitial compartment from tissues with a lower osmotic gradient (protein concentration). Lymphedema can be divided into six etiologic categories: overload, inadequate collection, abnormal lymphatic contractility, insufficient lymphatic vessels, lymph node obstruction, and structural defects in lymphatic vessels. Primary lymphedema is caused by aplasia, hypoplasia, or dysplasia of lymphatic ducts, vessels, and/or lymph nodes, whereas secondary lymphedema is an acquired defect due to various disease processes (e.g., neoplasia, radiation, parasites). Primary lymphedema is rare in both dogs and cats, but it is more common in dogs. It can be temporary or permanent, and it usually affects the distal extremities, mainly of the hindlimbs. Secondary lymphedema due to lymphatic filariasis in cats is common in tropical countries and is caused by Brugia spp., such as Brugia malayi and Brugia pahangi . Chronic lymphedema, regardless of its etiology, results in secondary fibrosis, which worsens edema and creates a vicious cycle that leads to chronic progressive lymphedema. Disturbances of Growth. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Blood and Lymphatic Vascular Systems . Neoplastic Transformation. Lymphangioma is a rare benign neoplasm composed of lymphatic channels. Lymphangiosarcoma, the malignant counterpart, occurs more often than the benign neoplasm. Vascular spaces formed by neoplastic lymphatic endothelial cells contain lymph rather than blood. Lymphatic vessels are frequently invaded by primary carcinomas and are a common route of metastasis (see the section on Disorders of Dogs ). Inflammation Lymphangitis. Lymphangitis is a feature of many diseases (see Box 10-8 ). The affected vessels are often located in the distal limbs and are thick, cordlike structures ( Fig. 10-70 ). Lymphedema can be present. Nodular suppurative lesions of lymphangitis often ulcerate and discharge pus onto the surface of the skin. In Johne's disease, the mesenteric lymphatic vessels are often prominent because of granulomatous lymphangitis, an extension of the enteric infection producing a granulomatous enteritis and lymphangitis ( Fig. 10-71 ). Figure 10-70 Lymphangitis, Forelimb, Lymphatic Vessels, Horse. Note the multiple swellings (cordlike) of the afferent lymphatic vessels in the skin. These lymphatic vessels lie in the subcutis and empty into the caudal superficial cervical (prescapular) lymph node. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-71 Granulomatous Lymphangitis, Johne's Disease, Mesenteric Lymphatic Vessel, Sheep. The lymphatic is occluded by a fibrinous thrombus secondary to the destruction of the endothelium by inflammatory cells including macrophages. Early proliferating fibrous tissue and extensive edema (E) surround the lymphatic vessel. The adjacent artery (upper right) and vein (V) are unaffected. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Blood Vessels Disturbances of Circulation Effusions. See the previous discussion on disturbances of circulation in the sections on Pericardium and Epicardium. Hemopericardium. See the later discussion on the hemopericardium under Effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium; Disturbances of Circulation . Hemothorax and Hemoabdomen. Hemothorax and hemoabdomen arise from spontaneous or traumatic rupture of large arteries or veins or from rupture of aneurysms located in the thoracic or abdominal cavity, respectively. An aneurysm is a localized dilation or outpouching of a thinned and weakened portion of a vessel. Usually, arteries are affected, especially large elastic arteries, but the lesion can also occur in veins. Known causes include copper deficiency in pigs ( Fig. 10-64 ) because copper is necessary for normal development of elastic tissue and damage from infection with Spirocerca lupi in dogs or Strongylus vulgaris in horses. Most cases are idiopathic. Dissecting aneurysms are infrequent but have been seen in birds, most notably turkeys ( Fig. 10-65 ). They result from disruption of the intima, which allows entry of blood into the media, and this dissects along the wall. Aneurysms can rupture. Usually the consequences are rapidly fatal because rather large arteries typically are involved. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-64 Dissecting Aneurysm, Copper Deficiency, Heart, Pulmonary Artery, Right Ventricle (RV), Pig. The dark, blood-filled, bulging segment of the wall of the pulmonary artery (arrows) has resulted from disruption of elastic fibers. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-65 Dissecting Aneurysm, Aorta, Turkey. Blood has dissected through the tunica media (in a nearby section of the aorta) and in this section has come to lie in the outer layers of the tunica media and adventitia. L, Vessel lumen. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Aortic Rupture and Rupture of Large Arteries. Aortic rupture and rupture of large arteries can be the sequela of severe trauma or occur spontaneously (see Figs. 10-64 and 10-65 ). Sudden rupture of the ascending aorta or pulmonary artery near the pulmonic valve in horses is associated with notable exertion and severe trauma to the ventral thorax from falling. Death ensues rapidly from cardiac tamponade because the tear is in that portion of the aorta or pulmonary artery within the pericardial sac. In horses, the internal carotid artery can rupture into the adjacent guttural pouch, with subsequent epistaxis. This is a consequence of deep mycotic infection of the guttural pouch. Rupture of the middle uterine artery may occur during parturition in mares and with uterine torsion or prolapse in cows. Aortic rupture, with or without dissection, is an important cause of death in male turkeys. The most common vascular diseases with rupture are listed in Box 10-15 . Box 10-15 Most Common Vascular Diseases with Rupture Aortic rupture: Horse, turkey Carotid artery rupture: Horse Thoracic duct rupture: Dog, cat Gastric Dilation and Volvulus. See the discussion on gastric dilation and volvulus in Chapter 7. Disturbances of Growth Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma. Cardiac hemangiosarcoma is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or by metastasis (secondary) from sites such as the spleen. This neoplasm is usually seen in the wall of the right atrium and only occasionally involves the right ventricle. The tumor arises from neoplastic transformation of vascular endothelium. Also see Disorders of Dogs , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth, Neoplastic Transformation, Hemangiosarcoma and Hemangioma. Vascular Melanosis. See the discussion on vascular melanosis in Chapters 1 and 2. Cell Degeneration and Death. Toxicants that affect vessels are listed in E-Box 10-1 . See Chapter 1. Generalized vascular degenerative diseases in animals are classified into the following three principal groups: • Arteriosclerosis • Atherosclerosis • Arterial medial calcification Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis also occur in all animal species. Arteriosclerosis. Arteriosclerosis is characterized by intimal fibrosis of large elastic arteries, atherosclerosis is characterized by intimal and medial lipid deposits in elastic and muscular arteries, and arterial medial calcification has characteristic mineralization of the walls of elastic and muscular arteries. Arteriosclerosis is an age-related disease that occurs frequently in many animal species but rarely causes clinical signs. The disease develops as chronic degenerative and proliferative responses in the arterial wall and results in loss of elasticity ("hardening of the arteries") and, less often, luminal narrowing. The abdominal aorta is most frequently affected, but other elastic arteries and peripheral large muscular vessels may be involved. Lesions are often localized around the orifices of arterial branches. Etiologic factors in the development of arteriosclerosis are not well defined, but the significant role of hemodynamic influences is suggested by the frequent involvement at arterial branching sites, in which blood flow is turbulent. Grossly, the lesions are seen as slightly raised, firm, white plaques. Microscopically, initially the intima is thickened by accumulation of mucopolysaccharides and later by the proliferation of smooth muscle cells in the tunica media and fibrous tissue infiltration into the intima. Splitting and fragmentation of the internal elastic lamina are common Atherosclerosis. Atherosclerosis, the vascular disease of greatest importance in human beings, occurs only infrequently in animals and rarely leads to clinical disease such as infarction of the heart or brain. The principal alteration is accumulation of deposits (atheroma) of lipid, fibrous tissue, and calcium in vessel walls, which eventually results in luminal narrowing. Many studies have established that the pig, rabbit, and chicken are susceptible to the experimental disease produced by the feeding of a high-cholesterol diet; the dog, cat, cow, goat, and rat are resistant. Lesions of the naturally occurring disease have been detected in aged pigs and birds (especially parrots) and in dogs with hypothyroidism and diabetes mellitus that develop an accompanying hypercholesterolemia. Arteries of the heart, mesentery, and kidneys are prominently thickened, firm, and yellow-white ( Fig. 10-66, A ). Microscopically, lipid globules accumulate in the cytoplasm of smooth muscle cells and macrophages, often termed foam cells , in the media and intima (see Fig. 10-66, B and C ). Necrosis and fibrosis develop in some arterial lesions. The pathogenesis of atherosclerosis has been extensively studied in human beings. The vascular response-to-injury hypothesis is the current proposed mechanism of injury. The dyslipoproteinemia associated with diabetes or hypothyroidism in the dog results in endothelial injury. A variety of mechanisms, including oxygen free radical production, increase the decay of nitric oxide and decrease its vasodilator activity. The damaged endothelial cell allows lipoproteins to accumulate within the intima, where they are oxidized by free radicals generated by macrophages and endothelial cells. The oxidized products are directly toxic to endothelium and smooth muscle cells. Cellular debris is ingested by macrophages and smooth muscle cells, resulting in the formation of "foam cells." The lesion in dogs differs from that of human beings with respect to the location of lipid, which is abundant throughout the wall of the artery in contrast to human beings, who have lipid accumulation in the tunica intima. The chronic progression of atherosclerosis may result in narrowing of the lumen, ulceration and thrombosis, and hemorrhage or aneurysmal dilation. Figure 10-66 Coronary Atherosclerosis, Hypothyroidism, Heart, Left Ventricle, Dog. A, The affected coronary arteries are prominent and cordlike (arrows) with thickened walls. The diffuse and focal yellow areas in the walls of the arteries are the sites of atheromatous deposits. B, Note the extensive accumulation of lipid-laden (clear vacuoles) macrophages termed "foam cells" throughout the thickened tunica intima and media of this branch of the coronary artery. H&E stain. C, Higher magnification of B. The tunica intima contains abundant lipid-laden macrophages (arrows). Note the disruption of the endothelium with fibrin on the exposed luminal surface. This condition is highly unstable and is prone to activation of Virchow's triad and the coagulation cascade with the formation of mural thrombi and infarction of myocardium supplied by this artery. The arrowheads identify the internal elastic lamina of the tunica intima. H&E stain. ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B and C courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Arterial Medial Calcification. Arterial medial calcification is a frequent lesion in animals that often have concurrent endocardial mineralization and involves both elastic and muscular arteries. The causes of arterial medial calcification include calcinogenic plant toxicosis, vitamin D toxicosis, renal insufficiency, and severe debilitation, as seen in cattle with Johne's disease (see Fig. 10-53 ). Medial calcification occurs spontaneously in horses, rabbits, aged guinea pigs, and in rats with chronic renal disease. Affected arteries, such as the aorta, have a unique gross appearance; they appear as solid, dense, pipelike structures with raised, white, solid intimal plaques ( Fig. 10-67 ). Microscopically, in elastic arteries, prominent basophilic granular mineral deposits are present on elastic fibers of the media, but in muscular arteries, they can form a complete ring of mineralization in the tunica media ( Fig. 10-68 ). Siderocalcinosis (so-called iron rings), the result of deposition of both iron and calcium salts, occurs in the cerebral arteries of aged horses. Lesions in the surrounding brain tissue are generally absent. Siderocalcinosis lesions are considered incidental. Figure 10-67 Calcification, Vitamin D Toxicosis, Aorta, Rabbit. The aorta is firm and inelastic because of the calcium deposits in the tunica intima and media. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-68 Medial Calcification, Aorta, Cow. Note the layer of mineralization (between arrows) in the middle of the tunica media. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Hyaline Degeneration, Fibrinoid Necrosis, and Amyloidosis. Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis are vascular lesions of small muscular arteries and arterioles and occur in all animal species. These lesions are generally not detected grossly, but in some diseases with fibrinoid necrosis of vessels, hemorrhages and edema are seen in affected organs at necropsy. The microscopic feature shared by these lesions is the formation of a homogeneous eosinophilic zone in the vessel wall ( Fig. 10-69 ; also see Fig. 10-78 ). Special stains allow differentiation into three types: (1) amyloid confirmed by Congo red and methyl violet; (2) fibrinoid deposits, positive by the periodic acid–Schiff technique; and (3) negative staining of hyaline deposits by these stains. Amyloidosis and hyaline degeneration are often observed in small muscular arteries of the myocardium, lungs, and spleen of old dogs. Lesions in the intramyocardial arteries can cause small foci of myocardial infarction. Figure 10-69 Fibrinoid Necrosis of Small Arteries, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. Note the circumferential eosinophilic (arrows) material in the walls of the arterioles and the extensive edema and mild hemorrhage in surrounding submucosa. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid necrosis of arteries is associated with endothelial damage and is characterized by entry and accumulation of serum proteins followed by fibrin polymerization in the vessel wall. These materials form an intensely eosinophilic collar that obliterates cellular detail. This lesion is frequent in many acute degenerative and inflammatory diseases of small arteries and arterioles. Fibrinoid necrosis is seen frequently in dogs with uremia and in dogs with hypertension, although hypertension is an uncommon finding in animals. Vitamin E–Selenium Deficiency. See the discussion on vitamin E–selenium deficiency in the section on Disorders of Pigs . Inflammation Omphalophlebitis ("Navel Ill"). Omphalophlebitis ("navel ill") is inflammation of the umbilical vein that often occurs in neonatal farm animals because of bacterial contamination of the umbilicus immediately after parturition. Bacteria from this site can cause septicemia, suppurative polyarthritis, hepatic abscesses (the umbilical vein drains into the liver), and umbilical abscesses. Jugular Thrombophlebitis. Jugular thrombophlebitis may be associated with indwelling jugular catheters and is reported to be increased with several concurrent disease conditions, such as hypoproteinemia, salmonellosis, endotoxemia, and large intestinal disease (see Fig. 10-27 ). The most common diseases with thrombosis and embolism are listed in Box 10-16 . Box 10-16 Most Common Diseases with Thrombosis and/or Embolism in Animals Pulmonary thromboembolism: Dogs, cats Aortic thromboembolism in cats and dogs with cardiomyopathy: "Saddle" thrombi Aortoiliac thrombosis in horses: Verminous or idiopathic Verminous arteritis in horses: Strongylus vulgaris Septic embolism from lesions of vegetative endocarditis Fibrocartilaginous emboli: Dogs Conditions accompanied by DIC (e.g., hog cholera, ICH, FIP, Gram-negative endotoxemia) Thrombosis of caudal vena cava: Cattle DIC, Disseminated intravascular coagulation; FIP, feline infectious peritonitis; ICH, infectious canine hepatitis. Disturbances of Circulation Effusions. See the previous discussion on disturbances of circulation in the sections on Pericardium and Epicardium. Hemopericardium. See the later discussion on the hemopericardium under Effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium; Disturbances of Circulation . Hemothorax and Hemoabdomen. Hemothorax and hemoabdomen arise from spontaneous or traumatic rupture of large arteries or veins or from rupture of aneurysms located in the thoracic or abdominal cavity, respectively. An aneurysm is a localized dilation or outpouching of a thinned and weakened portion of a vessel. Usually, arteries are affected, especially large elastic arteries, but the lesion can also occur in veins. Known causes include copper deficiency in pigs ( Fig. 10-64 ) because copper is necessary for normal development of elastic tissue and damage from infection with Spirocerca lupi in dogs or Strongylus vulgaris in horses. Most cases are idiopathic. Dissecting aneurysms are infrequent but have been seen in birds, most notably turkeys ( Fig. 10-65 ). They result from disruption of the intima, which allows entry of blood into the media, and this dissects along the wall. Aneurysms can rupture. Usually the consequences are rapidly fatal because rather large arteries typically are involved. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-64 Dissecting Aneurysm, Copper Deficiency, Heart, Pulmonary Artery, Right Ventricle (RV), Pig. The dark, blood-filled, bulging segment of the wall of the pulmonary artery (arrows) has resulted from disruption of elastic fibers. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-65 Dissecting Aneurysm, Aorta, Turkey. Blood has dissected through the tunica media (in a nearby section of the aorta) and in this section has come to lie in the outer layers of the tunica media and adventitia. L, Vessel lumen. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Aortic Rupture and Rupture of Large Arteries. Aortic rupture and rupture of large arteries can be the sequela of severe trauma or occur spontaneously (see Figs. 10-64 and 10-65 ). Sudden rupture of the ascending aorta or pulmonary artery near the pulmonic valve in horses is associated with notable exertion and severe trauma to the ventral thorax from falling. Death ensues rapidly from cardiac tamponade because the tear is in that portion of the aorta or pulmonary artery within the pericardial sac. In horses, the internal carotid artery can rupture into the adjacent guttural pouch, with subsequent epistaxis. This is a consequence of deep mycotic infection of the guttural pouch. Rupture of the middle uterine artery may occur during parturition in mares and with uterine torsion or prolapse in cows. Aortic rupture, with or without dissection, is an important cause of death in male turkeys. The most common vascular diseases with rupture are listed in Box 10-15 . Box 10-15 Most Common Vascular Diseases with Rupture Aortic rupture: Horse, turkey Carotid artery rupture: Horse Thoracic duct rupture: Dog, cat Gastric Dilation and Volvulus. See the discussion on gastric dilation and volvulus in Chapter 7. Effusions. See the previous discussion on disturbances of circulation in the sections on Pericardium and Epicardium. Hemopericardium. See the later discussion on the hemopericardium under Effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium; Disturbances of Circulation . Hemothorax and Hemoabdomen. Hemothorax and hemoabdomen arise from spontaneous or traumatic rupture of large arteries or veins or from rupture of aneurysms located in the thoracic or abdominal cavity, respectively. An aneurysm is a localized dilation or outpouching of a thinned and weakened portion of a vessel. Usually, arteries are affected, especially large elastic arteries, but the lesion can also occur in veins. Known causes include copper deficiency in pigs ( Fig. 10-64 ) because copper is necessary for normal development of elastic tissue and damage from infection with Spirocerca lupi in dogs or Strongylus vulgaris in horses. Most cases are idiopathic. Dissecting aneurysms are infrequent but have been seen in birds, most notably turkeys ( Fig. 10-65 ). They result from disruption of the intima, which allows entry of blood into the media, and this dissects along the wall. Aneurysms can rupture. Usually the consequences are rapidly fatal because rather large arteries typically are involved. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-64 Dissecting Aneurysm, Copper Deficiency, Heart, Pulmonary Artery, Right Ventricle (RV), Pig. The dark, blood-filled, bulging segment of the wall of the pulmonary artery (arrows) has resulted from disruption of elastic fibers. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-65 Dissecting Aneurysm, Aorta, Turkey. Blood has dissected through the tunica media (in a nearby section of the aorta) and in this section has come to lie in the outer layers of the tunica media and adventitia. L, Vessel lumen. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Aortic Rupture and Rupture of Large Arteries. Aortic rupture and rupture of large arteries can be the sequela of severe trauma or occur spontaneously (see Figs. 10-64 and 10-65 ). Sudden rupture of the ascending aorta or pulmonary artery near the pulmonic valve in horses is associated with notable exertion and severe trauma to the ventral thorax from falling. Death ensues rapidly from cardiac tamponade because the tear is in that portion of the aorta or pulmonary artery within the pericardial sac. In horses, the internal carotid artery can rupture into the adjacent guttural pouch, with subsequent epistaxis. This is a consequence of deep mycotic infection of the guttural pouch. Rupture of the middle uterine artery may occur during parturition in mares and with uterine torsion or prolapse in cows. Aortic rupture, with or without dissection, is an important cause of death in male turkeys. The most common vascular diseases with rupture are listed in Box 10-15 . Box 10-15 Most Common Vascular Diseases with Rupture Aortic rupture: Horse, turkey Carotid artery rupture: Horse Thoracic duct rupture: Dog, cat Aortic Rupture and Rupture of Large Arteries. Aortic rupture and rupture of large arteries can be the sequela of severe trauma or occur spontaneously (see Figs. 10-64 and 10-65 ). Sudden rupture of the ascending aorta or pulmonary artery near the pulmonic valve in horses is associated with notable exertion and severe trauma to the ventral thorax from falling. Death ensues rapidly from cardiac tamponade because the tear is in that portion of the aorta or pulmonary artery within the pericardial sac. In horses, the internal carotid artery can rupture into the adjacent guttural pouch, with subsequent epistaxis. This is a consequence of deep mycotic infection of the guttural pouch. Rupture of the middle uterine artery may occur during parturition in mares and with uterine torsion or prolapse in cows. Aortic rupture, with or without dissection, is an important cause of death in male turkeys. The most common vascular diseases with rupture are listed in Box 10-15 . Box 10-15 Most Common Vascular Diseases with Rupture Aortic rupture: Horse, turkey Carotid artery rupture: Horse Thoracic duct rupture: Dog, cat Gastric Dilation and Volvulus. See the discussion on gastric dilation and volvulus in Chapter 7. Disturbances of Growth Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma. Cardiac hemangiosarcoma is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or by metastasis (secondary) from sites such as the spleen. This neoplasm is usually seen in the wall of the right atrium and only occasionally involves the right ventricle. The tumor arises from neoplastic transformation of vascular endothelium. Also see Disorders of Dogs , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth, Neoplastic Transformation, Hemangiosarcoma and Hemangioma. Vascular Melanosis. See the discussion on vascular melanosis in Chapters 1 and 2. Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma. Cardiac hemangiosarcoma is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or by metastasis (secondary) from sites such as the spleen. This neoplasm is usually seen in the wall of the right atrium and only occasionally involves the right ventricle. The tumor arises from neoplastic transformation of vascular endothelium. Also see Disorders of Dogs , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth, Neoplastic Transformation, Hemangiosarcoma and Hemangioma. Hemangiosarcoma. Cardiac hemangiosarcoma is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or by metastasis (secondary) from sites such as the spleen. This neoplasm is usually seen in the wall of the right atrium and only occasionally involves the right ventricle. The tumor arises from neoplastic transformation of vascular endothelium. Also see Disorders of Dogs , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth, Neoplastic Transformation, Hemangiosarcoma and Hemangioma. Vascular Melanosis. See the discussion on vascular melanosis in Chapters 1 and 2. Cell Degeneration and Death. Toxicants that affect vessels are listed in E-Box 10-1 . See Chapter 1. Generalized vascular degenerative diseases in animals are classified into the following three principal groups: • Arteriosclerosis • Atherosclerosis • Arterial medial calcification Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis also occur in all animal species. Arteriosclerosis. Arteriosclerosis is characterized by intimal fibrosis of large elastic arteries, atherosclerosis is characterized by intimal and medial lipid deposits in elastic and muscular arteries, and arterial medial calcification has characteristic mineralization of the walls of elastic and muscular arteries. Arteriosclerosis is an age-related disease that occurs frequently in many animal species but rarely causes clinical signs. The disease develops as chronic degenerative and proliferative responses in the arterial wall and results in loss of elasticity ("hardening of the arteries") and, less often, luminal narrowing. The abdominal aorta is most frequently affected, but other elastic arteries and peripheral large muscular vessels may be involved. Lesions are often localized around the orifices of arterial branches. Etiologic factors in the development of arteriosclerosis are not well defined, but the significant role of hemodynamic influences is suggested by the frequent involvement at arterial branching sites, in which blood flow is turbulent. Grossly, the lesions are seen as slightly raised, firm, white plaques. Microscopically, initially the intima is thickened by accumulation of mucopolysaccharides and later by the proliferation of smooth muscle cells in the tunica media and fibrous tissue infiltration into the intima. Splitting and fragmentation of the internal elastic lamina are common Atherosclerosis. Atherosclerosis, the vascular disease of greatest importance in human beings, occurs only infrequently in animals and rarely leads to clinical disease such as infarction of the heart or brain. The principal alteration is accumulation of deposits (atheroma) of lipid, fibrous tissue, and calcium in vessel walls, which eventually results in luminal narrowing. Many studies have established that the pig, rabbit, and chicken are susceptible to the experimental disease produced by the feeding of a high-cholesterol diet; the dog, cat, cow, goat, and rat are resistant. Lesions of the naturally occurring disease have been detected in aged pigs and birds (especially parrots) and in dogs with hypothyroidism and diabetes mellitus that develop an accompanying hypercholesterolemia. Arteries of the heart, mesentery, and kidneys are prominently thickened, firm, and yellow-white ( Fig. 10-66, A ). Microscopically, lipid globules accumulate in the cytoplasm of smooth muscle cells and macrophages, often termed foam cells , in the media and intima (see Fig. 10-66, B and C ). Necrosis and fibrosis develop in some arterial lesions. The pathogenesis of atherosclerosis has been extensively studied in human beings. The vascular response-to-injury hypothesis is the current proposed mechanism of injury. The dyslipoproteinemia associated with diabetes or hypothyroidism in the dog results in endothelial injury. A variety of mechanisms, including oxygen free radical production, increase the decay of nitric oxide and decrease its vasodilator activity. The damaged endothelial cell allows lipoproteins to accumulate within the intima, where they are oxidized by free radicals generated by macrophages and endothelial cells. The oxidized products are directly toxic to endothelium and smooth muscle cells. Cellular debris is ingested by macrophages and smooth muscle cells, resulting in the formation of "foam cells." The lesion in dogs differs from that of human beings with respect to the location of lipid, which is abundant throughout the wall of the artery in contrast to human beings, who have lipid accumulation in the tunica intima. The chronic progression of atherosclerosis may result in narrowing of the lumen, ulceration and thrombosis, and hemorrhage or aneurysmal dilation. Figure 10-66 Coronary Atherosclerosis, Hypothyroidism, Heart, Left Ventricle, Dog. A, The affected coronary arteries are prominent and cordlike (arrows) with thickened walls. The diffuse and focal yellow areas in the walls of the arteries are the sites of atheromatous deposits. B, Note the extensive accumulation of lipid-laden (clear vacuoles) macrophages termed "foam cells" throughout the thickened tunica intima and media of this branch of the coronary artery. H&E stain. C, Higher magnification of B. The tunica intima contains abundant lipid-laden macrophages (arrows). Note the disruption of the endothelium with fibrin on the exposed luminal surface. This condition is highly unstable and is prone to activation of Virchow's triad and the coagulation cascade with the formation of mural thrombi and infarction of myocardium supplied by this artery. The arrowheads identify the internal elastic lamina of the tunica intima. H&E stain. ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B and C courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Arterial Medial Calcification. Arterial medial calcification is a frequent lesion in animals that often have concurrent endocardial mineralization and involves both elastic and muscular arteries. The causes of arterial medial calcification include calcinogenic plant toxicosis, vitamin D toxicosis, renal insufficiency, and severe debilitation, as seen in cattle with Johne's disease (see Fig. 10-53 ). Medial calcification occurs spontaneously in horses, rabbits, aged guinea pigs, and in rats with chronic renal disease. Affected arteries, such as the aorta, have a unique gross appearance; they appear as solid, dense, pipelike structures with raised, white, solid intimal plaques ( Fig. 10-67 ). Microscopically, in elastic arteries, prominent basophilic granular mineral deposits are present on elastic fibers of the media, but in muscular arteries, they can form a complete ring of mineralization in the tunica media ( Fig. 10-68 ). Siderocalcinosis (so-called iron rings), the result of deposition of both iron and calcium salts, occurs in the cerebral arteries of aged horses. Lesions in the surrounding brain tissue are generally absent. Siderocalcinosis lesions are considered incidental. Figure 10-67 Calcification, Vitamin D Toxicosis, Aorta, Rabbit. The aorta is firm and inelastic because of the calcium deposits in the tunica intima and media. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-68 Medial Calcification, Aorta, Cow. Note the layer of mineralization (between arrows) in the middle of the tunica media. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Hyaline Degeneration, Fibrinoid Necrosis, and Amyloidosis. Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis are vascular lesions of small muscular arteries and arterioles and occur in all animal species. These lesions are generally not detected grossly, but in some diseases with fibrinoid necrosis of vessels, hemorrhages and edema are seen in affected organs at necropsy. The microscopic feature shared by these lesions is the formation of a homogeneous eosinophilic zone in the vessel wall ( Fig. 10-69 ; also see Fig. 10-78 ). Special stains allow differentiation into three types: (1) amyloid confirmed by Congo red and methyl violet; (2) fibrinoid deposits, positive by the periodic acid–Schiff technique; and (3) negative staining of hyaline deposits by these stains. Amyloidosis and hyaline degeneration are often observed in small muscular arteries of the myocardium, lungs, and spleen of old dogs. Lesions in the intramyocardial arteries can cause small foci of myocardial infarction. Figure 10-69 Fibrinoid Necrosis of Small Arteries, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. Note the circumferential eosinophilic (arrows) material in the walls of the arterioles and the extensive edema and mild hemorrhage in surrounding submucosa. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid necrosis of arteries is associated with endothelial damage and is characterized by entry and accumulation of serum proteins followed by fibrin polymerization in the vessel wall. These materials form an intensely eosinophilic collar that obliterates cellular detail. This lesion is frequent in many acute degenerative and inflammatory diseases of small arteries and arterioles. Fibrinoid necrosis is seen frequently in dogs with uremia and in dogs with hypertension, although hypertension is an uncommon finding in animals. Vitamin E–Selenium Deficiency. See the discussion on vitamin E–selenium deficiency in the section on Disorders of Pigs . Arteriosclerosis. Arteriosclerosis is characterized by intimal fibrosis of large elastic arteries, atherosclerosis is characterized by intimal and medial lipid deposits in elastic and muscular arteries, and arterial medial calcification has characteristic mineralization of the walls of elastic and muscular arteries. Arteriosclerosis is an age-related disease that occurs frequently in many animal species but rarely causes clinical signs. The disease develops as chronic degenerative and proliferative responses in the arterial wall and results in loss of elasticity ("hardening of the arteries") and, less often, luminal narrowing. The abdominal aorta is most frequently affected, but other elastic arteries and peripheral large muscular vessels may be involved. Lesions are often localized around the orifices of arterial branches. Etiologic factors in the development of arteriosclerosis are not well defined, but the significant role of hemodynamic influences is suggested by the frequent involvement at arterial branching sites, in which blood flow is turbulent. Grossly, the lesions are seen as slightly raised, firm, white plaques. Microscopically, initially the intima is thickened by accumulation of mucopolysaccharides and later by the proliferation of smooth muscle cells in the tunica media and fibrous tissue infiltration into the intima. Splitting and fragmentation of the internal elastic lamina are common Atherosclerosis. Atherosclerosis, the vascular disease of greatest importance in human beings, occurs only infrequently in animals and rarely leads to clinical disease such as infarction of the heart or brain. The principal alteration is accumulation of deposits (atheroma) of lipid, fibrous tissue, and calcium in vessel walls, which eventually results in luminal narrowing. Many studies have established that the pig, rabbit, and chicken are susceptible to the experimental disease produced by the feeding of a high-cholesterol diet; the dog, cat, cow, goat, and rat are resistant. Lesions of the naturally occurring disease have been detected in aged pigs and birds (especially parrots) and in dogs with hypothyroidism and diabetes mellitus that develop an accompanying hypercholesterolemia. Arteries of the heart, mesentery, and kidneys are prominently thickened, firm, and yellow-white ( Fig. 10-66, A ). Microscopically, lipid globules accumulate in the cytoplasm of smooth muscle cells and macrophages, often termed foam cells , in the media and intima (see Fig. 10-66, B and C ). Necrosis and fibrosis develop in some arterial lesions. The pathogenesis of atherosclerosis has been extensively studied in human beings. The vascular response-to-injury hypothesis is the current proposed mechanism of injury. The dyslipoproteinemia associated with diabetes or hypothyroidism in the dog results in endothelial injury. A variety of mechanisms, including oxygen free radical production, increase the decay of nitric oxide and decrease its vasodilator activity. The damaged endothelial cell allows lipoproteins to accumulate within the intima, where they are oxidized by free radicals generated by macrophages and endothelial cells. The oxidized products are directly toxic to endothelium and smooth muscle cells. Cellular debris is ingested by macrophages and smooth muscle cells, resulting in the formation of "foam cells." The lesion in dogs differs from that of human beings with respect to the location of lipid, which is abundant throughout the wall of the artery in contrast to human beings, who have lipid accumulation in the tunica intima. The chronic progression of atherosclerosis may result in narrowing of the lumen, ulceration and thrombosis, and hemorrhage or aneurysmal dilation. Figure 10-66 Coronary Atherosclerosis, Hypothyroidism, Heart, Left Ventricle, Dog. A, The affected coronary arteries are prominent and cordlike (arrows) with thickened walls. The diffuse and focal yellow areas in the walls of the arteries are the sites of atheromatous deposits. B, Note the extensive accumulation of lipid-laden (clear vacuoles) macrophages termed "foam cells" throughout the thickened tunica intima and media of this branch of the coronary artery. H&E stain. C, Higher magnification of B. The tunica intima contains abundant lipid-laden macrophages (arrows). Note the disruption of the endothelium with fibrin on the exposed luminal surface. This condition is highly unstable and is prone to activation of Virchow's triad and the coagulation cascade with the formation of mural thrombi and infarction of myocardium supplied by this artery. The arrowheads identify the internal elastic lamina of the tunica intima. H&E stain. ( A courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University. B and C courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Arterial Medial Calcification. Arterial medial calcification is a frequent lesion in animals that often have concurrent endocardial mineralization and involves both elastic and muscular arteries. The causes of arterial medial calcification include calcinogenic plant toxicosis, vitamin D toxicosis, renal insufficiency, and severe debilitation, as seen in cattle with Johne's disease (see Fig. 10-53 ). Medial calcification occurs spontaneously in horses, rabbits, aged guinea pigs, and in rats with chronic renal disease. Affected arteries, such as the aorta, have a unique gross appearance; they appear as solid, dense, pipelike structures with raised, white, solid intimal plaques ( Fig. 10-67 ). Microscopically, in elastic arteries, prominent basophilic granular mineral deposits are present on elastic fibers of the media, but in muscular arteries, they can form a complete ring of mineralization in the tunica media ( Fig. 10-68 ). Siderocalcinosis (so-called iron rings), the result of deposition of both iron and calcium salts, occurs in the cerebral arteries of aged horses. Lesions in the surrounding brain tissue are generally absent. Siderocalcinosis lesions are considered incidental. Figure 10-67 Calcification, Vitamin D Toxicosis, Aorta, Rabbit. The aorta is firm and inelastic because of the calcium deposits in the tunica intima and media. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-68 Medial Calcification, Aorta, Cow. Note the layer of mineralization (between arrows) in the middle of the tunica media. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Hyaline Degeneration, Fibrinoid Necrosis, and Amyloidosis. Hyaline degeneration, fibrinoid necrosis, and amyloidosis are vascular lesions of small muscular arteries and arterioles and occur in all animal species. These lesions are generally not detected grossly, but in some diseases with fibrinoid necrosis of vessels, hemorrhages and edema are seen in affected organs at necropsy. The microscopic feature shared by these lesions is the formation of a homogeneous eosinophilic zone in the vessel wall ( Fig. 10-69 ; also see Fig. 10-78 ). Special stains allow differentiation into three types: (1) amyloid confirmed by Congo red and methyl violet; (2) fibrinoid deposits, positive by the periodic acid–Schiff technique; and (3) negative staining of hyaline deposits by these stains. Amyloidosis and hyaline degeneration are often observed in small muscular arteries of the myocardium, lungs, and spleen of old dogs. Lesions in the intramyocardial arteries can cause small foci of myocardial infarction. Figure 10-69 Fibrinoid Necrosis of Small Arteries, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. Note the circumferential eosinophilic (arrows) material in the walls of the arterioles and the extensive edema and mild hemorrhage in surrounding submucosa. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid necrosis of arteries is associated with endothelial damage and is characterized by entry and accumulation of serum proteins followed by fibrin polymerization in the vessel wall. These materials form an intensely eosinophilic collar that obliterates cellular detail. This lesion is frequent in many acute degenerative and inflammatory diseases of small arteries and arterioles. Fibrinoid necrosis is seen frequently in dogs with uremia and in dogs with hypertension, although hypertension is an uncommon finding in animals. Vitamin E–Selenium Deficiency. See the discussion on vitamin E–selenium deficiency in the section on Disorders of Pigs . Inflammation Omphalophlebitis ("Navel Ill"). Omphalophlebitis ("navel ill") is inflammation of the umbilical vein that often occurs in neonatal farm animals because of bacterial contamination of the umbilicus immediately after parturition. Bacteria from this site can cause septicemia, suppurative polyarthritis, hepatic abscesses (the umbilical vein drains into the liver), and umbilical abscesses. Jugular Thrombophlebitis. Jugular thrombophlebitis may be associated with indwelling jugular catheters and is reported to be increased with several concurrent disease conditions, such as hypoproteinemia, salmonellosis, endotoxemia, and large intestinal disease (see Fig. 10-27 ). The most common diseases with thrombosis and embolism are listed in Box 10-16 . Box 10-16 Most Common Diseases with Thrombosis and/or Embolism in Animals Pulmonary thromboembolism: Dogs, cats Aortic thromboembolism in cats and dogs with cardiomyopathy: "Saddle" thrombi Aortoiliac thrombosis in horses: Verminous or idiopathic Verminous arteritis in horses: Strongylus vulgaris Septic embolism from lesions of vegetative endocarditis Fibrocartilaginous emboli: Dogs Conditions accompanied by DIC (e.g., hog cholera, ICH, FIP, Gram-negative endotoxemia) Thrombosis of caudal vena cava: Cattle DIC, Disseminated intravascular coagulation; FIP, feline infectious peritonitis; ICH, infectious canine hepatitis. Omphalophlebitis ("Navel Ill"). Omphalophlebitis ("navel ill") is inflammation of the umbilical vein that often occurs in neonatal farm animals because of bacterial contamination of the umbilicus immediately after parturition. Bacteria from this site can cause septicemia, suppurative polyarthritis, hepatic abscesses (the umbilical vein drains into the liver), and umbilical abscesses. Jugular Thrombophlebitis. Jugular thrombophlebitis may be associated with indwelling jugular catheters and is reported to be increased with several concurrent disease conditions, such as hypoproteinemia, salmonellosis, endotoxemia, and large intestinal disease (see Fig. 10-27 ). The most common diseases with thrombosis and embolism are listed in Box 10-16 . Box 10-16 Most Common Diseases with Thrombosis and/or Embolism in Animals Pulmonary thromboembolism: Dogs, cats Aortic thromboembolism in cats and dogs with cardiomyopathy: "Saddle" thrombi Aortoiliac thrombosis in horses: Verminous or idiopathic Verminous arteritis in horses: Strongylus vulgaris Septic embolism from lesions of vegetative endocarditis Fibrocartilaginous emboli: Dogs Conditions accompanied by DIC (e.g., hog cholera, ICH, FIP, Gram-negative endotoxemia) Thrombosis of caudal vena cava: Cattle DIC, Disseminated intravascular coagulation; FIP, feline infectious peritonitis; ICH, infectious canine hepatitis. Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Effusions Rupture of the Thoracic Duct. Rupture of the thoracic duct, either as a result of trauma or from spontaneous disruption, causes chylothorax in dogs and cats (see Fig. 9-116). However, many cases of chylothorax occur without injury to the thoracic duct and have been attributed to lesions that interfere with central venous return or produce obstruction of the thoracic duct (right-sided heart failure, neoplasms, granulomas, cranial vena cava thrombosis, or dirofilariasis) or that are idiopathic. Lymphedema. Lymphedema specifically refers to accumulation of fluid in interstitial space secondary to abnormal lymphatic absorption and should be differentiated from other causes of edema, such as hypoproteinemia, vasculitis, and increased hydrostatic pressure. Lymphatic fluid contains a variable amount of protein that may have an osmotic pressure that allows fluid to be drawn into the interstitial compartment from tissues with a lower osmotic gradient (protein concentration). Lymphedema can be divided into six etiologic categories: overload, inadequate collection, abnormal lymphatic contractility, insufficient lymphatic vessels, lymph node obstruction, and structural defects in lymphatic vessels. Primary lymphedema is caused by aplasia, hypoplasia, or dysplasia of lymphatic ducts, vessels, and/or lymph nodes, whereas secondary lymphedema is an acquired defect due to various disease processes (e.g., neoplasia, radiation, parasites). Primary lymphedema is rare in both dogs and cats, but it is more common in dogs. It can be temporary or permanent, and it usually affects the distal extremities, mainly of the hindlimbs. Secondary lymphedema due to lymphatic filariasis in cats is common in tropical countries and is caused by Brugia spp., such as Brugia malayi and Brugia pahangi . Chronic lymphedema, regardless of its etiology, results in secondary fibrosis, which worsens edema and creates a vicious cycle that leads to chronic progressive lymphedema. Disturbances of Growth. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Blood and Lymphatic Vascular Systems . Neoplastic Transformation. Lymphangioma is a rare benign neoplasm composed of lymphatic channels. Lymphangiosarcoma, the malignant counterpart, occurs more often than the benign neoplasm. Vascular spaces formed by neoplastic lymphatic endothelial cells contain lymph rather than blood. Lymphatic vessels are frequently invaded by primary carcinomas and are a common route of metastasis (see the section on Disorders of Dogs ). Inflammation Lymphangitis. Lymphangitis is a feature of many diseases (see Box 10-8 ). The affected vessels are often located in the distal limbs and are thick, cordlike structures ( Fig. 10-70 ). Lymphedema can be present. Nodular suppurative lesions of lymphangitis often ulcerate and discharge pus onto the surface of the skin. In Johne's disease, the mesenteric lymphatic vessels are often prominent because of granulomatous lymphangitis, an extension of the enteric infection producing a granulomatous enteritis and lymphangitis ( Fig. 10-71 ). Figure 10-70 Lymphangitis, Forelimb, Lymphatic Vessels, Horse. Note the multiple swellings (cordlike) of the afferent lymphatic vessels in the skin. These lymphatic vessels lie in the subcutis and empty into the caudal superficial cervical (prescapular) lymph node. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-71 Granulomatous Lymphangitis, Johne's Disease, Mesenteric Lymphatic Vessel, Sheep. The lymphatic is occluded by a fibrinous thrombus secondary to the destruction of the endothelium by inflammatory cells including macrophages. Early proliferating fibrous tissue and extensive edema (E) surround the lymphatic vessel. The adjacent artery (upper right) and vein (V) are unaffected. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Disturbances of Circulation Effusions Rupture of the Thoracic Duct. Rupture of the thoracic duct, either as a result of trauma or from spontaneous disruption, causes chylothorax in dogs and cats (see Fig. 9-116). However, many cases of chylothorax occur without injury to the thoracic duct and have been attributed to lesions that interfere with central venous return or produce obstruction of the thoracic duct (right-sided heart failure, neoplasms, granulomas, cranial vena cava thrombosis, or dirofilariasis) or that are idiopathic. Lymphedema. Lymphedema specifically refers to accumulation of fluid in interstitial space secondary to abnormal lymphatic absorption and should be differentiated from other causes of edema, such as hypoproteinemia, vasculitis, and increased hydrostatic pressure. Lymphatic fluid contains a variable amount of protein that may have an osmotic pressure that allows fluid to be drawn into the interstitial compartment from tissues with a lower osmotic gradient (protein concentration). Lymphedema can be divided into six etiologic categories: overload, inadequate collection, abnormal lymphatic contractility, insufficient lymphatic vessels, lymph node obstruction, and structural defects in lymphatic vessels. Primary lymphedema is caused by aplasia, hypoplasia, or dysplasia of lymphatic ducts, vessels, and/or lymph nodes, whereas secondary lymphedema is an acquired defect due to various disease processes (e.g., neoplasia, radiation, parasites). Primary lymphedema is rare in both dogs and cats, but it is more common in dogs. It can be temporary or permanent, and it usually affects the distal extremities, mainly of the hindlimbs. Secondary lymphedema due to lymphatic filariasis in cats is common in tropical countries and is caused by Brugia spp., such as Brugia malayi and Brugia pahangi . Chronic lymphedema, regardless of its etiology, results in secondary fibrosis, which worsens edema and creates a vicious cycle that leads to chronic progressive lymphedema. Effusions Rupture of the Thoracic Duct. Rupture of the thoracic duct, either as a result of trauma or from spontaneous disruption, causes chylothorax in dogs and cats (see Fig. 9-116). However, many cases of chylothorax occur without injury to the thoracic duct and have been attributed to lesions that interfere with central venous return or produce obstruction of the thoracic duct (right-sided heart failure, neoplasms, granulomas, cranial vena cava thrombosis, or dirofilariasis) or that are idiopathic. Rupture of the Thoracic Duct. Rupture of the thoracic duct, either as a result of trauma or from spontaneous disruption, causes chylothorax in dogs and cats (see Fig. 9-116). However, many cases of chylothorax occur without injury to the thoracic duct and have been attributed to lesions that interfere with central venous return or produce obstruction of the thoracic duct (right-sided heart failure, neoplasms, granulomas, cranial vena cava thrombosis, or dirofilariasis) or that are idiopathic. Lymphedema. Lymphedema specifically refers to accumulation of fluid in interstitial space secondary to abnormal lymphatic absorption and should be differentiated from other causes of edema, such as hypoproteinemia, vasculitis, and increased hydrostatic pressure. Lymphatic fluid contains a variable amount of protein that may have an osmotic pressure that allows fluid to be drawn into the interstitial compartment from tissues with a lower osmotic gradient (protein concentration). Lymphedema can be divided into six etiologic categories: overload, inadequate collection, abnormal lymphatic contractility, insufficient lymphatic vessels, lymph node obstruction, and structural defects in lymphatic vessels. Primary lymphedema is caused by aplasia, hypoplasia, or dysplasia of lymphatic ducts, vessels, and/or lymph nodes, whereas secondary lymphedema is an acquired defect due to various disease processes (e.g., neoplasia, radiation, parasites). Primary lymphedema is rare in both dogs and cats, but it is more common in dogs. It can be temporary or permanent, and it usually affects the distal extremities, mainly of the hindlimbs. Secondary lymphedema due to lymphatic filariasis in cats is common in tropical countries and is caused by Brugia spp., such as Brugia malayi and Brugia pahangi . Chronic lymphedema, regardless of its etiology, results in secondary fibrosis, which worsens edema and creates a vicious cycle that leads to chronic progressive lymphedema. Disturbances of Growth. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Blood and Lymphatic Vascular Systems . Neoplastic Transformation. Lymphangioma is a rare benign neoplasm composed of lymphatic channels. Lymphangiosarcoma, the malignant counterpart, occurs more often than the benign neoplasm. Vascular spaces formed by neoplastic lymphatic endothelial cells contain lymph rather than blood. Lymphatic vessels are frequently invaded by primary carcinomas and are a common route of metastasis (see the section on Disorders of Dogs ). Neoplastic Transformation. Lymphangioma is a rare benign neoplasm composed of lymphatic channels. Lymphangiosarcoma, the malignant counterpart, occurs more often than the benign neoplasm. Vascular spaces formed by neoplastic lymphatic endothelial cells contain lymph rather than blood. Lymphatic vessels are frequently invaded by primary carcinomas and are a common route of metastasis (see the section on Disorders of Dogs ). Inflammation Lymphangitis. Lymphangitis is a feature of many diseases (see Box 10-8 ). The affected vessels are often located in the distal limbs and are thick, cordlike structures ( Fig. 10-70 ). Lymphedema can be present. Nodular suppurative lesions of lymphangitis often ulcerate and discharge pus onto the surface of the skin. In Johne's disease, the mesenteric lymphatic vessels are often prominent because of granulomatous lymphangitis, an extension of the enteric infection producing a granulomatous enteritis and lymphangitis ( Fig. 10-71 ). Figure 10-70 Lymphangitis, Forelimb, Lymphatic Vessels, Horse. Note the multiple swellings (cordlike) of the afferent lymphatic vessels in the skin. These lymphatic vessels lie in the subcutis and empty into the caudal superficial cervical (prescapular) lymph node. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-71 Granulomatous Lymphangitis, Johne's Disease, Mesenteric Lymphatic Vessel, Sheep. The lymphatic is occluded by a fibrinous thrombus secondary to the destruction of the endothelium by inflammatory cells including macrophages. Early proliferating fibrous tissue and extensive edema (E) surround the lymphatic vessel. The adjacent artery (upper right) and vein (V) are unaffected. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Lymphangitis. Lymphangitis is a feature of many diseases (see Box 10-8 ). The affected vessels are often located in the distal limbs and are thick, cordlike structures ( Fig. 10-70 ). Lymphedema can be present. Nodular suppurative lesions of lymphangitis often ulcerate and discharge pus onto the surface of the skin. In Johne's disease, the mesenteric lymphatic vessels are often prominent because of granulomatous lymphangitis, an extension of the enteric infection producing a granulomatous enteritis and lymphangitis ( Fig. 10-71 ). Figure 10-70 Lymphangitis, Forelimb, Lymphatic Vessels, Horse. Note the multiple swellings (cordlike) of the afferent lymphatic vessels in the skin. These lymphatic vessels lie in the subcutis and empty into the caudal superficial cervical (prescapular) lymph node. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Figure 10-71 Granulomatous Lymphangitis, Johne's Disease, Mesenteric Lymphatic Vessel, Sheep. The lymphatic is occluded by a fibrinous thrombus secondary to the destruction of the endothelium by inflammatory cells including macrophages. Early proliferating fibrous tissue and extensive edema (E) surround the lymphatic vessel. The adjacent artery (upper right) and vein (V) are unaffected. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Disorders of Horses Myocardium Cell Degeneration and Death: Toxicoses White Snakeroot–Induced Myocardial Degeneration. After ingestion, white snakeroot ( Eupatorium rugosum ) causes myocardial degeneration and necrosis (acute injury) followed by fibrosis (reparative response). Tremetol is the toxic compound in white snakeroot; it becomes toxic after microsomal activation of a precursor compound by cytochrome P450 enzymes in the liver. The mechanism used by tremetol to cause injury is unclear, but dysfunction of mitochondrial oxidative phosphorylation by inhibiting the tricarboxylic acid cycle has been suggested. Acute cardiac rhabdomyocyte degeneration and necrosis are discussed in detail in the section on Responses to Injury: Myocardium, Myocardial Necrosis and also in Chapter 15. Reparative responses are discussed in Chapter 3. Macroscopic lesions include pale white to tan areas and linear streaks throughout the myocardium; microscopic lesions include multifocal myocardial degeneration and necrosis with vacuolation of myocardial cytoplasm; loss of cross-striations; fragmentation of rhabdomyocytes; hypereosinophilia, coagulation, and clumping of the sarcoplasm; and nuclear pyknosis and karyolysis. The pericardium may contain a modified transudate with fibrin. Ionophore-Induced Myocardial Degeneration. See the discussion on ionophore-induced myocardial degeneration in the section on Disorders of Domestic Animals . Pericardium and Epicardium Inflammation Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis in the horse. These include Actinobacillus , streptococcal, and mycoplasma infections. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Equine herpesvirus types 1 and 2 and influenza virus infections may result in fibrinous pericarditis. Fibrinous pericarditis has been reported in horses with mare reproductive loss syndrome following exposure to the Eastern tent caterpillars. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Inflammation Equine Viral Arteritis. Equine viral arteritis is a systemic viral infection with a tropism for vascular endothelial cells. In this disease, affected small muscular arteries have lesions of fibrinoid necrosis, extensive edema, and primarily mononuclear infiltration with thrombosis ( Fig. 10-72 ). Grossly, the vascular injury is reflected by hemorrhage and severe edema of the subcutaneous tissues, lymph nodes, and intestinal wall and mesentery accompanied by notable accumulation of serous fluids in body cavities and pulmonary edema. Figure 10-72 Acute Arteritis, Equine Viral Arteritis, Small Intestine, Submucosa, Horse. Small arteries have fibrinoid degeneration (circumferential eosinophilic material [arrows] ) with leukocytic infiltration of the tunica media. The surrounding loose connective tissue is edematous and infiltrated by numerous leukocytes. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) African Horse Sickness: Subacute Cardiac Form. African horse sickness is an insect-borne ( Culicoides spp.) viral disease of Equidae that is endemic in Africa, the Middle East, India, and Spain. The occurrence is seasonal because the insect vectors thrive in hot, wet conditions. The febrile disease may produce high mortality (up to 95%) and appears in several clinical forms, including the subacute cardiac form described here, as well as an acute respiratory form with massive pulmonary edema. The pathogenesis is initiated by the introduction of the virus by bites of the insect vector. The virus proliferates in local lymph node, and viremia ensues. The virus has a tropism for endothelial cells, monocytes, and macrophages, and increased vascular permeability, edema, hemorrhage, and microthrombosis are produced. The gross lesions are extensive subcutaneous and intermuscular edematous swelling of the head and neck. Massive hydropericardium is present with accompanying epicardial and endocardial ecchymotic hemorrhages. Histopathologically, endothelial degeneration and necrosis occur with the edema. In the myocardium, hemorrhage, edema, and focal myocardial necrosis with inflammatory cell infiltrates are present (see Chapter 4 and Fig. 4-40). Cranial Mesenteric Arteritis and Thrombosis. Cranial mesenteric arteritis and thrombosis results from fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris ( Fig. 10-73 ). Infection of horses by Strongylus vulgaris is now less common because of widespread use of highly efficacious antiparasitic drugs. During its larval development, the parasite migrates through the intestinal arteries, and the most severe lesions are generally found in the cranial mesenteric artery near its origin. The affected vessel is enlarged, and its wall is firm and fibrotic. The intimal surface often has an adhering thrombus often admixed with larvae. Microscopically, the affected vessel has extensive infiltration of inflammatory cells and proliferation of fibroblasts throughout the wall. As a consequence, thromboembolism of the intestinal arteries frequently occurs and can produce colic, but the abundant collateral circulation to the equine intestinal tract makes intestinal infarction an unusual event. Figure 10-73 Verminous Arteritis and Mural Thrombosis, Strongylosis, Abdominal Aorta (A) and Cranial Mesenteric Artery, Horse. A pale friable thrombotic mass, in which several Strongylus vulgaris larvae (arrows) are embedded, is attached to the wall of the cranial mesenteric artery (C) . (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Aortoiliac Thrombosis. Aortoiliac thrombosis is characterized by extensive and progressive thrombosis thought to be caused by migration of fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris. Aortoiliac thrombosis results in posterior weakness following exercise with recovery following rest. See the previous section on cranial mesenteric arteritis and thrombosis. Jugular Thrombophlebitis. See the discussion on jugular thrombophlebitis in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vessels, Blood Vessels, Inflammation. Cell Degeneration and Death Arterial Intimal Calcification. Arterial intimal calcifications (intimal bodies) are distinctively small, mineralized masses within the subendothelium in small muscular arteries and arterioles of horses ( E-Fig. 10-24 ). They have no deleterious effect. E-Figure 10-24 Intimal Body (Arrow) , Intestine, Muscular Artery, Horse. Intimal bodies are distinctive small, mineralized masses within the subendothelium of small muscular arteries and arterioles of horses. They are an incidental finding and have no pathologic significance. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Lymphatic Vessels Inflammation Glanders Disease (Farcy): Cutaneous Form. Glanders disease (Farcy) is a contagious disease of horses, donkeys, and mules caused by infection with Burkholderia ( Pseudomonas ) mallei. Once worldwide in distribution, it is now seen in eastern Europe, Asia, and northern Africa. The disease occurs in several clinical forms, and the cutaneous form with involvement of lymphatic vessels is described here. The pathogenesis is initiated by ingestion of contaminated food and water. The organisms enter through the pharynx and are disseminated to the skin hematogenously. The gross lesions of the skin appear as multiple ulcerated nodules that follow infected lymphatic vessels. Most frequent in the limbs, the ulcerated lesions discharge suppurative exudate onto the skin surface. Swollen tortuous cutaneous lymphatic vessels are visible between the ulcerative lesions. Microscopically, the skin nodules represent pyogranulomatous inflammation extending from cutaneous lymphatic vessels with suppurative lymphangitis (see Fig. 4-25). Miscellaneous Cutaneous Lymphangitides. The cutaneous lesions affecting lymphatic vessels in less common cutaneous lymphangitides are as follows (see Box 10-8 ): 1. Ulcerative (likely caused by Corynebacterium pseudotuberculosis and other cutaneous bacteria) 2. Sporadic (cause unknown) 3. Epizootic lymphangitis ( Histoplasma farciminosum ) 4. Melioidosis ( Burkholderia pseudomallei ) These lesions mimic those of Glanders disease, and differentiation occurs by impression smears and microbiologic cultures and analyses. The skin of the legs, head, neck, and/or flanks has raised firm nodules (≈1 to 2 cm in diameter), draining nodules, and draining fistulous tracts, often arranged in linear bands (beaded appearance) that follow the flow of lymphatic vessels. These lesions contain or drain pus, which is often thick and white-yellow in color. Microscopically, lesions are characterized by suppurative to pyogranulomatous inflammation. Infectious microorganisms are often present in the exudate (see Fig. 4-25). Chronic Progressive Lymphedema in Draft Horses. Chronic progressive lymphedema (CPL) occurs in many draft horse breeds and is a debilitating condition. A definitive cause is not known; however, a genetic disorder of elastin metabolism resulting in dysfunction of the lymphatic vessels in the distal extremities with multiple contributing factors including secondary bacterial infections is suspected. The distal limbs are swollen with pitting edema, thickened, scaling skin with exudation, erosions, and ulcerations. Microscopically, dermal lymphatic vessels are markedly dilated within the edematous dermis. In chronic cases, the dermis may become markedly thickened with fibrous connective tissue as a result of the chronic edema. The overlying epidermis may be acanthotic with intraepidermal pustules, erosions, and ulcerations. Folliculitis and deep dermal abscesses may be present. Staining for elastin fibers demonstrates a disorganized and excessive network of elastin fibers within the superficial dermis. Lymphatic vessels within the deep dermis lack normal elastin fibers. Myocardium Cell Degeneration and Death: Toxicoses White Snakeroot–Induced Myocardial Degeneration. After ingestion, white snakeroot ( Eupatorium rugosum ) causes myocardial degeneration and necrosis (acute injury) followed by fibrosis (reparative response). Tremetol is the toxic compound in white snakeroot; it becomes toxic after microsomal activation of a precursor compound by cytochrome P450 enzymes in the liver. The mechanism used by tremetol to cause injury is unclear, but dysfunction of mitochondrial oxidative phosphorylation by inhibiting the tricarboxylic acid cycle has been suggested. Acute cardiac rhabdomyocyte degeneration and necrosis are discussed in detail in the section on Responses to Injury: Myocardium, Myocardial Necrosis and also in Chapter 15. Reparative responses are discussed in Chapter 3. Macroscopic lesions include pale white to tan areas and linear streaks throughout the myocardium; microscopic lesions include multifocal myocardial degeneration and necrosis with vacuolation of myocardial cytoplasm; loss of cross-striations; fragmentation of rhabdomyocytes; hypereosinophilia, coagulation, and clumping of the sarcoplasm; and nuclear pyknosis and karyolysis. The pericardium may contain a modified transudate with fibrin. Ionophore-Induced Myocardial Degeneration. See the discussion on ionophore-induced myocardial degeneration in the section on Disorders of Domestic Animals . Cell Degeneration and Death: Toxicoses White Snakeroot–Induced Myocardial Degeneration. After ingestion, white snakeroot ( Eupatorium rugosum ) causes myocardial degeneration and necrosis (acute injury) followed by fibrosis (reparative response). Tremetol is the toxic compound in white snakeroot; it becomes toxic after microsomal activation of a precursor compound by cytochrome P450 enzymes in the liver. The mechanism used by tremetol to cause injury is unclear, but dysfunction of mitochondrial oxidative phosphorylation by inhibiting the tricarboxylic acid cycle has been suggested. Acute cardiac rhabdomyocyte degeneration and necrosis are discussed in detail in the section on Responses to Injury: Myocardium, Myocardial Necrosis and also in Chapter 15. Reparative responses are discussed in Chapter 3. Macroscopic lesions include pale white to tan areas and linear streaks throughout the myocardium; microscopic lesions include multifocal myocardial degeneration and necrosis with vacuolation of myocardial cytoplasm; loss of cross-striations; fragmentation of rhabdomyocytes; hypereosinophilia, coagulation, and clumping of the sarcoplasm; and nuclear pyknosis and karyolysis. The pericardium may contain a modified transudate with fibrin. Ionophore-Induced Myocardial Degeneration. See the discussion on ionophore-induced myocardial degeneration in the section on Disorders of Domestic Animals . White Snakeroot–Induced Myocardial Degeneration. After ingestion, white snakeroot ( Eupatorium rugosum ) causes myocardial degeneration and necrosis (acute injury) followed by fibrosis (reparative response). Tremetol is the toxic compound in white snakeroot; it becomes toxic after microsomal activation of a precursor compound by cytochrome P450 enzymes in the liver. The mechanism used by tremetol to cause injury is unclear, but dysfunction of mitochondrial oxidative phosphorylation by inhibiting the tricarboxylic acid cycle has been suggested. Acute cardiac rhabdomyocyte degeneration and necrosis are discussed in detail in the section on Responses to Injury: Myocardium, Myocardial Necrosis and also in Chapter 15. Reparative responses are discussed in Chapter 3. Macroscopic lesions include pale white to tan areas and linear streaks throughout the myocardium; microscopic lesions include multifocal myocardial degeneration and necrosis with vacuolation of myocardial cytoplasm; loss of cross-striations; fragmentation of rhabdomyocytes; hypereosinophilia, coagulation, and clumping of the sarcoplasm; and nuclear pyknosis and karyolysis. The pericardium may contain a modified transudate with fibrin. Ionophore-Induced Myocardial Degeneration. See the discussion on ionophore-induced myocardial degeneration in the section on Disorders of Domestic Animals . Pericardium and Epicardium Inflammation Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis in the horse. These include Actinobacillus , streptococcal, and mycoplasma infections. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Equine herpesvirus types 1 and 2 and influenza virus infections may result in fibrinous pericarditis. Fibrinous pericarditis has been reported in horses with mare reproductive loss syndrome following exposure to the Eastern tent caterpillars. Inflammation Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis in the horse. These include Actinobacillus , streptococcal, and mycoplasma infections. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Equine herpesvirus types 1 and 2 and influenza virus infections may result in fibrinous pericarditis. Fibrinous pericarditis has been reported in horses with mare reproductive loss syndrome following exposure to the Eastern tent caterpillars. Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis in the horse. These include Actinobacillus , streptococcal, and mycoplasma infections. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. Equine herpesvirus types 1 and 2 and influenza virus infections may result in fibrinous pericarditis. Fibrinous pericarditis has been reported in horses with mare reproductive loss syndrome following exposure to the Eastern tent caterpillars. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Inflammation Equine Viral Arteritis. Equine viral arteritis is a systemic viral infection with a tropism for vascular endothelial cells. In this disease, affected small muscular arteries have lesions of fibrinoid necrosis, extensive edema, and primarily mononuclear infiltration with thrombosis ( Fig. 10-72 ). Grossly, the vascular injury is reflected by hemorrhage and severe edema of the subcutaneous tissues, lymph nodes, and intestinal wall and mesentery accompanied by notable accumulation of serous fluids in body cavities and pulmonary edema. Figure 10-72 Acute Arteritis, Equine Viral Arteritis, Small Intestine, Submucosa, Horse. Small arteries have fibrinoid degeneration (circumferential eosinophilic material [arrows] ) with leukocytic infiltration of the tunica media. The surrounding loose connective tissue is edematous and infiltrated by numerous leukocytes. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) African Horse Sickness: Subacute Cardiac Form. African horse sickness is an insect-borne ( Culicoides spp.) viral disease of Equidae that is endemic in Africa, the Middle East, India, and Spain. The occurrence is seasonal because the insect vectors thrive in hot, wet conditions. The febrile disease may produce high mortality (up to 95%) and appears in several clinical forms, including the subacute cardiac form described here, as well as an acute respiratory form with massive pulmonary edema. The pathogenesis is initiated by the introduction of the virus by bites of the insect vector. The virus proliferates in local lymph node, and viremia ensues. The virus has a tropism for endothelial cells, monocytes, and macrophages, and increased vascular permeability, edema, hemorrhage, and microthrombosis are produced. The gross lesions are extensive subcutaneous and intermuscular edematous swelling of the head and neck. Massive hydropericardium is present with accompanying epicardial and endocardial ecchymotic hemorrhages. Histopathologically, endothelial degeneration and necrosis occur with the edema. In the myocardium, hemorrhage, edema, and focal myocardial necrosis with inflammatory cell infiltrates are present (see Chapter 4 and Fig. 4-40). Cranial Mesenteric Arteritis and Thrombosis. Cranial mesenteric arteritis and thrombosis results from fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris ( Fig. 10-73 ). Infection of horses by Strongylus vulgaris is now less common because of widespread use of highly efficacious antiparasitic drugs. During its larval development, the parasite migrates through the intestinal arteries, and the most severe lesions are generally found in the cranial mesenteric artery near its origin. The affected vessel is enlarged, and its wall is firm and fibrotic. The intimal surface often has an adhering thrombus often admixed with larvae. Microscopically, the affected vessel has extensive infiltration of inflammatory cells and proliferation of fibroblasts throughout the wall. As a consequence, thromboembolism of the intestinal arteries frequently occurs and can produce colic, but the abundant collateral circulation to the equine intestinal tract makes intestinal infarction an unusual event. Figure 10-73 Verminous Arteritis and Mural Thrombosis, Strongylosis, Abdominal Aorta (A) and Cranial Mesenteric Artery, Horse. A pale friable thrombotic mass, in which several Strongylus vulgaris larvae (arrows) are embedded, is attached to the wall of the cranial mesenteric artery (C) . (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Aortoiliac Thrombosis. Aortoiliac thrombosis is characterized by extensive and progressive thrombosis thought to be caused by migration of fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris. Aortoiliac thrombosis results in posterior weakness following exercise with recovery following rest. See the previous section on cranial mesenteric arteritis and thrombosis. Jugular Thrombophlebitis. See the discussion on jugular thrombophlebitis in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vessels, Blood Vessels, Inflammation. Cell Degeneration and Death Arterial Intimal Calcification. Arterial intimal calcifications (intimal bodies) are distinctively small, mineralized masses within the subendothelium in small muscular arteries and arterioles of horses ( E-Fig. 10-24 ). They have no deleterious effect. E-Figure 10-24 Intimal Body (Arrow) , Intestine, Muscular Artery, Horse. Intimal bodies are distinctive small, mineralized masses within the subendothelium of small muscular arteries and arterioles of horses. They are an incidental finding and have no pathologic significance. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Lymphatic Vessels Inflammation Glanders Disease (Farcy): Cutaneous Form. Glanders disease (Farcy) is a contagious disease of horses, donkeys, and mules caused by infection with Burkholderia ( Pseudomonas ) mallei. Once worldwide in distribution, it is now seen in eastern Europe, Asia, and northern Africa. The disease occurs in several clinical forms, and the cutaneous form with involvement of lymphatic vessels is described here. The pathogenesis is initiated by ingestion of contaminated food and water. The organisms enter through the pharynx and are disseminated to the skin hematogenously. The gross lesions of the skin appear as multiple ulcerated nodules that follow infected lymphatic vessels. Most frequent in the limbs, the ulcerated lesions discharge suppurative exudate onto the skin surface. Swollen tortuous cutaneous lymphatic vessels are visible between the ulcerative lesions. Microscopically, the skin nodules represent pyogranulomatous inflammation extending from cutaneous lymphatic vessels with suppurative lymphangitis (see Fig. 4-25). Miscellaneous Cutaneous Lymphangitides. The cutaneous lesions affecting lymphatic vessels in less common cutaneous lymphangitides are as follows (see Box 10-8 ): 1. Ulcerative (likely caused by Corynebacterium pseudotuberculosis and other cutaneous bacteria) 2. Sporadic (cause unknown) 3. Epizootic lymphangitis ( Histoplasma farciminosum ) 4. Melioidosis ( Burkholderia pseudomallei ) These lesions mimic those of Glanders disease, and differentiation occurs by impression smears and microbiologic cultures and analyses. The skin of the legs, head, neck, and/or flanks has raised firm nodules (≈1 to 2 cm in diameter), draining nodules, and draining fistulous tracts, often arranged in linear bands (beaded appearance) that follow the flow of lymphatic vessels. These lesions contain or drain pus, which is often thick and white-yellow in color. Microscopically, lesions are characterized by suppurative to pyogranulomatous inflammation. Infectious microorganisms are often present in the exudate (see Fig. 4-25). Chronic Progressive Lymphedema in Draft Horses. Chronic progressive lymphedema (CPL) occurs in many draft horse breeds and is a debilitating condition. A definitive cause is not known; however, a genetic disorder of elastin metabolism resulting in dysfunction of the lymphatic vessels in the distal extremities with multiple contributing factors including secondary bacterial infections is suspected. The distal limbs are swollen with pitting edema, thickened, scaling skin with exudation, erosions, and ulcerations. Microscopically, dermal lymphatic vessels are markedly dilated within the edematous dermis. In chronic cases, the dermis may become markedly thickened with fibrous connective tissue as a result of the chronic edema. The overlying epidermis may be acanthotic with intraepidermal pustules, erosions, and ulcerations. Folliculitis and deep dermal abscesses may be present. Staining for elastin fibers demonstrates a disorganized and excessive network of elastin fibers within the superficial dermis. Lymphatic vessels within the deep dermis lack normal elastin fibers. Blood Vessels Inflammation Equine Viral Arteritis. Equine viral arteritis is a systemic viral infection with a tropism for vascular endothelial cells. In this disease, affected small muscular arteries have lesions of fibrinoid necrosis, extensive edema, and primarily mononuclear infiltration with thrombosis ( Fig. 10-72 ). Grossly, the vascular injury is reflected by hemorrhage and severe edema of the subcutaneous tissues, lymph nodes, and intestinal wall and mesentery accompanied by notable accumulation of serous fluids in body cavities and pulmonary edema. Figure 10-72 Acute Arteritis, Equine Viral Arteritis, Small Intestine, Submucosa, Horse. Small arteries have fibrinoid degeneration (circumferential eosinophilic material [arrows] ) with leukocytic infiltration of the tunica media. The surrounding loose connective tissue is edematous and infiltrated by numerous leukocytes. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) African Horse Sickness: Subacute Cardiac Form. African horse sickness is an insect-borne ( Culicoides spp.) viral disease of Equidae that is endemic in Africa, the Middle East, India, and Spain. The occurrence is seasonal because the insect vectors thrive in hot, wet conditions. The febrile disease may produce high mortality (up to 95%) and appears in several clinical forms, including the subacute cardiac form described here, as well as an acute respiratory form with massive pulmonary edema. The pathogenesis is initiated by the introduction of the virus by bites of the insect vector. The virus proliferates in local lymph node, and viremia ensues. The virus has a tropism for endothelial cells, monocytes, and macrophages, and increased vascular permeability, edema, hemorrhage, and microthrombosis are produced. The gross lesions are extensive subcutaneous and intermuscular edematous swelling of the head and neck. Massive hydropericardium is present with accompanying epicardial and endocardial ecchymotic hemorrhages. Histopathologically, endothelial degeneration and necrosis occur with the edema. In the myocardium, hemorrhage, edema, and focal myocardial necrosis with inflammatory cell infiltrates are present (see Chapter 4 and Fig. 4-40). Cranial Mesenteric Arteritis and Thrombosis. Cranial mesenteric arteritis and thrombosis results from fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris ( Fig. 10-73 ). Infection of horses by Strongylus vulgaris is now less common because of widespread use of highly efficacious antiparasitic drugs. During its larval development, the parasite migrates through the intestinal arteries, and the most severe lesions are generally found in the cranial mesenteric artery near its origin. The affected vessel is enlarged, and its wall is firm and fibrotic. The intimal surface often has an adhering thrombus often admixed with larvae. Microscopically, the affected vessel has extensive infiltration of inflammatory cells and proliferation of fibroblasts throughout the wall. As a consequence, thromboembolism of the intestinal arteries frequently occurs and can produce colic, but the abundant collateral circulation to the equine intestinal tract makes intestinal infarction an unusual event. Figure 10-73 Verminous Arteritis and Mural Thrombosis, Strongylosis, Abdominal Aorta (A) and Cranial Mesenteric Artery, Horse. A pale friable thrombotic mass, in which several Strongylus vulgaris larvae (arrows) are embedded, is attached to the wall of the cranial mesenteric artery (C) . (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Aortoiliac Thrombosis. Aortoiliac thrombosis is characterized by extensive and progressive thrombosis thought to be caused by migration of fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris. Aortoiliac thrombosis results in posterior weakness following exercise with recovery following rest. See the previous section on cranial mesenteric arteritis and thrombosis. Jugular Thrombophlebitis. See the discussion on jugular thrombophlebitis in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vessels, Blood Vessels, Inflammation. Cell Degeneration and Death Arterial Intimal Calcification. Arterial intimal calcifications (intimal bodies) are distinctively small, mineralized masses within the subendothelium in small muscular arteries and arterioles of horses ( E-Fig. 10-24 ). They have no deleterious effect. E-Figure 10-24 Intimal Body (Arrow) , Intestine, Muscular Artery, Horse. Intimal bodies are distinctive small, mineralized masses within the subendothelium of small muscular arteries and arterioles of horses. They are an incidental finding and have no pathologic significance. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Inflammation Equine Viral Arteritis. Equine viral arteritis is a systemic viral infection with a tropism for vascular endothelial cells. In this disease, affected small muscular arteries have lesions of fibrinoid necrosis, extensive edema, and primarily mononuclear infiltration with thrombosis ( Fig. 10-72 ). Grossly, the vascular injury is reflected by hemorrhage and severe edema of the subcutaneous tissues, lymph nodes, and intestinal wall and mesentery accompanied by notable accumulation of serous fluids in body cavities and pulmonary edema. Figure 10-72 Acute Arteritis, Equine Viral Arteritis, Small Intestine, Submucosa, Horse. Small arteries have fibrinoid degeneration (circumferential eosinophilic material [arrows] ) with leukocytic infiltration of the tunica media. The surrounding loose connective tissue is edematous and infiltrated by numerous leukocytes. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) African Horse Sickness: Subacute Cardiac Form. African horse sickness is an insect-borne ( Culicoides spp.) viral disease of Equidae that is endemic in Africa, the Middle East, India, and Spain. The occurrence is seasonal because the insect vectors thrive in hot, wet conditions. The febrile disease may produce high mortality (up to 95%) and appears in several clinical forms, including the subacute cardiac form described here, as well as an acute respiratory form with massive pulmonary edema. The pathogenesis is initiated by the introduction of the virus by bites of the insect vector. The virus proliferates in local lymph node, and viremia ensues. The virus has a tropism for endothelial cells, monocytes, and macrophages, and increased vascular permeability, edema, hemorrhage, and microthrombosis are produced. The gross lesions are extensive subcutaneous and intermuscular edematous swelling of the head and neck. Massive hydropericardium is present with accompanying epicardial and endocardial ecchymotic hemorrhages. Histopathologically, endothelial degeneration and necrosis occur with the edema. In the myocardium, hemorrhage, edema, and focal myocardial necrosis with inflammatory cell infiltrates are present (see Chapter 4 and Fig. 4-40). Cranial Mesenteric Arteritis and Thrombosis. Cranial mesenteric arteritis and thrombosis results from fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris ( Fig. 10-73 ). Infection of horses by Strongylus vulgaris is now less common because of widespread use of highly efficacious antiparasitic drugs. During its larval development, the parasite migrates through the intestinal arteries, and the most severe lesions are generally found in the cranial mesenteric artery near its origin. The affected vessel is enlarged, and its wall is firm and fibrotic. The intimal surface often has an adhering thrombus often admixed with larvae. Microscopically, the affected vessel has extensive infiltration of inflammatory cells and proliferation of fibroblasts throughout the wall. As a consequence, thromboembolism of the intestinal arteries frequently occurs and can produce colic, but the abundant collateral circulation to the equine intestinal tract makes intestinal infarction an unusual event. Figure 10-73 Verminous Arteritis and Mural Thrombosis, Strongylosis, Abdominal Aorta (A) and Cranial Mesenteric Artery, Horse. A pale friable thrombotic mass, in which several Strongylus vulgaris larvae (arrows) are embedded, is attached to the wall of the cranial mesenteric artery (C) . (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Aortoiliac Thrombosis. Aortoiliac thrombosis is characterized by extensive and progressive thrombosis thought to be caused by migration of fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris. Aortoiliac thrombosis results in posterior weakness following exercise with recovery following rest. See the previous section on cranial mesenteric arteritis and thrombosis. Jugular Thrombophlebitis. See the discussion on jugular thrombophlebitis in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vessels, Blood Vessels, Inflammation. Equine Viral Arteritis. Equine viral arteritis is a systemic viral infection with a tropism for vascular endothelial cells. In this disease, affected small muscular arteries have lesions of fibrinoid necrosis, extensive edema, and primarily mononuclear infiltration with thrombosis ( Fig. 10-72 ). Grossly, the vascular injury is reflected by hemorrhage and severe edema of the subcutaneous tissues, lymph nodes, and intestinal wall and mesentery accompanied by notable accumulation of serous fluids in body cavities and pulmonary edema. Figure 10-72 Acute Arteritis, Equine Viral Arteritis, Small Intestine, Submucosa, Horse. Small arteries have fibrinoid degeneration (circumferential eosinophilic material [arrows] ) with leukocytic infiltration of the tunica media. The surrounding loose connective tissue is edematous and infiltrated by numerous leukocytes. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) African Horse Sickness: Subacute Cardiac Form. African horse sickness is an insect-borne ( Culicoides spp.) viral disease of Equidae that is endemic in Africa, the Middle East, India, and Spain. The occurrence is seasonal because the insect vectors thrive in hot, wet conditions. The febrile disease may produce high mortality (up to 95%) and appears in several clinical forms, including the subacute cardiac form described here, as well as an acute respiratory form with massive pulmonary edema. The pathogenesis is initiated by the introduction of the virus by bites of the insect vector. The virus proliferates in local lymph node, and viremia ensues. The virus has a tropism for endothelial cells, monocytes, and macrophages, and increased vascular permeability, edema, hemorrhage, and microthrombosis are produced. The gross lesions are extensive subcutaneous and intermuscular edematous swelling of the head and neck. Massive hydropericardium is present with accompanying epicardial and endocardial ecchymotic hemorrhages. Histopathologically, endothelial degeneration and necrosis occur with the edema. In the myocardium, hemorrhage, edema, and focal myocardial necrosis with inflammatory cell infiltrates are present (see Chapter 4 and Fig. 4-40). Cranial Mesenteric Arteritis and Thrombosis. Cranial mesenteric arteritis and thrombosis results from fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris ( Fig. 10-73 ). Infection of horses by Strongylus vulgaris is now less common because of widespread use of highly efficacious antiparasitic drugs. During its larval development, the parasite migrates through the intestinal arteries, and the most severe lesions are generally found in the cranial mesenteric artery near its origin. The affected vessel is enlarged, and its wall is firm and fibrotic. The intimal surface often has an adhering thrombus often admixed with larvae. Microscopically, the affected vessel has extensive infiltration of inflammatory cells and proliferation of fibroblasts throughout the wall. As a consequence, thromboembolism of the intestinal arteries frequently occurs and can produce colic, but the abundant collateral circulation to the equine intestinal tract makes intestinal infarction an unusual event. Figure 10-73 Verminous Arteritis and Mural Thrombosis, Strongylosis, Abdominal Aorta (A) and Cranial Mesenteric Artery, Horse. A pale friable thrombotic mass, in which several Strongylus vulgaris larvae (arrows) are embedded, is attached to the wall of the cranial mesenteric artery (C) . (Courtesy College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Aortoiliac Thrombosis. Aortoiliac thrombosis is characterized by extensive and progressive thrombosis thought to be caused by migration of fourth-stage larval migration from Strongylus vulgaris. Aortoiliac thrombosis results in posterior weakness following exercise with recovery following rest. See the previous section on cranial mesenteric arteritis and thrombosis. Jugular Thrombophlebitis. See the discussion on jugular thrombophlebitis in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vessels, Blood Vessels, Inflammation. Cell Degeneration and Death Arterial Intimal Calcification. Arterial intimal calcifications (intimal bodies) are distinctively small, mineralized masses within the subendothelium in small muscular arteries and arterioles of horses ( E-Fig. 10-24 ). They have no deleterious effect. E-Figure 10-24 Intimal Body (Arrow) , Intestine, Muscular Artery, Horse. Intimal bodies are distinctive small, mineralized masses within the subendothelium of small muscular arteries and arterioles of horses. They are an incidental finding and have no pathologic significance. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Arterial Intimal Calcification. Arterial intimal calcifications (intimal bodies) are distinctively small, mineralized masses within the subendothelium in small muscular arteries and arterioles of horses ( E-Fig. 10-24 ). They have no deleterious effect. E-Figure 10-24 Intimal Body (Arrow) , Intestine, Muscular Artery, Horse. Intimal bodies are distinctive small, mineralized masses within the subendothelium of small muscular arteries and arterioles of horses. They are an incidental finding and have no pathologic significance. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Lymphatic Vessels Inflammation Glanders Disease (Farcy): Cutaneous Form. Glanders disease (Farcy) is a contagious disease of horses, donkeys, and mules caused by infection with Burkholderia ( Pseudomonas ) mallei. Once worldwide in distribution, it is now seen in eastern Europe, Asia, and northern Africa. The disease occurs in several clinical forms, and the cutaneous form with involvement of lymphatic vessels is described here. The pathogenesis is initiated by ingestion of contaminated food and water. The organisms enter through the pharynx and are disseminated to the skin hematogenously. The gross lesions of the skin appear as multiple ulcerated nodules that follow infected lymphatic vessels. Most frequent in the limbs, the ulcerated lesions discharge suppurative exudate onto the skin surface. Swollen tortuous cutaneous lymphatic vessels are visible between the ulcerative lesions. Microscopically, the skin nodules represent pyogranulomatous inflammation extending from cutaneous lymphatic vessels with suppurative lymphangitis (see Fig. 4-25). Miscellaneous Cutaneous Lymphangitides. The cutaneous lesions affecting lymphatic vessels in less common cutaneous lymphangitides are as follows (see Box 10-8 ): 1. Ulcerative (likely caused by Corynebacterium pseudotuberculosis and other cutaneous bacteria) 2. Sporadic (cause unknown) 3. Epizootic lymphangitis ( Histoplasma farciminosum ) 4. Melioidosis ( Burkholderia pseudomallei ) These lesions mimic those of Glanders disease, and differentiation occurs by impression smears and microbiologic cultures and analyses. The skin of the legs, head, neck, and/or flanks has raised firm nodules (≈1 to 2 cm in diameter), draining nodules, and draining fistulous tracts, often arranged in linear bands (beaded appearance) that follow the flow of lymphatic vessels. These lesions contain or drain pus, which is often thick and white-yellow in color. Microscopically, lesions are characterized by suppurative to pyogranulomatous inflammation. Infectious microorganisms are often present in the exudate (see Fig. 4-25). Chronic Progressive Lymphedema in Draft Horses. Chronic progressive lymphedema (CPL) occurs in many draft horse breeds and is a debilitating condition. A definitive cause is not known; however, a genetic disorder of elastin metabolism resulting in dysfunction of the lymphatic vessels in the distal extremities with multiple contributing factors including secondary bacterial infections is suspected. The distal limbs are swollen with pitting edema, thickened, scaling skin with exudation, erosions, and ulcerations. Microscopically, dermal lymphatic vessels are markedly dilated within the edematous dermis. In chronic cases, the dermis may become markedly thickened with fibrous connective tissue as a result of the chronic edema. The overlying epidermis may be acanthotic with intraepidermal pustules, erosions, and ulcerations. Folliculitis and deep dermal abscesses may be present. Staining for elastin fibers demonstrates a disorganized and excessive network of elastin fibers within the superficial dermis. Lymphatic vessels within the deep dermis lack normal elastin fibers. Inflammation Glanders Disease (Farcy): Cutaneous Form. Glanders disease (Farcy) is a contagious disease of horses, donkeys, and mules caused by infection with Burkholderia ( Pseudomonas ) mallei. Once worldwide in distribution, it is now seen in eastern Europe, Asia, and northern Africa. The disease occurs in several clinical forms, and the cutaneous form with involvement of lymphatic vessels is described here. The pathogenesis is initiated by ingestion of contaminated food and water. The organisms enter through the pharynx and are disseminated to the skin hematogenously. The gross lesions of the skin appear as multiple ulcerated nodules that follow infected lymphatic vessels. Most frequent in the limbs, the ulcerated lesions discharge suppurative exudate onto the skin surface. Swollen tortuous cutaneous lymphatic vessels are visible between the ulcerative lesions. Microscopically, the skin nodules represent pyogranulomatous inflammation extending from cutaneous lymphatic vessels with suppurative lymphangitis (see Fig. 4-25). Miscellaneous Cutaneous Lymphangitides. The cutaneous lesions affecting lymphatic vessels in less common cutaneous lymphangitides are as follows (see Box 10-8 ): 1. Ulcerative (likely caused by Corynebacterium pseudotuberculosis and other cutaneous bacteria) 2. Sporadic (cause unknown) 3. Epizootic lymphangitis ( Histoplasma farciminosum ) 4. Melioidosis ( Burkholderia pseudomallei ) These lesions mimic those of Glanders disease, and differentiation occurs by impression smears and microbiologic cultures and analyses. The skin of the legs, head, neck, and/or flanks has raised firm nodules (≈1 to 2 cm in diameter), draining nodules, and draining fistulous tracts, often arranged in linear bands (beaded appearance) that follow the flow of lymphatic vessels. These lesions contain or drain pus, which is often thick and white-yellow in color. Microscopically, lesions are characterized by suppurative to pyogranulomatous inflammation. Infectious microorganisms are often present in the exudate (see Fig. 4-25). Chronic Progressive Lymphedema in Draft Horses. Chronic progressive lymphedema (CPL) occurs in many draft horse breeds and is a debilitating condition. A definitive cause is not known; however, a genetic disorder of elastin metabolism resulting in dysfunction of the lymphatic vessels in the distal extremities with multiple contributing factors including secondary bacterial infections is suspected. The distal limbs are swollen with pitting edema, thickened, scaling skin with exudation, erosions, and ulcerations. Microscopically, dermal lymphatic vessels are markedly dilated within the edematous dermis. In chronic cases, the dermis may become markedly thickened with fibrous connective tissue as a result of the chronic edema. The overlying epidermis may be acanthotic with intraepidermal pustules, erosions, and ulcerations. Folliculitis and deep dermal abscesses may be present. Staining for elastin fibers demonstrates a disorganized and excessive network of elastin fibers within the superficial dermis. Lymphatic vessels within the deep dermis lack normal elastin fibers. Glanders Disease (Farcy): Cutaneous Form. Glanders disease (Farcy) is a contagious disease of horses, donkeys, and mules caused by infection with Burkholderia ( Pseudomonas ) mallei. Once worldwide in distribution, it is now seen in eastern Europe, Asia, and northern Africa. The disease occurs in several clinical forms, and the cutaneous form with involvement of lymphatic vessels is described here. The pathogenesis is initiated by ingestion of contaminated food and water. The organisms enter through the pharynx and are disseminated to the skin hematogenously. The gross lesions of the skin appear as multiple ulcerated nodules that follow infected lymphatic vessels. Most frequent in the limbs, the ulcerated lesions discharge suppurative exudate onto the skin surface. Swollen tortuous cutaneous lymphatic vessels are visible between the ulcerative lesions. Microscopically, the skin nodules represent pyogranulomatous inflammation extending from cutaneous lymphatic vessels with suppurative lymphangitis (see Fig. 4-25). Miscellaneous Cutaneous Lymphangitides. The cutaneous lesions affecting lymphatic vessels in less common cutaneous lymphangitides are as follows (see Box 10-8 ): 1. Ulcerative (likely caused by Corynebacterium pseudotuberculosis and other cutaneous bacteria) 2. Sporadic (cause unknown) 3. Epizootic lymphangitis ( Histoplasma farciminosum ) 4. Melioidosis ( Burkholderia pseudomallei ) These lesions mimic those of Glanders disease, and differentiation occurs by impression smears and microbiologic cultures and analyses. The skin of the legs, head, neck, and/or flanks has raised firm nodules (≈1 to 2 cm in diameter), draining nodules, and draining fistulous tracts, often arranged in linear bands (beaded appearance) that follow the flow of lymphatic vessels. These lesions contain or drain pus, which is often thick and white-yellow in color. Microscopically, lesions are characterized by suppurative to pyogranulomatous inflammation. Infectious microorganisms are often present in the exudate (see Fig. 4-25). Chronic Progressive Lymphedema in Draft Horses. Chronic progressive lymphedema (CPL) occurs in many draft horse breeds and is a debilitating condition. A definitive cause is not known; however, a genetic disorder of elastin metabolism resulting in dysfunction of the lymphatic vessels in the distal extremities with multiple contributing factors including secondary bacterial infections is suspected. The distal limbs are swollen with pitting edema, thickened, scaling skin with exudation, erosions, and ulcerations. Microscopically, dermal lymphatic vessels are markedly dilated within the edematous dermis. In chronic cases, the dermis may become markedly thickened with fibrous connective tissue as a result of the chronic edema. The overlying epidermis may be acanthotic with intraepidermal pustules, erosions, and ulcerations. Folliculitis and deep dermal abscesses may be present. Staining for elastin fibers demonstrates a disorganized and excessive network of elastin fibers within the superficial dermis. Lymphatic vessels within the deep dermis lack normal elastin fibers. Disorders of Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) Myocardium Disturbances of Growth Dilated Cardiomyopathy. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Lymphoma (Lymphosarcoma). See the discussion on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth. Inflammation Blackleg Myocarditis. Hemorrhagic myocarditis occurs together with the hemorrhagic inflammation typically found in skeletal muscle of cattle with blackleg ( Clostridium chauvoei ) ( Fig. 10-74 ). See the discussion on myocarditis in the section on Responses to Injury: Myocardium , Inflammation; sections on disorders of individual animal species; and also Chapter 15. Figure 10-74 Necrohemorrhagic Myocarditis, "Blackleg," Heart, Steer. A, Note the area of hemorrhagic myocarditis (arrows) in the wall of the ventricular myocardium. This disease is caused by Clostridium chauvoei , and lesions are most common in skeletal muscle. B, Necrohemorrhagic myocarditis, heart, cow. Note the myocardial necrosis, serocellular interstitial debris, and the clear spaces (arrows) representative of gas bubbles. ( A courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois. B courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) East Coast Fever ( Theileria parva ). East Coast fever is a tick-transmitted protozoal disease of cattle, sheep, and goats in Africa caused by Theileria parva , which causes myocardial necrosis and inflammation ( E-Fig. 10-25 ). E-Figure 10-25 Myocarditis, East Coast Fever, Heart, Cow. The multiple white-beige areas in the left ventricular wall are infiltrates of mononuclear inflammatory cells. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Foot-and-Mouth Disease. Foot-and-mouth disease can cause myocarditis in young lambs and piglets. Focal myocardial necrosis and apoptosis with infiltration of mononuclear inflammatory cells are scattered throughout the myocardium. Myocarditis may precede the typical vesicular lesions (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). Eosinophilic Myocarditis. Eosinophilic myocarditis and the accumulation of eosinophils in the inflammatory response are the result of some parasitic infections such as sarcocystosis (see Chapter 15). Cell Degeneration and Death: Toxicoses Gossypol-Induced Myocardial Degeneration. See the discussion on gossypol-induced myocardial degeneration in Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Cell Degeneration and Death, Toxicoses. Excess Vitamin D and Calcinogenic Plants. See the discussion on mineralization in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Cell Degeneration and Death, Endocardial Mineralization; in others sections of this chapter; and also Chapters 1 and 15. Endocardium and Heart Valves Disturbances of Growth Valvular Hematomas. Valvular hematomas (hematocysts, valvular telangiectasia) frequently are observed on the AV valves of postnatal ruminants (see Fig. 10-51, A ). These lesions, which may regress spontaneously by the time the animals are several months of age, do not produce any functional abnormalities. Lesions are bulging, blood-filled cysts, several millimeters in diameter, on the AV valves. Valvular Lymphocysts. Valvular lymphocysts may also occur and appear as yellow serum-filled cysts on the AV valve cusps (see Fig. 10-51, B ). Inflammation Vegetative Valvular Endocarditis. Endocarditis is usually the result of bacterial infections in which the affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can largely occlude the valvular orifice (see Fig. 10-54, A ). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation, and also Chapter 3. Cell Degeneration and Death Endocardial Mineralization See the discussion on mineralization in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Cell Degeneration and Death, Endocardial Mineralization; in others sections of this chapter; and also Chapters 1 and 15. Pericardium and Epicardium Inflammation Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. In goats, Mycoplasma mycoides subspecies mycoides produces a fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. See the discussion on pericarditis in Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation and also Chapters 7 and 9. Suppurative Pericarditis (Traumatic Reticulopericarditis). Suppurative pericarditis is seen mainly in cattle as a complication of traumatic reticuloperitonitis ("hardware disease"). Foreign bodies, such as nails or pieces of wire that accumulate in the reticulum, occasionally penetrate the reticular wall and diaphragm, enter the adjacent pericardial sac, and introduce infection. Some affected cattle survive for weeks to months until death ensues from congestive heart failure and septicemia. Grossly, the pericardial surfaces are notably thickened by white, often rough, shaggy-appearing masses of fibrous connective tissue that enclose an accumulation of white to gray, thick, foul-smelling, purulent exudate (see Fig. 10-62 ). See the discussion on pericarditis in the section on Epicardium and Pericardium, Disorders of Domestic Animals , and also Chapters 7 and 9. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Inflammation: Infectious Diseases Thrombotic Meningoencephalitis. Histophilus somni (formerly Haemophilus somnus ) causes a systemic vasculitis in cattle resulting in meningoencephalitis. Mural thrombi from local vascular injury rather than thromboemboli from distal sites of vascular injury, such as the lungs, are the major type of thrombus in this disease. Gross lesions in the central nervous system (CNS) are characteristic of infarcts (see Fig. 14-89, A ). Microscopic lesions are initially vasculitis and vascular necrosis, which are followed by thrombosis and infarction (see Fig. 14-89, B ). Septic vasculitis, the initial event, is followed by edema and an influx of neutrophils and macrophages in and around vessel walls and adjacent parenchyma. Colonies of small Gram-negative bacilli are frequent in thrombi, in and around affected vessels, and in areas of necrosis. Histophilus somni can also cause a necrotizing myocarditis, frequently in the left ventricular papillary myocardium. Thrombosis of the Caudal Vena Cava. Thrombosis of the caudal vena cava occurs in association with rupture of hepatic abscesses into either the hepatic vein or the caudal vena cava. The hepatic abscess inflammation extends into the adjacent large hepatic veins and results in formation of a septic thrombus in the caudal vena cava. Rupture and release of the contents of the abscess into the lumen can cause multiple septic emboli in the pulmonary capillaries and unexpected death of the affected animal, often preceded by severe hemoptysis. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins. These diseases in cattle and water buffalo include schistosomiasis (blood fluke infection— Schistosoma spp.) in which adult parasites are present in the mesenteric and portal veins, and the resulting phlebitis is characterized by intimal proliferation and thrombosis. Omphalophlebitis ("Navel Ill"). See the discussion on omphalophlebitis ("navel ill") in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Blood Vessels, Inflammation, and also Chapter 8. Johne's Disease. Lesions of Johne's disease affecting blood and lymphatic vessels and characterized by intimal mineralization and granulomatous lymphangitis, respectively, are discussed in greater detail in Chapters 4, 7, and 13Chapter 4Chapter 7Chapter 13. Anthrax. Anthrax in herbivores often occurs as an acute febrile highly fatal septicemic disease. Although global in distribution, the disease is enzootic in certain areas. The etiology is Bacillus anthracis , a large rod-shaped spore-forming bacterium. The pathogenesis of the disease in affected herbivores is exposure by ingestion of contaminated food (especially bone meal) and water. The organisms produce a variety of lethal toxins that provoke local edema and tissue necrosis and increased vascular permeability associated with lymphangitis and lymphadenitis. Herbivores that die from septicemic anthrax have dark, thick unclotted blood oozing from body orifices. These cases should NOT be subjected to necropsy to avoid massive contamination of the environment by the spores of the organism. Instead, a blood smear should be collected and examined for the presence of the diagnostic bacilli. If a case is necropsied by mistake, the diagnostic findings are massive splenomegaly (so-called blackberry jam spleen), disseminated serosal hemorrhages, and swollen edematous lymph nodes. Microscopic findings (histopathologic evaluation is NOT recommended) include massive numbers of typical large rod-shaped organisms in the blood, congestion, hemorrhage, lymphangitis, and lymphadenitis (see Chapter 4, Fig. 4-23; Chapter 7, Fig. 7-135; and Chapter 13, Fig. 13-57). Neospora caninum. See the discussion on Neospora caninum in Chapter 4. Malignant Catarrhal Fever. See the discussion on malignant catarrhal fever in Chapter 4. Bovine Virus Diarrhea. See the discussion on bovine virus diarrhea in Chapters 4 and 7. Bluetongue. See the discussion on bluetongue in Chapters 4 and 7. Myocardium Disturbances of Growth Dilated Cardiomyopathy. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Lymphoma (Lymphosarcoma). See the discussion on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth. Inflammation Blackleg Myocarditis. Hemorrhagic myocarditis occurs together with the hemorrhagic inflammation typically found in skeletal muscle of cattle with blackleg ( Clostridium chauvoei ) ( Fig. 10-74 ). See the discussion on myocarditis in the section on Responses to Injury: Myocardium , Inflammation; sections on disorders of individual animal species; and also Chapter 15. Figure 10-74 Necrohemorrhagic Myocarditis, "Blackleg," Heart, Steer. A, Note the area of hemorrhagic myocarditis (arrows) in the wall of the ventricular myocardium. This disease is caused by Clostridium chauvoei , and lesions are most common in skeletal muscle. B, Necrohemorrhagic myocarditis, heart, cow. Note the myocardial necrosis, serocellular interstitial debris, and the clear spaces (arrows) representative of gas bubbles. ( A courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois. B courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) East Coast Fever ( Theileria parva ). East Coast fever is a tick-transmitted protozoal disease of cattle, sheep, and goats in Africa caused by Theileria parva , which causes myocardial necrosis and inflammation ( E-Fig. 10-25 ). E-Figure 10-25 Myocarditis, East Coast Fever, Heart, Cow. The multiple white-beige areas in the left ventricular wall are infiltrates of mononuclear inflammatory cells. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Foot-and-Mouth Disease. Foot-and-mouth disease can cause myocarditis in young lambs and piglets. Focal myocardial necrosis and apoptosis with infiltration of mononuclear inflammatory cells are scattered throughout the myocardium. Myocarditis may precede the typical vesicular lesions (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). Eosinophilic Myocarditis. Eosinophilic myocarditis and the accumulation of eosinophils in the inflammatory response are the result of some parasitic infections such as sarcocystosis (see Chapter 15). Cell Degeneration and Death: Toxicoses Gossypol-Induced Myocardial Degeneration. See the discussion on gossypol-induced myocardial degeneration in Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Cell Degeneration and Death, Toxicoses. Excess Vitamin D and Calcinogenic Plants. See the discussion on mineralization in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Cell Degeneration and Death, Endocardial Mineralization; in others sections of this chapter; and also Chapters 1 and 15. Disturbances of Growth Dilated Cardiomyopathy. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Lymphoma (Lymphosarcoma). See the discussion on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth. Dilated Cardiomyopathy. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Lymphoma (Lymphosarcoma). See the discussion on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth. Inflammation Blackleg Myocarditis. Hemorrhagic myocarditis occurs together with the hemorrhagic inflammation typically found in skeletal muscle of cattle with blackleg ( Clostridium chauvoei ) ( Fig. 10-74 ). See the discussion on myocarditis in the section on Responses to Injury: Myocardium , Inflammation; sections on disorders of individual animal species; and also Chapter 15. Figure 10-74 Necrohemorrhagic Myocarditis, "Blackleg," Heart, Steer. A, Note the area of hemorrhagic myocarditis (arrows) in the wall of the ventricular myocardium. This disease is caused by Clostridium chauvoei , and lesions are most common in skeletal muscle. B, Necrohemorrhagic myocarditis, heart, cow. Note the myocardial necrosis, serocellular interstitial debris, and the clear spaces (arrows) representative of gas bubbles. ( A courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois. B courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) East Coast Fever ( Theileria parva ). East Coast fever is a tick-transmitted protozoal disease of cattle, sheep, and goats in Africa caused by Theileria parva , which causes myocardial necrosis and inflammation ( E-Fig. 10-25 ). E-Figure 10-25 Myocarditis, East Coast Fever, Heart, Cow. The multiple white-beige areas in the left ventricular wall are infiltrates of mononuclear inflammatory cells. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Foot-and-Mouth Disease. Foot-and-mouth disease can cause myocarditis in young lambs and piglets. Focal myocardial necrosis and apoptosis with infiltration of mononuclear inflammatory cells are scattered throughout the myocardium. Myocarditis may precede the typical vesicular lesions (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). Eosinophilic Myocarditis. Eosinophilic myocarditis and the accumulation of eosinophils in the inflammatory response are the result of some parasitic infections such as sarcocystosis (see Chapter 15). Blackleg Myocarditis. Hemorrhagic myocarditis occurs together with the hemorrhagic inflammation typically found in skeletal muscle of cattle with blackleg ( Clostridium chauvoei ) ( Fig. 10-74 ). See the discussion on myocarditis in the section on Responses to Injury: Myocardium , Inflammation; sections on disorders of individual animal species; and also Chapter 15. Figure 10-74 Necrohemorrhagic Myocarditis, "Blackleg," Heart, Steer. A, Note the area of hemorrhagic myocarditis (arrows) in the wall of the ventricular myocardium. This disease is caused by Clostridium chauvoei , and lesions are most common in skeletal muscle. B, Necrohemorrhagic myocarditis, heart, cow. Note the myocardial necrosis, serocellular interstitial debris, and the clear spaces (arrows) representative of gas bubbles. ( A courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois. B courtesy Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island.) East Coast Fever ( Theileria parva ). East Coast fever is a tick-transmitted protozoal disease of cattle, sheep, and goats in Africa caused by Theileria parva , which causes myocardial necrosis and inflammation ( E-Fig. 10-25 ). E-Figure 10-25 Myocarditis, East Coast Fever, Heart, Cow. The multiple white-beige areas in the left ventricular wall are infiltrates of mononuclear inflammatory cells. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Foot-and-Mouth Disease. Foot-and-mouth disease can cause myocarditis in young lambs and piglets. Focal myocardial necrosis and apoptosis with infiltration of mononuclear inflammatory cells are scattered throughout the myocardium. Myocarditis may precede the typical vesicular lesions (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). Eosinophilic Myocarditis. Eosinophilic myocarditis and the accumulation of eosinophils in the inflammatory response are the result of some parasitic infections such as sarcocystosis (see Chapter 15). Cell Degeneration and Death: Toxicoses Gossypol-Induced Myocardial Degeneration. See the discussion on gossypol-induced myocardial degeneration in Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Cell Degeneration and Death, Toxicoses. Excess Vitamin D and Calcinogenic Plants. See the discussion on mineralization in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Cell Degeneration and Death, Endocardial Mineralization; in others sections of this chapter; and also Chapters 1 and 15. Gossypol-Induced Myocardial Degeneration. See the discussion on gossypol-induced myocardial degeneration in Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Cell Degeneration and Death, Toxicoses. Excess Vitamin D and Calcinogenic Plants. See the discussion on mineralization in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Cell Degeneration and Death, Endocardial Mineralization; in others sections of this chapter; and also Chapters 1 and 15. Endocardium and Heart Valves Disturbances of Growth Valvular Hematomas. Valvular hematomas (hematocysts, valvular telangiectasia) frequently are observed on the AV valves of postnatal ruminants (see Fig. 10-51, A ). These lesions, which may regress spontaneously by the time the animals are several months of age, do not produce any functional abnormalities. Lesions are bulging, blood-filled cysts, several millimeters in diameter, on the AV valves. Valvular Lymphocysts. Valvular lymphocysts may also occur and appear as yellow serum-filled cysts on the AV valve cusps (see Fig. 10-51, B ). Inflammation Vegetative Valvular Endocarditis. Endocarditis is usually the result of bacterial infections in which the affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can largely occlude the valvular orifice (see Fig. 10-54, A ). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation, and also Chapter 3. Cell Degeneration and Death Endocardial Mineralization See the discussion on mineralization in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Cell Degeneration and Death, Endocardial Mineralization; in others sections of this chapter; and also Chapters 1 and 15. Disturbances of Growth Valvular Hematomas. Valvular hematomas (hematocysts, valvular telangiectasia) frequently are observed on the AV valves of postnatal ruminants (see Fig. 10-51, A ). These lesions, which may regress spontaneously by the time the animals are several months of age, do not produce any functional abnormalities. Lesions are bulging, blood-filled cysts, several millimeters in diameter, on the AV valves. Valvular Lymphocysts. Valvular lymphocysts may also occur and appear as yellow serum-filled cysts on the AV valve cusps (see Fig. 10-51, B ). Valvular Hematomas. Valvular hematomas (hematocysts, valvular telangiectasia) frequently are observed on the AV valves of postnatal ruminants (see Fig. 10-51, A ). These lesions, which may regress spontaneously by the time the animals are several months of age, do not produce any functional abnormalities. Lesions are bulging, blood-filled cysts, several millimeters in diameter, on the AV valves. Valvular Lymphocysts. Valvular lymphocysts may also occur and appear as yellow serum-filled cysts on the AV valve cusps (see Fig. 10-51, B ). Inflammation Vegetative Valvular Endocarditis. Endocarditis is usually the result of bacterial infections in which the affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can largely occlude the valvular orifice (see Fig. 10-54, A ). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation, and also Chapter 3. Vegetative Valvular Endocarditis. Endocarditis is usually the result of bacterial infections in which the affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can largely occlude the valvular orifice (see Fig. 10-54, A ). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation, and also Chapter 3. Cell Degeneration and Death Endocardial Mineralization See the discussion on mineralization in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Cell Degeneration and Death, Endocardial Mineralization; in others sections of this chapter; and also Chapters 1 and 15. Endocardial Mineralization See the discussion on mineralization in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Cell Degeneration and Death, Endocardial Mineralization; in others sections of this chapter; and also Chapters 1 and 15. Pericardium and Epicardium Inflammation Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. In goats, Mycoplasma mycoides subspecies mycoides produces a fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. See the discussion on pericarditis in Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation and also Chapters 7 and 9. Suppurative Pericarditis (Traumatic Reticulopericarditis). Suppurative pericarditis is seen mainly in cattle as a complication of traumatic reticuloperitonitis ("hardware disease"). Foreign bodies, such as nails or pieces of wire that accumulate in the reticulum, occasionally penetrate the reticular wall and diaphragm, enter the adjacent pericardial sac, and introduce infection. Some affected cattle survive for weeks to months until death ensues from congestive heart failure and septicemia. Grossly, the pericardial surfaces are notably thickened by white, often rough, shaggy-appearing masses of fibrous connective tissue that enclose an accumulation of white to gray, thick, foul-smelling, purulent exudate (see Fig. 10-62 ). See the discussion on pericarditis in the section on Epicardium and Pericardium, Disorders of Domestic Animals , and also Chapters 7 and 9. Inflammation Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. In goats, Mycoplasma mycoides subspecies mycoides produces a fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. See the discussion on pericarditis in Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation and also Chapters 7 and 9. Suppurative Pericarditis (Traumatic Reticulopericarditis). Suppurative pericarditis is seen mainly in cattle as a complication of traumatic reticuloperitonitis ("hardware disease"). Foreign bodies, such as nails or pieces of wire that accumulate in the reticulum, occasionally penetrate the reticular wall and diaphragm, enter the adjacent pericardial sac, and introduce infection. Some affected cattle survive for weeks to months until death ensues from congestive heart failure and septicemia. Grossly, the pericardial surfaces are notably thickened by white, often rough, shaggy-appearing masses of fibrous connective tissue that enclose an accumulation of white to gray, thick, foul-smelling, purulent exudate (see Fig. 10-62 ). See the discussion on pericarditis in the section on Epicardium and Pericardium, Disorders of Domestic Animals , and also Chapters 7 and 9. Fibrinous Pericarditis. Hematogenous spread of specific organisms may result in fibrinous pericarditis. Mannheimiosis, blackleg, coliform septicemias, contagious bovine pleuropneumonia, sporadic bovine encephalomyelitis, and in utero Brucella spp. and Arcanobacter pyogenesis fetal septicemias may all produce fibrinous pericarditis. In sheep, Mannheimiosis and streptococcal infections most commonly result in fibrinous pericarditis. In goats, Mycoplasma mycoides subspecies mycoides produces a fibrinous pericarditis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. See the discussion on pericarditis in Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation and also Chapters 7 and 9. Suppurative Pericarditis (Traumatic Reticulopericarditis). Suppurative pericarditis is seen mainly in cattle as a complication of traumatic reticuloperitonitis ("hardware disease"). Foreign bodies, such as nails or pieces of wire that accumulate in the reticulum, occasionally penetrate the reticular wall and diaphragm, enter the adjacent pericardial sac, and introduce infection. Some affected cattle survive for weeks to months until death ensues from congestive heart failure and septicemia. Grossly, the pericardial surfaces are notably thickened by white, often rough, shaggy-appearing masses of fibrous connective tissue that enclose an accumulation of white to gray, thick, foul-smelling, purulent exudate (see Fig. 10-62 ). See the discussion on pericarditis in the section on Epicardium and Pericardium, Disorders of Domestic Animals , and also Chapters 7 and 9. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Inflammation: Infectious Diseases Thrombotic Meningoencephalitis. Histophilus somni (formerly Haemophilus somnus ) causes a systemic vasculitis in cattle resulting in meningoencephalitis. Mural thrombi from local vascular injury rather than thromboemboli from distal sites of vascular injury, such as the lungs, are the major type of thrombus in this disease. Gross lesions in the central nervous system (CNS) are characteristic of infarcts (see Fig. 14-89, A ). Microscopic lesions are initially vasculitis and vascular necrosis, which are followed by thrombosis and infarction (see Fig. 14-89, B ). Septic vasculitis, the initial event, is followed by edema and an influx of neutrophils and macrophages in and around vessel walls and adjacent parenchyma. Colonies of small Gram-negative bacilli are frequent in thrombi, in and around affected vessels, and in areas of necrosis. Histophilus somni can also cause a necrotizing myocarditis, frequently in the left ventricular papillary myocardium. Thrombosis of the Caudal Vena Cava. Thrombosis of the caudal vena cava occurs in association with rupture of hepatic abscesses into either the hepatic vein or the caudal vena cava. The hepatic abscess inflammation extends into the adjacent large hepatic veins and results in formation of a septic thrombus in the caudal vena cava. Rupture and release of the contents of the abscess into the lumen can cause multiple septic emboli in the pulmonary capillaries and unexpected death of the affected animal, often preceded by severe hemoptysis. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins. These diseases in cattle and water buffalo include schistosomiasis (blood fluke infection— Schistosoma spp.) in which adult parasites are present in the mesenteric and portal veins, and the resulting phlebitis is characterized by intimal proliferation and thrombosis. Omphalophlebitis ("Navel Ill"). See the discussion on omphalophlebitis ("navel ill") in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Blood Vessels, Inflammation, and also Chapter 8. Johne's Disease. Lesions of Johne's disease affecting blood and lymphatic vessels and characterized by intimal mineralization and granulomatous lymphangitis, respectively, are discussed in greater detail in Chapters 4, 7, and 13Chapter 4Chapter 7Chapter 13. Anthrax. Anthrax in herbivores often occurs as an acute febrile highly fatal septicemic disease. Although global in distribution, the disease is enzootic in certain areas. The etiology is Bacillus anthracis , a large rod-shaped spore-forming bacterium. The pathogenesis of the disease in affected herbivores is exposure by ingestion of contaminated food (especially bone meal) and water. The organisms produce a variety of lethal toxins that provoke local edema and tissue necrosis and increased vascular permeability associated with lymphangitis and lymphadenitis. Herbivores that die from septicemic anthrax have dark, thick unclotted blood oozing from body orifices. These cases should NOT be subjected to necropsy to avoid massive contamination of the environment by the spores of the organism. Instead, a blood smear should be collected and examined for the presence of the diagnostic bacilli. If a case is necropsied by mistake, the diagnostic findings are massive splenomegaly (so-called blackberry jam spleen), disseminated serosal hemorrhages, and swollen edematous lymph nodes. Microscopic findings (histopathologic evaluation is NOT recommended) include massive numbers of typical large rod-shaped organisms in the blood, congestion, hemorrhage, lymphangitis, and lymphadenitis (see Chapter 4, Fig. 4-23; Chapter 7, Fig. 7-135; and Chapter 13, Fig. 13-57). Neospora caninum. See the discussion on Neospora caninum in Chapter 4. Malignant Catarrhal Fever. See the discussion on malignant catarrhal fever in Chapter 4. Bovine Virus Diarrhea. See the discussion on bovine virus diarrhea in Chapters 4 and 7. Bluetongue. See the discussion on bluetongue in Chapters 4 and 7. Blood Vessels Inflammation: Infectious Diseases Thrombotic Meningoencephalitis. Histophilus somni (formerly Haemophilus somnus ) causes a systemic vasculitis in cattle resulting in meningoencephalitis. Mural thrombi from local vascular injury rather than thromboemboli from distal sites of vascular injury, such as the lungs, are the major type of thrombus in this disease. Gross lesions in the central nervous system (CNS) are characteristic of infarcts (see Fig. 14-89, A ). Microscopic lesions are initially vasculitis and vascular necrosis, which are followed by thrombosis and infarction (see Fig. 14-89, B ). Septic vasculitis, the initial event, is followed by edema and an influx of neutrophils and macrophages in and around vessel walls and adjacent parenchyma. Colonies of small Gram-negative bacilli are frequent in thrombi, in and around affected vessels, and in areas of necrosis. Histophilus somni can also cause a necrotizing myocarditis, frequently in the left ventricular papillary myocardium. Thrombosis of the Caudal Vena Cava. Thrombosis of the caudal vena cava occurs in association with rupture of hepatic abscesses into either the hepatic vein or the caudal vena cava. The hepatic abscess inflammation extends into the adjacent large hepatic veins and results in formation of a septic thrombus in the caudal vena cava. Rupture and release of the contents of the abscess into the lumen can cause multiple septic emboli in the pulmonary capillaries and unexpected death of the affected animal, often preceded by severe hemoptysis. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins. These diseases in cattle and water buffalo include schistosomiasis (blood fluke infection— Schistosoma spp.) in which adult parasites are present in the mesenteric and portal veins, and the resulting phlebitis is characterized by intimal proliferation and thrombosis. Omphalophlebitis ("Navel Ill"). See the discussion on omphalophlebitis ("navel ill") in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Blood Vessels, Inflammation, and also Chapter 8. Johne's Disease. Lesions of Johne's disease affecting blood and lymphatic vessels and characterized by intimal mineralization and granulomatous lymphangitis, respectively, are discussed in greater detail in Chapters 4, 7, and 13Chapter 4Chapter 7Chapter 13. Anthrax. Anthrax in herbivores often occurs as an acute febrile highly fatal septicemic disease. Although global in distribution, the disease is enzootic in certain areas. The etiology is Bacillus anthracis , a large rod-shaped spore-forming bacterium. The pathogenesis of the disease in affected herbivores is exposure by ingestion of contaminated food (especially bone meal) and water. The organisms produce a variety of lethal toxins that provoke local edema and tissue necrosis and increased vascular permeability associated with lymphangitis and lymphadenitis. Herbivores that die from septicemic anthrax have dark, thick unclotted blood oozing from body orifices. These cases should NOT be subjected to necropsy to avoid massive contamination of the environment by the spores of the organism. Instead, a blood smear should be collected and examined for the presence of the diagnostic bacilli. If a case is necropsied by mistake, the diagnostic findings are massive splenomegaly (so-called blackberry jam spleen), disseminated serosal hemorrhages, and swollen edematous lymph nodes. Microscopic findings (histopathologic evaluation is NOT recommended) include massive numbers of typical large rod-shaped organisms in the blood, congestion, hemorrhage, lymphangitis, and lymphadenitis (see Chapter 4, Fig. 4-23; Chapter 7, Fig. 7-135; and Chapter 13, Fig. 13-57). Neospora caninum. See the discussion on Neospora caninum in Chapter 4. Malignant Catarrhal Fever. See the discussion on malignant catarrhal fever in Chapter 4. Bovine Virus Diarrhea. See the discussion on bovine virus diarrhea in Chapters 4 and 7. Bluetongue. See the discussion on bluetongue in Chapters 4 and 7. Inflammation: Infectious Diseases Thrombotic Meningoencephalitis. Histophilus somni (formerly Haemophilus somnus ) causes a systemic vasculitis in cattle resulting in meningoencephalitis. Mural thrombi from local vascular injury rather than thromboemboli from distal sites of vascular injury, such as the lungs, are the major type of thrombus in this disease. Gross lesions in the central nervous system (CNS) are characteristic of infarcts (see Fig. 14-89, A ). Microscopic lesions are initially vasculitis and vascular necrosis, which are followed by thrombosis and infarction (see Fig. 14-89, B ). Septic vasculitis, the initial event, is followed by edema and an influx of neutrophils and macrophages in and around vessel walls and adjacent parenchyma. Colonies of small Gram-negative bacilli are frequent in thrombi, in and around affected vessels, and in areas of necrosis. Histophilus somni can also cause a necrotizing myocarditis, frequently in the left ventricular papillary myocardium. Thrombosis of the Caudal Vena Cava. Thrombosis of the caudal vena cava occurs in association with rupture of hepatic abscesses into either the hepatic vein or the caudal vena cava. The hepatic abscess inflammation extends into the adjacent large hepatic veins and results in formation of a septic thrombus in the caudal vena cava. Rupture and release of the contents of the abscess into the lumen can cause multiple septic emboli in the pulmonary capillaries and unexpected death of the affected animal, often preceded by severe hemoptysis. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins. These diseases in cattle and water buffalo include schistosomiasis (blood fluke infection— Schistosoma spp.) in which adult parasites are present in the mesenteric and portal veins, and the resulting phlebitis is characterized by intimal proliferation and thrombosis. Omphalophlebitis ("Navel Ill"). See the discussion on omphalophlebitis ("navel ill") in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Blood Vessels, Inflammation, and also Chapter 8. Johne's Disease. Lesions of Johne's disease affecting blood and lymphatic vessels and characterized by intimal mineralization and granulomatous lymphangitis, respectively, are discussed in greater detail in Chapters 4, 7, and 13Chapter 4Chapter 7Chapter 13. Anthrax. Anthrax in herbivores often occurs as an acute febrile highly fatal septicemic disease. Although global in distribution, the disease is enzootic in certain areas. The etiology is Bacillus anthracis , a large rod-shaped spore-forming bacterium. The pathogenesis of the disease in affected herbivores is exposure by ingestion of contaminated food (especially bone meal) and water. The organisms produce a variety of lethal toxins that provoke local edema and tissue necrosis and increased vascular permeability associated with lymphangitis and lymphadenitis. Herbivores that die from septicemic anthrax have dark, thick unclotted blood oozing from body orifices. These cases should NOT be subjected to necropsy to avoid massive contamination of the environment by the spores of the organism. Instead, a blood smear should be collected and examined for the presence of the diagnostic bacilli. If a case is necropsied by mistake, the diagnostic findings are massive splenomegaly (so-called blackberry jam spleen), disseminated serosal hemorrhages, and swollen edematous lymph nodes. Microscopic findings (histopathologic evaluation is NOT recommended) include massive numbers of typical large rod-shaped organisms in the blood, congestion, hemorrhage, lymphangitis, and lymphadenitis (see Chapter 4, Fig. 4-23; Chapter 7, Fig. 7-135; and Chapter 13, Fig. 13-57). Neospora caninum. See the discussion on Neospora caninum in Chapter 4. Malignant Catarrhal Fever. See the discussion on malignant catarrhal fever in Chapter 4. Bovine Virus Diarrhea. See the discussion on bovine virus diarrhea in Chapters 4 and 7. Bluetongue. See the discussion on bluetongue in Chapters 4 and 7. Thrombotic Meningoencephalitis. Histophilus somni (formerly Haemophilus somnus ) causes a systemic vasculitis in cattle resulting in meningoencephalitis. Mural thrombi from local vascular injury rather than thromboemboli from distal sites of vascular injury, such as the lungs, are the major type of thrombus in this disease. Gross lesions in the central nervous system (CNS) are characteristic of infarcts (see Fig. 14-89, A ). Microscopic lesions are initially vasculitis and vascular necrosis, which are followed by thrombosis and infarction (see Fig. 14-89, B ). Septic vasculitis, the initial event, is followed by edema and an influx of neutrophils and macrophages in and around vessel walls and adjacent parenchyma. Colonies of small Gram-negative bacilli are frequent in thrombi, in and around affected vessels, and in areas of necrosis. Histophilus somni can also cause a necrotizing myocarditis, frequently in the left ventricular papillary myocardium. Thrombosis of the Caudal Vena Cava. Thrombosis of the caudal vena cava occurs in association with rupture of hepatic abscesses into either the hepatic vein or the caudal vena cava. The hepatic abscess inflammation extends into the adjacent large hepatic veins and results in formation of a septic thrombus in the caudal vena cava. Rupture and release of the contents of the abscess into the lumen can cause multiple septic emboli in the pulmonary capillaries and unexpected death of the affected animal, often preceded by severe hemoptysis. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins. These diseases in cattle and water buffalo include schistosomiasis (blood fluke infection— Schistosoma spp.) in which adult parasites are present in the mesenteric and portal veins, and the resulting phlebitis is characterized by intimal proliferation and thrombosis. Omphalophlebitis ("Navel Ill"). See the discussion on omphalophlebitis ("navel ill") in the section on Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Blood Vessels, Inflammation, and also Chapter 8. Johne's Disease. Lesions of Johne's disease affecting blood and lymphatic vessels and characterized by intimal mineralization and granulomatous lymphangitis, respectively, are discussed in greater detail in Chapters 4, 7, and 13Chapter 4Chapter 7Chapter 13. Anthrax. Anthrax in herbivores often occurs as an acute febrile highly fatal septicemic disease. Although global in distribution, the disease is enzootic in certain areas. The etiology is Bacillus anthracis , a large rod-shaped spore-forming bacterium. The pathogenesis of the disease in affected herbivores is exposure by ingestion of contaminated food (especially bone meal) and water. The organisms produce a variety of lethal toxins that provoke local edema and tissue necrosis and increased vascular permeability associated with lymphangitis and lymphadenitis. Herbivores that die from septicemic anthrax have dark, thick unclotted blood oozing from body orifices. These cases should NOT be subjected to necropsy to avoid massive contamination of the environment by the spores of the organism. Instead, a blood smear should be collected and examined for the presence of the diagnostic bacilli. If a case is necropsied by mistake, the diagnostic findings are massive splenomegaly (so-called blackberry jam spleen), disseminated serosal hemorrhages, and swollen edematous lymph nodes. Microscopic findings (histopathologic evaluation is NOT recommended) include massive numbers of typical large rod-shaped organisms in the blood, congestion, hemorrhage, lymphangitis, and lymphadenitis (see Chapter 4, Fig. 4-23; Chapter 7, Fig. 7-135; and Chapter 13, Fig. 13-57). Neospora caninum. See the discussion on Neospora caninum in Chapter 4. Malignant Catarrhal Fever. See the discussion on malignant catarrhal fever in Chapter 4. Bovine Virus Diarrhea. See the discussion on bovine virus diarrhea in Chapters 4 and 7. Bluetongue. See the discussion on bluetongue in Chapters 4 and 7. Disorders of Pigs Myocardium Cell Degeneration and Death Mulberry Heart Disease. See the discussion on mulberry heart disease in the next section on Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Cell Degeneration and Death, Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Inflammation: Infectious Diseases Viral Myocarditis Encephalomyocarditis. Encephalomyocarditis virus is a cardiovirus of the Picornaviridae. The type B strain can affect several species including human beings, but pigs are most often affected. Pigs of any age can be affected. Gross lesions can include multifocal areas of pallor. Multifocal areas of myocardial necrosis with infiltrations of mononuclear inflammatory cells are observed microscopically. Other viruses that can cause myocarditis in pigs include porcine parvovirus and porcine circovirus 2 associated with postweaning multisystemic wasting syndrome. Endocardium and Heart Valves Inflammation Endocarditis. Endocarditis is commonly found in pigs and results from a bacterial septicemia. The most commonly isolated organisms are Streptococcus spp. and Erysipelothrix rhusiopathiae. Confirmation of the definitive organism requires bacterial isolation. Affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can largely occlude the valvular orifice (see Fig. 10-54 ). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). See the discussion on valvular and mural endocarditis in the section on Inflammation; Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , and also Chapter 3. Pericardium and Epicardium Inflammation: Infectious Diseases Fibrinous Pericarditis. Fibrinous pericarditis may accompany Glasser's disease ( Haemophilus parasuis ) ( Fig. 10-75 ), streptococcal infections, enzootic mycoplasma pneumonia, and salmonellosis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. See the discussion of pericarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation, and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-75 Fibrinous Porcine Polyserositis, Glasser's Disease, Pericardium and Epicardium (Pericardial Cavity), Pig. A fibrinous pericarditis is typical of Glasser's disease ( Haemophilus parasuis ). Streptococcal infections, enzootic mycoplasma pneumonia, and salmonellosis can also cause this lesion. (Courtesy Dr. D. Driemeier, Federal University of Rio Grande do Sul, Brazil.) Porcine Polyserositis (Glasser's Disease, Streptococcus suis II). See Fig. 10-75 ; also see the discussion of edema disease in the next section and in Chapters 4 and 7. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Cell Degeneration and Death Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease. Dietary microangiopathy of pigs or "mulberry heart disease" is produced by a deficiency of vitamin E and/or selenium and the resultant effect on the microvasculature, which is characterized by fibrinoid necrosis, and thromboses of small vessels resulting in microhemorrhages. The hemorrhage results in major discoloration of the epicardial surface of the heart, particularly the right atrium said to resemble a mulberry ( Figs. 10-76 and 10-77 ). In addition to the epicardial hemorrhages, hydropericardium often ensues. Massive hemorrhagic hepatic necrosis (hepatosis dietetica) is also produced with vitamin E and/or selenium deficiency (see Fig. 8-74). With either form of the disease, fibrinoid necrosis of small muscular arteries and arterioles is widespread and is accompanied by endothelial damage and fibrin thrombi in capillaries, especially capillaries of the myocardium ( Fig. 10-78 ; E-Fig. 10-26 ). This complex of vascular lesions has been termed dietary microangiopathy. Figure 10-76 "Mulberry Heart Disease," Suffusive Hemorrhage, Epicardium, Right Ventricle, Heart, Pig. Red areas of suffusive hemorrhage ("mulberry-like") are present on the epicardial surface of the right ventricle. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-77 "Mulberry Heart Disease," Hemorrhage and Necrosis, Left and Right Ventricular Myocardium, Transverse Section, Pig. Red and pale mottled areas are caused by hemorrhage and necrosis, respectively. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-78 Vitamin E–Selenium Deficiency ("Mulberry Heart Disease"), Fibrinoid Necrosis, Myocardial Arteriole, Heart, Pig. Note the circumferential eosinophilic deposits (arrows) in the wall of the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-26 Fibrinoid Necrosis, "Mulberry Heart Disease," Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Section of Myocardium, Pig. The affected arteriole (left) has intraluminal masses of fibrin (F) and entrapped erythrocytes. Fibrin masses are present in the vessel wall, and the adjacent interstitium has edema and hemorrhage. Note scattered erythrocytes (E). TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid Necrosis of Blood Vessels. Fibrinoid necrosis of arteries and veins (see Fig. 10-69 ) is particularly frequent in pigs and is an important diagnostic feature in cases of vitamin E–selenium deficiency (heart), edema disease (gastric submucosa), cerebrospinal angiopathy, porcine circovirus II vasculopathy, and organic mercury toxicosis (meninges). See the previous section on Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Inflammation: Infectious Diseases Edema Disease (Cerebrospinal Angiopathy). Infections with certain strains of hemolytic E. coli produce a cytotoxin that targets vascular endothelium, resulting in fibrinoid necrosis of arterioles and resultant edema. Lesions are often prominent in the arterioles of the gastric submucosa ( Fig. 10-79 ). Vascular changes occurring in the CNS are known as cerebrospinal angiopathy and can produce clinical signs of disease of the nervous system ( E-Fig. 10-27 ; also see Fig. 10-69 ; Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11; and Figs. 7-169 and 7-170). Figure 10-79 Submucosal Edema, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. The submucosa (between arrows) is distended with edema fluid. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-27 Vasculitis with Infarction (Arrows) , Neuroparenchyma, Edema Disease (Enterotoxemic Colibacillosis), Brainstem, Pig. Some strains of Escherichia coli produce a Shiga-like toxin that causes necrosis of smooth muscle cells in small arteries and arterioles in the central nervous system (CNS), leading to vasculitis and infarction. The toxin binds to specific receptors on endothelial cells (see Chapter 4), and this binding can initiate a chain of inflammatory and immunologic reactions that lead to vascular damage. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Erysipelosis (Erysipelothrix rhusiopathiae). Cutaneous lesions in erysipelosis are caused by Erysipelothrix rhusiopathiae and are the result of bacterial embolization to the skin during sepsis. Lesions consist of square to rhomboidal, firm, raised, pink to dark purple areas ( Fig. 10-80 ; see Fig. 17-70) caused by vasculitis, thrombosis, and ischemia (infarction). The rhomboidal shape likely represents an area of skin supplied by a thrombosed vessel (see Chapter 17). Figure 10-80 Cutaneous Infarcts, Diamond Skin Disease, Erysipelothrix Rhusiopathiae Septicemia, Skin, Pig. Emboli of Erysipelothrix rhusiopathiae have lodged in cutaneous vessels and caused a localized vasculitis, which has resulted in thrombosis followed by ischemia and cutaneous infarction. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Porcine Polyserositis (Streptococcus suis II). Streptococcus suis II is one of several bacteria that can cause the disease porcine polyserositis. Gross lesions include vasculitis leading to variable quantities of a gray-white friable material (fibrin) on serosal surfaces (fibrinous polyserositis) of the lungs (fibrinous pleuritis), heart (fibrinous pericarditis [see Fig. 10-75 ]), and abdominal cavity (fibrinous peritonitis). The bacterium gains access to and spreads systemically through the blood vascular system. Lesions suggest this bacterium may have a tropism for vascular endothelial cells of serosae, and bacterial endotoxins may contribute to vascular injury and permeability changes leading to the leakage of fibrinogen and its polymerization to fibrin on serosal surfaces and in some cases to microthrombus formation and disseminated intravascular coagulation (DIC) in other organ systems (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). African Swine Fever (Wart Hog Disease, African Pig Disease). African swine fever is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of pigs associated with a DNA virus. The clinical and pathologic features are very similar to those of classic swine fever (hog cholera). The disease is enzootic in Africa, and outbreaks have occurred in Europe, South America, and the Caribbean region. The pathogenesis of the disease is via entry in the upper respiratory tract. The virus proliferates in the tonsils and lymph nodes of the head and neck with subsequent viremia and dissemination to the entire body. Transmission to domestic swine is via ingestion of infected tissues of warthogs and bush pigs, which develop an unapparent infection, or by the bite of infected soft ticks ( Ornithodoros moubata ). The distinctive hemorrhagic lesions are attributed to disruption of the clotting mechanism and thrombocytopenia. The gross lesions are characterized by widespread congestion, edema, and hemorrhage. Hemorrhagic visceral lymph nodes and splenomegaly are present along with petechial hemorrhages of the renal cortices, epicardium, and other serosal surfaces. Pulmonary edema and hydrothorax also occur. Microscopically, viral-induced vascular alterations include congestion, hemorrhage, and edema with fibrin microthrombi ( E-Fig. 10-28 ). The virus produces widespread necrosis of lymphocytes and macrophages (see Fig. 4-42). E-Figure 10-28 Fibrin Thrombi, Disseminated Intravascular Coagulation, Lung, Alveolar Septal Capillaries, Horse. Fibrin thrombi (arrows) occlude two alveolar capillaries. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hog Cholera/Classic Swine Fever (Swine Fever, Swine Plague, Schweinpest). Hog cholera (also termed classic swine fever ) is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of swine produced by an RNA virus. The disease is enzootic in South America, Central America, Caribbean countries, Asia, and Europe. The pathogenesis of the disease is initiated by inhalation of the virus from direct contact with infected pigs or by ingestion of uncooked infected pork. The virus traverses the oral mucosa, replicates in the tonsils, and initiates viremia. The virus selectively damages endothelial cells, cells of the immune system (lymphoreticular cells and macrophages), and epithelial cells. The characteristic hemorrhagic lesions are associated with increased vascular permeability, thrombocytopenia, and DIC. The gross lesions are characterized by widespread petechial hemorrhages, especially of the renal cortices, urinary bladder, larynx, gastric mucosa, and epicardium with accompanying hemorrhage in lymph nodes and skin. A distinctive finding is hemorrhagic infarction of the spleen and "button ulcers" of the colonic mucosa. Microscopically, endothelial damage is evident as hydropic degeneration and cellular proliferation. Affected vessels may have fibrinoid necrosis with fibrin deposition in the media and intima. Circulatory alterations include congestion, hemorrhage, thrombosis, and infarction. The brain has a diffuse nonsuppurative encephalitis (see Fig. 4-41). Porcine Anthrax. See the discussion on anthrax in the section on Disorders of Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, and also Chapter 4. Myocardium Cell Degeneration and Death Mulberry Heart Disease. See the discussion on mulberry heart disease in the next section on Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Cell Degeneration and Death, Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Inflammation: Infectious Diseases Viral Myocarditis Encephalomyocarditis. Encephalomyocarditis virus is a cardiovirus of the Picornaviridae. The type B strain can affect several species including human beings, but pigs are most often affected. Pigs of any age can be affected. Gross lesions can include multifocal areas of pallor. Multifocal areas of myocardial necrosis with infiltrations of mononuclear inflammatory cells are observed microscopically. Other viruses that can cause myocarditis in pigs include porcine parvovirus and porcine circovirus 2 associated with postweaning multisystemic wasting syndrome. Cell Degeneration and Death Mulberry Heart Disease. See the discussion on mulberry heart disease in the next section on Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Cell Degeneration and Death, Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Mulberry Heart Disease. See the discussion on mulberry heart disease in the next section on Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Cell Degeneration and Death, Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Inflammation: Infectious Diseases Viral Myocarditis Encephalomyocarditis. Encephalomyocarditis virus is a cardiovirus of the Picornaviridae. The type B strain can affect several species including human beings, but pigs are most often affected. Pigs of any age can be affected. Gross lesions can include multifocal areas of pallor. Multifocal areas of myocardial necrosis with infiltrations of mononuclear inflammatory cells are observed microscopically. Other viruses that can cause myocarditis in pigs include porcine parvovirus and porcine circovirus 2 associated with postweaning multisystemic wasting syndrome. Viral Myocarditis Encephalomyocarditis. Encephalomyocarditis virus is a cardiovirus of the Picornaviridae. The type B strain can affect several species including human beings, but pigs are most often affected. Pigs of any age can be affected. Gross lesions can include multifocal areas of pallor. Multifocal areas of myocardial necrosis with infiltrations of mononuclear inflammatory cells are observed microscopically. Other viruses that can cause myocarditis in pigs include porcine parvovirus and porcine circovirus 2 associated with postweaning multisystemic wasting syndrome. Encephalomyocarditis. Encephalomyocarditis virus is a cardiovirus of the Picornaviridae. The type B strain can affect several species including human beings, but pigs are most often affected. Pigs of any age can be affected. Gross lesions can include multifocal areas of pallor. Multifocal areas of myocardial necrosis with infiltrations of mononuclear inflammatory cells are observed microscopically. Other viruses that can cause myocarditis in pigs include porcine parvovirus and porcine circovirus 2 associated with postweaning multisystemic wasting syndrome. Endocardium and Heart Valves Inflammation Endocarditis. Endocarditis is commonly found in pigs and results from a bacterial septicemia. The most commonly isolated organisms are Streptococcus spp. and Erysipelothrix rhusiopathiae. Confirmation of the definitive organism requires bacterial isolation. Affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can largely occlude the valvular orifice (see Fig. 10-54 ). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). See the discussion on valvular and mural endocarditis in the section on Inflammation; Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , and also Chapter 3. Inflammation Endocarditis. Endocarditis is commonly found in pigs and results from a bacterial septicemia. The most commonly isolated organisms are Streptococcus spp. and Erysipelothrix rhusiopathiae. Confirmation of the definitive organism requires bacterial isolation. Affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can largely occlude the valvular orifice (see Fig. 10-54 ). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). See the discussion on valvular and mural endocarditis in the section on Inflammation; Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , and also Chapter 3. Endocarditis. Endocarditis is commonly found in pigs and results from a bacterial septicemia. The most commonly isolated organisms are Streptococcus spp. and Erysipelothrix rhusiopathiae. Confirmation of the definitive organism requires bacterial isolation. Affected valves have large, adhering, friable, yellow-to-gray masses of fibrin termed vegetations , which can largely occlude the valvular orifice (see Fig. 10-54 ). Microscopically, the lesion consists of accumulated layers of fibrin and numerous embedded bacterial colonies underlain by a zone of infiltrated leukocytes and granulation tissue (see Fig. 10-54, B ). See the discussion on valvular and mural endocarditis in the section on Inflammation; Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , and also Chapter 3. Pericardium and Epicardium Inflammation: Infectious Diseases Fibrinous Pericarditis. Fibrinous pericarditis may accompany Glasser's disease ( Haemophilus parasuis ) ( Fig. 10-75 ), streptococcal infections, enzootic mycoplasma pneumonia, and salmonellosis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. See the discussion of pericarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation, and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-75 Fibrinous Porcine Polyserositis, Glasser's Disease, Pericardium and Epicardium (Pericardial Cavity), Pig. A fibrinous pericarditis is typical of Glasser's disease ( Haemophilus parasuis ). Streptococcal infections, enzootic mycoplasma pneumonia, and salmonellosis can also cause this lesion. (Courtesy Dr. D. Driemeier, Federal University of Rio Grande do Sul, Brazil.) Porcine Polyserositis (Glasser's Disease, Streptococcus suis II). See Fig. 10-75 ; also see the discussion of edema disease in the next section and in Chapters 4 and 7. Inflammation: Infectious Diseases Fibrinous Pericarditis. Fibrinous pericarditis may accompany Glasser's disease ( Haemophilus parasuis ) ( Fig. 10-75 ), streptococcal infections, enzootic mycoplasma pneumonia, and salmonellosis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. See the discussion of pericarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation, and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-75 Fibrinous Porcine Polyserositis, Glasser's Disease, Pericardium and Epicardium (Pericardial Cavity), Pig. A fibrinous pericarditis is typical of Glasser's disease ( Haemophilus parasuis ). Streptococcal infections, enzootic mycoplasma pneumonia, and salmonellosis can also cause this lesion. (Courtesy Dr. D. Driemeier, Federal University of Rio Grande do Sul, Brazil.) Porcine Polyserositis (Glasser's Disease, Streptococcus suis II). See Fig. 10-75 ; also see the discussion of edema disease in the next section and in Chapters 4 and 7. Fibrinous Pericarditis. Fibrinous pericarditis may accompany Glasser's disease ( Haemophilus parasuis ) ( Fig. 10-75 ), streptococcal infections, enzootic mycoplasma pneumonia, and salmonellosis. Sterile swabs of the pericardial exudates are recommended to identify the causative organism. See the discussion of pericarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Inflammation, and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Figure 10-75 Fibrinous Porcine Polyserositis, Glasser's Disease, Pericardium and Epicardium (Pericardial Cavity), Pig. A fibrinous pericarditis is typical of Glasser's disease ( Haemophilus parasuis ). Streptococcal infections, enzootic mycoplasma pneumonia, and salmonellosis can also cause this lesion. (Courtesy Dr. D. Driemeier, Federal University of Rio Grande do Sul, Brazil.) Porcine Polyserositis (Glasser's Disease, Streptococcus suis II). See Fig. 10-75 ; also see the discussion of edema disease in the next section and in Chapters 4 and 7. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Cell Degeneration and Death Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease. Dietary microangiopathy of pigs or "mulberry heart disease" is produced by a deficiency of vitamin E and/or selenium and the resultant effect on the microvasculature, which is characterized by fibrinoid necrosis, and thromboses of small vessels resulting in microhemorrhages. The hemorrhage results in major discoloration of the epicardial surface of the heart, particularly the right atrium said to resemble a mulberry ( Figs. 10-76 and 10-77 ). In addition to the epicardial hemorrhages, hydropericardium often ensues. Massive hemorrhagic hepatic necrosis (hepatosis dietetica) is also produced with vitamin E and/or selenium deficiency (see Fig. 8-74). With either form of the disease, fibrinoid necrosis of small muscular arteries and arterioles is widespread and is accompanied by endothelial damage and fibrin thrombi in capillaries, especially capillaries of the myocardium ( Fig. 10-78 ; E-Fig. 10-26 ). This complex of vascular lesions has been termed dietary microangiopathy. Figure 10-76 "Mulberry Heart Disease," Suffusive Hemorrhage, Epicardium, Right Ventricle, Heart, Pig. Red areas of suffusive hemorrhage ("mulberry-like") are present on the epicardial surface of the right ventricle. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-77 "Mulberry Heart Disease," Hemorrhage and Necrosis, Left and Right Ventricular Myocardium, Transverse Section, Pig. Red and pale mottled areas are caused by hemorrhage and necrosis, respectively. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-78 Vitamin E–Selenium Deficiency ("Mulberry Heart Disease"), Fibrinoid Necrosis, Myocardial Arteriole, Heart, Pig. Note the circumferential eosinophilic deposits (arrows) in the wall of the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-26 Fibrinoid Necrosis, "Mulberry Heart Disease," Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Section of Myocardium, Pig. The affected arteriole (left) has intraluminal masses of fibrin (F) and entrapped erythrocytes. Fibrin masses are present in the vessel wall, and the adjacent interstitium has edema and hemorrhage. Note scattered erythrocytes (E). TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid Necrosis of Blood Vessels. Fibrinoid necrosis of arteries and veins (see Fig. 10-69 ) is particularly frequent in pigs and is an important diagnostic feature in cases of vitamin E–selenium deficiency (heart), edema disease (gastric submucosa), cerebrospinal angiopathy, porcine circovirus II vasculopathy, and organic mercury toxicosis (meninges). See the previous section on Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Inflammation: Infectious Diseases Edema Disease (Cerebrospinal Angiopathy). Infections with certain strains of hemolytic E. coli produce a cytotoxin that targets vascular endothelium, resulting in fibrinoid necrosis of arterioles and resultant edema. Lesions are often prominent in the arterioles of the gastric submucosa ( Fig. 10-79 ). Vascular changes occurring in the CNS are known as cerebrospinal angiopathy and can produce clinical signs of disease of the nervous system ( E-Fig. 10-27 ; also see Fig. 10-69 ; Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11; and Figs. 7-169 and 7-170). Figure 10-79 Submucosal Edema, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. The submucosa (between arrows) is distended with edema fluid. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-27 Vasculitis with Infarction (Arrows) , Neuroparenchyma, Edema Disease (Enterotoxemic Colibacillosis), Brainstem, Pig. Some strains of Escherichia coli produce a Shiga-like toxin that causes necrosis of smooth muscle cells in small arteries and arterioles in the central nervous system (CNS), leading to vasculitis and infarction. The toxin binds to specific receptors on endothelial cells (see Chapter 4), and this binding can initiate a chain of inflammatory and immunologic reactions that lead to vascular damage. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Erysipelosis (Erysipelothrix rhusiopathiae). Cutaneous lesions in erysipelosis are caused by Erysipelothrix rhusiopathiae and are the result of bacterial embolization to the skin during sepsis. Lesions consist of square to rhomboidal, firm, raised, pink to dark purple areas ( Fig. 10-80 ; see Fig. 17-70) caused by vasculitis, thrombosis, and ischemia (infarction). The rhomboidal shape likely represents an area of skin supplied by a thrombosed vessel (see Chapter 17). Figure 10-80 Cutaneous Infarcts, Diamond Skin Disease, Erysipelothrix Rhusiopathiae Septicemia, Skin, Pig. Emboli of Erysipelothrix rhusiopathiae have lodged in cutaneous vessels and caused a localized vasculitis, which has resulted in thrombosis followed by ischemia and cutaneous infarction. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Porcine Polyserositis (Streptococcus suis II). Streptococcus suis II is one of several bacteria that can cause the disease porcine polyserositis. Gross lesions include vasculitis leading to variable quantities of a gray-white friable material (fibrin) on serosal surfaces (fibrinous polyserositis) of the lungs (fibrinous pleuritis), heart (fibrinous pericarditis [see Fig. 10-75 ]), and abdominal cavity (fibrinous peritonitis). The bacterium gains access to and spreads systemically through the blood vascular system. Lesions suggest this bacterium may have a tropism for vascular endothelial cells of serosae, and bacterial endotoxins may contribute to vascular injury and permeability changes leading to the leakage of fibrinogen and its polymerization to fibrin on serosal surfaces and in some cases to microthrombus formation and disseminated intravascular coagulation (DIC) in other organ systems (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). African Swine Fever (Wart Hog Disease, African Pig Disease). African swine fever is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of pigs associated with a DNA virus. The clinical and pathologic features are very similar to those of classic swine fever (hog cholera). The disease is enzootic in Africa, and outbreaks have occurred in Europe, South America, and the Caribbean region. The pathogenesis of the disease is via entry in the upper respiratory tract. The virus proliferates in the tonsils and lymph nodes of the head and neck with subsequent viremia and dissemination to the entire body. Transmission to domestic swine is via ingestion of infected tissues of warthogs and bush pigs, which develop an unapparent infection, or by the bite of infected soft ticks ( Ornithodoros moubata ). The distinctive hemorrhagic lesions are attributed to disruption of the clotting mechanism and thrombocytopenia. The gross lesions are characterized by widespread congestion, edema, and hemorrhage. Hemorrhagic visceral lymph nodes and splenomegaly are present along with petechial hemorrhages of the renal cortices, epicardium, and other serosal surfaces. Pulmonary edema and hydrothorax also occur. Microscopically, viral-induced vascular alterations include congestion, hemorrhage, and edema with fibrin microthrombi ( E-Fig. 10-28 ). The virus produces widespread necrosis of lymphocytes and macrophages (see Fig. 4-42). E-Figure 10-28 Fibrin Thrombi, Disseminated Intravascular Coagulation, Lung, Alveolar Septal Capillaries, Horse. Fibrin thrombi (arrows) occlude two alveolar capillaries. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hog Cholera/Classic Swine Fever (Swine Fever, Swine Plague, Schweinpest). Hog cholera (also termed classic swine fever ) is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of swine produced by an RNA virus. The disease is enzootic in South America, Central America, Caribbean countries, Asia, and Europe. The pathogenesis of the disease is initiated by inhalation of the virus from direct contact with infected pigs or by ingestion of uncooked infected pork. The virus traverses the oral mucosa, replicates in the tonsils, and initiates viremia. The virus selectively damages endothelial cells, cells of the immune system (lymphoreticular cells and macrophages), and epithelial cells. The characteristic hemorrhagic lesions are associated with increased vascular permeability, thrombocytopenia, and DIC. The gross lesions are characterized by widespread petechial hemorrhages, especially of the renal cortices, urinary bladder, larynx, gastric mucosa, and epicardium with accompanying hemorrhage in lymph nodes and skin. A distinctive finding is hemorrhagic infarction of the spleen and "button ulcers" of the colonic mucosa. Microscopically, endothelial damage is evident as hydropic degeneration and cellular proliferation. Affected vessels may have fibrinoid necrosis with fibrin deposition in the media and intima. Circulatory alterations include congestion, hemorrhage, thrombosis, and infarction. The brain has a diffuse nonsuppurative encephalitis (see Fig. 4-41). Porcine Anthrax. See the discussion on anthrax in the section on Disorders of Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, and also Chapter 4. Blood Vessels Cell Degeneration and Death Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease. Dietary microangiopathy of pigs or "mulberry heart disease" is produced by a deficiency of vitamin E and/or selenium and the resultant effect on the microvasculature, which is characterized by fibrinoid necrosis, and thromboses of small vessels resulting in microhemorrhages. The hemorrhage results in major discoloration of the epicardial surface of the heart, particularly the right atrium said to resemble a mulberry ( Figs. 10-76 and 10-77 ). In addition to the epicardial hemorrhages, hydropericardium often ensues. Massive hemorrhagic hepatic necrosis (hepatosis dietetica) is also produced with vitamin E and/or selenium deficiency (see Fig. 8-74). With either form of the disease, fibrinoid necrosis of small muscular arteries and arterioles is widespread and is accompanied by endothelial damage and fibrin thrombi in capillaries, especially capillaries of the myocardium ( Fig. 10-78 ; E-Fig. 10-26 ). This complex of vascular lesions has been termed dietary microangiopathy. Figure 10-76 "Mulberry Heart Disease," Suffusive Hemorrhage, Epicardium, Right Ventricle, Heart, Pig. Red areas of suffusive hemorrhage ("mulberry-like") are present on the epicardial surface of the right ventricle. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-77 "Mulberry Heart Disease," Hemorrhage and Necrosis, Left and Right Ventricular Myocardium, Transverse Section, Pig. Red and pale mottled areas are caused by hemorrhage and necrosis, respectively. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-78 Vitamin E–Selenium Deficiency ("Mulberry Heart Disease"), Fibrinoid Necrosis, Myocardial Arteriole, Heart, Pig. Note the circumferential eosinophilic deposits (arrows) in the wall of the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-26 Fibrinoid Necrosis, "Mulberry Heart Disease," Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Section of Myocardium, Pig. The affected arteriole (left) has intraluminal masses of fibrin (F) and entrapped erythrocytes. Fibrin masses are present in the vessel wall, and the adjacent interstitium has edema and hemorrhage. Note scattered erythrocytes (E). TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid Necrosis of Blood Vessels. Fibrinoid necrosis of arteries and veins (see Fig. 10-69 ) is particularly frequent in pigs and is an important diagnostic feature in cases of vitamin E–selenium deficiency (heart), edema disease (gastric submucosa), cerebrospinal angiopathy, porcine circovirus II vasculopathy, and organic mercury toxicosis (meninges). See the previous section on Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Inflammation: Infectious Diseases Edema Disease (Cerebrospinal Angiopathy). Infections with certain strains of hemolytic E. coli produce a cytotoxin that targets vascular endothelium, resulting in fibrinoid necrosis of arterioles and resultant edema. Lesions are often prominent in the arterioles of the gastric submucosa ( Fig. 10-79 ). Vascular changes occurring in the CNS are known as cerebrospinal angiopathy and can produce clinical signs of disease of the nervous system ( E-Fig. 10-27 ; also see Fig. 10-69 ; Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11; and Figs. 7-169 and 7-170). Figure 10-79 Submucosal Edema, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. The submucosa (between arrows) is distended with edema fluid. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-27 Vasculitis with Infarction (Arrows) , Neuroparenchyma, Edema Disease (Enterotoxemic Colibacillosis), Brainstem, Pig. Some strains of Escherichia coli produce a Shiga-like toxin that causes necrosis of smooth muscle cells in small arteries and arterioles in the central nervous system (CNS), leading to vasculitis and infarction. The toxin binds to specific receptors on endothelial cells (see Chapter 4), and this binding can initiate a chain of inflammatory and immunologic reactions that lead to vascular damage. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Erysipelosis (Erysipelothrix rhusiopathiae). Cutaneous lesions in erysipelosis are caused by Erysipelothrix rhusiopathiae and are the result of bacterial embolization to the skin during sepsis. Lesions consist of square to rhomboidal, firm, raised, pink to dark purple areas ( Fig. 10-80 ; see Fig. 17-70) caused by vasculitis, thrombosis, and ischemia (infarction). The rhomboidal shape likely represents an area of skin supplied by a thrombosed vessel (see Chapter 17). Figure 10-80 Cutaneous Infarcts, Diamond Skin Disease, Erysipelothrix Rhusiopathiae Septicemia, Skin, Pig. Emboli of Erysipelothrix rhusiopathiae have lodged in cutaneous vessels and caused a localized vasculitis, which has resulted in thrombosis followed by ischemia and cutaneous infarction. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Porcine Polyserositis (Streptococcus suis II). Streptococcus suis II is one of several bacteria that can cause the disease porcine polyserositis. Gross lesions include vasculitis leading to variable quantities of a gray-white friable material (fibrin) on serosal surfaces (fibrinous polyserositis) of the lungs (fibrinous pleuritis), heart (fibrinous pericarditis [see Fig. 10-75 ]), and abdominal cavity (fibrinous peritonitis). The bacterium gains access to and spreads systemically through the blood vascular system. Lesions suggest this bacterium may have a tropism for vascular endothelial cells of serosae, and bacterial endotoxins may contribute to vascular injury and permeability changes leading to the leakage of fibrinogen and its polymerization to fibrin on serosal surfaces and in some cases to microthrombus formation and disseminated intravascular coagulation (DIC) in other organ systems (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). African Swine Fever (Wart Hog Disease, African Pig Disease). African swine fever is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of pigs associated with a DNA virus. The clinical and pathologic features are very similar to those of classic swine fever (hog cholera). The disease is enzootic in Africa, and outbreaks have occurred in Europe, South America, and the Caribbean region. The pathogenesis of the disease is via entry in the upper respiratory tract. The virus proliferates in the tonsils and lymph nodes of the head and neck with subsequent viremia and dissemination to the entire body. Transmission to domestic swine is via ingestion of infected tissues of warthogs and bush pigs, which develop an unapparent infection, or by the bite of infected soft ticks ( Ornithodoros moubata ). The distinctive hemorrhagic lesions are attributed to disruption of the clotting mechanism and thrombocytopenia. The gross lesions are characterized by widespread congestion, edema, and hemorrhage. Hemorrhagic visceral lymph nodes and splenomegaly are present along with petechial hemorrhages of the renal cortices, epicardium, and other serosal surfaces. Pulmonary edema and hydrothorax also occur. Microscopically, viral-induced vascular alterations include congestion, hemorrhage, and edema with fibrin microthrombi ( E-Fig. 10-28 ). The virus produces widespread necrosis of lymphocytes and macrophages (see Fig. 4-42). E-Figure 10-28 Fibrin Thrombi, Disseminated Intravascular Coagulation, Lung, Alveolar Septal Capillaries, Horse. Fibrin thrombi (arrows) occlude two alveolar capillaries. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hog Cholera/Classic Swine Fever (Swine Fever, Swine Plague, Schweinpest). Hog cholera (also termed classic swine fever ) is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of swine produced by an RNA virus. The disease is enzootic in South America, Central America, Caribbean countries, Asia, and Europe. The pathogenesis of the disease is initiated by inhalation of the virus from direct contact with infected pigs or by ingestion of uncooked infected pork. The virus traverses the oral mucosa, replicates in the tonsils, and initiates viremia. The virus selectively damages endothelial cells, cells of the immune system (lymphoreticular cells and macrophages), and epithelial cells. The characteristic hemorrhagic lesions are associated with increased vascular permeability, thrombocytopenia, and DIC. The gross lesions are characterized by widespread petechial hemorrhages, especially of the renal cortices, urinary bladder, larynx, gastric mucosa, and epicardium with accompanying hemorrhage in lymph nodes and skin. A distinctive finding is hemorrhagic infarction of the spleen and "button ulcers" of the colonic mucosa. Microscopically, endothelial damage is evident as hydropic degeneration and cellular proliferation. Affected vessels may have fibrinoid necrosis with fibrin deposition in the media and intima. Circulatory alterations include congestion, hemorrhage, thrombosis, and infarction. The brain has a diffuse nonsuppurative encephalitis (see Fig. 4-41). Porcine Anthrax. See the discussion on anthrax in the section on Disorders of Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, and also Chapter 4. Cell Degeneration and Death Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease. Dietary microangiopathy of pigs or "mulberry heart disease" is produced by a deficiency of vitamin E and/or selenium and the resultant effect on the microvasculature, which is characterized by fibrinoid necrosis, and thromboses of small vessels resulting in microhemorrhages. The hemorrhage results in major discoloration of the epicardial surface of the heart, particularly the right atrium said to resemble a mulberry ( Figs. 10-76 and 10-77 ). In addition to the epicardial hemorrhages, hydropericardium often ensues. Massive hemorrhagic hepatic necrosis (hepatosis dietetica) is also produced with vitamin E and/or selenium deficiency (see Fig. 8-74). With either form of the disease, fibrinoid necrosis of small muscular arteries and arterioles is widespread and is accompanied by endothelial damage and fibrin thrombi in capillaries, especially capillaries of the myocardium ( Fig. 10-78 ; E-Fig. 10-26 ). This complex of vascular lesions has been termed dietary microangiopathy. Figure 10-76 "Mulberry Heart Disease," Suffusive Hemorrhage, Epicardium, Right Ventricle, Heart, Pig. Red areas of suffusive hemorrhage ("mulberry-like") are present on the epicardial surface of the right ventricle. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-77 "Mulberry Heart Disease," Hemorrhage and Necrosis, Left and Right Ventricular Myocardium, Transverse Section, Pig. Red and pale mottled areas are caused by hemorrhage and necrosis, respectively. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-78 Vitamin E–Selenium Deficiency ("Mulberry Heart Disease"), Fibrinoid Necrosis, Myocardial Arteriole, Heart, Pig. Note the circumferential eosinophilic deposits (arrows) in the wall of the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-26 Fibrinoid Necrosis, "Mulberry Heart Disease," Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Section of Myocardium, Pig. The affected arteriole (left) has intraluminal masses of fibrin (F) and entrapped erythrocytes. Fibrin masses are present in the vessel wall, and the adjacent interstitium has edema and hemorrhage. Note scattered erythrocytes (E). TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid Necrosis of Blood Vessels. Fibrinoid necrosis of arteries and veins (see Fig. 10-69 ) is particularly frequent in pigs and is an important diagnostic feature in cases of vitamin E–selenium deficiency (heart), edema disease (gastric submucosa), cerebrospinal angiopathy, porcine circovirus II vasculopathy, and organic mercury toxicosis (meninges). See the previous section on Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease. Dietary microangiopathy of pigs or "mulberry heart disease" is produced by a deficiency of vitamin E and/or selenium and the resultant effect on the microvasculature, which is characterized by fibrinoid necrosis, and thromboses of small vessels resulting in microhemorrhages. The hemorrhage results in major discoloration of the epicardial surface of the heart, particularly the right atrium said to resemble a mulberry ( Figs. 10-76 and 10-77 ). In addition to the epicardial hemorrhages, hydropericardium often ensues. Massive hemorrhagic hepatic necrosis (hepatosis dietetica) is also produced with vitamin E and/or selenium deficiency (see Fig. 8-74). With either form of the disease, fibrinoid necrosis of small muscular arteries and arterioles is widespread and is accompanied by endothelial damage and fibrin thrombi in capillaries, especially capillaries of the myocardium ( Fig. 10-78 ; E-Fig. 10-26 ). This complex of vascular lesions has been termed dietary microangiopathy. Figure 10-76 "Mulberry Heart Disease," Suffusive Hemorrhage, Epicardium, Right Ventricle, Heart, Pig. Red areas of suffusive hemorrhage ("mulberry-like") are present on the epicardial surface of the right ventricle. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-77 "Mulberry Heart Disease," Hemorrhage and Necrosis, Left and Right Ventricular Myocardium, Transverse Section, Pig. Red and pale mottled areas are caused by hemorrhage and necrosis, respectively. (Courtesy Dr. L. Miller, Atlantic Veterinary College.) Figure 10-78 Vitamin E–Selenium Deficiency ("Mulberry Heart Disease"), Fibrinoid Necrosis, Myocardial Arteriole, Heart, Pig. Note the circumferential eosinophilic deposits (arrows) in the wall of the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. J. Simon, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) E-Figure 10-26 Fibrinoid Necrosis, "Mulberry Heart Disease," Vitamin E–Selenium Deficiency, Heart, Section of Myocardium, Pig. The affected arteriole (left) has intraluminal masses of fibrin (F) and entrapped erythrocytes. Fibrin masses are present in the vessel wall, and the adjacent interstitium has edema and hemorrhage. Note scattered erythrocytes (E). TEM. Uranyl acetate and lead citrate stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Fibrinoid Necrosis of Blood Vessels. Fibrinoid necrosis of arteries and veins (see Fig. 10-69 ) is particularly frequent in pigs and is an important diagnostic feature in cases of vitamin E–selenium deficiency (heart), edema disease (gastric submucosa), cerebrospinal angiopathy, porcine circovirus II vasculopathy, and organic mercury toxicosis (meninges). See the previous section on Dietary Microangiopathy: Mulberry Heart Disease . Inflammation: Infectious Diseases Edema Disease (Cerebrospinal Angiopathy). Infections with certain strains of hemolytic E. coli produce a cytotoxin that targets vascular endothelium, resulting in fibrinoid necrosis of arterioles and resultant edema. Lesions are often prominent in the arterioles of the gastric submucosa ( Fig. 10-79 ). Vascular changes occurring in the CNS are known as cerebrospinal angiopathy and can produce clinical signs of disease of the nervous system ( E-Fig. 10-27 ; also see Fig. 10-69 ; Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11; and Figs. 7-169 and 7-170). Figure 10-79 Submucosal Edema, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. The submucosa (between arrows) is distended with edema fluid. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-27 Vasculitis with Infarction (Arrows) , Neuroparenchyma, Edema Disease (Enterotoxemic Colibacillosis), Brainstem, Pig. Some strains of Escherichia coli produce a Shiga-like toxin that causes necrosis of smooth muscle cells in small arteries and arterioles in the central nervous system (CNS), leading to vasculitis and infarction. The toxin binds to specific receptors on endothelial cells (see Chapter 4), and this binding can initiate a chain of inflammatory and immunologic reactions that lead to vascular damage. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Erysipelosis (Erysipelothrix rhusiopathiae). Cutaneous lesions in erysipelosis are caused by Erysipelothrix rhusiopathiae and are the result of bacterial embolization to the skin during sepsis. Lesions consist of square to rhomboidal, firm, raised, pink to dark purple areas ( Fig. 10-80 ; see Fig. 17-70) caused by vasculitis, thrombosis, and ischemia (infarction). The rhomboidal shape likely represents an area of skin supplied by a thrombosed vessel (see Chapter 17). Figure 10-80 Cutaneous Infarcts, Diamond Skin Disease, Erysipelothrix Rhusiopathiae Septicemia, Skin, Pig. Emboli of Erysipelothrix rhusiopathiae have lodged in cutaneous vessels and caused a localized vasculitis, which has resulted in thrombosis followed by ischemia and cutaneous infarction. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Porcine Polyserositis (Streptococcus suis II). Streptococcus suis II is one of several bacteria that can cause the disease porcine polyserositis. Gross lesions include vasculitis leading to variable quantities of a gray-white friable material (fibrin) on serosal surfaces (fibrinous polyserositis) of the lungs (fibrinous pleuritis), heart (fibrinous pericarditis [see Fig. 10-75 ]), and abdominal cavity (fibrinous peritonitis). The bacterium gains access to and spreads systemically through the blood vascular system. Lesions suggest this bacterium may have a tropism for vascular endothelial cells of serosae, and bacterial endotoxins may contribute to vascular injury and permeability changes leading to the leakage of fibrinogen and its polymerization to fibrin on serosal surfaces and in some cases to microthrombus formation and disseminated intravascular coagulation (DIC) in other organ systems (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). African Swine Fever (Wart Hog Disease, African Pig Disease). African swine fever is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of pigs associated with a DNA virus. The clinical and pathologic features are very similar to those of classic swine fever (hog cholera). The disease is enzootic in Africa, and outbreaks have occurred in Europe, South America, and the Caribbean region. The pathogenesis of the disease is via entry in the upper respiratory tract. The virus proliferates in the tonsils and lymph nodes of the head and neck with subsequent viremia and dissemination to the entire body. Transmission to domestic swine is via ingestion of infected tissues of warthogs and bush pigs, which develop an unapparent infection, or by the bite of infected soft ticks ( Ornithodoros moubata ). The distinctive hemorrhagic lesions are attributed to disruption of the clotting mechanism and thrombocytopenia. The gross lesions are characterized by widespread congestion, edema, and hemorrhage. Hemorrhagic visceral lymph nodes and splenomegaly are present along with petechial hemorrhages of the renal cortices, epicardium, and other serosal surfaces. Pulmonary edema and hydrothorax also occur. Microscopically, viral-induced vascular alterations include congestion, hemorrhage, and edema with fibrin microthrombi ( E-Fig. 10-28 ). The virus produces widespread necrosis of lymphocytes and macrophages (see Fig. 4-42). E-Figure 10-28 Fibrin Thrombi, Disseminated Intravascular Coagulation, Lung, Alveolar Septal Capillaries, Horse. Fibrin thrombi (arrows) occlude two alveolar capillaries. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hog Cholera/Classic Swine Fever (Swine Fever, Swine Plague, Schweinpest). Hog cholera (also termed classic swine fever ) is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of swine produced by an RNA virus. The disease is enzootic in South America, Central America, Caribbean countries, Asia, and Europe. The pathogenesis of the disease is initiated by inhalation of the virus from direct contact with infected pigs or by ingestion of uncooked infected pork. The virus traverses the oral mucosa, replicates in the tonsils, and initiates viremia. The virus selectively damages endothelial cells, cells of the immune system (lymphoreticular cells and macrophages), and epithelial cells. The characteristic hemorrhagic lesions are associated with increased vascular permeability, thrombocytopenia, and DIC. The gross lesions are characterized by widespread petechial hemorrhages, especially of the renal cortices, urinary bladder, larynx, gastric mucosa, and epicardium with accompanying hemorrhage in lymph nodes and skin. A distinctive finding is hemorrhagic infarction of the spleen and "button ulcers" of the colonic mucosa. Microscopically, endothelial damage is evident as hydropic degeneration and cellular proliferation. Affected vessels may have fibrinoid necrosis with fibrin deposition in the media and intima. Circulatory alterations include congestion, hemorrhage, thrombosis, and infarction. The brain has a diffuse nonsuppurative encephalitis (see Fig. 4-41). Porcine Anthrax. See the discussion on anthrax in the section on Disorders of Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, and also Chapter 4. Edema Disease (Cerebrospinal Angiopathy). Infections with certain strains of hemolytic E. coli produce a cytotoxin that targets vascular endothelium, resulting in fibrinoid necrosis of arterioles and resultant edema. Lesions are often prominent in the arterioles of the gastric submucosa ( Fig. 10-79 ). Vascular changes occurring in the CNS are known as cerebrospinal angiopathy and can produce clinical signs of disease of the nervous system ( E-Fig. 10-27 ; also see Fig. 10-69 ; Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11; and Figs. 7-169 and 7-170). Figure 10-79 Submucosal Edema, Edema Disease, Stomach, Submucosa, Pig. The submucosa (between arrows) is distended with edema fluid. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-27 Vasculitis with Infarction (Arrows) , Neuroparenchyma, Edema Disease (Enterotoxemic Colibacillosis), Brainstem, Pig. Some strains of Escherichia coli produce a Shiga-like toxin that causes necrosis of smooth muscle cells in small arteries and arterioles in the central nervous system (CNS), leading to vasculitis and infarction. The toxin binds to specific receptors on endothelial cells (see Chapter 4), and this binding can initiate a chain of inflammatory and immunologic reactions that lead to vascular damage. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Erysipelosis (Erysipelothrix rhusiopathiae). Cutaneous lesions in erysipelosis are caused by Erysipelothrix rhusiopathiae and are the result of bacterial embolization to the skin during sepsis. Lesions consist of square to rhomboidal, firm, raised, pink to dark purple areas ( Fig. 10-80 ; see Fig. 17-70) caused by vasculitis, thrombosis, and ischemia (infarction). The rhomboidal shape likely represents an area of skin supplied by a thrombosed vessel (see Chapter 17). Figure 10-80 Cutaneous Infarcts, Diamond Skin Disease, Erysipelothrix Rhusiopathiae Septicemia, Skin, Pig. Emboli of Erysipelothrix rhusiopathiae have lodged in cutaneous vessels and caused a localized vasculitis, which has resulted in thrombosis followed by ischemia and cutaneous infarction. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Porcine Polyserositis (Streptococcus suis II). Streptococcus suis II is one of several bacteria that can cause the disease porcine polyserositis. Gross lesions include vasculitis leading to variable quantities of a gray-white friable material (fibrin) on serosal surfaces (fibrinous polyserositis) of the lungs (fibrinous pleuritis), heart (fibrinous pericarditis [see Fig. 10-75 ]), and abdominal cavity (fibrinous peritonitis). The bacterium gains access to and spreads systemically through the blood vascular system. Lesions suggest this bacterium may have a tropism for vascular endothelial cells of serosae, and bacterial endotoxins may contribute to vascular injury and permeability changes leading to the leakage of fibrinogen and its polymerization to fibrin on serosal surfaces and in some cases to microthrombus formation and disseminated intravascular coagulation (DIC) in other organ systems (see Chapters 4, 7, and 9Chapter 4Chapter 7Chapter 9). African Swine Fever (Wart Hog Disease, African Pig Disease). African swine fever is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of pigs associated with a DNA virus. The clinical and pathologic features are very similar to those of classic swine fever (hog cholera). The disease is enzootic in Africa, and outbreaks have occurred in Europe, South America, and the Caribbean region. The pathogenesis of the disease is via entry in the upper respiratory tract. The virus proliferates in the tonsils and lymph nodes of the head and neck with subsequent viremia and dissemination to the entire body. Transmission to domestic swine is via ingestion of infected tissues of warthogs and bush pigs, which develop an unapparent infection, or by the bite of infected soft ticks ( Ornithodoros moubata ). The distinctive hemorrhagic lesions are attributed to disruption of the clotting mechanism and thrombocytopenia. The gross lesions are characterized by widespread congestion, edema, and hemorrhage. Hemorrhagic visceral lymph nodes and splenomegaly are present along with petechial hemorrhages of the renal cortices, epicardium, and other serosal surfaces. Pulmonary edema and hydrothorax also occur. Microscopically, viral-induced vascular alterations include congestion, hemorrhage, and edema with fibrin microthrombi ( E-Fig. 10-28 ). The virus produces widespread necrosis of lymphocytes and macrophages (see Fig. 4-42). E-Figure 10-28 Fibrin Thrombi, Disseminated Intravascular Coagulation, Lung, Alveolar Septal Capillaries, Horse. Fibrin thrombi (arrows) occlude two alveolar capillaries. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Hog Cholera/Classic Swine Fever (Swine Fever, Swine Plague, Schweinpest). Hog cholera (also termed classic swine fever ) is a highly contagious febrile hemorrhagic disease of swine produced by an RNA virus. The disease is enzootic in South America, Central America, Caribbean countries, Asia, and Europe. The pathogenesis of the disease is initiated by inhalation of the virus from direct contact with infected pigs or by ingestion of uncooked infected pork. The virus traverses the oral mucosa, replicates in the tonsils, and initiates viremia. The virus selectively damages endothelial cells, cells of the immune system (lymphoreticular cells and macrophages), and epithelial cells. The characteristic hemorrhagic lesions are associated with increased vascular permeability, thrombocytopenia, and DIC. The gross lesions are characterized by widespread petechial hemorrhages, especially of the renal cortices, urinary bladder, larynx, gastric mucosa, and epicardium with accompanying hemorrhage in lymph nodes and skin. A distinctive finding is hemorrhagic infarction of the spleen and "button ulcers" of the colonic mucosa. Microscopically, endothelial damage is evident as hydropic degeneration and cellular proliferation. Affected vessels may have fibrinoid necrosis with fibrin deposition in the media and intima. Circulatory alterations include congestion, hemorrhage, thrombosis, and infarction. The brain has a diffuse nonsuppurative encephalitis (see Fig. 4-41). Porcine Anthrax. See the discussion on anthrax in the section on Disorders of Ruminants (Cattle, Sheep, and Goats) , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, and also Chapter 4. Disorders of Dogs Myocardium Disturbances of Growth Developmental Errors: Congenital Anomalies. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Cardiomyopathies. Also see the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Dilated (Congestive) Cardiomyopathy. Dilated or congestive cardiomyopathy is an important cause of congestive heart failure in dogs. Some affected dogs have low tissue concentrations of taurine, but supplementation has not proved beneficial. Affected dogs often are males of large breeds, such as Doberman pinschers, Portuguese water dogs, Dalmatians, Scottish deerhounds, Irish wolfhounds, Saint Bernards, Afghan hounds, Newfoundland dogs, Old English sheepdogs, Great Danes, and boxers, although smaller breeds, such as English cocker spaniels, may be affected. The disease often has a familial pattern in the affected breeds and appears to be inherited as an autosomal recessive or X-linked recessive trait. At necropsy, lesions of congestive heart failure are present and the hearts are rounded because of biventricular dilation (see Figs. 10-43 and 10-44 ). The dilated cardiac chambers often have a diffusely white, thickened endocardium. Microscopic and ultrastructural alterations are nonspecific, can be either mild or absent, and may include interstitial fibrosis and fatty infiltration and changes of myocyte degeneration, including the occurrence of so-called attenuated wavy fibers. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Cardiac Neoplasms. Cardiac neoplasms comprise primary and secondary (metastatic) tumors. Primary cardiac tumors include hemangiosarcoma (most frequent), thyroid/parathyroid ectopic carcinomas, mesotheliomas, thymomas, granular cell tumor, sarcomas (osteosarcomas, chondrosarcomas, fibrosarcomas/fibro­mas, rhabdomyosarcomas/rhabdomyoma, neurofibrosarcomas/neurofibroma, and malignant mixed mesenchymal tumor), and chemodectomas (heart-base tumors). Secondary cardiac neoplasms are metastases from distant, primary tumor sites. In a study that included 80 dogs with primary and/or secondary cardiac neoplasms, 36% of dogs had evidence of cardiac metastases. Inflammation: Infectious Diseases Canine Parvovirus Myocarditis. Lymphocytic myocarditis is usually a lesion of viral infections and is well illustrated by the lesions of parvoviral myocarditis of puppies. Dogs with parvoviral myocarditis die unexpectedly and have generalized lesions of acute congestive heart failure but lack lesions in the intestine, the primary site of viral damage in approximately 95% of clinical cases. The heart is pale and flabby and has disseminated interstitial lymphocytic infiltrations and scattered myocytes with large, basophilic, intranuclear viral inclusion bodies in dogs that survive fibrosis ( Fig. 10-81 ). Figure 10-81 Parvovirus Myocarditis, Heart, Dog. A, Note the multifocal pale areas (arrow) in the ventricular myocardium. B, Parvovirus infection, section of myocardium. An intranuclear basophilic inclusion body is in a myocyte (arrow). H&E stain. ( A courtesy Dr. B. Weeks, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Trypanosoma cruzi . Trypanosoma cruzi is the protozoan hemoflagellate that causes American trypanosomiasis (Chagas' disease). The kissing bug (family Reduviidae, subfamily Triatominae) transmits the disease. Infection with Trypanosoma cruzi causes fatal chronic myocarditis. Acute disease is characteristic in dogs younger than 1 year of age. Affected dogs develop lymphohistiocytic myocarditis resulting in right-sided congestive heart failure with ascites, lymphadenomegaly, and hepatosplenomegaly. Grossly, the cardiac muscle contains multiple yellow-white myocardial streaks and spots that are often accompanied by hemorrhage. Chronic lymphocytic and plasmacytic myocarditis that leads to right-sided congestive heart failure typically affects older dogs. Grossly, the heart is bilaterally enlarged, thinned and flaccid, and contains fibrous plaques (areas of fibrosis). Cell Degeneration and Death Neurogenic Cardiomyopathy (Heart-Brain Syndrome). Neurogenic cardiomyopathy (heart-brain syndrome) is a syndrome in dogs characterized by unexpected death 5 to 10 days after diffuse CNS injury (usually hit by car). Affected dogs die of cardiac arrhythmias caused by myocardial degeneration and necrosis. Grossly, the myocardium has numerous discrete and coalescing pale white streaks and/or poorly defined areas of myocardial necrosis—most often involving the papillary muscles of the left ventricle ( Fig. 10-82 ). Neurogenic cardiomyopathy is thought to be caused by overstimulation of the heart by autonomic neurotransmitters and systemic catecholamines released at the time of trauma. It is unknown why there is a 5- to 10-day delay in the development of myocardial necrosis. See Chapter 14 for a discussion of heart-brain syndrome. Figure 10-82 Myocardial Necrosis, "Heart-Brain Syndrome," Heart, Transverse Section of Ventricles, Dog. Necrotic areas are pale beige to white and are concentrated in the inner half of the wall of the left ventricle (LV) and in the ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Endocardium and Heart Valves Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Cell Degeneration and Death Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis). Myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis) is the most common cardiovascular disease in dogs, and it is the most common cause of congestive heart failure in old dogs. Other names for this disease include endocarditis valvularis chronica fibrosa (nodosa), chronic valvular endocarditis, chronic valvular disease, billowing sail distortion of the mitral valve, endocardiosis, chronic mitral valve fibrosis, senile nodular sclerosis, mucoid degeneration, chronic myxomatous valve disease, and degenerative mitral valve disease. Myxomatous valvular degeneration (MVD) is an age-related cardiac disease of middle-aged to old dogs, especially small, toy, and medium-sized breeds. Males of affected breeds develop the disease at an earlier age than females. MVD appears to have a polygenic inheritance in dachshunds and Cavalier King Charles spaniels. The Cavalier King Charles spaniel breed has a unique susceptibility, with more than 50% prevalence by 4 years of age and 100% prevalence by 10 years of age. Other breeds with high incidence include the cocker spaniel, Lhasa apsos, bichons, Yorkshire terriers, shih tzus, dachshund, poodle, Pomeranian, miniature schnauzer, Chihuahua, fox terrier, Boston terrier, and Pekingese. At autopsies (syn: necropsies) of 3245 dogs, gross lesions occurred on the mitral valve alone (57.3%), mitral and tricuspid valves (26.6%), tricuspid valve alone (7.5%), aortic valve alone (2.1%), pulmonic valve alone (0.4%), and in combinations (6.1%). The lesions in MVD become progressively worse with age. Affected valves are shortened and thickened (nodular), either focal or diffusely, and appear smooth and shiny ( Fig. 10-83 ) rather than rough and granular, as is usual in cases of valvular endocarditis. Figure 10-83 Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis), Left Atrioventricular Valve, Heart, Dog. A, The cusps of the mitral valve are thickened by white, smooth nodules (arrows). LV, Left ventricular free wall. B, Note the characteristic smooth and shiny (endocardial) surface of the valve and nodules. This differentiates myxomatous valvular degeneration (endocardiosis) from the rough and granular surface of chronic bacterial endocarditis. The pink staining of the valve is caused by postmortem imbibition of hemoglobin. ( A courtesy Dr. J. Wright, College of Veterinary Medicine, North Carolina State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) MVD is grossly classified into four groups as follows : type 1, a few small discrete nodules in the area of contact that are associated with areas of diffuse opacity in the proximal portion of the valve; type 2, larger nodules that are evident in the area of contact, which tend to coalesce with their neighbors, along with areas of diffuse opacity that may be present; type 3, large nodules that coalesced into irregular, plaque-like deformities that extend to involve the proximal portions of the chordae tendineae; and type 4, there is gross distortion and "ballooning" of the valve cusp, and the chordae tendinea are thickened proximally ( Fig. 10-84 ). These lesions result in valvular insufficiency with subsequent atrial dilation and development of atrial "jet lesions." The jet lesion is a raised, rough, firm streak of endocardial fibrosis resulting from long-term trauma by a jet of blood leaking through the damaged valve in the closed position. Histologically, the valves are divided into four layers: atrialis, ventricularis, spongiosa, and fibrosa. The atrialis and ventricularis layers face the respective cardiac chambers and consist of endothelium and immediate subendothelial tissue containing fibroblasts, scattered collagen fibers, and a thin layer of elastic fibers. The spongiosa layer is loose connective tissue with interstitial cells and minimal fibers. The fibrosa consists of dense collagen that is continuous with the collagen core of chordae tendineae. Histopathologic lesions in MVD predominate in the distal third of the valve leaflets, and the incidence and severity increase with age. Lesions include progressive expansion of the spongiosa layer and disruption of the fibrosa layer. Figure 10-84 Natural Progression of Myxomatous Valvular Disease in the Mitral Leaflet. Myxomatous valvular disease is grossly classified into four groups (1-4). Type 1 has a few discrete nodules (minimal changes); type 2 has larger nodules in contact areas (mild changes); type 3 has large, coalescing nodules forming plaquelike deformities (moderate changes); and type 4 has obvious distortions of the valve (severe changes). The light-colored areas represent areas of nodular or diffuse thickening and ballooning of the valve cusp and proximal chordae tendineae. The dark-colored areas represent areas of diffuse opacity due to accumulation of neutral fat within the spongiosa layer. N, Normal valve. (Redrawn from Figure 2 from Borgarelli, M, Buchanan JW: Historical review, epidemiology and natural history of degenerative mitral valve disease, J Vet Cardiol 14(1):93-101, 2012.) Microscopically, the thickened valves have notably increased myofibroblastic proliferation and deposition of acid mucopolysaccharides ( Fig. 10-85 ). It is important not to confuse normal age-related valve thickening in asymptomatic dogs with true pathologic thickening. Therefore a "clinical relevant diagnosis" would be more certain when the mitral valve and chordae tendineae are thickened and/or ruptured or when left heart chambers are enlarged or there are left atrial jet lesions. Severe complications of MVD include occasional rupture of chordae tendineae, occasional splitting or rupture of the left atrial wall that can result in hemopericardium, or acquired atrial septal defects. Frequent accompanying myocardial alterations include arteriosclerosis of intramyocardial arteries and multifocal myocardial necrosis and fibrosis. Progression of MVD is associated with an increase in plasma N-terminal pro-B-type natriuretic peptide concentration and an altered serotonin (5-hydroxytryptamine) signaling pathway. Figure 10-85 Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis), Cusp of Right Atrioventricular Valve, Heart, Dog. The valve is thickened and nodular from an increase in myxomatous tissue supported by a fibrous stroma. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation Endocarditis. Endocarditis is occasionally observed in dogs. Bacterial septicemias result in inflammation of cardiac valves. Bacteria most commonly isolated include Streptococcus spp., Bartonella spp., and Escherichia coli . The mitral valve is most commonly involved and is associated with polyarthritis. Infections with Bartonellosis may only have inflammatory changes involving the aortic valve leaflets. Erysipelothrix tonsillarum (formally known as Erysipelothrix serovar 7) is occasionally isolated. Confirmation of the definitive organism requires bacterial isolation and/or identification by molecular tools. See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation, and also Chapter 3. Pericardium and Epicardium Disturbances of Circulation Idiopathic Pericardial Effusion (Hemorrhagic Pericardial Effusion). Idiopathic pericardial effusion is one of the most common causes of canine pericardial effusion and accounts for approximately 19% of all canine pericardial effusions. Large or giant breeds, such as the Great Dane, Saint Bernard, Great Pyrenees, German shepherd, and golden retriever, are most often affected. It is a diagnosis of exclusion after all other potential causes (neoplastic, traumatic, infectious, metabolic, cardiac, and coagulopathy) have been ruled out. Idiopathic pericardial effusion can be hemorrhagic or serosanguinous. The pericardium is thickened by diffuse fibrosis; neovascularization; areas of lymphocytic, plasmacytic, and histiocytic infiltrates; and areas of mesothelial hyperplasia alongside regions void of parietal mesothelium. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions, and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma and Hemangioma. Cardiac hemangiosarcoma (HSA) is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or via metastasis (secondary) from primary sites such as the spleen. In a recent study, HSA frequently occurred in older golden retrievers, followed by Maltese dogs and miniature dachshunds. Mass lesions of HSA were found more commonly in the right auricle and right atrium, and the right atrial masses were significantly larger than the right auricular masses, potentially accounting for their higher antemortem detection rate by echocardiography. Grossly, protruding red to red-black blood-containing masses are located on the epicardial surface ( Fig. 10-86 ) and may also protrude into the atrial lumen. Rupture can produce fatal hemopericardium and cardiac tamponade. Microscopically, the neoplasms are composed of scattered, elongated, plump neoplastic endothelial cells, which may or may not form vascular spaces containing blood ( Fig. 10-87 ). Pulmonary metastases are frequent. Immunohistochemistry staining for factor VIII-related antigen or CD31 (an endothelial marker) confirms the tumor cells are endothelial in origin. Hemangiomas are benign neoplasms often found in the skin of dogs ( Fig. 10-88 ). These red, blood-filled masses are well circumscribed. Figure 10-86 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. A dark-red hemangiosarcoma protrudes from the wall of the right atrium (RA) , a predilection site in the dog for this tumor (arrow). RV, Right ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-87 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. Malignant endothelial cells have invaded the myocardium of the right atrium, thus giving it the bluish granular appearance (cell nuclei) at low magnification. The high magnification (inset) shows these endothelial cells with large, round-to-oval nuclei forming poorly delineated and haphazardly arranged vascular channels. These cells can also "pile up" and be arranged in clusters or solid sheets. Mitotic figures can be prominent and numerous (not shown here). A golden-brown pigment (hemosiderin) can form secondary to erythrophagocytosis of damaged or effete erythrocytes (not shown here). H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-88 Cutaneous Hemangioma, Skin, Dog. The subcutis contains a well-demarcated mass formed by vascular channels lined by a single layer of well-differentiated endothelial cells. Inset, Higher magnification of the well-differentiated endothelial cells lining the vascular channels. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Heart-Base Tumors. See the discussion on cardiac neoplasms in the section on Disorders of Dogs , Myocardium, Disturbances of Growth; on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth; and also see Fig. 10-48 . Cell Degeneration and Death Medial Necrosis and Hemorrhage. Medial necrosis and hemorrhage is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats by a wide variety of vasoactive drugs. These vascular lesions, detected during evaluations of new compounds, produce grossly apparent hemorrhage, especially in the epicardium. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Segmental Arterial Mediolysis. Segmental arterial mediolysis is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats that most often occurs in the splanchnic muscular and coronary arteries and causes catastrophic hemorrhages. The pathology can be induced experimentally by administration of ractopamine, a synthetic β 2 -adrenoceptor agonist to dogs. Exposure to α 1 -adrenergic receptor agonists or β 2 agonists induces the release of norepinephrine from the peripheral nervous system. Epinephrine is thought to induce injury at the adventitial medial junction through medial muscle apoptosis. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Fibrocartilaginous Embolism. Fibrocartilaginous embolism of the spinal cord vasculature and resultant infarction of the spinal cord supplied or drained by the obstructed blood vessel lead to posterior paresis or paralysis. Affected dogs are typically middle-aged large or giant breeds, but occurrence in young Irish wolfhounds has been reported. The mechanism of formation of the arterial or venous emboli is still unclear, but movement within the spinal vasculature of fibrocartilaginous fragments from degenerated intervertebral disks is generally considered to underlie the presence of these unusual emboli ( Fig. 10-89 ; E-Fig. 10-29 ). Figure 10-89 Fibrocartilaginous Emboli, Spinal Cord, Pig. The basophilic masses (arrows) occluding small arteries (cross sections) in the spinal cord gray matter adjacent to the central canal (top left margin) are fibrocartilaginous emboli. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-29 Fibrocartilaginous Emboli, Multifocal Infarction, Spinal Cord, Dog. Note the poorly stained (pale red to clear) areas in the left half of the spinal cord affecting both dorsal and ventral gray horns and all funiculi. The ventral gray horn is affected on the right side. These areas are infarcts caused by occlusion and blockage of blood flow in arterioles supplying blood to these areas by fibrocartilaginous emboli. Emboli are thought to cross from the venous side to the arterial side of the circulatory system in vascular anastomoses that form in metaplastic and degenerative cartilage as occurs in intervertebral disk disease. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Pulmonary Artery Thromboembolism. Pulmonary artery thromboembolism ( Fig. 10-90 ) is often a life-threatening condition and in dogs has an incidence of 0.9% over a 10-year period. A wide variety of predisposing conditions may result in altered blood flow, hypercoagulability, or endothelial damage. These include sepsis, immune-mediated hemolytic anemia, neoplastic disease, protein-losing nephropathy/amyloidosis, disseminated intravascular coagulation, cardiac disease, hyperadrenocorticism, dirofilariasis, and use of intravenous catheters. The thrombus in the pulmonary arteries lyses within a few hours and therefore may be absent at the time of autopsy (syn: necropsy) in approximately 15% of cases, as was indicated by one study. Because of extensive collateral pulmonary arterial circulation, the presence of a large thrombus in the pulmonary artery or its main branches makes a clinically relevant diagnosis of pulmonary artery thromboembolism more certain, unless antemortem ancillary tests such as pulmonary angiography and ventilation/perfusion scanning are strongly supportive of it. Figure 10-90 Arterial Thrombus, Pulmonary Artery, Dog. Arterial thrombi are composed primarily of platelets and fibrin because the rapid flow of blood tends to exclude erythrocytes from the thrombus, and thus arterial thrombi are usually pale beige to gray (arrow). (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Arterial Thromboembolism and Thrombosis. Arterial thromboembolism and thrombosis occur in dogs and arise from injury to vascular endothelium, propagated via the coagulation cascade (see Chapter 2). In dogs, the most common site is the aortoiliac trifurcation ( Fig. 10-91 ), in which a thromboembolus extends from the caudal aorta distally to the external and internal iliac arteries. Embolization of the subclavian and brachial arteries also results in lameness of the forelimb, albeit less commonly. Other sites include embolization of the coronary arteries in the heart, renal arteries, and intestinal arteries. Aortoiliac thromboembolism in dogs has been reported with infection by Spirocerca lupi and Blastomyces dermatitides and in association with various disease conditions, such as protein-losing nephropathy, hypothyroidism, hypercortisolism, diabetes mellitus, and aortic neoplasia. Figure 10-91 Aortic Thrombosis, Aorta and External Iliac Arteries, Dog. The tan thrombus occluding the caudal abdominal aorta is a cranial extension of the red saddle thromboembolus at the aortic bifurcation and in the external iliac arteries (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Thrombosis of the Femoral Artery. Thrombosis of the femoral artery, with resulting partial to complete occlusion, has been reported in Cavalier King Charles spaniels. Affected dogs generally do not develop hindlimb ischemia, in contrast to human patients with this condition, because of extensive collateral circulation and thrombus recanalization. It is a common but clinically insignificant pathology in Cavalier King Charles spaniels that is suspected to result from a probable weakness in the femoral artery wall. Inflammation Heartworm Dirofilariasis (Dirofilaria immitis). Dirofilariasis (heartworm disease) may occur in 35% to 45% of dogs and 2% of cats in areas of high infection rates, such as within 150 miles of the Atlantic and Gulf coasts from Texas to New Jersey and along the Mississippi River and its major tributaries. The extent of cardiac alterations is related to the number of adult parasites present. Initially, the parasites accumulate in the pulmonary arteries ( Fig. 10-92 ), and as the numbers increase, they are present in the right ventricle, then in the right atrium, and finally may occupy the vena cavae. Pulmonary hypertension results from vascular blockage and pulmonary vascular lesions produced by the parasites, and right ventricular hypertrophy follows. Right-sided heart failure may eventually develop. The pulmonary arteries containing parasites initially have an infiltration of the intima (termed endarteritis ) by eosinophils, with subsequent development of an irregular fibromuscular proliferation of the intima visible grossly as a rough granular or shaggy appearance of the luminal surface (see Fig. 10-92 ; E-Figs. 10-30 and 10-31 ). Live or dead parasites can be present within these vascular lesions and be accompanied by thromboembolism and pulmonary infarction. The pleura of the caudal lung lobes may contain multifocal areas of hemorrhage, hemosiderosis, and fibrosis. The presence of a massive number of adult worms may result in filling the right heart extending into venae cavae, resulting in venal caval syndrome. This syndrome results in sudden collapse, liver failure, intravascular hemolytic anemia, shock, and death if the adult worms are not removed surgically. Figure 10-92 Dirofilariasis, Heart, Opened Right Ventricle, and Pulmonary Artery, Dog. Numerous adult Dirofilaria immitis are present in the right ventricle (RV), right atrium, and pulmonary artery (PA) . (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-30 Verminous Arteritis, Dirofilariasis, Pulmonary Artery, Dog. A dead adult Dirofilaria immitis (DI) parasite in the lumen of the pulmonary artery is surrounded by pyogranulomatous inflammatory cells adhered to the wall (left) of the artery. Note the loss of the endothelial cells on the left side of the artery. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-31 Chronic Endarteritis, Dirofilariasis, Lung, Pulmonary Artery, Dog. Several intact adult Dirofilaria immitis are in the lumen. Note the thickened fibrotic intima (arrow). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Polyarteritis: "Beagle Pain Syndrome." Polyarteritis is a disease that occurs sporadically in many animal species and is an important disease of aged rats called polyarteritis nodosa ( E-Fig. 10-32 ). Many recent reports have described the occurrence of polyarteritis in a disease termed idiopathic necrotizing polyarteritis (idiopathic canine polyarteritis, juvenile polyarteritis syndrome) involving multiple arteries, including the coronary and meningeal arteries in dogs, most often pet and laboratory beagle dogs ("beagle pain syndrome"). Clinically, affected dogs typically show recurrent episodes of fever, body weight loss, and occasionally cervical pain manifested by a stilted gait and stiff neck with a hunched body posture. However, some affected dogs do not display clinical signs of disease. The lesions are usually attributed to an immune-mediated vascular injury. Small and medium-sized muscular arteries in a wide variety of organs, including the heart, meninges, epididymis, and thymus, are selectively involved and grossly appear thick and tortuous, have associated focal hemorrhage, and develop aneurysms and thrombosis. Microscopically, the early lesions include fibrinoid necrosis and leukocytic invasion of the intima and media ( E-Fig. 10-33 ). In chronic lesions, inflammatory cells and fibrosis involve all layers of the vascular wall. E-Figure 10-32 Polyarteritis Nodosa, Mesenteric Arteries, Rat. The affected segments of the arteries are thick, red, hemorrhagic, and tortuous (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-33 Periarteritis and Arteritis (Polyarteritis—"Beagle Pain Syndrome"), Beagle Dog. Note the accumulation of lymphocytes and macrophages around the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. P.W. Snyder, School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Primary Lymphedema. Primary lymphedema is a rare pathology in dogs that often involves the distal hindlimbs, and it results from aplasia/hypoplasia of superficial lymphatic vessels and/or draining lymph nodes of the distal hindlimbs. Antemortem, dogs are being presented with nonpainful pitting edema of the distal hindlimbs. At autopsy (syn: necropsy) there is lymphatic hypoplasia and/or absence of popliteal lymph nodes with distal secondary lymphatic hyperplasia. Marked delay in lymphatic filling in lymphangiography, in lymphoscintigraphy, or in the patent blue violet dye absorption test are antemortem ancillary test results that strongly support the diagnosis of primary lymphedema. Primary Intestinal Lymphangiectasia. Primary intestinal lymphangiectasia is a rare intestinal pathology of dogs that results in severe protein-losing enteropathy. The Lundehund breed is predisposed. Clinically, dogs are presented for wasting, diarrhea, and ascites. Lacteals in the intestinal villi are fused, blunted, and have markedly distended tips, whereas lymphatic vessels throughout the wall of the intestine, and occasionally mesentery and mesenteric lymph nodes, are distended with milky opaque fluid (i.e., chyle) (see Fig. 7-14). In dogs, the role of obstruction of lymphatic vessels or their structural integrity (i.e., hypoplasia) in the pathogenesis of this disease is still unclear. Secondary intestinal lymphangiectasia is much more common and results from obstruction of lymphatic drainage by inflammation or neoplasia. Myocardium Disturbances of Growth Developmental Errors: Congenital Anomalies. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Cardiomyopathies. Also see the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Dilated (Congestive) Cardiomyopathy. Dilated or congestive cardiomyopathy is an important cause of congestive heart failure in dogs. Some affected dogs have low tissue concentrations of taurine, but supplementation has not proved beneficial. Affected dogs often are males of large breeds, such as Doberman pinschers, Portuguese water dogs, Dalmatians, Scottish deerhounds, Irish wolfhounds, Saint Bernards, Afghan hounds, Newfoundland dogs, Old English sheepdogs, Great Danes, and boxers, although smaller breeds, such as English cocker spaniels, may be affected. The disease often has a familial pattern in the affected breeds and appears to be inherited as an autosomal recessive or X-linked recessive trait. At necropsy, lesions of congestive heart failure are present and the hearts are rounded because of biventricular dilation (see Figs. 10-43 and 10-44 ). The dilated cardiac chambers often have a diffusely white, thickened endocardium. Microscopic and ultrastructural alterations are nonspecific, can be either mild or absent, and may include interstitial fibrosis and fatty infiltration and changes of myocyte degeneration, including the occurrence of so-called attenuated wavy fibers. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Cardiac Neoplasms. Cardiac neoplasms comprise primary and secondary (metastatic) tumors. Primary cardiac tumors include hemangiosarcoma (most frequent), thyroid/parathyroid ectopic carcinomas, mesotheliomas, thymomas, granular cell tumor, sarcomas (osteosarcomas, chondrosarcomas, fibrosarcomas/fibro­mas, rhabdomyosarcomas/rhabdomyoma, neurofibrosarcomas/neurofibroma, and malignant mixed mesenchymal tumor), and chemodectomas (heart-base tumors). Secondary cardiac neoplasms are metastases from distant, primary tumor sites. In a study that included 80 dogs with primary and/or secondary cardiac neoplasms, 36% of dogs had evidence of cardiac metastases. Inflammation: Infectious Diseases Canine Parvovirus Myocarditis. Lymphocytic myocarditis is usually a lesion of viral infections and is well illustrated by the lesions of parvoviral myocarditis of puppies. Dogs with parvoviral myocarditis die unexpectedly and have generalized lesions of acute congestive heart failure but lack lesions in the intestine, the primary site of viral damage in approximately 95% of clinical cases. The heart is pale and flabby and has disseminated interstitial lymphocytic infiltrations and scattered myocytes with large, basophilic, intranuclear viral inclusion bodies in dogs that survive fibrosis ( Fig. 10-81 ). Figure 10-81 Parvovirus Myocarditis, Heart, Dog. A, Note the multifocal pale areas (arrow) in the ventricular myocardium. B, Parvovirus infection, section of myocardium. An intranuclear basophilic inclusion body is in a myocyte (arrow). H&E stain. ( A courtesy Dr. B. Weeks, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Trypanosoma cruzi . Trypanosoma cruzi is the protozoan hemoflagellate that causes American trypanosomiasis (Chagas' disease). The kissing bug (family Reduviidae, subfamily Triatominae) transmits the disease. Infection with Trypanosoma cruzi causes fatal chronic myocarditis. Acute disease is characteristic in dogs younger than 1 year of age. Affected dogs develop lymphohistiocytic myocarditis resulting in right-sided congestive heart failure with ascites, lymphadenomegaly, and hepatosplenomegaly. Grossly, the cardiac muscle contains multiple yellow-white myocardial streaks and spots that are often accompanied by hemorrhage. Chronic lymphocytic and plasmacytic myocarditis that leads to right-sided congestive heart failure typically affects older dogs. Grossly, the heart is bilaterally enlarged, thinned and flaccid, and contains fibrous plaques (areas of fibrosis). Cell Degeneration and Death Neurogenic Cardiomyopathy (Heart-Brain Syndrome). Neurogenic cardiomyopathy (heart-brain syndrome) is a syndrome in dogs characterized by unexpected death 5 to 10 days after diffuse CNS injury (usually hit by car). Affected dogs die of cardiac arrhythmias caused by myocardial degeneration and necrosis. Grossly, the myocardium has numerous discrete and coalescing pale white streaks and/or poorly defined areas of myocardial necrosis—most often involving the papillary muscles of the left ventricle ( Fig. 10-82 ). Neurogenic cardiomyopathy is thought to be caused by overstimulation of the heart by autonomic neurotransmitters and systemic catecholamines released at the time of trauma. It is unknown why there is a 5- to 10-day delay in the development of myocardial necrosis. See Chapter 14 for a discussion of heart-brain syndrome. Figure 10-82 Myocardial Necrosis, "Heart-Brain Syndrome," Heart, Transverse Section of Ventricles, Dog. Necrotic areas are pale beige to white and are concentrated in the inner half of the wall of the left ventricle (LV) and in the ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Disturbances of Growth Developmental Errors: Congenital Anomalies. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Cardiomyopathies. Also see the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Dilated (Congestive) Cardiomyopathy. Dilated or congestive cardiomyopathy is an important cause of congestive heart failure in dogs. Some affected dogs have low tissue concentrations of taurine, but supplementation has not proved beneficial. Affected dogs often are males of large breeds, such as Doberman pinschers, Portuguese water dogs, Dalmatians, Scottish deerhounds, Irish wolfhounds, Saint Bernards, Afghan hounds, Newfoundland dogs, Old English sheepdogs, Great Danes, and boxers, although smaller breeds, such as English cocker spaniels, may be affected. The disease often has a familial pattern in the affected breeds and appears to be inherited as an autosomal recessive or X-linked recessive trait. At necropsy, lesions of congestive heart failure are present and the hearts are rounded because of biventricular dilation (see Figs. 10-43 and 10-44 ). The dilated cardiac chambers often have a diffusely white, thickened endocardium. Microscopic and ultrastructural alterations are nonspecific, can be either mild or absent, and may include interstitial fibrosis and fatty infiltration and changes of myocyte degeneration, including the occurrence of so-called attenuated wavy fibers. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Cardiac Neoplasms. Cardiac neoplasms comprise primary and secondary (metastatic) tumors. Primary cardiac tumors include hemangiosarcoma (most frequent), thyroid/parathyroid ectopic carcinomas, mesotheliomas, thymomas, granular cell tumor, sarcomas (osteosarcomas, chondrosarcomas, fibrosarcomas/fibro­mas, rhabdomyosarcomas/rhabdomyoma, neurofibrosarcomas/neurofibroma, and malignant mixed mesenchymal tumor), and chemodectomas (heart-base tumors). Secondary cardiac neoplasms are metastases from distant, primary tumor sites. In a study that included 80 dogs with primary and/or secondary cardiac neoplasms, 36% of dogs had evidence of cardiac metastases. Developmental Errors: Congenital Anomalies. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Cardiomyopathies. Also see the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Dilated (Congestive) Cardiomyopathy. Dilated or congestive cardiomyopathy is an important cause of congestive heart failure in dogs. Some affected dogs have low tissue concentrations of taurine, but supplementation has not proved beneficial. Affected dogs often are males of large breeds, such as Doberman pinschers, Portuguese water dogs, Dalmatians, Scottish deerhounds, Irish wolfhounds, Saint Bernards, Afghan hounds, Newfoundland dogs, Old English sheepdogs, Great Danes, and boxers, although smaller breeds, such as English cocker spaniels, may be affected. The disease often has a familial pattern in the affected breeds and appears to be inherited as an autosomal recessive or X-linked recessive trait. At necropsy, lesions of congestive heart failure are present and the hearts are rounded because of biventricular dilation (see Figs. 10-43 and 10-44 ). The dilated cardiac chambers often have a diffusely white, thickened endocardium. Microscopic and ultrastructural alterations are nonspecific, can be either mild or absent, and may include interstitial fibrosis and fatty infiltration and changes of myocyte degeneration, including the occurrence of so-called attenuated wavy fibers. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Dilated (Congestive) Cardiomyopathy. Dilated or congestive cardiomyopathy is an important cause of congestive heart failure in dogs. Some affected dogs have low tissue concentrations of taurine, but supplementation has not proved beneficial. Affected dogs often are males of large breeds, such as Doberman pinschers, Portuguese water dogs, Dalmatians, Scottish deerhounds, Irish wolfhounds, Saint Bernards, Afghan hounds, Newfoundland dogs, Old English sheepdogs, Great Danes, and boxers, although smaller breeds, such as English cocker spaniels, may be affected. The disease often has a familial pattern in the affected breeds and appears to be inherited as an autosomal recessive or X-linked recessive trait. At necropsy, lesions of congestive heart failure are present and the hearts are rounded because of biventricular dilation (see Figs. 10-43 and 10-44 ). The dilated cardiac chambers often have a diffusely white, thickened endocardium. Microscopic and ultrastructural alterations are nonspecific, can be either mild or absent, and may include interstitial fibrosis and fatty infiltration and changes of myocyte degeneration, including the occurrence of so-called attenuated wavy fibers. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Cardiac Neoplasms. Cardiac neoplasms comprise primary and secondary (metastatic) tumors. Primary cardiac tumors include hemangiosarcoma (most frequent), thyroid/parathyroid ectopic carcinomas, mesotheliomas, thymomas, granular cell tumor, sarcomas (osteosarcomas, chondrosarcomas, fibrosarcomas/fibro­mas, rhabdomyosarcomas/rhabdomyoma, neurofibrosarcomas/neurofibroma, and malignant mixed mesenchymal tumor), and chemodectomas (heart-base tumors). Secondary cardiac neoplasms are metastases from distant, primary tumor sites. In a study that included 80 dogs with primary and/or secondary cardiac neoplasms, 36% of dogs had evidence of cardiac metastases. Inflammation: Infectious Diseases Canine Parvovirus Myocarditis. Lymphocytic myocarditis is usually a lesion of viral infections and is well illustrated by the lesions of parvoviral myocarditis of puppies. Dogs with parvoviral myocarditis die unexpectedly and have generalized lesions of acute congestive heart failure but lack lesions in the intestine, the primary site of viral damage in approximately 95% of clinical cases. The heart is pale and flabby and has disseminated interstitial lymphocytic infiltrations and scattered myocytes with large, basophilic, intranuclear viral inclusion bodies in dogs that survive fibrosis ( Fig. 10-81 ). Figure 10-81 Parvovirus Myocarditis, Heart, Dog. A, Note the multifocal pale areas (arrow) in the ventricular myocardium. B, Parvovirus infection, section of myocardium. An intranuclear basophilic inclusion body is in a myocyte (arrow). H&E stain. ( A courtesy Dr. B. Weeks, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Trypanosoma cruzi . Trypanosoma cruzi is the protozoan hemoflagellate that causes American trypanosomiasis (Chagas' disease). The kissing bug (family Reduviidae, subfamily Triatominae) transmits the disease. Infection with Trypanosoma cruzi causes fatal chronic myocarditis. Acute disease is characteristic in dogs younger than 1 year of age. Affected dogs develop lymphohistiocytic myocarditis resulting in right-sided congestive heart failure with ascites, lymphadenomegaly, and hepatosplenomegaly. Grossly, the cardiac muscle contains multiple yellow-white myocardial streaks and spots that are often accompanied by hemorrhage. Chronic lymphocytic and plasmacytic myocarditis that leads to right-sided congestive heart failure typically affects older dogs. Grossly, the heart is bilaterally enlarged, thinned and flaccid, and contains fibrous plaques (areas of fibrosis). Canine Parvovirus Myocarditis. Lymphocytic myocarditis is usually a lesion of viral infections and is well illustrated by the lesions of parvoviral myocarditis of puppies. Dogs with parvoviral myocarditis die unexpectedly and have generalized lesions of acute congestive heart failure but lack lesions in the intestine, the primary site of viral damage in approximately 95% of clinical cases. The heart is pale and flabby and has disseminated interstitial lymphocytic infiltrations and scattered myocytes with large, basophilic, intranuclear viral inclusion bodies in dogs that survive fibrosis ( Fig. 10-81 ). Figure 10-81 Parvovirus Myocarditis, Heart, Dog. A, Note the multifocal pale areas (arrow) in the ventricular myocardium. B, Parvovirus infection, section of myocardium. An intranuclear basophilic inclusion body is in a myocyte (arrow). H&E stain. ( A courtesy Dr. B. Weeks, College of Veterinary Medicine, Texas A&M University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Trypanosoma cruzi . Trypanosoma cruzi is the protozoan hemoflagellate that causes American trypanosomiasis (Chagas' disease). The kissing bug (family Reduviidae, subfamily Triatominae) transmits the disease. Infection with Trypanosoma cruzi causes fatal chronic myocarditis. Acute disease is characteristic in dogs younger than 1 year of age. Affected dogs develop lymphohistiocytic myocarditis resulting in right-sided congestive heart failure with ascites, lymphadenomegaly, and hepatosplenomegaly. Grossly, the cardiac muscle contains multiple yellow-white myocardial streaks and spots that are often accompanied by hemorrhage. Chronic lymphocytic and plasmacytic myocarditis that leads to right-sided congestive heart failure typically affects older dogs. Grossly, the heart is bilaterally enlarged, thinned and flaccid, and contains fibrous plaques (areas of fibrosis). Cell Degeneration and Death Neurogenic Cardiomyopathy (Heart-Brain Syndrome). Neurogenic cardiomyopathy (heart-brain syndrome) is a syndrome in dogs characterized by unexpected death 5 to 10 days after diffuse CNS injury (usually hit by car). Affected dogs die of cardiac arrhythmias caused by myocardial degeneration and necrosis. Grossly, the myocardium has numerous discrete and coalescing pale white streaks and/or poorly defined areas of myocardial necrosis—most often involving the papillary muscles of the left ventricle ( Fig. 10-82 ). Neurogenic cardiomyopathy is thought to be caused by overstimulation of the heart by autonomic neurotransmitters and systemic catecholamines released at the time of trauma. It is unknown why there is a 5- to 10-day delay in the development of myocardial necrosis. See Chapter 14 for a discussion of heart-brain syndrome. Figure 10-82 Myocardial Necrosis, "Heart-Brain Syndrome," Heart, Transverse Section of Ventricles, Dog. Necrotic areas are pale beige to white and are concentrated in the inner half of the wall of the left ventricle (LV) and in the ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Neurogenic Cardiomyopathy (Heart-Brain Syndrome). Neurogenic cardiomyopathy (heart-brain syndrome) is a syndrome in dogs characterized by unexpected death 5 to 10 days after diffuse CNS injury (usually hit by car). Affected dogs die of cardiac arrhythmias caused by myocardial degeneration and necrosis. Grossly, the myocardium has numerous discrete and coalescing pale white streaks and/or poorly defined areas of myocardial necrosis—most often involving the papillary muscles of the left ventricle ( Fig. 10-82 ). Neurogenic cardiomyopathy is thought to be caused by overstimulation of the heart by autonomic neurotransmitters and systemic catecholamines released at the time of trauma. It is unknown why there is a 5- to 10-day delay in the development of myocardial necrosis. See Chapter 14 for a discussion of heart-brain syndrome. Figure 10-82 Myocardial Necrosis, "Heart-Brain Syndrome," Heart, Transverse Section of Ventricles, Dog. Necrotic areas are pale beige to white and are concentrated in the inner half of the wall of the left ventricle (LV) and in the ventricular septum. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Endocardium and Heart Valves Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Cell Degeneration and Death Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis). Myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis) is the most common cardiovascular disease in dogs, and it is the most common cause of congestive heart failure in old dogs. Other names for this disease include endocarditis valvularis chronica fibrosa (nodosa), chronic valvular endocarditis, chronic valvular disease, billowing sail distortion of the mitral valve, endocardiosis, chronic mitral valve fibrosis, senile nodular sclerosis, mucoid degeneration, chronic myxomatous valve disease, and degenerative mitral valve disease. Myxomatous valvular degeneration (MVD) is an age-related cardiac disease of middle-aged to old dogs, especially small, toy, and medium-sized breeds. Males of affected breeds develop the disease at an earlier age than females. MVD appears to have a polygenic inheritance in dachshunds and Cavalier King Charles spaniels. The Cavalier King Charles spaniel breed has a unique susceptibility, with more than 50% prevalence by 4 years of age and 100% prevalence by 10 years of age. Other breeds with high incidence include the cocker spaniel, Lhasa apsos, bichons, Yorkshire terriers, shih tzus, dachshund, poodle, Pomeranian, miniature schnauzer, Chihuahua, fox terrier, Boston terrier, and Pekingese. At autopsies (syn: necropsies) of 3245 dogs, gross lesions occurred on the mitral valve alone (57.3%), mitral and tricuspid valves (26.6%), tricuspid valve alone (7.5%), aortic valve alone (2.1%), pulmonic valve alone (0.4%), and in combinations (6.1%). The lesions in MVD become progressively worse with age. Affected valves are shortened and thickened (nodular), either focal or diffusely, and appear smooth and shiny ( Fig. 10-83 ) rather than rough and granular, as is usual in cases of valvular endocarditis. Figure 10-83 Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis), Left Atrioventricular Valve, Heart, Dog. A, The cusps of the mitral valve are thickened by white, smooth nodules (arrows). LV, Left ventricular free wall. B, Note the characteristic smooth and shiny (endocardial) surface of the valve and nodules. This differentiates myxomatous valvular degeneration (endocardiosis) from the rough and granular surface of chronic bacterial endocarditis. The pink staining of the valve is caused by postmortem imbibition of hemoglobin. ( A courtesy Dr. J. Wright, College of Veterinary Medicine, North Carolina State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) MVD is grossly classified into four groups as follows : type 1, a few small discrete nodules in the area of contact that are associated with areas of diffuse opacity in the proximal portion of the valve; type 2, larger nodules that are evident in the area of contact, which tend to coalesce with their neighbors, along with areas of diffuse opacity that may be present; type 3, large nodules that coalesced into irregular, plaque-like deformities that extend to involve the proximal portions of the chordae tendineae; and type 4, there is gross distortion and "ballooning" of the valve cusp, and the chordae tendinea are thickened proximally ( Fig. 10-84 ). These lesions result in valvular insufficiency with subsequent atrial dilation and development of atrial "jet lesions." The jet lesion is a raised, rough, firm streak of endocardial fibrosis resulting from long-term trauma by a jet of blood leaking through the damaged valve in the closed position. Histologically, the valves are divided into four layers: atrialis, ventricularis, spongiosa, and fibrosa. The atrialis and ventricularis layers face the respective cardiac chambers and consist of endothelium and immediate subendothelial tissue containing fibroblasts, scattered collagen fibers, and a thin layer of elastic fibers. The spongiosa layer is loose connective tissue with interstitial cells and minimal fibers. The fibrosa consists of dense collagen that is continuous with the collagen core of chordae tendineae. Histopathologic lesions in MVD predominate in the distal third of the valve leaflets, and the incidence and severity increase with age. Lesions include progressive expansion of the spongiosa layer and disruption of the fibrosa layer. Figure 10-84 Natural Progression of Myxomatous Valvular Disease in the Mitral Leaflet. Myxomatous valvular disease is grossly classified into four groups (1-4). Type 1 has a few discrete nodules (minimal changes); type 2 has larger nodules in contact areas (mild changes); type 3 has large, coalescing nodules forming plaquelike deformities (moderate changes); and type 4 has obvious distortions of the valve (severe changes). The light-colored areas represent areas of nodular or diffuse thickening and ballooning of the valve cusp and proximal chordae tendineae. The dark-colored areas represent areas of diffuse opacity due to accumulation of neutral fat within the spongiosa layer. N, Normal valve. (Redrawn from Figure 2 from Borgarelli, M, Buchanan JW: Historical review, epidemiology and natural history of degenerative mitral valve disease, J Vet Cardiol 14(1):93-101, 2012.) Microscopically, the thickened valves have notably increased myofibroblastic proliferation and deposition of acid mucopolysaccharides ( Fig. 10-85 ). It is important not to confuse normal age-related valve thickening in asymptomatic dogs with true pathologic thickening. Therefore a "clinical relevant diagnosis" would be more certain when the mitral valve and chordae tendineae are thickened and/or ruptured or when left heart chambers are enlarged or there are left atrial jet lesions. Severe complications of MVD include occasional rupture of chordae tendineae, occasional splitting or rupture of the left atrial wall that can result in hemopericardium, or acquired atrial septal defects. Frequent accompanying myocardial alterations include arteriosclerosis of intramyocardial arteries and multifocal myocardial necrosis and fibrosis. Progression of MVD is associated with an increase in plasma N-terminal pro-B-type natriuretic peptide concentration and an altered serotonin (5-hydroxytryptamine) signaling pathway. Figure 10-85 Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis), Cusp of Right Atrioventricular Valve, Heart, Dog. The valve is thickened and nodular from an increase in myxomatous tissue supported by a fibrous stroma. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation Endocarditis. Endocarditis is occasionally observed in dogs. Bacterial septicemias result in inflammation of cardiac valves. Bacteria most commonly isolated include Streptococcus spp., Bartonella spp., and Escherichia coli . The mitral valve is most commonly involved and is associated with polyarthritis. Infections with Bartonellosis may only have inflammatory changes involving the aortic valve leaflets. Erysipelothrix tonsillarum (formally known as Erysipelothrix serovar 7) is occasionally isolated. Confirmation of the definitive organism requires bacterial isolation and/or identification by molecular tools. See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation, and also Chapter 3. Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Cell Degeneration and Death Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis). Myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis) is the most common cardiovascular disease in dogs, and it is the most common cause of congestive heart failure in old dogs. Other names for this disease include endocarditis valvularis chronica fibrosa (nodosa), chronic valvular endocarditis, chronic valvular disease, billowing sail distortion of the mitral valve, endocardiosis, chronic mitral valve fibrosis, senile nodular sclerosis, mucoid degeneration, chronic myxomatous valve disease, and degenerative mitral valve disease. Myxomatous valvular degeneration (MVD) is an age-related cardiac disease of middle-aged to old dogs, especially small, toy, and medium-sized breeds. Males of affected breeds develop the disease at an earlier age than females. MVD appears to have a polygenic inheritance in dachshunds and Cavalier King Charles spaniels. The Cavalier King Charles spaniel breed has a unique susceptibility, with more than 50% prevalence by 4 years of age and 100% prevalence by 10 years of age. Other breeds with high incidence include the cocker spaniel, Lhasa apsos, bichons, Yorkshire terriers, shih tzus, dachshund, poodle, Pomeranian, miniature schnauzer, Chihuahua, fox terrier, Boston terrier, and Pekingese. At autopsies (syn: necropsies) of 3245 dogs, gross lesions occurred on the mitral valve alone (57.3%), mitral and tricuspid valves (26.6%), tricuspid valve alone (7.5%), aortic valve alone (2.1%), pulmonic valve alone (0.4%), and in combinations (6.1%). The lesions in MVD become progressively worse with age. Affected valves are shortened and thickened (nodular), either focal or diffusely, and appear smooth and shiny ( Fig. 10-83 ) rather than rough and granular, as is usual in cases of valvular endocarditis. Figure 10-83 Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis), Left Atrioventricular Valve, Heart, Dog. A, The cusps of the mitral valve are thickened by white, smooth nodules (arrows). LV, Left ventricular free wall. B, Note the characteristic smooth and shiny (endocardial) surface of the valve and nodules. This differentiates myxomatous valvular degeneration (endocardiosis) from the rough and granular surface of chronic bacterial endocarditis. The pink staining of the valve is caused by postmortem imbibition of hemoglobin. ( A courtesy Dr. J. Wright, College of Veterinary Medicine, North Carolina State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) MVD is grossly classified into four groups as follows : type 1, a few small discrete nodules in the area of contact that are associated with areas of diffuse opacity in the proximal portion of the valve; type 2, larger nodules that are evident in the area of contact, which tend to coalesce with their neighbors, along with areas of diffuse opacity that may be present; type 3, large nodules that coalesced into irregular, plaque-like deformities that extend to involve the proximal portions of the chordae tendineae; and type 4, there is gross distortion and "ballooning" of the valve cusp, and the chordae tendinea are thickened proximally ( Fig. 10-84 ). These lesions result in valvular insufficiency with subsequent atrial dilation and development of atrial "jet lesions." The jet lesion is a raised, rough, firm streak of endocardial fibrosis resulting from long-term trauma by a jet of blood leaking through the damaged valve in the closed position. Histologically, the valves are divided into four layers: atrialis, ventricularis, spongiosa, and fibrosa. The atrialis and ventricularis layers face the respective cardiac chambers and consist of endothelium and immediate subendothelial tissue containing fibroblasts, scattered collagen fibers, and a thin layer of elastic fibers. The spongiosa layer is loose connective tissue with interstitial cells and minimal fibers. The fibrosa consists of dense collagen that is continuous with the collagen core of chordae tendineae. Histopathologic lesions in MVD predominate in the distal third of the valve leaflets, and the incidence and severity increase with age. Lesions include progressive expansion of the spongiosa layer and disruption of the fibrosa layer. Figure 10-84 Natural Progression of Myxomatous Valvular Disease in the Mitral Leaflet. Myxomatous valvular disease is grossly classified into four groups (1-4). Type 1 has a few discrete nodules (minimal changes); type 2 has larger nodules in contact areas (mild changes); type 3 has large, coalescing nodules forming plaquelike deformities (moderate changes); and type 4 has obvious distortions of the valve (severe changes). The light-colored areas represent areas of nodular or diffuse thickening and ballooning of the valve cusp and proximal chordae tendineae. The dark-colored areas represent areas of diffuse opacity due to accumulation of neutral fat within the spongiosa layer. N, Normal valve. (Redrawn from Figure 2 from Borgarelli, M, Buchanan JW: Historical review, epidemiology and natural history of degenerative mitral valve disease, J Vet Cardiol 14(1):93-101, 2012.) Microscopically, the thickened valves have notably increased myofibroblastic proliferation and deposition of acid mucopolysaccharides ( Fig. 10-85 ). It is important not to confuse normal age-related valve thickening in asymptomatic dogs with true pathologic thickening. Therefore a "clinical relevant diagnosis" would be more certain when the mitral valve and chordae tendineae are thickened and/or ruptured or when left heart chambers are enlarged or there are left atrial jet lesions. Severe complications of MVD include occasional rupture of chordae tendineae, occasional splitting or rupture of the left atrial wall that can result in hemopericardium, or acquired atrial septal defects. Frequent accompanying myocardial alterations include arteriosclerosis of intramyocardial arteries and multifocal myocardial necrosis and fibrosis. Progression of MVD is associated with an increase in plasma N-terminal pro-B-type natriuretic peptide concentration and an altered serotonin (5-hydroxytryptamine) signaling pathway. Figure 10-85 Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis), Cusp of Right Atrioventricular Valve, Heart, Dog. The valve is thickened and nodular from an increase in myxomatous tissue supported by a fibrous stroma. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis). Myxomatous valvular degeneration (valvular endocardiosis) is the most common cardiovascular disease in dogs, and it is the most common cause of congestive heart failure in old dogs. Other names for this disease include endocarditis valvularis chronica fibrosa (nodosa), chronic valvular endocarditis, chronic valvular disease, billowing sail distortion of the mitral valve, endocardiosis, chronic mitral valve fibrosis, senile nodular sclerosis, mucoid degeneration, chronic myxomatous valve disease, and degenerative mitral valve disease. Myxomatous valvular degeneration (MVD) is an age-related cardiac disease of middle-aged to old dogs, especially small, toy, and medium-sized breeds. Males of affected breeds develop the disease at an earlier age than females. MVD appears to have a polygenic inheritance in dachshunds and Cavalier King Charles spaniels. The Cavalier King Charles spaniel breed has a unique susceptibility, with more than 50% prevalence by 4 years of age and 100% prevalence by 10 years of age. Other breeds with high incidence include the cocker spaniel, Lhasa apsos, bichons, Yorkshire terriers, shih tzus, dachshund, poodle, Pomeranian, miniature schnauzer, Chihuahua, fox terrier, Boston terrier, and Pekingese. At autopsies (syn: necropsies) of 3245 dogs, gross lesions occurred on the mitral valve alone (57.3%), mitral and tricuspid valves (26.6%), tricuspid valve alone (7.5%), aortic valve alone (2.1%), pulmonic valve alone (0.4%), and in combinations (6.1%). The lesions in MVD become progressively worse with age. Affected valves are shortened and thickened (nodular), either focal or diffusely, and appear smooth and shiny ( Fig. 10-83 ) rather than rough and granular, as is usual in cases of valvular endocarditis. Figure 10-83 Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis), Left Atrioventricular Valve, Heart, Dog. A, The cusps of the mitral valve are thickened by white, smooth nodules (arrows). LV, Left ventricular free wall. B, Note the characteristic smooth and shiny (endocardial) surface of the valve and nodules. This differentiates myxomatous valvular degeneration (endocardiosis) from the rough and granular surface of chronic bacterial endocarditis. The pink staining of the valve is caused by postmortem imbibition of hemoglobin. ( A courtesy Dr. J. Wright, College of Veterinary Medicine, North Carolina State University; and Noah's Arkive, College of Veterinary Medicine, The University of Georgia. B courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) MVD is grossly classified into four groups as follows : type 1, a few small discrete nodules in the area of contact that are associated with areas of diffuse opacity in the proximal portion of the valve; type 2, larger nodules that are evident in the area of contact, which tend to coalesce with their neighbors, along with areas of diffuse opacity that may be present; type 3, large nodules that coalesced into irregular, plaque-like deformities that extend to involve the proximal portions of the chordae tendineae; and type 4, there is gross distortion and "ballooning" of the valve cusp, and the chordae tendinea are thickened proximally ( Fig. 10-84 ). These lesions result in valvular insufficiency with subsequent atrial dilation and development of atrial "jet lesions." The jet lesion is a raised, rough, firm streak of endocardial fibrosis resulting from long-term trauma by a jet of blood leaking through the damaged valve in the closed position. Histologically, the valves are divided into four layers: atrialis, ventricularis, spongiosa, and fibrosa. The atrialis and ventricularis layers face the respective cardiac chambers and consist of endothelium and immediate subendothelial tissue containing fibroblasts, scattered collagen fibers, and a thin layer of elastic fibers. The spongiosa layer is loose connective tissue with interstitial cells and minimal fibers. The fibrosa consists of dense collagen that is continuous with the collagen core of chordae tendineae. Histopathologic lesions in MVD predominate in the distal third of the valve leaflets, and the incidence and severity increase with age. Lesions include progressive expansion of the spongiosa layer and disruption of the fibrosa layer. Figure 10-84 Natural Progression of Myxomatous Valvular Disease in the Mitral Leaflet. Myxomatous valvular disease is grossly classified into four groups (1-4). Type 1 has a few discrete nodules (minimal changes); type 2 has larger nodules in contact areas (mild changes); type 3 has large, coalescing nodules forming plaquelike deformities (moderate changes); and type 4 has obvious distortions of the valve (severe changes). The light-colored areas represent areas of nodular or diffuse thickening and ballooning of the valve cusp and proximal chordae tendineae. The dark-colored areas represent areas of diffuse opacity due to accumulation of neutral fat within the spongiosa layer. N, Normal valve. (Redrawn from Figure 2 from Borgarelli, M, Buchanan JW: Historical review, epidemiology and natural history of degenerative mitral valve disease, J Vet Cardiol 14(1):93-101, 2012.) Microscopically, the thickened valves have notably increased myofibroblastic proliferation and deposition of acid mucopolysaccharides ( Fig. 10-85 ). It is important not to confuse normal age-related valve thickening in asymptomatic dogs with true pathologic thickening. Therefore a "clinical relevant diagnosis" would be more certain when the mitral valve and chordae tendineae are thickened and/or ruptured or when left heart chambers are enlarged or there are left atrial jet lesions. Severe complications of MVD include occasional rupture of chordae tendineae, occasional splitting or rupture of the left atrial wall that can result in hemopericardium, or acquired atrial septal defects. Frequent accompanying myocardial alterations include arteriosclerosis of intramyocardial arteries and multifocal myocardial necrosis and fibrosis. Progression of MVD is associated with an increase in plasma N-terminal pro-B-type natriuretic peptide concentration and an altered serotonin (5-hydroxytryptamine) signaling pathway. Figure 10-85 Myxomatous Valvular Degeneration (Valvular Endocardiosis), Cusp of Right Atrioventricular Valve, Heart, Dog. The valve is thickened and nodular from an increase in myxomatous tissue supported by a fibrous stroma. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Inflammation Endocarditis. Endocarditis is occasionally observed in dogs. Bacterial septicemias result in inflammation of cardiac valves. Bacteria most commonly isolated include Streptococcus spp., Bartonella spp., and Escherichia coli . The mitral valve is most commonly involved and is associated with polyarthritis. Infections with Bartonellosis may only have inflammatory changes involving the aortic valve leaflets. Erysipelothrix tonsillarum (formally known as Erysipelothrix serovar 7) is occasionally isolated. Confirmation of the definitive organism requires bacterial isolation and/or identification by molecular tools. See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation, and also Chapter 3. Endocarditis. Endocarditis is occasionally observed in dogs. Bacterial septicemias result in inflammation of cardiac valves. Bacteria most commonly isolated include Streptococcus spp., Bartonella spp., and Escherichia coli . The mitral valve is most commonly involved and is associated with polyarthritis. Infections with Bartonellosis may only have inflammatory changes involving the aortic valve leaflets. Erysipelothrix tonsillarum (formally known as Erysipelothrix serovar 7) is occasionally isolated. Confirmation of the definitive organism requires bacterial isolation and/or identification by molecular tools. See the discussion on vegetative valvular and mural endocarditis in the section on Disorders of Domestic Animals: Endocardium and Heart Valves , Inflammation, and also Chapter 3. Pericardium and Epicardium Disturbances of Circulation Idiopathic Pericardial Effusion (Hemorrhagic Pericardial Effusion). Idiopathic pericardial effusion is one of the most common causes of canine pericardial effusion and accounts for approximately 19% of all canine pericardial effusions. Large or giant breeds, such as the Great Dane, Saint Bernard, Great Pyrenees, German shepherd, and golden retriever, are most often affected. It is a diagnosis of exclusion after all other potential causes (neoplastic, traumatic, infectious, metabolic, cardiac, and coagulopathy) have been ruled out. Idiopathic pericardial effusion can be hemorrhagic or serosanguinous. The pericardium is thickened by diffuse fibrosis; neovascularization; areas of lymphocytic, plasmacytic, and histiocytic infiltrates; and areas of mesothelial hyperplasia alongside regions void of parietal mesothelium. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions, and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Disturbances of Circulation Idiopathic Pericardial Effusion (Hemorrhagic Pericardial Effusion). Idiopathic pericardial effusion is one of the most common causes of canine pericardial effusion and accounts for approximately 19% of all canine pericardial effusions. Large or giant breeds, such as the Great Dane, Saint Bernard, Great Pyrenees, German shepherd, and golden retriever, are most often affected. It is a diagnosis of exclusion after all other potential causes (neoplastic, traumatic, infectious, metabolic, cardiac, and coagulopathy) have been ruled out. Idiopathic pericardial effusion can be hemorrhagic or serosanguinous. The pericardium is thickened by diffuse fibrosis; neovascularization; areas of lymphocytic, plasmacytic, and histiocytic infiltrates; and areas of mesothelial hyperplasia alongside regions void of parietal mesothelium. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions, and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Idiopathic Pericardial Effusion (Hemorrhagic Pericardial Effusion). Idiopathic pericardial effusion is one of the most common causes of canine pericardial effusion and accounts for approximately 19% of all canine pericardial effusions. Large or giant breeds, such as the Great Dane, Saint Bernard, Great Pyrenees, German shepherd, and golden retriever, are most often affected. It is a diagnosis of exclusion after all other potential causes (neoplastic, traumatic, infectious, metabolic, cardiac, and coagulopathy) have been ruled out. Idiopathic pericardial effusion can be hemorrhagic or serosanguinous. The pericardium is thickened by diffuse fibrosis; neovascularization; areas of lymphocytic, plasmacytic, and histiocytic infiltrates; and areas of mesothelial hyperplasia alongside regions void of parietal mesothelium. See the discussion on effusions in the section on Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Effusions, and also Chapters 3, 7, and 9Chapter 3Chapter 7Chapter 9. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma and Hemangioma. Cardiac hemangiosarcoma (HSA) is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or via metastasis (secondary) from primary sites such as the spleen. In a recent study, HSA frequently occurred in older golden retrievers, followed by Maltese dogs and miniature dachshunds. Mass lesions of HSA were found more commonly in the right auricle and right atrium, and the right atrial masses were significantly larger than the right auricular masses, potentially accounting for their higher antemortem detection rate by echocardiography. Grossly, protruding red to red-black blood-containing masses are located on the epicardial surface ( Fig. 10-86 ) and may also protrude into the atrial lumen. Rupture can produce fatal hemopericardium and cardiac tamponade. Microscopically, the neoplasms are composed of scattered, elongated, plump neoplastic endothelial cells, which may or may not form vascular spaces containing blood ( Fig. 10-87 ). Pulmonary metastases are frequent. Immunohistochemistry staining for factor VIII-related antigen or CD31 (an endothelial marker) confirms the tumor cells are endothelial in origin. Hemangiomas are benign neoplasms often found in the skin of dogs ( Fig. 10-88 ). These red, blood-filled masses are well circumscribed. Figure 10-86 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. A dark-red hemangiosarcoma protrudes from the wall of the right atrium (RA) , a predilection site in the dog for this tumor (arrow). RV, Right ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-87 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. Malignant endothelial cells have invaded the myocardium of the right atrium, thus giving it the bluish granular appearance (cell nuclei) at low magnification. The high magnification (inset) shows these endothelial cells with large, round-to-oval nuclei forming poorly delineated and haphazardly arranged vascular channels. These cells can also "pile up" and be arranged in clusters or solid sheets. Mitotic figures can be prominent and numerous (not shown here). A golden-brown pigment (hemosiderin) can form secondary to erythrophagocytosis of damaged or effete erythrocytes (not shown here). H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-88 Cutaneous Hemangioma, Skin, Dog. The subcutis contains a well-demarcated mass formed by vascular channels lined by a single layer of well-differentiated endothelial cells. Inset, Higher magnification of the well-differentiated endothelial cells lining the vascular channels. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Heart-Base Tumors. See the discussion on cardiac neoplasms in the section on Disorders of Dogs , Myocardium, Disturbances of Growth; on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth; and also see Fig. 10-48 . Cell Degeneration and Death Medial Necrosis and Hemorrhage. Medial necrosis and hemorrhage is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats by a wide variety of vasoactive drugs. These vascular lesions, detected during evaluations of new compounds, produce grossly apparent hemorrhage, especially in the epicardium. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Segmental Arterial Mediolysis. Segmental arterial mediolysis is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats that most often occurs in the splanchnic muscular and coronary arteries and causes catastrophic hemorrhages. The pathology can be induced experimentally by administration of ractopamine, a synthetic β 2 -adrenoceptor agonist to dogs. Exposure to α 1 -adrenergic receptor agonists or β 2 agonists induces the release of norepinephrine from the peripheral nervous system. Epinephrine is thought to induce injury at the adventitial medial junction through medial muscle apoptosis. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Fibrocartilaginous Embolism. Fibrocartilaginous embolism of the spinal cord vasculature and resultant infarction of the spinal cord supplied or drained by the obstructed blood vessel lead to posterior paresis or paralysis. Affected dogs are typically middle-aged large or giant breeds, but occurrence in young Irish wolfhounds has been reported. The mechanism of formation of the arterial or venous emboli is still unclear, but movement within the spinal vasculature of fibrocartilaginous fragments from degenerated intervertebral disks is generally considered to underlie the presence of these unusual emboli ( Fig. 10-89 ; E-Fig. 10-29 ). Figure 10-89 Fibrocartilaginous Emboli, Spinal Cord, Pig. The basophilic masses (arrows) occluding small arteries (cross sections) in the spinal cord gray matter adjacent to the central canal (top left margin) are fibrocartilaginous emboli. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-29 Fibrocartilaginous Emboli, Multifocal Infarction, Spinal Cord, Dog. Note the poorly stained (pale red to clear) areas in the left half of the spinal cord affecting both dorsal and ventral gray horns and all funiculi. The ventral gray horn is affected on the right side. These areas are infarcts caused by occlusion and blockage of blood flow in arterioles supplying blood to these areas by fibrocartilaginous emboli. Emboli are thought to cross from the venous side to the arterial side of the circulatory system in vascular anastomoses that form in metaplastic and degenerative cartilage as occurs in intervertebral disk disease. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Pulmonary Artery Thromboembolism. Pulmonary artery thromboembolism ( Fig. 10-90 ) is often a life-threatening condition and in dogs has an incidence of 0.9% over a 10-year period. A wide variety of predisposing conditions may result in altered blood flow, hypercoagulability, or endothelial damage. These include sepsis, immune-mediated hemolytic anemia, neoplastic disease, protein-losing nephropathy/amyloidosis, disseminated intravascular coagulation, cardiac disease, hyperadrenocorticism, dirofilariasis, and use of intravenous catheters. The thrombus in the pulmonary arteries lyses within a few hours and therefore may be absent at the time of autopsy (syn: necropsy) in approximately 15% of cases, as was indicated by one study. Because of extensive collateral pulmonary arterial circulation, the presence of a large thrombus in the pulmonary artery or its main branches makes a clinically relevant diagnosis of pulmonary artery thromboembolism more certain, unless antemortem ancillary tests such as pulmonary angiography and ventilation/perfusion scanning are strongly supportive of it. Figure 10-90 Arterial Thrombus, Pulmonary Artery, Dog. Arterial thrombi are composed primarily of platelets and fibrin because the rapid flow of blood tends to exclude erythrocytes from the thrombus, and thus arterial thrombi are usually pale beige to gray (arrow). (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Arterial Thromboembolism and Thrombosis. Arterial thromboembolism and thrombosis occur in dogs and arise from injury to vascular endothelium, propagated via the coagulation cascade (see Chapter 2). In dogs, the most common site is the aortoiliac trifurcation ( Fig. 10-91 ), in which a thromboembolus extends from the caudal aorta distally to the external and internal iliac arteries. Embolization of the subclavian and brachial arteries also results in lameness of the forelimb, albeit less commonly. Other sites include embolization of the coronary arteries in the heart, renal arteries, and intestinal arteries. Aortoiliac thromboembolism in dogs has been reported with infection by Spirocerca lupi and Blastomyces dermatitides and in association with various disease conditions, such as protein-losing nephropathy, hypothyroidism, hypercortisolism, diabetes mellitus, and aortic neoplasia. Figure 10-91 Aortic Thrombosis, Aorta and External Iliac Arteries, Dog. The tan thrombus occluding the caudal abdominal aorta is a cranial extension of the red saddle thromboembolus at the aortic bifurcation and in the external iliac arteries (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Thrombosis of the Femoral Artery. Thrombosis of the femoral artery, with resulting partial to complete occlusion, has been reported in Cavalier King Charles spaniels. Affected dogs generally do not develop hindlimb ischemia, in contrast to human patients with this condition, because of extensive collateral circulation and thrombus recanalization. It is a common but clinically insignificant pathology in Cavalier King Charles spaniels that is suspected to result from a probable weakness in the femoral artery wall. Inflammation Heartworm Dirofilariasis (Dirofilaria immitis). Dirofilariasis (heartworm disease) may occur in 35% to 45% of dogs and 2% of cats in areas of high infection rates, such as within 150 miles of the Atlantic and Gulf coasts from Texas to New Jersey and along the Mississippi River and its major tributaries. The extent of cardiac alterations is related to the number of adult parasites present. Initially, the parasites accumulate in the pulmonary arteries ( Fig. 10-92 ), and as the numbers increase, they are present in the right ventricle, then in the right atrium, and finally may occupy the vena cavae. Pulmonary hypertension results from vascular blockage and pulmonary vascular lesions produced by the parasites, and right ventricular hypertrophy follows. Right-sided heart failure may eventually develop. The pulmonary arteries containing parasites initially have an infiltration of the intima (termed endarteritis ) by eosinophils, with subsequent development of an irregular fibromuscular proliferation of the intima visible grossly as a rough granular or shaggy appearance of the luminal surface (see Fig. 10-92 ; E-Figs. 10-30 and 10-31 ). Live or dead parasites can be present within these vascular lesions and be accompanied by thromboembolism and pulmonary infarction. The pleura of the caudal lung lobes may contain multifocal areas of hemorrhage, hemosiderosis, and fibrosis. The presence of a massive number of adult worms may result in filling the right heart extending into venae cavae, resulting in venal caval syndrome. This syndrome results in sudden collapse, liver failure, intravascular hemolytic anemia, shock, and death if the adult worms are not removed surgically. Figure 10-92 Dirofilariasis, Heart, Opened Right Ventricle, and Pulmonary Artery, Dog. Numerous adult Dirofilaria immitis are present in the right ventricle (RV), right atrium, and pulmonary artery (PA) . (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-30 Verminous Arteritis, Dirofilariasis, Pulmonary Artery, Dog. A dead adult Dirofilaria immitis (DI) parasite in the lumen of the pulmonary artery is surrounded by pyogranulomatous inflammatory cells adhered to the wall (left) of the artery. Note the loss of the endothelial cells on the left side of the artery. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-31 Chronic Endarteritis, Dirofilariasis, Lung, Pulmonary Artery, Dog. Several intact adult Dirofilaria immitis are in the lumen. Note the thickened fibrotic intima (arrow). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Polyarteritis: "Beagle Pain Syndrome." Polyarteritis is a disease that occurs sporadically in many animal species and is an important disease of aged rats called polyarteritis nodosa ( E-Fig. 10-32 ). Many recent reports have described the occurrence of polyarteritis in a disease termed idiopathic necrotizing polyarteritis (idiopathic canine polyarteritis, juvenile polyarteritis syndrome) involving multiple arteries, including the coronary and meningeal arteries in dogs, most often pet and laboratory beagle dogs ("beagle pain syndrome"). Clinically, affected dogs typically show recurrent episodes of fever, body weight loss, and occasionally cervical pain manifested by a stilted gait and stiff neck with a hunched body posture. However, some affected dogs do not display clinical signs of disease. The lesions are usually attributed to an immune-mediated vascular injury. Small and medium-sized muscular arteries in a wide variety of organs, including the heart, meninges, epididymis, and thymus, are selectively involved and grossly appear thick and tortuous, have associated focal hemorrhage, and develop aneurysms and thrombosis. Microscopically, the early lesions include fibrinoid necrosis and leukocytic invasion of the intima and media ( E-Fig. 10-33 ). In chronic lesions, inflammatory cells and fibrosis involve all layers of the vascular wall. E-Figure 10-32 Polyarteritis Nodosa, Mesenteric Arteries, Rat. The affected segments of the arteries are thick, red, hemorrhagic, and tortuous (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-33 Periarteritis and Arteritis (Polyarteritis—"Beagle Pain Syndrome"), Beagle Dog. Note the accumulation of lymphocytes and macrophages around the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. P.W. Snyder, School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Primary Lymphedema. Primary lymphedema is a rare pathology in dogs that often involves the distal hindlimbs, and it results from aplasia/hypoplasia of superficial lymphatic vessels and/or draining lymph nodes of the distal hindlimbs. Antemortem, dogs are being presented with nonpainful pitting edema of the distal hindlimbs. At autopsy (syn: necropsy) there is lymphatic hypoplasia and/or absence of popliteal lymph nodes with distal secondary lymphatic hyperplasia. Marked delay in lymphatic filling in lymphangiography, in lymphoscintigraphy, or in the patent blue violet dye absorption test are antemortem ancillary test results that strongly support the diagnosis of primary lymphedema. Primary Intestinal Lymphangiectasia. Primary intestinal lymphangiectasia is a rare intestinal pathology of dogs that results in severe protein-losing enteropathy. The Lundehund breed is predisposed. Clinically, dogs are presented for wasting, diarrhea, and ascites. Lacteals in the intestinal villi are fused, blunted, and have markedly distended tips, whereas lymphatic vessels throughout the wall of the intestine, and occasionally mesentery and mesenteric lymph nodes, are distended with milky opaque fluid (i.e., chyle) (see Fig. 7-14). In dogs, the role of obstruction of lymphatic vessels or their structural integrity (i.e., hypoplasia) in the pathogenesis of this disease is still unclear. Secondary intestinal lymphangiectasia is much more common and results from obstruction of lymphatic drainage by inflammation or neoplasia. Blood Vessels Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma and Hemangioma. Cardiac hemangiosarcoma (HSA) is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or via metastasis (secondary) from primary sites such as the spleen. In a recent study, HSA frequently occurred in older golden retrievers, followed by Maltese dogs and miniature dachshunds. Mass lesions of HSA were found more commonly in the right auricle and right atrium, and the right atrial masses were significantly larger than the right auricular masses, potentially accounting for their higher antemortem detection rate by echocardiography. Grossly, protruding red to red-black blood-containing masses are located on the epicardial surface ( Fig. 10-86 ) and may also protrude into the atrial lumen. Rupture can produce fatal hemopericardium and cardiac tamponade. Microscopically, the neoplasms are composed of scattered, elongated, plump neoplastic endothelial cells, which may or may not form vascular spaces containing blood ( Fig. 10-87 ). Pulmonary metastases are frequent. Immunohistochemistry staining for factor VIII-related antigen or CD31 (an endothelial marker) confirms the tumor cells are endothelial in origin. Hemangiomas are benign neoplasms often found in the skin of dogs ( Fig. 10-88 ). These red, blood-filled masses are well circumscribed. Figure 10-86 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. A dark-red hemangiosarcoma protrudes from the wall of the right atrium (RA) , a predilection site in the dog for this tumor (arrow). RV, Right ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-87 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. Malignant endothelial cells have invaded the myocardium of the right atrium, thus giving it the bluish granular appearance (cell nuclei) at low magnification. The high magnification (inset) shows these endothelial cells with large, round-to-oval nuclei forming poorly delineated and haphazardly arranged vascular channels. These cells can also "pile up" and be arranged in clusters or solid sheets. Mitotic figures can be prominent and numerous (not shown here). A golden-brown pigment (hemosiderin) can form secondary to erythrophagocytosis of damaged or effete erythrocytes (not shown here). H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-88 Cutaneous Hemangioma, Skin, Dog. The subcutis contains a well-demarcated mass formed by vascular channels lined by a single layer of well-differentiated endothelial cells. Inset, Higher magnification of the well-differentiated endothelial cells lining the vascular channels. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Heart-Base Tumors. See the discussion on cardiac neoplasms in the section on Disorders of Dogs , Myocardium, Disturbances of Growth; on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth; and also see Fig. 10-48 . Cell Degeneration and Death Medial Necrosis and Hemorrhage. Medial necrosis and hemorrhage is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats by a wide variety of vasoactive drugs. These vascular lesions, detected during evaluations of new compounds, produce grossly apparent hemorrhage, especially in the epicardium. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Segmental Arterial Mediolysis. Segmental arterial mediolysis is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats that most often occurs in the splanchnic muscular and coronary arteries and causes catastrophic hemorrhages. The pathology can be induced experimentally by administration of ractopamine, a synthetic β 2 -adrenoceptor agonist to dogs. Exposure to α 1 -adrenergic receptor agonists or β 2 agonists induces the release of norepinephrine from the peripheral nervous system. Epinephrine is thought to induce injury at the adventitial medial junction through medial muscle apoptosis. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Fibrocartilaginous Embolism. Fibrocartilaginous embolism of the spinal cord vasculature and resultant infarction of the spinal cord supplied or drained by the obstructed blood vessel lead to posterior paresis or paralysis. Affected dogs are typically middle-aged large or giant breeds, but occurrence in young Irish wolfhounds has been reported. The mechanism of formation of the arterial or venous emboli is still unclear, but movement within the spinal vasculature of fibrocartilaginous fragments from degenerated intervertebral disks is generally considered to underlie the presence of these unusual emboli ( Fig. 10-89 ; E-Fig. 10-29 ). Figure 10-89 Fibrocartilaginous Emboli, Spinal Cord, Pig. The basophilic masses (arrows) occluding small arteries (cross sections) in the spinal cord gray matter adjacent to the central canal (top left margin) are fibrocartilaginous emboli. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-29 Fibrocartilaginous Emboli, Multifocal Infarction, Spinal Cord, Dog. Note the poorly stained (pale red to clear) areas in the left half of the spinal cord affecting both dorsal and ventral gray horns and all funiculi. The ventral gray horn is affected on the right side. These areas are infarcts caused by occlusion and blockage of blood flow in arterioles supplying blood to these areas by fibrocartilaginous emboli. Emboli are thought to cross from the venous side to the arterial side of the circulatory system in vascular anastomoses that form in metaplastic and degenerative cartilage as occurs in intervertebral disk disease. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Pulmonary Artery Thromboembolism. Pulmonary artery thromboembolism ( Fig. 10-90 ) is often a life-threatening condition and in dogs has an incidence of 0.9% over a 10-year period. A wide variety of predisposing conditions may result in altered blood flow, hypercoagulability, or endothelial damage. These include sepsis, immune-mediated hemolytic anemia, neoplastic disease, protein-losing nephropathy/amyloidosis, disseminated intravascular coagulation, cardiac disease, hyperadrenocorticism, dirofilariasis, and use of intravenous catheters. The thrombus in the pulmonary arteries lyses within a few hours and therefore may be absent at the time of autopsy (syn: necropsy) in approximately 15% of cases, as was indicated by one study. Because of extensive collateral pulmonary arterial circulation, the presence of a large thrombus in the pulmonary artery or its main branches makes a clinically relevant diagnosis of pulmonary artery thromboembolism more certain, unless antemortem ancillary tests such as pulmonary angiography and ventilation/perfusion scanning are strongly supportive of it. Figure 10-90 Arterial Thrombus, Pulmonary Artery, Dog. Arterial thrombi are composed primarily of platelets and fibrin because the rapid flow of blood tends to exclude erythrocytes from the thrombus, and thus arterial thrombi are usually pale beige to gray (arrow). (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Arterial Thromboembolism and Thrombosis. Arterial thromboembolism and thrombosis occur in dogs and arise from injury to vascular endothelium, propagated via the coagulation cascade (see Chapter 2). In dogs, the most common site is the aortoiliac trifurcation ( Fig. 10-91 ), in which a thromboembolus extends from the caudal aorta distally to the external and internal iliac arteries. Embolization of the subclavian and brachial arteries also results in lameness of the forelimb, albeit less commonly. Other sites include embolization of the coronary arteries in the heart, renal arteries, and intestinal arteries. Aortoiliac thromboembolism in dogs has been reported with infection by Spirocerca lupi and Blastomyces dermatitides and in association with various disease conditions, such as protein-losing nephropathy, hypothyroidism, hypercortisolism, diabetes mellitus, and aortic neoplasia. Figure 10-91 Aortic Thrombosis, Aorta and External Iliac Arteries, Dog. The tan thrombus occluding the caudal abdominal aorta is a cranial extension of the red saddle thromboembolus at the aortic bifurcation and in the external iliac arteries (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Thrombosis of the Femoral Artery. Thrombosis of the femoral artery, with resulting partial to complete occlusion, has been reported in Cavalier King Charles spaniels. Affected dogs generally do not develop hindlimb ischemia, in contrast to human patients with this condition, because of extensive collateral circulation and thrombus recanalization. It is a common but clinically insignificant pathology in Cavalier King Charles spaniels that is suspected to result from a probable weakness in the femoral artery wall. Inflammation Heartworm Dirofilariasis (Dirofilaria immitis). Dirofilariasis (heartworm disease) may occur in 35% to 45% of dogs and 2% of cats in areas of high infection rates, such as within 150 miles of the Atlantic and Gulf coasts from Texas to New Jersey and along the Mississippi River and its major tributaries. The extent of cardiac alterations is related to the number of adult parasites present. Initially, the parasites accumulate in the pulmonary arteries ( Fig. 10-92 ), and as the numbers increase, they are present in the right ventricle, then in the right atrium, and finally may occupy the vena cavae. Pulmonary hypertension results from vascular blockage and pulmonary vascular lesions produced by the parasites, and right ventricular hypertrophy follows. Right-sided heart failure may eventually develop. The pulmonary arteries containing parasites initially have an infiltration of the intima (termed endarteritis ) by eosinophils, with subsequent development of an irregular fibromuscular proliferation of the intima visible grossly as a rough granular or shaggy appearance of the luminal surface (see Fig. 10-92 ; E-Figs. 10-30 and 10-31 ). Live or dead parasites can be present within these vascular lesions and be accompanied by thromboembolism and pulmonary infarction. The pleura of the caudal lung lobes may contain multifocal areas of hemorrhage, hemosiderosis, and fibrosis. The presence of a massive number of adult worms may result in filling the right heart extending into venae cavae, resulting in venal caval syndrome. This syndrome results in sudden collapse, liver failure, intravascular hemolytic anemia, shock, and death if the adult worms are not removed surgically. Figure 10-92 Dirofilariasis, Heart, Opened Right Ventricle, and Pulmonary Artery, Dog. Numerous adult Dirofilaria immitis are present in the right ventricle (RV), right atrium, and pulmonary artery (PA) . (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-30 Verminous Arteritis, Dirofilariasis, Pulmonary Artery, Dog. A dead adult Dirofilaria immitis (DI) parasite in the lumen of the pulmonary artery is surrounded by pyogranulomatous inflammatory cells adhered to the wall (left) of the artery. Note the loss of the endothelial cells on the left side of the artery. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-31 Chronic Endarteritis, Dirofilariasis, Lung, Pulmonary Artery, Dog. Several intact adult Dirofilaria immitis are in the lumen. Note the thickened fibrotic intima (arrow). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Polyarteritis: "Beagle Pain Syndrome." Polyarteritis is a disease that occurs sporadically in many animal species and is an important disease of aged rats called polyarteritis nodosa ( E-Fig. 10-32 ). Many recent reports have described the occurrence of polyarteritis in a disease termed idiopathic necrotizing polyarteritis (idiopathic canine polyarteritis, juvenile polyarteritis syndrome) involving multiple arteries, including the coronary and meningeal arteries in dogs, most often pet and laboratory beagle dogs ("beagle pain syndrome"). Clinically, affected dogs typically show recurrent episodes of fever, body weight loss, and occasionally cervical pain manifested by a stilted gait and stiff neck with a hunched body posture. However, some affected dogs do not display clinical signs of disease. The lesions are usually attributed to an immune-mediated vascular injury. Small and medium-sized muscular arteries in a wide variety of organs, including the heart, meninges, epididymis, and thymus, are selectively involved and grossly appear thick and tortuous, have associated focal hemorrhage, and develop aneurysms and thrombosis. Microscopically, the early lesions include fibrinoid necrosis and leukocytic invasion of the intima and media ( E-Fig. 10-33 ). In chronic lesions, inflammatory cells and fibrosis involve all layers of the vascular wall. E-Figure 10-32 Polyarteritis Nodosa, Mesenteric Arteries, Rat. The affected segments of the arteries are thick, red, hemorrhagic, and tortuous (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-33 Periarteritis and Arteritis (Polyarteritis—"Beagle Pain Syndrome"), Beagle Dog. Note the accumulation of lymphocytes and macrophages around the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. P.W. Snyder, School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma and Hemangioma. Cardiac hemangiosarcoma (HSA) is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or via metastasis (secondary) from primary sites such as the spleen. In a recent study, HSA frequently occurred in older golden retrievers, followed by Maltese dogs and miniature dachshunds. Mass lesions of HSA were found more commonly in the right auricle and right atrium, and the right atrial masses were significantly larger than the right auricular masses, potentially accounting for their higher antemortem detection rate by echocardiography. Grossly, protruding red to red-black blood-containing masses are located on the epicardial surface ( Fig. 10-86 ) and may also protrude into the atrial lumen. Rupture can produce fatal hemopericardium and cardiac tamponade. Microscopically, the neoplasms are composed of scattered, elongated, plump neoplastic endothelial cells, which may or may not form vascular spaces containing blood ( Fig. 10-87 ). Pulmonary metastases are frequent. Immunohistochemistry staining for factor VIII-related antigen or CD31 (an endothelial marker) confirms the tumor cells are endothelial in origin. Hemangiomas are benign neoplasms often found in the skin of dogs ( Fig. 10-88 ). These red, blood-filled masses are well circumscribed. Figure 10-86 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. A dark-red hemangiosarcoma protrudes from the wall of the right atrium (RA) , a predilection site in the dog for this tumor (arrow). RV, Right ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-87 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. Malignant endothelial cells have invaded the myocardium of the right atrium, thus giving it the bluish granular appearance (cell nuclei) at low magnification. The high magnification (inset) shows these endothelial cells with large, round-to-oval nuclei forming poorly delineated and haphazardly arranged vascular channels. These cells can also "pile up" and be arranged in clusters or solid sheets. Mitotic figures can be prominent and numerous (not shown here). A golden-brown pigment (hemosiderin) can form secondary to erythrophagocytosis of damaged or effete erythrocytes (not shown here). H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-88 Cutaneous Hemangioma, Skin, Dog. The subcutis contains a well-demarcated mass formed by vascular channels lined by a single layer of well-differentiated endothelial cells. Inset, Higher magnification of the well-differentiated endothelial cells lining the vascular channels. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Heart-Base Tumors. See the discussion on cardiac neoplasms in the section on Disorders of Dogs , Myocardium, Disturbances of Growth; on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth; and also see Fig. 10-48 . Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies . Neoplastic Transformation Hemangiosarcoma and Hemangioma. Cardiac hemangiosarcoma (HSA) is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or via metastasis (secondary) from primary sites such as the spleen. In a recent study, HSA frequently occurred in older golden retrievers, followed by Maltese dogs and miniature dachshunds. Mass lesions of HSA were found more commonly in the right auricle and right atrium, and the right atrial masses were significantly larger than the right auricular masses, potentially accounting for their higher antemortem detection rate by echocardiography. Grossly, protruding red to red-black blood-containing masses are located on the epicardial surface ( Fig. 10-86 ) and may also protrude into the atrial lumen. Rupture can produce fatal hemopericardium and cardiac tamponade. Microscopically, the neoplasms are composed of scattered, elongated, plump neoplastic endothelial cells, which may or may not form vascular spaces containing blood ( Fig. 10-87 ). Pulmonary metastases are frequent. Immunohistochemistry staining for factor VIII-related antigen or CD31 (an endothelial marker) confirms the tumor cells are endothelial in origin. Hemangiomas are benign neoplasms often found in the skin of dogs ( Fig. 10-88 ). These red, blood-filled masses are well circumscribed. Figure 10-86 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. A dark-red hemangiosarcoma protrudes from the wall of the right atrium (RA) , a predilection site in the dog for this tumor (arrow). RV, Right ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-87 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. Malignant endothelial cells have invaded the myocardium of the right atrium, thus giving it the bluish granular appearance (cell nuclei) at low magnification. The high magnification (inset) shows these endothelial cells with large, round-to-oval nuclei forming poorly delineated and haphazardly arranged vascular channels. These cells can also "pile up" and be arranged in clusters or solid sheets. Mitotic figures can be prominent and numerous (not shown here). A golden-brown pigment (hemosiderin) can form secondary to erythrophagocytosis of damaged or effete erythrocytes (not shown here). H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-88 Cutaneous Hemangioma, Skin, Dog. The subcutis contains a well-demarcated mass formed by vascular channels lined by a single layer of well-differentiated endothelial cells. Inset, Higher magnification of the well-differentiated endothelial cells lining the vascular channels. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Heart-Base Tumors. See the discussion on cardiac neoplasms in the section on Disorders of Dogs , Myocardium, Disturbances of Growth; on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth; and also see Fig. 10-48 . Hemangiosarcoma and Hemangioma. Cardiac hemangiosarcoma (HSA) is an important neoplasm of dogs and can arise either in the heart (primary) or via metastasis (secondary) from primary sites such as the spleen. In a recent study, HSA frequently occurred in older golden retrievers, followed by Maltese dogs and miniature dachshunds. Mass lesions of HSA were found more commonly in the right auricle and right atrium, and the right atrial masses were significantly larger than the right auricular masses, potentially accounting for their higher antemortem detection rate by echocardiography. Grossly, protruding red to red-black blood-containing masses are located on the epicardial surface ( Fig. 10-86 ) and may also protrude into the atrial lumen. Rupture can produce fatal hemopericardium and cardiac tamponade. Microscopically, the neoplasms are composed of scattered, elongated, plump neoplastic endothelial cells, which may or may not form vascular spaces containing blood ( Fig. 10-87 ). Pulmonary metastases are frequent. Immunohistochemistry staining for factor VIII-related antigen or CD31 (an endothelial marker) confirms the tumor cells are endothelial in origin. Hemangiomas are benign neoplasms often found in the skin of dogs ( Fig. 10-88 ). These red, blood-filled masses are well circumscribed. Figure 10-86 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. A dark-red hemangiosarcoma protrudes from the wall of the right atrium (RA) , a predilection site in the dog for this tumor (arrow). RV, Right ventricle. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Figure 10-87 Hemangiosarcoma, Heart, Right Atrium, Dog. Malignant endothelial cells have invaded the myocardium of the right atrium, thus giving it the bluish granular appearance (cell nuclei) at low magnification. The high magnification (inset) shows these endothelial cells with large, round-to-oval nuclei forming poorly delineated and haphazardly arranged vascular channels. These cells can also "pile up" and be arranged in clusters or solid sheets. Mitotic figures can be prominent and numerous (not shown here). A golden-brown pigment (hemosiderin) can form secondary to erythrophagocytosis of damaged or effete erythrocytes (not shown here). H&E stain. (Courtesy Dr. J.F. Zachary, College of Veterinary Medicine, University of Illinois.) Figure 10-88 Cutaneous Hemangioma, Skin, Dog. The subcutis contains a well-demarcated mass formed by vascular channels lined by a single layer of well-differentiated endothelial cells. Inset, Higher magnification of the well-differentiated endothelial cells lining the vascular channels. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Heart-Base Tumors. See the discussion on cardiac neoplasms in the section on Disorders of Dogs , Myocardium, Disturbances of Growth; on neoplastic transformation in the section on Disorders of Domestic Animals , Blood and Lymphatic Vascular Systems, Blood Vessels, Disturbances of Growth; and also see Fig. 10-48 . Cell Degeneration and Death Medial Necrosis and Hemorrhage. Medial necrosis and hemorrhage is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats by a wide variety of vasoactive drugs. These vascular lesions, detected during evaluations of new compounds, produce grossly apparent hemorrhage, especially in the epicardium. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Segmental Arterial Mediolysis. Segmental arterial mediolysis is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats that most often occurs in the splanchnic muscular and coronary arteries and causes catastrophic hemorrhages. The pathology can be induced experimentally by administration of ractopamine, a synthetic β 2 -adrenoceptor agonist to dogs. Exposure to α 1 -adrenergic receptor agonists or β 2 agonists induces the release of norepinephrine from the peripheral nervous system. Epinephrine is thought to induce injury at the adventitial medial junction through medial muscle apoptosis. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Fibrocartilaginous Embolism. Fibrocartilaginous embolism of the spinal cord vasculature and resultant infarction of the spinal cord supplied or drained by the obstructed blood vessel lead to posterior paresis or paralysis. Affected dogs are typically middle-aged large or giant breeds, but occurrence in young Irish wolfhounds has been reported. The mechanism of formation of the arterial or venous emboli is still unclear, but movement within the spinal vasculature of fibrocartilaginous fragments from degenerated intervertebral disks is generally considered to underlie the presence of these unusual emboli ( Fig. 10-89 ; E-Fig. 10-29 ). Figure 10-89 Fibrocartilaginous Emboli, Spinal Cord, Pig. The basophilic masses (arrows) occluding small arteries (cross sections) in the spinal cord gray matter adjacent to the central canal (top left margin) are fibrocartilaginous emboli. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-29 Fibrocartilaginous Emboli, Multifocal Infarction, Spinal Cord, Dog. Note the poorly stained (pale red to clear) areas in the left half of the spinal cord affecting both dorsal and ventral gray horns and all funiculi. The ventral gray horn is affected on the right side. These areas are infarcts caused by occlusion and blockage of blood flow in arterioles supplying blood to these areas by fibrocartilaginous emboli. Emboli are thought to cross from the venous side to the arterial side of the circulatory system in vascular anastomoses that form in metaplastic and degenerative cartilage as occurs in intervertebral disk disease. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Pulmonary Artery Thromboembolism. Pulmonary artery thromboembolism ( Fig. 10-90 ) is often a life-threatening condition and in dogs has an incidence of 0.9% over a 10-year period. A wide variety of predisposing conditions may result in altered blood flow, hypercoagulability, or endothelial damage. These include sepsis, immune-mediated hemolytic anemia, neoplastic disease, protein-losing nephropathy/amyloidosis, disseminated intravascular coagulation, cardiac disease, hyperadrenocorticism, dirofilariasis, and use of intravenous catheters. The thrombus in the pulmonary arteries lyses within a few hours and therefore may be absent at the time of autopsy (syn: necropsy) in approximately 15% of cases, as was indicated by one study. Because of extensive collateral pulmonary arterial circulation, the presence of a large thrombus in the pulmonary artery or its main branches makes a clinically relevant diagnosis of pulmonary artery thromboembolism more certain, unless antemortem ancillary tests such as pulmonary angiography and ventilation/perfusion scanning are strongly supportive of it. Figure 10-90 Arterial Thrombus, Pulmonary Artery, Dog. Arterial thrombi are composed primarily of platelets and fibrin because the rapid flow of blood tends to exclude erythrocytes from the thrombus, and thus arterial thrombi are usually pale beige to gray (arrow). (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Arterial Thromboembolism and Thrombosis. Arterial thromboembolism and thrombosis occur in dogs and arise from injury to vascular endothelium, propagated via the coagulation cascade (see Chapter 2). In dogs, the most common site is the aortoiliac trifurcation ( Fig. 10-91 ), in which a thromboembolus extends from the caudal aorta distally to the external and internal iliac arteries. Embolization of the subclavian and brachial arteries also results in lameness of the forelimb, albeit less commonly. Other sites include embolization of the coronary arteries in the heart, renal arteries, and intestinal arteries. Aortoiliac thromboembolism in dogs has been reported with infection by Spirocerca lupi and Blastomyces dermatitides and in association with various disease conditions, such as protein-losing nephropathy, hypothyroidism, hypercortisolism, diabetes mellitus, and aortic neoplasia. Figure 10-91 Aortic Thrombosis, Aorta and External Iliac Arteries, Dog. The tan thrombus occluding the caudal abdominal aorta is a cranial extension of the red saddle thromboembolus at the aortic bifurcation and in the external iliac arteries (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Thrombosis of the Femoral Artery. Thrombosis of the femoral artery, with resulting partial to complete occlusion, has been reported in Cavalier King Charles spaniels. Affected dogs generally do not develop hindlimb ischemia, in contrast to human patients with this condition, because of extensive collateral circulation and thrombus recanalization. It is a common but clinically insignificant pathology in Cavalier King Charles spaniels that is suspected to result from a probable weakness in the femoral artery wall. Medial Necrosis and Hemorrhage. Medial necrosis and hemorrhage is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats by a wide variety of vasoactive drugs. These vascular lesions, detected during evaluations of new compounds, produce grossly apparent hemorrhage, especially in the epicardium. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Segmental Arterial Mediolysis. Segmental arterial mediolysis is a distinctive lesion produced in muscular arteries and arterioles of dogs and rats that most often occurs in the splanchnic muscular and coronary arteries and causes catastrophic hemorrhages. The pathology can be induced experimentally by administration of ractopamine, a synthetic β 2 -adrenoceptor agonist to dogs. Exposure to α 1 -adrenergic receptor agonists or β 2 agonists induces the release of norepinephrine from the peripheral nervous system. Epinephrine is thought to induce injury at the adventitial medial junction through medial muscle apoptosis. Microscopically, acute damage is evident as necrosis of smooth muscle cells in the tunica media with surrounding erythrocytes. Healing lesions have fibrosis of the vessel wall and perivascularly. Fibrocartilaginous Embolism. Fibrocartilaginous embolism of the spinal cord vasculature and resultant infarction of the spinal cord supplied or drained by the obstructed blood vessel lead to posterior paresis or paralysis. Affected dogs are typically middle-aged large or giant breeds, but occurrence in young Irish wolfhounds has been reported. The mechanism of formation of the arterial or venous emboli is still unclear, but movement within the spinal vasculature of fibrocartilaginous fragments from degenerated intervertebral disks is generally considered to underlie the presence of these unusual emboli ( Fig. 10-89 ; E-Fig. 10-29 ). Figure 10-89 Fibrocartilaginous Emboli, Spinal Cord, Pig. The basophilic masses (arrows) occluding small arteries (cross sections) in the spinal cord gray matter adjacent to the central canal (top left margin) are fibrocartilaginous emboli. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-29 Fibrocartilaginous Emboli, Multifocal Infarction, Spinal Cord, Dog. Note the poorly stained (pale red to clear) areas in the left half of the spinal cord affecting both dorsal and ventral gray horns and all funiculi. The ventral gray horn is affected on the right side. These areas are infarcts caused by occlusion and blockage of blood flow in arterioles supplying blood to these areas by fibrocartilaginous emboli. Emboli are thought to cross from the venous side to the arterial side of the circulatory system in vascular anastomoses that form in metaplastic and degenerative cartilage as occurs in intervertebral disk disease. H&E stain. (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) Pulmonary Artery Thromboembolism. Pulmonary artery thromboembolism ( Fig. 10-90 ) is often a life-threatening condition and in dogs has an incidence of 0.9% over a 10-year period. A wide variety of predisposing conditions may result in altered blood flow, hypercoagulability, or endothelial damage. These include sepsis, immune-mediated hemolytic anemia, neoplastic disease, protein-losing nephropathy/amyloidosis, disseminated intravascular coagulation, cardiac disease, hyperadrenocorticism, dirofilariasis, and use of intravenous catheters. The thrombus in the pulmonary arteries lyses within a few hours and therefore may be absent at the time of autopsy (syn: necropsy) in approximately 15% of cases, as was indicated by one study. Because of extensive collateral pulmonary arterial circulation, the presence of a large thrombus in the pulmonary artery or its main branches makes a clinically relevant diagnosis of pulmonary artery thromboembolism more certain, unless antemortem ancillary tests such as pulmonary angiography and ventilation/perfusion scanning are strongly supportive of it. Figure 10-90 Arterial Thrombus, Pulmonary Artery, Dog. Arterial thrombi are composed primarily of platelets and fibrin because the rapid flow of blood tends to exclude erythrocytes from the thrombus, and thus arterial thrombi are usually pale beige to gray (arrow). (Courtesy Dr. D.A. Mosier, College of Veterinary Medicine, Kansas State University.) Arterial Thromboembolism and Thrombosis. Arterial thromboembolism and thrombosis occur in dogs and arise from injury to vascular endothelium, propagated via the coagulation cascade (see Chapter 2). In dogs, the most common site is the aortoiliac trifurcation ( Fig. 10-91 ), in which a thromboembolus extends from the caudal aorta distally to the external and internal iliac arteries. Embolization of the subclavian and brachial arteries also results in lameness of the forelimb, albeit less commonly. Other sites include embolization of the coronary arteries in the heart, renal arteries, and intestinal arteries. Aortoiliac thromboembolism in dogs has been reported with infection by Spirocerca lupi and Blastomyces dermatitides and in association with various disease conditions, such as protein-losing nephropathy, hypothyroidism, hypercortisolism, diabetes mellitus, and aortic neoplasia. Figure 10-91 Aortic Thrombosis, Aorta and External Iliac Arteries, Dog. The tan thrombus occluding the caudal abdominal aorta is a cranial extension of the red saddle thromboembolus at the aortic bifurcation and in the external iliac arteries (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Thrombosis of the Femoral Artery. Thrombosis of the femoral artery, with resulting partial to complete occlusion, has been reported in Cavalier King Charles spaniels. Affected dogs generally do not develop hindlimb ischemia, in contrast to human patients with this condition, because of extensive collateral circulation and thrombus recanalization. It is a common but clinically insignificant pathology in Cavalier King Charles spaniels that is suspected to result from a probable weakness in the femoral artery wall. Inflammation Heartworm Dirofilariasis (Dirofilaria immitis). Dirofilariasis (heartworm disease) may occur in 35% to 45% of dogs and 2% of cats in areas of high infection rates, such as within 150 miles of the Atlantic and Gulf coasts from Texas to New Jersey and along the Mississippi River and its major tributaries. The extent of cardiac alterations is related to the number of adult parasites present. Initially, the parasites accumulate in the pulmonary arteries ( Fig. 10-92 ), and as the numbers increase, they are present in the right ventricle, then in the right atrium, and finally may occupy the vena cavae. Pulmonary hypertension results from vascular blockage and pulmonary vascular lesions produced by the parasites, and right ventricular hypertrophy follows. Right-sided heart failure may eventually develop. The pulmonary arteries containing parasites initially have an infiltration of the intima (termed endarteritis ) by eosinophils, with subsequent development of an irregular fibromuscular proliferation of the intima visible grossly as a rough granular or shaggy appearance of the luminal surface (see Fig. 10-92 ; E-Figs. 10-30 and 10-31 ). Live or dead parasites can be present within these vascular lesions and be accompanied by thromboembolism and pulmonary infarction. The pleura of the caudal lung lobes may contain multifocal areas of hemorrhage, hemosiderosis, and fibrosis. The presence of a massive number of adult worms may result in filling the right heart extending into venae cavae, resulting in venal caval syndrome. This syndrome results in sudden collapse, liver failure, intravascular hemolytic anemia, shock, and death if the adult worms are not removed surgically. Figure 10-92 Dirofilariasis, Heart, Opened Right Ventricle, and Pulmonary Artery, Dog. Numerous adult Dirofilaria immitis are present in the right ventricle (RV), right atrium, and pulmonary artery (PA) . (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-30 Verminous Arteritis, Dirofilariasis, Pulmonary Artery, Dog. A dead adult Dirofilaria immitis (DI) parasite in the lumen of the pulmonary artery is surrounded by pyogranulomatous inflammatory cells adhered to the wall (left) of the artery. Note the loss of the endothelial cells on the left side of the artery. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-31 Chronic Endarteritis, Dirofilariasis, Lung, Pulmonary Artery, Dog. Several intact adult Dirofilaria immitis are in the lumen. Note the thickened fibrotic intima (arrow). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Polyarteritis: "Beagle Pain Syndrome." Polyarteritis is a disease that occurs sporadically in many animal species and is an important disease of aged rats called polyarteritis nodosa ( E-Fig. 10-32 ). Many recent reports have described the occurrence of polyarteritis in a disease termed idiopathic necrotizing polyarteritis (idiopathic canine polyarteritis, juvenile polyarteritis syndrome) involving multiple arteries, including the coronary and meningeal arteries in dogs, most often pet and laboratory beagle dogs ("beagle pain syndrome"). Clinically, affected dogs typically show recurrent episodes of fever, body weight loss, and occasionally cervical pain manifested by a stilted gait and stiff neck with a hunched body posture. However, some affected dogs do not display clinical signs of disease. The lesions are usually attributed to an immune-mediated vascular injury. Small and medium-sized muscular arteries in a wide variety of organs, including the heart, meninges, epididymis, and thymus, are selectively involved and grossly appear thick and tortuous, have associated focal hemorrhage, and develop aneurysms and thrombosis. Microscopically, the early lesions include fibrinoid necrosis and leukocytic invasion of the intima and media ( E-Fig. 10-33 ). In chronic lesions, inflammatory cells and fibrosis involve all layers of the vascular wall. E-Figure 10-32 Polyarteritis Nodosa, Mesenteric Arteries, Rat. The affected segments of the arteries are thick, red, hemorrhagic, and tortuous (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-33 Periarteritis and Arteritis (Polyarteritis—"Beagle Pain Syndrome"), Beagle Dog. Note the accumulation of lymphocytes and macrophages around the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. P.W. Snyder, School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Heartworm Dirofilariasis (Dirofilaria immitis). Dirofilariasis (heartworm disease) may occur in 35% to 45% of dogs and 2% of cats in areas of high infection rates, such as within 150 miles of the Atlantic and Gulf coasts from Texas to New Jersey and along the Mississippi River and its major tributaries. The extent of cardiac alterations is related to the number of adult parasites present. Initially, the parasites accumulate in the pulmonary arteries ( Fig. 10-92 ), and as the numbers increase, they are present in the right ventricle, then in the right atrium, and finally may occupy the vena cavae. Pulmonary hypertension results from vascular blockage and pulmonary vascular lesions produced by the parasites, and right ventricular hypertrophy follows. Right-sided heart failure may eventually develop. The pulmonary arteries containing parasites initially have an infiltration of the intima (termed endarteritis ) by eosinophils, with subsequent development of an irregular fibromuscular proliferation of the intima visible grossly as a rough granular or shaggy appearance of the luminal surface (see Fig. 10-92 ; E-Figs. 10-30 and 10-31 ). Live or dead parasites can be present within these vascular lesions and be accompanied by thromboembolism and pulmonary infarction. The pleura of the caudal lung lobes may contain multifocal areas of hemorrhage, hemosiderosis, and fibrosis. The presence of a massive number of adult worms may result in filling the right heart extending into venae cavae, resulting in venal caval syndrome. This syndrome results in sudden collapse, liver failure, intravascular hemolytic anemia, shock, and death if the adult worms are not removed surgically. Figure 10-92 Dirofilariasis, Heart, Opened Right Ventricle, and Pulmonary Artery, Dog. Numerous adult Dirofilaria immitis are present in the right ventricle (RV), right atrium, and pulmonary artery (PA) . (Courtesy Dr. M.D. McGavin, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee.) E-Figure 10-30 Verminous Arteritis, Dirofilariasis, Pulmonary Artery, Dog. A dead adult Dirofilaria immitis (DI) parasite in the lumen of the pulmonary artery is surrounded by pyogranulomatous inflammatory cells adhered to the wall (left) of the artery. Note the loss of the endothelial cells on the left side of the artery. H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-31 Chronic Endarteritis, Dirofilariasis, Lung, Pulmonary Artery, Dog. Several intact adult Dirofilaria immitis are in the lumen. Note the thickened fibrotic intima (arrow). H&E stain. (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Polyarteritis: "Beagle Pain Syndrome." Polyarteritis is a disease that occurs sporadically in many animal species and is an important disease of aged rats called polyarteritis nodosa ( E-Fig. 10-32 ). Many recent reports have described the occurrence of polyarteritis in a disease termed idiopathic necrotizing polyarteritis (idiopathic canine polyarteritis, juvenile polyarteritis syndrome) involving multiple arteries, including the coronary and meningeal arteries in dogs, most often pet and laboratory beagle dogs ("beagle pain syndrome"). Clinically, affected dogs typically show recurrent episodes of fever, body weight loss, and occasionally cervical pain manifested by a stilted gait and stiff neck with a hunched body posture. However, some affected dogs do not display clinical signs of disease. The lesions are usually attributed to an immune-mediated vascular injury. Small and medium-sized muscular arteries in a wide variety of organs, including the heart, meninges, epididymis, and thymus, are selectively involved and grossly appear thick and tortuous, have associated focal hemorrhage, and develop aneurysms and thrombosis. Microscopically, the early lesions include fibrinoid necrosis and leukocytic invasion of the intima and media ( E-Fig. 10-33 ). In chronic lesions, inflammatory cells and fibrosis involve all layers of the vascular wall. E-Figure 10-32 Polyarteritis Nodosa, Mesenteric Arteries, Rat. The affected segments of the arteries are thick, red, hemorrhagic, and tortuous (arrows). (Courtesy School of Veterinary Medicine, Purdue University.) E-Figure 10-33 Periarteritis and Arteritis (Polyarteritis—"Beagle Pain Syndrome"), Beagle Dog. Note the accumulation of lymphocytes and macrophages around the arteriole. H&E stain. (Courtesy Dr. P.W. Snyder, School of Veterinary Medicine, Purdue University.) Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Primary Lymphedema. Primary lymphedema is a rare pathology in dogs that often involves the distal hindlimbs, and it results from aplasia/hypoplasia of superficial lymphatic vessels and/or draining lymph nodes of the distal hindlimbs. Antemortem, dogs are being presented with nonpainful pitting edema of the distal hindlimbs. At autopsy (syn: necropsy) there is lymphatic hypoplasia and/or absence of popliteal lymph nodes with distal secondary lymphatic hyperplasia. Marked delay in lymphatic filling in lymphangiography, in lymphoscintigraphy, or in the patent blue violet dye absorption test are antemortem ancillary test results that strongly support the diagnosis of primary lymphedema. Primary Intestinal Lymphangiectasia. Primary intestinal lymphangiectasia is a rare intestinal pathology of dogs that results in severe protein-losing enteropathy. The Lundehund breed is predisposed. Clinically, dogs are presented for wasting, diarrhea, and ascites. Lacteals in the intestinal villi are fused, blunted, and have markedly distended tips, whereas lymphatic vessels throughout the wall of the intestine, and occasionally mesentery and mesenteric lymph nodes, are distended with milky opaque fluid (i.e., chyle) (see Fig. 7-14). In dogs, the role of obstruction of lymphatic vessels or their structural integrity (i.e., hypoplasia) in the pathogenesis of this disease is still unclear. Secondary intestinal lymphangiectasia is much more common and results from obstruction of lymphatic drainage by inflammation or neoplasia. Disturbances of Circulation Primary Lymphedema. Primary lymphedema is a rare pathology in dogs that often involves the distal hindlimbs, and it results from aplasia/hypoplasia of superficial lymphatic vessels and/or draining lymph nodes of the distal hindlimbs. Antemortem, dogs are being presented with nonpainful pitting edema of the distal hindlimbs. At autopsy (syn: necropsy) there is lymphatic hypoplasia and/or absence of popliteal lymph nodes with distal secondary lymphatic hyperplasia. Marked delay in lymphatic filling in lymphangiography, in lymphoscintigraphy, or in the patent blue violet dye absorption test are antemortem ancillary test results that strongly support the diagnosis of primary lymphedema. Primary Intestinal Lymphangiectasia. Primary intestinal lymphangiectasia is a rare intestinal pathology of dogs that results in severe protein-losing enteropathy. The Lundehund breed is predisposed. Clinically, dogs are presented for wasting, diarrhea, and ascites. Lacteals in the intestinal villi are fused, blunted, and have markedly distended tips, whereas lymphatic vessels throughout the wall of the intestine, and occasionally mesentery and mesenteric lymph nodes, are distended with milky opaque fluid (i.e., chyle) (see Fig. 7-14). In dogs, the role of obstruction of lymphatic vessels or their structural integrity (i.e., hypoplasia) in the pathogenesis of this disease is still unclear. Secondary intestinal lymphangiectasia is much more common and results from obstruction of lymphatic drainage by inflammation or neoplasia. Primary Lymphedema. Primary lymphedema is a rare pathology in dogs that often involves the distal hindlimbs, and it results from aplasia/hypoplasia of superficial lymphatic vessels and/or draining lymph nodes of the distal hindlimbs. Antemortem, dogs are being presented with nonpainful pitting edema of the distal hindlimbs. At autopsy (syn: necropsy) there is lymphatic hypoplasia and/or absence of popliteal lymph nodes with distal secondary lymphatic hyperplasia. Marked delay in lymphatic filling in lymphangiography, in lymphoscintigraphy, or in the patent blue violet dye absorption test are antemortem ancillary test results that strongly support the diagnosis of primary lymphedema. Primary Intestinal Lymphangiectasia. Primary intestinal lymphangiectasia is a rare intestinal pathology of dogs that results in severe protein-losing enteropathy. The Lundehund breed is predisposed. Clinically, dogs are presented for wasting, diarrhea, and ascites. Lacteals in the intestinal villi are fused, blunted, and have markedly distended tips, whereas lymphatic vessels throughout the wall of the intestine, and occasionally mesentery and mesenteric lymph nodes, are distended with milky opaque fluid (i.e., chyle) (see Fig. 7-14). In dogs, the role of obstruction of lymphatic vessels or their structural integrity (i.e., hypoplasia) in the pathogenesis of this disease is still unclear. Secondary intestinal lymphangiectasia is much more common and results from obstruction of lymphatic drainage by inflammation or neoplasia. Disorders of Cats Myocardium Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Myocardium . Cardiomyopathies. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Endocardium and Heart Valves Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Inflammation Endomyocarditis. Endomyocarditis is a disease of cats of undetermined cause. The affected areas are thickened and often in the area of the outflow of the left ventricle. Lesions consist of a mixed population of inflammatory cells, which extends into the adjacent myocardium. Chronic lesions have marked, often visible fibrous connective tissue with fewer inflammatory cells within the endocardium. Pericardium and Epicardium Disturbances of Circulation Effusions. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Pericardial Effusions Hemopericardium. Rodenticide toxicity and systemic consumption of clotting factors from disseminated intravascular coagulation are the most common causes of hemopericardium in cats. Hydropericardium. Cats develop hydropericardium most commonly from congestive heart failure. Neoplasms, including heart-base tumors, mesotheliomas lymphoma, rhabdomyosarcoma, and fibrosarcoma, can produce hydropericardium. Uremia, through systemic damage to blood vessels, may result in hydropericardium. Inflammation Pericarditis. Feline infectious peritonitis (FIP) is a cause of fibrinous pericarditis in cats. The etiological agent is mutated feline enteric corona virus, and in that case pericarditis is a local manifestation of a multisystemic and generalized disease process. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Disturbances of Growth Medial Hypertrophy of Pulmonary Arteries. Medial (tunica media) hypertrophy of pulmonary arteries is a disorder of cats of unknown cause (see Fig. 10-26 ); however, a response to antigens during nematode infections may be involved. Inflammation Pulmonary Artery Thromboembolism. See the discussion on pulmonary artery thromboembolism in the section on Disorders of Dogs . Arterial Thromboembolism. Arterial thromboembolism (ATE) is defined as obstruction usually followed by infarction of arterial beds by embolic material derived from a thrombus from a distant site and in the presence of intact endothelial surface (to be distinguished from arterial thrombosis). The most common cause of ATE in cats is cardiomyopathy in which a large thrombus is formed in the enlarged left atrium. However, other conditions, such as protein-losing nephropathy/enteropathy, sepsis, DIC, and endocrinopathies, should be considered in the diagnostic workup. The fate of the infarcted area depends on the ability to establish collateral blood flow, thus bypassing the occluded artery. In cats and dogs, the most common site is the aortic trifurcation ("saddle embolus"), and the right subclavian artery is the second most common cause of ATE in cats with cardiomyopathy. Renal, splanchnic, and cerebral circulations can also be affected on occasion. In a saddle embolus, occlusion of limb(s) blood flow results in ischemic neuromyopathy of the limb(s). Grossly, distal limbs below the stifle are most severely affected, and the affected limb is often dark red to blue and edematous due to hemorrhagic ischemic necrosis. Feline Infectious Peritonitis. Feline infectious peritonitis is a severe viral infection that produces phlebitis in various organs. This lesion appears to result from deposition of immune complexes, which subsequently induce an inflammatory reaction in affected vessels (see Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11). Heartworm-Associated Respiratory Disease. Dirofilaria immitis infection in cats occasionally results in heartworm-associated respiratory disease. Cats are more susceptible than dogs to infection with Dirofilaria immitis , although many do not have adult worms or have only a few (one to four worms). Grossly, there may be a visible shaggy or roughened appearance to the large lobar arteries, especially the right caudal lobar artery. The pulmonary arteries develop villus endarteritis with medial hypertrophy (see Fig. 10-26 ). Initially, small pulmonary arteries may become embolized and infarcted, leading to small areas of hemorrhage and necrosis in the lung and sudden death in some cats. Many cats that survive this initial phase develop collateral blood supply, but histologically they have multiple small pulmonary arteries with villus endarteritis and multifocal areas with type II pneumocyte hyperplasia, which is indicative of chronic alveolar injury. The most common clinical manifestation is an asthma-like syndrome potentially from inflammatory mediators that are released by numerous eosinophils and other leukocytes that cuff affected small pulmonary arteries. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins and lymphatic vessels. These diseases include infection of cats in South America by Gurltia paralysans , infection of cats in tropical regions with Brugia spp., and infection of pulmonary vessels by Dirofilaria immitis . Cats infected with Gurltia paralysans have spinal cord damage from thrombophlebitis in the lumbar veins, associated with the presence of adult parasites in affected vessels. Brugia spp. infect lymphatic vessels and lead to secondary lymphedema. Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Lymphedema. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Lymphatic Vessels, Disturbances of Circulation, Lymphedema. Myocardium Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Myocardium . Cardiomyopathies. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Disturbances of Growth Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Myocardium . Cardiomyopathies. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Anomalies and Dysplasia. See the discussion on anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Myocardium . Cardiomyopathies. See the discussion on cardiomyopathies in the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Myocardium , Disturbances of Growth , Hypertrophy and Atrophy . Endocardium and Heart Valves Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Inflammation Endomyocarditis. Endomyocarditis is a disease of cats of undetermined cause. The affected areas are thickened and often in the area of the outflow of the left ventricle. Lesions consist of a mixed population of inflammatory cells, which extends into the adjacent myocardium. Chronic lesions have marked, often visible fibrous connective tissue with fewer inflammatory cells within the endocardium. Disturbances of Growth Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Valvular Anomalies and Dysplasia. See the discussion on valvular anomalies and dysplasia in the section on Disorders of Domestic Animals , Developmental Errors/Congenital Anomalies: Endocardium and Heart Valves . Inflammation Endomyocarditis. Endomyocarditis is a disease of cats of undetermined cause. The affected areas are thickened and often in the area of the outflow of the left ventricle. Lesions consist of a mixed population of inflammatory cells, which extends into the adjacent myocardium. Chronic lesions have marked, often visible fibrous connective tissue with fewer inflammatory cells within the endocardium. Endomyocarditis. Endomyocarditis is a disease of cats of undetermined cause. The affected areas are thickened and often in the area of the outflow of the left ventricle. Lesions consist of a mixed population of inflammatory cells, which extends into the adjacent myocardium. Chronic lesions have marked, often visible fibrous connective tissue with fewer inflammatory cells within the endocardium. Pericardium and Epicardium Disturbances of Circulation Effusions. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Pericardial Effusions Hemopericardium. Rodenticide toxicity and systemic consumption of clotting factors from disseminated intravascular coagulation are the most common causes of hemopericardium in cats. Hydropericardium. Cats develop hydropericardium most commonly from congestive heart failure. Neoplasms, including heart-base tumors, mesotheliomas lymphoma, rhabdomyosarcoma, and fibrosarcoma, can produce hydropericardium. Uremia, through systemic damage to blood vessels, may result in hydropericardium. Inflammation Pericarditis. Feline infectious peritonitis (FIP) is a cause of fibrinous pericarditis in cats. The etiological agent is mutated feline enteric corona virus, and in that case pericarditis is a local manifestation of a multisystemic and generalized disease process. Disturbances of Circulation Effusions. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Pericardial Effusions Hemopericardium. Rodenticide toxicity and systemic consumption of clotting factors from disseminated intravascular coagulation are the most common causes of hemopericardium in cats. Hydropericardium. Cats develop hydropericardium most commonly from congestive heart failure. Neoplasms, including heart-base tumors, mesotheliomas lymphoma, rhabdomyosarcoma, and fibrosarcoma, can produce hydropericardium. Uremia, through systemic damage to blood vessels, may result in hydropericardium. Effusions. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Pericardium and Epicardium , Disturbances of Circulation , Hemopericardium and Hydropericardium. Pericardial Effusions Hemopericardium. Rodenticide toxicity and systemic consumption of clotting factors from disseminated intravascular coagulation are the most common causes of hemopericardium in cats. Hydropericardium. Cats develop hydropericardium most commonly from congestive heart failure. Neoplasms, including heart-base tumors, mesotheliomas lymphoma, rhabdomyosarcoma, and fibrosarcoma, can produce hydropericardium. Uremia, through systemic damage to blood vessels, may result in hydropericardium. Pericardial Effusions Hemopericardium. Rodenticide toxicity and systemic consumption of clotting factors from disseminated intravascular coagulation are the most common causes of hemopericardium in cats. Hydropericardium. Cats develop hydropericardium most commonly from congestive heart failure. Neoplasms, including heart-base tumors, mesotheliomas lymphoma, rhabdomyosarcoma, and fibrosarcoma, can produce hydropericardium. Uremia, through systemic damage to blood vessels, may result in hydropericardium. Hemopericardium. Rodenticide toxicity and systemic consumption of clotting factors from disseminated intravascular coagulation are the most common causes of hemopericardium in cats. Hydropericardium. Cats develop hydropericardium most commonly from congestive heart failure. Neoplasms, including heart-base tumors, mesotheliomas lymphoma, rhabdomyosarcoma, and fibrosarcoma, can produce hydropericardium. Uremia, through systemic damage to blood vessels, may result in hydropericardium. Inflammation Pericarditis. Feline infectious peritonitis (FIP) is a cause of fibrinous pericarditis in cats. The etiological agent is mutated feline enteric corona virus, and in that case pericarditis is a local manifestation of a multisystemic and generalized disease process. Pericarditis. Feline infectious peritonitis (FIP) is a cause of fibrinous pericarditis in cats. The etiological agent is mutated feline enteric corona virus, and in that case pericarditis is a local manifestation of a multisystemic and generalized disease process. Blood and Lymphatic Vascular Systems Blood Vessels Disturbances of Growth Medial Hypertrophy of Pulmonary Arteries. Medial (tunica media) hypertrophy of pulmonary arteries is a disorder of cats of unknown cause (see Fig. 10-26 ); however, a response to antigens during nematode infections may be involved. Inflammation Pulmonary Artery Thromboembolism. See the discussion on pulmonary artery thromboembolism in the section on Disorders of Dogs . Arterial Thromboembolism. Arterial thromboembolism (ATE) is defined as obstruction usually followed by infarction of arterial beds by embolic material derived from a thrombus from a distant site and in the presence of intact endothelial surface (to be distinguished from arterial thrombosis). The most common cause of ATE in cats is cardiomyopathy in which a large thrombus is formed in the enlarged left atrium. However, other conditions, such as protein-losing nephropathy/enteropathy, sepsis, DIC, and endocrinopathies, should be considered in the diagnostic workup. The fate of the infarcted area depends on the ability to establish collateral blood flow, thus bypassing the occluded artery. In cats and dogs, the most common site is the aortic trifurcation ("saddle embolus"), and the right subclavian artery is the second most common cause of ATE in cats with cardiomyopathy. Renal, splanchnic, and cerebral circulations can also be affected on occasion. In a saddle embolus, occlusion of limb(s) blood flow results in ischemic neuromyopathy of the limb(s). Grossly, distal limbs below the stifle are most severely affected, and the affected limb is often dark red to blue and edematous due to hemorrhagic ischemic necrosis. Feline Infectious Peritonitis. Feline infectious peritonitis is a severe viral infection that produces phlebitis in various organs. This lesion appears to result from deposition of immune complexes, which subsequently induce an inflammatory reaction in affected vessels (see Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11). Heartworm-Associated Respiratory Disease. Dirofilaria immitis infection in cats occasionally results in heartworm-associated respiratory disease. Cats are more susceptible than dogs to infection with Dirofilaria immitis , although many do not have adult worms or have only a few (one to four worms). Grossly, there may be a visible shaggy or roughened appearance to the large lobar arteries, especially the right caudal lobar artery. The pulmonary arteries develop villus endarteritis with medial hypertrophy (see Fig. 10-26 ). Initially, small pulmonary arteries may become embolized and infarcted, leading to small areas of hemorrhage and necrosis in the lung and sudden death in some cats. Many cats that survive this initial phase develop collateral blood supply, but histologically they have multiple small pulmonary arteries with villus endarteritis and multifocal areas with type II pneumocyte hyperplasia, which is indicative of chronic alveolar injury. The most common clinical manifestation is an asthma-like syndrome potentially from inflammatory mediators that are released by numerous eosinophils and other leukocytes that cuff affected small pulmonary arteries. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins and lymphatic vessels. These diseases include infection of cats in South America by Gurltia paralysans , infection of cats in tropical regions with Brugia spp., and infection of pulmonary vessels by Dirofilaria immitis . Cats infected with Gurltia paralysans have spinal cord damage from thrombophlebitis in the lumbar veins, associated with the presence of adult parasites in affected vessels. Brugia spp. infect lymphatic vessels and lead to secondary lymphedema. Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Lymphedema. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Lymphatic Vessels, Disturbances of Circulation, Lymphedema. Blood Vessels Disturbances of Growth Medial Hypertrophy of Pulmonary Arteries. Medial (tunica media) hypertrophy of pulmonary arteries is a disorder of cats of unknown cause (see Fig. 10-26 ); however, a response to antigens during nematode infections may be involved. Disturbances of Growth Medial Hypertrophy of Pulmonary Arteries. Medial (tunica media) hypertrophy of pulmonary arteries is a disorder of cats of unknown cause (see Fig. 10-26 ); however, a response to antigens during nematode infections may be involved. Medial Hypertrophy of Pulmonary Arteries. Medial (tunica media) hypertrophy of pulmonary arteries is a disorder of cats of unknown cause (see Fig. 10-26 ); however, a response to antigens during nematode infections may be involved. Inflammation Pulmonary Artery Thromboembolism. See the discussion on pulmonary artery thromboembolism in the section on Disorders of Dogs . Arterial Thromboembolism. Arterial thromboembolism (ATE) is defined as obstruction usually followed by infarction of arterial beds by embolic material derived from a thrombus from a distant site and in the presence of intact endothelial surface (to be distinguished from arterial thrombosis). The most common cause of ATE in cats is cardiomyopathy in which a large thrombus is formed in the enlarged left atrium. However, other conditions, such as protein-losing nephropathy/enteropathy, sepsis, DIC, and endocrinopathies, should be considered in the diagnostic workup. The fate of the infarcted area depends on the ability to establish collateral blood flow, thus bypassing the occluded artery. In cats and dogs, the most common site is the aortic trifurcation ("saddle embolus"), and the right subclavian artery is the second most common cause of ATE in cats with cardiomyopathy. Renal, splanchnic, and cerebral circulations can also be affected on occasion. In a saddle embolus, occlusion of limb(s) blood flow results in ischemic neuromyopathy of the limb(s). Grossly, distal limbs below the stifle are most severely affected, and the affected limb is often dark red to blue and edematous due to hemorrhagic ischemic necrosis. Feline Infectious Peritonitis. Feline infectious peritonitis is a severe viral infection that produces phlebitis in various organs. This lesion appears to result from deposition of immune complexes, which subsequently induce an inflammatory reaction in affected vessels (see Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11). Heartworm-Associated Respiratory Disease. Dirofilaria immitis infection in cats occasionally results in heartworm-associated respiratory disease. Cats are more susceptible than dogs to infection with Dirofilaria immitis , although many do not have adult worms or have only a few (one to four worms). Grossly, there may be a visible shaggy or roughened appearance to the large lobar arteries, especially the right caudal lobar artery. The pulmonary arteries develop villus endarteritis with medial hypertrophy (see Fig. 10-26 ). Initially, small pulmonary arteries may become embolized and infarcted, leading to small areas of hemorrhage and necrosis in the lung and sudden death in some cats. Many cats that survive this initial phase develop collateral blood supply, but histologically they have multiple small pulmonary arteries with villus endarteritis and multifocal areas with type II pneumocyte hyperplasia, which is indicative of chronic alveolar injury. The most common clinical manifestation is an asthma-like syndrome potentially from inflammatory mediators that are released by numerous eosinophils and other leukocytes that cuff affected small pulmonary arteries. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins and lymphatic vessels. These diseases include infection of cats in South America by Gurltia paralysans , infection of cats in tropical regions with Brugia spp., and infection of pulmonary vessels by Dirofilaria immitis . Cats infected with Gurltia paralysans have spinal cord damage from thrombophlebitis in the lumbar veins, associated with the presence of adult parasites in affected vessels. Brugia spp. infect lymphatic vessels and lead to secondary lymphedema. Pulmonary Artery Thromboembolism. See the discussion on pulmonary artery thromboembolism in the section on Disorders of Dogs . Arterial Thromboembolism. Arterial thromboembolism (ATE) is defined as obstruction usually followed by infarction of arterial beds by embolic material derived from a thrombus from a distant site and in the presence of intact endothelial surface (to be distinguished from arterial thrombosis). The most common cause of ATE in cats is cardiomyopathy in which a large thrombus is formed in the enlarged left atrium. However, other conditions, such as protein-losing nephropathy/enteropathy, sepsis, DIC, and endocrinopathies, should be considered in the diagnostic workup. The fate of the infarcted area depends on the ability to establish collateral blood flow, thus bypassing the occluded artery. In cats and dogs, the most common site is the aortic trifurcation ("saddle embolus"), and the right subclavian artery is the second most common cause of ATE in cats with cardiomyopathy. Renal, splanchnic, and cerebral circulations can also be affected on occasion. In a saddle embolus, occlusion of limb(s) blood flow results in ischemic neuromyopathy of the limb(s). Grossly, distal limbs below the stifle are most severely affected, and the affected limb is often dark red to blue and edematous due to hemorrhagic ischemic necrosis. Feline Infectious Peritonitis. Feline infectious peritonitis is a severe viral infection that produces phlebitis in various organs. This lesion appears to result from deposition of immune complexes, which subsequently induce an inflammatory reaction in affected vessels (see Chapters 4, 7, and 11Chapter 4Chapter 7Chapter 11). Heartworm-Associated Respiratory Disease. Dirofilaria immitis infection in cats occasionally results in heartworm-associated respiratory disease. Cats are more susceptible than dogs to infection with Dirofilaria immitis , although many do not have adult worms or have only a few (one to four worms). Grossly, there may be a visible shaggy or roughened appearance to the large lobar arteries, especially the right caudal lobar artery. The pulmonary arteries develop villus endarteritis with medial hypertrophy (see Fig. 10-26 ). Initially, small pulmonary arteries may become embolized and infarcted, leading to small areas of hemorrhage and necrosis in the lung and sudden death in some cats. Many cats that survive this initial phase develop collateral blood supply, but histologically they have multiple small pulmonary arteries with villus endarteritis and multifocal areas with type II pneumocyte hyperplasia, which is indicative of chronic alveolar injury. The most common clinical manifestation is an asthma-like syndrome potentially from inflammatory mediators that are released by numerous eosinophils and other leukocytes that cuff affected small pulmonary arteries. Foreign Parasitic Diseases. Foreign parasitic diseases important in tropical regions of the world are characterized by the presence of parasites in the lumens of veins and lymphatic vessels. These diseases include infection of cats in South America by Gurltia paralysans , infection of cats in tropical regions with Brugia spp., and infection of pulmonary vessels by Dirofilaria immitis . Cats infected with Gurltia paralysans have spinal cord damage from thrombophlebitis in the lumbar veins, associated with the presence of adult parasites in affected vessels. Brugia spp. infect lymphatic vessels and lead to secondary lymphedema. Lymphatic Vessels Disturbances of Circulation Lymphedema. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Lymphatic Vessels, Disturbances of Circulation, Lymphedema. Disturbances of Circulation Lymphedema. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Lymphatic Vessels, Disturbances of Circulation, Lymphedema. Lymphedema. See the section on Disorders of Domestic Animals , Disorders of Domestic Animals: Blood and Lymphatic Vascular Systems , Lymphatic Vessels, Disturbances of Circulation, Lymphedema. Suggested Readings Suggested Readings are available at www.expertconsult.com . Suggested Readings Amati M Venco L Roccabianca P Pericardial lymphoma in seven cats J Feline Med Surg 16 2013 507 512 24108202 Atkins C Heartworm disease Ettinger SJ Feldman EC Textbook of veterinary internal medicine ed 7 2010 Saunders St. Louis Aupperle H Marz I Ellenberger C Primary and secondary heart tumors in dogs and cats J Comp Pathol 136 2007 18 26 17270204 Borgarelli M Buchanan JW Historical review, epidemiology and natural history of degenerative mitral valve disease J Vet Cardiol 14 2012 93 101 22386588 Bowman DD Atkins CE Heartworm biology, treatment, and control Vet Clin North Am Small Anim Pract 39 2009 1127 1158 19932367 Buchanan JW Chronic valvular disease (endocardiosis) in dogs Adv Vet Sci Comp Med 21 1977 75 106 146409 Buchanan JW Patterson DF Etiology of patent ductus arteriosus in dogs J Vet Intern Med 17 2003 167 171 12683616 Burns CG Bergh MS McLoughlin MA Surgical and nonsurgical treatment of peritoneopericardial diaphragmatic hernia in dogs and cats: 58 cases (1999-2008) J Am Vet Med Assoc 242 2013 643 650 23402411 Cagle LA Epstein SE Owens SD Diagnostic yield of cytologic analysis of pericardial effusion in dogs J Vet Intern Med 28 2014 66 71 24236526 Chetboul V Charles V Nicolle A Retrospective study of 156 atrial septal defects in dogs and cats (2001-2005) J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med 53 2006 179 184 16629951 Davidson BJ Paling AC Lahmers SL Disease association and clinical assessment of feline pericardial effusion J Am Anim Hosp Assoc 44 2008 5 9 18175793 Dempsey SM Ewing PJ A review of the pathophysiology, classification, and analysis of canine and feline cavitary effusions J Am Anim Hosp Assoc 47 2011 1 11 Ferasin L Sturgess CP Cannon MJ Feline idiopathic cardiomyopathy: A retrospective study of 106 cats (1994-2001) J Feline Med Surg 5 2003 151 159 12765625 Fossum TW Miller MW Lymphedema: Etiopathogenesis J Vet Intern Med 6 1992 283 293 1432902 Fox PR Pathology of myxomatous mitral valve disease in the dog J Vet Cardiol 14 2012 103 126 22386587 Fox PR Basso C Thiene G Spontaneously occurring restrictive nonhypertrophied cardiomyopathy in domestic cats: A new animal model of human disease Cardiovasc Pathol 23 2014 28 34 24035181 Fraga Veloso G Fraga Manteiga E Trehy M Septic pericarditis and myocardial abscess in an English springer spaniel J Vet Cardiol 16 2014 39 44 24444896 Guglielmini C Pietra M Cipone M Aorticopulmonary septal defect in a German shepherd dog J Am Anim Hosp Assoc 37 2001 433 437 11563441 Kornreich BG Craven M McDonough SP Fluorescence in-situ hybridization for the identification of bacterial species in archival heart valve sections of canine bacterial endocarditis J Comp Pathol 146 2012 298 307 22030263 MacDonald K Myocardial disease: Feline Ettinger SJ Feldman EC Textbook of veterinary internal medicine ed 7 2010 Saunders St. Louis Majoy SB Sharp CR Dickinson AE Septic pericarditis in a cat with pyometra J Vet Emerg Crit Care 23 2013 68 76 McCall JW Genchi C Kramer LH Heartworm disease in animals and humans Adv Parasitol 66 2008 193 285 18486691 Meurs KM Mauceli E Lahmers S Genome-wide association identifies a deletion in the 3′ untranslated region of striatin in a canine model of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy Hum Genet 128 2010 315 324 20596727 Needle DB Sharp CR Krein SR Pathology in practice: Arteriothromboembolism J Am Vet Med Assoc 242 2013 931 933 23517204 Nelson AW Aorticopulmonary window in a dog J Am Vet Med Assoc 188 1986 1055 1058 3710894 Noden DM de Lahunta A The embryology of domestic animals: Developmental mechanisms and malformations 1985 Williams & Wilkins Baltimore Oxford EM Danko CG Fox PR Change in beta-catenin localization suggests involvement of the canonical Wnt pathway in boxer dogs with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy J Vet Intern Med 28 2014 92 101 24428316 Oyama MA Reiken S Lehnart SE Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy in boxer dogs is associated with calstabin2 deficiency J Vet Cardio 10 2008 1 10 Oyama MA Sisson DD Thomas WP Congenital heart disease Ettinger SJ Feldman EC Textbook of veterinary internal medicine ed 7 2010 Saunders St. Louis Palermo V Stafford Johnson MJ Sala E Cardiomyopathy in boxer dogs: A retrospective study of the clinical presentation, diagnostic findings and survival J Vet Cardiol 13 2011 45 55 21306968 Pion PD Kittleson MD Skiles ML Dilated cardiomyopathy associated with taurine deficiency in the domestic cat: Relationship to diet and myocardial taurine content Adv Exp Med Biol 315 1992 63 73 1387282 Schrope DP Atrioventricular septal defects: Natural history, echocardiographic, electrocardiographic, and radiographic findings in 26 cats J Vet Cardiol 15 2013 233 242 24200832 Serfass P Chetboul V Sampedrano CC Retrospective study of 942 small-sized dogs: Prevalence of left apical systolic heart murmur and left-sided heart failure, critical effects of breed and sex J Vet Cardiol 8 2006 11 18 19083332 Shaw SP Rush JE Canine pericardial effusion: Pathophysiology and cause Compendium 29 2007 400 403 17727046 Son WC Idiopathic canine polyarteritis in control beagle dogs from toxicity studies J Vet Sci 5 2004 147 150 15192342 Stern JA White SN Lehmkuhl LB A single codon insertion in PICALM is associated with development of familial subvalvular aortic stenosis in Newfoundland dogs Hum Genet 133 2014 1139 1148 24898977 Sykes JE Kittleson MD Pesavento PA Evaluation of the relationship between causative organisms and clinical characteristics of infective endocarditis in dogs: 71 cases (1992-2005) J Am Vet Med Assoc 228 2006 1723 1734 16740074 Tidholm A Jonsson L Histologic characterization of canine dilated cardiomyopathy Vet Pathol 42 2005 1 8 15657266 Van Vleet JF Ferrans VJ Myocardial diseases of animals Am J Pathol 124 1986 98 178 3524254 Van Vleet JF Ferrans VJ Weirich WE Pathologic alterations in hypertrophic and congestive cardiomyopathy of cats Am J Vet Res 41 1980 2037 2048 7194009 Winter RL Sedacca CD Adams A Aortic thrombosis in dogs: Presentation, therapy, and outcome in 26 cases J Vet Cardiol 14 2012 333 342 22591640 Yaeger MJ Mullin K Ensley SM Myocardial toxicity in a group of greyhounds administered ractopamine Vet Pathol 49 2012 569 573 21997565 Yamamoto S Hoshi K Hirakawa A Epidemiological, clinical and pathological features of primary cardiac hemangiosarcoma in dogs: A review of 51 cases J Vet Med Sci 75 2013 1433 1441 23811814 Zhikun G Liping M Kang G Structural relationship between microlymphatic and microvascular blood vessels in the rabbit ventricular myocardium Lymphology 46 2013 193 201 25141462 E-Appendix 10-1 Necropsy Assessment of Heart and Vascular Structures Occasionally, normal features in animal hearts can be misinterpreted as lesions. The epicardial lymphatic vessels, especially in cattle, can appear as prominent white streaks that could be interpreted as areas of necrosis. The septal cusp of the tricuspid valve in dogs is normally rather tightly attached to the ventricular septum. In young ruminants up to 2 to 3 weeks of age, the ductus arteriosus and foramen ovale can be probed patent, but unless the openings are large, no significant shunting of blood is likely to occur during life. The overall shape of normal hearts can vary from the elongated conical profile in the horse to the somewhat rounded shape in the dog. Cardiac weights vary greatly among species and breeds; pigs have relatively small hearts (approximately 0.3% of body weight), and dogs have relatively large hearts (from 0.75% of body weight in nonathletic breeds to 1.25% in athletic breeds). Postmortem alterations in hearts and vascular structures must be recognized and correctly interpreted. Rigor mortis occurs in myocardium much as in skeletal muscles and produces contracted, rigid ventricular walls, which empties the more muscular left ventricle. After rigor passes, the ventricular walls relax. Postmortem blood clotting produces red ("currant jelly") clots in the atria, right ventricle, and large vessels at the base of the heart. Postmortem blood clots are found in these anatomic structures because they lack contractile elements (large vessels) or have less muscle mass (atria, right ventricle) to undergo contraction during rigor mortis. In postmortem evaluations of the heart, it is important to note the presence (or absence) of blood clots in the ventricles and their appearance ("currant jelly" vs. "chicken fat") ( E-Fig. 10-5 ). Under normal conditions, because of its larger chamber volume and thinner walls, a blood clot will be found in the right ventricle, whereas little or no blood clot will be found in the left ventricle because of its smaller chamber volume and thicker walls. Animals with prolonged heart disease may lack adequate glycogen reserves in cardiac myocytes. As a result, the ventricular chambers may fail to contract during rigor mortis, allowing a blood clot to form in the left ventricle. Occasionally, pale "chicken fat" clots that contain reduced numbers of erythrocytes form in animals with severe anemia, systemic inflammatory disease, leukemia, or after prolonged agonal periods. Horses more often have pale clots because of a rapid erythrocyte sedimentation rate termed rouleaux formation. Postmortem lysis of erythrocytes followed by imbibition of hemoglobin produces diffuse red staining of the endocardium and epicardium and simulates the appearance of hemorrhage. Usually 12 to 24 hours after death, erythrocytes lyse, and the resultant imbibition of hemoglobin produces red discoloration of the normally white intima of blood vessels. Postmortem clotting must be differentiated from thrombosis. Postmortem clots, found in veins and large elastic arteries as red "currant jelly" type or occasionally as pale "chicken fat" type, are readily removed by traction or gentle flushing at necropsy, in contrast to thrombi, which are adherent. Postmortem contraction of muscular arteries because of rigor mortis extrudes blood. Microscopically, these muscular arteries are devoid of blood, and their internal elastic lamina is wavy in cross sections of the contacted vessel. Other potentially misleading findings at necropsy of young dogs and horses include diffuse or patchy myocardial pallor that subsequently fails to correlate with any detectable microscopic alterations. Also, the intracardiac injection of euthanasia solution and other substances can cause hemopericardium and myocardial pallor from tissue dissolution and from crystalline deposits at the site of solution deposition ( E-Fig. 10-6 ). E-Appendix 10-2 Examination of the Cardiovascular and Lymphatic Systems at Necropsy and Tissue Sampling for Histopathologic Evaluation It has been stated that there are as many ways to open and evaluate the heart as there are pathologists! Your goal is to use a consistent method, which allows examination of the entire heart and its associated vascular structures. 1. First evaluate the pluck—both in situ and then after removal. If possible, carefully open the pericardial sac and observe the quantity and quality of the pericardial fluid. If the fluid appears abnormal, now is the time to take samples for bacterial isolation. 2. Remove the heart from the lungs and place the heart so that the auricles are facing you. This is an excellent time to look at the pulmonary arteries for thrombi. Once the heart and lungs are separated, it can be difficult to locate a thrombus. Note: The more vascular structures you leave attached to the heart, the easier you will find dissection. 3. Open the right atrium and remove any clotted blood using a transverse incision. 4. Assess the tricuspid valve by looking down into the lumen of the right ventricle. 5. Open the right ventricle. Start by cutting through the atrioventricular valve nearest the septum. Then with either scissors or a knife, using the ventricular septum as your guide, follow the septal wall to the pulmonary artery. 6. Evaluate the tricuspid and pulmonic valves, thickness of the right ventricle, and endocardium. 7. Open the left auricle in the same manner as the right auricle. Remove blood clots and examine the mitral valve. Now is the time to evaluate the functionality of the mitral valve. By using water (from the tap), you can evaluate whether or not the mitral valve closes completely. This is also the perfect time to look for a ruptured chordae tendineae. 8. By starting midway between the left ventricle, insert your knife and cut to the apex. Remove blood, and examine the mitral valve. Then make a "window" and exit out the aortic outflow. Note: This is the time when people usually stop—that is, before they examine the aortic valves and outflow. Do not make this mistake. This is an important area that needs to be carefully examined. 9. Examine the aortic valves, papillary muscles, endocardium, and mitral valve. 10. Measurements can be made at this time. By using string, you can measure the diameter of the aortic valve and pulmonic valves. They should be roughly similar in length. Measure the left and right ventricular free wall. Be sure to consistently measure at the same place and not include the thickness of the papillary muscles. Remember that the normal measurement should be roughly 3 : 1 for left to right measurement. Whatever technique you decide to use, be consistent . Always remember to examine the following: pericardial sac and contents, epicardial surface, and myocardium—left, right, and papillary muscles, valves (all four), endocardium, pulmonary and aortic outflow, and intimal surfaces. If you do this, you will be a successful cardiac pathologist. Now all you have to do is know what abnormalities are significant. After fixation for at least 24 hours, tissue samples should be removed from standard heart sites for histopathologic evaluation (see E-Fig. 10-7 ). If gross lesions are apparent, representative samples should be taken of those lesions. In small-sized hearts, the fixed specimen is bisected perpendicular to the long axis of the septum to provide a sample for histopathologic study that includes sections of all four chambers and interventricular and interatrial septa. Special sampling procedures are available for comprehensive evaluation of the cardiac conduction tissue. E-Appendix 10-3 Clinical Diagnostic Procedures The array of diagnostic tools available to the veterinarian to detect and evaluate changes in cases of cardiac disease has increased dramatically in the past several decades as many procedures have been adapted from use in human medicine. Procedures include physical examination, radiography, electrocardiography, echocardiography, angiocardiography, and cardiac catheterization. Cardiac myocardial damage can be detected by increased activity of serum enzymes and isoenzymes, such as creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), troponin T (TnT), troponin I (TnI), and aspartate aminotransferase (AST), which are specifically leaked from injured cardiac muscle cells. Also, increased plasma concentrations of plasma natriuretic peptides (A type [atrial] ANP and B type [brain BNP) may indicate cardiac disease. These hormones are synthesized and released by cardiac muscle cells in increased amounts during cardiac dysfunction. In research studies of cardiac diseases in animals, endomyocardial biopsies have been used to assess the light microscopic and ultrastructural alterations during the course of the disease.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2428103/

A Coupled Equilibrium Shift Mechanism in Calmodulin-Mediated Signal Transduction

Summary We used nuclear magnetic resonance data to determine ensembles of conformations representing the structure and dynamics of calmodulin (CaM) in the calcium-bound state (Ca 2+ -CaM) and in the state bound to myosin light chain kinase (CaM-MLCK). These ensembles reveal that the Ca 2+ -CaM state includes a range of structures similar to those present when CaM is bound to MLCK. Detailed analysis of the ensembles demonstrates that correlated motions within the Ca 2+ -CaM state direct the structural fluctuations toward complex-like substates. This phenomenon enables initial ligation of MLCK at the C-terminal domain of CaM and induces a population shift among the substates accessible to the N-terminal domain, thus giving rise to the cooperativity associated with binding. Based on these results and the combination of modern free energy landscape theory with classical allostery models, we suggest that a coupled equilibrium shift mechanism controls the efficient binding of CaM to a wide range of ligands. Introduction Calmodulin (CaM) is a ubiquitous protein that plays a key role in calcium-mediated signal transduction. It has been shown that CaM binds and regulates more than 300 target proteins and that its structural plasticity is crucial for enabling its interaction with the diverse partners ( Ikura and Ames, 2006 ). CaM consists of two homologous domains, the N-terminal domain (NTD) and the C-terminal domain (CTD), which are separated by an interdomain linker ( Figures 1 A–1D). Each domain is composed of two EF-hand helix-loop-helix motifs. These motifs occupy a "closed" conformation in the calcium-free (apo-CaM) state, in which the helices in the two pairs of EF hands are closely packed together. Ca 2+ ligation during a calcium spike leads to an "open" state (Ca 2+ -CaM) in which significant changes in conformation in each EF-hand pair result in the exposure of a hydrophobic cleft in both domains ( Zhang et al., 1995 , Ikura, 1996 ). The exposure of this cleft increases the affinity of CaM for a wide range of binding partners ( Osawa et al., 1998 , Crivici and Ikura, 1995 , Bayley et al., 1996 ). Figure 1 Structural and Dynamic Properties of the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK States (A and B) Ribbon diagram of the crystal structures of Ca 2+ -CaM (A) and CaM-MLCK (B). (C and D) Comparison between the solution structures of the two domains (NTD in magenta and CTD in red) of Ca 2+ -CaM and the corresponding ones in CaM-MLCK (blue). The alignment was optimized for residues 29–54 and 101–130 in NTD (C) and CTD (D), respectively. (E–G) Comparison of experimental and calculated S 2 order parameters. Backbone S 2 order parameters are shown in black, side-chain S 2 order parameters in red. (E and F) NTD and CTD of Ca 2+ -CaM. (G) CaM-MLCK. Ensemble averages and standard deviations are shown. (H–J) Comparison of experimental and calculated RDCs. (H and I) NTD and CTD of Ca 2+ -CaM. (J) CaM-MLCK. Ensemble averages and standard deviations are shown. The linker between the NTD and CTD also plays a key role in the function of CaM. Although this linker is seen as a long exposed helix in the crystal structure of Ca 2+ -CaM ( Wilson and Brunger, 2000 ; Figure 1 A), solution-state nuclear magnetic resonance (NMR) relaxation measurements ( Barbato et al., 1992 ) have revealed that its central region is highly flexible in the Ca 2+ -CaM state. The importance of this flexibility in binding becomes apparent on examining the structures of Ca 2+ -CaM in complex with target peptides such as that derived from myosin light chain kinase (CaM-MLCK) (for a review, see Hoeflich and Ikura, 2002 ). In most structures of complexes, the NTD and CTD are effectively clamped together around a helical peptide ( Figure 1 B), although more recent structural studies have uncovered a variety of other binding modes (reviewed in Hoeflich and Ikura, 2002 ). The mechanisms of conformational transitions that accompany the process of complex formation by proteins have been the subject of intense experimental and theoretical research for several decades ( Monod et al., 1965 , Koshland et al., 1966 , Perutz et al., 1998 , McCammon et al., 1976 , Gerstein et al., 1994 , Bui and McCammon, 2006 ). In recent years, a dynamic population shift model has been proposed according to which the structural transitions observed during complex formation can be described in terms of a variation in the equilibrium distributions of pre-existing populations that interchange dynamically in the absence of a binding partner ( Kern and Zuiderweg, 2003 , Boehr et al., 2006 , Vendruscolo and Dobson, 2006 , Faralado-Gómez and Roux, 2007 , Arora and Brooks, 2007 , Henzler-Wildman et al., 2007 ). In this model, consistent with the statistical view of protein folding ( Bryngelson et al., 1995 ), a protein continuously samples a range of substates whose statistical weights are redistributed upon binding. In the case of CaM, NMR relaxation data indicate that in the absence of bound Ca 2+ , the CTD exists in a dynamic equilibrium between the closed apo state and an open conformation that is similar to that of Ca 2+ -CaM ( Malmendal et al., 1999 ). In this paper, we describe the determination of ensembles of structures representing the equilibrium fluctuations of the free and bound states of CaM. In this protocol, experimental NMR order parameters (S 2 ) are used together with interproton distances derived from nuclear Overhauser effects (NOEs) as restraints in molecular dynamics simulations ( Lindorff-Larsen et al., 2005 , Richter et al., 2007 ). The method, as implemented here, allows extensive interdomain movements while reproducing accurately fluctuations on the picosecond to nanosecond timescale within the individual domains (see the Experimental Procedures ). It combines the strength of NMR spectroscopy to provide measurements of structural and dynamic features at atomic level with the ability of molecular dynamics simulations to generate a wide range of conformations ( Lindorff-Larsen et al., 2005 , Richter et al., 2007 ). We apply this approach to determine the ensembles of structures representing the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK states and characterize the equilibrium population shifts in CaM upon binding. Our results demonstrate that conformational features of the CaM-MLCK state are already present, although with a low statistical weight, in the ensemble of conformations representing the Ca 2+ -CaM state. We show that a population shift upon binding, which leads to much larger statistical weights for the bound-like conformations, is made possible through a specific organization of structural fluctuations that gives rise to correlated motions. We thus discuss a coupled equilibrium shift mechanism in which the ligand binds first to the CTD domain, and this event facilitates the further binding to the NTD domain. Results and Discussion Determination and Validation of Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK Structural Ensembles Simulated annealing cycles were used to generate multiple ensembles, each of 16 conformations, compatible with the experimental S 2 values and representing the Ca 2+ -CaM and the CaM-MLCK states ( Figures 1 E–1G). The quality of these ensembles was assessed by using them to predict residual dipolar couplings (RDCs). The calculated ensemble-averaged Q-factors (see the Experimental Procedures ) in the Ca 2+ -CaM state are 0.27 ± 0.1% and 0.30 ± 0.1% for the NTD and CTD, respectively ( Figures 1 H and 1I). This Q-factor for the NTD is actually better than that calculated from the high-resolution crystal structure ( Wilson and Brunger, 2000 ) (0.40%), while that of the CTD is comparable (0.25%). The Q-factor calculated from the N-HN RDCs of the CaM-MLCK ensemble is 0.28 ± 0.1%, which is essentially the same as that for the crystal structure of the CaM-MLCK complex (0.27%) ( Meador et al., 1992 ; Figure 1 J). To assess the heterogeneity of the structural ensembles, we determined the distribution of the root mean square (RMS) distances of the calculated ensembles from the RDC-refined structures of the NTD and CTD in Ca 2+ -CaM ( Chou et al., 2001 ) and the X-ray structures of Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK, respectively ( Wilson and Brunger, 2000 , Meador et al., 1992 ; see Figures S1 A–S1F in the Supplemental Data available with this article online). The structures in the Ca 2+ -CaM ensembles have, on average, a large RMS deviation from the X-ray structure ( Wilson and Brunger, 2000 ), 12.3 ± 3.1 à ( Figure S1 A), as a consequence of the central linker connecting the NTD and CTD being highly flexible in solution. Indeed, since in our molecular dynamics simulations we restrain the motion within the molecular frame of the individual domains without interfering with their tumbling in solution, the calculated structures span a range of interdomain conformations that can deviate significantly from that observed in a crystalline environment ( Figures 2 A and 2B). By contrast, for the individual domains, the RMS deviation from the RDC-refined solution structures ( Chou et al., 2001 ) is on average only 1.4 ± 0.3 and 1.8 ± 0.3 à for the NTD and CTD, respectively ( Figures S1 B and S1C). In the case of the CaM-MLCK ensemble, despite the conformational heterogeneity enforced through the S 2 restraints, the deviation of the entire complex from its crystalline counterpart ( Meador et al., 1992 ) is on average only 1.5 ± 0.3 à ( Figure S1 D). Therefore, through annealing cycles and ensemble-averaged simulations, NOEs and S 2 restraints allow heterogeneous structural ensembles to be generated whose RMS deviations from the X-ray structure and the RDC-refined solution structures are very low. Figure 2 Structural Ensembles and Analysis of Their Intradomain Properties (A and B) Ensemble of structures (PDB code: 2K0E ) representing the Ca 2+ -CaM state. Structures are aligned according to their NTD domains (magenta) and CTD domains (red), respectively. (C) Ensemble of structures (PDB code: 2K0F ) representing the CaM-MLCK state. The ligand is shown in green. (D) Distribution of interhelical angles in the ensembles of Ca 2+ -CaM (red) and CaM-MLCK (blue), respectively. Interhelical angles in the RDC-refined solution structure of Ca 2+ -CaM and the X-ray structure of CaM-MLCK are indicated by dashed red and blue lines, respectively, and are shown to be close to the average values obtained through the calculations presented here. These results indicate that the protocol used here provides structural ensembles that describe accurately the conformations presents in the Ca 2+ -CaM and the CaM-MLCK states. Moreover, we have also shown that the quality of the Ca 2+ -CaM ensemble is superior to that of ensembles generated with NOEs alone, or derived from classical molecular dynamics simulations or the superposition of the first 100 normal modes (see the Supplemental Data ). Motions of the EF Hands in the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK States Substantial variations exist in the orientations of the helical axes in the structures of the Ca 2+ -CaM ensembles. Interhelical angles, which are commonly used as indicators of structural changes between the open and closed states of CaM ( Nelson and Chazin, 1998 , Chou et al., 2001 ), fluctuate around their average orientations with amplitudes whose average and maximal values are 8° and 24°, respectively ( Figure 2 D); this latter value is consistent with estimates for the maximal amplitudes of helical motion of 20° ( Chou et al., 2001 ). We observed slightly reduced average values (5°) for the fluctuations of the interhelical angles within the CaM-MLCK complex. In accord with the structural differences observed between the previously determined structures of Ca 2+ -CaM ( Chou et al., 2001 ) and CaM-MLCK ( Meador et al., 1992 ), the average interhelical angles between helices I-II, III-IV, and V-VI are significantly different in the free and the bound states. The present study reveals that, despite the structural differences between the Ca 2+ -CaM and the CaM-MLCK states, interhelical angles are observed in the Ca 2+ -CaM state that correspond to those present in the most populated structures in the CaM-MLCK state, albeit with a low statistical weight. In the Ca 2+ -CaM ensemble there are few structures (less than 1%) in which the NTD interhelical angles (I-II and III-IV) are similar to those in the CaM-MLCK state (i.e., they deviate by less than 5° from the corresponding angles in the most populated structures of CaM-MLCK) ( Table 1 ). By contrast, significantly more Ca 2+ -CaM structures (about 17%) have their EF-hands in the CTD as open as in the CaM-MLCK complex. These data indicate that structural fluctuations in the NTD and CTD of Ca 2+ -CaM allow the occasional sampling of conformations that are very similar to the predominant ones in CaM-MLCK, particularly in the CTD. However, the likelihood of the EF-hands in both domains being simultaneously in a complex-like conformation is lower than 1%. Table 1 Percentage of Ca 2+ -CaM Structures with Properties Characteristic of the CaM-MLCK Ensemble Property NTD a CTD b NTD + CTD c Interhelical angles (±5°) 0.4% 17.4% 0.1% CαRMSD (±0.25 à ) 0.3% 2.5% 0.0% Helical axes disposition (±10°) 0.5% 13.2% 0.3% Methionine distances (±0.7 à ) 0.6% 8.5% 0.0% a Property present in the NTD. b Property present in the CTD. c Property present in both domains concomitantly. The table provides the percentage of structures in the Ca 2+ -CaM ensemble with properties within the specified range from the predominant value of the CaM-MLCK ensemble. Intradomain Overlap between the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK States We monitored the distributions of a range of other structural properties in the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK ensembles to verify in further detail their intradomain overlap. We performed a rigid body alignment of helices II and III in the NTD with respect to the RDC-refined solution structure of Ca 2+ -CaM as well as the crystal structure of CaM-MLCK to accentuate the differences between the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK ensembles (see the Supplemental Data ). In Figures 3 A and 3B, we show values of the Cα RMSDs of the nonaligned helices I and IV from their counterparts in the solution structure of Ca 2+ -CaM and the crystal structure of CaM-MLCK. Analysis of the Ca 2+ -CaM ensemble ( Figure 3 A) indicates that 56% of the conformations have helices I and IV within 2 à of their positions in the solution structure (conformations below the black dashed line). In the remaining structures of the ensemble, however, helices I and IV have a significantly higher Cα RMSD unbound , reaching values of up to 5 à . Importantly, in some of the conformations that have high values of Cα RMSD unbound , helices I and IV are found to deviate by less than 2 à from the structure they adopt in the complex (left of the red dashed line). This region of the projection (above the black dashed line and left of the red dashed line) also accommodates the structures most populated in the bound state ( Figure 3 B). Consequently, about 0.3% of the NTD conformations in the Ca 2+ -CaM ensemble correspond to those of highest probability in the CaM-MLCK ensemble ( Table 1 ). The analysis for the CTD shows similar results for helices V and VIII when helices VI and VII are aligned ( Figure S5 ). In the case of the CTD, however, the structural differences between the two ensembles are significantly smaller, and there is an almost 10-fold increased probability of finding structures in the Ca 2+ -CaM ensemble with low Cα RMSD relative to the complex. Figure 3 Comparison of Structural Properties in the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK Ensembles After superimposing the members of both ensembles on the crystal structure of CaM-MLCK as described in the Supplemental Data , properties of the nonaligned helices were determined and compared. (A) Probability distribution of the RMSD of helices I and IV with respect to the RDC-refined solution structure of Ca 2+ -CaM (CαRMSD unbound ) and the crystal structure of CaM-MLCK (CαRMSD bound ) in the Ca 2+ -CaM ensemble. (B) The probability distribution of the RMSD in the CaM-MLCK ensemble is added to the probability distribution shown in A. Projection of the third (green) and fourth (blue) modes of motion in the NTD on CαRMSD unbound and CαRMSD bound , respectively. (C and E) Probability distributions of the positions of helix I and helix VIII, respectively, in the Ca 2+ -CaM ensemble. (D and F) Probability distributions of the positions of helix I and helix VIII in CaM-MLCK ensembles are added to the ones shown in C and E, respectively. We also monitored the spatial orientation of the helical axes ( Figures 3 C–3F), the distributions of intermethionine distances ( Figure 4 ), and the tertiary structure of each EF-hand ( Figure S6 ) to compare the structural characteristics of the ensembles that we determined. Consistent with the analysis described above, a few conformations of the Ca 2+ -CaM ensemble have structural properties that are close to the ones found for the majority of structures in the CaM-MLCK ensemble. Figure 4 Distribution of Methionine Distances in the Ensembles of Ca 2+ -CaM, Red, and CaM-MLCK, Blue Correlated Intradomain Motions in the Ca 2+ -CaM State Leading Toward the CaM-MLCK State To obtain insight into the type of motions that bring Ca 2+ -CaM close to the CaM-MLCK state, we performed a detailed analysis of the dynamics of the Ca 2+ -CaM state. The extent to which backbone motions are correlated in the Ca 2+ -CaM ensemble is illustrated in Figure 5 , and the cross-correlation matrix ( Figure 5 A) clearly indicates that the changes in backbone structure are achieved by correlated rigid body motions. Helices I and IV in the NTD, as well as V and VIII in the CTD, move in a concerted way. By contrast, helices I(V) and IV(VIII) exhibit anticorrelated motions with helices II(VI) and III(VII), respectively, a finding that is consistent with their involvement in hinge or scissor-like motions. The correlation in rigid body backbone motions, which is more pronounced in the CTD, result in a concerted "opening" and "closing" of the EF-hands in the two domains ( Figures 5 B and 5C). Figure 5 Analysis of the Backbone Motions in Ca 2+ -CaM (A) Correlated backbone motions. The position of the helices and the Ca 2+ binding sites are indicated by magenta and cyan bars, respectively. (B and C) Correlation in interhelical angles (ρ CTD = 0.65 and ρ NTD = 0.15) ( P 85°), which is necessary for binding, is usually found in conformations that have a large RMS deviation from the crystal structure of CaM-MLCK ( Figure 6 F). These results suggest that a correlation is present, at least in the CTD, between the occasional adoption, in the absence of a ligand, of intradomain and interdomain conformational properties characteristic of the CaM-MLCK state. However, the coupling between interdomain and intradomain motions is not very tight, with large interhelical angles observable in both domains within conformations of the Ca 2+ -CaM ensemble that are not compact and that have a significant RMS deviation from the crystal structure of CaM-MLCK (green line Figures 6 E–6H). Interdomain Coupling of Intradomain Motions Finally, we investigated how intradomain motions are coupled between the domains. The cross-correlation matrix shown in Figure 5 A clearly indicates that concerted motions occur also across domains, not just within each domain. Helices I, IV, V, and VII exhibit correlated motions, but they are predominantly anticorrelated with the motions of the other helices. In particular, motions in the interdomain region, including helices IV and V as well as the short interdomain linker, are strongly coupled. As both of these helices are linked in their motions with the other helices within the respective domains (see above), the interdomain regions appears to play a key role in the communication between the NTD and CTD. A large body of experimental evidence on apo- and ligand-bound CaM suggests a structural coupling between the two domains ( Martin et al., 1992 , Sorensen and Shea, 1998 , Yazawa et al., 1992 ). Although it has not been possible to determine precisely whether, and to what extent, initial binding of a target protein or peptide by the CTD enhances the affinity for binding by the NTD ( Crothers and Metzger, 1972 ), the linked thermodynamics of Ca 2+ and ligand binding makes cooperative target binding highly likely. It appears, therefore, that altering the distribution of structural properties in one domain upon binding is capable of affecting those in the other domain. To test this possibility, the structure for Ca 2+ -CaM in complex with the N-terminal portion of the CaM-binding domain of the plasma membrane calcium pump, C20W ( Elshorst et al., 1999 ), was analyzed. In this case, the CTD of Ca 2+ -CaM binds to C20W with no detectable contacts between C20W and the NTD. As expected, the interhelical angles in the CTD are consistent with those of a bound structure (angles V-VI and VII-VII are 87 ± 3° and 104 ± 5°, respectively). Interestingly, the interhelical angles, I-II and III-IV, in the NTD are also very large (112 ± 6° and 98 ± 6°, respectively). Indeed, these latter values are among the largest found in any structures of CaM in complex with a protein or peptide, despite the fact that the NTD is not detectably involved in the binding with C20W. The structural correlations that we observed between the two domains in the Ca 2+ -CaM ensemble provide a structural basis for a variety of experimental observations that indicate interdomain communication in CaM. The coupling between the two domains is of statistical nature and is strongly dependent on the asymmetry in the structure and dynamics of the NTD and CTD. Sequential Population Shift upon Substrate Binding Our results show that Ca 2+ -CaM is in dynamic equilibrium with a series of complex-like states. Because there is fast exchange between substates and a high association rate, one may assume that ligand binding occurs by an equilibrium shift mechanism. Hence, the substrates may in principle bind to Ca 2+ -CaM conformations that are simultaneously complex-like in both domains. However, this type of conformation is sampled very rarely, because Ca 2+ -CaM is not completely symmetric and the CTD is more finely tuned than the NTD to adopt conformations resembling those normally populated by CaM-MLCK. Therefore, our analysis shows in structural terms why MLCK binding is far more likely to take place at the CTD prior to binding to the NTD. These results are strongly supported by the available biophysical evidence that shows that the "wrap-around" interactions are initiated by the binding of the CTD ( Liu et al., 2006 ). We have shown that structural changes are not only correlated within the two domains of Ca 2+ -CaM but also between them. Consequently, the population shift induced by initial target binding at the CTD will alter the equilibrium population of unbound conformations within the NTD, such that new substates become accessible and complex-like conformations are more frequently populated. Thus, the initial binding of the ligand by the CTD changes the free energy landscape of the NTD in such a way that substates necessary for ligand binding by the NTD are more readily accessible. Versatility and Efficiency in Ligand Binding The intradomain and interdomain structural variability of CaM provides the basis for the coupling between Ca 2+ binding and exposure of hydrophobic residues, both essential factors determining the ability of CaM to bind to its targets. This type of versatility is made possible through the presence of a flexible linker connecting the two domains as well as a structural and dynamical asymmetry within and between these two domains. The approach adopted in this study has enabled us to characterize in great detail both the structural and dynamical differences between the two domains and to reveal that large amplitude modes of motion have different structural effects in the NTD and CTD and create a high versatility and specificity for binding to a variety of substrates. Creating versatility by introducing asymmetry in duplicated motifs may, in principle, come at the expense of a reduced efficiency to bind a specific ligand. In the case of CaM, however, we have been able to show that the principal dynamic modes in the Ca 2+ -CaM state are essential to direct efficiently the sampling of the conformational space toward complex-like substates. In the CTD, it is the first mode that leads to CaM-MLCK-like substates, whereas the third mode has the same effect in the NTD. Overall, our data indicate that the design of this protein makes it possible to achieve structural variability without reducing significantly the efficiency in binding target proteins. Coupled Equilibrium Shifts on a Dynamic Energy Landscape Our results suggest that CaM binds to different targets through a mechanism of "coupled equilibrium shifts" ( Figure 9 ). Preferential prebinding of a target to a high-affinity substate of one of the domains—the CTD in the case of MLCK—shifts the equilibrium population in this domain and promotes the progression of the binding reaction along a particular channel on the free energy landscape. Other targets that bind different substates of Ca 2+ -CaM will promote progressions along different channels on this landscape. In this view, initial binding to one domain induces a shift in the free energy landscape, resulting in an increased population of substates in the other domain that have a high affinity for the ligand. Therefore, the binding to one domain effectively facilitates the subsequent binding to the other domain. This view is consistent with a previously described model of CaM binding ( Bayley et al., 1996 , Liu et al., 2006 , Slaughter et al., 2007 ), considering it within the concept of a dynamic energy landscape of a protein ( Faralado-Gómez and Roux, 2007 , Arora and Brooks, 2007 , Henzler-Wildman et al., 2007 ) and related to mechanisms of binding and conformational change that have been proposed for other proteins ( Boehr et al., 2006 ). The mechanism of coupled equilibrium shifts allows rationalizing the remarkable characteristic of many proteins to combine high versatility with high efficiency. Figure 9 Free Energy Landscape of CaM Illustrating the Coupled Equilibrium Shift Mechanism Based on our findings and previous experimental data ( Malmendal et al., 1999 ), we suggest that the different states of CaM are in a dynamic equilibrium and, in particular, that shifts in the equilibrium are coupled between the two domains. The binding of Ca 2+ ions initially shifts the equilibrium from the apo to the holo state (Ca 2+ -CaM). Binding of the MLCK ligand takes place first at the CTD, which assumes the bound conformation. This event increases the likelihood of sampling high-affinity substates in NTD (highlighted in yellow), which eventually leads to binding and an equilibrium shift in this domain. Determination and Validation of Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK Structural Ensembles Simulated annealing cycles were used to generate multiple ensembles, each of 16 conformations, compatible with the experimental S 2 values and representing the Ca 2+ -CaM and the CaM-MLCK states ( Figures 1 E–1G). The quality of these ensembles was assessed by using them to predict residual dipolar couplings (RDCs). The calculated ensemble-averaged Q-factors (see the Experimental Procedures ) in the Ca 2+ -CaM state are 0.27 ± 0.1% and 0.30 ± 0.1% for the NTD and CTD, respectively ( Figures 1 H and 1I). This Q-factor for the NTD is actually better than that calculated from the high-resolution crystal structure ( Wilson and Brunger, 2000 ) (0.40%), while that of the CTD is comparable (0.25%). The Q-factor calculated from the N-HN RDCs of the CaM-MLCK ensemble is 0.28 ± 0.1%, which is essentially the same as that for the crystal structure of the CaM-MLCK complex (0.27%) ( Meador et al., 1992 ; Figure 1 J). To assess the heterogeneity of the structural ensembles, we determined the distribution of the root mean square (RMS) distances of the calculated ensembles from the RDC-refined structures of the NTD and CTD in Ca 2+ -CaM ( Chou et al., 2001 ) and the X-ray structures of Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK, respectively ( Wilson and Brunger, 2000 , Meador et al., 1992 ; see Figures S1 A–S1F in the Supplemental Data available with this article online). The structures in the Ca 2+ -CaM ensembles have, on average, a large RMS deviation from the X-ray structure ( Wilson and Brunger, 2000 ), 12.3 ± 3.1 à ( Figure S1 A), as a consequence of the central linker connecting the NTD and CTD being highly flexible in solution. Indeed, since in our molecular dynamics simulations we restrain the motion within the molecular frame of the individual domains without interfering with their tumbling in solution, the calculated structures span a range of interdomain conformations that can deviate significantly from that observed in a crystalline environment ( Figures 2 A and 2B). By contrast, for the individual domains, the RMS deviation from the RDC-refined solution structures ( Chou et al., 2001 ) is on average only 1.4 ± 0.3 and 1.8 ± 0.3 à for the NTD and CTD, respectively ( Figures S1 B and S1C). In the case of the CaM-MLCK ensemble, despite the conformational heterogeneity enforced through the S 2 restraints, the deviation of the entire complex from its crystalline counterpart ( Meador et al., 1992 ) is on average only 1.5 ± 0.3 à ( Figure S1 D). Therefore, through annealing cycles and ensemble-averaged simulations, NOEs and S 2 restraints allow heterogeneous structural ensembles to be generated whose RMS deviations from the X-ray structure and the RDC-refined solution structures are very low. Figure 2 Structural Ensembles and Analysis of Their Intradomain Properties (A and B) Ensemble of structures (PDB code: 2K0E ) representing the Ca 2+ -CaM state. Structures are aligned according to their NTD domains (magenta) and CTD domains (red), respectively. (C) Ensemble of structures (PDB code: 2K0F ) representing the CaM-MLCK state. The ligand is shown in green. (D) Distribution of interhelical angles in the ensembles of Ca 2+ -CaM (red) and CaM-MLCK (blue), respectively. Interhelical angles in the RDC-refined solution structure of Ca 2+ -CaM and the X-ray structure of CaM-MLCK are indicated by dashed red and blue lines, respectively, and are shown to be close to the average values obtained through the calculations presented here. These results indicate that the protocol used here provides structural ensembles that describe accurately the conformations presents in the Ca 2+ -CaM and the CaM-MLCK states. Moreover, we have also shown that the quality of the Ca 2+ -CaM ensemble is superior to that of ensembles generated with NOEs alone, or derived from classical molecular dynamics simulations or the superposition of the first 100 normal modes (see the Supplemental Data ). Motions of the EF Hands in the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK States Substantial variations exist in the orientations of the helical axes in the structures of the Ca 2+ -CaM ensembles. Interhelical angles, which are commonly used as indicators of structural changes between the open and closed states of CaM ( Nelson and Chazin, 1998 , Chou et al., 2001 ), fluctuate around their average orientations with amplitudes whose average and maximal values are 8° and 24°, respectively ( Figure 2 D); this latter value is consistent with estimates for the maximal amplitudes of helical motion of 20° ( Chou et al., 2001 ). We observed slightly reduced average values (5°) for the fluctuations of the interhelical angles within the CaM-MLCK complex. In accord with the structural differences observed between the previously determined structures of Ca 2+ -CaM ( Chou et al., 2001 ) and CaM-MLCK ( Meador et al., 1992 ), the average interhelical angles between helices I-II, III-IV, and V-VI are significantly different in the free and the bound states. The present study reveals that, despite the structural differences between the Ca 2+ -CaM and the CaM-MLCK states, interhelical angles are observed in the Ca 2+ -CaM state that correspond to those present in the most populated structures in the CaM-MLCK state, albeit with a low statistical weight. In the Ca 2+ -CaM ensemble there are few structures (less than 1%) in which the NTD interhelical angles (I-II and III-IV) are similar to those in the CaM-MLCK state (i.e., they deviate by less than 5° from the corresponding angles in the most populated structures of CaM-MLCK) ( Table 1 ). By contrast, significantly more Ca 2+ -CaM structures (about 17%) have their EF-hands in the CTD as open as in the CaM-MLCK complex. These data indicate that structural fluctuations in the NTD and CTD of Ca 2+ -CaM allow the occasional sampling of conformations that are very similar to the predominant ones in CaM-MLCK, particularly in the CTD. However, the likelihood of the EF-hands in both domains being simultaneously in a complex-like conformation is lower than 1%. Table 1 Percentage of Ca 2+ -CaM Structures with Properties Characteristic of the CaM-MLCK Ensemble Property NTD a CTD b NTD + CTD c Interhelical angles (±5°) 0.4% 17.4% 0.1% CαRMSD (±0.25 à ) 0.3% 2.5% 0.0% Helical axes disposition (±10°) 0.5% 13.2% 0.3% Methionine distances (±0.7 à ) 0.6% 8.5% 0.0% a Property present in the NTD. b Property present in the CTD. c Property present in both domains concomitantly. The table provides the percentage of structures in the Ca 2+ -CaM ensemble with properties within the specified range from the predominant value of the CaM-MLCK ensemble. Intradomain Overlap between the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK States We monitored the distributions of a range of other structural properties in the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK ensembles to verify in further detail their intradomain overlap. We performed a rigid body alignment of helices II and III in the NTD with respect to the RDC-refined solution structure of Ca 2+ -CaM as well as the crystal structure of CaM-MLCK to accentuate the differences between the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK ensembles (see the Supplemental Data ). In Figures 3 A and 3B, we show values of the Cα RMSDs of the nonaligned helices I and IV from their counterparts in the solution structure of Ca 2+ -CaM and the crystal structure of CaM-MLCK. Analysis of the Ca 2+ -CaM ensemble ( Figure 3 A) indicates that 56% of the conformations have helices I and IV within 2 à of their positions in the solution structure (conformations below the black dashed line). In the remaining structures of the ensemble, however, helices I and IV have a significantly higher Cα RMSD unbound , reaching values of up to 5 à . Importantly, in some of the conformations that have high values of Cα RMSD unbound , helices I and IV are found to deviate by less than 2 à from the structure they adopt in the complex (left of the red dashed line). This region of the projection (above the black dashed line and left of the red dashed line) also accommodates the structures most populated in the bound state ( Figure 3 B). Consequently, about 0.3% of the NTD conformations in the Ca 2+ -CaM ensemble correspond to those of highest probability in the CaM-MLCK ensemble ( Table 1 ). The analysis for the CTD shows similar results for helices V and VIII when helices VI and VII are aligned ( Figure S5 ). In the case of the CTD, however, the structural differences between the two ensembles are significantly smaller, and there is an almost 10-fold increased probability of finding structures in the Ca 2+ -CaM ensemble with low Cα RMSD relative to the complex. Figure 3 Comparison of Structural Properties in the Ca 2+ -CaM and CaM-MLCK Ensembles After superimposing the members of both ensembles on the crystal structure of CaM-MLCK as described in the Supplemental Data , properties of the nonaligned helices were determined and compared. (A) Probability distribution of the RMSD of helices I and IV with respect to the RDC-refined solution structure of Ca 2+ -CaM (CαRMSD unbound ) and the crystal structure of CaM-MLCK (CαRMSD bound ) in the Ca 2+ -CaM ensemble. (B) The probability distribution of the RMSD in the CaM-MLCK ensemble is added to the probability distribution shown in A. Projection of the third (green) and fourth (blue) modes of motion in the NTD on CαRMSD unbound and CαRMSD bound , respectively. (C and E) Probability distributions of the positions of helix I and helix VIII, respectively, in the Ca 2+ -CaM ensemble. (D and F) Probability distributions of the positions of helix I and helix VIII in CaM-MLCK ensembles are added to the ones shown in C and E, respectively. We also monitored the spatial orientation of the helical axes ( Figures 3 C–3F), the distributions of intermethionine distances ( Figure 4 ), and the tertiary structure of each EF-hand ( Figure S6 ) to compare the structural characteristics of the ensembles that we determined. Consistent with the analysis described above, a few conformations of the Ca 2+ -CaM ensemble have structural properties that are close to the ones found for the majority of structures in the CaM-MLCK ensemble. Figure 4 Distribution of Methionine Distances in the Ensembles of Ca 2+ -CaM, Red, and CaM-MLCK, Blue Correlated Intradomain Motions in the Ca 2+ -CaM State Leading Toward the CaM-MLCK State To obtain insight into the type of motions that bring Ca 2+ -CaM close to the CaM-MLCK state, we performed a detailed analysis of the dynamics of the Ca 2+ -CaM state. The extent to which backbone motions are correlated in the Ca 2+ -CaM ensemble is illustrated in Figure 5 , and the cross-correlation matrix ( Figure 5 A) clearly indicates that the changes in backbone structure are achieved by correlated rigid body motions. Helices I and IV in the NTD, as well as V and VIII in the CTD, move in a concerted way. By contrast, helices I(V) and IV(VIII) exhibit anticorrelated motions with helices II(VI) and III(VII), respectively, a finding that is consistent with their involvement in hinge or scissor-like motions. The correlation in rigid body backbone motions, which is more pronounced in the CTD, result in a concerted "opening" and "closing" of the EF-hands in the two domains ( Figures 5 B and 5C). Figure 5 Analysis of the Backbone Motions in Ca 2+ -CaM (A) Correlated backbone motions. The position of the helices and the Ca 2+ binding sites are indicated by magenta and cyan bars, respectively. (B and C) Correlation in interhelical angles (ρ CTD = 0.65 and ρ NTD = 0.15) ( P 85°), which is necessary for binding, is usually found in conformations that have a large RMS deviation from the crystal structure of CaM-MLCK ( Figure 6 F). These results suggest that a correlation is present, at least in the CTD, between the occasional adoption, in the absence of a ligand, of intradomain and interdomain conformational properties characteristic of the CaM-MLCK state. However, the coupling between interdomain and intradomain motions is not very tight, with large interhelical angles observable in both domains within conformations of the Ca 2+ -CaM ensemble that are not compact and that have a significant RMS deviation from the crystal structure of CaM-MLCK (green line Figures 6 E–6H). Interdomain Coupling of Intradomain Motions Finally, we investigated how intradomain motions are coupled between the domains. The cross-correlation matrix shown in Figure 5 A clearly indicates that concerted motions occur also across domains, not just within each domain. Helices I, IV, V, and VII exhibit correlated motions, but they are predominantly anticorrelated with the motions of the other helices. In particular, motions in the interdomain region, including helices IV and V as well as the short interdomain linker, are strongly coupled. As both of these helices are linked in their motions with the other helices within the respective domains (see above), the interdomain regions appears to play a key role in the communication between the NTD and CTD. A large body of experimental evidence on apo- and ligand-bound CaM suggests a structural coupling between the two domains ( Martin et al., 1992 , Sorensen and Shea, 1998 , Yazawa et al., 1992 ). Although it has not been possible to determine precisely whether, and to what extent, initial binding of a target protein or peptide by the CTD enhances the affinity for binding by the NTD ( Crothers and Metzger, 1972 ), the linked thermodynamics of Ca 2+ and ligand binding makes cooperative target binding highly likely. It appears, therefore, that altering the distribution of structural properties in one domain upon binding is capable of affecting those in the other domain. To test this possibility, the structure for Ca 2+ -CaM in complex with the N-terminal portion of the CaM-binding domain of the plasma membrane calcium pump, C20W ( Elshorst et al., 1999 ), was analyzed. In this case, the CTD of Ca 2+ -CaM binds to C20W with no detectable contacts between C20W and the NTD. As expected, the interhelical angles in the CTD are consistent with those of a bound structure (angles V-VI and VII-VII are 87 ± 3° and 104 ± 5°, respectively). Interestingly, the interhelical angles, I-II and III-IV, in the NTD are also very large (112 ± 6° and 98 ± 6°, respectively). Indeed, these latter values are among the largest found in any structures of CaM in complex with a protein or peptide, despite the fact that the NTD is not detectably involved in the binding with C20W. The structural correlations that we observed between the two domains in the Ca 2+ -CaM ensemble provide a structural basis for a variety of experimental observations that indicate interdomain communication in CaM. The coupling between the two domains is of statistical nature and is strongly dependent on the asymmetry in the structure and dynamics of the NTD and CTD. Sequential Population Shift upon Substrate Binding Our results show that Ca 2+ -CaM is in dynamic equilibrium with a series of complex-like states. Because there is fast exchange between substates and a high association rate, one may assume that ligand binding occurs by an equilibrium shift mechanism. Hence, the substrates may in principle bind to Ca 2+ -CaM conformations that are simultaneously complex-like in both domains. However, this type of conformation is sampled very rarely, because Ca 2+ -CaM is not completely symmetric and the CTD is more finely tuned than the NTD to adopt conformations resembling those normally populated by CaM-MLCK. Therefore, our analysis shows in structural terms why MLCK binding is far more likely to take place at the CTD prior to binding to the NTD. These results are strongly supported by the available biophysical evidence that shows that the "wrap-around" interactions are initiated by the binding of the CTD ( Liu et al., 2006 ). We have shown that structural changes are not only correlated within the two domains of Ca 2+ -CaM but also between them. Consequently, the population shift induced by initial target binding at the CTD will alter the equilibrium population of unbound conformations within the NTD, such that new substates become accessible and complex-like conformations are more frequently populated. Thus, the initial binding of the ligand by the CTD changes the free energy landscape of the NTD in such a way that substates necessary for ligand binding by the NTD are more readily accessible. Versatility and Efficiency in Ligand Binding The intradomain and interdomain structural variability of CaM provides the basis for the coupling between Ca 2+ binding and exposure of hydrophobic residues, both essential factors determining the ability of CaM to bind to its targets. This type of versatility is made possible through the presence of a flexible linker connecting the two domains as well as a structural and dynamical asymmetry within and between these two domains. The approach adopted in this study has enabled us to characterize in great detail both the structural and dynamical differences between the two domains and to reveal that large amplitude modes of motion have different structural effects in the NTD and CTD and create a high versatility and specificity for binding to a variety of substrates. Creating versatility by introducing asymmetry in duplicated motifs may, in principle, come at the expense of a reduced efficiency to bind a specific ligand. In the case of CaM, however, we have been able to show that the principal dynamic modes in the Ca 2+ -CaM state are essential to direct efficiently the sampling of the conformational space toward complex-like substates. In the CTD, it is the first mode that leads to CaM-MLCK-like substates, whereas the third mode has the same effect in the NTD. Overall, our data indicate that the design of this protein makes it possible to achieve structural variability without reducing significantly the efficiency in binding target proteins. Coupled Equilibrium Shifts on a Dynamic Energy Landscape Our results suggest that CaM binds to different targets through a mechanism of "coupled equilibrium shifts" ( Figure 9 ). Preferential prebinding of a target to a high-affinity substate of one of the domains—the CTD in the case of MLCK—shifts the equilibrium population in this domain and promotes the progression of the binding reaction along a particular channel on the free energy landscape. Other targets that bind different substates of Ca 2+ -CaM will promote progressions along different channels on this landscape. In this view, initial binding to one domain induces a shift in the free energy landscape, resulting in an increased population of substates in the other domain that have a high affinity for the ligand. Therefore, the binding to one domain effectively facilitates the subsequent binding to the other domain. This view is consistent with a previously described model of CaM binding ( Bayley et al., 1996 , Liu et al., 2006 , Slaughter et al., 2007 ), considering it within the concept of a dynamic energy landscape of a protein ( Faralado-Gómez and Roux, 2007 , Arora and Brooks, 2007 , Henzler-Wildman et al., 2007 ) and related to mechanisms of binding and conformational change that have been proposed for other proteins ( Boehr et al., 2006 ). The mechanism of coupled equilibrium shifts allows rationalizing the remarkable characteristic of many proteins to combine high versatility with high efficiency. Figure 9 Free Energy Landscape of CaM Illustrating the Coupled Equilibrium Shift Mechanism Based on our findings and previous experimental data ( Malmendal et al., 1999 ), we suggest that the different states of CaM are in a dynamic equilibrium and, in particular, that shifts in the equilibrium are coupled between the two domains. The binding of Ca 2+ ions initially shifts the equilibrium from the apo to the holo state (Ca 2+ -CaM). Binding of the MLCK ligand takes place first at the CTD, which assumes the bound conformation. This event increases the likelihood of sampling high-affinity substates in NTD (highlighted in yellow), which eventually leads to binding and an equilibrium shift in this domain. Experimental Procedures Structure Calculations The atomic coordinates of the of the RDC-refined solution structure of Ca 2+ -CaM (PDB codes: 1J7O , 1J7P ) ( Chou et al., 2001 ) and the crystal of the CaM-MLCK complex (PDB code: 1CDL ) ( Meador et al., 1992 ) were used as starting structures for the molecular dynamics calculations. The calculations were performed using CHARMM ( Brooks et al., 1983 ) with the CHARMM22 force-field. The structures were solvated in an 8 à shell of TIP3 water molecules. A soft boundary potential was used to prevent water molecules from escaping ( Beglov and Roux, 1994 ). All calculations used an atom-based truncation scheme with a list cutoff of 14 à , a nonbond cutoff of 12 à , and the Lennard-Jones smoothing function initiated at 10 à . Electrostatic and Lennard-Jones interactions were force switched. MD simulations used a 2 fs integration time step and SHAKE for covalent bonds involving hydrogen atoms ( Ryckaert et al., 1977 ). As discussed previously ( Bonvin and Brunger, 1996 , Bürgi, 2001 ), it is difficult to demonstrate that the use of ensemble-averaged restraints provides the correct statistical weights of the conformations in the resulting ensembles. However, in a previous study, we have shown that use of the MUMO method enables the accurate recovery of all the pairwise distance distributions in a test case when such distributions are known exactly, and also provides very low Q factors for RDCs when experimental NOEs and S 2 data are used as restraints ( Richter et al., 2007 ). These results indicate that the statistical weights are effectively calculated with good accuracy when the MUMO procedure is used. In restrained ensemble-averaged simulations, structural information from NOEs is combined with NMR relaxation data in the form of order parameters (S 2 ) using an energy function (1) E tot = E CHARMM + E NOE + E S 2 in which E CHARMM is the CHARMM22 force field ( Brooks et al., 1983 ) and E NOE and E S 2 are the energies associated with the NOEs, and S2 ensemble-averaged restraints, respectively. The structure calculations consisted of 10 cycles of simulated annealing. After each cycle, structures were equilibrated at 300K and used for further analysis (for more details, see the Supplemental Data ). The resulting structures are deposited in the PDB (PDB codes: 2K0E and 2K0F ). Residual dipolar couplings were back-calculated from the structural ensembles using singular value decomposition to fit the alignment tensor. The RDCs deposited with the PDB codes 1J7O and 1J7P ( Chou et al., 2001 ) were used for fitting the alignment tensors of NTD and CTD, respectively, in the Ca 2+ -CaM ensembles. N-HN RDCs of the CaM-MLCK were used to fit the alignment tensors of the CaM-MLCK ensembles (provided by M. Ikura). The quality of agreement with experimental RDC data was assessed by calculating the Q-factor: (2) Q = ∑ ( RDC calc − RDC exp ) 2 ∑ ( RDC exp ) 2 The cross-correlation coefficient C ij between the displacement of Cα atoms i and j was calculated as (3) C ij = 〈 Δ r i Δ r j 〉 / ( 〈 Δ r i 2 〉 〈 Δ r j 2 〉 ) 1 2 where Δ r i is the displacement from the average position of the Cα atom i. To analyze the flexibility of the two domains in the Ca2+-CaM ensembles, we used the PCA for structural ensembles proposed by Nilges and coworkers ( Abseher et al., 1998 ; see the Supplemental Data ). Structure Calculations The atomic coordinates of the of the RDC-refined solution structure of Ca 2+ -CaM (PDB codes: 1J7O , 1J7P ) ( Chou et al., 2001 ) and the crystal of the CaM-MLCK complex (PDB code: 1CDL ) ( Meador et al., 1992 ) were used as starting structures for the molecular dynamics calculations. The calculations were performed using CHARMM ( Brooks et al., 1983 ) with the CHARMM22 force-field. The structures were solvated in an 8 à shell of TIP3 water molecules. A soft boundary potential was used to prevent water molecules from escaping ( Beglov and Roux, 1994 ). All calculations used an atom-based truncation scheme with a list cutoff of 14 à , a nonbond cutoff of 12 à , and the Lennard-Jones smoothing function initiated at 10 à . Electrostatic and Lennard-Jones interactions were force switched. MD simulations used a 2 fs integration time step and SHAKE for covalent bonds involving hydrogen atoms ( Ryckaert et al., 1977 ). As discussed previously ( Bonvin and Brunger, 1996 , Bürgi, 2001 ), it is difficult to demonstrate that the use of ensemble-averaged restraints provides the correct statistical weights of the conformations in the resulting ensembles. However, in a previous study, we have shown that use of the MUMO method enables the accurate recovery of all the pairwise distance distributions in a test case when such distributions are known exactly, and also provides very low Q factors for RDCs when experimental NOEs and S 2 data are used as restraints ( Richter et al., 2007 ). These results indicate that the statistical weights are effectively calculated with good accuracy when the MUMO procedure is used. In restrained ensemble-averaged simulations, structural information from NOEs is combined with NMR relaxation data in the form of order parameters (S 2 ) using an energy function (1) E tot = E CHARMM + E NOE + E S 2 in which E CHARMM is the CHARMM22 force field ( Brooks et al., 1983 ) and E NOE and E S 2 are the energies associated with the NOEs, and S2 ensemble-averaged restraints, respectively. The structure calculations consisted of 10 cycles of simulated annealing. After each cycle, structures were equilibrated at 300K and used for further analysis (for more details, see the Supplemental Data ). The resulting structures are deposited in the PDB (PDB codes: 2K0E and 2K0F ). Residual dipolar couplings were back-calculated from the structural ensembles using singular value decomposition to fit the alignment tensor. The RDCs deposited with the PDB codes 1J7O and 1J7P ( Chou et al., 2001 ) were used for fitting the alignment tensors of NTD and CTD, respectively, in the Ca 2+ -CaM ensembles. N-HN RDCs of the CaM-MLCK were used to fit the alignment tensors of the CaM-MLCK ensembles (provided by M. Ikura). The quality of agreement with experimental RDC data was assessed by calculating the Q-factor: (2) Q = ∑ ( RDC calc − RDC exp ) 2 ∑ ( RDC exp ) 2 The cross-correlation coefficient C ij between the displacement of Cα atoms i and j was calculated as (3) C ij = 〈 Δ r i Δ r j 〉 / ( 〈 Δ r i 2 〉 〈 Δ r j 2 〉 ) 1 2 where Δ r i is the displacement from the average position of the Cα atom i. To analyze the flexibility of the two domains in the Ca2+-CaM ensembles, we used the PCA for structural ensembles proposed by Nilges and coworkers ( Abseher et al., 1998 ; see the Supplemental Data ). Accession Numbers Structures have been deposited in the PDB under codes 2K0E and 2K0F . Supplemental Data Document S1. Nine Figures, Two Tables, Supplemental Results, Supplemental Experimental Procedures, and Supplemental References

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7712907/

Personalized Medicine for Antibiotics: The Role of Nanobiosensors in Therapeutic Drug Monitoring

Due to the high bacterial resistance to antibiotics (AB), it has become necessary to adjust the dose aimed at personalized medicine by means of therapeutic drug monitoring (TDM). TDM is a fundamental tool for measuring the concentration of drugs that have a limited or highly toxic dose in different body fluids, such as blood, plasma, serum, and urine, among others. Using different techniques that allow for the pharmacokinetic (PK) and pharmacodynamic (PD) analysis of the drug, TDM can reduce the risks inherent in treatment. Among these techniques, nanotechnology focused on biosensors, which are relevant due to their versatility, sensitivity, specificity, and low cost. They provide results in real time, using an element for biological recognition coupled to a signal transducer. This review describes recent advances in the quantification of AB using biosensors with a focus on TDM as a fundamental aspect of personalized medicine. 1. Introduction The discovery of antibiotics (AB) ushered in a new era of progress in controlling bacterial infections in human health, agriculture, and livestock [ 1 ] However, the use of AB has been challenged due to the appearance of multi-resistant bacteria (MDR), which have increased significantly in recent years due to AB mismanagement and have become a global public health problem [ 2 ]. More than 70% of bacteria are resistant to all or some of the known AB [ 3 ], creating the need for the development of new types of AB or the use of antimicrobial therapies with highly toxic "last-line" drugs to achieve effective treatment, mainly in critically ill patients [ 3 ]. According to the literature, it is estimated that, by 2050, antimicrobial drug resistant infections could kill 10 million people worldwide each year and cost around USD 100 trillion without the production of new molecules [ 3 , 4 ]. In order to stop this growing number of MDR infections, the World Health Organization (WHO) has established a series of measures among which are controls on the sale, administration, and dosage of AB [ 5 , 6 ]. Due to the fact that currently most doses are uniformly delivered to patients without taking into account the progress of the infection and the clinical picture, treatment failures are generated, which could lead to sub-therapeutic or toxic doses [ 2 , 7 , 8 ]. Among the solutions is the implementation of therapeutic drug monitoring (TDM), which can quantify drugs with a narrow therapeutic index (TI) that have high toxicity by tracking pharmacokinetic (PK) changes [ 6 , 9 ]. Monitoring techniques include single or mass-coupled chromatographic methods with a variety of detectors, including ultraviolet or fluorescent detectors (specified below) and immunoassays [ 10 , 11 ]. Many of these techniques have been approved by the Food and Drug Administration (FDA) of the United States [ 12 ]. However, they are expensive techniques that require specialized laboratories and trained personnel. An innovative solution to this problem is the use of nanobiotechnology, specifically biosensors that allow the measurement of drugs in body fluids (especially in blood, plasma, serum, and urine) [ 13 ]. These have become a new alternative as a specific, sensitive, and low-cost devices that can be miniaturized to be taken to the patient's bedside and easily operated by doctors or health personnel [ 14 , 15 ]. The main advantages of biosensors are a low sample volume, minimally invasive methods for sample collection, reduced reagent consumption, short analysis time, multiple analyte detection, and portability [ 16 , 17 ]. These features make them a new alternative for individualized therapy in real time, allowing timely decision making [ 18 ]. Therefore, health and economic sectors are benefiting of the use of nanobiosensors, reducing the residence times of patients in hospitals, lowering the cost of treatments, and reducing MDR strain infections that generate high cost on health systems worldwide [ 17 , 19 , 20 ]. According to this, monitoring with biosensors is a tool with many advantages, and this kind of devices will become indispensable equipment in clinical use, contributing to the reduction of hospital costs of the health system [ 21 ]. Electrochemical and optical biosensors are the most used types of biosensors for the quantification of AB in different matrices. These have been used in the quantification of vancomycin [ 22 ], tobramycin, doxorubicin [ 23 ], and kanamycin [ 24 ], among others in different matrices with low detection limits in the microgram to nanogram range. This article reviews the use of biosensors for the quantification of antibiotic molecules in different matrices and their use in TDM as an alternative way to generate data when establishing a dose focused on a patient's personalized medicine, minimizing the adverse effects inherent in the treatment. 2. Antibiotics The revolution in the treatment of infectious disease started in 1929 with the discovery of penicillin, a molecule capable of inhibiting the growth of some pathogenic bacteria among which are Staphylococcus , Streptococcus , and Pneumococcus [ 25 ]. This fact was a turning point, since it helped to save incalculable human lives during World War II, being one of the biggest medical discoveries in the fight against infections worldwide [ 4 , 26 ]. The AB include a set of heterogeneous molecules with different PK and pharmacodynamic (PD) behaviors, which are characterized by having a specific action on cellular targets present in bacterial cells, inhibiting or stopping their growth [ 27 ]. Over time, the discovery of new antibiotic molecules from microorganisms (mainly actinomycetes and fungi) or synthetically obtained (sulfonamides and quinolones) has grown exponentially [ 28 ], and AB are widely used worldwide in clinical, veterinary, and agricultural fields [ 1 ]. However, despite the great advantages and development of AB over time, these molecules have been mishandled, putting at risk millions of lives [ 29 ]. This is attributed to the fact that bacteria have developed multiple resistance mechanisms against most AB, which prevents a favorable response to severe infectious conditions that are mainly caused by multi-resistant bacteria (MDR) [ 29 , 30 ]. At the same time, the misuse of antibiotics has generated economic issues both in the health system and in the pharmaceutical sector [ 31 ], mainly due to the high hospital costs of patients in intensive care units (ICU) and the low investment by some pharmaceutical companies in the development of new antibiotic molecules [ 32 , 33 ]. The few discoveries of new molecular entities with antimicrobial properties is mainly due to the low return on investment, the short time to the death of patents and, therefore, short treatment times, the increase in legal requirements, and the reserved use of new drugs for certain patients or special situations [ 31 , 34 , 35 ]. An example of this is the decreasing number of new molecules coming in to the market; since in 1998 there were 20 new antibiotic molecules, while despite the high degree of resistance in 2011, only four new antibiotics were reported [ 36 ]. In addition, a report from Medina in 2014 revealed that pharmaceutical companies, such as Abbott, Merck, and Roche had significantly reduced the investment for new antibiotics development. Astra-Zeneca, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, and Schering-Plough are the only pharmaceutical companies that continue researching for new AB molecules [ 34 , 35 ]. This scenario is less and less encouraging, as pointed out by Nielsen and collaborators in 2019 reporting growing concern worldwide. Although the number of new antibiotics approved by the FDA has increased in the last six years [ 37 ], most of them do not meet the needs of patients and are redundant, since they share chemical structures and sites of action with former antibiotic molecules, which are already ineffective due to multiple resistance modalities developed by their target microbes [ 38 , 39 ]. For this reason, the WHO has been implementing sustained plans for development of new antibiotics, with the aim of increasing research on new molecules that can help mitigate resistance. However, this has not yielded the expected results so far [ 36 ]. It is estimated that at least 480,000 people will develop an MDR bacterial infection every year, if necessary measures are not taken to minimize resistance, which could lead to death due to the toxicity of last-line AB, the lack of new molecules, and poor accessibility to healthcare in developing countries [ 40 ]. Moreover, antimicrobial resistance (AR) compromises the effectiveness of treatments against diseases, such as HIV and malaria, among others [ 5 ]. This situation means that the number of AB used for MDR is increasingly reduced, and health personnel are forced to use some molecules that have high toxicity, such as colistin [ 41 ]. Research of new antibiotic alternatives is not an easy task due to the genotypic and phenotypic characteristics of the microorganisms to be inhibited, the PK and PD characteristics of patients, and the high costs of producing new molecules as result of the increase in regulatory requirements [ 42 ]. Thus, the development of novel AB has become a highly complex challenge [ 29 ]. As a consequence, one of the most effective solutions is the monitoring of some antibiotic molecules [ 43 ], with a view toward personalized medicine that reduces the risks inherent in AB treatment, such as toxicity, and allows the decrease in infections by resistant strains due to the individualization of the dose [ 9 ]. To achieve this, there are different techniques that detect or quantify AB in body fluids [ 44 ]. These results have generated a more practical and safer scenario for the treating doctor. 2.1. Classification of Antibiotics There are a large number of reported antibiotic molecules with different characteristics that allow them to be classified into different groups. Many antibiotic molecules have been discovered with different targets in the bacterial cell, depending on the morphological characteristics of the microorganism [ 45 ]. To reach intracellular targets, molecules must cross the cell wall (depending on the nature of the antibiotic). For hydrophilic molecules less than 600 Da, this is achieved by proteins called porins, while in case of lipophilic AB, it is necessary to transport them with energy consumption or via diffusion through the lipid membrane [ 45 ]. Once inside the cell, AB must avoid inactivation and effectively recognize their pharmacological target. Gram-negative bacteria (GNB) are more resistant than Gram-positive bacteria (GPB) due to the presence of an external lipid membrane that surrounds the GNB wall, which prevents the passage of some molecules. However, there are some exceptions when the pharmacological target is the outer envelope [ 46 ]. The most widely used classification of AB is based on molecular structure, mode of action, or spectrum [ 47 ]. AB generally show similar effectiveness and side effects when they have similar structural characteristics and mechanisms of action [ 48 ]. According to the mode of action, AB are classified mainly depending on (i) ability to inhibit bacterial wall synthesis, (ii) alteration the cytoplasmic membrane, (iii) inhibition protein synthesis, (iv) alteration the metabolism or the structure of the nucleic acids, (v) blocking the synthesis of metabolic factors, and (vi) inhibition β-lactamases. Figure 1 shows the main modes of action of AB on bacterial cells. [ 49 ] 2.1.1. Inhibition of Bacterial Wall Synthesis The cell wall is a membrane that covers the bacterial cell, characterized by supporting the internal osmotic pressure of the cell and allowing communication with the outside [ 49 ]. In order for the AB to act on the wall synthesis, the bacteria must be in the exponential phase and in an isotonic or hypotonic medium that favors cell lysis [ 50 ]. Three stages are involved in wall synthesis, which are targets for the different AB. Cytoplasmic phase inhibitors : In general, this type of AB inhibits or alters the precursors involved in wall synthesis [ 26 ]. Within these are two groups of AB, isoxazolidinones and phosphonopeptides [ 51 ]. Inhibitors of the precursor transport phase through the cytoplasmic membrane : Bacitracin is the most relevant group for this mechanism, which inhibits the incorporation of amino acids and nucleotides in the cell wall [ 52 , 53 ]. Inhibitors of the structural organization of peptidoglycan : At this stage, the peptidoglycan precursors are assembled with the help of penicillin-binding proteins (PBP), which have transpeptidase, transglucosylase, and carboxypeptidase activities, allowing them to interlock peptidoglycan components to form the bacterial wall. AB involved in this mechanism include beta-lactams and glycopeptides [ 54 ]. 2.1.2. Disruption of the Cytoplasmic Membrane Polymyxins and lipopeptides belong to this group and are molecules capable of altering the structure of the bacterial membrane, changing its permeability and generating influx or efflux of ions that can lead to cell death [ 55 ]. The initial target of polymyxin is the lipopolysaccharide (LPS) component of the outer membrane (OM) in GNB, which is able to form aggregates and is responsible for the permeabilizing action of OM [ 56 ]. In the case of lipopeptides (daptomycin has been the most studied), the AB interacts with the lipid tails of the membrane and is partially inserted. In the presence of Ca 2+ , anionic daptomycin binds to the anionic groups of the lipids of the bacterial membrane, and is thus able to insert more deeply into the membrane and form aggregates, perforating the membrane, causing depolarization or some other event associated with the membrane [ 57 ]. These AB are characterized by being highly toxic, due to the similarity between prokaryotic and eukaryotic cytoplasmic membranes [ 50 ]. 2.1.3. Inhibition of Protein Synthesis Protein synthesis is one of the most common target mechanisms of AB, because there are considerable differences between prokaryotic and eukaryotic systems. Among the main groups are mupirocin, a molecule capable of inhibiting the activation phase of proteins, preventing the incorporation of isoleucine into peptides [ 58 , 59 ]. Other families involved in the inhibition of protein synthesis are oxazolidinones, aminoglycosides, tetracyclines, amphenicols, lincosamides, macrolides, streptogramins, and fusidic acid; molecules capable of inhibiting the onset of protein synthesis and preventing the formation of complexes between translation elements (30S subunit, mRNA, initiation factors, and formylmethionyl-tRNA). The inactivation of the initiation complex or the inhibition of the elongation of protein lead to cell death [ 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 ]. 2.1.4. Antibiotics that Act on the Metabolism or Structure of Nucleic Acids A series of intermediaries and enzymes are involved in the processes of replication, transcription, and translation of nucleic acids. Some AB groups have action on this intermediaries and enzymes, such as quinolones, rifampicin, nitroimidazoles, and nitrofurans [ 68 , 69 ]. Quinolones act on chromosomal DNA by binding to topoisomerases (specifically topoisomerase IV) and gyrase by inhibiting their action [ 70 ]. In GNB bacteria, quinolones mainly inhibit DNA gyrase, interacting with the amino acids of the α-helices close to the tyrosine present in the active center that are involved in the separation of the DNA chains [ 71 ]. In GPB, AB molecules act on topoisomerase IV by breaking DNA strands after each replication in addition to having a relaxing effect on the chain [ 72 ]. Rifamycins are characterized by inhibiting the synthesis of ribosomal and messenger RNA chains, because they bind to the β subunit of RNA polymerase, preventing the start of transcription [ 26 , 73 ]. The most commonly used antibiotic in the clinic is rifampicin [ 74 ]. Nitroimidazoles generate radicals that affect DNA chains; they are mainly used against anaerobic microorganisms, which has allowed them to be used both in the clinic and in veterinary medicine [ 75 , 76 , 77 ]. Nitrofurans, like the previous molecules, are compounds that are reduced in the bacterial cytoplasm, forming toxic compounds causing damage DNA structures. At the same time, they inhibit acetyl coenzyme A, interfering in the carbohydrate metabolism and inhibiting cell-wall synthesis [ 78 ]. However, its mechanisms of action have not been widely studied. An antibiotic with high clinical relevance is nitrofurantoin, which is used against both GPB and GNB bacteria [ 79 ]. 2.1.5. Blocking the Synthesis of Metabolic Factors Bacteria require folic acid to carry out different metabolic processes essential for their survival, i.e., to obtain essential compounds, such as amino acids or puric bases. The AB of the sulfamide and diaminopyrimidine groups are capable of inhibiting folate synthesis pathways, leading to cell death [ 80 ]. The growing demand for AB has driven the search of strategies that allow the discovery of new molecules. One of them is the use of directed AB based on the search for biosynthetic genes (BGC) encoding secondary metabolites by the use of bioinformatic tools to determine the position of genes and the production of new molecules [ 81 ]. Investigations carried out by Juretic et al. in 2009 reported the synthesis of highly selective antimicrobial peptides through the use of computational tools. Starting from frog-derived peptides, a 23 residue glycine-rich peptide was synthesized, called adepatin 1, with bacterial activity against Escherichia coli [ 82 ]. Another strategy in the search of new AB consists in the use of enzyme assembly line engineering, although it has been a highly debated technique for years, due to its low efficacy. There are also new ways to create structures with improved properties based on existing ones. This has been shown to be effective against certain microorganisms [ 83 ]. Studies have also been conducted with antibacterial monoclonal antibodies directed towards exotoxins or endotoxins. These have been approved by the FDA for use in humans in the treatment of Bacillus anthracis (raxibacumab and obiltoxaximab) [ 84 , 85 ] and Clostridium difficile (bezlotoxumab) [ 86 ] in adult patients. In recent years, a small number of new AB molecules have been discovered, which are at different stages of development. Antibiotics approved from 2015 to date in the United States and the European Union are ceftazidime/avibactam, ceftobiprol, ceftolozane/tazobactam, dalbavancin, oritavancin, solithromycin, and tedizolid. Drugs in phase 3 trials include carbavance, cadazolid, iclaprim, and finafloxacin, among others [ 87 , 88 ]. However, despite the PD of AB and their bactericidal or bacteriostatic action on bacteria, microorganisms have developed strategies that give them the ability to develop AR mechanisms, making their elimination increasingly difficult. 2.2. Issue of Bacterial Resistance to Antibiotics Bacteria have developed different AR mechanisms in order to survive these agents and be able to colonize tissues [ 89 ]. AR is linked to natural phenomena including genetic recombination, genome dynamics and adaptation, leading to most of bacterial species being resistant to more than one AB molecule [ 42 ]. The main AR mechanisms involve the production of enzymes for chemical structure of AB, and among these, the presence of flow pumps, membrane alterations, modification of the target site, and horizontal transfer of resistance genes stand out ( Figure 1 ) [ 90 , 91 , 92 , 93 ]. It should be noted that horizontal transfer is a selective advantage of prokaryotes, which has allowed the accelerated increase in MDR. This property allows the acquisition of different resistance mechanisms present in genes on plasmids that are transferred from bacteria to bacteria, making this characteristic one of the main mechanisms of AR to AB [ 94 , 95 , 96 ]. Table 1 shows the main mechanisms of AR and the genes involved in bacterial resistance. As mentioned above, AR mainly arises due to poor management of AB and has become a public health problem that requires urgent action [ 42 ]. An example of this fact is the increasing number of acute respiratory infections cases, diarrheal diseases, and tuberculosis, among others. These pathologies cause more than 85% of deaths from infection in the world, due to the fact that most of them are caused by MDR bacteria [ 97 ]. These types of microorganisms spread easily due to the accelerated increase in globalization, leading to high rates of contagion worldwide [ 98 ]. This also has an impact on the healthcare cost throughout the world, as a result of the ineffectiveness of treatment, which in the worst-case scenario leads to death. Taking into account that health costs are not covered likewise for developed and underdeveloped countries, the latter do not have the same access to resources, and the use of new molecules is limited or absent [ 99 ]. The main causes of increased AR are general misinformation of patients, which has led to self-medication and/or mismanagement of the doses prescribed by doctors. This misuse of AB, without taking into account the PK and PD properties of the molecules [ 100 , 101 ], generate the appearance of new strains resistant to most of the known AB. Other factor that influences the acquisition of AR by bacteria is the constant contact of bacterial strains with traces of AB from the effluents of pharmaceutical companies and hospitals, where high concentrations have been reported in magnitudes of g/L [ 102 ]. Another source of AR is the presence of traces of AB reported in the agricultural and livestock sector, since AB are used as growth promoters in animals. This practice leads to variable concentrations of AB in meat, milk, and manure; the latter often used as organic fertilizer for crops [ 103 , 104 , 105 ]. Additionally, AB are administered to animals at high therapeutic doses to control infections, and on many occasions, they are applied in a generalized way without taking into account the specific strain of the microorganism or the physiological and general health condition of the animal. Considering the above and as a result of these activities, Ye et al. in 2007 reported the presence of traces of sulfonamides, macrolides, and quinolones in concentrations of ng/L in drinking water, groundwater, and surface water [ 106 , 107 ]. Therefore, the misuse of AB has been translated into an increase in MDR bacteria, making this issue one of the biggest public health concerns of the 21st century, according to the WHO [ 108 ]. According to the WHO, more than 50% of bacteria, such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae , and Staphylococcus aureus, are reported to be resistant to AB often used around the world [ 40 ]. In 2008, a first list of six pathogens was created under the tittle "ESKAPE pathogens" that includes bacteria, such as Enterococcus faecium, S. aureus, K. pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa , and Enterobacter with a high MDR [ 109 ]. In 2014, the United States FDA presented a final list of 21 target pathogens with a high unmet medical need [ 110 ]. It should be noted that this list shows that AR is not a problem restricted only to clinical care, but that community-acquired infections such as urinary tract infections, gonorrhea, and tuberculosis are mainly increased by MDR or extremely drug-resistant (XDR) bacteria [ 111 ]. Recent data show that 63% of Acinetobacter isolates, 13% of isolated Pseudomonas , and 11% of isolated Klebsiella causing health-associated infections in the United States are MDR [ 112 ]. According to the SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program) study, Latin America shows higher levels of antimicrobial resistance than other evaluated regions, such as the United States of America and Europe. In South America, a high prevalence of extended-spectrum beta-lactamases (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae (between 45.4 and 51.9%) and Escherichia coli (between 8.5 and 18.1%) has been reported [ 113 ]. Mortality from methicillin-resistant Staphylococcus aureus (SAMR) is 2.5 times higher than from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (SAMS) [ 97 ]. For all these reasons, WHO has determined that AR would be a potential cause of death for 300 million people over the next 35 years and would have a high impact by decreasing gross domestic product by 2–3.5% compared to what it could be by 2050 [ 114 ]. With these predictions based on high uncertainty, economic and health sectors should be concerned with AR. Most regions of the world consider AR as a future threat to the growth and development of nations [ 5 ]. Latin America is one of the regions with most nosocomial outbreaks by AR, accounting for millions of lives in the last 60 years, making it one of the three most dangerous factors for public health in the 21st century [ 2 ]. Studies carried out by the Pan American Health Organization (PAHO) determined that, in Latin America and the Caribbean, AB are dispensed without medical prescription, according to a survey carried out in these countries, declining world health outlook, and favoring bacterial resistance [ 115 ]. This situation has led the WHO to conclude that the world is running out of AB. The multiple new AR mechanisms are spreading and are increasing the cost of healthcare, mainly due to the long stays at hospitals of patients suffering from MDR and XDR infection [ 116 ]. According to the WHO, bacteria resistant to more than two AB have been isolated from the same AB family, or from different families. These include carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii , carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa , vancomycin-resistant Enterococcus faecium , methicillin-resistant Staphylococcus aureus with intermediate sensitivity and resistance to vancomycin, campylochrine-resistant Helicobacter pylori spp. resistant to fluoroquinolones, Salmonellae resistant to fluoroquinolones, Neisseria gonorrhoeae resistant to cephalosporin and fluoroquinolones, Streptococcus pneumoniae without sensitivity to penicillin, Haemophilus influenzae resistant to ampicillin, and Shigella spp. resistant to fluoroquinolones [ 110 , 117 ]. To control the indiscriminate use of AB, strategies have been implemented to mitigate the impact of MDR on patients and economy, such as social campaigns by health professionals focused on the regulation and proper use of medications, which have been largely ineffective [ 115 ]. At the same time, PAHO has created an antibiotic surveillance network, studying the susceptibility of some bacteria to AB in order to take actions for continuous improvement and good management by clinical personnel [ 118 ]. Highly toxic or narrow therapeutic window antimicrobials, such as aminoglycosides, glycopeptides, and some β-lactams (e.g., carbapenems), are being used [ 119 , 120 ], characterized by high nephrotoxicity, neurotoxicity, or muscular toxicity. However, at present, medical personnel has been forced to treat some patients with these drugs as an effective way for growth inhibition the of pathogenic bacteria [ 121 ]. Therefore, in order to avoid adverse reactions from this type of drug, it is necessary to measure the levels of AB with narrow therapeutic window, leading to personalized medicine that could have a high impact in public health and global economy. Nowadays, therapeutic drug monitoring (TDM) has become a fundamental tool to control AB doses in critically ill patients, increasing the chances of overcoming MDR bacterial infections. In this sense, nanobiotechnology is an innovative solution for mitigating the antimicrobial resistance. In particular, the use of nanobiosensors for AB detection in plasma of patients allow the real time quantification on site, using a low sample size easily and quickly [ 14 , 15 , 22 ]. These point of care devices are a helpfully tools for clinicians to decision making [ 24 ], reducing the impact of infections by MDR strains and, therefore, contributing to control this worldwide public health issue [ 23 , 24 ]. 2.1. Classification of Antibiotics There are a large number of reported antibiotic molecules with different characteristics that allow them to be classified into different groups. Many antibiotic molecules have been discovered with different targets in the bacterial cell, depending on the morphological characteristics of the microorganism [ 45 ]. To reach intracellular targets, molecules must cross the cell wall (depending on the nature of the antibiotic). For hydrophilic molecules less than 600 Da, this is achieved by proteins called porins, while in case of lipophilic AB, it is necessary to transport them with energy consumption or via diffusion through the lipid membrane [ 45 ]. Once inside the cell, AB must avoid inactivation and effectively recognize their pharmacological target. Gram-negative bacteria (GNB) are more resistant than Gram-positive bacteria (GPB) due to the presence of an external lipid membrane that surrounds the GNB wall, which prevents the passage of some molecules. However, there are some exceptions when the pharmacological target is the outer envelope [ 46 ]. The most widely used classification of AB is based on molecular structure, mode of action, or spectrum [ 47 ]. AB generally show similar effectiveness and side effects when they have similar structural characteristics and mechanisms of action [ 48 ]. According to the mode of action, AB are classified mainly depending on (i) ability to inhibit bacterial wall synthesis, (ii) alteration the cytoplasmic membrane, (iii) inhibition protein synthesis, (iv) alteration the metabolism or the structure of the nucleic acids, (v) blocking the synthesis of metabolic factors, and (vi) inhibition β-lactamases. Figure 1 shows the main modes of action of AB on bacterial cells. [ 49 ] 2.1.1. Inhibition of Bacterial Wall Synthesis The cell wall is a membrane that covers the bacterial cell, characterized by supporting the internal osmotic pressure of the cell and allowing communication with the outside [ 49 ]. In order for the AB to act on the wall synthesis, the bacteria must be in the exponential phase and in an isotonic or hypotonic medium that favors cell lysis [ 50 ]. Three stages are involved in wall synthesis, which are targets for the different AB. Cytoplasmic phase inhibitors : In general, this type of AB inhibits or alters the precursors involved in wall synthesis [ 26 ]. Within these are two groups of AB, isoxazolidinones and phosphonopeptides [ 51 ]. Inhibitors of the precursor transport phase through the cytoplasmic membrane : Bacitracin is the most relevant group for this mechanism, which inhibits the incorporation of amino acids and nucleotides in the cell wall [ 52 , 53 ]. Inhibitors of the structural organization of peptidoglycan : At this stage, the peptidoglycan precursors are assembled with the help of penicillin-binding proteins (PBP), which have transpeptidase, transglucosylase, and carboxypeptidase activities, allowing them to interlock peptidoglycan components to form the bacterial wall. AB involved in this mechanism include beta-lactams and glycopeptides [ 54 ]. 2.1.2. Disruption of the Cytoplasmic Membrane Polymyxins and lipopeptides belong to this group and are molecules capable of altering the structure of the bacterial membrane, changing its permeability and generating influx or efflux of ions that can lead to cell death [ 55 ]. The initial target of polymyxin is the lipopolysaccharide (LPS) component of the outer membrane (OM) in GNB, which is able to form aggregates and is responsible for the permeabilizing action of OM [ 56 ]. In the case of lipopeptides (daptomycin has been the most studied), the AB interacts with the lipid tails of the membrane and is partially inserted. In the presence of Ca 2+ , anionic daptomycin binds to the anionic groups of the lipids of the bacterial membrane, and is thus able to insert more deeply into the membrane and form aggregates, perforating the membrane, causing depolarization or some other event associated with the membrane [ 57 ]. These AB are characterized by being highly toxic, due to the similarity between prokaryotic and eukaryotic cytoplasmic membranes [ 50 ]. 2.1.3. Inhibition of Protein Synthesis Protein synthesis is one of the most common target mechanisms of AB, because there are considerable differences between prokaryotic and eukaryotic systems. Among the main groups are mupirocin, a molecule capable of inhibiting the activation phase of proteins, preventing the incorporation of isoleucine into peptides [ 58 , 59 ]. Other families involved in the inhibition of protein synthesis are oxazolidinones, aminoglycosides, tetracyclines, amphenicols, lincosamides, macrolides, streptogramins, and fusidic acid; molecules capable of inhibiting the onset of protein synthesis and preventing the formation of complexes between translation elements (30S subunit, mRNA, initiation factors, and formylmethionyl-tRNA). The inactivation of the initiation complex or the inhibition of the elongation of protein lead to cell death [ 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 ]. 2.1.4. Antibiotics that Act on the Metabolism or Structure of Nucleic Acids A series of intermediaries and enzymes are involved in the processes of replication, transcription, and translation of nucleic acids. Some AB groups have action on this intermediaries and enzymes, such as quinolones, rifampicin, nitroimidazoles, and nitrofurans [ 68 , 69 ]. Quinolones act on chromosomal DNA by binding to topoisomerases (specifically topoisomerase IV) and gyrase by inhibiting their action [ 70 ]. In GNB bacteria, quinolones mainly inhibit DNA gyrase, interacting with the amino acids of the α-helices close to the tyrosine present in the active center that are involved in the separation of the DNA chains [ 71 ]. In GPB, AB molecules act on topoisomerase IV by breaking DNA strands after each replication in addition to having a relaxing effect on the chain [ 72 ]. Rifamycins are characterized by inhibiting the synthesis of ribosomal and messenger RNA chains, because they bind to the β subunit of RNA polymerase, preventing the start of transcription [ 26 , 73 ]. The most commonly used antibiotic in the clinic is rifampicin [ 74 ]. Nitroimidazoles generate radicals that affect DNA chains; they are mainly used against anaerobic microorganisms, which has allowed them to be used both in the clinic and in veterinary medicine [ 75 , 76 , 77 ]. Nitrofurans, like the previous molecules, are compounds that are reduced in the bacterial cytoplasm, forming toxic compounds causing damage DNA structures. At the same time, they inhibit acetyl coenzyme A, interfering in the carbohydrate metabolism and inhibiting cell-wall synthesis [ 78 ]. However, its mechanisms of action have not been widely studied. An antibiotic with high clinical relevance is nitrofurantoin, which is used against both GPB and GNB bacteria [ 79 ]. 2.1.5. Blocking the Synthesis of Metabolic Factors Bacteria require folic acid to carry out different metabolic processes essential for their survival, i.e., to obtain essential compounds, such as amino acids or puric bases. The AB of the sulfamide and diaminopyrimidine groups are capable of inhibiting folate synthesis pathways, leading to cell death [ 80 ]. The growing demand for AB has driven the search of strategies that allow the discovery of new molecules. One of them is the use of directed AB based on the search for biosynthetic genes (BGC) encoding secondary metabolites by the use of bioinformatic tools to determine the position of genes and the production of new molecules [ 81 ]. Investigations carried out by Juretic et al. in 2009 reported the synthesis of highly selective antimicrobial peptides through the use of computational tools. Starting from frog-derived peptides, a 23 residue glycine-rich peptide was synthesized, called adepatin 1, with bacterial activity against Escherichia coli [ 82 ]. Another strategy in the search of new AB consists in the use of enzyme assembly line engineering, although it has been a highly debated technique for years, due to its low efficacy. There are also new ways to create structures with improved properties based on existing ones. This has been shown to be effective against certain microorganisms [ 83 ]. Studies have also been conducted with antibacterial monoclonal antibodies directed towards exotoxins or endotoxins. These have been approved by the FDA for use in humans in the treatment of Bacillus anthracis (raxibacumab and obiltoxaximab) [ 84 , 85 ] and Clostridium difficile (bezlotoxumab) [ 86 ] in adult patients. In recent years, a small number of new AB molecules have been discovered, which are at different stages of development. Antibiotics approved from 2015 to date in the United States and the European Union are ceftazidime/avibactam, ceftobiprol, ceftolozane/tazobactam, dalbavancin, oritavancin, solithromycin, and tedizolid. Drugs in phase 3 trials include carbavance, cadazolid, iclaprim, and finafloxacin, among others [ 87 , 88 ]. However, despite the PD of AB and their bactericidal or bacteriostatic action on bacteria, microorganisms have developed strategies that give them the ability to develop AR mechanisms, making their elimination increasingly difficult. 2.1.1. Inhibition of Bacterial Wall Synthesis The cell wall is a membrane that covers the bacterial cell, characterized by supporting the internal osmotic pressure of the cell and allowing communication with the outside [ 49 ]. In order for the AB to act on the wall synthesis, the bacteria must be in the exponential phase and in an isotonic or hypotonic medium that favors cell lysis [ 50 ]. Three stages are involved in wall synthesis, which are targets for the different AB. Cytoplasmic phase inhibitors : In general, this type of AB inhibits or alters the precursors involved in wall synthesis [ 26 ]. Within these are two groups of AB, isoxazolidinones and phosphonopeptides [ 51 ]. Inhibitors of the precursor transport phase through the cytoplasmic membrane : Bacitracin is the most relevant group for this mechanism, which inhibits the incorporation of amino acids and nucleotides in the cell wall [ 52 , 53 ]. Inhibitors of the structural organization of peptidoglycan : At this stage, the peptidoglycan precursors are assembled with the help of penicillin-binding proteins (PBP), which have transpeptidase, transglucosylase, and carboxypeptidase activities, allowing them to interlock peptidoglycan components to form the bacterial wall. AB involved in this mechanism include beta-lactams and glycopeptides [ 54 ]. 2.1.2. Disruption of the Cytoplasmic Membrane Polymyxins and lipopeptides belong to this group and are molecules capable of altering the structure of the bacterial membrane, changing its permeability and generating influx or efflux of ions that can lead to cell death [ 55 ]. The initial target of polymyxin is the lipopolysaccharide (LPS) component of the outer membrane (OM) in GNB, which is able to form aggregates and is responsible for the permeabilizing action of OM [ 56 ]. In the case of lipopeptides (daptomycin has been the most studied), the AB interacts with the lipid tails of the membrane and is partially inserted. In the presence of Ca 2+ , anionic daptomycin binds to the anionic groups of the lipids of the bacterial membrane, and is thus able to insert more deeply into the membrane and form aggregates, perforating the membrane, causing depolarization or some other event associated with the membrane [ 57 ]. These AB are characterized by being highly toxic, due to the similarity between prokaryotic and eukaryotic cytoplasmic membranes [ 50 ]. 2.1.3. Inhibition of Protein Synthesis Protein synthesis is one of the most common target mechanisms of AB, because there are considerable differences between prokaryotic and eukaryotic systems. Among the main groups are mupirocin, a molecule capable of inhibiting the activation phase of proteins, preventing the incorporation of isoleucine into peptides [ 58 , 59 ]. Other families involved in the inhibition of protein synthesis are oxazolidinones, aminoglycosides, tetracyclines, amphenicols, lincosamides, macrolides, streptogramins, and fusidic acid; molecules capable of inhibiting the onset of protein synthesis and preventing the formation of complexes between translation elements (30S subunit, mRNA, initiation factors, and formylmethionyl-tRNA). The inactivation of the initiation complex or the inhibition of the elongation of protein lead to cell death [ 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 ]. 2.1.4. Antibiotics that Act on the Metabolism or Structure of Nucleic Acids A series of intermediaries and enzymes are involved in the processes of replication, transcription, and translation of nucleic acids. Some AB groups have action on this intermediaries and enzymes, such as quinolones, rifampicin, nitroimidazoles, and nitrofurans [ 68 , 69 ]. Quinolones act on chromosomal DNA by binding to topoisomerases (specifically topoisomerase IV) and gyrase by inhibiting their action [ 70 ]. In GNB bacteria, quinolones mainly inhibit DNA gyrase, interacting with the amino acids of the α-helices close to the tyrosine present in the active center that are involved in the separation of the DNA chains [ 71 ]. In GPB, AB molecules act on topoisomerase IV by breaking DNA strands after each replication in addition to having a relaxing effect on the chain [ 72 ]. Rifamycins are characterized by inhibiting the synthesis of ribosomal and messenger RNA chains, because they bind to the β subunit of RNA polymerase, preventing the start of transcription [ 26 , 73 ]. The most commonly used antibiotic in the clinic is rifampicin [ 74 ]. Nitroimidazoles generate radicals that affect DNA chains; they are mainly used against anaerobic microorganisms, which has allowed them to be used both in the clinic and in veterinary medicine [ 75 , 76 , 77 ]. Nitrofurans, like the previous molecules, are compounds that are reduced in the bacterial cytoplasm, forming toxic compounds causing damage DNA structures. At the same time, they inhibit acetyl coenzyme A, interfering in the carbohydrate metabolism and inhibiting cell-wall synthesis [ 78 ]. However, its mechanisms of action have not been widely studied. An antibiotic with high clinical relevance is nitrofurantoin, which is used against both GPB and GNB bacteria [ 79 ]. 2.1.5. Blocking the Synthesis of Metabolic Factors Bacteria require folic acid to carry out different metabolic processes essential for their survival, i.e., to obtain essential compounds, such as amino acids or puric bases. The AB of the sulfamide and diaminopyrimidine groups are capable of inhibiting folate synthesis pathways, leading to cell death [ 80 ]. The growing demand for AB has driven the search of strategies that allow the discovery of new molecules. One of them is the use of directed AB based on the search for biosynthetic genes (BGC) encoding secondary metabolites by the use of bioinformatic tools to determine the position of genes and the production of new molecules [ 81 ]. Investigations carried out by Juretic et al. in 2009 reported the synthesis of highly selective antimicrobial peptides through the use of computational tools. Starting from frog-derived peptides, a 23 residue glycine-rich peptide was synthesized, called adepatin 1, with bacterial activity against Escherichia coli [ 82 ]. Another strategy in the search of new AB consists in the use of enzyme assembly line engineering, although it has been a highly debated technique for years, due to its low efficacy. There are also new ways to create structures with improved properties based on existing ones. This has been shown to be effective against certain microorganisms [ 83 ]. Studies have also been conducted with antibacterial monoclonal antibodies directed towards exotoxins or endotoxins. These have been approved by the FDA for use in humans in the treatment of Bacillus anthracis (raxibacumab and obiltoxaximab) [ 84 , 85 ] and Clostridium difficile (bezlotoxumab) [ 86 ] in adult patients. In recent years, a small number of new AB molecules have been discovered, which are at different stages of development. Antibiotics approved from 2015 to date in the United States and the European Union are ceftazidime/avibactam, ceftobiprol, ceftolozane/tazobactam, dalbavancin, oritavancin, solithromycin, and tedizolid. Drugs in phase 3 trials include carbavance, cadazolid, iclaprim, and finafloxacin, among others [ 87 , 88 ]. However, despite the PD of AB and their bactericidal or bacteriostatic action on bacteria, microorganisms have developed strategies that give them the ability to develop AR mechanisms, making their elimination increasingly difficult. 2.2. Issue of Bacterial Resistance to Antibiotics Bacteria have developed different AR mechanisms in order to survive these agents and be able to colonize tissues [ 89 ]. AR is linked to natural phenomena including genetic recombination, genome dynamics and adaptation, leading to most of bacterial species being resistant to more than one AB molecule [ 42 ]. The main AR mechanisms involve the production of enzymes for chemical structure of AB, and among these, the presence of flow pumps, membrane alterations, modification of the target site, and horizontal transfer of resistance genes stand out ( Figure 1 ) [ 90 , 91 , 92 , 93 ]. It should be noted that horizontal transfer is a selective advantage of prokaryotes, which has allowed the accelerated increase in MDR. This property allows the acquisition of different resistance mechanisms present in genes on plasmids that are transferred from bacteria to bacteria, making this characteristic one of the main mechanisms of AR to AB [ 94 , 95 , 96 ]. Table 1 shows the main mechanisms of AR and the genes involved in bacterial resistance. As mentioned above, AR mainly arises due to poor management of AB and has become a public health problem that requires urgent action [ 42 ]. An example of this fact is the increasing number of acute respiratory infections cases, diarrheal diseases, and tuberculosis, among others. These pathologies cause more than 85% of deaths from infection in the world, due to the fact that most of them are caused by MDR bacteria [ 97 ]. These types of microorganisms spread easily due to the accelerated increase in globalization, leading to high rates of contagion worldwide [ 98 ]. This also has an impact on the healthcare cost throughout the world, as a result of the ineffectiveness of treatment, which in the worst-case scenario leads to death. Taking into account that health costs are not covered likewise for developed and underdeveloped countries, the latter do not have the same access to resources, and the use of new molecules is limited or absent [ 99 ]. The main causes of increased AR are general misinformation of patients, which has led to self-medication and/or mismanagement of the doses prescribed by doctors. This misuse of AB, without taking into account the PK and PD properties of the molecules [ 100 , 101 ], generate the appearance of new strains resistant to most of the known AB. Other factor that influences the acquisition of AR by bacteria is the constant contact of bacterial strains with traces of AB from the effluents of pharmaceutical companies and hospitals, where high concentrations have been reported in magnitudes of g/L [ 102 ]. Another source of AR is the presence of traces of AB reported in the agricultural and livestock sector, since AB are used as growth promoters in animals. This practice leads to variable concentrations of AB in meat, milk, and manure; the latter often used as organic fertilizer for crops [ 103 , 104 , 105 ]. Additionally, AB are administered to animals at high therapeutic doses to control infections, and on many occasions, they are applied in a generalized way without taking into account the specific strain of the microorganism or the physiological and general health condition of the animal. Considering the above and as a result of these activities, Ye et al. in 2007 reported the presence of traces of sulfonamides, macrolides, and quinolones in concentrations of ng/L in drinking water, groundwater, and surface water [ 106 , 107 ]. Therefore, the misuse of AB has been translated into an increase in MDR bacteria, making this issue one of the biggest public health concerns of the 21st century, according to the WHO [ 108 ]. According to the WHO, more than 50% of bacteria, such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae , and Staphylococcus aureus, are reported to be resistant to AB often used around the world [ 40 ]. In 2008, a first list of six pathogens was created under the tittle "ESKAPE pathogens" that includes bacteria, such as Enterococcus faecium, S. aureus, K. pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa , and Enterobacter with a high MDR [ 109 ]. In 2014, the United States FDA presented a final list of 21 target pathogens with a high unmet medical need [ 110 ]. It should be noted that this list shows that AR is not a problem restricted only to clinical care, but that community-acquired infections such as urinary tract infections, gonorrhea, and tuberculosis are mainly increased by MDR or extremely drug-resistant (XDR) bacteria [ 111 ]. Recent data show that 63% of Acinetobacter isolates, 13% of isolated Pseudomonas , and 11% of isolated Klebsiella causing health-associated infections in the United States are MDR [ 112 ]. According to the SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program) study, Latin America shows higher levels of antimicrobial resistance than other evaluated regions, such as the United States of America and Europe. In South America, a high prevalence of extended-spectrum beta-lactamases (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae (between 45.4 and 51.9%) and Escherichia coli (between 8.5 and 18.1%) has been reported [ 113 ]. Mortality from methicillin-resistant Staphylococcus aureus (SAMR) is 2.5 times higher than from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (SAMS) [ 97 ]. For all these reasons, WHO has determined that AR would be a potential cause of death for 300 million people over the next 35 years and would have a high impact by decreasing gross domestic product by 2–3.5% compared to what it could be by 2050 [ 114 ]. With these predictions based on high uncertainty, economic and health sectors should be concerned with AR. Most regions of the world consider AR as a future threat to the growth and development of nations [ 5 ]. Latin America is one of the regions with most nosocomial outbreaks by AR, accounting for millions of lives in the last 60 years, making it one of the three most dangerous factors for public health in the 21st century [ 2 ]. Studies carried out by the Pan American Health Organization (PAHO) determined that, in Latin America and the Caribbean, AB are dispensed without medical prescription, according to a survey carried out in these countries, declining world health outlook, and favoring bacterial resistance [ 115 ]. This situation has led the WHO to conclude that the world is running out of AB. The multiple new AR mechanisms are spreading and are increasing the cost of healthcare, mainly due to the long stays at hospitals of patients suffering from MDR and XDR infection [ 116 ]. According to the WHO, bacteria resistant to more than two AB have been isolated from the same AB family, or from different families. These include carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii , carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa , vancomycin-resistant Enterococcus faecium , methicillin-resistant Staphylococcus aureus with intermediate sensitivity and resistance to vancomycin, campylochrine-resistant Helicobacter pylori spp. resistant to fluoroquinolones, Salmonellae resistant to fluoroquinolones, Neisseria gonorrhoeae resistant to cephalosporin and fluoroquinolones, Streptococcus pneumoniae without sensitivity to penicillin, Haemophilus influenzae resistant to ampicillin, and Shigella spp. resistant to fluoroquinolones [ 110 , 117 ]. To control the indiscriminate use of AB, strategies have been implemented to mitigate the impact of MDR on patients and economy, such as social campaigns by health professionals focused on the regulation and proper use of medications, which have been largely ineffective [ 115 ]. At the same time, PAHO has created an antibiotic surveillance network, studying the susceptibility of some bacteria to AB in order to take actions for continuous improvement and good management by clinical personnel [ 118 ]. Highly toxic or narrow therapeutic window antimicrobials, such as aminoglycosides, glycopeptides, and some β-lactams (e.g., carbapenems), are being used [ 119 , 120 ], characterized by high nephrotoxicity, neurotoxicity, or muscular toxicity. However, at present, medical personnel has been forced to treat some patients with these drugs as an effective way for growth inhibition the of pathogenic bacteria [ 121 ]. Therefore, in order to avoid adverse reactions from this type of drug, it is necessary to measure the levels of AB with narrow therapeutic window, leading to personalized medicine that could have a high impact in public health and global economy. Nowadays, therapeutic drug monitoring (TDM) has become a fundamental tool to control AB doses in critically ill patients, increasing the chances of overcoming MDR bacterial infections. In this sense, nanobiotechnology is an innovative solution for mitigating the antimicrobial resistance. In particular, the use of nanobiosensors for AB detection in plasma of patients allow the real time quantification on site, using a low sample size easily and quickly [ 14 , 15 , 22 ]. These point of care devices are a helpfully tools for clinicians to decision making [ 24 ], reducing the impact of infections by MDR strains and, therefore, contributing to control this worldwide public health issue [ 23 , 24 ]. 3. Therapeutic Drug Monitoring (TDM) TDM has been used since the early 1970s to personalize pharmacotherapy, with the aim of individualizing the dose of a drug, keeping drug concentrations in body fluids within a target range, minimizing adverse effects on the patient, and helping health personnel to determine the correct dose [ 160 ]. TDM helps to decrease PK variability (effects caused by the organism on the drug, in terms of absorption, bioavailability, distribution, metabolism, and excretion) and PD variability (effects of the drug on the organism, studying receptor binding and chemical interactions) [ 161 ]. According to WHO reports, certain criteria allow for determining whether a drug needs to be monitored, including: (i) pharmacokinetic variability, (ii) adverse and therapeutic effects related to concentration, (iii) narrow therapeutic index, (iv) undefined range of therapeutic concentration, and (v) difficult to control desired therapeutic effect ( Figure 2 ) [ 6 , 10 ]. These criteria allow for understanding drug interactions in the body, so they are useful in cases where it is not clear whether the correct medication is being administered, if drug–drug interactions are occurring, or if poisoning is occurring [ 7 ]. According to the WHO, the drugs that require monitoring are AB (aminoglycosides and glycopeptides, β-lactams, fluoroquinolones, oxazolidinones, lipopeptides, and polymyxins), anticonvulsants (valproic acid, phenytoin, phenobarbital, and carbamazepine), cytotoxic drugs (methotrexate), antiarrhythmics (digoxin), and immunosuppressants (cyclosporine), because they are indispensable drugs for the treatment of a large number of diseases in today's clinic [ 162 ]. At the same time, TDM has had a positive impact in economic terms, since it has allowed reduce the costs of hospitalization of patients through an effective dose of the correct medication, gradually eliminating the triggering of future related pathologies. It also allows clinicians to use drugs with a narrow therapeutic window [ 7 ]. 3.1. Therapeutic Drug Monitoring of Antibiotics as Personalized Medicine Most drug dosages were defined in healthy adults during the drug development phase [ 11 ] by assessing the condition of a selective group of patients. However, these characteristics are not representative of all the patients who use these drugs, due to PK variability [ 12 ]. The "one dose for all" strategy is a mistake; it is the cause of death of some patients in health centers [ 163 ]. For correct managing the adverse effects of antibiotics in patients, a strategy directed towards personalized medicine is being implemented, which allows for determining the dose of the drug depending on the genetic, physical, and clinical condition of the patient, by means of assessing the concentrations of the drug in different body fluids [ 164 ]. TDM in the management of AB is mainly used to find a personalized dose that allows successful antibiotic therapy, low probabilities of AR, and minimizes side effects in patients as much as possible [ 120 ]. The main groups of AB reported in the literature that require TDM are aminoglycosides, glycopeptides, β-lactams, fluoroquinolones, oxazolidinones, lipopeptides, and polymyxins. The PK and PD variability of each patient must be taken into account, and TDM could become necessary for some AB for which this is not routinely performed, since they can represent a risk to life, as observed in Table 2 . Regarding the groups reported in the literature, aminoglycosides induce nephrotoxicity, ototoxicity, and neuromuscular blockage due to the presence of a positive charge at physiological pH [ 120 ]. Nephrotoxicity is mainly due to the fact that aminoglycosides are excreted by glomerular filtration, unmodified, and toxicity is mainly due to the absorption of AB in the epithelial cells of the proximal renal tubules after filtration, causing accumulation of AB, generating morphological and functional problems [ 165 ]. The toxicity incidence data range between 5 to 25% of treated patients and is related to the duration of administration and the dose. On the other hand, ototoxicity is mainly manifested by cochlear or vestibular damage and in most cases is irreversible if it is not detected in time [ 120 ]. The AB classes (e.g., fluoroquinolones, aminoglycosides, lipopeptides) show different measures of exposures, such as the peak concentration, AUC, and AUC/minimum inhibitory concentration (MIC). These parameters are correlated with the PK/PD modelling to aid the dose selection and dose optimization of antimicrobial agents. In this way, TDM provides a higher possibility of clinical success [ 166 ]. The measurement in serum/plasma of AB is generally done by chromatography analysis (HPLC and UV), but other methods can be used, such as nanobiosensors and immunochromatography, which does not require specialized equipment or toxic solvents [ 167 , 168 ]. Thus, it is necessary to establish a dosage regimen in which AB concentrations are measured, especially in prolonged medication use [ 119 ], considering the minimum and maximum serum concentrations after the third dose. Thus, depending on the drug, average serum concentration ranges have been established in which the drug is toxic. For example, gentamicin is nephrotoxic at concentrations >0.5–2 mg/L [ 169 ], tobramycin at >1 mg/L [ 13 ] and amikacin at >5 mg/L [ 13 ]. Plasma levels higher than these, could affect the proper functioning of the body and even lead to death. Another interesting case is the glycopeptides, including vancomycin and teicoplanin [ 120 ]. Vancomycin is generally administered when the bacteria causing the infection are resistant to other lower spectrum AB. Studies have shown that high plasma vancomycin concentrations increase the risk of ototoxicity and nephrotoxicity, so an average plasma concentration of 12 to 15 mg/L should be maintained [ 170 , 171 , 172 ]. In addition, recent research has shown that this drug increases the toxicity of other nephrotoxic AB, such as aminoglycosides, leading to the production of antibodies and causing thrombocytopenia and bleeding [ 173 ]. Regarding teicoplanin, the incidence of nephrotoxicity is lower than in patients treated with vancomycin, but it is recommended to perform TDM in order to achieve the effectiveness of the antibiotic with plasma concentrations of 0.5–2 mg/L [ 169 ], tobramycin at >1 mg/L [ 13 ] and amikacin at >5 mg/L [ 13 ]. Plasma levels higher than these, could affect the proper functioning of the body and even lead to death. Another interesting case is the glycopeptides, including vancomycin and teicoplanin [ 120 ]. Vancomycin is generally administered when the bacteria causing the infection are resistant to other lower spectrum AB. Studies have shown that high plasma vancomycin concentrations increase the risk of ototoxicity and nephrotoxicity, so an average plasma concentration of 12 to 15 mg/L should be maintained [ 170 , 171 , 172 ]. In addition, recent research has shown that this drug increases the toxicity of other nephrotoxic AB, such as aminoglycosides, leading to the production of antibodies and causing thrombocytopenia and bleeding [ 173 ]. Regarding teicoplanin, the incidence of nephrotoxicity is lower than in patients treated with vancomycin, but it is recommended to perform TDM in order to achieve the effectiveness of the antibiotic with plasma concentrations of <10 mg/L [ 174 , 175 ]. In the case of β-lactams, these AB are still widely used in the clinical setting due to the wide therapeutic range and the fact that they are rarely toxic [ 176 ]. However, in recent decades, due to changes in the minimum inhibitory concentration (MIC) of microorganisms and clinical alterations in critically ill patients, the therapeutic window has been reduced, mainly in the intensive care unit ICU [ 177 ]. The main monitored β-lactams are carbapenems, such as meropenem. According to studies reported in the literature, toxicity has been reported in critically ill patients with special conditions, such as dialysis treatment [ 178 , 179 , 180 ]. Fluroquinolones are generally safe AB, but adverse effects are inherent in patients with previous pathologies related to the gastrointestinal tract, central nervous system, kidneys, and tendons [ 181 , 182 , 183 ]. Furthermore, its bactericidal activity increases as the concentration of the drug increases in serum, becoming 10 times the MIC [ 184 ]. This makes it possible to generate a risk of overdose or a subtherapeutic action of the drug [ 13 ]. According to this, it has become necessary to monitor this type of drugs depending on the patient's condition. Linezolid is an oxazolidinone with a recommended daily dose of 600 mg twice daily and does not require TDM under current guidelines [ 185 ]. In contrast, recent studies have shown that this dose does not reach the therapeutic range in a considerable number of critically ill patients or those with kidney failure [ 186 , 187 ]. This is mainly due to changes in protein binding or drug metabolism, leading to high variability in plasma concentrations [ 188 ]. Garrabau et al. determined that, according to the genetic status of the patient, linezolid can produce mitochondrial toxicity in blood cells and nerve fibers of the skin [ 189 ]. Thus, it is necessary to monitor this type of molecule in patients who are in the ICU [ 13 ]. On the other hand, daptomycin requires TDM depending on the patient's condition, mainly in septic and critical states [ 190 ]. Recent studies report musculoskeletal toxicity in patients receiving the antibiotic along with statins [ 191 , 192 ], with the presence of rhabdomyolysis after the administration of this drug regardless of dose [ 193 ]. In addition, liver damage can occur due to elevations in serum creatinine phosphokinase [ 194 ]. In 2019, Raza and coworkers found what they called a "rarity among rarities", but which is currently affecting many patients: daptomycin is capable of inducing eosinophilic pneumonia, which is caused by the detection of an antigen by alveolar macrophages [ 195 ]. Despite advances and the effort in the search for new molecules, research has focused on determining the PK parameters of some AB that had been discontinued due to adverse effects, such as colistimethate sodium (CMS), the prodrug of colistin, in order to find the optimal dose to maintain an adequate benefit-risk balance [ 196 ]. Currently, there is controversy regarding the dose of CMS. The FDA, for example, proposes a recommended dose for colistin in the range of 2.5 to 5 mg/kg, while researchers in Europe recommend doses between 50,000 to 80,000 IU/kg. The simple fact of having different units has caused confusion amongst clinicians and can lead to overdose, increasing the side effects, or underdosing with the development of greater resistance and mortality ( Table 2 ) [ 197 ]. Despite the fact that TDM is used more frequently for AB with a narrow therapeutic window, the interest in using TDM is increasing due to the raising number of patients for whom the PK of the antibiotic is not defined, causing ups and downs when controlling the infection (e.g., critical illness, significant comorbidities, the elderly, and extremes of body size) [ 8 , 198 , 199 ]. This will allow us to take actions to reduce the inappropriate use of AB, in order to control the growing public health problems that MDR bacteria are generating. To find a solution to this problem, it is necessary to generate strategies that allow the proper use and administration of these drugs. One of these strategies is the correct dosage of the AB, considering that most doses are currently delivered uniformly to patients, without taking into account the progress of the infection and the clinical picture [ 14 , 200 ]. In recent years, laboratory techniques have been used for measurement and monitoring of AB molecules. 3.2. Antibiotic Quantification Methods The quantification and monitoring of AB is based on the development of laboratory techniques, including high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), immunoassays, bacterial-growth-inhibition-based assays, and biosensors. Chromatographic techniques, including HPLC, are the reference techniques, robust, and with a high specificity. However, they require trained personnel, specialized laboratories with necessary equipment, and reagents, as well as extensive and time consuming sample processing procedures. Therefore, it is not possible get results in real time and also, due to the high cost, most hospitals in underdeveloped countries do not have the resources to implementation. However, they have been widely used for the quantification of AB, including β-lactams, macrolides, glycopeptides, daptomycin, and meropenem, due to their robustness and ability to quantify molecules in different matrices [ 228 , 229 , 230 , 231 , 232 , 233 ]. Herregodts and collaborators in 2019 reported a novel technique consisting on a device able to determine piperacillin/tazobactam or meropenem concentrations in exhaled air in critically non-ventilated patients. This device, called ExaBreath ® , retains the antibiotic molecules that are analyzed by mass spectrometry after a purification process [ 234 ]. On the other hand, immunoassays are based on the selectivity and affinity of an antibody for the antigen. They are cheaper techniques compared to chromatography but also require a laboratory, reagents, and trained laboratory personnel [ 235 ]. These techniques include enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), which are able to detect gentamicin and vancomycin in samples containing proteins with ranges of 2–500 ng/mL for gentamicin and 20–5000 ng/mL for vancomycin [ 236 ]. Fluoroquinolones, such as levofloxacin, have also been detected in urine using a fluorescence polarization immunoassay assay ranging from 2.5 to 50 ng/mL based on garenoxacin labeled with 4-aminomethylfluorescein and polyclonal antibodies (pAb) against levofloxacin [ 237 ] ( Table 3 ). For an AB like colistin, pAb have been used for quantification, mainly in food [ 238 , 239 ]. In addition, tobramycin and kanamycin have been determined with a lower limit of quantification of 0.30 mg/L, verified in human plasma [ 240 ]. Due to the precision, selectivity, reliability, and low cost based on this technique there are several commercial kits and reagents on the market that allow the determination of some AB requiring TDM. Some examples of commercial kits include QMS ® Tobramycin (TOBRA), QMS ® Gentamicin (GENT), QMS ® Vancomycin, Monoclonal Antibody Penicillin (mAb) (P2B9), and ARK™ Linezolid assays. In the case of bacterial-growth-inhibition-based assays, they can determinate the presence or absence of AB in patient or food samples. These tests are performed by inoculating dilutions of the body fluid or food samples on a bacterial culture sensitive to the administered drug [ 262 ]. This technique is inexpensive, and the presence or absence of AB in a sample is determined easily. However, it has low sensitivity and robustness, since it is limited by time and conditions of the culture medium [ 263 , 264 , 265 ]. Finally, an innovative solution to this problem is the use of nanobiotechnology, specifically biosensors, for the quantification of AB in samples of body fluids [ 15 , 266 , 267 ]. 4. Nanobiosensors as Bioanalytic Applications in the Quantification of Antibiotics In recent years, biosensors have become an interdisciplinary tool of great help in clinical diagnostic processes and in different industries, such as food and agriculture [ 268 ]. They are characterized by high sensitivity, selectivity, and reliability that ensure that the biosensor interacts exclusively with the compound of interest, minimizing background noise. In addition, these devices have a long lifetime and are simple to handle, portable, and can be automated and miniaturized. Regarding the sample, this method has a low cost of analysis, no complicated pre-treatment is required, and the analysis time is short [ 269 , 270 , 271 , 272 , 273 ]. These features make biosensors an attractive alternative for compound quantification. According to International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), a biosensor is defined as "a device that uses specific biochemical reactions mediated by isolated enzymes, immunosystems, tissues, organelles or whole cells to detect chemical compounds usually by electrical, thermal or optical signals" [ 274 ]. In other words, biosensor means a compact analytical device that incorporates a biological recognition element closely associated with or integrated into a transducer that allows the processing of the signal generated by the interaction between the recognition element and the ligand [ 275 ]. According to that, biosensors are classified in terms of the nature of the biological component and the transduction system used [ 276 ]. The biological components are classified as biocatalytic or affinity. Biocatalytic components use biocatalysts in isolated enzymes or multi-enzyme systems, cell organelles, whole cells, or animal/plant tissues. The signal is based on the measurement of the products generated by the catalyzed chemical reaction between the enzyme and the substrate [ 277 ]. Affinity bioreceptors are based on the interaction between the analyte and the recognition element, generating an analyte-receptor complex, which is detected by labeling (enzymatic or fluorescent) or by monitoring the change of a physical–chemical property of the transducer. The most commonly used biological components are antibodies, nucleic acids, microorganisms, aptamers, and receptor proteins [ 278 ]. Regarding transduction system, it is the biosensor element that turns variations in physical or chemical properties produced by the interaction between the analyte and the ligand into a signal that can be amplified, stored, and recorded [ 275 ]. There are different types of transducers, including electrochemical (amperometric, potentiometric and impedimetric), optical (fiber optic, surface plasmon resonance (SPR), surface-enhanced Raman scattering and biosensors of total internal reflection fluorescence (SERS), piezoelectric (microbalances of quartz crystals), and nanomechanical (nanolevers) [ 279 ]. Depending the nature of the sample and the analyte-ligand interaction, it is possible to choose the appropriate device. Table 3 shows the biosensors types used in AB quantification. 4.1. Electrochemical Biosensors Electrochemical biosensors measure the electrochemical change produced by the analyte–ligand interaction [ 280 ]. Depending the type of signal obtained, they are classified as potentiometric (electrical potential difference) [ 281 ], amperometric (current generated by reduction and oxidation of electroactive substances) [ 282 ], or impedimetric (changes in conductance) [ 283 ]. Electrochemical biosensors have been used for the quantification of aminoglycosides in blood serum with ribonucleic acid (RNA) aptamers with a detection range of 2–6 µM [ 241 ]. Amperometric biosensors have been used for the quantification of some AB molecules, such as penicillin G, by using gold nanoparticles (NP), with catalytic hydrolysis of AB with a low limit of detection (LOD) of 4.5 nM [ 242 ]. In addition, detection of chloramphenicol and kanamycin have been carried out with the use of antibodies as bioreceptors, with LODs of 45 µg/L and 6.31 μg/L, respectively [ 24 ]. This result is promising in contrast to LODs obtained by HPLC, where values of 38 mg/L have been reported [ 284 ]. The presence of amikacin in buffer solutions has also been determined using a carbon paste electrode modified with nano-sized copper oxide, obtaining an LOD of 0.58 µg/mL [ 243 ], compared to the LOD obtained by HPLC of 2.34 µg/mL [ 285 ]. Moreover, amperometric biosensors have been used in the food industry to quantify fluoroquinolones in milk, by combining modified magnetic beads with broad recognition profile antibodies for fluoroquinolones, with a haptenized enzyme and an electrode composed of magnetic graphite-epoxy (m-GEC). This was a highly reliable, fast, simple, and cost-effective device, with an LOD of 0.009 µg/L [ 244 ]. Regarding impedimetric biosensors, tobramycin, an aminoglycoside with a narrow therapeutic range, and several side effects, has been quantified in human serum using an RNA aptamer as a recognition element. The LOD obtained was 0.7 µM, concluding that detection of the antibiotic is limited by the dilution of the sample [ 245 ], in contrast with that reported by Shou et al., where the LOD for tobramycin in tissue fluid using the HPLC-MS/MS was 0.75 mg/L [ 286 ]. Impedimetric devices have been reported to detect AB in buffer, as is the case of label-free detection of ciprofloxacin based on the immobilization of anti-ciprofloxacin antibodies by chemical binding on a film of poly(pyrrole-NHS) electrogenerated on a solid gold substrate, showing an LOD of 10 pg/mL [ 246 ], lower than the obtained by HPLC in body fluids (0.05 μg/mL) [ 287 ]. Impedimetric biosensors have been used to quantify AB in different matrices, such as milk. An example of this is the detection of penicillin using a technology called Capture-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). This technique is based on selection of deoxyribonucleic acid (DNA) aptamers using penicillin in solution, while a single stranded DNA (ssDNA) library is fixed on a support, providing an LOD of 0.17 µg/L [ 247 ]. Penicillin has also been quantified with a magnetic graphene nanoparticle (NP) nanocomposite (GR-Fe 3 O 4 NP) and a gold (PEDOT-AuNP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) NP compound, with an LOD of 0.057 ng/mL [ 248 ]. In addition, tetracyclines in milk have been quantified through the use of antibodies by testing an electrode based on oleic acid and modified carbon paste, which allowed a minimum LOD of 3.8 fM, showing high selectivity between different types of tetracycline [ 249 ]. Potentiometric biosensors have been used for the quantification of ofloxacin in urine and serum with an LOD of 10 μM. Further research determined that there is no significant interference from the excipients found in commercial formulations, nor in the different ions present in body fluids, allowing quantification without markers or interfering potentials [ 250 ]. As the above devices, potentiometric biosensors have been used in the detection of penicillin in foods, such as milk, with an LOD of 3 mM [ 288 ] or in the detection of sulfamethoxazole for environmental control [ 289 ]. 4.2. Optical Biosensors Optical biosensors are devices that detect changes in the properties of light, such as refractive index, absorption, fluorescence, or light scattering, as a result of the interaction between the analyte and the receptor [ 290 ]. These devices are grouped into two categories: bio-optrods and evanescent field-based sensors. The former are based on the interaction between the analyte and a reagent immobilized at the end of a fiber, producing a quantifiable change in the optical properties of the transducer, optically monitored by dyes, fluorescent, and biochemiluminescent molecules. Within these biosensors are fiber optic devices [ 291 ]. The evanescent field biosensors are based on the guidance of electromagnetic waves, transmitting light through internal reflections under conditions of total reflection, creating an evanescent field capable of penetrating certain distance from the surface of the waveguide modified with the receiver [ 292 ]. Within this type are included SPR devices, SERS devices, total internal reflection fluorescence (TIRF) biosensors, optical waveguide interferometric biosensors, ellipsometric biosensors, and spectroscopy biosensors employing reflectometric interference. Fiber optic biosensors consist in a fiber where the recognition element is immobilized at the end. As a consequence of the interaction between the analyte and the recognition element, a change is generated in the marker, which spreads through the fiber to the detector [ 275 ]. This type of biosensor has been used in the quantification of tetracycline, oxytetracycline, and doxycycline with an anthracene-containing copolymer prepared from 9-anthrylmethyl methacrylate, methyl methacrylate, and n-butyl acrylate (PAMB). Detection is based on quenching of the fluorescence of the fiber due to the presence of the antibiotic in commercial and urine samples. The LODs are 0.1 μM for tetracycline and 2 μM for oxytetracycline and doxycycline [ 251 ]. This type of biosensor has also been reported for the quantification of antibiotic molecules in different matrices, such as foods or buffers, as in the case of doxorubicin and daunorubicin buffer solutions using LED fiber optics induced fluorescence, with LODs of 18 ng/mL and 13 ng/mL, respectively [ 23 ]. This method has also been used for the detection of moxifloxacin by hollow core photonic crystal fibers (HCPCF), with an LOD of 682.43 ng/mL in aqueous solution [ 252 ]. Korposh et al. have quantified vancomycin in porcine blood plasma enriched by means of long-term fiber optic grids functionalized with molecularly imprinted polymer NP (LPFG-MIP NPs), obtaining a very low LOD of 0.0032 ng/mL. This fiber optic sensor is capable of detecting target AB at low concentrations (~700 μM), even with traces of amoxicillin, bleomycin, and gentamicin in the medium [ 22 ]. In food sector, they have been very useful in detecting AB, such as sulfadimidine in dairy products, with an LOD of 0.05 ng/mL, using a portable and reusable optofluidic-based biosensing platform. This method has high sensitivity, portability, and acceptable reproducibility for the detection of sulfadimidine in real time in milk and other dairy products [ 253 ]. Surface resonance plasmon optical biosensors (SPRs) are based on an optical phenomenon generated when a polarized light beam is directed to a lower refractive index layer (metallic layer of gold or silver) between the prism and the sample. This light generates the excitation of a surface plasmon for a certain angle of incidence of said light, known as the resonance angle. The binding of the analytes with their recognition element induces a change in the refractive index and as a consequence the displacement of the resonance angle [ 275 , 293 ]. This type of biosensor has been used in different applications, such as in the clinic where tobramycin has been detected in patient serum based on a portable, palm-sized localized surface transmission plasmon resonance (T-LSPR) configuration. This device consist in standard components coupled with tobramycin-specific DNA aptamers, reaching a theoretical LOD of 3.4 μM, making it a portable, sensitive, and economical real-time measurement device [ 254 ]. Neomycin has been quantified by SPR using modified aptamers of ribonucleic acid (RNA), demonstrating that these aptamers can be modified to be resistant to enzymes, such as endonucleases, without variations in their analytical characteristics [ 294 ]. In addition to determination of AB in plasma samples, a large number of applications of SPR in the quantification of AB in food can be found in the literature. Faalnouri et al. have quantified amoxicillin in milk samples comparing a polymeric film (methacrylate hydroxyethyl-N-methacryloyl-(L)-glutamic acid) with similar polymer enclosing NP, finding LODs of 0.0012 ng/mL and 0.0009 ng/mL, respectively, according to the film, being a very sensitive technique for the detection of AB in milk [ 255 ]. Likewise, thiamphenicol, florfenicol, florfenicol amine, and chloramphenicol residues have been determined simultaneously in shrimp, using SPR with LODs of 0.1, 0.2, 250, and 0.5 ppb, respectively. These results show greater sensitivity with those obtained by an ELISA immunoassay [ 295 ]. The quantification of tetracycline hydrochloride and oxytetracycline hydrochloride in buffer solutions using a molecular printed polymer (MIP) has been reported based on various binding sites/nanocavities having the complementary form of the functional groups of the target molecules on its surface. This method raised LODs of 4.23 ng/mL for tetracycline and 4.05 ng/mL for oxytetracycline [ 296 ]. Likewise, traces of erythromycin in milk and honey have been quantified with LODs of 47.41 ng/mL and 28.48 ng/mL, respectively [ 256 ]. Sulfamethoxazole, an AB widely used for the treatment of infections and diseases in animals, such as chickens and cattle, has been quantified in the veterinary field. Detection was based on the SPR technique and functionalized carbon nanotubes (CNT), with an LOD of 225.98 ng/mL, lower than the corresponding to other techniques, such as Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA [ 297 ]. In addition, neomycin has been quantified by molecular coupling with bovine serum albumin (BSA), demonstrating a strong interaction between the AB and protein at different concentrations (1–128 µM) using low density carboxymethyl dextran (CMD) modified gold surface chips [ 298 ]. Using the same method, other types of antibiotic molecules have been quantified, such as rifampicin, by immobilizing BSA on a carboxymethyl dextran hydrogel chip [ 298 ]. This is an alternative to the quantification of AB using SPR optical biosensors. 4.3. Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) This type of biosensor is based on the intensity amplification of the Raman phenomenon by using metallic NP or metallic structures. When two particles get in contact and one of them has a rougher material on the surface, the electromagnetic field is dramatically amplified, resulting in a large amplification in Raman scattering [ 168 ]. There are few papers in the literature on the use of these devices in the clinic. One of them was carried out by Markina et al., where SERS was combined with liquid-liquid extraction in sulfamethoxazole-enriched urine, using silver NP stabilized with hydroxylamine as the SERS substrate, providing an LOD of 1.7 µg/mL. This would be quite useful to clinical staff, because this type of antibiotic is highly toxic when mixed with trimethoprim [ 257 ]. Furthermore, urine ceftriaxone has been quantified with the use of gold NP, with an LOD of 0.7 µM in a sample volume of 1 mL [ 258 ]. Moreover, Liu and collaborators quantified levofloxacin in mouse blood using a gold nanoparticle-coated fiber optic nanoprobe and SERS to measure levofloxacin lactate, representing a great opportunity to measure this type of AB in blood [ 299 ]. However, these types of devices have been used mostly in the food and environmental fields. For example, chloramphenicol has been detected in dairy products and honey by means of a polymer surface with a molecular impression, giving results in 15 min [ 300 ]. In addition, this technique has been used for the detection of ampicillin, penicillin G, carbenicillin, and penicilloic acid in deionized water by the use of hydroxylamine silver nanoparticles, with detection limits of 27, 29, 30, and 28 ng/mL, respectively. This is a promising methodology for the detection of different antibiotic molecules, including the penicillins, opening a new window to AB quantification [ 259 ]. Another application is the quantification of tetracycline in water samples using a Raman fingerprint strip sensor, coated with an anti-tetracycline mAb, obtaining an LOD of 0.04 ng/mL [ 260 ]. The use of gold nanoparticles and macroporous silicon provided high performance regarding the detection of the antibiotic with an LOD of 1 nM, compared to traditional techniques at pH between 5 and 6 [ 261 ]. This type of biosensor has also allowed the detection of quinolone residues in drinking water using silver NP and titanium dioxide (Ag-TiO2), with high detectability of difloxacin hydrochloride, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin, and enoxacin, with LODs of 4.36, 70.8, 39.4, 31.6, and 315 pM, respectively. These concentrations are below the European Union (EU) maximum residue limit (3.01 × 10 −7 mol/L) [ 301 ]. 4.4. Piezoelectric (Quartz Crystal Microbalance) Piezoelectric systems measure direct mass changes induced by the formation of the antigen–antibody complex (Ag-Ac). These devices consist on an oscillating crystal that resonates at a certain frequency when the interaction between the recognition element and the analyte takes place [ 275 ]. Most of these types of biosensors have been applied for the detection of AB in other fields different to clinic, such as food. Penicillin G and ampicillin have been detected in buffer using molecular printed nanoparticulate polymers (NMIP) as recognition element. LOD values of 0.04 µg/mL were found for penicillin G and 0.09 μg/mL for ampicillin [ 302 ]. Piezoelectric sensors have also been developed for the detection of β-lactams (penicillin G and cefotaxime) with LODs of 3.0 and 7.6 ng/mL, respectively, in meat and milk [ 302 , 303 ]. Furthermore, tetracycline molecules have been quantified by a molecularly imprinted polymer (MIP) with an LOD of 3 × 10 −7 µg/mL [ 304 ]. 4.5. Nanomechanical Biosensors In this type of biosensor the biological recognition element is immobilized on the surface of a microlever, generally made of silicon, which is immersed in a liquid sample. The interaction between the analyte and the ligand induces a differential change in the surface tension of the liquid, which generates a change in deflection and/or in the resonance frequency [ 275 ]. Nanomechanical biosensors have been used in different areas, mainly in the identification of pathogens in human samples [ 305 ] and for the identification of proteins, such as topoisomerases or cancer marker proteins [ 306 , 307 , 308 , 309 , 310 ]. However, there is no evidence that this type of device was applied to the detection or quantification of antibiotics in samples of body fluids. 4.1. Electrochemical Biosensors Electrochemical biosensors measure the electrochemical change produced by the analyte–ligand interaction [ 280 ]. Depending the type of signal obtained, they are classified as potentiometric (electrical potential difference) [ 281 ], amperometric (current generated by reduction and oxidation of electroactive substances) [ 282 ], or impedimetric (changes in conductance) [ 283 ]. Electrochemical biosensors have been used for the quantification of aminoglycosides in blood serum with ribonucleic acid (RNA) aptamers with a detection range of 2–6 µM [ 241 ]. Amperometric biosensors have been used for the quantification of some AB molecules, such as penicillin G, by using gold nanoparticles (NP), with catalytic hydrolysis of AB with a low limit of detection (LOD) of 4.5 nM [ 242 ]. In addition, detection of chloramphenicol and kanamycin have been carried out with the use of antibodies as bioreceptors, with LODs of 45 µg/L and 6.31 μg/L, respectively [ 24 ]. This result is promising in contrast to LODs obtained by HPLC, where values of 38 mg/L have been reported [ 284 ]. The presence of amikacin in buffer solutions has also been determined using a carbon paste electrode modified with nano-sized copper oxide, obtaining an LOD of 0.58 µg/mL [ 243 ], compared to the LOD obtained by HPLC of 2.34 µg/mL [ 285 ]. Moreover, amperometric biosensors have been used in the food industry to quantify fluoroquinolones in milk, by combining modified magnetic beads with broad recognition profile antibodies for fluoroquinolones, with a haptenized enzyme and an electrode composed of magnetic graphite-epoxy (m-GEC). This was a highly reliable, fast, simple, and cost-effective device, with an LOD of 0.009 µg/L [ 244 ]. Regarding impedimetric biosensors, tobramycin, an aminoglycoside with a narrow therapeutic range, and several side effects, has been quantified in human serum using an RNA aptamer as a recognition element. The LOD obtained was 0.7 µM, concluding that detection of the antibiotic is limited by the dilution of the sample [ 245 ], in contrast with that reported by Shou et al., where the LOD for tobramycin in tissue fluid using the HPLC-MS/MS was 0.75 mg/L [ 286 ]. Impedimetric devices have been reported to detect AB in buffer, as is the case of label-free detection of ciprofloxacin based on the immobilization of anti-ciprofloxacin antibodies by chemical binding on a film of poly(pyrrole-NHS) electrogenerated on a solid gold substrate, showing an LOD of 10 pg/mL [ 246 ], lower than the obtained by HPLC in body fluids (0.05 μg/mL) [ 287 ]. Impedimetric biosensors have been used to quantify AB in different matrices, such as milk. An example of this is the detection of penicillin using a technology called Capture-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). This technique is based on selection of deoxyribonucleic acid (DNA) aptamers using penicillin in solution, while a single stranded DNA (ssDNA) library is fixed on a support, providing an LOD of 0.17 µg/L [ 247 ]. Penicillin has also been quantified with a magnetic graphene nanoparticle (NP) nanocomposite (GR-Fe 3 O 4 NP) and a gold (PEDOT-AuNP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) NP compound, with an LOD of 0.057 ng/mL [ 248 ]. In addition, tetracyclines in milk have been quantified through the use of antibodies by testing an electrode based on oleic acid and modified carbon paste, which allowed a minimum LOD of 3.8 fM, showing high selectivity between different types of tetracycline [ 249 ]. Potentiometric biosensors have been used for the quantification of ofloxacin in urine and serum with an LOD of 10 μM. Further research determined that there is no significant interference from the excipients found in commercial formulations, nor in the different ions present in body fluids, allowing quantification without markers or interfering potentials [ 250 ]. As the above devices, potentiometric biosensors have been used in the detection of penicillin in foods, such as milk, with an LOD of 3 mM [ 288 ] or in the detection of sulfamethoxazole for environmental control [ 289 ]. 4.2. Optical Biosensors Optical biosensors are devices that detect changes in the properties of light, such as refractive index, absorption, fluorescence, or light scattering, as a result of the interaction between the analyte and the receptor [ 290 ]. These devices are grouped into two categories: bio-optrods and evanescent field-based sensors. The former are based on the interaction between the analyte and a reagent immobilized at the end of a fiber, producing a quantifiable change in the optical properties of the transducer, optically monitored by dyes, fluorescent, and biochemiluminescent molecules. Within these biosensors are fiber optic devices [ 291 ]. The evanescent field biosensors are based on the guidance of electromagnetic waves, transmitting light through internal reflections under conditions of total reflection, creating an evanescent field capable of penetrating certain distance from the surface of the waveguide modified with the receiver [ 292 ]. Within this type are included SPR devices, SERS devices, total internal reflection fluorescence (TIRF) biosensors, optical waveguide interferometric biosensors, ellipsometric biosensors, and spectroscopy biosensors employing reflectometric interference. Fiber optic biosensors consist in a fiber where the recognition element is immobilized at the end. As a consequence of the interaction between the analyte and the recognition element, a change is generated in the marker, which spreads through the fiber to the detector [ 275 ]. This type of biosensor has been used in the quantification of tetracycline, oxytetracycline, and doxycycline with an anthracene-containing copolymer prepared from 9-anthrylmethyl methacrylate, methyl methacrylate, and n-butyl acrylate (PAMB). Detection is based on quenching of the fluorescence of the fiber due to the presence of the antibiotic in commercial and urine samples. The LODs are 0.1 μM for tetracycline and 2 μM for oxytetracycline and doxycycline [ 251 ]. This type of biosensor has also been reported for the quantification of antibiotic molecules in different matrices, such as foods or buffers, as in the case of doxorubicin and daunorubicin buffer solutions using LED fiber optics induced fluorescence, with LODs of 18 ng/mL and 13 ng/mL, respectively [ 23 ]. This method has also been used for the detection of moxifloxacin by hollow core photonic crystal fibers (HCPCF), with an LOD of 682.43 ng/mL in aqueous solution [ 252 ]. Korposh et al. have quantified vancomycin in porcine blood plasma enriched by means of long-term fiber optic grids functionalized with molecularly imprinted polymer NP (LPFG-MIP NPs), obtaining a very low LOD of 0.0032 ng/mL. This fiber optic sensor is capable of detecting target AB at low concentrations (~700 μM), even with traces of amoxicillin, bleomycin, and gentamicin in the medium [ 22 ]. In food sector, they have been very useful in detecting AB, such as sulfadimidine in dairy products, with an LOD of 0.05 ng/mL, using a portable and reusable optofluidic-based biosensing platform. This method has high sensitivity, portability, and acceptable reproducibility for the detection of sulfadimidine in real time in milk and other dairy products [ 253 ]. Surface resonance plasmon optical biosensors (SPRs) are based on an optical phenomenon generated when a polarized light beam is directed to a lower refractive index layer (metallic layer of gold or silver) between the prism and the sample. This light generates the excitation of a surface plasmon for a certain angle of incidence of said light, known as the resonance angle. The binding of the analytes with their recognition element induces a change in the refractive index and as a consequence the displacement of the resonance angle [ 275 , 293 ]. This type of biosensor has been used in different applications, such as in the clinic where tobramycin has been detected in patient serum based on a portable, palm-sized localized surface transmission plasmon resonance (T-LSPR) configuration. This device consist in standard components coupled with tobramycin-specific DNA aptamers, reaching a theoretical LOD of 3.4 μM, making it a portable, sensitive, and economical real-time measurement device [ 254 ]. Neomycin has been quantified by SPR using modified aptamers of ribonucleic acid (RNA), demonstrating that these aptamers can be modified to be resistant to enzymes, such as endonucleases, without variations in their analytical characteristics [ 294 ]. In addition to determination of AB in plasma samples, a large number of applications of SPR in the quantification of AB in food can be found in the literature. Faalnouri et al. have quantified amoxicillin in milk samples comparing a polymeric film (methacrylate hydroxyethyl-N-methacryloyl-(L)-glutamic acid) with similar polymer enclosing NP, finding LODs of 0.0012 ng/mL and 0.0009 ng/mL, respectively, according to the film, being a very sensitive technique for the detection of AB in milk [ 255 ]. Likewise, thiamphenicol, florfenicol, florfenicol amine, and chloramphenicol residues have been determined simultaneously in shrimp, using SPR with LODs of 0.1, 0.2, 250, and 0.5 ppb, respectively. These results show greater sensitivity with those obtained by an ELISA immunoassay [ 295 ]. The quantification of tetracycline hydrochloride and oxytetracycline hydrochloride in buffer solutions using a molecular printed polymer (MIP) has been reported based on various binding sites/nanocavities having the complementary form of the functional groups of the target molecules on its surface. This method raised LODs of 4.23 ng/mL for tetracycline and 4.05 ng/mL for oxytetracycline [ 296 ]. Likewise, traces of erythromycin in milk and honey have been quantified with LODs of 47.41 ng/mL and 28.48 ng/mL, respectively [ 256 ]. Sulfamethoxazole, an AB widely used for the treatment of infections and diseases in animals, such as chickens and cattle, has been quantified in the veterinary field. Detection was based on the SPR technique and functionalized carbon nanotubes (CNT), with an LOD of 225.98 ng/mL, lower than the corresponding to other techniques, such as Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA [ 297 ]. In addition, neomycin has been quantified by molecular coupling with bovine serum albumin (BSA), demonstrating a strong interaction between the AB and protein at different concentrations (1–128 µM) using low density carboxymethyl dextran (CMD) modified gold surface chips [ 298 ]. Using the same method, other types of antibiotic molecules have been quantified, such as rifampicin, by immobilizing BSA on a carboxymethyl dextran hydrogel chip [ 298 ]. This is an alternative to the quantification of AB using SPR optical biosensors. 4.3. Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) This type of biosensor is based on the intensity amplification of the Raman phenomenon by using metallic NP or metallic structures. When two particles get in contact and one of them has a rougher material on the surface, the electromagnetic field is dramatically amplified, resulting in a large amplification in Raman scattering [ 168 ]. There are few papers in the literature on the use of these devices in the clinic. One of them was carried out by Markina et al., where SERS was combined with liquid-liquid extraction in sulfamethoxazole-enriched urine, using silver NP stabilized with hydroxylamine as the SERS substrate, providing an LOD of 1.7 µg/mL. This would be quite useful to clinical staff, because this type of antibiotic is highly toxic when mixed with trimethoprim [ 257 ]. Furthermore, urine ceftriaxone has been quantified with the use of gold NP, with an LOD of 0.7 µM in a sample volume of 1 mL [ 258 ]. Moreover, Liu and collaborators quantified levofloxacin in mouse blood using a gold nanoparticle-coated fiber optic nanoprobe and SERS to measure levofloxacin lactate, representing a great opportunity to measure this type of AB in blood [ 299 ]. However, these types of devices have been used mostly in the food and environmental fields. For example, chloramphenicol has been detected in dairy products and honey by means of a polymer surface with a molecular impression, giving results in 15 min [ 300 ]. In addition, this technique has been used for the detection of ampicillin, penicillin G, carbenicillin, and penicilloic acid in deionized water by the use of hydroxylamine silver nanoparticles, with detection limits of 27, 29, 30, and 28 ng/mL, respectively. This is a promising methodology for the detection of different antibiotic molecules, including the penicillins, opening a new window to AB quantification [ 259 ]. Another application is the quantification of tetracycline in water samples using a Raman fingerprint strip sensor, coated with an anti-tetracycline mAb, obtaining an LOD of 0.04 ng/mL [ 260 ]. The use of gold nanoparticles and macroporous silicon provided high performance regarding the detection of the antibiotic with an LOD of 1 nM, compared to traditional techniques at pH between 5 and 6 [ 261 ]. This type of biosensor has also allowed the detection of quinolone residues in drinking water using silver NP and titanium dioxide (Ag-TiO2), with high detectability of difloxacin hydrochloride, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin, and enoxacin, with LODs of 4.36, 70.8, 39.4, 31.6, and 315 pM, respectively. These concentrations are below the European Union (EU) maximum residue limit (3.01 × 10 −7 mol/L) [ 301 ]. 4.4. Piezoelectric (Quartz Crystal Microbalance) Piezoelectric systems measure direct mass changes induced by the formation of the antigen–antibody complex (Ag-Ac). These devices consist on an oscillating crystal that resonates at a certain frequency when the interaction between the recognition element and the analyte takes place [ 275 ]. Most of these types of biosensors have been applied for the detection of AB in other fields different to clinic, such as food. Penicillin G and ampicillin have been detected in buffer using molecular printed nanoparticulate polymers (NMIP) as recognition element. LOD values of 0.04 µg/mL were found for penicillin G and 0.09 μg/mL for ampicillin [ 302 ]. Piezoelectric sensors have also been developed for the detection of β-lactams (penicillin G and cefotaxime) with LODs of 3.0 and 7.6 ng/mL, respectively, in meat and milk [ 302 , 303 ]. Furthermore, tetracycline molecules have been quantified by a molecularly imprinted polymer (MIP) with an LOD of 3 × 10 −7 µg/mL [ 304 ]. 4.5. Nanomechanical Biosensors In this type of biosensor the biological recognition element is immobilized on the surface of a microlever, generally made of silicon, which is immersed in a liquid sample. The interaction between the analyte and the ligand induces a differential change in the surface tension of the liquid, which generates a change in deflection and/or in the resonance frequency [ 275 ]. Nanomechanical biosensors have been used in different areas, mainly in the identification of pathogens in human samples [ 305 ] and for the identification of proteins, such as topoisomerases or cancer marker proteins [ 306 , 307 , 308 , 309 , 310 ]. However, there is no evidence that this type of device was applied to the detection or quantification of antibiotics in samples of body fluids. 5. Conclusions The increasing number of MDR infections constitutes a public health problem that is affecting the healthcare systems and the economy worldwide. This has occurred as a result of AB mismanagement, not only in the health sector, but also in agriculture, livestock, and the pharmaceutical industry and has led to the use of highly toxic molecules with narrow therapeutic indices. For this reason, strategies have been implemented, such as determining the correct dosage in patients by TDM, the detection of AB in foods (mainly in chicken, meat, milk, and honey) and quantification in effluents from pharmaceutical companies. Biosensors are among the techniques used to quantify AB in different matrices in real time, at low cost and with highly reliable results. Since they are versatile, sensitive, and specific devices, they can be used on site and can be portable, providing advantages over conventional chromatography and immunoassay techniques, which are expensive techniques that require a specialized laboratory. The literature mainly reports on the use of biosensors in the quantification of AB in food for human consumption, as food is one of the main sources of traces of AB that lead to the generation of MDR. Biosensors represent a significant step toward the detection of AB in patient samples, in order to determine AB concentrations in patients in real time and, thus, provide personalized medicine by the means of TDM.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9609571/

Exploiting V -Gene Bias for Rapid, High-Throughput Monoclonal Antibody Isolation from Horses

Horses and humans share a close relationship that includes both species' viromes. Many emerging infectious diseases can be transmitted between horses and humans and can exhibit mortality rates as high as 90% in both populations. Antibody biologics represents an emerging field of rapidly discoverable and potent antiviral therapeutics. These biologics can be used to provide passive immunity, as well as blueprints for the rational design of novel active vaccine antigens. Here, we exploit the limited diversity of immunoglobulin variable genes used by horses to develop a rapid, high-throughput monoclonal antibody discovery pipeline. The antibodies isolated from two horses in this study were developed with near exclusivity from a few highly related germline genes within a single IgHV and IgλV gene family and could be recovered for cloning with just three primer pairs. This variable gene pairing was compatible with both horse and human immunoglobulin G isotypes, confirming the suitability of an equine antibody discovery pipeline for developing novel therapeutics to meet the One Health approach to infectious diseases. 1. Introduction The horse was likely first domesticated between four and six thousand years ago and has since elegantly bridged the gap between working and companion animal [ 1 ]. This co-evolution with humans has significantly shaped the species' genome, resulting in the selection of genes affecting speed, strength, physiology, development, and behaviour [ 2 ]. The close association between our two species has also fundamentally shaped human health. Historically, the horsepox virus (now extinct) is the most likely ancestor of the vaccinia virus vaccine, which was used to eradicate smallpox in humans by 1980 [ 3 ]. Equine plasma from hyperimmunised horses has been used for more than a hundred years to make snakebite antivenom which is needed to treat more than 2.5 million venomous bites every year, one fifth of which result in severe deformity, disability, or death [ 4 ]. This close relationship has also shaped our two species' viromes. Equine coronavirus (ECoV) and human coronavirus (hCoV) OC43 (as well as bovine-like coronaviruses) likely share a common ancestor [ 5 ]. More recently, equine and human viromes have converged again with the discovery of several emerging pathogens such as Eastern, Western and Venezuelan equine encephalitis, Japanese encephalitis, and West Nile, Nipah and Hendra viruses [ 6 , 7 , 8 ]. Understanding the equine immune response to these pathogens will help us to design better vaccines and therapies for both horses and humans. To this end, several studies have focused on characterising the immunoglobulin repertoire of the horse [ 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ]. Antibodies are composed of heavy (IgH) and light (Igλ or Igκ) chains, which can be further divided into constant and variable domains. Antigen recognition is primarily mediated by the complementarity determining regions (CDRs) [ 16 , 17 ]. Diversity within CDRs is achieved through the recombination of germline variable gene segments (IgHV, IgλV, IgκV) with diversity (IgHD) and joining (IgHJ, IgλJ, IgκJ) gene segments. In the horse, there are now 21 known and predicted functional IgHV genes, 9 potentially functional open reading frames (IgHV ORF ), and 74 IgHV pseudogenes, which can be recombined with 16 predicted functional IgHD genes and 28 potentially functional IgHD ORF , as well as 6 predicted functional IgHJ and 3 IgHJ ORF [ 18 ]. While there is no agreed standardisation and these genes have been renamed at least three times, a summary can be found on the international ImMunoGeneTics information system ® and in the associated literature [ 11 , 14 , 15 , 19 ]. More than 90% of circulating horse antibodies use the Igλ light chain [ 20 ], which can be formed from recombination of approximately 144 IgλV and 7 IgλJ genes [ 15 ]. As of October 2022, these Igλ genes have not been curated in the IMGT ® database. Antibodies can be repurposed as immunoglobulin therapeutics and have been developed as safe and highly effective pre- or post-exposure prophylactics for SARS-CoV-2, Ebola, respiratory syncytial virus, anthrax, and Clostridioides difficile [ 21 ]. Most of these antibodies have been isolated from infected humans, yielding fully human monoclonal antibodies. The speed of these discovery platforms has increased significantly over recent years, facilitating rapid therapeutic discovery as a component of pandemic preparedness [ 22 , 23 ]. A similarly efficient pipeline for the isolation of antibodies from horses would be of significant benefit, allowing for the rapid discovery of therapeutics to deadly equine pathogens such as African Horse Sickness (which has >90% mortality in naïve populations) [ 24 ], or emerging zoonotic pathogens infecting horses and humans [ 6 , 7 , 8 ]. Here, a rapid 14-day equine immunoglobulin discovery platform was developed. The high-throughput protocol was simplified using just two primer pairs that cover ~90% of IgH V - and Igλ V -genes used by the horse. A large fraction of the isolated antibodies derived from variable genes previously classed as an ORF or not recognised in older nomenclature. The expressed antibodies were natively paired, compatible with both equine and human IgG isotypes, and are therefore translatable into safe therapeutics for both equine and human use. 2. Materials and Methods 2.1. Donor Horses Two adult thoroughbred geldings enrolled in the South African Vaccine Producers (SAVP of the National Health Laboratories, South Africa) antivenom manufacturing program were selected for this study. The animals were chosen for their high-titre plasma antivenom elicited by immunisation, as well as the detection of low-level antibodies to ECoV strain NC99, possibly resulting from a prior exposure. Whole blood was collected from the horses (aged 5 and 8 years old) in CPDA-1 blood bags, and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated with SepMateTM isolation tubes and Lymphoprep™ density gradient medium using manufacturer recommended protocols (STEMCELL Technologies). Whole PBMC were cryopreserved in foetal bovine serum (FBS) containing 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) at 1 × 10 7 . Ethics waiver 20191129-CKW/O was obtained from the Animal Research Ethics Committee, of the University of the Witwatersrand, South Africa. 2.2. Antigen Preparation The ECoV strain NC99 C-terminal domain and subdomain 1 (spike positions 316 to 687) were subcloned into pCMV/R with a synthetic signal peptide (MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG), and a C-terminal HRV3C cleavage site (LEVLFQ/GP) followed by an 8× HisTag and an AviTag (LNDIFEAQKIEWHE). The protein was expressed in Expi293 cells (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) and purified sequentially by Ni Sepharose excel beads (Cytiva, Marlborough, MA, USA) and gel filtration. The AviTag was then biotinylated using BirA biotin ligase (Avidity, Aurora, CO, USA) and cleaned of excess biotin by dialysis. Whole lyophilised venom from Dendroaspis polylepis was resuspended at 50 mg/mL, biotinylated at primary amines with EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) by manufacturer recommendations and purified from excess biotin. Biotinylated D. polylepis venom, polyclonal goat anti-horse (Pierce, Waltham, MA, USA), or ECoV-NC99 CTD+SD1 protein was labelled with AlexaFluor488 (AF488), phycoerythrin (PE), or allophycocyanin (APC) fluorescent streptavidin using saturating levels of biotinylated protein. 2.3. Flow Cytometry PBMC was thawed in phosphate-buffered saline (PBS) containing 2% bovine serum albumin (BSA) and stained with LIVE/DEAD™ Fixable Violet stain (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) for 30 min at 4 °C. Cells were washed and then stained with anti-horse antibodies or antigen at concentrations between 0.2–1 μg/mL. After washing again, cells were resuspended in 2 mL PBS (2% BSA) and sorted as IgG+ and antigen single or double positive, at one cell per well, into PCR plates containing Rnasin ® Plus Ribonuclease Inhibitor (Promega, Madison, WI, USA) and IGEPAL CA-630. At completion, PCR plates were flash frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C. 2.4. Primer Design and Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) All primers ( Table 1 ) were designed based on immunoglobulin genes found in the EquCab3.0 reference genome (GCA_002863925.1, SAMN02953672, PRJNA421018). Primer sets EQ-HV and EQ-λ comprise the final high-throughput primer sets designed in this study. EQ-HC primers were used to check IgG isotype, and the EQ-λV-LEADER-17mix was used to fill in missing lambda sequences. EQ-κ primers were used to search for possible kappa light chains, while EQ-HV screening primers were used in the initial setup to look for non-dominant H V -gene representatives in bulk sorted cells. Thawed single B cell samples were reverse transcribed with SuperScript IV in the presence of fresh RNaseOUT, while immunoglobulin genes were amplified from resulting cDNA using Platinum™ SuperFi II DNA Polymerase and confirmed by size on 48-well E-Gel™ 2% Agarose Gels with SYBR™ Safe DNA Gel Stain, according to the manufacturer recommendations (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA). 2.5. PCR Purification and Cloning Once confirmed, PCR products were purified from 2% agarose gels using Zymoclean 96-well Gel DNA Recovery Kits (Zymo Research, Irvine, CA, USA) and cloned into pCMV/R using GeneArt™ HiFi Gibson Assembly kits (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA). Cloned products were transformed into XL-10 gold ultracompetent cells (Agilent) before plasmids were extracted using the Zyppy™ 96-well Plasmid Miniprep kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Both PCR products and plasmid preparations were confirmed by Sanger sequencing using the BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA). Heavy chain gene assignment was completed using IMGT ® /V-QUEST [ 25 , 26 ] while lambda gene assignment was carried out manually. 2.6. Immunoglobulin Expression and Screening Expi293 cells (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) were prepared in 24-well plates at 240 rpm, 37 °C, 80% relative humidity, 8% CO 2 and transfected with 1 μg each of sequence confirmed heavy and light chain plasmids. After 3–5 days, the supernatants were harvested by centrifugation at 5000× g for 20 min, and further clarified at 14,000 rpm (in a tabletop rotor) prior to screening. High binding ELISA plates (Corning, Corning, NY, USA) were coated with ECoV-NC99 CTD+SD1 or streptavidin at 4 μg/mL, or whole D. polylepis venom at 200 μg/mL (the higher concentration was used to account for the numerous protein toxin components). The plates were blocked with 5% fat-free milk powder in PBS, and incubated with two successive 200 μL aliquots of cell culture supernatant at 37 °C for two hours each. After washing, plates were incubated with anti-human Fc conjugated horse radish peroxidase (Merck, Darmstadt, Germany) in blocking buffer for one hour at 37 °C, and detected with a 4:1 ratio of 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) for 5 min preceding a 1M acid stop solution. Optical density was read at 450 nm. ELISA positives were expressed in larger 30 mL Expi293 cultures per manufacturer guidelines, harvested by centrifugation and 0.22 μm filtration, and purified using protein A affinity chromatography. 2.7. Fc-only Expression and Testing Horse constant domains IgHC1-3 for IgG1–IgG7 were synthesised (Genscript, Piscataway, NJ, USA) and cloned into pCMV/R. From this, IgHC2,3 was cloned behind an immunoglobulin signal peptide (MGWSCIILFLVATATGVHS) and an HRV3C cleavage site followed by an 8× HisTag and expressed in Expi293 according to manufacturer guidelines. Fc-only dimers were then purified by sequential Ni Sepharose excel affinity chromatography (Cytiva, Marlborough, MA, USA) and gel filtration and coated at 4 μg/mL onto high binding ELISA plates (Corning, Corning, NY, USA). ELISA was performed as above, using biotinylated protein A as the primary detection reagent, and streptavidin-HRP for detection. 2.1. Donor Horses Two adult thoroughbred geldings enrolled in the South African Vaccine Producers (SAVP of the National Health Laboratories, South Africa) antivenom manufacturing program were selected for this study. The animals were chosen for their high-titre plasma antivenom elicited by immunisation, as well as the detection of low-level antibodies to ECoV strain NC99, possibly resulting from a prior exposure. Whole blood was collected from the horses (aged 5 and 8 years old) in CPDA-1 blood bags, and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated with SepMateTM isolation tubes and Lymphoprep™ density gradient medium using manufacturer recommended protocols (STEMCELL Technologies). Whole PBMC were cryopreserved in foetal bovine serum (FBS) containing 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) at 1 × 10 7 . Ethics waiver 20191129-CKW/O was obtained from the Animal Research Ethics Committee, of the University of the Witwatersrand, South Africa. 2.2. Antigen Preparation The ECoV strain NC99 C-terminal domain and subdomain 1 (spike positions 316 to 687) were subcloned into pCMV/R with a synthetic signal peptide (MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG), and a C-terminal HRV3C cleavage site (LEVLFQ/GP) followed by an 8× HisTag and an AviTag (LNDIFEAQKIEWHE). The protein was expressed in Expi293 cells (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) and purified sequentially by Ni Sepharose excel beads (Cytiva, Marlborough, MA, USA) and gel filtration. The AviTag was then biotinylated using BirA biotin ligase (Avidity, Aurora, CO, USA) and cleaned of excess biotin by dialysis. Whole lyophilised venom from Dendroaspis polylepis was resuspended at 50 mg/mL, biotinylated at primary amines with EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) by manufacturer recommendations and purified from excess biotin. Biotinylated D. polylepis venom, polyclonal goat anti-horse (Pierce, Waltham, MA, USA), or ECoV-NC99 CTD+SD1 protein was labelled with AlexaFluor488 (AF488), phycoerythrin (PE), or allophycocyanin (APC) fluorescent streptavidin using saturating levels of biotinylated protein. 2.3. Flow Cytometry PBMC was thawed in phosphate-buffered saline (PBS) containing 2% bovine serum albumin (BSA) and stained with LIVE/DEAD™ Fixable Violet stain (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) for 30 min at 4 °C. Cells were washed and then stained with anti-horse antibodies or antigen at concentrations between 0.2–1 μg/mL. After washing again, cells were resuspended in 2 mL PBS (2% BSA) and sorted as IgG+ and antigen single or double positive, at one cell per well, into PCR plates containing Rnasin ® Plus Ribonuclease Inhibitor (Promega, Madison, WI, USA) and IGEPAL CA-630. At completion, PCR plates were flash frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C. 2.4. Primer Design and Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) All primers ( Table 1 ) were designed based on immunoglobulin genes found in the EquCab3.0 reference genome (GCA_002863925.1, SAMN02953672, PRJNA421018). Primer sets EQ-HV and EQ-λ comprise the final high-throughput primer sets designed in this study. EQ-HC primers were used to check IgG isotype, and the EQ-λV-LEADER-17mix was used to fill in missing lambda sequences. EQ-κ primers were used to search for possible kappa light chains, while EQ-HV screening primers were used in the initial setup to look for non-dominant H V -gene representatives in bulk sorted cells. Thawed single B cell samples were reverse transcribed with SuperScript IV in the presence of fresh RNaseOUT, while immunoglobulin genes were amplified from resulting cDNA using Platinum™ SuperFi II DNA Polymerase and confirmed by size on 48-well E-Gel™ 2% Agarose Gels with SYBR™ Safe DNA Gel Stain, according to the manufacturer recommendations (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA). 2.5. PCR Purification and Cloning Once confirmed, PCR products were purified from 2% agarose gels using Zymoclean 96-well Gel DNA Recovery Kits (Zymo Research, Irvine, CA, USA) and cloned into pCMV/R using GeneArt™ HiFi Gibson Assembly kits (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA). Cloned products were transformed into XL-10 gold ultracompetent cells (Agilent) before plasmids were extracted using the Zyppy™ 96-well Plasmid Miniprep kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Both PCR products and plasmid preparations were confirmed by Sanger sequencing using the BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA). Heavy chain gene assignment was completed using IMGT ® /V-QUEST [ 25 , 26 ] while lambda gene assignment was carried out manually. 2.6. Immunoglobulin Expression and Screening Expi293 cells (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) were prepared in 24-well plates at 240 rpm, 37 °C, 80% relative humidity, 8% CO 2 and transfected with 1 μg each of sequence confirmed heavy and light chain plasmids. After 3–5 days, the supernatants were harvested by centrifugation at 5000× g for 20 min, and further clarified at 14,000 rpm (in a tabletop rotor) prior to screening. High binding ELISA plates (Corning, Corning, NY, USA) were coated with ECoV-NC99 CTD+SD1 or streptavidin at 4 μg/mL, or whole D. polylepis venom at 200 μg/mL (the higher concentration was used to account for the numerous protein toxin components). The plates were blocked with 5% fat-free milk powder in PBS, and incubated with two successive 200 μL aliquots of cell culture supernatant at 37 °C for two hours each. After washing, plates were incubated with anti-human Fc conjugated horse radish peroxidase (Merck, Darmstadt, Germany) in blocking buffer for one hour at 37 °C, and detected with a 4:1 ratio of 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) for 5 min preceding a 1M acid stop solution. Optical density was read at 450 nm. ELISA positives were expressed in larger 30 mL Expi293 cultures per manufacturer guidelines, harvested by centrifugation and 0.22 μm filtration, and purified using protein A affinity chromatography. 2.7. Fc-only Expression and Testing Horse constant domains IgHC1-3 for IgG1–IgG7 were synthesised (Genscript, Piscataway, NJ, USA) and cloned into pCMV/R. From this, IgHC2,3 was cloned behind an immunoglobulin signal peptide (MGWSCIILFLVATATGVHS) and an HRV3C cleavage site followed by an 8× HisTag and expressed in Expi293 according to manufacturer guidelines. Fc-only dimers were then purified by sequential Ni Sepharose excel affinity chromatography (Cytiva, Marlborough, MA, USA) and gel filtration and coated at 4 μg/mL onto high binding ELISA plates (Corning, Corning, NY, USA). ELISA was performed as above, using biotinylated protein A as the primary detection reagent, and streptavidin-HRP for detection. 3. Results 3.1. Confirmation of V-Gne Bias within Horse Immunoglobulin G Two donor horses from the SAVP antivenom program were selected for this study based on high venom binding plasma titres ( Figure 1 A–left), and detectable binding activity for ECoV-NC99 spike antigens ( Figure 1 A–right). Memory B cells were bulk sorted as live and IgG+ at 100 cells per well into a PCR plate, and subject to V -gene specific RT-PCR. Sixteen primers specific for HV -gene leader sequences were paired with four reverse primers to yield 64 reactions, repeated over three replicates. These PCR products served as templates for 48 nested PCR reactions per replicate, amplifying a slightly smaller fragment in each instance ( Figure 1 B,C). The results for these PCRs are summarised into seven IgH V -gene groups ( Figure 1 C). Only reactions with primers specific for IMGT ® subgroup IgHV4 (defined previously as subgroup IgHV2 [ 14 , 15 ]) repeatedly amplified equine H V -gene fragments in both first and second rounds of a nested PCR, with increased efficiency for smaller gene products (1500 bp, 1270 bp, 730 bp, and 460 bp). IMGT ® defined subgroups IgHV1, IgHV4, IgHV5, and IgHV9 (defined previously as subgroups IgHV1, IgHV2 and IgHV4, IgHV5, and IgHV6, respectively [ 14 , 15 ]) also gave nested PCR products, but in only one or two reactions, using reverse primer Eq-IgHJx(SalI)R after Eq-IgG1CH1/x-R. A multiplexed nested PCR using all EQ-HV screening primers ( Table 1 ) together with Eq-IgG1CH1/x-R and then Eq-IgHJx(SalI)R also yielded a strong IgHV gene product, likely driven by IMGT ® subgroup IgHV4. For the light chain products, only Igλ gene primers alone or in multiplexed pools reproducibly amplified strong PCR products, while Igκ primers yielded no product. The entire Igλ gene ORF was recovered. Together with previous studies highlighting IgH V -gene and lambda-gene usage bias [ 9 , 10 , 12 , 13 ], these data confirm that most equine polyclonal antibodies derive from the IMGT ® IgHV4 gene cluster (formerly IgHV2), paired with a lambda gene. 3.2. V-Gene Bias and Antigen-Specific Immunoglobulin Properties in Two Horses To investigate V -gene bias within natively paired, antigen-specific monoclonal antibodies from the two-donor horse PBMC, memory B cells were single cell sorted as live, IgG+, and antigen+ (venom and ECoV-NC99, as above) into PCR plates, and subject to V -gene specific RT-PCR. Natively paired full-length lambda gene sequences and IgH V -gene sequences were recovered from >95% of single sorted B cells. Lambda genes were recovered from a single round of amplification, while IgH V -genes were recovered by nested PCR. From 158 single sorted B cells, two thirds of IgH V -genes were derived from the IMGT ® defined IgHV4-21 ORF ( n = 58, 37%) and IgHV4-22 genes ( n = 41, 26%) ( Figure 2 A). Both genes were not assigned in previous repertoire analyses, and their dominant usage by antigen specific B cells is reported here for the first time. This prevalence was followed by IgHV4S1 ( n = 31, 20%), IgHV4-29 ( n = 16, 10%), and IgHV4-82 ( n = 12, 8%) (referred to previously as IgHV2S2, IgHV2S3, IgHV2S4, respectively [ 15 ]). Importantly, despite the second largest proportion of equine V -genes having high identity to IgHV4-22, none of the isolated sequences included an extremely unusual cysteine at position 38 (Kabat)/position 43 (IMGT ® ), suggesting an important genomic allelic variant of this gene. IgHV4-21 ORF is defined as an ORF in the IMGT ® database as: "the gene is partial in 5′ owing to gaps", and these data support reclassification of IgHV4-21 ORF as a functional gene. Sorted antibody heavy chains displayed a range of somatic hypermutation, ranging from 1.1% to 20.7% affinity matured (average 6.7%). Similarly ( Figure 2 B), the majority of IgλV genes were derived from IgλV8-128 (alternatively IgλV8S2/Vλ17) and IgλV8-122 (alternatively IgλV8S1/Vλ15), with smaller percentages coming from IgλV8-133 (IgλV8S3/Vλ18), IgλV8-24 (IgλV8S7/Vλ25), IgλV8-12 (IgλV8S9/Vλ27), IgλV4-92 (IgλV4S5 ORF /VλORF1), IgλV8-28 (IgλV8S5/Vλ22), and IgλV8-20 (IgλV8S8/Vλ26) see [ 13 , 15 ]. IgHJ6*01 was preferentially used by VDJ-recombined CDR-H3, and eleven sequences showed high identity to IgHJ6*03/4 ORF ( Figure 2 C, top). Potentially all of the seven described IgG isotypes were detected (IgG4 or IgG7 could not be segregated in these data) ( Figure 2 C, bottom). IgG5 was only present in low frequencies, while IgG2 was observed as a VDJ-recombined precursor mRNA with intact introns. IgλC5 and IgλC7 dominated light chain constant domain sequences ( Figure 2 D), though several alleles of IgλC1 were also detected in 19% of sequences ( Supplementary Figure S1A ). In stark contrast, no significant gene bias was observed for IgHD genes, and 37 of the 44 currently described IgHD genes (including IgHD ORF ) were predicted amongst the isolated monoclonal antibodies ( Figure 2 E and Supplementary Figure S1B ). Insertions and/or deletions (Indels) were found in 20% of heavy chain sequences, ranging from -2 to 7 amino acids long, and were almost exclusively located in the CDR-H2 (a two amino acid insertion in CDR-H1 or framework region 1 was found in three and one antibodies, respectively). Indels appeared to be less common in predominant IgHV4-21 ORF or IgHV4-22 derived genes (~14% of all antibodies) when compared to IgHV4S1, IgHV4-29, or IgHV4-82 (~29% of all antibodies). Overall CDR-H3 length showed a bimodal distribution, peaking at 11 and 14 amino acids long by Kabat numbering [ 16 ], or 13 and 16 amino acids by IMGT ® [ 27 ] ( Figure 2 F). CDR-L3 length was between 8 and 13 amino acids, peaking at 11 amino acids long ( Figure 2 G). In both instances, CDR3 amino acid composition was skewed towards glycine (G), tyrosine (Y), and serine (S) ( Figure 2 H, 2I, Supplementary Figure S1D ). This included predominant use of glycine at CDR-H3 position 94 (Kabat numbering) or 106 (IMGT ® numbering) which was encoded by preferentially used IGHV4-21 ORF and IGHV4S1 genes ( Figure 2 H, third position). Similar to human antibodies, aspartic acid (D) predominated at CDR-L3 position 108 (IMGT ® )/92 (Kabat). However, unlike human antibodies glutamic acid (Q) was not common at positions 105 and 106 (IMGT ® )/89 and 90 (Kabat), where glycine (G) and serine (S) predominated, respectively ( Figure 2 I, second and third positions, respectively). 3.3. A High Throughput Cloning Strategy for Expression as Human and Equine IgG Isotypes Towards a One Health therapeutic discovery platform, isolated antibodies would need to be rapidly cloned into both human and equine expression cassettes to evaluate neutralisation and various antibody effector functions. Focusing on IgHV4 gene bias, primers were designed that included a 5′ overhang complimentary with the mammalian expression vector pCMV/R ( Figure 3 A, cyan). Interchangeable IgH isotype cassettes were inserted at the multiple cloning site, including IgHC1, IgHC2, and IgHC3 domains of human or equine antibodies ( Figure 3 A, yellow). A similar cloning strategy was employed for lambda chain PCR products, where primers introduced 5′ and 3′ complimentary overhangs for cloning into pCMV/R by Gibson assembly ( Figure 3 B). The V-domains of IgH and Igλ are flexibly joined to Ig constant domains, allowing for easy transition between human and equine isotype without drastically affecting binding or neutralisation ( Figure 3 C). This way, isolated antibodies can be sub-cloned into various IgG isotypes with desired antibody effector function properties specific to the target antigen. 3.4. Donor Horses Displayed a High Proportion of Streptavidin Seropositivity To assess whether V -gene bias was influenced by specific antigens, natively paired antibodies were expressed using high-throughput 24-well plates, and then evaluated for binding to the viral antigen ECoV-NC99 CTD+SD1 (representing natural viral pathogen exposure), or D. polylepis whole venom toxins (induced through immunisation). A total of 72 of 158 randomly selected heavy-light chain antibody pairs were transfected into 24-well plates with Expi293 cells and cultured for 5 days before assessing supernatant binding by ELISA. Initially, this yielded a relatively low antigen-positive ratio relative to the total sorted B cells (39%). To search for additional unintended sorting antigens, transfected cell culture supernatants were screened against the bacterial antigen streptavidin (used as the antigen fluorescent labelling agent). Remarkably, streptavidin binding antibodies accounted for 42% of the sorted B cells ( Figure 4 A, blue). Between all three antigens, 80% of the sorted antibodies were antigen specific, with 12 binding to ECoV-NC99, 16 binding to snake toxin, and 30 binding to streptavidin ( Figure 4 A). Altogether, V -gene usage bias was similar between three antigenically distinct groups: viral (ECoV-NC99), toxin ( D.polylepis ), and bacterial (streptavidin). 3.5. Equine V-Genes Are Equally Functional as Horse Antibodies and Human IgG-chimeras The top binder for each antigen group (Antibody 17b for ECoV-NC99, p3A4 for D. polylepis , and D3 for streptavidin) was then selected for equine isotype and human chimerisation studies. To first assess ease of purification by protein A, recombinant Fc-dimers of all seven equine isotypes were expressed with a HisTag in isolation and tested for binding to in-house protein A ( Figure 4 B). Only IgG6 was not bound by recombinant protein A, with detectable binding to all other isotypes. Based these binding data, the relative prevalence of each isotype ( Figure 2 C), and ability of each isotype to mediate effector functions [ 28 ], the three isolated antibodies were subcloned into expression vectors encoding constant domains for human IgG1, equine IgG1, or equine IgG7. These nine antibodies were then tested for binding to the three antigen groups. All isotypes, whether human or equine, retained equivalent levels of antigen recognition measured by ELISA ( Figure 4 C), confirming the suitability of equine variable domains for human antibody scaffolding ( Figure 3 C). 3.1. Confirmation of V-Gne Bias within Horse Immunoglobulin G Two donor horses from the SAVP antivenom program were selected for this study based on high venom binding plasma titres ( Figure 1 A–left), and detectable binding activity for ECoV-NC99 spike antigens ( Figure 1 A–right). Memory B cells were bulk sorted as live and IgG+ at 100 cells per well into a PCR plate, and subject to V -gene specific RT-PCR. Sixteen primers specific for HV -gene leader sequences were paired with four reverse primers to yield 64 reactions, repeated over three replicates. These PCR products served as templates for 48 nested PCR reactions per replicate, amplifying a slightly smaller fragment in each instance ( Figure 1 B,C). The results for these PCRs are summarised into seven IgH V -gene groups ( Figure 1 C). Only reactions with primers specific for IMGT ® subgroup IgHV4 (defined previously as subgroup IgHV2 [ 14 , 15 ]) repeatedly amplified equine H V -gene fragments in both first and second rounds of a nested PCR, with increased efficiency for smaller gene products (1500 bp, 1270 bp, 730 bp, and 460 bp). IMGT ® defined subgroups IgHV1, IgHV4, IgHV5, and IgHV9 (defined previously as subgroups IgHV1, IgHV2 and IgHV4, IgHV5, and IgHV6, respectively [ 14 , 15 ]) also gave nested PCR products, but in only one or two reactions, using reverse primer Eq-IgHJx(SalI)R after Eq-IgG1CH1/x-R. A multiplexed nested PCR using all EQ-HV screening primers ( Table 1 ) together with Eq-IgG1CH1/x-R and then Eq-IgHJx(SalI)R also yielded a strong IgHV gene product, likely driven by IMGT ® subgroup IgHV4. For the light chain products, only Igλ gene primers alone or in multiplexed pools reproducibly amplified strong PCR products, while Igκ primers yielded no product. The entire Igλ gene ORF was recovered. Together with previous studies highlighting IgH V -gene and lambda-gene usage bias [ 9 , 10 , 12 , 13 ], these data confirm that most equine polyclonal antibodies derive from the IMGT ® IgHV4 gene cluster (formerly IgHV2), paired with a lambda gene. 3.2. V-Gene Bias and Antigen-Specific Immunoglobulin Properties in Two Horses To investigate V -gene bias within natively paired, antigen-specific monoclonal antibodies from the two-donor horse PBMC, memory B cells were single cell sorted as live, IgG+, and antigen+ (venom and ECoV-NC99, as above) into PCR plates, and subject to V -gene specific RT-PCR. Natively paired full-length lambda gene sequences and IgH V -gene sequences were recovered from >95% of single sorted B cells. Lambda genes were recovered from a single round of amplification, while IgH V -genes were recovered by nested PCR. From 158 single sorted B cells, two thirds of IgH V -genes were derived from the IMGT ® defined IgHV4-21 ORF ( n = 58, 37%) and IgHV4-22 genes ( n = 41, 26%) ( Figure 2 A). Both genes were not assigned in previous repertoire analyses, and their dominant usage by antigen specific B cells is reported here for the first time. This prevalence was followed by IgHV4S1 ( n = 31, 20%), IgHV4-29 ( n = 16, 10%), and IgHV4-82 ( n = 12, 8%) (referred to previously as IgHV2S2, IgHV2S3, IgHV2S4, respectively [ 15 ]). Importantly, despite the second largest proportion of equine V -genes having high identity to IgHV4-22, none of the isolated sequences included an extremely unusual cysteine at position 38 (Kabat)/position 43 (IMGT ® ), suggesting an important genomic allelic variant of this gene. IgHV4-21 ORF is defined as an ORF in the IMGT ® database as: "the gene is partial in 5′ owing to gaps", and these data support reclassification of IgHV4-21 ORF as a functional gene. Sorted antibody heavy chains displayed a range of somatic hypermutation, ranging from 1.1% to 20.7% affinity matured (average 6.7%). Similarly ( Figure 2 B), the majority of IgλV genes were derived from IgλV8-128 (alternatively IgλV8S2/Vλ17) and IgλV8-122 (alternatively IgλV8S1/Vλ15), with smaller percentages coming from IgλV8-133 (IgλV8S3/Vλ18), IgλV8-24 (IgλV8S7/Vλ25), IgλV8-12 (IgλV8S9/Vλ27), IgλV4-92 (IgλV4S5 ORF /VλORF1), IgλV8-28 (IgλV8S5/Vλ22), and IgλV8-20 (IgλV8S8/Vλ26) see [ 13 , 15 ]. IgHJ6*01 was preferentially used by VDJ-recombined CDR-H3, and eleven sequences showed high identity to IgHJ6*03/4 ORF ( Figure 2 C, top). Potentially all of the seven described IgG isotypes were detected (IgG4 or IgG7 could not be segregated in these data) ( Figure 2 C, bottom). IgG5 was only present in low frequencies, while IgG2 was observed as a VDJ-recombined precursor mRNA with intact introns. IgλC5 and IgλC7 dominated light chain constant domain sequences ( Figure 2 D), though several alleles of IgλC1 were also detected in 19% of sequences ( Supplementary Figure S1A ). In stark contrast, no significant gene bias was observed for IgHD genes, and 37 of the 44 currently described IgHD genes (including IgHD ORF ) were predicted amongst the isolated monoclonal antibodies ( Figure 2 E and Supplementary Figure S1B ). Insertions and/or deletions (Indels) were found in 20% of heavy chain sequences, ranging from -2 to 7 amino acids long, and were almost exclusively located in the CDR-H2 (a two amino acid insertion in CDR-H1 or framework region 1 was found in three and one antibodies, respectively). Indels appeared to be less common in predominant IgHV4-21 ORF or IgHV4-22 derived genes (~14% of all antibodies) when compared to IgHV4S1, IgHV4-29, or IgHV4-82 (~29% of all antibodies). Overall CDR-H3 length showed a bimodal distribution, peaking at 11 and 14 amino acids long by Kabat numbering [ 16 ], or 13 and 16 amino acids by IMGT ® [ 27 ] ( Figure 2 F). CDR-L3 length was between 8 and 13 amino acids, peaking at 11 amino acids long ( Figure 2 G). In both instances, CDR3 amino acid composition was skewed towards glycine (G), tyrosine (Y), and serine (S) ( Figure 2 H, 2I, Supplementary Figure S1D ). This included predominant use of glycine at CDR-H3 position 94 (Kabat numbering) or 106 (IMGT ® numbering) which was encoded by preferentially used IGHV4-21 ORF and IGHV4S1 genes ( Figure 2 H, third position). Similar to human antibodies, aspartic acid (D) predominated at CDR-L3 position 108 (IMGT ® )/92 (Kabat). However, unlike human antibodies glutamic acid (Q) was not common at positions 105 and 106 (IMGT ® )/89 and 90 (Kabat), where glycine (G) and serine (S) predominated, respectively ( Figure 2 I, second and third positions, respectively). 3.3. A High Throughput Cloning Strategy for Expression as Human and Equine IgG Isotypes Towards a One Health therapeutic discovery platform, isolated antibodies would need to be rapidly cloned into both human and equine expression cassettes to evaluate neutralisation and various antibody effector functions. Focusing on IgHV4 gene bias, primers were designed that included a 5′ overhang complimentary with the mammalian expression vector pCMV/R ( Figure 3 A, cyan). Interchangeable IgH isotype cassettes were inserted at the multiple cloning site, including IgHC1, IgHC2, and IgHC3 domains of human or equine antibodies ( Figure 3 A, yellow). A similar cloning strategy was employed for lambda chain PCR products, where primers introduced 5′ and 3′ complimentary overhangs for cloning into pCMV/R by Gibson assembly ( Figure 3 B). The V-domains of IgH and Igλ are flexibly joined to Ig constant domains, allowing for easy transition between human and equine isotype without drastically affecting binding or neutralisation ( Figure 3 C). This way, isolated antibodies can be sub-cloned into various IgG isotypes with desired antibody effector function properties specific to the target antigen. 3.4. Donor Horses Displayed a High Proportion of Streptavidin Seropositivity To assess whether V -gene bias was influenced by specific antigens, natively paired antibodies were expressed using high-throughput 24-well plates, and then evaluated for binding to the viral antigen ECoV-NC99 CTD+SD1 (representing natural viral pathogen exposure), or D. polylepis whole venom toxins (induced through immunisation). A total of 72 of 158 randomly selected heavy-light chain antibody pairs were transfected into 24-well plates with Expi293 cells and cultured for 5 days before assessing supernatant binding by ELISA. Initially, this yielded a relatively low antigen-positive ratio relative to the total sorted B cells (39%). To search for additional unintended sorting antigens, transfected cell culture supernatants were screened against the bacterial antigen streptavidin (used as the antigen fluorescent labelling agent). Remarkably, streptavidin binding antibodies accounted for 42% of the sorted B cells ( Figure 4 A, blue). Between all three antigens, 80% of the sorted antibodies were antigen specific, with 12 binding to ECoV-NC99, 16 binding to snake toxin, and 30 binding to streptavidin ( Figure 4 A). Altogether, V -gene usage bias was similar between three antigenically distinct groups: viral (ECoV-NC99), toxin ( D.polylepis ), and bacterial (streptavidin). 3.5. Equine V-Genes Are Equally Functional as Horse Antibodies and Human IgG-chimeras The top binder for each antigen group (Antibody 17b for ECoV-NC99, p3A4 for D. polylepis , and D3 for streptavidin) was then selected for equine isotype and human chimerisation studies. To first assess ease of purification by protein A, recombinant Fc-dimers of all seven equine isotypes were expressed with a HisTag in isolation and tested for binding to in-house protein A ( Figure 4 B). Only IgG6 was not bound by recombinant protein A, with detectable binding to all other isotypes. Based these binding data, the relative prevalence of each isotype ( Figure 2 C), and ability of each isotype to mediate effector functions [ 28 ], the three isolated antibodies were subcloned into expression vectors encoding constant domains for human IgG1, equine IgG1, or equine IgG7. These nine antibodies were then tested for binding to the three antigen groups. All isotypes, whether human or equine, retained equivalent levels of antigen recognition measured by ELISA ( Figure 4 C), confirming the suitability of equine variable domains for human antibody scaffolding ( Figure 3 C). 4. Discussion Monoclonal antibodies represent a first line in rapidly discoverable antiviral therapeutics for infectious diseases. Herein, a rapid, high throughput protocol for the discovery of monoclonal antibodies from horses has been described. In summary, PBMC were processed from immunised/infected horses and stained with fluorescent antigen, before single B cells were sorted, lysed, and subject to RT-PCR for IgHV and Igλ genes. PCR products were purified by commercial 96-well gel extraction kits, cloned by Gibson assembly, and prepared for transfection using commercial 96-well miniprep kits. The resulting products were used to transfect Expi293 cells in high-throughput 24-deepwell plates, and cell culture supernatants were harvested after five days for screening by ELISA. When compared with other equine mAb discovery platforms [ 12 , 29 ], this protocol is unique in the exploitation of V -gene bias to accelerate lead candidate identification (14 days) and allows for the isolation of full-length natively paired antibodies, with the ability to easily switch between human or equine IgG isotypes. The high prevalence of streptavidin-specific antibodies was unexpected and complicated our antigen-specific sorting strategy. These high titre antibodies may represent environmental exposure to avidin-like protein from various unknown bacterial sources. Based on these data, alternate strategies for the fluorescent labelling of sorting antigens are recommended and will be developed in future studies. In total, the process takes less than 14 days from whole blood to identifying antigen-specific lead candidates for further study ( Figure 5 ). These methods were simplified by the V -gene usage bias of expressed horse antibodies. V -gene bias for both heavy and light chain genes of the horse have been shown previously. Initially, Almagro et al. described antibodies from single scorpion antivenom producing horse that all belonged to a single family dubbed IgHV1 [ 9 ]. This discovery predated the first comprehensive analysis of the germline immunoglobulin repertoire of the horse, which expanded this family into three main genes: IgHV4, IgHV5, and IgHV14 [ 11 ]. These genes were later reclassified as IgHV2S2, IgHV2S3, and IgHV2S4 and shown to dominate expressed antibodies through all stages of life [ 14 ], as well as antigen-specific antibodies raised against keyhole limpet hemocyanin or equine influenza neuraminidase [ 12 ]. More recently, these genes were reclassified yet again as members of the larger IgHV4 gene family [ 18 ]. Based on the most recent IMGT ® classification, we confirm here that almost all expressed antibodies use just a handful of IgHV4-related genes (independent of antigen) and show that the majority of these derive from IgHV4-21 ORF . While our study was limited in sample size ( n = 2), reanalysis of 920 NCBI GenBank sequences (summarised in [ 29 ]) revealed the same gene bias predominated by IgHV4-21 ORF ( Supplementary Figure S1C ). Importantly, none of our antibodies which were assigned to IgHV4-22 had the rare framework region 2 (FWR2) cysteine residue described in the IMGT ® data. This could represent a database sequencing error, or an important allelic variant that may impact IgHV4-22 gene usage between different individuals. Furthermore, we discovered several highly mutated heavy chains (17–20% divergent from the closest germline relative) that may represent yet undiscovered germline genes, or highly affinity mature antigen specific sequences. An overview of the mAb isolation protocol is shown, and average timeframes are given in brackets. This does not account for time to acquire antigens. The entire process takes less than two weeks. Created with BioRender.com. Similar to heavy chain V -gene bias, we confirmed dominant usage of several related IgλV8 genes, as has been previously shown [ 13 ]. These lambda genes have not yet been fully catalogued in IMGT ® and are likely to renamed. The prevalence and high similarity of IgHV4:IgλV8 paired antibodies in horse PBMC facilitated the development of a high-throughput antibody discovery platform using just three primers pairs, which resulted in >90% immunoglobulin gene recovery. The remaining antibody sequences could be recovered by a more gene-specific targeted approach where necessary, such as the EQ-λV-LEADER-17mix lambda primer pool. The composition of CDR-H3 in the horse antibody repertoire has recently been interrogated by next-generation sequencing and was shown to have a low conservation of charged amino acids at positions 106 (IMGT)/94 (Kabat) and 116 (IMGT)/101 (Kabat) [ 10 ]. Here, we show that the high proportion of glycine at position 106 (IMGT)/94 (Kabat) is directly encoded by the dominantly used IgHV4-21 ORF and IgHV4S1, explaining this phenomenon. We also observed an unusually high frequency of glycine, serine, and alanine at CDR-L3 positions 89 and 90, normally occupied by glutamine. The combination of short, flexible amino acids at the base of both CDR-H3 and CDR-L3 is likely to result in greater flexibility resulting in increased conformational sampling of CDR3. In addition, we observed diverse inclusion of IgHD genes in horse CDR-H3, which were ascribed to at least three quarters of the known IgHD gene repertoire. This agrees with next-generation sequence data for CDR-H3 [ 10 ] and suggests that despite limited IgHV and IgHλ gene usage, horses are able to recognise numerous antigens through diverse CDR3 loop conformations and compositions. The isolated IgV genes could be successfully cloned into both human and horse immunoglobulin isotypes, without loss of binding. This experiment was critical to confirming the usefulness of a rapid horse antibody discovery pipeline for the identification of novel biologics to treat emerging threats in both human and equine populations. Further study will aim to apply this pipeline to additional equine and human health priorities, assess the neutralisation and effector functions of isolated antibodies, and understand structural differences between equine and human antibodies to rationally develop fully human monoclonal antibodies using isolated equine templates.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2763108/

Marine-Derived Metabolites of S- Adenosylmethionine as Templates for New Anti-Infectives

S -Adenosylmethionine (AdoMet) is a key biochemical co-factor whose proximate metabolites include methylated macromolecules ( e.g. , nucleic acids, proteins, phospholipids), methylated small molecules ( e.g. , sterols, biogenic amines), polyamines ( e.g. , spermidine, spermine), ethylene, and N -acyl-homoserine lactones. Marine organisms produce numerous AdoMet metabolites whose novel structures can be regarded as lead compounds for anti-infective drug design. 1. Introduction S -Adenosyl- l -methionine (AdoMet, SAM) is a biochemical intermediate which serves as precursor to a vast compendium of bioactive metabolites in all living organisms. The remarkable structural diversity that characterizes known metabolites of AdoMet is a key component of AdoMet's ability to meet specialized needs in highly different microenvironments. Many AdoMet metabolites and AdoMet-utilizing pathways, as yet unknown, remain to be discovered and characterized. Marine environments provide an attractive and abundant reservoir to search for new classes of molecules that are structurally derived from AdoMet. This is corroborated by a recent novel finding that the chloro-substituent of salinosporamide A, a marine product now undergoing Phase I clinical trials for cancer treatment, is enzymatically derived from AdoMet [ 1 ]. The aims of this article are: 1) to present an overview of AdoMet metabolism that increases readers' awareness of the intrinsic roles of these pathways in maintaining the viability of all living organisms; and 2) to highlight novel marine natural products that incorporate structural components of AdoMet in their molecular structure. Our intent is to provide broadly based evidence for our premise that marine environments will remain a continuous source of new AdoMet metabolites that can be viewed as templates for novel anti-infectives and other therapeutic agents. 2. Overview of Major AdoMet-Utilizing Pathways AdoMet is synthesized from l -methionine and ATP by various isoforms of the enzyme, methionine adenosyltransferase (MAT, Figure 1 ) [ 2 ]. Central to AdoMet's reactivity is the presence of a chiral sulfonium ion whose three adjacent alkyl substituents are susceptible to nucleophilic attack at their respective carbon-sulfur bonds [ 3 , 4 ]. A robust family of methyltransferases catalyzes transfer of AdoMet's methyl group to diverse biological substrates [ 5 ]. Nucleophilic attacks directed at the carbon-sulfur bond of ribose lead to formation of 5'-halogenated adenosine derivatives [ 6 ]; those directed at the 3-amino-3-carboxypropyl portion of AdoMet give rise to polyamines, ethylene and homoserine lactone derivatives [ 3 , 4 ]. As the principal biological methyl donor, AdoMet is an obligatory cofactor for the enzymatic methylation of DNA, RNA, proteins, phospholipids, and various small molecules such as catecholamines, steroids, etc. Polyamine biosynthesis is another important AdoMet-dependent pathway: AdoMet, subsequent to its enzymatic decarboxylation, serves as aminopropyl donor for synthesis of the ubiquitous polyamines, spermidine and spermine. Ethylene, another key metabolite of AdoMet, is produced in plants where it plays major roles in ripening, senescence and responses to stress. AdoMet-dependent biosyntheses of methylated molecules, polyamines and ethylene have been studied for many years and are regarded as classical pathways of AdoMet metabolism. In more recent years, two major pathways of AdoMet metabolism in bacteria have been uncovered. The discovery of N -acyl- l -homoserine lactones, a new class of signal molecules produced by many gram negative bacteria, was followed by studies which determined that its l -homoserine lactone component is enzymatically derived from AdoMet [ 7 , 8 ]. Autoinducer-2 is another important bacterial signal molecule which is derived from AdoMet [ 9 ]. A new class of AdoMet-utilizing proteins, the radical SAM superfamily, was discovered recently [ 10 ]. These proteins use AdoMet as substrate or catalyst in various enzymatic reactions that are associated with a diverse array of chemical transformations and biological functions [ 10 – 12 ]. In addition, a novel role for AdoMet in the biosynthesis of complex, halogenated organic molecules was first reported in 2002 [ 13 , 14 ]. Subsequently, an AdoMet-utilizing halogenase was identified in a marine organism [ 1 ]. The importance and scope of AdoMet-dependent biohalogenation pathways will become more evident as additional scientific studies are published. Several uncommon pathways of AdoMet metabolism are worthy of mention because they highlight novel, unprecedented donor properties of this ubiquitous sulfonium compound [ 4 ]. AdoMet serves as amino donor for biosynthesis of 7,8-pelargonic acid, an intermediate in the biosynthesis of biotin [ 15 ]. AdoMet serves as 3-amino-3-carboxypropyl donor for biosynthesis of the hypermodified nucleoside, 3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine, which was first found in Escherichia coli tRNA [ 16 – 18 ]. AdoMet serves as ribosyl donor for biosynthesis of the hypermodified tRNA nucleoside, queuosine [ 19 ]. These highly specific, AdoMet-dependent, structural modifications to RNA are complemented by AdoMet's more pervasive activities as methyl donor for RNA [ 20 – 25 ]. 3. AdoMet Pathways and Marine-Derived AdoMet Metabolites The role of AdoMet as precursor for ethylene, polyamines and methylated molecules has been extensively documented in the scientific literature. Biochemical studies with labeled precursors have been instrumental in validating the diverse pathways of AdoMet consumption in living organisms. For the most part, these studies have used terrestrial organisms as platforms for experimental design. Discovery of the AdoMet-derived, bacterial signal molecules, N -acyl- l -homoserine lactones (AHLs) and autoinducer-2 ( AI-2 ), in marine bacteria is a notable exception. Precursor studies using marine organisms have been reported but their scope has been limited by the elusiveness of marine microorganisms and challenges associated with scientific exploration of marine habitats. When such studies were carried out, most were designed to provide evidence of the role of AdoMet as the biological methyl donor for a range of marine-derived methylated natural products. Several examples of marine-derived molecules whose methyl group origins have been unambiguously attributed to AdoMet by labeled methionine precursor studies are listed in Table 1 . Their structures are shown in Figure 2 . Labeled decarboxylated AdoMet was used to determine that AdoMet is the source of aminopropyl groups of the polyamines produced by Pyrococcus furiosus , a hyperthermophilic archeon [ 36 ]. Moreover, these studies identified a new aminopropyl transferase enzyme whose natural substrates include the expected 1,4-diaminobutane (putrescine) as well as the less common diamines, 1,3-diaminopropane, cadaverine, thermine and agmatine [ 36 ]. 3.1. Polyamine Pathways [ 37 – 44 ] Putrescine, spermidine and spermine are the major eukaryotic polyamines. Putrescine, which is enzymatically derived from ornithine, is metabolized to spermidine and then to spermine by successive enzymatic transfers of an aminopropyl group from decarboxylated AdoMet ( Figure 3 ). The purine nucleoside, 5'-deoxy-5'-(methylthio)adenosine (MTA) is the common byproduct of spermidine and spermine synthesis. At physiologic pH, polyamines exist as polycations and modulate functions of acidic structures such as DNA, RNA, phospholipids and proteins. They are important participants in processes associated with cell viability, growth and differentiation. The naturally high intracellular levels of polyamines ( i.e. , mM concentrations) have made clarification of their high affinity molecular targets more difficult. They are known to specifically affect the functions of ion channels and the N -methyl- d -aspartate (NMDA) glutamate receptor at physiological concentrations [ 40 , 45 ]. Igarashi and colleagues studied the binding interactions of spermidine and spermine with cellular DNA, RNA, phospholipids and ATP in rat liver and bovine lymphocytes [ 41 ]. In both cell types, the largest fractions of intracellular spermidine and spermine were found to be associated with RNA, suggesting that the structural changes to RNA arising from these binding interactions may play a major role in the intracellular functions of polyamines [ 41 ]. Polyamines are involved in key cellular functions such as responses to oxidative stress, pH, and osmoregulation, which are of particular importance to marine bacteria. These functions are even more important to extreme thermophilic bacteria, which use polyamines to stabilize their RNA and DNA at high temperatures [ 46 ]. The fact that polyamines have specialized functions in aquatic environments is evidenced by an abundance of novel straight chain and branched polyamines produced by marine organisms. The marine thermophile, Thermus thermophilus is an example of a prolific producer of different polycationic polyamine structures (shown in Table 2 ). A collection of unusually long-chain polyamines (LCPAs) has been isolated from the marine sponge, Axinyssa aculeate . A composite of their structures, + H 3 N-(CH 2 ) 3 -[NH 2 + -(CH 2 ) 3 ]n–NH 3 + (n = 4–14), gives an idea of their extraordinary length [ 47 ]. Other LCPAs have been isolated from marine algae [ 48 – 50 ]. LCPAs are known to combine with silica precipitating proteins (silaffins) to produce a composite material called biosilica that is essential to the formation of complex cell wall structures such as those found in shells. Biomineralization is manifested by the use of species-specific sets of silaffins and LCPA constituents whose structural variations may include differences in chain length, N -methylation patterns and/or the positioning of secondary amino substituents and quaternary ammonium groups [ 48 , 49 , 51 ]. Consequently, polyamines are essential for the formation of intricate silica patterns on cell walls of diatoms [ 47 – 50 ]. From a technical perspective, an understanding of the biochemical mechanisms that regulate nanoscale production of biosilica-based structures is highly relevant to research and product development in the field of nanotechnology [ 51 ]. Marine habitats have also proved to be a rich source of unusual polyamine conjugates (PACs) such as those depicted in Figure 4 . For each conjugate, at least one marine source is listed in Table 3 . Crambescidin 800 ( PAC-5 ) and ptilomycalin A ( PAC-6 ) belong to a family of guanidine alkaloids whose structures contain an unusual pentacyclic guanidine framework linked by a ω–hydroxy fatty acid to a spermidine or hydroxyspermidine moiety. The structures of PAC-5 and PAC-6 differ only by the presence or absence of a hydroxyl substituent on spermidine. Although both compounds showed activity in various antitumor and antimicrobial screens, their potencies were unremarkable [ 53 – 56 ]. However, in the course of comprehensive, high-throughput screens of ~3,100 compounds from NCI libraries and >300 crude marine-derived extracts for antifungal activity, Crambescidin 800 emerged as the most potent compound [ 57 ]. Penaramide A ( PAC-4 ) is one of several acylated polyamine structures that were isolated from the sponge Penares aff. Incrustans . Penaramides are symmetric molecules that differ only in the composition of their N -terminal acyl substituents. Penaramide A, the simplest of these compounds, contains two linear, C11 fatty acids. At the time these compounds were described, they were found to inhibit binding of the peptide neurotoxin, ω-conotoxin GVIA to N-type (high voltage-activated) calcium channels [ 33 ]. Acarnidines ( PAC-1 ), another class of polyamine fatty acid conjugates, are distinguished by the presence of a homospermidine backbone. As seen in the penaramide series, acarnidines differ only by the structures of their respective fatty acid components. The acarnadines were reported to have significant antimicrobial activity against Herpes simplex type 1, Bacillus subtilis, and Penicillium atrovenetum [ 58 ]. Another fatty acid polyamine conjugate, sinulamide ( PAC-3 ), is an inhibitor of H,K-ATPase [ 66 ]. Sinulamide has structural features similar to some of those seen in penaramides and acarnidines. The novel alkaloid, spermatinamine ( PAC-8 ) is a symmetrical spermine conjugate whose uncommon feature is its unusual acyl component which is derived from 3,5-dibromotyrosine. Spermatinamine is an inhibitor of isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT), one of the enzymes involved in activation of the Ras signaling pathway [ 64 ]. Ras family proteins contain a CAAX terminal sequence that undergoes a series of successive posttranslational modifications, resulting in the translocation of these proteins to the cell membrane [ 67 ]. The specific enzymes that contribute to activation of Ras signaling are considered to be promising anticancer targets. Spermatinamine, the first natural product known to inhibit ICMT, is a compound of significant chemotherapeutic interest [ 64 ]. Petrobactin ( PAC-9 ) was first isolated from Marinobacter hydrocarbonoclasticus [ 68 ]. This oil-degrading molecule has since been found in both pathogenic and nonpathogenic bacteria [ 69 ]. Petrobactin is required for expression of virulence by Bacillus anthracis , the causative agent of anthrax disease and is the primary siderophore produced by this pathogen under conditions of iron starvation [ 65 ]. Elucidation of its structure, biosynthetic origins and biological properties as well as chemical routes to its synthesis, have been well established [ 65 , 70 – 81 ]. Pseudoceratidine ( PAC-7 ), an antifouling agent that can prevent attachment of marine organisms ( e.g. , mollusks, barnacles) to hulls of ships and other submerged structures, was first isolated and synthesized in 1996 [ 63 , 82 ]. Its interesting spectrum of antimicrobial and marine biocidal effects are of potential industrial significance [ 83 ]. Trimethylspermidine amide ( PAC-2 ) and sinulamide ( PAC-3 ), a potent inhibitor of H,K-ATPase, were isolated from different species of the soft coral Sinularia [ 66 ]. Marine PACs with unusually complex N -acyl components can be viewed as lead structures for combinatorial synthesis of novel PACs from libraries of acyl substituents and linear polyamines. 3.2. Methylation Pathways Methylated molecules are the most abundant type of AdoMet metabolites in living organisms. Their biosynthesis is catalyzed by a superfamily of methyltransferase enzymes [ 5 , 84 – 87 ] ( Figure 5 ). Several classes of methyltransferases have been structurally defined [ 5 , 86 – 88 ]. The AdoMet binding regions in many of these enzymes contain a common, three-dimensional structural motif that has been used to seek out putative methyltransferases among proteins of unknown function [ 84 ]. Clarke and colleagues established a methyltransferase-specific database and have continued to search for protein sequences predictive of methyltransferase function by scanning open reading frames of genomes using automated methods they developed for this purpose [ 84 ]. The physiological consequences of enzymatic methyl group transfer can be viewed from fundamental chemical and biochemical perspectives. A methyl group can be transferred to atoms such as carbon, nitrogen, oxygen, sulfur, and selenium. However, methyltransferases that catalyze methyl transfer to carbon, nitrogen and oxygen atoms are predominant. Methyl group addition increases steric bulk and can alter charge, conformation and/or tertiary structure of the acceptor molecule. Furthermore, methylation can profoundly affect biochemical pathways and physiological processes by altering the binding affinities of associated ligands for macromolecules such as proteins, DNA, RNA and phospholipids as well as for small molecule ligands, such as steroids, amino acids, nucleosides and biogenic amines. Complex methylation patterns are seen in many classes of small marine-derived molecules such as purines ( Table 4 , Figure 6 ) and sterols ( Figure 7 ). A variety of methylated purines has been isolated from marine organisms [ 106 ]. Figure 6 depicts a selected number of these structures. Examples of methylation within the purine scaffold, which contains four heterocyclic nitrogen atoms, as well as on some of the exocyclic amino- and imino-substitutents are depicted. MP-7 and MP-17 contain exocyclic methoxy substituents. MP-8 elicits an antitumor response, MP-9 displays antibacterial behavior and MP-17 is a collagenase inhibitor [ 106 ]. Whether these purine analogs afford any benefits to their host organisms is unclear. However, they may be useful as anti-metabolite templates for potential anti-infectives. Sponges are the most abundant marine source of novel sterols [ 107 ]. Changes in the compositions of these membrane constituents, which are vital for cell permeability, are associated with increased defensive capabilities [ 108 , 109 ]. Marine sterols exhibit structural complexities that are not observed in terrestrial organisms [ 110 ]. Although most variations occur in the side chain, the steroid ring system is also subject to chemical transformations [ 111 ]. Structural variations also arise in the methylation patterns of steroid rings, alkyl side chains and/or exocyclic substituents. The structurally complex, anti-angiogenic cortistatins isolated from the sponge Corticium simplex contain both C - and N -methylated substituents [ 112 ] ( Figure 7 ). 3.3. AdoMet-Dependent Ethylene Biosynthesis [ 113 – 117 ] Ethylene is a phytohormone that stands at the apex of a robust signaling pathway in plants. Ethylene, which is enzymatically derived from AdoMet ( Figure 8 ), serves as a critical regulator of life sustaining processes such as plant growth and development, responses to external stresses, and senescence. The terrestrial plant, Arabidopsis thaliana has served as a model system for elucidating the biochemical, molecular and genetic complexities of the ethylene signaling pathway, which is still the focus of intense scientific study [ 84 , 115 , 116 , 118 ]. AdoMet-dependent ethylene biosynthesis has been documented in a variety of marine plants and sponges [ 119 – 121 ]. Suberites domuncula , a marine sponge, responds to the presence of ethylene (5 μM) by upregulating its intracellular concentration of Ca +2 and reducing its apoptotic response to starvation [ 122 ]. When the marine macroalga Ulva (Enteromorpha) intestinalis moves from conditions of low light intensity to high light intensity, its production of ethylene increases. This suggests that ethylene is involved in an adaptive response to light stress [ 119 ]. Ethylene is also naturally present in seawater as a consequence of widespread photochemical degradation of organic materials. Thus ethylene can be acquired from the aquatic environment by ethylene-responsive marine organisms that might not contain the biosynthetic machinery for its production. 3.4. Biohalogenation Pathways [ 123 – 125 ] The discovery of a fluorinase enzyme that catalyzes the formation of a carbon-fluorine bond not only opened a new chapter in the field of biohalogenation, but also uncovered a previously unknown pathway of AdoMet metabolism [ 13 ]. The fluorinase was first isolated from the soil bacterium Streptomyces cattleya . The enzyme's x-ray crystal structure, catalytic mechanism and kinetic features have since been determined [ 13 , 123 , 126 ]. The fluorinase reaction yields the proximate AdoMet metabolite, 5'-deoxy-5'-fluoroadenosine, which is ultimately transformed to a toxin, monofluoroacetic acid and an unusual amino acid, 4-fluorothreonine. Subsequent discovery of an AdoMet-utilizing chlorinase from Salinispora tropica has demonstrated the existence of AdoMet biohalogenation pathways in marine organisms [ 1 ]. The chlorinase reaction, mechanistically similar to that of the S. cattleya fluorinase, produces the proximate AdoMet metabolite, 5'-deoxy-5'-chloroadenosine which is a key intermediate in the biosynthesis of salinosporamide A ( Figure 9 ). Cell-free assays of S. tropica chlorinase activity determined that inorganic bromide and iodide, but not fluoride, can be used as inorganic substrates in place of chloride, suggesting that brominated and iodinated marine structures arising from AdoMet-dependent biohalogenations may possibly be found in the future [ 1 ]. 3.5. Radical SAM Pathways [ 10 – 12 , 127 – 130 ] In a groundbreaking study, Sofia and colleagues discovered a new protein superfamily of enzymes, designated radical SAM, through iterative profile searches of protein databases, data analysis employing powerful bioinformatic tools and information visualization techniques [ 10 ]. Shared features of radical SAM proteins are the presence of an uncommon iron-sulfur cluster [4Fe-4S], the specific sequence motif CxxCxxC and an AdoMet binding motif. Two basic types of radical SAM proteins have been characterized. One uses AdoMet as a catalytic cofactor that is the direct precursor of the 5'-deoxyadenosyl radical (DOA radical). The other uses AdoMet as a substrate to irreversbly generate a DOA radical. In the first reaction type, AdoMet abstracts a hydrogen atom from 5'-deoxyadenosine (DOA), the end product of step 1, and concomitantly, recycles AdoMet and regenerates a DOA radical. In the second type, AdoMet serves as a radical SAM substrate whose proximate products are methionine and a DOA radical. The initial reaction steps, which are identical for all SAM enzymes, are illustrated in Figure 10 . DOA radicals can act as powerful anaerobic oxidants whose biochemical functions vary among different radical SAM proteins. Many of these proteins use DOA radicals to cleave and functionalize otherwise unreactive carbon-hydrogen (C-H) bonds in protein and small molecule substrates [ 12 ]. Chemical reactions such as isomerization, sulfur insertion, dehydrogenation and cyclization are catalyzed by radical SAM family members [ 10 , 11 ]. The radical SAM enzymes, biotin synthase and lipoyl synthase are responsible for the production of the key biochemical cofactors, biotin and lipoic acid [ 11 , 12 , 127 – 130 ]. Brief mention here of other known radical SAM family members attests to the functional diversity of these proteins: spore photoproduct lyase; anaerobic ribonucleotide reductase activating enzyme; benzylsuccinate synthase; coproporphyrinogen III oxidase; lysine 2,3-amino-mutase; pyruvate formate-lyase [ 127 ]. Existence of radical SAM proteins in marine organisms has been noted. The green sulfur bacterium , Chlorobaculum tepidum , produces bacteriochlorophylls c, d , and e , a group of photosynthetic pigments that differ from other chlorophylls by the presence of methyl groups at their C -8 2 and C -12 1 carbons. These site-specific methylations are critical to the organism's ability to adapt to decreased light intensities [ 131 ]. Labeled precursor studies confirmed that these methyl groups are derived from AdoMet [ 132 ]. The methyltransferases responsible for addition of these two methyl groups have been identified recently as members of the radical SAM superfamily [ 131 ]. Sequencing of the complete genome of Acaryochloris marina has led to the discovery of twelve proteins that contain the characteristic, distinguishing features of radical SAM proteins [ 133 ]. A. marina is a cyanobacterium whose predominant photosynthetic pigment is chlorophyll d . The presence of this unusual pigment enables A. marina to use far-red light for its photosynthetic pathways. 3.6. Quorum Sensing Pathways Some gram-negative bacteria sense conspecific cell density, and the density of other bacteria, by monitoring the extracellular concentration of specific small molecules. This phenomenon, called quorum sensing (QS), is used by bacteria to coordinate transcriptional regulation of genes that control population-sensitive programs. QS was first described as a general phenomenon in a landmark review [ 134 ]. An example from this review illustrates the process as a whole: Vibrio fischeri , a bioluminescent marine bacterium, expresses genes needed to produce bioluminescence only at high population density. A small molecule, N -3-oxo-hexanoyl- l -homoserine lactone, accumulates in culture fluid with increasing density of V. fischeri. N -3-oxo-hexanoyl- l -homoserine binds to the receptor/transcription factor, LuxR, which controls population density dependent expression of bioluminescence genes. Further work showed that different species of bacteria use different AHLs of varying acyl chain lengths as species specific QS signals. In addition to control of bioluminescence in other Vibrio species, AHL-controlled QS coordinates what are effectively multicellular developmental programs in a wide range of bacteria. These include biofilm formation, swarming, and induction of virulence in pathogenic species. [ 135 – 137 ]. AHLs are enzymatically produced from AdoMet and an acyl-acyl carrier protein [ 7 , 138 ] ( Figure 11 ). The lactone ring is an invariant feature of AHLs, arising from cyclization of the methionine moiety of AdoMet by AHL synthase enzymes. Natural AHL structures vary not only in the length of the acyl side chain but also in the oxidation state at carbon 3 and the occasional presence of unsaturated carbon-carbon bonds. This is illustrated in three AHL structures produced by various Vibrio sp. [ 139 ] ( Figure 12 ). Marine gram-negative α-proteobacteria produce many novel AHL structures, such as those isolated from Mesorhizobium sp. [ 140 ] ( Figure 13 ). The Roseobacter clade, grouped by a shared lineage, is a ubiquitous class of α-proteobacteria, [ 141 , 142 ]. Although Roseobacters can exist as free-living organisms, they frequently reside in marine habitats that promote their symbiotic associations with microalgae, corals, diatoms, oysters, etc. A significant number of Roseobacter strains isolated from North Sea marine habitats were found to produce complex mixtures of unusual, long-chain AHLs ( Figure 14 ) [ 143 ]. Quorum sensing in Roseobacters is associated with adaptive responses, such as biofilm formation, which promote colonization of other organisms, and antibiotic production, which is presumably used for self protection [ 144 ]. Tryptantrin and thiotropocin are two known Roseobacter -derived antibiotics, whose production is regulated by AHL-dependent signaling [ 142 ]. Comparison of the long-chain AHLs produced by Roseobacters ( Figure 14 ) and Mesorhizobium sp. ( Figure 13 ) shows remarkable similarities in the acyl side chain structures. Except for AHL-7 , which is produced by both organisms, their respective AHL signal molecules are in fact structurally distinct and allow for self discrimination. Autoinducer-2 ( AI-2 ) is another AdoMet-derived bacterial QS signal molecule that was discovered in a marine bacterium [ 9 , 145 ]. The proximate precursor of AI-2 is S -adenosylhomocysteine (AdoHcy), the AdoMet metabolite that is generated as the byproduct of all AdoMet-utilizing methylation reactions ( Figure 15 ). Since AdoHcy is a potent product inhibitor of methyltransferases, conditions that allow its accumulation in cells have toxic consequences. Two pathways of AdoHcy degradation are known. One is initiated by the enzyme AdoHcy hydrolase which produces the proximate metabolites, adenosine and l -homocysteine. A second pathway of AdoHcy degradation is initiated by the enzyme AdoHcy nucleosidase, which produces the proximate metabolites, adenine and S -ribosylhomocysteine. Gram-positive bacteria also utilize QS as a means to communicate and coordinate responses to a variety of environmental stimuli. However, they do not generate AHLs; instead they utilize small autoinducing peptides [ 146 ]. Although AHL production is considered to be exclusive to gram negative bacteria, both gram-positive and gram-negative bacteria are able to synthesize AI-2 . Thus QS signaling via AI-2 provides an avenue for interspecies communication [ 147 ]. 3.7. N-Acylhomoserine Lactones as Templates for Anti-Infective Tetramic and Tetronic Acids Bacteria that rely on the production of QS signal molecules to coordinate expression of genetic programs, must also have signal molecule degradation pathways to effectively shut down these processes. Two major enzymatic mechanisms for AHL removal are hydrolytic opening of the lactone ring by lactonases or hydrolytic cleavage of the amide bond by acylases [ 148 ]. AHLs can also undergo a nonenzymatic chemical rearrangement to form tetramic acids (TAMs). The biological relevance of this type of AHL rearrangement was observed in Pseudomonas aeruginosa cultures by Kaufmann and colleagues, who isolated the expected AHL, N -3-oxo-dodecanoyl- l -homoserine lactone (OdDHL) as well as the corresponding tetramic acid ( TAM-1 ) from the culture medium [ 149 ] ( Figure 16 ). Notably, TAM-1 displayed a spectrum of antibacterial activity different from that of OdDHL. Based on these novel findings, marine-derived AHLs can be regarded as templates for the design of tetramic acid derivatives with antibacterial effects distinct from those of their parent AHLs. Similarly, the tetramic acids can serve as templates for synthesis of the related tetronic acids (TONs). In fact, 3-alkanoyl-5-hydroxymethyl tetronic acid (RK-682, TON-1 ), isolated from actinomycete strain DSM 7357, at first sight appears to be an AHL-derived tetronic acid analog [ 150 ] ( Figure 17 ). The initial finding that TON-1 is a potent inhibitor of tyrosine phosphatase that blocks G2/M cell cycle progression has spurred interest in analog synthesis and evaluation [ 150 – 152 ]. 3.8. Marine-Derived Quorum Sensing Antagonists Marine organisms have not sat by idly while various bacteria coordinate their destruction with AHLs. Many have developed additional pathways to disrupt AHL function and QS signaling. Some marine eukaryotes produce AHL mimics that interfere with AHL-receptor binding, effectively blocking the QS signal. Halogenated furanones produced by the Australian red algae, Delisea pulchra are the best studied examples of naturally occurring AHL mimics [ 153 , 154 ] ( Figure 18 ). Several studies have determined that two D. pulchra halogenated furanones ( HF-1 and HF-2 ) disrupt the AHL-controlled swarming phenotype of S. liquefaciens through competitive binding of AHL receptors [ 155 ], [ 156 ]. Furthermore, binding of halogenated furanones to AHL receptors decreases receptor half life [ 156 ]. Like tetronic acids, halogenated furanones may serve as retro-templates for related AHL or tetramic acid structures with potential anti-QS and/or anti-infective activities. 3.9. Unusual Marine Metabolites of AdoMet Many AdoMet-derived compounds that were isolated from marine sources have unconventional structures and/or exhibit unusual biological properties ( Figure 19 ). Some of these metabolites contain a polyamine backbone within a more complex chemical structure ( UM-5, UM-7 ); most integrate methyl substituents within unusual structural scaffolds ( UM1 - UM7 ). From a shared chemical and biological perspective, the most extraordinary AdoMet-derived marine metabolite is, arguably, the low molecular weight boronate diester, AI-2 , which acts as an interspecies bacterial signal molecule. Inclusion of salinosporamide A ( H-1 ) in this small group of uncommon molecules reflects its novelty as the first marine metabolite known to be halogenated via an AdoMet-dependent halogenase (as noted in Section 3.4 [ 1 ]). Motuporamines (MPAs) were first isolated from the tropical marine sponge Xestospongia exigua (Kirkpatrick) [ 157 ]. Their heterocyclic structures are characterized by the presence of an incorporated polyamine ( i.e. , spermidine) tail. Additional motuporamines whose structures differ by ring size and by the presence and positions of unsaturated bonds and/or methyl substituents, have since been isolated [ 158 ]. The MPAs, UM-5 (composite structure ) each contain a methyl group of unassigned position. AdoMet independently serves as polyamine precursor and methyl donor for the structural components of UM-5 . MPAs have been shown to inhibit angiogenesis and tumor cell invasiveness [ 158 , 159 ]. To and colleagues considered that MPAs might have similar effects on neuronal growth and motility. They studied the effects of MPA-C on neurite development in chicks and determined that this compound profoundly represses formation of the highly motile, neuronal growth cone that plays a key role in axonal outgrowth [ 160 ]. MPA-C is used as a novel neurobiological probe to study molecular mechanisms associated with neuronal outgrowth [ 158 – 161 ]. The sesquiterpene quinone, ilimaquinone ( UM-6 ) was first isolated from the marine sponge Hippospongia metachromia in 1979 [ 162 ]. One of its unusual biological properties is its ability to completely vesiculate Golgi membranes and consequently affect protein transport [ 163 ]. As such, ilimaquinone has been widely used to elucidate the physiological functions of the Golgi apparatus [ 164 , 165 ]. Ilimaquinone has also been found to potently inhibit S -adenosylhomocysteine hydrolase (AHH), a key enzyme in methylation pathways [ 166 ]. AHH inhibition blocks degradation of S -adenosylhomocysteine, the potent product inhibitor of all AdoMet dependent methyltransferases, suggesting that AdoHcy levels are elevated in ilimaquinone-producing marine organisms. Since AdoHcy also serves as proximate precursor of the QS signal molecule, AI-2 , "ilimaquinone-producers" in marine habitats may have an enhanced capability to synthesize AI-2 in response to environmental stresses. The aminosterol, squalamine ( UM-7 ) is a spermidine-dihydroxycholestane-sulfate conjugate that was initially isolated from stomach extracts of the dogfish shark Squalus acanthias [ 167 ]. Additional aminosterols, with structural variations primarily in the sterol side chain, were subsequently isolated from the same source [ 168 ]. One of these compounds is a spermine conjugate. Squalamine is a water-soluble, broad spectrum antimicrobial, having shown activity against strains of Escherichia coli , Staphylococcus aureus , C andida albicans and P. aeruginosa [ 167 , 168 ]. Squalamine, which has also shown anticancer and antiangiogenic activities, has undergone phase II clinical trials against ovarian, prostate and non-small cell lung cancers [ 167 – 169 ]. Monodictychromones A and B ( UM-1 and UM-3 ) were found in the marine algicolous fungus, Monodictys putredinis by Konig and colleagues who had previously isolated a group of monomeric xanthones from the same organism [ 140 , 170 ]. UM-1 and UM-3 contain two unusual, non identical xanthone subunits and three chiral methyl substituents. UM-1 and UM-3 differ only by the site of their linkage [ 170 ]. The two compounds were evaluated for their ability to inhibit the activities of aromatase and cytochrome P450 1A enzymes as well as induction of NAD(P)H:quinone reductase. Both dimeric structures showed similar, but modest inhibitory effects (μM range) in these assays [ 170 ]. Hectochlorin, UM-2 has been isolated from the marine cyanobacterium Lyngbya majuscula as well as the sea hare, Bursatella leachii [ 171 , 172 ]. UM-2 's notable biological properties include its potent stimulatory effects on actin polymerization in PtK2 (normal kidney) cells and its potent antifungal activity against C. albicans [ 171 ]. Gerwick and colleagues characterized the hectochlorin biosynthetic gene cluster from L. majuscula [ 173 ]. During these investigations, an AdoMet-dependent C -methyl-transferase signature motif, previously identified in the biosynthetic gene clusters of curacin A and jamaicamide from other L. majuscula strains, was found to be present in the hectochlorin biosynthetic gene cluster [ 29 , 173 – 175 ]. The unusual, asymmetric diester of MTA, UM-4 was isolated from the marine ascadian, Atriolum robustum [ 175 ]. The 2'-ribose ester substituent of UM-4 is derived from 3-(4-hydroxyphenyl-2-methoxyacrylic acid (HMA); the 3'-ribose ester substituent, from urocanic acid (UCA). UM-4 was consistently inferior to MTA in receptor-specific binding assays for the A1, A2A, A2B, and A3 adenosine receptors with binding constants in the micromolar range for the A1, A2A, and A3 receptors [ 175 ]. In silico docking into homology models of the A1 and A3 receptors demonstrated that UM-4 readily docks into the adenosine binding sites of both receptors, likely due to the inherent flexibility of its long chain ester substituents [ 175 ]. MTA is the enzymatic by product of three major AdoMet-dependent pathways: polyamine, ethylene and N -acylhomoserine lactone biosyntheses. Thus, the quantities of MTA produced by marine organisms are not insignificant. MTA, like S -adenosylhomocysteine, is a proximate AdoMet metabolite that is usually recycled to methionine [ 176 , 177 ]. Two major routes of MTA metabolism are known [ 178 – 181 ]. One is initiated by the enzyme MTA phosphorylase to yield adenine and 5-methyl-thioribose-1-phosphate; a second enzymatic pathway involves initial hydrolytic cleavage of MTA by one of several closely related nucleosidases, to produce adenine and 5-methylthioribose. Konig and colleagues suggested UM-4 might be an MTA prodrug that is slowly hydrolyzed by marine esterases [ 175 ]. Expanding on this idea, UM-4 may also be a depot form of UCA and/or HMA. UCA's biological properties support this possibility [ 182 ]. The trans -isomer of UCA is biosynthesized from histidine in the outer epidermal layers of marine organisms. Subsequent exposure to UV radiation converts trans -UCA to the bioactive, immunosuppressive cis -isomer. The mechanisms associated with these biological properties, although widely studied, are not well understood [ 182 ]. Further insights into UM-4 function may be forthcoming in the future. From a structural perspective alone, UM-4 is, perhaps, the most bizarre AdoMet metabolite to be extracted from the oceans' depths. 3.1. Polyamine Pathways [ 37 – 44 ] Putrescine, spermidine and spermine are the major eukaryotic polyamines. Putrescine, which is enzymatically derived from ornithine, is metabolized to spermidine and then to spermine by successive enzymatic transfers of an aminopropyl group from decarboxylated AdoMet ( Figure 3 ). The purine nucleoside, 5'-deoxy-5'-(methylthio)adenosine (MTA) is the common byproduct of spermidine and spermine synthesis. At physiologic pH, polyamines exist as polycations and modulate functions of acidic structures such as DNA, RNA, phospholipids and proteins. They are important participants in processes associated with cell viability, growth and differentiation. The naturally high intracellular levels of polyamines ( i.e. , mM concentrations) have made clarification of their high affinity molecular targets more difficult. They are known to specifically affect the functions of ion channels and the N -methyl- d -aspartate (NMDA) glutamate receptor at physiological concentrations [ 40 , 45 ]. Igarashi and colleagues studied the binding interactions of spermidine and spermine with cellular DNA, RNA, phospholipids and ATP in rat liver and bovine lymphocytes [ 41 ]. In both cell types, the largest fractions of intracellular spermidine and spermine were found to be associated with RNA, suggesting that the structural changes to RNA arising from these binding interactions may play a major role in the intracellular functions of polyamines [ 41 ]. Polyamines are involved in key cellular functions such as responses to oxidative stress, pH, and osmoregulation, which are of particular importance to marine bacteria. These functions are even more important to extreme thermophilic bacteria, which use polyamines to stabilize their RNA and DNA at high temperatures [ 46 ]. The fact that polyamines have specialized functions in aquatic environments is evidenced by an abundance of novel straight chain and branched polyamines produced by marine organisms. The marine thermophile, Thermus thermophilus is an example of a prolific producer of different polycationic polyamine structures (shown in Table 2 ). A collection of unusually long-chain polyamines (LCPAs) has been isolated from the marine sponge, Axinyssa aculeate . A composite of their structures, + H 3 N-(CH 2 ) 3 -[NH 2 + -(CH 2 ) 3 ]n–NH 3 + (n = 4–14), gives an idea of their extraordinary length [ 47 ]. Other LCPAs have been isolated from marine algae [ 48 – 50 ]. LCPAs are known to combine with silica precipitating proteins (silaffins) to produce a composite material called biosilica that is essential to the formation of complex cell wall structures such as those found in shells. Biomineralization is manifested by the use of species-specific sets of silaffins and LCPA constituents whose structural variations may include differences in chain length, N -methylation patterns and/or the positioning of secondary amino substituents and quaternary ammonium groups [ 48 , 49 , 51 ]. Consequently, polyamines are essential for the formation of intricate silica patterns on cell walls of diatoms [ 47 – 50 ]. From a technical perspective, an understanding of the biochemical mechanisms that regulate nanoscale production of biosilica-based structures is highly relevant to research and product development in the field of nanotechnology [ 51 ]. Marine habitats have also proved to be a rich source of unusual polyamine conjugates (PACs) such as those depicted in Figure 4 . For each conjugate, at least one marine source is listed in Table 3 . Crambescidin 800 ( PAC-5 ) and ptilomycalin A ( PAC-6 ) belong to a family of guanidine alkaloids whose structures contain an unusual pentacyclic guanidine framework linked by a ω–hydroxy fatty acid to a spermidine or hydroxyspermidine moiety. The structures of PAC-5 and PAC-6 differ only by the presence or absence of a hydroxyl substituent on spermidine. Although both compounds showed activity in various antitumor and antimicrobial screens, their potencies were unremarkable [ 53 – 56 ]. However, in the course of comprehensive, high-throughput screens of ~3,100 compounds from NCI libraries and >300 crude marine-derived extracts for antifungal activity, Crambescidin 800 emerged as the most potent compound [ 57 ]. Penaramide A ( PAC-4 ) is one of several acylated polyamine structures that were isolated from the sponge Penares aff. Incrustans . Penaramides are symmetric molecules that differ only in the composition of their N -terminal acyl substituents. Penaramide A, the simplest of these compounds, contains two linear, C11 fatty acids. At the time these compounds were described, they were found to inhibit binding of the peptide neurotoxin, ω-conotoxin GVIA to N-type (high voltage-activated) calcium channels [ 33 ]. Acarnidines ( PAC-1 ), another class of polyamine fatty acid conjugates, are distinguished by the presence of a homospermidine backbone. As seen in the penaramide series, acarnidines differ only by the structures of their respective fatty acid components. The acarnadines were reported to have significant antimicrobial activity against Herpes simplex type 1, Bacillus subtilis, and Penicillium atrovenetum [ 58 ]. Another fatty acid polyamine conjugate, sinulamide ( PAC-3 ), is an inhibitor of H,K-ATPase [ 66 ]. Sinulamide has structural features similar to some of those seen in penaramides and acarnidines. The novel alkaloid, spermatinamine ( PAC-8 ) is a symmetrical spermine conjugate whose uncommon feature is its unusual acyl component which is derived from 3,5-dibromotyrosine. Spermatinamine is an inhibitor of isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT), one of the enzymes involved in activation of the Ras signaling pathway [ 64 ]. Ras family proteins contain a CAAX terminal sequence that undergoes a series of successive posttranslational modifications, resulting in the translocation of these proteins to the cell membrane [ 67 ]. The specific enzymes that contribute to activation of Ras signaling are considered to be promising anticancer targets. Spermatinamine, the first natural product known to inhibit ICMT, is a compound of significant chemotherapeutic interest [ 64 ]. Petrobactin ( PAC-9 ) was first isolated from Marinobacter hydrocarbonoclasticus [ 68 ]. This oil-degrading molecule has since been found in both pathogenic and nonpathogenic bacteria [ 69 ]. Petrobactin is required for expression of virulence by Bacillus anthracis , the causative agent of anthrax disease and is the primary siderophore produced by this pathogen under conditions of iron starvation [ 65 ]. Elucidation of its structure, biosynthetic origins and biological properties as well as chemical routes to its synthesis, have been well established [ 65 , 70 – 81 ]. Pseudoceratidine ( PAC-7 ), an antifouling agent that can prevent attachment of marine organisms ( e.g. , mollusks, barnacles) to hulls of ships and other submerged structures, was first isolated and synthesized in 1996 [ 63 , 82 ]. Its interesting spectrum of antimicrobial and marine biocidal effects are of potential industrial significance [ 83 ]. Trimethylspermidine amide ( PAC-2 ) and sinulamide ( PAC-3 ), a potent inhibitor of H,K-ATPase, were isolated from different species of the soft coral Sinularia [ 66 ]. Marine PACs with unusually complex N -acyl components can be viewed as lead structures for combinatorial synthesis of novel PACs from libraries of acyl substituents and linear polyamines. 3.2. Methylation Pathways Methylated molecules are the most abundant type of AdoMet metabolites in living organisms. Their biosynthesis is catalyzed by a superfamily of methyltransferase enzymes [ 5 , 84 – 87 ] ( Figure 5 ). Several classes of methyltransferases have been structurally defined [ 5 , 86 – 88 ]. The AdoMet binding regions in many of these enzymes contain a common, three-dimensional structural motif that has been used to seek out putative methyltransferases among proteins of unknown function [ 84 ]. Clarke and colleagues established a methyltransferase-specific database and have continued to search for protein sequences predictive of methyltransferase function by scanning open reading frames of genomes using automated methods they developed for this purpose [ 84 ]. The physiological consequences of enzymatic methyl group transfer can be viewed from fundamental chemical and biochemical perspectives. A methyl group can be transferred to atoms such as carbon, nitrogen, oxygen, sulfur, and selenium. However, methyltransferases that catalyze methyl transfer to carbon, nitrogen and oxygen atoms are predominant. Methyl group addition increases steric bulk and can alter charge, conformation and/or tertiary structure of the acceptor molecule. Furthermore, methylation can profoundly affect biochemical pathways and physiological processes by altering the binding affinities of associated ligands for macromolecules such as proteins, DNA, RNA and phospholipids as well as for small molecule ligands, such as steroids, amino acids, nucleosides and biogenic amines. Complex methylation patterns are seen in many classes of small marine-derived molecules such as purines ( Table 4 , Figure 6 ) and sterols ( Figure 7 ). A variety of methylated purines has been isolated from marine organisms [ 106 ]. Figure 6 depicts a selected number of these structures. Examples of methylation within the purine scaffold, which contains four heterocyclic nitrogen atoms, as well as on some of the exocyclic amino- and imino-substitutents are depicted. MP-7 and MP-17 contain exocyclic methoxy substituents. MP-8 elicits an antitumor response, MP-9 displays antibacterial behavior and MP-17 is a collagenase inhibitor [ 106 ]. Whether these purine analogs afford any benefits to their host organisms is unclear. However, they may be useful as anti-metabolite templates for potential anti-infectives. Sponges are the most abundant marine source of novel sterols [ 107 ]. Changes in the compositions of these membrane constituents, which are vital for cell permeability, are associated with increased defensive capabilities [ 108 , 109 ]. Marine sterols exhibit structural complexities that are not observed in terrestrial organisms [ 110 ]. Although most variations occur in the side chain, the steroid ring system is also subject to chemical transformations [ 111 ]. Structural variations also arise in the methylation patterns of steroid rings, alkyl side chains and/or exocyclic substituents. The structurally complex, anti-angiogenic cortistatins isolated from the sponge Corticium simplex contain both C - and N -methylated substituents [ 112 ] ( Figure 7 ). 3.3. AdoMet-Dependent Ethylene Biosynthesis [ 113 – 117 ] Ethylene is a phytohormone that stands at the apex of a robust signaling pathway in plants. Ethylene, which is enzymatically derived from AdoMet ( Figure 8 ), serves as a critical regulator of life sustaining processes such as plant growth and development, responses to external stresses, and senescence. The terrestrial plant, Arabidopsis thaliana has served as a model system for elucidating the biochemical, molecular and genetic complexities of the ethylene signaling pathway, which is still the focus of intense scientific study [ 84 , 115 , 116 , 118 ]. AdoMet-dependent ethylene biosynthesis has been documented in a variety of marine plants and sponges [ 119 – 121 ]. Suberites domuncula , a marine sponge, responds to the presence of ethylene (5 μM) by upregulating its intracellular concentration of Ca +2 and reducing its apoptotic response to starvation [ 122 ]. When the marine macroalga Ulva (Enteromorpha) intestinalis moves from conditions of low light intensity to high light intensity, its production of ethylene increases. This suggests that ethylene is involved in an adaptive response to light stress [ 119 ]. Ethylene is also naturally present in seawater as a consequence of widespread photochemical degradation of organic materials. Thus ethylene can be acquired from the aquatic environment by ethylene-responsive marine organisms that might not contain the biosynthetic machinery for its production. 3.4. Biohalogenation Pathways [ 123 – 125 ] The discovery of a fluorinase enzyme that catalyzes the formation of a carbon-fluorine bond not only opened a new chapter in the field of biohalogenation, but also uncovered a previously unknown pathway of AdoMet metabolism [ 13 ]. The fluorinase was first isolated from the soil bacterium Streptomyces cattleya . The enzyme's x-ray crystal structure, catalytic mechanism and kinetic features have since been determined [ 13 , 123 , 126 ]. The fluorinase reaction yields the proximate AdoMet metabolite, 5'-deoxy-5'-fluoroadenosine, which is ultimately transformed to a toxin, monofluoroacetic acid and an unusual amino acid, 4-fluorothreonine. Subsequent discovery of an AdoMet-utilizing chlorinase from Salinispora tropica has demonstrated the existence of AdoMet biohalogenation pathways in marine organisms [ 1 ]. The chlorinase reaction, mechanistically similar to that of the S. cattleya fluorinase, produces the proximate AdoMet metabolite, 5'-deoxy-5'-chloroadenosine which is a key intermediate in the biosynthesis of salinosporamide A ( Figure 9 ). Cell-free assays of S. tropica chlorinase activity determined that inorganic bromide and iodide, but not fluoride, can be used as inorganic substrates in place of chloride, suggesting that brominated and iodinated marine structures arising from AdoMet-dependent biohalogenations may possibly be found in the future [ 1 ]. 3.5. Radical SAM Pathways [ 10 – 12 , 127 – 130 ] In a groundbreaking study, Sofia and colleagues discovered a new protein superfamily of enzymes, designated radical SAM, through iterative profile searches of protein databases, data analysis employing powerful bioinformatic tools and information visualization techniques [ 10 ]. Shared features of radical SAM proteins are the presence of an uncommon iron-sulfur cluster [4Fe-4S], the specific sequence motif CxxCxxC and an AdoMet binding motif. Two basic types of radical SAM proteins have been characterized. One uses AdoMet as a catalytic cofactor that is the direct precursor of the 5'-deoxyadenosyl radical (DOA radical). The other uses AdoMet as a substrate to irreversbly generate a DOA radical. In the first reaction type, AdoMet abstracts a hydrogen atom from 5'-deoxyadenosine (DOA), the end product of step 1, and concomitantly, recycles AdoMet and regenerates a DOA radical. In the second type, AdoMet serves as a radical SAM substrate whose proximate products are methionine and a DOA radical. The initial reaction steps, which are identical for all SAM enzymes, are illustrated in Figure 10 . DOA radicals can act as powerful anaerobic oxidants whose biochemical functions vary among different radical SAM proteins. Many of these proteins use DOA radicals to cleave and functionalize otherwise unreactive carbon-hydrogen (C-H) bonds in protein and small molecule substrates [ 12 ]. Chemical reactions such as isomerization, sulfur insertion, dehydrogenation and cyclization are catalyzed by radical SAM family members [ 10 , 11 ]. The radical SAM enzymes, biotin synthase and lipoyl synthase are responsible for the production of the key biochemical cofactors, biotin and lipoic acid [ 11 , 12 , 127 – 130 ]. Brief mention here of other known radical SAM family members attests to the functional diversity of these proteins: spore photoproduct lyase; anaerobic ribonucleotide reductase activating enzyme; benzylsuccinate synthase; coproporphyrinogen III oxidase; lysine 2,3-amino-mutase; pyruvate formate-lyase [ 127 ]. Existence of radical SAM proteins in marine organisms has been noted. The green sulfur bacterium , Chlorobaculum tepidum , produces bacteriochlorophylls c, d , and e , a group of photosynthetic pigments that differ from other chlorophylls by the presence of methyl groups at their C -8 2 and C -12 1 carbons. These site-specific methylations are critical to the organism's ability to adapt to decreased light intensities [ 131 ]. Labeled precursor studies confirmed that these methyl groups are derived from AdoMet [ 132 ]. The methyltransferases responsible for addition of these two methyl groups have been identified recently as members of the radical SAM superfamily [ 131 ]. Sequencing of the complete genome of Acaryochloris marina has led to the discovery of twelve proteins that contain the characteristic, distinguishing features of radical SAM proteins [ 133 ]. A. marina is a cyanobacterium whose predominant photosynthetic pigment is chlorophyll d . The presence of this unusual pigment enables A. marina to use far-red light for its photosynthetic pathways. 3.6. Quorum Sensing Pathways Some gram-negative bacteria sense conspecific cell density, and the density of other bacteria, by monitoring the extracellular concentration of specific small molecules. This phenomenon, called quorum sensing (QS), is used by bacteria to coordinate transcriptional regulation of genes that control population-sensitive programs. QS was first described as a general phenomenon in a landmark review [ 134 ]. An example from this review illustrates the process as a whole: Vibrio fischeri , a bioluminescent marine bacterium, expresses genes needed to produce bioluminescence only at high population density. A small molecule, N -3-oxo-hexanoyl- l -homoserine lactone, accumulates in culture fluid with increasing density of V. fischeri. N -3-oxo-hexanoyl- l -homoserine binds to the receptor/transcription factor, LuxR, which controls population density dependent expression of bioluminescence genes. Further work showed that different species of bacteria use different AHLs of varying acyl chain lengths as species specific QS signals. In addition to control of bioluminescence in other Vibrio species, AHL-controlled QS coordinates what are effectively multicellular developmental programs in a wide range of bacteria. These include biofilm formation, swarming, and induction of virulence in pathogenic species. [ 135 – 137 ]. AHLs are enzymatically produced from AdoMet and an acyl-acyl carrier protein [ 7 , 138 ] ( Figure 11 ). The lactone ring is an invariant feature of AHLs, arising from cyclization of the methionine moiety of AdoMet by AHL synthase enzymes. Natural AHL structures vary not only in the length of the acyl side chain but also in the oxidation state at carbon 3 and the occasional presence of unsaturated carbon-carbon bonds. This is illustrated in three AHL structures produced by various Vibrio sp. [ 139 ] ( Figure 12 ). Marine gram-negative α-proteobacteria produce many novel AHL structures, such as those isolated from Mesorhizobium sp. [ 140 ] ( Figure 13 ). The Roseobacter clade, grouped by a shared lineage, is a ubiquitous class of α-proteobacteria, [ 141 , 142 ]. Although Roseobacters can exist as free-living organisms, they frequently reside in marine habitats that promote their symbiotic associations with microalgae, corals, diatoms, oysters, etc. A significant number of Roseobacter strains isolated from North Sea marine habitats were found to produce complex mixtures of unusual, long-chain AHLs ( Figure 14 ) [ 143 ]. Quorum sensing in Roseobacters is associated with adaptive responses, such as biofilm formation, which promote colonization of other organisms, and antibiotic production, which is presumably used for self protection [ 144 ]. Tryptantrin and thiotropocin are two known Roseobacter -derived antibiotics, whose production is regulated by AHL-dependent signaling [ 142 ]. Comparison of the long-chain AHLs produced by Roseobacters ( Figure 14 ) and Mesorhizobium sp. ( Figure 13 ) shows remarkable similarities in the acyl side chain structures. Except for AHL-7 , which is produced by both organisms, their respective AHL signal molecules are in fact structurally distinct and allow for self discrimination. Autoinducer-2 ( AI-2 ) is another AdoMet-derived bacterial QS signal molecule that was discovered in a marine bacterium [ 9 , 145 ]. The proximate precursor of AI-2 is S -adenosylhomocysteine (AdoHcy), the AdoMet metabolite that is generated as the byproduct of all AdoMet-utilizing methylation reactions ( Figure 15 ). Since AdoHcy is a potent product inhibitor of methyltransferases, conditions that allow its accumulation in cells have toxic consequences. Two pathways of AdoHcy degradation are known. One is initiated by the enzyme AdoHcy hydrolase which produces the proximate metabolites, adenosine and l -homocysteine. A second pathway of AdoHcy degradation is initiated by the enzyme AdoHcy nucleosidase, which produces the proximate metabolites, adenine and S -ribosylhomocysteine. Gram-positive bacteria also utilize QS as a means to communicate and coordinate responses to a variety of environmental stimuli. However, they do not generate AHLs; instead they utilize small autoinducing peptides [ 146 ]. Although AHL production is considered to be exclusive to gram negative bacteria, both gram-positive and gram-negative bacteria are able to synthesize AI-2 . Thus QS signaling via AI-2 provides an avenue for interspecies communication [ 147 ]. 3.7. N-Acylhomoserine Lactones as Templates for Anti-Infective Tetramic and Tetronic Acids Bacteria that rely on the production of QS signal molecules to coordinate expression of genetic programs, must also have signal molecule degradation pathways to effectively shut down these processes. Two major enzymatic mechanisms for AHL removal are hydrolytic opening of the lactone ring by lactonases or hydrolytic cleavage of the amide bond by acylases [ 148 ]. AHLs can also undergo a nonenzymatic chemical rearrangement to form tetramic acids (TAMs). The biological relevance of this type of AHL rearrangement was observed in Pseudomonas aeruginosa cultures by Kaufmann and colleagues, who isolated the expected AHL, N -3-oxo-dodecanoyl- l -homoserine lactone (OdDHL) as well as the corresponding tetramic acid ( TAM-1 ) from the culture medium [ 149 ] ( Figure 16 ). Notably, TAM-1 displayed a spectrum of antibacterial activity different from that of OdDHL. Based on these novel findings, marine-derived AHLs can be regarded as templates for the design of tetramic acid derivatives with antibacterial effects distinct from those of their parent AHLs. Similarly, the tetramic acids can serve as templates for synthesis of the related tetronic acids (TONs). In fact, 3-alkanoyl-5-hydroxymethyl tetronic acid (RK-682, TON-1 ), isolated from actinomycete strain DSM 7357, at first sight appears to be an AHL-derived tetronic acid analog [ 150 ] ( Figure 17 ). The initial finding that TON-1 is a potent inhibitor of tyrosine phosphatase that blocks G2/M cell cycle progression has spurred interest in analog synthesis and evaluation [ 150 – 152 ]. 3.8. Marine-Derived Quorum Sensing Antagonists Marine organisms have not sat by idly while various bacteria coordinate their destruction with AHLs. Many have developed additional pathways to disrupt AHL function and QS signaling. Some marine eukaryotes produce AHL mimics that interfere with AHL-receptor binding, effectively blocking the QS signal. Halogenated furanones produced by the Australian red algae, Delisea pulchra are the best studied examples of naturally occurring AHL mimics [ 153 , 154 ] ( Figure 18 ). Several studies have determined that two D. pulchra halogenated furanones ( HF-1 and HF-2 ) disrupt the AHL-controlled swarming phenotype of S. liquefaciens through competitive binding of AHL receptors [ 155 ], [ 156 ]. Furthermore, binding of halogenated furanones to AHL receptors decreases receptor half life [ 156 ]. Like tetronic acids, halogenated furanones may serve as retro-templates for related AHL or tetramic acid structures with potential anti-QS and/or anti-infective activities. 3.9. Unusual Marine Metabolites of AdoMet Many AdoMet-derived compounds that were isolated from marine sources have unconventional structures and/or exhibit unusual biological properties ( Figure 19 ). Some of these metabolites contain a polyamine backbone within a more complex chemical structure ( UM-5, UM-7 ); most integrate methyl substituents within unusual structural scaffolds ( UM1 - UM7 ). From a shared chemical and biological perspective, the most extraordinary AdoMet-derived marine metabolite is, arguably, the low molecular weight boronate diester, AI-2 , which acts as an interspecies bacterial signal molecule. Inclusion of salinosporamide A ( H-1 ) in this small group of uncommon molecules reflects its novelty as the first marine metabolite known to be halogenated via an AdoMet-dependent halogenase (as noted in Section 3.4 [ 1 ]). Motuporamines (MPAs) were first isolated from the tropical marine sponge Xestospongia exigua (Kirkpatrick) [ 157 ]. Their heterocyclic structures are characterized by the presence of an incorporated polyamine ( i.e. , spermidine) tail. Additional motuporamines whose structures differ by ring size and by the presence and positions of unsaturated bonds and/or methyl substituents, have since been isolated [ 158 ]. The MPAs, UM-5 (composite structure ) each contain a methyl group of unassigned position. AdoMet independently serves as polyamine precursor and methyl donor for the structural components of UM-5 . MPAs have been shown to inhibit angiogenesis and tumor cell invasiveness [ 158 , 159 ]. To and colleagues considered that MPAs might have similar effects on neuronal growth and motility. They studied the effects of MPA-C on neurite development in chicks and determined that this compound profoundly represses formation of the highly motile, neuronal growth cone that plays a key role in axonal outgrowth [ 160 ]. MPA-C is used as a novel neurobiological probe to study molecular mechanisms associated with neuronal outgrowth [ 158 – 161 ]. The sesquiterpene quinone, ilimaquinone ( UM-6 ) was first isolated from the marine sponge Hippospongia metachromia in 1979 [ 162 ]. One of its unusual biological properties is its ability to completely vesiculate Golgi membranes and consequently affect protein transport [ 163 ]. As such, ilimaquinone has been widely used to elucidate the physiological functions of the Golgi apparatus [ 164 , 165 ]. Ilimaquinone has also been found to potently inhibit S -adenosylhomocysteine hydrolase (AHH), a key enzyme in methylation pathways [ 166 ]. AHH inhibition blocks degradation of S -adenosylhomocysteine, the potent product inhibitor of all AdoMet dependent methyltransferases, suggesting that AdoHcy levels are elevated in ilimaquinone-producing marine organisms. Since AdoHcy also serves as proximate precursor of the QS signal molecule, AI-2 , "ilimaquinone-producers" in marine habitats may have an enhanced capability to synthesize AI-2 in response to environmental stresses. The aminosterol, squalamine ( UM-7 ) is a spermidine-dihydroxycholestane-sulfate conjugate that was initially isolated from stomach extracts of the dogfish shark Squalus acanthias [ 167 ]. Additional aminosterols, with structural variations primarily in the sterol side chain, were subsequently isolated from the same source [ 168 ]. One of these compounds is a spermine conjugate. Squalamine is a water-soluble, broad spectrum antimicrobial, having shown activity against strains of Escherichia coli , Staphylococcus aureus , C andida albicans and P. aeruginosa [ 167 , 168 ]. Squalamine, which has also shown anticancer and antiangiogenic activities, has undergone phase II clinical trials against ovarian, prostate and non-small cell lung cancers [ 167 – 169 ]. Monodictychromones A and B ( UM-1 and UM-3 ) were found in the marine algicolous fungus, Monodictys putredinis by Konig and colleagues who had previously isolated a group of monomeric xanthones from the same organism [ 140 , 170 ]. UM-1 and UM-3 contain two unusual, non identical xanthone subunits and three chiral methyl substituents. UM-1 and UM-3 differ only by the site of their linkage [ 170 ]. The two compounds were evaluated for their ability to inhibit the activities of aromatase and cytochrome P450 1A enzymes as well as induction of NAD(P)H:quinone reductase. Both dimeric structures showed similar, but modest inhibitory effects (μM range) in these assays [ 170 ]. Hectochlorin, UM-2 has been isolated from the marine cyanobacterium Lyngbya majuscula as well as the sea hare, Bursatella leachii [ 171 , 172 ]. UM-2 's notable biological properties include its potent stimulatory effects on actin polymerization in PtK2 (normal kidney) cells and its potent antifungal activity against C. albicans [ 171 ]. Gerwick and colleagues characterized the hectochlorin biosynthetic gene cluster from L. majuscula [ 173 ]. During these investigations, an AdoMet-dependent C -methyl-transferase signature motif, previously identified in the biosynthetic gene clusters of curacin A and jamaicamide from other L. majuscula strains, was found to be present in the hectochlorin biosynthetic gene cluster [ 29 , 173 – 175 ]. The unusual, asymmetric diester of MTA, UM-4 was isolated from the marine ascadian, Atriolum robustum [ 175 ]. The 2'-ribose ester substituent of UM-4 is derived from 3-(4-hydroxyphenyl-2-methoxyacrylic acid (HMA); the 3'-ribose ester substituent, from urocanic acid (UCA). UM-4 was consistently inferior to MTA in receptor-specific binding assays for the A1, A2A, A2B, and A3 adenosine receptors with binding constants in the micromolar range for the A1, A2A, and A3 receptors [ 175 ]. In silico docking into homology models of the A1 and A3 receptors demonstrated that UM-4 readily docks into the adenosine binding sites of both receptors, likely due to the inherent flexibility of its long chain ester substituents [ 175 ]. MTA is the enzymatic by product of three major AdoMet-dependent pathways: polyamine, ethylene and N -acylhomoserine lactone biosyntheses. Thus, the quantities of MTA produced by marine organisms are not insignificant. MTA, like S -adenosylhomocysteine, is a proximate AdoMet metabolite that is usually recycled to methionine [ 176 , 177 ]. Two major routes of MTA metabolism are known [ 178 – 181 ]. One is initiated by the enzyme MTA phosphorylase to yield adenine and 5-methyl-thioribose-1-phosphate; a second enzymatic pathway involves initial hydrolytic cleavage of MTA by one of several closely related nucleosidases, to produce adenine and 5-methylthioribose. Konig and colleagues suggested UM-4 might be an MTA prodrug that is slowly hydrolyzed by marine esterases [ 175 ]. Expanding on this idea, UM-4 may also be a depot form of UCA and/or HMA. UCA's biological properties support this possibility [ 182 ]. The trans -isomer of UCA is biosynthesized from histidine in the outer epidermal layers of marine organisms. Subsequent exposure to UV radiation converts trans -UCA to the bioactive, immunosuppressive cis -isomer. The mechanisms associated with these biological properties, although widely studied, are not well understood [ 182 ]. Further insights into UM-4 function may be forthcoming in the future. From a structural perspective alone, UM-4 is, perhaps, the most bizarre AdoMet metabolite to be extracted from the oceans' depths. 4. Conclusions Marine environments continue to serve as a source of newly identified, structurally novel metabolites of AdoMet. The discovery of quorum sensing activities in gram-negative marine bacteria and the ensuing studies of QS phenomena in marine environments have been instrumental to our current understanding of the complexities of this previously unrecognized bacterial signaling network. These studies provided the first evidence of two new types of AdoMet-derived metabolites, AHLs and AI-2 . We regard QS networks in global marine habitats as an unusually fertile source of potential, anti-infective AdoMet-derived molecules. The different types of QS-related molecules that can be used as templates for drug design include AHLs, their corresponding tetramic and tetronic acids, and halogenated furanones. Equally important drug templates will emerge from the vast array of defensive chemicals produced by marine organisms to combat the coordinated assaults of pathogenic, quorum sensing bacteria.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8763983/

Current Noise of a Protein-Selective Biological Nanopore

1/ f current noise is ubiquitous in protein pores, porins, and channels. We have previously shown that a protein-selective biological nanopore with an external protein receptor can function as a 1/ f noise generator when a high-affinity protein ligand is reversibly captured by the receptor. Here, we demonstrate that the binding affinity and concentration of the ligand are key determinants for the nature of current noise. For example, 1/ f was absent when a protein ligand was reversibly captured at a much lower concentration than its equilibrium dissociation constant against the receptor. Furthermore, we also analyzed the composite current noise that resulted from mixtures of low-affinity and high-affinity ligands against the same receptor. This study highlights the significance of protein recognition events in the current noise fluctuations across biological membranes.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5435163/

Pediatric fluoroquinolone prescription in South Korea before and after a regulatory intervention: A nationwide study, 2007-2015

Objective To investigate the impact of national implementation of age restriction on fluoroquinolone prescription in children and adolescents. Methods Data collected from the database of Health Insurance Review and Assessment Service in South Korea, a national health insurance system to analyze fluoroquinolone prescribing practice in children and adolescents younger than 18 years, between 2007 and 2015. The age restriction was implemented in December 2009. The annual prescription rate of FQ per 100,000 person-years was calculated and an autoregressive model was used to predict the prescription pattern if an intervention had not occurred. Results A total of 505,859 children received systemic fluoroquinolone during the study period—297,054 ciprofloxacin, and 208,805 levofloxacin. After implementation of the drug utilization review program, the annual prescription rate for ciprofloxacin declined by 97.5% (from 840 to 21 per 100,000 person-years, P < 0.001), and for levofloxacin by 96.4% (from 598 to 11 per 100,000 person-years, P < 0.001). The decline was more dramatic in the outpatient setting than in the inpatient setting for both drugs. Conclusion The dramatic and sustained decline in prescription number and change in prescription pattern after the regulatory action suggests that the implementation under drug utilization review program was successful in controlling excessive and inappropriate use of fluoroquinolones in children, possibly guiding towards more judicious and selective prescription behavior. Objective To investigate the impact of national implementation of age restriction on fluoroquinolone prescription in children and adolescents. Methods Data collected from the database of Health Insurance Review and Assessment Service in South Korea, a national health insurance system to analyze fluoroquinolone prescribing practice in children and adolescents younger than 18 years, between 2007 and 2015. The age restriction was implemented in December 2009. The annual prescription rate of FQ per 100,000 person-years was calculated and an autoregressive model was used to predict the prescription pattern if an intervention had not occurred. Results A total of 505,859 children received systemic fluoroquinolone during the study period—297,054 ciprofloxacin, and 208,805 levofloxacin. After implementation of the drug utilization review program, the annual prescription rate for ciprofloxacin declined by 97.5% (from 840 to 21 per 100,000 person-years, P < 0.001), and for levofloxacin by 96.4% (from 598 to 11 per 100,000 person-years, P < 0.001). The decline was more dramatic in the outpatient setting than in the inpatient setting for both drugs. Conclusion The dramatic and sustained decline in prescription number and change in prescription pattern after the regulatory action suggests that the implementation under drug utilization review program was successful in controlling excessive and inappropriate use of fluoroquinolones in children, possibly guiding towards more judicious and selective prescription behavior. Introduction Pediatric use of FQs has been restricted due to early findings of FQ-associated weight-bearing joint damage in juvenile animals [ 1 – 4 ]. However, the off-label pediatric use of FQ outside the regulatory boundaries is thought to be common and increasing worldwide [ 5 – 9 ]. Development of resistance to other antibiotics is thought to be the main driving factor behind the increasing use of FQs in children [ 10 – 15 ]. However, FQ itself is also associated with the rapid development of resistance, and thus, these agents should be used with caution and only when necessary [ 2 , 16 , 17 ]. A worldwide emergence of quinolone resistance has been observed, especially with Escherichia coli isolates, and this phenomenon is thought to be most prominent in the Asia–Pacific region [ 18 – 24 ]. Therefore, inappropriate and excessive use of FQs in children, especially in the ambulatory setting, is of concern in this era of increased antimicrobial resistance. Interventions have been often implemented on the individual hospital level to control the inappropriate use of antibiotics and restrict the use of certain broad-spectrum antibiotics. In South Korea, an intervention was implemented on a national level to control fluoroquinolone use of in children. South Korea has a unique Drug Utilization Review (DUR) system that is concurrent and provides real-time information to prescribers and pharmacists [ 25 ]. It uses a predefined DUR criteria that include a list of medications that are contraindicated in pregnant women, drugs with drug–drug interactions, and drugs with age restrictions. After its initial establishment in 2004, 58 drugs were added to the list of contraindicated drugs in pediatrics in December 2009, which included the fluoroquinolone (FQ) class of antibiotics [ 26 ]. When a contraindicated drug is prescribed, an alert appears; at this point, the prescriber may change the prescription or provide a reason to justify the use and continue with the prescription. When a contraindicated drug is dispensed, a similar warning appears, and the pharmacist should contact the prescriber and confirm the prescription. Before December 2009, there were no regulatory restrictions on FQ use in children and the Korean regulatory agencies reimbursed the use of FQs for patients of all ages. Such measure was in contrast to other countries where the regulatory approval status of FQs in children was expanded to allow the use in a wider range of indications, which was supported by the increasing availability of safety information showing that musculoskeletal events are rare and reversible [ 10 – 13 ]. Currently, the United States Food and Drug Administration (US FDA)-approved pediatric indications for FQs include inhalational anthrax, complicated urinary tract infections, and pyelonephritis for ciprofloxacin (CF), and inhalational anthrax for levofloxacin (LF) [ 27 , 28 ]. Some European countries also allow the use of CF in children under certain indications [ 29 ]. To our knowledge, no quantitative studies have been conducted to quantify national prescription volume of fluoroquinolone in children. Although one study has assessed FQ use in Korean pediatric patients, it used patient sample data and short study period of two years, and thus limited in evaluating the overall, sustained impact of the nationwide intervention [ 30 ]. Thus, the aims of our study were 1) to quantify the national pediatric use of fluoroquinolones and 2) to evaluate the sustained as well as immediate effect of nationwide implementation of age restriction on fluoroquinolone use by analyzing the changing rates and patterns of prescription over 9 years. Based on the understanding of the national reimbursement policy, where the prescription of a contraindicated drug included in the list may be restrictively reimbursed, we hypothesized that the classification of FQ as drug contraindicated for pediatric use would result in a dramatic reduction in the number of FQ prescriptions. Materials and methods Data source The Health Insurance Review and Assessment Service (HIRA), a Korean regulatory agency, is responsible for the review and assessment of reimbursement and plays a leading role in managing the DUR. The entire Korean population, with the exception of the 3% covered under medical aid, is enrolled in the national health insurance system, which achieved universal coverage of all citizens in 1989 [ 31 ]. The HIRA database contains nationwide information from medical facilities and pharmacies on patient demographics, diagnoses, prescriptions, and healthcare service providers. For reimbursement, the patient's diagnosis must be confirmed by physicians, and the Korean National Health Insurance agency reviews it against the eligibility criteria, before submitting claims to the HIRA claim database. Thus, these data are considered reliable [ 32 ]. The ethics approval was obtained from the Institutional Review Boards of Chungnam National University and Chung-Ang University. Study period and population Data were collected from 2007 to 2015. Due to the implementation of the DUR age restriction on FQ use in December 2009, the time periods were separated as follows for purposes of comparison: "pre-DUR:" 2007 to 2009; "post-DUR:" 2010 to 2015. Both male and female patients who met the following criteria at the time of prescription were included: (i) younger than 18 years, (ii) visited a medical facility from 2007 to 2015, and (iii) received a prescription for systemic CF or LF. Data on topical FQ use were excluded. Data collection and assessment Drug information, such as the generic name of the drug, prescription date, duration, and route of administration were collected. Gender and age were determined at the time of hospital admission or on the first outpatient prescription. To evaluate the rationale behind prescription as well as its patterns, we analyzed the International Classification of Diseases, tenth revision (ICD-10) diagnostic codes and the specialties of prescribers. To determine which medical facility the DUR implementation had a greater impact on, the number of FQ prescriptions prescribed in each medical facility was analyzed. The medical facility at which FQ was prescribed was classified according to the domestic hospital classification system: clinic, hospital, general hospital, or tertiary referral hospital. As all personal data were de-identified, patient information and healthcare service information could not be matched. To assess other factors that may have impacted pediatric FQ prescriptions, such as drug shortages and overall changes in pediatric antibiotic prescription patterns, data on the prescription volumes of five commonly prescribed pediatric antibiotics (amoxicillin, amoxicillin and clavulanate in combination, cefaclor, cefixime, and clarithromycin; selection based on literature review [ 33 – 35 ]) as well as FQs prescribed in adults were collected using the HIRA National Patients Sample (HIRA-NPS) database [ 36 ]. Statistical analysis The annual prescription rate of FQ per 100,000 person-years was calculated as the number of patients prescribed FQ divided by the number of all Korean residents in the same age group, which was obtained from the national statistics data of 2010 [ 37 ]. Categorical variables were expressed as frequencies and proportions. A chi-square (χ 2 ) test was performed to assess changes in prescription patterns after DUR implementation with regard to diagnostic codes, types of medical facility, and age groups. An autoregressive model was used to predict the prescription pattern if intervention had not occurred. The model coefficient and covariance were estimated based on the maximum-likelihood method. P < 0.05 were considered statistically significant, and all statistical analyses were performed using SAS version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Data source The Health Insurance Review and Assessment Service (HIRA), a Korean regulatory agency, is responsible for the review and assessment of reimbursement and plays a leading role in managing the DUR. The entire Korean population, with the exception of the 3% covered under medical aid, is enrolled in the national health insurance system, which achieved universal coverage of all citizens in 1989 [ 31 ]. The HIRA database contains nationwide information from medical facilities and pharmacies on patient demographics, diagnoses, prescriptions, and healthcare service providers. For reimbursement, the patient's diagnosis must be confirmed by physicians, and the Korean National Health Insurance agency reviews it against the eligibility criteria, before submitting claims to the HIRA claim database. Thus, these data are considered reliable [ 32 ]. The ethics approval was obtained from the Institutional Review Boards of Chungnam National University and Chung-Ang University. Study period and population Data were collected from 2007 to 2015. Due to the implementation of the DUR age restriction on FQ use in December 2009, the time periods were separated as follows for purposes of comparison: "pre-DUR:" 2007 to 2009; "post-DUR:" 2010 to 2015. Both male and female patients who met the following criteria at the time of prescription were included: (i) younger than 18 years, (ii) visited a medical facility from 2007 to 2015, and (iii) received a prescription for systemic CF or LF. Data on topical FQ use were excluded. Data collection and assessment Drug information, such as the generic name of the drug, prescription date, duration, and route of administration were collected. Gender and age were determined at the time of hospital admission or on the first outpatient prescription. To evaluate the rationale behind prescription as well as its patterns, we analyzed the International Classification of Diseases, tenth revision (ICD-10) diagnostic codes and the specialties of prescribers. To determine which medical facility the DUR implementation had a greater impact on, the number of FQ prescriptions prescribed in each medical facility was analyzed. The medical facility at which FQ was prescribed was classified according to the domestic hospital classification system: clinic, hospital, general hospital, or tertiary referral hospital. As all personal data were de-identified, patient information and healthcare service information could not be matched. To assess other factors that may have impacted pediatric FQ prescriptions, such as drug shortages and overall changes in pediatric antibiotic prescription patterns, data on the prescription volumes of five commonly prescribed pediatric antibiotics (amoxicillin, amoxicillin and clavulanate in combination, cefaclor, cefixime, and clarithromycin; selection based on literature review [ 33 – 35 ]) as well as FQs prescribed in adults were collected using the HIRA National Patients Sample (HIRA-NPS) database [ 36 ]. Statistical analysis The annual prescription rate of FQ per 100,000 person-years was calculated as the number of patients prescribed FQ divided by the number of all Korean residents in the same age group, which was obtained from the national statistics data of 2010 [ 37 ]. Categorical variables were expressed as frequencies and proportions. A chi-square (χ 2 ) test was performed to assess changes in prescription patterns after DUR implementation with regard to diagnostic codes, types of medical facility, and age groups. An autoregressive model was used to predict the prescription pattern if intervention had not occurred. The model coefficient and covariance were estimated based on the maximum-likelihood method. P < 0.05 were considered statistically significant, and all statistical analyses were performed using SAS version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Results Characteristics of the study population and number of FQ prescriptions Between 2007 and 2015, a total of 505,859 pediatric patients younger than 18 years received systemic FQs: 297,054 received CF, and 208,805 received LF ( Table 1 ). No significant gender differences were observed between the pre-DUR and post-DUR groups (CF: P = 0.253; LF: P = 0.126); however, a significant increase in the mean age of patients was observed after the implementation of DUR (mean age ± SD; CF: 13.31 ± 4.14 vs. 14.36 ± 3.63 years, P < 0.001; LF: 14.15 ± 3.10 vs. 14.91± 3.31 years, P < 0.001). 10.1371/journal.pone.0176420.t001 Table 1 Demographic characteristics of pediatric patients who received systemic fluoroquinolone treatment. Characteristics (No, %) Ciprofloxacin Levofloxacin Inpatient Outpatient Inpatient Outpatient Pre-DUR Post-DUR Pre-DUR Post-DUR Pre-DUR Post-DUR Pre-DUR Post-DUR (n = 19284) (n = 7553) (n = 263513) (n = 6704) (n = 7435) (n = 2474) (n = 193955) (n = 4941) Age <4 wks 31 (0.2) 21 (0.3) 76 (0.0) 0 (0) 0 (0) 10 (0.4) 35 (0) 1 (0) 4 wks–11 mos 143 (0.7) 168 (2.2) 3890 (1.5) 18 (0.3) 11 (0.1) 35 (1.4) 348 (0.2) 7 (0.1) 1–2 yrs 482 (2.5) 399 (5.3) 7794 (3.0) 36 (0.5) 39 (0.5) 35 (1.4) 1809 (0.9) 35 (0.7) 3–5 yrs 980 (5.1) 616 (8.2) 11816 (4.5) 90 (2.4) 60 (0.8) 51 (2.1) 5121 (2.6) 99 (2.0) 6–11 yrs 2233 (11.6) 771 (10.2) 54743 (20.8) 484 (7.2) 711 (9.6) 174 (7.0) 35015 (18.1) 312 (6.3) 12–17 yrs 15415 (79.9) 5578 (73.9) 185194 (70.3) 6076 (90.6) 6614 (89.0) 2169 (87.7) 151627 (78.2) 4487 (90.8) Gender Male 10663 (55.3) 4278 (56.6) 137684 (52.2) 3131 (46.7) 4531 (60.9) 1400 (56.6) 100554 (51.8) 2398 (48.5) Abbreviations: DUR, drug utilization review; wks, weeks; mos, months; yrs, years. Annual FQ prescription rate The monthly FQ prescription rate decreased significantly after the DUR implementation ( Fig 1 ). The mean annual pre-DUR prescription rate of CF decreased from 840 to 21 per 100,000 person-years (relative reduction: 97.5%) and LF from 598 to 11 per 100,000 person-years (relative reduction: 98.2%). A greater reduction in the FQ prescription rate was observed in the outpatient (CF: from 782 to 10 per 100,000 person-years, 98.7%; LF: from 576 to 7 per 100,000 person-years, 98.8%) than in the inpatient group (CF: from 57 to 11 per 100,000 person-years, 80.7%; LF: from 22 to 4 per 100,000 person-years, 81.8%). Prescription rate of other commonly prescribed antibiotics in children and prescription of FQs in adults remained stable during the study period ( Fig 2 ). 10.1371/journal.pone.0176420.g001 Fig 1 Impact of drug utilization review (DUR) intervention on the monthly fluoroquinolone prescription rates per 100,000 children younger than 18 years old. (A) monthly prescription rate of CF in inpatient setting; (B) monthly prescription rate of LF in inpatient setting; (C) monthly prescription rate of CF in outpatient setting; (D) monthly prescription rate of LF in outpatient setting. Solid lines represent observed values, dashed lines represent predicted values and dotted lines represent 95% confidence intervals of predicted values. Abbreviations: CF, ciprofloxacin; LF, levofloxacin; DUR, drug utilization review. 10.1371/journal.pone.0176420.g002 Fig 2 Prescription of fluoroquinolones and other antibiotics to children and prescription of fluoroquinolone to adults (log scale). Claimed diagnostic codes and specialties of prescribers The top five most common diagnostic codes under which FQ was prescribed in children are shown in S1 Table . The most commonly used diagnostic code in the inpatient group remained unchanged after DUR (CF: certain infectious and parasitic diseases [A00–B99]; LF: diseases of the respiratory system [J00–J99]), and only minor changes occurred in the other top five diagnostic codes. In the outpatient setting, respiratory system diseases (J00-J99) were the most prevalent diagnostic codes associated with prescriptions of both CF and LF in the pre-DUR group. However, after DUR, significant changes in the diagnostic codes were observed with CF most commonly prescribed for certain infectious and parasitic diseases (A00–B99), and LF for diseases of the genitourinary system (N00–N99). Furthermore, we analyzed the specialties of the physicians who prescribed FQ. The top five specialties of physicians who prescribed FQ in children are shown in Table 2 . The most common specialties that prescribed FQs in the inpatient setting remained the same (both CF and LF: 'Internal medicine'), and only minor changes between the pre-DUR and post-DUR periods were observed in the FQ prescription rates by the other top-ranked specialties. Notably, 'Pediatrics' ranked second in post-DUR LF inpatient prescriptions despite not being included in top five in pre-DUR. In the outpatient setting, significant changes in the distribution of FQ prescriptions across specialties were observed after DUR. For CF, 'Obstetrics & Gynecology' and 'Surgery' became newly ranked in top five after DUR replacing 'Otolaryngology' and 'Ophthalmology'. Similarly, for LF, 'Urology' and 'Obstetrics & Gynecology' became newly ranked in top five after DUR replacing 'Ophthalmology' and 'Pediatrics'. 10.1371/journal.pone.0176420.t002 Table 2 Five most common medical specialties of physicians prescribing pediatric fluoroquinolone prescriptions. Prescriber specialty, N (%) CF inpatient Rank Pre-DUR (n = 19284) Rank Post-DUR (n = 7553) 1 Internal Medicine: 9446 (49.0) 1 Internal Medicine: 2687 (35.6) 2 Surgery: 2080 (10.8) 2 Otolaryngology: 1252 (16.6) 3 Otolaryngology: 2047 (10.6) 3 Pediatrics: 1180 (15.6) 4 Orthopedics: 1958 (10.2) 4 Orthopedics: 885 (11.7) 5 Pediatrics: 1191 (6.2) 5 Surgery: 624 (8.3) CF outpatient Rank Pre-DUR (n = 263513) Rank Post-DUR (n = 6704) 1 Internal Medicine: 90469 (34.3) 1 Internal Medicine: 3005 (44.8) 2 Otolaryngology: 64643 (24.5) 2 Urology: 678 (10.1) 3 Pediatrics: 30836 (11.7) 3 Obstetrics & Gynecology: 627 (9.4) 4 Ophthalmology: 24350 (9.2) 4 Pediatrics: 524 (7.8) 5 Urology: 12358 (4.7) 5 Surgery: 322 (4.8) LF inpatient Rank Pre-DUR (n = 7435) Rank Post-DUR (n = 2474) 1 Internal Medicine: 2629 (35.4) 1 Internal Medicine: 1024 (41.4) 2 Surgery: 1039 (14.0) 2 Pediatrics: 402 (16.2) 3 Orthopedics: 913 (12.3) 3 Orthopedics: 252 (10.2) 4 Otolaryngology: 849 (11.4) 4 Otolaryngology: 223 (9.0) 5 Urology: 446 (6.0) 5 Surgery: 207 (8.4) LF outpatient Rank Pre-DUR (n = 193955) Rank Post-DUR (n = 4941) 1 Internal Medicine: 57390 (29.6) 1 Internal Medicine: 1575 (31.9) 2 Otolaryngology: 30020 (15.5) 2 Urology: 822 (16.6) 3 Ophthalmology: 28743 (14.8) 3 Obstetrics & Gynecology: 564 (11.4) 4 Pediatrics: 22870 (11.8) 4 Otolaryngology: 356 (7.2) 5 Dermatology: 16611 (8.6) 5 Dermatology: 324 (6.6) Abbreviations: CF, ciprofloxacin; LF, levofloxacin; DUR, drug utilization review Medical facility distribution of FQ prescriptions Significant changes in the distribution of FQ prescriptions by type of medical facility were observed after DUR implementation, ( Fig 3 ; CF: inpatient P < .001, outpatient P < .001; LF: inpatient P < .001, outpatient P < .001). Such changes were more dramatic in the outpatient setting than in the inpatient setting and the changes in the yearly distribution of CF and LF prescriptions in the outpatient settings are shown in Fig 4 . The proportion of FQ prescriptions issued by private clinics declined significantly after DUR, whereas those issued by other medical facilities, hospital, general hospital an tertiary hospital, increased. 10.1371/journal.pone.0176420.g003 Fig 3 Distribution of pediatric fluoroquinolone prescriptions in medical facilities before and after implementation of drug utilization review. (A) distribution of CF prescriptions in medical facilities in inpatient setting, pre- and post-DUR (log scale); (B) distribution of LF prescriptions in medical facilities in inpatient setting, pre- and post-DUR (log scale); (C) distribution of CF prescriptions in medical facilities in outpatient setting, pre- and post-DUR (log scale); (D) distribution of LF prescriptions in medical facilities in outpatient setting, pre- and post-DUR (log scale). 10.1371/journal.pone.0176420.g004 Fig 4 Yearly distribution of pediatric fluoroquinolone prescriptions in medical facilities in outpatient setting. Abbreviations: CF, ciprofloxacin; LF, levofloxacin; DUR, drug utilization review. Characteristics of the study population and number of FQ prescriptions Between 2007 and 2015, a total of 505,859 pediatric patients younger than 18 years received systemic FQs: 297,054 received CF, and 208,805 received LF ( Table 1 ). No significant gender differences were observed between the pre-DUR and post-DUR groups (CF: P = 0.253; LF: P = 0.126); however, a significant increase in the mean age of patients was observed after the implementation of DUR (mean age ± SD; CF: 13.31 ± 4.14 vs. 14.36 ± 3.63 years, P < 0.001; LF: 14.15 ± 3.10 vs. 14.91± 3.31 years, P < 0.001). 10.1371/journal.pone.0176420.t001 Table 1 Demographic characteristics of pediatric patients who received systemic fluoroquinolone treatment. Characteristics (No, %) Ciprofloxacin Levofloxacin Inpatient Outpatient Inpatient Outpatient Pre-DUR Post-DUR Pre-DUR Post-DUR Pre-DUR Post-DUR Pre-DUR Post-DUR (n = 19284) (n = 7553) (n = 263513) (n = 6704) (n = 7435) (n = 2474) (n = 193955) (n = 4941) Age <4 wks 31 (0.2) 21 (0.3) 76 (0.0) 0 (0) 0 (0) 10 (0.4) 35 (0) 1 (0) 4 wks–11 mos 143 (0.7) 168 (2.2) 3890 (1.5) 18 (0.3) 11 (0.1) 35 (1.4) 348 (0.2) 7 (0.1) 1–2 yrs 482 (2.5) 399 (5.3) 7794 (3.0) 36 (0.5) 39 (0.5) 35 (1.4) 1809 (0.9) 35 (0.7) 3–5 yrs 980 (5.1) 616 (8.2) 11816 (4.5) 90 (2.4) 60 (0.8) 51 (2.1) 5121 (2.6) 99 (2.0) 6–11 yrs 2233 (11.6) 771 (10.2) 54743 (20.8) 484 (7.2) 711 (9.6) 174 (7.0) 35015 (18.1) 312 (6.3) 12–17 yrs 15415 (79.9) 5578 (73.9) 185194 (70.3) 6076 (90.6) 6614 (89.0) 2169 (87.7) 151627 (78.2) 4487 (90.8) Gender Male 10663 (55.3) 4278 (56.6) 137684 (52.2) 3131 (46.7) 4531 (60.9) 1400 (56.6) 100554 (51.8) 2398 (48.5) Abbreviations: DUR, drug utilization review; wks, weeks; mos, months; yrs, years. Annual FQ prescription rate The monthly FQ prescription rate decreased significantly after the DUR implementation ( Fig 1 ). The mean annual pre-DUR prescription rate of CF decreased from 840 to 21 per 100,000 person-years (relative reduction: 97.5%) and LF from 598 to 11 per 100,000 person-years (relative reduction: 98.2%). A greater reduction in the FQ prescription rate was observed in the outpatient (CF: from 782 to 10 per 100,000 person-years, 98.7%; LF: from 576 to 7 per 100,000 person-years, 98.8%) than in the inpatient group (CF: from 57 to 11 per 100,000 person-years, 80.7%; LF: from 22 to 4 per 100,000 person-years, 81.8%). Prescription rate of other commonly prescribed antibiotics in children and prescription of FQs in adults remained stable during the study period ( Fig 2 ). 10.1371/journal.pone.0176420.g001 Fig 1 Impact of drug utilization review (DUR) intervention on the monthly fluoroquinolone prescription rates per 100,000 children younger than 18 years old. (A) monthly prescription rate of CF in inpatient setting; (B) monthly prescription rate of LF in inpatient setting; (C) monthly prescription rate of CF in outpatient setting; (D) monthly prescription rate of LF in outpatient setting. Solid lines represent observed values, dashed lines represent predicted values and dotted lines represent 95% confidence intervals of predicted values. Abbreviations: CF, ciprofloxacin; LF, levofloxacin; DUR, drug utilization review. 10.1371/journal.pone.0176420.g002 Fig 2 Prescription of fluoroquinolones and other antibiotics to children and prescription of fluoroquinolone to adults (log scale). Claimed diagnostic codes and specialties of prescribers The top five most common diagnostic codes under which FQ was prescribed in children are shown in S1 Table . The most commonly used diagnostic code in the inpatient group remained unchanged after DUR (CF: certain infectious and parasitic diseases [A00–B99]; LF: diseases of the respiratory system [J00–J99]), and only minor changes occurred in the other top five diagnostic codes. In the outpatient setting, respiratory system diseases (J00-J99) were the most prevalent diagnostic codes associated with prescriptions of both CF and LF in the pre-DUR group. However, after DUR, significant changes in the diagnostic codes were observed with CF most commonly prescribed for certain infectious and parasitic diseases (A00–B99), and LF for diseases of the genitourinary system (N00–N99). Furthermore, we analyzed the specialties of the physicians who prescribed FQ. The top five specialties of physicians who prescribed FQ in children are shown in Table 2 . The most common specialties that prescribed FQs in the inpatient setting remained the same (both CF and LF: 'Internal medicine'), and only minor changes between the pre-DUR and post-DUR periods were observed in the FQ prescription rates by the other top-ranked specialties. Notably, 'Pediatrics' ranked second in post-DUR LF inpatient prescriptions despite not being included in top five in pre-DUR. In the outpatient setting, significant changes in the distribution of FQ prescriptions across specialties were observed after DUR. For CF, 'Obstetrics & Gynecology' and 'Surgery' became newly ranked in top five after DUR replacing 'Otolaryngology' and 'Ophthalmology'. Similarly, for LF, 'Urology' and 'Obstetrics & Gynecology' became newly ranked in top five after DUR replacing 'Ophthalmology' and 'Pediatrics'. 10.1371/journal.pone.0176420.t002 Table 2 Five most common medical specialties of physicians prescribing pediatric fluoroquinolone prescriptions. Prescriber specialty, N (%) CF inpatient Rank Pre-DUR (n = 19284) Rank Post-DUR (n = 7553) 1 Internal Medicine: 9446 (49.0) 1 Internal Medicine: 2687 (35.6) 2 Surgery: 2080 (10.8) 2 Otolaryngology: 1252 (16.6) 3 Otolaryngology: 2047 (10.6) 3 Pediatrics: 1180 (15.6) 4 Orthopedics: 1958 (10.2) 4 Orthopedics: 885 (11.7) 5 Pediatrics: 1191 (6.2) 5 Surgery: 624 (8.3) CF outpatient Rank Pre-DUR (n = 263513) Rank Post-DUR (n = 6704) 1 Internal Medicine: 90469 (34.3) 1 Internal Medicine: 3005 (44.8) 2 Otolaryngology: 64643 (24.5) 2 Urology: 678 (10.1) 3 Pediatrics: 30836 (11.7) 3 Obstetrics & Gynecology: 627 (9.4) 4 Ophthalmology: 24350 (9.2) 4 Pediatrics: 524 (7.8) 5 Urology: 12358 (4.7) 5 Surgery: 322 (4.8) LF inpatient Rank Pre-DUR (n = 7435) Rank Post-DUR (n = 2474) 1 Internal Medicine: 2629 (35.4) 1 Internal Medicine: 1024 (41.4) 2 Surgery: 1039 (14.0) 2 Pediatrics: 402 (16.2) 3 Orthopedics: 913 (12.3) 3 Orthopedics: 252 (10.2) 4 Otolaryngology: 849 (11.4) 4 Otolaryngology: 223 (9.0) 5 Urology: 446 (6.0) 5 Surgery: 207 (8.4) LF outpatient Rank Pre-DUR (n = 193955) Rank Post-DUR (n = 4941) 1 Internal Medicine: 57390 (29.6) 1 Internal Medicine: 1575 (31.9) 2 Otolaryngology: 30020 (15.5) 2 Urology: 822 (16.6) 3 Ophthalmology: 28743 (14.8) 3 Obstetrics & Gynecology: 564 (11.4) 4 Pediatrics: 22870 (11.8) 4 Otolaryngology: 356 (7.2) 5 Dermatology: 16611 (8.6) 5 Dermatology: 324 (6.6) Abbreviations: CF, ciprofloxacin; LF, levofloxacin; DUR, drug utilization review Medical facility distribution of FQ prescriptions Significant changes in the distribution of FQ prescriptions by type of medical facility were observed after DUR implementation, ( Fig 3 ; CF: inpatient P < .001, outpatient P < .001; LF: inpatient P < .001, outpatient P < .001). Such changes were more dramatic in the outpatient setting than in the inpatient setting and the changes in the yearly distribution of CF and LF prescriptions in the outpatient settings are shown in Fig 4 . The proportion of FQ prescriptions issued by private clinics declined significantly after DUR, whereas those issued by other medical facilities, hospital, general hospital an tertiary hospital, increased. 10.1371/journal.pone.0176420.g003 Fig 3 Distribution of pediatric fluoroquinolone prescriptions in medical facilities before and after implementation of drug utilization review. (A) distribution of CF prescriptions in medical facilities in inpatient setting, pre- and post-DUR (log scale); (B) distribution of LF prescriptions in medical facilities in inpatient setting, pre- and post-DUR (log scale); (C) distribution of CF prescriptions in medical facilities in outpatient setting, pre- and post-DUR (log scale); (D) distribution of LF prescriptions in medical facilities in outpatient setting, pre- and post-DUR (log scale). 10.1371/journal.pone.0176420.g004 Fig 4 Yearly distribution of pediatric fluoroquinolone prescriptions in medical facilities in outpatient setting. Abbreviations: CF, ciprofloxacin; LF, levofloxacin; DUR, drug utilization review. Discussion Our study is first to assess the national off-label prescription of FQ in children, as no approved indications exist for FQ in South Korea. Prescription volume of FQ in all healthcare settings was observed over 9 years using a large-scale national database. Fluoroquinolone use declined substantially and immediately after the implementation of age restriction under DUR. The effect has been sustained for six years since implementation. The nationwide incidence of FQ off-label prescription in children declined from 0.840% to 0.021% for CF and from 0.598% to 0.011% for LF after the regulatory action. A study conducted in British Columbia, Canada showed an incidence ranging between 0.06% and 0.09%, which is closer to the incidence after DUR implementation in South Korea [ 9 ]. Due to the lack of nationwide studies in other countries, direct comparisons are not possible. However, the pediatric FQ use in South Korea can be thought to be high as there are no approved indications in South Korea. The incidence of FQ prescription in the ambulatory setting was found to be higher than in the inpatient setting before the regulatory action, and a greater reduction occurred in the ambulatory setting than in the inpatient setting. The pattern of the diagnostic codes associated with FQ prescription changed markedly after DUR implementation, especially in the outpatient setting. Before the implementation of DUR, 'Diseases of the respiratory system (J00–J99)' were the most commonly used diagnostic codes for both CF and LF outpatient prescriptions. However, after DUR implementation, 'Certain infectious and parasitic diseases (A00–B99)' and 'Diseases of the genitourinary system (N00–N99)' were the most commonly used diagnostic codes for CF and LF, respectively. In regards to medical specialties, 'Internal medicine' remained to be the most common medical specialty of physicians who prescribed FQs to children in both inpatient and outpatient settings for both CF and LF after DUR implementation. Prescribers with internal medicine as specialty are considered primary care physicians in Korea and internal medicine is a common specialty visited by patients of all ages [ 38 ]. The distribution of medical facilities at which FQs were prescribed also shifted significantly. After DUR implementation, the proportion of FQ prescriptions issued in clinics and primary care settings declined significantly; however, the proportion of prescriptions issued by referral hospitals increased, and such change was more dramatic in the ambulatory outpatient settings. The high volume of FQ prescriptions in primary care setting before DUR implementation is especially alarming, as unnecessary prescription of antibiotics frequently occur in an ambulatory setting [ 39 , 40 ]. Additionally, current recommendations for pediatric FQ use are restricted to situations were no safe and effective alternative is available and the infection is caused by multidrug-resistant pathogens likely requiring inpatient treatment. Therefore, the shift in FQ prescription from primary care settings to referral hospitals, especially in the outpatient setting, is promising. The volume of prescriptions of other antibiotics for pediatric patients, as well as that of FQ to adults, was stable during the study period from 2009 to 2015, confirming that no other factors such as drug shortages or overall changes in pediatric antibiotic prescription are attributable to such significant reduction in FQ prescription volume in children. Educational strategies, community-wide campaigns, and outpatient antimicrobial stewardship interventions often fail to exert a statistically significant and sustained effect on the issuance of antibiotic prescriptions [ 41 – 45 ]. Antimicrobial stewardship interventions by hospitals are commonly implemented to control for inappropriate use of antibiotics. However, in ambulatory settings, especially those involving primary care, these interventions or policies are rarely applied, which may be a reason behind the excessive antibiotic use in these settings. FQs have been suggested as the drugs of choice in treating complicated infections caused by drug-resistant pathogens in children [ 14 , 15 ]. However, on the other hand, the inappropriate prescription of antibiotics is the main factor driving the emergence and spread of antibiotic resistance, and increasing FQ resistance is also of concern in pediatric populations [ 16 , 46 – 50 ]. Therefore, it is important to promote judicious prescribing of FQ in children, only in situations where its use is required. The DUR system implemented in South Korea can contribute to such movement by encouraging reassessment of selecting FQ for use in pediatric patients. The outcomes of the intervention under DUR program are not only positive in terms of reducing resistance but also limiting potential toxicity in pediatrics. Fluoroquinolones were initially restricted for use in children due to potential for cartilage toxicity. Recently, US FDA issued a FDA Drug Safety Communication recommending restriction of fluoroquinolones in adults due to side effects involving the tendons, muscles and joints [ 51 ]. Thus, it may be necessary to limit fluoroquinolones to absolutely needed conditions in both adults and children. Regulatory interventions, like DUR, may be required in other countries to effectively and sustainably restrict use of fluoroquinolone antibiotics. Additionally, it may be valuable to assess the impact of other public health interventions, such as the recent issue of the US FDA Drug Safety Communication [ 51 ], although, to the best of our knowledge, the interventions implemented in other systems are likely to be much less invasive the intervention under Korean DUR system. Our results should be interpreted with caution. Claims data on individual-level do not contain information such as exact diagnosis, isolated pathogens, or antimicrobial susceptibility. Although diagnostic codes were collected for all prescribing events, the question of whether the changes in pediatric FQ prescription patterns align with the recommendations in the literature or with its approval status in other countries cannot be answered. Thus, we were unable to assess the appropriateness of any particular FQ prescription; therefore, it was not possible to determine whether most of the eliminated prescriptions were inappropriate. Also, domestic and international antimicrobial stewardship initiatives conducted during our study period may have influenced the results of the study and confounding factor from unmeasurable variables could not be excluded. Although we attempted to exclude the possible effect of drug shortages and overall changes in pediatric antibiotic prescription patterns by analyzing the prescription volume of five commonly prescribed antibiotics, it was not possible to determine which antibiotics had been used in place of FQ. Despite such limitations, it is evident that FQ use in children decreased in South Korea after DUR implementation and further studies on how the regulatory action influenced antibiotic prescribing and clinical outcomes are required. This study is first to analyze the nationwide pediatric prescription of FQ. Age restriction under the DUR system resulted in an immediate, dramatic decline in FQ prescription and which effect was sustained afterwards. Regulatory action via the national DUR system appears to be especially effective in the ambulatory setting, promoting more judicious use of FQ as part of antimicrobial stewardship on a national level. Therefore, the potential use of similar regulatory intervention to control inappropriate and excessive use of certain medications in other countries, states or institutions appear promising. Supporting information S1 Table Five most commonly used diagnostic codes of pediatric fluoroquinolone prescriptions. (PDF) Click here for additional data file.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4776447/

Occurrence and genetic characterisation of Acanthamoeba spp. from environmental and domestic water sources in Queen Elizabeth Protected Area, Uganda

Background Acanthamoeba is an emerging potentially pathogenic amoeba that has been receiving increasing attention worldwide as a reservoir and potential vector for the transmission of pathogenic bacteria. It is also associated with brain cell damage, keratitis and skin irritation in humans. Its effects are more severe in immunocompromised individuals. This study provides for the first time in Uganda, information on the prevalence and genotypes of Acanthamoeba in environmental and domestic (tap) water. Methods A total of 324 environmental and 84 tap water samples were collected between November 2013 and September 2014. The samples were centrifuged, cultured (Non-Nutrient agar seeded with gram-negative bacteria) and observed under a microscope. After confirmation of Acanthamoeba , genomic DNA was extracted for PCR assays by chemical lysis and purification with phenol/chloroform/isoamyl alcohol. Samples that showed the strongest positive bands (400–600 bp) were subjected to cycle sequencing. Results Among environmental and tap water samples, 107 (33 %) and 36 (42.9 %) tested positive for Acanthamoeba spp., respectively. Prevalence of Acanthamoeba from specific environmental locations was as follows; Kazinga channel banks (60.7 %), Fish landing sites (50 %), River Kyambura (39.6 %) and Kazinga mid channel (5.3 %). There was a significant difference ( p = 0.001) in the prevalence of Acanthamoeba between sampling sites. The mean (Mean ± SE) occurrence of the organism was higher in Kazinga channel banks (3.44 ± 0.49) and Fish landing sites (3.08 ± 0.53). Correlation between in situ parameters and Acanthamoeba was insignificant except for the Dissolved Oxygen (mg/ML) which was negatively correlated ( r = −0.231, p = 0.001) to Acanthamoeba. Six distinct partial Acanthamoeba T-genotype groups T1, T2, T4, T5, T6 and T11 were obtained. Ultimately, Acanthamoeba spp., Acanthamoeba hatchetti and Acanthamoeba polyphaga were isolated in the current study. Conclusions There was a high prevalence of Acanthamoeba in communal piped tap and environmental water used by communities, indicating poor environmental and domestic water quality. Background Acanthamoeba is an emerging potentially pathogenic amoeba that has been receiving increasing attention worldwide as a reservoir and potential vector for the transmission of pathogenic bacteria. It is also associated with brain cell damage, keratitis and skin irritation in humans. Its effects are more severe in immunocompromised individuals. This study provides for the first time in Uganda, information on the prevalence and genotypes of Acanthamoeba in environmental and domestic (tap) water. Methods A total of 324 environmental and 84 tap water samples were collected between November 2013 and September 2014. The samples were centrifuged, cultured (Non-Nutrient agar seeded with gram-negative bacteria) and observed under a microscope. After confirmation of Acanthamoeba , genomic DNA was extracted for PCR assays by chemical lysis and purification with phenol/chloroform/isoamyl alcohol. Samples that showed the strongest positive bands (400–600 bp) were subjected to cycle sequencing. Results Among environmental and tap water samples, 107 (33 %) and 36 (42.9 %) tested positive for Acanthamoeba spp., respectively. Prevalence of Acanthamoeba from specific environmental locations was as follows; Kazinga channel banks (60.7 %), Fish landing sites (50 %), River Kyambura (39.6 %) and Kazinga mid channel (5.3 %). There was a significant difference ( p = 0.001) in the prevalence of Acanthamoeba between sampling sites. The mean (Mean ± SE) occurrence of the organism was higher in Kazinga channel banks (3.44 ± 0.49) and Fish landing sites (3.08 ± 0.53). Correlation between in situ parameters and Acanthamoeba was insignificant except for the Dissolved Oxygen (mg/ML) which was negatively correlated ( r = −0.231, p = 0.001) to Acanthamoeba. Six distinct partial Acanthamoeba T-genotype groups T1, T2, T4, T5, T6 and T11 were obtained. Ultimately, Acanthamoeba spp., Acanthamoeba hatchetti and Acanthamoeba polyphaga were isolated in the current study. Conclusions There was a high prevalence of Acanthamoeba in communal piped tap and environmental water used by communities, indicating poor environmental and domestic water quality. Background Rural communities in and around Queen Elizabeth Protected Area (QEPA) are directly or indirectly dependent on environmental sources of water (fresh water lakes, rivers, streams, water holes, and gravity water) for all their water needs including; drinking, washing, bathing, recreation and agriculture. A significant portion of these communities using environmental or piped tap water sources could be exposed to the risk of contracting waterborne diseases. Waterborne diseases such as cholera, campylobacteriosis, shigellosis, salmonellosis and typhoid among others, are known to affect proportions of rural communities [ 1 , 2 ]. Several other waterborne diseases are not often mentioned and yet they might have potential pathogenic effects. Disease effects associated with free-living amoeba (FLA) in humans and animals in Uganda often go undetected because little is known about their presence and distribution in certain environments. Water and soil-dwelling amoebae are widespread in nature and have been isolated from a variety of engineered water systems, aquatic and terrestrial environments [ 3 – 5 ]. Some FLA of the genera Acanthamoeba , Balamuthia , Naegleria and Hartmannella occasionally invade hosts and cause infections [ 3 , 6 ]. Acanthamoeba is both opportunistic and pathogenic with two stages in the life-cycle, an active trophozoite that exhibits vegetative growth and a dormant cyst stage with minimal metabolic activity [ 3 , 7 ]. Acanthamoeba renders possible intracellular multiplication of Bacillus anthracis , Legionella pneumophila , Vibrio cholerae and Mycobacterium tuberculosis which are responsible for anthrax, legionellosis, cholera and tuberculosis respectively [ 7 – 9 ]. Certain Acanthamoebae spp. are also causative agents of granulomatous amoebic encephalitis (GAE), a fatal disease of the CNS, amoebic keratitis (AK), a painful sight-threatening disease of the eyes [ 8 , 9 ] and have also been associated with cutaneous lesions with sinusitis in HIV/AIDS patients and other immunocompromised individuals [ 8 , 10 ]. Although Acanthamoeba spp. are causative agents of various diseases and carriers of pathogenic bacteria, little is known about their occurrence in Uganda. We, therefore, report for the first time in Uganda the occurrence and genotypic classes of Acanthamoeba . Methods Study area The study was conducted in the Queen Elizabeth Protected Area (QEPA) that spans the districts of Rubirizi, Kasese, Rukungiri and Kamwenge in Uganda. The QEPA is a 1,978 sq. km with coordinates 00 12S, 30 00E (Latitude: 0.2000; Longitude: 30.00 C00). The vegetation cover is savannah grassland mixed with forest, woodland and wetland ecosystem. The protected area harbours Lake George and Edward that are joined by a 40 km long Kazinga channel. Within the protected area are 11 fishing enclaves, with a population of mostly fishermen and pastoral communities. Ethics This study does not require ethical approval. Sample collection, storage and transportation The locations for sample collection were purposively selected based on certain landmarks such as nearness to burial sites/mass graves of hippos that died of anthrax (water sources adjacent to the graves) and nearness to the fishing villages where communities fetch water for domestic use. The water sources included environmental water and communal piped tap water. Environmental water sites were derived as collection points on (1) River Kyambura (R. Kyambura), (2) Kazinga channel bank (KCB), (3) Fish landing site (FLS) and (4) Kazinga mid channel (KMC). The fifth site (communal piped tap water system) is fed by water from the environment (Kazinga channel and River Kyambura) after it is treated. Important in situ water parameters including; dissolved oxygen (mg/l), surface water temperature (°C), electrical conductivity (μS/m), pH, total dissolved solids (g/l) and oxidation reduction potential (mV) were determined on-site using a Multi-parameter water sensor (Greenspan, USA). Four hundred and eight water samples were collected using 50 ml sterile polypropylene falcon tubes (Discovery Labware, USA). A total number of 408 (324 environmental and 84 tap) water samples were collected. The samples were stored at room temperature and transported to the Makerere University Molecular Biology Laboratory (MOBILA) within 48 h for culturing and isolation of Acanthamoeba. Laboratory analysis This was done by culturing the collected water samples for Acanthamoeba spp. and examining for the presence of Acanthamoeba trophozoites under the microscope, followed by DNA extraction, DNA amplification and sequencing. Amoeba cultivation (Non – Nutrient agar seeded with gram-negative bacteria) The NN-EI non-nutritive medium (Page Amoeba Saline solution-2.5 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4 , 0.5 mM Na 2 HPO 4 , 40 mM CaCl 2 , and 20 mM MgSO 4 ) seeded with 0.1 ml of a heat inactivated 48-h culture of Escherichia coli BL21 was prepared and the final pH of the solution adjusted to 6.9. Water in the 50 ml tubes was centrifuged at 1000 × g for 15 min and the supernatant poured off to expose the pellet which was spread on the already prepared agar plates. The plates were incubated at 30–32 °C overnight. After one day, the plates were wrapped in polyethene bags and incubated upside down at 30–32 °C up to 7 days. After 3 days of incubation, the plates were monitored for detection of Acanthamoeba trophozoites microscopically daily until the 7 th day. The number of Acanthamoeba trophozoites were counted using haemocytometer (MicrobeHunter, Germany) and recorded. Identification of Acanthamoeba at genus level In order to determine the genus of the protozoa, movement and structural properties of amoebae were examined. Distinguishing features of the Acanthamoeba trophozoites were the presence of spiny or fingerlike surface projections called acanthopodia , a prominent contractile vacuole in the cytoplasm and vesicular nucleus with large central nucleolus [ 11 ]. Molecular identification of the isolates and phylogenetic analysis Reference strains The reference amoeba strain used in this study was the Amplirun® Acanthamoeba castellanii DNA Control, MBC054, and was the positive control for in vitro diagnosis techniques based on nucleic acids amplification (Labconsult, Bruxelles-Brussels, Belgium). Polymerase chain reaction (PCR) amplification assay for acanthamoebae After identifying amoebae from the water samples, genomic DNA was extracted for PCR analysis by chemical lysis and purification of DNA with phenol/chloroform/isoamyl alcohol extraction method [ 12 ]. Five hundred microliters of STE buffer (0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Trischloride, PH 8, 1 % SDS) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml) was added directly to each sample in an Eppendorf tube. The samples were incubated at 56 °C for one hour and then cooled before phenol extraction. An equal volume of phenol-chloroform (521 μl) was added to each sample, mixed by vortexing and centrifuged at 13,200 rpm for 10 min. The aqueous layer was recovered and transferred to a new Eppendorf tube. This step was repeated to make two phenol-chloroform extractions. The aqueous layer from each tube was subjected to another chloroform extraction, recovered by centrifugation and transferred to a new Eppendorf tube after which 1000 μl of absolute alcohol (96–100 %) was added. The samples were then put in a freezer at −80 °C for precipitation overnight. The next day, samples were removed from the freezer and centrifuged at 13,200 rpm for 30 min. After 30 min the absolute alcohol was poured off. The pellet in each tube was then washed with 1000 μl of 70 % alcohol, centrifuged at 13,200 rpm for 15 min and alcohol poured off to expose the pellet. Finally, the pellet was air dried and dissolved in 50 μl of TE buffer. Amplification of the partial 18S ribosomal RNA (18S rRNA) gene from Acanthamoeba was performed using primers previously shown to be specific for Acanthamoeba spp. [ 13 , 14 ]. The primer pairs were: forward primer JDP1 (5'GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3') and reverse primer JDP2 (5'TCTCACAAGCTGCTAGGGAGTCA-3'). Amplification reactions were performed using a DreamTaq PCR kit (Thermoscientific DreamTaq, USA). We used a 25 μl reaction volume containing 12.5 μl DreamTaq Green PCR Master Mix (2X), 0.5 μM forward primer, 0.5 μM reverse primer, 9 μl nuclease free water and 2.5 μl DNA template (50 pg concentration). The PCR was done under the following conditions: Initial denaturation at 94 °C for 3 min then 35 cycles with denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 55 °C for 30 s, extension at 72 °C for 30 s and final extension at 72 °C for 5 min. A sample of 5 μl of each PCR reaction was screened for successful amplification on a 2.5 % (W/V) agarose gel stained with ethidium bromide and run against 1kbp DNA ladder (Finnzymes, Finland). Electrophoresis was performed at 100 V of current and buffer used was 1X TAE containing 0.5 μg/ml of ethidium bromide. Once enough electrophoretic separation was obtained, the agarose gel was visualised using a UV gel documentation system (Wagtec, UK). The gel images were captured and a soft copy stored. Nucleic acid sequencing and analysis Samples that showed the strongest positive bands (400–600 bp) were extracted from the gel and the DNA was purified using QIAquick gel extraction kit (Qiagen Inc. Sample and Assay Technologies, Netherlands). The 18S rDNA segment from each of the Acanthamoeba isolates was subjected to cycle sequencing by the dideoxynucleotide chain termination method using the Dyenamic Terminator Cycle sequencing kit with JDP as sequencing primer [ 14 ]. The sequencing included 2 μl of PCR product, 5ХBigDye Buffer, and 2pmol primer. Sequencing was done in 30 cycles with step 1 at 94 °C for 30 s, step 2 at 55 °C for 15 s and step 3 at 65 °C for 4 min. The sequence files were checked for quality and base trimming carried using the Seqbuilder software (Dnastar, USA). For each of the nucleotide query sequences, a search for homologues in the NCBI database was carried out using the blastn tool. Homologues with query coverage > 80 %, identity > 70 % and low E values ( 80 %, identity > 70 % and low E values ( 80 %, identity > 70 % and low E values (<0) were considered. The molecular phylogenetic analysis was then carried out using the Maximum Likelihood Method in MEGA6 [ 15 ]. Statistical analysis Data was analysed using IBM SPSS version 22. Numerical variables were summarised using mean and standard error of the mean (SEM). Univariate analysis to compare the prevalence of Acanthamoeba across sampling sites was done using cross-tabulation with a Chi-square or Fisher's exact test. Variables with a p -value of ≤ 0.05 were taken to be significant. Correlation analysis between environmental variables and Acanthamoeba presence was done using Pearson correlation coefficient (r), a p -value of ≤ 0.05 was considered statistically significant. Results Prevalence of Acanthamoeba per water site source Acanthamoeba prevalence in environmental and tap water samples was 33 % and 42.9 % respectively (Table 1 ). The prevalence in various environmental sites where samples were collected was as follows: River Kyambura (39.6 %), KCB (60.7 %), FLS (50 %) and KMC (5.3 %) (Table 2 ). The results show that the number of organisms isolated was significantly ( p = 0.001) influenced by the sampling site. Table 1 Prevalence of Acanthamoeba by water source Acanthamoeba Source Number of samples Number positive Prevalence (%) Tap Water 84 36 42.9 Environmental Water 324 107 33 Total 408 143 65 Table 2 Presents prevalence, means and in situ parameters per sampling site Acanthamoeba In situ parameters DO(mg/l) Temp(°C) Cond(μS/m) pH TDS(g/l) ORP(mV) Site No. +ve Prev (%) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) R. Kyambura 48 19 39.6 2.23 ± 0.53 4.03 ± 0.16 21.43 ± 0.15 150.98 ± 3.02 7.99 ± 0.11 113.12 ± 6.42 −541.9 ± 52.99 Kazinga channel bank 84 51 60.7 3.44 ± 0.49 1.74 ± 0.15 25.63 ± 0.24 273.71 ± 9.27 9.31 ± 0.04 182.76 ± 4.87 −467.8 ± 29.30 Fish landing sites 60 30 50 3.08 ± 0.53 1.84 ± 0.21 26.22 ± 0.34 280.99 ± 10.36 8.91 ± 0.12 183.38 ± 6.84 −412.5 ± 33.97 Kazinga mid channel 132 7 5.3 0.17 ± 0.08 4.57 ± 0.26 25.76 ± 0.20 261.75 ± 6.78 9.18 ± 0.07 163.09 ± 4.04 −454.2 ± 25.09 Tap water 84 36 42.9 2.26 ± 0.4 4.08 ± 0.27 26.89 ± 0.36 163.26 ± 111.69 7.73 ± 0.10 108.94 ± 7.50 −322.8 ± 23.25 The means (Mean ± SEM) of the organism in water across sites were as follows from highest to lowest; KCB (3.44 ± 0.49), FLS (3.08 ± 0.5), Tap water (2.26 ± 0.4), R. Kyambura (2.23 ± 0.53) and KMC (0.17 ± 0.08). The highest Acanthamoeba prevalence and means (KCB and FLS) were associated with lower DO (mg/l), higher, Temperature (°C), conductance (μS/m) and TDS (g/l) (Table 2 ). Correlation of Acanthamoeba presence and in situ parameters Dissolved oxygen (DO) was negatively correlated ( r = −0.231 ** ) with Acanthamoeba spp. There was a weak negative correlation ( r = −0.051) between water temperature and Acanthamoeba spp. The other parameters (Conductance, pH, TDS and ORP) were positively correlated to the Acanthamoeba spp. (Table 3 ). Table 3 Correlation coefficient ( r ) between environmental variables and Acanthamoeba presence In situ parameter Correlation coefficient ( r ) Significance DO (mg/ML) −.231 ** 0.001 Temp (°C) −.051 0.3 Cond (μS/m) .090 0.07 pH 0.5 0.31 TDS(g/L) 0.09 0.09 ORP(mV) 0.2 0.059 **very significant Molecular identification of the isolates and phylogenetic analysis Amplicon sizes between 400 and 600 bp were observed (Fig. 1 ). Six distinct partial Acanthamoeba sequences belonging to the group of sequence types, T1, T2, T4, T5, T6 and T11 were obtained. The sequences were 98–99 % similar; with only two identical to already known Acanthamoeba sequences. Four sequences were not identical to known Acanthamoeba in NCBI. Ultimately, Acanthamoeba spp., Acanthamoeba hatchetti , and Acanthamoeba polyphaga were among the identified, following comparison with the GenBank results from NCBI (Table 4 ). Fig. 1 Agarose electrophoresis (2.5 %) showing amplification of JDP-PCR of Acanthamoeba . Lane M = DNA Ladder (100 bp), Lane A = Positive control, Lane N = Negative control, Lanes 1, 3, 5 & 6 = Acanthamoeba positive PCR product from obtained water samples Table 4 Acanthamoeba T-genotype groups isolated in this study and associated diseases T-genotype Species Name Associated human disease T1 Acanthamoeba spp. a Encephalitis [ 8 , 9 ] T2 Acanthamoeba spp. a , A. palestinensis, A. pustulosa Keratitis and sinusitis [ 8 , 10 ] T3 A. griffini, A. pearcei, Acanthamoeba spp. a , Keratitis [ 8 ] T4 A. castellanii, A. polyphaga a , A. lugdunensis , A. rhysodes , A. divionensis , A. mauritaniensis Keratitis [ 8 , 18 ] T5 Acanthamoeba spp a , A. lenticulata Keratitis [ 8 ] T6 Acanthamoeba hatchetti a , A. palestinensis Keratitis [ 8 ] T7 A. astronyxis Unknown T8 A. tubiashi Unknown T9 A. healyi Unknown T10 A. culbertsoni Keratitis and encephalitis [ 8 , 9 ] T11 Acanthamoeba hatchetti a , A. stevensoni , A.quina Keratitis and encephalitis [ 9 ] T12 A. healyi Encephalitis [ 8 , 9 ] T13 Acanthamoeba spp. Unknown T14 Acanthamoeba spp. Unknown T15 A. jacobsi Keratitis [ 8 ] T16 Acanthamoeba spp. Unknown T17 Acanthamoeba spp. Unknown T18 Acanthamoeba spp. Unknown a Isolated in the present study Prevalence of Acanthamoeba per water site source Acanthamoeba prevalence in environmental and tap water samples was 33 % and 42.9 % respectively (Table 1 ). The prevalence in various environmental sites where samples were collected was as follows: River Kyambura (39.6 %), KCB (60.7 %), FLS (50 %) and KMC (5.3 %) (Table 2 ). The results show that the number of organisms isolated was significantly ( p = 0.001) influenced by the sampling site. Table 1 Prevalence of Acanthamoeba by water source Acanthamoeba Source Number of samples Number positive Prevalence (%) Tap Water 84 36 42.9 Environmental Water 324 107 33 Total 408 143 65 Table 2 Presents prevalence, means and in situ parameters per sampling site Acanthamoeba In situ parameters DO(mg/l) Temp(°C) Cond(μS/m) pH TDS(g/l) ORP(mV) Site No. +ve Prev (%) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) Mean(±SE) R. Kyambura 48 19 39.6 2.23 ± 0.53 4.03 ± 0.16 21.43 ± 0.15 150.98 ± 3.02 7.99 ± 0.11 113.12 ± 6.42 −541.9 ± 52.99 Kazinga channel bank 84 51 60.7 3.44 ± 0.49 1.74 ± 0.15 25.63 ± 0.24 273.71 ± 9.27 9.31 ± 0.04 182.76 ± 4.87 −467.8 ± 29.30 Fish landing sites 60 30 50 3.08 ± 0.53 1.84 ± 0.21 26.22 ± 0.34 280.99 ± 10.36 8.91 ± 0.12 183.38 ± 6.84 −412.5 ± 33.97 Kazinga mid channel 132 7 5.3 0.17 ± 0.08 4.57 ± 0.26 25.76 ± 0.20 261.75 ± 6.78 9.18 ± 0.07 163.09 ± 4.04 −454.2 ± 25.09 Tap water 84 36 42.9 2.26 ± 0.4 4.08 ± 0.27 26.89 ± 0.36 163.26 ± 111.69 7.73 ± 0.10 108.94 ± 7.50 −322.8 ± 23.25 The means (Mean ± SEM) of the organism in water across sites were as follows from highest to lowest; KCB (3.44 ± 0.49), FLS (3.08 ± 0.5), Tap water (2.26 ± 0.4), R. Kyambura (2.23 ± 0.53) and KMC (0.17 ± 0.08). The highest Acanthamoeba prevalence and means (KCB and FLS) were associated with lower DO (mg/l), higher, Temperature (°C), conductance (μS/m) and TDS (g/l) (Table 2 ). Correlation of Acanthamoeba presence and in situ parameters Dissolved oxygen (DO) was negatively correlated ( r = −0.231 ** ) with Acanthamoeba spp. There was a weak negative correlation ( r = −0.051) between water temperature and Acanthamoeba spp. The other parameters (Conductance, pH, TDS and ORP) were positively correlated to the Acanthamoeba spp. (Table 3 ). Table 3 Correlation coefficient ( r ) between environmental variables and Acanthamoeba presence In situ parameter Correlation coefficient ( r ) Significance DO (mg/ML) −.231 ** 0.001 Temp (°C) −.051 0.3 Cond (μS/m) .090 0.07 pH 0.5 0.31 TDS(g/L) 0.09 0.09 ORP(mV) 0.2 0.059 **very significant Molecular identification of the isolates and phylogenetic analysis Amplicon sizes between 400 and 600 bp were observed (Fig. 1 ). Six distinct partial Acanthamoeba sequences belonging to the group of sequence types, T1, T2, T4, T5, T6 and T11 were obtained. The sequences were 98–99 % similar; with only two identical to already known Acanthamoeba sequences. Four sequences were not identical to known Acanthamoeba in NCBI. Ultimately, Acanthamoeba spp., Acanthamoeba hatchetti , and Acanthamoeba polyphaga were among the identified, following comparison with the GenBank results from NCBI (Table 4 ). Fig. 1 Agarose electrophoresis (2.5 %) showing amplification of JDP-PCR of Acanthamoeba . Lane M = DNA Ladder (100 bp), Lane A = Positive control, Lane N = Negative control, Lanes 1, 3, 5 & 6 = Acanthamoeba positive PCR product from obtained water samples Table 4 Acanthamoeba T-genotype groups isolated in this study and associated diseases T-genotype Species Name Associated human disease T1 Acanthamoeba spp. a Encephalitis [ 8 , 9 ] T2 Acanthamoeba spp. a , A. palestinensis, A. pustulosa Keratitis and sinusitis [ 8 , 10 ] T3 A. griffini, A. pearcei, Acanthamoeba spp. a , Keratitis [ 8 ] T4 A. castellanii, A. polyphaga a , A. lugdunensis , A. rhysodes , A. divionensis , A. mauritaniensis Keratitis [ 8 , 18 ] T5 Acanthamoeba spp a , A. lenticulata Keratitis [ 8 ] T6 Acanthamoeba hatchetti a , A. palestinensis Keratitis [ 8 ] T7 A. astronyxis Unknown T8 A. tubiashi Unknown T9 A. healyi Unknown T10 A. culbertsoni Keratitis and encephalitis [ 8 , 9 ] T11 Acanthamoeba hatchetti a , A. stevensoni , A.quina Keratitis and encephalitis [ 9 ] T12 A. healyi Encephalitis [ 8 , 9 ] T13 Acanthamoeba spp. Unknown T14 Acanthamoeba spp. Unknown T15 A. jacobsi Keratitis [ 8 ] T16 Acanthamoeba spp. Unknown T17 Acanthamoeba spp. Unknown T18 Acanthamoeba spp. Unknown a Isolated in the present study Discussion Over the past decade, Acanthamoeba has been the most studied FLA due to its ability to cause and exacerbate disease in humans and animal [ 3 ]. Disease effects associated with Acanthamoeba often go undetected in Uganda because very little is known about their existence and pathogenic effects, as most communities are completely oblivious of the diseases they might encounter by using contaminated water for cooking, drinking, washing or bathing. The most commonly diagnosed waterborne diseases in Uganda are cholera, campylobacteriosis, shigellosis, salmonellosis and typhoid [ 16 ]. Waterborne protozoan parasites Cryptosporidium and Giardia have also been reported but mostly in wild and domestic animals [ 17 ], with very scanty literature available on household water systems. There is no information on diseases caused by amoebae in Uganda and yet FLA of the genus Acanthamoeba if present in lethal threshold concentration are highly pathogenic. Acanthamoeba has mostly been associated with granulomatous amoebic encephalitis (GAE), amoebic keratitis (AK), cutaneous lesions and sinusitis in humans [ 8 – 10 ]. Eight species of Acanthamoeba ( A. castellanii, A. polyphaga, A. culbertsoni, A. hatchetti, A. rhysodes, A. lugdunensis, A. quina and A. griffini ) have been previously documented by researchers as aetiologic agents in Acanthamoeba keratitis [ 18 ] which is common in individuals using dirty contact lenses as well as those washing and bathing with contaminated water [ 3 ]. The effects of Acanthamoeba infection has been found to be more severe in HIV/AIDS patients and other immunocompromised individuals [ 8 , 9 ]. The present study investigated the prevalence and molecular genotyping of Acanthamoeba in environmental water bodies and communal piped tap water systems in Queen Elizabeth Protected Area, Western Uganda. Acanthamoeba prevalence in environmental water was 33 % and in tap water 42.9 %. The low prevalence in environmental samples could be due to a larger number of samples (324) compared to the smaller number of tap water samples (84) collected. The higher prevalence in tap water could also be due to the formation of bacterial biofilms along the water pipes and tap outlet that attracts more predatory Acanthamoeba spp. Acanthamoeba and bacteria are constantly involved in a predator-prey relationship, with Acanthamoeba engulfing and feeding on numerous bacterial colonies [ 3 , 9 , 19 ]. These findings are in agreement with previous studies that detected 51 % and 34 % prevalence in household tap water, all higher than the prevalence in environmental water [ 20 , 21 ]. Previous studies have also indicated that the prevalence of Acanthamoeba in environmental and domestic water can vary from as low as 1 % to as high as 79 % [ 12 , 19 , 22 – 25 ], all depending on sample size and site. Taking into consideration the prevalence from a specific environmental sample sources (R. Kyambura (39.6 %), KCB (60.7 %), FLS (50 %) and KMC (5.3 %), it is evident that water from the mid-channel had the least prevalence of the organisms; probably because this water was clearer and less contaminated with organic matter compared to that from other sites. The present study reports high microbial loads of Acanthamoeba at KCB (3.44 ± 0.49) and R. Kyambura (3.08 ± 0.53). These same sampling areas were associated with lower levels of DO (mg/l), elevated Temperature (°C) and conductance (μS/m) and TDS (g/l) (Table 2 ) compared to other sites. We report a significant correlation of Acanthamoeba with mean dissolved oxygen ( r = -.231 ** ) and temperature ( r = -.051). The high prevalence and mean of the organisms at the banks and FLS could be due to contamination of the water by formation of more organic matter from rotting leaves, household refuse and faecal matter dumped by communities living nearby. This increases the build-up of bacteria, consequently increasing the number of Acanthamoeba spp. and other amoebae. This concurs with previous findings, that there are more amoebae when there is a build-up of more organic matter in soil and water because the organic fraction contains organic molecules needed for microbial development [ 26 – 28 ]. Acanthamoeba spp. are common pathogenic FLA whose distribution is variable and often but not always influenced by physico-chemical parameters [ 29 ]. Acanthamoeba spp. have been found to be more prevalent in contaminated, bacteria-rich water [ 29 ] irrespective of the physico-chemical parameters of the water. However, very high and very low temperature, as well as dissolved oxygen will ultimately lead to low Acanthamoeba trophozoite counts. Acanthamoeba spp. being ubiquitous, exist in many natural environments and domestic water systems but their numbers fluctuate to a certain extent with precipitating factors like dissolved oxygen, temperature, organic matter, conductivity, oxidation reduction potential, although not so significantly [ 29 ]. Classifying the genus Acanthamoeba remains a debatable topic but the molecular genotyping being used currently has proved precise in isolate identification, producing more than 25 species. Acanthamoeba sequence types have been previously grouped from T1 to T18. In the present study six distinct partial Acanthamoeba sequences belonging to sequence T-genotype groups T1, T2, T4, T5, T6 and T11, with only two identical ( Acanthamoeba hatchetti and Acanthamoeba polyphaga ) to already known Acanthamoeba spp. sequences from NCBI comparisons were obtained. The remaining four Acanthamoeba spp. which were not classified to species level may be unique to Uganda. Two isolates belonged to T4, whereas T1, T2, T5, T6 and T11 had only one isolate each. The Acanthamoeba strain identified as genotype T4 and T6 was isolated from both environmental and tap water samples. All the other strains were from environmental samples. Previous studies indicate that T2 and T6 are largely environmental isolates that are phylogenetically close to one another [ 30 ] although they have also been both isolated from clinical AK cases [ 31 ]. Acanthamoeba T3 and T11 are closely related to T4 and have been found to also be responsible for AK [ 32 ]. Acanthamoeba of T4 is reported as the most commonly encountered and most diverse T-genotype group found in both environmental and clinical samples. [ 30 ]. Genotype T5 is the second most prevalent [ 12 ], mainly isolated from sewage dump locations and AK infections [ 30 ]. The findings from the present study indicate that there is a high likelihood of contamination of both environmental and domestic tap water systems with Acanthamoeba spp. indicating poor water source quality and possible predisposition of the end users to a variety of infections. Since there are no previous studies on Acanthamoeba or any other amoeba in Uganda, it is hard to know the current situation in terms of the effect on human health but we can state that the various genotypes isolated from water samples in the present study could be responsible for silent illnesses that often lead to severe morbidities and mortalities among communities. Acanthamoeba genotypes T1 (responsible for encephalitis), T2 (keratitis and sinusitis), T3/T5 (keratitis) and T11 (keratitis and encephalitis) isolated from the water samples pose a high risk to the households in QEPA using both environmental and piped tap water. It is, therefore, imperative that more research on Acanthamoeba spp. and other amoebae is done in Uganda to build up knowledge of the types, prevalence, diagnosis, prevention and treatment measures. Conclusion There was a high prevalence of Acanthamoeba in communal piped tap and environmental water used by communities (at fish landing sites, channel and river banks). Increasing prevalence of Acanthamoeba in water means that there is increased density of prey organisms (bacteria). This can be an indicator of poor environmental and domestic tap water quality.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7097297/

Structurally speaking

Technical advances in structural biology are beginning to help us to understand how cells work, and these studies are especially pertinent to understanding microbial processes. Main Microbiologists have traditionally exploited the simplicity of viral, bacterial and fungal systems to gain an insight into complex mechanisms and processes. And, although we recognize that microorganisms don't operate in isolation but are usually members of communities, structural biology is proving invaluable in understanding how microbial cellular processes function at the molecular level. A quick glance at the contents pages of some key microbiology research journals reveals the ongoing impact of structural studies on microbiology. The Journal of Virology and the Journal of Bacteriology both feature sections that showcase structural information. Funding bodies in the United Kingdom, such as the Biotechnology and Biological Sciences Research Council, have set up six research centres that concentrate solely on structural biology. Similarly, there are numerous structural biology centres in the United States and worldwide. Through a cursory examination of the premier published literature we can clearly see the impact that collaborations between microbiologists and structural biologists are having on microbiological and infectious disease research. The recent publication of X-ray crystal structures of the haemagglutinin from the 1918 influenza virus sheds new light on how avian influenza viruses might jump the species barrier and potentially cause pandemics 1 , 2 . Only nine months after the identification of the SARS coronavirus as the causative agent of a new type of pneumonia, the structure of its main protease was solved, providing a basis for researchers to rationally design anti-SARS drugs 3 . Reovirus, adenovirus and HIV-1 are three viruses for which collaborative teams are working towards solving the structures of all the viral proteins. Virology is not the only discipline that has benefitted from the structural renaissance: bacterial proteins, especially surface proteins and exported proteins, such as toxins, are often ideal candidates for structural studies. The structures of all three proteins that comprise the anthrax toxin, and now small-molecule inhibitors of the toxin, have been reported 4 . Structural studies are now central to devising and designing new anti-infective therapies and investigating host–pathogen interactions. Besides advances in our understanding of the microbial infection process, structural studies have also sprung some surprises in core microbiological disciplines. One study demonstrated that a quorum-sensing molecule that enables communication in some Gram-negative bacteria contains boron 5 . This was the first demonstration of a potential biological role for boron. Nitrogen fixation, which is restricted to bacterial and archaeal species and is crucial in global nitrogen cycling, has long been a favourite topic for study by microbial geneticists and physiologists. When the structure of bacterial nitrogenase was determined, a 'light' atom, probably nitrogen, was detected in the enzyme cofactor 6 . This could prove pivotal in understanding how nitrogen is fixed. Our understanding of cell division, DNA replication and transcription has similarly been revolutionized by determining the structures of some of the proteins involved. The mechanisms by which molecular machines, such as the flagella and pili, assemble and function have occupied the time of many microbiologists. Structures of the proteins that form these machines have already had a large impact on understanding how they work; these collaborations bode well for future advances in these fields. With this in mind, in this month's issue we publish a review article that integrates bacterial type IV pili structures with their biological functions — an article that clearly illustrates the power of relating structural information to biological function. Because microbiologists are embracing and integrating the core discipline of structural biology with traditional microbiological endeavours, we will no doubt be featuring many more articles that herald this new era of structural microbiology.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3756335/

Transmission of pathogens by Stomoxys flies (Diptera, Muscidae): a review

Stomoxys flies are mechanical vectors of pathogens present in the blood and skin of their animal hosts, especially livestock, but occasionally humans. In livestock, their direct effects are disturbance, skin lesions, reduction of food intake, stress, blood loss, and a global immunosuppressive effect. They also induce the gathering of animals for mutual protection; meanwhile they favor development of pathogens in the hosts and their transmission. Their indirect effect is the mechanical transmission of pathogens. In case of interrupted feeding, Stomoxys can re-start their blood meal on another host. When injecting saliva prior to blood-sucking, they can inoculate some infected blood remaining on their mouthparts. Beside this immediate transmission, it was observed that Stomoxys may keep some blood in their crop, which offers a friendly environment for pathogens that could be regurgitated during the next blood meal; thus a delayed transmission by Stomoxys seems possible. Such a mechanism has a considerable epidemiological impact since it allows inter-herd transmission of pathogens. Equine infectious anemia, African swine fever, West Nile, and Rift Valley viruses are known to be transmitted by Stomoxys , while others are suspected. Rickettsia ( Anaplasma , Coxiella ), other bacteria and parasites ( Trypanosoma spp ., Besnoitia spp. ) are also transmitted by Stomoxys . Finally, Stomoxys was also found to act as an intermediate host of the helminth Habronema microstoma and may be involved in the transmission of some Onchocerca and Dirofilaria species. Being cosmopolite, Stomoxys calcitrans might have a worldwide and greater impact than previously thought on animal and human pathogen transmission. 1. Introduction The genus Stomoxys (Diptera: Muscidae) contains 18 described species [ 136 ]. They are obligate blood-sucking insects and some species are considered significant economic pests of livestock and other warm-blooded animals in many parts of the world [ 136 ]. Stomoxys calcitrans is a cosmopolitan species. In addition to S. calcitrans , several other stomoxyine flies also readily attack domestic animals, including S. niger , S. sitiens , and S. indicus [ 123 ]. Both male and female stable flies feed on blood and they are often aggressive and persistent feeders; they even can attack humans in the absence of preferred hosts. It has been recently shown that those flies ( S. calcitrans and S. niger ) also take sugars from flowers or ripe fruits [ 89 ]. Although they are most active and problematic around livestock farms, they can also be a nuisance insect on coastal beaches and in residential areas near agricultural production [ 91 ] ( Figure 1 ). Figure 1. Stomoxys calcitrans . Stable flies can cause severe problems in dairies and feedlots, where larval stages develop in moist soil and similar substrates [ 81 , 88 ]. Severe biting activity can result in a reduction in animal weight and milk production. Reductions of 19% in weight gain and of 40–60% in milk yields have been reported [ 18 , 19 , 124 ]. S. calcitrans may also cause specific skin lesions like necrotic dermatitis at the tips of dog's ears, exsudative dermatitis on the legs of horses and in the "hair whirlpools" on the back of calves [ 131 ]. Stomoxys may also affect wild animals. A die-off of bongos ( Tragelaphus eurycerus (Ogilby, 1837)) and other large ungulates occurred following a Stomoxys biting fly outbreak in the lowland forest of the northern Republic of Congo in April–May 1997 [ 37 ]. The direct effects of swarming biting flies and the resulting attempts to fight off the flies seem to have contributed to extreme fatigue, disruption of foraging patterns, modification of behavior, and increased exposure to predation and accidents. Observations of bongos and examination of carcasses suggested that the physical torment and disruption caused by the biting of Stomoxys contributed directly to the deterioration of their condition [ 37 ]. Independent from their direct nuisance (annoyance, toxic effects of saliva, blood loss, etc.), a high number of flies biting cattle and other affected animals may have a direct role in the epidemiology of transmissible diseases. Several Stomoxys species have been implicated as mechanical vectors of pathogens, including viruses, bacteria, protozoa, and helminths. This review discusses the direct and indirect effects of Stomoxys flies and provides an overview of existing literature on the pathogens they can transmit. 2. Direct nuisance and secondary effects As partly described for tabanids [ 35 ] and stomoxes [ 11 ], the direct nuisance of Stomoxys flies and other biting flies can be summarized as follows: 2.1 Annoyances of animals By flying around the eyes, landing on the skin, and attempting to bite, these insects disturb animals. This is especially important for livestock; they induce defensive movements of the head, ears, skin, legs, and tail, and escaping- or hiding-behaviors (hiding in a forest, or deep into the water; close gathering of animals to protect each other, etc.). Thus, their annoyance causes: (1) a loss of energy, (2) a reduction of the time spent feeding and the total feed intake, (3) stress due to flying and landing events. 2.2 Pain and toxicity of skin puncture and saliva injection The physical action of mouth parts and the chemical action of the saliva create a local pain at the biting site, which is a source of stress for the animals. It is also the origin of local cutaneous infections or secondary infections in case of myiasis. Additionally, the chemical and immunogenic actions of the saliva have a general toxicity and create a general immune response which contributes to stress and immunosuppression. 2.3 Blood loss As blood feeders, Stomoxys flies can consume an average of 11–15 μL of blood per meal [ 106 ]. In addition to the direct loss of blood from feeding, more blood may pour out from the biting site when the mouthparts are removed from the skin, which may dry on the skin or be promptly absorbed by sucking flies. Often, Stomoxys will be disturbed by high abundances of sucking flies, which interrupts their blood meal, and creates more opportunities to lose blood by pouring from the biting site. The primary consequences of loss of energy, reduction of food intake, stress, and blood losses are a reduction of meat, milk, manure production, and draught power, which is summarized by a consequent loss of productivity with significant economic impact. For example, Barré [ 4 ] estimated in La Réunion that a total of 0.5–1 L of milk/cow/day is lost due to stomoxes in highly infested farms. In their study of grazing yearling steers/calves, Campbell et al. [ 18 ] observed an average loss of 0.2 kg in the weight gains of untreated animals versus insecticide-treated ones. As a consequence, these direct effects not only influence the rate of livestock production, but they also favor disease transmission. Indeed, the secondary consequences of the direct nuisance are (i) close gathering of animals (as a behavior to protect each other) which increases the probability for biting flies to move from one to another animal in case of interrupted feeding; (ii) immunosuppressive effects on the hosts (as a consequence of stress, energy losses, decrease in food-intake, and the toxic activity of the fly saliva [ 115 ]) have two important consequences: enhancing the pathogenesis of the infected animals (thus increasing the contaminative boost transmitted by the insects), and reducing the resistance of potential hosts (thus making the host more receptive and pathogen development easier). In summary, the direct effects of biting insects are notably favoring pathogen transmission and enhancing their development [ 33 ]. 2.1 Annoyances of animals By flying around the eyes, landing on the skin, and attempting to bite, these insects disturb animals. This is especially important for livestock; they induce defensive movements of the head, ears, skin, legs, and tail, and escaping- or hiding-behaviors (hiding in a forest, or deep into the water; close gathering of animals to protect each other, etc.). Thus, their annoyance causes: (1) a loss of energy, (2) a reduction of the time spent feeding and the total feed intake, (3) stress due to flying and landing events. 2.2 Pain and toxicity of skin puncture and saliva injection The physical action of mouth parts and the chemical action of the saliva create a local pain at the biting site, which is a source of stress for the animals. It is also the origin of local cutaneous infections or secondary infections in case of myiasis. Additionally, the chemical and immunogenic actions of the saliva have a general toxicity and create a general immune response which contributes to stress and immunosuppression. 2.3 Blood loss As blood feeders, Stomoxys flies can consume an average of 11–15 μL of blood per meal [ 106 ]. In addition to the direct loss of blood from feeding, more blood may pour out from the biting site when the mouthparts are removed from the skin, which may dry on the skin or be promptly absorbed by sucking flies. Often, Stomoxys will be disturbed by high abundances of sucking flies, which interrupts their blood meal, and creates more opportunities to lose blood by pouring from the biting site. The primary consequences of loss of energy, reduction of food intake, stress, and blood losses are a reduction of meat, milk, manure production, and draught power, which is summarized by a consequent loss of productivity with significant economic impact. For example, Barré [ 4 ] estimated in La Réunion that a total of 0.5–1 L of milk/cow/day is lost due to stomoxes in highly infested farms. In their study of grazing yearling steers/calves, Campbell et al. [ 18 ] observed an average loss of 0.2 kg in the weight gains of untreated animals versus insecticide-treated ones. As a consequence, these direct effects not only influence the rate of livestock production, but they also favor disease transmission. Indeed, the secondary consequences of the direct nuisance are (i) close gathering of animals (as a behavior to protect each other) which increases the probability for biting flies to move from one to another animal in case of interrupted feeding; (ii) immunosuppressive effects on the hosts (as a consequence of stress, energy losses, decrease in food-intake, and the toxic activity of the fly saliva [ 115 ]) have two important consequences: enhancing the pathogenesis of the infected animals (thus increasing the contaminative boost transmitted by the insects), and reducing the resistance of potential hosts (thus making the host more receptive and pathogen development easier). In summary, the direct effects of biting insects are notably favoring pathogen transmission and enhancing their development [ 33 ]. 3. Mechanism of pathogens transmission by Stomoxys flies Mechanical transmission is a simple mechanism of pathogen transmission which, in itself, is considered to be the most important "indirect effect" of blood-sucking insects. This mode of transmission appears to occur through either contamination of mouthparts or regurgitation of digestive tract contents. The chain of events leading to mechanical transmission is as follows: the initial blood feeding upon an infected animal is often interrupted because of the pain of the bite, leading to defensive movements of the host; the fly may then fly off and land on another animal, thus it is able to transfer blood pathogens remaining in its mouthparts to a susceptible animal. Pathogens are then transferred during the initiation of the second feeding through the saliva that hematophagous insects inject prior to blood-sucking. In addition to this "mouthpart" contamination, experimental evidence has shown that stable flies can regurgitate part of a previous blood meal before taking up another one [ 13 ]. Indeed, the regurgitation of a relatively high amount of the previously ingested blood meal could be an important way of transmitting high doses of disease agents. However, this phenomenon is limited by the short survival of pathogens which may be inhibited by digestive secretion. For example, T. vivax survival in a tabanid's guts was estimated to be around 5–7 h [ 38 ]. However, as observed by some authors in experimental conditions [ 23 ], some blood ingested can be directed to the insect's crop, where pathogens may survive longer since it is a more friendly environment devoid of digestive secretions. Blood can stay 24 h or more in the crop before being directed either to the gut or partially regurgitated during the early stage of a new blood meal. In such conditions, a partial regurgitation of blood from the crop would allow a delayed transmission, possibly up to 24 h or more. In tabanids, the interval between blood meals is quite long (5–7 days), above the maximum survival of most of the pathogens [ 43 ], regardless of whether they are kept in the crop or the gut. However, in stomoxe flies, which are frequent feeders [ 103 ], the interval between blood meals is variable, from 4 to 72 h [ 43 , 74 ]. Thus, the crop regurgitation of infectious blood could easily establish in these flies. As it was experimentally studied and mathematically modeled for tabanids and trypanosomes [ 35 ], the potential ability for transmission of pathogens mainly depends on the volume of blood left on the mouthparts after feeding (which is essentially governed by the size of the insect's mouth parts), the density of biting-insects flying around the animals, the level of parasitaemia in the host blood, and the relative proportion of infected and non-infected hosts which are close together. Specifically, it may also vary with the minimum infectious dose of a pathogen, the duration of the survival period of the pathogen in the insect, and the duration of the periods between repeated blood-sucking [ 42 , 105 ]. Pathogens possibly transmitted by tabanids have been reviewed by several authors and proved to be as varied as bacteria, viruses, and parasites [ 41 , 73 ]. Pathogens transmitted by stomoxes are thought to be the same; however, some more specific links may exist between stomoxes, pathogens, and their hosts, due to peculiar host species trophic affinity, type of bite or behaviour of stomoxes, and possible delayed transmission due to their higher frequency of blood meals. On top of the pathogens that are mechanically transmitted, stomoxes may also be a biological vector of a limited number of other pathogens. 4. Viruses Numerous viruses can be transmitted mechanically by Stomoxys spp. 4.1 Equine infectious anemia virus (EIAV) Equine infectious anemia is considered a worldwide disease caused by a Lentivirus (Retroviridae). EIAV is responsible for a persistent infection in horses that is characterized by recurring cycles of viremia and clinical episodes of fever, anemia, edema, thrombocytopenia, and various wasting symptoms [ 76 ]. Blood from persistently infected horses is the most important source of EIAV for transmission. The mechanical transmission of EIAV by arthropods is generally accepted as a major factor in the transmission of this virus [ 64 ]. Large hematophagous insects, especially tabanids, which feed from extravascular sites (i.e., pool feeding) appear to be the most efficient vectors [ 63 ]. But stable flies have also been reported to be capable of mechanically transmitting EIAV [ 44 , 52 , 56 , 110 ]. 4.2 African swine fever virus (ASFV) African swine fever, a disease of pigs, is caused by a virus of the genus Asfivirus (Asfarviridae). ASFV was first described from East Africa in 1921 [ 86 ], but subsequently identified in southern, central, and western Africa [ 97 , 98 ]. The most recent outbreak of ASF outside Africa started in 2007 in Georgia and has spread to neighboring countries. Fever, skin lesion, convulsions, and usually death within 15 days (young animals) are the main symptoms. These signs are often indistinguishable from those of Classical Swine Fever. ASFV persists in nature in a sylvatic cycle of transmission between wild suids (mainly the warthog, Phacochoerus aethiopicus ) and Ornithodoros moubata ticks, which infest their burrows [ 129 ]. The transmission can also occur by per-oral route, through the ingestion of infected feed [ 24 ]. S. calcitrans has also been shown to be an experimentally competent mechanical vector. ASFV was transmitted to susceptible pigs by S. calcitrans infected one hour and 24 h previously and the virus survived in those flies for at least two days without apparent loss of titer [ 80 ]. The persistence of high titers of virus in stable flies for periods of up to two days strongly suggests that transmission should be possible for at least this length of time. 4.3 West Nile fever virus (WNFV) West Nile Fever is caused by a Flavivirus (Flaviviridae). WNFV is a zoonotic pathogen that is primarily transmitted between birds by mosquitoes, but is also transmitted to mammals, including horses and humans [ 71 ]. Several species of Culex mosquitoes are particularly efficient vectors. This virus is currently the most widely distributed arbovirus in the world, occurring on all continents except Antarctica [ 72 ]. Johnson et al. [ 66 ] reported that stable flies were contaminated by WNFV through feeding upon American white pelicans. Fifty-four percent of abdomens from 67 blood-engorged flies tested positive for WNFV. Pelican viremia levels from the blood-engorged fly abdomens revealed that at least one of the ill pelicans circulated a viremia capable of infecting Culex mosquito vectors. Stable flies may also be involved in WNFV transmission within the pelican breeding colony by serving as either a mechanical vector or as a source for oral infection if ingested by predators [ 36 ]. 4.4 Rift Valley fever virus (RVFV) Rift Valley fever is a zoonotic disease of domestic ruminants and humans caused by an arbovirus belonging to the genus Phlebovirus (Bunyaviridae). It is widespread in Africa and has recently spread to Yemen and Saudi Arabia. RVF epidemics are becoming more and more frequent in Africa and the Middle East, probably in relation to climatic changes. Clinical manifestations vary depending on age and animal species. Animals usually experience fever with depression, hemorrhagic diarrhea, bloodstained muco-purulent nasal discharge, and icterus. Mortality rates may vary from 10% to 95% for newborn lambs. In pregnant animals, abortions are frequent, ranging from 5% to 100% [ 21 ]. Hoch et al. [ 59 ] conducted experimental studies to determine if hematophagous Diptera were capable of mechanical transmission of RVFV to laboratory animals. All species tested ( Glossina morsitans , Aedes aegypti , Aedes taeniorhynchus , Culex pipiens , Stomoxys calcitrans , Lutzomyia longipalpis , and Culicoides variipennis ) mechanically transmitted the virus to hamsters. S. calcitrans was able to mechanically transmit RVFV to susceptible hamsters ( Mesocricetus auratus ) after probing on infected hamsters with high viral titers. Therefore, S. calcitrans should be considered a possible mechanical vector of this virus and may contribute to the rapid spread of an RVF outbreak because of its close association with domestic animals that serve as amplifying hosts of RVFV. Other Stomoxys species present in Africa and elsewhere may also play similar roles [ 121 ]. 4.5 Lumpy skin disease virus (LSDV) Lumpy skin disease, caused by a Capripoxvirus (Poxviridae), is characterized in cattle by pyrexia, generalized skin lesions (nodules), internal pox lesions, and lymphadenopathy [ 69 ]. Lumpy skin disease was first recognized in Zambia in 1929 and is now endemic in most of sub-Saharan Africa, parts of North Africa and has also been reported in the Middle East [ 27 ]. S. calcitrans has been shown to mechanically transmit capripox virus (Yemeni strain) to susceptible hosts (sheep, goat) under experimental conditions [ 68 , 80 ]. Lumpy skin disease virus was detected by isolation from S. calcitrans immediately post-feeding, and viral nucleic acid was detectable by PCR up to 24 h post-feeding [ 22 ]. Although epidemiological observations also suggest the role of stomoxe flies in the transmission of the LSDV [ 132 ], a formal demonstration has not yet been made. 4.6 Bovine herpes virus (BHV) Bovid herpes virus-2 (BHV-2) (genus Herpesvirus , Herpesviridae) infection causes a bovine vesicular and ulcerative skin disease known as bovine herpes mammillitis (BHM). This is a localized, painful condition of the teats and udders, usually seen in first calving heifers. Both BHM and pseudo-lumpy skin disease (another manifestation of BHV-2 infection) have a seasonal prevalence, and both are thought to be initiated by biting insects. BHM can only be produced experimentally when the virus is introduced below the level of the stratum germinativum of the udder or teat skin, and S. calcitrans has been proposed as a mechanical vector [ 47 , 48 ]. S. calcitrans fed on infected blood mechanically transmitted enough of the virus to infect cell monolayers in an experimental infection [ 49 ], and therefore stable flies are considered a potential mechanical vector of BHV-2. 4.7 Bovine leukosis virus (BLV) The ability of tabanids to transmit enzootic BLV (genus Lentivirus , Retroviridae) has been experimentally demonstrated [ 45 ]. However, the role of stable flies has been investigated but not yet been demonstrated [ 14 , 46 , 126 ]. 4.8 Vesicular stomatitis virus (VSV) The mechanical transmission of VSV (genus Vesiculovirus , Rhabdoviridae) has been experimentally shown with stable flies [ 39 ]; but since 1955, no further studies have confirmed this result [ 19 ]. However, a recent study demonstrated the mechanical transmission of VSV to domestic swine by black flies [ 113 ]. 4.9 Blue tongue virus (BTV) BTV (genus Orbivirus , Reoviridae) causes an infectious, non-contagious disease of ruminants, and is transmitted between its vertebrate hosts by Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) acting as a biological vector. Until 2006, BTV existed around the world in a broad band covering much of the Americas, Africa, southern Asia, northern Australia and, occasionally, the southern fringe of Europe. Recently the virus causing this disease has extended northwards into areas of Europe. A BTV epizootic in South-Western France in the summer and autumn of 2008, with a high incidence of new cases, raised the question about the possibility of BTV transmission not only by biological Culicoides vectors but also by mechanical vectors. These mechanical vectors would amplify the epizootics observed, with biological consequences. Other viruses are also suspected to be transmitted by Stomoxys such as Classical Swine Fever, African Horse Sickness, Yellow Fever, Foot and Mouth Disease, Myxomatosis, Bovine Viral Diarrhea, and a number of viral Encephalites (West Equine Encephalitis, East Equine Encephalitis, Central Equine Encephalitis, Venezuelan Equine Encephalitis, etc.); however no demonstrations were made so far [ 73 ]. 4.1 Equine infectious anemia virus (EIAV) Equine infectious anemia is considered a worldwide disease caused by a Lentivirus (Retroviridae). EIAV is responsible for a persistent infection in horses that is characterized by recurring cycles of viremia and clinical episodes of fever, anemia, edema, thrombocytopenia, and various wasting symptoms [ 76 ]. Blood from persistently infected horses is the most important source of EIAV for transmission. The mechanical transmission of EIAV by arthropods is generally accepted as a major factor in the transmission of this virus [ 64 ]. Large hematophagous insects, especially tabanids, which feed from extravascular sites (i.e., pool feeding) appear to be the most efficient vectors [ 63 ]. But stable flies have also been reported to be capable of mechanically transmitting EIAV [ 44 , 52 , 56 , 110 ]. 4.2 African swine fever virus (ASFV) African swine fever, a disease of pigs, is caused by a virus of the genus Asfivirus (Asfarviridae). ASFV was first described from East Africa in 1921 [ 86 ], but subsequently identified in southern, central, and western Africa [ 97 , 98 ]. The most recent outbreak of ASF outside Africa started in 2007 in Georgia and has spread to neighboring countries. Fever, skin lesion, convulsions, and usually death within 15 days (young animals) are the main symptoms. These signs are often indistinguishable from those of Classical Swine Fever. ASFV persists in nature in a sylvatic cycle of transmission between wild suids (mainly the warthog, Phacochoerus aethiopicus ) and Ornithodoros moubata ticks, which infest their burrows [ 129 ]. The transmission can also occur by per-oral route, through the ingestion of infected feed [ 24 ]. S. calcitrans has also been shown to be an experimentally competent mechanical vector. ASFV was transmitted to susceptible pigs by S. calcitrans infected one hour and 24 h previously and the virus survived in those flies for at least two days without apparent loss of titer [ 80 ]. The persistence of high titers of virus in stable flies for periods of up to two days strongly suggests that transmission should be possible for at least this length of time. 4.3 West Nile fever virus (WNFV) West Nile Fever is caused by a Flavivirus (Flaviviridae). WNFV is a zoonotic pathogen that is primarily transmitted between birds by mosquitoes, but is also transmitted to mammals, including horses and humans [ 71 ]. Several species of Culex mosquitoes are particularly efficient vectors. This virus is currently the most widely distributed arbovirus in the world, occurring on all continents except Antarctica [ 72 ]. Johnson et al. [ 66 ] reported that stable flies were contaminated by WNFV through feeding upon American white pelicans. Fifty-four percent of abdomens from 67 blood-engorged flies tested positive for WNFV. Pelican viremia levels from the blood-engorged fly abdomens revealed that at least one of the ill pelicans circulated a viremia capable of infecting Culex mosquito vectors. Stable flies may also be involved in WNFV transmission within the pelican breeding colony by serving as either a mechanical vector or as a source for oral infection if ingested by predators [ 36 ]. 4.4 Rift Valley fever virus (RVFV) Rift Valley fever is a zoonotic disease of domestic ruminants and humans caused by an arbovirus belonging to the genus Phlebovirus (Bunyaviridae). It is widespread in Africa and has recently spread to Yemen and Saudi Arabia. RVF epidemics are becoming more and more frequent in Africa and the Middle East, probably in relation to climatic changes. Clinical manifestations vary depending on age and animal species. Animals usually experience fever with depression, hemorrhagic diarrhea, bloodstained muco-purulent nasal discharge, and icterus. Mortality rates may vary from 10% to 95% for newborn lambs. In pregnant animals, abortions are frequent, ranging from 5% to 100% [ 21 ]. Hoch et al. [ 59 ] conducted experimental studies to determine if hematophagous Diptera were capable of mechanical transmission of RVFV to laboratory animals. All species tested ( Glossina morsitans , Aedes aegypti , Aedes taeniorhynchus , Culex pipiens , Stomoxys calcitrans , Lutzomyia longipalpis , and Culicoides variipennis ) mechanically transmitted the virus to hamsters. S. calcitrans was able to mechanically transmit RVFV to susceptible hamsters ( Mesocricetus auratus ) after probing on infected hamsters with high viral titers. Therefore, S. calcitrans should be considered a possible mechanical vector of this virus and may contribute to the rapid spread of an RVF outbreak because of its close association with domestic animals that serve as amplifying hosts of RVFV. Other Stomoxys species present in Africa and elsewhere may also play similar roles [ 121 ]. 4.5 Lumpy skin disease virus (LSDV) Lumpy skin disease, caused by a Capripoxvirus (Poxviridae), is characterized in cattle by pyrexia, generalized skin lesions (nodules), internal pox lesions, and lymphadenopathy [ 69 ]. Lumpy skin disease was first recognized in Zambia in 1929 and is now endemic in most of sub-Saharan Africa, parts of North Africa and has also been reported in the Middle East [ 27 ]. S. calcitrans has been shown to mechanically transmit capripox virus (Yemeni strain) to susceptible hosts (sheep, goat) under experimental conditions [ 68 , 80 ]. Lumpy skin disease virus was detected by isolation from S. calcitrans immediately post-feeding, and viral nucleic acid was detectable by PCR up to 24 h post-feeding [ 22 ]. Although epidemiological observations also suggest the role of stomoxe flies in the transmission of the LSDV [ 132 ], a formal demonstration has not yet been made. 4.6 Bovine herpes virus (BHV) Bovid herpes virus-2 (BHV-2) (genus Herpesvirus , Herpesviridae) infection causes a bovine vesicular and ulcerative skin disease known as bovine herpes mammillitis (BHM). This is a localized, painful condition of the teats and udders, usually seen in first calving heifers. Both BHM and pseudo-lumpy skin disease (another manifestation of BHV-2 infection) have a seasonal prevalence, and both are thought to be initiated by biting insects. BHM can only be produced experimentally when the virus is introduced below the level of the stratum germinativum of the udder or teat skin, and S. calcitrans has been proposed as a mechanical vector [ 47 , 48 ]. S. calcitrans fed on infected blood mechanically transmitted enough of the virus to infect cell monolayers in an experimental infection [ 49 ], and therefore stable flies are considered a potential mechanical vector of BHV-2. 4.7 Bovine leukosis virus (BLV) The ability of tabanids to transmit enzootic BLV (genus Lentivirus , Retroviridae) has been experimentally demonstrated [ 45 ]. However, the role of stable flies has been investigated but not yet been demonstrated [ 14 , 46 , 126 ]. 4.8 Vesicular stomatitis virus (VSV) The mechanical transmission of VSV (genus Vesiculovirus , Rhabdoviridae) has been experimentally shown with stable flies [ 39 ]; but since 1955, no further studies have confirmed this result [ 19 ]. However, a recent study demonstrated the mechanical transmission of VSV to domestic swine by black flies [ 113 ]. 4.9 Blue tongue virus (BTV) BTV (genus Orbivirus , Reoviridae) causes an infectious, non-contagious disease of ruminants, and is transmitted between its vertebrate hosts by Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) acting as a biological vector. Until 2006, BTV existed around the world in a broad band covering much of the Americas, Africa, southern Asia, northern Australia and, occasionally, the southern fringe of Europe. Recently the virus causing this disease has extended northwards into areas of Europe. A BTV epizootic in South-Western France in the summer and autumn of 2008, with a high incidence of new cases, raised the question about the possibility of BTV transmission not only by biological Culicoides vectors but also by mechanical vectors. These mechanical vectors would amplify the epizootics observed, with biological consequences. Other viruses are also suspected to be transmitted by Stomoxys such as Classical Swine Fever, African Horse Sickness, Yellow Fever, Foot and Mouth Disease, Myxomatosis, Bovine Viral Diarrhea, and a number of viral Encephalites (West Equine Encephalitis, East Equine Encephalitis, Central Equine Encephalitis, Venezuelan Equine Encephalitis, etc.); however no demonstrations were made so far [ 73 ]. 5. Bacteria (with the exception of Rickettsia) 5.1 Anthrax Anthrax is caused by a spore-forming bacterium, Bacillus anthracis , and is considered a serious zoonotic disease. The disease affects animals and humans, inducing pulmonary, gastro-intestinal, or cutaneous symptoms, including a boil-like skin lesion that eventually forms a typical ulcer with a black center (eschar). It is often lethal in the absence of treatment. Although B. anthracis can be found worldwide, anthrax cases usually only occur in a limited geographic region. Outbreaks are most common in areas characterized by alkaline, calcareous soil, and in warm environments with periodic episodes of flooding [ 62 ]. Anthrax is particularly common in parts of Africa, Asia, and the Middle East. Herbivores usually become infected when they ingest sufficient numbers of spores in soil or on plants in pastures. Carnivores usually become infected after eating contaminated meat. However, B. anthracis infections can also be mechanically transmitted by stable flies. Schuberg and Kuhn [ 108 ] demonstrated with mice and guinea pigs that infections could be transmitted from sick animals to healthy ones via S. calcitrans . Schuberg and Boing [ 107 ] were able to infect sheep and goats using S. calcitrans [ 62 ]. Stable flies transmitted anthrax, even when they were held at room temperature for 4 h after exposure to the bacteremic guinea pig before being allowed to continue feeding on the susceptible animals. The potential for flies to mechanically transmit anthrax suggests that fly control should be considered as part of a program for control of epizootic anthrax [ 120 ]. 5.2 Other bacteria Mechanical transmission by stomoxes has been demonstrated for Pasteurella multocida (Hemorrhagic Septicemia in Buffalo), Erysipelothrix rhusiopathiae (an agent of erysipelas in animals and erysipeloid in humans), and Francisella tularensis (responsible for tularemia) [ 73 ]. For other bacteria, mechanical transmission by stomoxes is only suspected: Clostridium perfringens , Pasteurella multilocida , Brucella abortus , Brucella suis , Brucella melitensis , Listeria monocytogenes , Leptospira spp. [ 73 ]. Enterobacter sakazakii is an opportunistic food-borne pathogen causing meningitis, enterocolitis, and sepsis. Mramba et al. [ 87 ] reported that adult stable flies can carry E. sakazakii for several weeks and contaminate their food sources with this pathogen. E. sakazakii was supported during the development of immature stable flies in sterilized cattle manure and sterilized artificial medium. In addition, E. sakazakii survived during stable fly development and colonized the gut of emerging adult stable flies, which makes stomoxe flies biological vectors of this bacterium. Dermatophilus congolensis is a Gram-positive coccobacillary actinomycete that causes an exsudative dermatitis in a variety of species, most notably in ruminants and horses, although rare infections occur in cats, dogs, and humans [ 1 , 15 ]. It has a worldwide distribution but is more prevalent in the humid tropics and subtropics [ 133 ]. Domestic flies ( Musca domestica ), and biting insects such as S. calcitrans , Glossina morsitans , and mosquitoes have been reported to be involved in the transmission of the disease by breaking the skin barrier during feeding and releasing variable amounts of serum and blood which provide moisture, nutrition, and a suitable microclimate for the multiplication of D. congolensis . Richard and Pier [ 100 ] successfully infected rabbits through contaminated flies ( S. calcitrans and M. domestica ). Macadam [ 79 ] saw lesions of D. congolensis infection on sheep and horses in Sabah and noted that most lesions were not associated with ticks so he presumed that S. calcitrans was the main vector. De Castro et al. [ 28 ] reported the existence of 33 distinct species of bacteria in stable flies. Bacterial species were isolated from three different segments (cuticle, mouthparts, and abdominal alimentary tract) of stable flies. A total of 161 colonies of 33 distinct species were isolated, such as Escherichia coli , Staphylococcus aureus , and S. intermedius . The cuticle was the segment from where most species were isolated, followed by the abdominal digestive tract and mouthparts. 5.1 Anthrax Anthrax is caused by a spore-forming bacterium, Bacillus anthracis , and is considered a serious zoonotic disease. The disease affects animals and humans, inducing pulmonary, gastro-intestinal, or cutaneous symptoms, including a boil-like skin lesion that eventually forms a typical ulcer with a black center (eschar). It is often lethal in the absence of treatment. Although B. anthracis can be found worldwide, anthrax cases usually only occur in a limited geographic region. Outbreaks are most common in areas characterized by alkaline, calcareous soil, and in warm environments with periodic episodes of flooding [ 62 ]. Anthrax is particularly common in parts of Africa, Asia, and the Middle East. Herbivores usually become infected when they ingest sufficient numbers of spores in soil or on plants in pastures. Carnivores usually become infected after eating contaminated meat. However, B. anthracis infections can also be mechanically transmitted by stable flies. Schuberg and Kuhn [ 108 ] demonstrated with mice and guinea pigs that infections could be transmitted from sick animals to healthy ones via S. calcitrans . Schuberg and Boing [ 107 ] were able to infect sheep and goats using S. calcitrans [ 62 ]. Stable flies transmitted anthrax, even when they were held at room temperature for 4 h after exposure to the bacteremic guinea pig before being allowed to continue feeding on the susceptible animals. The potential for flies to mechanically transmit anthrax suggests that fly control should be considered as part of a program for control of epizootic anthrax [ 120 ]. 5.2 Other bacteria Mechanical transmission by stomoxes has been demonstrated for Pasteurella multocida (Hemorrhagic Septicemia in Buffalo), Erysipelothrix rhusiopathiae (an agent of erysipelas in animals and erysipeloid in humans), and Francisella tularensis (responsible for tularemia) [ 73 ]. For other bacteria, mechanical transmission by stomoxes is only suspected: Clostridium perfringens , Pasteurella multilocida , Brucella abortus , Brucella suis , Brucella melitensis , Listeria monocytogenes , Leptospira spp. [ 73 ]. Enterobacter sakazakii is an opportunistic food-borne pathogen causing meningitis, enterocolitis, and sepsis. Mramba et al. [ 87 ] reported that adult stable flies can carry E. sakazakii for several weeks and contaminate their food sources with this pathogen. E. sakazakii was supported during the development of immature stable flies in sterilized cattle manure and sterilized artificial medium. In addition, E. sakazakii survived during stable fly development and colonized the gut of emerging adult stable flies, which makes stomoxe flies biological vectors of this bacterium. Dermatophilus congolensis is a Gram-positive coccobacillary actinomycete that causes an exsudative dermatitis in a variety of species, most notably in ruminants and horses, although rare infections occur in cats, dogs, and humans [ 1 , 15 ]. It has a worldwide distribution but is more prevalent in the humid tropics and subtropics [ 133 ]. Domestic flies ( Musca domestica ), and biting insects such as S. calcitrans , Glossina morsitans , and mosquitoes have been reported to be involved in the transmission of the disease by breaking the skin barrier during feeding and releasing variable amounts of serum and blood which provide moisture, nutrition, and a suitable microclimate for the multiplication of D. congolensis . Richard and Pier [ 100 ] successfully infected rabbits through contaminated flies ( S. calcitrans and M. domestica ). Macadam [ 79 ] saw lesions of D. congolensis infection on sheep and horses in Sabah and noted that most lesions were not associated with ticks so he presumed that S. calcitrans was the main vector. De Castro et al. [ 28 ] reported the existence of 33 distinct species of bacteria in stable flies. Bacterial species were isolated from three different segments (cuticle, mouthparts, and abdominal alimentary tract) of stable flies. A total of 161 colonies of 33 distinct species were isolated, such as Escherichia coli , Staphylococcus aureus , and S. intermedius . The cuticle was the segment from where most species were isolated, followed by the abdominal digestive tract and mouthparts. 6. Rickettsia 6.1 Bovine anaplasmosis Bovine anaplasmosis caused by Anaplasma marginale occurs in tropical and subtropical areas throughout the world. The outstanding feature of clinical anaplasmosis is anemia associated with phagocytosis of parasitized erythrocytes. A. marginale is poorly transmitted but surely amplified by ticks ( Rhipicephalus ( Boophilus ) microplus , Dermacentor andersoni ) and many hematophagous diptera are implicated as mechanical vectors, including S. calcitrans , Haematobia irritans , and Tabanus spp. [ 53 , 70 , 109 , 122 ]. Anaplasma marginale multiplies in the lumen of the tick's gut (or Malpighi tubes) and migrates to the salivary glands of the ticks at adult stage. Thus Anaplasma can be re-injected into the host by adult ticks [ 20 ]. When there is a massive infestation of ticks, a large boost in re-injected Anaplasma may lead to immune failure and can explain why clinical cases of anaplasmosis are frequently observed during times of high tick infestations. However, this does not explain the transmission of Anaplasma by ticks. Although intrastasial transmission is possible during the adult stage, it requires the transfer of ticks from one to another host, which is numerically negligible for female ticks and occurs at low rate for males of Rhipicephalus ( Boophilus ) microplus . Thus ticks must be considered amplifiers of the parasitic burden rather than vectors [ 29 ]. On the contrary, Tabanids and stomoxes are responsible for the mechanical transmission of Anaplasma through blood-contaminated mouthparts of biting flies. Scoles et al. [ 109 ] provided evidence that the Florida strain of A. marginale , which is not transmissible by ticks, was more efficiently retained in stable fly mouthparts than was the St Maries strain, which is tick transmissible. The mechanical transmission is likely the major route of A. marginale in certain areas of the USA, Central and South America, and Africa, when tick vectors are absent. A survey by Oliveira et al. [ 94 ] indicated that the exposure of cattle to A. marginale is common in dairy herds of Costa Rica and demonstrated the association between seroprevalence and presence of tabanids and stable flies. This endemic instability situation is probably due to inadequate vector control. 6.2 Other rickettsia Q fever is a disease caused by Coxiella burnetii in cattle, goats, sheep, dogs and humans [ 26 ]. It can be transmitted directly by inhalation of dust contaminated by dried placental material or excreta of infected animals. It can also be transmitted by ticks, which are considered long-term carriers [ 111 ]. Livestock is commonly infected and can act as a reservoir. Clinical signs are fever, anorexia, respiratory signs, and abortion. Flies that feed on the feces, milk, carcasses, or blood of domestic animals can be infected with Coxiella burnetii [ 61 ]. S. calcitrans collected from an elk and cattle ranch were positive for C. burnetii DNA [ 90 ] and should therefore be suspected as a mechanical vector of this bacterium. 6.1 Bovine anaplasmosis Bovine anaplasmosis caused by Anaplasma marginale occurs in tropical and subtropical areas throughout the world. The outstanding feature of clinical anaplasmosis is anemia associated with phagocytosis of parasitized erythrocytes. A. marginale is poorly transmitted but surely amplified by ticks ( Rhipicephalus ( Boophilus ) microplus , Dermacentor andersoni ) and many hematophagous diptera are implicated as mechanical vectors, including S. calcitrans , Haematobia irritans , and Tabanus spp. [ 53 , 70 , 109 , 122 ]. Anaplasma marginale multiplies in the lumen of the tick's gut (or Malpighi tubes) and migrates to the salivary glands of the ticks at adult stage. Thus Anaplasma can be re-injected into the host by adult ticks [ 20 ]. When there is a massive infestation of ticks, a large boost in re-injected Anaplasma may lead to immune failure and can explain why clinical cases of anaplasmosis are frequently observed during times of high tick infestations. However, this does not explain the transmission of Anaplasma by ticks. Although intrastasial transmission is possible during the adult stage, it requires the transfer of ticks from one to another host, which is numerically negligible for female ticks and occurs at low rate for males of Rhipicephalus ( Boophilus ) microplus . Thus ticks must be considered amplifiers of the parasitic burden rather than vectors [ 29 ]. On the contrary, Tabanids and stomoxes are responsible for the mechanical transmission of Anaplasma through blood-contaminated mouthparts of biting flies. Scoles et al. [ 109 ] provided evidence that the Florida strain of A. marginale , which is not transmissible by ticks, was more efficiently retained in stable fly mouthparts than was the St Maries strain, which is tick transmissible. The mechanical transmission is likely the major route of A. marginale in certain areas of the USA, Central and South America, and Africa, when tick vectors are absent. A survey by Oliveira et al. [ 94 ] indicated that the exposure of cattle to A. marginale is common in dairy herds of Costa Rica and demonstrated the association between seroprevalence and presence of tabanids and stable flies. This endemic instability situation is probably due to inadequate vector control. 6.2 Other rickettsia Q fever is a disease caused by Coxiella burnetii in cattle, goats, sheep, dogs and humans [ 26 ]. It can be transmitted directly by inhalation of dust contaminated by dried placental material or excreta of infected animals. It can also be transmitted by ticks, which are considered long-term carriers [ 111 ]. Livestock is commonly infected and can act as a reservoir. Clinical signs are fever, anorexia, respiratory signs, and abortion. Flies that feed on the feces, milk, carcasses, or blood of domestic animals can be infected with Coxiella burnetii [ 61 ]. S. calcitrans collected from an elk and cattle ranch were positive for C. burnetii DNA [ 90 ] and should therefore be suspected as a mechanical vector of this bacterium. 7. Protozoa 7.1 Animal trypanosomes Animal trypanosomes are major pathogens of livestock in Africa, they are mainly transmitted by tsetse flies, and can induce anemia, loss of milk and meat production as well as abortion and death. However, not only tsetse flies can transmit trypanosomes. Mechanical transmission of several Trypanosoma species has been demonstrated, notably for T. vivax , T. congolense , T. brucei , and T. evansi [ 31 – 33 , 83 , 101 ]. The relative impact of mechanical transmission is variable from one species to another. In the case of T. evansi , which is responsible for a worldwide disease called surra, and for T. vivax in Latin America, mechanical transmission is nearly the only route of transmission, and is thus very crucial [ 30 , 93 ]. In their early series of experiments, Bouet and Roubaud [ 10 ] demonstrated that T. evansi might not only be immediately mechanically transmitted by stomoxes, but may also be transmitted with delays of 24, 48, and even 72 h. These experiments demonstrated a peculiar capacity of stomoxes for delayed transmission while compared to tabanids, such delayed transmission has never been observed. The clinical signs of surra in most domesticated mammals and wild animals are characterized by fever and anemia, enlargement of the lymph nodes and spleen, followed by emaciation, edema, abortion, and cachexia [ 12 ]. Mihok et al. [ 83 ] demonstrated that S. varipes was capable of transmitting T. evansi mechanically to mice in the laboratory. Sumba et al. [ 114 ] studied the mechanical transmission of T. evansi (South American origin) and T. congolense of Kilifi DNA type (Kenyan origin) in laboratory mice using the African stable flies S. niger niger and S. taeniatus . T. congolense , one of the most important etiologic agents of African Animal Trypanosomosis, was also transmitted by S. n. niger at low rates and T. evansi was transmitted by both Stomoxys species at higher rates [ 114 ]. Two outbreaks of trypanosomosis caused by T. evansi in camels occurred in France in 2006 and in Spain in 2008. Both outbreaks were associated with the import of camels from the Canary Islands [ 55 ]. In France, trypanosomes were observed in the blood of five camels, three of them were indigenous to the farm and two had been imported. The parasite was probably transmitted by tabanids and S. calcitrans , which were abundant from July to September 2006. No parasites were observed in other animals on the farm or on neighboring farms, but some of the sheep on these farms were positive by PCR or serology [ 34 ]. Cuglovici et al. [ 25 ] assessed the epidemiological situation of bovine trypanosomosis caused by T. vivax in a dairy cattle herd in Minas Gerais state, Brazil. The highest incidence of the seroprevalence observed could be correlated with an increased population of S. calcitrans flies in that region. 7.2 Besnoitia besnoiti Bovine besnoitiosis is a protozoal disease of cattle caused by the cyst-forming apicomplexan parasite Besnoitia besnoiti . This parasite has domestic and wild bovids as intermediate hosts. Bovine besnoitiosis is clinically characterized by the succession of three phases: (i) the initial febrile syndrome with photophobias, epiphora, ocular and nasal discharges, arrest of rumination, anorexia, increased heart and respiratory rates; (ii) the second phase with enlargement of lymph nodes, generalized edema, and hyperesthesia of the skin and; (iii) the third phase, i.e. the chronic form, with scleroderma, hyperkeratosis, hyperpigmentation, and extensive alopecia. Despite the recovery of appetite, weight loss becomes more marked, and death can occur in about 10% of cases [ 65 , 77 ]. Bovine besnoitiosis had been previously described in Africa, the Middle East, and Europe, and was deemed to be an emergent disease in the 1990s in European countries such as Spain, Portugal, France, Italy, and Germany [ 104 ]. The life cycle of B. besnoiti remains a mystery: the definitive host is unknown and the transmission routes are poorly understood. B. besnoiti is thought to be transmitted mainly by hematophagous insects [ 65 ]. Mechanical transmission of B. besnoiti by Stomoxys has been demonstrated [ 8 , 78 ] and the existence of blood-sucking flies could be a risk factor for the rapid spread of the disease. A long-term investigation was performed in a dairy cattle farm localized in an enzootic area of besnoitiosis of South-western France between March 2008 and May 2009. The seroprevalence determined by Western blot in a cohort of 57 animals continuously present during the whole survey increased from 30% in March 2008 to 89.5% in May 2009. New positive B. besnoitia seroconversions occurred throughout the year with the highest number in spring. In addition, many seroconversions were reported in the two months before turn-out and could be associated with a high indoor activity of S. calcitrans during this period [ 77 ]. 7.3 Other protozoa Berberian [ 6 ] successfully transmitted Leishmania tropica by the bites of Stomoxys calcitrans . But to our knowledge, this experiment has never been repeated, and there is no epidemiological evidence that this occurs in the nature. 7.1 Animal trypanosomes Animal trypanosomes are major pathogens of livestock in Africa, they are mainly transmitted by tsetse flies, and can induce anemia, loss of milk and meat production as well as abortion and death. However, not only tsetse flies can transmit trypanosomes. Mechanical transmission of several Trypanosoma species has been demonstrated, notably for T. vivax , T. congolense , T. brucei , and T. evansi [ 31 – 33 , 83 , 101 ]. The relative impact of mechanical transmission is variable from one species to another. In the case of T. evansi , which is responsible for a worldwide disease called surra, and for T. vivax in Latin America, mechanical transmission is nearly the only route of transmission, and is thus very crucial [ 30 , 93 ]. In their early series of experiments, Bouet and Roubaud [ 10 ] demonstrated that T. evansi might not only be immediately mechanically transmitted by stomoxes, but may also be transmitted with delays of 24, 48, and even 72 h. These experiments demonstrated a peculiar capacity of stomoxes for delayed transmission while compared to tabanids, such delayed transmission has never been observed. The clinical signs of surra in most domesticated mammals and wild animals are characterized by fever and anemia, enlargement of the lymph nodes and spleen, followed by emaciation, edema, abortion, and cachexia [ 12 ]. Mihok et al. [ 83 ] demonstrated that S. varipes was capable of transmitting T. evansi mechanically to mice in the laboratory. Sumba et al. [ 114 ] studied the mechanical transmission of T. evansi (South American origin) and T. congolense of Kilifi DNA type (Kenyan origin) in laboratory mice using the African stable flies S. niger niger and S. taeniatus . T. congolense , one of the most important etiologic agents of African Animal Trypanosomosis, was also transmitted by S. n. niger at low rates and T. evansi was transmitted by both Stomoxys species at higher rates [ 114 ]. Two outbreaks of trypanosomosis caused by T. evansi in camels occurred in France in 2006 and in Spain in 2008. Both outbreaks were associated with the import of camels from the Canary Islands [ 55 ]. In France, trypanosomes were observed in the blood of five camels, three of them were indigenous to the farm and two had been imported. The parasite was probably transmitted by tabanids and S. calcitrans , which were abundant from July to September 2006. No parasites were observed in other animals on the farm or on neighboring farms, but some of the sheep on these farms were positive by PCR or serology [ 34 ]. Cuglovici et al. [ 25 ] assessed the epidemiological situation of bovine trypanosomosis caused by T. vivax in a dairy cattle herd in Minas Gerais state, Brazil. The highest incidence of the seroprevalence observed could be correlated with an increased population of S. calcitrans flies in that region. 7.2 Besnoitia besnoiti Bovine besnoitiosis is a protozoal disease of cattle caused by the cyst-forming apicomplexan parasite Besnoitia besnoiti . This parasite has domestic and wild bovids as intermediate hosts. Bovine besnoitiosis is clinically characterized by the succession of three phases: (i) the initial febrile syndrome with photophobias, epiphora, ocular and nasal discharges, arrest of rumination, anorexia, increased heart and respiratory rates; (ii) the second phase with enlargement of lymph nodes, generalized edema, and hyperesthesia of the skin and; (iii) the third phase, i.e. the chronic form, with scleroderma, hyperkeratosis, hyperpigmentation, and extensive alopecia. Despite the recovery of appetite, weight loss becomes more marked, and death can occur in about 10% of cases [ 65 , 77 ]. Bovine besnoitiosis had been previously described in Africa, the Middle East, and Europe, and was deemed to be an emergent disease in the 1990s in European countries such as Spain, Portugal, France, Italy, and Germany [ 104 ]. The life cycle of B. besnoiti remains a mystery: the definitive host is unknown and the transmission routes are poorly understood. B. besnoiti is thought to be transmitted mainly by hematophagous insects [ 65 ]. Mechanical transmission of B. besnoiti by Stomoxys has been demonstrated [ 8 , 78 ] and the existence of blood-sucking flies could be a risk factor for the rapid spread of the disease. A long-term investigation was performed in a dairy cattle farm localized in an enzootic area of besnoitiosis of South-western France between March 2008 and May 2009. The seroprevalence determined by Western blot in a cohort of 57 animals continuously present during the whole survey increased from 30% in March 2008 to 89.5% in May 2009. New positive B. besnoitia seroconversions occurred throughout the year with the highest number in spring. In addition, many seroconversions were reported in the two months before turn-out and could be associated with a high indoor activity of S. calcitrans during this period [ 77 ]. 7.3 Other protozoa Berberian [ 6 ] successfully transmitted Leishmania tropica by the bites of Stomoxys calcitrans . But to our knowledge, this experiment has never been repeated, and there is no epidemiological evidence that this occurs in the nature. 8. Helminths 8.1 Habronema microstoma Habronemosis caused by the nematode H. microstoma is considered to have a global distribution. Musca domestica and S. calcitrans were found to act as intermediate hosts for H. microstoma [ 130 ]. The competence of S. calcitrans as a vector of H. microstoma was demonstrated by the discovery of nematode DNA in different anatomic parts (heads, thoraces, and abdomens) of both field-collected and laboratory-reared flies [ 119 ]. The adults of H. microstoma occur on the horse stomach mucosa under a layer of mucus and can cause inflammation of the mucosa, followed by digestive disturbances or even chronic gastritis and ulceration. Ovoviviparous females of Habronema release embryonated eggs which pass into the feces. The embryonated eggs or the larvae that hatch in the fecal mass are ingested by maggots ( Musca or Stomoxys larvae), within which they develop to the infective L3 stage. The infective stage is reached when the stable fly imago emerges from the puparium. The infective larvae are deposited on the nostrils, lips, eyes, or wounds of the host when the stable flies feed. Larvae deposited around nostrils and lips are swallowed and mature in the stomach of host. Gastric habronemosis is characterized by a chronic catarrhal gastritis with symptoms of varying degrees of severity, such as anorexia/dysorexia, digestive disorders, diarrhea, progressive weight loss, ulcers, and postprandial colics [ 119 ]. Larvae deposited on mucous membranes (vulvae, prepuce, eye) or on injured tissues cannot complete their life cycle; however, they induce a local inflammatory reaction with strong eosinophilia causing cutaneous "summer sores" and/or ophthalmic habronemosis [ 118 , 130 ]. 8.2 Other helminths Mechanical transmission by stable flies is also suspected for the nematodes Dirofilaria repens (which induces subcutaneous nodules in cats and dogs) [ 73 ], Dirofilaria roemeri (which induces subcutaneous nodules in wallabies and kangaroos), and Onchocerca gibsoni (subcutaneous filaria). Associated with the dispersion of stable flies, the dissemination of pathogenic agents carried on their cuticle can also be important. Stable flies can disseminate microorganisms to many places and materials, including food for animals. They have the ability to be a mechanical vector for pathogens due to their feeding habits, as well as their great flying capacity, which may be up to 29 km in 24 h according to laboratory flight mill studies. However, field dispersal studies showed that the flies would travel at least 3 km after 6 days in search of a blood meal [ 2 ]. Adult stable flies in a given area are most likely to have originated from larval development sites within a 5 km radius of the subject cattle [ 117 ]. 8.1 Habronema microstoma Habronemosis caused by the nematode H. microstoma is considered to have a global distribution. Musca domestica and S. calcitrans were found to act as intermediate hosts for H. microstoma [ 130 ]. The competence of S. calcitrans as a vector of H. microstoma was demonstrated by the discovery of nematode DNA in different anatomic parts (heads, thoraces, and abdomens) of both field-collected and laboratory-reared flies [ 119 ]. The adults of H. microstoma occur on the horse stomach mucosa under a layer of mucus and can cause inflammation of the mucosa, followed by digestive disturbances or even chronic gastritis and ulceration. Ovoviviparous females of Habronema release embryonated eggs which pass into the feces. The embryonated eggs or the larvae that hatch in the fecal mass are ingested by maggots ( Musca or Stomoxys larvae), within which they develop to the infective L3 stage. The infective stage is reached when the stable fly imago emerges from the puparium. The infective larvae are deposited on the nostrils, lips, eyes, or wounds of the host when the stable flies feed. Larvae deposited around nostrils and lips are swallowed and mature in the stomach of host. Gastric habronemosis is characterized by a chronic catarrhal gastritis with symptoms of varying degrees of severity, such as anorexia/dysorexia, digestive disorders, diarrhea, progressive weight loss, ulcers, and postprandial colics [ 119 ]. Larvae deposited on mucous membranes (vulvae, prepuce, eye) or on injured tissues cannot complete their life cycle; however, they induce a local inflammatory reaction with strong eosinophilia causing cutaneous "summer sores" and/or ophthalmic habronemosis [ 118 , 130 ]. 8.2 Other helminths Mechanical transmission by stable flies is also suspected for the nematodes Dirofilaria repens (which induces subcutaneous nodules in cats and dogs) [ 73 ], Dirofilaria roemeri (which induces subcutaneous nodules in wallabies and kangaroos), and Onchocerca gibsoni (subcutaneous filaria). Associated with the dispersion of stable flies, the dissemination of pathogenic agents carried on their cuticle can also be important. Stable flies can disseminate microorganisms to many places and materials, including food for animals. They have the ability to be a mechanical vector for pathogens due to their feeding habits, as well as their great flying capacity, which may be up to 29 km in 24 h according to laboratory flight mill studies. However, field dispersal studies showed that the flies would travel at least 3 km after 6 days in search of a blood meal [ 2 ]. Adult stable flies in a given area are most likely to have originated from larval development sites within a 5 km radius of the subject cattle [ 117 ]. 9. Control measures of Stomoxys flies Many types of control methods have been tested for stable flies, including insecticides, biological controls, baits, and sterile insect technique [ 9 , 16 , 17 , 40 , 54 , 67 , 82 , 84 , 99 , 116 ]. As no single control method is effective in controlling stable fly populations, the use of several vector management strategies for the control of the stable flies is highly recommended. Integrated vector management relies on three tactics for successful suppression of stable flies: sanitation, biological, and chemical controls [ 7 , 75 , 96 , 128 ]. Sanitation is the most important method for reduction of stable fly populations in livestock farms. Most common larva sites are piles of decomposing vegetative material or manure, old manure under fences, and poorly drained areas. In confined animal facilities, the highest priority should be to eliminate stable fly breeding sites as much as possible. Pupal parasitoids in the family Pteromalidae (Hymenoptera) such as Spalangia spp. have a high potential for the biological control of stable flies [ 112 ]. The parasitoid wasps lay their eggs in immature stable flies. The resulting wasp offspring feed on the stable fly maggot or pupa and eventually kill it. The immature parasitoid wasps will then develop into an adult, emerge from the fly pupa, and repeat its life cycle. Although parasitoid wasps offer some measure of control they do not produce immediate results. Therefore, biological control should not be used alone, but in concert with other methods, such as sanitation. Many different traps have been used to both survey and control the fly population [ 57 , 116 ]. Stable flies are attracted to certain olfactory stimuli such as carbon dioxide, ammonia, and phenylpropanoid compounds [ 50 ]. They are also attracted to visual stimuli such as fiberglass Alsynite which reflects near UV light [ 9 ], and the blue-colored fabrics used in insecticide impregnated screens [ 51 ] or in the Nzi and Vavoua traps [ 82 ]. Experiments are now performed to evaluate the association of the ATSB (Attractive Toxic Sugar Bait) method [ 5 , 89 ] with attractive devices to control flies. The objective is to take advantage of the materials stable flies are attracted to (blue fabric or Alysnite) and sugar bait with insecticide to kill them. Experiments are also performed to identify and evaluate the efficiency of potential repellents to protect domestic animals [ 3 , 58 , 134 , 135 ]. If a stable fly problem persists, an insecticide can be used. Many compounds are available to suppress adult and larval stable fly populations. Insecticides applied as residual sprays, such as permethrin, have been applied to the sides of buildings where adult stable flies congregate. However, the persistence of residuals is not predictable over time. Sublethal exposure levels may be found less than one month after application [ 60 ] and some stable fly populations have already shown a high degree of resistance [ 102 ]. Regardless, integrated pest control should be adapted to the specific conditions of each farm, medium, area, and should be established with synergistic procedures, to get the maximum benefit, as was suggested in La Réunion [ 11 ]. 10. Conclusion Table 1 is a summary of the evidence available for incriminating stomoxes as mechanical or biological vectors of the disease agents discussed in this review. Few studies involving natural transmission or isolation of a pathogen from wild stomoxes have been done. That's why the evidence for considering stomoxes as natural vectors of some of these pathogens is meager. Nonetheless, because of their feeding habits, stomoxes are regarded as important potential mechanical vectors of various microorganisms. It is highly recommended that future research takes these questions into account. In vitro feeding of Stomoxys on membranes where they are allowed to pick up infectious disease agents, subsequent study whether the flies remain infected, where the infection retains through dissection and PCR of parts of the flies, are made possible thanks to breeding facilities. Due to its epidemiological importance, the mechanisms of regurgitation of blood by stable flies and its frequency should be further analyzed. Table 1. Disease agents associated with Stomoxys spp. Disease agent Geographic occurrence Transmission Association * References Viruses Equine infectious anemia virus (EIAV) Worldwide Mechanical Experimental and natural transmission, isolation [ 44 , 56 , 110 ] African swine fever virus (ASFV) Africa, Sardinia (Italy) Mechanical Experimental transmission [ 80 ] West Nile Fever virus (WNFV) Worldwide Mechanical Experimental transmission, isolation [ 36 , 66 ] Rift Valley Fever virus (RVFV) Africa, Middle East Mechanical Experimental transmission [ 59 ] Lumpy Skin Disease virus (LSDV) Africa, Middle East Mechanical Experimental transmission, isolation [ 22 , 68 , 80 ] Bovine Herpes Virus (BHV) Worldwide Mechanical Experimental transmission [ 49 ] Bovine Leukosis Virus (BLV) Worldwide Mechanical Experimental transmission [ 14 , 46 , 126 ] Vesicular Stomatitis Virus (VSV) America Mechanical Experimental transmission [ 39 ] Bacteria Bacillus anthracis Worldwide Mechanical Experimental and natural transmission [ 107 , 108 ] Pasteurella multocida Worldwide Mechanical Experimental transmission [ 92 ] Erysipelothrix rhusiopathiae Worldwide Mechanical Experimental transmission [ 127 ] Francisella tularensis North America, Europe, northern Africa, Middle East, Asia Mechanical Experimental transmission [ 95 , 125 ] Enterobacter sakazakii Worldwide Biological and mechanical Natural transmission, isolation, and development. [ 87 ] Dermatophilus congolensis Worldwide Mechanical Experimental and natural transmission [ 100 ] Rickettsia Anaplasma marginale Worldwide (Tropics and subtropics) Mechanical Experimental and natural transmission, isolation [ 94 , 109 ] Protozoa Trypanosoma evansi South America, North Africa, Asia, Europe Mechanical Experimental transmission [ 10 , 83 , 114 ] Trypanosoma vivax South America, Africa Mechanical Experimental transmission [ 83 ] Trypanosoma brucei Africa Mechanical Experimental transmission, isolation [ 83 , 85 ] Trypanosoma congolense Africa Mechanical [ 114 ] Besnoitia besnoiti South America, Europe, Africa, Middle East, Asia Mechanical Experimental and natural transmission [ 8 , 77 , 78 ] Leishmania tropica North Africa, Middle East, Asia Mechanical Experimental transmission [ 6 ] Helminths Habronema microstoma Worldwide Biological Experimental transmission, isolation, and development [ 119 , 130 ] * Association between disease agents and stomoxes is described as follows: isolation (agent isolated from stomoxes), development (as if stomoxes were natural intermediate host), experimental transmission (transmission of agent by unnatural mode of infection or to unnatural host), and natural transmission (transmission of agent from one natural host to another by exposure to stomoxes) according to Krinsky (1976) [ 73 ]. Recent studies carried out on trypanosomes in cattle have shown and quantified the role of tabanids in mechanical transmission. They allowed to develop mathematic model for risk assessment and to predict impact and evolution of prevalence under various circumstances [ 31 – 33 ]. Implementation of research projects on quantitative experimental studies on the capacity of stomoxes for transmission of parasites like Trypanosoma evansi , Besnoitia besnoiti , and the Blue Tongue Virus/BTV, including immediate/delayed transmission, artificially/naturally interrupted blood feedings, study of behavioral modifications and interactions host/insects, in contention/semi-liberty conditions, with a study of the behavioral modifications of hosts and vectors, in rodents, cattle, or sheep, should allow to develop a mathematical model of transmission of pathogens by stomoxes. The integration of diffusion models of pathogens by hosts (inter-herd transmission) with a synthetic model of transmission by biting insects (intra-herd transmission) will allow generating a global model of diffusion-transmission of pathogens aiming at evaluating risk and predicting disease spreading and prevalence evolution. We hope that the information given in this review will stimulate more research on vector competence and capacity and on control of those Stomoxyine flies.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8179091/

Ultra-accurate microbial amplicon sequencing with synthetic long reads

Background Out of the many pathogenic bacterial species that are known, only a fraction are readily identifiable directly from a complex microbial community using standard next generation DNA sequencing. Long-read sequencing offers the potential to identify a wider range of species and to differentiate between strains within a species, but attaining sufficient accuracy in complex metagenomes remains a challenge. Methods Here, we describe and analytically validate LoopSeq, a commercially available synthetic long-read (SLR) sequencing technology that generates highly accurate long reads from standard short reads. Results LoopSeq reads are sufficiently long and accurate to identify microbial genes and species directly from complex samples. LoopSeq perfectly recovered the full diversity of 16S rRNA genes from known strains in a synthetic microbial community. Full-length LoopSeq reads had a per-base error rate of 0.005%, which exceeds the accuracy reported for other long-read sequencing technologies. 18S-ITS and genomic sequencing of fungal and bacterial isolates confirmed that LoopSeq sequencing maintains that accuracy for reads up to 6 kb in length. LoopSeq full-length 16S rRNA reads could accurately classify organisms down to the species level in rinsate from retail meat samples, and could differentiate strains within species identified by the CDC as potential foodborne pathogens. Conclusions The order-of-magnitude improvement in length and accuracy over standard Illumina amplicon sequencing achieved with LoopSeq enables accurate species-level and strain identification from complex- to low-biomass microbiome samples. The ability to generate accurate and long microbiome sequencing reads using standard short read sequencers will accelerate the building of quality microbial sequence databases and removes a significant hurdle on the path to precision microbial genomics. Video abstract. Supplementary Information The online version contains supplementary material available at 10.1186/s40168-021-01072-3. Background Out of the many pathogenic bacterial species that are known, only a fraction are readily identifiable directly from a complex microbial community using standard next generation DNA sequencing. Long-read sequencing offers the potential to identify a wider range of species and to differentiate between strains within a species, but attaining sufficient accuracy in complex metagenomes remains a challenge. Methods Here, we describe and analytically validate LoopSeq, a commercially available synthetic long-read (SLR) sequencing technology that generates highly accurate long reads from standard short reads. Results LoopSeq reads are sufficiently long and accurate to identify microbial genes and species directly from complex samples. LoopSeq perfectly recovered the full diversity of 16S rRNA genes from known strains in a synthetic microbial community. Full-length LoopSeq reads had a per-base error rate of 0.005%, which exceeds the accuracy reported for other long-read sequencing technologies. 18S-ITS and genomic sequencing of fungal and bacterial isolates confirmed that LoopSeq sequencing maintains that accuracy for reads up to 6 kb in length. LoopSeq full-length 16S rRNA reads could accurately classify organisms down to the species level in rinsate from retail meat samples, and could differentiate strains within species identified by the CDC as potential foodborne pathogens. Conclusions The order-of-magnitude improvement in length and accuracy over standard Illumina amplicon sequencing achieved with LoopSeq enables accurate species-level and strain identification from complex- to low-biomass microbiome samples. The ability to generate accurate and long microbiome sequencing reads using standard short read sequencers will accelerate the building of quality microbial sequence databases and removes a significant hurdle on the path to precision microbial genomics. Video abstract. Supplementary Information The online version contains supplementary material available at 10.1186/s40168-021-01072-3. Introduction The characterization of bacterial species and strains directly from complex microbial samples using amplicon sequencing — in which PCR-amplified DNA fragments (amplicons) from complex genetic mixtures are sequenced — is still an ongoing challenge in microbiology in part due to short sequencing reads not containing enough information to support highly resolved phylogenetic classification. In recent years, the development of long-read sequencing technologies and concomitant advances in their cost-efficiency and accuracy has brought disruptive change to a variety of important biological applications. Long-read sequencing has largely trivialized the generation of complete and accurate de novo bacterial genomes [ 26 ], has expanded and improved the enumeration of transcriptional isoforms [ 5 , 37 , 38 ] and immune repertoires [ 8 ], and has vastly improved the detection and description of structural genetic variation [ 30 ]. Long-read sequencing has become increasingly attractive for amplicon sequencing as well [ 12 , 21 , 28 ]. Long-read amplicon sequencing approaches based on PacBio and Oxford Nanopore sequencing technologies are being developed and deployed in a wide variety of applications (Caskey 2017 [ 14 , 17 , 29 ];), but a combination of error rates, cost, and more limited availability of long-read sequencing capacity continues to impede their widespread application. Synthetic long-read (SLR) sequencing technologies are appealing because they can leverage inexpensive, accurate, and widely available short-read sequencing platforms such as those from Illumina to generate accurate long-read sequencing data. However, SLR technologies that were previously commercialized by 10x Genomics [ 40 ] and Moleculo [ 27 ] were not compatible with amplicon sequencing because they assign the same identifier to multiple DNA molecules in the same well/droplet, which is not amenable to reconstructing the sequence of single long molecules. Other SLR methods exist that utilize unique molecular identifiers (UMIs) instead of well/droplet identifiers to tag each DNA molecule with an identifier that can be read by DNA sequencing to identify each molecule, but their chemistries limit their read lengths [ 9 , 23 ] and these methods have not been commercialized. We evaluated a new commercially available long-read microbiome sequencing technology that builds upon earlier academic work in SLR sequencing [ 20 , 36 ]. Specifically, LoopSeq's SLR chemistry addresses the largest limitation of first [ 27 ] and second [ 40 ] generation SLR technologies by enabling contiguous short read coverage of single, long DNA molecules. Long DNA molecules are barcoded with UMIs that are then intramolecularly distributed throughout the molecule. After fragmentation, short reads that share the same UMI are used to reconstruct the sequence of the long molecule. Additionally, first [ 27 ] and second [ 40 ] generation SLR sequencing assigned the same well/droplet barcode to many different DNA molecules and were therefore limited to sequencing molecules with a high degree of dissimilarity, which is not compatible with microbiome amplicon sequencing (e.g., 16S sequencing). LoopSeq's technology enables the reconstruction of SLRs from mixtures of highly homologous long molecules because UMIs are specific to each input molecule. Even and deep (~30×) short read coverage along UMI barcoded molecules enables an error-correction-by-consensus mechanism that, in principle, could yield very low error rates in the reconstructed long reads. In this paper, we report on the exceptional accuracy of LoopSeq SLR sequencing in a defined mixture of known bacterial sequences (a mock community) and develop guidelines for filtering and processing LoopSeq SLR sequencing data. We compare LoopSeq full-length 16S rRNA gene amplicon sequencing results to the current gold standard of PacBio CCS (or "HiFi") sequencing on a common set of human fecal microbiome samples. After denoising, the overall community compositions measured by LoopSeq and PacBio CCS from the same fecal samples were highly concordant. However, LoopSeq achieved higher levels of long-read amplicon sequencing accuracy, and that higher accuracy was likely maintained in complex communities based on the frequencies with which inferred differences between gene variants occurred in the conserved or variable regions of the 16S rRNA gene. Finally, we show how LoopSeq full-length 16S sequencing can be used to identify CDC defined foodborne pathogen species from samples of US retail meat and to distinguish distinct strains within those species. Results Accuracy and error modes: 16S sequencing of the Zymo mock community The ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard (the Zymo mock community) consists of genomic DNA from 8 bacterial strains of the species Bacillus subtilis , Enterococcus faecalis , Escherichia coli , Lactobacillus fermentum , Listeria monocytogenes , Pseudomonas aeruginosa , Salmonella enterica , and Staphylococcus aureus . We used the LoopSeq 16S Long Read Kit (Loop Genomics, CA) to barcode and amplify the full-length 16S rRNA gene (the " Methods " section), which was then sequenced by Loop Genomics using Illumina NextSeq500 PE150. The assembled long reads were filtered to remove those that did not contain both primers, which removed ~15% of the reads. Then reads with lengths outside the expected range (1400-1600 nts) or that contained more than two expected errors according to their quality scores [ 13 , 18 ] were filtered out, removing another ~3% of the reads. The ~83% of reads that passed filtering were processed by the DADA2 method using the current 1.18 release version and default parameters (the " Methods " section) to produce a set of denoised amplicon sequence variants (ASVs) discriminated at single-nucleotide resolution [ 11 ]. We conclude that all 27 denoised ASVs represent true sequences without any residual errors, using the same evaluation approach previously described for PacBio long-read amplicon sequencing [ 12 ]. In short, 26 of the 27 denoised ASVs from the Zymo 16S rRNA data were exact matches to previously sequenced genomes of the expected species. The sole exception was a single L. fermentum ASV with one mismatch from the previously sequenced variants available in the NCBI's nt database. Multiple ASVs were detected from six of the eight mock community strains, including L. fermentum . In each case, these variants appear in the integer ratios consistent with being different alleles of the known number of 16S rRNA genes in the genomes of those strains (Figure S 1 ). No contaminant sequences (i.e., sequences originating from outside the mock community) and no false positive sequences (i.e., sequences containing uncorrected errors) were present in the denoised ASVs. LoopSeq long amplicon sequencing reads were highly accurate. In total, 94.6% of these ~1500 nt reads contained no errors at all, a larger fraction than the ~50-90% of error-free reads in standard Illumina short reads given that technology's per-base error rates of 0.1-0.24% and read lengths of 100-300 nucleotides [ 33 ]. The DADA2 denoising method [ 10 ] was used to associate error-containing LoopSeq reads to the true sequence from which they most likely originated, and the locations, type, and quality score associated with each point error were recorded (the " Methods " section, Fig. 1 ). Insertion and deletion errors were extremely rare ( 90% of LoopSeq full-length 16S reads were error free as compared to ~ 50% error-free full-length 16S PacBio CCS reads [ 12 ]. Fifty percent is a sufficiently high fraction of error-free reads for modern denoising methods to achieve single-nucleotide resolution with high accuracy, and thus the total community compositions determined after denoising full-length 16S rRNA gene sequences obtained using LoopSeq reads and PacBio CCS reads from the same human fecal samples were very similar (Fig. 4 ). However, if we consider amplicon sequencing of the entire ~5 kb rrn operon, then LoopSeq produces > 50% error-free reads, while only ~10% of PacBio CCS reads would be expected to be error-free, limiting the resolution of lower-abundance members of a sampled community. Single-nucleotide resolution with high accuracy from the entire rrn operon opens the door for population-level analysis of genetic diversity, rather than just comparisons among species, and would enhance discrimination of critical sub-species variation such as pathogen and non-pathogen clades, especially in sample types where alternative shotgun metagenomics methods are challenged by large amounts of non-target DNA. PCR amplicon chimeras, in which sequencing reads are produced, that are a combination of multiple true DNA molecules, can be particularly pernicious for the accurate reconstruction of complex communities. LoopSeq SLRs have a significant advantage over standard long-read amplicon sequencing approaches in this regard because LoopSeq SLRs are assembled from a consensus of UMI-tagged reads. As a result, chimeric molecules do not contribute to the consensus assembly unless the chimera formed at the first cycle or two of PCR causing chimeric reads to constitute a majority of the short reads for that UMI. Chimera rates are also at their lowest during early PCR cycles, further reducing the effective LoopSeq chimera rate. In standard amplicon sequencing technologies, chimeric molecules formed during all PCR cycles will be present in the final data. This potential to leverage UMIs to identify and remove SLR chimeras was also demonstrated previously in a different SLR technology [ 9 ]. We identified and described an SLR-specific structural sequencing error, the introgression, in which a long SLR is formed with an internal insertion of a short segment from another DNA molecule (Fig. 2 a). Introgressions are caused by the stochastic preponderance of reads from chimeric DNA molecules over short regions of the SLR. The rate of introgressions in LoopSeq data is low, and no introgressions were detected when typical denoising of the Zymo mock community was performed that screened out singletons. Standard quality filtering based on expected errors further reduced the fraction of introgressions in the raw data (Fig. 2 ). As LoopSeq or other SLR sequencing technologies become more widely used it may be useful to revisit the quality filtering approaches used for such data. Dips in the quality scores corresponding to introgressed LoopSeq regions suggest that sliding window quality screens may be a useful tool for such data. In this manuscript, we focused on comparing LoopSeq to the long-read sequencing technologies developed by PacBio and Oxford Nanopore (ONT), because those technologies are currently the most widely used and are already commercially available. However, an important current research direction is the marriage of UMI methods with those long-read sequencing technologies to improve their accuracy. Recently, Karst and colleagues described and evaluated such a method, and reported achieving accuracy comparable to that reported here by pairing UMIs with Oxford Nanopore sequencing, and even higher levels of accuracy from pairing UMIs and PacBio CCS sequencing [ 24 ]. We expect this general approach, if not the exact implementation in Karst et al., will prove to be an attractive option for highly accurate long-read amplicon sequencing as it continues to develop. Each of these high-fidelity long-read sequencing methods (LoopSeq SLRs, PacBio + UMIs, ONT + UMIs) are able to achieve very high accuracy (> 99.99% per-base) that can be increased further at the expense of throughput by increasing the number of reads per UMI, with the exception that ONT may experience an accuracy plateau due to continuing issues with systematic error modes [ 24 ]. It is likely that in the next few years different highly accurate long-read technologies will find unique niches within microbial genomics. For example, ONT sequencing can be advantageous for field applications of microbial genomics in which rapid diagnosis is key while LoopSeq and PacBio HiFi long reads might be more useful for applications that require high accuracy and that can be obtained within days, not hours. A balance between the cost efficiency of high-fidelity long-read sequencing methods and the value of sequencing accuracy in different applications will determine their ultimate impact. The LoopSeq data presented in this manuscript used an average of 30× Illumina short-read coverage of each SLR, which naively extrapolates to a 30× increase in per-base sequencing cost relative to short-read amplicon sequencing. However, LoopSeq works with 150 nt paired-end reads without any cost to SLR length or quality, and 150 nt reads are up to tenfold cheaper per-base than the longer 300 nt paired-end reads currently in common usage for short-read amplicon sequencing. A cost comparison with other high-fidelity long-read sequencing methods is complicated by the rapid technological progress in this area, and the future cost evolution of the short-read (LoopSeq), PacBio, and ONT sequencing technologies underlying different methods is unclear. Shallow shotgun sequencing is another alternative suitable for profiling complex microbial communities that are often performed with similar short-read library sizes (~1-2 million) as might be generated for a LoopSeq 16S rRNA gene library. If large amounts of non-target DNA are present in relevant samples, then the targeting of sequencing effort by amplicon sequencing will make LoopSeq more cost effective for community profiling, but shotgun sequencing allows additional information on functional potential to be gleaned. The rapidly increasing accuracy and length of available amplicon sequencing technologies has laid bare the limitations of commonly used taxonomic assignment methods for 16S rRNA gene data. There are fundamental limits on the taxonomic resolution available from any marker-gene sequencing approach, but the most widely used methods for taxonomic assignment from 16S sequences were developed for short-read data and often do not even attempt to make taxonomic assignments beyond the genus level. Long-read amplicon sequencing data of the accuracy achieved by LoopSeq allows for species-level assignment from 16S rRNA gene data in most cases. Even higher levels of sub-species resolution are achievable, but substantial roadblocks exist in practice due to the multi-copy nature of the rrn operon in bacteria [ 25 ]. Full-length 16S rRNA gene sequencing with single-nucleotide resolution will resolve all intragenomic variation between the 16S alleles carried by a single bacterium [ 12 , 21 ], but there is no currently automated way to reconstruct the bins containing alleles arising from a common genome. There is also no universal database that contains and labels the full complement of 16S rRNA gene alleles arising from each strain. Furthermore, many reference genomes created from short-read sequencing data do not resolve the multiple copies of the rrn operon at all. Preliminary evidence suggests that, at least in some cases, pathogenic and non-pathogenic E. coli can be distinguished from full-length 16S sequencing alone [ 12 ], but current taxonomic assignment methods do not approach that level of resolution. There is a much larger potential universe of applications for LoopSeq and other highly accurate long-read sequencing technologies beyond profiling microbial communities by sequencing the rrn operon. One topical example is viral genomic sequencing, such as that being applied to the population genetics and genomic epidemiology of the SARS-CoV-2 virus. Viral DNA exists as a tiny minority of the DNA in clinical samples, and common SARS-CoV-2 sequencing approaches rely on amplifying nearly 100 different genetic regions that are then stitched together to reconstruct a consensus genome sequence [ 16 ]. Highly accurate long-read amplicon sequencing opens the door to simpler protocols using far fewer primers, and that can also achieve long-range linkage information [ 6 , 19 , 35 ]. These same advantages in simplicity, accuracy, and long-range linkage information are driving the adoption of highly accurate long-read amplicon sequencing for the study of HIV [ 14 , 32 ], HLA/MHC [ 22 , 34 , 39 ], and oncogene diversity in solid tumors [ 15 ]. Conclusion Three aspects of microbial genomics will have significant bearing on bringing about a future of precision microbiology: the (1) accuracy of reading microbial genomes, the (2) discriminatory power of microbial sequencing reads, largely determined by read lengths, and the (3) quality of microbial sequence databases. Improvements in accuracy and length will feed directly into building better databases and generate a positive feedback loop that will eventually trivialize microbial identification and characterization. In this manuscript, we showed how short-read sequencers can be used to generate microbial DNA reads with a combination of length and accuracy that matches and surpasses currently available methods. This LoopSeq technology leverages already widely available short read sequencers and is commercially supported, a combination of attributes that could accelerate the uptake of accurate long-read sequencing in general. Amplicon sequencing that is an order-of-magnitude longer and an order-of-magnitude more accurate than the Illumina short-read standard is available today. We look forward to the ways this technology will be applied in the future. Methods Samples and DNA extraction Zymo mock community The ZymoBIOMICS™ Microbial Community DNA Standard (P/N: D6306, Lot ZRC190811) was obtained from the manufacturer Zymo Research (Irvine, CA). The Zymo mock community contains genomic DNA from eight phylogenetically diverse bacteria, and two yeast strains not amplified by our 16S rRNA gene amplicon sequencing protocol. Note that five strains in ZymoBIOMICS™ standards were replaced with similar strains in Lot ZRC190633. The sample analyzed here is from a post-replacement lot. Fungal isolates Extracted and purified genomic DNA from the following six fungal isolates were obtained from the ATCC: Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen (Catalog Number ATCC 201389D-5), Aspergillus oryzae var. oryzae (Catalog Number ATCC 42149D-2), Candida albicans ( Robin ) Berkhout (Catalog Number ATCC10231D-5), Trichoderma reesei Simmons (Catalog Number ATCC 13631D-2), Kluyveromyces lactis ( Dombrowski ) van der Walt (Catalog Number ATCC 8585D-5), and Penicillium chrysogenum Thom (Catalog Number ATCC 10106D-2). Bacterial isolates Extracted and purified genomic DNA for the following three bacterial isolates were obtained from the ATCC: Nitrosomonas europaea (Catalog Number ATCC 19718D-5 ): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL954747 , Desulfovibrio desulfuricans (Catalog Number ATCC 27774D-5 ): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP001358 , and Salinispora tropica (Catalog Number ATCC CNB-440D-5 ): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000667 . Human fecal samples Genomic DNA was obtained from three human fecal samples previously analyzed in a publication on PacBio long-read amplicon sequencing [ 12 ]. The aliquots of DNA analyzed here were extracted as part of, and as described in, that publication. Retail meat rinse samples Two hundred fifty milliliters buffered peptone water (BPW) was added to > 50 g of retail meat (bone-in, skin on chicken breast; ground turkey, ground beef 50 g of retail meat (bone-in, skin on chicken breast; ground turkey, ground beef 50 g of retail meat (bone-in, skin on chicken breast; ground turkey, ground beef < 85% lean; or bone-in pork chop), and samples were shaken at room temperature for 15 min at 250 rpm. Meat samples were incubated 18 h in BPW at 37 °C. Two milliliters rinsate was centrifuged at 1000× g for 5 min, and supernatant was discarded. DNA was isolated from pellets using Lucigen MasterPure™ Gram Positive DNA Purification Kit according to manufacturer protocols. DNA was quantified by Qubit dsDNA HS Assay Kit assessed for purity using a Nanodrop 2000c (ThermoFisher Scientific). Sequencing library preparation Sequencing libraries were prepared from extracted genomic DNA with the commercially available LoopSeq kits from Loop Genomics (protocols available at loopgenomics.com ). Synthetic long reads (SLRs) were constructed from the short-read sequencing reads using the standard Loop Genomics informatics pipeline. The process involves attaching two DNA tags: one Unique Molecular Identifier (UMI) to each unique "parent" molecule and one sample-specific tag (i.e., a sample index) equally to all molecules in the same sample. Barcoded molecules are amplified, multiplexed, and each UMI is distributed intramolecularly to a random position within each parent molecule. Molecules are then fragmented into smaller units at the position of each UMI, creating a library of UMI-tagged fragments with an average length of 400 bp compatible with an Illumina sequencing platform run in PE150 mode. Full-length 16S sequencing For each LoopSeq Microbiome 16S kit, up to 24 samples were processed in multiplex and ~12,000 1.5 kb molecules were sequenced per sample (~300 k molecules from a complete kit run). 100-150M PE150 reads (50-75M clusters passing filter) were used for each sequencing run, yielding ~20 gigabases (Gb) of data. The complete sample preparation and sequencing protocol can be found in this link . Full-length 18S-ITS sequencing For each LoopSeq Mycobiome 18S-ITS kit, up to 24 samples were processed in multiplex and ~12,500~2.3 kb molecules were sequenced per sample (~300 k molecules from a complete kit run). 175-250M PE150 reads (87.5-125M clusters passing filter) were used for each sequencing run, yielding ~35 gigabases (Gb) of data. The complete sample preparation and sequencing protocol with sequencing instructions can be found in this link . Bacterial whole genome sequencing For each LoopSeq Bacterial Genome kit, up to 8 samples were processed in multiplex and ~40,000~5 kb molecules were sequenced per sample (~320 k molecules per library). 320M PE150 reads (160M clusters passing filter) were used for each sequencing run, yielding ~50 gigabases (Gb) of data. The complete sample preparation and sequencing protocol with sequencing instructions can be found in this link . Full-length 16S sequencing For each LoopSeq Microbiome 16S kit, up to 24 samples were processed in multiplex and ~12,000 1.5 kb molecules were sequenced per sample (~300 k molecules from a complete kit run). 100-150M PE150 reads (50-75M clusters passing filter) were used for each sequencing run, yielding ~20 gigabases (Gb) of data. The complete sample preparation and sequencing protocol can be found in this link . Full-length 18S-ITS sequencing For each LoopSeq Mycobiome 18S-ITS kit, up to 24 samples were processed in multiplex and ~12,500~2.3 kb molecules were sequenced per sample (~300 k molecules from a complete kit run). 175-250M PE150 reads (87.5-125M clusters passing filter) were used for each sequencing run, yielding ~35 gigabases (Gb) of data. The complete sample preparation and sequencing protocol with sequencing instructions can be found in this link . Bacterial whole genome sequencing For each LoopSeq Bacterial Genome kit, up to 8 samples were processed in multiplex and ~40,000~5 kb molecules were sequenced per sample (~320 k molecules per library). 320M PE150 reads (160M clusters passing filter) were used for each sequencing run, yielding ~50 gigabases (Gb) of data. The complete sample preparation and sequencing protocol with sequencing instructions can be found in this link . Short read coverage of LoopSeq synthetic long reads (SLRs) In general, greater short-read coverage of each SLR will result in a higher fraction of complete SLRs (i.e., SLRs that span the full targeted amplicon) and a lower error rate. Here, we evaluated LoopSeq data with an average of 300 150bp reads per full-length 16S read (30× coverage), which is the recommended short-read coverage in the manufacturer protocols. The minimal number of 150bp short reads required to assemble a full-length 1.5 kb 16S rRNA gene using the LoopSeq SPADES workflow is 30 (3× coverage), but this would result in a significantly higher per-base error rate. Correspondingly, higher than 30× short-read coverage per SLR would be expected to produce per-base error rates even lower than those reported here. Assembly of SLRs Loop Genomics maintains a cloud-based platform for processing raw short-reads prepared with a LoopSeq kit into assembled SLR contigs. Within this pipeline, short-reads are trimmed using Trimmomatic [ 7 ] to remove adapter sequences before they are de-multiplexed based on their Loop Sample Index, which groups them by the sample from which they originated. Within a grouped sample, short-reads are next binned by UMI such that those with the same UMI are processed collectively through SPADES [ 4 ]. Reads sharing the same UMI are derived from the same original molecule, with each read covering a different region of the sequence. With enough short-read data to cover the full length of a long DNA molecule, it is possible to assemble the original long DNA molecule by linking overlapping short-reads through their shared sequence, and then arranging the reads in the correct order to rebuild the original 16S/18S-ITS/Genomic molecule sequence. Assembly attempts with fewer reads result in shorter SLRs with lower accuracy. Amplicon bioinformatics The raw LoopSeq synthetic long reads (SLRs) were subjected to further quality filtering, denoising, and chimera removal using the dada2 R package, largely following the long-read workflow previously established for PacBio long-read amplicon sequencing [ 12 ]. Briefly, SLRs were screened for the presence of both forward and reverse primers of the full length 16S gene, and truncated to the region between those primers. Primer-free sequences were filtered based on the total expected errors (Flvyberg and [ 18 ]). The relationship between the quality scores and the error rates was learned from the data, and the denoised amplicon sequence variants (ASVs) were inferred using the DADA2 algorithm [ 10 ]. Standard data processing used the default parameters for long-reads described in [ 12 ]. High-sensitivity parameters appropriate for LoopSeq data were also developed and used in several analyses. The key differences between the high-sensitivity and default parameters were that the probability threshold for detecting new ASVs was made less stringent (OMEGA_A=1e−10), and the option to directly detect singleton sequences was enabled (DETECT_SINGLETONS=TRUE). Characterizing synthetic long-reads by error type After screening for and removing primers, a sliding window comparison was made between every synthetic long-read (SLR) present in the Zymo mock community data and the 27 "reference" sequences corresponding to the unique full-length 16S rRNA gene alleles present in each mock community strain. For each window of 50 nts (step size of 10 nts), the most similar reference sequence(s) were recorded, and a strain-level assignment for that SLR-window was made if all of the most similar reference sequences belonged to the same strain. Otherwise, no strain-level assignment was made for that window. Two types of structural errors — chimeras and introgressions — were assigned based on the results of the sliding window comparison. A chimera assignment was made if the best match to the left-hand side and the right-hand side of the SLR were from different strains. An introgression assignment was made if an internal segment was assigned to a different strain than the rest of the SLR. Windows in which no strain assignment was made were ignored. More complex patterns (e.g., SLRs that contained windows assigned to three or more different strains) were designated as complex errors. Finally, SLRs that had a consistent strain-level assignment throughout, but that had up to three mismatches with the closest reference sequence, were assigned as point errors. Comparing LoopSeq and PacBio 16S sequences The currently recommended 16S primer sets used in the LoopSeq and PacBio sequencing reported here are nearly identical. The PacBio forward primer was "AGRGTTYGATYMTGGCTCAG" and the PacBio reverse primer was "RGYTACCTTGTTACGACTT." The LoopSeq forward primer was "AGAGTTTGATCMTGGC" and the reverse primer was "TACCTTGTTACGACTT." These primer sets amplify nearly identical amplicons, up to a 4 nucleotide difference between the extent of the PacBio and LoopSeq forward primer sequences. As a result, we were able to directly merge the sequences generated by these two different technologies after trimming 4 base pairs off the start of the LoopSeq reads. Assessing conserved/variable status of substitutions The DADA2 algorithm provides a complete description of the nucleotides differences that distinguish each ASV from the "sibling" ASV from which it was divided. The ssu-align method ( http://eddylab.org/software/ssu-align/ ) was used to align each "sibling" ASV to a model for the bacterial 16S rRNA gene, and thereby to classify each nucleotide in the "sibling" ASV as either conserved or variable. Together, these two sources of information allowed the distinguishing substitutions for each ASV identified by DADA2 to be classified as occurring in conserved or variable positions. The null expectation of the ratio of conserved to variable positions was determined by randomizing the positions of distinguishing substitutions. Species assignment for potential foodborne pathogens Six meat samples were non-randomly chosen to ensure multiple foodborne pathogen species were present from a broader library of foodborne pathogen surveillance samples collected as part of the NARMS Retail Meat project. Species-level assignments were made by taking a consensus of BLAST results for each ASV. That is, sequences were BLAST-ed against nt, excluding uncultured/environmental accessions. The species designations of all BLAST hits sharing the top score were collated. If all top-hit species designations agreed, a species assignment was made. Accessions with no species designation were ignored. Code availability and reproducible analysis Rmarkdown code to reproduce the results described in this paper is available at https://github.com/benjjneb/LoopManuscript Supplementary Information Additional file 1: Figure S1. The abundances of all ASVs identified by LoopSeq and default DADA2 in the Zymo mock community. All abundances are scaled to the abundance of the corresponding genome in the amplified 16S rRNA gene data. The near-integer values of all genome-scaled abundances are consistent with each ASV representing a unique allele present in the multiple copies of the 16S rRNA gene present in the genomes of these strains. Additional file 1: Figure S1. The abundances of all ASVs identified by LoopSeq and default DADA2 in the Zymo mock community. All abundances are scaled to the abundance of the corresponding genome in the amplified 16S rRNA gene data. The near-integer values of all genome-scaled abundances are consistent with each ASV representing a unique allele present in the multiple copies of the 16S rRNA gene present in the genomes of these strains.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1326424/

The order of rafts

Summary Conference on Microdomains, Lipid Rafts and Caveolae

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7135105/

Occupational Health Update

Health care personnel are commonly exposed to infectious agents via sharp injuries (eg, human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, and hepatitis C virus), direct patient care (eg, pertussis and meningococcus), and the contaminated environment (eg, Clostridium difficile ). An effective occupational program is a key aspect of preventing acquisition of an infection by offering the following: (1) education of health care personnel regarding proper handling of sharps, early identification and isolation of potentially infectious patients, and hand hygiene; (2) assuring immunity to vaccine-preventable diseases; and, (3) immediate availability of a medical evaluation after a nonprotected exposure to an infectious disease. Key points • An effective occupational program is a key aspect of preventing the acquisition of an infection by health care providers through pre-exposure assessment of immunity to vaccine-preventable diseases and immediate access to medical evaluation for postexposure prophylaxis (PEP) after exposure to a communicable disease. • All health care providers should be immune to mumps, measles, rubella, varicella, pertussis, and influenza. Health care providers with the potential for blood or body fluid exposure should also be immune to hepatitis B. • PEP is available after exposure to several diseases, including hepatitis A, hepatitis B, HIV, measles, pertussis, invasive meningococcal infection, and syphilis. • Health care personnel (HCP) with certain communicable disease need to be evaluated for work restrictions or furlough. Introduction Health care is the fastest-growing sector of the US economy, employing more than 18 million persons. 1 HCP face a range of noninfectious hazards on the job, including back injuries, strains and sprains, latex allergy, violence, and stress. 1 HCP are also commonly exposed to infectious agents via sharp injuries (eg, hepatitis C virus [HCV], hepatitis B virus [HBV], and human immunodeficiency virus [HIV]), direct patient care (eg, respiratory viruses, gastrointestinal pathogens, and pertussis), and the contaminated environment (eg, Clostridium difficile ). Cases of nonfatal occupational injury and illness among HCP are among the highest of any industry sector. 1 The risks and methods preventing occupational acquisition of infection by HCP have been reviewed. 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 Minimizing the risk of disease acquisition is based on 6 key recommended practices: (1) proper training of HCP at initiation of health care practice and annually (eg, infection control practices and sharp injury prevention); (2) immunity to vaccine-preventable diseases 2 , 6 , 8 , 9 , 10 , 11 ; (3) evaluation of HCP who were exposed to communicable diseases for receipt of PEP 2 , 12 , 13 , 14 ; (4) adherence to standard precautions when providing patient care, 15 especially the performance of appropriate hand hygiene before and after patient care 16 , 17 , 18 ; (5) rapid institution of appropriate isolation precautions for patients with a known or suspected communicable disease 15 , 19 , 20 ; and (6) proper use of personal protective equipment, such as masks, N95 respirators, eye protection, and gowns when caring for patients with potentially communicable diseases. 15 , 21 Prevention of laboratory-acquired infection requires adherence to recommended administrative protocols (eg, no eating, drinking, or smoking in areas where microbiologic or pathologic samples are processed), engineering controls (eg, containment hoods), personal protective equipment (eg, N95 masks when culturing Mycobacterium tuberculosis ), and appropriate immunizations. 22 , 23 Definitions HCP refers to all paid and unpaid persons providing services in health care settings who have the potential for exposure to patients and/or infectious materials, including body substances, contaminated medical supplies and equipment, contaminated environmental surfaces, or contaminated air. These HCP may include but are not limited to those listed in Box 1 . In general, HCP who have regular or frequent contact with patients, body fluids, or specimens have a higher risk of acquiring or transmitting infections than do HCP who have only brief contact with patients and their environment (eg, beds, food trays, and medical equipment). All HCP who work within the confines of a health care facility, however should be covered by the occupational health service (OHS) and receive appropriate screening and pre-exposure prophylaxis even if they do not provide direct patient care because they frequently interact with HCP providing direct care and are, therefore, at risk for acquiring or transmitting infectious pathogens. Box 1 Health care personnel whose care should be covered by an occupational health service • Emergency medical service personnel • Nurse and nursing assistants • Physicians and dentists • Technicians • Therapists (eg, occupational health, physical, and respiratory care) • Pharmacists • Students and trainees • Contractual staff not employed by the health care facility • Persons not directly involved in patient care (eg, clerical, dietary, housekeeping, laundry, security, maintenance, administrative, billing, volunteers, laboratory, and mortuary) Health care settings refers to locations where health care is provided and includes, but is not limited to, facilities that provide acute care, long-term care, assisted living, rehabilitation, home health, dialysis, and ambulatory surgery. It also includes vehicles that transport patients (eg, ambulances, medical helicopters, and planes). Occupational health programs refer to formal, well-designed, organized plans that provide OHSs to HCP. Most commonly, OHSs are provided onsite within the health care facility in which HCP are performing patient care but may also be provided offsite. Occupational health programs should include a variety of activities designed to minimize the risk for HCP to acquire an infectious disease, to evaluate HCP with a potential exposure to a communicable disease, and to evaluate HCP with a communicable disease ( Box 2 ). Box 2 Components of an occupational health service for health care personnel At initial of employment or patient care • Evaluation for ability to perform job functions • Screen for illicit drugs • Medical evaluation of selected HCP ○ Department of transportation (required for use of certain motor vehicles) ○ Flight physical (required of pilots) ○ Police/security for use of weapons • Review of immunity to vaccine-preventable diseases (see Tables 1 and 2 ) • Evaluation for tuberculosis ○ Symptom review for active tuberculosis ○ Testing for latent tuberculosis (TST or IGRA) • Allergy screening for common health care–associated products ○ Latex/natural rubber, germicides (antiseptics and disinfectants) • Counseling for pregnant or immunocompromised personnel (voluntary) • Education ○ Fire and electrical safety ○ Prevention of sharps injury ○ Appropriate hand hygiene and proper use of personal protective equipment ○ Workplace violence ○ Disaster planning: weather, bomb threats, biothreats, chemical spills ○ Reporting infectious disease exposures, injuries, illnesses ○ OHSA required (if applicable): blood-borne pathogens, tuberculosis/respiratory protection Annual • Evaluation for tuberculosis • Review of immunity to vaccine-preventable diseases ○ Influenza immunization • Miscellaneous ○ Hearing evaluation if part of OSHA-required hearing conservation program ○ Test for color blindness if performing high level disinfection • Education ○ OHSA required (if applicable): blood-borne pathogens, tuberculosis/respiratory protection ○ Others as recommended/required by health care facility When needed • Evaluation for possible communicable disease ○ Consideration for treatment and job restriction/furlough if disease poses threat to patients or other HCP • Evaluation for PEP ○ Consideration for treatment and job restriction/furlough if disease poses threat to patients or other HCP • Evaluation of injured personnel (eg, strains, sprains, and lacerations) ○ Provide first aid ○ Refer to emergency department or specialize clinic for severe injuries ○ Provide long-term care ○ Communicate with workers' compensation department • Return to work evaluation for non–work-related injuries/illnesses • Fit for duty examination (may include drug and alcohol testing) Abbreviations: IGRA, interferon gamma release assay; TST, tuberculin skin test. Occupational health programs should be aware of appropriate guidelines from the Centers for Disease Control and Prevention and professional organizations. They should adhere to appropriate state and federal laws and regulations. Specific regulations promulgated by the US Occupational Health and Safety Administration (OSHA) related to HCP include Bloodborne Pathogens (1910.1030) 24 and Tuberculosis/Respiratory Protection (1910.134). 25 The federal Needlestick Safety and Prevention Act (HR 5178), which was enacted in 2000, requires the use of safety engineered devices whenever possible to reduce the likelihood of sharp injuries. 26 Pre-exposure screening and immunizations Pre-exposure Screening All new HCP should undergo a new personnel orientation. As part of the orientation process, new HCP should undergo screening and education directed at reducing the risk of acquisition of infection diseases by health care providers (see Box 2 ). All information obtained should be entered into an electronic database. Immunizations General recommendations regarding vaccination of HCP have been published by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2 the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 8 , 27 , 28 the American Academy of Pediatrics (AAP), 11 and the Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology (APIC). 10 The most recent ACIP recommendations, which are summarized yearly, should always be consulted. 28 It is recommended that all HCP be immune to mumps, measles, rubella, varicella, pertussis, and influenza. 2 , 8 , 10 , 27 , 28 Depending on the vaccine-preventable disease, immunity may be assured by several different measures ( Table 1 ). HCP who are not immune should receive appropriate immunization(s) ( Table 2 ). Even if HCP are considered immune to a vaccine-preventable disease transmitted by the droplet (pertussis, invasive meningococcal infection, mumps, or rubella) or airborne route (varicella), they should wear a mask (don prior to entering the room) while providing care to a patient with one of these disease because immunization is not 100% effective in preventing infection. Table 1 Methods of demonstrating proof of immunity of health care personnel Vaccine Birth Before 1957 Physician Diagnosis Positive Serology Self-Report Documented Appropriate Vaccine Series a Mumps (MMR) Yes b Yes d Yes No Yes Measles (MMR) Yes b Yes c Yes No Yes Rubella (MMR) Yes b , c No Yes No Yes Varicella No Yes Yes Yes e Yes Hepatitis B No — ≥10 mIU/mL f No Yes Pertussis (Tdap) No No No No Yes Influenza No No No No Yes Yes in any column is acceptable evidence of immunity. Greater than 96% of HCP born before 1957 were demonstrated to be immune to measles, mumps or and rubella (2006–2008). 118 a Written documentation (ie, signed by a health care provider). b Consider immunization of HCP born before 1957; recommend during an outbreak. c All HCP of childbearing potential should be immunized. d Requires laboratory confirmation of infection. e Based on published literature: greater than 97% of HCP born before 1980 were demonstrated to be immune to varicella in 2014. 119 f Obtain anti-HBs titer, 1 to 2 months post last vaccine dose; if immunization remote and anti-HBs titer not available, see text for management. Adapted from Weber DJ, Rutala WA, Schaffner W. Immunization for vaccine-preventable diseases: why aren't we protecting our students? Infect Contr Hosp Epidemiology 2011;32:912–4. Table 2 Immunizations recommended for nonimmune health care personnel Vaccine Health Care Personnel Comments Mumps All (2 doses) Provide as MMR Measles All (2 doses) Provide as MMR Rubella All (1 dose) Provide as MMR Varicella All (2 doses) — Hepatitis B HCP with potential exposure to blood or contaminated body fluids (3 doses) — Meningococcal (serogroups A, C, Y, W) Clinical microbiologists (1 dose; booster every 5 y) Use conjugate vaccine for HCP 18–54 y of age and polysaccharide vaccine for HCP ≥55 y of age Meningococcal (serogroup B) Clinical microbiologists (2 doses) — Tdap All (1 dose; no boosters recommended) Especially important for HCP who have contact with children Influenza All (1 dose each year) HCP who care for severely immunocompromised persons who require care in a protected environment should receive IIV or RIV; HCP who receive LAIV should avoid providing care for severely immunocompromised persons (ie, persons receiving care in "protected" hospital unit, such as BMTU) for 7 d after immunization. Abbreviations: BMTU, bone marrow transplant unit; IIV, inactivated influenza vaccine; RIV, recombinant influenza vaccine. All HCP with potential exposure to blood or body fluids should be immune to hepatitis B. Influenza vaccine should be offered to all HCP yearly. In the past few years, editorials and commentaries have recommended that yearly influenza immunization (unless contraindicated) should be a condition of employment for HCP. 29 , 30 , 31 In February 2012, the National Vaccine Advisory Committee issued a statement that provided recommendations on how to achieve the Healthy People 2020 annual influenza vaccine coverage goal (90%) for HCP; for facilities that have implemented the recommended initial strategies but have "not consistently achieved the Healthy People goal for vaccination coverage of HCP in an efficient and timely manner," it was recommended that they should "strongly consider an employer requirement for influenza immunization." 32 HCP should be provided vaccines that are recommended for adults, 28 such as human papillomavirus, herpes zoster (HZ), and pneumococcal vaccines, or referred to their local medical provider. In special circumstances, HCP and laboratory personnel and researchers should be offered immunization with other vaccines, including polio, rabies, hepatitis A, vaccinia (smallpox), and anthrax ( Box 3 ). In addition, HCP who are traveling outside the United States for work-related activities should be evaluated and provided CDC recommended immunizations, such as typhoid, cholera, and Japanese encephalitis. 33 , 34 Box 3 Special use vaccines • Anthrax: PEP, research, biothreat attack • Diphtheria (Tdap): Outbreak • Hepatitis A: PEP, outbreak, travel • Hepatitis B: PEP, travel • Measles (MMR): PEP, outbreak • Meningococcal serotypes A, C, W, Y: outbreak, travel • Meningococcal serotype B: outbreak • Mumps (MMR): outbreak • Pertussis (Tdap): outbreak • Poliomyelitis: research, outbreak • Rabies: PEP, research, travel • Rubella (MMR): outbreak • Smallpox (Vaccinia): PEP, research, biothreat attack • Tetanus (Tdap or Td): PEP • Varicella: PEP, outbreak • Vaccinia (smallpox): PEP, research, biothreat attack Additional vaccines may be recommended for researchers or travel, such as yellow fever, Japanese encephalitis, cholera, and so forth. Abbreviation: PEP, postexposure prophylaxis. Immunocompromised HCP require special consideration in the provision of immunizations. 8 , 27 , 28 , 35 First, live, attenuated virus vaccines (eg, measles-mumps-rubella [MMR] vaccine; varicella vaccine; and live, attenuated influenza vaccine [LAIV]) may be contraindicated. Second, vaccines not routinely recommended may be indicated (eg, pneumococcal, meningococcal, Haemophilus influenzae type b). Third, higher antigen doses (eg, hepatitis B vaccine in people with end-stage renal disease), additional doses of vaccine (eg, rabies vaccine in immunocompromised persons), or postimmunization serologic evaluation may be indicated (eg, antibody to hepatitis B surface antigen [anti-HBs] titer after hepatitis B vaccine or antibody response to rabies vaccine) because immunization of immunocompromised people may elicit a lower antibody response. Finally, such personnel should be individually evaluated for reassignment (with the consent of the employee) depending on their job duties. Caring for an immunocompromised patient is not a contraindication to receipt of a live, attenuated vaccine, although HCP receiving LAIV should not work in a protected environment (eg, stem cell transplant unit) for 7 days postimmunization. 28 , 36 Pregnant HCP also require special consideration in the provision of immunizations. The risks from immunization during pregnancy are largely theoretic. 27 The benefit of immunization among pregnant women usually outweighs the potential risks for adverse reactions, especially when the risk for disease exposure is high, infection would pose a special risk to the mother or fetus, and the vaccine is unlikely to cause harm. 27 , 28 , 37 , 38 , 39 , 40 Furthermore, newer information continues to confirm the safety of vaccines given inadvertently during pregnancy. Ideally, women of childbearing age, including HCP, should have been immunized against measles, mumps, rubella, varicella, tetanus, diphtheria, pertussis, meningococcus, polio, hepatitis A, and hepatitis B as children or adolescents before becoming pregnant. Because this may not have occurred, however, it is especially important that all HCP be screened for immunity to vaccine-preventable diseases. Nevertheless, live, attenuated vaccines should be provided only to nonpregnant HCP and deferred for pregnant women. The ACIP has recommended that "healthcare personnel should administer [tetanus toxoid, reduced diphtheria toxoid, and acellular pertussis] Tdap during all pregnancies, preferably during the third or late second trimester (after 20 weeks' gestation)." If not administered during pregnancy, Tdap should be administered immediately postpartum. Women who are pregnant during respiratory virus season should receive inactivated influenza immunization. 28 There is no convincing evidence of risk from immunizing pregnant women with other inactivated virus or bacterial vaccines, or toxoids. Susceptible pregnant women at high risk for specific infections should receive, as indicated, the following vaccines: hepatitis A, hepatitis B, pneumococcal polysaccharide, meningococcal, rabies, and poliovirus (inactivated) (see Box 3 ). 27 The indications for use of immunoglobulin preparations are the same in pregnant and nonpregnant women. Breastfeeding does not adversely affect the response to immunization and is not a contraindication for any of the currently routinely recommended vaccines. Before the administration of any vaccine, HCP should be evaluated for the presence of condition(s) that are listed as a vaccine contraindication or precaution. 27 If such a condition is present, the risks and benefits of vaccination need to be carefully weighed by the health care provider and the patient. The most common contraindication is a history of an anaphylactic reaction to a previous dose of the vaccine or to a vaccine component. Factors that are not contraindications to immunization include the following: household contact with a pregnant woman; breastfeeding; reaction to a previous vaccination, consisting only of mild to moderate local tenderness, swelling, or both, or fever less than 40.5°C; mild acute illness with or without low-grade fever; current antimicrobial therapy (except for oral typhoid vaccine) or convalescence from a recent illness; personal history of allergies except a history of an anaphylactic reaction to a vaccine component; and family history of allergies, serious adverse reactions to vaccination, or seizures. 27 Pre-exposure Screening All new HCP should undergo a new personnel orientation. As part of the orientation process, new HCP should undergo screening and education directed at reducing the risk of acquisition of infection diseases by health care providers (see Box 2 ). All information obtained should be entered into an electronic database. Immunizations General recommendations regarding vaccination of HCP have been published by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2 the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 8 , 27 , 28 the American Academy of Pediatrics (AAP), 11 and the Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology (APIC). 10 The most recent ACIP recommendations, which are summarized yearly, should always be consulted. 28 It is recommended that all HCP be immune to mumps, measles, rubella, varicella, pertussis, and influenza. 2 , 8 , 10 , 27 , 28 Depending on the vaccine-preventable disease, immunity may be assured by several different measures ( Table 1 ). HCP who are not immune should receive appropriate immunization(s) ( Table 2 ). Even if HCP are considered immune to a vaccine-preventable disease transmitted by the droplet (pertussis, invasive meningococcal infection, mumps, or rubella) or airborne route (varicella), they should wear a mask (don prior to entering the room) while providing care to a patient with one of these disease because immunization is not 100% effective in preventing infection. Table 1 Methods of demonstrating proof of immunity of health care personnel Vaccine Birth Before 1957 Physician Diagnosis Positive Serology Self-Report Documented Appropriate Vaccine Series a Mumps (MMR) Yes b Yes d Yes No Yes Measles (MMR) Yes b Yes c Yes No Yes Rubella (MMR) Yes b , c No Yes No Yes Varicella No Yes Yes Yes e Yes Hepatitis B No — ≥10 mIU/mL f No Yes Pertussis (Tdap) No No No No Yes Influenza No No No No Yes Yes in any column is acceptable evidence of immunity. Greater than 96% of HCP born before 1957 were demonstrated to be immune to measles, mumps or and rubella (2006–2008). 118 a Written documentation (ie, signed by a health care provider). b Consider immunization of HCP born before 1957; recommend during an outbreak. c All HCP of childbearing potential should be immunized. d Requires laboratory confirmation of infection. e Based on published literature: greater than 97% of HCP born before 1980 were demonstrated to be immune to varicella in 2014. 119 f Obtain anti-HBs titer, 1 to 2 months post last vaccine dose; if immunization remote and anti-HBs titer not available, see text for management. Adapted from Weber DJ, Rutala WA, Schaffner W. Immunization for vaccine-preventable diseases: why aren't we protecting our students? Infect Contr Hosp Epidemiology 2011;32:912–4. Table 2 Immunizations recommended for nonimmune health care personnel Vaccine Health Care Personnel Comments Mumps All (2 doses) Provide as MMR Measles All (2 doses) Provide as MMR Rubella All (1 dose) Provide as MMR Varicella All (2 doses) — Hepatitis B HCP with potential exposure to blood or contaminated body fluids (3 doses) — Meningococcal (serogroups A, C, Y, W) Clinical microbiologists (1 dose; booster every 5 y) Use conjugate vaccine for HCP 18–54 y of age and polysaccharide vaccine for HCP ≥55 y of age Meningococcal (serogroup B) Clinical microbiologists (2 doses) — Tdap All (1 dose; no boosters recommended) Especially important for HCP who have contact with children Influenza All (1 dose each year) HCP who care for severely immunocompromised persons who require care in a protected environment should receive IIV or RIV; HCP who receive LAIV should avoid providing care for severely immunocompromised persons (ie, persons receiving care in "protected" hospital unit, such as BMTU) for 7 d after immunization. Abbreviations: BMTU, bone marrow transplant unit; IIV, inactivated influenza vaccine; RIV, recombinant influenza vaccine. All HCP with potential exposure to blood or body fluids should be immune to hepatitis B. Influenza vaccine should be offered to all HCP yearly. In the past few years, editorials and commentaries have recommended that yearly influenza immunization (unless contraindicated) should be a condition of employment for HCP. 29 , 30 , 31 In February 2012, the National Vaccine Advisory Committee issued a statement that provided recommendations on how to achieve the Healthy People 2020 annual influenza vaccine coverage goal (90%) for HCP; for facilities that have implemented the recommended initial strategies but have "not consistently achieved the Healthy People goal for vaccination coverage of HCP in an efficient and timely manner," it was recommended that they should "strongly consider an employer requirement for influenza immunization." 32 HCP should be provided vaccines that are recommended for adults, 28 such as human papillomavirus, herpes zoster (HZ), and pneumococcal vaccines, or referred to their local medical provider. In special circumstances, HCP and laboratory personnel and researchers should be offered immunization with other vaccines, including polio, rabies, hepatitis A, vaccinia (smallpox), and anthrax ( Box 3 ). In addition, HCP who are traveling outside the United States for work-related activities should be evaluated and provided CDC recommended immunizations, such as typhoid, cholera, and Japanese encephalitis. 33 , 34 Box 3 Special use vaccines • Anthrax: PEP, research, biothreat attack • Diphtheria (Tdap): Outbreak • Hepatitis A: PEP, outbreak, travel • Hepatitis B: PEP, travel • Measles (MMR): PEP, outbreak • Meningococcal serotypes A, C, W, Y: outbreak, travel • Meningococcal serotype B: outbreak • Mumps (MMR): outbreak • Pertussis (Tdap): outbreak • Poliomyelitis: research, outbreak • Rabies: PEP, research, travel • Rubella (MMR): outbreak • Smallpox (Vaccinia): PEP, research, biothreat attack • Tetanus (Tdap or Td): PEP • Varicella: PEP, outbreak • Vaccinia (smallpox): PEP, research, biothreat attack Additional vaccines may be recommended for researchers or travel, such as yellow fever, Japanese encephalitis, cholera, and so forth. Abbreviation: PEP, postexposure prophylaxis. Immunocompromised HCP require special consideration in the provision of immunizations. 8 , 27 , 28 , 35 First, live, attenuated virus vaccines (eg, measles-mumps-rubella [MMR] vaccine; varicella vaccine; and live, attenuated influenza vaccine [LAIV]) may be contraindicated. Second, vaccines not routinely recommended may be indicated (eg, pneumococcal, meningococcal, Haemophilus influenzae type b). Third, higher antigen doses (eg, hepatitis B vaccine in people with end-stage renal disease), additional doses of vaccine (eg, rabies vaccine in immunocompromised persons), or postimmunization serologic evaluation may be indicated (eg, antibody to hepatitis B surface antigen [anti-HBs] titer after hepatitis B vaccine or antibody response to rabies vaccine) because immunization of immunocompromised people may elicit a lower antibody response. Finally, such personnel should be individually evaluated for reassignment (with the consent of the employee) depending on their job duties. Caring for an immunocompromised patient is not a contraindication to receipt of a live, attenuated vaccine, although HCP receiving LAIV should not work in a protected environment (eg, stem cell transplant unit) for 7 days postimmunization. 28 , 36 Pregnant HCP also require special consideration in the provision of immunizations. The risks from immunization during pregnancy are largely theoretic. 27 The benefit of immunization among pregnant women usually outweighs the potential risks for adverse reactions, especially when the risk for disease exposure is high, infection would pose a special risk to the mother or fetus, and the vaccine is unlikely to cause harm. 27 , 28 , 37 , 38 , 39 , 40 Furthermore, newer information continues to confirm the safety of vaccines given inadvertently during pregnancy. Ideally, women of childbearing age, including HCP, should have been immunized against measles, mumps, rubella, varicella, tetanus, diphtheria, pertussis, meningococcus, polio, hepatitis A, and hepatitis B as children or adolescents before becoming pregnant. Because this may not have occurred, however, it is especially important that all HCP be screened for immunity to vaccine-preventable diseases. Nevertheless, live, attenuated vaccines should be provided only to nonpregnant HCP and deferred for pregnant women. The ACIP has recommended that "healthcare personnel should administer [tetanus toxoid, reduced diphtheria toxoid, and acellular pertussis] Tdap during all pregnancies, preferably during the third or late second trimester (after 20 weeks' gestation)." If not administered during pregnancy, Tdap should be administered immediately postpartum. Women who are pregnant during respiratory virus season should receive inactivated influenza immunization. 28 There is no convincing evidence of risk from immunizing pregnant women with other inactivated virus or bacterial vaccines, or toxoids. Susceptible pregnant women at high risk for specific infections should receive, as indicated, the following vaccines: hepatitis A, hepatitis B, pneumococcal polysaccharide, meningococcal, rabies, and poliovirus (inactivated) (see Box 3 ). 27 The indications for use of immunoglobulin preparations are the same in pregnant and nonpregnant women. Breastfeeding does not adversely affect the response to immunization and is not a contraindication for any of the currently routinely recommended vaccines. Before the administration of any vaccine, HCP should be evaluated for the presence of condition(s) that are listed as a vaccine contraindication or precaution. 27 If such a condition is present, the risks and benefits of vaccination need to be carefully weighed by the health care provider and the patient. The most common contraindication is a history of an anaphylactic reaction to a previous dose of the vaccine or to a vaccine component. Factors that are not contraindications to immunization include the following: household contact with a pregnant woman; breastfeeding; reaction to a previous vaccination, consisting only of mild to moderate local tenderness, swelling, or both, or fever less than 40.5°C; mild acute illness with or without low-grade fever; current antimicrobial therapy (except for oral typhoid vaccine) or convalescence from a recent illness; personal history of allergies except a history of an anaphylactic reaction to a vaccine component; and family history of allergies, serious adverse reactions to vaccination, or seizures. 27 Postexposure prophylaxis General guidelines on PEP are available from the CDC, 2 ACIP, 8 AAP, 41 APIC, 7 and the American Public Health Association (APHA). 42 All HCP should be educated at their initiation of employment or providing service when and how to report an infectious disease exposure. In general, HCP should complete an incident form, have it signed by their supervisor, and then report to the occupational health clinic. Occupational health evaluation should be available 24/7 for exposed HCP. The incident form should be reviewed by occupational health and communicated to the workers' compensation department. HCP with serious or life-threating injuries or exposures should be referred to an emergency department or specialty clinic as appropriate. If patient or visitor exposures also occurred, the infection control department should be notified. A well-defined protocol should be in place that details the steps in evaluation of an HCP potentially exposed to an infectious agent ( Box 4 ). Proper counseling of the exposed HCP is critical ( Box 5 ). Appropriate first aid should be provided, including proper care of any sharp injury or mucosal membrane exposure (eg, copious rinsing of eyes in the case of splash to eyes). A proper evaluation of the source case should also be conducted to confirm the report by the exposed HCP that the source patient does have a communicable disease. Appropriate laboratory tests should be obtained from the source patient to determine if the source patient can transmit HIV, HBV, or HCV. Box 4 Management of an infectious disease exposure • Obtain name, medical record number, and location of source case • Determine if source case has an infection and is infectious (ie, capable of transmitting infection) • Determine if transmission possible (ie, appropriate exposure without appropriate personal protection) • Determine if health care provider is susceptible (may require laboratory tests) • Determine if PEP is available and indicated • Consider alternative prophylaxis (if available) if health care provider has a contraindication to the prophylaxis of first choice • Administer prophylaxis with informed consent (HCP may choose not to accept prophylaxis) • Arrange follow-up • Document all of the above in the medical record Box 5 Postexposure prophylaxis counseling of the exposed health care provider • Information to be provided to health care providers who are exposed to an infectious agent ○ Risk (if known) of acquiring the infectious disease ○ Risk (if known) of transmitting any infection that is acquired to patients, other HCP, and contacts (eg, household members) ○ Methods of preventing transmission of infection to other persons ○ Need for work restrictions (if any) ○ Recommended follow-up • Information to be provided to health care providers who are offered prophylaxis ○ Recommendations for prophylaxis ○ Alternative methods of prophylaxis if the primary method is contraindicated ○ Degree of protection provided by the therapy ○ Potential side effects of the therapy ○ Safety laboratory tests (if recommended) ○ Risks (if known) of infection if PEP is refused PEP is available for many diseases, including but not limited to, diphtheria, hepatitis A and B, HIV, influenza, measles, invasive meningococcal infection, pertussis, rabies, syphilis, tuberculosis, and varicella-zoster. PEP is also available for some exposures, including animal bites (eg, dogs, cats, rodents, and primates) and human bites. Unfortunately, PEP is not available for exposure to arboviruses, hepatitis C, mumps, parvovirus B-19, rubella, and Middle East respiratory syndrome–coronavirus. PEP may consist of antivirals, antibiotics, immunoglobulin preparations and/or vaccines (see Box 3 ). Immunoglobulin preparations may be indicated as part of PEP for exposure to hepatitis A (immune globulin [IG]), hepatitis B IG (HBIG), measles (IG), rabies IG, tetanus (tetanus IG), varicella (varicella-zoster IG), and vaccinia (vaccinia IG). More than 1 modality may be recommended. Pre-exposure prophylaxis with recommended immunization is not considered sufficient protection after an exposure to the following diseases, and postexposure antimicrobial prophylaxis is still recommended: pertussis, invasive meningococcal infection, and diphtheria (discussed later). Sharp Injuries Occupational blood and body fluid exposures to blood-borne pathogens remain a serious public health concern. 43 The CDC estimates that 5.6 million workers in the health care industry and related occupations are at risk of occupational exposure to blood-borne pathogens. More than 30 different pathogens have caused documented occupational infection after exposure to blood or body fluids in HCP or hospital laboratory personnel. 44 The most important blood-borne pathogens are HIV, HBV, and HCV. 44 , 45 The key features for assessing the risk of transmission of HBV, HCV, and HIV are for each agent their seroprevalence in the general population, their environmental survival, and transmissibility via percutaneous, mucous membrane or nonintact skin exposure. The seroprevalence of these viruses in the general population is HBV approximately 0.4%, HCV approximately 1.3%, and HIV approximately 0.31%. 46 HBV has been demonstrated to survive and remain infectious greater than 7 days on environmental surfaces. 47 The data on HCV environmental survival are varied, with articles reporting survival of 16 hours, 48 5 days, 49 and up to 6 weeks. 50 For HIV, the half-life has been reported as 28 hours, 51 with a maximum of several days. 52 The risk of transmission of HBV depends on the route of exposure, whether the exposed person is immune (via immunization or natural infection), and serologic status of the source patient. Rates of clinical hepatitis/serologic evidence of HBV infection in susceptible exposed HCP after a percutaneous exposure have been reported as 22% to 31%/37% to 62% if the source is hepatitis B surface antigen (HBsAg) positive and but hepatitis B e antigen (HBeAg) positive; rates of transmission have been reported as 1% to 6%/23% to 37% if the source is HBsAg positive but HBeAg negative. 53 The risk of transmission of HCV after percutaneous exposure has been reported as 1.8% to 1.9% (range, 0%–7%). 46 , 54 The risk of transmission of HIV after percutaneous exposure has been reported as 0.3% (95% CI, 0.2%–0.5%). 46 In addition to percutaneous transmission, the blood-borne viruses HBV, HCV, and HIV can be transmitted via blood or contaminated fluid exposure of mucous membranes, nonintact skin, or human bites. The risk of transmission by these routes has not been quantitated for HBV and HCV. The risk of transmission by the mucosal route for HIV has been reported to be 0.09% (95% CI, 0.01%–0.5%). 46 The risk of transmission of HIV via exposure of nonintact skin is likely less than 0.1% but has not been completely quantified. The risk from a human bite has also not been quantified. Transmission of HBV, 55 HCV, 56 and HIV 57 by human bites, however, has been reported. Human bites that penetrate the skin, however, should be considered as possible 2-way exposure (from patient-to-HCP and HCP-to-patient). The CDC has estimated that approximately 385,000 percutaneous injuries occurred annually among HCP in the United States in the time period of 1997 to 1998. 43 Although the incidence of needlestick injuries has been reduced by advances in education, needle disposal, engineering changes, and personnel protection, institutions and HCP must continue to assume responsibility in further lowering the risk. Several methods of reducing exposure to blood and other potential infectious body fluids have been described ( Box 6 ). Box 6 Methods of reducing percutaneous, mucous membrane, or nonintact skin exposure to blood or potentially infectious body fluids • Strict adherence to standard precautions including appropriate hand hygiene and use of personal protective equipment (eg, gloves, gowns, masks, and eye shields) • Use of safety engineered devices (needles, syringes, scalpels, etc.) • Use of double-gloves during surgical procedures with an increased risk of glove puncture • Use of blunted surgical needles, when possible • Work practice controls to reduce risk of injuries, such as elimination of capping needles, using a tray to pass sharp devices, and immediately and appropriately discard used sharp instruments • Puncture resistant sharp disposal units • Precautions should be taken to prevent sharps injuries during procedures and during cleaning/disinfection of instruments • Mouthpieces, resuscitation bags, or other ventilation devices should be available whenever their need can be anticipated • Health care personnel who have exudative lesions or weeping dermatitis on exposed body areas (hands/wrist and face/neck) must be excused from providing direct patient care or working patient equipment (OSHA regulation) • Enhanced education on the proper use of safety engineered device All occupational exposures to blood and other potentially infectious material place HCP at risk for infection with a blood-borne pathogen. OSHA defines blood to mean human blood, blood components, and products made from human blood. 24 Other potentially infectious material includes body fluids, such as semen, vaginal secretions, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pericardial fluid, pleural fluid, peritoneal fluid, human milk, amniotic fluid, saliva associated with dental procedures, and body fluid that is visibly contaminated with blood. All body fluids should be considered infectious in situations where it is difficult or impossible to differentiate between bloody fluids. Any unfixed tissues or organs (other than intact skin) from a human (living or dead) are also considered potentially infectious material. For laboratory personnel, other potentially infectious material includes HIV-containing cell or tissue cultures, organ cultures, and HIV or hepatitis virus-containing culture medium or other solutions, as well as blood, organs, or tissues from experimental animals infected with HIV, HBV, or HCV. Care for HCP who have been exposed to blood or potentially contaminated fluids has been reviewed. 46 , 53 , 54 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 Exposed HCP should immediately be provided with first aid. Exposed mucous membranes should be flushed with water. Wounds and skin sites that have been in contact with blood or body fluids should be washed with soap and water. Antiseptics, such as chlorhexidine, have not been shown to reduce the risk of HBV transmission. There is no contraindication, however, to their use as long as they are not injected into the wound. It is not recommended to squeeze the wound to express fluid or using potentially harmful agents, such as bleach. The following exposures do not require PEP: (1) contact of intact skin with blood or body fluids; (2) skin was not breached by a sharp; (3) contact with saliva (nondental), urine, vomit, or feces that was not visibly contaminated with blood; and, (4) a sharp that was used before the injury. The source patient for blood and body fluid exposures should be tested for HIV using a 4th-generation test (combined antibody and antigen test), HBsAg, hepatitis C antibody, and other tests as indicated by the source patient's medical history (eg, malaria, syphilis, or HTVL). If a source patient's HCV test is positive, an HCV polymerase chain reaction (PCR) should be obtained. Hepatitis B The risk of HBV acquisition by HCP has declined dramatically over the years. The number of HBV infections among HCP declined by approximately 98% from an estimated 17,000 infections in 1983 to 263 acute HBV infections in 2010. 53 This decline was likely due to decreased exposure from improved work practice controls (see Box 6 ) and HBV immunization of HCP. The risk of HBV transmission from patient-to-HCP provider remains, however, because there are an estimated 800,000 to 1.4 million persons in the United States living with chronic HBV infection. 53 The key method of preventing health care–associated HBV infection among HCP is HBV immunization prior to beginning direct patient care of all HCP with potential blood or body fluid exposure. Furthermore, all HCP should know their immune response to vaccination. For HCP immunized in training or at initiation of patient contact, an anti-HBs quantitative titer should be drawn 1 to 2 months after the last dose of vaccine. HCP with greater than or equal to 10 mIU/mL anti-HBs are considered immune for life. HCP who do not respond adequately should be reimmunized with 3 additional doses of vaccine and tested for immunity 1 to 2 months after the last (6th dose). HCP who have not responded adequately (≥10 mIU/mL anti-HBs) should be tests for HBsAg. Nonresponders to 6 doses of vaccine should be counseled to return to report any exposures to blood or body fluids because they may be prophylaxed with HBIG ( Table 3 ). HCP, especially trainees, with a remote history of hepatitis B vaccine should have their immunity to HBV assessed using the algorithm recommended by the CDC. 53 Table 3 Postexposure management to prevent hepatitis B infection of health care personnel after occupational percutaneous and mucosal exposure to blood and body fluids HCP Status Postexposure Testing Postexposure Prophylaxis Postvaccination Serologic Testing b Source Patient (HBsAg) HCP Testing (Anti-HBs) HBIG a Vaccination Documented responder c after complete series (≥3 doses) No action needed Documented nonresponder d after 6 doses Positive/unknown — e HBIG × 2 separated by 1 mo — No Negative No action needed Response unknown after 3 doses Positive/unknown 48–72 h after symptoms resolve) Convalescent stage ( Salmonella spp): restrict from care of high-risk patients and food handling (until symptoms resolve; consult local and state authorities for HCP/food handlers with Salmonella typhi ) Diphtheria Exposed: no restriction unless illness develops Exclude from duty (until antimicrobial therapy completed and 2 cultures obtained ≥24 h apart are negative) Hepatitis A Exposed: no restriction unless illness develops Restrict from patient contact, contact with patient's environment, and food handling (until 7 d after onset of jaundice) Hepatitis B (chronic) — Restrictions based on review of only HCP who perform exposure-prone procedures by expert panel (see text) Hepatitis C — Restrictions based on review of HCP who perform exposure-prone procedures by expert panel (see text) Herpes simplex (genital) — No restriction Herpes simplex (hands; herpetic whitlow) — Restrict from patient contact and contact with the patient's environment (until lesions heal) Herpes simplex (orofacial) — Evaluate for need to restrict from care of high-risk patients HIV — Restrictions based on review of HCP who perform exposure-prone procedures by expert panel (see text) Measles Exposed (susceptible HCP): exclude from duty (From the 5th day after 1st exposure through 21st day after last exposure and/or after rash appears) Exclude from duty (until 7 d after the rash appears) Meningococcal infections Exposed: no restriction unless illness develops Colonized (unrelated to invasive case): no restriction Exclude from duty (until 24 h after start of effective therapy) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Colonized: no restrictions unless or ill or epidemiologically/molecular test linked to patient infections Allow to work provided lesions can be contained under a bandage and clothes; if lesions on exposed area (eg, hand/wrists, face/neck), exclude from duty (until lesions healed) Mumps Exposed (susceptible HCP): exclude from duty (from the 12th day after 1st exposure through 26th day after last exposure or after onset of parotitis) Exclude from duty (until 9 d after onset of parotitis) Pertussis Exposure (asymptomatic): no restriction unless develops illness (PEP recommended) Exposed (symptomatic): per active disease Exclude from duty (from beginning of catarrhal stage through 3rd week after onset of paroxysms or until 5 d after start of effective antimicrobial therapy) Rubella Exposed (susceptible HCP): exclude from duty (from 7th day after 1st exposure through 21st day after last exposure) Exclude from duty (until 5 d after rash appears) Group A streptococcus Colonized: no restrictions unless or ill or epidemiologically/molecular test linked to patient infections Restrict from patient care, contact with patient's environment, or food handling (until 24 h after adequate treatment started) Tuberculosis Latent tuberculous infection: no restrictions Active pulmonary tuberculosis; exclude from duty (until proved noninfectious) Varicella Exposed (susceptible): exclude from duty (from 10th day after 1st exposure through 21st day [27th day if varicella IG provided] after last exposure) Exclude from duty (until all lesions dried and crusted) Zoster Exposed (susceptible): same as varicella Localized, in healthy HCP: Allow to work provided lesions can be contained under a bandage and clothes; if lesions on exposed area (eg, hand/wrists, face/neck), exclude from duty (until lesions dried and crusted) Generalized or localized in immunosuppressed HCP: exclude from duty (until all lesions dried and crusted) Viral respiratory tract infections (acute) No restrictions unless illness develops a Febrile: exclude from duty (until afebrile for >24 h) Afebrile: exclude from care immunocompromised patients (ie, patients cared for in a protected environment) (until afebrile for >24 h or 7 d since onset of symptoms, whichever is longer) – HCP should wear a mask providing care until symptom-free a Consider restrictions if HCP exposed to high-contagious disease transmitted by the respiratory route or close contact (Middle East respiratory syndrome–coronavirus, Ebola virus, etc.). Adapted from Boylard EA, Tablan OC, Williams WW, et al. Guideline for infection control in health care personnel. 1998. Available at: http://www.cdc.gov/hicpac/pubs.html ; and Advisory Committee on Immunization Practices, Centers for Disease Control and Prevention. Immunization of Health-Care Personnel Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep 2011;60(RR-7):1–45.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4057843/

Screening of surface markers on rat intestinal mucosa microfold cells by using laser capture microdissection combined with protein chip technology

Objective: The objective of this research was to investigate the possibility of screening surface markers on rat intestinal mucosa microfold cells (M cells) by using laser capture microdissection (LCM) combined with protein chip technology. Methods: We labeled rat intestinal mucosa microfold cells with Ulex europaeus agglutinin (UEA)-1 antibody and visualized these by immunofluorescence staining. Using the Proteome Profiler rat protein chip, we analyzed the protein expression profiles of LCM M-cells compared to lymph follicle-associated epithelial (FAE) cells, and we identified potential differences to screen for marker proteins. Results: M cells can be clearly distinguished from lymphoid FAE cells under the fluorescence microscope. We successfully cut, isolated, and obtained microfold and lymph FAE cells with more than 95% homogeneity. Six differentially expressed proteins were identified through comparison of the protein chip profiles of these 2 cell types. Among these, VEGF, LIX, CNTF, and IL-1α/IL-1F1 were found to be at significantly lower levels in M cells, IL-1ra/IL-1F3 and MIG/CXCL9 appeared in significantly higher levels in M cells (P < 0.05). Conclusion: The results presented here clearly demonstrate that the combined use of LCM and protein chip technology is effective in the screening of M cell surface markers with high sensitivity and specificity. This will facilitate isolation, identification, and establishment of M cell lines, allowing further characterization of their functional properties.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9693068/

From Bacterial Poisons to Toxins: The Early Works of Pasteurians

We review some of the precursor works of the Pasteurians in the field of bacterial toxins. The word "toxin" was coined in 1888 by Ludwig Brieger to qualify different types of poison released by bacteria. Pasteur had identified the bacteria as the cause of putrefaction but never used the word toxin. In 1888, Émile Roux and Alexandre Yersin were the first to demonstrate that the bacteria causing diphtheria was releasing a deadly toxin. In 1923, Gaston Ramon treated that toxin with formalin and heat, resulting in the concept of "anatoxin" as a mean of vaccination. A similar approach was performed to obtain the tetanus anatoxin by Pierre Descombey, Christian Zoeller and G. Ramon. On his side, Elie Metchnikoff also studied the tetanus toxin and investigated the cholera toxin. His colleague from Odessa, Nikolaï GamaleÏa who was expected to join Institut Pasteur, wrote the first book on bacterial poisons while other Pasteurians such as Etienne Burnet, Maurice Nicolle, Emile Césari, and Constant Jouan wrote books on toxins. Concerning the endotoxins, Alexandre Besredka obtained the first immune antiserum against lipopolysaccharide, and André Boivin characterized the biochemical nature of the endotoxins in a work initiated with Lydia Mesrobeanu in Bucharest. 1. From Bacteria of Putrefaction to Putrid Poisons, Bacterial Metabolites and Toxins Peter Ludvig Panum (1820–1885), a Danish physician and physiopathologist working in Copenhagen was among the very first scientists in 1856 to consider that putrefaction was associated with a putrid poison. It took him a while before he recognized that such poison could derive from the bacteria of putrefaction [ 1 , 2 ]. Efforts were then made to characterize these poisons, and Ernst von Bergmann (1836–1907), a Baltic German surgeon identified what he called sepsin [ 3 ]. The word toxin was coined in 1888 by Ludwig Brieger (1849–1919), a professor of medicine at Humboldt University in Berlin [ 4 ] who had identified putrescine and cadaverin, organic compounds released by bacteria of putrefaction (1885). In 1878, Francesco Selmi (1817–1881), an Italian chemist from Bologna, coined the word ptomaïnes, from Greek ptōma (corpse), to name the cadaveric alkaloids [ 5 ]. Many years later, Elie Metchnikoff (1845–1916) who worked at the Institut Pasteur as soon it had been inaugurated [ 6 , 7 ], also reported that bacteria of putrefaction were producing poisons [ 8 ]. He identified bacterial metabolites released by gut bacteria [ 9 ]. Two of them (indol and paracresol) were rendered responsible of tissue lesions and vasculature alterations when injected in rabbits and could even induce death when injected into monkeys. Two other scientists who trained at Institut Pasteur made a significant contribution in the field. Sir Marc Armand Ruffer (1859–1917) who later on became the father of paleopathology [ 10 ] worked with Pasteur and Metchnikoff from 1889 to 1890. While in Paris, he also worked with Albert Charrin (1856–1907) at the school of medicine and made a key observation [ 11 ]: the filtered supernatants of bacteria ( Pseudomonas aeruginosa ), devoid of any alive or dead bacteria could induce fever once injected into rabbits. Eugenio Centanni, an italian pathologist, named the responsible bacterial poison 'pyrotoxina' [ 12 ]. Accordingly, they had identified the effects of endotoxin, three years before Richard Pfeiffer (1858–1945) developed his concept of endotoxin [ 13 ]. Most fascinatingly, the authors suspected that fever was the consequence of the activation of macrophages, far before the discoveries of endogenous pyrogens (interleukin-1, IL-1; IL-6, etc.) were made [ 14 ]. The second one, Nikolaï Gamaleïa (1859–1949), attended the inaugural ceremony of Institut Pasteur, and was expected to join the institute [ 7 ]. In 1886, he was sent by the city of Odessa where he had worked with his mentor, Elie Metchnikoff, to spend four months with Pasteur's team to learn the preparation procedures of the anthrax and rabies vaccines. Pasteur sent him to London to follow the works of the British investigative committee on rabies vaccine. From 1886 to 1892, Gamaleïa shared his life between Odessa and Paris. In 1892, he published his investigations on the cholera poisons [ 15 ], in which he described two deleterious substances, one he called «nucléine» present in heated (120 °C) culture media of Vibrio cholerae , highly toxic for guinea-pigs, rabbits, pigeons and dogs. The second substance, a nucleo-albumin, obtained after filtration through Chamberland filter, was shown to be heat sensitive and to induce all cholera symptoms, including diarrhea. The same year Gamaleïa further characterized the diphtheria toxin [ 16 ]. He showed that both pepsin and trypsin destroyed the diphtheria poison. Still in 1892, Gamaleïa published the first treaty on bacterial poisons [ 17 ] (translated in English the following year). He considered that a new science has sprung up: the science of microbial poisons, which is based at once on bacteriology, on biological chemistry, and on general physiology. In his book Gamaleïa addresses all the emerging aspects of this new specialty. After offering a historical background, he argued that infectious diseases were an intoxication by the poisons of the pathogenic microbes, considering that the poisons are intimately linked to the bodies of the bacteria. After addressing the chemical nature of the bacterial poisons, he summarized the knowledges on tetanus, diphtheria, cholera, tuberculosis and anthrax, while referring to the early works on immunity against these toxins, particularly the antisera generated against diphtheria and tetanus toxins. 2. The Soluble Chemical Products Produced by Bacteria and Immunity Louis Pasteur was aware of the works of Panum and von Bergman, although he mentioned to have failed to reproduce the work of the later [ 18 ]. Pasteur did not seem to have been initially fascinated by the concept of bacterial poison. In 1880, he wrote: " Speak, if you want, of poisoning. Make this hypothesis, I accept it. I do not know the mechanism of death from any disease more than you or anyone else does, no more than we know the mechanism of life. Speak of poison, if you wish, but you will be forced to add that, if a poison causes death, it is the microbe that generates the poison " [ 19 ]. Indeed, he rarely mentioned the word poison and never used the word toxin. However, while working on fowl cholera, in 1880, he acknowledged that a soluble substance was released by the vibrio: " I have acquired that during the life of the parasite, a narcotic is made, and that it is this narcotic which provokes the morbid symptom so pronounced of sleep in fowl cholera " [ 20 ]. Later, Pasteur realized that these soluble substances could both induce the disease and be used to generate immunity: " The fine memoir of MM. Roux and Chamberland, contained in the December 1887 issue of the Annales of M. Duclaux, demonstrates with perfect rigor that the life of the septic vibrio develops soluble chemical products which act on it little by little like an antiseptic. Introduced in sufficient quantity into the body of guinea pigs, these products give them immunity to the fatal disease caused by this vibrio. The proof is thus made, that immunity, against a disease so serious and so quickly mortal, can be obtained by the injection of chemical substances which can be measured, and that these substances themselves result from the life of the deadly microbes. […] The first, among the observers who have occupied themselves with this subject, I had sought to produce immunity in hens by means of the soluble products formed in a broth of culture by the life of the microbe of the fowl cholera. I saw the symptoms of the disease to appear, but not the immunity; which was perhaps, as MM. Roux and Chamberland observed, only a question of the quantity of soluble products used in my experience " [ 21 ]. Despite Pasteur recognized that immunity could be achieved with bacterial soluble substances, as stated by Kendal Smith: " a careful reading of Pasteur's presentations to the Academy of Sciences reveals that Pasteur was entirely mistaken as to how immunity occurs, in that he reasoned, as a good microbiologist would, that appropriately attenuated microbes would deplete the host of vital trace nutrients absolutely required for their viability and growth, not an active response on the part of the host " [ 22 ]. Indeed, Roux and Chamberland opposed themselves to their master: " M. Pasteur thought that in the case of fowl cholera, the non-recurrence was due to the disappearance of some substances consumed by the microbe. " When they recognized that " It is not necessary for the cells of the pathogenic organism to live among the cells of the animal to confer immunity on it " [ 23 ]. On his side, Auguste Chauveau (1827–1917), a French veterinarian, director of the National veterinary school of Alfort disagreed with Pasteur's definition of immunity: " Also M. Pasteur believed himself more and more authorized to consider the organism as a medium of culture which, by a first attack of the disease, would lose, under the influence of the culture of the parasite, principles that life would not return there or would return there only after a certain time " [ 24 ]. However, the idea of Chauveau was not anymore correct: " immunity is due to a substance left in the body by the culture of the microbe and which opposes its further development ." To be opposed to the Master was not an easy task: " This judgment, passed by a master such as M. Pasteur, was of a nature to discourage opposing convictions, even the most robust. I hesitated for a moment to keep mine. Nevertheless, as, meanwhile, new experiments had come to fully confirm my first observations, it was impossible for me not to support the deductions which I had drawn from them. I therefore maintained them with respectful firmness " [ 24 ]. 3. Diphtheria Toxin Known as "the strangling angel of children," diphtheria was a deadly bacterial infection killing thousands of babies and children every year. The germ, Corynebacterium diphtheria , was discovered in Germany in 1883 by Edwin Klebs (1834–1913), isolated and cultured the following year by Friedrich Loeffler (1852–1915). From 1888 to 1890, Alexandre Yersin (1863–1943) and Émile Roux (1853–1933) ( Figure 1 ) who was the third director of Institut Pasteur after Louis Pasteur and Émile Duclaux (1840–1904), undertook their investigations on diphtheria [ 25 ]. They studied filtrates of 42 days cultures of the bacterium obtained through the porcelain filter set up by Charles Chamberland (1851–1908), one of the closest collaborators of Pasteur. Once injected in guinea pigs, the filtrates ended to the death of the animals, while rabbits and pigeons were more resistant than guinea pigs. Their analyses allowed them to claim that a toxin was elaborated by the germ of diphtheria. Furthermore, they also found the toxin in urines collected from sick children shortly before their deaths. In August 1891, E. Roux had the opportunity to precise his view during the seventh International Congress of Hygiene and Demography in London [ 26 ]. " It is natural to conclude that microbes act through their chemical products, true poisons specific to each of them, and which determine the symptoms of the disease in man and in animals […] The infectious disease is therefore a poisoning: the source of the poison is the microbe settled in the tissues; it elaborates his toxin there at the expense of the living being that it is going to kill ". Furthermore, he addressed a new way to induce protective immunity, he called "chemical vaccination" in contrast to the microbial vaccination defined by Pasteur in the case of fowl cholera and by Henry Toussaint (1847–1890) in the case of anthrax: " It is therefore not necessary for the refractory state to be acquired, that the microbes penetrate into the body, it suffices that the substances prepared in the artificial cultures be introduced into it. If, therefore, by swarming in the organism, microbes give immunity, it is undoubtedly because they produce the same chemicals that we find in in vitro cultures " [ 26 ]. In 1890, the use of immune sera against diphtheria toxin and tetanus toxin was rendered popular by Emil von Behring (1854–1917) and Shibasaburo Kitasato (1853–1931) who offered the basis of serotherapy to treat diphtheria and tetanus [ 27 ]. Von Behring and Kitasato prepared immune sera in guinea-pigs, rabbits, sheeps, goats, and horses. Adolf Baginsky (1843–1918) reported the first clinical trial in 220 children with diphtheria who received intraperitoneal injection of immune serum, ending to a healing rate of 77% [ 28 ]. Paul Ehrlich (1854–1915), the father of humoral immunity who shared the Nobel prize in 1908 with Metchnikoff, used the anti-toxin responsiveness to demonstrate the transmission of immunity during pregnancy and suckling [ 29 ] and developed a standardized method allowing to ensure reproducible titers of high toxin neutralizing activity in the antiserum [ 30 ]. Of note, two years before von Behring, two French physicians and scientists, friends since secondary school, Jules Héricourt (1850–1938) and Charles Richet (1850–1935) reported that the peritoneal transfusion of whole blood of dogs previously inoculated with Staphylococcus pyosepticus into rabbits was able to transfer immunity in these rabbits once challenged with the same bacteria, in contrast to the absence of protection provided by the blood from uninfected dogs [ 31 ]. Their failure to provide protection with a similar approach in the case of tuberculosis and cancer led to the oblivion of their pioneer works [ 32 ]. Later, Richet was awarded the Nobel prize 1913 for his discovery of anaphylaxis, and Emil von Behring was awarded with the very first Nobel prize in medicine or physiology in 1901. In his Nobel lecture, von Behring paid tribute to his precursors: " Without the preliminary works by Loeffler and Roux, there would be no serum treatment for diphtheria. " In addition to have discovered the toxin, to prepare the immune sera, Émile Roux developed the use of horses on a large scale with the help of Edmond Nocard (1850–1903). Nocard had joined Pasteur's laboratory in 1880 and was Director of the veterinary school of Alfort. Horses were first hosted at the veterinary school before a large number of horses could join the stables of the annex of Institut Pasteur in Marnes-La-Coquette ( Figure 2 ). With an initial number of a dozen in September 1894, 136 horses were hosted by the beginning of 1895. Because the Parisian production remained insufficient to cover the need of the whole country, institutions were created in various cities (including Institut Pasteur de Lille, and production centers in Lyon, Le Havre, Grenoble, Bordeaux, Marseille, Rouen). In Nancy, the center was created thanks to a donation of Osiris (1825–1907), a generous donator who had regularly supported the Institut Pasteur [ 33 ]. In 1894, Émile Roux with Louis Martin (1864–1946), a former student of Joseph Grancher (1843–1907), his colleague of Institut Pasteur, reported with great details the preparation of the diphtheria toxin and the immune sera [ 34 ]. It contrasted with the vagueness maintained by Pasteur on the preparation of his vaccine against anthrax, which was at odds with the scientific attitude of the very rigorous Dr. Roux. With Dr. Auguste Chaillou (1866–1915), from Necker Hospital, they published the treatment of 300 children, ending with a 50% decreased mortality [ 35 ]. The official announcement of the success of the experiment was made by Roux on 5 September 1894 in Budapest during the eighth International Congress of Hygiene and Demography ( Figure 3 ). The results had a great impact in the lay press ( Figure 4 ). "Le Figaro" of which the director was Gaston Calmette (1858–1914), the brother of the Pasteurian Albert Calmette (1863–1933), echoed this success and launched for a call for donations that helped to collect more than 612,000 francs and to gather numerous retired horses. Sarah Bernardt, a star actress, also raised funds for the Institut Pasteur, offering a hundred seats up for auction, at the theater de la Renaissance, for the 1894 première of Gismonda. However, because Roux had compared the outcome of patients treated with immune serum in one hospital with that of untreated patients in another hospital, some physicians were not fully convinced. Among those, were Johannes A. G. Fibiger (1867–1928), a junior physician, working in the ward of Søren Thorvald Sørensen (1849–1928) at Blegdamshospitalet in Copenhagen. In 1896–1897, Fibiger conducted the very first randomized controlled trial. Treatment allocation depended on the day of admittance, and patients received either standard treatment or standard treatment plus serotherapy. Only patients for whom the diphtheria bacterium was then identified were kept in the study. Eight out of 239 patients (3.3%) in the serum treated group, and 30 out of 245 (12.2%) in the control group died [ 36 , 37 ]. Of note, later, Fibiger was awarded with a Nobel Prize (1926), for his discovery of " Spiroptera carcinoma " ( Gongylonema neoplasticum , its current name), a nematode to which he attributed a role in the development of gastric cancer in rats. Systematic reanalyses of Fibiger's data led to conclude that his specific finding was found erroneous [ 38 ], despite the links between certain pathogens and cancer were then fully recognized. Gaston Ramon (1886–1963) ( Figure 5 ) was a veterinarian, hired by Roux to prepare the horse antisera at the annex of Institut Pasteur. In 1923, he showed that the treatment of the diphtheria toxin with formalin and heat resulted in an immunizing molecule that had lost its toxicity, but retained its antigenicity as shown in guinea pigs and horses [ 39 ]. Ramon coined the word anatoxin. The same year Alexander Thomas Glenny (1882–1965) from the Wellcome Research Laboratories, Beckenham (Kent) called toxoid his preparation that was only obtained after formalin treatment and needed to be mixed with anti-toxin to be used as an immunizing agent [ 40 ]. In France, the vaccination of infants against diphtheria with the Ramon anatoxin has been compulsory since the law of 24 June 1938. Among the other major contributions of Ramon, let us mention the discovery of the adjuvants: " It is necessary to involve an inflammatory reaction at the site of antigen injection to enhance the immune response ." [ 41 ], the famous «dirty little secret of the immunologists» as claimed by Charles Janeway (1943–2003), the father of the rebirth of innate immunity. Ramon had observed that if a small abscess was occurring at the site of injection of his anatoxin, the antibody titer was greatly enhanced. Then, on purpose he created an inflammation by mixing different substances with his vaccine, including tapioca, his favorite one. Gaston Ramon has been nominated 155 folds for the Nobel prize and is #1 of the scientists with the greatest number of nominations without being awarded. Of note, with 115 nominations Émile Roux is #2 on this podium! 4. Tetanus Toxin The bacillus of tetanus ( Clostridium tetani ) was first described in 1884 in Berlin by Arthur Nicolaier (1862–1942). In 1890, three groups reported the presence of a released toxin: In Denmark, Knud Faber (1862–1956), chief physician at Frederiks Hospital and later at Rigshospitalet and professor of clinical medicine at the University of Copenhagen [ 42 ]; In Italy, at the University of Bologna, Giuseppina Cattani (1859–1914) and Guido Tizzoni (1853–1932), medical doctors and bacteriologists [ 43 ] and Alessandro Bruschettini (1868–1932) [ 44 ]; and in France, Louis Vaillard (1850–1935), and Hyacinthe Jean Vincent (1862–1950) both professors at the military medical school (Val-de-Grâce) showed that filtered cultures of the tetanus bacillus could induce the disease and kill mice, guinea pigs and rabbits [ 45 ]. Émile Roux and Louis Vaillard, following the precursor works of von Behring and Kitasato [ 27 ]; initiated a collaboration to further define the preparation of the toxin and its treatment with iodine to obtain an appropriate less toxic immunogen to generate in mice's, rabbit's, guinea-pig's, sheep's, cow's and horse's protective immune sera [ 46 ]. They showed that in rabbits the protective immunity lasted more than two years, although they advocated to perform regular boosts. Most interestingly, they reported that the cow milk was a source of anti-toxin in agreement with the ingenious experiments of Ehrlich [ 29 ]. In agreement with Metchnikoff's observations, they suggested that the immune sera act on leukocytes to favor the phagocytosis of the tetanus germs, a phenomenon known as opsonization. They showed that the immune sera could be protective even when administered after the deadly bacteria. They also report their first attempts in humans with horse immune sera. Five patients died but two survived. Of course, an inappropriate timing may explain these results. The death of an eleven-year-old child after the extraction of two teeth reminds us that by the end of the 19th century, tetanus could happen in unexpected settings. In 1896, Dr. Eugene Tracey, a British physician reported how he saved a little girl with tetanus by injecting her the immune serum of Drs. Cattani & Tizzoni [ 47 ]. In 1897, Élie Metchnikoff compared the sensitivity of different animal species to the tetanus toxin and their respective capacity to produce anti-toxin. He reported that scorpions, beetles, carps, axolotl, tortoise were insensitive while hens, guinea-pigs, frog and caiman when maintained at 32–37 °C, were producing anti-toxin [ 48 ]. Auguste-Charles Marie (1864–1935), working in Elie Metchnikoff's laboratory localized the toxin after its injection within the blood compartment, the nervous system and in other organs of frogs, guinea-pigs, rabbits, mice and dogs [ 49 ]. Edmond Nocard played again a major role to favor the use of horses for tetanus serotherapy [ 50 ]. Institut Pasteur was engaged in a central role during world war I to provide antisera to the armies. In 1914, the Institut Pasteur had 300 horses and was preparing 80,000 vials of antisera a month. In 1918 there were 1462 horses, allowing the preparation of 600,000 vials per month. After the successful approach by Ramon to prepare the diphtheria anatoxin, the same experimental methodology was developed in 1925 to prepare the tetanus anatoxin, by Pierre Descombey (1895–1930), a young pasteurian who passed away when he was only 35. He successfully immunized horses and guinea pigs [ 51 ]. The following year after Albert Lafaille (1891–1963), Ramon's colleague had tested the safety of the injection on himself, Ramon and his colleague Christian Joseph Zoeller (1888–1934), professor at the Val de Grâce military hospital, tested the tetanus anatoxin on a hundred humans and obtained strong neutralizing activity of their sera after three injections [ 52 ]. In France, a law of 15 August 1936 rendered the anti-tetanus vaccination mandatory within the armies, and the association of both anatoxins was officialized in 1940 for children after Ramon and Zoeller had shown the feasibility of such association [ 53 ]. 5. Cholera Toxin In 1886, The Neapolitan physician, Antonio Cantani, was the first to presume that the cholera toxin was linked to the body substance of the bacteria [ 54 ]—a concept which had been further developed by others, especially by Gamaleïa in 1892 [ 15 ]. At Institut Pasteur, Metchnikoff compared the sensitivity of different animal species to Vibrio cholera . He found that guinea pigs were more sensitive than rabbits, which were more sensitive than mice, while pigeons and hens were insensitive [ 55 ]. In addition, he demonstrated that the toxicity was due to a toxin and that the antitoxin immunity was protective. For his demonstration he placed live bacteria in a bag preventing the bacteria's dispersal, and then he implanted the bag into the peritoneal cavity of guinea pigs. Most of them died, thus illustrating that a diffusible product was responsible of the poor outcome. When he placed dead bacteria or culture medium in the bag, the animals survived. Then, he selected the few animals that survived the bags containing the live bacteria and re-injected them with a lethal dose of V. cholerae . Not only the animals were protected, but they were able to resist further injections of up to 16 lethal doses. Afterwards, Metchnikoff prepared the cholera toxin and successfully immunized guinea pigs, rabbits, goats and horses demonstrating that their sera displayed a protective activity. It is admirable that the father of cellular immunity made key experiments demonstrating the importance of humoral immunity against bacterial toxins. Despite these precursors works, the discovery of the cholera toxin is often attributed to an Indian investigator from Calcutta, Sambhu Nath De (1915–1985) who reported in 1959 the toxicity of bacteria-free culture filtrate of Vibrio cholerae in rabbits [ 56 ]. He showed that the cholera toxin could kill the rabbit, inducing a fall of blood pressure, heart edema, an increased permeability of the capillaries of the intestinal mucosa and an alteration of the kidneys. 6. Endotoxins Richard Pfeiffer (1858–1945) coined the word endotoxin in 1892 [ 13 ]. Pfeiffer had worked as Robert Koch's assistant in the Institute of Hygiene in Berlin. In 1894, he reported the process of in vivo bacteriolysis (1894), known as "the Pfeiffer phenomenon" which was further deciphered by Jules Bordet at Institut Pasteur [ 57 , 58 ]. Pfeiffer accompanied Koch in 1897 in India to investigate the plague epidemics. Pfeiffer thought that the bacteria were containing such a toxic substance, before it was recognized that endotoxins are present on the surface of Gram-negative bacteria and are regularly released by growing bacteria [ 59 ]. Two major achievements were obtained by Pasteurians in the field of endotoxins. Alexandre Besredka (1870–1940) was born in Odessa and had Metchnikoff as a teacher. He moved to Paris in 1893 to study medicine and joined Metchnikoff's laboratory. At his master's death in 1916, Besredka, having spent more than 20 years at his side, became the head of the laboratory Metchnikoff had founded at Institut Pasteur. While Pfeiffer was mistaken in his appreciation of the inability of endotoxins to induce neutralizing antibodies, it was Alexandre Besredka who made the decisive discovery that antisera raised against intravenously injected bacteria developed endotoxin-neutralizing properties. A horse injected with typhoid vaccine generated antibodies against typhoid endotoxin that were able to protect guinea-pigs injected with 30 lethal doses of endotoxin. Once again, it is quite fascinating that in the laboratory of the father of innate cellular immunity, such a key experiment in the field of humoral immunity had been achieved [ 60 ]. André Boivin (1895–1949) joined the Institut Pasteur annex in Garches in 1936, working with Gaston Ramon, pursuing his research on smooth and rough endotoxins he had initiated together with Ion and Lydia Mesrobeanu, while he was at the Cantacuzene Institute in Bucharest [ 61 , 62 ]. Boivin and Mesrobeanu had deciphered the biochemical nature of the endotoxins, they initially called "antigène glucido-lipidique", before it acquired his popular name of lipopolysaccharide (LPS). 7. The First Pasteurian Books on Toxins In 1911, Etienne Burnet (1873–1960) published a book entitled «Microbes and Toxins» (translated in English in 1912) with a preface of Metchnikoff. Burnet was a physician who first joined the École Normale Supérieure (ENS) where Pasteur made most of his career. He entered at Institut Pasteur in 1904 as an assistant in the laboratory of Amédée Borrel (1867–1936) and from 1907–1919, he worked in the laboratory of Metchnikoff. His book is not only a book of bacteriology, dealing with the nature of microbes, but he also addressed the host response, immunity, inflammation, phagocytosis, anaphylaxis, and vaccines. In his chapter devoted to the toxins, he not only focused on bacterial toxins, but he also mentioned the vegetal ones, including ricin. Of note, Jan Danysz (1860–1928), a biologist from Poland who worked with Jules Bordet in South Africa, successfully proposing serotherapy to fight bovine plague [ 58 ], investigated the interaction of ricin with its anti-toxin antibodies [ 63 ]. Burnet compared the soluble toxins with diastases (enzymes) and also described the endotoxins, paying tribute to Besredka who was the first to report anti-endotoxins. The second book to be mentioned has been published in 1919. Entitled "Toxines et antitoxines", it has never been translated in English. It addresses vegetal toxins, those found in animal venoms and produced by bacteria, emphasizing on the pathophysiological consequences of their injections through different routes in experimental animals, and the acquired immunity associated with the protective role of antibodies. It was written by three authors: Maurice Nicolle (1862–1932), Emile Césari (1876–1956) and Constant Jouan (1877–1949). Maurice Nicolle is the oldest brother of Charles Nicolle (1866–1936) who received the Nobel prize in 1928 for his work performed while he was director of the Institut Pasteur in Tunis, demonstrating that lice transmit typhus. In 1893, Maurice Nicolle was appointed to replace Waldemar Haffkine (1860–1930) who had developed the cholera and the plague vaccines [ 64 ], as preparator of the microbiology course at the Institute. Soon, Louis Pasteur sent him to Turkey at the request of Sultan Abdul Hamid II. There, he directed the Imperial Institute of Bacteriology of Constantinople. From 1896 to 1915, Maurice Nicolle reported numerous investigations on the preparation of toxins, their preservation, and the properties of antisera. Back at the Institut Pasteur Institute (1902–1926), he attracted a number of young researchers and students around him, including Emile Césari who became his assistant in 1909. Their work on toxins and antitoxins, especially on the mutual precipitation of antigens and antibodies, allowed them to develop a method for measuring the in vitro activity of diphtheria and tetanus toxins on the one hand, and on the other hand, the antitoxic potency of anti-diphtheria and anti-tetanus sera. At the request of E. Roux and A. Calmette, he became head of the anti-venomous serotherapy department. The third co-author, Constant Jouan started in 1893 as a preparator in the Department of microbiology applied to hygiene and vaccinations, directed by Charles Chamberland. In 1909, he became assistant laboratory head, responsible for the manufacture of vaccines under the responsibility of Emile Roux. He shared this function with Ernest Fernbach (1875–1962) and came in charge of the laboratory of anthrax vaccines. In 1909, he registered a patent for an apparatus allowing the centrifugation of liquids. In 1919 when war had just ended in Europe, Constant Jouan, decided to devote all of his time to the creation of a new laboratory instruments company. His ingenuity and creativity ensured the rapid growth of the Jouan company. The first to adapt an electric motor to a centrifuge (until then manually operated), he opened new perspectives in research and diversified towards chemistry and biology, making a consortium with other older companies (Maison Adnet (Paris, France) for sterilization and hospital devices; and Maison Mathieu (Paris, France) for surgical instruments). The Nantes (France)-based Jouan company was acquired in September 2003 by its major competitor, the American Thermo Electron. 8. The French-German Relationships The war of 1870–1871 between France and the Prussian Empire profoundly traumatized Louis Pasteur. He left Paris, worrying about a possible destruction of his laboratory at the École Normale Supérieure during the siege of Paris. He moved to Arbois, then to Pontarlier, Geneva, Lyon and finally joined Émile Duclaux in Clermond-Ferrand. There, he worked in the close by city of Chamalières, at the Kuhn breweries to improve the local production of beers. In June 1871, he patented his process to prepare and preserve beers. In his text, one finds the famous sentence: " I wish that the beers manufactured with my process carry in France the name of Beer of the National Revenge ". He sent back his "Honoris causa" degree offered by the University of Bonn and refused to be awarded with the Prussian order of the Royal Crown proposed by the emperor, Guillaume of Prussia (Kronenorden). His words " science has no homeland, but the scientist has one " were recalled by Paul Brouardel (1837–1906), the Dean of the Faculty of Medicine during his Jubilé. To his former student, Jules Raulin (1836–1896) Pasteur wrote: " I try to keep away all these memories and the sight of all our miseries to which I see no salvation except in the despair of an all-out struggle. I would like France to resist until her last man, until her last rampart! I would like the war to be prolonged until the heart of winter so that, the elements coming to our aid, all these vandals would perish from cold, misery and disease. Each of my works until my last day will bear for epigraph: Hate to Prussia. Revenge. Revenge ." To Luigi Chiozza (1828–1889) a chemist and Italian deputy, in response to an invitation to leave France and to join Italy, Pasteur wrote: " My dear friend, I received your second letter. How touched I am by these steps and how happy I would be without the misfortunes of my country of these testimonies of esteem granted to my works, I who have always lived for glory. " These last words are a most interesting confession of his motivation. Of course, his hate of Prussia, after the humiliating defeat and the loss of Alsace, a place where he had been professor in his early career (teaching chemistry in Strasbourg), was shared by many of his country people. Among those was Jean-Jacques Henner (1829–1905), an Alsatian artist and friend of his family. He was famous for his allegorical painting "L'Alsace, is waiting" (1871). In the following years, Henner painted the portrait of his daughter, Marie-Louise Pasteur (1876), his daughter-in-law, Jeanne Pasteur (1854–1932), wife of Jean-Baptiste Pasteur (1877), and of Louis Pasteur himself (1877). Despite his Germanophobic attitude, Pasteur had little influence over his close collaborators. In 1888, Émile Roux sent Alexandre Yersin to visit the laboratory of Robert Koch, Pasteur's best enemy, to follow the courses and to bring back ideas of organization for the laboratories and for teaching purposes. In 1895, Joseph Grancher in his preface of the re-edition of the book "Etude sur les virus" by Jean Hameau (1779–1851) recognized the superiority of the German school in terms of bacterial staining, bacterial cultures on semi-solid media and regarding their identifications [ 65 ]. In 1904, Metchnikoff welcomed Robert Koch while he visited the Institut Pasteur. Roux, Metchnikoff and von Behring were friends to the point that Roux and Metchnikoff were the godfathers of Behring's sons. On 4 February 1914, few months before Germany declared war to France, the Pasteurians received Paul Ehrlich and his wife, offering a historical picture of both Nobel prize 1908 standing close to each other ( Figure 6 ). Finally, in March 1914, Roux and Metchnikoff paid tribute to the work of Paul Ehrlich in a paper published in French in a German journal [ 66 ]. The complementarity of the works of the Pasteurians and of the German school was illustrated all along this period, when key discoveries in bacteriology and immunology were made on both side of the Rhein.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4970553/

Cutaneous Anthrax on Eyelid in a Pregnant Woman

A 32-year-old patient who was 17 weeks of pregnant referred to our hospital due to a lesion on the eyelid and swelling on her face. Patient's history revealed that she helped her husband for slaughtering of a sick animal and contacted with the meat. A scabby lesion was detected on the inferior eyelid with hyperaemia around, central necrotic appearance and swelling. The diagnosis of anthrax was performed based on her epidemiological data, physical examination findings, and Bacillus anthracis were seen on direct preparation. This case was considered worthy to present since she was pregnant, the disease was located on the inferior eyelid, which is a rare place for location, and caused no complication or sequel either in mother or in baby.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10665291/

De novo assembly and comparative genome analysis for polyhydroxyalkanoates-producing Bacillus sp. BNPI-92 strain

Background Certain Bacillus species play a vital role in polyhydroxyalkanoate (PHA) production. However, most of these isolates did not properly identify to species level when scientifically had been reported. Results From NGS analysis, 5719 genes were predicted in the de novo genome assembly. Based on genome annotation using RAST server, 5,527,513 bp sequences were predicted with 5679 bp number of protein-coding sequence. Its genome sequence contains 35.1% and 156 GC content and contigs, respectively. In RAST server analysis, subsystem (43%) and non-subsystem coverage (57%) were generated. Ortho Venn comparative genome analysis indicated that Bacillus sp. BNPI-92 shared 2930 gene cluster (core gene) with B. cereus ATCC 14579 T (AE016877), B. paranthracis Mn5T (MACE01000012), B. thuringiensis ATCC 10792 T (ACNF01000156), and B. antrics Amen T (AE016879) strains. For our strain, the maximum gene cluster (190) was shared with B. cereus ATCC 14579 T (AE016877). For Ortho Venn pair wise analysis, the maximum overlapping gene clusters thresholds have been detected between Bacillus s p.BNPI-92 and Ba. cereus ATCC 14579 T (5414). Average nucleotide identity (ANI) such as OriginalANI and OrthoANI, in silicon digital DND-DNA hybridization ( is DDH), Type (Strain) Genome Server (TYGS), and Genome-Genome Distance Calculator (GGDC) were more essentially related Bacillus sp. BNPI-92 with B. cereus ATCC 14579 T strain. Therefore, based on the combination of RAST annotation, OrthoVenn server, ANI and isDDH result Bacillus sp.BNPI-92 strain was strongly confirmed to be a B. cereus type strain. It was designated as B. cereus BNPI-92 strain. In B. cereus BNPI-92 strain whole genome sequence, PHA biosynthesis encoding genes such as phaP , phaQ, phaR (PHA synthesis repressor phaR gene sequence), phaB/phbB , and phaC were predicted on the same operon. These gene clusters were designated as phaPQRBC . However, phaA was located on other operons. Conclusions This newly obtained isolate was found to be new a strain based on comparative genomic analysis and it was also observed as a potential candidate for PHA biosynthesis. Supplementary Information The online version contains supplementary material available at 10.1186/s43141-023-00578-7. Background Certain Bacillus species play a vital role in polyhydroxyalkanoate (PHA) production. However, most of these isolates did not properly identify to species level when scientifically had been reported. Results From NGS analysis, 5719 genes were predicted in the de novo genome assembly. Based on genome annotation using RAST server, 5,527,513 bp sequences were predicted with 5679 bp number of protein-coding sequence. Its genome sequence contains 35.1% and 156 GC content and contigs, respectively. In RAST server analysis, subsystem (43%) and non-subsystem coverage (57%) were generated. Ortho Venn comparative genome analysis indicated that Bacillus sp. BNPI-92 shared 2930 gene cluster (core gene) with B. cereus ATCC 14579 T (AE016877), B. paranthracis Mn5T (MACE01000012), B. thuringiensis ATCC 10792 T (ACNF01000156), and B. antrics Amen T (AE016879) strains. For our strain, the maximum gene cluster (190) was shared with B. cereus ATCC 14579 T (AE016877). For Ortho Venn pair wise analysis, the maximum overlapping gene clusters thresholds have been detected between Bacillus s p.BNPI-92 and Ba. cereus ATCC 14579 T (5414). Average nucleotide identity (ANI) such as OriginalANI and OrthoANI, in silicon digital DND-DNA hybridization ( is DDH), Type (Strain) Genome Server (TYGS), and Genome-Genome Distance Calculator (GGDC) were more essentially related Bacillus sp. BNPI-92 with B. cereus ATCC 14579 T strain. Therefore, based on the combination of RAST annotation, OrthoVenn server, ANI and isDDH result Bacillus sp.BNPI-92 strain was strongly confirmed to be a B. cereus type strain. It was designated as B. cereus BNPI-92 strain. In B. cereus BNPI-92 strain whole genome sequence, PHA biosynthesis encoding genes such as phaP , phaQ, phaR (PHA synthesis repressor phaR gene sequence), phaB/phbB , and phaC were predicted on the same operon. These gene clusters were designated as phaPQRBC . However, phaA was located on other operons. Conclusions This newly obtained isolate was found to be new a strain based on comparative genomic analysis and it was also observed as a potential candidate for PHA biosynthesis. Supplementary Information The online version contains supplementary material available at 10.1186/s43141-023-00578-7. Background Bacillus is one of the most diverse and versatile genus having representative members that has been reported from different natural ecosystems. A number of Bacillus species have been a well-known PHA-producing bacterial cells [ 1 ]. For instance, a newly isolated polyhydroxyalkanoates (PHA)-producing Bacillus sp. was identified to be a strain of B. cereus using microbiological and molecular techniques. It was designated as B. cereus SPV [ 2 ]. Gram-positive Bacillus has rarely been reported for polyhydroxyalkanoates (PHAs) at industrial levels in spite of the fact that a number of Gram-negative bacteria have been known for industrial applications [ 3 ]. There is similarly another newly characterized B. cereus strain tsu1 that has been identified by draft genome sequencing for PHA biosynthesis. Further study confirmed that B. cereus SE-1 and Bacillus sp . CS-605 were able to accumulate PHA [ 4 ]. It has been observed that PHA accumulation was increased for isolate B. cereus SE-1 than Bacillus sp. CS-605 under the same condition after 72 h of incubation. B. cereus and B. megaterium have also been well-known as PHA accumulators [ 5 ]. These accumulated PHA which can be biologically degraded have been used for various applications [ 6 ]. It was also confirmed that Bacillus sp. LPPI-18 which gram-positive isolates has been employed for PHA production [ 7 ]. They harbor genomic attributes (genes encoding proteins, responsible) for bioplastic production. Literature surveys revealed differences in the details of these genomic attributes for PHA metabolism. For instance, genes encoding MaoC-like protein have been reported in the B. cereus that contains the pha gene cluster. However, this protein was not detected in B. megaterium . Literature review revealed that this protein has been used to encode Enoyl-CoA hydratase (R-hydratase) enzymes that are involved in PHA metabolism [ 5 ]. The poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHA) biosynthesis can also be improved after genetic engineering from certain carbon sources such as glucose and propionic acid using E.coli [ 8 ] . Comparative genomic analysis has been used for study of relationships among different homologous genes such as orthologs gene that originate from a common ancestor during speciation events and paralogs that also share a common ancestor but arise from sequence duplication events within a species. Orthologous genes are usually syntenic between close-related species. Whereas, paralogs synteny genes often show a limited and more speciation-related divergence. Comparative genomic study used to compare multiple species with high sequence similarity due to orthologous genes that function with comparable biological function. It is also used to compare the genome of species that are able to perform distinct functions due to sequence with greater divergence from other species. On the other hand, orthologs with sequences that show are more likely to perform distinct functions [ 9 – 11 ]. Genomic DNA analysis is also a major source of information for microbial identification in microbial taxonomy [ 12 ]. For instance, certain pathogenic bacterial species like Bordetella petrii [ 13 ] can be differentiated based on genomic DNA analysis . It has been used for high-throughput DNA sequencing technologies [ 12 ]. Nowadays, the major application of genomic DNA sequence is to measure overall genomic relatedness between two microbial strains. It has also served as the framework for the species concept [ 14 ]. For microbial identification, the DNA–DNA hybridization (DDH) method is well-known for certain years and considered as a gold standard for microbial taxonomy [ 15 ] in spite of indirectly measuring genome sequence similarity, labor-intensive, and error-prone [ 16 ]. However, currently, several overall genome relatedness indices have been developed for microbial identification using whole-genome sequencing that has been freely available. Hence, OGRI used to replace costly DDH methods and is able to calculate the similarity between two genomic DNA sequences without gene-finding and functional reproducible, fast, and easy-to-implement [ 17 ]. Orthologous Average Nucleotide Identity (OAT) is another comparative genome analysis tool that is able to use OrthoANI to measure similarity between two genomic sequences. ANI and OrthoANI are comparable algorithms. They share the same species demarcation cut-off at 95 ~ 96% and large comparison studies have demonstrated both algorithms to produce near identical reciprocal similarities. OrthoANI is highly correlated with ANI (using BLASTn) and the former showed approximately 0.1% higher values than the latter. OrthoANI is more commonly used for calculating ANI similarity between two or more microbial strains. It is more robust and faster for taxonomic determinations. The standalone software tools are freely available at http://www.ezbiocloud.net/sw/oat . In fact, OAT employs an easy-to-follow Graphical User Interface that allows researchers to calculate OrthoANI values between genomes of interest [ 17 ]. They share the same species demarcation cut-off at 95 ~ 96% and large comparison studies have demonstrated both algorithms to produce near identical reciprocal similarities. OrthoANI is highly correlated with ANI (using BLASTn) and the former showed approximately 0.1% higher values than the latter. Comparative genome analysis is also performed by certain software like OrthoVenn, which is one of the web-based platforms used for comparison and annotation of orthologous gene clusters among multiple microbial species. It works on any operating system with a modern browser and Javascript-enabled. OrthoVenn is used to provide a comprehensive coverage of bacteria, fungi, metazoan, protists, plants, and vertebrates for identification of orthologous gene clusters and supports users for uploading protein sequences. OrthoVenn has an efficient and interactive graphic tool which provides a Venn diagram view for comparing protein sequences that belong to multiple microbial species [ 18 ]. The only things users need to do are choosing species or upload protein sequences. The draft genome sequence (5.81 Mb) and protein-coding sequence (5673 f) have also been used to predict genomic information of certain microbes and hence employed for microbial identification. Genes involved in cellulose degradation and PHA biosynthesis pathways have likely been reported for this strain. Similarly, 8 rRNA genes such as 5S, 16S, and 23S have been detected in this genome draft [ 19 ]. Certain PHA-producing microbial cells with pha genes have been reported and identified by using de novo assembly which is a fundamental technique for identification of various microbial diversity used for different fields of applications. For instance, de novo assembly is a foundation for the development of genetic resources such as gene prediction, high-resolution maps of polymorphism, and genomic structural variation [ 20 ]. In addition to pha genes, certain other genetic information have been predicted for this isolate with different features. These genomic features have been achieved with genomic DNA annotation, a process of extraction of biological information from a series of nucleotide sequencing data and identification of their respective role in biological systems which is a similar work with [ 21 ]. So far, two main levels of genome annotation have been identified [ 22 ]. These two-component hierarchies of genome annotations have been included such as a static view of genome annotation and a dynamic view of genome annotation [ 23 ]. Very few PHA-producing de novo genome assembly for Bacillus strains have been reported till date. Therefore, to fulfill this gap of knowledge, the present study was aimed to perform de novo assembly and comparative genomic analyses for PHA-producing Bacillus sp. BNPI-92 strain obtained from an area of plastic waste accumulation. It is also to identify location of evolutionary relationships, the genetic basis associated, and level of gene expression for this PHA-producing strain using different software. The other gap of knowledge to be fulfilled in this study is to identify orthologous genes and determine the degree of sequence similarity among or between microbial cells and identification of gene ontology (GO) involved in encoding gene clusters used for biosynthesis of PHA granules. The identification of protein-encoding for PHA metabolisms and its location and identification of BNPI-92 strain based on ANI and GGDC 2.1 using genome–genome distance phylogeny (GGDP) methods are also few important methods of comparative genomics studies to understand the evolutionary history of this strain and calculate their intergenomic distance. Methods Whole-genome sequence (WGS) was performed using next-generation sequencer (NGS). Briefly, Fastq quality checking and filtering, de novo genome assembly, gene prediction, and gene annotation were performed. Quality checking such as base quality score distribution, average base content per read, and GC distribution in the reads were performed for an input fastq file. The fastq files were pre-processed before performing the assembly. The adapter sequences were trimmed using the Trimmomatic tool. It then filtered out reads with an average quality score less than 30 in any of the paired-end reads [ 18 , 24 ]. Genome assembly and genome coverage De novo assembly was performed using SPAdes, ABySS, and Velvet software. The default k-mer sizes were used for SPAdes assembly. A range of k-mers from 31 to 95 was used for Velvet assembly and ABySS assembly. Velvet assembler was used with k-mer 47 for all further downstream analysis since it has better statistics than all other assemblies generated using QUAST 4.0 and BUSCO 2.0 statistical tools [ 25 – 29 ]. The genome coverage for the recent our isolate was also calculated using genome coverage = (read count * read length) / total genome size. Gene prediction and gene annotation The genes were predicted from the Velvet assembled contigs using Glimmer software. It was available at https://ccb.jhu.edu/software/glimmer/ . The predicted genes were annotated using in-house pipeline RAST server that is available at http://rast.theseed.org/FIG/rast.cgi . Matching with UniProt database using BLASTX program The predicted genes were compared with UniProt database using BLASTX program with E-value cutoff of 10 –3 . It was available at ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast + /. The best BLASTX hit based on query coverage, identity, similarity score, and description of each gene was filtered out using in-house pipeline. Organism annotation The top BLASTX hit of each gene was studied and the organism name was extracted. The top 10 organisms were used for blastx hits. Prior to performing comparative genomes for newly isolated strains, the sequence was first re-annotated using the RAST server that is available via http://rast.nmpdr.org/rast.cgi . The genome was collected from an annotated server. Assign annotation for predicted genes The predicted genes were annotated against UniProt and other databases; 5652 genes were annotated using BLASTX searches against Uniprot database ( ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/ ). Matching with UniProt database using BLASTX program The predicted genes were compared with UniProt database using BLASTX program with E-value cutoff of 10 –3 . It was available at ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast + /. The best BLASTX hit based on query coverage, identity, similarity score, and description of each gene was filtered out using in-house pipeline. Organism annotation The top BLASTX hit of each gene was studied and the organism name was extracted. The top 10 organisms were used for blastx hits. Prior to performing comparative genomes for newly isolated strains, the sequence was first re-annotated using the RAST server that is available via http://rast.nmpdr.org/rast.cgi . The genome was collected from an annotated server. Assign annotation for predicted genes The predicted genes were annotated against UniProt and other databases; 5652 genes were annotated using BLASTX searches against Uniprot database ( ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/ ). Genomic DNA annotation from RAST server perspective From de novo DNA assembly, genome annotation was performed for BNPI-92 and other closely related strains using RAST server [ 30 ] which is available at http://rast.nmpdr.org/rast.cgi with the default settings. Briefly, assembly of Bacillus sp. BNPI-92 genomic DNA was computed into EzTaxone server ( https://www.ezbiocloud.net/tools ) to extract 16SrRNA. Five complete genomic DNA sequences of closely related bacterial strains ( B. cereus ATCC 14579 T (AE016877), B. paranthracis Mn5 T (MACE01000012), B. thuringiensis ATCC 10792 T (ACNF01000156), B. anthracis str. Amen T (AE016879), and B. wiedmannii FSL W8-0169 T (LOBC01000053) which related to Bacillus sp. BNPI-92 were collected from EzBioCloud Genome database ( http://www.ezbiocloud.net/ ) based on their 16SrRNA gene sequence similarity. These strains were then re-annotated using the RAST server available via http://rast.theseed.org/FIG/rast.cgi . From annotation, functional genes, location of genes, and metabolic pathways for PHA were predicted. Comparatzive genomic DNA analysis Comparative genomic analysis using Ortho Venn 2 A re-annotated protein sequence corresponding to these six strains was collected from the RAST server in the form of a fasta file. These protein sequences were uploaded into the OrthoVenn2 [ 18 ] server that is available via https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home . The Occurrence table, Venn diagram, that displays the distribution of shared orthologous clusters among these six Bacillus strains keyword and cluster ID search for specific clusters, counts of clusters in each genome, and pairwise heatmap of overlapping gene clusters for these strains were performed at threshold E-value of 1e − 5 and inflation value of 1.5. Gene ontology The Gene Ontology (GO) terms such as biological process (BP), cellular component (CC), and molecular function (MF) were mapped using the in-house pipeline. Gene ontology (GO) was predicted from the output of the metabolic pathway and assigned for corresponding strains. Comparative genome analysis using OAT software A 16SrRNA gene sequence was extracted from WGS using EzBioCloud available via https://www.ezbiocloud.net/identify and phylogenetic tree performed using Mega 7.0.9 program. The BNPI-92 16SrRNA gene sequence was deposited in the NCBI database with OP329213 accession number. Re-annotated genomes (Fasta format) of these six closely related and Bacillus sp. BNPI-92 strains were computed into the OAT software (OrthoANI Tool version 0.93.1). Comparative genome similarities for these strains were calculated using Ortho ANI, original ANI, GGDC 2.1, and is DDH tools. Heatmap with values and unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) trees between Bacillus sp. BNPI-92 and these closely related strains were calculated and generated [ 17 ]. ANI calculator The ANI between two genomic datasets of Bacillus sp. BNPI-92 and corresponding these five strains were calculated using ANI calculator available at http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/ for both best hits (one-way ANI) and reciprocal best hits (two-way ANI) [ 31 ]. If ANI between two genomic datasets were > 95%, the organisms would be considered as the same species. If its ANI were below 75%, it would be rejected [ 32 ]. Comparative genomic analysis using Ortho Venn 2 A re-annotated protein sequence corresponding to these six strains was collected from the RAST server in the form of a fasta file. These protein sequences were uploaded into the OrthoVenn2 [ 18 ] server that is available via https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home . The Occurrence table, Venn diagram, that displays the distribution of shared orthologous clusters among these six Bacillus strains keyword and cluster ID search for specific clusters, counts of clusters in each genome, and pairwise heatmap of overlapping gene clusters for these strains were performed at threshold E-value of 1e − 5 and inflation value of 1.5. Gene ontology The Gene Ontology (GO) terms such as biological process (BP), cellular component (CC), and molecular function (MF) were mapped using the in-house pipeline. Gene ontology (GO) was predicted from the output of the metabolic pathway and assigned for corresponding strains. Comparative genome analysis using OAT software A 16SrRNA gene sequence was extracted from WGS using EzBioCloud available via https://www.ezbiocloud.net/identify and phylogenetic tree performed using Mega 7.0.9 program. The BNPI-92 16SrRNA gene sequence was deposited in the NCBI database with OP329213 accession number. Re-annotated genomes (Fasta format) of these six closely related and Bacillus sp. BNPI-92 strains were computed into the OAT software (OrthoANI Tool version 0.93.1). Comparative genome similarities for these strains were calculated using Ortho ANI, original ANI, GGDC 2.1, and is DDH tools. Heatmap with values and unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) trees between Bacillus sp. BNPI-92 and these closely related strains were calculated and generated [ 17 ]. ANI calculator The ANI between two genomic datasets of Bacillus sp. BNPI-92 and corresponding these five strains were calculated using ANI calculator available at http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/ for both best hits (one-way ANI) and reciprocal best hits (two-way ANI) [ 31 ]. If ANI between two genomic datasets were > 95%, the organisms would be considered as the same species. If its ANI were below 75%, it would be rejected [ 32 ]. TYPE strains genome server for closely related and annotated strains The genome sequence data were uploaded to the Type (Strain) Genome Server (TYGS). It is a free bioinformatics platform available via https://tygs.dsmz.de , for a whole genome-based taxonomic analysis [ 33 ]. In brief, the TYGS analysis was subdivided into the following steps: Determination of closely related type strains The 16S rRNA gene sequences were extracted from the user genomes using RNAmmer [ 34 ] and each sequence was subsequently BLASTed [ 35 ] against the 16S rRNA gene sequence of each of the currently 9844 type strains available in the TYGS database. This was used as a proxy to find the best 50 matching type strains (according to the bit score) for each user genome and to subsequently calculate precise distances using the Genome BLAST Distance Phylogeny approach (GBDP) under the algorithm "coverage" and distance formula d 5 [ 36 ]. The distances were finally used to determine the 10 closest type strain genomes for each of the user genomes. Pairwise comparison of genome sequences All pairwise comparisons among the set of genomes were conducted using GBDP and intergenomic distances inferred under the algorithm "trimming" and distance formula d 5 [ 36 ]. 100 distance replicates were calculated each. Digital DDH values and confidence intervals were calculated using the recommended settings of the GGDC2.1 [ 36 ]. Phylogenetic inference: The resulting intergenomic distances were used to infer a balanced minimum evolution tree with branch support via FASTME 2.1.4 including SPR post-processing [ 37 ]. Branch support was inferred from 100 pseudo-bootstrap replicates each. The trees were rooted at the midpoint [ 38 ] and visualized with PhyD3 [ 39 ]. Type-based species and subspecies clustering: The type-based species clustering using a 70% is DDH radius around each of the 10 type strains was done as previously applied [ 40 ]. Subspecies clustering was done using a 79% is DDH threshold as previously introduced [ 41 ]. Determination of closely related type strains The 16S rRNA gene sequences were extracted from the user genomes using RNAmmer [ 34 ] and each sequence was subsequently BLASTed [ 35 ] against the 16S rRNA gene sequence of each of the currently 9844 type strains available in the TYGS database. This was used as a proxy to find the best 50 matching type strains (according to the bit score) for each user genome and to subsequently calculate precise distances using the Genome BLAST Distance Phylogeny approach (GBDP) under the algorithm "coverage" and distance formula d 5 [ 36 ]. The distances were finally used to determine the 10 closest type strain genomes for each of the user genomes. Pairwise comparison of genome sequences All pairwise comparisons among the set of genomes were conducted using GBDP and intergenomic distances inferred under the algorithm "trimming" and distance formula d 5 [ 36 ]. 100 distance replicates were calculated each. Digital DDH values and confidence intervals were calculated using the recommended settings of the GGDC2.1 [ 36 ]. Phylogenetic inference: The resulting intergenomic distances were used to infer a balanced minimum evolution tree with branch support via FASTME 2.1.4 including SPR post-processing [ 37 ]. Branch support was inferred from 100 pseudo-bootstrap replicates each. The trees were rooted at the midpoint [ 38 ] and visualized with PhyD3 [ 39 ]. Type-based species and subspecies clustering: The type-based species clustering using a 70% is DDH radius around each of the 10 type strains was done as previously applied [ 40 ]. Subspecies clustering was done using a 79% is DDH threshold as previously introduced [ 41 ]. Metabolic pathways comparison using Heat map tool RAST annotated protein sequences were computed into the KEGG-KAAS pathway. KEGG metabolic pathways were performed for complete annotated protein sequences of Bacillus sp. BNPI-92 and other closely related Bacillus strains using KAAS job request (BBH method). It was available via https://www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main . The KEGG numbers [ 42 ] were collected for closely related strains. These KEGG numeric data were computed into a minPath server that is available via http://omics.informatics.indiana.edu/MinPath/run.php to search for the conserved metabolic pathway. The minPath results were collected from "Results in html link", copied, and transferred into excel. The completeness of the metabolic pathway was checked and its percentage of completeness of metabolic pathway was calculated as Families annotated / Families involved × 100%. Finally, Heatmap [ 43 ] was computed into the ClustVis server available at https://biit.cs.ut.ee/clustvis/ and performed for the corresponding secondary metabolite. Ribosomal multilocus sequence typing (rMLST) The rMLST were conducted for Bacillus sp. BNPI-92. It was performed using an online tool that is available at https://pubmlst.org/species-id . Results De novo assembly and scaffold sorting The lowest contigs (≥ 0 bp) (156) and highest (7441) were obtained from Velvet and SPAdes, respectively (Table 1 ) against BNPI -92 strain after these de novo assembly was performed. As it was revealed in the Table 1 , equal amount of GC % (35) was recorded for genomic DNA of BNPI-92 strain against ABySS and Velvet tools. The lowest (116,621) minimum contig length which required to cover 50% of the assembled genome sequence (N 50 ) (Table 1 ) was obtained from ABySS tools. However, the highest (202,477) N 50 was documented against SPAdes and followed by Velvet (200,267) tool. The default k-mer sizes were used for SPAdes assembly (Table 1 ). The complete assembly statistics made using QUAST 4.0 and BUSCO 2.0 were obtained for BNPI-92 strain (Table 1 ). As indicated in Table 1 , other various values for the GC (%), N 50 , N 75 , L 50 , L 75 , total BUSCO groups searched, complete BUSCOs (C), complete and single-copy BUSCOs (S), complete and duplicated BUSCOs (D), fragmented BUSCOs (F), and missing BUSCOs (M) were obtained against ABySS, SPAdes, and Velvet tools. Table 1 Assembly statistics QUAST 4.0 and BUSCO 2.0 S.N Assembly statistics ABySS SPAdes Velvet 1 contigs (≥ 0 bp) 376 7441 156 2 contigs (≥ 500 bp) 150 864 116 3 contigs (≥ 1000 bp) 124 122 96 4 contigs (≥ 5000 bp) 89 52 52 5 contigs (≥ 10,000 bp) 75 43 39 6 contigs (≥ 25,000 bp) 56 34 32 7 contigs (≥ 50,000 bp) 36 28 26 8 Average no. of contigs/scaffold (bp) 129.43 1226.285 73.85714 9 Total length (≥ 0 bp) 5,822,949 8,148,351 5,527,513 10 Total length (≥ 500 bp) 5,777,667 6,315,806 5,515,700 11 Total length (≥ 1000 bp) 5,759,070 5,832,559 5,501,478 12 Total length (≥ 5000 bp) 5,673,015 5,722,474 5,391,047 13 Total length (≥ 10,000 bp) 5,579,289 5,653,765 5,295,275 14 Total length (≥ 25,000 bp) 5,292,792 5,492,325 5,185,005 15 Total length (≥ 50,000 bp) 4,524,924 5,271,241 4,982,387 16 Largest contigs 537,434 732,848 698,773 17 GC (%) 35 38 35 18 N 50 116,621 202,477 200,267 19 N 75 61,283 94,390 137,847 20 L 50 15 9 8 21 L 75 33 21 16 22 Ns per 100 kbp 13.57 0 0 23 Total BUSCO groups searched 148 148 148 24 Complete BUSCOs (C) 147 147 147 25 Complete and single-copy BUSCOs (S) 144 143 144 26 Complete and duplicated BUSCOs (D) 3 4 3 27 Fragmented BUSCOs (F) 0 0 0 28 Missing BUSCOs (M) 1 1 1 De novo assembly and scaffold sorting The lowest contigs (≥ 0 bp) (156) and highest (7441) were obtained from Velvet and SPAdes, respectively (Table 1 ) against BNPI -92 strain after these de novo assembly was performed. As it was revealed in the Table 1 , equal amount of GC % (35) was recorded for genomic DNA of BNPI-92 strain against ABySS and Velvet tools. The lowest (116,621) minimum contig length which required to cover 50% of the assembled genome sequence (N 50 ) (Table 1 ) was obtained from ABySS tools. However, the highest (202,477) N 50 was documented against SPAdes and followed by Velvet (200,267) tool. The default k-mer sizes were used for SPAdes assembly (Table 1 ). The complete assembly statistics made using QUAST 4.0 and BUSCO 2.0 were obtained for BNPI-92 strain (Table 1 ). As indicated in Table 1 , other various values for the GC (%), N 50 , N 75 , L 50 , L 75 , total BUSCO groups searched, complete BUSCOs (C), complete and single-copy BUSCOs (S), complete and duplicated BUSCOs (D), fragmented BUSCOs (F), and missing BUSCOs (M) were obtained against ABySS, SPAdes, and Velvet tools. Table 1 Assembly statistics QUAST 4.0 and BUSCO 2.0 S.N Assembly statistics ABySS SPAdes Velvet 1 contigs (≥ 0 bp) 376 7441 156 2 contigs (≥ 500 bp) 150 864 116 3 contigs (≥ 1000 bp) 124 122 96 4 contigs (≥ 5000 bp) 89 52 52 5 contigs (≥ 10,000 bp) 75 43 39 6 contigs (≥ 25,000 bp) 56 34 32 7 contigs (≥ 50,000 bp) 36 28 26 8 Average no. of contigs/scaffold (bp) 129.43 1226.285 73.85714 9 Total length (≥ 0 bp) 5,822,949 8,148,351 5,527,513 10 Total length (≥ 500 bp) 5,777,667 6,315,806 5,515,700 11 Total length (≥ 1000 bp) 5,759,070 5,832,559 5,501,478 12 Total length (≥ 5000 bp) 5,673,015 5,722,474 5,391,047 13 Total length (≥ 10,000 bp) 5,579,289 5,653,765 5,295,275 14 Total length (≥ 25,000 bp) 5,292,792 5,492,325 5,185,005 15 Total length (≥ 50,000 bp) 4,524,924 5,271,241 4,982,387 16 Largest contigs 537,434 732,848 698,773 17 GC (%) 35 38 35 18 N 50 116,621 202,477 200,267 19 N 75 61,283 94,390 137,847 20 L 50 15 9 8 21 L 75 33 21 16 22 Ns per 100 kbp 13.57 0 0 23 Total BUSCO groups searched 148 148 148 24 Complete BUSCOs (C) 147 147 147 25 Complete and single-copy BUSCOs (S) 144 143 144 26 Complete and duplicated BUSCOs (D) 3 4 3 27 Fragmented BUSCOs (F) 0 0 0 28 Missing BUSCOs (M) 1 1 1 Fastq quality Fastq quality checking and filtering involves checking of quality parameters for the sequences obtained from the sequencer. Gene prediction and genome coverage Matching with UniProt database using BLASTX program We predicted genes from the Velvet assembled contigs using Glimmer software [ 44 ]. In this WGS analysis, 5719 genes were predicted in the assembly. These predicted genes were annotated and found to be 5652 genes (Additional File 1 : Table S1). The genome coverage for Bacillus sp. BNPI-92 was predicted to be 123X for raw read summary and 71X for cleaned reads statistics. However, for raw read and cleaned reads statistics the genome coverage for Bacillus sp. BNPI-92 strain was 193X. Matching with UniProt database using BLASTX program We predicted genes from the Velvet assembled contigs using Glimmer software [ 44 ]. In this WGS analysis, 5719 genes were predicted in the assembly. These predicted genes were annotated and found to be 5652 genes (Additional File 1 : Table S1). The genome coverage for Bacillus sp. BNPI-92 was predicted to be 123X for raw read summary and 71X for cleaned reads statistics. However, for raw read and cleaned reads statistics the genome coverage for Bacillus sp. BNPI-92 strain was 193X. Gene annotation against UniProt databases Organism annotation The top 10 BLASTX hits of each gene indicated that the recent isolate is allied with Bacillus strains (Additional file 1 : Fig. S1). As shown in Additional file 1 : Fig. S1, Bacillus sp. KbaL1 is found to be the majority of the top BLASTX hit strain (> 3000) and followed by Bacillus sp. YF23 (485) and B. cereus (339). However, the lowest number of hits (93) was predicted between the recent isolate and B. cereus Rock 1–15 (Additional file 1 : Fig. S1). However, annotation and comparative genomic DNA analysis indicated that Bacillus sp. BNPI-92 strain was similar to B. cereus ATCC 14579 T . Organism annotation The top 10 BLASTX hits of each gene indicated that the recent isolate is allied with Bacillus strains (Additional file 1 : Fig. S1). As shown in Additional file 1 : Fig. S1, Bacillus sp. KbaL1 is found to be the majority of the top BLASTX hit strain (> 3000) and followed by Bacillus sp. YF23 (485) and B. cereus (339). However, the lowest number of hits (93) was predicted between the recent isolate and B. cereus Rock 1–15 (Additional file 1 : Fig. S1). However, annotation and comparative genomic DNA analysis indicated that Bacillus sp. BNPI-92 strain was similar to B. cereus ATCC 14579 T . The RAST server: rapid annotations using subsystems technology and genomic features of annotated Bacillus sp. BNPI-92 A 35.1% GC content was generated for Bacillus sp. BNPI-92's genome assembly from RAST annotation. Various genomic features were recorded against BNPI-92 and other closely related strains (Table 2 ). As illustrated in Table 2 , the highest sequence size (5,527,513), number of contigs (156), and number of subsystems (481) were obtained from Bacillus sp. BNPI-92 A Bacillus sp. BNPI-92 strain genome annotation is also graphically depicted in Fig. 1 . Table 2 Features of annotated genomic DNA for BNPI-92 and its allied reference strains No Statistics As uploaded and after splitting into scaffolds Bacillus sp. BNPI-92 Bacillus cereus ATCC 14579 Bacillus thuringiensis Bacillus paranthracis Mn5 Bacillus wiedmannii FSL W8-0169 Bacillus anthracis Ames 1 Sequence size 5,527,513 4,190,892 936,205 5,513,239 3,763,655 5,227,293 2 Number of coding sequence 5679 4396 896 5675 4014 5642 3 Number of contigs 156 2 1 91 39 1 4 GC content (%) 35.1 35.0 36.9 35.2 35.2 35.4 5 Shortest contig size 201 15,274 35.4 204 251 5,227,293 6 Median sequence size 1880 5,411,809 77,112 17,468 65,251 5,227,293 7 Mean sequence size 35,432.8 2,713,541.5 5,237,682 60,585.0 96,504.0 5,227,293 8 Longest contig size 698,773 541,180.9 2,657,397.0 803,208 583,560 5,227,293 9 N50 value 200,267 5,411,809 5,237,682 135,274 145,774 1 10 L50 value 8 1 1 9 7 1 11 Number of RNA 57 102 100 19 29 117 12 Number of subsystems 481 275 333 480 287 360 Fig. 1 Graphical representation of annotated genome assembly of BNPI-92 based on RAST server. Genome assembly (genes) connected to subsystems and their distribution in different categories. a Subsystem coverage, b subsystem category of percentage distribution, and c subsystem feature count that expandable down to the specific gene with their respective role (see secondary metabolism). This online tool is available at http://rast.theseed.org/FIG/rast.cgi As shown in Fig. 1 a, subsystem coverage (bar chart) and non-subsystem coverage were found to be 43 and 57%, respectively. It was predicted that there is total coverage of 2408 subsystems and 3271 non-subsystems for Bacillus sp. BNPI-92 strain. In subsystem coverage, the hypothetical and non-hypothetical gene sizes are 125 and 2283, respectively (Fig. 1 a). The percentage distribution of subsystem features was depicted in graphical representation (Fig. 1 b). The highest percentage of subsystem features was detected for amino acids and derivatives and followed by carbohydrate metabolic features. However, the lowest percentage was detected for phages, prophages, transposable elements, and plasmids subsystem feature (Fig. 1 c) when expanded down to the specific gene feature. As it was shown in Fig. 1 c, a central carbohydrate metabolisms (123), aminosugars (10), di- and oligosaccharides (55), one-carbon metabolism (56), organic acid (44), fermentation (e.g., acetyl-CoA to butyrate) (66), sugar alcohol (17), polysaccharides (7), and monosaccharides (48) were predicted in carbohydrate metabolic subsystems (421). Genome mapping for Bacillus sp. BNPI-92 strain Circular genome mapping for Bacillus sp. BNPI-92 genomic DNA was obtained using CGView online server that is available via http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/ . GC content, open reading frame, GC skrew (±) , rRNA, starting codon, stop codon, and CDC were predicted on the genome mapping (Fig. 2 ). In this result, it was found that assembled and annotated genomic DNA of BNPI-92 strain has 5,527,513 bp gene size, 35.5 mol% G + C content, 481 number of subsystems, 8L 50 and 200, 267 N 50 (Fig. 2 ). From RAST server output, Bacillus sp. BNPI-92 genome is predicted to contain 156 contigs, 5679 amino acid coding sequence, and 57 numbers of RNA (Fig. 2 ). Fig. 2 Graphic circular genome mapping for Bacillus sp. BNPI-92 that produced PHA polymers and obtained from area of plastic wastes accumulation. This genome map is visualized by CGview.ca that available at http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/ Comparative genomic analysis using Ortho Venn 2 and pair wise In this study, after comparative genomics had been performed for PHA-producing Bacillus sp. BNPI-92 (VXJL00000000) and other five closely related bacterial strains ( B. cereus ATCC 14579 T (AE016877), B. paranthracis Mn5 T (MACE01000012), B. thuringiensis ATCC 10792 T (ACNF01000156), B. antrics Amen T (AE016879)), various results were obtained (Fig. 3 a, Additional File 1 : Table S2). The first pattern summarized in the cell graph displayed in the occurrence table was gene clusters (orthologous cluster group) (Fig. 3 a, Additional File 1 : Table S2). The second pattern represents cluster counts and the third pattern of stacked bars displayed at the right place represents a collective number of protein sequences present in the cluster group for corresponding strains (Additional File 1 : Table S2). Fig. 3 Ortho Venn analysis using online tools that available at available via https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/task/create . a The occurrence table contains multiple groups of gene cluster (the pattern to the left which indicates the species are in the clusters) such as cluster count (number of gene clusters shared between species) and protein count (number of protein members in the shared cluster for these strains). Row indicates orthologous gene cluster for multiple species that summarized as a cell graph and column indicates different closely related bacterial species. The occurrence table with deep purple color bar represented the pattern of shared multiple orthologous gene cluster among Bacillus sp. BNPI-92 and other closely related bacterial strains whereas gray color bars indicate the absence of gene cluster in these strains (Fig. 5 a). b OrthoVenn diagram graphic tools used for comparing a protein sequence of PHA-producing BNPI-92 strain with other five closely related strains. c Similarity matrix for pairwise protein sequence comparison for heatmap that shows the orthologs cluster between Bacillus sp. BNPI-92 and other closely related strains of protein sequence. This heatmap [ 43 ] was computed into ClustVis server that is available at https://biit.cs.ut.ee/clustvis/ As displayed in Venn diagram graphics (Fig. 3 b), Bacillus sp. BNPI-92 strain shared a common protein sequence with these six aligned and closely related Bacillus strains. These common distributions of protein sequences (the protein encoded with orthologous gene clusters) among the first six bacterial strains were shown in the occurrence table (Fig. 3 a). The deep purple colors represented cluster genes for respective reference strains and PHA-producing Bacillus sp. BNPI-92 strain. It was observed that 2930 gene clusters were shared among these closely related strains (Fig. 3 a). A number of orthologous protein-coding gene clusters shared by these strains were also represented in Venn diagram graphics (Fig. 3 b). As shown in the Venn diagram, overlapping gene clusters were predicted between Bacillus sp. BNPI-92 strains and these closely related strains. The minimum overlapping gene clusters (16 gene clusters) were predicted between BNPI-92 and B. wiedmannii FSL W8 0169 strains (Fig. 3 b). However, the maximum overlapping gene clusters (190 gene clusters) were detected between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14570 T . In the recent study, it was realized that newly PHA-producing isolates, Bacillus sp. BNPI-92, did not share 13 gene clusters with these allied strains (Fig. 3 b). The pairwise heatmap was obtained against Bacillus sp.BNPI-92 and other closely related strains (Fig. 3 c). The minimum thresholds of overlapping gene clusters were detected between Bacillus sp. BNPI-92 and B. anthracis Ames (5239) (Fig. 3 c). However, as indicated in Fig. 3 c, the maximum overlapping gene clusters threshold has been detected between Bacillus sp. BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T (5414) with a deep red color gradient (Fig. 3 c). Gene ontology from perspective of Ortho Venn. 2 A core genome belonging to PHA-producing BNPI-92 and these closely related strains were predicted in Fig. 3 b using Venn diagram graphics. Biological processes, molecular functions, and cellular components gene ontology (GO) with corresponding functional gene clusters were predicted (Additional File 1 : Table S3). Few of these gene clusters were cluster 87, 93, 191, 273, 300, 351, 380, 390, 563, and 1873 in GO terms. Secondary metabolite encoding gene clusters were predicted. Few of these gene clusters were glucose metabolic (GO:0006006), carbohydrate metabolic (GO:0005975), pyruvate metabolic (GO:0006090), 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (GO: 0003858, cluster2158), glycerol-3-phosphate metabolic (GO:0006072), butyrate metabolic (GO:0019605, cluster 380), lipid metabolic (GO:0006629), acyl-CoA metabolic (GO:0006637), and organic acid metabolic (GO:0006082). Multiple gene clusters (cluster23, 54, 55, 108, 147, 149, 157, etc.) for sporulation (GO:0030435), were similarly predicted in these genomes. In the present, using UniPort in-house pipeline that is available at http://www.geneontology.org GO was predicted for BNPI-92 strain whole-genome sequence (Additional File 1 : Table S2). Using the same pipeline, top 10 terms in each category are shown in Fig. 4 a–c. Fig. 4 a Top 10 terms in biological process category from GO annotation of BNPI-92 strain. b Top 10 terms in molecular function category from GO annotation of BNPI-92 strain. c Top cellular component category from GO annotation of BNPI-92 strain Biological process Certain protein-coding genes were identified for BNPI-92 strain in terms of biological process (Fig. 4 a). The highest number of hits (170) was predicted for transcription DNA template followed by regulation of transcription DNA template (Fig. 4 a). However, the lowest number of hits (32) was observed for DNA recombination (Fig. 4 a). In the current BNPI-92 strain's genomic analysis, carbohydrate metabolic process and metabolic process were few predicted Gene Ontology terms in biological process category (Fig. 4 a). It was found that 475 number of terms were predicted (log ( p−value ) for biological process category including transcription DNA template, regulation of transcription DNA template, and DNA recombination had been few biological GO predicted. Molecular functions Various molecular functions GO terms were obtained against BNPI-92 strains that were selected as a potential PHA-producing bacterial isolate (Fig. 4 b). A total of 802 numbers of terms (Fig. 4 b) were predicted for BNPI-92 strain when molecular function genome annotation had been performed. ATP binding (GO:0005524), catalytic activity (GO:0003824), and DNA binding (GO:0003677) were few molecular functions GO terms detected. Cellular component In this result, cellular component GO category (69) was predicted for BNPI-92 strain which is a less number of terms (Fig. 4 c). It was predicted that the integral component of membrane (GO:00016021) category is the highest number of hits (with highest enrichment score) in cellular component GO term and followed by cytoplasm GO (GO:0005737) category (Fig. 4 c). Biological process Certain protein-coding genes were identified for BNPI-92 strain in terms of biological process (Fig. 4 a). The highest number of hits (170) was predicted for transcription DNA template followed by regulation of transcription DNA template (Fig. 4 a). However, the lowest number of hits (32) was observed for DNA recombination (Fig. 4 a). In the current BNPI-92 strain's genomic analysis, carbohydrate metabolic process and metabolic process were few predicted Gene Ontology terms in biological process category (Fig. 4 a). It was found that 475 number of terms were predicted (log ( p−value ) for biological process category including transcription DNA template, regulation of transcription DNA template, and DNA recombination had been few biological GO predicted. Molecular functions Various molecular functions GO terms were obtained against BNPI-92 strains that were selected as a potential PHA-producing bacterial isolate (Fig. 4 b). A total of 802 numbers of terms (Fig. 4 b) were predicted for BNPI-92 strain when molecular function genome annotation had been performed. ATP binding (GO:0005524), catalytic activity (GO:0003824), and DNA binding (GO:0003677) were few molecular functions GO terms detected. Cellular component In this result, cellular component GO category (69) was predicted for BNPI-92 strain which is a less number of terms (Fig. 4 c). It was predicted that the integral component of membrane (GO:00016021) category is the highest number of hits (with highest enrichment score) in cellular component GO term and followed by cytoplasm GO (GO:0005737) category (Fig. 4 c). Comparative genome analysis for Bacillus sp. BNPI-92 using OAT tools Our result indicated that the sequences were aligned using ClustalW and found that (Fig. 5 a) BNPI-92 strain shows 100% sequence similarity with B. cereus ATCC 14579 T and followed by B. anthracis Ames and B. paranthracis Mn5 strains with each 99.93% sequence sharing. Fig. 5 a Phylogenetic tree and evolutionary relationships of taxa for Bacillus sp. BNPI-92 and the other closely related strains. The evolutionary history was inferred using the neighbor-joining method [ 45 ]. The optimal tree with the sum of branch length = 0.18016536 is shown. Evolutionary distances were calculated by neighbor-joining and based on 1000 bootstrap replication of confidence values (percentage of 1000 replication). Bar, 0.05 substitutions per nucleotide position [ 46 ]. The evolutionary distances were computed by using p-distance method [ 47 ]. The analysis involved six nucleotide sequences. All positions containing gaps and missing data were eliminated. Finally, evolutionary analyses were performed with MEGA7.0.9 software [ 48 ]. Micrococcus luteus DSM 20030 T (AJ536198.1) was designated and used as outgroup in the analyses; other related sequences were obtained from EzTaxon-e server and annotated using RAST server before tree construction b UPGMA dendrograms heatmap for OrthoANI [ 17 ], c UPGMA dendrograms heatmap for OriginalANI [ 17 ] and d UPGMA dendrograms heatmap for genome to genome distance calculator (GGDC) [ 17 ]. e In silicon DDH ( is DDH) for Bacillus sp. BNPI-92 and closely related strains. In silicon DDH analysis was performed using online tool that is available at https://tygs.dsmz.de/and Fig. 8 e constructed using GraphPad Software. f Average nucleotide identity (ANI) (%) between pairs of Bacillus sp. BNPI and other five strains. ANI values of ≥ 96% and is DDH values of ≥ 70% consistently grouped genomes originating from strains of the same species together. It was performed according to Goris et al . [ 31 ] and using online tools that are available at http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/ Orthologous Average Nucleotide Identity (OAT) tools such as OrthoANI, Original ANI, and GGDC used to predict sequence similarity between BNPI-92 and other allied stains. BNPI-92 strain (VXJL00000000) showed more than 91% genome sequence similarity with these strains (Fig. 5 b, c) against OrthoANI. Using the OAT tool, it was realized that BNPI-92 strain genomic DNA was closest to B. cereus ATCC 14579 T with 98.81% OrthoANI (Fig. 5 b) followed by B. paranthracis Mn5 (91.84%, OrthoANI), B. thuringiensis ATCC 10792 (91.74%, OrthoANI), B. anthracis Ames (91.70%, OrthoANI), and B. wiedmannii FSL W8-0169 (91.52%, OrthoANI) (Fig. 5 b). OrthoANI and original ANI showed a strong relation. As it was displayed in Fig. 5 b and c, OrthANI values (91.52–98.81%) between BNPI-92 and other closely related strains were higher than original ANI values (90.75–98.25%) recorded for these strains. The minimum OriginalANI (90.75%) was calculated between BNPI-92 and B. wiedmannii FSL W8 0169 T strains whereas the maximum OriginalANI (98.25%) (Fig. 5 b) was calculated between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T strains. Digital / in silicon DNA–DNA hybridization ( d/is DDH) was performed for BNPI-92 and these (5) closely related strains (Fig. 5 e). The minimum average sequence similarity for is DDH was predicted between BNPI-92 and B. wiedmannii FSL W8-0169 (46.8%) strain (Fig. 5 e). However, the maximum average sequence similarity for is DDH value was predicted between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T (73.73%) strain which is ≥ 70% (Fig. 5 e). ANI between BNPI-92 and other closely related pair genomic database were determined using ANI calculator available at http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/ for both best hits (one-way ANI) and reciprocal best hits (two-way ANI). It was observed that the average nucleotide identity (ANI) between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T strain was 99.10% (Fig. 5 f). And the maximum ANI has been calculated as it displays in Fig. 5 f between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T (99.1%) strain. TYPE strains genome server for closely related and annotated strains Based on TYGS (Type (Strain) Genome Server) analysis, BNPI-92 was identical as B. cereus ATCC 14579 T strain at species and subspecies level (Fig. 6 ) when this stain had been compared with other related stains. The GC% contents were recorded between 34.8 and 35.3% for all strains. A protein-coding region (protein count) (5255–6243) (Fig. 6 ) for BNPI-92 and these related strains were predicted in Fig. 6 along with Delta statistics and genome size in the range of 0.1–0.2 and 4,614,627–6,234,842 bp, respectively. Fig. 6 GBDP phylogeny based on genome data and TYGS result for PHA-producing bacterial isolate data set. Tree inferred with Fast ME 2.1.6.1 [ 37 ] from GBDP distances calculated from genome sequences of Bacillus sp. BNPI-92 and other closely related Bacillus strains. The branch lengths are scaled in terms of GBDP distance formula d 5 . The numbers above branches are GBDP pseudo-bootstrap support values > 60% from 100 replications, with average branch support of 99.9%. The tree was rooted at the midpoint [ 38 ]. A labeled and colored box are annotated by affiliation and corresponding to (1) is DDH species clusters, (2) is DDH sub-species clusters, (3) percent GC (34.8–35.3%), (4) delta statistics (0.1–0.2), (5) genome size (4,614,627–6,234,842 bp), (6) protein count (5255–6243), and (7) user strain (query sequence) Metabolic pathway comparison using heatmap BNPI-92 contains certain gene-encoded metabolic pathway (Additional file 1 : Fig. S2) which is related to the other allied stains. However, the level of gene expressions was various among these metabolic pathways (Additional file 1 : Fig. S2) for respective strains. In Fig. S2 (Additional file 1 : Fig. S2), BNPI-92 shows very fewer levels of gene expression for various metabolic pathways gene clusters. A highly expressed gene for biosynthesis of vancomycin group antibiotics and thiamine metabolic pathways were detected for BNPI-92 isolates. However, very fewer expressions were detected for focal adhesion (0.8%), epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection (1.82%), phosphotransferase system (PTS) (10%), methane metabolite (12.24%), gamma-hexachlorocyclohexane degradation (13.64%), and butanoate metabolite (34.33%) pathways (Additional file 1 : Fig. S2). Annotation overview and PHA biosynthesis gene organization in Bacillus sp.BNPI-92 strain PHA biosynthesis encoding genes were predicted in the RAST server. In this annotation, phaA, phaB , and phaC genes were detected for BNPI-92 strain (Fig. 7 ). As it displays in graphic Fig. 7 a, phaB and phaC genes have been located on the same operon for BNPI-92 strain. Annotated overview of a chromosomal region of phaC gene for BNPI-92 strain was compared with certain similar bacterial strains (database) (Fig. 7 a). And in this graphic representation, sets of genes with a similar sequence are grouped with the same number and color (Fig. 7 a). The functional and focus gene always points to the right direction as shown in Fig. 7 a. Genes whose relative position is conserved in other species are functionally coupled. In this genome annotation output, the graphic centered on the focus gene with a red color arrow and numbered as a 1 is phaC gene (1086 bp length) (Fig. 7 b). The graphic situated on the focus gene with green and numbered as a 2 is phaB/phbB gene (744 bp length) (Fig. 7 a). In this graphic representation, it was displayed that the phaB gene existed in both BNPI-92 and B. anthracis st. Ames strains (Fig. 7 a). Fig. 7 Annotation overview and schematic representation of secondary metabolite gene clusters for PHA biosynthesis and a comparative PHA genetic organization for Bacillus sp. BNPI-92 and other closely related strains from RAST server annotation for a and b using online tools that are available at http://rast.theseed.org/FIG/rast.cgi . A deep red colored arrow indicates a phaC gene that is supposed to encode protein used for PHA polymerization. a is a phaA gene or nucleotide sequences (744 bp) encoded by acetyl-CoA thiolase and b is a phaC gene or nucleotide sequence (1086 bp) encoded by polyhydroxyalkanoic acid synthase. It is a conserved nucleotide sequence. And phaB gene (arrow with number 2) encodes acetoacetyl-CoA reductase. phaB and phaC genes are located on the same operon. Note that phaB gene sequence is not shown. c Three-dimensional structure of phaC protein with 319 residues (residue of protein structure for phaC gene) and presumed for PHA biosynthesis in Bacillus sp. BNPI-92. It has 319 residues. Its 88% has been modeled with 100.0% confidence by the single highest scoring template. The given protein residue resembles class I polyhydroxybutyrate synthase that was derived from Cupriavidus necator in terms of its structure. The three-dimensional structure of protein was predicted using PHYRE2 which is an online tool that is available at http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index ( d ). Evolutionary relationships for Bacillus sp. BNPI-92 It was found that acetoacetyl-CoA reductase was found to be encoded by phaB using RAST server pipeline. It was found that (Fig. 7 a) phaC gene predicted in BNPI-92 strain shared (Fig. 7 d) sequences similarity with other strains. Three-dimensional phaC crystal protein was obtained after its protein had been computed into PHYRE2 Protein Fold Recognition Server that is available at http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index (Fig. 7 c). And the 3D protein structures were constructed as displayed in Fig. 7 c. Polyhydroxyalkanoate synthesis repressor PhaR gene sequence (Fig. 8 ) was detected in the BNPI-92 strain annotated genome sequence. As displayed in Fig. 8 , 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase enzyme was predicted and its gene was found to be croR gene (444 nts, 263 aa) based on RAST server annotation. Fig. 8 PHA biosynthesis promoting genetic organizations (gene loci) in Bacillus sp. BNPI-92 and other closely related type strains genome ( Bacillus cereus ATCC 14579 T (AE016877), Bacillus paranthracis Mn5 T (MACE01000012), Bacillus thuringiensis ATCC 10792 T (ACNF01000156), and Bacillus antrics Amen T (AE016879). These strains harbored PHA biosynthesis gene with nearly similar nucleotide sequence size (nts) such as croR (predicted for PHA metabolisms), PhaQ (a PHB-responsive repressor controlling expression of phaP ), phaP (predicted for phasin biosynthesis), phaA (suggested for acetyle fermentation), phaB (predicted for butyrate fermentation), phaR (suggested as class IV PHA synthase or polyhydroxyalkanoate synthesis repressor phaR ), and phaC (predicted as PHA polymerization). phaA was located on a separate gene and suggested for encoding 3-ketoacyl-CoA thiolase or acetyl-CoA acetyltransferase protein. phaJ [ 5 ] (encoding enoyl-CoA hydratase) and acsA gene [ 49 ] (encoding acetoacetyl-CoA synthetase) predicted for PHA biosynthesis were located on the same operon. Isolog butyryl-CoA dehydrogenase enzyme is a gene which is unidentified In Fig. 8 , unidentified acetoacetyl-CoA synthetase [EC 6.2.1.16] (1686 nts, 562 aa) encoding gene was located on the same operon along with enoyl-CoA hydratase [EC:4.2.1.17] (777 nts, 259aa) encoding gene ( fadB) in B. cereus BNPI-92 strain (Fig. 8 ). We realized that the presence of phaA, phaB , and phaC genes in our BNPI-92 strains suggested that this strain has a capability to synthesize short chain length ( sch PHA) biopolymer. As illustrated in Fig. 8 , phaP gene was predicted in BNPI-92 strains. However, its feature was not yet part of a subsystem using the RAST server pipeline. This gene may not be expressed despite existed on the operon along with phaB, phaC , and phaR genes. It was predicted that the phaQ gene encodes a P(3HB)-transcriptional regulator ( PhaQ ) protein as predicted from RAST server and KEGG metabolism pathways. The evolutionary history of phaC protein was inferred using the neighbor-joining method [ 45 ]. The optimal tree with the sum of branch length = 1.29481050 is shown. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) was shown next to the branches [ 46 ]. The tree was drawn to scale, with branch lengths in the same units as those of the evolutionary distances used to infer the phylogenetic tree. The evolutionary distances were computed using the p-distance method [ 47 ] and are in the units of the number of base differences per site. The analysis involved 31 phaC protein or gene nucleotide sequences belonging to different corresponding bacterial strains mainly belonging to Bacillus strains. Codon positions included were 1 st + 2 nd + 3 rd + Noncoding. All positions containing gaps and missing data were eliminated. There was a total of 719 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were performed in MEGA7 [ 48 ]. Prediction of polyhydroxyalkanoates metabolic pathway In RAST annotation, enoyl-CoA hydratase [EC 4.2.1.17] or 3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] encoding gene where located in the B. cereus BNPI-92 strain genome sequence along with 3-ketoacyl-CoA thiolase [EC 2.3.1.16] or acetyl-CoA acetyltransferase [EC:2.3.1.9] (Fig. 8 ) and butyryl-CoA dehydrogenase (Fig. 8 ). However, in KEGG-KASS server, a gene encoding for enoyl-CoA hydratase and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase were separately predicted as fadB and fadN, respectively . In Fig. 8 , unidentified acetoacetyl-CoA synthetase [EC 6.2.1.16] (1686 nts, 562 aa) encoding gene was located on the same operon along with enoyl-CoA hydratase encoding gene ( fadB) in B. cereus BNPI-92 strain (Fig. 8 ). PHA metabolic pathway was predicted by RAST server and KEGG-KASS server that available via https://www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main . In these metabolic pathways, short-chain length of PHA ( sch PHB) were predicted after a Fasta format of B. cereus BNPI-92 strain genome had been computed into KEGG-KASS server. From KEGG-KASS metabolic pathway (Fig. 8 ), it was predicted that glucose converted into pyruvate. Pyruvate then converted into acetyl-CoA by formate C-acetyltransferase enzyme and gene involved in encoding formate C-acetyltransferase has been identified as pf1D gene in this pathway. As displayed in Fig. 9 , acetyl -CoA was metabolically converted into acetoacetyl-CoA in B. cereus BNPI-92 due to acetyl-CoA C-acetyltransferase encoded by atoB gene. Fig. 9 Metabolic pathway for PHA-producing Bacillus cereus BNPI-92 strain obtained from an area of plastic waste accumulation. A letter in green color box (a–v) indicates the most likely enzymes involved in metabolic activities. The letter in violet color box signifies possible gene involved in coding enzyme. List of enzymes: a not predicted in this study, b formate C-acetyltransferase [EC:2.3.1.54] (transferases), c acetyl-CoA C-acetyltransferase [EC:2.3.1.9] (transferases), d acetoacetyl-CoA reductase [EC:1.1.1.36] (oxidoreductases), e polyhydroxyalkanoate synthase subunit phaC [EC:2.3.1.-] (transferases), f butane monooxygenase alpha subunit [EC:1.14.13.230] (oxidoreductases), g butanol dehydrogenase [EC:1.1.1.-] (oxidoreductases), h acetaldehyde dehydrogenase (acetylating) [EC:1.2.1.10] (oxidoreductases), i butyryl-CoA dehydrogenase [EC:1.3.8.1] (oxidoreductases), k 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase/vinylacetyl-CoA-Delta-isomerase [EC:4.2.1.1205.3.3.3] (lyases), l butyrate kinase [EC:2.7.2.7] (transferases), m phosphate butyryltransferase [EC:2.3.1.19] (transferases), n 2-hydroxyglutarate dehydrogenase [EC:1.1.99.2], p glutaconate CoA-transferase, subunit A [EC:2.8.3.12] (transferases), q unidentified, r glutaconyl-CoA decarboxylase subunit alpha [EC:7.2.4.5], s 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase [EC:4.2.1.55] (lyases), t 3-hydroxybutyrate dehydrogenase [EC:1.1.1.30] (oxidoreductases), u hydroxybutyrate-dimer hydrolase [EC:3.1.1.22] (hydrolases), and v poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase [EC:3.1.1.75] (hydrolases). List of few predicted gene in these pathways: a unidentified, b pf1D or it could be pflB [ 50 ] gene , c atoBgene, and d phbB gene. However, others were designated as phaA [ 51 – 53 ], orphbA [ 54 , 55 ] gene, d its phaB [ 56 , 57 ] or phbB [ 58 ] gene, e predicted as phaC or phbB gene , f unidentified in pathway, g it could be yugJ [ 59 ], h unidentified in the KEGG-KASS pathway, i gene encoding isologs of butyryl-CoA dehydrogenase enzyme are unidentified. It could be Swol_1933 [ 60 ], k croR gene, l unidentified in pathway, n unidentified gene, p it could be gctA , r it could be gcdA (s) croR gene, t it could be Bdh2 [ 61 ] gene, u unidentified, and v phaZ gene. These metabolic pathway and respective KEEG number database were collected from KEGG [ 62 ] As illustrated in Fig. 9 , acetyl-CoA has been metabolically converted into acetoacetyl-CoA by 3- ketoacyl-CoA thiolase or acetyl -CoA acyltransferase [EC:2.3.1.16] enzyme that was encoded by fadA gene (1173 nts, 391 aa residue) (Fig. 9 ) when it was performed by KEGG-KASS and RAST servers. As displayed in Fig. 9 , acetoacetyl-Co-A was converted into (R)-3-hydroxybutanoyl - CoA by acetoacetyl-CoA reductase in B. cereus BNPI-92 strain. In this metabolic pathway, gene encoding acetoacetyl-CoA reductase was predicted as phbB (Fig. 9 ). A PHA-producing B. cereus BNPI-92 strain collected from an area of plastic waste harbored polyhydroxyalkanoate synthase enzymes (Fig. 9 . As observed in Fig. 9 , polyhydroxyalkanoate synthase enzyme is used to transform (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA into poly-β-hydroxybutyrate (PHB). As predicted in the KEGG-KASS metabolic pathway, polyhydroxyalkanoate synthase was encoded by the phbC or phaC gene. As displayed in Fig. 9 , butanol dehydrogenase (1164 nts, 388aa) activated conversion of 1-butanol to butanal for the PHB biosynthesis process. The gene encoding for NADH-dependent- butanol dehydrogenase enzyme was unidentified in the metabolic pathway for B. cereus BNPI-92 strain. A 4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase or vinylacetyl-CoA-delta-isomerase enzymes was observed as a conversion tools of Crotonoyl-CoA to (R)-3-Hydroxybutanoyl-CoA in B. cereus BNPI-92 strain screened for PHA biosynthesis. In the B. cereus BNPI-92 strain of the PHA metabolic cycle, a short pathway was similarly observed (Fig. 9 ). In this pathway, acetoacetate converted into (R)-3-hydrooxybuyrate by D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase enzyme (EC 1.1.1.30).(R)-3-hydrooxybuyrate was metabolized into (R)-3-((R)-3 hydroxybutnoyloxy) butanoate by enzyme hydroxybutyrate-dimer hydrolase [EC:3.1.1.22] that involved in PHA metabolisms (Fig. 9 ). But, the gene involved in encoding hydroxybutyrate-dimer hydrolase was not identified. Poly (3-hydroxybutyrate) depolymerase gene was also detected in the genome sequence of BNPI-92 strain (Fig. 9 ). As was illustrated in Fig. 9 , 2-hydroxyglutarate dehydrogenase was used to convert five carbon compound (2-oxoglutarate) into a hydrogenated 2-hydroxyglutarate compound in B. cereus BNPI-92 strain metabolic pathway. In KEGG-KASS server, a gene encoding for 2-hydroxyglutarate dehydrogenase was identified (Fig. 9 ). From KEGG-KASS server, it was observed that 2-hydroxyglutarate was metabolically converted into 2-hydroxyglutaryl-CoA due to glutaconate CoA-transferase , subunit A [EC:2.8.3.12] that belonged to class transferase . As illustrated in Fig. 9 , glutaconyl-CoA may be altered into crotonyl - CoA by glutaconyl-CoA decarboxylase in the 2-oxoglutarate pathway for B. cereus BNPI-92 strain. Hydroxybutyrate-dimer hydrolase was identified in the genome sequence of BNPI-92 strain. Finally, PHB was produced from (R)-3-((R)-3-hydroxybutnoyloxy) butanoate when poly (3-hydroxybutyrate) depolymerase had been activated for the reaction to start in acetoacetate pathway for this hydrolases class of enzyme. Ribosomal multilocus sequence typing (rMLST) In rMLST, various housekeeping genes were obtained for Bacillus sp. BNPI-92. These housekeeping genes include rpsA, rpsB, rpsC , rpsD, rpsE, rpsF, and others with their corresponding allele, contigs, start position, end position, and linked data values for typification of the recent our isolate (Additional File 1 : Table S4). There are 20, 22, and 12 encoding the bacterial ribosome protein subunits for rps , rpl , and rpm genes that were predicted for Bacillus sp. BNPI-92 strain, respectively (Additional File 1 : Table S4). As indicated in Additional File 1 : Table S4, the rMLST report were found to be 100% allelic support for B. cereus . It was also predicted that 55 out of 55 exactly matched B. cereus . Other related bacterial species such as B. albus, B. bombysepticus, B. paranthracis, B. thuringiensis, B. tropicus, and others (Additional File 1 : Table S4). Discussion A range of k-mers from 31 to 95 was used for Velvet and ABySS assembly. Our result demonstrated that Velvet assembly was used with kmer 47 for all further downstream analysis. It was a better statistics than all other assembly generated for the complete assembly statistics made using QUAST 4.0 and BUSCO 2.0 for bacterial genome draft. In contrast to this study, ABySS and IDBA-UD assembling tools showed a good performance for the fungal genomic draft in terms of memory, running time, and quality [ 63 ]. In our result, a considerable amount of contigs and genomic length was predicted. In line with this study, it was reported that [ 64 ] all obtained contigs by Velvet software that used to generate scaffolds with average size of 108,565 bp in which the minimum and maximum scaffold sizes of 144 and 1,059,836 bp [ 65 ], respectively, are lower than the current of our results. Abdelhafiz and his co-author found that a total of 34 gaps from 41 gaps were closed. In addition, after gap closing, they found a total of 39 scaffolds with an average size of 108,580 bp [ 65 ]. Velvet assembler generated GC contents and N 50 for Bacillus sp. BNPI-92 which is a related GC content reported by Lin et al. (2011) using Velvet and other tools. However, compared to the present prediction, a higher number of uncalled bases (gaps) (N 50 , 488,188) [ 66 ] was detected using the same tools for B. subtilis Strain QB928. It was realized that the RAST server was able to identify a set of gene calls with their respective function, location, and level of protein expression. A GC content was similarly reported for Bacillus sp. BNPI-92 strain which is a similar percentage reported for B. cereus (35.14–35.38%) that is isolated from Foodstuff [ 67 ]. In agreement with this study, SEED subsystem categories [ 68 ] and the functional gene for B. cereus FORC_013 had been identified. It was also found that B. cereus FORC_013 have a genomic feature (5,418,913 bp WGS and 35.3% GC contents) similar to our strains. It was suggested that our strain may share the species level with B. cereus FORC_013. A single circular plasmid was similarly detected in FORC_013 WGS which is a conflicting finding to our prediction for Bacillus sp.BNPI-92 strain screened for PHA biosynthesis. Subsystem category distribution (pie-chart) and subsystem feature counts were also predicted after BNPI-92 genomic DNA annotation had been performed using the RAST server. These subsystems are supposed to be used for cellular function and metabolisms. Strengthening our suggestion, it was predicted that subsystems used to provide general information about metabolism, to improve quality of annotation, and offer a framework for establishing the statistical properties needed to effectively exploit these tendencies [ 69 ]. Carbohydrates and other organic compounds were predicted in our result. It was suggested that these organic compounds might have been used to initiate PHA biosynthesis. Acetyl-CoA thiolase, acetoacetyl-CoA reductase and polyhydroxyalkanoic acid synthase were similarly predicted for PHA biosynthesis process in BNPI-92 strain using RAST server which supposed to use for PHA accumulations. In this result, Acetyl-CoA thiolase, acetoacetyl-CoA reductase and polyhydroxyalkanoic acid synthase were predicted for BNPI-92 strain which is a similar genome annotation reported for Pseudomonas extremaustralis. These genes could have been employed for PHB production and other metabolic processes [ 70 ]. In P. extremaustralis , coding sequences (CDS) (5934) and structural RNAs (49 tRNAs) (62) [ 70 ] had been predicted from its annotated WGS, a lower tRNA than RNA predicted for BNPI-92 strain. This indicates that both strains may share only less sequence in common. Biochemically, it was checked that Bacillus sp. BNPI-92 is a gram-positive, and endospore former using RAST server, these features were confirmed for BNPI-92 strain as depicted in expandable down in cell wall and capsule (180) and dormancy and sporulation (149) subsystem feature counts. Similarly, these biochemical tests were reported for B. cereus [ 67 ] obtained from food stuff and B. cereus FORC_005 strain [ 71 ], a food-borne pathogen isolated from the soy sauce braised fish cake with quail egg. In the present study, genomic features had been predicted for Bacillus sp. BNPI-92. In line with this study, it was stated that GC content (35.6%. 35.11%), circular chromosome (5,221,581 bp, 4.82 Mb), protein-coding genes (5,415, 5132), rRNA (14, 2), and tRNAs (104, 21) had been reported for B. cereus ATCC 14579 T and B. cereus 25, respectively [ 72 , 73 ]. It is a similar feature of Bacillus sp. BNPI-92, a recently isolated strain for PHA biosynthesis [ 74 ]. It has been suggested that Bacillus sp. BNPI-92 strain could have belonged to them at the species level. Similarly, related GC content (35.0%), circular chromosome sequence size (5,218,947 bp), ORFs (5480), protein-encoding genes (5309), tRNA (96), and rRNA (10) were predicted for B. anthracis H9401 strain collected from Korean Patient with Anthrax [ 75 ]. Despite being essentially similar in terms of genetic feature, the current strain is not pathogenic rather it was found to be economically important and industrially applicable. Genomic comparison for Bacillus sp. BNPI-92 and these five closely related bacterial strains were displayed in the occurrence table and Venn diagram graphics based on their protein sequences. In line with this study, comparative genomic analyses were performed between B . cereus 905 and other three B. cereus ( B . cereus AR156 (CP015589), B . cereus LCR12 (MCAX00000000), and B . cereus UW85 (LYVD00000000)) using Ortho Venn 2 for their protein sequences. It was found that these four strains shared a large set of core genome (63.9% to 72.8%) with a similar protein-coding genes sequence [ 76 ]. In agreement with this study, a similar analysis was performed for different Streptomyces species and these species contained a common orthologous gene cluster [ 18 ]. Genome comparative analysis had been similarly performed for eight species of Streptomyces involved in genome plasticity and common orthologous cluster gene groups were found [ 77 ] using the same tool. Gene clusters were shared between Bacillus sp. BNPI-92 and other related strains (2930 gene clusters). This indicates that Bacillus sp. BNPI-92 strain shared a common protein sequence with these six aligned and closely related Bacillus strains. It was similarly reported that common gene clusters (2501 cluster count) had been predicted between Streptomyces species [ 18 ]. These common genes clusters may be suggested to be a core genome. This suggests that these strains are homologous to one another and may arise from a common ancestor. Additionally, this conserved region for these all strains might be suggested by their gene conservation in the lineage after speciation and confirms the similarity between these strains due to common protein sequence. In Venn diagram results, a similar gene clusters (2930) were shared among these related strains, a comparable work reported for Streptomyces species with 2501 cluster count [ 18 ]. A number of orthologous protein-coding gene clusters shared by these strains were also represented in Venn diagram graphics. These cluster genes are common to all these strains. Probably, it could be a core genome belonging to these strains. This suggests that these strains are homologous to one another and may arise from a common ancestor. Additionally, this conserved region for these all strains might be suggested by their gene conservation in the lineage after speciation and confirms the similarity between these strains due to common protein sequence. The common gene cluster for these strains (core genome orthologs) is fewer than the number reported for eight Streptomyces (2501) [ 18 ] and six Streptomyces species (3096) [ 77 ] genomes characterized for genome plasticity. In line with this study, several of common orthologous protein-coding gene clusters (3998) were also reported among four B. cereus strains which are a higher core genome (2930 gene clusters) reported for Bacillus sp. BNPI-92. It was demonstrated that more overlapping gene clusters had been detected between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14570 T and it was suggested that this strain is more closely related to B. cereus ATCC 14570 T (AE016877). The phylogenetic tree for BNPI-92 (OP329213) strain was also close allied with B. cereus ATCC 14570 T [ 74 ]. Non-over lapping gene clusters were similarly observed for these corresponding strains and it was suggesting that these gene clusters were unique to them. It indicates a unique number of coding sequences (CDS) which may be served as fingerprinting. In line with this study, common orthologous protein-coding gene clusters, overlapping and non-overlapping gene clusters were predicted for B. cereus 905 and other B. cereus strains [ 76 ]. Pair heatmap was used for genome comparative analysis to visualize the overlapping gene clusters for these strains in a pairwise fashion. Overlapping gene clusters were happened among Bacillus sp. BNPI-92 and these strains. It was suggested that Bacillus sp.BNPI-92 shared more sequence similarity with B. cereus ATCC 14579 T . From RAST server, it was similarly confirmed that Bacillus sp. BNPI-92 strain could be B. cereus ATCC 14579 T type strain. In line with this study, overlapping gene clusters were performed for few Streptomyces species . The maximum and minimum thresholds of overlapping clusters were also reported for Streptomyces albidoflavus , S. cattleya , S. fulvissimus , S. globisporus, S. lividans , S. rapamycinicus , S. sp.Mg1 , and S. sp. Sv ACTE SirexAA [ 18 ] . The more the shared number of gene cluster among strains, the higher overlapping gene cluster which suggested that these organisms have more common gene cluster as it witnessed. Similarly, Staphylococcus caeli and S. xylosus were also found to be closely related with each other [ 78 ]. The same authors further confirmed that these isolates were shared clade with S. hemolyticus . But, in our previous publication for Bacillus sp., BNPI-92 [ 74 ] was found to share clade with B. cereus ATCC 14579 T type strain as indicated in the phylogenetic tree for 16S rRNA gene sequences. Based on 16S rRNA gene sequencing, it was confirmed that Lactobacillus paracasei PCR140 shown 97% similarity Lacticaseibacillus paracasei which are probiotic bacterial species [ 79 ]. The L. fermentum NMCC-14 [ 80 ] showed sequence similarity with other species lactic acid bacterial species. This core genome is predicted to have Gene Ontology (GO) that is subdivided into biological processes, molecular functions, and cellular components based on functional information associated with different gene clusters or gene families, a similar report by [ 81 ]. BNPI-92 strains have certain functionally annotated and a secondary metabolite that is able to encode orthologous gene clusters associated with biological and cellular metabolisms. In line with study, it was similarly reported that the biosynthetic gene clusters [ 77 ] were able to produce secondary metabolites in Streptomyces. It was also recorded that secondary metabolism encoding gene clusters (cluster 67, 66, 13, 12, and 7) [ 77 ] were predicted for five Streptomyces genomes. Gene clusters associated with sporulation resulting in the formation of a cellular spore was predicted in core genomics of these isolates and suggested to be used for resistance to harsh environmental conditions. It also confirms our biochemical test for Bacillus sp. BNPI-92 strain screened PHA biosynthesis. In the core genome, it was similarly observed that a gene family is associated with butyrate metabolic process and it was suggested that this gene cluster could have been used to encode protein involved in PHA biosynthesis. In line with this suggestion, a P (3HB-4HB-3HV) terpolymer had been produced from a metabolic process of butyrate, valerate, and 4HB [ 54 ]. It was added that the polymerization of 3OH-butyrate monomers was assisted with PHB synthase that encoded phaC gene [ 82 , 83 ]. Bacillus sp. INT005 which is the same genus to our isolate is able to metabolize butyrate to produce PHB, strengthening results to our estimation [ 84 ]. The prediction of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase GO in this result could have been associated with PHA degradation. This is probably a reason for decreasing PHA production after 72 h onward as indicated in our previous study for the same PHA-producing isolate [ 74 ]. Similarly, it was reported that gene encoding 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (Hbd) that can degrade PHA was detected in Paracoccus denitrificans PD01 [ 85 ]. Gene ontology for β ketothiolase (GO:0003988), acetoacetyl-CoA reductase (GO:0018454), and polyhydroxyalkanoates synthase (GO:190,144) activity have been founded in PHA-producing microorganisms [ 83 , 86 ]. The biological process GO prediction in terms of carbohydrates (GO: 0005975) and metabolic process (GO: 0008152) strongly estimated to be used for PHA biosynthesis in the BNPI-92 strain (data not shown). Similarly, the presence of transcription DNA template (GO: 0006351) and regulation of transcription DNA template (GO: 0006355) may be used for cellular structure and function. In line with this study, the most conserved functional groups of GO of biological process such as cation transport (GO: 0006812), ion transport (GO:0006811), and single-organism transport (GO:0044765) [ 87 ] were reported for B. cereus. The presence of ATP binding, catalytic activity, and DNA binding GO in the BNPI-92 strain was confirmed as a molecular function in a comparable report for B. cereus (626 number of terms) [ 87 ]. But, it is a higher molecular function GO term than the current GO term reported for our strain. It was also indicated that our strain might have shared sequence similarity with B. cereus [ 87 ] . The catalytic activity was similarly confirmed from subsystem information of RAST server genome annotation a similar report for B. cereus ATCC 14579 T (NC_004722) strain [ 88 ] for certain extracellular enzymatic activity such as amylase, catalase, and protease. Cellular component category is among milestones for GO such as integral component of membrane, cellular component GO term, and cytoplasm GO term for identification of specific gene function in this strain. In line with this study, membrane-associated category GO was reported as a cellular component in Bacillus B. cereus that is associated with specific disease manifestations [ 87 ]. For B. subtilis essential genes, it was found that the cellular component GO terms with the highest enrichment score were predicted for cytoplasm (GO:0005737) and ribosome (GO:0006412) [ 89 ]. This suggested that the recent BNPI-92 strain did not share essential core genes with B. subtilis in terms of ribosome GO. However, B. subtilis and the BNPI-92 strain have certain common essential GO terms like cytoplasm GO (GO:0005737) category terms. Genome comparative analysis between these closely related strains can be achieved by using OrthoANI, Origin Ani, and ANI calculator. The OrthoANI obtained between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T strain (98.88%) genomes was higher than OrthoANI values reported between strain GFP-2 and B. siamensis KCTC 13613 T (94.1%) and GFP-2 strain and B. amyloliquefaciens DSM 7 T (94.4%) [ 90 ]. It was similarly reported that B. licheniformis CBA7126 strain was closest to B. licheniformis VTM3R78 (99.99% orthoANI), followed by B. licheniformis B4164 (99.98%), B. sp. H15-1 (99.85%), B. licheniformis B4124 (99.81%), and B. licheniformis V30 (99.80%) [ 91 ] which are generally higher sequence similarity reported for Bacillus sp. BNPI-92 strain. Origin ANI was also evaluated for comparative genome analysis for BNPI-92 and other closely related strains. Considering the finding of [ 17 ] benchmark for ANI (> 95–96%) and demarcation range set [ 31 ] for certain strains, it was indicated that the two strains belong to B. cereus . Therefore, the recent PHA-producing Bacillus sp. BNPI-92 strain isolated from landfill was confirmed to be a B. cereus type strain. It was delineated to B. cereus ATCC 14579 T type strain. Besides, based on analysis of original ANI value reported for CBA7126 genome sequences (with the symmetric identity of > 97%) [ 91 ] (> 99%) and its conclusion, Bacillus sp. BNPI-92 strains that showed 98.25% genome sequence similarity with B. cereus ATCC 14579 T suggested as B. cereus type strain. An is DDH was used to estimate the relatedness among BNPI-92 and the rest strains. It was found that 73.73% sequence similarity had been detected between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T strain. This indicated that BNPI-92 was suggested to be a B. cereus species based on a benchmark set for is DDH [ 40 ]. Thus, the BNPI-92 strain was delineated to a B. cereus species. In line with this study, about 43 B. cereus groups (BCG) were characterized with is DDH and found that cluster BCG03 yielded is DDH values ≥ 70%. Similarly, is DDH was performed for 15 strains delineation and found that is DDH values were ≥ 70% for cluster BCG04 that proposed to be B. thuringiensis type strain of [ 40 ] . In agreement with this study, is DDH values were predicted between Aeromonas veronii and the other two strains were slightly below 70% [ 40 ]. Except for B. cereus ATTCC 14579 T strains, the remaining strains shared a ≤ 70% genome sequence with BNPI-92 strains. Thus, based on [ 31 ] finding, BNPI-92 strain did not share sequence similarity to a species level with these strains. Strongly, it was confirmed that in is DDH values, ≥ 70% genome sequence similarity between two species was recommended as a cut-off point for the same species delineation [ 31 ]. Comparative genome analysis similarity among strains were checked by ANI calculator to estimate their genome sequence similarity using best hits (one-way ANI) and reciprocal best hits (two-way ANI) as per calculated by [ 31 ]. The ANI calculator used to estimate the ANI using best hits (one-way ANI) and reciprocal best hits (two-way ANI) between two genomics which were 99.04% (from 3277) and 99.10% (from 3206) fragments, respectively, as founded by Goris et al. [ 31 ]. It strongly confirms BNPI-92 strain to be B. cereus strain type based on Goris et al.'s [ 31 ] suggestion. A predicted, ANI between BNPI-92 and B. wiedmannii FSL W8-0169 strains which is 90.79% suggests that the BNPI-92 strains were different from B. wiedmannii FSL W8-0169 strains at both species and strain levels and it should not be named as B. wiedmannii . In line with this study, ANI was performed for strain AR156 and other B. cereus strains (905, UW85, and LCR12) [ 76 ]. It was found that their sequence similarity by ANI is lower than 93% and it was suggested that strain AR156 may represent a species other than B . cereus. The prediction of maximum ANI between BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T strain (99.1%) strongly confirms that BNPI-92 strain should be named as B. cereus BNPI-92 strain. In conclusion, based on a combination of RAST annotation of genomic DNA, OrthoVenn tool, in silicon DDH ( is DDH), OriginalANI, and OrthoANI results, Bacillus sp.BNPI-92 strains were confirmed to be a B. cereus type strain . Similarly, [ 91 ] comparative genomic analysis was performed for B. licheniformis CBA7126 using a certain related sequence of B. licheniformis strains. The TYGS result indicated that BNPI-92 strain has been identical with B. cereus ATCC 14579 strain at species and subspecies. The result for Delta value suggests that the constructed tree-likeness for our current phylogenetic tree was accurate as it was stated by [ 92 ]. The same authors stated that when δ approaches zero, the distance matrix for phylogeny is found to be accurate. For instance, if the δ value of the resulting distance matrix is 0.1629, globally, the highest distance quality obtained [ 92 ] is higher than the value obtained. However, it was revealed that operational taxonomic units (OTUs) with high δ values are able to provide a poor phylogenetic tree or less tree-like data. It could be due to sequence contamination or sequence incompleteness. It was found that vitamin, sugar metabolism, and genes involved in fructose/mannose, amino/nucleotide sugar metabolisms were expressed at the highest level in date palm ( Phoenix dactylifera, L.) at some stages of growth [ 93 ]. Glycolysis or gluconeogenesis and vitamin B6 metabolisms were similarly expressed in BNPI-92 and B. cereus ATCC 14579 T strain which were similarly detected in date palm tree [ 93 ]. This result suggested that these strains and date palm could have conserved genes for glycolysis and vitamin production though their classification in terms of kingdom or domains were distinct. It was detected that Bacillus sp.BNPI-9 shared relatively a similar level of gene expression for zeatin biosynthesis, vitamin B6 metabolisms, valine, leucine and isoleucine degradation, valine, leucine and isoleucine biosynthesis, and polyketide sugar unit biosynthesis metabolic pathways with B. cereus ATCC 14579 T for a given metabolic pathways. This could be used to estimate their evolutionary relationship based on a given gene encoded KEGG metabolic pathway. BNPI-92 strain used to produce PHA biosynthesis encoding genes ( phaA, phaB and phaC ) that suggested it was used for PHA polymerization. These genes were predicted when the De Novo assembly whole genome sequence had been computed and annotated in the RAST server system. In line with this study, it was found that genes such as phaA (1179 nts), phaB (738 nts), and phaC (1767 nts) that able to encode PHB biosynthetic enzyme were predicted for Ralstonia eutropha. These genes were organized on the same operon and designated as phaCAB [ 94 ]. In line with this study, the phaC gene sequence was reported in different Bacillus species genomic DNA such as B. megaterium, B. cereus , and B. anthracic . This confirms the current result for phaC gene predicted in annotated genomic DNA of BNPI-92 strain in Rast server or subsystem. The PHA polymerases or PHA synthases are able to catalyze 3-R-hydroxyalkyl CoA thioesters into PHA [ 95 – 98 ]. RAST server analysis showed that acetoacetyl-CoA reductase is able to metabolize and convert a cetyl-CoA to butyrate in PHA biosynthesis pathways. It was also confirmed that acetoacetyl-CoAreductase encoded by phaB gene is able to form PHB. The acetoacetyl-CoA reductase protein-coding gene ( phaB ) was reported in R. eutropha H16 genome sequence and harbors isologs phaB 2 , phaB 3 , and phaB 15 [ 54 , 99 ]. In line with this finding, an isologous isologs phaA gene sequences were similarly detected in annotated BNPI-92 strains and designed as phaA 1 , phaA 2 , and phaA 3 . They encode β-ketoacyl-CoA thiolase or acetyl-CoA acetyltransferase. In agreement with this assumption, phaA is stated as an encoding gene for β-ketoacyl-CoA thiolase or acetyl-CoA acetyltransferase enzyme and plays a role in PHB formation [ 54 ]. These enzymes were predicted in RAST server pipeline and suggested for the conversion of acetyl-CoA to butyrate and promote polyhydroxybutyrate metabolic processes. The existence of PhaR gene sequence BNPI-92 strain genomes suggested that this gene may be used to suppress PHA biosynthesis protein such as phaP [ 100 ], a well-known enzyme reported for encoding phasin protein and PHA granules polymerization along with phaC gene [ 95 ]. The prediction of this gene strongly confirms time course PHA biosynthesis of our result in which the PHA biosynthesis (data not shown) and Nile Blue A staining (data not shown) were decreased after 72 h onward. It was presumed that the phaR repressor protein may be over-expressed as the incubation period goes on. In contrary to this suggestion, a gram-positive poly (3-hydroxybutyrate) (PHB)-degrading B. megaterium N-18–25-9 harbors PHB depolymerase gene designed as PhaZ (Bm) [ 101 ] which is a confirming finding with our results in KEGG-KASS metabolic pathways. Gene suggested to encode 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase enzyme ( croR gene) was predicted in these strain and suggested that these strains have a common gene sequence that used to express this protein. After genome annotation had been performed, it was realized that 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase enzyme plays an essential role for acetyl-CoA fermentation to butyrate and PHB metabolism . In line with this study, it was found that 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase enzyme was able to hydrate crotonyl-CoA to 3-hydroxybutyryl-CoA and lead to PHB biosynthesis in the metabolic pathways [ 102 ]. However, in Clostridium aminobutyricum metabolic pathway, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase was used to hydrate crotonyl-CoA to 3-hydroxybutyryl-CoA and oxidized to acetoacetyl-CoA, which is finally cleaved to two acetyl-CoA (Buckel, 2010). The BNPI-92 contained pha gene loci such as phaP, phaQ, phaR, phaB , and phaC on the same operon and designated as phaPQRBC gene cluster. The phaP and phaQ genes were located in the opposite direction to phaR , phaB , and phaC which is boldly agreed with PHA genetic organization for B. megaterium subgroup [ 98 ]. It was predicted that the phaQ gene encodes a P(3HB)-transcriptional regulator ( phaP ) protein as predicted in the RAST server. Similarly, it was stated that phaQ gene is a PHB-responsive repressor due to phaP expression levels being blocked [ 103 ]. However, in B. megaterium with phaPQRBC gene cluster, PHA can be synthesized when it had been transferred to E. coli, Pseudomonas putida , and B. subtilis [ 95 , 104 ], a similar result with our suggestion of its role for PHA biosynthesis in the present study. However, in KEGG-KASS server, a gene encoding for enoyl-CoA hydratase and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase were separately predicted as fadB and fadN, respectively . However, in contrast to this perdition, [ 5 ] designed R-specific enoyl-CoA hydratase encoding gene as phaJ . Gene encoding for acetoacetyl-CoA synthetase was proposed as acsA based on [ 49 ] report, and similarly, it was predicted in BNPI-92 strain. Poly-3-hydroxybutyrate degradation affecting pathway had been identified in Sinorhizobium meliloti chromosomal loci as acetoacetyl coenzyme A (acetoacetyl-CoA) synthetase (encode by acsA gene) with 72,000 kDa molecular weight. These findings suggest that acetoacetyl-CoA synthetase tends to activate acetoacetate to acetoacetyl-CoA in the S. meliloti for poly-3-hydroxybutyrate accumulation [ 49 ]. We realized that the presence of phaA, phaB , and phaC genes in our BNPI-92 strains suggested that this strain has a capability to synthesize short chain length ( sch PHA) biopolymer. In the present study, FTIR, XRD, and NMR characterization for the same strain similarly confirm this assumption (data not shown). In line with this study, it was confirmed that Bacillus strains such as B. megaterium and B. cereus harboreda PHA biosynthesis gene [ 98 ] designated as phaC despite being essential unlike in nucleotide sequence. The same authors stated that these species tend to produce short-chain-length monomers such as 3-hydroxybutyrate (C 4 ) and 3-hydroxyvalerate (C 5 ) for PHA polymerization [ 98 ] which is strong evidence for our current suggestion. It was stated that phaB used to encode an NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase ( PhaB ) that plays a vital role for the conversion of (R)-3HB-CoA monomer to PHA polymerization whereas phaR and phaC genes encode PHA synthase subunits [ 103 ] which is a similar finding with our current suggestion for a phaPQRBC gene cluster roles. A genomic feature of the phaP gene predicted in BNPI-92 strains was not yet part of a subsystem in the RAST server pipeline. This gene may not be expressed despite existing on the same operon along with phaB, phaC , and phaR genes. It was reported that the phaP gene was used to encode PHA granule-associated protein ( PhaP ) [ 103 ] which is a non-enzymatic protein (Phasin) that is located on the surface of PHA granules within the microbial cell membrane. It was reported to function for blocking unnecessary proteins binding to PHA granules [ 103 ]. Once the metabolic pathway is well-known, it is more essential to produce large amounts of polyhydroxyalkanoate (PHA) polymers from microorganisms using a recommended carbon source. We realized that glucose conversion to pyruvate was activated by formate C-acetyltransferase enzyme that was encoded by pf1D gene in BNPI-92 strain. However, in L. sakei carbohydrate conversion, pyruvate was activated by formate C-acetyltransferase (pyruvate formate-lyase) (formate acetyltransferase ) [ 50 ] that encoded and identified as pflB gene. An atoB gene was used to encode acetyl-CoA C-acetyltransferase that is able to metabolically convert acetyle -CoA into acetoacetyl-CoA in the BNPI-92 strain. Similarly, in metabolic engineering of E.coli, acetyl-CoA C-acetyltransferase (encoded by atoB gene) [ 105 ] engaged in 1,3-Butanediol biosynthesis process, a strongly supporting report for our prediction, despite distinct strain involved in the metabolic process. This strain could have a common atoB gene that is essentially involved in metabolisms and carbon source utilization. Biosynthesis of 1,3-butanediol was observed when acetyl-CoA C-acetyltransferase [ 105 ] had been overexpressed by metabolically engineered E. coli . The same authors further stated that acetyl-CoA C-acetyltransferase can be under-expressed due to aldehyde dehydrogenase activity in spite of atoB gene overexpression [ 105 ]. It was shown that acetyl-CoA has been metabolically activated into acetoacetyl-CoA by 3-ketoacyl-CoA thiolase or acetyl -CoA acyltransferase (encoded by fadA ) enzyme. In consistency with this study, it was found that two acetyl-CoA molecules had been condensed to acetoacetyl-CoA in the form of Zoogloea ramigera and Halomonas boliviensis [ 51 , 52 , 106 ]. However, the enzyme involved in the conversion of acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA was identified as 3-ketothiolase. Its gene was similarly designated as phbA [ 54 ]. Similarly, it was stated that β-ketoacyl-CoA thiolase (encoded by phbA gene) was able to condense two molecules of acetyl-CoA into acetoacetyl-CoA in fluorescent Pseudomonads [ 55 ]. Davis et al. [ 56 ] identified a new pathway b-ketothiolase and NADPH-dependent acetoacetyl CoA reductase pathway that encoded phaA and phaB gene Bacillus sp. 256 isolated from soil samples. Five genes namely phaA, phaB, phaR , phaC, and phaP were similarly reported for B. cereus strain tsu1 strain [ 57 ] which is a similar isolate at species with our newly isolated strain. Acetoacetyl-CoA reductase was used to convert acetoacetyl-Co-A into (R)-3-hydroxybutanoyl - CoA in B. cereus BNPI-92 strain. In line with this study, in PHA biosynthesis pathway, phbB was found to be used for encoding NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase enzyme that tends to convert acetoacetyl-CoA to 3- hydroxybutyryl - CoA [ 54 ] in Z. ramigera . However, from the same pathway, phaB isologous genes, namely phaB 2 , phaB 3 , and 15 others were identified in R. eutropha H16 [ 58 ]. The gene sequence analyses showed them as paralogs originated from gene duplication events [ 58 ]. It was further confirmed that NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase (encoded by phbB ) was able to reduce acetoacetyl-CoA to (R)-3-hydroxybutyryl-CoA [ 55 ] in F. pseudomonads metabolic pathway. In the genomic sequence of the BNPI-92 strain, phaC is predicted to be used for PHA biosynthesis, similar information with the review paper written by [ 107 ]. P(3HB) polymerase engaged in (R)-3-hydroxybutyryl-CoA monomers polymerization into short-chain length PHB. It was encoded by phbC gene [ 55 ] in F. pseudomonads, which strongly confirms our prediction. Despite similar genes reported from different genera, these bacterial genera may share certain common gene sequence in evolutionary history. PHA biosynthesis due to PHA polymerases ( PhaCs gene) had been reported for B. megaterium and Rhodospirillum rubrum . The PHA polymerization (PHB) was facilitated with PHA synthase enzymes that had been reported for the conversion of 3-R-hydroxyalkyl CoA thioesters to PHAs [ 96 , 108 , 109 ]. B utyryl-CoA dehydrogenase encoding gene was detected in the genome of Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei (strain DSM 2245B), similar result predicted in BNPI-92 strain. It was a slow growing anaerobic and evolutionarily adapted bacteria for syntrophic growth with methanogens and other hydrogen or formate using microorganisms in the natural ecosystem [ 60 ]. Its gene was identified as Swol_1933 [ 60 ]. A 3-hydroxybutyrate dehydrogenase-encoding gene ( bdhA ) had been cloned and sequenced from Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti [ 61 ]. It was reported that the gene contains 777 bp open reading frame that encodes a polypeptide of 258 amino acid residues, strongly similar to our prediction for gene size. bdhA is the first gene transcribed in an operon that also includes xdhA , encoding xanthine oxidase/dehydrogenase [ 61 ] in R. meliloti . It was found that 2-hydroxyglutarate dehydrogenase is involved for PHA biosynthesis in the BNPI-92 strain. However, in Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, and R. eutropha transgenic cell , 2-hydroxyglutarate dehydrogenase overexpression had been reported for crotonic acid production from 2-oxoglutarate [ 110 ]. This could be due to different strain types involved in the metabolic process. It was stated that 2-hydroxyglutarate dehydrogenase had been encoded by lhgD in E. coli k12 which is a contradictory result to our prediction. Similarly, it was reported that gene encoding for glutaconate CoA-transferase , subunit A was detected in Acidaminococcus fermentans (strain ATCC 25085 / DSM 20731 / VR4) and named as gctA [ 111 ] . Although mechanisms of action were unknown, in this pathway, glutaconyl-CoA decarboxylase was suggested for PHA biosynthesis. However, 2-hydroxyglutarate dehydrogenase is reported for crotonic acid production [ 112 ], which has an additional role in 2-oxoglutarate pathway. In agreement with our estimation, it was stated that conversion of glutaconyl-CoA to crotonyl-CoA was activated by glutaconyl-CoA decarboxylase and glutaryl-CoA dehydrogenase in Pseudomonas , Rhodomicrobium annielii, R. palustris, and Rhodocyclus purpureus [ 113 ] . Although currently not detected in B. cereus BNPI-92 strain, a gene encoding for glutaconyl-CoA decarboxylase had been reported as gcdA in Acidaminococcus fermentans (ATCC 25085 / DSM 20731) type strain [ 111 ]. Hydroxybutyrate-dimer hydrolase plays a vital role for hydrolysis of (R)-3-hydroxybutyrate (3HB) to (R)-3-((R)-3-hydroxybutnoyloxy) butanoate in B. cereus BNPI-92 strain for acetoacetate metabolic pathway. Finally, PHB was produced by poly (3-hydroxybutyrate) depolymerase when B. cereus BNPI-92 strain used (R)-3-((R)-3-hydroxybutnoyloxy) butanoate as a carbon source. The presence of this enzyme suggests that phaZ , a depolymerase enzyme, could have existed in B. cereus BNPI-92 strain, a similar PHA gene profile reported in B. megaterium [ 95 ]. In line with our estimation, it was stated that intracellular D(-)-3-hydroxybutyrate (3HB)-oligomer hydrolase gene from R. eutropha ( Alcaligenes eutrophus) H16 was cloned, sequenced, and characterized as phaZ [ 114 ]. The rMLST is an approach that indexes variation among different housekeeping genes that encoding the bacterial ribosome protein subunits. In this study, using rMLST, genes such as rps , rpl , and rpm genes were anticipated for Bacillus sp. BNPI-92 strain. Study showed that rps and rplX genes were identified from the genomic DNA of Streptococcus pneumoniae [ 115 ] using rMLST which is a similar finding to the recent prediction . This indicated that these genes may be conserved among Bacillus and other bacterial species. The rMLST report had supported 100% B. cereus . Other related bacterial species were also predicted during rMLST analysis. They are mainly B. albus, B. paranthracis, B. thuringiensis, and B. tropicus . Conclusions Whole genome sequence was performed and PHA-producing Bacillus sp. BNPI-92 was delineated to a specific category. In this identification, SPAdes, ABySS, and Velvet software were employed for de novo assembly, and velvet was chosen for analysis since it has better statistics. A total average of 73.85714 bp contigs was generated using Velvet assembler with an average length of 698,773 bp and with minimum and maximum length of 982,387 and 5,527,513 bp, respectively. In this WGS analysis, 5719 genes were predicted. About 5652 genes were predicted to be significant. Genome annotation was performed using the UniProt database, BLASTX program, and RAST server for Bacillus sp. BNPI-92 strain genome assembly to identify functional gene, gene location, and distribution. The assembled genome sequence of Bacillus sp. BNPI-92 strain was annotated to identify functional genes, their location, and arrangements using RAST server. It was found that the recent PHA-producing strain was related to B. cereus ATCC 14579 in terms of GC %, sequence length, number of coding sequence, and size and location of PHA expressing genes such as phaA, phaB , and phaC genes. Multiple genomic comparisons were performed and the recent strains and its related strains have shared 1231 gene clusters which were conserved, and probably, it could be a core genome belonging to these strains. The sequence of the recent strain was annotated using RAST server and it was found that this strain could be B. cereus ATCC 14579 type strains based on genome information and their gene features. In the present study, 16SrRNA gene sequence was extracted from WGS using EzBioCloud to identify the BNPI-92 strain. It was found that BNPI-92 has 100% sequence similarity with B. cereus ATCC 14579. Orthologous Average Nucleotide Identity (OAT) tools such as OrthoANI, Original ANI, and GGDC of 16SrRNA were performed for Bacillus sp. BNPI-92 comparative genomic analysis. The result showed that Bacillus sp. BNPPI-92 was the closest strain to B. cereus ATCC 14579 with 98.88% OrthoANI followed by B. thuringiensis (92.09%, OrthoANI), B. wiedmannii FSL w8-0169 (91.76%, OrthoANI), B. paranthracis Mn5 (91.54), and (98.89%, OrthoANI) and B. anthracis Ames (91.70%, OrthoANI). Based on similarity values > 95–96%, the current PHA-producing Bacillus sp. BNPI-92 isolated from landfill was strongly confirmed to be a B. cereus type strain. Finally, it was designated as B. cereus BNPI-92. Genetic organization was predicted for Bacillus sp. BNPI-92 using RAST server to determine a PHA biosynthesis encoding gene. It was found that phaP , phaQ, phaR, phaA , phaB , and phaC were found in both B. cereus BNPI-92. These genes were located on the same operon except for phaA . It was designated as phaPQRBC . Supplementary Information Additional file 1. Supplementary Information Additional file 1.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7206762/

Extraction and Purification of Wall-Bound Polymers of Gram-Positive Bacteria

The envelope of gram-positive bacteria encompasses the cell wall, a rigid exoskeleton comprised of peptidoglycan that provides protection against lysis and governs bacterial cell shapes. Peptidoglycan also serves as the site of attachment for proteins and nonproteinaceous polymers that interact with the bacterial environment. Nonproteinaceous molecules include teichoic acids, capsular polysaccharides, and secondary cell wall polysaccharides (SCWP). Treatment of gram-positive bacterial cells with proteases, nucleases, and detergents results in the isolation of "murein sacculi" (i.e., peptidoglycan with bound carbohydrate polymers). Incubation of sacculi with acid or base releases carbohydrate polymers that can be purified for further biochemical characterization. This protocol describes the hydrofluoric acid extraction and purification of the secondary cell wall polymer of Bacillus anthracis that is also found in the envelope of the other members of the Bacillus cereus sensu lato group of bacteria.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7825107/

Harnessing the Membrane Translocation Properties of AB Toxins for Therapeutic Applications

Over the last few decades, proteins and peptides have become increasingly more common as FDA-approved drugs, despite their inefficient delivery due to their inability to cross the plasma membrane. In this context, bacterial two-component systems, termed AB toxins, use various protein-based membrane translocation mechanisms to deliver toxins into cells, and these mechanisms could provide new insights into the development of bio-based drug delivery systems. These toxins have great potential as therapies both because of their intrinsic properties as well as the modular characteristics of both subunits, which make them highly amenable to conjugation with various drug classes. This review focuses on the therapeutical approaches involving the internalization mechanisms of three representative AB toxins: botulinum toxin type A, anthrax toxin, and cholera toxin. We showcase several specific examples of the use of these toxins to develop new therapeutic strategies for numerous diseases and explain what makes these toxins promising tools in the development of drugs and drug delivery systems. 1. Introduction The FDA is increasingly approving biological drugs. In 2018, these protein-based drugs made up 25% of FDA approvals and included antibodies, growth factors, hormones, and enzymes that target a broad range of diseases [ 1 ]. The market for such drugs is expected to increase over the next few years due to their interesting properties [ 2 ]. Compared to traditional small-molecule drugs, protein- or peptide-based drugs generally show high specificity, high efficacy and high selectivity, and allow the development of drugs for a broad range of targets, notably in cancer treatment [ 3 ]. The increasing market share for biologics is even more impressive considering the inability of most of these drugs to cross the cellular plasma membrane and reach the cytosol, making their delivery a huge challenge that currently hinders the field [ 4 ]. Indeed, tools that could improve the delivery of biologics, especially those that could be applied broadly, would see immediate application and greatly benefit the drug-delivery field. Furthermore, if delivery were sufficiently efficient, the range of potential drug targets would be drastically broadened due to the increased accessibility of intracellular proteins. Fortunately, a naturally evolved system for delivering functional proteins into cells is provided by bacterial toxins, which have evolved to hijack cellular internalization mechanisms and developed membrane translocation devices for exactly this purpose. AB toxins are a family of bacterial toxins that include diphtheria toxin, cholera toxin, anthrax toxin, Shiga toxin, and botulinum toxin, among others [ 5 , 6 , 7 , 8 , 9 ]. They are named for their two components: an active part (A) that is responsible for the catalytic activity of the toxin, and a binding part (B) that is involved in binding to the cell membrane and escorting the A subunit to its destination. AB toxins have finely tuned their cellular entry to evade host defenses, providing hints and tools for protein-based drug development. In this review, we focus on how the internalization mechanisms of three AB toxins—botulinum toxin type A, anthrax toxin, and cholera toxin—can be used in different therapeutic approaches ( Table 1 ). We decided to focus on these three toxins based on the strong modular potential of anthrax toxin, on the already approved use of botulinum toxin type A in several neurological disorders and on the wide variety of therapeutical applications of cholera toxin. The practical approaches presented in this review take advantage of both the intrinsic properties of the toxins as well as the modularity of both the A and B subunits, all aspects that can be further extended to other AB toxins. 2. Botulinum Toxin Type A 2.1. Botulinum Toxin Type A Internalization Mechanism As part of the AB toxin family, botulinum neurotoxins consist of seven different toxin types (termed A–G) and are produced by the Clostridium family of bacteria [ 7 ]. Generally, the toxin reaches the bloodstream by using transcytosis to cross the epithelial layer of the lungs or the gastrointestinal tract [ 62 ]. This review will briefly depict the internalization mechanism of botulinum toxin type A (BoNT/A), which is the most-studied toxin subtype with the most FDA-approved therapeutical applications. For more detailed informations about this particular process, the readers are referred to previously published literature [ 7 , 63 ] BoNT/A is composed of a catalytic subunit, the 50-kDa light chain (LC), connected by a disulfide bridge to the binding subunit, a 100-kDa heavy chain (HC), responsible for the binding and translocation of the catalytic subunit into the cytosol ( Figure 1 A) [ 10 ]. The HC first recognizes polysialogangliosides (PSGs) at the nerve terminal and then stabilizes the binding by a high-affinity interaction with synaptic vesicle protein 2 (SV2) [ 11 , 19 ]. Endocytosis of BoNT/A targets it to small synaptic vesicles, which was shown to be enhanced by synaptic vesicle recycling induced by neuronal activity [ 20 , 24 ]. The exact membrane translocation mechanism remains unsolved, though experiments with lipid bilayer modeling this process were reviewed by Pirazzini et al. [ 64 ]. According to the models, the acidic environment of synaptic vesicles induces a structural change of the HC, converting it into a chaperone and an ion channel that unfolds LC and shuttles it across the membrane of the vesicle to the cytosol [ 64 ]. In the cytosol, LC refolds into a Zn 2+ -dependent metalloprotease that hydrolyses a specific peptide bond in SNAP-25, which is part of the cytosolic membrane fusion complex, termed SNARE [ 28 , 65 , 66 ]. This complex consists of three different proteins: SNAP-25, syntaxin, and vesicle-associated membrane protein (VAMP), the latter two being targets of the other botulinum toxin types [ 67 , 68 ]. The cleavage of SNAP-25 by BoNT/A in neurons inhibits the fusion of synaptic vesicles, and thus the release of neurotransmitters in the synapses, leading to paralysis. While the half-life of the toxin in the bloodstream is approximately four hours, the lifetime of BoNT/A is drastically increased once it reaches the cytosol due to its high stability and resistance to proteasomal degradation [ 69 , 70 ]. The very long lifetime of the toxin explains how it can induce paralysis for up to 6 months in humans. Although botulinum toxin subtypes seem to internalize using the same pathway, they bind to different receptors with variable expression in the different neuronal cell types and their catalytic subunits target different proteins of the SNARE complex, inducing variations in the inhibition of synaptic vesicle fusion. These two aspects of botulinum toxin, aside from its intrinsic therapeutic properties, allow for the development of new therapeutic strategies for numerous diseases. 2.2. Botulinum Toxin Type A Therapeutic Applications Under the name of Botox ® , botulinum toxin is well known for its use in cosmetic treatments, as its effect on acetylcholine release by motoneurons at the neuromuscular junction leads to muscle relaxation. This is of great interest in muscle hyperactivation disorders. In this context, BoNT/A was first approved by the FDA in 1989 for the treatment of blepharospasm, a hyperactivation of the eyelid muscles that leads to repetitive and uncontrolled eyelid quivering. The long-term effect of the toxin, which can last for months, and the low diffusion rate in the extracellular fluid, which allows restricted and precise treatment in targeted body areas, make BoNT/A an invaluable therapeutic tool [ 30 ]. Since its initial approval, botulinum toxin has shown promise in the treatment of many other dystonic and spastic disorders which are associated with the dysfunction of the skeletal nervous system and voluntary body movements, such as cervical dystonia, laryngeal dystonia, or upper and lower limb spasticity [ 31 ]. BoNT/A also inhibits the autonomic nervous system, which controls unconscious muscular contractions, and was used in the treatment of several autonomic disorders, such as hyperhidrosis, hypersalivation, allergic rhinitis, as well as some urologic and gastrointestinal disorders characterized by hyperactivation of smooth muscles [ 71 ]. The development of therapeutic BoNT/A also showed a nociceptive effect that was first considered to be a consequence of muscle relaxation [ 72 ], though it was later shown that the reduction in pain was a direct effect of BoNT/A on the nociceptor system. This effect was induced by a combination of the inhibition of neuropeptides and the release of anti-inflammatory mediators with a decrease in the transport of pain sensors, such as TRPV1 and TRPA1, at the plasma membrane in a process that relies on SNAP-25 [ 7 ]. Furthermore, several publications showed a distant action of the toxin in CNS regions following localized peripheral injections, indicating that the nociceptive function of botulinum toxin might arise from retro and anterograde axonal transport, which is responsible for the movement of different organelles to and from the neuronal cell body, towards the central nervous system [ 73 , 74 ]. Indeed, BoNT/A has been FDA-approved for the treatment of chronic migraines and also showed efficacy in the treatment of chronic headaches and certain neuropathies, such as postherpetic neuralgia, post-traumatic neuralgia, and painful diabetic neuropathy [ 63 ]. The intrinsic properties of botulinum toxin have made it an effective therapeutic for many seemingly unrelated disorders, though the major therapeutic potential of BoNT/A lies in its modularity. For example, the seven currently recognized serotypes (A-G) of botulinum toxin each have several subtypes (A1, C2, etc.) [ 75 ]. All these toxins have the same general structure consisting of one catalytic domain (LC), one binding domain, and one translocation domain (HC), but they each have specific binding affinities for different receptors and distinctive cleavage sites on various targets [ 68 , 76 ]. This modularity is normally used by bacteria to target different neuronal membranes and induce various deleterious effects, though it has also been elegantly exploited by Rummel et al. They swapped the N-terminal and C-terminal domain of the HC of several botulinum toxin types and showed that these domains can modulate toxin affinity for unique neuronal membranes [ 77 ]. In this context, a botulinum toxin chimera was designed with the HC of BoNT/B (HC B ), due to higher concentration of the HC B receptor, Synaptotagmin II (SytII), over HC A receptors for an increased uptake in synaptic vesicles, and the LC of BoNT/A (LC A ), due to its longer lifetime in the cytosol compared to LC B . This chimera induced a prolonged neuromuscular paralysis in mice of 50 days, compared to 30 days when using the full-length BoNT/A [ 49 ]. Similarly, Wang et al. made a chimeric botulinum toxin to target and suppress the release of the pain signaling peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP), by sensory neurons. This distinctive specificity was achieved due to the properties of the three different chains of the chimera, which was composed of LC E fused to a mutated inactive form of LC A (mLC A ), both connected to the HC A that internalized the fused LCs in the cytosol [ 38 ]. In this chimera, internalization was achieved because sensory neurons express the HC A receptor isoform SV2C, but not the HC E receptor isoforms SV2A and B [ 19 , 78 ]. A long-lasting effect was due to the presence of a dileucine motif in mLC A that plays a role in its protection from proteasomal degradation [ 79 ]. Finally, the strong inhibition of CGRP release is due to the LC E -induced cleavage of 26 amino acids from the C-terminal of SNAP-25, while LC A cleaves only 9. Taken together, this LC E -mLC A -HC A chimera showed strong nociceptive inhibition both in vitro in trigerminal ganglion neurons and in vivo in mice [ 38 ]. These two chimera examples perfectly illustrate how the modularity of the different types of botulinum toxin can affect their therapeutic applications. Using the same strategy, fusion proteins of botulinum toxin with other proteins were created in order to modulate the targeted receptor and, thus, the targeted cell type. To develop a treatment for acromegaly, an endocrine disorder characterized by an increased secretion of pituitary growth hormone (GH), Somm et al. made a modified fusion construct of the GH-releasing hormone with the translocation domain of HC D and the LC D , which cleaves one of the protein of the SNARE complex responsible for GH secretion, VAMP2 [ 50 ]. This construct decreased GH production and secretion in vivo, which reduced the body weight and body size of juvenile rats. Similarly, a study using a botulinum toxin fusion construct with wheat germ agglutinin inhibited insulin secretion in hamster pancreatic cells [ 51 ]. Together, these examples further illustrate the extraordinarily broad spectrum of therapeutic applications of AB toxins and how the properties of the bacterial toxins can be exploited to achieve a targeted therapeutic strategy. 2.1. Botulinum Toxin Type A Internalization Mechanism As part of the AB toxin family, botulinum neurotoxins consist of seven different toxin types (termed A–G) and are produced by the Clostridium family of bacteria [ 7 ]. Generally, the toxin reaches the bloodstream by using transcytosis to cross the epithelial layer of the lungs or the gastrointestinal tract [ 62 ]. This review will briefly depict the internalization mechanism of botulinum toxin type A (BoNT/A), which is the most-studied toxin subtype with the most FDA-approved therapeutical applications. For more detailed informations about this particular process, the readers are referred to previously published literature [ 7 , 63 ] BoNT/A is composed of a catalytic subunit, the 50-kDa light chain (LC), connected by a disulfide bridge to the binding subunit, a 100-kDa heavy chain (HC), responsible for the binding and translocation of the catalytic subunit into the cytosol ( Figure 1 A) [ 10 ]. The HC first recognizes polysialogangliosides (PSGs) at the nerve terminal and then stabilizes the binding by a high-affinity interaction with synaptic vesicle protein 2 (SV2) [ 11 , 19 ]. Endocytosis of BoNT/A targets it to small synaptic vesicles, which was shown to be enhanced by synaptic vesicle recycling induced by neuronal activity [ 20 , 24 ]. The exact membrane translocation mechanism remains unsolved, though experiments with lipid bilayer modeling this process were reviewed by Pirazzini et al. [ 64 ]. According to the models, the acidic environment of synaptic vesicles induces a structural change of the HC, converting it into a chaperone and an ion channel that unfolds LC and shuttles it across the membrane of the vesicle to the cytosol [ 64 ]. In the cytosol, LC refolds into a Zn 2+ -dependent metalloprotease that hydrolyses a specific peptide bond in SNAP-25, which is part of the cytosolic membrane fusion complex, termed SNARE [ 28 , 65 , 66 ]. This complex consists of three different proteins: SNAP-25, syntaxin, and vesicle-associated membrane protein (VAMP), the latter two being targets of the other botulinum toxin types [ 67 , 68 ]. The cleavage of SNAP-25 by BoNT/A in neurons inhibits the fusion of synaptic vesicles, and thus the release of neurotransmitters in the synapses, leading to paralysis. While the half-life of the toxin in the bloodstream is approximately four hours, the lifetime of BoNT/A is drastically increased once it reaches the cytosol due to its high stability and resistance to proteasomal degradation [ 69 , 70 ]. The very long lifetime of the toxin explains how it can induce paralysis for up to 6 months in humans. Although botulinum toxin subtypes seem to internalize using the same pathway, they bind to different receptors with variable expression in the different neuronal cell types and their catalytic subunits target different proteins of the SNARE complex, inducing variations in the inhibition of synaptic vesicle fusion. These two aspects of botulinum toxin, aside from its intrinsic therapeutic properties, allow for the development of new therapeutic strategies for numerous diseases. 2.2. Botulinum Toxin Type A Therapeutic Applications Under the name of Botox ® , botulinum toxin is well known for its use in cosmetic treatments, as its effect on acetylcholine release by motoneurons at the neuromuscular junction leads to muscle relaxation. This is of great interest in muscle hyperactivation disorders. In this context, BoNT/A was first approved by the FDA in 1989 for the treatment of blepharospasm, a hyperactivation of the eyelid muscles that leads to repetitive and uncontrolled eyelid quivering. The long-term effect of the toxin, which can last for months, and the low diffusion rate in the extracellular fluid, which allows restricted and precise treatment in targeted body areas, make BoNT/A an invaluable therapeutic tool [ 30 ]. Since its initial approval, botulinum toxin has shown promise in the treatment of many other dystonic and spastic disorders which are associated with the dysfunction of the skeletal nervous system and voluntary body movements, such as cervical dystonia, laryngeal dystonia, or upper and lower limb spasticity [ 31 ]. BoNT/A also inhibits the autonomic nervous system, which controls unconscious muscular contractions, and was used in the treatment of several autonomic disorders, such as hyperhidrosis, hypersalivation, allergic rhinitis, as well as some urologic and gastrointestinal disorders characterized by hyperactivation of smooth muscles [ 71 ]. The development of therapeutic BoNT/A also showed a nociceptive effect that was first considered to be a consequence of muscle relaxation [ 72 ], though it was later shown that the reduction in pain was a direct effect of BoNT/A on the nociceptor system. This effect was induced by a combination of the inhibition of neuropeptides and the release of anti-inflammatory mediators with a decrease in the transport of pain sensors, such as TRPV1 and TRPA1, at the plasma membrane in a process that relies on SNAP-25 [ 7 ]. Furthermore, several publications showed a distant action of the toxin in CNS regions following localized peripheral injections, indicating that the nociceptive function of botulinum toxin might arise from retro and anterograde axonal transport, which is responsible for the movement of different organelles to and from the neuronal cell body, towards the central nervous system [ 73 , 74 ]. Indeed, BoNT/A has been FDA-approved for the treatment of chronic migraines and also showed efficacy in the treatment of chronic headaches and certain neuropathies, such as postherpetic neuralgia, post-traumatic neuralgia, and painful diabetic neuropathy [ 63 ]. The intrinsic properties of botulinum toxin have made it an effective therapeutic for many seemingly unrelated disorders, though the major therapeutic potential of BoNT/A lies in its modularity. For example, the seven currently recognized serotypes (A-G) of botulinum toxin each have several subtypes (A1, C2, etc.) [ 75 ]. All these toxins have the same general structure consisting of one catalytic domain (LC), one binding domain, and one translocation domain (HC), but they each have specific binding affinities for different receptors and distinctive cleavage sites on various targets [ 68 , 76 ]. This modularity is normally used by bacteria to target different neuronal membranes and induce various deleterious effects, though it has also been elegantly exploited by Rummel et al. They swapped the N-terminal and C-terminal domain of the HC of several botulinum toxin types and showed that these domains can modulate toxin affinity for unique neuronal membranes [ 77 ]. In this context, a botulinum toxin chimera was designed with the HC of BoNT/B (HC B ), due to higher concentration of the HC B receptor, Synaptotagmin II (SytII), over HC A receptors for an increased uptake in synaptic vesicles, and the LC of BoNT/A (LC A ), due to its longer lifetime in the cytosol compared to LC B . This chimera induced a prolonged neuromuscular paralysis in mice of 50 days, compared to 30 days when using the full-length BoNT/A [ 49 ]. Similarly, Wang et al. made a chimeric botulinum toxin to target and suppress the release of the pain signaling peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP), by sensory neurons. This distinctive specificity was achieved due to the properties of the three different chains of the chimera, which was composed of LC E fused to a mutated inactive form of LC A (mLC A ), both connected to the HC A that internalized the fused LCs in the cytosol [ 38 ]. In this chimera, internalization was achieved because sensory neurons express the HC A receptor isoform SV2C, but not the HC E receptor isoforms SV2A and B [ 19 , 78 ]. A long-lasting effect was due to the presence of a dileucine motif in mLC A that plays a role in its protection from proteasomal degradation [ 79 ]. Finally, the strong inhibition of CGRP release is due to the LC E -induced cleavage of 26 amino acids from the C-terminal of SNAP-25, while LC A cleaves only 9. Taken together, this LC E -mLC A -HC A chimera showed strong nociceptive inhibition both in vitro in trigerminal ganglion neurons and in vivo in mice [ 38 ]. These two chimera examples perfectly illustrate how the modularity of the different types of botulinum toxin can affect their therapeutic applications. Using the same strategy, fusion proteins of botulinum toxin with other proteins were created in order to modulate the targeted receptor and, thus, the targeted cell type. To develop a treatment for acromegaly, an endocrine disorder characterized by an increased secretion of pituitary growth hormone (GH), Somm et al. made a modified fusion construct of the GH-releasing hormone with the translocation domain of HC D and the LC D , which cleaves one of the protein of the SNARE complex responsible for GH secretion, VAMP2 [ 50 ]. This construct decreased GH production and secretion in vivo, which reduced the body weight and body size of juvenile rats. Similarly, a study using a botulinum toxin fusion construct with wheat germ agglutinin inhibited insulin secretion in hamster pancreatic cells [ 51 ]. Together, these examples further illustrate the extraordinarily broad spectrum of therapeutic applications of AB toxins and how the properties of the bacterial toxins can be exploited to achieve a targeted therapeutic strategy. 3. Anthrax Toxin 3.1. Anthrax Toxin Internalization Mechanism An important concern for animal health and human public safety in the context of bioterrorism, anthrax toxin is an AB toxin produced by the gram-positive spore-forming bacterium Bacillus anthracis . This toxin consists of a B subunit, protective antigen (PA), and two catalytic A subunits, lethal factor (LF) and edema factor (EF). PA is an 83-kDa protein that is responsible for the binding of the toxin to its main receptors, capillary morphogenesis 2 (CMG2) and tumor endothelial marker 8 (TEM8) [ 12 , 13 ]. LF is an 91-kDa matrix metalloprotease that cleaves the MAPKK family members, which impairs the associated signaling pathways and eventually leads to apoptosis, especially in macrophages [ 29 , 80 ]. EF is a calmodulin-dependent adenylyl cyclase that increases the cytosolic cAMP levels. This review briefly describes the internalization process of anthrax toxin and, for a more in-depth understanding of this mechanism, readers are oriented towards previously published reviews [ 6 ]. Initially in LF and EF internalization, extracellular PA binds to one of its receptors, CMG2 or TEM8, and then is cleaved by furin-family proteins ( Figure 1 B). This cleavage allows PA to oligomerize into heptamers or octamers, also called pre-pores [ 15 , 16 , 81 ], which can then recruit three or four LF or EF subunits, respectively, for internalization. On the cytosolic side, PA binding to the TEM8 or CMG2 receptor causes it to release from the actin cytoskeleton [ 82 , 83 ], allowing ubiquitination of the receptor, which triggers endocytosis of the receptor-anthrax toxins complex [ 82 ]. Anthrax toxin and its receptors are then targeted to early endosomes where they are sorted in endosomal intraluminal vesicles (ILVs) and trafficked through the endocytic pathway towards late endosomes [ 21 ]. On the way to late endosomes, the acidification of the microenvironment induces a conformational change in the PA pore [ 25 ], and this low pH is also required for the translocation of LF [ 26 ]. Pores can form at the limiting membrane of the endosomes, translocating LF or EF directly into the cytosol, though most pores form in the membrane of ILVs [ 21 , 84 ]. These pores allow the translocation of LF or EF to the lumen of ILVs and, by back-fusion of ILVs with the limiting membrane of late endosomes, LF or EF eventually reaches the cytosol [ 21 ]. In opposition to BoNT/A, evidence suggest that LF has a very short half-life in the cytosol and its long-term effect relies on its ability to remain dormant in ILVs which stochastically back-fuse with the membrane of endosomes over a long period of time [ 21 ]. 3.2. Anthrax Toxin Therapeutic Applications The therapeutic potential of anthrax lethal toxin was originally exploited in anti-cancer treatments due to its inhibitory effect on the MAPKK-associated pathway. Unlike normal cells, cancer cells usually rely on only a few dysregulated pathways to increase their growth, survival, or motility. Accordingly, some cancers, such as melanoma bearing the V600E BRAF mutation, mostly rely on the constitutively activated MAPK pathway for cell growth and survival, and anthrax toxin was shown to decrease both these processes in this particular cell line [ 32 ]. Similarly, anthrax lethal toxin was shown to reduce cell growth and tumor angiogenesis in renal cell carcinoma and to reduce cell motility and invasiveness in astrocytes by targeting the MAPK pathway [ 33 ]. Although anthrax lethal toxin showed interesting intrinsic anti-tumor properties, most of its potential in therapy relies on its modular properties, like its ability to translocate different non-native proteins, drugs, and other molecules. As mentioned previously, PA oligomers create a pore in endosomes, allowing LF to eventually reach the cytosol, suggesting that LF fusion proteins could go through the pore as well—as long as they can successfully unfold while passing through the pore and refold later in the cytosol. In the 1990s, the first attempts to fuse proteins to the N-terminus of the LF subunit were done to target proteins to the cytosol and confirm the potential of anthrax toxin as a delivery system. FP59, a fusion between the N-terminus of LF (LF N ) with the ADP-ribosylation domains of Pseudomonas exotoxin A, was the first successful translocation of a foreign protein into the cytosol [ 39 ]. Shortly after, both catalytic domains of the Shiga and diphtheria toxins reached the cytosol when fused to LF N , further supporting that the N-terminal residues of LF were sufficient to translocate complicated polypeptide chains through the PA pore [ 40 , 41 ]. However, Blanke et al. later showed that a simple positively-charged polycationic peptide could replace LF N for the delivery of diphtheria toxin to the cytosol [ 42 ]. Besides bacterial toxins, the LF N delivery system was shown to be useful in other applications, such as the development of a potential HIV vaccine and the treatment of neurodegenerative diseases [ 43 , 44 ]. In a broader perspective, Rabideau et al. assessed the feasibility of translocation through the PA pore for many different cargo molecules, from short or cyclic peptides to small molecule drugs. They concluded that while non-canonical peptides and small-molecule drugs, such as doxorubicin, can be translocated, cyclic peptides and the small molecule docetaxel cannot, which they hypothesized was due to rigidity of the cargo [ 45 ]. These examples provide strong evidence that many different cargo proteins can be delivered to the cytosol both in vitro and in vivo using anthrax toxin, which can be used for the targeted delivery of vaccines, drugs, and other proteins. Besides its ability to translocate different non-native cargos, another modular characteristic of PA lies in the specificity of the protease that processes it, thereby allowing it to oligomerize. In the last two decades, several groups focused on unraveling the best combinations of mutations in PA that would allow more targeted and less toxic tumor therapies. The two PA mutants, PA-L1 and PA-U2, were programmed to be specific for several cancer cell lines in vitro by changing the cleavage site from furin to matrix metalloproteases (MMPs) and urokinase plasminogen activator (uPA), respectively [ 52 , 53 ], which are overexpressed in many cancer types while not very abundant at the surface of normal cells. In particular, PA-U2 showed a strong anti-tumor activity and specificity when combined with FP59 in mice [ 54 ]. To make the tumor targeting more specific, PA-L1 and PA-U2 were mutated on their homo-oligomerization domain to render them complementary, making them even more specific to cancer cells expressing both proteases. This approach was shown to be efficient with different sets of PA mutants both in vitro and in vivo [ 85 , 86 , 87 , 88 ]. In addition to their use as anti-tumor drugs, the protease-specific PA mutants were also used in combination with radioactively labelled LF or LF N -β-lactamase fusion protein to develop methods of imaging plasma membrane protease activity in tumors or in cancer cell lines, respectively [ 89 , 90 ]. Using the potential of PA to internalize molecules, several research groups adapted this technology to allow cancer-specific receptors to bind and internalize PA-fusions specific for those receptors. Varughese et al. were the first to unravel the potential of this strategy by targeting FP59 to a c-Myc-specific 9E10 hybridoma cell line using a PA-c-Myc fusion protein [ 55 ]. McCluskey et al. used a similar approach containing a mutated PA (mPA) that cannot bind its natural receptors fused with a high-affinity Affibody, ZHER2, targeting the HER2 receptor [ 56 ]. They showed that both mPA-EGF and mPA-ZHER2 could deliver an LF N -fused diphtheria toxin catalytic domain (DTA) to kill several cancer cell lines depending on the presence of their respective receptors [ 56 ]. Based on these observations, PA can form pores and deliver cargos as long as the targeted receptor is able to internalize, broadening the number of potential targets at the cell surface of cancer cells. Additionally, Loftis et al. used an mPA fused with the single-chain variable fragment (scFv) of an antibody to internalize and deliver LF N -DTA through EGFR or carcinoembryonic antigen, which could kill pancreatic cancer cells overexpressing the two receptors at the plasma membrane. For additional specificity towards their pancreatic cancer cell line, they made an LF-RRSP fusion protein which targets the Ras–ERK signaling pathway, crucial for many pancreatic cancer cells [ 57 ]. Similarly, Becker et al. used designed ankyrin repeat proteins (DARPins) fused to a PA-CMG2-based construct to specifically target transmembrane glycoprotein epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) at the surface of cells. These engineered constructs were shown to target EpCAM-expressing cells with a high specificity and to deliver LF N -based constructs to the cytosol [ 58 ]. Overall, these engineered proteins show that both the A and B subunits of anthrax toxin have strong potential as a protein delivery system, and they open many new routes for investigating the development of therapeutics. However, the immunogenicity of anthrax toxin subunits, as illustrated by the use of PA in anthrax vaccines, for example, remain a challenge to address in its therapeutical applications [ 91 ]. 3.1. Anthrax Toxin Internalization Mechanism An important concern for animal health and human public safety in the context of bioterrorism, anthrax toxin is an AB toxin produced by the gram-positive spore-forming bacterium Bacillus anthracis . This toxin consists of a B subunit, protective antigen (PA), and two catalytic A subunits, lethal factor (LF) and edema factor (EF). PA is an 83-kDa protein that is responsible for the binding of the toxin to its main receptors, capillary morphogenesis 2 (CMG2) and tumor endothelial marker 8 (TEM8) [ 12 , 13 ]. LF is an 91-kDa matrix metalloprotease that cleaves the MAPKK family members, which impairs the associated signaling pathways and eventually leads to apoptosis, especially in macrophages [ 29 , 80 ]. EF is a calmodulin-dependent adenylyl cyclase that increases the cytosolic cAMP levels. This review briefly describes the internalization process of anthrax toxin and, for a more in-depth understanding of this mechanism, readers are oriented towards previously published reviews [ 6 ]. Initially in LF and EF internalization, extracellular PA binds to one of its receptors, CMG2 or TEM8, and then is cleaved by furin-family proteins ( Figure 1 B). This cleavage allows PA to oligomerize into heptamers or octamers, also called pre-pores [ 15 , 16 , 81 ], which can then recruit three or four LF or EF subunits, respectively, for internalization. On the cytosolic side, PA binding to the TEM8 or CMG2 receptor causes it to release from the actin cytoskeleton [ 82 , 83 ], allowing ubiquitination of the receptor, which triggers endocytosis of the receptor-anthrax toxins complex [ 82 ]. Anthrax toxin and its receptors are then targeted to early endosomes where they are sorted in endosomal intraluminal vesicles (ILVs) and trafficked through the endocytic pathway towards late endosomes [ 21 ]. On the way to late endosomes, the acidification of the microenvironment induces a conformational change in the PA pore [ 25 ], and this low pH is also required for the translocation of LF [ 26 ]. Pores can form at the limiting membrane of the endosomes, translocating LF or EF directly into the cytosol, though most pores form in the membrane of ILVs [ 21 , 84 ]. These pores allow the translocation of LF or EF to the lumen of ILVs and, by back-fusion of ILVs with the limiting membrane of late endosomes, LF or EF eventually reaches the cytosol [ 21 ]. In opposition to BoNT/A, evidence suggest that LF has a very short half-life in the cytosol and its long-term effect relies on its ability to remain dormant in ILVs which stochastically back-fuse with the membrane of endosomes over a long period of time [ 21 ]. 3.2. Anthrax Toxin Therapeutic Applications The therapeutic potential of anthrax lethal toxin was originally exploited in anti-cancer treatments due to its inhibitory effect on the MAPKK-associated pathway. Unlike normal cells, cancer cells usually rely on only a few dysregulated pathways to increase their growth, survival, or motility. Accordingly, some cancers, such as melanoma bearing the V600E BRAF mutation, mostly rely on the constitutively activated MAPK pathway for cell growth and survival, and anthrax toxin was shown to decrease both these processes in this particular cell line [ 32 ]. Similarly, anthrax lethal toxin was shown to reduce cell growth and tumor angiogenesis in renal cell carcinoma and to reduce cell motility and invasiveness in astrocytes by targeting the MAPK pathway [ 33 ]. Although anthrax lethal toxin showed interesting intrinsic anti-tumor properties, most of its potential in therapy relies on its modular properties, like its ability to translocate different non-native proteins, drugs, and other molecules. As mentioned previously, PA oligomers create a pore in endosomes, allowing LF to eventually reach the cytosol, suggesting that LF fusion proteins could go through the pore as well—as long as they can successfully unfold while passing through the pore and refold later in the cytosol. In the 1990s, the first attempts to fuse proteins to the N-terminus of the LF subunit were done to target proteins to the cytosol and confirm the potential of anthrax toxin as a delivery system. FP59, a fusion between the N-terminus of LF (LF N ) with the ADP-ribosylation domains of Pseudomonas exotoxin A, was the first successful translocation of a foreign protein into the cytosol [ 39 ]. Shortly after, both catalytic domains of the Shiga and diphtheria toxins reached the cytosol when fused to LF N , further supporting that the N-terminal residues of LF were sufficient to translocate complicated polypeptide chains through the PA pore [ 40 , 41 ]. However, Blanke et al. later showed that a simple positively-charged polycationic peptide could replace LF N for the delivery of diphtheria toxin to the cytosol [ 42 ]. Besides bacterial toxins, the LF N delivery system was shown to be useful in other applications, such as the development of a potential HIV vaccine and the treatment of neurodegenerative diseases [ 43 , 44 ]. In a broader perspective, Rabideau et al. assessed the feasibility of translocation through the PA pore for many different cargo molecules, from short or cyclic peptides to small molecule drugs. They concluded that while non-canonical peptides and small-molecule drugs, such as doxorubicin, can be translocated, cyclic peptides and the small molecule docetaxel cannot, which they hypothesized was due to rigidity of the cargo [ 45 ]. These examples provide strong evidence that many different cargo proteins can be delivered to the cytosol both in vitro and in vivo using anthrax toxin, which can be used for the targeted delivery of vaccines, drugs, and other proteins. Besides its ability to translocate different non-native cargos, another modular characteristic of PA lies in the specificity of the protease that processes it, thereby allowing it to oligomerize. In the last two decades, several groups focused on unraveling the best combinations of mutations in PA that would allow more targeted and less toxic tumor therapies. The two PA mutants, PA-L1 and PA-U2, were programmed to be specific for several cancer cell lines in vitro by changing the cleavage site from furin to matrix metalloproteases (MMPs) and urokinase plasminogen activator (uPA), respectively [ 52 , 53 ], which are overexpressed in many cancer types while not very abundant at the surface of normal cells. In particular, PA-U2 showed a strong anti-tumor activity and specificity when combined with FP59 in mice [ 54 ]. To make the tumor targeting more specific, PA-L1 and PA-U2 were mutated on their homo-oligomerization domain to render them complementary, making them even more specific to cancer cells expressing both proteases. This approach was shown to be efficient with different sets of PA mutants both in vitro and in vivo [ 85 , 86 , 87 , 88 ]. In addition to their use as anti-tumor drugs, the protease-specific PA mutants were also used in combination with radioactively labelled LF or LF N -β-lactamase fusion protein to develop methods of imaging plasma membrane protease activity in tumors or in cancer cell lines, respectively [ 89 , 90 ]. Using the potential of PA to internalize molecules, several research groups adapted this technology to allow cancer-specific receptors to bind and internalize PA-fusions specific for those receptors. Varughese et al. were the first to unravel the potential of this strategy by targeting FP59 to a c-Myc-specific 9E10 hybridoma cell line using a PA-c-Myc fusion protein [ 55 ]. McCluskey et al. used a similar approach containing a mutated PA (mPA) that cannot bind its natural receptors fused with a high-affinity Affibody, ZHER2, targeting the HER2 receptor [ 56 ]. They showed that both mPA-EGF and mPA-ZHER2 could deliver an LF N -fused diphtheria toxin catalytic domain (DTA) to kill several cancer cell lines depending on the presence of their respective receptors [ 56 ]. Based on these observations, PA can form pores and deliver cargos as long as the targeted receptor is able to internalize, broadening the number of potential targets at the cell surface of cancer cells. Additionally, Loftis et al. used an mPA fused with the single-chain variable fragment (scFv) of an antibody to internalize and deliver LF N -DTA through EGFR or carcinoembryonic antigen, which could kill pancreatic cancer cells overexpressing the two receptors at the plasma membrane. For additional specificity towards their pancreatic cancer cell line, they made an LF-RRSP fusion protein which targets the Ras–ERK signaling pathway, crucial for many pancreatic cancer cells [ 57 ]. Similarly, Becker et al. used designed ankyrin repeat proteins (DARPins) fused to a PA-CMG2-based construct to specifically target transmembrane glycoprotein epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) at the surface of cells. These engineered constructs were shown to target EpCAM-expressing cells with a high specificity and to deliver LF N -based constructs to the cytosol [ 58 ]. Overall, these engineered proteins show that both the A and B subunits of anthrax toxin have strong potential as a protein delivery system, and they open many new routes for investigating the development of therapeutics. However, the immunogenicity of anthrax toxin subunits, as illustrated by the use of PA in anthrax vaccines, for example, remain a challenge to address in its therapeutical applications [ 91 ]. 4. Cholera Toxin 4.1. Cholera Toxin Internalization Mechanism Cholera toxin (CT) is an AB toxin of the heat-labile enterotoxin family and is produced by the bacterium Vibrio cholerae . The functional B subunit is actually a 55-kDa pentameric ring of individual B subunits (CTB) that tightly bind to its glycolipid receptor, GM1. The A subunit consists of two parts: an 11-kDa catalytically active CTA1 subunit and a 18-kDa CTA2 subunit, whose role is to anchor CTA1 in the lumen of the B-pentameric ring [ 5 , 17 , 18 ]. CTA1 is an ADP-ribosyltransferase that constitutively activates the heterotrimeric G-protein, Gαs. CTA1 and CTA2 are connected through a flexible linker containing a disulfide bridge. For a more detailed description of the cholera toxin internalization process, readers are referred to the following reviews [ 5 , 14 ]. Once bound to its receptor, CT associates with the GM1- and cholesterol-rich lipid rafts at the plasma membrane, which are necessary for efficient endocytosis of the toxin ( Figure 1 C) [ 22 ]. Once endocytosed, the toxin reaches early endosomes where it is targeted to the trans-Golgi network (TGN) via retrograde transport [ 23 ]. From there, CT bypasses the Golgi stacks and directly reaches the reductive environment of the ER [ 92 ], wherein the disulfide bridge between CTA1 and CTA2 is reduced and protein disulfide isomerase finishes the separation of both CTA subunits [ 27 , 93 ]. CTA1 is then thought to spontaneously unfold at physiological temperature. At that stage, it is thought to mimic a misfolded protein leading to its recognition by the ER-associated degradation (ERAD)-dependent pathway and its retro-translocation into the cytosol [ 14 ]. The C-terminus of CTA1 contains a KDEL motif that is not necessary for endosome to ER retrograde transport, but it is thought to play a role in ER retention once CTA1 dissociates from CTA2 and CTB [ 94 ]. In the cytosol, the low number of lysines in CTA1 most likely protects it from ubiquitination and further degradation by the proteasome [ 95 ]. Its ADP-ribosyltransferase activity then activates Gαs, which in turn increases cAMP levels in the cell, impairing sodium uptake and increasing chloride extrusion. Eventually, this induces the secretion of water and leads to intense diarrhea [ 14 ]. 4.2. Cholera Toxin Therapeutic Applications CT has been known for decades to have immunogenic properties. As early as 1984, it was used as an adjuvant in mucosal vaccines, as it was able to trigger both a mucosal and systemic antibody response [ 34 , 35 ]. It was also shown that the CTA-induced toxicity could be avoided by triggering the immune response through the use of only CTB [ 96 ]. Besides co-injection of the CTB adjuvant with different antigens, the immune response could be improved by conjugating CTB with an antigen [ 96 ]. This improvement is likely due to the broad presence of GM1 in many immune cells (B cells, T cells, macrophages, dendritic cells), as well as in epithelial cells and neurons, which would increase the uptake of the antigen-conjugated CTB in those cells [ 97 ]. This strategy has been used for the development of mucosal vaccines against a wide range of bacteria, viruses, and parasites in mice, as reviewed in previous publications [ 59 , 98 ]. Additionally, several other groups used the non-toxic CTA2 subunit as a fusion protein, co-injected with CTB, to develop their mucosal vaccine [ 46 , 47 ]. For example, Tinker et al. developed a mucosal vaccine against West Nile Virus using domain III of the virus envelope conjugated to CTA2 and the CTB subunit. The fusion protein was shown to efficiently bind to the plasma membrane, internalize into the perinuclear region of Vero and DC2.4 dendritic cells in vitro, and induce an increased production of IgG and IgM in mice after several injections [ 48 ]. Although the immunogenic effect of CTB has been exploited as previously mentioned, one drawback of this immunogenicity lies in the production of neutralizing antibodies towards CTB, which can be an issue if used as a therapeutic or as a drug delivery system. This particular topic will be discussed further below. In addition to immunogenicity, CT was also shown to have immunosuppressive and anti-inflammatory properties [ 99 ]. When conjugated to different antigens, CTB induced immune tolerance towards autoantigens in the context of autoimmune diseases or allergies, such as type I diabetes, asthma, Behcet's disease, atherosclerosis, or Crohn's disease [ 18 ]. These immunosuppressive properties of CT were shown to rely on several different mechanisms: modulation of cytokine production, mucosal generation of regulatory T cells, and induction of tolerogenic antigen-presenting cells and B cells [ 100 ]. For example, a treatment for type I diabetes using a CTB-GAD (glutamic acid decarboxylase) fusion protein was shown to suppress the activation of human umbilical cord blood dendritic cells through the down-regulation of pro-inflammatory cytokines (IL-6 and IL-12) and up-regulation of immunosuppressive cytokine IL-10 [ 101 ]. Similarly, Denes et al. used a recombinant vaccinia virus rVV-CTB-GAD to treat non-obese diabetic (NOD) mice, which showed a significant decrease in hyperglycemia and pancreatic β islet inflammation [ 102 ]. This underlines the potential of CT in antigen uptake and its role in the modulation of the immune response. Another very interesting therapeutic approach provided by CT consists of targeting and temporarily occupying the ERAD pathway, thus rescuing deleterious phenotypes in genetic diseases with mutations that lead to the premature degradation of a misfolded protein. Adnan et al. illustrated this strategy using inactivated Shiga toxin and CT in cells derived from patients with an F508 deletion in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) bronchiolar epithelia, a mutation in a plasma membrane chloride channel that leads to cystic fibrosis [ 36 ]. The inactivated toxins were able to induce 5–10-fold increases in protein levels, 20-fold increases in cell surface expression, and 2-fold chloride transport through the membrane with no apparent cytotoxicity. Similarly, they were also able to increase glucocerebrocidase (GCC) by 3-fold in N370SGCC Gaucher's disease cells, the mutation of which leads to the accumulation of glucocerebrosides in lysosomes. An advantage of this strategy over the use of ERAD inhibitors is that inactivated CT doesn't induce any ER stress and unfolded protein response (UPR), which can lead to apoptosis. Using a relatively similar approach, Royal et al. designed a CTB subunit with a KDEL ER-retention motif that would induce an UPR response [ 60 ]. This UPR response led to TGF-β secretion and increased the wound healing response in vitro in Caco2 cells and in colon explants from patients with inflammatory bowel disease as well as in vivo in a dextran sodium sulfate-induced acute colitis mouse model. These two examples strongly illustrate the potential for hijacking the CT membrane translocation mechanism or its ability to trigger ER stress to treat diseases based on genetic protein misfolding and for mucosal healing in intestinal inflammatory diseases. In addition to these therapeutic strategies, CT has interesting potential for the treatment of neurological disorders due to its ability to cross the blood-brain barrier (BBB) and internalize into neuronal cells. It has been shown to be particularly efficient in the treatment of glioblastoma in mice [ 61 ]. CTB subunits conjugated with paclitaxel-loaded nanoparticles induced apoptosis of intracranial glioma cells and suppressed neovasculature in vivo. Furthermore, this ability of CT to enter neuronal cells has been exploited to develop new neural imaging techniques. Once internalized, the toxin is able to reach the cell body and its dendrites via retrograde transport, which makes it useful for nerve visualization and potentially drug delivery. For example, CTB was conjugated to fluorescent gold nanodots and injected in the sciatic nerve of rats [ 37 ]. After 2 days, the fluorescent signal was visible in the spinal cord and was stable for 10 days. This tool could bring an interesting novel visualization technique for the detection of neuronal lesions, further supporting the potential of CT in the development of therapeutic tools. 4.1. Cholera Toxin Internalization Mechanism Cholera toxin (CT) is an AB toxin of the heat-labile enterotoxin family and is produced by the bacterium Vibrio cholerae . The functional B subunit is actually a 55-kDa pentameric ring of individual B subunits (CTB) that tightly bind to its glycolipid receptor, GM1. The A subunit consists of two parts: an 11-kDa catalytically active CTA1 subunit and a 18-kDa CTA2 subunit, whose role is to anchor CTA1 in the lumen of the B-pentameric ring [ 5 , 17 , 18 ]. CTA1 is an ADP-ribosyltransferase that constitutively activates the heterotrimeric G-protein, Gαs. CTA1 and CTA2 are connected through a flexible linker containing a disulfide bridge. For a more detailed description of the cholera toxin internalization process, readers are referred to the following reviews [ 5 , 14 ]. Once bound to its receptor, CT associates with the GM1- and cholesterol-rich lipid rafts at the plasma membrane, which are necessary for efficient endocytosis of the toxin ( Figure 1 C) [ 22 ]. Once endocytosed, the toxin reaches early endosomes where it is targeted to the trans-Golgi network (TGN) via retrograde transport [ 23 ]. From there, CT bypasses the Golgi stacks and directly reaches the reductive environment of the ER [ 92 ], wherein the disulfide bridge between CTA1 and CTA2 is reduced and protein disulfide isomerase finishes the separation of both CTA subunits [ 27 , 93 ]. CTA1 is then thought to spontaneously unfold at physiological temperature. At that stage, it is thought to mimic a misfolded protein leading to its recognition by the ER-associated degradation (ERAD)-dependent pathway and its retro-translocation into the cytosol [ 14 ]. The C-terminus of CTA1 contains a KDEL motif that is not necessary for endosome to ER retrograde transport, but it is thought to play a role in ER retention once CTA1 dissociates from CTA2 and CTB [ 94 ]. In the cytosol, the low number of lysines in CTA1 most likely protects it from ubiquitination and further degradation by the proteasome [ 95 ]. Its ADP-ribosyltransferase activity then activates Gαs, which in turn increases cAMP levels in the cell, impairing sodium uptake and increasing chloride extrusion. Eventually, this induces the secretion of water and leads to intense diarrhea [ 14 ]. 4.2. Cholera Toxin Therapeutic Applications CT has been known for decades to have immunogenic properties. As early as 1984, it was used as an adjuvant in mucosal vaccines, as it was able to trigger both a mucosal and systemic antibody response [ 34 , 35 ]. It was also shown that the CTA-induced toxicity could be avoided by triggering the immune response through the use of only CTB [ 96 ]. Besides co-injection of the CTB adjuvant with different antigens, the immune response could be improved by conjugating CTB with an antigen [ 96 ]. This improvement is likely due to the broad presence of GM1 in many immune cells (B cells, T cells, macrophages, dendritic cells), as well as in epithelial cells and neurons, which would increase the uptake of the antigen-conjugated CTB in those cells [ 97 ]. This strategy has been used for the development of mucosal vaccines against a wide range of bacteria, viruses, and parasites in mice, as reviewed in previous publications [ 59 , 98 ]. Additionally, several other groups used the non-toxic CTA2 subunit as a fusion protein, co-injected with CTB, to develop their mucosal vaccine [ 46 , 47 ]. For example, Tinker et al. developed a mucosal vaccine against West Nile Virus using domain III of the virus envelope conjugated to CTA2 and the CTB subunit. The fusion protein was shown to efficiently bind to the plasma membrane, internalize into the perinuclear region of Vero and DC2.4 dendritic cells in vitro, and induce an increased production of IgG and IgM in mice after several injections [ 48 ]. Although the immunogenic effect of CTB has been exploited as previously mentioned, one drawback of this immunogenicity lies in the production of neutralizing antibodies towards CTB, which can be an issue if used as a therapeutic or as a drug delivery system. This particular topic will be discussed further below. In addition to immunogenicity, CT was also shown to have immunosuppressive and anti-inflammatory properties [ 99 ]. When conjugated to different antigens, CTB induced immune tolerance towards autoantigens in the context of autoimmune diseases or allergies, such as type I diabetes, asthma, Behcet's disease, atherosclerosis, or Crohn's disease [ 18 ]. These immunosuppressive properties of CT were shown to rely on several different mechanisms: modulation of cytokine production, mucosal generation of regulatory T cells, and induction of tolerogenic antigen-presenting cells and B cells [ 100 ]. For example, a treatment for type I diabetes using a CTB-GAD (glutamic acid decarboxylase) fusion protein was shown to suppress the activation of human umbilical cord blood dendritic cells through the down-regulation of pro-inflammatory cytokines (IL-6 and IL-12) and up-regulation of immunosuppressive cytokine IL-10 [ 101 ]. Similarly, Denes et al. used a recombinant vaccinia virus rVV-CTB-GAD to treat non-obese diabetic (NOD) mice, which showed a significant decrease in hyperglycemia and pancreatic β islet inflammation [ 102 ]. This underlines the potential of CT in antigen uptake and its role in the modulation of the immune response. Another very interesting therapeutic approach provided by CT consists of targeting and temporarily occupying the ERAD pathway, thus rescuing deleterious phenotypes in genetic diseases with mutations that lead to the premature degradation of a misfolded protein. Adnan et al. illustrated this strategy using inactivated Shiga toxin and CT in cells derived from patients with an F508 deletion in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) bronchiolar epithelia, a mutation in a plasma membrane chloride channel that leads to cystic fibrosis [ 36 ]. The inactivated toxins were able to induce 5–10-fold increases in protein levels, 20-fold increases in cell surface expression, and 2-fold chloride transport through the membrane with no apparent cytotoxicity. Similarly, they were also able to increase glucocerebrocidase (GCC) by 3-fold in N370SGCC Gaucher's disease cells, the mutation of which leads to the accumulation of glucocerebrosides in lysosomes. An advantage of this strategy over the use of ERAD inhibitors is that inactivated CT doesn't induce any ER stress and unfolded protein response (UPR), which can lead to apoptosis. Using a relatively similar approach, Royal et al. designed a CTB subunit with a KDEL ER-retention motif that would induce an UPR response [ 60 ]. This UPR response led to TGF-β secretion and increased the wound healing response in vitro in Caco2 cells and in colon explants from patients with inflammatory bowel disease as well as in vivo in a dextran sodium sulfate-induced acute colitis mouse model. These two examples strongly illustrate the potential for hijacking the CT membrane translocation mechanism or its ability to trigger ER stress to treat diseases based on genetic protein misfolding and for mucosal healing in intestinal inflammatory diseases. In addition to these therapeutic strategies, CT has interesting potential for the treatment of neurological disorders due to its ability to cross the blood-brain barrier (BBB) and internalize into neuronal cells. It has been shown to be particularly efficient in the treatment of glioblastoma in mice [ 61 ]. CTB subunits conjugated with paclitaxel-loaded nanoparticles induced apoptosis of intracranial glioma cells and suppressed neovasculature in vivo. Furthermore, this ability of CT to enter neuronal cells has been exploited to develop new neural imaging techniques. Once internalized, the toxin is able to reach the cell body and its dendrites via retrograde transport, which makes it useful for nerve visualization and potentially drug delivery. For example, CTB was conjugated to fluorescent gold nanodots and injected in the sciatic nerve of rats [ 37 ]. After 2 days, the fluorescent signal was visible in the spinal cord and was stable for 10 days. This tool could bring an interesting novel visualization technique for the detection of neuronal lesions, further supporting the potential of CT in the development of therapeutic tools. 5. Discussion In this review, we have illustrated the outstanding diversity of therapeutical strategies provided by the use of botulinum toxin type A, anthrax toxin, and cholera toxin. In addition to the intrinsic therapeutic properties provided by these AB toxins, their modularity in terms of receptor recognition, protease specificity, and non-native cargo delivery allowed the development of many treatments ( Figure 2 ). While the intrinsic properties alone of the three toxins could be therapeutic against specific diseases, their huge potential lies in the possibility of modifying both the A and B subunits of the toxins. The A subunit allows the internalization of non-native cargos into different cell types and in vivo, while the B subunit allows targeting of different receptors and cell types. Several groups have even modulated both subunits of these toxins to deliver drugs or proteins to cells expressing specific non-native receptors, showing the potential of AB toxins as intracellular delivery systems. However, some challenges linked to the immunogenicity and toxicity of these toxins remain to be addressed. As exogenous proteins, toxins often induce the production of neutralizing antibodies that can interfere with treatments, especially for repeated injections of a drug over a long period of time, like with autoinflammatory diseases [ 103 , 104 ]. In this context, due to its low immunogenicity and, likely also, to the localized mode of administration, BoNT/A triggers the production of neutralizing antibodies in only up to 3% of patients [ 105 ]. However, both CT and anthrax toxin were shown to induce the formation of neutralizing antibodies, potentially decreasing the efficiency of an associated drug in long-term therapies [ 103 , 104 ]. This issue could be addressed by investigating potential mutations in the antigens or by using immunosuppressive drugs to decrease the production of neutralizing antibodies [ 106 , 107 ]. In this context, Liu et al. used a combination of cyclophosphamide and pentostatin, two drugs to prevent host-versus-graft rejections, to successfully suppress the antibody production induced by an anthrax-based cancer treatment in mice [ 87 ]. However, the risk and benefits have to be carefully weighed when attempting to deliver these therapies together. Another issue linked to the use of toxins in therapy would be toxicity. While BoNT/A and cholera toxin B are not toxic when used properly, anthrax toxin PA might have a toxic effect as illustrated by its potential role in the Gulf War Illness, in which multi-systemic disease was first observed in Gulf War veterans vaccinated with the PA-based anthrax vaccine [ 108 ]. However, this observation needs further validation, as many other chemical or biological factors might have played a role in the development of the disease. The three bacterial toxins reviewed here have interesting modular properties that could allow their development into various elegant therapeutic strategies. Overall, these toxins have shown new potential therapeutic alternatives in autoimmune and inflammatory diseases, cancer, genetic protein misfolding diseases, movement disorders, and in vaccine development. Although many examples used these three highlighted toxins, several other AB toxins have been shown to have similar characteristics in therapy, such as Shiga toxin and diphtheria toxin, further widening the range of therapeutic possibilities [ 109 , 110 ]. For example, these toxins target different cell types depending on the expression of their receptor. Such specificity can be hijacked to deliver drugs or non-native proteins conjugated to AB toxins to very specific targets in the human organism, as long as the cargo can unfold or is flexible enough to be translocated across the membrane by the B subunit. In addition, one can imagine various ways to target non-native receptors using fusion constructs of the B subunit of AB toxins with Affibodies, DARPins or the natural ligand of the targeted receptor, among others. As described for botulinum toxin and for anthrax toxin in the previous chapters, this elegant strategy has shown promising results and allows for the delivery of cargos to several different cell types with high specificity. Importantly, such systems provide new solutions for the delivery of proteins and peptides which are unable to efficiently translocate through membranes, thereby potentially further increasing the number of new biologics on the market in the coming years.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6539186/

Ubiquitination-Mediated Inflammasome Activation during Bacterial Infection

Inflammasome activation is essential for host immune responses during pathogenic infection and sterile signals insult, whereas excessive activation is injurious. Thus, inflammasome activation is tightly regulated at multiple layers. Ubiquitination is an important post-translational modification for orchestrating inflammatory immune responses during pathogenic infection, and a major target hijacked by pathogenic bacteria for promoting their survival and proliferation. This review summarizes recent insights into distinct mechanisms of the inflammasome activation and ubiquitination process triggered by bacterial infection. We discuss the complex regulatory of inflammasome activation mediated by ubiquitination machinery during bacterial infection, and provide therapeutic approaches for specifically targeting aberrant inflammasome activation. 1. Introduction Early innate immune responses play essential roles in host defense against bacterial infection and rely on the recognition of pattern recognition receptors (PRRs) [ 1 ]. PRRs can be divided into two major classes including membrane-bound Toll-like receptors (TLRs) and C-type lectin receptors (CLRs), and non-membrane bound intracellular receptors such as the RIG-I-like receptor (RLR), AIM2-like receptor (ALR), and nucleotide-binding protein domain and leucine-rich repeat-containing (NLR) proteins [ 2 ]. AIM2 and a subgroup of the NLR proteins have the ability to assemble inflammasomes [ 3 , 4 ]. Inflammasomes are multiple protein complexes activated in response to infections or sterile stress, and involved in the activation of pyroptotic cell death and release of proinflammatory cytokines IL-1β and IL-18 [ 5 , 6 ]. Dysregulation of the inflammasome activation can result in a wide range of infectious and inflammatory diseases, cancer, metabolic and autoimmune disorders [ 7 , 8 ]. Both extracellular and intracellular bacterial infections trigger different types of inflammasome activation through engagements with distinct inflammasome sensors [ 5 ]. The inflammasome process is tightly regulated and recent studies have significantly advanced our understanding on the regulation of inflammasome activation, assembly and posttranslational modification of inflammasome proteins such as ubiquitin and ubiquitin-like modifications [ 5 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ]. Ubiquitination is a highly complex and dynamic post-translational protein modification that is involved in targeting protein for proteasomal degradation, interaction and signaling. Ubiquitination has multiple effects in the bacteria-host interface and bacteria also can target host-cell ubiquitin and ubiquitin-like pathways for invasion [ 14 ]. In this review, we highlight new observations on bacterial infection triggering inflammasome activation and ubiquitination, as well as ubiquitination-mediated inflammasome activation. 2. Bacterial Infection Triggers Inflammasome Activation Inflammasome activation plays essential roles in the innate immune defense against bacterial infection. The inflammasome-mediated proinflammatory cytokine production and pyroptotic cell death contribute to the induction of inflammatory response and host defense. Assembly of inflammasome initiates from the engagement of bacterial pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and NLRs or ALRs, such as NLR family pyrin domain containing 1 (NLRP1), NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), NLR family CARD domain-containing protein 4 (NLRC4), AIM2, and Pyrin receptors [ 15 , 16 ]. NLRP1 also known as NACHT leucine-rich-repeat protein 1(NALP1), was the first identified NLR family member to form inflammasome complex mediating caspase-1 activation and IL-1β maturation in 2002 [ 17 ]. Until ten years later, NLRP1 activation was identified to be regulated by the anthrax lethal toxin (LT), and LT-mediated NLRP1 cleavage was required and sufficient for its activation [ 18 , 19 , 20 ]. The NLRP1 inflammasome activation can occur independently of the adaptor apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC)-dependent caspase-1 autoproteolysis and speck formation [ 21 ]. Bacillus anthracis infection also can trigger caspase 1 activation through the NOD2-NLRP1 complex formation induced by bacterial muramyl dipeptide (MDP) [ 22 ]. In NOD2-mediated Crohn's disease (CD), the NLRP1 and NLRP3 inflammasome activation is essential for the distinct outcomes of decreased inflammatory cytokines but increased bacterial killing activity [ 23 ]. Furthermore, the MDP induced NLRP1 inflammasome formation and caspase-1 activation was demonstrated to be suppressed by Bcl-2 and Bcl-XL binding [ 24 ]. NLRP1 activation in macrophages and dendritic cells triggered pyroptotic cell death and inflammatory cytokine release confer to the resistance to B. anthracis infection [ 25 ]. Instead, the NLRP1 activation in hematopoietic progenitor cells results in cytopenia and immunosuppression, and the deficiency of NLRP1 promotes recovery from the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and chemotherapy [ 26 ]. NLRP3 (also known as NALP3) inflammasome is the most extensively studied inflammasome and can be activated by a broad range of bacterial pathogens, yet the cellular mechanisms that regulate the NLRP3 inflammasome activation is not completely understood [ 27 ]. NLRP3 inflammasome components comprise of NLRP3, ASC, and caspase-1. Two signals are required for the NLRP3 inflammasome activation. The first signal mediates transcription of NLRP3 and IL-1β through NF-κB signaling, and the second signal triggers inflammasome assembly and capase-1 activation through exposure to endogenous and exogenous danger molecules, such as K + efflux, ATP, ROS signal, lysosomal rupture, pore-forming toxins, and other microbial virulence factors [ 28 , 29 ]. Extensive studies were performed to investigate the mechanism of NLRP3 inflammasome assembly, and growing evidences indicate that the mitochondria localization of NLRP3 inflammasome components is essential for its activation. Response to activation, NLRP3 and ASC were reported to co-localize with endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria, and mitochondria produced ROS activated the NLRP3 inflammasome [ 30 ]. It was shown that the microtube mediated the mitochondria transport and apposition of ASC on mitochondria to NLRP3 on the ER [ 31 ]. Furthermore, the mitochondria-associated adaptor molecule, MAVS, was defined to mediate the NLRP3 recruitment to mitochondria and subsequent events [ 32 ]. Recent studies also demonstrated that newly synthesized mitochondrial DNA (mtDNA) was necessary for the NLRP3 inflammasome activation [ 33 ], and the trans-Golgi network (TGN) served as a scaffold for NLRP3 aggregation puncta leading to ASC polymerization mediated by phosphatidylinositol-4-phosphate (PtdIns4P) on dispersed TGN [ 34 ]. NLRP3 inflammasome plays dual protective and pathogenic roles in host defense against bacterial infection due to the caspase-1-dependent cell death and released inflammatory cytokines that contribute to limit the spread of invading pathogens and simultaneously are involved in various inflammatory pathologies [ 35 , 36 ]. Various bacterial components can induce the NLRP3 inflammasome activation through diverse mechanisms. Pore-forming toxins and bacterial RNAs represent the major triggers of the NLRP3 inflammasome activation. Pore-forming toxin secreted by bacteria disrupt plasma membrane permeability that allow the efflux of intracellular potassium and trigger the NLRP3 inflammasome activation [ 28 , 37 ]. NLRP3 also recognizes microbial components and plays an essential role in the inflammasome activation, such as human NLRP3 inflammasome senses all three types of bacterial RNAs-mRNA, tRNA, and rRNAs [ 38 ]. Gram-negative bacteria induced NLRP3 inflammasome activation was identified as TRIF and caspase-11 dependent, and caspase-11 mediated non-canonical inflammasome activation leading to pyroptotic cell death instead of processing of IL-1β and IL-18 through engagement with intracellular LPS [ 39 , 40 , 41 , 42 ]. Recently, Rathinam et al. demonstrated that bacterial outer membrane vesicles derived from gram-negative bacteria were essential for LPS delivery to host the cell cytosol and caspase-11 activation [ 43 ]. Furthermore, Broz group showed that host GBPs recruited to the intracellular LPS-containing OMVs and contributed to the LPS triggered non-canonical caspase-11 activation [ 44 ]. NLRP3 inflammasome activation was also reported to be negatively regulated in the transcriptional level and assembly process by various molecules, such as TRIM 30, A20, nitric oxide, carbon monoxide, and aryl hydrocarbon receptor (AhR) [ 45 , 46 ]. NLRC4 was initially identified as an adaptor protein mediating inflammasome activation specially responsive to the intracellular bacteria Salmonella typhimurium [ 47 ]. Later on, it was shown that bacterial flagellin and type III secretion system (T3SS) proteins rod and needle engagements with NLR family, apoptosis inhibitory protein (NAIP) proteins triggered the NLRC4 inflammasome activation [ 48 , 49 , 50 ]. Biochemical and genetic functional studies have revealed that NAIP1, NAIP2 and NAIP5 were cytosolic receptors that directly recognize bacterial Needle, Rod and Flagellin proteins to trigger the NLRC4 inflammasome activation [ 51 , 52 ]. Thus, the NAIP-NLRC4 inflammasome plays a key role in host defense against bacterial infection through sensing flagellin and T3SS rod/needle proteins in the bacteria [ 53 ]. Recently, IRF8 was demonstrated to mediate the transcription of Naip genes ( Naip1 , Naip2 , Naip5 , and Naip6 ) and play key roles for the NLRC4 inflammasome activation [ 54 ]. NLRC4 phosphorylation at Ser533 mediated by LRRK2 was crucial for the NLRC4 inflammasome activation during host defense against the Salmonella typhimurium infection [ 55 ]. Extensive studies of the L. pneumophila infection model revealed the protective role of the NAIP5–NLRC4 inflammasome activation through the development of a coordinated host response [ 53 ]. In addition, the NLRC4 activation and caspase-1-indcued cell death instead of proinflammatory cytokines act as innate immune effector mechanism against intracellular bacteria Salmonella typhimurium through exposing intracellular bacteria to killing by ROS in neutrophils [ 56 ]. Transfection of bacterial and host DNA was reported to trigger the NLRP3-independent and ASC-dependent inflammasome activation in macrophages [ 57 ], indicating that a novel intracellular receptor mediates cytosolic DNA-induced inflammasome activation. In 2009, AIM2 was demonstrated to act as a cytosolic DNA sensor that forms inflammasome with ASC and caspase-1 independently by four groups [ 58 , 59 , 60 , 61 ]. In contrast to the NLRP3 and NLRC4 inflammasomes, the AIM2 inflammasome is rarely investigated. In the context of bacterial infection, AIM2 is recognized as mainly responsive to the Francisella infection and partially involved in the infection with Mycobacteria and Listeria [ 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 ]. The observation of the AIM2 inflammasome activation triggered by the cytosolic DNA exposed by intracellular bacteria provides a promising tool to study the intracellular bacteriolysis. Type I interferon signaling was identified essential for the Francisella infection-induced inflammasome activation by Monack group, whereas which inflammasome involved was not known at that time [ 68 ]. Now we know that type I IFN signaling induces IRF1 expression, which in turn activates the expression of GBP proteins and IRGB10 during the Francisella infection; IRGB10 and GBPs coordinate the bacteriolysis of the Francisella and inflammasome activation [ 69 , 70 , 71 ]. Structural analysis revealed that DNA serves as an oligomerization platform for the AIM2 inflammasome and the length of DNA not the sequence determines the activation of the AIM2 inflammasome [ 72 ]. Whether the host DNA also contributes to the activation of the AIM2 inflammasome during bacterial infection remains unclear. Pyrin protein is encoded by the MEFV gene in human, whose mutation is associated with human autoinflammatory disease known as familial Mediterranean fever (FMF) [ 73 , 74 ]. Gain-of-function Pyrin induces constitutively activation of caspase-1, which is the ASC-dependent NLRP3-independent inflammasome activation [ 75 ]. The pyrin inflammasome can also be activated by the intracellular Burkholderia cenocepacia infection, whereas the physiological function of Pyrin remains unknown [ 76 ]. In 2014, Shao group elucidated the components of the Pyrin inflammasome and activation mechanism in response to various bacterial cytotoxins stimulation [ 77 ]. They identified that inactivation of Rho GTPase is the direct trigger of the Pyrin inflammasome, and the Rho-inactivating toxins and Burkholderia cenocepacia all have the capacity to inactivate Rho family members and trigger the Pyrin inflammasome activation [ 77 ]. Subsequently, it was demonstrated that phosphorylation of Pyrin, 14-3-3 protein binding, and microtubule dynamics are critical for modulating the Pyrin inflammasome activation [ 78 , 79 , 80 ]. In addition, pathogenic Yersinia pestis can secret multiple effectors known as YoPs to trigger and inhibit the Pyrin inflammasome activation. For example, both YopE and YopT effectors trigger the Pyrin inflammasome through inactivating RhoA, while YopM can hijack host kinase PRKs to regulate phosphorylation of 14-3-3 binding sites of Pyrin protein, which lead to inhibition of the Pyrin inflammasome [ 81 , 82 ]. Different from other defined inflammasomes, the Pyrin inflammasome does not directly recognize molecular patterns, but rather relies on the inactivation of Rho GTPase and the disturbances in cytoplasmic homeostasis need to be further examined [ 83 ]. One of the biggest challenges in the inflammasome field was how inflammatory caspases caspase-1 and caspase4/11 caused pyroptotic cell death. In 2015, Shao group and Dixit group independently identified Gasdermin D (GSDMD) as an executioner of the pyroptosis downstream of canonical inflammasome caspase-1 and non-canonical inflammasome caspase-11/4/5 [ 84 , 85 ]. They both found that the N-terminal of GSDMD cleaved by inflammatory caspases was required and sufficient for pyroptotic cell death. Later on, these two groups both reported that the pore-forming activity of GSDMD compromises the integrity of the membrane [ 86 , 87 ]. The Shao group further demonstrated that other gasdermin-N domains, GSDMA3 and GSDMA, also formed pores within the membrane, and most gasdermin pores contained 16 symmetric protomers with an inner diameter of 10–14 nm [ 86 ]. The identification of GSDMD and its pore-forming activity provided significant advances in our understanding of substrates of inflammatory caspases and pyroptosis [ 88 , 89 ]. Recently, the events downstream of GSDMD has been revealed by Petr Broz group, they found that the ESCRT-dependent membrane repair triggered by calcium influx signaling through GSDMD pores negatively regulates pyroptosis, and the inhibition of the ESCRT-III machinery enhances pyroptosis and IL-1β secretion [ 90 ]. Up-to-date, GSDMD-mediated pyroptosis has been extensively studied in molecular mechanism and various disease models. GSDMD-mediated pyroptosis was identified critical for the systemic autoinflammatory pathology in Familial Mediterranean Fever knock-in mice ( Mefv V726A / V726A ) [ 91 ]. In the context of bacterial infection, GSDMD is essential for the F. novicida -triggered AIM2 inflammasome activation, the deficiency of GSDMD increases the mouse susceptibility to the F. novicida infection [ 92 ]. Instead, GSDMD-mediated neutrophil death dampens the bactericidal activity against the E. coli infection, and the delayed neutrophil death in GSDMD-deficient mice results in enhanced host defense [ 93 ]. Furthermore, GSDMD is also required for the Brucella abortus infection-triggered caspase-11-mediated pyroptosis and host defense [ 94 ]. 3. Inflammasome Activation and Ubiquitination Precise regulation of the inflammasome activation is critical for adequate immune responses while limiting tissue damage and preventing autoimmunity. Emerging studies have shown that post-translational modifications (PTMs) of inflammasome components are crucial for the inflammasome activation, such as phosphorylation, ubiquitination, S-Nitrosylation, ADP-ribosylation and proteolysis process, and PTMs of inflammasome components have been recognized as a major regulatory mechanism for the inflammasome activation [ 95 ]. Ubiquitination is a post-translational modification by the covalent attachment of a small protein ubiquitin that governs a variety of eukaryotic cellular processes and serves as an important signal in the host immune responses to the pathogenic infection. In eukaryotes, the conjugation of ubiquitin to target proteins is sequentially mediated by the ubiquitin-activating enzyme E1, the ubiquitin-conjugating enzyme E2 and the ubiquitin ligase E3 [ 96 ]. Initially, ubiquitination was reported to mediate the delivery of inflammasome to autophagosomes for destruction through the recruitment of autophagic adaptor p62 and ASC polyubiquitination [ 97 ]. Recently, increasing evidences indicate that ubiquitination mediates inflammasome assembly and activation. We will describe the roles of ubiquitination of ASC, NLRP3 and other inflammasome sensors and components in the inflammasome activation. The NLRP3 inflammasome is the best characterized for post translational regulations, because various pathogenic infections and host-derived damage-associated molecular patterns can trigger its activation [ 10 ]. Alnemri et al. first demonstrated that the deubiquitination of NLRP3 was required for the NLRP3 inflammasome activation by using deubiquitinase inhibitors PR-619 and WP1130 [ 98 ]. Yuan group first demonstrated that the NLRP3 deubiquitination mediated by deubiquitinase BRCC3 was essential for its activation [ 99 ]. They found the inhibition of deubiquitination by G5 triggered the NLRP3 ubiquitination and inhibited NLRP3 inflammasome activation. Through the screening library of deubiquitinases and functional analysis, they defined that the deubiquitinase BRCC3 can promote the NLRP3 inflammasome activation through deubiquitinating NLRP3. This study demonstrated that the NLRP3 deubiquitination played critical roles for its assembly and activation, even without knowing the detailed ubiquitination process. Lopez-Castejon et al. also reported that small molecule inhibitors of the deubiquitinase enzyme activity inhibited the inflammasome activation through impairing the ASC oligomerization [ 100 ]. In addition, a study from Alnemri group revealed that signaling through the TLR4 recognition induced the mitochondrial reactive oxygen species production, which in turn promoted the NLRP3 deubiquitination and its activation [ 98 ]. Regarding the mechanism by which deubiquitination mediates the inflammasome assembly and activation, the David Brough group recently identified that deubiquitinases USP7 and USP47 regulate the NLRP3 inflammasome activation by promoting ASC oligomerization and speck formation [ 101 ]. Lee et al. also reported that deubiquitinase USP50 interacted with ASC and removed the K63-linked ubiquitin of ASC to mediate the ASC oligomerization and NLRP3 inflammasome activation [ 102 ]. Met1-linked linear ubiquitin modification formed by the linear ubiquitination assembly complex (LUBAC) has been reported to regulate the NF-κB activation by the linear polyubiquitylation of NF-kappa-B essential modulator (NEMO) [ 103 ]. In 2014, Rodgers et al. reported that the LUBAC-mediated ASC linear ubiquitination was essential for the assembly of the NLRP3/ASC complex and NLRP3 inflammasome activation [ 104 , 105 ]. So far, numbers of E3 ligase-regulated NLRP3 inflammasome activation have been reported. These E3 ligases exhibited either positive or negative roles for the NLRP3 inflammasome activation depending on the ubiquitin linkage types and targets. Zhou group reported that the E3 ligase MARCH7 promoted K48-linked polyubiquitination of the NLRP3 and NLRP3 degradation, which contributed to the dopamine inhibited NLRP3 inflammasome activation and neuroinflammation [ 106 ]. TRIM31, Cullin1 and ARIH2 also were demonstrated to negatively regulate the NLRP3 inflammasome activation through the ubiquitination of NLRP3 [ 107 , 108 , 109 ]. In contrast, TRAF3 and Pellino2 were reported to promote the NLRP3 inflammasome activation via mediating K63-linked polyubiquitination of ASC and NLRP3, respectively [ 110 , 111 ]. TRAF6 was also required for the NLRP3 inflammasome activation through mediating the NLRP3 oligomerization and ubiquitination [ 112 ]. F-box containing the E3 ubiquitin ligase FBXL2 was demonstrated to mediate the NLRP3 ubiquitination and proteasomal degradation, LPS priming inhibited the FBXL2 activity and thus promoted the NLRP3 stability [ 113 ]. In addition, the phosphorylation of NLRP3 also has an effect on its ubiquitin modification. Guo et al. reported that bile acids inhibited inflammation and exhibited improvement in metabolic syndromes through directly inhibiting the NLRP3 inflammasome activation [ 114 ]. Mechanistically, the bile acids treatment induces the PKA activation and NLRP3 phosphorylation at Ser 291, which drives the NLRP3 ubiquitination without knowing the E3 ligase involved. How the NLRP1B cleavage induced by LT resulting in the NLRP1B inflammasome activation is an unsolved puzzle. The Vance group first showed that the proteasome-mediated degradation of NLRP1B N-terminal domains was necessary and sufficient for the NLRP1B activation. In addition to LT, they also identified that Shigella flexneri E3 ubiquitin ligase IpaH7.8 regulated the NLRP1B ubiquitination, degradation and activation [ 115 ]. Simultaneously, the Bachovchin group used genome-wide screening and identified that the N-end rule protein E3 ligases UBR2/4 mediated the N-end rule proteasomal degradation of NLRP1B and its activation [ 115 , 116 ]. Shao group also demonstrated the UBR2 mediated ubiquitination and N-terminal cleavage of NLRP1B through interacting with the ubiquitin conjugating enzyme E2O [ 117 ]. These studies demonstrated ubiquitination and the N-terminal degradation were essential for NLRP1B activation. Bacteria E3 ligases can subvert the host immune response by targeting inflammasome components. Shigella IpaH7.8 is one of best studied bacterial E3 ligases. Suzuki et al. demonstrated that Shigella IpaH7.8 E3 ubiquitin ligase mediated ubiquitination of GLMN for proteasomal degradation and promoted both the NLRP3 and NLRC4 inflammasome activation without knowing the detailed mechanism [ 118 ]. Further, Wei et al. reported that the Yersinia Type III secretion effector YopM interacted with NLRP3 and mediated its K63-linked polyubiquitination, which was crucial for the NLRP3-mediated cell death [ 119 ]. Yen et al. showed that the effector protein NleA of severe gastrointestinal disease-inducing pathogens enteropathogenic could subdue IL-1β secretion through inhibiting caspase-1 activation [ 120 ]. The authors identified NLRP3 as one target of NleA and the interaction of NleA and NLRP3 blocked the deubiquitination of NLRP3 resulting in the decreased NLRP3 inflammasome activation. E3 ligase TRIM11 was reported to interact with AIM2 and induce its degradation through the recruitment of p62 for autophagy-dependent degradation but not ubiquitination-mediated proteasome degradation [ 121 ]. In contrast to the NLRP3 ubiquitination, the ubiquitination of AIM2 was less studied. Type I IFN signaling and its inducible GBP proteins were illustrated to mediate the AIM2 inflammasome activation [ 70 , 71 ]. Bacterial ubiquitin ligase IpaH9.8 secreted into the cell cytosol caused the ubiquitination of GBP proteins and their proteasome degradation [ 122 , 123 ], which highlighted the importance of ubiquitination in the regulation of the AIM2 inflammasome activation and host defense. In addition to the caspase-1-dependent pyroptosis, the ubiquitinated NLRC4 regulated by SUG1 was demonstrated to mediate FADD-caspase-8 dependent apoptosis. NLRC4 point mutation NLRC4 H433P enhanced interaction with SUG1 which mediated the NLRC4 H433P ubiquitination and interaction with FADD leading to the caspase-8-dependent cell death [ 124 ]. Instead, the direct modification of the Pyrin ubiquitination has not been reported yet. Regarding the ubiquitination of caspase-1 and its targets, the E2 conjugate enzyme UBE2L3 was shown to be one of caspase-1 targets and mediates IL-1β proteasome degradation through K48-linked polyubiquitination [ 125 ]. The NF-κB inhibitor A20 is a deubiquitinase, it was investigated to prevent inflammatory responses through regulating the K63-linked ubiquitination of pro-IL-1β, and its associated complex. The deficiency of A20 causes a spontaneous NLRP3 inflammasome activation response to the LPS treatment alone [ 126 ]. Inhibitors of apoptosis cIAP1 and cIAP2 were reported to regulate K63-linked ubiquitination of caspase-1 in the complex with TRAF2, and mediate the caspase-1 activation [ 127 , 128 ]. Caspase-1 was also shown to be modified by the ubiquitin-like protein Nedd8, which directly interacted with caspase-1 and promoted the caspase-1 activation [ 129 ]. In summary, recent studies have provided significant advances of the inflammasome activation regulated by ubiquitination. So far, ubiquitination events were almost identified in every inflammasome components and even the upstream and downstream molecules of the inflammasome activation [ 12 ]. The reported inflammasome activation regulated by ubiquitination were summarized in Table 1 . 4. Bacterial Infection and Ubiquitination-Mediated Immune Responses During bacterial infection, the components of host ubiquitination machinery can be regulated or exploited by a variety of bacterial effector proteins. Bacterial pathogens use multiple strategies to exploit the host ubiquitination and deubiquitination pathways to favor their survival and growth [ 130 ]. To subvert host ubiquitin machinery, bacterial pathogens have evolved different classes of enzymes to mimic specific components of the host ubiquitin system such as RING, HECT, novel E3 ligases (NELs), non-E3 ligase enzymes and bacterial deubiquitinating enzymes [ 131 ]. Bacterial effector SopA from the Salmonella type III secretion system was the first identified as HECT-type E3 ligase [ 132 ], which targeted and mediated the ubiquitination of two host E3 ligases TRIM56 and TRIM65 for promoting type I IFN production and innate immune responses [ 133 ]. Another well studied bacterial HECT-type E3 ligase was NleL derived from E. coli , which catalyzed the K6- and k48-linked polyubiquitin formation through a thioester intermediate with ubiquitin [ 134 ]. NleG type III effectors of pathogenic E. coli were recognized as RING/U-box E3 ubiquitin ligases, bacterial NlgG effectors displayed strong autoubiquitination activity and were demonstrated to interact with human E2 enzymes for supporting the activity [ 135 ]. Multiple effector proteins from Legionella pneumophila have been defined as the U-box and F-box domain-containing E3 ligases. LubX and GobX were two U-box domain-containing effectors to mediate the ubiquitination of other bacterial effectors and host cellular proteins. L. pneumophila F-box effectors LegU1 and AnkB were reported to direct the ubiquitination of the host chaperone protein BAT3 and recruit polyubiquitinated proteins into Legionella containing vacuole for promoting the L. pneumophila intracellular replication, respectively [ 136 , 137 ]. In addition to the conventional ubiquitination process, pathogenic bacteria evolved unconventional NELs and non-E3 ligase enzymes through an E1- and E2-independent process. Numbers of NELs have been discovered in Salmonella and Shigella pathogens, such as SspH2 of Salmonella and IpaH family proteins from Shigella [ 138 , 139 ]. The host NF-κB and inflammasome pathways were demonstrated as major targets of Shigella IpaH effectors. In addition to the inflammasome activation mediated by bacterial NELs described above, bacterial novel E3 ubiquitin ligases IpaH9.8 and IpaH0722 were reported to target NEMO and TRAF2 for the ubiquitination-mediated proteasome degradation and dampen NF-κB-dependent inflammatory responses [ 140 , 141 ]. IpaH1.4 and IpaH2.5 interacted with LUBAC subunits and conjugated the K48-linked ubiquitin to HOIP for proteasomal degradation of HOIP and inhibiting of NF-κB signaling [ 142 ]. Effector IpaH4.5 was reported to target TBK1 for mediating its K48-linked polyubiquitination and proteasome degradation, which inhibited the IRF3 activation and antibacterial responses [ 143 ]. One of the significant advances in the understanding of bacterial effectors hijack of host cell ubiquitin machinery is the identified non E3 ligase enzymes that catalyze ubiquitylation in an E1- and E2-independent manner. Qiu et al. first reported the L. pneumophila effector protein SidE family ubiquitinated host Rab small GTPases without involvement of the E1 and E2 enzymes [ 144 ]. In fact, the mono-ADP-ribosyltransferase (mART) motif within the SidE family member SdeA was found to catalyze the ADP-ribosylated ubiquitin on Arg42 of ubiquitin. Nucleotidase-phosphohydrolase domain (NP) mediates the cleavage of phosphodiester bond in the ADP-ribosylated ubiquitin creating a phosphor-ribosylated ubiquitin, which is conjugated to substrate proteins. Subsequently, Ivan Dikic group demonstrated that the phosphoribosylated ubiquitin promoted substrate proteins serine ubiquitination and prevented the activation of E1 and E2 enzymes within conventional ubiquitination cascade [ 145 ]. In addition, Ralph R. Isberg group identified Sde promoted the ubiquitination of Rtn4 with phosphor-ribosylated ubiquitin resulting in the rearrangement of tubular ER for replication [ 146 ]. Given that ubiquitination is a reversible process, bacterial pathogens also evolved effectors mimicking host DUBs to remove ubiquitin from substrate proteins. The non E3 ligase enzyme SidE was initially recognized as deubiquitinase with preference for the removal of K63-linked ubiquitin from the phagosomal surface [ 147 ]. Another well-studied bacterial deubiquitinase is the SseL from Salmonella . Holden et al. identified SseL as deubiquitinase for hydrolyzing mono- and polyubiquitin proteins with a preference of K63-linked ubiquitin chains, which led to the lower autophagic flux and favor intracellular Salmonella replication [ 148 , 149 ]. Collectively, these studies suggest that ubiquitination and deubiquitination pathways are indeed important targets by bacterial pathogens exploitation to manipulate host immune responses and promote their survival and replication. 5. Concluding Remarks and Perspectives Based on the work reviewed above and elsewhere [ 11 , 12 , 130 ], the inflammasome activation and ubiquitination process are two major events of host immune responses during bacterial infection. Similar to the ubiquitination mediated NF-κB and type I IFN signaling pathways, the ubiquitination-mediated inflammasome activation was increasingly identified, which added an additional layer of complexity in the regulation of the inflammasome activation. Inflammasome activation is a double-edged sword for intracellular bacterial infection, it triggers an inflammatory response and simultaneously, the replication niche of intracellular bacteria is reduced due to the pyroptotic cell death. Thus, the activation of inflammasome needs to be tightly regulated at multiple layers during bacterial infection. Ubiquitination is a reversible process and inhibitors that regulate ubiquitin machinery are an attractive therapeutic approach for specifically targeting the aberrant inflammasome activation. Ubiquitination could regulate the components of the inflammasome complex and the regulators that are involved in the inflammasome activation. Our current understanding of the interplay between the ubiquitination and inflammasome activation during bacterial infection is still limited. Several important questions need to be addressed. The detailed mechanisms by which deubiquitinates mediate the ASC oligomerization are not clear. What are the E3 ligases that mediate the K63-linked ubiquitination of ASC? Do bacterial E3 ligases or non E3 ligase enzymes directly modify components of host cellular inflammasome and mediate the inflammasome activation? How is the ubiquitination activity regulated by bacterial infection? Overall, the ubiquitination as a regulatory mechanism for the inflammasome activation will remain a perspective and interesting area of study for the future.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3147676/

Cooperativity and Interference of Germination Pathways in Bacillus anthracis Spores ▿ †

Spore germination is the first step to Bacillus anthracis pathogenicity. Previous work has shown that B. anthracis spores use germination (Ger) receptors to recognize amino acids and nucleosides as germinants. Genetic analysis has putatively paired each individual Ger receptor with a specific germinant. However, Ger receptors seem to be able to partially compensate for each other and recognize alternative germinants. Using kinetic analysis of B. anthracis spores germinated with inosine and l -alanine, we previously determined kinetic parameters for this germination process and showed binding synergy between the cogerminants. In this work, we expanded our kinetic analysis to determine kinetic parameters and binding order for every B. anthracis spore germinant pair. Our results show that germinant binding can exhibit positive, neutral, or negative cooperativity. Furthermore, different germinants can bind spores by either a random or an ordered mechanism. Finally, simultaneous triggering of multiple germination pathways shows that germinants can either cooperate or interfere with each other during the spore germination process. We postulate that the complexity of germination responses may allow B. anthracis spores to respond to different environments by activating different germination pathways.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3212758/

Viral hepatitis as an occupational disease in Poland

Background In medical terms, occupational diseases are defined as health disorders specifically associated with the working environment of people and their occupational activity. From the medical and legal perspectives, the vast majority of European countries consider particular diseases to be of occupational origin if they are mentioned in the current list of occupational diseases and caused by exposure to factors in the working environment that are harmful to health. Objectives The aim of this study was to analyze the occurrence of cases of viral hepatitis certified as an occupational disease in Poland during 1979-2009. This article presents the medical, economic, and legal aspects of the epidemiology of hepatitis as an occupational disease in Poland. Materials and Methods Publically available statistical data on certified occupational diseases in Poland and data contained in individual "occupational disease diagnosis cards" (based on data used in Poland statistical form), regarding certified cases of hepatitis among health care professionals, which were collected by the Department of Occupational Hygiene of the Polish Public Health Service, were analyzed in this study. Results In Poland, the highest number of cases of hepatitis certified as an occupational disease was observed in 1987. A gradual reduction in the number of cases of hepatitis as an occupational disease has been noted since then. Currently, hepatitis C as an occupational disease is certified more frequently than hepatitis B. In Poland, the number of women with hepatitis certified as an occupational disease is higher than that of men. However, among health care professionals, particularly nurses, this difference is insignificant because women outnumber the men. The existence of such a situation is due to the significant quantitative predominance of women over men among medical personnel, especially among nurses. Conclusions Immunization of health care professionals against the hepatitis B virus (HBV), introduced in Poland in 1988, was an important factor involved in reducing the number of cases of occupational viral hepatitis. Socioeconomic and financial factors affected the epidemiological data on cases of hepatitis certified as an occupational disease in Poland. An additional problem associated with the diagnosis of occupational diseases is the lack of obligatory testing for anti-hepatitis C virus (HCV) and anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies and examinations to ensure the efficacy of HBV vaccination among medical staff before and during employment. Background In medical terms, occupational diseases are defined as health disorders specifically associated with the working environment of people and their occupational activity. From the medical and legal perspectives, the vast majority of European countries consider particular diseases to be of occupational origin if they are mentioned in the current list of occupational diseases and caused by exposure to factors in the working environment that are harmful to health. Objectives The aim of this study was to analyze the occurrence of cases of viral hepatitis certified as an occupational disease in Poland during 1979-2009. This article presents the medical, economic, and legal aspects of the epidemiology of hepatitis as an occupational disease in Poland. Materials and Methods Publically available statistical data on certified occupational diseases in Poland and data contained in individual "occupational disease diagnosis cards" (based on data used in Poland statistical form), regarding certified cases of hepatitis among health care professionals, which were collected by the Department of Occupational Hygiene of the Polish Public Health Service, were analyzed in this study. Results In Poland, the highest number of cases of hepatitis certified as an occupational disease was observed in 1987. A gradual reduction in the number of cases of hepatitis as an occupational disease has been noted since then. Currently, hepatitis C as an occupational disease is certified more frequently than hepatitis B. In Poland, the number of women with hepatitis certified as an occupational disease is higher than that of men. However, among health care professionals, particularly nurses, this difference is insignificant because women outnumber the men. The existence of such a situation is due to the significant quantitative predominance of women over men among medical personnel, especially among nurses. Conclusions Immunization of health care professionals against the hepatitis B virus (HBV), introduced in Poland in 1988, was an important factor involved in reducing the number of cases of occupational viral hepatitis. Socioeconomic and financial factors affected the epidemiological data on cases of hepatitis certified as an occupational disease in Poland. An additional problem associated with the diagnosis of occupational diseases is the lack of obligatory testing for anti-hepatitis C virus (HCV) and anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies and examinations to ensure the efficacy of HBV vaccination among medical staff before and during employment. 1. Background In medical terms, occupational diseases are defined as health disorders specifically associated with the working environment of people and their occupational activity. From medical and legal perspectives, the vast majority of European countries consider particular diseases to be of occupational origin if they are mentioned in the current list of occupational diseases and are caused by exposure to factors in the working environment that are harmful to health. The European List of Occupational Diseases was prepared in 1990 and has been updated since then. The list is a variant of the European Commission's (EC) recommendation for European Union (EU) Member States. In Poland, the current list of occupational diseases includes 26 points, denoting groups of diseases and particular types of occupational diseases, and its scope is similar to that of the EC recommendations. As defined in Polish law, "Occupational diseases are recognized as such if included in the list of occupational diseases and considered to be obviously or most probably caused by exposure to deleterious factors in the working environment, or associated with occupational activities." In Poland, the procedure involved in the identification of occupational diseases is composed of 3 elements: suspicion of an occupational disease, its diagnosis by a physician possessing appropriate qualifications and employed by an authorized institution, and its certification by administrative proceedings carried out by the Public Health Service (in addition to the opportunity of recourse to law). On the basis of the certification of an occupational disease, the affected employee is entitled to receive specific financial benefits. Therefore, official data on the number of cases of certified occupational diseases are analyzed not only from a medical perspective (the actual occurrence of the disease and access to suitable diagnostic services and treatment), as well as from a socioeconomic perspective. An individual's awareness of the disease and the labor market situation are also considered. These guidelines predominantly apply to diseases that cause permanent or chronic health impairment. Furthermore, in some diseases, access of the exposed individuals to suitable high-quality medical diagnosis may be of significance. The occupational background of infectious diseases in Poland was considered in 1928. Ascariasis, glanders, tuberculosis, anthrax, tetanus, and diseases posing a risk for medical personnel were included in the group of occupational diseases. Currently, the vast majority of certified infectious occupational diseases in Poland are cases of hepatitis and tuberculosis among health care professionals and borreliosis among forest service workers [ 1 ][ 2 ][ 3 ]. According to official epidemiological data, the most common certified occupational diseases in Poland are hepatitis B and C; hepatitis A and D are much less common. In case of hepatitis A, the low number is associated with the low incidence of the disease in the general population (only several dozen cases are officially registered annually), with the acute course of the disease, and with the common lack of any constant or long-term health damage following recovery. From the financial perspective, an employee in Poland is entitled to compensation not because of contracting an occupational disease, but because of the persistent or long-term health damage caused by the disease. In case of hepatitis D, rare diagnosis is associated with the relatively low incidence of hepatitis B + D co-infections in the general population and is a result of the compulsory vaccination of medical personnel against the hepatitis B virus (HBV). However, cases of hepatitis D virus (HDV) infection have been noted among health care professionals in Poland. These were individuals who had previously been HBV carriers and who had become additionally infected with HDV via professional exposure to infected blood. Certification of viral hepatitis as an occupational disease is a difficult process. Because infection with hepatotropic viruses may occur under conditions other than professional exposure to those microbes, care must be taken while evaluating the patient's working conditions. Non-occupational factors increasing the risk of infection, i.e., surgeries, blood transfusions, frequent hospitalizations, and diagnostic procedures, are additional obstacles to the certification processes. From the viewpoint of medical certification, the sole fact of performing professional duties posing a risk of accidental disruption of skin continuity or exposure of the mucosa does not allow an unequivocal definition of the professional exposure of an employee to of hepatitis. However, documented confirmation of an event of exposure of an individual employee to potentially infectious material provides a basis for considering the existence of a causal relationship between professional duties and the diagnosed disease. Unfortunately, a significant proportion of these events has not been recorded in the past [ 4 ]. Doctors, more often than nurses, have disregarded such situations [ 4 ]. Currently, a majority of institutions have so called "needlestick notebooks" and "individual exposure cards." Needlestick or other exposure to potentially infectious material is, of course, treated as an accident at work; even though it does not result in serious consequences (according to the Polish definition, an accident at work is "a sudden event caused by an external cause associated with work, causing injury or death"). It should also be noted that detection of anti-hepatitis C virus (HCV) antibodies or diagnosis of HBs carriers in itself is not considered as an occupational disease. Only the diagnosis of an acute or chronic inflammatory condition in the hepatic tissue constitutes a basis for the recognition of hepatitis as an occupational disease. Difficulties associated with the lack of serological examination for HCV and HBV in employees before they start performing their professional duties in health care institutions in Poland have also been observed. Therefore, an infection detected after a long asymptomatic course of the disease may be wrongly diagnosed as an occupational disease. Routin examination of health care professionals for the presence of anti-HCV, anti-human immune deficiency virus HIV, and anti-HBsAg was introduced in Poland in 1996, but this was cancelled a year later (in contrast to many European countries). Currently, whether these examinations are performed or not is left to the discretion of a doctor specializing in occupational medicine. However, compulsory tests include estimation of bilirubin and alanine aminotransferase levels in blood serum (tests that may yield false negative results). Unfortunately, standard protocols for diagnosis of health care professionals infected with HBV and HCV, in Poland, still need to be improved[ 5 ][ 6 ]. Common examinations of the efficacy of vaccination against HBV are not performed in Poland, and this prevents the discovery of non-responders. It may be suspected that the incidence of carriers may be higher in some medical personnel than in the general population (a similar situation has been observed in other countries). Previous studies have shown that the percentage of health care professionals in Poland who have anti-HCV antibodies in their blood fluctuates from below 1.3% to over 3.2% of the average values for the Polish society, which have been estimated to be approximately 1.5-2.0% [ 7 ][ 8 ]. The risk factors for the presence of anti-HCV antibodies in medical personnel in Poland include work in therapeutic dialysis units, performing duties characteristic for mid-level medical personnel, and past surgical procedures [ 8 ]. Notably, in many countries, the problem of HCV infection has been recognized as a problem of auxiliary personnel, employees of hemodialysis wards, and surgeons [ 8 ][ 9 ][ 10 ]. Poland is considered to have a low incidence of HBV infection [ 11 ]. Earlier estimates have suggested that about 1-2% of the general Polish population have HBsAg, and about 20% have the anti-hepatitis B core antigen (HBc) [ 12 ]. 2. Objectives The aim of this study was to analyze the occurrence of cases of viral hepatitis certified as an occupational disease in Poland during the years 1979-2009. 3. Materials and Methods Publically available statistical data on certified occupational diseases in Poland and data contained in individual "occupational disease diagnosis cards" regarding certified cases of hepatitis among health care professionals, which were collected by the Departments of Occupational Hygiene of the Polish Public Health Service, were analyzed in this study [ 3 ][ 13 ][ 14 ][ 15 ]. "Occupational disease diagnosis cards" are only statistical standards used in Poland (these are not medically or legally defined standards of diagnosis occupational diseases; the general and current rules of diagnostics and certification of viral hepatitis as an occupational disease in Poland and in EU have been presented in the background). The following data were analyzed: number of cases of viral hepatitis certified as an occupational disease during the years 1979-2009 (including gender and age data) and the number of cases in which the patient was a medical professional. The collected data did not include any personal information The employment data included professionally active doctors (including dentists), nurses, midwives, laboratory diagnosticians, paramedics, medical technicians, and medical rescue team members. For example, in 2008, there were 78,086 doctors; 12,765 dentists; 182,778 nurses; 21,808 midwifes; 9,008 lab diagnosticians; and 7,743 paramedics professionally active in Poland (the population of Poland is approximately 38.5 million). Data on the number of employees in health care institutions, published by the Polish Main Statistical Office in Warsaw, were used for estimating the incidence coefficients of hepatitis in medical professionals [ 16 ]. Additional epidemiological examples were obtained from Wielkopolska province, where the author's University is located. Wielkopolska province is the second largest (29,825 km(2)) province in Poland and it has the third highest population (3.3 million). 4. Results In Poland, cases of hepatitis as an occupational disease were certified only among representatives of health care workers during 1979-2009. The highest number of cases of hepatitis certified as an occupational disease was noted in 1987 ( Figure 1 ). Since then, the number of cases has gradually reduced (with a small inhibition in 1997-1998 and 2003). Currently, hepatitis C is certified as an occupational disease more frequently than hepatitis B was in the past years ( Figure 2 ). In Poland, the number of women with hepatitis certified as an occupational disease is higher than that of men. However, among health care professionals, this difference is insignificant because women outnumber the men ( Figure 3 ). Figure 1 The number of hepatitis cases certified as an occupational disease per 1000 working health care professionals in the last 30 years in Poland Figure 2 The number of hepatitis B and hepatitis C cases certified as occupational diseases per 1000 working health care professionals during the last years in Poland Figure 3 The number of hepatitis cases certified as an occupational disease among men and women per 1000 working male and female health care professionals during the last years in Poland 5. Discussion The cases of hepatitis certified as an occupational disease in Poland during 1979-2009 occurred among medical professionals. This may be attributed to the fact that this group has the highest risk of hepatitis virus infection and probably, increased has awareness about medical certification. In Poland, the highest number of cases of viral hepatitis certified as an occupational disease was noted in 1987. Active immunization against HBV was introduced in Poland in 1988, and vaccination was first provided to medical personnel (for many years, this group had been administered booster vaccination every 5 years) ( Figure 1 ). In 1993, the schedule of compulsory vaccination was expanded by immunization of patients before scheduled surgical procedures, common immunization of neonates in selected areas of the country, and in groups with high risk of HBV infection. Since 1997, all neonates and schoolchildren have been vaccinated against HBV, according to the following schedule: 0, 1, and 6 months (without booster doses). Intensification of vaccination in the 1990s caused a radical decrease in the number of new cases of hepatitis B in the general population. Before the introduction of general immunization against hepatitis B, Poland was an infamous regional record-breaker in the category of nosocomial HBV infections. This was because of the use of ineffective sterilization methods, lack of proper hygiene by medical personnel, and the utilization of multiple-use medical equipment. Some inhibition of the reduction in the number of certified cases of viral hepatitis, both nationwide and in Wielkopolska province in 1997-1998 and 2003 (invasive specialties among men), was most probably caused by a reform in the health care system in Poland and the need for some financial security for health care professionals facing possible dismissal or because of a transformation of health care institutions ( Figure 1 and Figure 3 ). From a medical perspective, cases of viral hepatitis certified as an occupational disease could be cases of hepatitis diagnosed many years ago, but employees took some steps towards the certification of their viral hepatitis as an occupational disease only in the face of some economic threat. The aim of certification was financial compensation for persistent or long-term damage to health. The situation in 1997-1998, 10 years after the introduction (1988) of the compulsory immunizations of medical personnel against HBV, was not a result of low efficacy, but of the fact that the period of time between medical diagnosis of the disease and its certification as an occupational disease may be quite long in Poland (however, in Poland, obligatory testing for anti-HBs antibodies after immunization to identify non-responders among health care workers has not been enforced). The majority of cases of hepatitis certified as an occupational disease in Poland occurred among women (this trend has also been observed in Wielkopolska province [ 17 ]; approximately 83.3% of the cases in the country have been reported in women). This situation is associated with the significantly high number of medical personnel, particularly nurses, who are women. Occupational hepatitis occurs most often among nurses [ 17 ]. The differences are insignificant when we consider the number of male and female health care professionals in Poland ( Figure 3 ). The characteristic mean age of employees with hepatitis certified as an occupational disease is worth noting. In the past, hepatitis B has very often been certified among young nurses (aged 21-30 years), as described in a previous report [ 17 ]. This disturbing finding was mainly associated with the significant risk of blood-borne infections (common needlestick injuries and other forms of exposure to potentially infectious material), in the above-mentioned population easy transmission of HBV from patients to medical personnel, and lack of protective immunization against HBV at that time [ 18 ][ 19 ]. The mean age of employees with hepatitis certified as an occupational disease has increased lately. On average, the mean age is 46.0 ± 9.8 years for hepatitis B, and 45.4 ± 9.9 years for hepatitis C during 2001-2005 [ 1 ]. This epidemiological situation may be associated with the identification of hepatitis B certified as an occupational disease many years after medical diagnosis, or (hypothetically) with the lower immunity of older individuals to the infection, or the lower efficacy of immunization in older people. In the case of hepatitis C, the old age of employees in whom the disease is certified as an occupational disease may be associated with lower probability of HCV transmission (since viremia levels are lower hepatitis C than those in hepatitis B). Therefore, an employee has to be exposed to HCV more often to become infected with the virus. The deceptive course of HCV infection and the development of non-specific signs and symptoms may be additional factors that delay medical diagnosis, and consequently, the administrative certification of the disease as an occupational disease. The problem associated with the diagnosis of occupational diseases in Poland is the lack of obligatory testing (for anti-HCV or anti-HBsAg antibodies) among the medical staff before and during employment. In Poland, the tests for anti-HBs antibody levels are not obligatory and are not widely performed. A doctor specializing in occupational medicine decides whether these examinations have to be performed or not (the decision also depends on the rules in a particular hospital). Preplacement medical examination and regular follow-up are necessary to document occupational hepatitis. For non-medical reasons (such as financial loss and risk of losing a job, etc.), an employee with earlier diagnosed infectious disease may start action aimed at the certification of this disease (i.e. hepatitis) as an occupational disease at any time. In conclusion, we state the following: Immunization against HBV among health care workers (introduced in Poland in 1988) was an important factor affecting the reduction in the number of cases of viral hepatitis as an occupational disease in Poland. Socioeconomic and financial factors affected the epidemiological data on cases of hepatitis certified as an occupational disease in Poland. An additional problem associated with the diagnosis of occupational diseases in Poland is the lack of obligatory testing (for anti-HCV, anti-HBsAg antibodies, as well as examinations to estimate the efficacy of vaccinations against HBV) among medical staff before and during employment.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3463344/

Porphyromonas gingivalis Mediates Inflammasome Repression in Polymicrobial Cultures through a Novel Mechanism Involving Reduced Endocytosis *

Background: Porphyromonas gingivalis has low immunogenicity and synergizes with other periodontal pathogens, including Fusobacterium nucleatum. Results: Porphyromonas gingivalis selectively represses the activation of the IL-1β-processing inflammasome by Fusobacterium nucleatum and inducers that are endocytosed. Conclusion: Porphyromonas gingivalis suppresses inflammasome activity through a novel mechanism involving modulation of endocytosis. Significance: Inflammasome suppression may contribute to periodontitis and other chronic diseases.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4011807/

Raxibacumab: potential role in the treatment of inhalational anthrax

Anthrax is a highly contagious and potentially fatal human disease caused by Bacillus anthracis , an aerobic, Gram-positive, spore-forming rod-shaped bacterium with worldwide distribution as a zoonotic infection in herbivore animals. Bioterrorist attacks with inhalational anthrax have prompted the development of more effective treatments. Antibodies against anthrax toxin have been shown to decrease mortality in animal studies. Raxibacumab is a recombinant human monoclonal antibody developed against inhalational anthrax. The drug received approval after human studies showed its safety and animal studies demonstrated its efficacy for treatment as well as prophylaxis against inhalational anthrax. It works by preventing binding of the protective antigen component of the anthrax toxin to its receptors in host cells, thereby blocking the toxin's deleterious effects. Recently updated therapy guidelines for Bacillus anthracis recommend the use of antitoxin treatment. Raxibacumab is the first monoclonal antitoxin antibody made available that can be used with the antibiotics recommended for treatment of the disease. When exposure is suspected, raxibacumab should be given with anthrax vaccination to augment immunity. Raxibacumab provides additional protection against inhalational anthrax via a mechanism different from that of either antibiotics or active immunization. In combination with currently available and recommended therapies, raxibacumab should reduce the morbidity and mortality of inhalational anthrax. Introduction In December 2012, the United States Food and Drug Administration (FDA) approved raxibacumab for treatment of and prophylaxis against inhalational anthrax. 1 Its labeled uses are to treat inhalational anthrax in combination with appropriate antibacterial drugs, and for prophylaxis when alternative therapies are not appropriate or available. 2 For its approval, the FDA granted fast track designation, priority review, orphan product designation, and applied the Animal Efficacy Rule. Under this rule, medications are given FDA approval based on efficacy findings from adequate and well controlled animal studies when it is not feasible or ethical to conduct studies in human subjects. 3 Inhalational anthrax is a rare and lethal disease, so efficacy studies are unethical and prohibited in humans. After the bioterrorist attacks of September 2001, which resulted in eleven confirmed cases of inhalational anthrax and five fatalities, the US government enacted new rules and regulations to encourage pharmaceutical industry development of medical countermeasures against bioterrorist threats. 4 , 5 The Project Bioshield Act was signed into law on July 2004 and provided funding for the development of raxibacumab. Under Project Bioshield, the pharmaceutical company, Human Genome Sciences (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC, USA) was awarded a contract to develop and deliver human immune globulin against anthrax. 5 The reason for commissioning the development of passive immunity is that current recommendations for therapy and exposure prophylaxis have limitations. 6 , 7 Why is raxibacumab needed? Current therapy guidelines recommend use of antibiotics that are highly effective against Bacillus anthracis , but until recently did not recommend administration of antitoxin therapy. Patients die due to toxin-induced disease despite effective antibiotic use that kills the bacteria. 8 Toxin levels are highest during initial presentation and decline with early antibiotic administration. 9 The Anthrax Vaccine Adsorbed (BioThrax ® ; Emergent BioSolutions Inc., Rockville, MD, USA) licensed for use in the USA requires at least 4 weeks to develop sufficient protective immunity. 7 Exposed patients are at risk of disease despite receiving immunization, given the bacteria's short incubation period of at least 4 days after inhalation. Another concern is adherence with the recommended 2-month oral antibiotic regimens against exposure prophylaxis. In a study of antibiotic adherence among postal workers in Washington after the terrorist attacks of 2001, only 40% of those sampled reported full adherence, while another 18% had completely discontinued their prophylaxis. 10 The US Centers for Disease Control and Prevention recently updated their guidelines in 2014 and support the use of antitoxin therapy (either raxibacumab or anthrax immune globulin) in combination with antimicrobial drug treatment in any patient for whom there is a high level of clinical suspicion for inhalational anthrax. They acknowledge that optimal timing of antitoxin administration remains unknown given the lack of data. 11 Thus, passive immunity in the form of protective antibodies has a role in treatment as well as post-exposure prophylaxis against inhalational anthrax. This review discusses raxibacumab (Abthrax ® , GlaxoSmithKline), the first human monoclonal antibody approved for treatment and prophylaxis against inhalational anthrax. Pathophysiology of anthrax B. anthracis is a large rod-shaped, aerobic, Gram-positive, spore-forming bacterium that exists in a spore or vegetative state. The spore is the dormant form and is found in soils around the world. Anthrax spores are stable particles that can withstand very extreme conditions due to their highly coated and thick protein shell. This allows spores to survive in an adverse environment for prolonged periods of time. 12 The vegetative state is the replicating form that exists during active infection. Herbivore mammals typically acquire the infection after ingestion of spores, with transmission to humans upon contact with contaminated animal products. Infection in humans results in four recognized forms of the disease, depending on the route of entry, ie, cutaneous, gastrointestinal, injection, and inhalational anthrax. 13 , 14 Cutaneous anthrax is the most common and frequently resolves spontaneously. Initially, a painless or pruritic papule appears, and is surrounded by edema. The papule progresses to a vesicle, rupturing and creating an ulcer covered by a black eschar that sloughs 2–3 weeks later. Gastrointestinal anthrax occurs after ingestion of contaminated meat. Spores germinate, resulting in oropharyngeal and gastrointestinal ulceration, followed by regional lymphadenopathy, edema, sepsis, necrosis, and perforation. Ascites can also occur. Patients develop nausea, vomiting, bloody diarrhea, and ultimately pain resulting in an acute abdomen. Intravenous or intramuscular drug use results in injectional anthrax where the typical black eschar is absent. Patients develop subcutaneous lesions that lead to sepsis. Inhalational anthrax occurs after inhaled spores are phagocytosed by alveolar macrophages that carry the spores to hilar and mediastinal lymph nodes where they germinate. Germination results in hemorrhagic mediastinitis, bilateral hemorrhagic pleural effusions, dyspnea, hypotension, shock, and death. Patients initially present with influenza-like symptoms during the first 4 days, but rapidly progress to respiratory failure. 13 , 14 The anthrax genome is comprised of a single covalently closed chromosome. It contains two virulent plasmids, pXO1 and pXO2, responsible for synthesizing the immunologically inert capsule and the anthrax toxin, respectively. 15 The capsule is composed of poly-γ-D-glutamyl amino acids and protects the bacteria from phagocytosis. 16 , 17 The anthrax toxin is composed of two binary combinations, each containing a common binding component known as protective antigen (PA). The other two components, edema factor and lethal factor, are enzymes. PA combines with edema factor to form edema toxin, and in a similar way with lethal factor to form lethal toxin. PA is a protein that mediates binding to its receptors in the cell membrane of host cells. Binding to either a high-affinity or low-affinity receptor (ANTXR1/2) that may or may not require a coreceptor (LRP6) occurs, with subsequent transformation of PA, resulting in pore formation and facilitating translocation of edema factor and lethal factor into the cell cytosol ( Figure 1 ). 18 , 19 PA is therefore essential for intracellular translocation of both edema and lethal toxins. PA induces immunization, and all current acellular or attenuated live anthrax vaccines contain or express PA. 20 Edema factor is a calcium-dependent and calmodulin-dependent adenylate cyclase that increases intracellular levels of cyclic adenosine monophosphate. 21 Edema toxin results in cell and tissue edema. Patients develop pulmonary edema, congestion, and large serosanguinous exudative pleural effusions. 22 , 23 Lethal factor is a zinc metalloproteinase that inactivates mitogen-activated protein kinase-kinase. Lethal toxin impairs both innate and adaptive immune reactions, leading to uncontrolled bacterial proliferation and cell death. 24 , 25 Patients develop hemorrhagic mediastinitis from lymph node ulceration and septic shock. 26 Efforts directed at preventing anthrax toxin from entering the cell should avoid the deleterious effects of edema and lethal toxins. The most effective way to neutralize these toxins is to inhibit their common binding component, PA. Inhibition of PA would prevent its binding to the cell membrane and translocation of the toxin into the cell. Mechanism of action Raxibacumab is a recombinant human immunoglobulin G1λ monoclonal antibody that blocks the binding of PA to its cell receptor, thereby inhibiting pore formation and internalization of edema and lethal toxins ( Figure 2 ). 2 , 27 , 28 The antibody was derived from a phage display library licensed by Human Genome Sciences from Cambridge Antibody Technology (AstraZeneca, London, UK). Raxibacumab binds to PA at the domain IV epitope with an affinity of 2.78±0.9 nM, and its inhibition is dose-dependent. 29 , 30 Raxibacumab does not have any direct antibacterial activity. Therefore, it is advised that its use should be combined with the antibiotics recommended for the treatment of anthrax. Pharmacokinetics Raxibacumab shows linear pharmacokinetics over a dose range of 1–40 mg/kg after administration of a single intravenous dose. Serum levels can be detected for up to 56 days after administration. Raxibacumab has a mean half-life of 16–19 days, and has limited renal clearance. Its steady-state volume ranges from 58 mL/kg to 73 mL/kg, suggesting tissue distribution. 31 Raxibacumab does not penetrate the blood–brain barrier. 2 When given with intravenous or oral ciprofloxacin, serum concentrations of neither medication are affected and the regimen is well tolerated. 27 Dosage, administration, and safety In adults, raxibacumab is given as a single intravenous dose of 40 mg/kg over 2 hours and 15 minutes. The medication is diluted in 0.9% normal saline to give a total volume of 250 mL, and 25 mg or 50 mg of oral or intravenous diphenhydramine should be given within one hour to reduce the risk of infusion reactions. 2 The intravenous route is perceived as disadvantageous given that the intramuscular and subcutaneous routes are easier ways to administer the drug. A Phase I study showed that two intramuscular injection sites produced different bioavailabilities when compared with intravenous infusion. 31 All studies evaluating the safety of raxibacumab have been done in adults ( Table 1 ). 27 , 29 , 31 The most common reactions reported during infusion included rash, urticaria, and pruritus. Other reactions included headache, upper respiratory tract infection, nausea, pain in arm or leg, cough, and arthralgias. 27 The following adverse reactions were seen more commonly with raxibacumab than placebo but occurred in less than 1.5% of subjects given raxibacumab: lymphadenopathy, palpitations, vertigo, fatigue, infusion site pain, peripheral edema, back pain, muscle spasms, vasovagal syncope, insomnia, flushing, and hypertension. Laboratory abnormalities seen after drug infusion included anemia, leukopenia, elevated amylase and creatine phosphokinase, and prolonged prothrombin time. 2 All adverse events resolved within the time period that safety studies were conducted. 27 Raxibacumab is considered a pregnancy category B medication (ie, no evidence of risk in animal studies, but no adequate human studies in pregnancy available). 2 , 28 Safety studies Four substudies were performed by Human Genome Sciences to assess the safety, tolerability, and pharmacokinetics of raxibacumab in healthy humans ( Table 1 ). The first was a randomized, single-blind, placebo-controlled Phase I dose-escalation study conducted in 105 healthy volunteers. 31 Subjects received placebo or raxibacumab as a single intramuscular injection or intravenous infusion. Three intramuscular and five intravenous dose levels were studied, along with two intramuscular injection sites. The pharmacokinetics, half-life, and different bioavailabilities were calculated. This study showed that raxibacumab was safe, well tolerated, and bioavailable after a single intravenous or intramuscular dose. The second study was an open-label Phase I evaluation of the pharmacokinetics and safety of intravenous raxibacumab given at a dose of 40 mg/kg in combination with ciprofloxacin. 27 Concomitant use of ciprofloxacin did not reduce the serum concentrations of either drug. The third study was a randomized, placebo-controlled comparison of a single dose of raxibacumab versus two doses of the drug. 27 The results of this study were combined with those of the previous two studies and did not find significant differences in adverse reactions when compared with placebo. The fourth study was an open-label evaluation of the persistence of immunogenicity and safety with a repeat dose of intravenous raxibacumab at 4 months. 27 The results of this last study have not yet been published. It is unethical and illegal to perform prophylactic and therapeutic efficacy studies in humans, so the majority of these studies have been performed in animals. Animal studies Prophylactic and therapeutic efficacy studies were conducted in rats, rabbits, and monkeys before raxibacumab received FDA approval ( Table 2 ). Initial studies were conducted in rats, and two of these have been published. The first was a randomized, placebo-controlled study in which survival was evaluated at different time intervals after a 24-hour infusion of anthrax lethal toxin (PA plus lethal factor). 32 Rats receiving raxibacumab within 6 hours of toxin administration had a better survival rate than those that received raxibacumab at 9 or 12 hours. In the same study, different doses of raxibacumab given 6 hours after toxin infusion were evaluated. The survival rate decreased with lower doses of raxibacumab. In the second study, rats were given a single injection of raxibacumab or placebo 24 hours before administration of the lethal toxin. 27 The survival rate in rats that received the single raxibacumab dose was 100%, whereas that in rats that received placebo was 0%. The positive outcomes of the above-mentioned studies led to further evaluation in animal models that better resemble humans. Rabbits are one of the preferred models of inhalational anthrax. In the first study, rabbits were given a single subcutaneous dose of raxibacumab 48 hours before exposure to anthrax spores on day 0 or a single 40 mg/kg intravenous raxibacumab dose immediately after exposure. 29 Survival at 14 days was dose-dependent and significantly greater in the raxibacumab group than in the placebo group (which had a survival rate of 0%). Bacteremia was noted in all the rabbits that died but not in any of the rabbits given raxibacumab. The second study looked at therapeutic administration of raxibacumab after exposure. 29 In the first experiment, a 40 mg/kg intravenous dose of raxibacumab was given at different time intervals starting at time 0 after exposure to anthrax spores. At 14 days post-exposure, all rabbits that had received raxibacumab at 0 and 12 hours were alive, whereas rabbits that received raxibacumab at 24 and 36 hours had 50% and 41.7% survival rates, respectively. In the second experiment, rabbits were exposed to anthrax spores and then given intravenous raxibacumab at different doses. The survival rate at 14 days post-exposure increased in rabbits that received higher doses, with 20 mg/kg and 40 mg/kg having the highest survival rates. The third study was an open-label, parallel-group, randomized, placebo-controlled study that randomized rabbits into three groups challenged with anthrax aerosol on day 0. 27 Upon recording of body temperature at least 1.1°C above baseline or detection of PA in serum, rabbits were given a single dose of raxibacumab (20 mg/kg or 40 mg/kg) or placebo. Survival at 14 days was significantly greater in the groups that received raxibacumab (28% for 20 mg/kg and 44% for 40 mg/kg) when compared with placebo (0%). The difference in survival between the two groups that received raxibacumab was not statistically significant. A fourth study evaluated the survival benefit of adding raxibacumab to levofloxacin versus levofloxacin alone 84 hours after inhalational exposure. 33 Although the difference in survival rate did not reach statistical significance, it was higher in the group that received the combination of levofloxacin and raxibacumab. Half as many deaths occurred in the group that received combination treatment than in the group that received levofloxacin alone. Monkeys are another preferred model of inhalational anthrax, given their close anatomic and genetic resemblance to humans. The initial study evaluated the efficacy of raxibacumab at different doses using a single subcutaneous injection 48 hours before exposure to spores. 27 Monkeys that received higher doses had a greater likelihood of survival, the highest being achieved with the 40 mg/kg dose. Monkeys that survived were rechallenged with anthrax spores one year later, and all were protected. The second study was a single-blind, parallel-group, randomized, placebo-controlled evaluation of the therapeutic efficacy of raxibacumab after exposure to anthrax spores. 27 Monkeys in this study received a single intravenous dose of raxibacumab (20 mg/kg or 40 mg/kg) or placebo after detection of PA in serum. The survival rate was higher at 28 days in both raxibacumab groups when compared with placebo. These animal studies established that raxibacumab is effective against inhalational anthrax, and also demonstrated its effectiveness as a prophylactic agent. There seems to be protection against inhalational rechallenge one year after the initial exposure. Concomitant use with levofloxacin resulted in a clinically meaningful increase in survival 3.5 days after exposure. Raxibacumab adds an additional element of protection against inhalational anthrax not previously covered by antibiotics or vaccination. Other similar antibodies Six other monoclonal antibodies against PA are currently under investigation ( Table 3 ), 30 and neutralize PA via different mechanisms: inhibition of receptor binding (like raxibacumab); interference with transformation of PA into a heptamer when forming a pore in the cell membrane; and disruption of the preformed PA heptamer by formation of a supercomplex. Other monoclonal antibodies that are currently not in clinical use neutralize PA by interfering with lethal factor and binding or by blocking the enzymatic cleavage of PA 83 into PA 63 and PA 20 30 Polyclonal antibodies against PA have also been developed. Human anthrax immunoglobulin (Anthrivig™, Emergent BioSolutions Inc., Rockville, MD, USA) is derived from the plasma of humans immunized with Anthrax Vaccine Adsorbed vaccine and contains polyclonal antibodies against PA. 34 Whether these other monoclonal and polyclonal antibodies are as effective as raxibacumab or provide advantages against inhalational anthrax remains to be determined. Conclusion Raxibacumab is a recombinant human monoclonal antibody that neutralizes anthrax toxins by inhibiting binding of PA to cell receptors. It is given intravenously as a single dose and its current FDA-approved indications include use as therapy for and prevention against inhalational anthrax. To meet the FDA Animal Efficacy Rule requirements, raxibacumab has needed both human and animal studies to evaluate its safety and efficacy, respectively. Animals do not reflect human disease precisely. Therefore, different animal models were developed in order to determine survival outcomes and extrapolate these to humans as precisely as possible. Under the current rules, efficacy needs to be demonstrated in at least two different animal species. In addition, post-marketing human efficacy studies are mandated. Meeting these two requirements can be difficult and challenging. In the event of a bioterrorist attack, a post-marketing efficacy study would be a resource-intensive and difficult task to perform given the circumstances. Costly and timely resources have been invested in raxibacumab in order to receive FDA approval. Current antibiotics or available anthrax vaccines do not provide antitoxin therapy like raxibacumab does. Whether future guidelines should incorporate passive immunity as part of the therapeutic armamentarium against inhalational anthrax needs to be discussed. This is important given the potential for anthrax to be used as a bioterrorist weapon. When combined with currently recommended antianthrax antibiotics, as well as immunization when available, raxibacumab seems to be an effective therapy to combat the deleterious effects of anthrax toxins.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2825879/

Chelator Fragment Libraries for Targeting Metalloproteinases

A chelator fragment library based on a variety of metal binding groups was screened against a metalloproteinase. Lead hits were identified and an expanded library of select compounds was synthesized, resulting in numerous high-affinity hits against several metalloprotein targets. The findings clearly demonstrate that chelators can be used to generate libraries suitable for fragment-based lead design (FBLD) directed at important metalloproteins.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7764812/

Long Non-Coding RNA LINC00466 Knockdown Inhibits Tongue Squamous Cell Carcinoma Malignancy by Targeting microRNA-493/HMGA2

Purpose Long intergenic non-protein-coding RNA 00466 ( LINC00466 ) promotes lung adenocarcinoma progression. Nonetheless, the expression and precise roles of LINC00466 in tongue squamous cell carcinoma (TSCC) remains uncertain and warrant further investigation. Hence, the present study aimed to examine the LINC00466 effects on the aggressive TSCC cell characteristics and to elucidate the potential underlying mechanisms. Methods First, LINC00466 expression in TSCC was determined by reverse transcription-quantitative PCR. Subsequently, cell proliferation, apoptosis, migration, and invasion in vitro, as well as tumor growth in vivo were assessed to examine the LINC00466 effects on TSCC cells. Results LINC00466 was upregulated in TSCC. This upregulation was notably associated with shorter overall TSCC patient survival. In vitro experiments indicated that LINC00466 depletion suppressed TSCC cell proliferation, migration and invasion, and promoted apoptosis. An in vivo experiment revealed that LINC00466 downregulation attenuated TSCC tumor growth in vivo. Mechanistic analysis revealed that LINC00466 functions as a microRNA-493 (miR-493) molecular sponge, a miRNA that targets high-mobility group AT-hook 2 ( HMGA2 ) mRNA. LINC00466 upregulated HMGA2 in TSCC cells, and this phenomenon was regulated by the miR-493 sponge. Rescue experiments revealed a decrease in the miR-493/HMGA2 axis output, partially reversing the effects of LINC00466 downregulation on aggressive TSCC cell behavior. Conclusion These findings demonstrate that LINC00466 promotes TSCC cell oncogenicity in vitro and in vivo by upregulating the miR-493/HMGA2 axis output. These results may provide a new perspective and new insight into the molecular mechanisms of TSCC. Purpose Long intergenic non-protein-coding RNA 00466 ( LINC00466 ) promotes lung adenocarcinoma progression. Nonetheless, the expression and precise roles of LINC00466 in tongue squamous cell carcinoma (TSCC) remains uncertain and warrant further investigation. Hence, the present study aimed to examine the LINC00466 effects on the aggressive TSCC cell characteristics and to elucidate the potential underlying mechanisms. Methods First, LINC00466 expression in TSCC was determined by reverse transcription-quantitative PCR. Subsequently, cell proliferation, apoptosis, migration, and invasion in vitro, as well as tumor growth in vivo were assessed to examine the LINC00466 effects on TSCC cells. Results LINC00466 was upregulated in TSCC. This upregulation was notably associated with shorter overall TSCC patient survival. In vitro experiments indicated that LINC00466 depletion suppressed TSCC cell proliferation, migration and invasion, and promoted apoptosis. An in vivo experiment revealed that LINC00466 downregulation attenuated TSCC tumor growth in vivo. Mechanistic analysis revealed that LINC00466 functions as a microRNA-493 (miR-493) molecular sponge, a miRNA that targets high-mobility group AT-hook 2 ( HMGA2 ) mRNA. LINC00466 upregulated HMGA2 in TSCC cells, and this phenomenon was regulated by the miR-493 sponge. Rescue experiments revealed a decrease in the miR-493/HMGA2 axis output, partially reversing the effects of LINC00466 downregulation on aggressive TSCC cell behavior. Conclusion These findings demonstrate that LINC00466 promotes TSCC cell oncogenicity in vitro and in vivo by upregulating the miR-493/HMGA2 axis output. These results may provide a new perspective and new insight into the molecular mechanisms of TSCC. Introduction Tongue cancer is a prevalent type of head and neck carcinoma endangering public health worldwide. 1 Tongue squamous cell carcinoma (TSCC) is the most common type of tongue cancer and exhibits characteristics, such as a high malignancy, unlimited growth, and active tissue infiltration that results in the malfunction of mastication, speech, and deglutition. 2 Surgery plus radiotherapy, and neoadjuvant chemotherapy are the primary therapeutic methods for TSCC. 3 Local relapse rates range from 18 to 76% among TSCC patients following first-line anticancer therapies, and local lymph node metastasis poses an enormous challenge for physicians treating TSCC patients. 4 Despite recent advances in diagnostic and treatment methods, the clinical outcomes for TSCC patients have not improved significantly, and the 5-year overall survival rate is only 50%–60%. 5 Even though TSCC pathogenesis has been investigated extensively over the past few decades, the detailed mechanisms and molecular events involved remain uncharacterized. 6 , 7 Thus, it is critical to elucidate the mechanisms behind TSCC formation and progression. These findings may be useful for identifying potential targets for anticancer treatments. Long non-coding RNAs (lncRNAs) are a heterogeneous family of non-protein-coding RNAs, typically over 200 nucleotides in length. 8 Originally, lncRNAs were regarded as genomic 'junk' or 'noise' as they lack a protein-coding sequence. 9 However, accumulating evidence suggests that lncRNAs are capable of interacting with RNA, proteins, and DNA. This interaction consequently regulates gene expression through different mechanisms. 10–12 lncRNAs are involved in almost all physiological and pathological phenomena, including carcinogenesis and cancer progression. 13 Lately, increasing numbers of studies have demonstrated the aberrant expression of lncRNAs in TSCC. 14–17 lncRNAs possess both tumor-suppressive or cancer-promoting activities during TSCC initiation and progression. These processes include regulating the cell cycle, cell proliferation, apoptosis, metastasis, angiogenesis, and epithelial-mesenchymal transition. 18–20 Accordingly, identifying lncRNAs contributing to TSCC pathogenesis is of utmost importance to discover novel diagnostic targets and treatments for this malignant tumor type. A lncRNA, named long intergenic non-protein-coding RNA 00466 ( LINC00466 ), was previously reported to facilitate tumor progression in lung adenocarcinoma. 21 Nevertheless, the LINC00466 expression and precise roles in TSCC remain poorly studied. Therefore, the present study aimed to quantify LINC00466 expression in TSCC and to elucidate LINC00466 's clinical relevance in TSCC. Moreover, the LINC00466 effects on aggressive TSCC behavior were investigated and the possible LINC00466 mechanisms of action for TSCC progression were elucidated. We demonstrate for the first time that the LINC00466 /miR-493/high-mobility group AT-hook 2 ( HMGA2 ) pathway promotes TSCC progression. The pathway provides a promising set of targets for diagnosing, preventing, and/or treating TSCC. Patients and Methods Patients and Tissue Samples The study was approved by the Zaozhuang Municipal Hospital Ethics Committee (ECZZMH-2014.0615) and was conducted following the World Medical Association Declaration of Helsinki. In addition, written informed consent was obtained from all study subjects. TSCC tissue samples and adjacent normal tissues were obtained from 53 patients with TSCC who had been admitted to Zaozhuang Municipal Hospital. None of these patients were treated with preoperative chemotherapy, radiotherapy, or other anti-tumor modalities. The clinicopathological characteristics of these patients were shown in Table 1 . Follow-up was conducted for 5 years or until the patient's death. Follow-up was executed by outpatient visits or by telephone. All the tissue samples collected were snap-frozen in liquid nitrogen and stored at −80°C. Table 1 The Clinicopathological Information of TSCC Patients No. Age Sex Smoking Drinking Clinical Stage Treatment 1 36 Male Yes No IV Surgery + radiochemotherapy 2 57 Male No No I Surgery 3 45 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 4 49 Male Yes Yes III Surgery + radiotherapy 5 62 Female No No I Surgery 6 68 Female No Yes IV Surgery + radiochemotherapy 7 40 Male Yes No III Surgery 8 52 Male Yes No I Surgery 9 44 Female No Yes I Surgery 10 59 Female Yes Yes III Surgery + chemotherapy 11 75 Male Yes No I Surgery 12 35 Male Yes Yes III Surgery + radiochemotherapy 13 62 Female No No I Surgery 14 77 Male Yes Yes IV Surgery + radiochemotherapy 15 71 Female Yes No I Surgery 16 49 Female No Yes II Surgery 17 46 Female No No III Surgery + radiotherapy 18 52 Male Yes No I Surgery 19 42 Female No No IV Surgery + radiochemotherapy 20 45 Female Yes No I Surgery 21 56 Male Yes No II Surgery 22 39 Female No Yes III Surgery + radiochemotherapy 23 72 Male No No III Surgery + radiotherapy 24 71 Female Yes No I Surgery 25 44 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 26 49 Male No No I Surgery 27 45 Male No No I Surgery 28 52 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 29 41 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 30 47 Female Yes Yes IV Surgery + radiochemotherapy 31 72 Female No No I Surgery 32 45 Female No No I Surgery 33 44 Female Yes No I Surgery 34 52 Female No Yes I Surgery 35 57 Male No No I Surgery 36 53 Female Yes Yes IV Surgery + chemotherapy 37 40 Male Yes No I Surgery 38 74 Female Yes No I Surgery 39 66 Male No Yes III Surgery + chemotherapy 40 68 Male No No I Surgery 41 42 Female Yes Yes I Surgery 42 53 Male Yes No IV Surgery + radiochemotherapy 43 46 Male Yes Yes I Surgery 44 48 Male Yes No III Surgery + radiotherapy 45 65 Male No No I Surgery 46 40 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 47 62 Female No Yes III Surgery + radiochemotherapy 48 68 Female Yes Yes I Surgery 49 55 Female Yes No IV Surgery + chemotherapy 50 36 Male Yes Yes I Surgery 51 47 Female No No II Surgery 52 55 Male No Yes I Surgery 53 58 Female Yes No III Surgery + radiotherapy Cell Lines and Cell Culture Human TSCC cell lines (SCC-15 and CAL-27) were acquired from the American Type Culture Collection (ATCC) and were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific) and 1% penicillin/streptomycin mixture (Gibco; Thermo Fisher Scientific). The Minimum Essential Medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin mixture was used for cultivating normal gingival epithelial cells (ATCC ® PCS-200-014™; ATCC). Cells were cultured at a constant temperature (37°C) supplied with 5% CO 2 . Transient Transfection Specific small interfering RNAs (siRNA) targeting LINC00466 (si-LINC00466#1 and si-LINC00466#2) and negative control (NC) siRNA (si-NC) were purchased from RiboBio Co. A miR-493 agomir (agomir-493) and miR-493 antagomir (antagomir-493) were synthesized by GenePharma Co., Ltd. and applied to increase or silence endogenous miR-493 expression, respectively. An NC agomir (agomir-NC) and NC antagomir (antagomir-NC) served as the controls for agomir-493 and antagomir-493, respectively. To restore HMGA2 expression, the full-length HMGA2 gene was amplified and inserted into the pcDNA3.1 vector (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), yielding the pcDNA3.1-HMGA2 plasmid (hereafter referred to as pc-HMGA2). Cells were transfected with plasmids or oligonucleotides using Lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Cellular Fractionation and Quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR) Cellular fractionation was conducted using the Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification kit (Norgen Biotek Corp.). Following separation of the nuclear and cytosolic fractions, RT-qPCR was carried out to assess LINC00466 expression inside TSCC cells. RNA extraction was performed using TRIzol (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). To analyze HMGA2 mRNA and LINC00466 expression, complementary DNA was synthesized from each RNA sample using M-MLV reverse transcriptase (Promega Corporation). Following this, qPCR was performed using FastStart Universal SYBR-Green Master Mix (Roche Diagnostics). The relative HMGA2 mRNA and LINC00466 expression levels were normalized to GAPDH expression. To measure miR-493 expression, each RNA sample was reverse transcribed into complementary DNA using the miScript Reverse Transcription kit (Qiagen GmbH). The synthesized cDNA was then analyzed by qPCR via the miScript SYBR-Green PCR kit (Qiagen GmbH). The U6 small nuclear RNA served as an internal control for miR-493. The 2 −ΔΔCq method 22 was employed to calculate relative gene expression. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay Transfected cells were seeded in 96-well plates, with each well containing 2 × 10 3 cells in 200 μL of complete culture medium. Cellular proliferation was measured every 24 h: designated as day 0, 1, 2, and 3. A total of 10 µL of the CCK-8 solution (Dojindo Laboratories Co., Ltd.) was added to each well at each time point. Following a 2 h incubation at 37°C and 5% CO 2 , the absorbance at 450 nm was measured using a Sunrise Microplate Reader (Tecan Group, Ltd.). Flow Cytometry Apoptosis was evaluated using the Annexin V-Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Apoptosis Detection kit (BioLegend). Transfected cells were harvested at 48 h post-transfection, and washed three times with ice-cold phosphate-buffered saline. The cells were then resuspended in 100 μL of flow cytometry binding buffer, and stained with 5 μL of Annexin V-FITC and 5 μL of propidium iodide solution. Following a 15 min incubation at room temperature in the dark, the proportion of apoptotic cells was assessed on a flow cytometer (FACScan™, BD Biosciences). Transwell Migration and Invasion Assays Transwell inserts with 8 µm pore size polycarbonate membranes (EMD Millipore) were used to determine the migratory and invasive abilities of TSCC cells. Migration assays were carried out using membranes not coated with Matrigel (BD Biosciences), whereas Matrigel-coated membranes (BD Biosciences) were used in the invasion assays. A cell suspension (200 µL) containing 5 × 10 4 transfected cells was added to the upper inserts. The bottom inserts contained 600 μL culture medium containing 10% of FBS. The non-migratory or non-invasive cells still inside the upper chamber were gently scraped off with a cotton swab following 24 h of incubation at 37°C. The migratory or invasive cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.5% crystal violet solution (Beyotime Institute of Biotechnology, Inc.). Following extensive washing and air drying, the membranes were photographed under an inverted microscope (Olympus Corporation). Finally, the numbers of migratory and invasive cells were determined in 5 randomly selected visual fields per membrane. In vivo Tumorigenesis Assay To create stable LINC00466 -deficient SCC-15 cells, a short hairpin RNA (shRNA) targeting LINC00466 (sh- LINC00466 ) and NC shRNA (sh- NC ) were obtained from GenePharma Co., Ltd., and cloned into the pLKO.1 vector (Biosettia). This resulted in the creation of plasmids, pLKO.1-sh- LINC00466 , and pLKO.1-sh- NC . HEK293T cells were transduced with either pLKO.1-sh- LINC00466 or pLKO.1-sh- NC in the presence of psPAX2 and pMD2.G. Lentiviruses expressing either sh- LINC00466 or sh-NC were collected 2 days after transduction and subsequently introduced to SCC-15 cells. Puromycin (5 μg/mL; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) was used to select stable LINC00466 -deficient cells. All animal experiments were approved by the Committee on Ethics of Animal Experiments at Zaozhuang Municipal Hospital (ECAZZMH-2018.0902) and performed in strict accordance with NIH guidelines for the care and use of laboratory animals. For this study, 4- to 6-week-old male BALB/c nude mice (weight, 20 g) were acquired from Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. SCC-15 cells stably expressing either sh- LINC00466 or sh- NC were injected subcutaneously into the dorsal flanks of the mice. Tumor size was measured using calipers every 3 days. Tumor xenografts volumes were calculated using the following formula: Volume = 0.5 × length × width 2 . All the mice were euthanized employing cervical dislocation 30 days after cell injection. No injectable anesthetics were used in the present study. Tumor xenografts were collected, photographed, and weighed. Tumors were then imaged and stored for RT-qPCR and Western blot analysis. Bioinformatics Analysis microRNAs (miRNAs or miRs) binding to the lncRNA was predicted from the starBase 3.0 database ( http://starbase.sysu.edu.cn/ ). Luciferase Reporter Assay LINC00466 fragments containing either the wild-type (wt) miR-493-binding site or a mutant (mut) binding site were amplified by GenePharma Co., Ltd., and cloned into the psiCHECK2 luciferase reporter vector (Promega Corporation). This process yielded plasmids LINC00466-wt and LINC00466-mut. The wt or mut luciferase reporter plasmid was co-transfected with either agomir-493 or agomir-NC into TSCC cells using Lipofectamine 2000. Firefly and Renilla luciferase activities were determined by the Dual-Luciferase Reporter assay (Promega Corporation) following 48 h of cell culture at 37°C. Renilla luciferase activity was normalized to Firefly luciferase activity. RNA Immunoprecipitation (RIP) Assay The RIP assay was performed using the Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoprecipitation kit (EMD Millipore). TSCC cells were lysed in RIP lysis buffer at 4°C, centrifuged to obtain a debris-free cell lysate, and subjected to overnight incubation at 4°C with magnetic beads conjugated with an anti-Argonaute 2 (AGO2) or control IgG antibody (both from EMD Millipore). Magnetic beads were collected and incubated with proteinase K at 55°C for 30 min to digest proteins. Finally, the immunoprecipitated RNA was extracted and analyzed by RT-qPCR. Western Blot Analysis Cells were lysed with ice-cold RIPA lysis buffer (Beyotime Institute of Biotechnology, Inc.). The extracted total protein was quantified using a Bicinchoninic Acid Assay kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Inc.). Equal amounts of protein were separated on a 10%SDS-PAGE gel and transferred onto polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes. Membranes were blocked with 5% fat-free milk at room temperature for 2 h. Following overnight incubation at 4°C with primary antibodies, the membranes were rinsed with Tris-buffered saline containing 0.1% of Tween-20 and incubated with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (cat. no. ab205718; Abcam) for 2 h at room temperature. Following an additional wash with Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20, chemiluminescence quantification and signal development were performed using the Enhanced Chemiluminescence Reagent (Bio-Rad Laboratories, Inc.). The primary antibodies anti-HMGA2 antibody (cat. no. ab207301; Abcam) and anti-GAPDH antibody (cat. no. ab181602; Abcam) were used at a 1:1000 dilution. Statistical Analysis All data are presented as the mean ± SD. Comparisons between 2 groups were conducted using a paired and unpaired Student's t -test. One-way analysis of variance with Tukey's post hoc test was used out to assess the differences among multiple groups. The overall patient survival with TSCC was analyzed via the Kaplan–Meier method, and the Log rank test was performed for univariate analysis. Correlations between the LINC00466 , miR-493, and HMGA2 expression levels in the 53 TSCC tissue samples were calculated using Spearman's rank-order correlation. Statistical significance was assumed when a P -value was < 0.05. Patients and Tissue Samples The study was approved by the Zaozhuang Municipal Hospital Ethics Committee (ECZZMH-2014.0615) and was conducted following the World Medical Association Declaration of Helsinki. In addition, written informed consent was obtained from all study subjects. TSCC tissue samples and adjacent normal tissues were obtained from 53 patients with TSCC who had been admitted to Zaozhuang Municipal Hospital. None of these patients were treated with preoperative chemotherapy, radiotherapy, or other anti-tumor modalities. The clinicopathological characteristics of these patients were shown in Table 1 . Follow-up was conducted for 5 years or until the patient's death. Follow-up was executed by outpatient visits or by telephone. All the tissue samples collected were snap-frozen in liquid nitrogen and stored at −80°C. Table 1 The Clinicopathological Information of TSCC Patients No. Age Sex Smoking Drinking Clinical Stage Treatment 1 36 Male Yes No IV Surgery + radiochemotherapy 2 57 Male No No I Surgery 3 45 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 4 49 Male Yes Yes III Surgery + radiotherapy 5 62 Female No No I Surgery 6 68 Female No Yes IV Surgery + radiochemotherapy 7 40 Male Yes No III Surgery 8 52 Male Yes No I Surgery 9 44 Female No Yes I Surgery 10 59 Female Yes Yes III Surgery + chemotherapy 11 75 Male Yes No I Surgery 12 35 Male Yes Yes III Surgery + radiochemotherapy 13 62 Female No No I Surgery 14 77 Male Yes Yes IV Surgery + radiochemotherapy 15 71 Female Yes No I Surgery 16 49 Female No Yes II Surgery 17 46 Female No No III Surgery + radiotherapy 18 52 Male Yes No I Surgery 19 42 Female No No IV Surgery + radiochemotherapy 20 45 Female Yes No I Surgery 21 56 Male Yes No II Surgery 22 39 Female No Yes III Surgery + radiochemotherapy 23 72 Male No No III Surgery + radiotherapy 24 71 Female Yes No I Surgery 25 44 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 26 49 Male No No I Surgery 27 45 Male No No I Surgery 28 52 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 29 41 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 30 47 Female Yes Yes IV Surgery + radiochemotherapy 31 72 Female No No I Surgery 32 45 Female No No I Surgery 33 44 Female Yes No I Surgery 34 52 Female No Yes I Surgery 35 57 Male No No I Surgery 36 53 Female Yes Yes IV Surgery + chemotherapy 37 40 Male Yes No I Surgery 38 74 Female Yes No I Surgery 39 66 Male No Yes III Surgery + chemotherapy 40 68 Male No No I Surgery 41 42 Female Yes Yes I Surgery 42 53 Male Yes No IV Surgery + radiochemotherapy 43 46 Male Yes Yes I Surgery 44 48 Male Yes No III Surgery + radiotherapy 45 65 Male No No I Surgery 46 40 Female No No III Surgery + radiochemotherapy 47 62 Female No Yes III Surgery + radiochemotherapy 48 68 Female Yes Yes I Surgery 49 55 Female Yes No IV Surgery + chemotherapy 50 36 Male Yes Yes I Surgery 51 47 Female No No II Surgery 52 55 Male No Yes I Surgery 53 58 Female Yes No III Surgery + radiotherapy Cell Lines and Cell Culture Human TSCC cell lines (SCC-15 and CAL-27) were acquired from the American Type Culture Collection (ATCC) and were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific) and 1% penicillin/streptomycin mixture (Gibco; Thermo Fisher Scientific). The Minimum Essential Medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin mixture was used for cultivating normal gingival epithelial cells (ATCC ® PCS-200-014™; ATCC). Cells were cultured at a constant temperature (37°C) supplied with 5% CO 2 . Transient Transfection Specific small interfering RNAs (siRNA) targeting LINC00466 (si-LINC00466#1 and si-LINC00466#2) and negative control (NC) siRNA (si-NC) were purchased from RiboBio Co. A miR-493 agomir (agomir-493) and miR-493 antagomir (antagomir-493) were synthesized by GenePharma Co., Ltd. and applied to increase or silence endogenous miR-493 expression, respectively. An NC agomir (agomir-NC) and NC antagomir (antagomir-NC) served as the controls for agomir-493 and antagomir-493, respectively. To restore HMGA2 expression, the full-length HMGA2 gene was amplified and inserted into the pcDNA3.1 vector (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), yielding the pcDNA3.1-HMGA2 plasmid (hereafter referred to as pc-HMGA2). Cells were transfected with plasmids or oligonucleotides using Lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Cellular Fractionation and Quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR) Cellular fractionation was conducted using the Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification kit (Norgen Biotek Corp.). Following separation of the nuclear and cytosolic fractions, RT-qPCR was carried out to assess LINC00466 expression inside TSCC cells. RNA extraction was performed using TRIzol (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). To analyze HMGA2 mRNA and LINC00466 expression, complementary DNA was synthesized from each RNA sample using M-MLV reverse transcriptase (Promega Corporation). Following this, qPCR was performed using FastStart Universal SYBR-Green Master Mix (Roche Diagnostics). The relative HMGA2 mRNA and LINC00466 expression levels were normalized to GAPDH expression. To measure miR-493 expression, each RNA sample was reverse transcribed into complementary DNA using the miScript Reverse Transcription kit (Qiagen GmbH). The synthesized cDNA was then analyzed by qPCR via the miScript SYBR-Green PCR kit (Qiagen GmbH). The U6 small nuclear RNA served as an internal control for miR-493. The 2 −ΔΔCq method 22 was employed to calculate relative gene expression. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay Transfected cells were seeded in 96-well plates, with each well containing 2 × 10 3 cells in 200 μL of complete culture medium. Cellular proliferation was measured every 24 h: designated as day 0, 1, 2, and 3. A total of 10 µL of the CCK-8 solution (Dojindo Laboratories Co., Ltd.) was added to each well at each time point. Following a 2 h incubation at 37°C and 5% CO 2 , the absorbance at 450 nm was measured using a Sunrise Microplate Reader (Tecan Group, Ltd.). Flow Cytometry Apoptosis was evaluated using the Annexin V-Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Apoptosis Detection kit (BioLegend). Transfected cells were harvested at 48 h post-transfection, and washed three times with ice-cold phosphate-buffered saline. The cells were then resuspended in 100 μL of flow cytometry binding buffer, and stained with 5 μL of Annexin V-FITC and 5 μL of propidium iodide solution. Following a 15 min incubation at room temperature in the dark, the proportion of apoptotic cells was assessed on a flow cytometer (FACScan™, BD Biosciences). Transwell Migration and Invasion Assays Transwell inserts with 8 µm pore size polycarbonate membranes (EMD Millipore) were used to determine the migratory and invasive abilities of TSCC cells. Migration assays were carried out using membranes not coated with Matrigel (BD Biosciences), whereas Matrigel-coated membranes (BD Biosciences) were used in the invasion assays. A cell suspension (200 µL) containing 5 × 10 4 transfected cells was added to the upper inserts. The bottom inserts contained 600 μL culture medium containing 10% of FBS. The non-migratory or non-invasive cells still inside the upper chamber were gently scraped off with a cotton swab following 24 h of incubation at 37°C. The migratory or invasive cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.5% crystal violet solution (Beyotime Institute of Biotechnology, Inc.). Following extensive washing and air drying, the membranes were photographed under an inverted microscope (Olympus Corporation). Finally, the numbers of migratory and invasive cells were determined in 5 randomly selected visual fields per membrane. In vivo Tumorigenesis Assay To create stable LINC00466 -deficient SCC-15 cells, a short hairpin RNA (shRNA) targeting LINC00466 (sh- LINC00466 ) and NC shRNA (sh- NC ) were obtained from GenePharma Co., Ltd., and cloned into the pLKO.1 vector (Biosettia). This resulted in the creation of plasmids, pLKO.1-sh- LINC00466 , and pLKO.1-sh- NC . HEK293T cells were transduced with either pLKO.1-sh- LINC00466 or pLKO.1-sh- NC in the presence of psPAX2 and pMD2.G. Lentiviruses expressing either sh- LINC00466 or sh-NC were collected 2 days after transduction and subsequently introduced to SCC-15 cells. Puromycin (5 μg/mL; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) was used to select stable LINC00466 -deficient cells. All animal experiments were approved by the Committee on Ethics of Animal Experiments at Zaozhuang Municipal Hospital (ECAZZMH-2018.0902) and performed in strict accordance with NIH guidelines for the care and use of laboratory animals. For this study, 4- to 6-week-old male BALB/c nude mice (weight, 20 g) were acquired from Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. SCC-15 cells stably expressing either sh- LINC00466 or sh- NC were injected subcutaneously into the dorsal flanks of the mice. Tumor size was measured using calipers every 3 days. Tumor xenografts volumes were calculated using the following formula: Volume = 0.5 × length × width 2 . All the mice were euthanized employing cervical dislocation 30 days after cell injection. No injectable anesthetics were used in the present study. Tumor xenografts were collected, photographed, and weighed. Tumors were then imaged and stored for RT-qPCR and Western blot analysis. Bioinformatics Analysis microRNAs (miRNAs or miRs) binding to the lncRNA was predicted from the starBase 3.0 database ( http://starbase.sysu.edu.cn/ ). Luciferase Reporter Assay LINC00466 fragments containing either the wild-type (wt) miR-493-binding site or a mutant (mut) binding site were amplified by GenePharma Co., Ltd., and cloned into the psiCHECK2 luciferase reporter vector (Promega Corporation). This process yielded plasmids LINC00466-wt and LINC00466-mut. The wt or mut luciferase reporter plasmid was co-transfected with either agomir-493 or agomir-NC into TSCC cells using Lipofectamine 2000. Firefly and Renilla luciferase activities were determined by the Dual-Luciferase Reporter assay (Promega Corporation) following 48 h of cell culture at 37°C. Renilla luciferase activity was normalized to Firefly luciferase activity. RNA Immunoprecipitation (RIP) Assay The RIP assay was performed using the Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoprecipitation kit (EMD Millipore). TSCC cells were lysed in RIP lysis buffer at 4°C, centrifuged to obtain a debris-free cell lysate, and subjected to overnight incubation at 4°C with magnetic beads conjugated with an anti-Argonaute 2 (AGO2) or control IgG antibody (both from EMD Millipore). Magnetic beads were collected and incubated with proteinase K at 55°C for 30 min to digest proteins. Finally, the immunoprecipitated RNA was extracted and analyzed by RT-qPCR. Western Blot Analysis Cells were lysed with ice-cold RIPA lysis buffer (Beyotime Institute of Biotechnology, Inc.). The extracted total protein was quantified using a Bicinchoninic Acid Assay kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Inc.). Equal amounts of protein were separated on a 10%SDS-PAGE gel and transferred onto polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes. Membranes were blocked with 5% fat-free milk at room temperature for 2 h. Following overnight incubation at 4°C with primary antibodies, the membranes were rinsed with Tris-buffered saline containing 0.1% of Tween-20 and incubated with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (cat. no. ab205718; Abcam) for 2 h at room temperature. Following an additional wash with Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20, chemiluminescence quantification and signal development were performed using the Enhanced Chemiluminescence Reagent (Bio-Rad Laboratories, Inc.). The primary antibodies anti-HMGA2 antibody (cat. no. ab207301; Abcam) and anti-GAPDH antibody (cat. no. ab181602; Abcam) were used at a 1:1000 dilution. Statistical Analysis All data are presented as the mean ± SD. Comparisons between 2 groups were conducted using a paired and unpaired Student's t -test. One-way analysis of variance with Tukey's post hoc test was used out to assess the differences among multiple groups. The overall patient survival with TSCC was analyzed via the Kaplan–Meier method, and the Log rank test was performed for univariate analysis. Correlations between the LINC00466 , miR-493, and HMGA2 expression levels in the 53 TSCC tissue samples were calculated using Spearman's rank-order correlation. Statistical significance was assumed when a P -value was < 0.05. Results LINC00466 Upregulation in TSCC Patients is Associated with a Poor Prognosis To determine the function of LINC00466 in TSCC, its expression in Head and Neck squamous cell carcinoma (HNSC) was first analyzed employing The Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset. LINC00466 was upregulated in tumor tissues in comparison with that in normal tissues ( Figure 1A ). In addition, LINC00466 expression in 53 pairs of TSCC tissue samples and adjacent normal tissues were detected by RT-qPCR. Compared with adjacent normal tissues, LINC00466 expression was higher in TSCC tissues ( Figure 1B ). Subsequently, the clinical relevance of LINC00466 in TSCC was determined. A high LINC00466 expression was significantly correlated with tumor size ( Figure 1C ) and lymph node metastasis ( Figure 1D ) but not related with distant metastasis ( Figure 1E ) in patients with TSCC. Study subjects were binned into a high- LINC00466 expression group or a low- LINC00466 expression group, based on the LINC00466 expression median value among all TSCC tissue samples. Patients in the high- LINC00466 expression group exhibited a shorter overall survival than the patients in the low- LINC00466 expression group ( Figure 1F ; P = 0.0305). These results indicated that LINC00466 upregulated in TSCC and may be important for TSCC tumor progression. Figure 1 LINC00466 is upregulated in TSCC and is associated with a poor prognosis. ( A ) Analysis of LINC00466 expression in Head and Neck squamous cell carcinoma (HNSC) was analyzed using The Cancer Genome Atlas (TCGA) database. ( B ) Analysis of LINC00466 expression was conducted in 53 pairs of TSCC tissue samples and adjacent normal tissues using RT-qPCR. ( C – E ) The correlation between LINC00466 expression and Tumor-Node-Metastasis status in patients with TSCC was examined. ( F ) Kaplan–Meier and Log rank tests were used to analyze the overall TSCC patient survival for the high -LINC00466 expression group and low- LINC00466 expression group (P = 0.0305). *P < 0.05 and **P < 0.01. LINC00466 Depletion Weakens the TSCC Malignant Phenotype in vitro LINC00466 expression was quantified by RT-qPCR in TSCC cell lines (SCC-15 and CAL-27) and normal gingival epithelial cells. The results revealed that LINC00466 expression was higher in TSCC cell lines than in normal gingival epithelial cells ( Figure 2A ). SCC-15 and CAL-27 is widely used in functional experiments regarding TSCC and manifested overexpressed LINC00466 expression; thus, the two cell lines were selected for use in subsequent loss-of-function assay. To further analyze the LINC00466 effects on the biological characteristics of TSCC, LINC00466 reducing siRNAs (si-LINC00466#1 and si-LINC00466#2) were separately transfected into SCC-15 and CAL-27 cells to knock down LINC00466 expression. RT-qPCR was used to assess transfection efficiency ( Figure 2B ). Figure 2 LINC00466 knockdown inhibits SCC-15 and CAL-27 cell proliferation, migration, and invasiveness, but promotes apoptosis. ( A ) Compared to normal gingival epithelial cells, LINC00466 was overexpressed in TSCC cell lines (SCC-15 and CAL-27). ( B ) RT-qPCR analysis demonstrated the LINC00466 silencing efficiency in SCC-15 and CAL-27 cells. ( C ) CCK-8 assay determined the LINC00466 silencing effects on SCC-15 and CAL-27 cell proliferation. ( D ) The apoptotic rate was examined in SCC-15 and CAL-27 cells following LINC00466 knockdown. ( E and F ) SCC-15 and CAL-27 cell migratory and invasive abilities were assessed by transwell migration and invasion assays following transfection with either si-LINC00466 or si-NC. *P < 0.05 and **P < 0.01. CCK-8 assay was conducted to assess the effects of LINC00466 on TSCC cell proliferation. Transfection with si-LINC00466 resulted in decreased proliferation for SCC-15 and CAL-27 cells ( Figure 2C ). Flow cytometry showed the proportion of apoptotic SCC-15 and CAL-27 cells was substantially increased when was LINC00466 knocked down ( Figure 2D ). Furthermore, transwell migration and invasion assays suggested that LINC00466 knockdown significantly suppressed SCC-15 and CAL-27 cell migratory ( Figure 2E ) and invasive ( Figure 2F ) abilities. The above-mentioned results indicate that LINC00466 may function as an oncogenic lncRNA, promoting TSCC progression. LINC00466 Functions as a Molecular Sponge of miR-493 in TSCC Cells lncRNAs may serve as competing endogenous RNAs (ceRNAs) by directly interacting with and sequestering miRNAs. 23 To elucidate the mechanisms through which LINC00466 affects TSCC progression, we determined the location of LINC00466 in SCC-15 and CAL-27 cells. LINC00466 was mainly located in the cytoplasm of the SCC-15 and CAL-27 cells ( Figure 3A ). We hypothesized that LINC00466 may function as a ceRNA, sequestering certain miRNAs in TSCC cells. The online database, starBase 3.0, was used to search for predicted LINC00466 target miRNAs. LINC00466 contained a putative miR-493–binding site ( Figure 3B ). Figure 3 LINC00466 functions as a molecular miR-493 sponge in TSCC cells. ( A ) The LINC00466 distribution was examined in SCC-15 and CAL-27 cells by cellular fractionation. ( B ) The predicted miR-493-binding sequences in a LINC00466 region. The mutant binding site is depicted as well. ( C ) Agomir-493 efficiency was estimated by RT-qPCR in SCC-15 and CAL-27 cells. Agomir-NC served as the control. ( D ) Luciferase reporter assay was performed with SCC-15 and CAL-27 cells co-transfected with either LINC00466-wt or LINC00466-mut with either agomir-493 or agomir-NC. ( E ) RIP assay revealed that miR-493 and LINC00466 were enriched on the AGO2-containing beads. ( F ) miR-493 expression in the 53 pairs of TSCC tissue samples with adjacent normal tissues was quantified by RT-qPCR. ( G ) Correlation between miR-493 and LINC00466 levels among the 53 TSCC tissue samples was tested by Spearman correlation (r s =−0.6250, P<0.0001). ( H ) miR-493 expression in SCC-15 and CAL-27 cells transfected with either the siRNAs targeting LINC00466 or with si-NC. **P < 0.01. A luciferase reporter assay was performed to confirm the complementary base pairing between miR-493 and LINC00466 . First, the transfection efficiency of agomir-493 was validated by RT-qPCR ( Figure 3C ). The luciferase reporter assay showed the luciferase activity in the SCC-15 and CAL-27 cells decreased by co-transfection with agomir-493 and LINC00466 -wt. However, miR-493 overexpression did not affect LINC00466 -mut luciferase activity ( Figure 3D ). RIP assay revealed miR-493 and LINC00466 were enriched following immunoprecipitation with anti-AGO2 antibody (compared to IgG) in SCC-15 and CAL-27 cell lysates ( Figure 3E ). This indicated a direct interaction between miR-493 and LINC00466 in TSCC cells. miR-493 expression in the 53 pairs of TSCC tissue samples and adjacent normal tissues was also measured by RT-qPCR. The results indicated that miR-493 expression was lower in TSCC tissues compared to adjacent normal tissues ( Figure 3F ). In addition, miR-493 expression inversely correlated with LINC00466 expression in the 53 TSCC tissue samples ( Figure 3G ; r s = −0.6250, P < 0.0001). Subsequently, RT-qPCR was performed to examine the LINC00466 regulatory effects on miR-493 expression in TSCC cells. miR-493 expression was upregulated in SCC-15 and CAL-27 cells after LINC00466 expression was silenced ( Figure 3H ). Overall, these findings suggested that LINC00466 directly targets miR-493 and functions as a miR-493 molecular sponge in TSCC cells. LINC00466 Positively Regulates HMGA2 Expression in TSCC Cells Given that HMGA2 is a direct target gene of miR-493 in TSCC cells, 24 we sought to determine whether LINC00466 is involved in regulating HMGA2 expression. SCC-15 and CAL-27 cells were transfected with either si-LINC00466 or si-NC. The transfected cells were then subjected to RT-qPCR and Western blot to determine HMGA2 mRNA and protein expression, respectively. Inhibiting LINC00466 expression downregulated HMGA2 expression in SCC-15 and CAL-27 cells at the mRNA ( Figure 4A ) and protein level ( Figure 4B ). Additionally, the HMGA2 mRNA level was quantified in the 53 pairs of TSCC tissue samples. HMGA2 mRNA level was higher in the TSCC tissues when compared to the adjacent normal tissues ( Figure 4C ). TSCC patients with high HMGA2 expression manifested a shorter overall survival in contrast to those with low HMGA2 expression ( Figure 4D ; P = 0.0046). Furthermore, a positive correlation between HMGA2 mRNA and LINC00466 expression levels in the 53 TSCC tissue samples ( Figure 4E ; r s = 0.5342, P < 0.0001). Thus, these results indicate that LINC00466 functions as a ceRNA on miR-493, and increasing HMGA2 expression in TSCC cells. Figure 4 LINC00466 knockdown decreases HMGA2 expression in TSCC cells. ( A and B ) SCC-15 and CAL-27 cells were transfected with either si-LINC00466 or si-NC, followed by measuring HMGA2 mRNA and protein expression. ( C ) HMGA2 mRNA levels in the 53 pairs of TSCC tissue samples with adjacent normal tissues were determined by RT-qPCR. ( D ) Kaplan–Meier and Log rank tests were used to analyze the overall TSCC patient survival in the high-HMGA2 expression group and low-HMGA2 expression group (P = 0.0046). ( E ) Spearman correlation was conducted to verify the positive correlation between HMGA2 mRNA and LINC00466 expression levels in the 53 TSCC tissue samples (r s = 0.5342, P < 0.0001). **P < 0.01. The LINC00466/miR-493/HMGA2 Axis Promotes TSCC Progression To examine whether the miR-493/HMGA2 axis is indispensable for LINC00466 -mediated TSCC progression, a series of rescue assays were performed. Before the assays, the efficiency of antagomir-493 was analyzed by RT-qPCR. The results revealed that transfection with antagomir-493 notably silenced miR-493 expression in both SCC-15 and CAL-27 cells ( Figure 5A ). Subsequently, either antagomir-493 or antagomir-NC was co-transfected with si-LINC00466 in SCC-15 and CAL-27 cells. The increase in miR-493 levels induced in SCC-15 and CAL-27 cells by LINC00466 knockdown was attenuated by co-transfection with antagomir-493, as shown by the RT-qPCR data ( Figure 5B ). In addition, the si-LINC00466 effects on HMGA2 mRNA ( Figure 5C ) and protein ( Figure 5D ) expression were partly reversed by antagomir-493 transfection into SCC-15 and CAL-27 cells. In functional assays, miR-493 silencing reversed the si-LINC00466 effects on proliferation ( Figure 5E ), apoptosis ( Figure 5F ), migration ( Figure 5G ), and invasiveness ( Figure 5H ) in SCC-15 and CAL-27 cells. Figure 5 Antagomir-493 abrogates the LINC00466 knockdown suppressive effects on proliferation, migration, and invasiveness, as well as the stimulatory apoptotic effects in SCC-15 and CAL-27 cells. ( A ) SCC-15 and CAL-27 cells were transfected with either antagomir-493 or antagomir-NC. Following transfection, RT-qPCR was used to evaluate the transfection efficiency. ( B – D ) si-LINC00466 with either antagomir-493 or antagomir-NC were transfected into SCC-15 and CAL-27 cells. miR-493, HMGA2 mRNA, and HMGA2 protein expression were analyzed in the co-transfected cells. ( E and F ) Proliferation and apoptosis of the aforementioned cells were determined by CCK-8 assay and flow-cytometric analysis. ( G and H ) Migration and invasiveness of the transfected cells were assessed by transwell migration and invasion assays. *P < 0.05 and **P < 0.01. An HMGA2 overexpression plasmid (pc-HMGA2) was constructed, and its efficiency was examined by Western blot analysis ( Figure 6A ). The pc-HMGA2 or empty pcDNA3.1 vector was transfected into SCC-15 and CAL-27 cells in the presence of si-LINC00466. HMGA2 expression restoration attenuated the LINC00466 knockdown effects in SCC-15 and CAL-27 cell proliferation ( Figure 6B ), apoptosis ( Figure 6C ), migration ( Figure 6D ), and invasion ( Figure 6E ). Overall, LINC00466 contributed to TSCC progression by upregulating the miR-493/HMGA2 axis. Figure 6 Upregulated HMGA2 attenuates the si-LINC00466 effects on TSCC malignant behavior. ( A ) Western blot analysis examined the transfection efficiency of pc-HMGA2 in SCC-15 and CAL-27 cells, with the empty pcDNA3.1 vector as a control. ( B – E ) SCC-15 and CAL-27 cells were co-transfected with si-LINC00466 with either the pc-HMGA2 plasmid or empty pcDNA3.1 vector. The transfected cells were assessed for cell proliferation, apoptosis, migration, and invasion. *P < 0.05 and **P < 0.01. LINC00466 Depletion Suppresses TSCC Cell Growth in vivo A tumorigenesis experiment was conducted to examine the LINC00466 effects on TSCC tumor growth in vivo. First, LINC00466 expression was determined in SCC-15 cells stably transfected with either sh- LINC00466 or sh-NC. The RT-qPCR results suggested that LINC00466 expression was very low in SCC-15 cells infected with the sh- LINC00466 lentivirus ( Figure 7A ). SCC-15 cells stably expressing either sh- LINC00466 or sh-NC were injected subcutaneously into the dorsal flanks of nude mice. The tumor volume ( Figure 7B and C) and weight ( Figure 7D ) were smaller in the sh- LINC00466 group than in the sh- NC group. The RT-qPCR results showed tumor miR-493 expression was significantly higher in the sh- LINC00466 group compared to the sh- NC group ( Figure 7E ). The HMGA2 mRNA ( Figure 7F ) and protein levels ( Figure 7G ) in tumor xenografts derived from sh- LINC00466 -transfected SCC-15 cells were substantially lower compared to sh- NC tumor xenografts. Overall, these findings suggested that LINC00466 knockdown suppressed TSCC growth in vivo by regulating the miR-493/HMGA2 axis. Figure 7 LINC00466 knockdown suppresses TSCC growth in vivo. ( A ) SCC-15 cells were stably transduced with lentivirus expressing either sh-LINC00466 or sh-NC. RT-qPCR analysis confirmed the successful LINC00466 knockdown in SCC-15 cells. ( B ) SCC-15 cells stably expressing sh-LINC00466 or sh-NC were injected into nude mice. Tumor xenograft volumes were measured every 3 days until 30 days following cell inoculation. ( C ) Tumor xenografts representative images collected from groups 'sh-LINC00466ʹ and 'sh-NC'. ( D ) All the mice were euthanized 30 days after cell injection. The tumor xenografts were resected and weighed. ( E ) miR-493 levels in the tumor xenografts were measured via RT-qPCR. ( F and G ) The mRNA and protein levels of HMGA2 were determined in the tumor xenografts by respectively RT-qPCR and Western blot analysis. **P < 0.01. LINC00466 Upregulation in TSCC Patients is Associated with a Poor Prognosis To determine the function of LINC00466 in TSCC, its expression in Head and Neck squamous cell carcinoma (HNSC) was first analyzed employing The Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset. LINC00466 was upregulated in tumor tissues in comparison with that in normal tissues ( Figure 1A ). In addition, LINC00466 expression in 53 pairs of TSCC tissue samples and adjacent normal tissues were detected by RT-qPCR. Compared with adjacent normal tissues, LINC00466 expression was higher in TSCC tissues ( Figure 1B ). Subsequently, the clinical relevance of LINC00466 in TSCC was determined. A high LINC00466 expression was significantly correlated with tumor size ( Figure 1C ) and lymph node metastasis ( Figure 1D ) but not related with distant metastasis ( Figure 1E ) in patients with TSCC. Study subjects were binned into a high- LINC00466 expression group or a low- LINC00466 expression group, based on the LINC00466 expression median value among all TSCC tissue samples. Patients in the high- LINC00466 expression group exhibited a shorter overall survival than the patients in the low- LINC00466 expression group ( Figure 1F ; P = 0.0305). These results indicated that LINC00466 upregulated in TSCC and may be important for TSCC tumor progression. Figure 1 LINC00466 is upregulated in TSCC and is associated with a poor prognosis. ( A ) Analysis of LINC00466 expression in Head and Neck squamous cell carcinoma (HNSC) was analyzed using The Cancer Genome Atlas (TCGA) database. ( B ) Analysis of LINC00466 expression was conducted in 53 pairs of TSCC tissue samples and adjacent normal tissues using RT-qPCR. ( C – E ) The correlation between LINC00466 expression and Tumor-Node-Metastasis status in patients with TSCC was examined. ( F ) Kaplan–Meier and Log rank tests were used to analyze the overall TSCC patient survival for the high -LINC00466 expression group and low- LINC00466 expression group (P = 0.0305). *P < 0.05 and **P < 0.01. LINC00466 Depletion Weakens the TSCC Malignant Phenotype in vitro LINC00466 expression was quantified by RT-qPCR in TSCC cell lines (SCC-15 and CAL-27) and normal gingival epithelial cells. The results revealed that LINC00466 expression was higher in TSCC cell lines than in normal gingival epithelial cells ( Figure 2A ). SCC-15 and CAL-27 is widely used in functional experiments regarding TSCC and manifested overexpressed LINC00466 expression; thus, the two cell lines were selected for use in subsequent loss-of-function assay. To further analyze the LINC00466 effects on the biological characteristics of TSCC, LINC00466 reducing siRNAs (si-LINC00466#1 and si-LINC00466#2) were separately transfected into SCC-15 and CAL-27 cells to knock down LINC00466 expression. RT-qPCR was used to assess transfection efficiency ( Figure 2B ). Figure 2 LINC00466 knockdown inhibits SCC-15 and CAL-27 cell proliferation, migration, and invasiveness, but promotes apoptosis. ( A ) Compared to normal gingival epithelial cells, LINC00466 was overexpressed in TSCC cell lines (SCC-15 and CAL-27). ( B ) RT-qPCR analysis demonstrated the LINC00466 silencing efficiency in SCC-15 and CAL-27 cells. ( C ) CCK-8 assay determined the LINC00466 silencing effects on SCC-15 and CAL-27 cell proliferation. ( D ) The apoptotic rate was examined in SCC-15 and CAL-27 cells following LINC00466 knockdown. ( E and F ) SCC-15 and CAL-27 cell migratory and invasive abilities were assessed by transwell migration and invasion assays following transfection with either si-LINC00466 or si-NC. *P < 0.05 and **P < 0.01. CCK-8 assay was conducted to assess the effects of LINC00466 on TSCC cell proliferation. Transfection with si-LINC00466 resulted in decreased proliferation for SCC-15 and CAL-27 cells ( Figure 2C ). Flow cytometry showed the proportion of apoptotic SCC-15 and CAL-27 cells was substantially increased when was LINC00466 knocked down ( Figure 2D ). Furthermore, transwell migration and invasion assays suggested that LINC00466 knockdown significantly suppressed SCC-15 and CAL-27 cell migratory ( Figure 2E ) and invasive ( Figure 2F ) abilities. The above-mentioned results indicate that LINC00466 may function as an oncogenic lncRNA, promoting TSCC progression. LINC00466 Functions as a Molecular Sponge of miR-493 in TSCC Cells lncRNAs may serve as competing endogenous RNAs (ceRNAs) by directly interacting with and sequestering miRNAs. 23 To elucidate the mechanisms through which LINC00466 affects TSCC progression, we determined the location of LINC00466 in SCC-15 and CAL-27 cells. LINC00466 was mainly located in the cytoplasm of the SCC-15 and CAL-27 cells ( Figure 3A ). We hypothesized that LINC00466 may function as a ceRNA, sequestering certain miRNAs in TSCC cells. The online database, starBase 3.0, was used to search for predicted LINC00466 target miRNAs. LINC00466 contained a putative miR-493–binding site ( Figure 3B ). Figure 3 LINC00466 functions as a molecular miR-493 sponge in TSCC cells. ( A ) The LINC00466 distribution was examined in SCC-15 and CAL-27 cells by cellular fractionation. ( B ) The predicted miR-493-binding sequences in a LINC00466 region. The mutant binding site is depicted as well. ( C ) Agomir-493 efficiency was estimated by RT-qPCR in SCC-15 and CAL-27 cells. Agomir-NC served as the control. ( D ) Luciferase reporter assay was performed with SCC-15 and CAL-27 cells co-transfected with either LINC00466-wt or LINC00466-mut with either agomir-493 or agomir-NC. ( E ) RIP assay revealed that miR-493 and LINC00466 were enriched on the AGO2-containing beads. ( F ) miR-493 expression in the 53 pairs of TSCC tissue samples with adjacent normal tissues was quantified by RT-qPCR. ( G ) Correlation between miR-493 and LINC00466 levels among the 53 TSCC tissue samples was tested by Spearman correlation (r s =−0.6250, P<0.0001). ( H ) miR-493 expression in SCC-15 and CAL-27 cells transfected with either the siRNAs targeting LINC00466 or with si-NC. **P < 0.01. A luciferase reporter assay was performed to confirm the complementary base pairing between miR-493 and LINC00466 . First, the transfection efficiency of agomir-493 was validated by RT-qPCR ( Figure 3C ). The luciferase reporter assay showed the luciferase activity in the SCC-15 and CAL-27 cells decreased by co-transfection with agomir-493 and LINC00466 -wt. However, miR-493 overexpression did not affect LINC00466 -mut luciferase activity ( Figure 3D ). RIP assay revealed miR-493 and LINC00466 were enriched following immunoprecipitation with anti-AGO2 antibody (compared to IgG) in SCC-15 and CAL-27 cell lysates ( Figure 3E ). This indicated a direct interaction between miR-493 and LINC00466 in TSCC cells. miR-493 expression in the 53 pairs of TSCC tissue samples and adjacent normal tissues was also measured by RT-qPCR. The results indicated that miR-493 expression was lower in TSCC tissues compared to adjacent normal tissues ( Figure 3F ). In addition, miR-493 expression inversely correlated with LINC00466 expression in the 53 TSCC tissue samples ( Figure 3G ; r s = −0.6250, P < 0.0001). Subsequently, RT-qPCR was performed to examine the LINC00466 regulatory effects on miR-493 expression in TSCC cells. miR-493 expression was upregulated in SCC-15 and CAL-27 cells after LINC00466 expression was silenced ( Figure 3H ). Overall, these findings suggested that LINC00466 directly targets miR-493 and functions as a miR-493 molecular sponge in TSCC cells. LINC00466 Positively Regulates HMGA2 Expression in TSCC Cells Given that HMGA2 is a direct target gene of miR-493 in TSCC cells, 24 we sought to determine whether LINC00466 is involved in regulating HMGA2 expression. SCC-15 and CAL-27 cells were transfected with either si-LINC00466 or si-NC. The transfected cells were then subjected to RT-qPCR and Western blot to determine HMGA2 mRNA and protein expression, respectively. Inhibiting LINC00466 expression downregulated HMGA2 expression in SCC-15 and CAL-27 cells at the mRNA ( Figure 4A ) and protein level ( Figure 4B ). Additionally, the HMGA2 mRNA level was quantified in the 53 pairs of TSCC tissue samples. HMGA2 mRNA level was higher in the TSCC tissues when compared to the adjacent normal tissues ( Figure 4C ). TSCC patients with high HMGA2 expression manifested a shorter overall survival in contrast to those with low HMGA2 expression ( Figure 4D ; P = 0.0046). Furthermore, a positive correlation between HMGA2 mRNA and LINC00466 expression levels in the 53 TSCC tissue samples ( Figure 4E ; r s = 0.5342, P < 0.0001). Thus, these results indicate that LINC00466 functions as a ceRNA on miR-493, and increasing HMGA2 expression in TSCC cells. Figure 4 LINC00466 knockdown decreases HMGA2 expression in TSCC cells. ( A and B ) SCC-15 and CAL-27 cells were transfected with either si-LINC00466 or si-NC, followed by measuring HMGA2 mRNA and protein expression. ( C ) HMGA2 mRNA levels in the 53 pairs of TSCC tissue samples with adjacent normal tissues were determined by RT-qPCR. ( D ) Kaplan–Meier and Log rank tests were used to analyze the overall TSCC patient survival in the high-HMGA2 expression group and low-HMGA2 expression group (P = 0.0046). ( E ) Spearman correlation was conducted to verify the positive correlation between HMGA2 mRNA and LINC00466 expression levels in the 53 TSCC tissue samples (r s = 0.5342, P < 0.0001). **P < 0.01. The LINC00466/miR-493/HMGA2 Axis Promotes TSCC Progression To examine whether the miR-493/HMGA2 axis is indispensable for LINC00466 -mediated TSCC progression, a series of rescue assays were performed. Before the assays, the efficiency of antagomir-493 was analyzed by RT-qPCR. The results revealed that transfection with antagomir-493 notably silenced miR-493 expression in both SCC-15 and CAL-27 cells ( Figure 5A ). Subsequently, either antagomir-493 or antagomir-NC was co-transfected with si-LINC00466 in SCC-15 and CAL-27 cells. The increase in miR-493 levels induced in SCC-15 and CAL-27 cells by LINC00466 knockdown was attenuated by co-transfection with antagomir-493, as shown by the RT-qPCR data ( Figure 5B ). In addition, the si-LINC00466 effects on HMGA2 mRNA ( Figure 5C ) and protein ( Figure 5D ) expression were partly reversed by antagomir-493 transfection into SCC-15 and CAL-27 cells. In functional assays, miR-493 silencing reversed the si-LINC00466 effects on proliferation ( Figure 5E ), apoptosis ( Figure 5F ), migration ( Figure 5G ), and invasiveness ( Figure 5H ) in SCC-15 and CAL-27 cells. Figure 5 Antagomir-493 abrogates the LINC00466 knockdown suppressive effects on proliferation, migration, and invasiveness, as well as the stimulatory apoptotic effects in SCC-15 and CAL-27 cells. ( A ) SCC-15 and CAL-27 cells were transfected with either antagomir-493 or antagomir-NC. Following transfection, RT-qPCR was used to evaluate the transfection efficiency. ( B – D ) si-LINC00466 with either antagomir-493 or antagomir-NC were transfected into SCC-15 and CAL-27 cells. miR-493, HMGA2 mRNA, and HMGA2 protein expression were analyzed in the co-transfected cells. ( E and F ) Proliferation and apoptosis of the aforementioned cells were determined by CCK-8 assay and flow-cytometric analysis. ( G and H ) Migration and invasiveness of the transfected cells were assessed by transwell migration and invasion assays. *P < 0.05 and **P < 0.01. An HMGA2 overexpression plasmid (pc-HMGA2) was constructed, and its efficiency was examined by Western blot analysis ( Figure 6A ). The pc-HMGA2 or empty pcDNA3.1 vector was transfected into SCC-15 and CAL-27 cells in the presence of si-LINC00466. HMGA2 expression restoration attenuated the LINC00466 knockdown effects in SCC-15 and CAL-27 cell proliferation ( Figure 6B ), apoptosis ( Figure 6C ), migration ( Figure 6D ), and invasion ( Figure 6E ). Overall, LINC00466 contributed to TSCC progression by upregulating the miR-493/HMGA2 axis. Figure 6 Upregulated HMGA2 attenuates the si-LINC00466 effects on TSCC malignant behavior. ( A ) Western blot analysis examined the transfection efficiency of pc-HMGA2 in SCC-15 and CAL-27 cells, with the empty pcDNA3.1 vector as a control. ( B – E ) SCC-15 and CAL-27 cells were co-transfected with si-LINC00466 with either the pc-HMGA2 plasmid or empty pcDNA3.1 vector. The transfected cells were assessed for cell proliferation, apoptosis, migration, and invasion. *P < 0.05 and **P < 0.01. LINC00466 Depletion Suppresses TSCC Cell Growth in vivo A tumorigenesis experiment was conducted to examine the LINC00466 effects on TSCC tumor growth in vivo. First, LINC00466 expression was determined in SCC-15 cells stably transfected with either sh- LINC00466 or sh-NC. The RT-qPCR results suggested that LINC00466 expression was very low in SCC-15 cells infected with the sh- LINC00466 lentivirus ( Figure 7A ). SCC-15 cells stably expressing either sh- LINC00466 or sh-NC were injected subcutaneously into the dorsal flanks of nude mice. The tumor volume ( Figure 7B and C) and weight ( Figure 7D ) were smaller in the sh- LINC00466 group than in the sh- NC group. The RT-qPCR results showed tumor miR-493 expression was significantly higher in the sh- LINC00466 group compared to the sh- NC group ( Figure 7E ). The HMGA2 mRNA ( Figure 7F ) and protein levels ( Figure 7G ) in tumor xenografts derived from sh- LINC00466 -transfected SCC-15 cells were substantially lower compared to sh- NC tumor xenografts. Overall, these findings suggested that LINC00466 knockdown suppressed TSCC growth in vivo by regulating the miR-493/HMGA2 axis. Figure 7 LINC00466 knockdown suppresses TSCC growth in vivo. ( A ) SCC-15 cells were stably transduced with lentivirus expressing either sh-LINC00466 or sh-NC. RT-qPCR analysis confirmed the successful LINC00466 knockdown in SCC-15 cells. ( B ) SCC-15 cells stably expressing sh-LINC00466 or sh-NC were injected into nude mice. Tumor xenograft volumes were measured every 3 days until 30 days following cell inoculation. ( C ) Tumor xenografts representative images collected from groups 'sh-LINC00466ʹ and 'sh-NC'. ( D ) All the mice were euthanized 30 days after cell injection. The tumor xenografts were resected and weighed. ( E ) miR-493 levels in the tumor xenografts were measured via RT-qPCR. ( F and G ) The mRNA and protein levels of HMGA2 were determined in the tumor xenografts by respectively RT-qPCR and Western blot analysis. **P < 0.01. Discussion A growing body of evidence suggests that numerous lncRNAs are aberrantly expressed in TSCC. 14 , 20 , 25 lncRNAs are major molecular regulators implicated in modulating multiple malignant characteristics during TSCC initiation and progression. 26 Consequently, the in-depth elucidation of TSCC-associated lncRNA functions in tumor progression may provide novel diagnostic and therapeutic perspectives for managing TSCC. In the present study, the LINC00466 expression in TSCC was measured and its clinical relevance was determined. Additionally, the LINC00466 effects on the aggressive TSCC cell phenotype were investigated in vitro and in vivo. The mechanisms behind the LINC00466 cancer-promoting effects on TSCC progression were also clarified. LINC00466 is upregulated in lung adenocarcinoma. 21 In terms of its function, LINC00466 downregulation inhibits lung adenocarcinoma cell proliferation, migration, and invasion, as well as induced apoptosis in vitro, and reduced tumorigenicity in vivo. 21 To the best of our knowledge, the LINC00466 expression profiles and roles in TSCC have not yet been reported. In the present study, RT-qPCR was performed to assess LINC00466 expression in TSCC tumors and cell lines. We revealed that LINC00466 was upregulated in both sources of TSCC samples and cell lines. TSCC patients with high- LINC00466 expression exhibited adverse clinicopathological characteristics and a shorter overall survival than patients with low- LINC00466 expression. In vitro experiments indicated that LINC00466 knockdown suppressed TSCC cell proliferation, migration, and invasion in vitro. In addition, LINC00466 knockdown promoted TSCC cell apoptosis. In vivo experiments revealed that LINC00466 knockdown attenuated TSCC tumor growth in vivo. These findings suggest LINC00466 as a prognostic biomarker and therapeutic target for TSCC. Recent research indicates the existence of ceRNA interaction networks, in which lncRNAs function as molecular sponges that bind to miRNAs and consequently sequester the miRNA targets. 27 , 28 Therefore, we investigated the possibility that LINC00466 was a molecular sponge that promotes TSCC growth by regulating downstream molecular events underlying tumor-promoting activities. Cellular fractionation indicated that LINC00466 was mainly located in the cytoplasm of TSCC cells, suggesting LINC00466 functions as a miRNA sponge. Bioinformatics analysis revealed a putative miR-493-binding site within LINC00466 . Experiments conducted confirmed bioinformatics results. The luciferase reporter and RIP assays revealed that LINC00466 can specifically bind and interact with miR-493 in TSCC cells. Additionally, miR-493 expression was markedly downregulated in TSCC tissues when compared to adjacent normal tissues. These findings are consistent with observations from a previous study. 24 Moreover, an inverse correlation between LINC00466 and miR-493 expression levels in 53 TSCC tissue samples was identified by Spearman correlation. Further experiments revealed that LINC00466 knockdown increased miR-493 expression and decreased HMGA2 expression in TSCC cells. Hence, the role of LINC00466 in TSCC malignancy can be partly explained by a ceRNA mechanism. Our study, for the first time, identified a novel ceRNA pathway in ceRNA involving involving LINC00466 , miR-493, and HMGA2 mRNA. miR-493 dysregulation in a variety of human cancers has been widely reported. 29–34 miR-493 expression is low in TSCC and is significantly associated with adverse clinical characteristics and poor clinical outcomes. 24 Functional experiments have confirmed miR-493 as an antioncogenic miRNA important for TSCC progression. 24 Mechanistic experiments have identified HMGA2 mRNA as a direct miR-493 target in TSCC cells. 24 HMGA2, a member of the high-mobility group A protein family, is upregulated and functions as an oncogenic protein in TSCC. 35 , 36 In the present study, HMGA2 was also upregulated in TSCC. TSCC patients with high HMGA2 expression had a shorter overall survival than those with low HMGA2 expression. LINC00466 positively regulates HMGA2 expression in TSCC cells and this effect link to miR-493 sequestration. Furthermore, the expression of HMGA2 was positively correlated with LINC00466 levels in TSCC tissues. Rescue experiments indicated a decrease in the miR-493/HMGA2 axis output, partially reversing the LINC00466 downregulated effects on TSCC's aggressive behavior. These results support the notion that the LINC00466/ miR-493/HMGA2 pathway is functional and involved in TSCC pathogenesis, which might be an effective therapeutic route for TSCC. Conclusion In conclusion, LINC00466 upregulation is associated with a poor TSCC patient prognosis. LINC00466 promotes TSCC progression and plays a critical part in regulating tumor cell proliferation, apoptosis, migration, invasion, and ultimately tumor growth. LINC00466 functions as a miR-493 sponge and consequently attenuates the negative miR-493 regulatory effects on HMGA2 expression and promoting TSCC malignancy. The findings in this present study reveal crucial LINC00466 functions in TSCC cell oncogenicity and suggests possible LINC00466 applications in anticancer therapies. Ethics Approval The study protocol was approved by the Zaozhuang Municipal Hospital Ethics Committee (ECZZMH-2014.0615) and was conducted following the World Medical Association Declaration of Helsinki. All animal experiments were approved by the Committee on Ethics of Animal Experiments at Zaozhuang Municipal Hospital (ECAZZMH-2018.0902) and performed in strict accordance with NIH guidelines for the care and use of laboratory animals. Consent for Publication Not applicable. Disclosure The authors declare that they have no conflicts of interest for this work.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10366755/

Pulmonary Pathogen-Induced Epigenetic Modifications

Epigenetics generally involves genetic control by factors other than our own DNA sequence. Recent research has focused on delineating the mechanisms of two major epigenetic phenomena: DNA methylation and histone modification. As epigenetics involves many cellular processes, it is no surprise that it can also influence disease-associated gene expression. A direct link between respiratory infections, host cell epigenetic regulations, and chronic lung diseases is still unknown. Recent studies have revealed bacterium- or virus-induced epigenetic changes in the host cells. In this review, we focused on respiratory pathogens (viruses, bacteria, and fungi) induced epigenetic modulations (DNA methylation and histone modification) that may contribute to lung disease pathophysiology by promoting host defense or allowing pathogen persistence. 1. Introduction Pulmonary pathogens have been responsible for some of the biggest global health crises in humans for centuries. This is in part due to the efficiency of their mode of transmission. However, their ability to manipulate the human immune system has also been observed as a significant factor. It has already been known that epigenetic alterations play an important role in pathology as well as their ability to modify the immune response [ 1 ]. Epigenetic modifications associated with nutrition and the microbiome and their contribution to long-term health development have been well documented [ 2 ]. Importantly, the recent research successes show how pulmonary pathogens can modulate the human genome and cause chronic diseases due to the advancement in the OMICS sciences, such as genomics, transcriptomics, proteomics, or metabolomics. For example, genome-wide association studies have revealed genetic changes in different regions of the genome that are primarily associated with complex and nonmalignant respiratory diseases, e.g., chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, and pulmonary arterial hypertension (PAH) [ 3 , 4 , 5 ]. Benincasa et al., have reviewed the epigenetic role in COPD, asthma, and PAH [ 6 ]. The epigenetic markers for these common chronic respiratory diseases were identified, e.g., DNA methylation, histone modification, and microRNA (miRNA) [ 7 , 8 , 9 , 10 ]. There is growing evidence supporting bacterial infection-induced epigenetic modification in the host by different mechanisms [ 11 ]. Viruses are intracellular parasites that continuously utilize the subordination and exploitation of cellular machinery for transcription and translation. Thus, it is no surprise that viruses induce modulation of host chromatin dynamics and transcription regulation, and examples of modulated epigenetic mechanisms are DNA methylation, histone post-translational modification, and transcription modification [ 12 , 13 ]. Bacterial virulence factors can modulate host cell genetic expression rates, limiting the ability of the immune system to adequately respond and allowing replicating bacteria to evade phagocytosis. Multiple virulence factors have been identified in recent studies that may be able to cause lasting pathogenic changes to host cell genomes, some of which may be associated with chronic pathologies such as allergy development, asthma, latent infection, carcinogenesis, and COPD exacerbation. Previously described epigenetic genome modifications, including histone modification, miRNA processing, DNA methylation and acetylation, protein chaperones, and protein degradation processes, all have the potential to upregulate and downregulate host genes at the whim of the invading organism [ 1 , 14 , 15 ]. These epigenetic changes have potentially chronic or permanent consequences for the host, which can last long after the resolution of the initial infection due to the persistence of some of these changes throughout generations of proliferating cells. Linking the virulence factors of common respiratory infections to consistent host genome modifications and finally to measurable long-term pathogenic outcomes is a potential new front for pulmonary research. The field of infectious epigenetics is still in its early stages, but many authors have already extensively cataloged the most common pathogens and their respective epigenetic targets [ 1 , 14 , 15 ]. In this review, we have discussed pulmonary pathogens (viruses, bacteria, and fungi) induced epigenetic alterations and their role in typical cell pathology. We highlighted the current understanding of how host-bacterial, viral, or fungal infections contribute changes to the epigenetic landscape and whether those interactions are responsible for the downstream effects contributing to chronic pulmonary diseases. 2. Epigenetic Mechanisms Regulate Gene Expression The cells of eukaryotes are genetically homogenous but phenotypically heterogenous due to the differential expression of genes. One of the ways of regulating differential gene expression is epigenetically, which does not need mutation but is heritable [ 16 ]. Pathogens (bacterium, virus, and fungus) are known to modulate diverse epigenetic factors, namely histone modification, DNA methylation, chromatin-associated complexes, non-coding RNAs, and RNA splicing factors [ 11 ]. Here, we highlighted two major epigenetic mechanisms of gene regulation that have been reported to be modulated by pathogens ( Figure 1 ): histone modifications [ 17 ] and DNA methylation [ 18 ]. 2.1. Histone Modification Histone modification is the host cell's ability to condense transcriptionally active euchromatin into highly condensed and silenced heterochromatin. The 147 base pairs of DNA wrapped around the histone octamers create a superstructure called a nucleosome that provides a highly ordered scaffold for condensing and storing DNA, and also uses steric hindrance to restrict the access of RNA polymerase enzymes to the incorporated DNA strand and any included genes [ 17 ]. The host cell can use writer proteins to covalently modify the N-terminal histone tails at more than 200 different sites with phosphorylation, acetylation, acylation, citrullination, methylation, or ubiquitination to change their properties of interaction with surrounding nucleosomes. The specific pattern of histone modification can either move nucleosome complexes along the strand of DNA, exposing particular genes for transcription, or create transcriptionally silent supercoils [ 19 ]. Each post-translational modification exerts electrochemical "cross-talk" on other covalent groups on the histone, creating a complex pattern of modification that can drastically influence the way a cell behaves. Proteins called erasers are responsible for removing these post-translational modifications, creating a dynamic balance between writing and erasing these groups that can be quickly modulated to respond to an infectious threat [ 20 ]. Multiple species of bacteria can secrete virulence factors that can directly remove the covalent modifications on the histone tails, modulating transcriptional activity for their own benefit [ 14 , 21 ]. Many virulence factors have the effect of slowing the immune response by suppressing transcription of proinflammatory proteins, thereby inhibiting immune cascades and the recruitment of additional immune cells [ 17 ]. Chlamydia trachomatis uses this mechanism by secreting a nuclear effector protein with histone N-lysine methyltransferase activity and histone demethylase activity to specifically modulate the methylation of histones H2B, H3, and H4. This subversion of host transcription can cause a global reduction in overall genetic activity and severely limit the cell's ability to secrete alarm chemokines [ 22 ]. Another pathogenic histone modification mechanism can be accomplished through the modulation of histone-modifying enzymes, impairing the host's ability to sense and respond to immune threats. Acetylation of histone tails at lysine residues creates a net negative charge, which can repel nearby nucleosomes and cause the chromatin to uncoil, but can have other varying effects based on other local post-translational modifications and their intrinsic cross-talk [ 23 ]. HDAC (Histone Deacetylase) proteins are responsible for removing acetyl groups when necessary, which often creates a heterochromatin state and silences genes [ 23 ]. This process has been shown to be upregulated during infections with Anaplasma phagocytophilum , Mycobacterium tuberculosis, and Pseudomonas aeruginosa , limiting the host cell's ability to transcribe genes and respond to the infection. A well-defined example is the development of bacterial virulence factors that mimic the Ankyrin A protein and directly recruit and activate the HDAC1 enzymes at the site of transcriptionally active euchromatin. This causes localized hypoacetylation and gene suppression at the CYBB gene, which is essential for superoxide anion production and the proper function of the NADPH oxidase reaction [ 24 ]. 2.2. DNA Methylation DNA methylation is an easy way for a host cell to functionally silence transcription of a gene without excising the genetic code completely. DNA methyltransferases can quickly add a methyl group to a gene of interest at a cytosine or adenosine residue, creating methyl-cytosine or methyl-adenosine [ 18 ]. These bulky chemical groups inhibit the attachment of transcription factors and downregulate the activity of RNA polymerase and subsequent gene expression. Methyl groups will virtually silence all transcription, and acetyl groups tend to increase RNA polymerase activity at the site in question. These changes are persistent throughout generations of progenitor cells, creating chronic consequences for the host. Recognizing deleterious genomic methylations in a host cell that were specifically caused by an infection is difficult, and because of this, few pathogens have been associated with epigenetic methylations. Host cell methylations are usually localized to CpG islands in the genome, areas rich in cytosine and guanine residues, which allow for the activity of DNA-methyltransferase. Non-CpG methylations are one of the few true markers of pathogenic methylation [ 25 ]. Perhaps one of the best-characterized examples of this effect has been demonstrated by Mycobacterium tuberculosis Rv2699 protein secretion within host macrophages [ 25 , 26 ]. Multiple studies have shown various de novo methylations associated with Rv2699 proteins in macrophages infected with M. tuberculosis , with a possible decrease in IL-6 expression in infected cells [ 14 ]. Current reviews have also highlighted many different temporary epigenetic mechanisms used by pathogens to enhance virulence [ 1 , 14 ]. These changes are not passed through host progenitor cell lineages, so they are unlikely to cause chronic disease after infection, but many of these mechanisms may lead to clinically significant effects on the host beyond what may have been directly caused by the pathogen. Many questions remain about the long-term potential consequences of these infections. The exact mechanisms for the oncogenic epigenetic impacts of some infections like Helicobacter pylori and Human papillomavirus have been extensively documented [ 27 , 28 , 29 , 30 ]. 2.1. Histone Modification Histone modification is the host cell's ability to condense transcriptionally active euchromatin into highly condensed and silenced heterochromatin. The 147 base pairs of DNA wrapped around the histone octamers create a superstructure called a nucleosome that provides a highly ordered scaffold for condensing and storing DNA, and also uses steric hindrance to restrict the access of RNA polymerase enzymes to the incorporated DNA strand and any included genes [ 17 ]. The host cell can use writer proteins to covalently modify the N-terminal histone tails at more than 200 different sites with phosphorylation, acetylation, acylation, citrullination, methylation, or ubiquitination to change their properties of interaction with surrounding nucleosomes. The specific pattern of histone modification can either move nucleosome complexes along the strand of DNA, exposing particular genes for transcription, or create transcriptionally silent supercoils [ 19 ]. Each post-translational modification exerts electrochemical "cross-talk" on other covalent groups on the histone, creating a complex pattern of modification that can drastically influence the way a cell behaves. Proteins called erasers are responsible for removing these post-translational modifications, creating a dynamic balance between writing and erasing these groups that can be quickly modulated to respond to an infectious threat [ 20 ]. Multiple species of bacteria can secrete virulence factors that can directly remove the covalent modifications on the histone tails, modulating transcriptional activity for their own benefit [ 14 , 21 ]. Many virulence factors have the effect of slowing the immune response by suppressing transcription of proinflammatory proteins, thereby inhibiting immune cascades and the recruitment of additional immune cells [ 17 ]. Chlamydia trachomatis uses this mechanism by secreting a nuclear effector protein with histone N-lysine methyltransferase activity and histone demethylase activity to specifically modulate the methylation of histones H2B, H3, and H4. This subversion of host transcription can cause a global reduction in overall genetic activity and severely limit the cell's ability to secrete alarm chemokines [ 22 ]. Another pathogenic histone modification mechanism can be accomplished through the modulation of histone-modifying enzymes, impairing the host's ability to sense and respond to immune threats. Acetylation of histone tails at lysine residues creates a net negative charge, which can repel nearby nucleosomes and cause the chromatin to uncoil, but can have other varying effects based on other local post-translational modifications and their intrinsic cross-talk [ 23 ]. HDAC (Histone Deacetylase) proteins are responsible for removing acetyl groups when necessary, which often creates a heterochromatin state and silences genes [ 23 ]. This process has been shown to be upregulated during infections with Anaplasma phagocytophilum , Mycobacterium tuberculosis, and Pseudomonas aeruginosa , limiting the host cell's ability to transcribe genes and respond to the infection. A well-defined example is the development of bacterial virulence factors that mimic the Ankyrin A protein and directly recruit and activate the HDAC1 enzymes at the site of transcriptionally active euchromatin. This causes localized hypoacetylation and gene suppression at the CYBB gene, which is essential for superoxide anion production and the proper function of the NADPH oxidase reaction [ 24 ]. 2.2. DNA Methylation DNA methylation is an easy way for a host cell to functionally silence transcription of a gene without excising the genetic code completely. DNA methyltransferases can quickly add a methyl group to a gene of interest at a cytosine or adenosine residue, creating methyl-cytosine or methyl-adenosine [ 18 ]. These bulky chemical groups inhibit the attachment of transcription factors and downregulate the activity of RNA polymerase and subsequent gene expression. Methyl groups will virtually silence all transcription, and acetyl groups tend to increase RNA polymerase activity at the site in question. These changes are persistent throughout generations of progenitor cells, creating chronic consequences for the host. Recognizing deleterious genomic methylations in a host cell that were specifically caused by an infection is difficult, and because of this, few pathogens have been associated with epigenetic methylations. Host cell methylations are usually localized to CpG islands in the genome, areas rich in cytosine and guanine residues, which allow for the activity of DNA-methyltransferase. Non-CpG methylations are one of the few true markers of pathogenic methylation [ 25 ]. Perhaps one of the best-characterized examples of this effect has been demonstrated by Mycobacterium tuberculosis Rv2699 protein secretion within host macrophages [ 25 , 26 ]. Multiple studies have shown various de novo methylations associated with Rv2699 proteins in macrophages infected with M. tuberculosis , with a possible decrease in IL-6 expression in infected cells [ 14 ]. Current reviews have also highlighted many different temporary epigenetic mechanisms used by pathogens to enhance virulence [ 1 , 14 ]. These changes are not passed through host progenitor cell lineages, so they are unlikely to cause chronic disease after infection, but many of these mechanisms may lead to clinically significant effects on the host beyond what may have been directly caused by the pathogen. Many questions remain about the long-term potential consequences of these infections. The exact mechanisms for the oncogenic epigenetic impacts of some infections like Helicobacter pylori and Human papillomavirus have been extensively documented [ 27 , 28 , 29 , 30 ]. 3. Bacterial Infection-Mediated Pulmonary Epigenetics Bacterial infections causing epigenetic change within a host nasal epithelial cell genome have been newly credited for being a significant pathogenic contributor to future chronic disease [ 11 , 31 ]. Ebenezer et al., have shown Pseudomonous aeruginosa infection drives epigenetic regulation in the host. They used the P. aeruginosa mouse model to test how the infection regulates nuclear spingosine-1-phosphate kinase 2 (SPHK2) and spingosine-1-phosphaet (SP1) and modulates epigenetic regulation in ling injury in vivo [ 32 ]. An in vitro study has also shown pathogenic bacterial infection-induced epigenetic modulation, e.g., flagellin of Legionella pneumophila is known to modulate histone (H3) acetylation or phosphorylation in infected lung epithelial cells [ 11 ]. Importantly, respiratory tract commensal bacteria, e.g., Moraxella catarrhalis , were also found to modulate acetylation or phosphorylation of H3 via the induction of an inflammatory signaling cascade ( Figure 1 ) [ 33 , 34 ]. Denzer et al. [ 14 ] and Rajeev et al. [ 1 ] have comprehensively reviewed current research on epigenetic changes caused by bacterial infections, including many demonstrated epigenetic mechanisms of modification. Dupont et al. [ 35 ] define epigenetics as a change in gene function that is mitotically and/or meiotically heritable and that does not entail a change in DNA sequence. This is a rather classical perspective and excludes extra-genomic modifications done to the cell that have drastic effects on phenotype yet are not passed through progenitors. Interestingly, intrinsic, acquired, or adaptive forms of antimicrobial resistance can be characterized by different genetic and epigenetic molecular pathways [ 36 , 37 , 38 ]. Many current reviews of epigenetics have now expanded that definition to include those changes that are not passed through DNA replication and instead only affect cells directly modified by genetically active virulence factors [ 39 ]. For the purposes of this review and studying the effect of these diseases on the development of chronic ailments, we focused on the heritable epigenetic changes shown by human epithelial cells after a bacterial infection ( Table 1 ). 4. Viral Infection-Mediated Pulmonary Epigenetics Respiratory viral infections can trigger chronic lung diseases [ 63 , 64 , 65 ]. Asthma is a common chronic disease affecting children in Western countries. Although the pathophysiological changes underlying asthma development are complex and unknown, respiratory syncytial virus (RSV) and human rhinovirus virus (HRV) have been recognized as major etiological factors in wheezing illness, with a significant correlation with asthma development during childhood [ 66 , 67 ]. A recent number of studies have shown that respiratory viral infection causes epigenetic changes, which refer to genetic alterations that affect gene expression without any mutational genetic changes [ 64 ]. Here, we focused on a few common respiratory virus-driven epigenetic changes ( Table 2 and Table 3 ). 4.1. Adenovirus Adenovirus is a double-stranded DNA virus that commonly causes respiratory infections in humans. It uses a lytic type of life cycle, which is important in its pathophysiology [ 68 ]. A common theme in adenovirus infection is the suppression of the expression of most host genes except a few that are involved in cell division [ 69 ]. These profound changes are believed to be caused in part by epigenetic changes. ChIP-sip and ChIP-seq-based data analyses suggested that Adenovirus infection was associated with the modulation of two major epigenetic regulations: the organization of certain histone modifications and transcription factors within infected cells. The adenovirus e1a protein appeared to affect the acetylation of H3K9 and H3K18 and certain transcriptional factors [ 70 , 71 ]. Adenovirus protein VII is expressed late in the infected cells and translocates into the nucleus, which allows it to associate with host chromatin; consequently, it alters the chromatin composition of the infected cells. [ 72 , 73 ]. Additionally, the Adenovirus e1A protein is known to localize to host chromatin, alter host histone modifications, and overhaul transcription in infected cells. e1A binds to three different locations on the host's chromatin. The first site is a region occupied by multiple genes related to the immune response of the host, and e1A binding downregulates these genes [ 72 ]. The second site of binding for this protein involves genes involved in the cell cycle. These genes were observed to have been upregulated [ 68 , 72 ]. The genes at the third site of binding are mostly involved in specialization and growth, and these genes were found to have been downregulated. These epigenetic changes hinder the immune system's ability to respond to an adenovirus infection [ 72 ]. 4.2. RSV RSV is a negative-sense, single-stranded RNA virus enveloped by a protein coat. Since RSV affects the epithelial cells of the respiratory tract, the epigenetic factors that may induce changes in these cells are of particular interest. Caixia et al., underlined how the epigenetic dysregulation of signaling pathways in epithelial cells of the respiratory tract is related to shortfalls in immunological functions [ 74 ]. This implies that, through the induction of epigenetic modification, the virus can offset the immune response against it. Some of the signaling pathways that RSV can impact are tyrosine kinase growth factor signaling, the hexosamine biosynthetic pathway, and the extracellular matrix secretory pathways [ 75 ]. The virus can do this by inducing chromatin remodeling, which involves an increase in the number of nucleosome-free regions. This remodeling affects genes that regulate the aforementioned pathways. The increased accessibility of specific chromatin regions directly affects TGFβ-ECM and HBP pathways, which may explain the airway remodeling that happens in RSV infection [ 75 ]. Fonseca et al. [ 76 ] discussed that the disparities in immune responses between adults and infants are caused by epigenetic alterations of inflammatory genes. Histone methylation caused by RSV infection has been seen to enhance the production of Th2 cytokines after diminishing the production of pro-inflammatory cytokines. Other observations that have been made in mouse models suggest that RSV is also able to induce changes in non-coding RNAs [ 76 ]. These changes were seen to have impacts after the infection had subsided, which involved allergic asthma [ 76 ]. By having these effects, the virus is able to increase its own virulence while also having lasting effects, especially on vulnerable hosts. 4.3. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) SARS-CoV-2 is a positive-sense, single-stranded RNA virus that was first identified in the city of Wuhan, China. It is the virus responsible for the respiratory disease coronavirus disease 2019 (COVID-19). The virus has been found to alter the epigenetic environment of the host cell to increase its virulence by disrupting the host's ability to recognize and respond to the pathogen [ 77 ]. Arguably the most significant regulator of the severity of COVID-19 infection is correlated with the increased expression of the receptor ACE2. DNA methylation is one way in which this receptor can be altered by the virus. Decreased DNA methylation close to the transcription site was found to result in increased expression of ACE2 in lung epithelial cells [ 77 ]. Chlamydas et al., suggested that the upregulation of the ACE2 receptor on the host cells by the virus is through histone modifications at the DNA packaging histones H3, H3K4me1, H3K4me3, and H3K27Ac [ 77 ]. Ozturkler et al., summarized how epigenetic changes such as hypermethylation of IFN genes and hypomethylation of inflammatory genes can be induced by the virus, and this change can be cell-specific [ 78 ]. Corley et al., described how, in severe cases of COVID-19, the epigenetic changes in immune cells varied and DNA methylation decreased in primary neutrophils [ 79 ]. epigenomes-07-00013-t002_Table 2 Table 2 Common viral pulmonary pathogens and their associated epigenetic changes. Pulmonary Pathogen Epigenetic Changes Cellular Impact References Adenovirus Histone deacetylase inhibitor suppresses host HDAC proteins Increased global acetylation, transcription modulation [ 68 , 72 ] Respiratory syncytial virus (RSV) Chromatin modifications inducing nucleosome-free regions Demethylation of Nodal promoter Increased TGFβ expression Impacts tyrosine kinase growth factor signaling, affects extracellular matrix secretory pathways Reduced pro-inflammatory cytokines release [ 74 , 75 , 76 ] Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV2) Hypermethylation of IFN related Hypomethylation of inflammatory genes Perturbation of epigenetic clock IRF1 and IRF7 were upregulated Epi-factors HDAC9 and SIRT1 were deregulated. Increased level of ACE2 receptor expression Increased cytokine release [ 77 , 78 , 79 , 80 ] Influenza virus Post translational histone modification Decrease in histone acetylation Demethylation on CREB1 binding region Hypercytokinemia [ 81 , 82 , 83 ] Rhino virus Modifications in DNA methylation [ 64 ] Middle East respiratory syndrome-related corona virus (MERS) H3K27 methylation Downregulate antigen-presenting molecules [ 13 , 77 , 83 ] TGFβ: tumor growth factor β; IFN: interferon; IFR1: interferon regulatory factor 1; IRF7: interferon regulatory factor 7; SIRT1: sirtuin 1; ACE2: angiotensin converting enzyme 2; CREB1: CAMP responsive element binding protein 1; H3K27: histone 3 at lysine residue in position 27. epigenomes-07-00013-t003_Table 3 Table 3 Main types of epigenetic changes and virus presence in common respiratory viral diseases. Types of Epigenetic Change Adenovirus SARS-CoV-2 RSV Influenza Virus Rhino Virus MERS Chromatin remodeling Not Identified Not Identified Yes [ 75 ] Yes [ 83 ] Not Identified Not Identified Changes in DNA methylation Yes [ 68 ] Yes [ 77 , 78 , 79 ] Yes [ 74 ] Yes [ 81 , 82 ] Yes [ 64 ] Yes [ 83 ] Non-coding RNA Yes [ 80 ] Yes [ 74 ] Changes in DNA acetylation Yes [ 68 ] Not Identified Not Identified Yes [ 81 ] Not Identified Not Identified 4.1. Adenovirus Adenovirus is a double-stranded DNA virus that commonly causes respiratory infections in humans. It uses a lytic type of life cycle, which is important in its pathophysiology [ 68 ]. A common theme in adenovirus infection is the suppression of the expression of most host genes except a few that are involved in cell division [ 69 ]. These profound changes are believed to be caused in part by epigenetic changes. ChIP-sip and ChIP-seq-based data analyses suggested that Adenovirus infection was associated with the modulation of two major epigenetic regulations: the organization of certain histone modifications and transcription factors within infected cells. The adenovirus e1a protein appeared to affect the acetylation of H3K9 and H3K18 and certain transcriptional factors [ 70 , 71 ]. Adenovirus protein VII is expressed late in the infected cells and translocates into the nucleus, which allows it to associate with host chromatin; consequently, it alters the chromatin composition of the infected cells. [ 72 , 73 ]. Additionally, the Adenovirus e1A protein is known to localize to host chromatin, alter host histone modifications, and overhaul transcription in infected cells. e1A binds to three different locations on the host's chromatin. The first site is a region occupied by multiple genes related to the immune response of the host, and e1A binding downregulates these genes [ 72 ]. The second site of binding for this protein involves genes involved in the cell cycle. These genes were observed to have been upregulated [ 68 , 72 ]. The genes at the third site of binding are mostly involved in specialization and growth, and these genes were found to have been downregulated. These epigenetic changes hinder the immune system's ability to respond to an adenovirus infection [ 72 ]. 4.2. RSV RSV is a negative-sense, single-stranded RNA virus enveloped by a protein coat. Since RSV affects the epithelial cells of the respiratory tract, the epigenetic factors that may induce changes in these cells are of particular interest. Caixia et al., underlined how the epigenetic dysregulation of signaling pathways in epithelial cells of the respiratory tract is related to shortfalls in immunological functions [ 74 ]. This implies that, through the induction of epigenetic modification, the virus can offset the immune response against it. Some of the signaling pathways that RSV can impact are tyrosine kinase growth factor signaling, the hexosamine biosynthetic pathway, and the extracellular matrix secretory pathways [ 75 ]. The virus can do this by inducing chromatin remodeling, which involves an increase in the number of nucleosome-free regions. This remodeling affects genes that regulate the aforementioned pathways. The increased accessibility of specific chromatin regions directly affects TGFβ-ECM and HBP pathways, which may explain the airway remodeling that happens in RSV infection [ 75 ]. Fonseca et al. [ 76 ] discussed that the disparities in immune responses between adults and infants are caused by epigenetic alterations of inflammatory genes. Histone methylation caused by RSV infection has been seen to enhance the production of Th2 cytokines after diminishing the production of pro-inflammatory cytokines. Other observations that have been made in mouse models suggest that RSV is also able to induce changes in non-coding RNAs [ 76 ]. These changes were seen to have impacts after the infection had subsided, which involved allergic asthma [ 76 ]. By having these effects, the virus is able to increase its own virulence while also having lasting effects, especially on vulnerable hosts. 4.3. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) SARS-CoV-2 is a positive-sense, single-stranded RNA virus that was first identified in the city of Wuhan, China. It is the virus responsible for the respiratory disease coronavirus disease 2019 (COVID-19). The virus has been found to alter the epigenetic environment of the host cell to increase its virulence by disrupting the host's ability to recognize and respond to the pathogen [ 77 ]. Arguably the most significant regulator of the severity of COVID-19 infection is correlated with the increased expression of the receptor ACE2. DNA methylation is one way in which this receptor can be altered by the virus. Decreased DNA methylation close to the transcription site was found to result in increased expression of ACE2 in lung epithelial cells [ 77 ]. Chlamydas et al., suggested that the upregulation of the ACE2 receptor on the host cells by the virus is through histone modifications at the DNA packaging histones H3, H3K4me1, H3K4me3, and H3K27Ac [ 77 ]. Ozturkler et al., summarized how epigenetic changes such as hypermethylation of IFN genes and hypomethylation of inflammatory genes can be induced by the virus, and this change can be cell-specific [ 78 ]. Corley et al., described how, in severe cases of COVID-19, the epigenetic changes in immune cells varied and DNA methylation decreased in primary neutrophils [ 79 ]. epigenomes-07-00013-t002_Table 2 Table 2 Common viral pulmonary pathogens and their associated epigenetic changes. Pulmonary Pathogen Epigenetic Changes Cellular Impact References Adenovirus Histone deacetylase inhibitor suppresses host HDAC proteins Increased global acetylation, transcription modulation [ 68 , 72 ] Respiratory syncytial virus (RSV) Chromatin modifications inducing nucleosome-free regions Demethylation of Nodal promoter Increased TGFβ expression Impacts tyrosine kinase growth factor signaling, affects extracellular matrix secretory pathways Reduced pro-inflammatory cytokines release [ 74 , 75 , 76 ] Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV2) Hypermethylation of IFN related Hypomethylation of inflammatory genes Perturbation of epigenetic clock IRF1 and IRF7 were upregulated Epi-factors HDAC9 and SIRT1 were deregulated. Increased level of ACE2 receptor expression Increased cytokine release [ 77 , 78 , 79 , 80 ] Influenza virus Post translational histone modification Decrease in histone acetylation Demethylation on CREB1 binding region Hypercytokinemia [ 81 , 82 , 83 ] Rhino virus Modifications in DNA methylation [ 64 ] Middle East respiratory syndrome-related corona virus (MERS) H3K27 methylation Downregulate antigen-presenting molecules [ 13 , 77 , 83 ] TGFβ: tumor growth factor β; IFN: interferon; IFR1: interferon regulatory factor 1; IRF7: interferon regulatory factor 7; SIRT1: sirtuin 1; ACE2: angiotensin converting enzyme 2; CREB1: CAMP responsive element binding protein 1; H3K27: histone 3 at lysine residue in position 27. epigenomes-07-00013-t003_Table 3 Table 3 Main types of epigenetic changes and virus presence in common respiratory viral diseases. Types of Epigenetic Change Adenovirus SARS-CoV-2 RSV Influenza Virus Rhino Virus MERS Chromatin remodeling Not Identified Not Identified Yes [ 75 ] Yes [ 83 ] Not Identified Not Identified Changes in DNA methylation Yes [ 68 ] Yes [ 77 , 78 , 79 ] Yes [ 74 ] Yes [ 81 , 82 ] Yes [ 64 ] Yes [ 83 ] Non-coding RNA Yes [ 80 ] Yes [ 74 ] Changes in DNA acetylation Yes [ 68 ] Not Identified Not Identified Yes [ 81 ] Not Identified Not Identified 5. Fungal Epigenetics Human pathogenic fungi-induced epigenetic changes are not well studied like viruses and bacteria, although there is a plethora of research into plant pathogenic fungi [ 84 ]. One cause for this lack of human-centered research could be the population affected by pathogenic fungi. Most fungal infections, including fungal respiratory infections, are asymptomatic in healthy populations [ 85 ]. Patients with asymptomatic fungal infections are less likely to seek medical care and thus pose no additional burden on the healthcare system. However, when pathogenic fungi infect vulnerable or immunocompromised patients, the infections may become invasive and require hospitalization [ 86 , 87 , 88 ]. A smaller patient population that is afflicted with fungal infections may be less enticing to researchers as compared with the vast population that can be infected with a bacterium like Streptococcus pneumoniae [ 88 , 89 ]. However, despite the smaller proportion of patients affected by fungal disease, the burden of fungal infections on the United States healthcare system should not be understated. A recent study from the Open Forum on Infectious Diseases, a publication from the Infectious Diseases Society of America, shows that fungal infections cost the United States approximately $6.7 billion in 2018. This study attributes 76.3% of the fungal infections and 81.1% of the associated costs to three pathogens: Aspergillus , Pneumocystis , and Candida [ 90 ]. All three of those fungi cause severe pulmonary disease in immunocompromised patients. Fungal infections can impact the treatment and care of patients who are both immunocompromised and immunocompetent. In patients with chronic conditions like COPD or asthma, additional fungal infections complicate their care and may cause a severe exacerbation that requires hospitalization. A key factor contributing to all three chronic diseases (asthma, COPD, and cystic fibrosis) is mucus hypersecretion. Although epigenetic regulation of mucus hypersecretion remains unknown, a comprehensive review of epigenetic research on the mucus hypersecretion aspect of these chronic diseases reveals genes associated with DNA methylation and histone modification are major contributing factors [ 91 ]. One indication of fungal infection-induced epigenetic changes could be extrapolated from the funding by Perez FJ et al. They showed that fungal colonization with Pneumocystis has been shown to elevate the concentration of chloride channel accessory 1 (hCLCA1) in the infant lung parenchyma, and it also correlates with overproduction of mucin 5 AC (MUC5AC) [ 92 ]. Co-infections of fungal disease and viral infections, such as a co-infection of Aspergillus and SARS-CoV-2, can complicate the treatment of both diseases and have been attributed to poorer patient outcomes [ 93 ]. 6. Conclusions Genome-wide studies for characterization of epigenetic changes during pulmonary pathogen infection provide a better understanding of the complex relationship between pathogen infections and pulmonary diseases and even chronic lung diseases, e.g., asthma and COPD. However, we need to emphasize whether epigenetic changes directly correlate with changes in biological functions. Less common pathogens have still not been fully studied in the context of epigenetic modulations, and notably, neither have the long-term clinical consequences of these infections. Identifying which pathogens pose the greatest risk for the development of chronic disease and delineating the mechanism of their epigenetic changes can help focus public health efforts on the prevention or elimination of those diseases.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3795625/

Toxicity and Immunogenicity of Enterotoxigenic Escherichia coli Heat-Labile and Heat-Stable Toxoid Fusion 3xSTa A14Q -LT S63K/R192G/L211A in a Murine Model

Diarrhea is the second leading cause of death to young children. Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are the most common bacteria causing diarrhea. Adhesins and enterotoxins are the virulence determinants in ETEC diarrhea. Adhesins mediate bacterial attachment and colonization, and enterotoxins including heat-labile (LT) and heat-stable type Ib toxin (STa) disrupt fluid homeostasis in host cells that leads to fluid hyper-secretion and diarrhea. Thus, adhesins and enterotoxins have been primarily targeted in ETEC vaccine development. A recent study reported toxoid fusions with STa toxoid (STa P13F ) fused at the N- or C-terminus, or inside the A subunit of LT R192G elicited neutralizing antitoxin antibodies, and suggested application of toxoid fusions in ETEC vaccine development (Liu et al., Infect. Immun. 79:4002-4009, 2011). In this study, we generated a different STa toxoid (STa A14Q ) and a triple-mutant LT toxoid (LT S63K/R192G/L211A , tmLT), constructed a toxoid fusion (3xSTa A14Q -tmLT) that carried 3 copies of STa A14Q for further facilitation of anti-STa immunogenicity, and assessed antigen safety and immunogenicity in a murine model to explore its potential for ETEC vaccine development. Mice immunized with this fusion antigen showed no adverse effects, and developed antitoxin antibodies particularly through the IP route. Anti-LT antibodies were detected and were shown neutralizing against CT in vitro . Anti-STa antibodies were also detected in the immunized mice, and serum from the IP immunized mice neutralized STa toxin in vitro . Data from this study indicated that toxoid fusion 3xSTa A14Q -tmLT is safe and can induce neutralizing antitoxin antibodies, and provided helpful information for vaccine development against ETEC diarrhea. Introduction Diarrhea is the second leading cause of death to young children who live in developing countries [ 1 ], and continues to be a major threat to global health [ 2 ]. Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), E. coli strains producing enterotoxins, are the most common bacteria that cause diarrhea, and are responsible for 300,000 - 500,000 deaths of young children annually [ 2 , 3 ]. In addition, ETEC strains are the most common cause of diarrhea to children and adults travelling to ETEC endemic countries or regions, military personnel deployed at these areas, and immunocompromised patients [ 2 , 4 - 6 ]. These ETEC strains produce various bacterial adhesins and one or more enterotoxins. Bacterial adhesins mediate ETEC initial attachment to host epithelial cells and subsequent colonization at host small intestines, and 23 different adhesins including colonization factor antigens (CFAs) and coli surface antigens (CSs) were characterized among ETEC strains [ 7 ]. Enterotoxins including heat-labile toxin (LT) and heat-stable toxin type Ib (STa) disrupt fluid homeostasis in host small intestinal epithelial cells to cause hyper-secretion of electrolyte-rich fluid through activation of intracellular adenylate cyclase (by LT) or guanylate cyclase (by STa), that leads to diarrhea [ 8 ]. Since being identified as virulence determinants in ETEC-associated diarrhea, adhesins and toxins have been primarily targeted in anti-adhesin and antitoxin vaccine development. It is believed that anti-adhesin vaccines inducing immunity to block attachment and colonization of ETEC at host small intestines, and antitoxin vaccines inducing antitoxin immunity to neutralize LT and STa enterotoxicity should provide effective protection against ETEC diarrhea [ 9 , 10 ]. Unfortunately, there are no effective vaccines currently available to protect against ETEC diarrhea [ 10 ], despite the facts that the association between E. coli and children diarrhea was discovered over 100 years ago [ 11 ], that the disease mechanism of ETEC-associated diarrhea has been well studied [ 8 , 10 ], and that ETEC strains have been identified the leading bacteria that cause diarrhea [ 2 ]. Developing broadly effective ETEC vaccines is hampered by challenges including heterogeneity of ETEC adhesins and potent toxicity of enterotoxins. As different ETEC strains produce immunologically heterogeneous adhesins, experimental vaccines targeting on one adhesin provide protection against only ETEC expressing the same or homologous adhesin, but not strains expressing heterogeneous adhesins. The potent enterotoxicity of LT and STa pre-excludes both toxins from being considered as antigens in developing safe vaccines. Moreover, STa, a 19-amino-acid peptide, is poorly immunogenic, thus itself cannot be used as a vaccine component [ 10 , 12 , 13 ]. In addition, STa shares no genetic or antigenic homology with LT; therefore, anti-LT immunity is not cross protective against STa toxin. Indeed, early experimental vaccines using LT antigens (the nontoxic LT B subunit) were found protective against only ETEC strains expressing LT toxin but not against strains expressing STa toxin [ 14 , 15 ]. Now it becomes acknowledged that an effective antitoxin vaccine should include both LT and STa antigens to induce anti-LT and anti-STa immunity. To be included as safe vaccine components, however, LT and STa would first have their toxicity eliminated or reduced, and only STa and LT derivatives with toxicity reduced or eliminated can be considered safe antigens; second, STa must also have its immunogenicity facilitated to stimulate anti-STa immune responses [ 16 , 17 ]. STa peptides were found to induce anti-STa antibodies when genetically fused or chemically conjugated to strongly immunogenic carrier proteins, such as BSA or detoxified LT peptides [ 15 , 17 - 21 ]. Recently, studies demonstrated that some full-length non-toxic STa molecules can be genetically fused to a detoxified LT toxoid (LT R192G ) and resultant LT-STa toxoid fusions were found safe and elicited neutralizing antibodies against both toxins, and suggested that LT-STa toxoid fusions can be potentially used for developing antitoxin vaccines against ETEC diarrhea [ 17 , 22 , 23 ]. In this study, we generated a different STa molecule, STa A14Q , and a less toxic triple-mutant LT, LT S63K/R192G/L211A (tmLT), to construct a different toxoid fusion antigen. STa A14Q was selected because its analogue, porcine-type pSTa A13Q not only has toxicity more reduced but also maintains an antigenic topology more similar to native STa toxin compared to toxoids pSTa N11K (an analogue of STa N12K ) and pSTa P12F (an analogue of STa P13F ) [ 17 ]. Therefore, this STa A14Q toxoid, after being genetically fused to an LT toxoid, is expected to elicit stronger neutralizing antibodies against STa toxin. Attempting to further facilitate anti-STa immunogenicity, we genetically fused three copies of STa A14Q at the N-terminus, the C-terminus, and inside the LT A subunit of tmLT. This constructed toxoid fusion was evaluated in a murine model for safety and immunogenicity, and potential application in ETEC vaccine development. Materials and Methods Bacterial strains and plasmids E. coli strains and plasmids used in this study are listed in Table 1 . Three previously constructed LT R192G -STa P13F toxoid fusion recombinant strains: 8751, 8752 and 8753 [ 22 ], were used as templates to construct the new fusion strain. Since the eltAB genes (coding LT AB toxin) and the estA gene (coding heat-stable toxin 1b; Figure 1A ) were of human ETEC prototype strain H10407, the eltAB , LT, estA , and STa in this study are of the human-type. E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) and BL21 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) were used as host strains. Vector pBR322 (Promega, Madison, WI) was used to clone the mutated STa and LT genes, and pET28α (Novagen, Madison, WI) was used to clone and express the toxoid fusion gene. Strain 8955, a BL21 strain with vector pET28α [ 23 ], was used as the negative control. Recombinant E. coli strains were cultured in Luria Broth (LB) supplemented with ampicillin (100 µg/ml) or kanamycin (30 µg/ml). 10.1371/journal.pone.0077386.t001 Table 1 Escherichia coli strains and plasmids used in the study. Strains Relevant properties Plasmid Reference BL21 B F - , omp T, hsd S (r B - , m B - ), gal , dcm. GE Healthcare 8751 LT R192G -STa P13F , BL21/pfusion-2b LT 192 -L-STa 13 /pET28α [ 22 ] 8752 STa P13F -LT R192G , BL21/pfusion-3b STa 13 -gly-pro-LT 192 /pET28α [ 22 ] 8753 LT R192GA1 -STa P13F -LT A2-B , BL21/pfusion-4b LT 192A1 -gly-pro-STa 13 -LT A2-B /pET28α [ 22 ] TOP10 F - mcr AΔ( mrr - hsd RMS- mcr BC) Φ80 lac ZΔM15 Δ lac X74 recA1 deo R ara D139Δ( ara - leu )7697 gal U gal K rps L (Str R )endA1 nup G Invitrogen 8325 STa recombinant strain, TOP10 STa in pBR322 [ 23 ] 8407 pSTa A14Q mutant strain, TOP10 STa A14Q in pBR322 this study 8460 LT recombinant strain, TOP10 LT in pBR322 [ 22 ] 8543 LT R192G mutant strain, TOP10 LT R192G in pBR322 [ 22 ] 9123 LT S63K mutant strain, TOP10 LT S63K in pBR322 this study 9125 LT S63K/R192G mutant strain, TOP10 LT S63K/R192G in pBR322 this study 9078 LT R192G/L211A mutant strain, TOP10 LT R192G/L211A in pBR322 this study 9127 LT S62K/R192G/L211A mutant strain, TOP10 LT S62K/R192G/L211A in pBR322 this study 9157 p3xSTa A14Q -tmLT plasmid * , TOP10 3xSTa A14Q -tmLT in pET28α this study 9164 p9157, BL21 3xSTa A14Q -tmLT in pET28α this study 8955 Negative control, BL21/pET28α pET28α [ 23 ] *: Nucleotides coding the transmembrane signal peptides of the mutated eltA , eltB and estA genes, and the stop codons of the eltA, eltB , & the firs 2 copies of estA were removed to construct the fusion as a single open reading frame. 10.1371/journal.pone.0077386.g001 Figure 1 Construction and detection of the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion. Panel A: Amino acid sequences of the native STa toxin and the STa A14Q toxoid. Panel B: Construction of the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion gene with 3 copies of the STa A14Q toxoid gene genetically fused at the 5' end, within LT A , and the 3' end of the tmLT toxoid gene (LT S63K/R192G/L211A ). The numbers and arrows indicated primers used in PCRs to mutate the genes and to amplify fragments to be overlapped for a single open reading frame encoding the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion. This chimeric toxoid fusion gene was cloned in vector pET28α and expressed in E. coli BL21 as a 6xHis-tagged fusion protein. The drawing scale is not in proportion to nucleotide fragment sizes. Panel C: Detection of 6xHis-tagged 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein in Western blot using 12% PAGE gel, with rabbit anti-CT antiserum (1:3300; Sigma) and IRDye-labeled goat anti-rabbit IgG (1:5000; LI-COR, Lincoln, NE). Panel D: Detection of the toxoid fusion protein with purified rabbit anti-STa antiserum (1:5000) and IRDye-labeled goat anti-rabbit IgG (1:5000; LI-COR, Lincoln, NE). Extracted 6xHis-tagged protein form fusion strain 9164 and total protein extracts from negative control strain 8955 were examined in the SDS-PAGE. Lane M is the protein marker (Precision Plus Protein Pre-stained standards, Bio-Rad, Hercules, CA). Cloning and mutation of the LT and STa genes, and construction of the toxoid fusion gene The STa gene ( estA ), that was isolated from E. coli H10407 and cloned into pBR322 [ 22 , 23 ], was mutated at nucleotides coding the 14 th amino acid (GCT to CAG) for mutant STa A14Q ( Figure 1A ). Two PCR amplified products: one using primers pBRNheI-F [ 22 ] and hSTa14Q-R (5'- cccggtaca ctg aggattacaaca '-3), the other with primers hSTa14Q-F (5' tgttgtaatcct cag tgtaccggg -'3) and pBREagI-R [ 22 ], were overlapped in a splicing overlap extension (SOE) PCR. The overlapped fragment was digested with NheI and EagI and cloned into vector pBR322 for STa mutant STa A14Q . Similar to the PCR method previously used to mutate the 192 th amino acid (AGA to GGA) for toxoid LT R192G [ 17 , 22 ], native eltAB genes isolated from E. coli H10407 were mutated at the 211 th amino acid (CTC to GCC) using primers LT211-F (5-' cagaatctgagcacaatatat gcc ag -'3; nucleotides underlined were the target mutation) and LT211-R (5'- tgattgatatttcct ggc atatattgt -'3) for mutant LT L211A , at the 63 th (TCT to AAA) with primers LT63-F (5'- gtttccact aaa cttagtttgagaagt -'3) and LT63-R (5'- caaactaag ttt agtggaaacatatc -'3) for mutant LT S63K , at both the 192 th and the 211 th for double-mutant LT R192G/A211L (dmLT), and at the 63th, 192 th and the 211 th for triple-mutant LT S63K/R192G/L211A (tmLT). All mutated eltAB genes were cloned into pBR322 vector and expressed in E. coli TOP 10 cells. Expression and secretion of the mutated STa and LT were examined in STa competitive ELISA and GM1 ELISA as described previously [ 17 ]. To construct the toxoid fusion gene carrying 3 copies of the STa A14Q gene and 1 copy of the tmLT gene, we genetically fused together 3 pieces of DNA fragments, which were resulted from 3 SOEs, to form a single open reading frame ( Figure 1B ). Briefly, the first piece of fragment consisted of nucleotides coding the first copy of STa A14Q and the first 63 amino acids of the LT A1 peptide. That came from an overlap of two PCR products: one by primer 1 (T7-F, 5'- taatacgactcactataggg -'3) paired with primer 3 (hSTa14Q-R), and the other by primer 2 (STa14Q-F) paired with primer 4 (LT63-R), with plasmid of 8752 (STa 13 -gly-pro-LT 192 /pET28α) as the template. The second piece of fragment contained nucleotides coding the second copy of STa A14Q and the LT A peptide coding the 64 - 211 amino acids. This fragment was generated by the overlap of another two PCR products: one by primer 5 (LT63-F) with primer 3 (hSTa14Q-R) and the other by primer 2 (hSTa14Q-F) with primer 6 (LT211-R), with plasmid 8753 (LT 192A1 -gly-pro-STa 13 -LT A2-B /pET28α) as the DNA template. The third fragment included the LT A peptide coding the 212-240 amino acids, the LT B peptide, and a third copy of STa A14Q (with a stop codon). The third fragment was resulted from the overlap of PCR products using primer 7 (LT211-F) and primer 3 (hSTa14Q-R), and primer 2 (hSTa14Q-F) paired with primer 8 (T7-R, 5'- tgctagttattggtcaggggt -'3), with plasmid 8751 (LT 192 -L-STa 13 /pET28α) as the template. The second and third fragments were connected first in another SOE PCR, and the resultant fragment was further overlapped to the first fragment in a final SOE PCR to generate the single-open-reading-frame toxoid fusion gene. Since the DNA templates (p8751,8752,p8753) used in PCRs derived from strain 8543 that had nucleotides coding the LT 192 residue mutated, and PCR primers carried mutated nucleotides coding the LT 63 and LT 211 residues, overlapping these 3 pieces of fragments resulted in an entire chimeric toxoid fusion gene designated as 3xSTa A14Q -LT S63K/R192GL211A ( Figure 1B ). All PCRs and SOEs were carried out with pfu DNA polymerase (Strategene/Agilent Technologies, Santa Clara, CA) as described previously [ 17 , 22 ]. The final overlapped fragment was further amplified with PCR primers T7-F and T7-R, digested with NheI and EagI restriction enzymes, cloned into pET28α vector, and expressed as a 6xHis-tagged protein in E. coli TOP10 or E. coli BL21, by following standard protocols [ 17 , 22 , 24 ]. Expression and detection of the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein Expression of the 6xHis-tagged fusion protein by E. coli TOP10 and BL21 recombinant strains was examined in a standard sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The toxoid fusion recombinant strain was grown at 37 °C in 500 ml LB medium supplemented with kanamycin (30 µg/ml), and was induced with isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG; 100 µM) for 4 h after culture optical density (OD) reached 0.5. Bacteria were pelleted with centrifugation and were resuspended with 5 ml bacterial protein extraction reagent (B-PER, in phosphate buffer; Pierce, Rockford, IL) for total protein extraction (largely from inclusion body, in denatured buffer), followed by extraction of 6xHis-tagged proteins to a purity of greater than 90% using nickel affinity chromatography with Ni-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose by following the manufacturer's protocol (QIAGen, Valencia, CA). Extracted 6xHis-tagged proteins were refolded using a Pierce ® Protein Refolding kit with #5 and #9 buffers (Thermo Scientific, Rochester, NY). Refolded proteins were dialyzed 24 h at 4 °C in a series of guanidine-HCl (Sigma, St. Louis, MO) -PBS buffers with guanidine concentrations gradually reduced from 6M to 1M by following manufacture's recommendation (Thermo Scientific), then concentrated using Spectra/Por ® molecularporous membrane tubing (Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominquez, CA) and polyethylene glycol compound (PEG; Sigma) at 4 °C overnight. Ten microliter 6xHis-tagged protein extracts were analyzed in a 12% SDS-PAGE gel and immuno-blot assay. Rabbit anti-CT (1:3300; Sigma) and anti-STa antisera (1:5000; Robertson laboratory) were used to detect the fusion protein. IRDye-labeled goat anti-rabbit IgG (1:5000; LI-COR, Lincoln, NE) were used as the secondary antibody. Bound proteins were detected using a LI-COR Odyssey premium infrared gel imaging system (LI-COR). In addition, ELISAs using fusion proteins as the coating antigen and anti-CT and anti-STa antiserum as antibodies were carried out to assess the toxoid fusion for LT and STa antigenicity, and GM 1 ELISA to examine its binding activity to GM 1 receptors. Toxicity detection of the STa toxoid, LT toxoids, and the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein Toxicity of the expressed STa A14Q , LT S63K , LT S63K/R192G , LT R192G/L211A and LT S63K/R192G/L211A proteins (in pBR322 vector and E. coli TOP10 cells), with prototype H10407 and STa recombinant strain 8325 as positives, as well as the 3xSTa A14Q -tmLT fusion protein (200 ng or 2 µg) with purified STa and CT toxins as references, was assessed in T84 cells using EIA cGMP and cAMP kits (Assay Designs, Ann Arbor, MI). As described previously [ 17 , 22 ], 150 µl overnight-grown culture supernatants (from an equal amount of cells based on culture optical density values) of each toxoid mutant strain and the positive control strain, the extracted refolded fusion protein (200 ng or 2 µg in 150 µl PBS), 10 ng cholera toxin (CT, Sigma; in 150 µl PBS) which is highly homologous to LT structurally and functionally, or 2 ng purified STa toxin (from Robertson laboratory; in 150 µl PBS), were added to each microplate well (in duplicate) that had 1x10 5 T-84 cells seeded. After 2 h incubation in a CO 2 incubator, wells were washed and T-84 cells were lysed. The lyses were collected and used in ELISAs to measure intracellular cAMP or cGMP levels (pmol/ml) by following the manufacturer's protocol. Mouse immunization with toxoid fusion protein A group of 8 to 10 female adult BALB/c mice (Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MI) were immunized intraperitoneally (IP) or intranasally (IN) with the refolded 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein. For IP immunization, each of the 10 mice in the immunization group was IP injected with 100 µl of the refolded fusion protein (1.3 mg/ml) and 100 µl Freund's complete adjuvant (Sigma), and each of the 10 mice in the control group was injected with 100 µl Freund's complete adjuvant and 100 µl 0.02 M Tris-HCl buffer. Two booster injections at the same dose but with Freund's incomplete adjuvant were followed biweekly. Mice for IN immunization were divided into 4 groups: the first group of 10 mice was each administrated with 30 µl of the refolded fusion protein (1.3 mg/ml) mixed with 2 µg CT (as adjuvant), the second group of 6 mice was given the adjuvant alone (2 µg CT in 30 µl 0.02 M Tris-HCl buffer), the third group of 8 mice was given 30 µl of the refolded fusion protein (1.3 mg/ml) without adjuvant, and the fourth group of 8 mice received the 0.02 M Tris-HCl buffer only. All samples were administrated drop by drop (4-5 µl) alternatively to each mouse nostril cavity with a p-100 pipettor and a flat flexible gel loading pipettor tip. Mice were held at a horizontal position for 1 min after each drop so that antigen could have a prolong stay at nostril area. The same dose was given at each booster on day 14 and day 28. Mice were anaesthetized with CO 2 and exsanguinated at day 37. Serum and fecal samples (1 g feces resuspended in 5 ml fecal reconstitution buffer; 1:6 dilution) [ 22 , 25 ] collected before and 7 days after each immunization were stored at -80 °C until use. After exsanguination mice were necropsied, and intestines were collected and minced with a pair of surgical scissors in PBS (1 g in 2.5 ml; 1:3.5 dilution) supplemented with protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride (0.2 mg/ml). Minced products were vortexed for 1 min and centrifuged 3 min at 13,000 rpm to collect supernatants. Collected supernatants were referred as 'intestinal wash samples' in this study. Animal studies were in compliance with the Animal Welfare Act by following The 1996 National Research Council guidelines [ 26 ], and were approved and supervised by a state veterinarian and the South Dakota State University's Institutional Animal Care and Use Committee. Antitoxin antibody titration Anti-LT and anti-STa IgG and IgA antibodies in serum, fecal suspension and intestine wash samples of each mouse were examined in ELISAs. ELISAs were conducted similarly as described previously [ 17 , 22 , 23 ], but with modification. In ELISA to titrate anti-LT antibodies, 25 ng CT (an LT homologue which has been commonly used as coating antigen to titrate anti-LT antibodies) in 100 µl antigen coating buffer (0.015 M Na 2 CO 3 , 0.035 M NaHCO 3 , pH9.6) were coated to each well of an Immulon 2HB plate (Thermo Scientific, Rochester, NY) for 1 h at 37 °C and followed by overnight at 4 °C. Coated wells were washed with PBST (0.05% Tween-20), and uncoated sites were blocked with 10% non-fat milk-PBST (150 µl per well) for 1 h at 37 °C. After washing (5x with PBST), each well was incubated with serum (initially diluted 1:200 in 5% milk-PBST), fecal suspension (1:20 dilution in 5% milk-PBST), or intestine wash sample (1:25 dilution in 5% milk-PBST), in a binary dilution, for 1 h at 37 °C. Wells were washed (5x with PBST) and incubated with HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (1:5000 dilution; Sigma) or IgA (1:1000 dilution; Sigma), 100 µl per well, for 1 h at 37 °C; then washed again (3x with PBST and 2x with PBS), and incubated with TMB Microwell Peroxidase Substrate System (2-C) (KPL, Gaithersburg, MD), 100 µl per well, for 20 min at room temperature. Optical density (OD) was measured with a plate reader at 405 nm wavelength. OD readings, greater than 0.4 after subtraction of background readings, were calculated for antibody titers at a scale of log 10 , as described previously [ 17 , 22 ]. In ELISA to titrate anti-STa IgG and IgA antibodies, 1.3 - 2 ng STa-ovalbumin conjugates (from D. C. Robertson Laboratory), in 100 µl STa ELISA buffer [ 27 ], were added to each well of a Costar plate (Corning Inc., Corning, NY) and incubated for 1 h at 37 °C and followed by overnight at 4 °C. After washing twice with PBST, each well was blocked with 150 µl 5% non-fat milk (in PBST) at 37 °C for 1 h. After three washes, 100 µl serum (1:25 dilution in 1% milk-PBST), fecal suspension 1:15-20 diluted (in 1% milk-PBST) or without diluting, or intestine wash samples (1:10-15 dilution in 1% milk-PBST) was added to each well, binarily diluted, and incubated 1 h at 37 °C. After washing (4x), each well had 100 µl HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG (1:3000 dilution) or IgA (1:1000 dilution) antibodies added and incubated for 1 h at 37 °C; followed by washes (3x with PBST and 2x with PBS) and incubation with 100 µl TMB peroxidase substrate (KPL) for 20 min. OD measurement and antibody titration were conducted the same as described above. Samples in anti-LT antibody titration ELISAs were examined in triplicate, and in anti-STa antibody titration ELISAs were in duplicate due to limited supply of the STa-ovalbumin conjugates. Each antibody titration ELISA was repeated at least once. Weekly collected serum and fecal samples, of individual mouse or pooled from the group, were also used to measure anti-LT and anti-STa antibody titers. Antitoxin antibody neutralization assays Mouse serum, fecal suspension and intestine wash samples were examined for antibody neutralization activities against CT and STa toxins using T-84 cells and EIA cAMP and cGMP kits (Assay Design). Since neutralizing antitoxin antibodies prevent CT or STa from stimulating intracellular cyclic GMP or AMP levels in T-84 cells, antibody neutralization activities against CT (or LT) and STa toxins can be assessed with cyclic GMP and cAMP ELISA kits. As described previously [ 17 ], serum (30 µl serum in 120 µl DMEM/F12 medium; 1:33.3 dilution in a final volume of 1 ml), fecal (30 µl 1:6 diluted fecal suspension in 120 µl DMEM/F12 medium, a 1:200 final dilution; or 150 µl 1:6 diluted fecal suspension, a 1:40 dilution) and intestine washes (30 µl 1:2.5 diluted washes in 120 µl DMEM/F12 medium; 1:83.3 final dilution), pooled from each group or from individual mouse, were incubated with 2 ng STa toxin or 10 ng CT (diluted in 150-µl DMEM/F12 medium). After 1 h at room temperature, the mixture (300 µl in total) was added to T-84 cells (with 700 µl culture medium), and incubated 2 h at 37 °C in a CO 2 incubator. Cells were washed and lysed, and cell lysates were collected and measured for intracellular cAMP or cGMP levels (pmol/ml) using cAMP and cGMP ELISA kits, respectively. Statistical analysis Data were analyzed by using the SAS for windows version 8 (SAS Institute, Cary, N.C.), adjusting for multiple comparison by Bonferroni. Results were expressed as means ± standard errors. Student's t -test was used to compare the different treatment groups. Calculated p values of < 0.05 were regarded as significant when treatments were compared at two-tailed distribution and two-sample equal or unequal variance. Bacterial strains and plasmids E. coli strains and plasmids used in this study are listed in Table 1 . Three previously constructed LT R192G -STa P13F toxoid fusion recombinant strains: 8751, 8752 and 8753 [ 22 ], were used as templates to construct the new fusion strain. Since the eltAB genes (coding LT AB toxin) and the estA gene (coding heat-stable toxin 1b; Figure 1A ) were of human ETEC prototype strain H10407, the eltAB , LT, estA , and STa in this study are of the human-type. E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) and BL21 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) were used as host strains. Vector pBR322 (Promega, Madison, WI) was used to clone the mutated STa and LT genes, and pET28α (Novagen, Madison, WI) was used to clone and express the toxoid fusion gene. Strain 8955, a BL21 strain with vector pET28α [ 23 ], was used as the negative control. Recombinant E. coli strains were cultured in Luria Broth (LB) supplemented with ampicillin (100 µg/ml) or kanamycin (30 µg/ml). 10.1371/journal.pone.0077386.t001 Table 1 Escherichia coli strains and plasmids used in the study. Strains Relevant properties Plasmid Reference BL21 B F - , omp T, hsd S (r B - , m B - ), gal , dcm. GE Healthcare 8751 LT R192G -STa P13F , BL21/pfusion-2b LT 192 -L-STa 13 /pET28α [ 22 ] 8752 STa P13F -LT R192G , BL21/pfusion-3b STa 13 -gly-pro-LT 192 /pET28α [ 22 ] 8753 LT R192GA1 -STa P13F -LT A2-B , BL21/pfusion-4b LT 192A1 -gly-pro-STa 13 -LT A2-B /pET28α [ 22 ] TOP10 F - mcr AΔ( mrr - hsd RMS- mcr BC) Φ80 lac ZΔM15 Δ lac X74 recA1 deo R ara D139Δ( ara - leu )7697 gal U gal K rps L (Str R )endA1 nup G Invitrogen 8325 STa recombinant strain, TOP10 STa in pBR322 [ 23 ] 8407 pSTa A14Q mutant strain, TOP10 STa A14Q in pBR322 this study 8460 LT recombinant strain, TOP10 LT in pBR322 [ 22 ] 8543 LT R192G mutant strain, TOP10 LT R192G in pBR322 [ 22 ] 9123 LT S63K mutant strain, TOP10 LT S63K in pBR322 this study 9125 LT S63K/R192G mutant strain, TOP10 LT S63K/R192G in pBR322 this study 9078 LT R192G/L211A mutant strain, TOP10 LT R192G/L211A in pBR322 this study 9127 LT S62K/R192G/L211A mutant strain, TOP10 LT S62K/R192G/L211A in pBR322 this study 9157 p3xSTa A14Q -tmLT plasmid * , TOP10 3xSTa A14Q -tmLT in pET28α this study 9164 p9157, BL21 3xSTa A14Q -tmLT in pET28α this study 8955 Negative control, BL21/pET28α pET28α [ 23 ] *: Nucleotides coding the transmembrane signal peptides of the mutated eltA , eltB and estA genes, and the stop codons of the eltA, eltB , & the firs 2 copies of estA were removed to construct the fusion as a single open reading frame. 10.1371/journal.pone.0077386.g001 Figure 1 Construction and detection of the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion. Panel A: Amino acid sequences of the native STa toxin and the STa A14Q toxoid. Panel B: Construction of the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion gene with 3 copies of the STa A14Q toxoid gene genetically fused at the 5' end, within LT A , and the 3' end of the tmLT toxoid gene (LT S63K/R192G/L211A ). The numbers and arrows indicated primers used in PCRs to mutate the genes and to amplify fragments to be overlapped for a single open reading frame encoding the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion. This chimeric toxoid fusion gene was cloned in vector pET28α and expressed in E. coli BL21 as a 6xHis-tagged fusion protein. The drawing scale is not in proportion to nucleotide fragment sizes. Panel C: Detection of 6xHis-tagged 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein in Western blot using 12% PAGE gel, with rabbit anti-CT antiserum (1:3300; Sigma) and IRDye-labeled goat anti-rabbit IgG (1:5000; LI-COR, Lincoln, NE). Panel D: Detection of the toxoid fusion protein with purified rabbit anti-STa antiserum (1:5000) and IRDye-labeled goat anti-rabbit IgG (1:5000; LI-COR, Lincoln, NE). Extracted 6xHis-tagged protein form fusion strain 9164 and total protein extracts from negative control strain 8955 were examined in the SDS-PAGE. Lane M is the protein marker (Precision Plus Protein Pre-stained standards, Bio-Rad, Hercules, CA). Cloning and mutation of the LT and STa genes, and construction of the toxoid fusion gene The STa gene ( estA ), that was isolated from E. coli H10407 and cloned into pBR322 [ 22 , 23 ], was mutated at nucleotides coding the 14 th amino acid (GCT to CAG) for mutant STa A14Q ( Figure 1A ). Two PCR amplified products: one using primers pBRNheI-F [ 22 ] and hSTa14Q-R (5'- cccggtaca ctg aggattacaaca '-3), the other with primers hSTa14Q-F (5' tgttgtaatcct cag tgtaccggg -'3) and pBREagI-R [ 22 ], were overlapped in a splicing overlap extension (SOE) PCR. The overlapped fragment was digested with NheI and EagI and cloned into vector pBR322 for STa mutant STa A14Q . Similar to the PCR method previously used to mutate the 192 th amino acid (AGA to GGA) for toxoid LT R192G [ 17 , 22 ], native eltAB genes isolated from E. coli H10407 were mutated at the 211 th amino acid (CTC to GCC) using primers LT211-F (5-' cagaatctgagcacaatatat gcc ag -'3; nucleotides underlined were the target mutation) and LT211-R (5'- tgattgatatttcct ggc atatattgt -'3) for mutant LT L211A , at the 63 th (TCT to AAA) with primers LT63-F (5'- gtttccact aaa cttagtttgagaagt -'3) and LT63-R (5'- caaactaag ttt agtggaaacatatc -'3) for mutant LT S63K , at both the 192 th and the 211 th for double-mutant LT R192G/A211L (dmLT), and at the 63th, 192 th and the 211 th for triple-mutant LT S63K/R192G/L211A (tmLT). All mutated eltAB genes were cloned into pBR322 vector and expressed in E. coli TOP 10 cells. Expression and secretion of the mutated STa and LT were examined in STa competitive ELISA and GM1 ELISA as described previously [ 17 ]. To construct the toxoid fusion gene carrying 3 copies of the STa A14Q gene and 1 copy of the tmLT gene, we genetically fused together 3 pieces of DNA fragments, which were resulted from 3 SOEs, to form a single open reading frame ( Figure 1B ). Briefly, the first piece of fragment consisted of nucleotides coding the first copy of STa A14Q and the first 63 amino acids of the LT A1 peptide. That came from an overlap of two PCR products: one by primer 1 (T7-F, 5'- taatacgactcactataggg -'3) paired with primer 3 (hSTa14Q-R), and the other by primer 2 (STa14Q-F) paired with primer 4 (LT63-R), with plasmid of 8752 (STa 13 -gly-pro-LT 192 /pET28α) as the template. The second piece of fragment contained nucleotides coding the second copy of STa A14Q and the LT A peptide coding the 64 - 211 amino acids. This fragment was generated by the overlap of another two PCR products: one by primer 5 (LT63-F) with primer 3 (hSTa14Q-R) and the other by primer 2 (hSTa14Q-F) with primer 6 (LT211-R), with plasmid 8753 (LT 192A1 -gly-pro-STa 13 -LT A2-B /pET28α) as the DNA template. The third fragment included the LT A peptide coding the 212-240 amino acids, the LT B peptide, and a third copy of STa A14Q (with a stop codon). The third fragment was resulted from the overlap of PCR products using primer 7 (LT211-F) and primer 3 (hSTa14Q-R), and primer 2 (hSTa14Q-F) paired with primer 8 (T7-R, 5'- tgctagttattggtcaggggt -'3), with plasmid 8751 (LT 192 -L-STa 13 /pET28α) as the template. The second and third fragments were connected first in another SOE PCR, and the resultant fragment was further overlapped to the first fragment in a final SOE PCR to generate the single-open-reading-frame toxoid fusion gene. Since the DNA templates (p8751,8752,p8753) used in PCRs derived from strain 8543 that had nucleotides coding the LT 192 residue mutated, and PCR primers carried mutated nucleotides coding the LT 63 and LT 211 residues, overlapping these 3 pieces of fragments resulted in an entire chimeric toxoid fusion gene designated as 3xSTa A14Q -LT S63K/R192GL211A ( Figure 1B ). All PCRs and SOEs were carried out with pfu DNA polymerase (Strategene/Agilent Technologies, Santa Clara, CA) as described previously [ 17 , 22 ]. The final overlapped fragment was further amplified with PCR primers T7-F and T7-R, digested with NheI and EagI restriction enzymes, cloned into pET28α vector, and expressed as a 6xHis-tagged protein in E. coli TOP10 or E. coli BL21, by following standard protocols [ 17 , 22 , 24 ]. Expression and detection of the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein Expression of the 6xHis-tagged fusion protein by E. coli TOP10 and BL21 recombinant strains was examined in a standard sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The toxoid fusion recombinant strain was grown at 37 °C in 500 ml LB medium supplemented with kanamycin (30 µg/ml), and was induced with isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG; 100 µM) for 4 h after culture optical density (OD) reached 0.5. Bacteria were pelleted with centrifugation and were resuspended with 5 ml bacterial protein extraction reagent (B-PER, in phosphate buffer; Pierce, Rockford, IL) for total protein extraction (largely from inclusion body, in denatured buffer), followed by extraction of 6xHis-tagged proteins to a purity of greater than 90% using nickel affinity chromatography with Ni-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose by following the manufacturer's protocol (QIAGen, Valencia, CA). Extracted 6xHis-tagged proteins were refolded using a Pierce ® Protein Refolding kit with #5 and #9 buffers (Thermo Scientific, Rochester, NY). Refolded proteins were dialyzed 24 h at 4 °C in a series of guanidine-HCl (Sigma, St. Louis, MO) -PBS buffers with guanidine concentrations gradually reduced from 6M to 1M by following manufacture's recommendation (Thermo Scientific), then concentrated using Spectra/Por ® molecularporous membrane tubing (Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominquez, CA) and polyethylene glycol compound (PEG; Sigma) at 4 °C overnight. Ten microliter 6xHis-tagged protein extracts were analyzed in a 12% SDS-PAGE gel and immuno-blot assay. Rabbit anti-CT (1:3300; Sigma) and anti-STa antisera (1:5000; Robertson laboratory) were used to detect the fusion protein. IRDye-labeled goat anti-rabbit IgG (1:5000; LI-COR, Lincoln, NE) were used as the secondary antibody. Bound proteins were detected using a LI-COR Odyssey premium infrared gel imaging system (LI-COR). In addition, ELISAs using fusion proteins as the coating antigen and anti-CT and anti-STa antiserum as antibodies were carried out to assess the toxoid fusion for LT and STa antigenicity, and GM 1 ELISA to examine its binding activity to GM 1 receptors. Toxicity detection of the STa toxoid, LT toxoids, and the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein Toxicity of the expressed STa A14Q , LT S63K , LT S63K/R192G , LT R192G/L211A and LT S63K/R192G/L211A proteins (in pBR322 vector and E. coli TOP10 cells), with prototype H10407 and STa recombinant strain 8325 as positives, as well as the 3xSTa A14Q -tmLT fusion protein (200 ng or 2 µg) with purified STa and CT toxins as references, was assessed in T84 cells using EIA cGMP and cAMP kits (Assay Designs, Ann Arbor, MI). As described previously [ 17 , 22 ], 150 µl overnight-grown culture supernatants (from an equal amount of cells based on culture optical density values) of each toxoid mutant strain and the positive control strain, the extracted refolded fusion protein (200 ng or 2 µg in 150 µl PBS), 10 ng cholera toxin (CT, Sigma; in 150 µl PBS) which is highly homologous to LT structurally and functionally, or 2 ng purified STa toxin (from Robertson laboratory; in 150 µl PBS), were added to each microplate well (in duplicate) that had 1x10 5 T-84 cells seeded. After 2 h incubation in a CO 2 incubator, wells were washed and T-84 cells were lysed. The lyses were collected and used in ELISAs to measure intracellular cAMP or cGMP levels (pmol/ml) by following the manufacturer's protocol. Mouse immunization with toxoid fusion protein A group of 8 to 10 female adult BALB/c mice (Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MI) were immunized intraperitoneally (IP) or intranasally (IN) with the refolded 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein. For IP immunization, each of the 10 mice in the immunization group was IP injected with 100 µl of the refolded fusion protein (1.3 mg/ml) and 100 µl Freund's complete adjuvant (Sigma), and each of the 10 mice in the control group was injected with 100 µl Freund's complete adjuvant and 100 µl 0.02 M Tris-HCl buffer. Two booster injections at the same dose but with Freund's incomplete adjuvant were followed biweekly. Mice for IN immunization were divided into 4 groups: the first group of 10 mice was each administrated with 30 µl of the refolded fusion protein (1.3 mg/ml) mixed with 2 µg CT (as adjuvant), the second group of 6 mice was given the adjuvant alone (2 µg CT in 30 µl 0.02 M Tris-HCl buffer), the third group of 8 mice was given 30 µl of the refolded fusion protein (1.3 mg/ml) without adjuvant, and the fourth group of 8 mice received the 0.02 M Tris-HCl buffer only. All samples were administrated drop by drop (4-5 µl) alternatively to each mouse nostril cavity with a p-100 pipettor and a flat flexible gel loading pipettor tip. Mice were held at a horizontal position for 1 min after each drop so that antigen could have a prolong stay at nostril area. The same dose was given at each booster on day 14 and day 28. Mice were anaesthetized with CO 2 and exsanguinated at day 37. Serum and fecal samples (1 g feces resuspended in 5 ml fecal reconstitution buffer; 1:6 dilution) [ 22 , 25 ] collected before and 7 days after each immunization were stored at -80 °C until use. After exsanguination mice were necropsied, and intestines were collected and minced with a pair of surgical scissors in PBS (1 g in 2.5 ml; 1:3.5 dilution) supplemented with protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride (0.2 mg/ml). Minced products were vortexed for 1 min and centrifuged 3 min at 13,000 rpm to collect supernatants. Collected supernatants were referred as 'intestinal wash samples' in this study. Animal studies were in compliance with the Animal Welfare Act by following The 1996 National Research Council guidelines [ 26 ], and were approved and supervised by a state veterinarian and the South Dakota State University's Institutional Animal Care and Use Committee. Antitoxin antibody titration Anti-LT and anti-STa IgG and IgA antibodies in serum, fecal suspension and intestine wash samples of each mouse were examined in ELISAs. ELISAs were conducted similarly as described previously [ 17 , 22 , 23 ], but with modification. In ELISA to titrate anti-LT antibodies, 25 ng CT (an LT homologue which has been commonly used as coating antigen to titrate anti-LT antibodies) in 100 µl antigen coating buffer (0.015 M Na 2 CO 3 , 0.035 M NaHCO 3 , pH9.6) were coated to each well of an Immulon 2HB plate (Thermo Scientific, Rochester, NY) for 1 h at 37 °C and followed by overnight at 4 °C. Coated wells were washed with PBST (0.05% Tween-20), and uncoated sites were blocked with 10% non-fat milk-PBST (150 µl per well) for 1 h at 37 °C. After washing (5x with PBST), each well was incubated with serum (initially diluted 1:200 in 5% milk-PBST), fecal suspension (1:20 dilution in 5% milk-PBST), or intestine wash sample (1:25 dilution in 5% milk-PBST), in a binary dilution, for 1 h at 37 °C. Wells were washed (5x with PBST) and incubated with HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (1:5000 dilution; Sigma) or IgA (1:1000 dilution; Sigma), 100 µl per well, for 1 h at 37 °C; then washed again (3x with PBST and 2x with PBS), and incubated with TMB Microwell Peroxidase Substrate System (2-C) (KPL, Gaithersburg, MD), 100 µl per well, for 20 min at room temperature. Optical density (OD) was measured with a plate reader at 405 nm wavelength. OD readings, greater than 0.4 after subtraction of background readings, were calculated for antibody titers at a scale of log 10 , as described previously [ 17 , 22 ]. In ELISA to titrate anti-STa IgG and IgA antibodies, 1.3 - 2 ng STa-ovalbumin conjugates (from D. C. Robertson Laboratory), in 100 µl STa ELISA buffer [ 27 ], were added to each well of a Costar plate (Corning Inc., Corning, NY) and incubated for 1 h at 37 °C and followed by overnight at 4 °C. After washing twice with PBST, each well was blocked with 150 µl 5% non-fat milk (in PBST) at 37 °C for 1 h. After three washes, 100 µl serum (1:25 dilution in 1% milk-PBST), fecal suspension 1:15-20 diluted (in 1% milk-PBST) or without diluting, or intestine wash samples (1:10-15 dilution in 1% milk-PBST) was added to each well, binarily diluted, and incubated 1 h at 37 °C. After washing (4x), each well had 100 µl HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG (1:3000 dilution) or IgA (1:1000 dilution) antibodies added and incubated for 1 h at 37 °C; followed by washes (3x with PBST and 2x with PBS) and incubation with 100 µl TMB peroxidase substrate (KPL) for 20 min. OD measurement and antibody titration were conducted the same as described above. Samples in anti-LT antibody titration ELISAs were examined in triplicate, and in anti-STa antibody titration ELISAs were in duplicate due to limited supply of the STa-ovalbumin conjugates. Each antibody titration ELISA was repeated at least once. Weekly collected serum and fecal samples, of individual mouse or pooled from the group, were also used to measure anti-LT and anti-STa antibody titers. Antitoxin antibody neutralization assays Mouse serum, fecal suspension and intestine wash samples were examined for antibody neutralization activities against CT and STa toxins using T-84 cells and EIA cAMP and cGMP kits (Assay Design). Since neutralizing antitoxin antibodies prevent CT or STa from stimulating intracellular cyclic GMP or AMP levels in T-84 cells, antibody neutralization activities against CT (or LT) and STa toxins can be assessed with cyclic GMP and cAMP ELISA kits. As described previously [ 17 ], serum (30 µl serum in 120 µl DMEM/F12 medium; 1:33.3 dilution in a final volume of 1 ml), fecal (30 µl 1:6 diluted fecal suspension in 120 µl DMEM/F12 medium, a 1:200 final dilution; or 150 µl 1:6 diluted fecal suspension, a 1:40 dilution) and intestine washes (30 µl 1:2.5 diluted washes in 120 µl DMEM/F12 medium; 1:83.3 final dilution), pooled from each group or from individual mouse, were incubated with 2 ng STa toxin or 10 ng CT (diluted in 150-µl DMEM/F12 medium). After 1 h at room temperature, the mixture (300 µl in total) was added to T-84 cells (with 700 µl culture medium), and incubated 2 h at 37 °C in a CO 2 incubator. Cells were washed and lysed, and cell lysates were collected and measured for intracellular cAMP or cGMP levels (pmol/ml) using cAMP and cGMP ELISA kits, respectively. Statistical analysis Data were analyzed by using the SAS for windows version 8 (SAS Institute, Cary, N.C.), adjusting for multiple comparison by Bonferroni. Results were expressed as means ± standard errors. Student's t -test was used to compare the different treatment groups. Calculated p values of < 0.05 were regarded as significant when treatments were compared at two-tailed distribution and two-sample equal or unequal variance. Results STa A14Q and tmLT (LT S63K/R192G/L211A ) showed significant reduction in toxicity Cloning of the mutated STa or LT genes in each mutant strain was verified from DNA sequencing, and expression and secretion of the STa and LT proteins were confirmed from STa competitive ELISA and GM1 ELISA, respectively. In vitro toxicity assays indicated that the mutated STa and LT had toxicity eliminated or reduced. Cyclic GMP ELISA showed the cGMP level (to measure STa toxicity) in T-84 cells incubated with culture supernatant of STa A14Q mutant strain 8407 ( Table 1 ) was 0.093 pmole/ml, a level significantly lower (p=0.007, p<0.001) compared to the cGMP levels in the T-84 cells incubated with the culture supernatant of STa recombinant strain 8325 (1.42 pmol/ml) or wildtype strain H10407 (2.79 pmol/ml). Similar to STa toxoids, modified LT also showed toxicity reduction. The cAMP levels (to measure LT toxicity) in the T-84 cells incubated with culture supernatant of 9123 (LT S63K ), 9125 (LT S63K/R192G ), 9078 (LT R192G/L211A ) and 9127 (LT S63K/R192GL211A ) ( Table 1 ) were 3.55, 3.35, 6.45 and 2.5 pmole/ml, respectively. These levels were significantly lower compared to the cAMP level in the T-84 cells incubated with the culture supernatant of LT recombinant strain 8460 (16.3 pmole/ml; p=0.008, 0.002, 0.034, 0.013). The 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein was expressed DNA sequencing verified that the toxoid gene consisted of 3 copies of the mutated STa gene ( estA ) which carried no precursor sequences and only the mutated STa at the 3'end of the fusion gene carried nucleotides coding the stop codon, and one copy of a triple mutated LT S63K/R192G/L211A ( Figure 1B ). It was also revealed that the entire toxoid fusion was a single open reading frame. Expression of this 3xSTa A14Q -tmLT fusion protein in strain 9164 was confirmed in Western blot. A protein at the size close to 50 KDa, equivalent to the expected size of the monomeric 3xSTa A14Q -tmLT fusion, was detected with rabbit anti-CT ( Figure 1C ) and anti-STa antiserum ( Figure 1D ). No proteins of 50 KDa from the E. coli BL21 host strain 8955 were detected. Additionally, ELISAs indicated that this fusion protein reacted to anti-CT antiserum, with an average OD value of 0.58 (1.69 in wells coated with CT; 0.079 in negative control wells). The GM 1 ELISA showed this fusion protein had significant reduction in binding to GM 1 receptor, compared to CT (OD values 0.19 vs. 1.33, p < 0.001). The 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein was shown to be safe in vitro This 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein did not stimulate an increase of cAMP or cGMP in T-84 cells ( Figure 2 ). The cAMP levels in T-84 cells incubated with 200 ng and 2 µg toxoid fusion protein were 1.17 and 1.35 pmole/ml, respectively. These levels were similar to the cAMP level in T-84 cells incubated with cell culture medium alone, but significantly lower compared to the cAMP in the T-84 cells incubated with 10 ng CT (15 pmole/ml; p=0.003, 0.003) ( Figure 2A ). The cGMP levels in T-84 cells incubated with 200 ng and 2 µg purified toxoid fusion protein were 0.365 and 0.585 pmole/ml, respectively. These levels were not different from the cGMP in T-84 cells treated with cell culture medium (0.38 pmol/ml), but differed significantly from the cGMP in T-84 cells treated with 2 ng STa toxin (46.5 pmole/ml; p<0.001, <0.001) ( Figure 2B ). Moreover, mice tolerated this fusion protein well, as the immunized mice exhibited no apparent adverse effects. 10.1371/journal.pone.0077386.g002 Figure 2 Fusion protein toxicity assays in T-84 cells using cAMP and cGMP EIA ELISA kits. 200 ng or 2 µg of the refolded toxoid fusion protein 3xSTa A14Q -tmLT were incubated with T-84 cells, and intracellular cAMP (panel A) and cGMP (panel B) levels (pmol/ml) were measured. T-84 cells incubated with the toxoid fusion stimulated significant less cAMP (p<0.01) or cGMP (p<0.01) compared to those incubated with 2 ng STa or 10 ng CT. Toxoid fusion protein 3xSTa A14Q -tmLT was immunogenic Mice IP or IN immunized with the toxoid fusion protein (with adjuvants) had anti-STa antibodies detected. The IP immunized mice had anti-STa IgG antibody detected in the serum samples of all 10 immunized mice and in intestine wash samples of 9 (out 10) immunized mice, and anti-STa IgA antibodies in the intestine wash samples of 5 immunized mice ( Figure 3A ). Anti-STa IgA antibodies were also examined from the fecal suspension samples, but the ODs were lower than 0.4, the cutoff point; therefore, ELISA data were not included in final analyses. In the IN groups, anti-STa IgG antibodies were detected in the serum (7 out 10 immunized mice) and washes (7 out 10), and anti-STa IgA antibodies only in the intestinal washes (4 out 10) of the mice immunized with the toxoid fusion antigen with CT adjuvant ( Figure 3B ). When weekly-collected serum samples were examined, anti-STa IgG antibodies were detected after the IP primary immunization and after the first IN booster immunization. 10.1371/journal.pone.0077386.g003 Figure 3 Anti-STa IgG and IgA antibody titration of serum and intestinal wash samples of IP or IN immunized mice (solid dots) and the control mice (circles). Panel A: anti-STa IgG and IgA antibodies titers in the serum and intestine wash samples of the IP immunized mice, but not in the control mice (p<0.01). Panel B: anti-STa IgG and IgA antibodies titers from serum and intestine wash samples of the IN immunized mice, and no anti-STa IgG or IgA antibodies detected in the control mice (p<0.01). For STa antibody titration ELISAs, 1.3 - 2 ng STa-ovalbumin conjugates were used to coat each well of a Costar plate (Nunc); HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG (1:3000) or IgA (1:1000) as the secondary antibodies. Optical densities of greater than 0.4 (after subtracting the background reading) were used to calculate anti-STa antibody titers (in log 10 ). Anti-LT antibodies were detected in the immunized (with adjuvants) mice ( Figure 4 ). In the IP immunization groups, anti-LT IgG antibodies in the serum and intestinal wash samples, and anti-LT IgA antibodies in the intestinal wash samples were detected from the immunized mice, but not the control mice ( Figure 4A ). In the IN immunized mice, anti-LT antibodies were detected in mice immunized with either the toxoid fusion antigen (with CT adjuvant) or CT adjuvant alone, but not among mice immunized with the toxoid fusion protein alone or the buffer. Mice IN immunized with the toxoid fusion with CT adjuvant or CT adjuvant alone had anti-LT IgG and IgA antibodies detected in the serum samples ( Figure 4B ), anti-LT IgA antibodies in the fecal suspension sample ( Figure 4C ), and anti-LT IgG and IgA in the intestinal wash samples ( Figure 4D ). Analyses of the weekly collected samples (pooled) showed that IP immunized mice has anti-LT IgG antibodies detected in serum samples after the IP primary immunization and that antibody induction was boosted after each booster immunization. Mice IN immunized with the toxoid fusion (with CT adjuvant) or CT adjuvant had anti-LT antibodies detected in serum samples after the primary injection, and anti-LT IgA detected in the serum samples and fecal suspension after the 1 st booster injection. 10.1371/journal.pone.0077386.g004 Figure 4 Anti-LT antibody titration from serum, fecal suspension, and intestine wash samples of the IP and IN immunized mice. Panel A: anti-LT IgG and IgA antibody titers from serum and intestine wash samples of the IP immunized (solid dots) and control mice (circles) (p<0.01). Panel B: anti-LT IgG and IgA antibody titers from serum samples of the mice IN immunized with 130 µg fusion antigen with 2 µg CT adjuvant or 2 µg CT adjuvant alone, but not of mice immunized with 130 µg fusion antigen without CT or Tris-HCl buffer only. Panel C: anti-LT IgA antibody titers detected from fecal suspension samples of mice IN immunized with the fusion antigen with 2 µg CT adjuvant or CT adjuvant alone, but not of mice immunized with fusion antigen without CT or Tris-HCl buffer. Panel D: anti-LT IgG and IgA antibody titers detected in intestinal wash samples of the mice IN immunized with the fusion and CT or CT, but not with the fusion alone or Tri-HCl buffer. Anti-LT antibody titration ELISAs used 25 ng CT (Sigma) to coat each well of an Immulon 2HB plate (Thermo Scientific); HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG (1:5000) or IgA (1:1000) as the secondary antibodies. Optical densities of greater than 0.4 (after subtracting the background reading) were used to calculate anti-LT antibody titers (in log 10 ). Elicited antibodies neutralized CT and STa toxins in vitro In vitro antibody neutralization assays indicated that elicited antibodies exhibited neutralization activities against CT and STa toxins ( Figures 5 & 6 ). Cyclic AMP ELISA showed that cAMP levels in the T-84 cells incubated with 10 ng CT and the serum or washes of the IP immunized mice were 1.45 and 2.26 pmole/ml ( Figure 5A ). These levels were significantly lower than the cAMP in T-84 cells incubated with the same amount of CT but serum (8.9 pmole/ml, p=0.002) or washes (9.9 pmole/ml, p=0.027) from the IP control mice. When incubated with the fecal samples of the IP immunized and control mice, the T-84 cells had the cAMP detected at levels of 8.9 and 8.3 pmole/ml, with no statistically significant differences (p=0.59). But when undiluted fecal suspension samples were used, T-84 cells incubated with fecal suspension of the IP immunized mice had significant lower cAMP level compared to the cells incubated with fecal samples of the control mice ( p=0.02). Incubated with CT (10 ng) and the serum, fecal suspension, or intestinal wash samples from the mice IN immunized with the toxoid fusion (with CT adjuvant), T-84 cells had cAMP levels of 1.88, 2.1, and 1.95 pmole/ml, respectively ( Figure 5B ). These levels were lower than that in cells treated with the samples from mice immunized with the CT adjuvant alone, as the cAMP levels in T-84 cells incubated with the serum, fecal and washes of the mice IN immunized with CT alone were 3.35, 2.26 and 2.5 pmole/ml. Differences at inhibiting CT in stimulating cAMP in T-84 cells by the serum (p=0.08), fecal (p=0.18), or washes (p=0.06) samples between these two groups (IN with fusion and CT adjuvant vs. IN with CT alone) were not statistically significant. These levels, however, were significantly lower compared to those in cells treated with 10 ng CT alone (15 pmole/ml; p<0.01), or the cAMP levels in cells incubated with CT and serum (p<0.01), fecal suspension (p<0.01) or intestinal wash samples (p<0.01) of the mice IN immunized with either the toxoid fusion without CT adjuvant or the Tris-HCl buffer. 10.1371/journal.pone.0077386.g005 Figure 5 Neutralization against CT from antibodies in pooled serum (1:33.3 dilution), fecal (1:200 dilution) and intestine washes (1:83.3 dilution) of the IP and IN immunized mice. Panel A: serum, fecal suspension and intestine wash samples of the IP immunized mice (solid boxes) and the control mice (open boxes) were examined for neutralizing against 10 ng CT in T-84 cells using EIA cyclic AMP ELISA kit (cAMP EIA, Assay Design). Panel B: serum, fecal suspension and intestine wash samples of mice IN immunized with the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion with CT (solid boxes) or CT adjuvant (open boxes) were examined for neutralization against 10 ng CT. Intracellular cAMP concentrations (pmol/ml) were measured by following the manufacture's protocol. Boxes and error bars indicate means and standard deviations. 10.1371/journal.pone.0077386.g006 Figure 6 Neutralization against STa toxin from antibodies in pooled serum (1:33.3), fecal suspension (1:200) and intestine washes (1:83.3) of the IP and IN immunized mice. Panel A: serum, fecal suspension and intestine wash samples of the IP immunized mice (solid boxes) and control mice (open boxes) were examined for neutralization against 2 ng STa in T-84 cells using EIA cyclic GMP ELISA kit (cGMP EIA, Assay Design). Panel B: serum, fecal suspension and intestine wash samples of mice IN immunized with the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion antigen with CT (solid boxes) or CT adjuvant (open boxes) were examined for neutralization against 2 ng STa. Boxes and error bars indicate means and standard deviations. Elicited antibodies in the serum of the IP immunized mice exhibited neutralizing activities against STa toxin ( Figure 6 ). The cGMP in the T-84 cells incubated with STa toxin and the serum of the IP mice was 2.15 pmole/ml, that was significantly different from the cGMP in cells incubated with STa toxin and the serum sample from the IP control mice (76.5 pmole/ml; p<0.001) ( Figure 6A ). The cGMP in T-84 cells incubated with fecal suspension or intestinal wash samples of the IP immunized mice were lower than those in cells incubated with fecal and washes of the IP control mice, but were not significantly different (p=0.31, 0.11). When the intestinal wash sample pooled from the 5 IP immunized mice that had anti-STa IgA detected was used, the cGMP in T-84 cells was significantly lower than that in the cells incubated with the intestinal washes of the IP control mice (p=0.04). T-84 cells incubated with STa toxin and the serum, fecal suspension and intestinal washes of the mice IN immunized with the toxoid fusion antigen (with CT adjuvant) had lower cGMP levels compared to cells incubated with the toxin and the serum, fecal suspension and intestinal wash samples from the mice IN immunized with CT alone ( Figure 6B ), but differences were not statistically significant. Serum samples from individual IP immunized mice were examined in neutralization assays against STa toxin. The serum of mouse 7E, among those had greater anti-STa IgG antibody titers detected, showed strong neutralizing activity against STa toxin. It was found that even when 5 µl (versus 30 µl used in the pooled samples) serum was used, STa toxin showed significant reduction in stimulation of intracellular cGMP in T-84 cells (p=0.03). When 10 µl serum (1:100 in final dilution) was used, it completely prevented STa toxin from stimulating any increase of intracellular cGMP in T-84 cells (1.79 pmol/ml, a level detected in T-84 cells incubated with cell culture medium alone). STa A14Q and tmLT (LT S63K/R192G/L211A ) showed significant reduction in toxicity Cloning of the mutated STa or LT genes in each mutant strain was verified from DNA sequencing, and expression and secretion of the STa and LT proteins were confirmed from STa competitive ELISA and GM1 ELISA, respectively. In vitro toxicity assays indicated that the mutated STa and LT had toxicity eliminated or reduced. Cyclic GMP ELISA showed the cGMP level (to measure STa toxicity) in T-84 cells incubated with culture supernatant of STa A14Q mutant strain 8407 ( Table 1 ) was 0.093 pmole/ml, a level significantly lower (p=0.007, p<0.001) compared to the cGMP levels in the T-84 cells incubated with the culture supernatant of STa recombinant strain 8325 (1.42 pmol/ml) or wildtype strain H10407 (2.79 pmol/ml). Similar to STa toxoids, modified LT also showed toxicity reduction. The cAMP levels (to measure LT toxicity) in the T-84 cells incubated with culture supernatant of 9123 (LT S63K ), 9125 (LT S63K/R192G ), 9078 (LT R192G/L211A ) and 9127 (LT S63K/R192GL211A ) ( Table 1 ) were 3.55, 3.35, 6.45 and 2.5 pmole/ml, respectively. These levels were significantly lower compared to the cAMP level in the T-84 cells incubated with the culture supernatant of LT recombinant strain 8460 (16.3 pmole/ml; p=0.008, 0.002, 0.034, 0.013). The 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein was expressed DNA sequencing verified that the toxoid gene consisted of 3 copies of the mutated STa gene ( estA ) which carried no precursor sequences and only the mutated STa at the 3'end of the fusion gene carried nucleotides coding the stop codon, and one copy of a triple mutated LT S63K/R192G/L211A ( Figure 1B ). It was also revealed that the entire toxoid fusion was a single open reading frame. Expression of this 3xSTa A14Q -tmLT fusion protein in strain 9164 was confirmed in Western blot. A protein at the size close to 50 KDa, equivalent to the expected size of the monomeric 3xSTa A14Q -tmLT fusion, was detected with rabbit anti-CT ( Figure 1C ) and anti-STa antiserum ( Figure 1D ). No proteins of 50 KDa from the E. coli BL21 host strain 8955 were detected. Additionally, ELISAs indicated that this fusion protein reacted to anti-CT antiserum, with an average OD value of 0.58 (1.69 in wells coated with CT; 0.079 in negative control wells). The GM 1 ELISA showed this fusion protein had significant reduction in binding to GM 1 receptor, compared to CT (OD values 0.19 vs. 1.33, p < 0.001). The 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein was shown to be safe in vitro This 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion protein did not stimulate an increase of cAMP or cGMP in T-84 cells ( Figure 2 ). The cAMP levels in T-84 cells incubated with 200 ng and 2 µg toxoid fusion protein were 1.17 and 1.35 pmole/ml, respectively. These levels were similar to the cAMP level in T-84 cells incubated with cell culture medium alone, but significantly lower compared to the cAMP in the T-84 cells incubated with 10 ng CT (15 pmole/ml; p=0.003, 0.003) ( Figure 2A ). The cGMP levels in T-84 cells incubated with 200 ng and 2 µg purified toxoid fusion protein were 0.365 and 0.585 pmole/ml, respectively. These levels were not different from the cGMP in T-84 cells treated with cell culture medium (0.38 pmol/ml), but differed significantly from the cGMP in T-84 cells treated with 2 ng STa toxin (46.5 pmole/ml; p<0.001, <0.001) ( Figure 2B ). Moreover, mice tolerated this fusion protein well, as the immunized mice exhibited no apparent adverse effects. 10.1371/journal.pone.0077386.g002 Figure 2 Fusion protein toxicity assays in T-84 cells using cAMP and cGMP EIA ELISA kits. 200 ng or 2 µg of the refolded toxoid fusion protein 3xSTa A14Q -tmLT were incubated with T-84 cells, and intracellular cAMP (panel A) and cGMP (panel B) levels (pmol/ml) were measured. T-84 cells incubated with the toxoid fusion stimulated significant less cAMP (p<0.01) or cGMP (p<0.01) compared to those incubated with 2 ng STa or 10 ng CT. Toxoid fusion protein 3xSTa A14Q -tmLT was immunogenic Mice IP or IN immunized with the toxoid fusion protein (with adjuvants) had anti-STa antibodies detected. The IP immunized mice had anti-STa IgG antibody detected in the serum samples of all 10 immunized mice and in intestine wash samples of 9 (out 10) immunized mice, and anti-STa IgA antibodies in the intestine wash samples of 5 immunized mice ( Figure 3A ). Anti-STa IgA antibodies were also examined from the fecal suspension samples, but the ODs were lower than 0.4, the cutoff point; therefore, ELISA data were not included in final analyses. In the IN groups, anti-STa IgG antibodies were detected in the serum (7 out 10 immunized mice) and washes (7 out 10), and anti-STa IgA antibodies only in the intestinal washes (4 out 10) of the mice immunized with the toxoid fusion antigen with CT adjuvant ( Figure 3B ). When weekly-collected serum samples were examined, anti-STa IgG antibodies were detected after the IP primary immunization and after the first IN booster immunization. 10.1371/journal.pone.0077386.g003 Figure 3 Anti-STa IgG and IgA antibody titration of serum and intestinal wash samples of IP or IN immunized mice (solid dots) and the control mice (circles). Panel A: anti-STa IgG and IgA antibodies titers in the serum and intestine wash samples of the IP immunized mice, but not in the control mice (p<0.01). Panel B: anti-STa IgG and IgA antibodies titers from serum and intestine wash samples of the IN immunized mice, and no anti-STa IgG or IgA antibodies detected in the control mice (p<0.01). For STa antibody titration ELISAs, 1.3 - 2 ng STa-ovalbumin conjugates were used to coat each well of a Costar plate (Nunc); HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG (1:3000) or IgA (1:1000) as the secondary antibodies. Optical densities of greater than 0.4 (after subtracting the background reading) were used to calculate anti-STa antibody titers (in log 10 ). Anti-LT antibodies were detected in the immunized (with adjuvants) mice ( Figure 4 ). In the IP immunization groups, anti-LT IgG antibodies in the serum and intestinal wash samples, and anti-LT IgA antibodies in the intestinal wash samples were detected from the immunized mice, but not the control mice ( Figure 4A ). In the IN immunized mice, anti-LT antibodies were detected in mice immunized with either the toxoid fusion antigen (with CT adjuvant) or CT adjuvant alone, but not among mice immunized with the toxoid fusion protein alone or the buffer. Mice IN immunized with the toxoid fusion with CT adjuvant or CT adjuvant alone had anti-LT IgG and IgA antibodies detected in the serum samples ( Figure 4B ), anti-LT IgA antibodies in the fecal suspension sample ( Figure 4C ), and anti-LT IgG and IgA in the intestinal wash samples ( Figure 4D ). Analyses of the weekly collected samples (pooled) showed that IP immunized mice has anti-LT IgG antibodies detected in serum samples after the IP primary immunization and that antibody induction was boosted after each booster immunization. Mice IN immunized with the toxoid fusion (with CT adjuvant) or CT adjuvant had anti-LT antibodies detected in serum samples after the primary injection, and anti-LT IgA detected in the serum samples and fecal suspension after the 1 st booster injection. 10.1371/journal.pone.0077386.g004 Figure 4 Anti-LT antibody titration from serum, fecal suspension, and intestine wash samples of the IP and IN immunized mice. Panel A: anti-LT IgG and IgA antibody titers from serum and intestine wash samples of the IP immunized (solid dots) and control mice (circles) (p<0.01). Panel B: anti-LT IgG and IgA antibody titers from serum samples of the mice IN immunized with 130 µg fusion antigen with 2 µg CT adjuvant or 2 µg CT adjuvant alone, but not of mice immunized with 130 µg fusion antigen without CT or Tris-HCl buffer only. Panel C: anti-LT IgA antibody titers detected from fecal suspension samples of mice IN immunized with the fusion antigen with 2 µg CT adjuvant or CT adjuvant alone, but not of mice immunized with fusion antigen without CT or Tris-HCl buffer. Panel D: anti-LT IgG and IgA antibody titers detected in intestinal wash samples of the mice IN immunized with the fusion and CT or CT, but not with the fusion alone or Tri-HCl buffer. Anti-LT antibody titration ELISAs used 25 ng CT (Sigma) to coat each well of an Immulon 2HB plate (Thermo Scientific); HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG (1:5000) or IgA (1:1000) as the secondary antibodies. Optical densities of greater than 0.4 (after subtracting the background reading) were used to calculate anti-LT antibody titers (in log 10 ). Elicited antibodies neutralized CT and STa toxins in vitro In vitro antibody neutralization assays indicated that elicited antibodies exhibited neutralization activities against CT and STa toxins ( Figures 5 & 6 ). Cyclic AMP ELISA showed that cAMP levels in the T-84 cells incubated with 10 ng CT and the serum or washes of the IP immunized mice were 1.45 and 2.26 pmole/ml ( Figure 5A ). These levels were significantly lower than the cAMP in T-84 cells incubated with the same amount of CT but serum (8.9 pmole/ml, p=0.002) or washes (9.9 pmole/ml, p=0.027) from the IP control mice. When incubated with the fecal samples of the IP immunized and control mice, the T-84 cells had the cAMP detected at levels of 8.9 and 8.3 pmole/ml, with no statistically significant differences (p=0.59). But when undiluted fecal suspension samples were used, T-84 cells incubated with fecal suspension of the IP immunized mice had significant lower cAMP level compared to the cells incubated with fecal samples of the control mice ( p=0.02). Incubated with CT (10 ng) and the serum, fecal suspension, or intestinal wash samples from the mice IN immunized with the toxoid fusion (with CT adjuvant), T-84 cells had cAMP levels of 1.88, 2.1, and 1.95 pmole/ml, respectively ( Figure 5B ). These levels were lower than that in cells treated with the samples from mice immunized with the CT adjuvant alone, as the cAMP levels in T-84 cells incubated with the serum, fecal and washes of the mice IN immunized with CT alone were 3.35, 2.26 and 2.5 pmole/ml. Differences at inhibiting CT in stimulating cAMP in T-84 cells by the serum (p=0.08), fecal (p=0.18), or washes (p=0.06) samples between these two groups (IN with fusion and CT adjuvant vs. IN with CT alone) were not statistically significant. These levels, however, were significantly lower compared to those in cells treated with 10 ng CT alone (15 pmole/ml; p<0.01), or the cAMP levels in cells incubated with CT and serum (p<0.01), fecal suspension (p<0.01) or intestinal wash samples (p<0.01) of the mice IN immunized with either the toxoid fusion without CT adjuvant or the Tris-HCl buffer. 10.1371/journal.pone.0077386.g005 Figure 5 Neutralization against CT from antibodies in pooled serum (1:33.3 dilution), fecal (1:200 dilution) and intestine washes (1:83.3 dilution) of the IP and IN immunized mice. Panel A: serum, fecal suspension and intestine wash samples of the IP immunized mice (solid boxes) and the control mice (open boxes) were examined for neutralizing against 10 ng CT in T-84 cells using EIA cyclic AMP ELISA kit (cAMP EIA, Assay Design). Panel B: serum, fecal suspension and intestine wash samples of mice IN immunized with the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion with CT (solid boxes) or CT adjuvant (open boxes) were examined for neutralization against 10 ng CT. Intracellular cAMP concentrations (pmol/ml) were measured by following the manufacture's protocol. Boxes and error bars indicate means and standard deviations. 10.1371/journal.pone.0077386.g006 Figure 6 Neutralization against STa toxin from antibodies in pooled serum (1:33.3), fecal suspension (1:200) and intestine washes (1:83.3) of the IP and IN immunized mice. Panel A: serum, fecal suspension and intestine wash samples of the IP immunized mice (solid boxes) and control mice (open boxes) were examined for neutralization against 2 ng STa in T-84 cells using EIA cyclic GMP ELISA kit (cGMP EIA, Assay Design). Panel B: serum, fecal suspension and intestine wash samples of mice IN immunized with the 3xSTa A14Q -tmLT toxoid fusion antigen with CT (solid boxes) or CT adjuvant (open boxes) were examined for neutralization against 2 ng STa. Boxes and error bars indicate means and standard deviations. Elicited antibodies in the serum of the IP immunized mice exhibited neutralizing activities against STa toxin ( Figure 6 ). The cGMP in the T-84 cells incubated with STa toxin and the serum of the IP mice was 2.15 pmole/ml, that was significantly different from the cGMP in cells incubated with STa toxin and the serum sample from the IP control mice (76.5 pmole/ml; p<0.001) ( Figure 6A ). The cGMP in T-84 cells incubated with fecal suspension or intestinal wash samples of the IP immunized mice were lower than those in cells incubated with fecal and washes of the IP control mice, but were not significantly different (p=0.31, 0.11). When the intestinal wash sample pooled from the 5 IP immunized mice that had anti-STa IgA detected was used, the cGMP in T-84 cells was significantly lower than that in the cells incubated with the intestinal washes of the IP control mice (p=0.04). T-84 cells incubated with STa toxin and the serum, fecal suspension and intestinal washes of the mice IN immunized with the toxoid fusion antigen (with CT adjuvant) had lower cGMP levels compared to cells incubated with the toxin and the serum, fecal suspension and intestinal wash samples from the mice IN immunized with CT alone ( Figure 6B ), but differences were not statistically significant. Serum samples from individual IP immunized mice were examined in neutralization assays against STa toxin. The serum of mouse 7E, among those had greater anti-STa IgG antibody titers detected, showed strong neutralizing activity against STa toxin. It was found that even when 5 µl (versus 30 µl used in the pooled samples) serum was used, STa toxin showed significant reduction in stimulation of intracellular cGMP in T-84 cells (p=0.03). When 10 µl serum (1:100 in final dilution) was used, it completely prevented STa toxin from stimulating any increase of intracellular cGMP in T-84 cells (1.79 pmol/ml, a level detected in T-84 cells incubated with cell culture medium alone). Discussion As E. coli strains producing LT, STa (heat-stable toxin I), or both toxins are the most common bacteria causing diarrhea, effective prevention against ETEC is urgently needed. Vaccines that induce host anti-adhesin immunity to inhibit ETEC attachment and colonization and antitoxin immunity to neutralize enterotoxicity are expected to provide effective protection against ETEC diarrhea. Although significant progress has been made in developing vaccines against colonization from the most prevalent CFA adhesins and against LT enterotoxicity [ 9 , 10 , 12 , 13 ], ETEC vaccine candidates currently under development including the promising ones do not carry STa antigens to induce immunity protecting against STa toxin [ 10 ]. As ETEC strains expressing STa toxin, alone or together with LT, are associated with two thirds of ETEC-associated diarrhea cases [ 28 , 29 ] and the severe cases [ 30 ], only vaccines that also induce anti-STa immunity can provide effective protection against ETEC diarrhea. But the potent toxicity and poor immunogenicity of STa have brought major challenges. It was suggested that STa needs to have its toxicity eliminated or reduced and also anti-STa immunogenicity enhanced in order to be used as an ETEC vaccine antigen [ 16 , 17 ]. Recent studies reported that STa toxoids, such as STa P13F , STa E8A , STa T16Q , STa G17S , and porcine-type pSTa N11K and pSTa P12F which are homologues to human-type STa N12K and STa P13F , when genetically fused to a full-length LT toxoid (LT R192G ), induced anti-STa antibodies in mice, rabbits or pigs [ 17 , 22 , 23 ]. Moreover, elicited antibodies demonstrated neutralizing activity against STa toxin (and CT as well) in vitro [ 17 , 22 ], and protected suckling piglets against infection from a STa-producing ETEC strain [ 17 ]. The current study demonstrated that the STa A14Q had toxicity eliminated and induced anti-STa antibodies after being genetically fused to an LT antigen, and suggested potential application of toxoid fusion antigens in ETEC vaccine development. In this study, we selected STa A14Q to be fused to the LT toxoid and to explore this fusion for eliciting neutralizing anti-STa antibodies. This STa A14Q likely maintains the native STa antigenic epitope topology, indicated by results from a previous study showing its analogue pSTa A13Q (porcine-type STa toxoid) was less toxic but maintained an antigenic structure more similar to native pSTa than toxoid pSTa N11K or pST P12F did [ 17 ]. That suggests STa A14Q could be a better candidate for constructing a toxoid fusion antigen to elicit antibodies exhibiting greater neutralizing activity against STa toxin, although its STa antigenic topology could potentially alter after being fused to an LT toxoid. Results from this study showed that antibodies in serum sample of the IP immunized mice neutralized STa toxin, demonstrated by complete prevention of STa toxin in stimulation of any increase of cGMP in T-84 cells ( Figure 6A ). Future antibody titration using a serial of diluted samples will determine the anti-STa antibody neutralization titer. Assuming that an antigen dose effect would occur, we included 3 copies of STa A14Q in the fusion in order to further facilitate anti-STa immunogenicity in this study. Results from a comparative study, by re-analyzing serum sample from the previous study with the anti-STa antibody titration method used in this study, indicated that mice IP immunized with 3xSTa A14Q -tmLT developed anti-STa IgG (serum) titers more than twice greater than the mice previously IP immunized with the LT R192G -STa P13F fusion, although a lineal dosage association was not observed (data not shown). That indicated that additional copies of STa toxoid enhanced a toxoid fusion in stimulation of anti-STa immunity and provided helpful information in future ETEC toxoid vaccine development. It was noted that antibodies induced by the current 3xSTa A14Q -tmLT and the previous LT R192G -STa P13F toxoid fusions showed variation regarding neutralizing activities. Strong anti-STa neutralization activity was observed in serum, but poor in fecal or intestinal wash samples, of the mice IP immunized with the current toxoid fusion 3xSTa A14Q -tmLT. Results from the previous study suggested that antibodies in fecal samples of mice immunized with fusion LT 192 -STa P13F showed fair to moderate neutralization activity against STa [ 22 ]. We also observed that individual mice responded variously to the toxoid fusion antigen. Some IP immunized mice had anti-STa antibody titers detected twice greater than others, and serum sample of these mice, even at a dilution of 1:100 or 1:200, strongly neutralized STa toxin as they prevented STa from stimulation of cGMP in T-84 cells. The structure, or more importantly the antigenic epitope topology, of the STa toxoid presented by toxoid fusions would affect induction of neutralizing anti-STa antibodies. But the cause of variation in immune responses among mice immunized with the same antigen is unclear momently. Immunogenicity of STa toxoids, even enhanced after fused to a strongly immunogenic carrier protein, could be still relatively moderate. That could attribute to inconsistence towards interactions between the STa antigenic domain and host cells, and likely induction of host immune responses in individual mice. Future studies to comparatively examine toxoid fusions, instead of STa toxoids (as STa toxoid topology could be altered after being fused to an LT toxoid), for affinity (or reactivity) to antibodies against native STa can help us to identify fusion antigens with maximum anti-STa immunogenicity to induce antibodies strongly neutralizing against native STa. It should be noted that neutralizing activities against STa (and CT) from antibodies elicited by this toxoid fusion was only assessed in vitro , future in vivo studies including infant suckling mouse assays and piglet challenge studies will be needed to better evaluate elicited anti-STa antibodies. Data from this study indicated that STa A14Q is a good candidate for LT-STa toxoid fusion antigen to elicit neutralizing anti-STa antibodies. But they may also suggest that other modified STa molecules, such as those having mutation at amino acids other than the 8 th , 12 th , 13 th , 14 th , 16 th and 17 th , or mutations at the same position but with alternative amino acid replacements, may also become STa toxoids and elicit neutralizing anti-STa antibodies when fused to an LT toxoid or other protein carriers. Constructing a STa toxoid or STa-LT toxoid fusion library and thoroughly screening these candidates for not only toxicity reduction but also retention of native STa antigenic structure or topology, a project currently carried out by the STa Toxoid Vaccine Consortium group, may help us to identify optimal STa toxoids for genetic fusions or chemical conjugations to elicit strongly protective anti-STa antibodies. The tmLT was used to construct the toxoid fusion antigen in this study because it was less toxic based on the results from intracellular cAMP ELISA assays in T-84 cells, although the cAMP level in T-84 cells incubated with tmLT was not significantly different than those incubated with LT S63K (p=0.24) or LT S63K/R192G (p=0.21), but significantly different compared to dmLT (p=0.046). No studies were carried out to directly compare toxicity of 3xSTa A14Q -tmLT with 3xSTa A14Q -dmLT or 3xSTa A14Q -LT R192G in this study. It is likely that none of these fusions retain LT toxicity, especially considering that only the monomeric LT molecule was presented in these fusions. As toxoid fusion 3xSTa A14Q -tmLT did not stimulate an increase of either cAMP or cGMP level in T-84 cells, and mice showed no adverse effects after immunization, this fusion can be considered a safe antigen. Results from IP immunization studies indicated this tmLT maintained LT immunogenicity as neutralizing anti-LT antibodies were developed in mice immunized with the toxoid fusion (with Freund's adjuvant), thus tmLT is suitable to construct genetic fusions or chemical conjugates for inducing anti-LT immunity and enhancing anti-STa immunity. IN immunization studies, however, showed that mice immunized with this toxoid fusion antigen alone did not stimulate detectable immune responses to LT or STa, unless CT adjuvant was included. That could be caused by the fact that this monomeric toxoid fusion antigen no longer formed a pentamer LT B structure and did not bind effectively to host ganglioside (GM) receptors as LT B pentamer or LT holotoxin did. Binding to GM receptors at host epithelial cells is believed to enhance antigens uptake and stimulation of host mucosal immune responses. On the other hand, binding to gangliosides and then retrograde neuronal transportation of IN administrated LT toxoid LT S63K were believed to cause the undesirable Bell's palsy to human volunteers [ 31 ]. Since it does not effectively bind to ganglioside GM 1 , this toxoid fusion antigen may not cause Bell's palsy if taken intranasally by human volunteers, but would induce anti-LT and anti-STa immunity at the presence of a proper adjuvant. That may provide helpful information to solve the dilemma in developing IN immunized ETEC vaccines. CT (2µg) was used as adjuvant for IN immunization in this study. CT was commonly used as an adjuvant in oral, intragastric and epicutaneous immunization [ 32 - 36 ], as well as in IN immunization [ 37 - 39 ]. Data from this study suggested that CT is a very effective adjuvant for IN immunization, as mice IN immunized with the toxoid fusion with CT developed strong immune responses to LT and STa toxins, whereas those immunized with the toxoid fusion alone did not. Unfortunately, due to the high homology between CT and LT, we were unable to differentiate immune responses induced by the LT of the fusion toxoid or the CT adjuvant. Future studies using alternative adjuvants, like monophosphoryl lipid A (MPL), flagellin or others, instead of CT, may help us to better assess induction of anti-LT immunity by this toxoid fusion antigen through the IN route. On the other hand, because of their homology, anti-CT or anti-LT immunity is cross protective; therefore, immunity, whether induced by the toxoid fusion or CT adjuvant, can protect against ETEC LT toxin. CT was also used as the coating antigen to titrate anti-LT antibodies or the toxin to examine anti-LT antibody neutralization activity in this study. The structure homology between CT and LT made the commercially available CT commonly used for anti-LT antibody titration. Although LT is recently also commercially available, CT is still preferred for in vitro anti-LT antibody neutralization assays as CT is more potent in stimulating cAMP levels in T-84 cells. This toxoid fusion antigen was also sublingually (SL) administrated to a group of 10 mice. However, in contrast to early studies that showed mice developed strong systemic and mucosal immunity after being SL immunized with LT or CT antigens [ 40 - 44 ], mice SL immunized with toxoid fusion 3xSTa A14Q -tmLT (with CT adjuvant) had only anti-STa and anti-LT IgA in the intestine washes, and anti-LT IgG in serum detected. In addition, only antibodies in the serum samples were found to neutralize CT toxin (data not shown). However, in this study, SL administration was carried out without anesthesia, which likely resulted in that the given fusion antigen (40 µg) being swallowed by the mice and thus not effectively delivered to sublingual glands. Under anesthesia, mice would have had antigens effectively delivered and had the given antigens a prolonged stay at sublingual areas to induce robust immune responses. Future studies to SL immunize mice under anesthesia will better assess immunogenicity of this toxoid fusion antigen through the SL route. We modified antibody titration ELISA assays in this study, with more stringent blocking, additional washes and use of different microtiter plates (for anti-LT), to eliminate background readings. In the previous study [ 22 ], antibody titration data from intestinal wash samples had to be excluded due to background readings. Stringent blocking and additional wash steps clearly reduced ELISA background readings. But on the other hand, the stringent blocking and washing procedures likely resulted in low or no detection of anti-STa and anti-LT antibodies from the fecal suspension samples, and also the lack of detection of anti-STa antibodies in some immunized mice. The nature of low antibodies presented in fecal samples may directly attributed to a low detection of anti-STa antibodies in the fecal samples of the immunized mice. Future studies performing kinetic ELISA instead of endpoint measurement may help to detect immune responses from the fecal suspension samples. Unexpectedly, anti-STa antibodies were detected from one mouse in the IP control group ( Figure 3 ). It was unclear to us what caused the outcome, especially since anti-LT antibodies were not detected in this mouse. Knowing only STa A14Q toxoid was studied in this study, we realized that this 3xSTa A14Q -tmLT may not necessarily be the optimal fusion antigen for ETEC vaccine development. Continuous studies to evaluate STa toxoids and STa-LT toxoid fusions in eliciting neutralizing anti-STa antibodies will help us to identify optimal toxoid fusion antigen(s) for ETEC vaccines development. Nevertheless, results from this study indicated that: 1) LT-STa toxoid fusions are proper antigens to induce protective immunity against ETEC toxins; 2) this STa A14Q toxoid is a better candidate for constructing LT-STa toxoid fusions to elicit neutralizing anti-STa antibodies; and 3) additional copies of STa toxoid enhanced the toxoid fusion for anti-STa immunogenicity. That suggested this 3xSTa A14Q -tmLT fusion antigen can be potentially used in vaccine development against ETEC diarrhea. In addition, the approach of fusing multiple copies of a small and poorly immunogenic antigen to further enhance its immunogenicity may be useful in general vaccine development.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8484440/

EPAC2 acts as a negative regulator in Matrigel-driven tubulogenesis of human microvascular endothelial cells

Angiogenesis is physiologically essential for embryogenesis and development and reinitiated in adult animals during tissue growth and repair. Forming new vessels from the walls of existing vessels occurs as a multistep process coordinated by sprouting, branching, and a new lumenized network formation. However, little is known regarding the molecular mechanisms that form new tubular structures, especially molecules regulating the proper network density of newly formed capillaries. This study conducted microarray analyses in human primary microvascular endothelial cells (HMVECs) plated on Matrigel. The RAPGEF4 gene that encodes exchange proteins directly activated by cAMP 2 (EPAC2) proteins was increased in Matrigel-driven tubulogenesis. Tube formation was suppressed by the overexpression of EPAC2 and enhanced by EPAC2 knockdown in endothelial cells. Endothelial cell morphology was changed to round cell morphology by EPAC2 overexpression, while EPAC2 knockdown showed an elongated cell shape with filopodia-like protrusions. Furthermore, increased EPAC2 inhibited endothelial cell migration, and ablation of EPAC2 inversely enhanced cell mobility. These results suggest that EPAC2 affects the morphology and migration of microvascular endothelial cells and is involved in the termination and proper network formation of vascular tubes. Introduction Angiogenesis, the process by which new vascular networks are formed from preexisting capillaries, is physiologically essential for embryogenesis and development. It is reinitiated in adult animals during tissue growth and repair processes, such as wound healing and menstrual cycle 1 . It also plays a vital role in the progression of various pathological conditions, such as cancer growth and metastasis, diabetic retinopathy, and rheumatoid arthritis 1 . The formation of new vessels from the walls of existing vessels occurs as a multistep process coordinated by sprouting, branching, and new lumenized network formation. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is the most potent angiogenic activator, and the initiation and progression of vessel formation are now well understood 2 . The tip cells, which produce many filopodia, lead to sprouting; and the stalk cells follow the tip cells. Consequently, the tight endothelial cell–cell adhesion is disrupted, and the stalk cells proliferate and migrate to form the vascular lumen. It has been reported that the tip and stalk cells differ in their gene expression profile, suggesting that they have specialized functions during sprouting angiogenesis 2 . However, little is known regarding the molecular mechanisms in the tubular structure formation, especially molecules in terminating angiogenesis and proper network formation of vascular tubes. Several in vitro models have been developed to investigate the angiogenic states 3 , 4 . Specific angiogenesis models of angiogenesis are the capillary-like structure formation of endothelial cells 5 . Endothelial cells can form tubules on a gel composed of extracted basement membrane derived from mouse Engelbreth–Kolm–Swarm sarcoma (Matrigel). The Matrigel, whose primary component is laminin, can initiate endothelial cell tube formation. The capillary-like structure of endothelial cells contains a lumen surrounded by cells. The advantage of this model is that the molecular dissection of the tube formation can be unveiled because the differentiated cells are compared with undifferentiated, proliferating cells. Some studies have been conducted to investigate the differential gene expression in endothelial cells using the Matrigel 6 – 8 . Although these studies have described some candidate genes as relevant to the tube formation, crucial genes remain unidentified. Exchange proteins directly activated by cAMP (EPAC) is a family of guanine nucleotide exchange factor (GEF) for the small GTPases, Raps (Rap1 and Rap2) 9 . EPACs activate Raps by stimulating guanine nucleotide exchange in a cAMP-dependent manner. Raps regulate actin cytoskeletal dynamics, such as integrin-mediated cell adhesion and cadherin-mediated formation of cell junctions 10 , 11 . There are two isoforms of EPAC, EPAC1 and EPAC2, coded by RAPGEF3 and RAPGEF4 genes, respectively. Although their amino acid similarity is less than 50%, they have the same regulatory and catalytic domains 9 , 12 , 13 . cAMP binding to the regulatory domain induces a dynamic conformational change and stabilizes the open conformation, allowing the catalytic domain to interact with the substrate, Raps. EPAC1 expression is relatively ubiquitous 14 and involved in a myriad of physiological functions. Notably, functional roles in the cardiovascular system are well-studied 15 . EPAC2 is primarily expressed in the brain and adrenal gland with limited levels in the heart, small intestine, and testis 14 . The prominent roles of EPAC2 are insulin and glucagon secretion in the pancreatic islets and neurotransmitter release in the brain 13 , 16 – 18 . However, EPAC2 expressions and functions in endothelial cells remain elusive. This study investigated the differential gene expression of tube-forming endothelial cells versus monolayer cultured cells using microarray analysis and identified EPAC2 as a novel angiogenic regulator. EPAC2 regulates endothelial cell morphology and cell migration activity and negatively controls the angiogenic processes, resulting in adequate vascular networks. Results Microarray analysis of gene expression during the tube formation of human primary microvascular endothelial cells (HMVECs) HMVECs form capillary-like structures on the Matrigel (Matrigel-driven tubulogenesis). It comprises of an early attachment and migration phase lasting for approximately 2 h and reorganization and capillary formation phase extending for 2–8 h followed by a breakdown after 24 h (Fig. 1 a). To identify genes that are involved in capillary-like structure formation in HMVECs, we performed microarray analyses. HMVECs on Matrigel after 8 h post-plating were compared with monolayer cultured HMVECs which were inoculated on a plate. One hundred and fifty-one genes were differentially expressed in the two independent experiments with more than a 1.8-fold change (Supplementary Table S1 online ). Among them, 87 genes were upregulated, and 64 genes were downregulated. According to previous reports 19 , 20 , matrix metallopeptidase 10 (MMP10) expression was relatively highly upregulated (Fig. 1 b). Notably, the RAPGEF4 gene, which encodes the EPAC2 proteins, was increased in Matrigel-driven tubulogenesis (Fig. 1 b). EPAC2 has not been identified as a tubulogenesis-related protein so far. Furthermore, Rap1, a substrate of EPAC2, regulates actin cytoskeletal dynamics and is involved in angiogenesis 10 . Thus, we focused on EPAC2 and analyzed its functions in tube formation. Figure 1 Gene expression analysis of HMVECs during in vitro tube formation on Matrigel. ( a ) HMVECs were plated on Matrigel and observed at the indicated time. Cells were cultured in 0.5% FBS/HMEB2 medium containing 30 ng/mL of VEGF. Scale bars: 200 μm. ( b ) Gene expression profiling of HMVECs in Matrigel-driven tubulogenesis was analyzed by DNA microarray. Tube formation of HMVECs was performed in 0.5% FBS/HMEB2 medium containing 30 ng/mL of VEGF. Total RNAs from 8 h after cell culture were prepared, and DNA microarray analyses were performed as described in the Methods section. Gene expression signals during tube formation were compared with those of monolayer cultured cells. Listed genes showed higher fold changes of the average (Av.) of the two independent experiments (Exp 1 and Exp 2). EPAC2 is upregulated in Matrigel-driven tubulogenesis RT-qPCR was conducted to confirm the upregulation of EPAC2 during tube formation. EPAC2 expression during tubulogenesis was increased 7.3-fold compared with the control monolayer cultured HMVECs (Fig. 2 a). In the time-course experiment, EPAC2 was induced at 2 h after plating on Matrigel and peaked at 6–8 h, suggesting that EPAC2 expression is not induced by Matrigel but driven during capillary formation and reorganization (Fig. 2 b). Matrigel-driven tubulogenesis experiments shown in Figs. 1 a and 2 a were conducted in the presence of VEGF, but the monolayer HMVECs, the control, were cultured without VEGF. Thus, we examined whether VEGF is necessary for forming capillary-like structures in endothelial cells. When HMVECs were cultured on Matrigel with or without VEGF, there was no difference in the tube length (Fig. 2 c). Furthermore, EPAC2 was upregulated during tube formation with and without VEGF (Fig. 2 d), suggesting that EPAC2 upregulation depends on tube formation itself but not VEGF. We also observed an increase in EPAC2 expression in telomerase-immortalized microvascular endothelial (TIME) cells (Fig. 2 e). These data suggest that EPAC2 is involved in tube formation in microvascular endothelial cells. Figure 2 EPAC2 expression in endothelial cells during in vitro tube formation. ( a ) RT-qPCR confirmed EPAC2 expression during tube formation. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). ( b ) Time-course experiment of the EPAC2 expression. HMVECs were cultured on Matrigel in the presence of VEGF, and total RNAs were prepared at the indicated time. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). *** P < 0.001 versus 0 h. ( c ) VEGF is not necessary for the tube formation of HMVECs. HMVECs were cultured on Matrigel in the presence or absence of VEGF, and tube lengths were analyzed at 8 h as described in the Methods section (n = 10). The box represents the 25–75th percentiles, and the median is indicated. The whiskers show the maximum and minimum values. Scale bars: 200 μm. ( d ) EPAC2 expression was increased by tube formation but not VEGF. HMVECs were cultured on Matrigel in the presence or absence of VEGF for 8 h, and RT-qPCR was used to analyze EPAC2 mRNA levels. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). ( e ) EPAC2 expression was increased in HMVECs and TIME cells. HMVECs and TIME cells were cultured on Matrigel in the presence or absence of VEGF for 8 h, and RT-qPCR was used to analyze EPAC2 mRNA levels. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). EPAC2B and EPAC2C isoforms are induced during tube formation There are two EPAC isoforms, EPAC1 and EPAC2 (Fig. 3 a). In our experiments, only EPAC2 was upregulated, and EPAC1 was not upregulated during tube formation in HMVECs and TIME cells (Supplementary Fig. S1 online). EPAC2 has three variants, EPAC2A, EPAC2B, and EPAC2C (Fig. 3 a). To examine which variant is induced during tube formation, RT-PCR was conducted using specific primers for each variant (Table 1 and Supplementary Fig. S2 online). EPAC2A was slightly increased during tube formation in HMVECs (Fig. 3 b) and TIME cells (Fig. 3 c). In contrast, EPAC2B and EPAC2C expressions were enhanced during tube formation, suggesting that EPAC2B and EPAC2C are isoforms induced during tube formation (Fig. 3 b,c, and Supplementary Fig. S3 online). Furthermore, the induction of these isoforms was independent of VEGF in HMVECs and TIME cells (Fig. 3 b,c). The time-course study also demonstrated that EPAC2B and EPAC2C were increased at 2 h after plating on Matrigel and peaked at 6–8 h, as seen in Fig. 2 b (Fig. 3 d). These results indicated that EPAC2B and EPAC2C are involved in tube formation of microvascular endothelial cells. Figure 3 EPAC2 isoform expression in endothelial cells in the in vitro tube formation. ( a ) Schematic representation of EPAC1 and EPAC2 isoforms. EPAC1 and EPAC2 have an N-terminal regulatory region and a C-terminal catalytic region. The regulatory region comprises one or two cyclic nucleotide binding domains (CNB) and a DEP (Disheveled, Egl-10, and Pleckstrin) domain. The catalytic region contains a Ras exchange motif (REM), a Ras association (RA) domain, and a CDC25 homology domain (CDC25-HD). EPAC2A has two CNBs, but EPAC1, EPAC2B, and EPAC2C only have a CNB. ( b,c ) RT-PCR analysis of EPAC2 isoforms using isoform-specific primers. HMVECs ( b ) and TIME cells ( c ) were cultured on Matrigel in the presence or absence of VEGF for 8 h, and RT-PCR was performed using variant-specific primers. Band intensity was quantified, and data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). ( d ) Time-course experiment of the EPAC2 isoform expression. HMVECs were cultured on Matrigel in the presence of VEGF, and total RNAs were prepared at the indicated time. Band intensity was quantified and data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). * P < 0.05, ** P < 0.01, and *** P < 0.001 versus 0 h. Full-length gels are presented in Supplementary Fig. S4 . Table 1 Primers for RT-PCR and oligonucleotides for shRNA. Target gene Sequence RAPGEF4 variant 1 (EPAC2A) 5′-GATCCAGCGAAGATGTGGAT-3′ 5′-CACCATAAGGAGGAGCCAGA-3′ RAPGEF4 variant 2 (EPAC2B) 5′-AACCATCAGCACCAGTTTCC-3′ 5′-CACCATAAGGAGGAGCCAGA-3′ RAPGEF4 variant 3 (EPAC2C) 5′-GCTGACACGTGCTTCCATGT-3′ 5′-GTCATCCACAGTCCTCTGGCCA-3′ shRNA for control 5′-TAGCGACTAAACACATCAA-3′ shRNA for EPAC2 5′-TCAGTGAATGTAGTCATTT-3′ 5′-GTTCATTGACAATCTAGTAAA-3′ 5′-GAGTTATGTACGGCAATTAAA-3′ EPAC2 suppresses tube formation of microvascular endothelial cells To determine the roles of EPAC2 in tube formation, we examined the effects of EPAC2 overexpression or knockdown on tube formation in TIME cells. Although EPAC2B and EPAC2C were increased during tube formation (Fig. 3 b,c), only the effects of EPAC2B were investigated in this study because both proteins are responsive to cAMP due to their CNB-B domain. TIME cells were transduced by lentiviruses encoding EPAC2B or shRNAs for EPAC2, followed by sorting cells expressing GFP. EPAC2 expression was increased 25-fold in overexpressing cells (Fig. 4 a) and decreased by 30% in knockdown cells (Fig. 4 b). Because endogenous EPAC2 protein expression was hardly detectable due to the lower expression levels in the control state (Supplementary Fig. S3 online), EPAC2 knockdown was confirmed in EPAC2-overexpressing HEK293T cells (Fig. 4 c). As shown in Fig. 4 d,e, EPAC2 expression significantly affected tube formation in TIME cells. EPAC2 overexpression suppressed tube formation, as shown by the short tube length and large polygonal area (Fig. 4 d). Alternatively, EPAC2 knockdown oppositely enhanced tube formation with a smaller polygonal area than the control (Fig. 4 e). Additionally, we examined the effects of Forskolin, a drug that induces cAMP formation by activating adenylyl cyclase, on tube formation. It is reported that Forskolin induces Rap1 activation via EPAC in endothelial cells 11 . HMVECs on Matrigel containing Forskolin failed to form an appropriate mesh structure (Supplementary Fig. S5 online), suggesting that EPAC2 activation by cAMP is involved in tube formation via Rap1 activation. These results suggest that EPAC2 negatively regulates dense mesh organization during tube formation. Figure 4 EPAC2 modulates tube formation on Matrigel. ( a,b ) EPAC2 expression in EPAC2 overexpressing ( a ) and knockdown ( b ) TIME cells. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). ( c ) Protein levels of EPAC2 expression. EPAC2 suppression was confirmed in EPAC2 overexpressing HEK293T cells. ( d,e ) Tube formation was suppressed by EPAC2 overexpression ( d ) and facilitated by EPAC2 knockdown ( e ). EPAC2 overexpressing or knockdown TIME cells were cultured on Matrigel in the absence of VEGF, and tube lengths and polygonal areas were analyzed at 8 h as described in the Methods section (n = 10). The box represents the 25–75th percentiles, and the median is indicated. The whiskers show the maximum and minimum values. The same results were obtained in at least three independent experiments. Scale bars: 200 μm. Full-length blots are presented in Supplementary Fig. S6 . EPAC2 affects cell morphology and migration in microvascular endothelial cells Given that EPAC2 negatively affects the tube formation in microvascular endothelial cells, we examined the effect of EPAC2 expression on cell morphology. EPAC2 overexpression and knockdown led to a remarkable morphological change in TIME cells (Fig. 5 a,b). Thus, EPAC2 overexpression likely changed endothelial cells to a round cell morphology (Fig. 5 a). Furthermore, EPAC2 knockdown strikingly showed an elongated cell shape with filopodia-like protrusions like tip cells (Fig. 5 b). To examine whether EPAC2 overexpression or knockdown affects cell proliferation, we measured cell numbers after two days of inoculation of monolayer cultures. As shown in Fig. 5 c, neither EPAC2 overexpression nor EPAC2 knockdown changed the cell proliferation rate, suggesting that endothelial cell proliferation is unaffected by EPAC2. Alternatively, we measured migration distance using scratch assay (Fig. 5 d,e). The distance between the cell edges was extended in EPAC2 overexpression (Fig. 5 d) and narrowed in EPAC2 knockdown (Fig. 5 e). These results suggest that EPAC2 prevents cell migration but not proliferation. Figure 5 EPAC2 regulates cell migration of endothelial cells. ( a,b ) Cell morphology in EPAC2 overexpressing ( a ) and knockdown ( b ) TIME cells. Images were taken using phase contrast (upper panel) and fluorescence microscopy (lower panel). Representative cell shapes are surrounded by dotted lines. Filopodia-like protrusions are indicated with arrowheads. Scale bars: 50 μm. ( c ) Cell proliferation was evaluated as described in the Methods section. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 6). ( d,e ) Cell migration of TIME cells was blocked by EPAC2 overexpression ( d ) and accelerated by EPAC2 knockdown ( e ). Cells were scratched and followed by culture for 12 h. Data were expressed as mean ± S.E.M. (d; n = 24 and e; n = 18). Scale bars: 200 μm. Microarray analysis of gene expression during the tube formation of human primary microvascular endothelial cells (HMVECs) HMVECs form capillary-like structures on the Matrigel (Matrigel-driven tubulogenesis). It comprises of an early attachment and migration phase lasting for approximately 2 h and reorganization and capillary formation phase extending for 2–8 h followed by a breakdown after 24 h (Fig. 1 a). To identify genes that are involved in capillary-like structure formation in HMVECs, we performed microarray analyses. HMVECs on Matrigel after 8 h post-plating were compared with monolayer cultured HMVECs which were inoculated on a plate. One hundred and fifty-one genes were differentially expressed in the two independent experiments with more than a 1.8-fold change (Supplementary Table S1 online ). Among them, 87 genes were upregulated, and 64 genes were downregulated. According to previous reports 19 , 20 , matrix metallopeptidase 10 (MMP10) expression was relatively highly upregulated (Fig. 1 b). Notably, the RAPGEF4 gene, which encodes the EPAC2 proteins, was increased in Matrigel-driven tubulogenesis (Fig. 1 b). EPAC2 has not been identified as a tubulogenesis-related protein so far. Furthermore, Rap1, a substrate of EPAC2, regulates actin cytoskeletal dynamics and is involved in angiogenesis 10 . Thus, we focused on EPAC2 and analyzed its functions in tube formation. Figure 1 Gene expression analysis of HMVECs during in vitro tube formation on Matrigel. ( a ) HMVECs were plated on Matrigel and observed at the indicated time. Cells were cultured in 0.5% FBS/HMEB2 medium containing 30 ng/mL of VEGF. Scale bars: 200 μm. ( b ) Gene expression profiling of HMVECs in Matrigel-driven tubulogenesis was analyzed by DNA microarray. Tube formation of HMVECs was performed in 0.5% FBS/HMEB2 medium containing 30 ng/mL of VEGF. Total RNAs from 8 h after cell culture were prepared, and DNA microarray analyses were performed as described in the Methods section. Gene expression signals during tube formation were compared with those of monolayer cultured cells. Listed genes showed higher fold changes of the average (Av.) of the two independent experiments (Exp 1 and Exp 2). EPAC2 is upregulated in Matrigel-driven tubulogenesis RT-qPCR was conducted to confirm the upregulation of EPAC2 during tube formation. EPAC2 expression during tubulogenesis was increased 7.3-fold compared with the control monolayer cultured HMVECs (Fig. 2 a). In the time-course experiment, EPAC2 was induced at 2 h after plating on Matrigel and peaked at 6–8 h, suggesting that EPAC2 expression is not induced by Matrigel but driven during capillary formation and reorganization (Fig. 2 b). Matrigel-driven tubulogenesis experiments shown in Figs. 1 a and 2 a were conducted in the presence of VEGF, but the monolayer HMVECs, the control, were cultured without VEGF. Thus, we examined whether VEGF is necessary for forming capillary-like structures in endothelial cells. When HMVECs were cultured on Matrigel with or without VEGF, there was no difference in the tube length (Fig. 2 c). Furthermore, EPAC2 was upregulated during tube formation with and without VEGF (Fig. 2 d), suggesting that EPAC2 upregulation depends on tube formation itself but not VEGF. We also observed an increase in EPAC2 expression in telomerase-immortalized microvascular endothelial (TIME) cells (Fig. 2 e). These data suggest that EPAC2 is involved in tube formation in microvascular endothelial cells. Figure 2 EPAC2 expression in endothelial cells during in vitro tube formation. ( a ) RT-qPCR confirmed EPAC2 expression during tube formation. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). ( b ) Time-course experiment of the EPAC2 expression. HMVECs were cultured on Matrigel in the presence of VEGF, and total RNAs were prepared at the indicated time. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). *** P < 0.001 versus 0 h. ( c ) VEGF is not necessary for the tube formation of HMVECs. HMVECs were cultured on Matrigel in the presence or absence of VEGF, and tube lengths were analyzed at 8 h as described in the Methods section (n = 10). The box represents the 25–75th percentiles, and the median is indicated. The whiskers show the maximum and minimum values. Scale bars: 200 μm. ( d ) EPAC2 expression was increased by tube formation but not VEGF. HMVECs were cultured on Matrigel in the presence or absence of VEGF for 8 h, and RT-qPCR was used to analyze EPAC2 mRNA levels. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). ( e ) EPAC2 expression was increased in HMVECs and TIME cells. HMVECs and TIME cells were cultured on Matrigel in the presence or absence of VEGF for 8 h, and RT-qPCR was used to analyze EPAC2 mRNA levels. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). EPAC2B and EPAC2C isoforms are induced during tube formation There are two EPAC isoforms, EPAC1 and EPAC2 (Fig. 3 a). In our experiments, only EPAC2 was upregulated, and EPAC1 was not upregulated during tube formation in HMVECs and TIME cells (Supplementary Fig. S1 online). EPAC2 has three variants, EPAC2A, EPAC2B, and EPAC2C (Fig. 3 a). To examine which variant is induced during tube formation, RT-PCR was conducted using specific primers for each variant (Table 1 and Supplementary Fig. S2 online). EPAC2A was slightly increased during tube formation in HMVECs (Fig. 3 b) and TIME cells (Fig. 3 c). In contrast, EPAC2B and EPAC2C expressions were enhanced during tube formation, suggesting that EPAC2B and EPAC2C are isoforms induced during tube formation (Fig. 3 b,c, and Supplementary Fig. S3 online). Furthermore, the induction of these isoforms was independent of VEGF in HMVECs and TIME cells (Fig. 3 b,c). The time-course study also demonstrated that EPAC2B and EPAC2C were increased at 2 h after plating on Matrigel and peaked at 6–8 h, as seen in Fig. 2 b (Fig. 3 d). These results indicated that EPAC2B and EPAC2C are involved in tube formation of microvascular endothelial cells. Figure 3 EPAC2 isoform expression in endothelial cells in the in vitro tube formation. ( a ) Schematic representation of EPAC1 and EPAC2 isoforms. EPAC1 and EPAC2 have an N-terminal regulatory region and a C-terminal catalytic region. The regulatory region comprises one or two cyclic nucleotide binding domains (CNB) and a DEP (Disheveled, Egl-10, and Pleckstrin) domain. The catalytic region contains a Ras exchange motif (REM), a Ras association (RA) domain, and a CDC25 homology domain (CDC25-HD). EPAC2A has two CNBs, but EPAC1, EPAC2B, and EPAC2C only have a CNB. ( b,c ) RT-PCR analysis of EPAC2 isoforms using isoform-specific primers. HMVECs ( b ) and TIME cells ( c ) were cultured on Matrigel in the presence or absence of VEGF for 8 h, and RT-PCR was performed using variant-specific primers. Band intensity was quantified, and data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). ( d ) Time-course experiment of the EPAC2 isoform expression. HMVECs were cultured on Matrigel in the presence of VEGF, and total RNAs were prepared at the indicated time. Band intensity was quantified and data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). * P < 0.05, ** P < 0.01, and *** P < 0.001 versus 0 h. Full-length gels are presented in Supplementary Fig. S4 . Table 1 Primers for RT-PCR and oligonucleotides for shRNA. Target gene Sequence RAPGEF4 variant 1 (EPAC2A) 5′-GATCCAGCGAAGATGTGGAT-3′ 5′-CACCATAAGGAGGAGCCAGA-3′ RAPGEF4 variant 2 (EPAC2B) 5′-AACCATCAGCACCAGTTTCC-3′ 5′-CACCATAAGGAGGAGCCAGA-3′ RAPGEF4 variant 3 (EPAC2C) 5′-GCTGACACGTGCTTCCATGT-3′ 5′-GTCATCCACAGTCCTCTGGCCA-3′ shRNA for control 5′-TAGCGACTAAACACATCAA-3′ shRNA for EPAC2 5′-TCAGTGAATGTAGTCATTT-3′ 5′-GTTCATTGACAATCTAGTAAA-3′ 5′-GAGTTATGTACGGCAATTAAA-3′ EPAC2 suppresses tube formation of microvascular endothelial cells To determine the roles of EPAC2 in tube formation, we examined the effects of EPAC2 overexpression or knockdown on tube formation in TIME cells. Although EPAC2B and EPAC2C were increased during tube formation (Fig. 3 b,c), only the effects of EPAC2B were investigated in this study because both proteins are responsive to cAMP due to their CNB-B domain. TIME cells were transduced by lentiviruses encoding EPAC2B or shRNAs for EPAC2, followed by sorting cells expressing GFP. EPAC2 expression was increased 25-fold in overexpressing cells (Fig. 4 a) and decreased by 30% in knockdown cells (Fig. 4 b). Because endogenous EPAC2 protein expression was hardly detectable due to the lower expression levels in the control state (Supplementary Fig. S3 online), EPAC2 knockdown was confirmed in EPAC2-overexpressing HEK293T cells (Fig. 4 c). As shown in Fig. 4 d,e, EPAC2 expression significantly affected tube formation in TIME cells. EPAC2 overexpression suppressed tube formation, as shown by the short tube length and large polygonal area (Fig. 4 d). Alternatively, EPAC2 knockdown oppositely enhanced tube formation with a smaller polygonal area than the control (Fig. 4 e). Additionally, we examined the effects of Forskolin, a drug that induces cAMP formation by activating adenylyl cyclase, on tube formation. It is reported that Forskolin induces Rap1 activation via EPAC in endothelial cells 11 . HMVECs on Matrigel containing Forskolin failed to form an appropriate mesh structure (Supplementary Fig. S5 online), suggesting that EPAC2 activation by cAMP is involved in tube formation via Rap1 activation. These results suggest that EPAC2 negatively regulates dense mesh organization during tube formation. Figure 4 EPAC2 modulates tube formation on Matrigel. ( a,b ) EPAC2 expression in EPAC2 overexpressing ( a ) and knockdown ( b ) TIME cells. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 3). ( c ) Protein levels of EPAC2 expression. EPAC2 suppression was confirmed in EPAC2 overexpressing HEK293T cells. ( d,e ) Tube formation was suppressed by EPAC2 overexpression ( d ) and facilitated by EPAC2 knockdown ( e ). EPAC2 overexpressing or knockdown TIME cells were cultured on Matrigel in the absence of VEGF, and tube lengths and polygonal areas were analyzed at 8 h as described in the Methods section (n = 10). The box represents the 25–75th percentiles, and the median is indicated. The whiskers show the maximum and minimum values. The same results were obtained in at least three independent experiments. Scale bars: 200 μm. Full-length blots are presented in Supplementary Fig. S6 . EPAC2 affects cell morphology and migration in microvascular endothelial cells Given that EPAC2 negatively affects the tube formation in microvascular endothelial cells, we examined the effect of EPAC2 expression on cell morphology. EPAC2 overexpression and knockdown led to a remarkable morphological change in TIME cells (Fig. 5 a,b). Thus, EPAC2 overexpression likely changed endothelial cells to a round cell morphology (Fig. 5 a). Furthermore, EPAC2 knockdown strikingly showed an elongated cell shape with filopodia-like protrusions like tip cells (Fig. 5 b). To examine whether EPAC2 overexpression or knockdown affects cell proliferation, we measured cell numbers after two days of inoculation of monolayer cultures. As shown in Fig. 5 c, neither EPAC2 overexpression nor EPAC2 knockdown changed the cell proliferation rate, suggesting that endothelial cell proliferation is unaffected by EPAC2. Alternatively, we measured migration distance using scratch assay (Fig. 5 d,e). The distance between the cell edges was extended in EPAC2 overexpression (Fig. 5 d) and narrowed in EPAC2 knockdown (Fig. 5 e). These results suggest that EPAC2 prevents cell migration but not proliferation. Figure 5 EPAC2 regulates cell migration of endothelial cells. ( a,b ) Cell morphology in EPAC2 overexpressing ( a ) and knockdown ( b ) TIME cells. Images were taken using phase contrast (upper panel) and fluorescence microscopy (lower panel). Representative cell shapes are surrounded by dotted lines. Filopodia-like protrusions are indicated with arrowheads. Scale bars: 50 μm. ( c ) Cell proliferation was evaluated as described in the Methods section. Data were expressed as mean ± S.E.M. (n = 6). ( d,e ) Cell migration of TIME cells was blocked by EPAC2 overexpression ( d ) and accelerated by EPAC2 knockdown ( e ). Cells were scratched and followed by culture for 12 h. Data were expressed as mean ± S.E.M. (d; n = 24 and e; n = 18). Scale bars: 200 μm. Discussion This study investigated the global gene expression changes in Matrigel-driven endothelial cell tubulogenesis and demonstrated that EPAC2 expression was strongly induced in tube-forming microvascular endothelial cells. Among the EPAC2 isoforms, EPAC2B and EPAC2C expressions were specifically increased during tube formation on Matrigel regardless of VEGF existence. EPAC2 suppressed endothelial cell migration and changed endothelial cell morphology, suggesting that EPAC2 acts as a negative regulator of an excessively formed network. Our results also showed that MMP-10, HDAC9, and HECW2 were highly upregulated (Fig. 1 b). It has been reported that MMP-10 is markedly induced during capillary tubular morphogenesis in the three-dimensional (3D) collagen model of vascular morphogenesis 19 , 20 . Endothelial cells may express these proteases for degrading the extracellular matrix to migrate on Matrigel and form a capillary-like structure. HDAC9 has been demonstrated to promote angiogenesis mediated by repressing of the miR-17-92 cluster 21 . The study showed that HDAC9 silencing decreased vessel formation in mice 21 . Furthermore, endothelial cell junctions were stabilized by the endothelial E3 ubiquitin ligase, HECW2, to promote angiogenesis 22 . HECW2 enhances AMOTL1 stability by lysine 63-linked ubiquitination to tighten cell-to-cell junctions 22 . The upregulation of these genes in our study suggested that an angiogenic status was reflected in Matrigel-driven tubulogenesis. In these conditions, we found the RAPGEF4 gene which encodes EPAC2 to be upregulated in endothelial cell tubulogenesis for the first time. Previous gene expression analyses have been performed by inducing capillary-like tubular structures into 3D fibrin matrix or on Matrigel in human umbilical vein endothelial cells or HMVECs 6 – 8 , 23 . Glesne et al. used Matrigel and HMVECs, but they reported the differential gene expression from 0.5 to 4 h post-Matrigel stimulation 7 . Meanwhile, we chose a time-point of 8 h. This time-point is suitable for investigating the gene expression profiling in the maturation of tubulogenesis since the network is completed at approximately 10 h and starts to break after 12 h. Our results demonstrated that EPAC2 expression was induced during tube formation and peaked at 6–8 h. The migration phase at the first 2 h on Matrigel showed the filopodia-like structure and low expression of EPAC2 in HMVECs. The signals from Matrigel and underexpression of EPAC2 may allow endothelial cells to differentiate into the tip cell-like phenotype. Consistent with this idea, the early phase of Matrigel-driven tubulogenesis (by 1 h post-plating) was reported to the increased expression of the tip cell marker, delta-like 4 homologue (Dll4) 7 . Therefore, if Matrigel directly stimulates EPAC2 expression, EPAC2 should be increased immediately after plating. However, EPAC2 expression was induced from 2 h on Matrigel, suggesting that the stimuli could be needed to induce EPAC2 expression in addition to Matrigel. During the reorganization and capillary formation by 8 h post-plating on Matrigel, EPAC2 expression was increased around eightfold compared with the control monolayer culture. Considering that EPAC2 suppressed dense mesh network formation in this study, the function of EPAC2 on tube formation could be the regulation of the proper network density. The tube formation with a proper dense network is thought to be executed by a negative regulator, such as EPAC2. Given the fact that EPAC2 inhibited endothelial cell migration and changed cells to a round morphology, EPAC2 expression could induce endothelial cells that compose capillary structures to lose tip cell-like characteristics and cell migratory capacities. Although EPAC1 and EPAC2 act on the same downstream effectors, Rap1 and Rap2, their functions are mostly nonredundant because of distinct tissue and cellular distribution 9 . EPAC1 is mainly localized in the nuclear membrane and mitochondria 24 . The N-terminal domains are critical for the cellular localization of EPAC2 25 . EPAC2A, the longest isoform with a CNB-A domain (Fig. 3 a), is localized near the plasma membrane, while EPAC2B is primarily present in the cytoplasm with a localization profile similar to EPAC1 25 . The localization of EPAC2C remains unknown. In this study, the EPAC2B and EPAC2C isoforms were induced on Matrigel. Furthermore, EPAC1 expression was not so much different between the control and tube formation, suggesting that EPAC2 acts as a regulator in endothelial cell tube formation. EPAC2B and EPAC2C are expressed mainly in the adrenal gland 14 , 25 , 26 and liver, respectively, but these functions are largely unknown. EPAC2C has only CNB-B domain in regulatory region, but CNB-B region is sufficient to block the EPAC2 catalytic region 27 . This finding suggests that EPAC2C could be activated by cAMP as well as EPAC2B. We demonstrated that EPAC2B acts as a negative regulator of tubulogenesis (Figs. 4 , 5 ); that is, EPAC2B suppresses endothelial cell migration and may prevent excessive tube formation. In contrast, EPAC2 knockdown enhanced cell migration with elongated cell shape, which stimulated tube formation. Consistent with our results, Hong et al. reported that EPAC2 and Rap1 are involved in endothelial cell morphology 28 . The study showed that anthrax edema toxin induces morphological change to a round shape and inhibits VEGF-induced migration but not proliferation in endothelial cells via EPAC2 and Rap1. Also, it has been reported that 8CPT-2Me-cAMP, an agonist for EPAC, induces endothelial actin rearrangement 11 . Therefore, EPAC2-Rap1 signaling could contribute to endothelial cell migration by inducing actin rearrangement, resulting in Matrigel-driven tubulogenesis suppression. Although there are some limitations of the endothelial cell/Matrigel system to mimic the in vivo angiogenic processes, it shows many similar biological processes to in vivo angiogenesis, such as the formation of lumenized structures 5 . Concerning EPAC2, which we identified in this study, its function in in vivo angiogenesis has already been reported. EPACs and Rap1 have previously been demonstrated to inhibit angiogenesis in HMVECs 29 and human dermal microvascular endothelial cells (HDMECs) 30 . One study showed that EPACs activation by 8CPT-2Me-cAMP and constitutive active Rap1 blocked the expression of an inhibitor of DNA binding 1 (Id1) in vivo 29 . Since Id1 suppresses the expression of thrombospondin-1 (TSP1) transcriptionally, EPACs and Rap1 activation increases TSP1 expression. TSP1 is reported to inhibit endothelial cell migration via CD36 or β 1 integlin 31 , 32 , thus indicating the anti-angiogenic effects of EPACs and Rap1 activation 29 . Furthermore, EPAC2 activation by β-adrenoceptors decreased cell migration and tube formation in HDMECs and murine skin wound angiogenesis in vivo 30 . These reports support this study that EPAC2 changes cell morphology and inhibits cell migration in microvascular endothelial cells. EPAC2 knockout (KO) mice have been generated, and KO mice have only subtle phenotype 33 , 34 . Some of these mice were generated by lacking a part of exon 1 and intron 1 of the mouse Rapgef4 gene, resulting in the EPAC2A isoform-deficient mouse 16 , 33 – 36 . A study has made KO mouse by disrupting around exon 7, and consequently EPAC2A and EPAC2B deficiency 37 . It did not mention the status of the mouse and architecture of the vascular network, but KO mouse exhibited unaltered basal cardiac function. Kopperud et al. have generated EPAC2 KO mice by genomic deletion of exons 12–13 of Rapgef4 gene 38 . The study demonstrated that the EPAC2 KO mouse was healthy and fertile and that EPAC2 was dispensable for the basal endothelial permeability without the description of the vascular abnormality. These findings indicate that EPAC2 has only a few contributions to mouse development. Similar to the mild phenotype of EPAC2 KO mice, Rap1a or Rap1b KO mice showed a normal phenotype unless the embryos died in utero 39 , 40 . However, Rap1 deficiency induced defective angiogenesis, endothelial cell migration, and tube formation 41 – 44 . Since Rap1 plays a vital role in cell adhesion and cell–cell junction 10 , 45 , endothelial cell function and angiogenesis are adequately affected by lacking Rap1. Considering that overactivation of Rap1 also inhibits angiogenesis as described above, Rap1 may act as both pro- and anti-angiogenic factors and need to be exquisitely regulated. Dramatic regulation of Rap1 may be unnecessary for maintaining endothelial cell function. Although the functions of endothelial cells in EPAC2 KO mice cannot be declared, EPAC2 may have only modest effects, which are mediated by Rap1, on endothelial cell functions. We demonstrated that tube formation and cell migration were significantly but slightly influenced by EPAC2 overexpression and knockdown in this study, supporting the idea that EPAC2 could finely tune angiogenesis via Rap1. The angiogenic growth factor in the tube formation assay is normally supplemented by VEGF. Matrigel-driven tubulogenesis has not been performed without VEGF so far. However, we showed that a capillary-like structure was built on Matrigel without exogenous VEGF, suggesting that supplemented VEGF is not a driving force of tube formation. Alternatively, a capillary-like structure is not formed on the plate, even if VEGF is treated, indicating that the components of Matrigel are essential for tube formation. Extracellular matrices may be involved in tubulogenesis. Laminin, a major component of Matrigel, induces Dll4 expression and activates the tube formation via integrin in endothelial cells 46 , 47 , suggesting that laminin is a driving force of tube formation. The Dll4 expressing tip cell-like cells induce the differentiation into the stalk cell-like phenotype in neighbors via Dll4-Notch signaling. The control of Notch signaling via Dll4 is involved in the control of tip-stalk cell balance 2 . In this study, EPAC2 isoforms but not EPAC1 were specifically induced during tube formation. EPAC2 isoform expression in different tissues was reported to be regulated by DNA methylation of alternative promoters 26 . However, the mechanism of the transcriptional regulation of EPAC2 expression is unknown. Given that EPAC2 expression was stimulated 2 h after but not just after plating, laminin-integrin signaling is not a direct upstream factor for EPAC2 expression. Instead, the differentiated tip cell- or stalk cell-like cells may produce some factors that induce EPAC2 expression in tip cell-like cells to prevent the formation of the protrusions and cell migration possibly via actin rearrangement as described above. The promoter region of EPAC2B is in intron 4 of the RAPGEF4 gene, and the alternative exon 1b is used for exon 1 of EPAC2B. On the other hand, EPAC2C uses different transcriptional start points in intron 9 of the RAPGEF4 gene and commences translation at the end of exon 10, resulting in the lack of both CNB-A and DEP domains of EPAC2A. It is unclear what cis -elements and regulatory factors govern the specific expression of EPAC2B and EPAC2C, but this needs to be further elucidated. This study indicated for the first time that EPAC2 is involved as a negative regulator in the capillary-like tube formation of microvascular endothelial cells. Although additional studies are needed to clarify the function of EPAC2 in tubulogenesis, these findings have revealed new regulatory features in vascular endothelial cell tube formation. The results obtained in this study may provide new clues to clarify further the mechanisms in regulating capillary-like tube formation and angiogenesis, especially in the proper network formation of vascular tube formation, and for developing therapeutic strategies to treat angiogenesis-related diseases. Methods Cell culture HMVECs (Cascade Biologics Inc.) and TIME cells (#CRL4025, ATCC) were maintained in HuMedia-EB2 (HMEB2) medium supplemented with 5% FBS, 5 ng/mL basic fibroblast growth factor, 10 μg/mL heparin, 10 ng/mL epidermal growth factor, 1 μg/mL hydrocortisone, 39.3 μg/mL (80 µM) dibutyryl cAMP, 50 µg/mL gentamicin and 50 ng/mL amphotericin B (growth medium) according to the manufacturer's instructions (Kurabo Corp., Tokyo Japan). HEK293TN cells (System Biosciences) were maintained in DMEM (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS, 100 IU/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin. Microarray The microarray analysis was performed as previously described 48 . Briefly, cells were cultured on Matrigel for 8 h in a 100-mm plate and washed with 15 mM HEPES/PBS, followed by Matrigel digestion with dispase for 10 min at 37 °C. Cells were lysed with TRIzol and purified using RNeasy Plus mini kit (Qiagen). The RNA quality was determined by the 28S/18S ratios of ribosomal RNA band intensities on electrophoresis gels under denaturation. Subsequently, 300 ng of total RNA was labeled according to the manufacturer's instructions for the GeneChip WT Sense Target Labeling Kit (Affymetrix). Fragmented and labeled cDNAs were then hybridized onto the Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST arrays in a GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix). Arrays were washed and stained using the GeneChip Fluidics Station 450 and detected using a 3000 7G GeneChip Scanner (Affymetrix). All arrays passed the quality control criteria of the Expression Console software (Affymetrix). Raw data CEL files were then normalized using the RMA algorithm, and the data were exported using Expression Console or Gene Spring software version 10.0.1 (Agilent Technologies). RT-qPCR Total RNA was extracted from cells using RNeasy Mini kits (Qiagen). Subsequently, 0.1–0.6 µg aliquots of total RNA samples were reverse transcribed using High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Thermo Fisher Scientific). qPCR was performed using a StepOnePlus Real-Time System (Thermo Fisher Scientific). EPAC2 mRNA levels were measured using TaqMan Gene Expression Assay (Thermo Fisher Scientific: Hs00199754_m1 or Hs00899815_m1). Predeveloped TaqMan Assay Reagent Control kits (Human GAPDH or Human ACTB Endogenous Control, Thermo Fisher Scientific) were used as internal controls. RT-PCR RT-PCR was performed by RT reaction at 55 °C for 30 min, followed by adequate cycles at 94 °C for 15 s, 60 °C for 30 s, and 68 °C for 30 s using a SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific) (primers are listed in Table 1 ). The amounts of RNA and amplification cycle numbers were determined from linear amplification kinetics. DNA band intensity was analyzed and quantified by ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ). Lentivirus production and transduction The coding region of EPAC2B isoform (NM_001100397.2) was amplified by RT-PCR using the Prime Script High Fidelity RT-PCR kit (TaKaRa) and cloned into Nhe I and Not I sites of the pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vector (System Biosciences). shRNA vectors were constructed using the pSIH-H1-copGFP shRNA vector (System Biosciences) by inserting synthetic oligonucleotides listed in Table 1 . Pseudoviral particles were generated by co-transfecting the pCDH vector or pSIH vector and pPACKH1 packaging plasmid mix (System Biosciences) into HEK293TN cells in a 6-well plate using Lipofectamine and Plus Reagent (Life Technologies). A 72 h cultured media supernatant was collected and filtered through a Millex HV 0.45 µm PVDF membrane. Pseudoviral particles were then transduced into TIME cells seeded at a density of 2 × 10 5 cells per well in a 6-well plate. After transduction, higher GFP expressing TIME cells were sorted by GFP intensity using a SH800 Cell Sorter (Sony) and used for experiments. Western blotting Cells were suspended in Laemmli-sample buffer containing 0.2 µM DTT and shredded using a QIA shredder (Qiagen) and heated at 98 °C for 5 min. The resulting protein samples were applied to SDS-PAGE using 7.5% polyacrylamide gel (ATTO). After electrophoresis, proteins were transferred onto PVDF membranes (ATTO) and blocked with 5% skim milk in 0.1% Tween 20/PBS (TPBS). Anti-EPAC2 (5B1, Cell Signaling Technology) or anti-β-actin (Sigma-Aldrich) antibodies in 1% BSA/TPBS were used as primary antibodies, and anti-mouse IgG-HRP (Cell Signaling Technology) or anti-rabbit IgG-HRP (GE Healthcare) in 1% BSA/TPBS were used as secondary antibodies. Protein signals were detected using an ECL Plus Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) using Molecular Dynamics Typhoon 9400 Imager. Tube formation assay The tube formation assay was performed as previously described 49 , 50 . Briefly, growth factor-reduced Matrigel (BD Biosciences) were prepared at the bottom chambers of µ-Slide Angiogenesis ibiTreat (ibidi). 5000 cells of HMVECs and TIME cells in HMEB2 supplemented with 0.5% FBS were added on Matrigel in the presence or absence of 30 ng/mL VEGF 165 (Millipore). Tube structure was observed using ZEISS Axiovert A1 microscope (Zeiss). Tube length and the polygonal area were measured using ImageJ. The positions of sprawling and lined cells were over-drawn with straight lines. The sum of the line lengths from one image in a single well, and then the mean of the sum of tube length from ten images was calculated as tube length. The polygonal area was measured as the mean of the area surrounded by the straight lines from one image, and then the average of the mean of the polygonal area from ten images was calculated. Cell migration assay Lentiviral-transduced TIME cells were seeded at a density of 5 × 10 4 cells per well in a 12-well plate in 1.6 ml of the growth medium. After 4 d, confluent cell layers were scratched and changed to the new growth medium (0 h), and were incubated for 12 h. The distances between one side of the scratch and the other were measured at 0 and 12 h. Cell migration was calculated by subtracting the distance at 0 h from a distance at 12 h. Cell proliferation assay Cell proliferation assay was performed as previously described 51 . Briefly, lentiviral-transduced TIME cells were seeded at a density of 3 × 10 3 cells per well in a 96-well plate in 0.2 mL of the growth medium. The cells were incubated for 1 d or 3 d at 37 ºC. After incubation, cell proliferation was assessed by cellular reduction of the tetrazolium salt, WST-8, to formazan (Cell Counting Kit-8, Dojindo Laboratories). The ratio of absorbance (450 nm) of 1 d to 3 d was calculated as the cell proliferation. Statistical analysis Statistical significance of the data was determined using Student's t-test for unpaired data. Multiple comparisons were analyzed by one-way ANOVA Tukey–Kramer test using the R package (version 3.5.1; https://www.r-project.org ). Cell culture HMVECs (Cascade Biologics Inc.) and TIME cells (#CRL4025, ATCC) were maintained in HuMedia-EB2 (HMEB2) medium supplemented with 5% FBS, 5 ng/mL basic fibroblast growth factor, 10 μg/mL heparin, 10 ng/mL epidermal growth factor, 1 μg/mL hydrocortisone, 39.3 μg/mL (80 µM) dibutyryl cAMP, 50 µg/mL gentamicin and 50 ng/mL amphotericin B (growth medium) according to the manufacturer's instructions (Kurabo Corp., Tokyo Japan). HEK293TN cells (System Biosciences) were maintained in DMEM (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS, 100 IU/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin. Microarray The microarray analysis was performed as previously described 48 . Briefly, cells were cultured on Matrigel for 8 h in a 100-mm plate and washed with 15 mM HEPES/PBS, followed by Matrigel digestion with dispase for 10 min at 37 °C. Cells were lysed with TRIzol and purified using RNeasy Plus mini kit (Qiagen). The RNA quality was determined by the 28S/18S ratios of ribosomal RNA band intensities on electrophoresis gels under denaturation. Subsequently, 300 ng of total RNA was labeled according to the manufacturer's instructions for the GeneChip WT Sense Target Labeling Kit (Affymetrix). Fragmented and labeled cDNAs were then hybridized onto the Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST arrays in a GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix). Arrays were washed and stained using the GeneChip Fluidics Station 450 and detected using a 3000 7G GeneChip Scanner (Affymetrix). All arrays passed the quality control criteria of the Expression Console software (Affymetrix). Raw data CEL files were then normalized using the RMA algorithm, and the data were exported using Expression Console or Gene Spring software version 10.0.1 (Agilent Technologies). RT-qPCR Total RNA was extracted from cells using RNeasy Mini kits (Qiagen). Subsequently, 0.1–0.6 µg aliquots of total RNA samples were reverse transcribed using High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Thermo Fisher Scientific). qPCR was performed using a StepOnePlus Real-Time System (Thermo Fisher Scientific). EPAC2 mRNA levels were measured using TaqMan Gene Expression Assay (Thermo Fisher Scientific: Hs00199754_m1 or Hs00899815_m1). Predeveloped TaqMan Assay Reagent Control kits (Human GAPDH or Human ACTB Endogenous Control, Thermo Fisher Scientific) were used as internal controls. RT-PCR RT-PCR was performed by RT reaction at 55 °C for 30 min, followed by adequate cycles at 94 °C for 15 s, 60 °C for 30 s, and 68 °C for 30 s using a SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific) (primers are listed in Table 1 ). The amounts of RNA and amplification cycle numbers were determined from linear amplification kinetics. DNA band intensity was analyzed and quantified by ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ). Lentivirus production and transduction The coding region of EPAC2B isoform (NM_001100397.2) was amplified by RT-PCR using the Prime Script High Fidelity RT-PCR kit (TaKaRa) and cloned into Nhe I and Not I sites of the pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vector (System Biosciences). shRNA vectors were constructed using the pSIH-H1-copGFP shRNA vector (System Biosciences) by inserting synthetic oligonucleotides listed in Table 1 . Pseudoviral particles were generated by co-transfecting the pCDH vector or pSIH vector and pPACKH1 packaging plasmid mix (System Biosciences) into HEK293TN cells in a 6-well plate using Lipofectamine and Plus Reagent (Life Technologies). A 72 h cultured media supernatant was collected and filtered through a Millex HV 0.45 µm PVDF membrane. Pseudoviral particles were then transduced into TIME cells seeded at a density of 2 × 10 5 cells per well in a 6-well plate. After transduction, higher GFP expressing TIME cells were sorted by GFP intensity using a SH800 Cell Sorter (Sony) and used for experiments. Western blotting Cells were suspended in Laemmli-sample buffer containing 0.2 µM DTT and shredded using a QIA shredder (Qiagen) and heated at 98 °C for 5 min. The resulting protein samples were applied to SDS-PAGE using 7.5% polyacrylamide gel (ATTO). After electrophoresis, proteins were transferred onto PVDF membranes (ATTO) and blocked with 5% skim milk in 0.1% Tween 20/PBS (TPBS). Anti-EPAC2 (5B1, Cell Signaling Technology) or anti-β-actin (Sigma-Aldrich) antibodies in 1% BSA/TPBS were used as primary antibodies, and anti-mouse IgG-HRP (Cell Signaling Technology) or anti-rabbit IgG-HRP (GE Healthcare) in 1% BSA/TPBS were used as secondary antibodies. Protein signals were detected using an ECL Plus Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) using Molecular Dynamics Typhoon 9400 Imager. Tube formation assay The tube formation assay was performed as previously described 49 , 50 . Briefly, growth factor-reduced Matrigel (BD Biosciences) were prepared at the bottom chambers of µ-Slide Angiogenesis ibiTreat (ibidi). 5000 cells of HMVECs and TIME cells in HMEB2 supplemented with 0.5% FBS were added on Matrigel in the presence or absence of 30 ng/mL VEGF 165 (Millipore). Tube structure was observed using ZEISS Axiovert A1 microscope (Zeiss). Tube length and the polygonal area were measured using ImageJ. The positions of sprawling and lined cells were over-drawn with straight lines. The sum of the line lengths from one image in a single well, and then the mean of the sum of tube length from ten images was calculated as tube length. The polygonal area was measured as the mean of the area surrounded by the straight lines from one image, and then the average of the mean of the polygonal area from ten images was calculated. Cell migration assay Lentiviral-transduced TIME cells were seeded at a density of 5 × 10 4 cells per well in a 12-well plate in 1.6 ml of the growth medium. After 4 d, confluent cell layers were scratched and changed to the new growth medium (0 h), and were incubated for 12 h. The distances between one side of the scratch and the other were measured at 0 and 12 h. Cell migration was calculated by subtracting the distance at 0 h from a distance at 12 h. Cell proliferation assay Cell proliferation assay was performed as previously described 51 . Briefly, lentiviral-transduced TIME cells were seeded at a density of 3 × 10 3 cells per well in a 96-well plate in 0.2 mL of the growth medium. The cells were incubated for 1 d or 3 d at 37 ºC. After incubation, cell proliferation was assessed by cellular reduction of the tetrazolium salt, WST-8, to formazan (Cell Counting Kit-8, Dojindo Laboratories). The ratio of absorbance (450 nm) of 1 d to 3 d was calculated as the cell proliferation. Statistical analysis Statistical significance of the data was determined using Student's t-test for unpaired data. Multiple comparisons were analyzed by one-way ANOVA Tukey–Kramer test using the R package (version 3.5.1; https://www.r-project.org ). Supplementary Information Supplementary Information. Supplementary Information. Supplementary Information The online version contains supplementary material available at 10.1038/s41598-021-98906-9.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7810811/

Integration and Potential Application Ability of Culturable Functional Microorganism in Oil Tea Camellia

Oil tea Camellia is a major woody oil plant, which has a positive influence on alleviating the contradiction between supply and demand of edible oil in China. Microbial fertilizer for Oil tea Camellia is urgently needed in current production, and it is of great significance to improve the yield and quality. Culturable functional microorganisms are the basis of research and development for microbial fertilizer. In this study, culturable microorganisms which had abilities of antagonism, growth promotion, phosphorus solubility, nitrogen fixation and drought resistance, were integrated from oil tea literature. And the strains potential application ability were evaluated in terms of functionality, safety and adaptability, culture characteristics, suitable conditions and colonization or infection ability of strains. The results showed that the strains with strongest antagonistic ability were Bacillus amyloliquefacien s D2WM and Bacillus subtilis Y13. Beauveria bassiana BbTK-01 and Metarhizium anisopliae FJMa201101 had the strongest insect resistant ability. Glomus versiforme and Glomus intraradices can promote oil tea fastest growth. Phosphorus dissolving ability of Bacillus aryabhattai NC285 and Burkholderia cepacia 6-Y-09 were strongest. The strains with strongest Nitrogen fixing ability were Azomonas N7-3 and Sphingobium B7-7, and the strains with strongest improving drought resistance ability were Glomus versiforme and Glomus intraradices. Comprehensive evaluation of strains showed that Bacillus subtilis Y13 and Azomonas N7-3 had a good applied potential ability. This study would save time-consuming of isolate, purify and identify repetitively for the researchers of functional bacteria of oil tea Camellia. Meanwhile it provides a research basis for selecting targeted strains and constructing the combination of functional strains, therefore provides data support for fertilizer efficiency.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6817855/

Spatial ecology of male hippopotamus in a changing watershed

The obligate dependency of the common hippopotamus, Hippopotamus amphibius , on water makes them particularly vulnerable to hydrological disturbances. Despite the threats facing this at-risk species, there is a lack of information regarding H. amphibius spatial ecology. We used high-resolution tracking data of male H. amphibius to assess home range size, movement mode (e.g. residency and migratory movements), and resource selection patterns. We compared these results across seasons to understand how hydrological variability influences H. amphibius movement. Our study watershed has been severely impacted by anthropogenic water abstraction causing the river to stop flowing for prolonged periods. We observed H. amphibius movements to be highly constrained to the river course with grassy floodplains being their preferred habitat. Dominant and small sub-adult males displayed year-round residency in/near river pools and had smaller home ranges compared to large sub-adults. During the dry season, large sub-adult males made significant (~15 km) upstream movements. The larger home range size of large sub-adults can be attributed to the elevated levels of migratory and exploratory activities to limit conspecific aggression as the river dries. Our observations provide insight into how future changes in water flow may influence male H. amphibius movements and populations through density-dependent effects. Introduction In African savannas, the common hippopotamus ( Hippopotamus amphibius ) is an important ecosystem engineer because it shapes the physical structure of ecosystems 1 , vegetation communities 2 , 3 , and biogeochemical cycling 4 , 5 . These effects are detectable in both aquatic and terrestrial ecosystems. Across their range, H. amphibius populations are declining due to a variety of factors including habitat loss and degradation as well as illegal and unregulated hunting practices 6 . The semi-aquatic nature of H. amphibius makes it highly vulnerable to human-driven hydrological change 7 , 8 . Suitable water availability is essential for H. amphibius for two reasons. Firstly, the unique skin of H. amphibius is susceptible to cracking when exposed to direct sunlight; for the skin to maintain its thermoregulatory function, it needs regular immersion in water 9 . Secondly, Clauss, et al . 10 posit that the reliance of H. amphibius on water is a consequence of high faecal water loss related to their gastrointestinal morphology. Intensified anthropogenic water abstraction and the associated drying of lakes and rivers, in addition to accelerating rates of agricultural and urban development along riverine and lacustrine environments, are major sources of direct and indirect stress for H. amphibius . Furthermore, climate change-associated shifts in rainfall, which affect watershed hydrology through prolonged drought and intensified rainfall events, appear to be creating conditions that amplify this stress 5 . Seasonal drying events that reduce river flow can naturally limit the number of aquatic refugia (e.g. deep river pools) for H. amphibius and can cause large, densely packed aggregations of H. amphibius to form within remaining pools 5 , 11 . This dry season crowding can become exacerbated under conditions where river discharge has been significantly reduced due to anthropogenic water abstraction. Stress within H. amphibius populations during these prolonged dry periods can be further elevated as a result of increased competition. For example, dominant male H. amphibius are territorial and defend aquatic refugia and can be extremely aggressive to sub-adult male H. amphibius , frequently ejecting them from pools, thereby forcing these displaced individuals to disperse to find their own pool, often of lower quality 7 . In addition, during their nightly foraging bouts, H. amphibius consume approximately 40–50 kg wet mass 12 , thus requiring productive terrestrial habitats that can support their foraging needs. These resources become more difficult to obtain during dry seasons – and more so in dry seasons where vegetation is stressed by human activity (e.g. livestock grazing). Thus, it is critically important to understand how the spatial and temporal structuring of vital aquatic and terrestrial resources influence the spatial ecology of H. amphibius . The mechanisms that drive H. amphibius movements can influence their fitness as well as regulate the aforementioned effects that H. amphibius have upon communities and ecosystems e.g. 13 , 14 . To date, very little is known about the spatial ecology of H. amphibius . There is a paucity of information available on the core patterns of H. amphibius spatial ecology and the drivers that shape these patterns of space use. Generating information of this kind is essential for improving our understanding of the ecology of H. amphibius and can also be used to develop more spatially informed and, thus, more effective conservation and management strategies for this at-risk species. Such information is needed more than ever in this period of rapid environmental change 15 , 16 . To address these issues, we used GPS technology to track male H. amphibius movements in a historically perennial river in central Tanzania that, as a result of human modification, now dries down seasonally into a series of isolated pools. GPS devices were deployed for one year, covering multiple seasons, which allowed us to elucidate how seasonal variability in both terrestrial resources and aquatic refugia influenced H. amphibius movements. From these data, we asked two broad questions: (1) what are the spatial patterns by which male H. amphibius use their landscape? and (2) how does hydrological variation shape these patterns of male H. amphibius space use? We focused our tracking efforts on male H. amphibius because their movements are more likely to be influenced by water availability compared to female H. amphibius . These differences are potentially due to the interaction between altered water availability and the social structure of this species (i.e. increased competition and aggression between males as suitable habitat declines) 11 . Collectively, the results from our study contribute the first high-resolution view of the spatial ecology of male H. amphibius and elucidate the high degree of sensitivity of their movements to environmental change. Methods Study area This study was conducted in the Ruaha National Park in central Tanzania (7°42′ S, 34 °54′ E) from November 2016 to  December 2017. Ruaha National Park encompasses a transitional vegetation zone between the East African Acacia-Commiphora zone and the Southern African Brachystegia and Miombo zone 17 , 18 . Mean annual rainfall in this region is approximately 580 mm with most rainfall occurring during the wet season from November/December to May. The extensive dry season spans from June to November/December 19 . From 1960–1990 the Great Ruaha River flowed throughout the year and maintained 1–3 m 3 s −1 dry season flow 20 . However, from 1993 to present day (2019), intensive water abstraction from the Great Ruaha River by agriculture has consistently reduced dry season river flow to zero 20 . As a result, approximately 60% of the river dries up 19 and only discrete pools remain that are separated by large expanses of dry river bed (Fig. 1 ). Figure 1 Comparison of wet and dry season river flow in the Great Ruaha River from two vantage points. Panels ( a,c ) depict when the river is flowing during the wet season and ( b,d ) shows when river flow ceases and only isolated pools remain during the dry season. Hydrological monitoring Monthly rainfall records for Ruaha National Park during our study period were obtained from park officials. River hydrology was monitored at the Msembe gauging station located ~2 km upstream of our sampling area. For the purpose of our study, we partitioned our H. amphibius movement data into five seasonal periods defined as follows based on rainfall and river hydrology: (1) Peak dry period: no rainfall and zero flow, (2) Wetting period: start of the rainy season with an increase in river flow only being observed towards the end of the wetting period, (3) Peak wet: peak rainfall and river flow, (4) Drying period: no rainfall and rapidly declining river flow, and (5) Second peak dry: no rainfall and zero flow (Supplementary Information Fig. S1 ). Our study period consists of two dry periods; however, our goal was to quantify seasonal, rather than inter-annual variation in H. amphibius movement. Consequently, for the below analyses, we combined observations from these two periods into a single dry season. H. amphibius GPS tracking All H. amphibius were immobilized in strict accordance with the guidelines of the American Society of Mammalogists for the use of wild mammals in research. The protocol was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at the University of California Santa Barbara (protocol number 914). Tanzania National Parks Authority veterinarians conducted the immobilizations and approval was received by the Tanzanian Wildlife Research Institute and the Tanzania Commission of Science and Technology (permit numbers 2016–286-ER-2013-52 and 2017–331-NA-2013-52). We tracked 10 male H. amphibius in the Great Ruaha River using GPS-GSM UHF collars (Wireless Wildlife, Potchefstroom, South Africa). The dry conditions of our study site allowed veterinarians to immobilize H. amphibius away from water sources using a gas-propelled dart, following protocols outlined in 21 , 22 . Due to the difficulties in attaching a collar to the neck of H. amphibius 7 , we fitted a modified rhinoceros ankle collar to the front foot of H. amphibius . After the reversal drug was administered, we observed each H. amphibius for ~1 hr to ensure that (1) the collar did not influence their normal behaviour, and (2) each H. amphibius was able to safely return to its river pool. No complications were observed for any of the collared individuals. Collars were programmed to acquire a location fix every 30 minutes between 18h00 and 06h00. The start and end of the GPS sampling period was based on observing camera trap images noting the time that H. amphibius left the river to forage and the approximate time many returned to the river after each nightly foraging bout. As a result, the assessment of H. amphibius spatial ecology is based on the nocturnal movement patterns while foraging. We used natural breaks in the distribution of body length (tip of snout to base of the tail) measurements of tracked H. amphibius to define three life stage categories: "dominant male", "large sub-adult male", and "small sub-adult male" (Supplementary Information Fig. S2 ). Given the fix-rate, collars were expected to last approximately one year. However, during the study period, some collars did fall off the ankle of H. amphibius before the end of the one year period. Seasonal sample sizes for each life stage category used in the below analyses are provided in Table 1 (See Supplementary Information Table S1 for a timeline showing the duration that each collar collected location data as well as the total number of fixes). These collar losses were not associated with H. amphibius injury or death, but rather because of the difficult conditions that the collars were subjected to (e.g. submerged under water for extended periods). Finally, we conducted stationary experiments to assess GPS collar fix-success rate and location error (see Supplementary Method S1 ) 23 . The fix success rate was 0.99 with only 8 missed fixes out of the 953 fix attempts during the test period and the location error for the collars ranged from 8–17 m (average: 11 m). Table 1 The number of Hippopotamus amphibius that were tracked in each life stage category per season. Life stage Season Peak dry Wetting Peak wet Drying Second peak dry Dominant male 4 4 3 3 3 Large sub-adult male 2 2 2 2 2 Small sub-adult 4 4 2 2 2 Total 10 10 7 7 7 H. amphibius space use H. amphibius home range We estimated H. amphibius home ranges using the Time Local Convex Hull approach implemented in the R package, 'T-LoCoH' 24 , which takes into account both spatial and autocorrelation of GPS fixes when creating convex hulls. For hull construction, T-LoCoH uses a distance function that transforms a unit of time into a unit of distance, called the time-scaled distance TSD 25 . We weighted the time and space components of the TSD by setting the scaling parameter ( s ) to a time interval of interest. We selected a time interval of five hours based on our observations of the average duration of a nightly foraging bout for H. amphibius , which is similar to the estimated 30% of the day they spend feeding 26 . To make comparisons across individuals and seasons, we used the same approach for all individuals in each season by always estimating the scaling parameter at five hours. Finally, we used the k -method of sampling to construct polygons 25 . To ensure the selected value of k did not result in a sudden increase in area used by an individual H. amphibius , we assessed the isopleth area curves and compared the perimeter: area estimates. We explored the factors that shape H. amphibius home range estimates using a generalized linear mixed effect model (gamma error distribution and log-link function) using the 'lme4' package in R 27 . For these models, we included season, life stage, and their interaction as main effects. We used individual H. amphibius as a random grouping effect. We found a significant interaction effect; therefore, we conducted a Tukey's pairwise post-hoc analyses of marginal means to elucidate differences between the interaction terms. Relationship between distance from the river and key foraging areas Given that the Great Ruaha River appeared to play a key role in shaping H. amphibius movement in this semi-arid environment, we analysed several attributes that aided in determining the relationship between H. amphibius and the river. Specifically, we used T-LoCoH's revisitation rate and duration of visitation to delineate important foraging areas within individual home ranges. Revisitation rate (nsv) is the number of separate visits to the area inside an individual polygon and the average duration of each visit (mnlv) is the number of GPS locations per visit to an individual polygon. We calculated the revisitation rate and duration of visits for each hull based on an inter-visit gap (IVG) of five hours (the average duration of a nightly foraging bout). Thus, separate visits to a hull were identified when an individual H. amphibius left a given hull and only returned after a period of 5 hours. To relate revisitation rate and visit duration (proxy for important foraging areas) with distance travelled away from the river, we calculated and extracted the distance between the Great Ruaha River and every H. amphibius GPS location using the 'gdistance' function in the R package, 'rgeos' 28 . We used Kendall's rank correlation coefficient to determine if distance from the river was correlated with high or low occurrences of revisitation and visitation duration. We explored this relationship for each season (See Table 1 for sample sizes). Furthermore, we ran generalized linear mixed models (gamma error distribution and log-link function) to determine whether the mean distance travelled away from the river by H. amphibius was influenced by season, life stage, or their interaction. We included individual H. amphibius as a random grouping effect. We found a significant interaction effect; therefore, we conducted a Tukey's pairwise post-hoc analyses of marginal means. Characterization of H. amphibius movement modes To classify H. amphibius movement modes, we integrated distributions of net squared displacement values (NSD) calculated from GPS fixes from the duration of the study with latent, discrete-state models using the 'lsmnsd' package in R 29 . NSD is the square of the Euclidean distance between a starting location and each subsequent location. The latest, discrete-state models (a type of hidden Markov model) allow for greater flexibility and accuracy in classifying large-scale movement modes 30 , 31 . These models define movement modes based on the distribution of NSD. For example, normally distributed NSD values are associated with areas of intensive and recurrent space use (e.g. resident) whereas a uniform distribution is indicative of sporadic use of an area while travelling (e.g. dispersing). We defined the starting location as the initial pool in which the respective H. amphibius was collared. For each individual (n = 10), we characterized movement modes by extracting the switching probability and the number of transitions between movement modes identified by the model (for further details see 29 ). For brevity, we only present a single figure for each of the different movement modes that we observed (see Supplementary Information Fig. S3 for the NSD plots and switching probabilities for the different movement modes for the remaining individuals). We overlaid these NSD values with season to identify potential mechanisms driving individual movement modes. Furthermore, we calculated modified NSD metrics that measured displacement along the river and away from the river (See Supplementary Method S2 ). H. amphibius habitat selection Environmental data We obtained spatial data on vegetation cover types and the distance to the Great Ruaha River (m) from the Ruaha National Park GIS landcover type database. The landcover and vegetation map was derived from Landsat Thematic Mapper satellite imagery using unsupervised classification algorithms 32 . Vegetation types were mapped to a 30 m resolution and the reliability of the vegetation cover was assessed by comparing map classification with field measurements. From the landcover map, we defined and included the following vegetation cover types in our models: floodplain (area within the banks of the Great Ruaha River), drainage lines (small seasonal streams that flow into the Great Ruaha River), short grass savanna (open savanna dominated by short grass with ~15% shrub cover), tall grass savanna (open savanna dominated by tall grass with ~15% shrub cover), shrub dominated savanna (40–65% shrub cover), and tall tree savanna (40–65% tree cover with the understory dominated by short grass). We derived slope estimates (degrees) from high-resolution satellite imagery (Planet satellite imagery) of the study site by creating a digital elevation model (DEM) and extracting slope values in QGIS 33 . All datasets were converted to 30 m resolution using the 'raster' package in R 34 . We assessed for collinearity among environmental data variables using Pearson correlation coefficients. We found that distance from the Great Ruaha River, distance from anthropogenic settlements (e.g. camps), and distance from roads were highly correlated (r > 0.6). From these variables, we only included distance from the Great Ruaha River in our resource selection functions described below because it was a better predictor of H. amphibius locations compared to distance from anthropogenic settlements and distance from roads. Resource selection functions We fitted seasonal RSFs using generalized linear mixed effects models with a binomial error distribution and log-link function. We included random intercepts and random slope coefficients to account for unequal sample sizes and individual-specific differences in habitat selection 35 . Within the home range of each individual H. amphibius , we paired used locations with randomly generated available locations selected from within the 100% minimum convex polygon (i.e. third-order selection 36 ). To reduce bias and improve the interpretation of coefficients obtained from RSF models, a sufficiently large sample of available points needs to be generated and the spatial extent of these available points must match the scale of inference over which habitat selection is being inferred (in this case, third-order selection) 37 , 38 . Thus, following Fithian and Hastie 39 , we weighted the availability of randomly selected available points so that there were 5 times more available locations than used locations. Furthermore, the available points were generated from the same spatial extent as the used locations (i.e. both used and available locations were obtained from within the 100% minimum convex polygon). Prior to model selection, RSFs were partitioned into two life stage categories. For the first category, we combined dominant males with small sub-adult males because of their similar home ranges and movement modes (i.e. dominant males tolerate sub-adult males permitting overlap between their spatial ecology). For the second category, we analysed large sub-adult males separately because of the stark contrast in home range and movement modes compared to dominant and small sub-adult males. For each season (peak dry, wetting, peak wet, and drying), we ran seven different models where we regressed H. amphibius habitat use by the abovementioned environmental data (Supplementary Information Tables S2 and S3 ). We selected the best-performing model using AICc scores and Akaike weights 40 . For categorical environmental variables (e.g. vegetation cover), preference was modelled in respect to a reference category 37 . We selected floodplain habitat as the reference category because it was the habitat that was consistently preferred (i.e. positive selection ratios; Fig. S5 ). Finally, we determined the ability of each life stage-specific seasonal RSF model to predict H. amphibius habitat selection using k-fold cross validation 41 . Study area This study was conducted in the Ruaha National Park in central Tanzania (7°42′ S, 34 °54′ E) from November 2016 to  December 2017. Ruaha National Park encompasses a transitional vegetation zone between the East African Acacia-Commiphora zone and the Southern African Brachystegia and Miombo zone 17 , 18 . Mean annual rainfall in this region is approximately 580 mm with most rainfall occurring during the wet season from November/December to May. The extensive dry season spans from June to November/December 19 . From 1960–1990 the Great Ruaha River flowed throughout the year and maintained 1–3 m 3 s −1 dry season flow 20 . However, from 1993 to present day (2019), intensive water abstraction from the Great Ruaha River by agriculture has consistently reduced dry season river flow to zero 20 . As a result, approximately 60% of the river dries up 19 and only discrete pools remain that are separated by large expanses of dry river bed (Fig. 1 ). Figure 1 Comparison of wet and dry season river flow in the Great Ruaha River from two vantage points. Panels ( a,c ) depict when the river is flowing during the wet season and ( b,d ) shows when river flow ceases and only isolated pools remain during the dry season. Hydrological monitoring Monthly rainfall records for Ruaha National Park during our study period were obtained from park officials. River hydrology was monitored at the Msembe gauging station located ~2 km upstream of our sampling area. For the purpose of our study, we partitioned our H. amphibius movement data into five seasonal periods defined as follows based on rainfall and river hydrology: (1) Peak dry period: no rainfall and zero flow, (2) Wetting period: start of the rainy season with an increase in river flow only being observed towards the end of the wetting period, (3) Peak wet: peak rainfall and river flow, (4) Drying period: no rainfall and rapidly declining river flow, and (5) Second peak dry: no rainfall and zero flow (Supplementary Information Fig. S1 ). Our study period consists of two dry periods; however, our goal was to quantify seasonal, rather than inter-annual variation in H. amphibius movement. Consequently, for the below analyses, we combined observations from these two periods into a single dry season. H. amphibius GPS tracking All H. amphibius were immobilized in strict accordance with the guidelines of the American Society of Mammalogists for the use of wild mammals in research. The protocol was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at the University of California Santa Barbara (protocol number 914). Tanzania National Parks Authority veterinarians conducted the immobilizations and approval was received by the Tanzanian Wildlife Research Institute and the Tanzania Commission of Science and Technology (permit numbers 2016–286-ER-2013-52 and 2017–331-NA-2013-52). We tracked 10 male H. amphibius in the Great Ruaha River using GPS-GSM UHF collars (Wireless Wildlife, Potchefstroom, South Africa). The dry conditions of our study site allowed veterinarians to immobilize H. amphibius away from water sources using a gas-propelled dart, following protocols outlined in 21 , 22 . Due to the difficulties in attaching a collar to the neck of H. amphibius 7 , we fitted a modified rhinoceros ankle collar to the front foot of H. amphibius . After the reversal drug was administered, we observed each H. amphibius for ~1 hr to ensure that (1) the collar did not influence their normal behaviour, and (2) each H. amphibius was able to safely return to its river pool. No complications were observed for any of the collared individuals. Collars were programmed to acquire a location fix every 30 minutes between 18h00 and 06h00. The start and end of the GPS sampling period was based on observing camera trap images noting the time that H. amphibius left the river to forage and the approximate time many returned to the river after each nightly foraging bout. As a result, the assessment of H. amphibius spatial ecology is based on the nocturnal movement patterns while foraging. We used natural breaks in the distribution of body length (tip of snout to base of the tail) measurements of tracked H. amphibius to define three life stage categories: "dominant male", "large sub-adult male", and "small sub-adult male" (Supplementary Information Fig. S2 ). Given the fix-rate, collars were expected to last approximately one year. However, during the study period, some collars did fall off the ankle of H. amphibius before the end of the one year period. Seasonal sample sizes for each life stage category used in the below analyses are provided in Table 1 (See Supplementary Information Table S1 for a timeline showing the duration that each collar collected location data as well as the total number of fixes). These collar losses were not associated with H. amphibius injury or death, but rather because of the difficult conditions that the collars were subjected to (e.g. submerged under water for extended periods). Finally, we conducted stationary experiments to assess GPS collar fix-success rate and location error (see Supplementary Method S1 ) 23 . The fix success rate was 0.99 with only 8 missed fixes out of the 953 fix attempts during the test period and the location error for the collars ranged from 8–17 m (average: 11 m). Table 1 The number of Hippopotamus amphibius that were tracked in each life stage category per season. Life stage Season Peak dry Wetting Peak wet Drying Second peak dry Dominant male 4 4 3 3 3 Large sub-adult male 2 2 2 2 2 Small sub-adult 4 4 2 2 2 Total 10 10 7 7 7 H. amphibius space use H. amphibius home range We estimated H. amphibius home ranges using the Time Local Convex Hull approach implemented in the R package, 'T-LoCoH' 24 , which takes into account both spatial and autocorrelation of GPS fixes when creating convex hulls. For hull construction, T-LoCoH uses a distance function that transforms a unit of time into a unit of distance, called the time-scaled distance TSD 25 . We weighted the time and space components of the TSD by setting the scaling parameter ( s ) to a time interval of interest. We selected a time interval of five hours based on our observations of the average duration of a nightly foraging bout for H. amphibius , which is similar to the estimated 30% of the day they spend feeding 26 . To make comparisons across individuals and seasons, we used the same approach for all individuals in each season by always estimating the scaling parameter at five hours. Finally, we used the k -method of sampling to construct polygons 25 . To ensure the selected value of k did not result in a sudden increase in area used by an individual H. amphibius , we assessed the isopleth area curves and compared the perimeter: area estimates. We explored the factors that shape H. amphibius home range estimates using a generalized linear mixed effect model (gamma error distribution and log-link function) using the 'lme4' package in R 27 . For these models, we included season, life stage, and their interaction as main effects. We used individual H. amphibius as a random grouping effect. We found a significant interaction effect; therefore, we conducted a Tukey's pairwise post-hoc analyses of marginal means to elucidate differences between the interaction terms. Relationship between distance from the river and key foraging areas Given that the Great Ruaha River appeared to play a key role in shaping H. amphibius movement in this semi-arid environment, we analysed several attributes that aided in determining the relationship between H. amphibius and the river. Specifically, we used T-LoCoH's revisitation rate and duration of visitation to delineate important foraging areas within individual home ranges. Revisitation rate (nsv) is the number of separate visits to the area inside an individual polygon and the average duration of each visit (mnlv) is the number of GPS locations per visit to an individual polygon. We calculated the revisitation rate and duration of visits for each hull based on an inter-visit gap (IVG) of five hours (the average duration of a nightly foraging bout). Thus, separate visits to a hull were identified when an individual H. amphibius left a given hull and only returned after a period of 5 hours. To relate revisitation rate and visit duration (proxy for important foraging areas) with distance travelled away from the river, we calculated and extracted the distance between the Great Ruaha River and every H. amphibius GPS location using the 'gdistance' function in the R package, 'rgeos' 28 . We used Kendall's rank correlation coefficient to determine if distance from the river was correlated with high or low occurrences of revisitation and visitation duration. We explored this relationship for each season (See Table 1 for sample sizes). Furthermore, we ran generalized linear mixed models (gamma error distribution and log-link function) to determine whether the mean distance travelled away from the river by H. amphibius was influenced by season, life stage, or their interaction. We included individual H. amphibius as a random grouping effect. We found a significant interaction effect; therefore, we conducted a Tukey's pairwise post-hoc analyses of marginal means. Characterization of H. amphibius movement modes To classify H. amphibius movement modes, we integrated distributions of net squared displacement values (NSD) calculated from GPS fixes from the duration of the study with latent, discrete-state models using the 'lsmnsd' package in R 29 . NSD is the square of the Euclidean distance between a starting location and each subsequent location. The latest, discrete-state models (a type of hidden Markov model) allow for greater flexibility and accuracy in classifying large-scale movement modes 30 , 31 . These models define movement modes based on the distribution of NSD. For example, normally distributed NSD values are associated with areas of intensive and recurrent space use (e.g. resident) whereas a uniform distribution is indicative of sporadic use of an area while travelling (e.g. dispersing). We defined the starting location as the initial pool in which the respective H. amphibius was collared. For each individual (n = 10), we characterized movement modes by extracting the switching probability and the number of transitions between movement modes identified by the model (for further details see 29 ). For brevity, we only present a single figure for each of the different movement modes that we observed (see Supplementary Information Fig. S3 for the NSD plots and switching probabilities for the different movement modes for the remaining individuals). We overlaid these NSD values with season to identify potential mechanisms driving individual movement modes. Furthermore, we calculated modified NSD metrics that measured displacement along the river and away from the river (See Supplementary Method S2 ). H. amphibius home range We estimated H. amphibius home ranges using the Time Local Convex Hull approach implemented in the R package, 'T-LoCoH' 24 , which takes into account both spatial and autocorrelation of GPS fixes when creating convex hulls. For hull construction, T-LoCoH uses a distance function that transforms a unit of time into a unit of distance, called the time-scaled distance TSD 25 . We weighted the time and space components of the TSD by setting the scaling parameter ( s ) to a time interval of interest. We selected a time interval of five hours based on our observations of the average duration of a nightly foraging bout for H. amphibius , which is similar to the estimated 30% of the day they spend feeding 26 . To make comparisons across individuals and seasons, we used the same approach for all individuals in each season by always estimating the scaling parameter at five hours. Finally, we used the k -method of sampling to construct polygons 25 . To ensure the selected value of k did not result in a sudden increase in area used by an individual H. amphibius , we assessed the isopleth area curves and compared the perimeter: area estimates. We explored the factors that shape H. amphibius home range estimates using a generalized linear mixed effect model (gamma error distribution and log-link function) using the 'lme4' package in R 27 . For these models, we included season, life stage, and their interaction as main effects. We used individual H. amphibius as a random grouping effect. We found a significant interaction effect; therefore, we conducted a Tukey's pairwise post-hoc analyses of marginal means to elucidate differences between the interaction terms. Relationship between distance from the river and key foraging areas Given that the Great Ruaha River appeared to play a key role in shaping H. amphibius movement in this semi-arid environment, we analysed several attributes that aided in determining the relationship between H. amphibius and the river. Specifically, we used T-LoCoH's revisitation rate and duration of visitation to delineate important foraging areas within individual home ranges. Revisitation rate (nsv) is the number of separate visits to the area inside an individual polygon and the average duration of each visit (mnlv) is the number of GPS locations per visit to an individual polygon. We calculated the revisitation rate and duration of visits for each hull based on an inter-visit gap (IVG) of five hours (the average duration of a nightly foraging bout). Thus, separate visits to a hull were identified when an individual H. amphibius left a given hull and only returned after a period of 5 hours. To relate revisitation rate and visit duration (proxy for important foraging areas) with distance travelled away from the river, we calculated and extracted the distance between the Great Ruaha River and every H. amphibius GPS location using the 'gdistance' function in the R package, 'rgeos' 28 . We used Kendall's rank correlation coefficient to determine if distance from the river was correlated with high or low occurrences of revisitation and visitation duration. We explored this relationship for each season (See Table 1 for sample sizes). Furthermore, we ran generalized linear mixed models (gamma error distribution and log-link function) to determine whether the mean distance travelled away from the river by H. amphibius was influenced by season, life stage, or their interaction. We included individual H. amphibius as a random grouping effect. We found a significant interaction effect; therefore, we conducted a Tukey's pairwise post-hoc analyses of marginal means. Characterization of H. amphibius movement modes To classify H. amphibius movement modes, we integrated distributions of net squared displacement values (NSD) calculated from GPS fixes from the duration of the study with latent, discrete-state models using the 'lsmnsd' package in R 29 . NSD is the square of the Euclidean distance between a starting location and each subsequent location. The latest, discrete-state models (a type of hidden Markov model) allow for greater flexibility and accuracy in classifying large-scale movement modes 30 , 31 . These models define movement modes based on the distribution of NSD. For example, normally distributed NSD values are associated with areas of intensive and recurrent space use (e.g. resident) whereas a uniform distribution is indicative of sporadic use of an area while travelling (e.g. dispersing). We defined the starting location as the initial pool in which the respective H. amphibius was collared. For each individual (n = 10), we characterized movement modes by extracting the switching probability and the number of transitions between movement modes identified by the model (for further details see 29 ). For brevity, we only present a single figure for each of the different movement modes that we observed (see Supplementary Information Fig. S3 for the NSD plots and switching probabilities for the different movement modes for the remaining individuals). We overlaid these NSD values with season to identify potential mechanisms driving individual movement modes. Furthermore, we calculated modified NSD metrics that measured displacement along the river and away from the river (See Supplementary Method S2 ). H. amphibius habitat selection Environmental data We obtained spatial data on vegetation cover types and the distance to the Great Ruaha River (m) from the Ruaha National Park GIS landcover type database. The landcover and vegetation map was derived from Landsat Thematic Mapper satellite imagery using unsupervised classification algorithms 32 . Vegetation types were mapped to a 30 m resolution and the reliability of the vegetation cover was assessed by comparing map classification with field measurements. From the landcover map, we defined and included the following vegetation cover types in our models: floodplain (area within the banks of the Great Ruaha River), drainage lines (small seasonal streams that flow into the Great Ruaha River), short grass savanna (open savanna dominated by short grass with ~15% shrub cover), tall grass savanna (open savanna dominated by tall grass with ~15% shrub cover), shrub dominated savanna (40–65% shrub cover), and tall tree savanna (40–65% tree cover with the understory dominated by short grass). We derived slope estimates (degrees) from high-resolution satellite imagery (Planet satellite imagery) of the study site by creating a digital elevation model (DEM) and extracting slope values in QGIS 33 . All datasets were converted to 30 m resolution using the 'raster' package in R 34 . We assessed for collinearity among environmental data variables using Pearson correlation coefficients. We found that distance from the Great Ruaha River, distance from anthropogenic settlements (e.g. camps), and distance from roads were highly correlated (r > 0.6). From these variables, we only included distance from the Great Ruaha River in our resource selection functions described below because it was a better predictor of H. amphibius locations compared to distance from anthropogenic settlements and distance from roads. Resource selection functions We fitted seasonal RSFs using generalized linear mixed effects models with a binomial error distribution and log-link function. We included random intercepts and random slope coefficients to account for unequal sample sizes and individual-specific differences in habitat selection 35 . Within the home range of each individual H. amphibius , we paired used locations with randomly generated available locations selected from within the 100% minimum convex polygon (i.e. third-order selection 36 ). To reduce bias and improve the interpretation of coefficients obtained from RSF models, a sufficiently large sample of available points needs to be generated and the spatial extent of these available points must match the scale of inference over which habitat selection is being inferred (in this case, third-order selection) 37 , 38 . Thus, following Fithian and Hastie 39 , we weighted the availability of randomly selected available points so that there were 5 times more available locations than used locations. Furthermore, the available points were generated from the same spatial extent as the used locations (i.e. both used and available locations were obtained from within the 100% minimum convex polygon). Prior to model selection, RSFs were partitioned into two life stage categories. For the first category, we combined dominant males with small sub-adult males because of their similar home ranges and movement modes (i.e. dominant males tolerate sub-adult males permitting overlap between their spatial ecology). For the second category, we analysed large sub-adult males separately because of the stark contrast in home range and movement modes compared to dominant and small sub-adult males. For each season (peak dry, wetting, peak wet, and drying), we ran seven different models where we regressed H. amphibius habitat use by the abovementioned environmental data (Supplementary Information Tables S2 and S3 ). We selected the best-performing model using AICc scores and Akaike weights 40 . For categorical environmental variables (e.g. vegetation cover), preference was modelled in respect to a reference category 37 . We selected floodplain habitat as the reference category because it was the habitat that was consistently preferred (i.e. positive selection ratios; Fig. S5 ). Finally, we determined the ability of each life stage-specific seasonal RSF model to predict H. amphibius habitat selection using k-fold cross validation 41 . Environmental data We obtained spatial data on vegetation cover types and the distance to the Great Ruaha River (m) from the Ruaha National Park GIS landcover type database. The landcover and vegetation map was derived from Landsat Thematic Mapper satellite imagery using unsupervised classification algorithms 32 . Vegetation types were mapped to a 30 m resolution and the reliability of the vegetation cover was assessed by comparing map classification with field measurements. From the landcover map, we defined and included the following vegetation cover types in our models: floodplain (area within the banks of the Great Ruaha River), drainage lines (small seasonal streams that flow into the Great Ruaha River), short grass savanna (open savanna dominated by short grass with ~15% shrub cover), tall grass savanna (open savanna dominated by tall grass with ~15% shrub cover), shrub dominated savanna (40–65% shrub cover), and tall tree savanna (40–65% tree cover with the understory dominated by short grass). We derived slope estimates (degrees) from high-resolution satellite imagery (Planet satellite imagery) of the study site by creating a digital elevation model (DEM) and extracting slope values in QGIS 33 . All datasets were converted to 30 m resolution using the 'raster' package in R 34 . We assessed for collinearity among environmental data variables using Pearson correlation coefficients. We found that distance from the Great Ruaha River, distance from anthropogenic settlements (e.g. camps), and distance from roads were highly correlated (r > 0.6). From these variables, we only included distance from the Great Ruaha River in our resource selection functions described below because it was a better predictor of H. amphibius locations compared to distance from anthropogenic settlements and distance from roads. Resource selection functions We fitted seasonal RSFs using generalized linear mixed effects models with a binomial error distribution and log-link function. We included random intercepts and random slope coefficients to account for unequal sample sizes and individual-specific differences in habitat selection 35 . Within the home range of each individual H. amphibius , we paired used locations with randomly generated available locations selected from within the 100% minimum convex polygon (i.e. third-order selection 36 ). To reduce bias and improve the interpretation of coefficients obtained from RSF models, a sufficiently large sample of available points needs to be generated and the spatial extent of these available points must match the scale of inference over which habitat selection is being inferred (in this case, third-order selection) 37 , 38 . Thus, following Fithian and Hastie 39 , we weighted the availability of randomly selected available points so that there were 5 times more available locations than used locations. Furthermore, the available points were generated from the same spatial extent as the used locations (i.e. both used and available locations were obtained from within the 100% minimum convex polygon). Prior to model selection, RSFs were partitioned into two life stage categories. For the first category, we combined dominant males with small sub-adult males because of their similar home ranges and movement modes (i.e. dominant males tolerate sub-adult males permitting overlap between their spatial ecology). For the second category, we analysed large sub-adult males separately because of the stark contrast in home range and movement modes compared to dominant and small sub-adult males. For each season (peak dry, wetting, peak wet, and drying), we ran seven different models where we regressed H. amphibius habitat use by the abovementioned environmental data (Supplementary Information Tables S2 and S3 ). We selected the best-performing model using AICc scores and Akaike weights 40 . For categorical environmental variables (e.g. vegetation cover), preference was modelled in respect to a reference category 37 . We selected floodplain habitat as the reference category because it was the habitat that was consistently preferred (i.e. positive selection ratios; Fig. S5 ). Finally, we determined the ability of each life stage-specific seasonal RSF model to predict H. amphibius habitat selection using k-fold cross validation 41 . Results H. amphibius home range When pooling all data from this study, we estimated that H. amphibius in this system occupied a home range averaging 8 ± 3 km 2 (±SE) (individual range: 1.6–37.6 km 2 ; Fig. 2 ). These home range sizes varied by season and H. amphibius life stage (χ 2 = 17.7, df = 6, P = 0.007; Fig. 3 ). Large sub-adult males traversed home ranges that were more than three times larger than other individuals during the wetter parts of the year (Fig. 3 ). After an initial increase in home range size following the first dry season, dominant males maintained relatively constant home ranges throughout the year. Changes in water availability did not affect the home range size of dominant and small sub-adult males. Comparatively, these two life stages maintained similar home ranges throughout the study ( P > 0.05; Fig. 3 ). Figure 2 ( a ) Long-term home ranges (95% utilization distribution) for all male Hippopotamus amphibius ( n = 10) along the Great Ruaha River, Ruaha National Park, Tanzania (November 2016 to December 2017). Each individual is represented by a different colour. ( b ) H. amphibius grazing on green grass within its preferred habitat (floodplains) during the dry season. Figure 3 Home range size (mean ± SE) of male Hippopotamus amphibius calculated using the 95% density isopleth (utilization distribution). Data is separated by three different H. amphibius life stages and analysed within the context of four different seasons (peak dry and wetting: n = 4 dominant males, n = 2 large sub-adult males, and n = 4 small sub-adult males; peak wet and drying: n = 3 dominant males, n = 2 large sub-adult, and n = 2 small sub-adults). Letters denote significant differences ( P  0.05). Figure 5 Distance travelled away from the Great Ruaha River (mean ± SE) by the different life stage categories of male Hippopotamus amphibius in each of the seasonal sampling periods (peak dry and wetting: n = 4 dominant males, n = 2 large sub-adult males, and n = 4 small sub-adult males; peak wet and drying: n = 3 dominant males, n = 2 large sub-adult, and n = 2 small sub-adults). Letters denote significant differences ( P  0.90, q 22 > 0.90, and q 33 > 0.85; Fig. 6a ). This individual moved between multiple core areas within the sampling period. Upstream migrations (range: 3–15 km from the initial pool) occurred during the driest parts of the year and lasted ~60 days, whereas downstream migrations (range: 2–15 km below the initial pool) occurred during wetter periods of the year and lasted ~81 days (Fig. 6a ). Figure 6 Examples of Hippopotamus amphibius movement data and the corresponding pattern in net squared displacement for H. amphibius that match ( a ) migratory movement patterns, ( b ) residency and exploratory movements, and ( c ) residency around an aquatic refuge. Within H. amphibius home ranges, red denotes areas of high use and the black point represent the initial pool in which the individual was collared. Iso level refers to the density of isopleths (i.e. 0.95 reflects the 95% home range). Switching probabilities (q 11 , q 22 , and q 33 ) that were used to classify movement modes are also presented. Positive net squared displacement values reflect upstream movement while negative values denote downstream movement of H. amphibius from their starting pool. Net squared displacement values are plotted across seasons in the second column (dashed grey line): (i) peak dry, (ii) wetting, (iii) peak wet, (iv) drying, and (v) second peak dry. The second large sub-adult male also showed a pattern of transition between movement modes similar to a migratory pattern. However, this individual spent less time in the second movement mode relative to the first movement mode. As such, a movement pattern akin to exploratory resident is the most appropriate movement mode classification (Fig. 6b ). This individual remained resident around its initial pool, but explored two core areas throughout the sampling period. This individual showed similar patterns when compared to the other large sub-adult by moving upstream (range: 2–5 km and lasting 60 days) during dry periods and moving downstream (range: 5–15 km lasting 38 days) during wet periods of the year. In contrast, dominant and small sub-adult males did not exhibit large-scale up or downstream movements (Supplementary Information, Fig. S4 ). In fact, they showed highly constrained movements around their respective pools that is indicative of residency (switching probabilities for resident movement strategy when: q 22 ≤ 0.90 and q 33 ≤ 0.90; Fig. 6c ). H. amphibius habitat selection All top seasonal RSF models had relatively high accuracy in predicting H. amphibius occurrence: dominant and small sub-adult H. amphibius accuracy range: 61–80%; large sub-adult accuracy range: 67–77%. Seasonal RSF models revealed that all male H. amphibius selected for areas closer to the river (distance from river coefficients), except during the wetting period where dominant and small sub-adult males selected for areas further from the river (Table 2 ). Dominant and small sub-adult males selected for less steep areas in all seasons except the peak dry period when they selected for steeper areas. Large sub-adults preferred less steep areas during the wetting period, but preferred steeper areas during the peak wet and drying periods. Table 2 Seasonal coefficient estimates from the top performing resource selection models for Hippopotamus amphibius . Season Dominant and small sub-adult males Large sub-adult males Coefficient Beta SE P Beta SE P Peak dry Intercept −9.03 0.53  0.05; Fig. 3 ). Figure 2 ( a ) Long-term home ranges (95% utilization distribution) for all male Hippopotamus amphibius ( n = 10) along the Great Ruaha River, Ruaha National Park, Tanzania (November 2016 to December 2017). Each individual is represented by a different colour. ( b ) H. amphibius grazing on green grass within its preferred habitat (floodplains) during the dry season. Figure 3 Home range size (mean ± SE) of male Hippopotamus amphibius calculated using the 95% density isopleth (utilization distribution). Data is separated by three different H. amphibius life stages and analysed within the context of four different seasons (peak dry and wetting: n = 4 dominant males, n = 2 large sub-adult males, and n = 4 small sub-adult males; peak wet and drying: n = 3 dominant males, n = 2 large sub-adult, and n = 2 small sub-adults). Letters denote significant differences ( P  0.05). Figure 5 Distance travelled away from the Great Ruaha River (mean ± SE) by the different life stage categories of male Hippopotamus amphibius in each of the seasonal sampling periods (peak dry and wetting: n = 4 dominant males, n = 2 large sub-adult males, and n = 4 small sub-adult males; peak wet and drying: n = 3 dominant males, n = 2 large sub-adult, and n = 2 small sub-adults). Letters denote significant differences ( P  0.90, q 22 > 0.90, and q 33 > 0.85; Fig. 6a ). This individual moved between multiple core areas within the sampling period. Upstream migrations (range: 3–15 km from the initial pool) occurred during the driest parts of the year and lasted ~60 days, whereas downstream migrations (range: 2–15 km below the initial pool) occurred during wetter periods of the year and lasted ~81 days (Fig. 6a ). Figure 6 Examples of Hippopotamus amphibius movement data and the corresponding pattern in net squared displacement for H. amphibius that match ( a ) migratory movement patterns, ( b ) residency and exploratory movements, and ( c ) residency around an aquatic refuge. Within H. amphibius home ranges, red denotes areas of high use and the black point represent the initial pool in which the individual was collared. Iso level refers to the density of isopleths (i.e. 0.95 reflects the 95% home range). Switching probabilities (q 11 , q 22 , and q 33 ) that were used to classify movement modes are also presented. Positive net squared displacement values reflect upstream movement while negative values denote downstream movement of H. amphibius from their starting pool. Net squared displacement values are plotted across seasons in the second column (dashed grey line): (i) peak dry, (ii) wetting, (iii) peak wet, (iv) drying, and (v) second peak dry. The second large sub-adult male also showed a pattern of transition between movement modes similar to a migratory pattern. However, this individual spent less time in the second movement mode relative to the first movement mode. As such, a movement pattern akin to exploratory resident is the most appropriate movement mode classification (Fig. 6b ). This individual remained resident around its initial pool, but explored two core areas throughout the sampling period. This individual showed similar patterns when compared to the other large sub-adult by moving upstream (range: 2–5 km and lasting 60 days) during dry periods and moving downstream (range: 5–15 km lasting 38 days) during wet periods of the year. In contrast, dominant and small sub-adult males did not exhibit large-scale up or downstream movements (Supplementary Information, Fig. S4 ). In fact, they showed highly constrained movements around their respective pools that is indicative of residency (switching probabilities for resident movement strategy when: q 22 ≤ 0.90 and q 33 ≤ 0.90; Fig. 6c ). H. amphibius habitat selection All top seasonal RSF models had relatively high accuracy in predicting H. amphibius occurrence: dominant and small sub-adult H. amphibius accuracy range: 61–80%; large sub-adult accuracy range: 67–77%. Seasonal RSF models revealed that all male H. amphibius selected for areas closer to the river (distance from river coefficients), except during the wetting period where dominant and small sub-adult males selected for areas further from the river (Table 2 ). Dominant and small sub-adult males selected for less steep areas in all seasons except the peak dry period when they selected for steeper areas. Large sub-adults preferred less steep areas during the wetting period, but preferred steeper areas during the peak wet and drying periods. Table 2 Seasonal coefficient estimates from the top performing resource selection models for Hippopotamus amphibius . Season Dominant and small sub-adult males Large sub-adult males Coefficient Beta SE P Beta SE P Peak dry Intercept −9.03 0.53 <0.001 −9.23 0.18 <0.001 Distance from river −0.99 0.27 <0.001 −0.38 0.19 0.043 Drainage −0.46 0.64 0.4986 −0.39 1.34 0.77 Short grass −0.56 0.24 0.1268 −0.3 0.38 0.434 Shrub −1.8 0.34 0.0007 −0.77 0.47 0.095 Tall grass −0.59 0.35 0.1223 −0.71 0.33 0.03 Tall tree −1.32 1.06 0.6523 −0.51 1.78 0.772 Slope 0.01 0.12 0.1446 — — — Wetting Intercept −7.98 0.31 <0.001 −8.21 0.34 <0.001 Distance from river 0.16 0.32 0.621 −0.65 0.14 <0.001 Drainage −0.32 0.33 0.327 0.02 0.56 0.972 Short grass −0.73 0.24 0.002 0.16 0.34 0.639 Shrub −1.51 0.3 <0.001 −0.78 0.16 <0.001 Tall grass −1.14 0.23 <0.001 0.07 0.22 0.748 Tall tree 1.28 1.66 0.441 −0.48 0.57 0.402 Slope −0.23 0.07 0.003 −0.06 0.13 0.665 Peak wet Intercept −8.23 0.19 <0.001 −8.95 0.31 <0.001 Distance from river −0.78 0.24 <0.001 −1.01 0.07 <0.001 Drainage 0.23 0.24 0.321 0.68 0.48 0.160 Short grass −0.3 0.23 0.179 0.05 0.11 0.673 Shrub −0.47 0.27 0.074 0.07 0.36 0.852 Tall grass −1.14 0.25 <0.001 0.14 0.48 0.772 Tall tree 10.55 3.28 <0.001 0.65 0.12 <0.001 Slope −0.09 0.13 0.524 — — — Drying Intercept −8.62 0.41 <0.001 −9.28 0.18 <0.001 Distance from river −1.41 0.46 0.002 −0.85 0.24 <0.001 Drainage −1.58 0.46 <0.001 −1.65 1.68 0.327 Short grass −1.10 0.28 <0.001 −0.57 0.13 <0.001 Shrub −2.54 0.33 <0.001 −2.29 0.32 <0.001 Tall grass −2.81 0.43 <0.001 −1.00 0.66 0.132 Tall tree −0.67 0.32 0.037 −0.92 0.70 0.188 Slope −0.20 0.06 0.331 0.18 0.06 0.001 The floodplain habitat was used as the reference category for all models and the use of other habitats is relative to the reference category. Patterns of H. amphibius selection for different habitats appeared to be strongly influenced by season. During the peak dry and drying periods, H. amphibius used all habitats less than expected when compared to floodplains (Table 2 ). However, when rainfall and river flow increased (wetting and peak wet periods), all H. amphibius moved out of the floodplains and selected for specific upland habitats. Dominant and small sub-adult males selected for tall tree habitats (both wetting and peak wet periods) and drainage lines (peak wet period). Large sub-adults, selected for drainage lines (wetting and peak wet periods), short grass habitats (wetting and peak wet periods), tall grass (wetting period only), and tall tree habitats (peak wet). Discussion Our findings represent the first high-resolution data on H. amphibius movement and insight into the mechanisms that shape their spatial ecology. Previous research on H. amphibius spatial ecology has been based upon directly observing H. amphibius as they move across landscapes and manually following H. amphibius foraging paths 42 , 43 . In addition, our results provide insight into how variation in river flow may influence the core patterns of H. amphibius movement and habitat use and which H. amphibius are most affected by this variation. Home range size and the distance travelled away from the river by H. amphibius are particularly useful core measures to better understand the basic principles for protected area design strategy for the numerous sub-Saharan African parks that host populations of H. amphibius. Futhermore, these measures can be used to gauge the potential for H. amphibius -human conflict in H. amphibius -inhabited riverine areas. On average, the resident and migratory H. amphibius we tracked occupied a home range of ~3 km 2 and 26 km 2 (averaging ~8 km 2 ), respectively during the course of our study, which is considerably smaller than other African megaherbivores such as white rhinoceros, Ceratotherium simum ~0.75–45 km 2 44 , 45 and elephant, Loxodonta Africana ~200–10,000 km 2 46 , 47 . In comparison, the smaller home ranges of H. amphibius likely derives from the need of this obligate aquatic mammal to return to their aquatic refuges daily. Tracking data also helped to quantify the distances that H. amphibius move away from rivers during their night-time foraging bouts. Previous research has reported sightings of H. amphibius ranging up to 0.3–30 km from a nearest known aquatic refuge 7 , 42 , 43 , 48 . In our study, the majority of H. amphibius movements occurred within 0.5–2 km and even the absolute maximum distance travelled away from the river that we recorded (4.7 km), fell short of the maximum distances found in other studies. Among-site differences in the distances travelled away from aquatic refugia by H. amphibius is likely related to the productivity and distribution of terrestrial resources 42 , distance to nearest watershed 48 , and the availability of temporary wallows in foraging areas 7 . This suggests that, much like other species, H. amphibius space use is context-dependent and the attributes of H. amphibius spatial ecology that we measured in Ruaha National Park should be replicated in local contexts where any spatial design strategies are being developed to better manage local H. amphibius populations. Our resource selection function models and revisitation rate analyses identified that key H. amphibius foraging areas were highly structured around the river and use of these areas declined as the distance from the river increased. These results corroborate observations made elsewhere that H. amphibius are generally central place foragers 49 and that the distance from rivers or water bodies significantly influences foraging decisions 12 . The H. amphibius tracked in our study invested more time in patches further from the river to compensate for increased travel costs. During the wet season, H. amphibius did not conform to central place foraging predictions because they are less likely to be energetically constrained by the higher availability and quality of the herbaceous layer 50 , 51 . Past observations have suggested that H. amphibius habitat use is largely constrained to open habitats 42 , 43 . However, we found that H. amphibius also selected for woody habitats. The combination of H. amphibius being a large generalist herbivore and that their key foraging areas are in close proximity to the river, which reduces energetic travel costs, likely results in H. amphibius meeting their energetic demands without having to increase search or travel time to select specific habitats. This could potentially explain why H. amphibius used many of the available habitats less than expected. Floodplains are a key resource for H. amphibius because they are able to maintain grazing lawns with short-cropped, green foliose, an important resource for H. amphibius 3 , 26 , 42 , even at the peak of the dry season (Fig. 1b ). H. amphibius only shift their habitat use when the grazing lawns in the floodplains were flooded. The small home range size and obligate dependency of H. amphibius on aquatic refugia and floodplain food resources has important implications for mitigating crop raiding and human- H. amphibius conflict. Although we did not observe crop-raiding by H. amphibius , this behaviour has been reported along the periphery of the park 52 and is a significant issue across the geographic range of H. amphibius 53 , 54 . The probability of crop raiding increases when farms are in close proximity to water sources or near H. amphibius access points to water sources 52 . Thus, by taking advantage of the limited movement of H. amphibius away from water sources, buffer zones around rivers or lacustrine environments could provide a low-cost solution to mitigate crop raiding and retaliatory killing of H. amphibius . Such riparian buffers are also well known in other management contexts to provide the added value of protecting watershed resources and providing wildlife corridors 55 , 56 . Alternatives, such as fencing farms with electric fences 54 are costly and frequently not a viable solution for rural areas. Furthermore, the resident behaviour of H. amphibius should make the identification of consistent access points viable. However, this may be more complicated for the subset of the population that displays migratory behaviour and visit multiple aquatic refugia throughout the year. The implementation of buffer zones around rivers may also afford protection to important floodplain habitats from livestock, thereby reducing potential competition between livestock and H. amphibius . Increased grazing pressure by livestock in productive floodplain habitats can increase potential competition with H. amphibius by reducing food availability 2 , 57 . Overall, the patterns of H. amphibius space use that we observed underscore the value of riparian buffer zones as a tool to both minimize human- H. amphibius conflict 53 and protect at-risk H. amphibius populations. The patterns we observed in the Ruaha watershed reveal clear variation in the movement of different H. amphibius life history stages and provides the first evidence of large-scale male dispersal in this species. Although circumstantial, the only direct evidence of dispersal in H. amphibius is from a single female in South Africa 7 . The larger home range size of large sub-adult male H. amphibius can be attributed to the elevated levels of migratory and exploratory activities of this life stage – patterns that were clearly evident in the movement mode characterizations assigned to these individuals. Other observation-based studies of H. amphibius have previously noted that it is common for large sub-adults to be excluded from pools through aggressive interactions 11 , 58 . By contrast to the elevated mobility of the large sub-adult males, small sub-adult males held much smaller home ranges that were similar to the home range size of dominant male H. amphibius , affirming that these smaller sub-adult males are tolerated in the social groups controlled by dominant males. We observed a very clear structuring influence of flow regime on certain elements of H. amphibius movement. A number of observational studies have noted that H. amphibius dispersal coincides with peak river flow 11 , 59 . However, in addition to down-stream migration during the wet season, we also observed migrations of large sub-adult males during the driest parts of the year when river flow was low (which included some of the wetting season). During this time, these large sub-adult males moved upstream away from downstream areas of the river that were drying most severely (Fig. 6a,b ). During the dry season, the Great Ruaha River dries by approximately 60% 19 , thereby greatly reducing available water sources, which results in large aggregations forming in the remaining river pools (e.g. up to 95 individuals in a single river pool) 5 , 11 . Under these conditions, aggression and competition are exaggerated, which may be forcing these large sub-adult males to disperse under less than ideal environmental conditions. This would seem to explain why the large-scale movements that we observed were diffuse and uncoordinated, which are characteristics of avoidance-driven migration 60 , 61 . Furthermore, we posit that the spatial scale of these movement patterns may be greatly exacerbated by altered river hydrology because of the effects of reduced water availability on conspecific competition. By contrast, in less water stressed environments where the availability of suitable river pools is not limited, we suggest that migration behaviour would occur at smaller spatial scales and there would be less movement between multiple unsuitable pools. These hypotheses require exploration through future tracking studies in less water-stressed environments. If food availability was a more dominant mechanism driving the observed migratory behaviours of large sub-adult males, we alternatively might have expected to find distinct seasonal movements more in accordance with the forage maturation hypothesis 62 , 63 . No such connections were observed in this study system. Furthermore, H. amphibius did not increase the distance they travelled away from the river when resources were limited during the dry season (as predicted by central place foraging theory). This suggests that food resources are not driving increased ranging behaviour, which supports our hypothesis that water availability, and not food resources, is driving the observed large-scale movements along the river. Many climate forecasts for parts of sub-Saharan Africa predict prolonged periods of drought and diminished river flow 64 , 65 . These effects may be amplified by increases in anthropogenic water abstraction, such as those associated with expansion of agriculture. Based on the patterns in our tracking results observed across more and less dry periods, we suggest that river drying would most directly affect large sub-adult male H. amphibius , forced by the drying to undertake avoidance-driven migration to escape competition and aggression. For the other males and females, other density-dependent effects, induced by drying, may be more important. These density-dependent effects include: (1) elevated disease transmission rates resulting from increased aggregation sizes 66 , (2) increased mortality from aggressive interactions 11 , and (3) increased feeding competition around water sources with large aggregations. The energetically and physiologically stressful large-scale movements of large sub-adult male H. amphibius and these density-dependent effects together present significant challenges that in conjunction with even moderate human disturbances can lead to significant H. amphibius population declines 67 . While connections between human-driven landscape aridification and H. amphibius behaviour and population health are critically important and timely to better understand, we caution against over-interpretation of the patterns we observed between seasonal drying in the Great Ruaha River and H. amphibius spatial ecology. Properly understanding these connections will require more tracking research on H. amphibius populations in less water limited regions as a point of comparison to these results as well as further longitudinal tracking work of H. amphibius in contexts that may be undergoing long-term drying. Previous studies have shown that H. amphibius vector terrestrially-derived nutrients across ecosystem boundaries, thereby significantly shaping regional ecosystem ecology and biodiversity 4 , 14 , 68 , 69 . The observations we contribute here provide a clear opportunity to understand, in a more spatially-explicit and quantitative fashion, the role that H. amphibius plays in the structure and functioning of the terrestrial and aquatic habitats with which they interact. Stears et al . 5 found that in the Great Ruaha River, river pools that maintain low-densities of H. amphibius , or no H. amphibius at all, act as important source pools during the dry season because of their ability to maintain aquatic biodiversity (no eutrophication due to low dung/nutrient inputs from H. amphibius ). Frequently, H. amphibius do not inhabit smaller river pools because these pools do not provide H. amphibius with suitable protection from the sun or predators 11 . However, during the dry season when competition for suitable river pools is high, we observed large sub-adult male H. amphibius frequently being forced to inhabit relatively small, unsuitable river pools, that were previously unoccupied by H. amphibius . A single H. amphibius can egest ~5 kg of organic matter per day 4 , thus even relatively short residency by a single H. amphibius within these smaller river pools can result in eutrophic conditions and aquatic biodiversity loss 5 . Therefore, the frequent movement of large sub-adult males between multiple river pools, as a result of exaggerated levels of competition and aggression caused by the river drying, has the potential to greatly reduce the number of available source pools that may be important in shaping local patterns of aquatic species abundance and diversity within the Great Ruaha River. A critically important caveat of this research is that we were not able to track the movements of female H. amphibius . Females were a major contributor to the increase in H. amphibius densities that we observed in riverine pools in the dry season. Dominant males allow females to freely enter their pools because it increases potential mating opportunities. Thus, we predict that when females move to a new pool, it is likely that they will set up residency in these pools, unlike the large sub-adult males that directly compete with dominant males. Future investigation that include tracking of females will be required to complete a portrait of the spatial ecology of this species, to better understand how the female population is influenced by hydrological variation, and to connect these observations to their effects on ecosystem ecology as well as to better inform H. amphibius management. In our study, we also only tracked individuals between 18h00 and 06h00, which precludes any opportunity to record any potential daytime activity or may have caused us to miss individuals that either leave or return to their pools before or after the start and ending periods for location fixes. Our camera trap and in situ observations suggested that daytime activities, however, were extremely limited. Manual inspection of GPS locations from tracked individuals also suggested that all movement paths started and ended in close proximity to the river. Based on these observations, we suggest that our sampling procedure captured the majority of H. amphibius movements in this population. Conclusions Our results provide a first view of how male H. amphibius use their environment. They highlight the clear influence that life stage and hydrological regime have on the movement ecology of H. amphibius males. In particular, during the dry season, we observed significant (~15 km) upstream movement by large sub-adult males. These movements, coupled with other secondary stressors resulting from crowding of females and other life stages of males may have deleterious effects on H. amphibius populations in increasingly water-stressed contexts. Collectively, the movements we describe and quantify here provide important insight into the spatial scale and the potential degree of connectivity provided by this ecosystem-linking species. Furthermore, these results provide important insight into how H. amphibius populations can be most effectively conserved by proper water management policies (e.g. ensuring minimum environmental flow requirements), protecting riverine and lacustrine floodplains, anticipating upstream movements and ensuring connectivity between habitats in more flow sensitive rivers, and extending management zones to buffer rivers to reduce potential for H. amphibius -human conflict. While there is more to be learnt from future work that includes the tracking of females as well as H. amphibius populations in other hydrological contexts, these results collectively contribute critical spatially-explicit insights into the drivers that shape H. amphibius spatial ecology, how these behaviours shape their environment, and how we can better design strategies to improve the management of H. amphibius populations now and into the future. Supplementary information Supplementary information Supplementary information Supplementary information is available for this paper at 10.1038/s41598-019-51845-y.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC262321/

Sequencing and Characterization of pBM400 from Bacillus megaterium QM B1551

Bacillus megaterium QM B1551 plasmid pBM400, one of seven indigenous plasmids, has been labeled with a selectable marker, isolated, completely sequenced, and partially characterized. A sequence of 53,903 bp was generated, revealing a total of 50 predicted open reading frames (ORFs); 33 were carried on one strand and 17 were carried on the other. These ORFs comprised 57% of the pBM400 sequence. Besides the replicon region and a complete rRNA operon that have previously been described, several interesting genes were found, including genes for predicted proteins for cell division (FtsZ and FtsK), DNA-RNA interaction (FtsK, Int/Rec, and reverse transcriptase), germination (CwlJ), styrene degradation (StyA), and heavy metal resistance (Cu-Cd export and ATPase). Three of the ORF products had high similarities to proteins from the Bacillus anthracis virulence plasmid pXO1. An insertion element with similarity to the IS 256 family and several hypothetical proteins similar to those from the chromosomes of other Bacillus and Lactococcus species were present. This study provides a basis for isolation and sequencing of other high-molecular-weight plasmids from QM B1551 and for understanding the role of megaplasmids in gram-positive bacteria. The genes carried by pBM400 suggest a possible role of this plasmid in the survival of B. megaterium in hostile environments with heavy metals or styrene and also suggest that there has been an exchange of genes within the gram-positive bacteria, including pathogens.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8792504/

Mechanisms and Contextual Factors Affecting the Implementation of Animal Health Surveillance in Tanzania: A Process Evaluation

A strong animal health surveillance system is an essential determinant of the health of animal and human population. To ensure its functionality and performance, it needs to be evaluated regularly. Therefore, a process evaluation was conducted in this study to assess animal health surveillance processes, mechanisms and the contextual factors which facilitate or hinder uptake, implementation and sustainability of the system in Tanzania. A mixed-method study design was used to evaluate the national animal health surveillance system guided by a framework for process evaluation of complex interventions developed by Moore and others. The system was assessed against standard guidelines and procedures using the following attributes: fidelity, adherence, exposure, satisfaction, participation rate, recruitment and context. Quantitative and qualitative data were collected using a cross-sectional survey, key informant interviews, document review, site visits and non-participant observation. Data from questionnaires were downloaded, cleaned and analyzed in Microsoft™ Excel. Qualitative data were analyzed following deductive thematic and content analysis methods. Fidelity attribute showed that case identification is mainly based on clinical signs due to limited laboratory services for confirmation. Data collection was not well-coordinated and there were multiple disparate reporting channels. Adherence in terms of the proportion of reports submitted per month was only 61% of the target. District-level animal health officials spent an average of 60% of their weekly time on surveillance-related activities, but only 12% of them were satisfied with the surveillance system. Their dissatisfaction was caused by large area coverage with little to no facilitation, poor communication, and lack of a supporting system. The cost of surveillance data was found to be 1.4 times higher than the annual surveillance budget. The timeliness of the system ranged between 0 and 153 days from the observation date (median = 2 days, mean = 6 days). The study pointed out some deviations in animal health surveillance processes from the standard guidelines and their implication on the system's performance. The system could be improved by developing a user-friendly unified reporting system, the active involvement of subnational level animal health officials, optimization of data sources and an increase in the horizon of the financing mechanism. Introduction In the last three decades, there has been increased attention on strengthening health surveillance systems in both animals and humans due to increased threats on emergence and re-emergence of infectious diseases and bioterrorism amplified by cross-border activities among countries, animal movements and livestock trades. A robust animal health surveillance system is a determining factor of the health of animal and human populations. It is used to predict public health risks ( 1 ), provide early warning for natural hazards and bioterrorism ( 2 ), and enable the disease-free movement of animals and animal-derived products ( 3 ). The information and outputs of the surveillance programmes help to set priorities and guide effective disease prevention and control strategies ( 4 ). The ability of the system to meet its surveillance objectives is determined by how the data are collected, analyzed and used in solving animal health-related problems. Therefore, to ensure that the systems provide timely and reliable information for planning and decision making and that resources are used efficiently, surveillance systems need to be evaluated regularly ( 5 ). The purpose of an evaluation is to assess the functionality, performance and efficiency of a system and to generate recommendations for improvement. Once implemented, they will help to improve the surveillance information provided and thereby help improve service provision and delivery. In early warning surveillance, it is necessary to evaluate the relevance of the selected events, how the system can detect and report them, and how the system can respond to them ( 6 ). Evaluation of surveillance programmes is also essential to ensure that limited resources are effectively used to provide the evidence required for protecting animal health ( 7 ). Several evaluation methods have been developed for health surveillance systems, but most of them are from the public health field, while few are from animal health ( 7 , 8 ). Common evaluation methods mainly apply quantitative approaches such as simulation models, measuring the proportion of cases reported and comparing one system with another; only few use qualitative approaches ( 7 ). Furthermore, evaluation is commonly based on the attributes of the systems where the most frequently assessed performance attributes are sensitivity, timeliness and data quality ( 7 ). Process evaluation, a predominantly qualitative approach, explains how and why decisions are made, and activities undertaken and assess the reasons for the successful and unsuccessful performance of the programme ( 9 ). The primary aim of process evaluation is to determine whether programme activities have been implemented as intended and where they have resulted in certain outputs. By understanding of the processes underpinning the programme's implementation using standardized variables, it will be possible to determine the link between performance, outcomes and factors influencing the implementation ( 10 ). It helps to make a distinction between implementation failure and theory failure. Tanzania's animal health surveillance system has been evaluated using various tools, namely the OIE Performance of Veterinary Services (PVS) evaluation in 2008 and 2016, PVS Gap analysis in 2009 and the FAO Surveillance Evaluation Tool (SET) in 2017. The system was also subjected to a Joint External Evaluation (JEE) in 2016. The second PVS evaluation of 2016 pointed out technical strengths and weaknesses of the surveillance, among other components. It showed that the technical authorities and capacities had not changed since the 2008 evaluation. The underreporting was still high, and more than 90% of the reports were based on clinical signs without laboratory confirmation. Further, there was a limited number of veterinary paraprofessionals, inadequate in-service trainings on surveillance and disease control, insufficient funding and an unclear communication chain ( 11 ). The JEE 2016 results were consistent with the second PVS evaluation of the same year ( 12 ). The SET 2017 report highlighted strengths in the analytical aspects of laboratory, epidemiology workforce management, training, and internal communication. It also pointed out areas that needed improvement, including unclear roles and responsibilities of partners in the surveillance system, limited supervision, partial harmonization of surveillance activities at the field level, low inter-sectoral collaboration and limited integration between laboratories and the wider surveillance system ( 13 ). All these evaluation tools are voluntary, applied by countries upon request and commonly used for self-assessment; overall they aim at identifying critical gaps, strengths and weaknesses in the systemThe PVS and JEE tools focus on the entire veterinary and health service delivery system, of which animal health surveillance is just one of the components. The SET is exclusively dedicated to the assessment of animal health surveillance systems. The tool is relatively new since it was piloted for the first time in Tanzania in 2017 before being adopted by other countries. Unlike the previous evaluation tools which focused on technical and resource capacities and capabilities using pre-defined set of indicators and scoring system, this study aimed to evaluate surveillance processes, mechanisms and the contextual factors which facilitate or hinder uptake, implementation and sustainability of the system. Using a process evaluation approach, the objectives were to: Evaluate whether animal health surveillance in Tanzania is implemented as per national and international guidelines. Understand what and how contextual factors influence the implementation of animal health surveillance activities. Explore how implementation processes are linked to the surveillance outcomes. This study identifies factors related to the successful implementation of animal health surveillance in Tanzania. The evaluation results may provide more insights on intervention areas for improving the surveillance system. Materials and Methods Study Setting: Tanzania Animal Health Surveillance System The study involved the national animal health surveillance system in Tanzania, coordinated by the Ministry of Livestock and Fisheries (MoLF) through the epidemiology unit in the Directorate of Veterinary Services (DVS). It is a multi-objective system focused on understanding the disease distribution, the introduction of new strains, risks of disease introduction, and vaccination efficiency. The system covers both domestic and wildlife animals. Figure 1 illustrates Tanzania's animal health surveillance reporting structure involving local government authorities, zonal veterinary centres, Tanzania veterinary laboratory agency (TVLA), Tanzania Wildlife research Institute (TAWIRI) and DVS. The primary providers of surveillance information are farmers at the farm level, livestock field officers (LFOs), and district veterinary officers (DVOs) who collect information from veterinary facilities in the areas of jurisdiction. At the zoo-sanitary checkpoints, inspectors are the point of capture, while in wildlife, data flow starts from the park warden. TVLA tests biological samples from zonal veterinary centres (ZVCs) and private clients while TAWIRI tests samples on few selected diseases from wildlife and livestock in the interfaces on annual basis or whenever there is an outbreak. Currently, the two institutions only report notifiable diseases to DVS. The generated reports are shared with various stakeholders, including ministries and international organizations such as World Organization for Animal Health (OIE), East African Community (EAC), African Union (AU), Southern African Development Community (SADC), and Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). Figure 1 Tanzania's animal health surveillance reporting structure. Surveillance activities include the mandatory reporting of notifiable diseases as per the Animal Disease Act of 2003 and international bodies such as OIE and FAO, ante-mortem and post-mortem inspection reports from slaughter facilities, visual inspection reports from animal congregational areas such as dipping sites, livestock markets and checkpoints, reports on zoonotic diseases and laboratory-based surveillance. George et al. ( 16 ) provided a detailed description of each data source including information collected and coverage. The study involved multi-level data collection. At the national level, seven institutions and six veterinary facilities were conveniently sampled and visited. The institutions included the MoLF, TVLA, TAWIRI, three ZVCs. The visited veterinary facilities included three zoo-sanitary checkpoints, two private poultry farms, and a cattle ranch. The field investigation was conducted in three districts: Kibaha, Ngorongoro and Kongwa ( Figure 2 ). Selection criteria included the livestock production system, location, cross-border interaction and level of intervention activities in the district. Ngorongoro has high pastoral with a unique human-livestock-wildlife interface. Its closeness to a bordering country (Kenya) was an excellent opportunity to observe cross-border activities related to surveillance and ongoing intervention activities on improvement of human and animal health surveillance systems through mobile technologies. Kibaha is a peri-urban district with mixed livestock production systems, and it was included to observe whether proximity to the city (Dar es Salaam) and has also received some interventions on the improvement of the surveillance system. Kongwa is characterized by high pastoral activities, including national ranches but received interventions in terms of surveillance improvement. From the districts, 10 administrative divisions (hereafter called "wards") were randomly selected using a random number generator from a list obtained from district economic profile reports and census data. The selection process of the study areas has been explained in detail elsewhere ( 16 ). Figure 2 Map of the study districts and zoo-sanitary checkpoints [Personal creation using QGIS version 3.12.3-Bucureşti ( 14 )]. Process Evaluation Framework The study design was guided by a framework for process evaluation of complex interventions developed by Moore et al. ( 15 ). Although the framework was originally designed for the evaluation of public health interventions it is highly relevant in other domains as it embrace the systems perspective ( 17 ). It has been adapted in this study in order to understand the relationships between animal health surveillance implementation, mechanisms and context in wholesomeness. The framework consists of three main components: implementation, mechanisms of impact, and context. The implementation component captures what is delivered by looking at whether the surveillance components were delivered as intended (fidelity), how they were delivered (completeness/adherence), and the level of exposure (interaction) to the system. Mechanisms of impact explore how the delivered surveillance components produce outcomes by testing and establishing causal pathways using qualitative and quantitative data. Data were collected based on seven process evaluation attributes: fidelity, completeness, exposure, satisfaction, participation rate, recruitment and context. In order to fit the context of this study, the framework has been adapted by replacing intervention with animal health surveillance as illustrated in Figure 3 , and defined evaluation attributes as applied in the study ( Table 1 ) while maintaining the key components. Figure 3 Process evaluation framework adapted from Moore et al. ( 15 ) (amour colored boxes are the key components of a process evaluation. Investigation of these components is shaped by a clear description of the surveillance system which also informs interpretation of outcomes). Table 1 Process evaluation attributes and data collection instruments. No . Attributes and original definitions Application of terms in this study Data collection instrument Participants/information source 1 Description of the ideal surveillance system and causal assumptions Key informant interviews Ministry of Livestock and Fisheries 2 Fidelity Whether the intervention was delivered as intended The extent to which the surveillance components have been implemented as per guideline. The following processes were assessed: case identification, reporting, analysis and interpretation, investigation, response and feedback Questionnaire, record review and non-participant observation Ministry of Livestock and Fisheries, Livestock field officers, District veterinary officers, Tanzania veterinary laboratory agency, Zonal veterinary centres 3 Adherence Proportion of units delivered against the intended as per protocol Number of surveillance reports submitted on time Key informant interviews and record review District veterinary officers, Ministry of Livestock and Fisheries 4 Exposure Extent to which the participants were engaged and interact with the system . It entailed levels of participation in surveillance activities, communication and feedback mechanisms and training related to surveillance Questionnaire District veterinary officers, Livestock field officers, 5 Satisfaction The level of participants' satisfaction with the programme Respondents' satisfaction with how the system works. It was measured through ranking using the Likert scale. Questionnaire District veterinary officers, Livestock field officers, 6 Participation The proportion of intended target audience that participates in an intervention Proportion of respondents who participated in the surveillance system and barriers to their participation. It was measured by the proportion of total working time dedicated to the surveillance activities Questionnaire District veterinary officers, Livestock field officers, 7 Recruitment Procedures used to approach and attract participants Procedures for recruiting human resource in the systems and sustaining them in the surveillance activities. This was assessed using the education background of animal health professionals, on-job trainings and refresher trainings Questionnaire and key informant interviews Ministry of Livestock and Fisheries, Livestock field officers, District veterinary officers, Zonal veterinary centres 8 Context Aspects of the larger social, political, and economic environment that may influence intervention Aspects of the larger social, political, and economic environment that may influence animal health surveillance implementation Questionnaire, key informant interviews and record review Ministry of Livestock and Fisheries, Livestock field officers, District veterinary officers, Tanzania veterinary laboratory agency, Zonal veterinary centres Contextual factors entail all the environmental influences on the surveillance implementation and outcomes. Factors affecting the implementation of animal heath surveillance were grouped into four categories namely: organizational factors, systems characteristics, actors' characteristics and the support system and they are regarded as internal contextual factors of the system ( Figure 4 ). However, the system doesn't operate in isolation and its operations are dependent on the external factors such as legal frameworks, the political environment and funding. Figure 4 Contextual factors for the implementation of animal health surveillance. The four compartments represent the internal contextual factors of the surveillance system surrounded by external contextual factors in the outer layer which together influence the implementation of the animal health surveillance. The following outcome variables were included: timeliness, quality of data, usefulness and simplicity, guided by the WHO protocol for evaluation of epidemiological surveillance system ( 6 ). Selection of Participants The selection of participants combined random and purposive sampling based on their role in animal health surveillance and designations at their respective institutions. The purposive sampling technique, also called judgment sampling, is the deliberate choice of an informant due to the qualities the informant possesses ( 18 ). At the ward level, respondents were LFOs and officers in-charge of the public veterinary facilities. At the district level, DVOs or district livestock officers and livestock officers in-charge of district-level veterinary facilities such as slaughterhouses and livestock markets were interviewed. At the zonal level, respondents were officers in charge of ZVCs and livestock officers at zoo-sanitary checkpoints. At the national level, the interviews were conducted with senior officials responsible for animal health surveillance. Data Collection Questionnaire Administration A structured questionnaire for the quantitative cross-sectional survey was administered to LFOs and DVOs through face-to-face interviews conducted in Swahili language by the first author. The questionnaire included the following closed questions: area coverage, the respondent's role in surveillance, data collection and transmission procedures, communication channels to stakeholders, time dedicated to surveillance activities, conversance with data collection tools, facilitation and costs incurred during implementation of activities, recruitment and trainings. A Likert scale was used to establish participants' satisfaction with the current animal health surveillance system (1-not satisfied at all, 5-highly satisfied). Open-ended questions captured challenges during the implementation of surveillance activities and proposed system improvements. Data were collected using Open Data Kit (ODK). Key Informant Interviews Semi-structured interviews were conducted with DVOs, in-charge of veterinary facilities, zoo-sanitary checkpoints, and ZVCs. The focus of the interviews was on the data generated and collected from the sources in their designated areas, data management, standard operating procedures (SOPs), and supervision of field staff, the status of the facilities and workforce, internal and external communication and triangulation of some of the data collected through other methods. The interviews were audio-recorded and later transcribed for data analysis. Site Visits to Veterinary Facilities and Non-participant Observation These methods were used to assess the physical conditions of the veterinary facilities, observe the practices on the sites to compare them with the SOPs established by the animal health authorities and triangulate data obtained through other methods. The visited veterinary facilities included cattle dipping sites, zoo-sanitary checkpoints, slaughter facilities and livestock markets. During the observation, the first author found an inconspicuous spot took notes on the ongoing events and scenes notes on the scenes in real-time. The researcher informed the participants about the reasons for their presence so that they did not change their normal practices and sometimes had post-observation informal interviews with some of them to clarify what was happening and why. The observation period was 1–4 h, and field notes were taken for later analysis. The purpose of the observation was to observe participants' practices and behavior patterns while routine surveillance-related activities went on. Record Review The reviewed records comprised of monthly reports for 2018/2019 data from Agricultural Routine Data system (ARDS), an official data collection system in the agricultural sector and year 2020 from FAO EMPRES Global Animal Disease Information System (EMPRES-i) which were made available by DVOs and National veterinary epidemiologist respectively. Weekly reports, SOPs documents and animal disease surveillance forms were obtained from MoLF and TVLA while the legal and policy documents were collected from the official government portal ( https://www.tanzania.go.tz/ ), and other websites. The document review was necessary for triangulation and gathering comprehensive information, which were not readily available through other methods ( 19 ). Data on the surveillance budget were obtained from the annual ministerial budget speech and the Policy and Planning Division of the MoLF which is responsible for budgeting and planning. Data Processing and Analysis Statistical Analysis Data from questionnaires were downloaded, cleaned and analyzed using Microsoft™ Excel. Descriptive statistics using frequency and simple percentages were obtained to summarize participants' demographics, report submission rate, participation and area coverage. Estimation Methods Cost of surveillance data included labor charges, data collection, transmission, compilation and analysis at ward, district, zonal and ministry levels. Costs of surveillance data per LFO were calculated by adding the cost of data collection to the cost of transmission with the assumption that every time LFOs do routine visits to the village, they also collect surveillance data. The cost of data collection was calculated by multiplying the total distance traveled per month by the average cost per kilometer. The respondents provided the cost of transmission to the district level during questionnaire administration. The calculation of the costs per kilometer was done using a motorbike as a means of transport as reported by the majority of the LFOs. The average prices of petrol per liter for 2019 were 2375TZS (Ngorongoro), 2256TZS (Kongwa) and 2205TZS (Kibaha) ( 20 ). It was estimated that motorbike can use 1 liter per 20 kms based on the informal interviews with random five motorbike riders. The average surveillance data cost per LFO was then multiplied by the number of wards in the country to get the total cost national-wide. There were a total of 3,956 wards in the country ( 21 ). A n n u a l c o s t o f s u r v e i l l a n c e d a t a p e r L F O = d i s t a n c e y e a r x c o s t k i l o m e t r e + c o s t o f d a t a t r a n s m i s s i o n Where; T o t a l d i s t a n c e = n u m b e r o f v i l l a g e x a v e r a g e d i s t a n c e t r a v e l e d p e r m o n t h And T o t a l c o s t o f s u r v e i l l a n c e d a t a = T o t a c o s t a t w a r d l e v e l + c o s t a t d i s t r i c t l e v e l + c o s t a t z o n a l l e v e l + c o s t a t m i n i s t r y l e v e l EMAi-Dataset: Raw data from EMPRES-i database for the year 2020 was downloaded in CSV format and cleaned for analysis of timeliness. Timeliness was measured as difference between observation date and reporting date. Mean, median and rate timeliness also were estimated. Proportion of monthly reports received at national level was calculated by dividing the total number of monthly reports received from the districts with the total number of monthly reports expected at national level. It should be noted that the reporting is done weekly, and analysis considered all the LGAs which have been reported at least once in that month. Data for surveillance budget analysis: A 5-year surveillance budget analysis (2015/2016–2019/2020) was conducted by extracting surveillance items in the main budgets. However, it was very difficult to separate surveillance activities from disease prevention and control. Therefore, the analysis included all items mentioned in disease prevention and control in addition to explicitly mentioned surveillance items. Qualitative Data Analysis Data collected through non-participant observation and site visits were organized and summarized in Microsoft Word. Audio recordings obtained during key informants interviews were transcribed and translated from Swahili into English. Qualitative data were analyzed following deductive thematic analysis. Thematic analysis was guided by Joffe and Yardley ( 22 ), whereby data were reviewed, manually coded in MS Word and clustered to establish themes. Documents reviewed were analyzed by using content analysis method ( 23 ) which involves open coding of the potential words of interest, creation of categories and abstraction. Study Setting: Tanzania Animal Health Surveillance System The study involved the national animal health surveillance system in Tanzania, coordinated by the Ministry of Livestock and Fisheries (MoLF) through the epidemiology unit in the Directorate of Veterinary Services (DVS). It is a multi-objective system focused on understanding the disease distribution, the introduction of new strains, risks of disease introduction, and vaccination efficiency. The system covers both domestic and wildlife animals. Figure 1 illustrates Tanzania's animal health surveillance reporting structure involving local government authorities, zonal veterinary centres, Tanzania veterinary laboratory agency (TVLA), Tanzania Wildlife research Institute (TAWIRI) and DVS. The primary providers of surveillance information are farmers at the farm level, livestock field officers (LFOs), and district veterinary officers (DVOs) who collect information from veterinary facilities in the areas of jurisdiction. At the zoo-sanitary checkpoints, inspectors are the point of capture, while in wildlife, data flow starts from the park warden. TVLA tests biological samples from zonal veterinary centres (ZVCs) and private clients while TAWIRI tests samples on few selected diseases from wildlife and livestock in the interfaces on annual basis or whenever there is an outbreak. Currently, the two institutions only report notifiable diseases to DVS. The generated reports are shared with various stakeholders, including ministries and international organizations such as World Organization for Animal Health (OIE), East African Community (EAC), African Union (AU), Southern African Development Community (SADC), and Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). Figure 1 Tanzania's animal health surveillance reporting structure. Surveillance activities include the mandatory reporting of notifiable diseases as per the Animal Disease Act of 2003 and international bodies such as OIE and FAO, ante-mortem and post-mortem inspection reports from slaughter facilities, visual inspection reports from animal congregational areas such as dipping sites, livestock markets and checkpoints, reports on zoonotic diseases and laboratory-based surveillance. George et al. ( 16 ) provided a detailed description of each data source including information collected and coverage. The study involved multi-level data collection. At the national level, seven institutions and six veterinary facilities were conveniently sampled and visited. The institutions included the MoLF, TVLA, TAWIRI, three ZVCs. The visited veterinary facilities included three zoo-sanitary checkpoints, two private poultry farms, and a cattle ranch. The field investigation was conducted in three districts: Kibaha, Ngorongoro and Kongwa ( Figure 2 ). Selection criteria included the livestock production system, location, cross-border interaction and level of intervention activities in the district. Ngorongoro has high pastoral with a unique human-livestock-wildlife interface. Its closeness to a bordering country (Kenya) was an excellent opportunity to observe cross-border activities related to surveillance and ongoing intervention activities on improvement of human and animal health surveillance systems through mobile technologies. Kibaha is a peri-urban district with mixed livestock production systems, and it was included to observe whether proximity to the city (Dar es Salaam) and has also received some interventions on the improvement of the surveillance system. Kongwa is characterized by high pastoral activities, including national ranches but received interventions in terms of surveillance improvement. From the districts, 10 administrative divisions (hereafter called "wards") were randomly selected using a random number generator from a list obtained from district economic profile reports and census data. The selection process of the study areas has been explained in detail elsewhere ( 16 ). Figure 2 Map of the study districts and zoo-sanitary checkpoints [Personal creation using QGIS version 3.12.3-Bucureşti ( 14 )]. Process Evaluation Framework The study design was guided by a framework for process evaluation of complex interventions developed by Moore et al. ( 15 ). Although the framework was originally designed for the evaluation of public health interventions it is highly relevant in other domains as it embrace the systems perspective ( 17 ). It has been adapted in this study in order to understand the relationships between animal health surveillance implementation, mechanisms and context in wholesomeness. The framework consists of three main components: implementation, mechanisms of impact, and context. The implementation component captures what is delivered by looking at whether the surveillance components were delivered as intended (fidelity), how they were delivered (completeness/adherence), and the level of exposure (interaction) to the system. Mechanisms of impact explore how the delivered surveillance components produce outcomes by testing and establishing causal pathways using qualitative and quantitative data. Data were collected based on seven process evaluation attributes: fidelity, completeness, exposure, satisfaction, participation rate, recruitment and context. In order to fit the context of this study, the framework has been adapted by replacing intervention with animal health surveillance as illustrated in Figure 3 , and defined evaluation attributes as applied in the study ( Table 1 ) while maintaining the key components. Figure 3 Process evaluation framework adapted from Moore et al. ( 15 ) (amour colored boxes are the key components of a process evaluation. Investigation of these components is shaped by a clear description of the surveillance system which also informs interpretation of outcomes). Table 1 Process evaluation attributes and data collection instruments. No . Attributes and original definitions Application of terms in this study Data collection instrument Participants/information source 1 Description of the ideal surveillance system and causal assumptions Key informant interviews Ministry of Livestock and Fisheries 2 Fidelity Whether the intervention was delivered as intended The extent to which the surveillance components have been implemented as per guideline. The following processes were assessed: case identification, reporting, analysis and interpretation, investigation, response and feedback Questionnaire, record review and non-participant observation Ministry of Livestock and Fisheries, Livestock field officers, District veterinary officers, Tanzania veterinary laboratory agency, Zonal veterinary centres 3 Adherence Proportion of units delivered against the intended as per protocol Number of surveillance reports submitted on time Key informant interviews and record review District veterinary officers, Ministry of Livestock and Fisheries 4 Exposure Extent to which the participants were engaged and interact with the system . It entailed levels of participation in surveillance activities, communication and feedback mechanisms and training related to surveillance Questionnaire District veterinary officers, Livestock field officers, 5 Satisfaction The level of participants' satisfaction with the programme Respondents' satisfaction with how the system works. It was measured through ranking using the Likert scale. Questionnaire District veterinary officers, Livestock field officers, 6 Participation The proportion of intended target audience that participates in an intervention Proportion of respondents who participated in the surveillance system and barriers to their participation. It was measured by the proportion of total working time dedicated to the surveillance activities Questionnaire District veterinary officers, Livestock field officers, 7 Recruitment Procedures used to approach and attract participants Procedures for recruiting human resource in the systems and sustaining them in the surveillance activities. This was assessed using the education background of animal health professionals, on-job trainings and refresher trainings Questionnaire and key informant interviews Ministry of Livestock and Fisheries, Livestock field officers, District veterinary officers, Zonal veterinary centres 8 Context Aspects of the larger social, political, and economic environment that may influence intervention Aspects of the larger social, political, and economic environment that may influence animal health surveillance implementation Questionnaire, key informant interviews and record review Ministry of Livestock and Fisheries, Livestock field officers, District veterinary officers, Tanzania veterinary laboratory agency, Zonal veterinary centres Contextual factors entail all the environmental influences on the surveillance implementation and outcomes. Factors affecting the implementation of animal heath surveillance were grouped into four categories namely: organizational factors, systems characteristics, actors' characteristics and the support system and they are regarded as internal contextual factors of the system ( Figure 4 ). However, the system doesn't operate in isolation and its operations are dependent on the external factors such as legal frameworks, the political environment and funding. Figure 4 Contextual factors for the implementation of animal health surveillance. The four compartments represent the internal contextual factors of the surveillance system surrounded by external contextual factors in the outer layer which together influence the implementation of the animal health surveillance. The following outcome variables were included: timeliness, quality of data, usefulness and simplicity, guided by the WHO protocol for evaluation of epidemiological surveillance system ( 6 ). Selection of Participants The selection of participants combined random and purposive sampling based on their role in animal health surveillance and designations at their respective institutions. The purposive sampling technique, also called judgment sampling, is the deliberate choice of an informant due to the qualities the informant possesses ( 18 ). At the ward level, respondents were LFOs and officers in-charge of the public veterinary facilities. At the district level, DVOs or district livestock officers and livestock officers in-charge of district-level veterinary facilities such as slaughterhouses and livestock markets were interviewed. At the zonal level, respondents were officers in charge of ZVCs and livestock officers at zoo-sanitary checkpoints. At the national level, the interviews were conducted with senior officials responsible for animal health surveillance. Data Collection Questionnaire Administration A structured questionnaire for the quantitative cross-sectional survey was administered to LFOs and DVOs through face-to-face interviews conducted in Swahili language by the first author. The questionnaire included the following closed questions: area coverage, the respondent's role in surveillance, data collection and transmission procedures, communication channels to stakeholders, time dedicated to surveillance activities, conversance with data collection tools, facilitation and costs incurred during implementation of activities, recruitment and trainings. A Likert scale was used to establish participants' satisfaction with the current animal health surveillance system (1-not satisfied at all, 5-highly satisfied). Open-ended questions captured challenges during the implementation of surveillance activities and proposed system improvements. Data were collected using Open Data Kit (ODK). Key Informant Interviews Semi-structured interviews were conducted with DVOs, in-charge of veterinary facilities, zoo-sanitary checkpoints, and ZVCs. The focus of the interviews was on the data generated and collected from the sources in their designated areas, data management, standard operating procedures (SOPs), and supervision of field staff, the status of the facilities and workforce, internal and external communication and triangulation of some of the data collected through other methods. The interviews were audio-recorded and later transcribed for data analysis. Site Visits to Veterinary Facilities and Non-participant Observation These methods were used to assess the physical conditions of the veterinary facilities, observe the practices on the sites to compare them with the SOPs established by the animal health authorities and triangulate data obtained through other methods. The visited veterinary facilities included cattle dipping sites, zoo-sanitary checkpoints, slaughter facilities and livestock markets. During the observation, the first author found an inconspicuous spot took notes on the ongoing events and scenes notes on the scenes in real-time. The researcher informed the participants about the reasons for their presence so that they did not change their normal practices and sometimes had post-observation informal interviews with some of them to clarify what was happening and why. The observation period was 1–4 h, and field notes were taken for later analysis. The purpose of the observation was to observe participants' practices and behavior patterns while routine surveillance-related activities went on. Record Review The reviewed records comprised of monthly reports for 2018/2019 data from Agricultural Routine Data system (ARDS), an official data collection system in the agricultural sector and year 2020 from FAO EMPRES Global Animal Disease Information System (EMPRES-i) which were made available by DVOs and National veterinary epidemiologist respectively. Weekly reports, SOPs documents and animal disease surveillance forms were obtained from MoLF and TVLA while the legal and policy documents were collected from the official government portal ( https://www.tanzania.go.tz/ ), and other websites. The document review was necessary for triangulation and gathering comprehensive information, which were not readily available through other methods ( 19 ). Data on the surveillance budget were obtained from the annual ministerial budget speech and the Policy and Planning Division of the MoLF which is responsible for budgeting and planning. Questionnaire Administration A structured questionnaire for the quantitative cross-sectional survey was administered to LFOs and DVOs through face-to-face interviews conducted in Swahili language by the first author. The questionnaire included the following closed questions: area coverage, the respondent's role in surveillance, data collection and transmission procedures, communication channels to stakeholders, time dedicated to surveillance activities, conversance with data collection tools, facilitation and costs incurred during implementation of activities, recruitment and trainings. A Likert scale was used to establish participants' satisfaction with the current animal health surveillance system (1-not satisfied at all, 5-highly satisfied). Open-ended questions captured challenges during the implementation of surveillance activities and proposed system improvements. Data were collected using Open Data Kit (ODK). Key Informant Interviews Semi-structured interviews were conducted with DVOs, in-charge of veterinary facilities, zoo-sanitary checkpoints, and ZVCs. The focus of the interviews was on the data generated and collected from the sources in their designated areas, data management, standard operating procedures (SOPs), and supervision of field staff, the status of the facilities and workforce, internal and external communication and triangulation of some of the data collected through other methods. The interviews were audio-recorded and later transcribed for data analysis. Site Visits to Veterinary Facilities and Non-participant Observation These methods were used to assess the physical conditions of the veterinary facilities, observe the practices on the sites to compare them with the SOPs established by the animal health authorities and triangulate data obtained through other methods. The visited veterinary facilities included cattle dipping sites, zoo-sanitary checkpoints, slaughter facilities and livestock markets. During the observation, the first author found an inconspicuous spot took notes on the ongoing events and scenes notes on the scenes in real-time. The researcher informed the participants about the reasons for their presence so that they did not change their normal practices and sometimes had post-observation informal interviews with some of them to clarify what was happening and why. The observation period was 1–4 h, and field notes were taken for later analysis. The purpose of the observation was to observe participants' practices and behavior patterns while routine surveillance-related activities went on. Record Review The reviewed records comprised of monthly reports for 2018/2019 data from Agricultural Routine Data system (ARDS), an official data collection system in the agricultural sector and year 2020 from FAO EMPRES Global Animal Disease Information System (EMPRES-i) which were made available by DVOs and National veterinary epidemiologist respectively. Weekly reports, SOPs documents and animal disease surveillance forms were obtained from MoLF and TVLA while the legal and policy documents were collected from the official government portal ( https://www.tanzania.go.tz/ ), and other websites. The document review was necessary for triangulation and gathering comprehensive information, which were not readily available through other methods ( 19 ). Data on the surveillance budget were obtained from the annual ministerial budget speech and the Policy and Planning Division of the MoLF which is responsible for budgeting and planning. Data Processing and Analysis Statistical Analysis Data from questionnaires were downloaded, cleaned and analyzed using Microsoft™ Excel. Descriptive statistics using frequency and simple percentages were obtained to summarize participants' demographics, report submission rate, participation and area coverage. Estimation Methods Cost of surveillance data included labor charges, data collection, transmission, compilation and analysis at ward, district, zonal and ministry levels. Costs of surveillance data per LFO were calculated by adding the cost of data collection to the cost of transmission with the assumption that every time LFOs do routine visits to the village, they also collect surveillance data. The cost of data collection was calculated by multiplying the total distance traveled per month by the average cost per kilometer. The respondents provided the cost of transmission to the district level during questionnaire administration. The calculation of the costs per kilometer was done using a motorbike as a means of transport as reported by the majority of the LFOs. The average prices of petrol per liter for 2019 were 2375TZS (Ngorongoro), 2256TZS (Kongwa) and 2205TZS (Kibaha) ( 20 ). It was estimated that motorbike can use 1 liter per 20 kms based on the informal interviews with random five motorbike riders. The average surveillance data cost per LFO was then multiplied by the number of wards in the country to get the total cost national-wide. There were a total of 3,956 wards in the country ( 21 ). A n n u a l c o s t o f s u r v e i l l a n c e d a t a p e r L F O = d i s t a n c e y e a r x c o s t k i l o m e t r e + c o s t o f d a t a t r a n s m i s s i o n Where; T o t a l d i s t a n c e = n u m b e r o f v i l l a g e x a v e r a g e d i s t a n c e t r a v e l e d p e r m o n t h And T o t a l c o s t o f s u r v e i l l a n c e d a t a = T o t a c o s t a t w a r d l e v e l + c o s t a t d i s t r i c t l e v e l + c o s t a t z o n a l l e v e l + c o s t a t m i n i s t r y l e v e l EMAi-Dataset: Raw data from EMPRES-i database for the year 2020 was downloaded in CSV format and cleaned for analysis of timeliness. Timeliness was measured as difference between observation date and reporting date. Mean, median and rate timeliness also were estimated. Proportion of monthly reports received at national level was calculated by dividing the total number of monthly reports received from the districts with the total number of monthly reports expected at national level. It should be noted that the reporting is done weekly, and analysis considered all the LGAs which have been reported at least once in that month. Data for surveillance budget analysis: A 5-year surveillance budget analysis (2015/2016–2019/2020) was conducted by extracting surveillance items in the main budgets. However, it was very difficult to separate surveillance activities from disease prevention and control. Therefore, the analysis included all items mentioned in disease prevention and control in addition to explicitly mentioned surveillance items. Qualitative Data Analysis Data collected through non-participant observation and site visits were organized and summarized in Microsoft Word. Audio recordings obtained during key informants interviews were transcribed and translated from Swahili into English. Qualitative data were analyzed following deductive thematic analysis. Thematic analysis was guided by Joffe and Yardley ( 22 ), whereby data were reviewed, manually coded in MS Word and clustered to establish themes. Documents reviewed were analyzed by using content analysis method ( 23 ) which involves open coding of the potential words of interest, creation of categories and abstraction. Statistical Analysis Data from questionnaires were downloaded, cleaned and analyzed using Microsoft™ Excel. Descriptive statistics using frequency and simple percentages were obtained to summarize participants' demographics, report submission rate, participation and area coverage. Estimation Methods Cost of surveillance data included labor charges, data collection, transmission, compilation and analysis at ward, district, zonal and ministry levels. Costs of surveillance data per LFO were calculated by adding the cost of data collection to the cost of transmission with the assumption that every time LFOs do routine visits to the village, they also collect surveillance data. The cost of data collection was calculated by multiplying the total distance traveled per month by the average cost per kilometer. The respondents provided the cost of transmission to the district level during questionnaire administration. The calculation of the costs per kilometer was done using a motorbike as a means of transport as reported by the majority of the LFOs. The average prices of petrol per liter for 2019 were 2375TZS (Ngorongoro), 2256TZS (Kongwa) and 2205TZS (Kibaha) ( 20 ). It was estimated that motorbike can use 1 liter per 20 kms based on the informal interviews with random five motorbike riders. The average surveillance data cost per LFO was then multiplied by the number of wards in the country to get the total cost national-wide. There were a total of 3,956 wards in the country ( 21 ). A n n u a l c o s t o f s u r v e i l l a n c e d a t a p e r L F O = d i s t a n c e y e a r x c o s t k i l o m e t r e + c o s t o f d a t a t r a n s m i s s i o n Where; T o t a l d i s t a n c e = n u m b e r o f v i l l a g e x a v e r a g e d i s t a n c e t r a v e l e d p e r m o n t h And T o t a l c o s t o f s u r v e i l l a n c e d a t a = T o t a c o s t a t w a r d l e v e l + c o s t a t d i s t r i c t l e v e l + c o s t a t z o n a l l e v e l + c o s t a t m i n i s t r y l e v e l EMAi-Dataset: Raw data from EMPRES-i database for the year 2020 was downloaded in CSV format and cleaned for analysis of timeliness. Timeliness was measured as difference between observation date and reporting date. Mean, median and rate timeliness also were estimated. Proportion of monthly reports received at national level was calculated by dividing the total number of monthly reports received from the districts with the total number of monthly reports expected at national level. It should be noted that the reporting is done weekly, and analysis considered all the LGAs which have been reported at least once in that month. Data for surveillance budget analysis: A 5-year surveillance budget analysis (2015/2016–2019/2020) was conducted by extracting surveillance items in the main budgets. However, it was very difficult to separate surveillance activities from disease prevention and control. Therefore, the analysis included all items mentioned in disease prevention and control in addition to explicitly mentioned surveillance items. Qualitative Data Analysis Data collected through non-participant observation and site visits were organized and summarized in Microsoft Word. Audio recordings obtained during key informants interviews were transcribed and translated from Swahili into English. Qualitative data were analyzed following deductive thematic analysis. Thematic analysis was guided by Joffe and Yardley ( 22 ), whereby data were reviewed, manually coded in MS Word and clustered to establish themes. Documents reviewed were analyzed by using content analysis method ( 23 ) which involves open coding of the potential words of interest, creation of categories and abstraction. Results Demographic Characteristics of the Respondents At the district level, the questionnaire was administered to 30 livestock field officers (LFOs), two DVOs, and a district livestock officer. Table 2 illustrates the demographic characteristics of the respondents. Thirty-four semi-structured interviews were conducted with designated officials at various levels. Non-participant observation was conducted in three livestock markets, three zoo-sanitary checkpoints, 20 slaughter facilities and 15 dip sites. Table 2 Demographic characteristics of the survey respondents. Characteristics Number of respondents ( n ) Gender Male 26 Female 7 Age 21–30 1 31–40 17 41–50 10 51–60 5 Education level Certificate 2 Diploma 26 Bachelor degree 2 Higher degrees 3 Work experience 1–5 years 4 6–10 years 18 >10 years 11 Implementation of Animal Health Surveillance in Tanzania Fidelity Standard operating procedures require every suspected case to be confirmed in the laboratory. However, it was reported that it was reported that case identification was mainly based on clinical signs and symptoms due to limited access to laboratory services. Sample collection for laboratory examination was reported to be very rare due to limited and distant diagnostic facilities. Although data collection and reporting were supposed to be done through designated surveillance forms, only 27% of the respondents ( n = 33) reported using them while the rest maintained their records on notebooks. Notification of the disease events was mostly verbal using mobile phones or short message services with limited formal documentation. There were multiple reporting channels, including the Agricultural routine data system (ARDS), disease surveillance form, and Event mobile application (EMA-i), but they were not coordinated causing a risk of double-counting the event. Eighty four percentage of LFOs ( n = 30) reported to physically transmit surveillance reports to the district offices and transport costs were covered out-of-pocket. Data transmissions from the districts to ZVCs and MoLF were done via emails, but the internet expenses were covered by the sender. Adherence The study found that there were different reporting levels and timelines. At the district levels, LFOs submitted a brief report on the disease status every Thursday via SMS, and monthly ARDS reports had to reach the district desk by the 5th day of the new month. The weekly reports from the districts were forwarded to ZVCs and ultimately reached the ministry desk by Monday. The record review revealed that most of the collected data by the LFOs were filled in the ARDS and submitted to the Ministry of Agriculture through local government authorities (LGAs), but that information never reached the MoLF for analysis because there was no direct communication link between the two ministries on surveillance related matters and the reporting systems were not linked. At the national level, the proportion of monthly reports submitted from the LGAs for the year 2020 was 61% (number of LGA, n = 185) (range 47–82%). It was also found that 99% of the reported events were from the rural LGAs (refers as DCs), but proportionally, their average reporting annually is lower (40%, n = 137) as compared to the urban LGAs (55%, n = 48) which include city councils, municipalities and townships. Figure 5 depicts a lack of consistency in reporting, although it is mandatory. The sharp rise on the curve from September was explained by the intervention from veterinary council of Tanzania (VCT), which directed all the DVOs to send the report as required by the law; otherwise, necessary action would be taken against them. Figure 5 Proportion of monthly reports received by the MoLF from LGAs throughout the year. Exposure Figure 6 shows the level of which respondents were engaged in animal surveillance activities. They were mainly engaged in mainly in data collection from the primary sources (33/33), and data compilation and integration (10/33). However, they rarely received feedback on the data they sent, they reported that to be demotivating. Only 30% of the LFOs ( n = 30) have ever received any training related to surveillance, while DVOs and other officers at higher levels reported having received regular trainings on the same. Figure 6 Role played by respondents in surveillance activities. Mechanisms of Impact Satisfaction Figure 7 depicts the satisfaction level of respondents in each study district. When asked to rank their satisfaction with the current animal surveillance system on a scale of 1–5 (1 = very dissatisfied, 2 = dissatisfied, 3 = neutral, 4 = satisfied, 5 = very satisfied) but during analysis were collapsed into scales 1–3 (1 = satisfied, 2 = Neutral, 3 = dissatisfied). Nineteen out of thirty three (58%) respondents were neutral on their satisfaction with the surveillance system, while only 4/33 (12%) were satisfied. Some of their dissatisfaction was explained to be caused by high transport costs, hard working conditions, lack of feedback and limited human resources. Figure 7 Satisfaction level of the respondents to the current surveillance system. Participation of LFOs in Surveillance Activities The majority of the LFOs (20/30) use 20–90% (mean = 61.2%, SD = 20.4%) of their time per week for surveillance-related activities, while DVOs spent an average of 60% on the same. The level of effort varied among the districts; LFOs in Kibaha dedicated more time to surveillance activities than those from Kongwa and Ngorongoro ( Table 3 ). Field-level staff reported to be overwhelmed by other responsibilities which were not animal health-related, including administration roles and revenue collection. Table 3 Proportion of time district level animal health officials spent on surveillance activities. District Proportion of time spent in surveillance activities (in percentage) 80 (%) Kongwa ( n = 10) 0 40 20 40 0 Kibaha ( n = 10) 0 0 30 60 10 Ngorongoro ( n = 10) 0 20 40 20 20 Recruitment, Trainings and Technical Assistance All LFOs in Kibaha and Ngorongoro have a diploma or degree in animal health sciences, but in Kongwa, only three of the 22 extension officers have an animal health background, the rest have a diploma or certificate in general agriculture. Officials from the district to the ministerial level have bachelor degrees in veterinary medicine or animal health sciences. All respondents were employed at entry level in their respective wards and have served with 4–29 years in their current positions (mean = 12, SD = 7.7 years), but only 33% ( n = 30) and 30% ( n = 30) of them have ever received on-job and surveillance trainings, respectively. The last training was 5 years ago (min = 1, max = 15). The trainings were mainly about artificial insemination, Tsetse control, vaccination or animal health management. Field supervisions were irregular due to financial constraints. Contextual Factors Affecting the Implementation of Animal Health Surveillance Area Coverage per Designated Officer Average area coverage per ward LFO was 5 villages (Kongwa = 6, Kibaha = 4, Ngorogoro = 4). During the implementation of activities, LFOs traveled long distances to serve their livestock keepers. In Kibaha, LFOs traveled an average of 192 kms, Kongwa 209 kms and 328 kms every month for animal health-related activities, including surveillance. Either livestock keepers or LFOs themselves bore the travel costs all the time. In providing veterinary services and implementing surveillance activities, wards were supervised DVOs or DLFOs while LGAs were under respective ZVCs. However, the supervisors have to travel long distances to reach some wards and LGAs, as indicated in Table 4 . Table 4 Area covered and furthest distance traveled by the DVOs and ZVC officers. ZVC Number of LGAs Farthest LGAs (in kms) Selected LGAs Number of wards Farthest ward (in kms) Eastern 22 560 Kibaha DC 22 87 Central 15 350 Kongwa 14 100 Northern 32 550 Ngorongoro 28 320 Field Level Human Resource vs. Livestock Population In the three studied district councils, the common livestock kept were cattle, goat and sheep. There were 828,904 cattle, 886,044 goats and 889,978 sheep as of 2019. The availability of the ward LFOs with animal health backgrounds was only 50% of what was required ( Table 5 ) with kongwa being the most constrained (3/22) in animal health professionals. However, Ngorongoro had a high number of livestock to LFO ratio because it had the highest number of livestock. To reduce the gap, in some areas, ward agricultural extension officers were being used to provide livestock extension services and other LFO responsibilities. LFOs reported to be serving multiple roles in the field, including providing livestock extension services to livestock keepers, collecting surveillance data, delivering meat inspection in slaughter facilities, and collecting revenue in livestock markets. In some places, they were found to assume administrative roles such as acting as ward executive officers (WEOs). Table 5 Field level human resources vs. livestock population in the selected district councils in 2019. District council Cattle Goats Sheep Total Available LFOs Required No. of Livestock/LFO Kongwa 121,973 79,793 36,662 238,428 3 22 79,476 Kibaha 51,408 18,379 7,121 76,908 14 14 5,493 Ngorongoro 655,523 787,872 846,195 2,289,590 15 28 152,639 Total 828,904 886,044 889,978 2,604,926 32 64 81,404 Source: District veterinary officers . Costs of Surveillance Data From Field to the Epidemiology Unit The annual cost of surveillance data national-wide was 12,168,085,833 TZS. Field level data collection and transmission accounted for 97% of the total cost (11,760,238,560 TZS). Cost of surveillance per ward LFO ranged from 80,740 to 828,200 TZS per month (mean = 247,730 TZS). Ngorongoro had the highest total surveillance costs per LFO compared to other districts ( Figure 8 ). When asked whether they received transport allowance for those who transmit data physically, 83% of respondents ( n = 30) reported to use their own funds without re-imbursement by the employer. Only two respondents who were working in the Ngorongoro Conservation Authority Area (NCAA) reported to receive facilitation allowance. Figure 8 Monthly cost of surveillance data incurred by each LFO in Tanzanian shillings (TZS). Communication and Supporting System The DVOs or DLFO were the primary recipients of surveillance data, except for NCAA, where LFOs sent reports to NCAA-Veterinary officer who then forwarded them to the DVO. Apart from sending reports to the district, 40% of the ward LFOs ( n = 30) reported sharing the reports with the ward development council. There was no direct communication with LFOs beyond the district level. Inter-sectoral collaboration, especially between animal health sectors professionals and other sectors, was strong at the field level, as reported by 70% of the LFOs who mainly collaborate with human health professionals. Kibaha had the strongest collaboration (90%) while Kongwa had the weakest (50%). Refresher training on surveillance for the field level staff was very low as only 27% LFOs reported to have received training. In most cases, they used the college and field experience knowledge to solve day-to-day animal health-related challenges. Commonly reported challenges at the field level were lack of transport (21/33), no facilitation for the collection and transmission of surveillance data (17/33), low awareness of livestock keepers on the importance of disease reporting (14/33), lack of working equipment and tools such as sample collection kits and data collection tools (13/33), and limited workforce compare to the vastness of the areas (12/33). Other reported challenges were the low response rate from higher authorities on the reported cases, poor veterinary infrastructures, lack of a coordinated filing system leading to the reports getting lost, political interference and a limited laboratory network for sample confirmation. Legislation and Reporting Obligations Animal health surveillance in Tanzania is governed by national and international guidelines and legal frameworks. First, surveillance is guided by the OIE Terrestrial animal health code, which sets standards for improving the health and welfare of terrestrial animals and veterinary public health worldwide. Second, at the national level, there were several policy and legal frameworks guiding animal health surveillance and disease control which spelt out processes and roles and responsibilities of various players as indicated in Table 6 . Table 6 Legal documents guiding animal health surveillance in Tanzania. Legal document Year Provision National Livestock Development Policy 2006 The Government to strengthen technical support services in animal health, control and eradication of Trans-boundary animal diseases, tick-borne, tsetse flies and trypanosomes control and other diseases of economic importance Animal Disease Act, No. 17 of 2003 2003 Mandate of DVS in disease prevention and control, powers of inspectors, compulsory measures and general provisions for disease prevention and control Veterinary Act No 16 of 2003 2003 Registration of veterinarian, paraprofessionals and paraprofessional assistants and retention requirements and registration of veterinary practice facilities Local Government (District Authorities) Act of 1982 1982 Regulate livestock movement Livestock Registration, Identification and Traceability Act No 12 of 2010 2010 Spelled out the purpose of the act, which among others was controlling animal diseases Animal Diseases Regulations 2005 Power and duties of inspectors in disease identification, prevention and control However, the execution of the mandate as stipulated in the legal frameworks was still a challenge, especially at the field level. Some of the difficulties reported were: interference of local government administration in the quarantine exercises especially when it would compromise the revenue collection; a limited number of animal health officers vs. the vastness of the designated areas, limited budget allocation and political influence on surveillance and animal health activities, e.g., registration of animal into Tanzania livestock identification and traceability system as per law. The Veterinary Act 2003 spelt out eligibility for registration of animal health practitioners. 76.7% of the respondents ( n = 33) were eligible and registered as professional or paraprofessional assistants. Financial Resource Allocation vs. the Cost of Surveillance Data Since DVS was responsible for disease prevention and control, including surveillance, every year, the budget had been allocated to implement such activities. However, a 5-year budget analysis (2015/2016–2019/2020) showed that DVS budget allocation had been consistently low, with an average of 8,832,835,768 TZS per year (21% of the total ministerial budget). The budget entailed personal emolument, development and other charges. It was allocated to facilitate veterinary laboratory services, implement disease control strategies, strengthen epidemiological surveillance, and strengthen ZVCs, among other budget items. On average, 32% (2,870,630,149 TZS) of the total DVS budget was directed exclusively to surveillance and disease control. Figure 9 illustrates the trend on DVS budget allocation to surveillance and disease control in comparison to the ministerial budget over 5 years. The sharp rise in the 2017/2018 financial year for surveillance and disease control was accounted for by the budget allocated to TVLA for developing the vaccine institute. On the other hand, the cost of surveillance data was approximated at 12,168,085,833 TZS per year, which is 1.4 times higher than the annual national surveillance and disease control budget. Figure 9 Budget allocation for surveillance and disease control against DVS and ministerial budgets. Linkage Between Surveillance Processes and System Attributes Data Quality There were guidelines for surveillance, including animal diseases surveillance field reports and veterinary services abattoir report forms, but they were rarely used. It was reported and observed that LFOs recorded their activities on the notebooks. Weekly reports on the events were sent through short message service (SMS) or social media group (WhatsApp) to DVOs/DLFOs outlining what has happened in that particular week. The excel database at the epidemiology unit showed the inconsistency in reporting, and data in the sheets were not the reflection of the information on the surveillance forms. The review of the dataset identified the following weaknesses potentially affecting the data quality: (i) lack of consistency on data, e.g., a data entry can have different labels for the same item, such as Dodoma, Dodoma MC, Dodoma council, Dodoma city council, Dodoma CC or Chemba and Chemba DC or for the dates 24–29/January 2020 vs. 30 JANUARY-05 FEBRUARY 2020, 31st January to 6 February 2020, (ii) incomplete data, (iii) data were not in analyzable format, (iv) and (v) typing errors. Simplicity It was reported several sources generated surveillance data, including livestock farmers, veterinary facilities such as markets and slaughterhouses/slabs and zoo-sanitary checkpoints. It was also observed that there were multiple reporting channels such as ARDS, animal disease surveillance form, abattoir forms, phone calls, and SMS reporting similar information; however, they were not synchronized thereby creating a risk of double counting certain events. Data were compiled and cross-checked at district and zonal level Overall analysis and reporting were done at the ministry level from weekly and monthly reports from ZVCs. Every 6 months, data cleaning and analysis are done to prepare semi-annual reports. However, data extraction and cleaning reported and observed to be tedious process for the data analysts and takes long due to lack of standardized formats. At the ministry level, surveillance reports were submitted to different users, including international bodies such as OIE, SADC, AU, and EA, with varying reporting formats. Feedback to the field staff was reported to be limited. Timeliness Weekly reports were to be submitted by LFOs to the DVO by Wednesday of every week to reach the ministry desk by Monday. A total of 2,255 reported disease events were extracted from EMPRES-I, whereby 95.6% of them are from rural LGAs. The median reporting delay ranged from 0 to 153 days from the observation date (median = 2 days, mean = 6 days). Usefulness Surveillance data were mainly used at the national level to design interventions such as rabies, anthrax, or Peste des Petits Ruminants (PPR) control, to prepare the list of priority zoonotic diseases, to report to international bodies, and to rollout of vaccination programmes throughout the country for the selected list of diseases. Although other stakeholders such as traders were able to access data upon enquiry, they rarely made such requests. Demographic Characteristics of the Respondents At the district level, the questionnaire was administered to 30 livestock field officers (LFOs), two DVOs, and a district livestock officer. Table 2 illustrates the demographic characteristics of the respondents. Thirty-four semi-structured interviews were conducted with designated officials at various levels. Non-participant observation was conducted in three livestock markets, three zoo-sanitary checkpoints, 20 slaughter facilities and 15 dip sites. Table 2 Demographic characteristics of the survey respondents. Characteristics Number of respondents ( n ) Gender Male 26 Female 7 Age 21–30 1 31–40 17 41–50 10 51–60 5 Education level Certificate 2 Diploma 26 Bachelor degree 2 Higher degrees 3 Work experience 1–5 years 4 6–10 years 18 >10 years 11 Implementation of Animal Health Surveillance in Tanzania Fidelity Standard operating procedures require every suspected case to be confirmed in the laboratory. However, it was reported that it was reported that case identification was mainly based on clinical signs and symptoms due to limited access to laboratory services. Sample collection for laboratory examination was reported to be very rare due to limited and distant diagnostic facilities. Although data collection and reporting were supposed to be done through designated surveillance forms, only 27% of the respondents ( n = 33) reported using them while the rest maintained their records on notebooks. Notification of the disease events was mostly verbal using mobile phones or short message services with limited formal documentation. There were multiple reporting channels, including the Agricultural routine data system (ARDS), disease surveillance form, and Event mobile application (EMA-i), but they were not coordinated causing a risk of double-counting the event. Eighty four percentage of LFOs ( n = 30) reported to physically transmit surveillance reports to the district offices and transport costs were covered out-of-pocket. Data transmissions from the districts to ZVCs and MoLF were done via emails, but the internet expenses were covered by the sender. Adherence The study found that there were different reporting levels and timelines. At the district levels, LFOs submitted a brief report on the disease status every Thursday via SMS, and monthly ARDS reports had to reach the district desk by the 5th day of the new month. The weekly reports from the districts were forwarded to ZVCs and ultimately reached the ministry desk by Monday. The record review revealed that most of the collected data by the LFOs were filled in the ARDS and submitted to the Ministry of Agriculture through local government authorities (LGAs), but that information never reached the MoLF for analysis because there was no direct communication link between the two ministries on surveillance related matters and the reporting systems were not linked. At the national level, the proportion of monthly reports submitted from the LGAs for the year 2020 was 61% (number of LGA, n = 185) (range 47–82%). It was also found that 99% of the reported events were from the rural LGAs (refers as DCs), but proportionally, their average reporting annually is lower (40%, n = 137) as compared to the urban LGAs (55%, n = 48) which include city councils, municipalities and townships. Figure 5 depicts a lack of consistency in reporting, although it is mandatory. The sharp rise on the curve from September was explained by the intervention from veterinary council of Tanzania (VCT), which directed all the DVOs to send the report as required by the law; otherwise, necessary action would be taken against them. Figure 5 Proportion of monthly reports received by the MoLF from LGAs throughout the year. Exposure Figure 6 shows the level of which respondents were engaged in animal surveillance activities. They were mainly engaged in mainly in data collection from the primary sources (33/33), and data compilation and integration (10/33). However, they rarely received feedback on the data they sent, they reported that to be demotivating. Only 30% of the LFOs ( n = 30) have ever received any training related to surveillance, while DVOs and other officers at higher levels reported having received regular trainings on the same. Figure 6 Role played by respondents in surveillance activities. Fidelity Standard operating procedures require every suspected case to be confirmed in the laboratory. However, it was reported that it was reported that case identification was mainly based on clinical signs and symptoms due to limited access to laboratory services. Sample collection for laboratory examination was reported to be very rare due to limited and distant diagnostic facilities. Although data collection and reporting were supposed to be done through designated surveillance forms, only 27% of the respondents ( n = 33) reported using them while the rest maintained their records on notebooks. Notification of the disease events was mostly verbal using mobile phones or short message services with limited formal documentation. There were multiple reporting channels, including the Agricultural routine data system (ARDS), disease surveillance form, and Event mobile application (EMA-i), but they were not coordinated causing a risk of double-counting the event. Eighty four percentage of LFOs ( n = 30) reported to physically transmit surveillance reports to the district offices and transport costs were covered out-of-pocket. Data transmissions from the districts to ZVCs and MoLF were done via emails, but the internet expenses were covered by the sender. Adherence The study found that there were different reporting levels and timelines. At the district levels, LFOs submitted a brief report on the disease status every Thursday via SMS, and monthly ARDS reports had to reach the district desk by the 5th day of the new month. The weekly reports from the districts were forwarded to ZVCs and ultimately reached the ministry desk by Monday. The record review revealed that most of the collected data by the LFOs were filled in the ARDS and submitted to the Ministry of Agriculture through local government authorities (LGAs), but that information never reached the MoLF for analysis because there was no direct communication link between the two ministries on surveillance related matters and the reporting systems were not linked. At the national level, the proportion of monthly reports submitted from the LGAs for the year 2020 was 61% (number of LGA, n = 185) (range 47–82%). It was also found that 99% of the reported events were from the rural LGAs (refers as DCs), but proportionally, their average reporting annually is lower (40%, n = 137) as compared to the urban LGAs (55%, n = 48) which include city councils, municipalities and townships. Figure 5 depicts a lack of consistency in reporting, although it is mandatory. The sharp rise on the curve from September was explained by the intervention from veterinary council of Tanzania (VCT), which directed all the DVOs to send the report as required by the law; otherwise, necessary action would be taken against them. Figure 5 Proportion of monthly reports received by the MoLF from LGAs throughout the year. Exposure Figure 6 shows the level of which respondents were engaged in animal surveillance activities. They were mainly engaged in mainly in data collection from the primary sources (33/33), and data compilation and integration (10/33). However, they rarely received feedback on the data they sent, they reported that to be demotivating. Only 30% of the LFOs ( n = 30) have ever received any training related to surveillance, while DVOs and other officers at higher levels reported having received regular trainings on the same. Figure 6 Role played by respondents in surveillance activities. Mechanisms of Impact Satisfaction Figure 7 depicts the satisfaction level of respondents in each study district. When asked to rank their satisfaction with the current animal surveillance system on a scale of 1–5 (1 = very dissatisfied, 2 = dissatisfied, 3 = neutral, 4 = satisfied, 5 = very satisfied) but during analysis were collapsed into scales 1–3 (1 = satisfied, 2 = Neutral, 3 = dissatisfied). Nineteen out of thirty three (58%) respondents were neutral on their satisfaction with the surveillance system, while only 4/33 (12%) were satisfied. Some of their dissatisfaction was explained to be caused by high transport costs, hard working conditions, lack of feedback and limited human resources. Figure 7 Satisfaction level of the respondents to the current surveillance system. Participation of LFOs in Surveillance Activities The majority of the LFOs (20/30) use 20–90% (mean = 61.2%, SD = 20.4%) of their time per week for surveillance-related activities, while DVOs spent an average of 60% on the same. The level of effort varied among the districts; LFOs in Kibaha dedicated more time to surveillance activities than those from Kongwa and Ngorongoro ( Table 3 ). Field-level staff reported to be overwhelmed by other responsibilities which were not animal health-related, including administration roles and revenue collection. Table 3 Proportion of time district level animal health officials spent on surveillance activities. District Proportion of time spent in surveillance activities (in percentage) 80 (%) Kongwa ( n = 10) 0 40 20 40 0 Kibaha ( n = 10) 0 0 30 60 10 Ngorongoro ( n = 10) 0 20 40 20 20 Recruitment, Trainings and Technical Assistance All LFOs in Kibaha and Ngorongoro have a diploma or degree in animal health sciences, but in Kongwa, only three of the 22 extension officers have an animal health background, the rest have a diploma or certificate in general agriculture. Officials from the district to the ministerial level have bachelor degrees in veterinary medicine or animal health sciences. All respondents were employed at entry level in their respective wards and have served with 4–29 years in their current positions (mean = 12, SD = 7.7 years), but only 33% ( n = 30) and 30% ( n = 30) of them have ever received on-job and surveillance trainings, respectively. The last training was 5 years ago (min = 1, max = 15). The trainings were mainly about artificial insemination, Tsetse control, vaccination or animal health management. Field supervisions were irregular due to financial constraints. Satisfaction Figure 7 depicts the satisfaction level of respondents in each study district. When asked to rank their satisfaction with the current animal surveillance system on a scale of 1–5 (1 = very dissatisfied, 2 = dissatisfied, 3 = neutral, 4 = satisfied, 5 = very satisfied) but during analysis were collapsed into scales 1–3 (1 = satisfied, 2 = Neutral, 3 = dissatisfied). Nineteen out of thirty three (58%) respondents were neutral on their satisfaction with the surveillance system, while only 4/33 (12%) were satisfied. Some of their dissatisfaction was explained to be caused by high transport costs, hard working conditions, lack of feedback and limited human resources. Figure 7 Satisfaction level of the respondents to the current surveillance system. Participation of LFOs in Surveillance Activities The majority of the LFOs (20/30) use 20–90% (mean = 61.2%, SD = 20.4%) of their time per week for surveillance-related activities, while DVOs spent an average of 60% on the same. The level of effort varied among the districts; LFOs in Kibaha dedicated more time to surveillance activities than those from Kongwa and Ngorongoro ( Table 3 ). Field-level staff reported to be overwhelmed by other responsibilities which were not animal health-related, including administration roles and revenue collection. Table 3 Proportion of time district level animal health officials spent on surveillance activities. District Proportion of time spent in surveillance activities (in percentage) 80 (%) Kongwa ( n = 10) 0 40 20 40 0 Kibaha ( n = 10) 0 0 30 60 10 Ngorongoro ( n = 10) 0 20 40 20 20 Recruitment, Trainings and Technical Assistance All LFOs in Kibaha and Ngorongoro have a diploma or degree in animal health sciences, but in Kongwa, only three of the 22 extension officers have an animal health background, the rest have a diploma or certificate in general agriculture. Officials from the district to the ministerial level have bachelor degrees in veterinary medicine or animal health sciences. All respondents were employed at entry level in their respective wards and have served with 4–29 years in their current positions (mean = 12, SD = 7.7 years), but only 33% ( n = 30) and 30% ( n = 30) of them have ever received on-job and surveillance trainings, respectively. The last training was 5 years ago (min = 1, max = 15). The trainings were mainly about artificial insemination, Tsetse control, vaccination or animal health management. Field supervisions were irregular due to financial constraints. Contextual Factors Affecting the Implementation of Animal Health Surveillance Area Coverage per Designated Officer Average area coverage per ward LFO was 5 villages (Kongwa = 6, Kibaha = 4, Ngorogoro = 4). During the implementation of activities, LFOs traveled long distances to serve their livestock keepers. In Kibaha, LFOs traveled an average of 192 kms, Kongwa 209 kms and 328 kms every month for animal health-related activities, including surveillance. Either livestock keepers or LFOs themselves bore the travel costs all the time. In providing veterinary services and implementing surveillance activities, wards were supervised DVOs or DLFOs while LGAs were under respective ZVCs. However, the supervisors have to travel long distances to reach some wards and LGAs, as indicated in Table 4 . Table 4 Area covered and furthest distance traveled by the DVOs and ZVC officers. ZVC Number of LGAs Farthest LGAs (in kms) Selected LGAs Number of wards Farthest ward (in kms) Eastern 22 560 Kibaha DC 22 87 Central 15 350 Kongwa 14 100 Northern 32 550 Ngorongoro 28 320 Field Level Human Resource vs. Livestock Population In the three studied district councils, the common livestock kept were cattle, goat and sheep. There were 828,904 cattle, 886,044 goats and 889,978 sheep as of 2019. The availability of the ward LFOs with animal health backgrounds was only 50% of what was required ( Table 5 ) with kongwa being the most constrained (3/22) in animal health professionals. However, Ngorongoro had a high number of livestock to LFO ratio because it had the highest number of livestock. To reduce the gap, in some areas, ward agricultural extension officers were being used to provide livestock extension services and other LFO responsibilities. LFOs reported to be serving multiple roles in the field, including providing livestock extension services to livestock keepers, collecting surveillance data, delivering meat inspection in slaughter facilities, and collecting revenue in livestock markets. In some places, they were found to assume administrative roles such as acting as ward executive officers (WEOs). Table 5 Field level human resources vs. livestock population in the selected district councils in 2019. District council Cattle Goats Sheep Total Available LFOs Required No. of Livestock/LFO Kongwa 121,973 79,793 36,662 238,428 3 22 79,476 Kibaha 51,408 18,379 7,121 76,908 14 14 5,493 Ngorongoro 655,523 787,872 846,195 2,289,590 15 28 152,639 Total 828,904 886,044 889,978 2,604,926 32 64 81,404 Source: District veterinary officers . Costs of Surveillance Data From Field to the Epidemiology Unit The annual cost of surveillance data national-wide was 12,168,085,833 TZS. Field level data collection and transmission accounted for 97% of the total cost (11,760,238,560 TZS). Cost of surveillance per ward LFO ranged from 80,740 to 828,200 TZS per month (mean = 247,730 TZS). Ngorongoro had the highest total surveillance costs per LFO compared to other districts ( Figure 8 ). When asked whether they received transport allowance for those who transmit data physically, 83% of respondents ( n = 30) reported to use their own funds without re-imbursement by the employer. Only two respondents who were working in the Ngorongoro Conservation Authority Area (NCAA) reported to receive facilitation allowance. Figure 8 Monthly cost of surveillance data incurred by each LFO in Tanzanian shillings (TZS). Communication and Supporting System The DVOs or DLFO were the primary recipients of surveillance data, except for NCAA, where LFOs sent reports to NCAA-Veterinary officer who then forwarded them to the DVO. Apart from sending reports to the district, 40% of the ward LFOs ( n = 30) reported sharing the reports with the ward development council. There was no direct communication with LFOs beyond the district level. Inter-sectoral collaboration, especially between animal health sectors professionals and other sectors, was strong at the field level, as reported by 70% of the LFOs who mainly collaborate with human health professionals. Kibaha had the strongest collaboration (90%) while Kongwa had the weakest (50%). Refresher training on surveillance for the field level staff was very low as only 27% LFOs reported to have received training. In most cases, they used the college and field experience knowledge to solve day-to-day animal health-related challenges. Commonly reported challenges at the field level were lack of transport (21/33), no facilitation for the collection and transmission of surveillance data (17/33), low awareness of livestock keepers on the importance of disease reporting (14/33), lack of working equipment and tools such as sample collection kits and data collection tools (13/33), and limited workforce compare to the vastness of the areas (12/33). Other reported challenges were the low response rate from higher authorities on the reported cases, poor veterinary infrastructures, lack of a coordinated filing system leading to the reports getting lost, political interference and a limited laboratory network for sample confirmation. Legislation and Reporting Obligations Animal health surveillance in Tanzania is governed by national and international guidelines and legal frameworks. First, surveillance is guided by the OIE Terrestrial animal health code, which sets standards for improving the health and welfare of terrestrial animals and veterinary public health worldwide. Second, at the national level, there were several policy and legal frameworks guiding animal health surveillance and disease control which spelt out processes and roles and responsibilities of various players as indicated in Table 6 . Table 6 Legal documents guiding animal health surveillance in Tanzania. Legal document Year Provision National Livestock Development Policy 2006 The Government to strengthen technical support services in animal health, control and eradication of Trans-boundary animal diseases, tick-borne, tsetse flies and trypanosomes control and other diseases of economic importance Animal Disease Act, No. 17 of 2003 2003 Mandate of DVS in disease prevention and control, powers of inspectors, compulsory measures and general provisions for disease prevention and control Veterinary Act No 16 of 2003 2003 Registration of veterinarian, paraprofessionals and paraprofessional assistants and retention requirements and registration of veterinary practice facilities Local Government (District Authorities) Act of 1982 1982 Regulate livestock movement Livestock Registration, Identification and Traceability Act No 12 of 2010 2010 Spelled out the purpose of the act, which among others was controlling animal diseases Animal Diseases Regulations 2005 Power and duties of inspectors in disease identification, prevention and control However, the execution of the mandate as stipulated in the legal frameworks was still a challenge, especially at the field level. Some of the difficulties reported were: interference of local government administration in the quarantine exercises especially when it would compromise the revenue collection; a limited number of animal health officers vs. the vastness of the designated areas, limited budget allocation and political influence on surveillance and animal health activities, e.g., registration of animal into Tanzania livestock identification and traceability system as per law. The Veterinary Act 2003 spelt out eligibility for registration of animal health practitioners. 76.7% of the respondents ( n = 33) were eligible and registered as professional or paraprofessional assistants. Financial Resource Allocation vs. the Cost of Surveillance Data Since DVS was responsible for disease prevention and control, including surveillance, every year, the budget had been allocated to implement such activities. However, a 5-year budget analysis (2015/2016–2019/2020) showed that DVS budget allocation had been consistently low, with an average of 8,832,835,768 TZS per year (21% of the total ministerial budget). The budget entailed personal emolument, development and other charges. It was allocated to facilitate veterinary laboratory services, implement disease control strategies, strengthen epidemiological surveillance, and strengthen ZVCs, among other budget items. On average, 32% (2,870,630,149 TZS) of the total DVS budget was directed exclusively to surveillance and disease control. Figure 9 illustrates the trend on DVS budget allocation to surveillance and disease control in comparison to the ministerial budget over 5 years. The sharp rise in the 2017/2018 financial year for surveillance and disease control was accounted for by the budget allocated to TVLA for developing the vaccine institute. On the other hand, the cost of surveillance data was approximated at 12,168,085,833 TZS per year, which is 1.4 times higher than the annual national surveillance and disease control budget. Figure 9 Budget allocation for surveillance and disease control against DVS and ministerial budgets. Area Coverage per Designated Officer Average area coverage per ward LFO was 5 villages (Kongwa = 6, Kibaha = 4, Ngorogoro = 4). During the implementation of activities, LFOs traveled long distances to serve their livestock keepers. In Kibaha, LFOs traveled an average of 192 kms, Kongwa 209 kms and 328 kms every month for animal health-related activities, including surveillance. Either livestock keepers or LFOs themselves bore the travel costs all the time. In providing veterinary services and implementing surveillance activities, wards were supervised DVOs or DLFOs while LGAs were under respective ZVCs. However, the supervisors have to travel long distances to reach some wards and LGAs, as indicated in Table 4 . Table 4 Area covered and furthest distance traveled by the DVOs and ZVC officers. ZVC Number of LGAs Farthest LGAs (in kms) Selected LGAs Number of wards Farthest ward (in kms) Eastern 22 560 Kibaha DC 22 87 Central 15 350 Kongwa 14 100 Northern 32 550 Ngorongoro 28 320 Field Level Human Resource vs. Livestock Population In the three studied district councils, the common livestock kept were cattle, goat and sheep. There were 828,904 cattle, 886,044 goats and 889,978 sheep as of 2019. The availability of the ward LFOs with animal health backgrounds was only 50% of what was required ( Table 5 ) with kongwa being the most constrained (3/22) in animal health professionals. However, Ngorongoro had a high number of livestock to LFO ratio because it had the highest number of livestock. To reduce the gap, in some areas, ward agricultural extension officers were being used to provide livestock extension services and other LFO responsibilities. LFOs reported to be serving multiple roles in the field, including providing livestock extension services to livestock keepers, collecting surveillance data, delivering meat inspection in slaughter facilities, and collecting revenue in livestock markets. In some places, they were found to assume administrative roles such as acting as ward executive officers (WEOs). Table 5 Field level human resources vs. livestock population in the selected district councils in 2019. District council Cattle Goats Sheep Total Available LFOs Required No. of Livestock/LFO Kongwa 121,973 79,793 36,662 238,428 3 22 79,476 Kibaha 51,408 18,379 7,121 76,908 14 14 5,493 Ngorongoro 655,523 787,872 846,195 2,289,590 15 28 152,639 Total 828,904 886,044 889,978 2,604,926 32 64 81,404 Source: District veterinary officers . Costs of Surveillance Data From Field to the Epidemiology Unit The annual cost of surveillance data national-wide was 12,168,085,833 TZS. Field level data collection and transmission accounted for 97% of the total cost (11,760,238,560 TZS). Cost of surveillance per ward LFO ranged from 80,740 to 828,200 TZS per month (mean = 247,730 TZS). Ngorongoro had the highest total surveillance costs per LFO compared to other districts ( Figure 8 ). When asked whether they received transport allowance for those who transmit data physically, 83% of respondents ( n = 30) reported to use their own funds without re-imbursement by the employer. Only two respondents who were working in the Ngorongoro Conservation Authority Area (NCAA) reported to receive facilitation allowance. Figure 8 Monthly cost of surveillance data incurred by each LFO in Tanzanian shillings (TZS). Communication and Supporting System The DVOs or DLFO were the primary recipients of surveillance data, except for NCAA, where LFOs sent reports to NCAA-Veterinary officer who then forwarded them to the DVO. Apart from sending reports to the district, 40% of the ward LFOs ( n = 30) reported sharing the reports with the ward development council. There was no direct communication with LFOs beyond the district level. Inter-sectoral collaboration, especially between animal health sectors professionals and other sectors, was strong at the field level, as reported by 70% of the LFOs who mainly collaborate with human health professionals. Kibaha had the strongest collaboration (90%) while Kongwa had the weakest (50%). Refresher training on surveillance for the field level staff was very low as only 27% LFOs reported to have received training. In most cases, they used the college and field experience knowledge to solve day-to-day animal health-related challenges. Commonly reported challenges at the field level were lack of transport (21/33), no facilitation for the collection and transmission of surveillance data (17/33), low awareness of livestock keepers on the importance of disease reporting (14/33), lack of working equipment and tools such as sample collection kits and data collection tools (13/33), and limited workforce compare to the vastness of the areas (12/33). Other reported challenges were the low response rate from higher authorities on the reported cases, poor veterinary infrastructures, lack of a coordinated filing system leading to the reports getting lost, political interference and a limited laboratory network for sample confirmation. Legislation and Reporting Obligations Animal health surveillance in Tanzania is governed by national and international guidelines and legal frameworks. First, surveillance is guided by the OIE Terrestrial animal health code, which sets standards for improving the health and welfare of terrestrial animals and veterinary public health worldwide. Second, at the national level, there were several policy and legal frameworks guiding animal health surveillance and disease control which spelt out processes and roles and responsibilities of various players as indicated in Table 6 . Table 6 Legal documents guiding animal health surveillance in Tanzania. Legal document Year Provision National Livestock Development Policy 2006 The Government to strengthen technical support services in animal health, control and eradication of Trans-boundary animal diseases, tick-borne, tsetse flies and trypanosomes control and other diseases of economic importance Animal Disease Act, No. 17 of 2003 2003 Mandate of DVS in disease prevention and control, powers of inspectors, compulsory measures and general provisions for disease prevention and control Veterinary Act No 16 of 2003 2003 Registration of veterinarian, paraprofessionals and paraprofessional assistants and retention requirements and registration of veterinary practice facilities Local Government (District Authorities) Act of 1982 1982 Regulate livestock movement Livestock Registration, Identification and Traceability Act No 12 of 2010 2010 Spelled out the purpose of the act, which among others was controlling animal diseases Animal Diseases Regulations 2005 Power and duties of inspectors in disease identification, prevention and control However, the execution of the mandate as stipulated in the legal frameworks was still a challenge, especially at the field level. Some of the difficulties reported were: interference of local government administration in the quarantine exercises especially when it would compromise the revenue collection; a limited number of animal health officers vs. the vastness of the designated areas, limited budget allocation and political influence on surveillance and animal health activities, e.g., registration of animal into Tanzania livestock identification and traceability system as per law. The Veterinary Act 2003 spelt out eligibility for registration of animal health practitioners. 76.7% of the respondents ( n = 33) were eligible and registered as professional or paraprofessional assistants. Financial Resource Allocation vs. the Cost of Surveillance Data Since DVS was responsible for disease prevention and control, including surveillance, every year, the budget had been allocated to implement such activities. However, a 5-year budget analysis (2015/2016–2019/2020) showed that DVS budget allocation had been consistently low, with an average of 8,832,835,768 TZS per year (21% of the total ministerial budget). The budget entailed personal emolument, development and other charges. It was allocated to facilitate veterinary laboratory services, implement disease control strategies, strengthen epidemiological surveillance, and strengthen ZVCs, among other budget items. On average, 32% (2,870,630,149 TZS) of the total DVS budget was directed exclusively to surveillance and disease control. Figure 9 illustrates the trend on DVS budget allocation to surveillance and disease control in comparison to the ministerial budget over 5 years. The sharp rise in the 2017/2018 financial year for surveillance and disease control was accounted for by the budget allocated to TVLA for developing the vaccine institute. On the other hand, the cost of surveillance data was approximated at 12,168,085,833 TZS per year, which is 1.4 times higher than the annual national surveillance and disease control budget. Figure 9 Budget allocation for surveillance and disease control against DVS and ministerial budgets. Linkage Between Surveillance Processes and System Attributes Data Quality There were guidelines for surveillance, including animal diseases surveillance field reports and veterinary services abattoir report forms, but they were rarely used. It was reported and observed that LFOs recorded their activities on the notebooks. Weekly reports on the events were sent through short message service (SMS) or social media group (WhatsApp) to DVOs/DLFOs outlining what has happened in that particular week. The excel database at the epidemiology unit showed the inconsistency in reporting, and data in the sheets were not the reflection of the information on the surveillance forms. The review of the dataset identified the following weaknesses potentially affecting the data quality: (i) lack of consistency on data, e.g., a data entry can have different labels for the same item, such as Dodoma, Dodoma MC, Dodoma council, Dodoma city council, Dodoma CC or Chemba and Chemba DC or for the dates 24–29/January 2020 vs. 30 JANUARY-05 FEBRUARY 2020, 31st January to 6 February 2020, (ii) incomplete data, (iii) data were not in analyzable format, (iv) and (v) typing errors. Simplicity It was reported several sources generated surveillance data, including livestock farmers, veterinary facilities such as markets and slaughterhouses/slabs and zoo-sanitary checkpoints. It was also observed that there were multiple reporting channels such as ARDS, animal disease surveillance form, abattoir forms, phone calls, and SMS reporting similar information; however, they were not synchronized thereby creating a risk of double counting certain events. Data were compiled and cross-checked at district and zonal level Overall analysis and reporting were done at the ministry level from weekly and monthly reports from ZVCs. Every 6 months, data cleaning and analysis are done to prepare semi-annual reports. However, data extraction and cleaning reported and observed to be tedious process for the data analysts and takes long due to lack of standardized formats. At the ministry level, surveillance reports were submitted to different users, including international bodies such as OIE, SADC, AU, and EA, with varying reporting formats. Feedback to the field staff was reported to be limited. Timeliness Weekly reports were to be submitted by LFOs to the DVO by Wednesday of every week to reach the ministry desk by Monday. A total of 2,255 reported disease events were extracted from EMPRES-I, whereby 95.6% of them are from rural LGAs. The median reporting delay ranged from 0 to 153 days from the observation date (median = 2 days, mean = 6 days). Usefulness Surveillance data were mainly used at the national level to design interventions such as rabies, anthrax, or Peste des Petits Ruminants (PPR) control, to prepare the list of priority zoonotic diseases, to report to international bodies, and to rollout of vaccination programmes throughout the country for the selected list of diseases. Although other stakeholders such as traders were able to access data upon enquiry, they rarely made such requests. Data Quality There were guidelines for surveillance, including animal diseases surveillance field reports and veterinary services abattoir report forms, but they were rarely used. It was reported and observed that LFOs recorded their activities on the notebooks. Weekly reports on the events were sent through short message service (SMS) or social media group (WhatsApp) to DVOs/DLFOs outlining what has happened in that particular week. The excel database at the epidemiology unit showed the inconsistency in reporting, and data in the sheets were not the reflection of the information on the surveillance forms. The review of the dataset identified the following weaknesses potentially affecting the data quality: (i) lack of consistency on data, e.g., a data entry can have different labels for the same item, such as Dodoma, Dodoma MC, Dodoma council, Dodoma city council, Dodoma CC or Chemba and Chemba DC or for the dates 24–29/January 2020 vs. 30 JANUARY-05 FEBRUARY 2020, 31st January to 6 February 2020, (ii) incomplete data, (iii) data were not in analyzable format, (iv) and (v) typing errors. Simplicity It was reported several sources generated surveillance data, including livestock farmers, veterinary facilities such as markets and slaughterhouses/slabs and zoo-sanitary checkpoints. It was also observed that there were multiple reporting channels such as ARDS, animal disease surveillance form, abattoir forms, phone calls, and SMS reporting similar information; however, they were not synchronized thereby creating a risk of double counting certain events. Data were compiled and cross-checked at district and zonal level Overall analysis and reporting were done at the ministry level from weekly and monthly reports from ZVCs. Every 6 months, data cleaning and analysis are done to prepare semi-annual reports. However, data extraction and cleaning reported and observed to be tedious process for the data analysts and takes long due to lack of standardized formats. At the ministry level, surveillance reports were submitted to different users, including international bodies such as OIE, SADC, AU, and EA, with varying reporting formats. Feedback to the field staff was reported to be limited. Timeliness Weekly reports were to be submitted by LFOs to the DVO by Wednesday of every week to reach the ministry desk by Monday. A total of 2,255 reported disease events were extracted from EMPRES-I, whereby 95.6% of them are from rural LGAs. The median reporting delay ranged from 0 to 153 days from the observation date (median = 2 days, mean = 6 days). Usefulness Surveillance data were mainly used at the national level to design interventions such as rabies, anthrax, or Peste des Petits Ruminants (PPR) control, to prepare the list of priority zoonotic diseases, to report to international bodies, and to rollout of vaccination programmes throughout the country for the selected list of diseases. Although other stakeholders such as traders were able to access data upon enquiry, they rarely made such requests. Discussion The objective of the study was to evaluate surveillance processes and the contextual factors which facilitate or hinder uptake, implementation and sustainability of the system. The study indicated that there were clear reporting structures, guidelines and legal frameworks for implementation of animal health surveillance in the country. Most of the field-level staff had the desired qualifications and there was strong intersectoral relationship. Nevertheless, there were deviations from standard processes and procedures in some of the aspects of the surveillance such as limited coordination of data collection with multiple reporting channels and lack of refresher trainings for the staff. That has led to low adherence including low monthly submission and poor quality of data. The cost of surveillance data was found to be 1.4 times higher than the annual surveillance budget. Generally, the study revealed the interconnectedness between the animal health surveillance processes, contextual factors and outcomes which may need holistic analysis. Findings from this study may help provide more insights on its implementation. Implementation of the surveillance activities was assessed in terms of fidelity, completeness and exposure to the system. It was found that there were deviations from standard guidelines, especially in case detection and reporting. Case detection, the critical component of any surveillance system, was primarily through visual observations due to limited diagnostic facilities. Although the laboratory system is an important pillar of surveillance, Tanzania's network of laboratories has only eleven units ( 24 ), and laboratory test results were not well-mainstreamed into the surveillance system ( 16 ). Laboratory tests can contribute to early warning by analyzing the test requests and diagnosis ( 25 ), but very few suspected cases reach the laboratories ( 26 ). Effective animal health surveillance systems require reliable, high-quality, and timely data for decision making. Designated disease surveillance forms were not being used by majority of the LFOs because of difficult in accessing them especially where they don't have access to stationary services hence they opted to send by SMS or phone calls which also have limitations. The evaluation found high reliance of the system on data from livestock keepers and slaughter facilities mostly collected by LFOs during their routine animal health activities. At the same time, other sources such as dipping sites and veterinary shops were not being utilized. The reporting system was fragmented with multiple reporting channels, which were not unified hence lead to the loss of some of the data on the way. George et al. ( 16 ) demonstrated how available data sources could be leveraged to improve Tanzania's animal health surveillance system by banking on their complementary strengths. Tanzania's animal health surveillance is mostly passive, considered the most cost-effective approach for early warning and outbreak detection. However, its performance depends on the users' acceptability, attitude, participation, and understanding of how the system works. It was noted that despite the high participation of subnational level officials in surveillance-related activities, they received little to no training on the surveillance. Several studies emphasized the importance of frontline workers in increasing the ability of the system to detect and contain infectious diseases ( 26 – 28 ). The recruitment of designated surveillance officers must be in line with national and international competency guidelines ( 29 – 31 ). More than 76% of animal health officials in the field qualified to be surveillance officers, but only 30% of them had ever received training on animal health surveillance. This could be contributing to the poor quality of submitted data and low compliance with surveillance protocols. Improving the performance of the frontline workers in surveillance requires changes in capacity building and management particularly motivation mechanisms, supervision system, clear communication and regular refresher trainings to keep up with the demand for quality and timely data. The usefulness of an early warning surveillance system lies in its ability to detect any anomaly timely, and that information is used to decide on disease prevention or control. Despite the limitations identified, Tanzania's surveillance system was reported to be useful in designing interventions. Nonetheless, the time lapse between the occurrence of the event and reporting compromises the sensitivity of the system to detect outbreaks timely. This attribute is most needed in this era of a high rate of new emerging and re-emerging infectious diseases. The findings were consistent with the 2020 performance audit report ( 32 ). Some of the contextual factors that accounted for those setbacks included the vastness of the areas that are not proportional to the available workforce, multiple and sometimes conflicting roles of the LFOs, poor communication, the surveillance organizational structure, and the high cost of surveillance data. To address these challenges and enhance passive surveillance, there is a need for public awareness and education on the importance of timely reporting and incentivization of reporting, especially on unusual cases ( 33 ). The data collection process should be easy and integrated into routine works of the subnational level animal health officials to maintain their participation. The system may also benefit from integrating available data sources while leveraging digital tools such as AfyaData and EMA-I to reduce transmission costs and improve data quality. In most of the low-income countries, animal health surveillance budgets are heavily dependent on public and donor funding. Still, for a long time, there has been a funding gap in the resources required to carry out surveillance for disease control as compared to human-health related surveillance ( 34 ). Tanzania's budget allocation has also demonstrated the same trend in the past 5 years with no clear pattern. The analysis also revealed that a large portion of the budget went into staff costs compared to the surveillance and disease control activities. This affects the performance of surveillance systems and disease prevention and control in general. The main methodological challenges in the budget analysis have always been the inaccessibility of quality data during data collection and extraction ( 35 , 36 ). For instance, in this study, the researcher resorted to using only allocated budget instead of actual expenditures because data were fragmented, not straightforward, and others were missing. However, this situation is expected to be reversed soon as the country moving toward e-Government services, including the operationalization of the Government Accounting System (MUSE). Despite having the third-largest livestock population in Africa, the livestock sector contribution to the gross domestic product (GDP) is only 7.4 percent and growing at 2.2 percent annually ( 37 ). Therefore, to challenge the status quo, the government has to take deliberate efforts to invest in surveillance to prevent avoidable disease outbreaks, which come with high economic impact. It should explore financing mechanisms leveraging on the public-private partnerships. Institutional arrangement and collaboration between government institutions and other stakeholders play a significant role in influencing the implementation of surveillance activities. Inter-sectoral collaboration between animal health professionals and other stakeholders at the subnational level was commendable. However, a lack of coordination and communication was observed between the MoLF and PO-RALG, the custodian of all LGAs on animal health surveillance, especially reporting. Tanzania Public Service Act, Cap 298 R.E 2019 and The Local Government Laws (Miscellaneous Amendments) Act, 2006 spelt out the mandates of LGA and sector ministries to local government public servants, but its execution has always been challenging due to unclear chain of commands ( 32 ). In order to rectify that, the two ministries may have a memorandum of understanding that all matters related to surveillance and animal health should be accounted directly to the sectoral ministry. Alternatively, all the staff working in animal health should be answerable to the sectoral ministry for easier communication and greater accountability. Institutional collaboration is increasingly necessary because some of the interconnected challenges can only be tackled interorganisationally ( 38 ). The growing demand for the operationalization of One Health also emphasizes the importance of improving communication between ministries, especially for zoonotic diseases. The process evaluation was for the national surveillance system and data were collected at all levels. Due to limited resources, authors selected three districts as case study for the district-level representatives which may not be representation of the whole country but complement information collected at other levels. In the analysis of financial resources for animal health surveillance, authors opted to use budget allocates instead of actual expenditures due to inaccessibility of data. This may have led to overestimation of the funds spent on surveillance activities but may suffice in providing insights on financial resource allocation. Conclusion This study assessed the implementation of the animal health surveillance system in Tanzania and contextual factors that affect the system performance. The study revealed that the uptake on the recommendations from the previous evaluations was low; therefore, there were deviations in implementing surveillance from its core principles and standards that affected the system's performance, especially on data quality and timeliness, necessary for early warning. The study also showed barriers to the functionality of the surveillance system, including a large area coverage, lack of funding, limited law enforcement, challenges in communication and supporting systems and high cost of surveillance data. Therefore, this process evaluation showed that for the animal health surveillance to improve, it requires the integrated and coordinated mechanisms that are sustainably funded. User-friendly unified reporting system, active involvement of subnational level animal health officials and optimization of available data sources while tapping into digital tools may reduce the cost of data and improve timeliness and data quality. Finally, the government should explore other financing mechanisms besides from the national budgets, such as re-investing certain percent of its collected revenue into disease control and surveillance and leveraging the public-private partnership. Data Availability Statement The original contributions presented in the study are included in the article/supplementary material, further inquiries can be directed to the corresponding author/s. Ethics Statement This study was approved by Research Ethics Committee of Sokoine University of Agriculture. It was granted research clearance from the Vice Chancellor on behalf of Tanzania Commission for Science and Technology (COSTECH), reference no. SUA/ADM/R.1/8/331-335. Participants gave written consent after reading consent declaration form. Author Contributions JG conceptualized the study with critical inputs from BH, EK, JM, MR, and SK. JG collected, analyzed and interpreted data, and wrote the first draft of the manuscript. BH, EK, JM, MR, and SK provided oversight throughout data collection, analysis and interpretation of the results, and substantively revised the first draft of the manuscript and subsequent modifications. All authors contributed to the article and approved the submitted version. Funding The study was part of research on the development of a prototype for cost-effective integration of animal health surveillance systems in Tanzania supported by the Government of Tanzania and World Bank, grant no. PAD 1436 through SACIDS Africa Centre of Excellence for Infectious Diseases of Humans and Animals in Southern and Eastern Africa (SACIDS-ACE). The funder had no role in the design of the study, data collection, analysis and interpretation or preparation of this manuscript. Conflict of Interest The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest. Publisher's Note All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7673974/

Lessons learned and questions raised during and post-COVID-19 anthropopause period in relation to the environment and climate

In the first part, this work reports that during the global "anthropopause" period, that was imposed in March and April 2020 for limiting the spread of COVID-19, the concentrations of basic air pollutants over Europe were reduced by up to 70%. During May and June, the gradual lift of the stringent measures resulted in the recovery of these reductions with pollution concentrations approaching the levels before the lockdown by the end of June 2020. In the second part, this work examines the alleged correlations between the reported cases of COVID-19 and temperature, humidity and particulate matter for March and April 2020 in Europe. It was found that decreasing temperatures and relative humidity with increasing concentrations of particulate matter are correlated with an increase in the number of reported cases during these 2 months. However, when these calculations were repeated for May and June, we found a remarkable drop in the significance of the correlations which leads us to question the generally accepted inverse relation between pandemics and air temperature at least during the warmer months. Such a relationship could not be supported in our study for SARS-CoV-2 virus and the question remains open. In the third and last part of this work, we examine the question referring to the origin of pandemics. In this context we have examined the hypothesis that the observed climate warming in Siberia and the Arctic and the thawing of permafrost could result to the release of trapped in the permafrost pathogens in the atmosphere. We find that although such relations cannot be directly justified, they present a possible horrifying mechanism for the origin of viruses in the future during the developing global warming of our planet in the decades to come. Overall the findings of our study indicate that: (1) the reduction of anthropogenic emissions in Europe during the "anthropopause" period of March and April 2020 was significant, but when the lockdown measures were raised the concentrations of atmospheric pollutants quickly recovered to pre-pandemic levels and therefore any possible climatic feedbacks were negligible; (2) no robust relationship between atmospheric parameters and the spread of COVID-19 cases can be justified in the warmer part of the year and (3) more research needs to be done regarding the possible links between climate change and the release of new pathogens from thawing of permafrost areas. Introduction The recent unprecedented pandemic crisis is so large, that the scientific community has been tempted to investigate the possible links and feedbacks between COVID-19 and the environment (Gautam and Hens 2020 ). Obviously, the pandemic has many negative effects influencing our lives, health and the economy (Wang et al. 2020 ). However, COVID-19 had also one positive effect for the atmospheric environment, namely the reduction of air pollution at several parts of the world due to the lockdown measures (Liu et al. 2020a , b ; Muhammad et al. 2020 ). Paradoxically, this improvement in air quality may be beneficiary for the health and well-being of the local populations despite the pandemic risk. On the other hand, most of the reduction in anthropogenic emissions was associated with the transport sector, while industrial pollution sources and adverse weather conditions were still found to increase the concentrations of air pollutants at specific areas (e.g., Wang et al. 2020 ). Significant improvements in air-quality conditions have already been reported for India (Gautam et al. 2020 ; Gautam 2020a , b ), China (Dutheil et al. 2020 ; Gupta et al. 2020 ) and for specific cities like Delhi, London, Paris and Wuhan (Bherwani et al. 2020 ). In this study, we focus on the links and feedbacks between COVID-19 and the environment both during and after the lockdown period based on station measurements over Europe. In this manner, we examine both the effects of the COVID-19 lockdown measures on the atmospheric environment and vice versa, i.e., the possible effects of atmospheric variables on pandemic spread. We present air quality measurements of NO 2 , CO, O 3 , and PM2.5 concentrations in Europe during the lockdown phase (March–April 2020) and during the recovery phase (May–June 2020). To the best of our knowledge, this is the first study to report the variability in air-quality conditions, before, during, and after the lockdown period, based on station measurements over the entire Europe. This "anthropopause" period imposed by COVID-19 measures provided a formidable opportunity to study air pollutants in Europe under the conditions of reduced anthropogenic activity. Air quality measurements are discussed in the first part of this work where we found out that air pollutants have been reduced at levels normally anticipated not before 2050 if the European Union Green Agenda is fully implemented. Next this work tackles important questions related to the alleged interrelations between environmental conditions (temperature, moisture, PM2.5 concentrations) and the spread of COVID-19 cases. The last part of the paper examines a hypothesis, according to which the observed climate warming at high latitudes and the thawing of permafrost could facilitate the release of pathogens in the atmosphere. Air quality during the anthropopause period in Europe A global anthropopause period was imposed through the lockdown due to the COVID-19 pandemic outbreak. During March–April 2020, the lockdown of transport and various businesses related activities have resulted in significant reduction of emissions. We have used the Eionet platform ( https://discomap.eea.europa.eu/map/fme/AirQualityExport.htm ) air quality data provided by the European Environmental Agency (EEA), to study the anomalies (in percentage) of 4 selected air pollutants. Τhe percentage anomalies for NO2, CO, O3 and PM2.5 are shown in Fig. 1 . In this figure, the anomalies were calculated in percent from the mean of the 5-year period 2015–2019. As can be seen from Fig. 1 , during the lockdown of transport and other activities the concentrations of basic air pollutants such as NO2, CO, PM2.5 have all dropped in the range from − 10 up to − 60 or − 70%. As expected, surface O3 levels have increased by more than 10% in most parts of Europe, which is observed in the most polluted regions of the continent and at urban stations due to the reduction in the main ozone destruction mechanism in urban environments (NO titration) following the substantial decrease of NO x emissions (Finlayson-Pitts and Pitts 1997 ). These changes were unprecedented and so coherent spatially, that the Europe as a whole had air quality characteristics foreseen to occur only after the possible implementation of European decisions that will take place until 2050 towards a neutral carbon environment. Figure 2 shows the time series of percent anomalies for NO 2 during the period June 2015–June 2020, based on the Eionet network. The points in the timeseries represent biweekly NO 2 concentration percentage departures from the corresponding 5-year (2015–2019) mean during the period 2015–2020. The horizontal dashed lines indicate ± 2 σ and 3σ confidence levels. From that figure one can easily see the overall European response of NO 2 concentration on a biweekly basis from July 2015 to July 2020. The abrupt and highly significant drop in NO 2 concentration is evident during the antropopause period (March and April 2020) followed by a recovery phase in May and June 2020. It is important to mention here that the observed changes to the concentrations of the above short-lived pollutants are mostly relative to local air-quality considerations. Any possible impacts on the actual global climate would require much longer periods of emission limitations before any expected effect can be detected. Fig. 1 March–April 2020 percentage anomalies from 2015 to 2019 climatology based on Eionet network Fig. 2 Time series of percent anomalies for biweekly mean NO 2 concentrations in Europe during the period 2015–2020, based on the Eionet network The large-scale spread of infections and the alleged role of atmospheric parameters in Europe The COVID-19 outbreak has caught by surprise China's Wuhan area before Christmas 2019 where stringent measures forced people to stay at home. The population in the Western world started being affected much later close to February 2020. Stringent measures were not taken worldwide and in fact WHO has characterized COVID-19 as pandemic on 12 March 2020 (World Health Organization—WHO 2020 ). In Europe the first cases followed a day to day increase in geometrical progression throughout the month of March 2020 which also marks the beginning of the declining phase in China. Some countries took early measures (such as Greece), while others implemented measures later on. Some took no measures at all, such as Sweden. A detailed table which includes the measures taken by different countries is provided in Appendix Table 4 . Here we examine the alleged interrelationship between atmospheric temperature, humidity, particulate matter concentrations and the mean daily number of COVID-19 cases at individual European countries and in Europe as a total. Although the global spread of the infection occurs primarily through social contact, traveling, aviation, trade, etc., the variability of meteorological conditions could also be related to the changes in the daily reported number of cases. The role of environmental conditions on infection spread has been previously reported for pandemics ( Hemmes et al. 1960 ; Kissler et al. 2020 ; Lin et al. 2006 ). Recent publications address the relation of COVID-19 cases with the meteorological conditions either on a global scale (Huang et al. 2020 ; Lal et al. 2020 ; Sobral et al. 2020 ) or at specific cities and countries Benedetti et al. 2020 ; Briz-Redón and Serrano-Aroca 2020 ; Demongeot et al. 2020 ; Gunthe et al. 2020 ; Menebo 2020 ; Şahin 2020 ). Other papers have studied separately the effects of meteorology from those of air pollution on the number of COVID-19 infections or deaths in Europe (Ogen 2020 ; Zoran et al. 2020a , b ) and elsewhere (Wang et al. 2020 ). In this context, we have re-examined the relationship that was alleged in some of the above papers to exist between air temperature, humidity and daily number of new COVID-19 cases. In that sense, we have correlated the day-to-day variability of COVID-19 cases with major environmental parameters such as the daily mean temperature and relative humidity and the daily mean concentrations of suspended particulates with diameter less than 2.5 μm. Meteorological and air quality data for the regression analysis were taken from Copernicus ERA5 reanalysis (Hersbach et al. 2020 ) and CAMS NRT Global, respectively ( https://apps.ecmwf.int/datasets/data/cams-nrealtime/levtype=sfc/ ). The sources for pandemic COVID-19 cases are shown in Appendix Table 5 (last update July 2020). In view of the difficulties involved in reporting the cases on time for every day, we decided to calculate the 5-day average for each dataset which pertains to a given region and country in Europe. The number of regions for each country are shown in Tables 1 and 2 which also show the number of pairs entering each correlation. For each 5-day period, we calculated the average number of new reported COVID-19 cases normalized by the population of each region which were afterwards correlated with the climatic anomalies of the atmospheric parameters (T, RH) together with PM2.5 daily mean concentrations. The correlations were calculated for 18 European countries as shown in both Tables 1 and 2 , where the Balkans include Slovenia, Croatia, Bosnia-Herzegovina, Montenegro, Albania and Greece. We should note here that different countries have different testing rates. Low testing rates may well mask the true infection numbers. However the large number of pairs entering our correlations (in Tables 1 and 2 ) ensures that statistically speaking, the significance of the correlations ensures the percentage of variance explained by environmental parameters without refering to the true infection numbers. The last column in Tables 1 and 2 shows the correlations for Europe as a whole between COVID-19 cases, temperature, relative humidity, PM2.5. More specifically, Table 1 shows the above-mentioned correlations for individual months (March, April, May, June), while Table 2 shows the correlations for the 2 bimonthly samples (March–April and May–June) as well as the 4-month period (March–June 2020). Statistically significant correlations at better than the 99% confidence level are shown by an asterisk next to the correlation coefficent. Both Tables 1 and 2 show in parentheses for each country and for the Europe as a whole, the number of regions from which data were provided and in parenthesis the number of pairs entering each correlation. Table 1 Correlation coefficients between the number of new COVID-19 cases during a 5-day period and the mean 5 days temperature, relative humidity, PM2.5 and CVI for each month from March to June 2020 Portugal (7 regions) Spain (19 regions) Italy (21 regions) U.K. (10 regions) France (13 regions) Belgium (3 regions) Netherlands (12 regions) Germany (15 regions) Swiss (23 regions) Poland (15 regions) Sweden (21 regions) Norway (11 regions) Balcans (6 regions) Europe (176 regions) March Temperature − 0.18 (35) − 0.33* (105) − 0.45* (95) − 0.07 (50) − 0.38* (65) − 0.7* (15) − 0.47* (60) − 0.3* (80) − 0.12 (115) − 0.22 (80) 0.02 (105) 0.03 (55) 0.29 (28) − 0.14* (860) Relative humidity 0.02 (35) − 0.03 (105) 0.07 (95) − 0.38* (50) − 0.59* (65) − 0.9* (15) − 0.68* (60) − 0.64* (80) − 0.34* (115) − 0.7* (80) − 0.47* (105) 0.12 (55) − 0.08 (28) − 0.12 (860) PM 2.5 0.36 (35) 0.17 (105) 0.2 (95) 0.47* (50) 0.29 (65) 0.5 (15) 0.47* (60) 0.28 (80) 0.38* (115) 0.37* (80) 0.07 (105) − 0.11 (55) 0.72* (28) 0.22* (860) CVI 0.36 (35) 0.37* (105) 0.43* (95) 0.43* (50) 0.46* (65) 0.87* (15) 0.69* (60) 0.52* (80) 0.43* (115) 0.6* (80) 0.21 (105) − 0.16 (55) 0.65* (28) 0.29* (860) April Temperature − 0.23 (42) − 0.47* (126) − 0.68* (114) 0.06 (60) − 0.46* (78) − 0.16 (18) 0.14 (72) − 0.19 (96) − 0.39* (138) 0.1 (96) 0.2 (126) − 0.26 (66) 0.05 (36) − 0.17* (1032) Relative humidity 0.27 (42) − 0.4* (126) − 0.22 (114) 0.28 (60) − 0.51* (78) − 0.29 (18) − 0.42* (72) − 0.11 (96) − 0.23* (138) − 0.25 (96) − 0.32* (126) 0.42* (66) − 0.25 (36) − 0.01 (1032) PM 2.5 0.39 (42) 0.08 (126) 0.11 (114) 0.38* (60) 0.14 (78) 0.03 (18) 0.35* (72) 0.31* (96) 0.11 (138) 0.16 (96) − 0.03 (126) 0.01 (66) 0.36 (36) 0.19* (1032) CVI 0.3 (42) 0.4* (126) 0.57* (114) 0.45* (60) 0.49* (78) 0.51 (18) 0.53* (72) 0.57* (96) 0.43* (138) 0.1 (96) − 0.24* (126) 0.2 (66) 0.42 (36) 0.3* (1032) May Temperature 0.07 (42) − 0.17 (126) − 0.1 (114) − 0.08 (60) − 0.12 (78) − 0.51 (18) − 0.03 (72) − 0.23 (96) − 0.35* (138) 0.15 (96) 0.15 (126) − 0.23 (11) − 0.07 (36) − 0.09 (977) Relative humidity 0.07 (42) 0.14 (126) − 0.08 (114) 0.28 (60) − 0.25 (78) 0.09 (18) − 0.09 (72) 0.13 (96) 0.27* (138) − 0.01 (96) − 0.16 (126) 0.56 (11) 0.05 (36) 0.02 (977) PM 2.5 0.26 (42) − 0.03 (126) − 0.05 (114) 0.43* (60) 0.22 (78) 0.29 (18) 0.26 (72) − 0.18 (96) − 0.25* (138) 0.47* (96) − 0.13 (126) 0.64 (11) 0.02 (36) 0.1 (977) CVI 0.26 (42) 0.11 (126) 0.08 (114) 0.46* (60) 0.35* (78) 0.7* (18) 0.31* (72) − 0.02 (96) 0 (138) 0.4* (96) − 0.26* (126) 0.46 (11) 0.18 (36) 0.19* (977) June Temperature 0.15 (7) − 0.09 (126) 0.17 (114) − 0.04 (60) − 0.23 (78) − 0.52 (18) − 0.33* (72) 0.04 (96) 0.03 (138) 0.05 (96) 0.16 (126) − 0.21 (6) 0.09 (931) Relative humidity 0.07 (7) 0.11 (126) − 0.25* (114) 0.05 (60) − 0.14 (78) 0.26 (18) 0.08 (72) − 0.08 (96) 0.04 (138) 0.14 (96) − 0.14 (126) 0.35 (6) 0.15* (931) PM 2.5 0.29 (7) 0.24* (126) 0.24 (114) 0.25 (60) 0.27 (78) − 0.01 (18) − 0.13 (72) − 0.05 (96) 0.03 (138) 0.36* (96) − 0.01 (126) − 0.36 (6) 0.12 (931) CVI 0.24 (7) 0.32* (126) 0.15 (114) 0.37* (60) 0.49* (78) 0.46 (18) 0.16 (72) − 0.07 (96) − 0.02 (138) 0.26 (96) − 0.15 (126) − 0.11 (6) − 0.01 (931) * Denotes statistically significant correlations at 99% c.l Table 2 Correlation coefficients between the number of new COVID-19 cases during a 5-day period and the mean 5 days temperature, relative humidity, PM2.5 and CVI for the bi-monthly periods March–April, May–June and the 4-month period March–June 2020 Portugal (7 regions) Spain (19 regions) Italy (21 regions) U.K. (10 regions) France (13 regions) Belgium (3 regions) Netherlands (12 regions) Germany (15 regions) Swiss (23 regions) Poland (15 regions) Sweden (21 regions) Norway (11 regions) Balcans (6 regions) Europe (176 regions) March–April Temperature − 0.14 (77) − 0.38* (231) − 0.59* (209) 0.21 (110) − 0.18 (143) 0.21 (33) 0.22 (132) − 0.05 (176) − 0.26* (253) 0.38* (176) 0.41* (231) − 0.19 (121) 0.21 (64) − 0.13 (1892) Relative humidity 0.27 (77) − 0.16 (231) − 0.11 (209) − 0.02 (110) − 0.56* (143) − 0.72* (33) − 0.62* (132) − 0.43* (176) − 0.11 (253) − 0.57* (176) − 0.48* (231) 0.3* (121) − 0.25 (64) − 0.06 (1892) PM 2.5 0.27 (77) 0.19* (231) 0.26* (209) 0.44* (110) 0.28* (143) 0.52* (33) 0.5* (132) 0.31* (176) 0.21* (253) − 0.07 (176) − 0.14 (231) − 0.14 (121) 0.43* (64) 0.21* (1892) CVI 0.16 (77) 0.13 (231) 0.3* (209) 0.44* (110) 0.23* (143) 0.51* (33) 0.47* (132) 0.31* (176) 0.21* (253) − 0.09 (176) − 0.18* (231) − 0.03 (121) 0.47* (64) 0.21* (1892) May–June Temperature 0.09 (49) − 0.22* (252) − 0.07 (228) − 0.16 (120) − 0.24* (156) − 0.68* (36) − 0.36* (144) − 0.29* (192) − 0.23* (276) 0.33* (192) 0.32* (252) − 0.23 (11) − 0.07 (42) 0.11 (1908) Relative humidity 0.06 (49) 0.05 (252) − 0.1 (228) 0.07 (120) − 0.22* (156) − 0.21 (36) − 0.11 (144) − 0.02 (192) 0.14 (276) 0.26* (192) − 0.19* (252) 0.56 (11) 0.05 (42) 0.13 (1908) PM 2.5 0.32 (49) 0.14 (252) 0.1 (228) 0.22 (120) 0.27* (156) − 0.11 (36) − 0.06 (144) − 0.23* (192) − 0.16* (276) 0.33* (192) 0.11 (252) 0.65 (11) − 0.02 (42) 0.1 (1908) CVI 0.27 (49) 0.07 (252) 0.07 (228) 0.25* (120) 0.24* (156) − 0.15 (36) − 0.09 (144) − 0.24* (192) − 0.15 (276) 0.36* (192) 0.1 (252) 0.64 (11) 0.02 (42) 0.11 (1908) March–June Temperature 0.02 (126) − 0.5* (483) − 0.6* (437) − 0.09 (230) − 0.43* (299) − 0.46* (69) − 0.37* (276) − 0.42* (368) − 0.42* (529) 0.35* (368) 0.49* (483) − 0.21 (132) − 0.07 (106) 0.11 (3800) Relative humidity 0.15 (126) − 0.13 (483) 0.13 (437) 0.02 (230) − 0.39* (299) − 0.39* (69) − 0.45* (276) − 0.38* (368) − 0.23* (529) 0.27* (368) − 0.3* (483) 0.3* (132) − 0.2 (106) 0.09 (3800) PM 2.5 0.29* (126) 0.33* (483) 0.29* (437) 0.36* (230) 0.37* (299) 0.28 (69) 0.16* (276) 0.11 (368) 0.27* (529) 0.15* (368) 0.04 (483) − 0.13 (132) 0.4* (106) 0.05 (3800) CVI 0.2 (126) 0.26* (483) 0.33* (437) 0.37* (230) 0.35* (299) 0.29 (69) 0.14 (276) 0.12 (368) 0.27* (529) 0.18* (368) 0.02 (483) − 0.01 (132) 0.4* (106) 0.05 (3800) * Denotes statistically significant correlations at 99% c.l In both tables, we have calculated an index (COVID-19 Index, hereafter CVI) to describe the interrelationship between the atmospheric variables discussed above and the number of COVID-19 cases. In order to do so, we use a multiple regression analysis in which the dependent variable COVID-19 index (CVI) is the mean daily number of new cases in each group and the independent variables are the temperature (°C), the relative humidity (%), and the daily anomalies of PM2.5 concentrations (in μg m −3 ) as shown in Eq. 1 . The CVI index is correlated with the number of new cases in Europe explaining about 9% of their total variance during March and April, 4% during May and 0% during June (Table 1 ). 1 \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$$CVI = a_{0} + a_{1} T + a_{2} \left( {{ ext{RH}}} ight) + a_{3} { ext{PM}}2.5$$\end{document} C V I = a 0 + a 1 T + a 2 RH + a 3 PM 2.5 The multiple regression analysis for Eq. ( 1 ) in Europe takes the form: 2 \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$${ ext{CVI}} = 0.302 - 0.041T - 0.004\left( {{ ext{RH}}} ight) + 0.059\left( {{ ext{PM}}2.5} ight)$$\end{document} CVI = 0.302 - 0.041 T - 0.004 RH + 0.059 PM 2.5 \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$$a_{0} = \, 0.302 \pm 0.023, \, a_{1} = 0.041 \pm 0.005; \, a_{2} = 0.004 \pm 0.001{ ext{ and }}a_{3} = 0.059 \pm 0.006$$\end{document} a 0 = 0.302 ± 0.023 , a 1 = 0.041 ± 0.005 ; a 2 = 0.004 ± 0.001 and a 3 = 0.059 ± 0.006 To summarize, part of the variance of the reported 5-day averaged number of COVID-19 cases in Europe for March and April can be explained by an index based on the atmospheric variables used. More specifically, temperature and humidity are anti-correlated with the number of COVID-19 cases, while PM2.5 is positively correlated. So, the number of new COVID-19 cases shows an increase at lower temperature (cold), lower humidity (dry) and high concentrations of particulates only during March and April. The correlation between particulates and CVI can be expected in view of the fact that smaller particulates have negative effects on respiratory diseases (Dockery and Pope 1994 ). However when we repeated the above calculations for May and June, the correlations proved to be insignificant. More specifically the CVI correlation coefficient for the entire 4-month period March–June in Europe drops to 0.05 (Table 2 ). These results raise a question on whether the spread of COVID-19 disease depends on atmospheric conditions, or not. Based on the contradicting results between the two different periods (the anthropopause and post-anthropopause), the existence of such a relationship cannot be supported and the above analysis remains inconclusive. The spread of the disease is affected primarily by social distancing and the implementation of lockdown measures (e.g., Bherwani et al. 2020 ). In fact, we have been witnessing an increase in COVID-19 cases during the summer months of 2020 globally. A working hypothesis on acceleration of climate change in Siberia and the Arctic and the possible implications for the emergence of pathogens from the permafrost An additional mechanism connecting climate change with epidemic infections could be that viruses originating from melting glacier or thawing permafrost in the arctic can be transferred both by the wind and the migratory birds toward lower latitudes, eventually enhancing the complexity for infection dynamics. Similar hypotheses on the release of deadly infection vectors from exposed carcasses due to thawing of permafrost in arctic regions have been discussed for anthrax (Revich and Podolnaya 2011 ; Revich et al. 2012 ; Hueffer et al. 2020 ). The viruses could be hidden in the melting ice and thawing of permafrost regions in the Arctic in view of the evolving global warming and its acceleration in this part of the world (IPCC Intergovernmental Panel on Climate Change 2013 ). Pathogenic viruses and microbes have been found to survive very long periods of time buried in permafrost regions (Tumpey et al. 2005 ; Biagini et al. 2012 ; Legendre et al. 2014 ). For example Legendre et al. 2014 (Legendre et al. 2014 ) found a still infectious 30,000-year-old virus (named Pithovirus sibericum) in a Siberian permafrost sample. Tumpey et al., 2005 managed to reconstruct the Spanish influenza virus from a victim that was buried in Alaska since 1918 and Biagini et al. 2012 detected a smallpox related virus (variola virus) in mummies buried in Siberian permafrost from the late 17th to early 18th. Permafrost is the soil layer that remains permanently frozen throughout the year under various permafrost types at higher latitudes (i.e., continuous, discontinuous, sporadic and isolated) (Brown et al. 1997 ). In Central Asia, several mixed types of permafrost start from NW China and Mongolia and extend northward toward Siberia. Long-term measurements of deep permafrost temperatures at depths of 10–200 m in Central Asia and Russia (Romanovsky et al. 2010 ; Zhao et al. 2010 ) have shown a continuous warming trend over the last decades (1972–2009). Climate warming leads also in thickening of the active soil layer, i.e., the upper soil region that responds to the seasonal ambient conditions (temperature and precipitation) (Streletskiy et al. 2015 ). The consecutive melting of permafrost layers from year to year due to climate warming could eventually result to the exposure of gradually deeper permafrost layers and thus increase the possibility for exposure of contaminating sources such as buried carcasses, cemetery graves and fossils along the migrating birds' pathways and stopover sites (Clairbaux et al. 2019 ). Lower latitude permafrost areas such as the regions of north Mongolia and south Russia (e.g., Irkutsk, Lake Baikal) are more susceptible to inter-annual temperature changes and to global warming (Hueffer et al. 2020 ). Following this hypothesis, the acceleration of temperature increase in the Arctic and the melting of permafrost in these areas could be related to the release of present and future "unknown" viruses. That scenario is horrifying, particularly if one considers that migrating bird pathways and wintering areas can also be modified in view of global warming continuation (Romanovsky et al. 2010 ). From the climatological point of view, Central Asia is one of the most vulnerable regions for manmade climate change. The 140 years (1880–2020) continuous record of mean temperature at the station of Irkutsk (52.27° N, 104.32° E) exhibits a heating of almost 3 °C in this period (Fig. 3 ). Most of this warming (about 2.5 °C) occurs after 1970 as seen from the right regression line in Fig. 3 . Fig. 3 Mean monthly temperature anomalies for Irkutsk (1880–2019) Warming of the arctic is also clearly evident by the National Snow and Ice Data Center (NSIDC) analysis of satellite observations showing the changes in the arctic sea-ice since 1979 (Fig. 4 ). The annual minimum of the arctic sea-ice area shrinks from about 7 million km 2 before 2000 to 4.5 million km 2 after 2000. The red numbers in Fig. 4 correspond to specific pandemics listed in Table 3 . It is worth noticing that as seen in Table 3 , seven out of ten major influenza and coronavirus outbreaks in the past 130 years originated in Southeast Asia (Drosten et al. 2003 ; Ksiazek et al. 2003 ; Doshi 2011 ; Zaki et al. 2012 ; Saunders-Hastings and Krewski 2016 ; Paraskevis et al. 2020 ; Wu et al. 2020a , b ). Fig. 4 Annual minimum extent of the Arctic Sea Ice (in million km 2 ) from 1979 to 2019. Important pandemics during this period are also shown in the graph with red numbers corresponding to Table 3 Table 3 Historical Pandemics in the northern hemisphere from 1889 to 2019 Pandemic Onset date Origin of Outbreak Type and proposed carrier in the literature (see references) 1. COVID-19 17 November 2019 Wuhan China Coronavirus, bats, pangolins 2. Bird Flu 19 February 2013 Shanghai China H7N9, birds, poultry 3. MERS November 2012 Jeddah Saudi Arabia Coronavirus, bats, camels 4. Swine Flu 17 April 2009 San Diego, California, USA H1N1, pigs 5. SARS-CoV November 2002 Guangdong China Coronavirus, bats, Civets 6. Bird flu March 1997 Hong Kong H5N1, birds, poultry 7. Hong Kong Flu July 1968 Hong Kong H3N2, birds, pigs 8. Asian Flu February 1957 Guizhou China H2N2, birds 9. Spanish Flu 1918 Possibly China H1N1, birds, poultry 10. Russian Flu 1889 Asia, Canada and Greenland H2N2, birds The continuous decrease in arctic ice cover in the summer months (Fig. 4 ) will eventually lead to an ice-free polar ocean by the end of this century. This could modify the behavior of several local species including migrating birds. Emerging of new stopover sites previously covered by ice and the ability to prey on the open sea might alter the birds' habits such as migrating routes and wintering areas (Clairbaux et al. 2019 ). To emphasize the complexity of this hypothesis, climate warming and consequent changes in permafrost are more evident near lakes and wetlands accompanied also by geological deformations such as landslides along river and lake banks due to permafrost thawing and increase of the active layer depth (Tyszkowski et al. 2015 ). Such water and wetland ecological complexes are natural resting biotopes for a variety of species like Anseriformes and Gruiformes especially at the south parts of Siberia (Sivay et al. 2012 ). In a recent study by Sharshov et al. ( 2017 ), the virus of influenza was detected in 185 birds from a total of 2300 samples obtained from wild migratory birds in the south of Western Siberia during 2007–2014. Certain viruses including influenza persist in environmental ice (glaciers, snow, permafrost) for years, centuries, millennia, or even longer (Rogers et al. 2004 ). Therefore, it is possible that a continuous alteration of wetland biotopes landscapes due to climate warming and the consecutive melting of soil layers after centuries of remaining at permafrost stage could assist the re-emergence of ancient virus agents in the environment. The virus agents remain frozen in birds' feces and are exposed back in spring and summer through melting and thawing processes to generate a seasonal infection cycle (Yu et al. 2010 ). For the interested reader, we provide in Appendix calculations of back trajectories for the prevailing air masses up to 10 days before the onset of major pandemics. Finally, the extremely rapid urbanization of large regions of biotopes and brutal changes of landscape in the past few decades in China may have also played a role to enhance the genetic diversity of certain pathogens. Conclusions The findings of our study can be summarized as follows: The COVID-19 anthropopause period resulted in a remarkable drop of atmospheric pollutant concentrations in Europe, resembling the anticipated 2050 Green Deal conditions. The comparisons are presented as percentage anomalies from the 2015–2019 average values. The reduction in NO 2 concentrations is pronounced over the entire continent ranging between − 10 and − 20% in the south and east Europe and − 50% in central Europe. This reduction in NO 2 is accompanied by an increase of up to 30% in O 3 as an expected result (titration). The reduction of CO concentrations is also found to be more than − 30% especially in Italy and central Europe with only a few stations presenting a statistical increase (mainly in the Iberian Peninsula). Particulate matter (PM2.5) concentrations also present significant reduction of − 10 to − 20% at most stations. The improvement of air quality in Europe lasted only for 2 months during the lockdown (March and April 2020). As soon as the lockdown measures were waived, the concentrations of pollutants in the atmosphere quickly recovered to pre-pandemic levels. The recovery phase took little more than two months. No climatic implications can be justified from this short-term perturbation of anthropogenic emissions. Our analysis on the possible correlation between meteorology, air quality and the number of daily reported COVID-19 cases in Europe resulted in the construction of a tentative statistical index that explained more than 9% of the total variance in the reported COVID-19 cases for March and April 2020. However, the correlations dropped to insignificant levels when we repeated our calculations for May and June 2020. This shows that any suggested relation between temperature, humidity and virus spread cannot be justified and most likely the global spread of the infection occurs primarily through social contact, traveling, aviation, trade, etc. Seven out of ten influenza and coronavirus pandemics from 1889 to the present originated in China. Significant climate warming, thawing of permafrost soil and glacier retreat is evident in Siberia and the Arctic in coincidence with the increase of epidemics in Southeast Asia. The possible release of frozen viruses at these areas and the possible changes in migrating birds' routes due to climate change cannot be excluded in studying past and future epidemic hazards. The significant correlation that was found between virus spread, colder temperatures and lower relative humidity levels during the first two months of the pandemic (March and April 2020) is in accordance with previous correlation studies on the connections between COVID-19 and meteorology for China (Liu et al. 2020a , b ; Wang et al. 2020 ), Iran (Ahmadi et al. 2020 ), US and Italian regions (Livadiotis 2020 ) and at global scale (Wu et al. 2020a , b ) during the same period. Contradictory results have been reported by a correlation study in Brazil (Auler et al. 2020 ) where high temperatures and intermediate relative humidity are found to favor the spread of COVID-19. On the other hand, the correlation between the increased PM levels and virus infections is also in agreement with previous COVID-19 studies (Comunian et al. 2020 ; Fattorini and Regoli 2020 ; Frontera et al. 2020 ; Sasidharan et al. 2020 ). However, as shown in our analysis, such correlations can be misleading because these relations are not robust when repeated for a longer period of time. The persistence of the infection at the north hemisphere during the summer months is also an indication that the variability of COVID-19 cases is not significantly correlated with air temperature variability. The findings of this paper bring us before new challenges and directions in climate change research. Glacier retreating and thawing of permafrost layers expected in the forthcoming decades may result in new and unknown epidemics posing new horrifying threats to mankind. It is important that combined atmospheric and epidemiological studies as well as detailed scientific expeditions should be organized to investigate such health-related aspects of climate change. Species like bats and other exotic mammals are believed to be the largest reservoir for SARS-CoV-like viruses (Cheng et al. 2007 ; Cupertino et al. 2020 ; Fan et al. 2019 ) and therefore the humanity needs to revisit certain social customs and traditional diets which can threaten our lives and result in pandemic disasters like the one we experience at present. Appendix See Tables 4 and 5 Table 4 Measures taken by each country during COVID-19 pandemic Country Measures Italy 4 March: full closure of all schools and universities nationwide Spain 14 March: all citizens in quarantine except for those working in healthcare or other vital activities, closing all non-critical businesses Portugal March 18: the entirety of the Portuguese territory in a State of Emergency April 2–17: extension of the State of Emergency UK 18 March: Closed schools 21 March: Closed bars, restaurants, cafes and other entertainment venues 22 March: Advised vulnerable people to stay at home 23 March: Initiated Lockdown Phase, Closed most businesses Germany 16 March: Non-essential public services closed 22 March: Public gatherings banned France 13 March: closure of all non-essential public places 6 March: mandatory home confinement Belgium 29 January: travel notice advising against non-essential flights to China, Hong Kong excluded 10 March: the government advised citizens to cancel any indoor scheduled events to be attended by more than 1,000 people for the month of March 12 March: federal phase of crisis management = closure of schools, discos, cafes and restaurants, cancellation of all public gatherings for sporting, cultural or festive purposes 17 March: additional measures = Stricter social distancing measures from noon the following day until 5 April, with non-essential travel prohibited, non-essential shops to close, gatherings banned, with penalties for corporate and individual persons who failed to comply with the restrictions Netherlands 12 March: Gatherings of more than 100 people banned 13 March: Prison visitations limited to legal affairs 15 March: All food and beverage outlets, bars, cafes, restaurants, gyms, saunas, sex clubs and coffee shops required to close, except for takeaway and delivery services. Schools closed 17 March: All education services closed 23 March: Visits to youth, disability and psychiatric care restricted 23 March: Ban on non-essential outdoors activities, gatherings with more than 2 people banned, 1.5 m introduced Poland 12 March—10 April: All schools were closed 20 March: An official epidemic was declared 24 March: home restriction Switzerland 20 March: the government announced that no lockdown would be implemented, but all events or meetings over 5 people were prohibited 13 March: cancelling of classes in all educational establishments until 4 April 2020, and banning all events (public or private) involving more than 100 people Sweden 11 March: limiting freedom of assembly by banning all gatherings larger than 500 people No mandatory lockdown Norway 12 March: a national lockdown was announced 13 March, Norway introduced a ban on visits to Norway through Oslo airport Greece 10 March: suspension of school operation 13 March: close down all cafes, bars, museums, shopping centres, sports facilities and restaurants in the country 6 March, all retail shops were also closed and all services in all areas of religious worship of any religion or dogma were suspended. Supermarkets, pharmacies, food outlets that offer take-away and delivery only, as well as some other businesses, remained open 23 March: significant restrictions on all nonessential transport and movement Albania 8 March: all schools for two weeks, ordered cancellation of all large public gatherings, and asked sports federations to cancel scheduled matches 12 March: 72-h curfew during which only transportation of basic needs such as food and medicine would be permitted, a three-month loan holiday, and the forced closure of garment factories and call centres 15 March: hardening of its lockdown Montenegro 13 March: initial round of precautionary measures Slovenia 16 March: all educational institutions, public transport, all restaurants and bars 20 March: De facto quarantine (with some exemptions) Croatia 1 February: preparedness measures for the coronavirus epidemic to be prepared for all scenarios 24 February: additional measures that Croatia will take against the spread of coronavirus, with enhanced control of border crossings to Italy 3 March: people 60 and those suffering from chronic diseases, according to which they should avoid visiting and entering overcrowded public areas 16 March: two-week suspension of classes in schools and colleges Bosnia-Herzegovina 11 March: 2-week shutdown of all schools, high schools and universities 18 March: an order that banned all public gatherings, suspending the operation of all catering facilities for the preparation and sale of food and beverages, restaurants, pizzerias, confectioneries, beauty salons, hookah bars, coffee bars, discos, tea shops, cafes, private dentists 20 March: order which banned the movement of people under the age of 18 and over 65 22 March: a curfew was introduced every day from 18:00 until 05:00 Table 5 Pandemic data were obtained (data was retrieved in 27 July 2020) from the following sources: Country Data source Italy Protezione Civile bulletins at 17:00 CET https://opendatadpc.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/b0c68bce2cce478eaac82fe38d4138b1 Spain Spanish Ministry of Health on confirmed cases of COVID-19 https://cnecovid.isciii.es/covid19/ Portugal Directorate-General of Health of Portugal (Direção-Geral da Saúde) https://covid19.min-saude.pt/ponto-de-situacao-atual-em-portugal/ U.K Government of the United Kingdom https://coronavirus.data.gov.uk/ Germany Robert Koch Institute https://www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuartiges_Coronavirus/Fallzahlen.html France Government of France https://dashboard.covid19.data.gouv.fr/vue-d-ensemble?location=FRA Belgium Sciensano national public health institute of Belgium https://epistat.wiv-isp.be/covid/ Netherlands National Institute for Public Health and the Environment Switzerland https://www.corona-data.ch/ Sweden Public Health Agency of Sweden (Folkhälsomyndigheten) https://experience.arcgis.com/experience/09f821667ce64bf7be6f9f87457ed9aa Norway Norwegian Institute of Public Health https://www.fhi.no/en/id/infectious-diseases/coronavirus/daily-reports/daily-reports-COVID19/#by-county Balkans https://github.com/CSSEGISandData/COVID-19/blob/master/who_covid_19_situation_reports/who_covid_19_sit_rep_time_series/who_covid_19_sit_rep_time_series.csv Meteorological conditions before the onset of historical pandemics and a possible hypothesis on pathogens transport by migrating birds See Figs. 5 and 6 Fig. 5 Worldwide distribution of migrating birds pathways (based on Shupeng et al. 2008; Zhang et al. 2014 ) Fig. 6 HYSPLIT backtrajectories from origin of epidemic outbreak together with migrating bird pathways (see Fig. 5 ). The numbers correspond to specific infections in Table 3 ; a Asia; b US and Canada c Egypt Arabia and Mesopotamia. The starting locations for the backtrajectories are: (1) Wuhan (30.583 N, 114.283E), (2) Shanghai (31.22 N, 121.46E), (3) Jeddah (39.17 N, 21.54E), (4) San-Diego (32.71 N, 117.16 W), (5) Guangdong (23.24 N, 113.30E), (6,7) Hong Kong (22.30 N, 114.18E), (8) Guizhou (26.83 N, 106.83E). No runs were performed for Spanish Flu (1918) and Russian Flu (1889) due to the lack of meteorological data in these eras As seen in Fig. 5 , the eight identified major migratory routes are mostly meridional and the majority of them extend to more than one continent (Shupeng and van Genderen 2008 ; Zhang et al. 2014 ). Wild birds such as waterfowls and cranes follow the Asian flyways in autumn, moving from the northern latitudes of Central and Eastern Asia toward the wintering grounds in China (e.g., Lake Qinghai and Yangtze River delta, see (Wang et al. 2018 ; Zhang et al. 2014 ). Particularly in China, a total of 53.6 million hectares of wetlands such as lakes, swamps, rivers as well as artificial wetlands provide breeding and wintering sites for several species including cranes, gulls, ducks, and geese (Wang et al. 2018 ). A recent study (Deng et al. 2019 ) shows that the Greater White-fronted Geese autumn migration starts from the Russian Arctic breeding sites in late September moving to wintering areas in southeast China in late October. These worldwide migrating pathways provide a possible natural avian carrier network which should be considered seriously in any mechanism explaining interspecies transmission of viruses. Additionally, earlier studies on the seasonality and origin of pathogenic infections suggest the possibility of long-range airborne transport for influenza virus (Hammond et al. 1989 ) and transport of avian influenza by dust storms outbreaks (Chen et al. 2010 ). In order to investigate the possible atmospheric connections for the historical pandemics of Table 3 we perform a back-trajectory analysis at the onset regions with the Hybrid Single-Particle Lagrangian Integrated Trajectory model (HYSPLIT) (Stein et al. 2015 ). HYSPLIT runs after 2005 are driven by the Global Data Assimilation System (GDAS) 1° × 1° fields from NOAA's National Centers for Environmental Prediction Reanalysis data sets ( https://ready.arl.noaa.gov/READYcmet.php ). The runs before 2005 are driven by NOAA's CDAS reanalysis dataset ( https://psl.noaa.gov/data/gridded/data.ncep.reanalysis.html ) that are available at 2.5° × 2.5° grid from 1948 onward. No HYSPLIT runs have been performed for the 1918 Spanish Flu and the 1889 Russian Flu due to the lack of data for these periods. Each backward trajectory is simulated for 10 days starting at 150 m height a.g.l over the infected onset site. The trajectories are calculated at 00:00, 06:00, 12:00 and 18:00 UTC for each day during the month preceding the infection onset. The total of 120 trajectories for each case is filtered to keep only trajectories including points below 100 m a.g.l. This is done in order to exclude the air masses subsiding from upper tropospheric layers without interfering with the boundary layer along their paths. Finally, the trajectories for each case are clustered to a single preferential direction as seen in Fig. 6 . The coordinates for the starting point of the trajectories nearest to the reported epidemic outbreak are also given in Fig. 6 caption. From the cluster analysis shown in Fig. 6 , the 5 out of 6 outbreaks which occurred in China were associated with air masses arriving from the northern sector (Mongolia, Siberia). These backtrajectories are seen to intersect the three major migrating birds' flyways in Asia (Central Asian, East Asian–Australian and East African–West Asian). The onset season of the epidemics reported in Table 3 , mainly autumn and winter, coincide with the southward migration of waterfowl species from their breeding summer regions toward their wintering places in China (G. Wang et al. 2008 ; Wille et al. 2017 ). The only exception is the Hong Kong flu of 1968 (yellow line in Fig. 6 a) that is reported to outbreak in July 1968. For this pandemic Saunders-Hastings and Krewski, 2016 have shown that the responsible H3N2 agent was the result of an antigenic shift (i.e., merging of different strains of a virus to form a new virus subtype) on the H2N2 virus that caused the 1957 Asian flu in the same area which can explain the local outburst of the infection during a summer month. Caution should be given also to the San Diego back trajectory in Fig. 6 b (magenta line) which is associated with the outbreak of the Swine Flu pandemic in April 2009. Its direction is again from the north extending up to the Aleutian Islands in the Arctic and interfering with the East Asian–Australian, Pacific Americas and Mississippi Americas flyways. Finally, the MERS 2012 trajectory (blue line in Fig. 6 c) indicates a mostly regional origin of the air masses arriving in Jeddah during November 2012 and also possible interference with the Black Sea—Mediterranean flyway. Recirculation of the viruses along the annually migration flyways and spillover of the infection to other avian and mammalian hosts adds to the complexity of epidemic dynamics and the need to clarify its possible association with atmospheric processes. We caution that our trajectory analysis provides only an indication that air mass intersection with the aerial flyways could facilitate virus transport before the onset of the epidemics under study. It is obvious that the actual processes that are responsible for the initiation of an epidemic at a specific place and time are very complex and include a number of biological and social parameters. The possible role of migrating birds needs further elucidation (Tsiodras et al. 2008 ) and could be considered as additional parameter to this complexity. Meteorological conditions before the onset of historical pandemics and a possible hypothesis on pathogens transport by migrating birds See Figs. 5 and 6 Fig. 5 Worldwide distribution of migrating birds pathways (based on Shupeng et al. 2008; Zhang et al. 2014 ) Fig. 6 HYSPLIT backtrajectories from origin of epidemic outbreak together with migrating bird pathways (see Fig. 5 ). The numbers correspond to specific infections in Table 3 ; a Asia; b US and Canada c Egypt Arabia and Mesopotamia. The starting locations for the backtrajectories are: (1) Wuhan (30.583 N, 114.283E), (2) Shanghai (31.22 N, 121.46E), (3) Jeddah (39.17 N, 21.54E), (4) San-Diego (32.71 N, 117.16 W), (5) Guangdong (23.24 N, 113.30E), (6,7) Hong Kong (22.30 N, 114.18E), (8) Guizhou (26.83 N, 106.83E). No runs were performed for Spanish Flu (1918) and Russian Flu (1889) due to the lack of meteorological data in these eras As seen in Fig. 5 , the eight identified major migratory routes are mostly meridional and the majority of them extend to more than one continent (Shupeng and van Genderen 2008 ; Zhang et al. 2014 ). Wild birds such as waterfowls and cranes follow the Asian flyways in autumn, moving from the northern latitudes of Central and Eastern Asia toward the wintering grounds in China (e.g., Lake Qinghai and Yangtze River delta, see (Wang et al. 2018 ; Zhang et al. 2014 ). Particularly in China, a total of 53.6 million hectares of wetlands such as lakes, swamps, rivers as well as artificial wetlands provide breeding and wintering sites for several species including cranes, gulls, ducks, and geese (Wang et al. 2018 ). A recent study (Deng et al. 2019 ) shows that the Greater White-fronted Geese autumn migration starts from the Russian Arctic breeding sites in late September moving to wintering areas in southeast China in late October. These worldwide migrating pathways provide a possible natural avian carrier network which should be considered seriously in any mechanism explaining interspecies transmission of viruses. Additionally, earlier studies on the seasonality and origin of pathogenic infections suggest the possibility of long-range airborne transport for influenza virus (Hammond et al. 1989 ) and transport of avian influenza by dust storms outbreaks (Chen et al. 2010 ). In order to investigate the possible atmospheric connections for the historical pandemics of Table 3 we perform a back-trajectory analysis at the onset regions with the Hybrid Single-Particle Lagrangian Integrated Trajectory model (HYSPLIT) (Stein et al. 2015 ). HYSPLIT runs after 2005 are driven by the Global Data Assimilation System (GDAS) 1° × 1° fields from NOAA's National Centers for Environmental Prediction Reanalysis data sets ( https://ready.arl.noaa.gov/READYcmet.php ). The runs before 2005 are driven by NOAA's CDAS reanalysis dataset ( https://psl.noaa.gov/data/gridded/data.ncep.reanalysis.html ) that are available at 2.5° × 2.5° grid from 1948 onward. No HYSPLIT runs have been performed for the 1918 Spanish Flu and the 1889 Russian Flu due to the lack of data for these periods. Each backward trajectory is simulated for 10 days starting at 150 m height a.g.l over the infected onset site. The trajectories are calculated at 00:00, 06:00, 12:00 and 18:00 UTC for each day during the month preceding the infection onset. The total of 120 trajectories for each case is filtered to keep only trajectories including points below 100 m a.g.l. This is done in order to exclude the air masses subsiding from upper tropospheric layers without interfering with the boundary layer along their paths. Finally, the trajectories for each case are clustered to a single preferential direction as seen in Fig. 6 . The coordinates for the starting point of the trajectories nearest to the reported epidemic outbreak are also given in Fig. 6 caption. From the cluster analysis shown in Fig. 6 , the 5 out of 6 outbreaks which occurred in China were associated with air masses arriving from the northern sector (Mongolia, Siberia). These backtrajectories are seen to intersect the three major migrating birds' flyways in Asia (Central Asian, East Asian–Australian and East African–West Asian). The onset season of the epidemics reported in Table 3 , mainly autumn and winter, coincide with the southward migration of waterfowl species from their breeding summer regions toward their wintering places in China (G. Wang et al. 2008 ; Wille et al. 2017 ). The only exception is the Hong Kong flu of 1968 (yellow line in Fig. 6 a) that is reported to outbreak in July 1968. For this pandemic Saunders-Hastings and Krewski, 2016 have shown that the responsible H3N2 agent was the result of an antigenic shift (i.e., merging of different strains of a virus to form a new virus subtype) on the H2N2 virus that caused the 1957 Asian flu in the same area which can explain the local outburst of the infection during a summer month. Caution should be given also to the San Diego back trajectory in Fig. 6 b (magenta line) which is associated with the outbreak of the Swine Flu pandemic in April 2009. Its direction is again from the north extending up to the Aleutian Islands in the Arctic and interfering with the East Asian–Australian, Pacific Americas and Mississippi Americas flyways. Finally, the MERS 2012 trajectory (blue line in Fig. 6 c) indicates a mostly regional origin of the air masses arriving in Jeddah during November 2012 and also possible interference with the Black Sea—Mediterranean flyway. Recirculation of the viruses along the annually migration flyways and spillover of the infection to other avian and mammalian hosts adds to the complexity of epidemic dynamics and the need to clarify its possible association with atmospheric processes. We caution that our trajectory analysis provides only an indication that air mass intersection with the aerial flyways could facilitate virus transport before the onset of the epidemics under study. It is obvious that the actual processes that are responsible for the initiation of an epidemic at a specific place and time are very complex and include a number of biological and social parameters. The possible role of migrating birds needs further elucidation (Tsiodras et al. 2008 ) and could be considered as additional parameter to this complexity.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5359748/

Commensal or pathogen – a challenge to fulfil Koch’s Postulates

ABSTRACT 1. Infectious diseases have a large impact on poultry health and economics. Elucidating the pathogenesis of a certain disease is crucial to implement control strategies. 2. Multiplication of a pathogen and its characterisation in vitro are basic requirements to perform experimental studies. However, passaging of the pathogen in vitro can influence the pathogenicity, a process targeted for live vaccine development, but limits the reproduction of clinical signs. 3. Numerous factors can influence the outcome of experimental infections with some importance on the pathogen, application route and host as exemplarily outlined for Histomonas meleagridis, Gallibacterium anatis and fowl aviadenoviruses (FAdVs). 4. In future, more comprehensive and detailed settings are needed to obtain as much information as possible from animal experiments. Processing of samples with modern diagnostic tools provides the option to closely monitor the host–pathogen interaction. Introduction Robert Koch (1843–1910) was a physician and microbiologist who made eminent contributions to understand important bacterial diseases in humans like tuberculosis, cholera and anthrax. In his innovative discoveries, he focused on the characterisation of the microorganisms in vitro and in vivo . These observations led to the formulation of postulates which describe the basic requirements for a microorganism and its link to certain causalities (Gradmann, 2014 ). They are regarded as the gold standard to summarise principle investigations ranging from the isolation of a pathogen from a diseased host and its pure cultivation until re-isolation following induction of the disease in susceptible hosts. For his achievements, he was awarded with the Nobel Prize in Physiology and Medicine in 1905. Since their discovery, the knowledge about microorganisms and their interaction with the host extended substantially, arguing for a revision and modification of the original postulates. Specifically, endemic microorganisms that induce disease only under certain conditions hardly ever comply with the postulates. Rigorousness and exclusive application of the postulates were already questioned by Robert Koch himself, because he noticed that some infectious bacteria can appear as a commensal but the context between pathogen–host and environment were not the main focus at that time. Good health is considered as a major principle to sustain animal welfare in addition to good housing and feeding, together with appropriate behaviour (European Food Saftey Authority (EFSA), 2012 ). This is also of high importance to support the prosperity and sustainability of production. Robert Fraser Gordon published different articles about the importance of diseases for the economy in poultry production and he already claimed that not only mortality needs to be considered in this context (Gordon, 1967 , 1971 , 1973 ). According to R.F. Gordon, "adverse effects on production and reproduction, food conversion and body weight and the costs for disease control and prevention" contribute to economic losses. Research is mandatory to address these challenges and as a consequence he set up the Houghton Poultry Research Station which was solely focused on poultry research (Gordon, 1973 ). Ever since, infectious diseases in poultry have had a high impact on health and production and the number of pathogens known to influence health has increased constantly (Swayne et al ., 2013 ). However, for some microorganisms, the link between pathogenicity and being a sole commensal is not that clear. This is also supported by controversial results of animal experiments reported in the literature. Some imponderabilities, like the inoculum, the route of application and the host are discussed in this article based upon infections of chickens with Histomonas meleagridis, Gallibacterium anatis and fowl aviadenoviruses (FAdVs). The main aim of this paper is to highlight influences which contribute to the pathogenicity in the field, and the necessity to address and consider such features in experimental settings, in order to strengthen the association with causation. Considering the wide range of pathogens – from a parasite to a virus – it remains obvious that not all necessary references can be given for each individual subject in this review, which should not prevent the truth of the main conclusions becoming clear. Histomonas meleagridis Taxonomy H. meleagridis was originally regarded as an amoeba and named Amoeba meleagridis (Smith, 1895 ). Extensive and detailed morphological investigations revealed a close relationship but not identity to trichomonads and, therefore, Tyzzer ( 1920 ) suggested a reclassification as H. meleagridis . Later on, Dwyer ( 1972 ) did a series of studies in which he investigated the antigenic relationship between H. meleagridis, Entamoeba histolytica, Entamoeba invadens, Dientamoeba fragilis and Trichomonas gallinae by fluorescent antibodies, gel diffusion and immunoelectrophoresis. As an outcome of this research, a somewhat close relationship between H. meleagridis and D. fragilis was noticed with much fewer antigens in common with the Entamoeba species. The close genetic relationship between D. fragilis and H. meleagridis was also confirmed by genetic data via sequencing of the small subunit rRNA sequence (Gerbod et al ., 2001 ). This was further elaborated by applying a multilocus sequence approach considering three genes with different levels of sequence identity and isolates from different geographic regions, altogether identifying two genotypes (Bilic et al ., 2014 ). Consequently, considering ultrastructural and molecular–phylogenetic studies, it was concluded that H. meleagridis was a member of the family Dientamoebidae, order Tritrichomonadida, class Tritrichomonadea (Cepicka et al ., 2010 ). Field reports with focus on chickens Histomonosis caused by H. meleagridis , was first described in turkeys where it can be a fastidious disease (Cushman, 1893 ). In addition to turkeys, various other galliformes can also be infected but the following sections will mainly focus on infections and the appearance of histomonosis in chicken, as the primary pathogenicity of H. meleagridis in these birds is not clear. Instead, chickens are often considered as reservoir to spread the parasite. Additional and more general aspects of the parasite and its biology can be found in recently published reviews (McDougald, 2005 ; Hess et al ., 2015 ). Furthermore, the reviews of Lund ( 1969 ) and Reid ( 1967 ) are highly recommended to obtain a detailed overview on the earlier literature and the debate about the aetiology of blackhead. The fact that hardly any research was carried out after those reviews were published until the twenty-first century makes them even more valuable. Soon after the first description in turkeys, histomonosis was described in chickens (Chester and Robin, 1900 ) and Bayon and Bishop ( 1937 ) reported the appearance in various laying chicken flocks in England without presenting further clinical data. Exceptionally high mortality of 50% was reported in broilers, reflecting very much the disease in turkeys (Eveleth, 1943 ). Following those initial reports, the disease in chickens disappeared due to an increase of biosecurity with the exception of a few case reports in pullets with mortalities up to 10% in cases of co-infection with Eimeria (Schulze, 1975 ; Müller, 1990 ; Homer and Butcher, 1991 ). The availability of effective drugs, mainly arsenicals, nitrofurans and imidazols, was helpful to prevent or minimise losses (Liebhart et al ., 2016 ). Furthermore, the introduction of cage systems for layers contributed to the disappearance of the disease. This changed with the recent introduction of new legislation in Europe banning the major anti-parasitic drugs and an increasing number of layers kept in alternative housing systems (Hafez, 2001 ; Kaufmann-Bart and Hoop, 2009 ; Stokholm et al ., 2010 ). Low biosecurity is also reported as a reason for the occurrence of histomonosis in broilers (Ganapathy et al ., 2000 ; Cortes et al ., 2004 ; Popp et al ., 2011 ). In addition to such single case reports, the development of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) systems for monitoring antibodies offered the chance to perform more comprehensive epidemiological studies. Whereas Grafl et al . ( 2011 ) were able to demonstrate a link between the level of biosecurity and the prevalence in Austrian layers such a connection was not confirmed by Van Der Heijden and Landman ( 2011 ) who found a high infection rate in Dutch layer chickens independent of the housing system. The DNA of the parasite was detected by polymerase chain reaction (PCR) in 42% of organ or environmental samples taken from turkey, chicken or peacock flocks in Germany with a higher prevalence during the summer (Hauck et al ., 2010 ). A much less pronounced seasonality was noticed in Vietnamese chicken samples with a slightly higher number of samples tested positive from dry areas in comparison with rainy ones (Nguyen et al ., 2015 ). However, the study highlighted the differences between applied diagnostics as the presence of macroscopic lesions did not always coincide with the detection of parasitic DNA and vice versa. In addition to caecal and liver lesions, an infection at the end of rearing can have an impact on egg production which reached standard targets only at 22 weeks of life (Gerth et al ., 1985 ). An influence on laying performance was also reported by Esquenet et al . ( 2003 ) who noticed a drop in egg production of 9% between weeks 57 and 59 and an increase in weekly mortality of 0.8% resulting in a total loss of 6% due to histomonosis. The authors reported that pathomorphological lesions were mainly observed in the caeca with microscopic necrosis in livers. This is similar to other studies in chickens (Homer and Butcher, 1991 ; Stokholm et al ., 2010 ) and helps to explain the somewhat lower mortality in comparison with turkeys. Co-infections with Escherichia coli have also been described (Müller, 1990 ; Stokholm et al ., 2010 ) which can complicate the clinical outcome and indicate that lesions in the caeca due to H. meleagridis might pave the way for E. coli . However, multilocus sequence typing and plasmid profile analysis of E. coli isolates indicated that colibacillosis appearing in combination with histomonosis should be regarded as a primary disease (Olsen et al ., 2011 ). Interestingly, histomonosis was recently also reported in broiler breeders during rearing (weeks 16 and 19) and production (weeks 25–44) (Dolka et al ., 2015 ). In rearing birds various clinical signs were noticed with an increase of mortality reaching 5% for 2 weeks following a total mortality in the flock of 1.05% until onset of the disease. The described cases indicate that the disease can also occur in more bio-secure breeding stock and it contradicts, together with the above-mentioned reports, the assumptions that chickens are solely a reservoir for the pathogen. Experimental studies focusing on the pathogen Of all three organisms described in this review, H. meleagridis is by far the most complicated one, with consequence on the clinical picture and the reproduction of lesions in experimental studies. This is mainly due to the complex life cycle of the parasite and a so far unresolved interaction of the parasite and bacteria. The frequent appearance of other protozoan parasites in the gut of chickens and turkeys is of relevance for the preparation of a defined inoculum as well as for the application of diagnostic procedures. Due to the fact that the disease is most severe in turkeys, the majority of experimental studies were performed in these birds in order (i) to investigate the pathogenesis, (ii) to determine the value of intervention strategies and (iii) to apply different diagnostic techniques. A detailed review on experimental studies with H. meleagridis was recently published by Hauck and Hafez ( 2013 ). The authors compiled data about the various routes of infection applied to reproduce the disease in turkeys and chickens, from contaminated litter to eggs or other stages of Heterakis gallinarum towards in vitro grown parasites. Applying eggs harbouring H. meleagridis goes back to the initial observation that the ceacal worm H. gallinarum is an important intermediate host for the protozoan parasite (Graybill and Smith, 1920 ). However, the fact that lesions induced by H. meleagridis established a less favourable environment for the caecal worm together with the observation that certain feed components can influence the interaction between both parasites in vivo indicates a complicated relationship (Lund, 1958 ; Daş et al ., 2011 ). If unprotected parasites are used, the rectal route is the most reliable one due to the low tenacity of the parasite, already noticed in the early studies of Tyzzer ( 1934 ). Oral infection of chickens with cultures of H. meleagridis is possible but most effective if birds have been starved for a certain time and an alkali is given to neutralise the negative consequences of a low pH in the alimentary tract (Horton-Smith and Long, 1956 ). The necessity of live bacteria to successfully infect chickens and turkeys is a further complication to studying the host–pathogen interaction. Doll and Franker ( 1963 ) described that only 1 out of 12 gnotobiotic turkeys was successfully infected with bacteria-free heterakis eggs harbouring H. meleagridis , whereas nearly all conventional turkeys died. The authors hypothesised that a heat-labile factor released from the bacteria is necessary for the growth of the parasite and to establish an infection in the host. Bradley and Reid ( 1966 ) noticed that E. coli on its own was helpful to support the infection of the turkeys, whereas killed bacteria or bacterial filtrate were insufficient. The situation in chickens seems even more complex as a more diverse range of bacteria is needed in order to reproduce the disease compared with turkeys (Springer et al ., 1970 ). Based on surgically ex vivo inoculated caeca, the authors demonstrated that the infection of chickens was less consistent than in turkeys and the authors even speculated that some non-cultivable bacteria might be needed to induce the disease. Their conclusion that bacteria are more essential to complete the development of H. gallinarum is a further indication for the complexity of the infection process. The fact that H. meleagridis could only be isolated from liver lesions in the presence of bacteria, as summarised by Goedbloed and Bool ( 1962 ), illustrates further this unresolved and complex interaction. Interactions between H. meleagridis and caecal bacteria are also very relevant for in vitro cultivation, a prerequisite to obtain a standardised inoculum for infection experiments. Bishop ( 1938 ) already regarded the cultivation of histomonads free of bacteria to induce the disease as a crucial test to unambiguously prove the aetiology, except a virus might be symbiotically present in the culture. Adding antibiotics to the culture medium, Delappe ( 1953 ) noticed the difficult balance between bacteria and parasite in vitro . Increasing the antibiotics might kill the bacteria with negative consequences on growth of the parasite, similar to overgrowth of bacteria, necessitating changes in serum and glucose levels (Devolt, 1950 ). An axenic culture was so far only once reported by Lesser ( 1961 ), achieved by replacing caecal bacteria with hamster liver and a mix of certain metals, altogether a rather complicated substrate. All other cultures used for in vivo studies consisted of H. meleagridis and a non-defined bacterial mixture, a so-called xenic culture. Frequent co-infection of birds with other protozoa can further complicate the establishment of a defined inoculum. In this context, Tetratrichomonas gallinarum, Parahistomonas wenrichi and Blastocystis spp . can be mentioned. Although they resemble certain morphological similarities, PCRs combined with sequencing can be used for precise discrimination from H. meleagridis and to elucidate the phylogenetic relationship (Bilic et al ., 2014 ). Summarising the reports above, it is very obvious that various factors – in addition to the primary pathogen – can contribute to the pathogenicity and the outcome of in vivo trials. This does not exclude that general observations and conclusions can be drawn from individual studies but it limits the comparison. Considering the difficulties of demonstrating an unambiguous host–pathogen interaction, it is not surprising that the true aetiology of blackhead remained under debate for a long time, due to the difficulties and inability of fulfilling Koch's Postulates, despite the fact that numerous experimental studies were available indicating the importance of H. meleagridis as an etiological agent of histomonosis. However, in 1967 – following half a century of intense research – Reid ( 1967 ) summarised all possible theories and highlighted the importance of improved laboratory methods to confirm the true aetiology of noticed lesions. In order to obtain a more defined and standardised inoculum for experimental trials, we applied micromanipulation with which defined cultures of different protozoan parasites were established. Multiplication by binary fission enabled us to grow up a whole stock from a single cell. Using such a xenic clonal culture, numerous infection studies were performed and various diagnostic procedures were developed (reviewed by Hess et al ., 2015 ). In addition, re-isolation of live parasites from cloacal swabs was implemented in all trials, enabling the investigation of the transmission dynamics. Consequently, it could be demonstrated that sentinel turkeys or chickens already excreted live parasites 2 d postinfection which questions cloacal drinking as the sole route of lateral transmission in the absence of any vector (Hess et al ., 2006 ). Sequential culling of animals revealed new data about the pathogenesis of histomonosis in turkeys and chickens. The development of a monoxenic clonal culture not only confirmed earlier studies about the importance of E. coli for the in vitro growth but also demonstrated that pathogenicity itself is solely triggered by the parasite as long as successful infection can be established (Ganas et al ., 2012 ). Beside this, the main aim of our studies was to test the consequences of in vitro passaging on the pathogenicity of H. meleagridis and the development of a possible live vaccine. It was not only possible to demonstrate that H. meleagrids could be attenuated in vitro , something questioned by Lund et al . ( 1966 ), the efficacy of these attenuated parasites to protect against a severe challenge in turkeys and chickens could also be shown (reviewed by Liebhart et al ., 2016 ). Finally, the availability of monoxenic clonal cultures with different levels of pathogenicity offers certain potential to enter into the "omics" era of histomonas research. Gallibacterium anatis Taxonomy The genus Gallibacterium is classified within the family Pasteurellaceae Pohl 1981. It contains 4 species namely G. anatis, Gallibacterium melopsittaci, Gallibacterium trehalosifermentans and Gallibacterium salpingitidis , three genomospecies 1, 2 and 3 and an unknown taxon (group V) (Christensen et al ., 2003 ; Bisgaard et al ., 2009 ). Prior to this assignment as a separate entity, G. anatis was formerly known as avian Pasteurella haemolytica, Actinobacillus salpingitidis or Pasteurella anatis . Consequently, changes in terminology need to be considered when performing literature searches. Field reports First field reports date back to 1950 when Kjos-Hanssen ( 1950 ) reported the isolation of a Pasteurella -like organism from the oviduct of hens with egg peritonitis, which was named "cloacal bacteria". Salpingitis, peritonitis, degeneration of the ovary and oviduct, haemorrhagic follicles and a drop in egg production with varying mortality were also mentioned in later reports from the field (Hacking and Pettit, 1974 ; Jones and Owen, 1981 ; Mirle et al ., 1991 ; Neubauer et al ., 2009 ; Jones et al ., 2013 ). In these reports, the bacterium was often isolated together with E. coli , although pure cultures were also noticed, especially from the reproductive tract, in combination with macroscopic lesions. Various field studies described the presence of G. anatis in the upper respiratory tract. In a survey performed in Israel, 97% of 322 healthy chickens from 23 flocks carried the organism in the tracheal flora, whereas a much lower prevalence was noticed in turkeys, geese, ducks and wild birds (Mushin et al ., 1980 ). Jones et al . ( 2013 ) considered G. anatis as a primary pathogen of the respiratory tract with similar lesions as P. multocida . Performing extensive bacteriological investigation of 10 organs from 3–8 birds/flock, positive birds were detected in 30 flocks with only one flock recorded negative (Neubauer et al ., 2009 ). Earlier on it was demonstrated that G. anatis was much more widespread in chicken flocks housed under lower biosecurity with broiler grandparents being negative and the vast majority of tracheal samples obtained from layers kept under organic conditions were found to be positive (Bojesen et al ., 2003 ). Beside lesions in the reproductive tract, necrotic and inflammatory changes in liver, intestine, heart and kidney were also noticed in connection with the isolation of G. anatis (Greenham and Hill, 1962 ; Harbourne, 1962 ; Harry, 1962 ; Hacking and Pettit, 1974 ; Addo and Mohan, 1985 ). In a recent case report, G. anatis was described in context with a hepatitis in layers, an unusual pathology attributed to the infestation of the free range birds with Ascaridia galli (Jung, 2012 ). However, based on the fact that G. anatis was isolated from diseased and healthy chickens, different authors questioned the primary pathogenicity of the bacterium and suggested that it should be regarded rather as a commensal. Experimental studies focusing on the infection route First experimental studies with G. anatis were performed in 1-d-old chicks up to 15-week-old pullets (Matthes et al ., 1969 ; Bisgaard, 1977 ; Gerlach, 1977 ; Mushin et al ., 1980 ). The main focus was to elucidate whether the infection induces clinical signs, most likely respiratory symptoms, due to the frequent isolation of bacteria in the upper respiratory tract in field surveys. However, no clinical symptoms were noticed following intranasal or intratracheal infections. It was also noticed that G. anatis was unable to exacerbate clinical symptoms of infectious bronchitis virus in a co-infection model, although single infected groups were not reported (Bisgaard, 1977 ). Invasive (subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal) and non-invasive (intranasal and intratracheal) infections were carried out in those earlier studies with very diverse outcomes. Most severe lesions were noticed in a study described by Matthes et al . ( 1969 ) who reported high mortality following intravenous or intraperitoneal infection with prominent macroscopic lesions. Similarly, Gerlach ( 1977 ) reported high mortality with haemorrhagic enteritis but attributed it to the young age of the birds as 1-d-old chicks were used. The studies had in common that no detailed laboratory investigations were performed. Following intratracheal infection, the bacteria did not obtain access to internal organs but no time point postinfection was mentioned and only three birds/group were used (Mushin et al ., 1980 ). In contrast, re-isolation was successful from heart and liver after intranasal infection (Matthes et al ., 1969 ). Overall, it was concluded in those earlier studies that G. anatis is part of the physiological tracheal flora in chickens and additional influences might be needed to induce any adverse effects. This was supported by frequent isolations from the upper respiratory tract in field studies, as mentioned above, but it neglected field reports that the bacteria were also isolated from reproductive tract lesions. Following the initial studies, almost no experimental infections were reported until Bojesen et al . ( 2004 ) performed a study with a detailed experimental design, including sequential killing of birds between 3 and 24 h postinfection, after intraperitoneal or intravenous infection. Intraperitoneal infection was applied by the same research group in other studies, in order to mimic a peritoneal infection due to ascending bacteria from the cloaca via the oviduct, a hypothesis well known from E. coli infections in layers (Bager et al ., 2013 ; Pedersen et al ., 2015 ; Pors et al ., 2016 ). Testing certain deletion mutants, and/or the efficacy of recombinant proteins to be used as vaccine candidates, fibrinous and purulent peritonitis were noticed, similar to previous studies and expected due to the route of infection. As sexually mature birds were used, oophoritis and salpingitis were also recorded with G. anatis isolated from the reproductive tract. However, in these studies commercial birds were used that were already carrying G. anatis prior to infection, which complicates further conclusions on primary aetiologies, although it might be close to a clinical situation considering the widespread distribution of the bacteria with an increasing age of the birds. First studies in 12-week-old specific pathogen-free (SPF) chickens were reported by Zepeda et al . ( 2010 ), who demonstrated efficient intranasal infection. Although a wide dissemination of the bacteria in pullets and microscopic lesions was noticed, no samples were taken from the reproductive tract. In continuing studies, the same route of infection was used and with this it was possible to confirm that bacteria are widely disseminated in the organism with lesions in the reproductive tract of 4-week-old SPF chickens (Paudel et al ., 2013 ). This research indicated that the intranasal route of infection was very suitable to mimic the clinical situation. Based on this study, two further separate experimental trials in mature SPF chickens, hens and cockerels, were performed (Paudel et al ., 2014 a , 2014 b ). Macroscopic and microscopic lesions in the reproductive tract were successfully induced and the infection resulted in a drop in egg production due to severe folliculitis in addition to egg peritonitis. Such conditions reflect very closely the field situation and question the view that infection of layers occurs via the oviduct. The intranasal infection of cockerels confirmed the predilection of G. anatis for the reproductive tract also for male birds, with consequences on semen quality. Histology and re-isolation of G. anatis completed the laboratory investigations and confirmed the pathogenic nature of the bacterium together with the potential of being vertically transmitted. Despite the fact that clinical signs and macroscopic lesions could be successfully reproduced in SPF birds, mimicking a natural infection, numerous questions remain. Genetically different strains exist with major differences about the absence or presence of certain virulence factors and the consequences on pathogenicity are so far only established for some strains (Persson and Bojesen, 2015 ). Following infection by the nasal route, the bacterium has to pass the mucosal barrier in order to reach the ovaries/testes as G. anatis is less prevalent in internal organs, a phenomenon currently not understood. Furthermore, additional host and pathogen-driven influences for the recognised pathologies need to be considered. At least two studies reported the consequences of immunosuppression leading to a higher load of bacteria in internal organs (Bojesen et al ., 2004 ; Paudel et al ., 2015 ). However, as those treatments were introduced prior to infection, the impact of immunosuppression on latent carriers remains to be resolved. Fowl aviadenoviruses (FAdVs) Taxonomy FAdVs are non-enveloped, double-strand DNA viruses which belong to the genus Aviadenovirus within the family Adenoviridae (Harrach et al ., 2011 ). They are separated into 5 different species (FAdV-A to FAdV-E) with 12 different serotypes (Hess, 2000 ). The grouping into 5 different species was originally suggested by Zsak and Kisary ( 1981 ) who digested the DNA of the 12 FAdV serotypes with restriction enzymes and obtained 5 different patterns, identical to the later species A–E. In the older literature, the family Adenoviridae was split into two genera only, Mast- and Aviadenovirus, reflecting the origin of those viruses, either from mammals or birds. The latter ones were further separated into three different groups (I–III) to address genomic and biological differences between FAdVs, the haemorrhagic enteritis virus of turkeys (HEV) and the egg drop syndrome virus (EDSV). Although substantial differences between members of the three groups (e.g. host specificities, pathogenesis and antigenicity) were already known for some time, the complete sequence of the EDSV genome demonstrated a closer phylogenetic relationship to viruses isolated from mammals in comparison with FAdV questioning the existing taxonomy (Hess et al ., 1997 ). In the actual taxonomy, characterised by genera containing viruses from different animal species, such similarities are considered and prioritised over the origin and host. Field reports Based on the existing field reports, FAdVs can induce three different diseases, adenoviral gizzard erosion (AGE), hydropericardium-hepatitis syndrome (HHS) and inclusion body hepatitis (IBH) (Hess, 2013 ). Comprehensive epidemiological studies in which genomic analyses were performed indicate that certain species/serotypes can be isolated from a specific disease (Schachner et al ., 2016 ). Whereas AGE is mainly reported in connection to FAdV-1 (species A), virulent strains of FAdV-4 (species C) induce HHS and various serotypes of FAdV-D and FAdV-E are etiological agents of IBH. Although such epidemiological studies indicate a link between aviadenoviruses and a certain disease, it needs to be mentioned that FAdVs are also present in clinically healthy birds with mixed infections of different serotypes again confirmed in recent reports (Kaján et al ., 2013 ; Niczyporuk, 2016 ). This underlines the importance of precise laboratory investigations in order to establish a robust link between detection of virus and disease. Various FAdVs can be isolated from a wide range of birds, ranging from poultry species to wild birds, indicating low host specificity. Like in chickens, FAdV infections in other bird species might occur without clinical signs but the appearance of virulent FAdV-4 in pigeons and ducks in coincidence with severe clinical signs and high mortality indicates the risk of such a spread (Naeem and Akram, 1995 ; Hess, 2013 ; Chen et al ., 2016 ). Clinical signs due to FAdV are mainly noticed in young birds up to 5 weeks of age. Since the first description by Yates and Fry ( 1957 ), vertical transmission of FAdV from breeders to progeny is of special importance for spreading FAdV and the induction of disease in progenies (Toro et al ., 2001 ; Grgic et al ., 2006 ; Grafl et al ., 2012 ). An impact on breeder performance with reduced egg production and hatchability was reported in cases of vertical transmission or due to infection with virulent FAdV-4 (Christensen and Saifuddin, 1989 ; Abe et al ., 1998 ; Kim et al ., 2008 ; Grafl et al ., 2012 ). Introduction of FAdVs into a flock can also occur via horizontal transmission, but very often the source of entrance could not be resolved due to the fact that no accurate samples were available. Serum samples are of special importance to determine the infectious status of breeders and to prove vertical transmission in a serum neutralisation test using the virus from the diseased progenies. Based on field data and experimental infections (see below), it was the general perception for a long time that a co-infection with an immunosuppressive virus (either infectious bursal disease virus (IBDV) or chicken anemia virus (CAV)) was needed for clinical manifestation of an FAdV-induced disease, mainly IBH and HHS. However, earlier reports about IBH in New Zealand had already indicated that IBH can be a primary disease which was confirmed in a series of more recent reports of IBH outbreaks in Canada, Australia and Japan (Christensen and Saifuddin, 1989 ; Gomis et al ., 2006 ; Nakamura et al ., 2011 ; Steer et al ., 2011 ). In addition, the prevalence of FAdV does not coincide with the presence of IBDV or CAV (Eregae et al ., 2014 ). However, as immunosuppression is an important trigger for IBH and HHS, special care should be taken to protect birds accordingly. First reports about IBH date back to 1963 when Helmboldt and Frazier ( 1963 ) described inclusion bodies in chicken livers with unknown significance. Later on, various studies aimed to isolate the relevant agent and FAdVs were isolated and typed by different research groups (reviewed by McFerran and Adair, 1977 ). A larger number of IBH outbreaks were reported from Canada (Pettit and Carlson, 1972 ) and Iraq (Al-Sheikhly and Mutalib, 1979 ) based on histological diagnosis until the disease was reported from New Zealand (Saifuddin et al ., 1992 ) and Australia (Erny et al ., 1991 ), predominantly caused by FAdV-8. Single case reports were published until about 10 years ago when the number of outbreaks in geographically different areas worldwide increased substantially (Gomis et al ., 2006 ; Ojkic et al ., 2008 a , 2008 b ; Lim et al ., 2011 ; Nakamura et al ., 2011 ; Steer et al ., 2011 ; Choi et al ., 2012 ; Kaján et al ., 2013 ; Maartens et al ., 2015 ; Zhao et al ., 2015 ; Niczyporuk, 2016 ; Schachner et al ., 2016 ). The clinical picture of IBH is characterised by sudden onset of mortality in 1–5-week-old birds. Mortality varies greatly between 1% and 30%, indicating that numerous factors might influence the disease. The majority of field cases were reported from broilers with severe hepatitis noticed during post- mortem investigations, sometimes accompanied with an atrophy of the bursa of Fabricius. Histological changes in the kidneys and inclusion bodies in the pancreas have also been noticed together with hypoglycaemia (Goodwin et al ., 1993 ; Wilson et al ., 2010 ). In 1987, HHS was first described in Pakistan and later on in other Asian and Arabian countries and some parts of Middle and Latin America (Anjum et al ., 1989 ; Hess et al ., 1999 ). Clinical signs and pathomorphological lesions of HHS are similar to IBH, except that they are more severe. In addition, hydropericardium is noticeable characterised by a straw-coloured fluid in the pericardial sac. Exceptionally, clinical signs with 6.4% mortality in 35-week-old broiler breeders were reported (Abe et al ., 1998 ). Several reviews are available describing the clinical signs together with pathomorphological and histological lesions (Ganesh and Raghavan, 2000 ; Balamurugan and Kataria, 2004 ; Asthana et al ., 2013 ). Mixed pathologies, especially for HHS and IBH, are frequently reported but the presence of a hydropericardium in combination with a somewhat higher mortality is a strong indication for HHS. Circulating virulent FAdV-4 viruses inducing mixed pathologies of HHS and/or IBH have been reported from various Asian countries (Lim et al ., 2011 ; Mittal et al ., 2014 ; Zhao et al ., 2015 ). AGE is a rather new disease mainly noticed in broilers, although Grimes et al . ( 1977 ) already reported AGE in the context of an FAdV infection during an IBH outbreak without further investigations. Later on, Tanimura et al . ( 1993 ) noticed gizzard erosions with haemorrhages in the proventriculus of 10-week-old pullets. Inclusion bodies were demonstrated in the gizzard together with degeneration and desquamation of the keratinoid layer and necrosis of the epithelium. Clinically, AGE can already be differentiated from HHS and IBH due to the somewhat lower mortality. A slightly elevated mortality with higher selection rate was reported but the disease might go unnoticed, despite the fact that 50% of the birds can have lesions at the slaughterhouse leading to a higher condemnation rate (Ono et al ., 2001 , 2003 ; Grafl et al ., 2012 ). The disease has so far been reported from Europe and Asia, with the majority of reports identifying FAdV-1 as etiological agent. As FAdV-1 is very widespread and as gizzard erosions can have various aetiologies (Gjevre et al ., 2013 ), specific diagnostic methods should be applied to characterise FAdVs and to demonstrate the virus in the pathomorphological lesions. In addition, demonstration of specific antibodies is helpful to confirm the aetiology. Experimental studies focusing on the type of bird Although the field studies described above indicate a link between certain FAdVs and disease, the fact that FAdVs are also isolated from clinically healthy birds is a severe complication to fulfil Koch's Postulates. The mechanism behind this is hardly understood and so far the genetic background of FAdVs in context of pathogenicity was only targeted in a single study highlighting the importance of the fibre protein for pathogenicity of FAdV-E viruses (Pallister et al ., 1996 ). In the previous section, it was already outlined that IBH and HHS are somewhat similar with regard to the appearance in the field. Consequently, they share certain principles with regard to experimental trials, also mentioned in the different reviews cited above. Soon after the first description of IBH in the field, Clemmer ( 1965 , 1972 ) reported an age resistance based upon virus excretion, following oral infection of chickens, at either 1-d-old or 45 d of age, with FAdV-1. The virus was mainly confined to the gastrointestinal tract and no lesions were noticed. Interestingly, he also noticed that birds infected at 12 d of age were refractory to a second infection 33 d later. Age resistance was confirmed later on by several authors who used different routes of infection, mainly intramuscular and subcutaneous at two different time points in birds up to 21 d of age, in order to reproduce IBH (Cook, 1974 b ; Nakamura et al ., 2000 ; Lim et al ., 2011 ; Dar et al ., 2012 ). A very virulent FAdV-4 isolated from a broiler breeder hen suffering from HHS induced 70% mortality in 15-month-old SPF hens, the oldest birds ever used in experimental studies, with 100% mortality in 1-d-old birds independent of the infection route (Nakamura et al ., 1999 ). A different dose of the same virus was used in various studies to reproduce IBH (Erny et al ., 1991 ; Mendelson et al ., 1995 ; Nakamura et al ., 1999 ; Dar et al ., 2012 ). Differences became more significant as birds were getting older (> 1 week of age) indicating a negative correlation between age and a lower viral dose. However, virulent FAdV-E viruses given intranasally to 1-d-old birds at a low dose of 5 TCID 50 were able to induce IBH (Erny et al ., 1991 ). As an outcome of available studies, it can be concluded that after 1 week of age an invasive route, most often intramuscular, is needed to induce clinical signs characterised by apathy, huddling of birds and mortality. This was also demonstrated in the first study reproducing HHS in SPF chicks with plaque-purified FAdV (Mazaheri et al ., 1998 ). Initial experiments to reproduce HHS were done in commercial broilers with a less well-characterised overall infectious status (Anjum, 1990 ; Chandra et al ., 1997 ). The application of organ homogenates reflects the uncertainties at that time about the true aetiology of HHS, although an adenovirus was already demonstrated by electron microscopy. Different to FAdV-1 mentioned above, other FAdV strains were more widespread in the organism following oral and intranasal infection of 1-d-old birds (Cook, 1983 ). Viruses could be recovered from the respiratory system, gonads, liver, spleen, bursa of Fabricius and some FAdVs were even recovered from the brain, although replication in the later tissue was questioned. Highest viral loads were noticed in different parts of the digestive tract, either proventriculus, caecum or ileum, which, together with the ceacal tonsils are the organs of virus persistence, something also noticed by measuring viral antigen by ELISA in numerous organs (Saifuddin and Wilks, 1991 ). Based upon detailed assessment of macroscopic and histological lesions, virulent IBH viruses induce most severe changes between 4 and 7 d postinfection (Steer et al ., 2015 ). Co-infection experiments with either IBDV or CAV indicated that reproduction of IBH depends on a compromised immune system (Fadly et al ., 1976 ; Von Bülow et al ., 1986 ). The importance of a fully functional immune system was also confirmed in an experimental study demonstrating significant differences between chemically immunosuppressed chickens versus untreated birds (Nakamura et al ., 2003 ). However, infection of SPF birds with virulent FAdV-4 demonstrated a severe impact of FAdV itself on lymphocyte subpopulations in the thymus and bursa of Fabricius, although the true nature and mechanism still need to be elucidated (Schonewille et al ., 2008 ). Furthermore, progenies investigated from intramuscularly infected serologically negative layer breeders developed microscopic lesions in the liver irrespective of a CAV co-infection confirming the primary pathogenicity of FAdV after vertical transmission (Toro et al ., 2001 ). In an earlier experimental study, Grimes et al . (1978) noticed a necrotising pancreatitis, something also reported from the field. In a recent study, detailed histological investigations of liver and pancreas together with an assessment of clinical chemistry analytes were combined, altogether correlating very well, which indicates that the pancreas is an important target organ in IBH pathogenesis (Matos et al ., 2016 b ). As a consequence of this finding, we hypothesised that the type of bird is of importance for the outcome of an experimental infection. This was confirmed in another study in which much more severe clinical signs in SPF broilers in comparison with SPF layers, characterised by hypoglycaemia and severe pathological lesions in the pancreas, were noticed (Matos et al ., 2016 a ). Such results might help to explain why IBH outbreaks in fast-growing broilers, who are physiologically very different from layers, are more frequently reported, as mentioned above. And it indicates that experiments performed decades ago, although different kinds of SPF birds were used (Cook, 1974 a ), are difficult to compare with current studies, considering the substantial recent progress in breeding and the accompanying change in bird metabolism. The majority of experimental studies to reproduce AGE were performed in SPF White Leghorn layers (Okuda et al ., 2001 b , 2004 ; Nakamura et al ., 2002 ; Ono et al ., 2004 , 2007 ; Domanska-Blicharz et al ., 2011 ). Whereas mortality was only noticed in one study (Domanska-Blicharz et al ., 2011 ) all the others did not report severe clinical signs. However, in all of those studies it was possible to induce lesions in the gizzard similar to those described from field outbreaks. Lesions were characterised by erosion of the koilin layer accompanied with an inflammation or ulceration of the gizzard mucosa, which peaked around 10 d postinfection. In all studies, such lesions were successfully reproduced by oral infection with field isolates characterised as FAdV-1, except in one study where a FAdV-8 strain was applied and lesions in the gizzard were less severe (Okuda et al ., 2004 ). If intramuscular or intravenous application were used, more severe lesions were noticed including the induction of IBH with the FAdV-8 isolate. Soon after the initial reproduction of AGE in SPF layers, Okuda et al . ( 2001 a ) reproduced the disease in commercial broilers due to the assumption that layer-type chickens might be an inappropriate model. Despite the fact that the commercial birds had maternal antibodies, which were no longer present at 5 weeks of age, it was possible to induce severe lesions and, different to SPF layers, a drop in body weight gain. Such findings were confirmed by our own investigations in SPF broilers, which showed a more pronounced effect on body weight than commercial birds with maternal antibodies (Grafl et al ., 2013 ). Applying real-time PCR, it could also be demonstrated that the viral load in the gizzard was higher than in the liver, emphasising a certain aberrant tissue tropism of FAdV-1. The finding that lesions can also be induced in older birds up to 53 d of age, completes the range of experimental data. Altogether, the animal experiments in combination with the applied laboratory methods, especially the confirmation of FAdV-1 virus in histological lesions from where it could be isolated, confirmed the aetiology of AGE and the fulfilment of Koch's Postulates. Furthermore, the results indicate that the pathogenesis of AGE is somewhat different to IBH and HHS with consequences on protection. The absence of lesions following oral reinfection (Ono et al ., 2004 ; Grafl et al ., 2014 ) highlights the importance of a local immune response and closes the circle with the initial observation reported by Clemmer 50 years ago (Clemmer, 1965 ). Histomonas meleagridis Taxonomy H. meleagridis was originally regarded as an amoeba and named Amoeba meleagridis (Smith, 1895 ). Extensive and detailed morphological investigations revealed a close relationship but not identity to trichomonads and, therefore, Tyzzer ( 1920 ) suggested a reclassification as H. meleagridis . Later on, Dwyer ( 1972 ) did a series of studies in which he investigated the antigenic relationship between H. meleagridis, Entamoeba histolytica, Entamoeba invadens, Dientamoeba fragilis and Trichomonas gallinae by fluorescent antibodies, gel diffusion and immunoelectrophoresis. As an outcome of this research, a somewhat close relationship between H. meleagridis and D. fragilis was noticed with much fewer antigens in common with the Entamoeba species. The close genetic relationship between D. fragilis and H. meleagridis was also confirmed by genetic data via sequencing of the small subunit rRNA sequence (Gerbod et al ., 2001 ). This was further elaborated by applying a multilocus sequence approach considering three genes with different levels of sequence identity and isolates from different geographic regions, altogether identifying two genotypes (Bilic et al ., 2014 ). Consequently, considering ultrastructural and molecular–phylogenetic studies, it was concluded that H. meleagridis was a member of the family Dientamoebidae, order Tritrichomonadida, class Tritrichomonadea (Cepicka et al ., 2010 ). Field reports with focus on chickens Histomonosis caused by H. meleagridis , was first described in turkeys where it can be a fastidious disease (Cushman, 1893 ). In addition to turkeys, various other galliformes can also be infected but the following sections will mainly focus on infections and the appearance of histomonosis in chicken, as the primary pathogenicity of H. meleagridis in these birds is not clear. Instead, chickens are often considered as reservoir to spread the parasite. Additional and more general aspects of the parasite and its biology can be found in recently published reviews (McDougald, 2005 ; Hess et al ., 2015 ). Furthermore, the reviews of Lund ( 1969 ) and Reid ( 1967 ) are highly recommended to obtain a detailed overview on the earlier literature and the debate about the aetiology of blackhead. The fact that hardly any research was carried out after those reviews were published until the twenty-first century makes them even more valuable. Soon after the first description in turkeys, histomonosis was described in chickens (Chester and Robin, 1900 ) and Bayon and Bishop ( 1937 ) reported the appearance in various laying chicken flocks in England without presenting further clinical data. Exceptionally high mortality of 50% was reported in broilers, reflecting very much the disease in turkeys (Eveleth, 1943 ). Following those initial reports, the disease in chickens disappeared due to an increase of biosecurity with the exception of a few case reports in pullets with mortalities up to 10% in cases of co-infection with Eimeria (Schulze, 1975 ; Müller, 1990 ; Homer and Butcher, 1991 ). The availability of effective drugs, mainly arsenicals, nitrofurans and imidazols, was helpful to prevent or minimise losses (Liebhart et al ., 2016 ). Furthermore, the introduction of cage systems for layers contributed to the disappearance of the disease. This changed with the recent introduction of new legislation in Europe banning the major anti-parasitic drugs and an increasing number of layers kept in alternative housing systems (Hafez, 2001 ; Kaufmann-Bart and Hoop, 2009 ; Stokholm et al ., 2010 ). Low biosecurity is also reported as a reason for the occurrence of histomonosis in broilers (Ganapathy et al ., 2000 ; Cortes et al ., 2004 ; Popp et al ., 2011 ). In addition to such single case reports, the development of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) systems for monitoring antibodies offered the chance to perform more comprehensive epidemiological studies. Whereas Grafl et al . ( 2011 ) were able to demonstrate a link between the level of biosecurity and the prevalence in Austrian layers such a connection was not confirmed by Van Der Heijden and Landman ( 2011 ) who found a high infection rate in Dutch layer chickens independent of the housing system. The DNA of the parasite was detected by polymerase chain reaction (PCR) in 42% of organ or environmental samples taken from turkey, chicken or peacock flocks in Germany with a higher prevalence during the summer (Hauck et al ., 2010 ). A much less pronounced seasonality was noticed in Vietnamese chicken samples with a slightly higher number of samples tested positive from dry areas in comparison with rainy ones (Nguyen et al ., 2015 ). However, the study highlighted the differences between applied diagnostics as the presence of macroscopic lesions did not always coincide with the detection of parasitic DNA and vice versa. In addition to caecal and liver lesions, an infection at the end of rearing can have an impact on egg production which reached standard targets only at 22 weeks of life (Gerth et al ., 1985 ). An influence on laying performance was also reported by Esquenet et al . ( 2003 ) who noticed a drop in egg production of 9% between weeks 57 and 59 and an increase in weekly mortality of 0.8% resulting in a total loss of 6% due to histomonosis. The authors reported that pathomorphological lesions were mainly observed in the caeca with microscopic necrosis in livers. This is similar to other studies in chickens (Homer and Butcher, 1991 ; Stokholm et al ., 2010 ) and helps to explain the somewhat lower mortality in comparison with turkeys. Co-infections with Escherichia coli have also been described (Müller, 1990 ; Stokholm et al ., 2010 ) which can complicate the clinical outcome and indicate that lesions in the caeca due to H. meleagridis might pave the way for E. coli . However, multilocus sequence typing and plasmid profile analysis of E. coli isolates indicated that colibacillosis appearing in combination with histomonosis should be regarded as a primary disease (Olsen et al ., 2011 ). Interestingly, histomonosis was recently also reported in broiler breeders during rearing (weeks 16 and 19) and production (weeks 25–44) (Dolka et al ., 2015 ). In rearing birds various clinical signs were noticed with an increase of mortality reaching 5% for 2 weeks following a total mortality in the flock of 1.05% until onset of the disease. The described cases indicate that the disease can also occur in more bio-secure breeding stock and it contradicts, together with the above-mentioned reports, the assumptions that chickens are solely a reservoir for the pathogen. Experimental studies focusing on the pathogen Of all three organisms described in this review, H. meleagridis is by far the most complicated one, with consequence on the clinical picture and the reproduction of lesions in experimental studies. This is mainly due to the complex life cycle of the parasite and a so far unresolved interaction of the parasite and bacteria. The frequent appearance of other protozoan parasites in the gut of chickens and turkeys is of relevance for the preparation of a defined inoculum as well as for the application of diagnostic procedures. Due to the fact that the disease is most severe in turkeys, the majority of experimental studies were performed in these birds in order (i) to investigate the pathogenesis, (ii) to determine the value of intervention strategies and (iii) to apply different diagnostic techniques. A detailed review on experimental studies with H. meleagridis was recently published by Hauck and Hafez ( 2013 ). The authors compiled data about the various routes of infection applied to reproduce the disease in turkeys and chickens, from contaminated litter to eggs or other stages of Heterakis gallinarum towards in vitro grown parasites. Applying eggs harbouring H. meleagridis goes back to the initial observation that the ceacal worm H. gallinarum is an important intermediate host for the protozoan parasite (Graybill and Smith, 1920 ). However, the fact that lesions induced by H. meleagridis established a less favourable environment for the caecal worm together with the observation that certain feed components can influence the interaction between both parasites in vivo indicates a complicated relationship (Lund, 1958 ; Daş et al ., 2011 ). If unprotected parasites are used, the rectal route is the most reliable one due to the low tenacity of the parasite, already noticed in the early studies of Tyzzer ( 1934 ). Oral infection of chickens with cultures of H. meleagridis is possible but most effective if birds have been starved for a certain time and an alkali is given to neutralise the negative consequences of a low pH in the alimentary tract (Horton-Smith and Long, 1956 ). The necessity of live bacteria to successfully infect chickens and turkeys is a further complication to studying the host–pathogen interaction. Doll and Franker ( 1963 ) described that only 1 out of 12 gnotobiotic turkeys was successfully infected with bacteria-free heterakis eggs harbouring H. meleagridis , whereas nearly all conventional turkeys died. The authors hypothesised that a heat-labile factor released from the bacteria is necessary for the growth of the parasite and to establish an infection in the host. Bradley and Reid ( 1966 ) noticed that E. coli on its own was helpful to support the infection of the turkeys, whereas killed bacteria or bacterial filtrate were insufficient. The situation in chickens seems even more complex as a more diverse range of bacteria is needed in order to reproduce the disease compared with turkeys (Springer et al ., 1970 ). Based on surgically ex vivo inoculated caeca, the authors demonstrated that the infection of chickens was less consistent than in turkeys and the authors even speculated that some non-cultivable bacteria might be needed to induce the disease. Their conclusion that bacteria are more essential to complete the development of H. gallinarum is a further indication for the complexity of the infection process. The fact that H. meleagridis could only be isolated from liver lesions in the presence of bacteria, as summarised by Goedbloed and Bool ( 1962 ), illustrates further this unresolved and complex interaction. Interactions between H. meleagridis and caecal bacteria are also very relevant for in vitro cultivation, a prerequisite to obtain a standardised inoculum for infection experiments. Bishop ( 1938 ) already regarded the cultivation of histomonads free of bacteria to induce the disease as a crucial test to unambiguously prove the aetiology, except a virus might be symbiotically present in the culture. Adding antibiotics to the culture medium, Delappe ( 1953 ) noticed the difficult balance between bacteria and parasite in vitro . Increasing the antibiotics might kill the bacteria with negative consequences on growth of the parasite, similar to overgrowth of bacteria, necessitating changes in serum and glucose levels (Devolt, 1950 ). An axenic culture was so far only once reported by Lesser ( 1961 ), achieved by replacing caecal bacteria with hamster liver and a mix of certain metals, altogether a rather complicated substrate. All other cultures used for in vivo studies consisted of H. meleagridis and a non-defined bacterial mixture, a so-called xenic culture. Frequent co-infection of birds with other protozoa can further complicate the establishment of a defined inoculum. In this context, Tetratrichomonas gallinarum, Parahistomonas wenrichi and Blastocystis spp . can be mentioned. Although they resemble certain morphological similarities, PCRs combined with sequencing can be used for precise discrimination from H. meleagridis and to elucidate the phylogenetic relationship (Bilic et al ., 2014 ). Summarising the reports above, it is very obvious that various factors – in addition to the primary pathogen – can contribute to the pathogenicity and the outcome of in vivo trials. This does not exclude that general observations and conclusions can be drawn from individual studies but it limits the comparison. Considering the difficulties of demonstrating an unambiguous host–pathogen interaction, it is not surprising that the true aetiology of blackhead remained under debate for a long time, due to the difficulties and inability of fulfilling Koch's Postulates, despite the fact that numerous experimental studies were available indicating the importance of H. meleagridis as an etiological agent of histomonosis. However, in 1967 – following half a century of intense research – Reid ( 1967 ) summarised all possible theories and highlighted the importance of improved laboratory methods to confirm the true aetiology of noticed lesions. In order to obtain a more defined and standardised inoculum for experimental trials, we applied micromanipulation with which defined cultures of different protozoan parasites were established. Multiplication by binary fission enabled us to grow up a whole stock from a single cell. Using such a xenic clonal culture, numerous infection studies were performed and various diagnostic procedures were developed (reviewed by Hess et al ., 2015 ). In addition, re-isolation of live parasites from cloacal swabs was implemented in all trials, enabling the investigation of the transmission dynamics. Consequently, it could be demonstrated that sentinel turkeys or chickens already excreted live parasites 2 d postinfection which questions cloacal drinking as the sole route of lateral transmission in the absence of any vector (Hess et al ., 2006 ). Sequential culling of animals revealed new data about the pathogenesis of histomonosis in turkeys and chickens. The development of a monoxenic clonal culture not only confirmed earlier studies about the importance of E. coli for the in vitro growth but also demonstrated that pathogenicity itself is solely triggered by the parasite as long as successful infection can be established (Ganas et al ., 2012 ). Beside this, the main aim of our studies was to test the consequences of in vitro passaging on the pathogenicity of H. meleagridis and the development of a possible live vaccine. It was not only possible to demonstrate that H. meleagrids could be attenuated in vitro , something questioned by Lund et al . ( 1966 ), the efficacy of these attenuated parasites to protect against a severe challenge in turkeys and chickens could also be shown (reviewed by Liebhart et al ., 2016 ). Finally, the availability of monoxenic clonal cultures with different levels of pathogenicity offers certain potential to enter into the "omics" era of histomonas research. Taxonomy H. meleagridis was originally regarded as an amoeba and named Amoeba meleagridis (Smith, 1895 ). Extensive and detailed morphological investigations revealed a close relationship but not identity to trichomonads and, therefore, Tyzzer ( 1920 ) suggested a reclassification as H. meleagridis . Later on, Dwyer ( 1972 ) did a series of studies in which he investigated the antigenic relationship between H. meleagridis, Entamoeba histolytica, Entamoeba invadens, Dientamoeba fragilis and Trichomonas gallinae by fluorescent antibodies, gel diffusion and immunoelectrophoresis. As an outcome of this research, a somewhat close relationship between H. meleagridis and D. fragilis was noticed with much fewer antigens in common with the Entamoeba species. The close genetic relationship between D. fragilis and H. meleagridis was also confirmed by genetic data via sequencing of the small subunit rRNA sequence (Gerbod et al ., 2001 ). This was further elaborated by applying a multilocus sequence approach considering three genes with different levels of sequence identity and isolates from different geographic regions, altogether identifying two genotypes (Bilic et al ., 2014 ). Consequently, considering ultrastructural and molecular–phylogenetic studies, it was concluded that H. meleagridis was a member of the family Dientamoebidae, order Tritrichomonadida, class Tritrichomonadea (Cepicka et al ., 2010 ). Field reports with focus on chickens Histomonosis caused by H. meleagridis , was first described in turkeys where it can be a fastidious disease (Cushman, 1893 ). In addition to turkeys, various other galliformes can also be infected but the following sections will mainly focus on infections and the appearance of histomonosis in chicken, as the primary pathogenicity of H. meleagridis in these birds is not clear. Instead, chickens are often considered as reservoir to spread the parasite. Additional and more general aspects of the parasite and its biology can be found in recently published reviews (McDougald, 2005 ; Hess et al ., 2015 ). Furthermore, the reviews of Lund ( 1969 ) and Reid ( 1967 ) are highly recommended to obtain a detailed overview on the earlier literature and the debate about the aetiology of blackhead. The fact that hardly any research was carried out after those reviews were published until the twenty-first century makes them even more valuable. Soon after the first description in turkeys, histomonosis was described in chickens (Chester and Robin, 1900 ) and Bayon and Bishop ( 1937 ) reported the appearance in various laying chicken flocks in England without presenting further clinical data. Exceptionally high mortality of 50% was reported in broilers, reflecting very much the disease in turkeys (Eveleth, 1943 ). Following those initial reports, the disease in chickens disappeared due to an increase of biosecurity with the exception of a few case reports in pullets with mortalities up to 10% in cases of co-infection with Eimeria (Schulze, 1975 ; Müller, 1990 ; Homer and Butcher, 1991 ). The availability of effective drugs, mainly arsenicals, nitrofurans and imidazols, was helpful to prevent or minimise losses (Liebhart et al ., 2016 ). Furthermore, the introduction of cage systems for layers contributed to the disappearance of the disease. This changed with the recent introduction of new legislation in Europe banning the major anti-parasitic drugs and an increasing number of layers kept in alternative housing systems (Hafez, 2001 ; Kaufmann-Bart and Hoop, 2009 ; Stokholm et al ., 2010 ). Low biosecurity is also reported as a reason for the occurrence of histomonosis in broilers (Ganapathy et al ., 2000 ; Cortes et al ., 2004 ; Popp et al ., 2011 ). In addition to such single case reports, the development of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) systems for monitoring antibodies offered the chance to perform more comprehensive epidemiological studies. Whereas Grafl et al . ( 2011 ) were able to demonstrate a link between the level of biosecurity and the prevalence in Austrian layers such a connection was not confirmed by Van Der Heijden and Landman ( 2011 ) who found a high infection rate in Dutch layer chickens independent of the housing system. The DNA of the parasite was detected by polymerase chain reaction (PCR) in 42% of organ or environmental samples taken from turkey, chicken or peacock flocks in Germany with a higher prevalence during the summer (Hauck et al ., 2010 ). A much less pronounced seasonality was noticed in Vietnamese chicken samples with a slightly higher number of samples tested positive from dry areas in comparison with rainy ones (Nguyen et al ., 2015 ). However, the study highlighted the differences between applied diagnostics as the presence of macroscopic lesions did not always coincide with the detection of parasitic DNA and vice versa. In addition to caecal and liver lesions, an infection at the end of rearing can have an impact on egg production which reached standard targets only at 22 weeks of life (Gerth et al ., 1985 ). An influence on laying performance was also reported by Esquenet et al . ( 2003 ) who noticed a drop in egg production of 9% between weeks 57 and 59 and an increase in weekly mortality of 0.8% resulting in a total loss of 6% due to histomonosis. The authors reported that pathomorphological lesions were mainly observed in the caeca with microscopic necrosis in livers. This is similar to other studies in chickens (Homer and Butcher, 1991 ; Stokholm et al ., 2010 ) and helps to explain the somewhat lower mortality in comparison with turkeys. Co-infections with Escherichia coli have also been described (Müller, 1990 ; Stokholm et al ., 2010 ) which can complicate the clinical outcome and indicate that lesions in the caeca due to H. meleagridis might pave the way for E. coli . However, multilocus sequence typing and plasmid profile analysis of E. coli isolates indicated that colibacillosis appearing in combination with histomonosis should be regarded as a primary disease (Olsen et al ., 2011 ). Interestingly, histomonosis was recently also reported in broiler breeders during rearing (weeks 16 and 19) and production (weeks 25–44) (Dolka et al ., 2015 ). In rearing birds various clinical signs were noticed with an increase of mortality reaching 5% for 2 weeks following a total mortality in the flock of 1.05% until onset of the disease. The described cases indicate that the disease can also occur in more bio-secure breeding stock and it contradicts, together with the above-mentioned reports, the assumptions that chickens are solely a reservoir for the pathogen. Experimental studies focusing on the pathogen Of all three organisms described in this review, H. meleagridis is by far the most complicated one, with consequence on the clinical picture and the reproduction of lesions in experimental studies. This is mainly due to the complex life cycle of the parasite and a so far unresolved interaction of the parasite and bacteria. The frequent appearance of other protozoan parasites in the gut of chickens and turkeys is of relevance for the preparation of a defined inoculum as well as for the application of diagnostic procedures. Due to the fact that the disease is most severe in turkeys, the majority of experimental studies were performed in these birds in order (i) to investigate the pathogenesis, (ii) to determine the value of intervention strategies and (iii) to apply different diagnostic techniques. A detailed review on experimental studies with H. meleagridis was recently published by Hauck and Hafez ( 2013 ). The authors compiled data about the various routes of infection applied to reproduce the disease in turkeys and chickens, from contaminated litter to eggs or other stages of Heterakis gallinarum towards in vitro grown parasites. Applying eggs harbouring H. meleagridis goes back to the initial observation that the ceacal worm H. gallinarum is an important intermediate host for the protozoan parasite (Graybill and Smith, 1920 ). However, the fact that lesions induced by H. meleagridis established a less favourable environment for the caecal worm together with the observation that certain feed components can influence the interaction between both parasites in vivo indicates a complicated relationship (Lund, 1958 ; Daş et al ., 2011 ). If unprotected parasites are used, the rectal route is the most reliable one due to the low tenacity of the parasite, already noticed in the early studies of Tyzzer ( 1934 ). Oral infection of chickens with cultures of H. meleagridis is possible but most effective if birds have been starved for a certain time and an alkali is given to neutralise the negative consequences of a low pH in the alimentary tract (Horton-Smith and Long, 1956 ). The necessity of live bacteria to successfully infect chickens and turkeys is a further complication to studying the host–pathogen interaction. Doll and Franker ( 1963 ) described that only 1 out of 12 gnotobiotic turkeys was successfully infected with bacteria-free heterakis eggs harbouring H. meleagridis , whereas nearly all conventional turkeys died. The authors hypothesised that a heat-labile factor released from the bacteria is necessary for the growth of the parasite and to establish an infection in the host. Bradley and Reid ( 1966 ) noticed that E. coli on its own was helpful to support the infection of the turkeys, whereas killed bacteria or bacterial filtrate were insufficient. The situation in chickens seems even more complex as a more diverse range of bacteria is needed in order to reproduce the disease compared with turkeys (Springer et al ., 1970 ). Based on surgically ex vivo inoculated caeca, the authors demonstrated that the infection of chickens was less consistent than in turkeys and the authors even speculated that some non-cultivable bacteria might be needed to induce the disease. Their conclusion that bacteria are more essential to complete the development of H. gallinarum is a further indication for the complexity of the infection process. The fact that H. meleagridis could only be isolated from liver lesions in the presence of bacteria, as summarised by Goedbloed and Bool ( 1962 ), illustrates further this unresolved and complex interaction. Interactions between H. meleagridis and caecal bacteria are also very relevant for in vitro cultivation, a prerequisite to obtain a standardised inoculum for infection experiments. Bishop ( 1938 ) already regarded the cultivation of histomonads free of bacteria to induce the disease as a crucial test to unambiguously prove the aetiology, except a virus might be symbiotically present in the culture. Adding antibiotics to the culture medium, Delappe ( 1953 ) noticed the difficult balance between bacteria and parasite in vitro . Increasing the antibiotics might kill the bacteria with negative consequences on growth of the parasite, similar to overgrowth of bacteria, necessitating changes in serum and glucose levels (Devolt, 1950 ). An axenic culture was so far only once reported by Lesser ( 1961 ), achieved by replacing caecal bacteria with hamster liver and a mix of certain metals, altogether a rather complicated substrate. All other cultures used for in vivo studies consisted of H. meleagridis and a non-defined bacterial mixture, a so-called xenic culture. Frequent co-infection of birds with other protozoa can further complicate the establishment of a defined inoculum. In this context, Tetratrichomonas gallinarum, Parahistomonas wenrichi and Blastocystis spp . can be mentioned. Although they resemble certain morphological similarities, PCRs combined with sequencing can be used for precise discrimination from H. meleagridis and to elucidate the phylogenetic relationship (Bilic et al ., 2014 ). Summarising the reports above, it is very obvious that various factors – in addition to the primary pathogen – can contribute to the pathogenicity and the outcome of in vivo trials. This does not exclude that general observations and conclusions can be drawn from individual studies but it limits the comparison. Considering the difficulties of demonstrating an unambiguous host–pathogen interaction, it is not surprising that the true aetiology of blackhead remained under debate for a long time, due to the difficulties and inability of fulfilling Koch's Postulates, despite the fact that numerous experimental studies were available indicating the importance of H. meleagridis as an etiological agent of histomonosis. However, in 1967 – following half a century of intense research – Reid ( 1967 ) summarised all possible theories and highlighted the importance of improved laboratory methods to confirm the true aetiology of noticed lesions. In order to obtain a more defined and standardised inoculum for experimental trials, we applied micromanipulation with which defined cultures of different protozoan parasites were established. Multiplication by binary fission enabled us to grow up a whole stock from a single cell. Using such a xenic clonal culture, numerous infection studies were performed and various diagnostic procedures were developed (reviewed by Hess et al ., 2015 ). In addition, re-isolation of live parasites from cloacal swabs was implemented in all trials, enabling the investigation of the transmission dynamics. Consequently, it could be demonstrated that sentinel turkeys or chickens already excreted live parasites 2 d postinfection which questions cloacal drinking as the sole route of lateral transmission in the absence of any vector (Hess et al ., 2006 ). Sequential culling of animals revealed new data about the pathogenesis of histomonosis in turkeys and chickens. The development of a monoxenic clonal culture not only confirmed earlier studies about the importance of E. coli for the in vitro growth but also demonstrated that pathogenicity itself is solely triggered by the parasite as long as successful infection can be established (Ganas et al ., 2012 ). Beside this, the main aim of our studies was to test the consequences of in vitro passaging on the pathogenicity of H. meleagridis and the development of a possible live vaccine. It was not only possible to demonstrate that H. meleagrids could be attenuated in vitro , something questioned by Lund et al . ( 1966 ), the efficacy of these attenuated parasites to protect against a severe challenge in turkeys and chickens could also be shown (reviewed by Liebhart et al ., 2016 ). Finally, the availability of monoxenic clonal cultures with different levels of pathogenicity offers certain potential to enter into the "omics" era of histomonas research. Gallibacterium anatis Taxonomy The genus Gallibacterium is classified within the family Pasteurellaceae Pohl 1981. It contains 4 species namely G. anatis, Gallibacterium melopsittaci, Gallibacterium trehalosifermentans and Gallibacterium salpingitidis , three genomospecies 1, 2 and 3 and an unknown taxon (group V) (Christensen et al ., 2003 ; Bisgaard et al ., 2009 ). Prior to this assignment as a separate entity, G. anatis was formerly known as avian Pasteurella haemolytica, Actinobacillus salpingitidis or Pasteurella anatis . Consequently, changes in terminology need to be considered when performing literature searches. Field reports First field reports date back to 1950 when Kjos-Hanssen ( 1950 ) reported the isolation of a Pasteurella -like organism from the oviduct of hens with egg peritonitis, which was named "cloacal bacteria". Salpingitis, peritonitis, degeneration of the ovary and oviduct, haemorrhagic follicles and a drop in egg production with varying mortality were also mentioned in later reports from the field (Hacking and Pettit, 1974 ; Jones and Owen, 1981 ; Mirle et al ., 1991 ; Neubauer et al ., 2009 ; Jones et al ., 2013 ). In these reports, the bacterium was often isolated together with E. coli , although pure cultures were also noticed, especially from the reproductive tract, in combination with macroscopic lesions. Various field studies described the presence of G. anatis in the upper respiratory tract. In a survey performed in Israel, 97% of 322 healthy chickens from 23 flocks carried the organism in the tracheal flora, whereas a much lower prevalence was noticed in turkeys, geese, ducks and wild birds (Mushin et al ., 1980 ). Jones et al . ( 2013 ) considered G. anatis as a primary pathogen of the respiratory tract with similar lesions as P. multocida . Performing extensive bacteriological investigation of 10 organs from 3–8 birds/flock, positive birds were detected in 30 flocks with only one flock recorded negative (Neubauer et al ., 2009 ). Earlier on it was demonstrated that G. anatis was much more widespread in chicken flocks housed under lower biosecurity with broiler grandparents being negative and the vast majority of tracheal samples obtained from layers kept under organic conditions were found to be positive (Bojesen et al ., 2003 ). Beside lesions in the reproductive tract, necrotic and inflammatory changes in liver, intestine, heart and kidney were also noticed in connection with the isolation of G. anatis (Greenham and Hill, 1962 ; Harbourne, 1962 ; Harry, 1962 ; Hacking and Pettit, 1974 ; Addo and Mohan, 1985 ). In a recent case report, G. anatis was described in context with a hepatitis in layers, an unusual pathology attributed to the infestation of the free range birds with Ascaridia galli (Jung, 2012 ). However, based on the fact that G. anatis was isolated from diseased and healthy chickens, different authors questioned the primary pathogenicity of the bacterium and suggested that it should be regarded rather as a commensal. Experimental studies focusing on the infection route First experimental studies with G. anatis were performed in 1-d-old chicks up to 15-week-old pullets (Matthes et al ., 1969 ; Bisgaard, 1977 ; Gerlach, 1977 ; Mushin et al ., 1980 ). The main focus was to elucidate whether the infection induces clinical signs, most likely respiratory symptoms, due to the frequent isolation of bacteria in the upper respiratory tract in field surveys. However, no clinical symptoms were noticed following intranasal or intratracheal infections. It was also noticed that G. anatis was unable to exacerbate clinical symptoms of infectious bronchitis virus in a co-infection model, although single infected groups were not reported (Bisgaard, 1977 ). Invasive (subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal) and non-invasive (intranasal and intratracheal) infections were carried out in those earlier studies with very diverse outcomes. Most severe lesions were noticed in a study described by Matthes et al . ( 1969 ) who reported high mortality following intravenous or intraperitoneal infection with prominent macroscopic lesions. Similarly, Gerlach ( 1977 ) reported high mortality with haemorrhagic enteritis but attributed it to the young age of the birds as 1-d-old chicks were used. The studies had in common that no detailed laboratory investigations were performed. Following intratracheal infection, the bacteria did not obtain access to internal organs but no time point postinfection was mentioned and only three birds/group were used (Mushin et al ., 1980 ). In contrast, re-isolation was successful from heart and liver after intranasal infection (Matthes et al ., 1969 ). Overall, it was concluded in those earlier studies that G. anatis is part of the physiological tracheal flora in chickens and additional influences might be needed to induce any adverse effects. This was supported by frequent isolations from the upper respiratory tract in field studies, as mentioned above, but it neglected field reports that the bacteria were also isolated from reproductive tract lesions. Following the initial studies, almost no experimental infections were reported until Bojesen et al . ( 2004 ) performed a study with a detailed experimental design, including sequential killing of birds between 3 and 24 h postinfection, after intraperitoneal or intravenous infection. Intraperitoneal infection was applied by the same research group in other studies, in order to mimic a peritoneal infection due to ascending bacteria from the cloaca via the oviduct, a hypothesis well known from E. coli infections in layers (Bager et al ., 2013 ; Pedersen et al ., 2015 ; Pors et al ., 2016 ). Testing certain deletion mutants, and/or the efficacy of recombinant proteins to be used as vaccine candidates, fibrinous and purulent peritonitis were noticed, similar to previous studies and expected due to the route of infection. As sexually mature birds were used, oophoritis and salpingitis were also recorded with G. anatis isolated from the reproductive tract. However, in these studies commercial birds were used that were already carrying G. anatis prior to infection, which complicates further conclusions on primary aetiologies, although it might be close to a clinical situation considering the widespread distribution of the bacteria with an increasing age of the birds. First studies in 12-week-old specific pathogen-free (SPF) chickens were reported by Zepeda et al . ( 2010 ), who demonstrated efficient intranasal infection. Although a wide dissemination of the bacteria in pullets and microscopic lesions was noticed, no samples were taken from the reproductive tract. In continuing studies, the same route of infection was used and with this it was possible to confirm that bacteria are widely disseminated in the organism with lesions in the reproductive tract of 4-week-old SPF chickens (Paudel et al ., 2013 ). This research indicated that the intranasal route of infection was very suitable to mimic the clinical situation. Based on this study, two further separate experimental trials in mature SPF chickens, hens and cockerels, were performed (Paudel et al ., 2014 a , 2014 b ). Macroscopic and microscopic lesions in the reproductive tract were successfully induced and the infection resulted in a drop in egg production due to severe folliculitis in addition to egg peritonitis. Such conditions reflect very closely the field situation and question the view that infection of layers occurs via the oviduct. The intranasal infection of cockerels confirmed the predilection of G. anatis for the reproductive tract also for male birds, with consequences on semen quality. Histology and re-isolation of G. anatis completed the laboratory investigations and confirmed the pathogenic nature of the bacterium together with the potential of being vertically transmitted. Despite the fact that clinical signs and macroscopic lesions could be successfully reproduced in SPF birds, mimicking a natural infection, numerous questions remain. Genetically different strains exist with major differences about the absence or presence of certain virulence factors and the consequences on pathogenicity are so far only established for some strains (Persson and Bojesen, 2015 ). Following infection by the nasal route, the bacterium has to pass the mucosal barrier in order to reach the ovaries/testes as G. anatis is less prevalent in internal organs, a phenomenon currently not understood. Furthermore, additional host and pathogen-driven influences for the recognised pathologies need to be considered. At least two studies reported the consequences of immunosuppression leading to a higher load of bacteria in internal organs (Bojesen et al ., 2004 ; Paudel et al ., 2015 ). However, as those treatments were introduced prior to infection, the impact of immunosuppression on latent carriers remains to be resolved. Taxonomy The genus Gallibacterium is classified within the family Pasteurellaceae Pohl 1981. It contains 4 species namely G. anatis, Gallibacterium melopsittaci, Gallibacterium trehalosifermentans and Gallibacterium salpingitidis , three genomospecies 1, 2 and 3 and an unknown taxon (group V) (Christensen et al ., 2003 ; Bisgaard et al ., 2009 ). Prior to this assignment as a separate entity, G. anatis was formerly known as avian Pasteurella haemolytica, Actinobacillus salpingitidis or Pasteurella anatis . Consequently, changes in terminology need to be considered when performing literature searches. Field reports First field reports date back to 1950 when Kjos-Hanssen ( 1950 ) reported the isolation of a Pasteurella -like organism from the oviduct of hens with egg peritonitis, which was named "cloacal bacteria". Salpingitis, peritonitis, degeneration of the ovary and oviduct, haemorrhagic follicles and a drop in egg production with varying mortality were also mentioned in later reports from the field (Hacking and Pettit, 1974 ; Jones and Owen, 1981 ; Mirle et al ., 1991 ; Neubauer et al ., 2009 ; Jones et al ., 2013 ). In these reports, the bacterium was often isolated together with E. coli , although pure cultures were also noticed, especially from the reproductive tract, in combination with macroscopic lesions. Various field studies described the presence of G. anatis in the upper respiratory tract. In a survey performed in Israel, 97% of 322 healthy chickens from 23 flocks carried the organism in the tracheal flora, whereas a much lower prevalence was noticed in turkeys, geese, ducks and wild birds (Mushin et al ., 1980 ). Jones et al . ( 2013 ) considered G. anatis as a primary pathogen of the respiratory tract with similar lesions as P. multocida . Performing extensive bacteriological investigation of 10 organs from 3–8 birds/flock, positive birds were detected in 30 flocks with only one flock recorded negative (Neubauer et al ., 2009 ). Earlier on it was demonstrated that G. anatis was much more widespread in chicken flocks housed under lower biosecurity with broiler grandparents being negative and the vast majority of tracheal samples obtained from layers kept under organic conditions were found to be positive (Bojesen et al ., 2003 ). Beside lesions in the reproductive tract, necrotic and inflammatory changes in liver, intestine, heart and kidney were also noticed in connection with the isolation of G. anatis (Greenham and Hill, 1962 ; Harbourne, 1962 ; Harry, 1962 ; Hacking and Pettit, 1974 ; Addo and Mohan, 1985 ). In a recent case report, G. anatis was described in context with a hepatitis in layers, an unusual pathology attributed to the infestation of the free range birds with Ascaridia galli (Jung, 2012 ). However, based on the fact that G. anatis was isolated from diseased and healthy chickens, different authors questioned the primary pathogenicity of the bacterium and suggested that it should be regarded rather as a commensal. Experimental studies focusing on the infection route First experimental studies with G. anatis were performed in 1-d-old chicks up to 15-week-old pullets (Matthes et al ., 1969 ; Bisgaard, 1977 ; Gerlach, 1977 ; Mushin et al ., 1980 ). The main focus was to elucidate whether the infection induces clinical signs, most likely respiratory symptoms, due to the frequent isolation of bacteria in the upper respiratory tract in field surveys. However, no clinical symptoms were noticed following intranasal or intratracheal infections. It was also noticed that G. anatis was unable to exacerbate clinical symptoms of infectious bronchitis virus in a co-infection model, although single infected groups were not reported (Bisgaard, 1977 ). Invasive (subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal) and non-invasive (intranasal and intratracheal) infections were carried out in those earlier studies with very diverse outcomes. Most severe lesions were noticed in a study described by Matthes et al . ( 1969 ) who reported high mortality following intravenous or intraperitoneal infection with prominent macroscopic lesions. Similarly, Gerlach ( 1977 ) reported high mortality with haemorrhagic enteritis but attributed it to the young age of the birds as 1-d-old chicks were used. The studies had in common that no detailed laboratory investigations were performed. Following intratracheal infection, the bacteria did not obtain access to internal organs but no time point postinfection was mentioned and only three birds/group were used (Mushin et al ., 1980 ). In contrast, re-isolation was successful from heart and liver after intranasal infection (Matthes et al ., 1969 ). Overall, it was concluded in those earlier studies that G. anatis is part of the physiological tracheal flora in chickens and additional influences might be needed to induce any adverse effects. This was supported by frequent isolations from the upper respiratory tract in field studies, as mentioned above, but it neglected field reports that the bacteria were also isolated from reproductive tract lesions. Following the initial studies, almost no experimental infections were reported until Bojesen et al . ( 2004 ) performed a study with a detailed experimental design, including sequential killing of birds between 3 and 24 h postinfection, after intraperitoneal or intravenous infection. Intraperitoneal infection was applied by the same research group in other studies, in order to mimic a peritoneal infection due to ascending bacteria from the cloaca via the oviduct, a hypothesis well known from E. coli infections in layers (Bager et al ., 2013 ; Pedersen et al ., 2015 ; Pors et al ., 2016 ). Testing certain deletion mutants, and/or the efficacy of recombinant proteins to be used as vaccine candidates, fibrinous and purulent peritonitis were noticed, similar to previous studies and expected due to the route of infection. As sexually mature birds were used, oophoritis and salpingitis were also recorded with G. anatis isolated from the reproductive tract. However, in these studies commercial birds were used that were already carrying G. anatis prior to infection, which complicates further conclusions on primary aetiologies, although it might be close to a clinical situation considering the widespread distribution of the bacteria with an increasing age of the birds. First studies in 12-week-old specific pathogen-free (SPF) chickens were reported by Zepeda et al . ( 2010 ), who demonstrated efficient intranasal infection. Although a wide dissemination of the bacteria in pullets and microscopic lesions was noticed, no samples were taken from the reproductive tract. In continuing studies, the same route of infection was used and with this it was possible to confirm that bacteria are widely disseminated in the organism with lesions in the reproductive tract of 4-week-old SPF chickens (Paudel et al ., 2013 ). This research indicated that the intranasal route of infection was very suitable to mimic the clinical situation. Based on this study, two further separate experimental trials in mature SPF chickens, hens and cockerels, were performed (Paudel et al ., 2014 a , 2014 b ). Macroscopic and microscopic lesions in the reproductive tract were successfully induced and the infection resulted in a drop in egg production due to severe folliculitis in addition to egg peritonitis. Such conditions reflect very closely the field situation and question the view that infection of layers occurs via the oviduct. The intranasal infection of cockerels confirmed the predilection of G. anatis for the reproductive tract also for male birds, with consequences on semen quality. Histology and re-isolation of G. anatis completed the laboratory investigations and confirmed the pathogenic nature of the bacterium together with the potential of being vertically transmitted. Despite the fact that clinical signs and macroscopic lesions could be successfully reproduced in SPF birds, mimicking a natural infection, numerous questions remain. Genetically different strains exist with major differences about the absence or presence of certain virulence factors and the consequences on pathogenicity are so far only established for some strains (Persson and Bojesen, 2015 ). Following infection by the nasal route, the bacterium has to pass the mucosal barrier in order to reach the ovaries/testes as G. anatis is less prevalent in internal organs, a phenomenon currently not understood. Furthermore, additional host and pathogen-driven influences for the recognised pathologies need to be considered. At least two studies reported the consequences of immunosuppression leading to a higher load of bacteria in internal organs (Bojesen et al ., 2004 ; Paudel et al ., 2015 ). However, as those treatments were introduced prior to infection, the impact of immunosuppression on latent carriers remains to be resolved. Fowl aviadenoviruses (FAdVs) Taxonomy FAdVs are non-enveloped, double-strand DNA viruses which belong to the genus Aviadenovirus within the family Adenoviridae (Harrach et al ., 2011 ). They are separated into 5 different species (FAdV-A to FAdV-E) with 12 different serotypes (Hess, 2000 ). The grouping into 5 different species was originally suggested by Zsak and Kisary ( 1981 ) who digested the DNA of the 12 FAdV serotypes with restriction enzymes and obtained 5 different patterns, identical to the later species A–E. In the older literature, the family Adenoviridae was split into two genera only, Mast- and Aviadenovirus, reflecting the origin of those viruses, either from mammals or birds. The latter ones were further separated into three different groups (I–III) to address genomic and biological differences between FAdVs, the haemorrhagic enteritis virus of turkeys (HEV) and the egg drop syndrome virus (EDSV). Although substantial differences between members of the three groups (e.g. host specificities, pathogenesis and antigenicity) were already known for some time, the complete sequence of the EDSV genome demonstrated a closer phylogenetic relationship to viruses isolated from mammals in comparison with FAdV questioning the existing taxonomy (Hess et al ., 1997 ). In the actual taxonomy, characterised by genera containing viruses from different animal species, such similarities are considered and prioritised over the origin and host. Field reports Based on the existing field reports, FAdVs can induce three different diseases, adenoviral gizzard erosion (AGE), hydropericardium-hepatitis syndrome (HHS) and inclusion body hepatitis (IBH) (Hess, 2013 ). Comprehensive epidemiological studies in which genomic analyses were performed indicate that certain species/serotypes can be isolated from a specific disease (Schachner et al ., 2016 ). Whereas AGE is mainly reported in connection to FAdV-1 (species A), virulent strains of FAdV-4 (species C) induce HHS and various serotypes of FAdV-D and FAdV-E are etiological agents of IBH. Although such epidemiological studies indicate a link between aviadenoviruses and a certain disease, it needs to be mentioned that FAdVs are also present in clinically healthy birds with mixed infections of different serotypes again confirmed in recent reports (Kaján et al ., 2013 ; Niczyporuk, 2016 ). This underlines the importance of precise laboratory investigations in order to establish a robust link between detection of virus and disease. Various FAdVs can be isolated from a wide range of birds, ranging from poultry species to wild birds, indicating low host specificity. Like in chickens, FAdV infections in other bird species might occur without clinical signs but the appearance of virulent FAdV-4 in pigeons and ducks in coincidence with severe clinical signs and high mortality indicates the risk of such a spread (Naeem and Akram, 1995 ; Hess, 2013 ; Chen et al ., 2016 ). Clinical signs due to FAdV are mainly noticed in young birds up to 5 weeks of age. Since the first description by Yates and Fry ( 1957 ), vertical transmission of FAdV from breeders to progeny is of special importance for spreading FAdV and the induction of disease in progenies (Toro et al ., 2001 ; Grgic et al ., 2006 ; Grafl et al ., 2012 ). An impact on breeder performance with reduced egg production and hatchability was reported in cases of vertical transmission or due to infection with virulent FAdV-4 (Christensen and Saifuddin, 1989 ; Abe et al ., 1998 ; Kim et al ., 2008 ; Grafl et al ., 2012 ). Introduction of FAdVs into a flock can also occur via horizontal transmission, but very often the source of entrance could not be resolved due to the fact that no accurate samples were available. Serum samples are of special importance to determine the infectious status of breeders and to prove vertical transmission in a serum neutralisation test using the virus from the diseased progenies. Based on field data and experimental infections (see below), it was the general perception for a long time that a co-infection with an immunosuppressive virus (either infectious bursal disease virus (IBDV) or chicken anemia virus (CAV)) was needed for clinical manifestation of an FAdV-induced disease, mainly IBH and HHS. However, earlier reports about IBH in New Zealand had already indicated that IBH can be a primary disease which was confirmed in a series of more recent reports of IBH outbreaks in Canada, Australia and Japan (Christensen and Saifuddin, 1989 ; Gomis et al ., 2006 ; Nakamura et al ., 2011 ; Steer et al ., 2011 ). In addition, the prevalence of FAdV does not coincide with the presence of IBDV or CAV (Eregae et al ., 2014 ). However, as immunosuppression is an important trigger for IBH and HHS, special care should be taken to protect birds accordingly. First reports about IBH date back to 1963 when Helmboldt and Frazier ( 1963 ) described inclusion bodies in chicken livers with unknown significance. Later on, various studies aimed to isolate the relevant agent and FAdVs were isolated and typed by different research groups (reviewed by McFerran and Adair, 1977 ). A larger number of IBH outbreaks were reported from Canada (Pettit and Carlson, 1972 ) and Iraq (Al-Sheikhly and Mutalib, 1979 ) based on histological diagnosis until the disease was reported from New Zealand (Saifuddin et al ., 1992 ) and Australia (Erny et al ., 1991 ), predominantly caused by FAdV-8. Single case reports were published until about 10 years ago when the number of outbreaks in geographically different areas worldwide increased substantially (Gomis et al ., 2006 ; Ojkic et al ., 2008 a , 2008 b ; Lim et al ., 2011 ; Nakamura et al ., 2011 ; Steer et al ., 2011 ; Choi et al ., 2012 ; Kaján et al ., 2013 ; Maartens et al ., 2015 ; Zhao et al ., 2015 ; Niczyporuk, 2016 ; Schachner et al ., 2016 ). The clinical picture of IBH is characterised by sudden onset of mortality in 1–5-week-old birds. Mortality varies greatly between 1% and 30%, indicating that numerous factors might influence the disease. The majority of field cases were reported from broilers with severe hepatitis noticed during post- mortem investigations, sometimes accompanied with an atrophy of the bursa of Fabricius. Histological changes in the kidneys and inclusion bodies in the pancreas have also been noticed together with hypoglycaemia (Goodwin et al ., 1993 ; Wilson et al ., 2010 ). In 1987, HHS was first described in Pakistan and later on in other Asian and Arabian countries and some parts of Middle and Latin America (Anjum et al ., 1989 ; Hess et al ., 1999 ). Clinical signs and pathomorphological lesions of HHS are similar to IBH, except that they are more severe. In addition, hydropericardium is noticeable characterised by a straw-coloured fluid in the pericardial sac. Exceptionally, clinical signs with 6.4% mortality in 35-week-old broiler breeders were reported (Abe et al ., 1998 ). Several reviews are available describing the clinical signs together with pathomorphological and histological lesions (Ganesh and Raghavan, 2000 ; Balamurugan and Kataria, 2004 ; Asthana et al ., 2013 ). Mixed pathologies, especially for HHS and IBH, are frequently reported but the presence of a hydropericardium in combination with a somewhat higher mortality is a strong indication for HHS. Circulating virulent FAdV-4 viruses inducing mixed pathologies of HHS and/or IBH have been reported from various Asian countries (Lim et al ., 2011 ; Mittal et al ., 2014 ; Zhao et al ., 2015 ). AGE is a rather new disease mainly noticed in broilers, although Grimes et al . ( 1977 ) already reported AGE in the context of an FAdV infection during an IBH outbreak without further investigations. Later on, Tanimura et al . ( 1993 ) noticed gizzard erosions with haemorrhages in the proventriculus of 10-week-old pullets. Inclusion bodies were demonstrated in the gizzard together with degeneration and desquamation of the keratinoid layer and necrosis of the epithelium. Clinically, AGE can already be differentiated from HHS and IBH due to the somewhat lower mortality. A slightly elevated mortality with higher selection rate was reported but the disease might go unnoticed, despite the fact that 50% of the birds can have lesions at the slaughterhouse leading to a higher condemnation rate (Ono et al ., 2001 , 2003 ; Grafl et al ., 2012 ). The disease has so far been reported from Europe and Asia, with the majority of reports identifying FAdV-1 as etiological agent. As FAdV-1 is very widespread and as gizzard erosions can have various aetiologies (Gjevre et al ., 2013 ), specific diagnostic methods should be applied to characterise FAdVs and to demonstrate the virus in the pathomorphological lesions. In addition, demonstration of specific antibodies is helpful to confirm the aetiology. Experimental studies focusing on the type of bird Although the field studies described above indicate a link between certain FAdVs and disease, the fact that FAdVs are also isolated from clinically healthy birds is a severe complication to fulfil Koch's Postulates. The mechanism behind this is hardly understood and so far the genetic background of FAdVs in context of pathogenicity was only targeted in a single study highlighting the importance of the fibre protein for pathogenicity of FAdV-E viruses (Pallister et al ., 1996 ). In the previous section, it was already outlined that IBH and HHS are somewhat similar with regard to the appearance in the field. Consequently, they share certain principles with regard to experimental trials, also mentioned in the different reviews cited above. Soon after the first description of IBH in the field, Clemmer ( 1965 , 1972 ) reported an age resistance based upon virus excretion, following oral infection of chickens, at either 1-d-old or 45 d of age, with FAdV-1. The virus was mainly confined to the gastrointestinal tract and no lesions were noticed. Interestingly, he also noticed that birds infected at 12 d of age were refractory to a second infection 33 d later. Age resistance was confirmed later on by several authors who used different routes of infection, mainly intramuscular and subcutaneous at two different time points in birds up to 21 d of age, in order to reproduce IBH (Cook, 1974 b ; Nakamura et al ., 2000 ; Lim et al ., 2011 ; Dar et al ., 2012 ). A very virulent FAdV-4 isolated from a broiler breeder hen suffering from HHS induced 70% mortality in 15-month-old SPF hens, the oldest birds ever used in experimental studies, with 100% mortality in 1-d-old birds independent of the infection route (Nakamura et al ., 1999 ). A different dose of the same virus was used in various studies to reproduce IBH (Erny et al ., 1991 ; Mendelson et al ., 1995 ; Nakamura et al ., 1999 ; Dar et al ., 2012 ). Differences became more significant as birds were getting older (> 1 week of age) indicating a negative correlation between age and a lower viral dose. However, virulent FAdV-E viruses given intranasally to 1-d-old birds at a low dose of 5 TCID 50 were able to induce IBH (Erny et al ., 1991 ). As an outcome of available studies, it can be concluded that after 1 week of age an invasive route, most often intramuscular, is needed to induce clinical signs characterised by apathy, huddling of birds and mortality. This was also demonstrated in the first study reproducing HHS in SPF chicks with plaque-purified FAdV (Mazaheri et al ., 1998 ). Initial experiments to reproduce HHS were done in commercial broilers with a less well-characterised overall infectious status (Anjum, 1990 ; Chandra et al ., 1997 ). The application of organ homogenates reflects the uncertainties at that time about the true aetiology of HHS, although an adenovirus was already demonstrated by electron microscopy. Different to FAdV-1 mentioned above, other FAdV strains were more widespread in the organism following oral and intranasal infection of 1-d-old birds (Cook, 1983 ). Viruses could be recovered from the respiratory system, gonads, liver, spleen, bursa of Fabricius and some FAdVs were even recovered from the brain, although replication in the later tissue was questioned. Highest viral loads were noticed in different parts of the digestive tract, either proventriculus, caecum or ileum, which, together with the ceacal tonsils are the organs of virus persistence, something also noticed by measuring viral antigen by ELISA in numerous organs (Saifuddin and Wilks, 1991 ). Based upon detailed assessment of macroscopic and histological lesions, virulent IBH viruses induce most severe changes between 4 and 7 d postinfection (Steer et al ., 2015 ). Co-infection experiments with either IBDV or CAV indicated that reproduction of IBH depends on a compromised immune system (Fadly et al ., 1976 ; Von Bülow et al ., 1986 ). The importance of a fully functional immune system was also confirmed in an experimental study demonstrating significant differences between chemically immunosuppressed chickens versus untreated birds (Nakamura et al ., 2003 ). However, infection of SPF birds with virulent FAdV-4 demonstrated a severe impact of FAdV itself on lymphocyte subpopulations in the thymus and bursa of Fabricius, although the true nature and mechanism still need to be elucidated (Schonewille et al ., 2008 ). Furthermore, progenies investigated from intramuscularly infected serologically negative layer breeders developed microscopic lesions in the liver irrespective of a CAV co-infection confirming the primary pathogenicity of FAdV after vertical transmission (Toro et al ., 2001 ). In an earlier experimental study, Grimes et al . (1978) noticed a necrotising pancreatitis, something also reported from the field. In a recent study, detailed histological investigations of liver and pancreas together with an assessment of clinical chemistry analytes were combined, altogether correlating very well, which indicates that the pancreas is an important target organ in IBH pathogenesis (Matos et al ., 2016 b ). As a consequence of this finding, we hypothesised that the type of bird is of importance for the outcome of an experimental infection. This was confirmed in another study in which much more severe clinical signs in SPF broilers in comparison with SPF layers, characterised by hypoglycaemia and severe pathological lesions in the pancreas, were noticed (Matos et al ., 2016 a ). Such results might help to explain why IBH outbreaks in fast-growing broilers, who are physiologically very different from layers, are more frequently reported, as mentioned above. And it indicates that experiments performed decades ago, although different kinds of SPF birds were used (Cook, 1974 a ), are difficult to compare with current studies, considering the substantial recent progress in breeding and the accompanying change in bird metabolism. The majority of experimental studies to reproduce AGE were performed in SPF White Leghorn layers (Okuda et al ., 2001 b , 2004 ; Nakamura et al ., 2002 ; Ono et al ., 2004 , 2007 ; Domanska-Blicharz et al ., 2011 ). Whereas mortality was only noticed in one study (Domanska-Blicharz et al ., 2011 ) all the others did not report severe clinical signs. However, in all of those studies it was possible to induce lesions in the gizzard similar to those described from field outbreaks. Lesions were characterised by erosion of the koilin layer accompanied with an inflammation or ulceration of the gizzard mucosa, which peaked around 10 d postinfection. In all studies, such lesions were successfully reproduced by oral infection with field isolates characterised as FAdV-1, except in one study where a FAdV-8 strain was applied and lesions in the gizzard were less severe (Okuda et al ., 2004 ). If intramuscular or intravenous application were used, more severe lesions were noticed including the induction of IBH with the FAdV-8 isolate. Soon after the initial reproduction of AGE in SPF layers, Okuda et al . ( 2001 a ) reproduced the disease in commercial broilers due to the assumption that layer-type chickens might be an inappropriate model. Despite the fact that the commercial birds had maternal antibodies, which were no longer present at 5 weeks of age, it was possible to induce severe lesions and, different to SPF layers, a drop in body weight gain. Such findings were confirmed by our own investigations in SPF broilers, which showed a more pronounced effect on body weight than commercial birds with maternal antibodies (Grafl et al ., 2013 ). Applying real-time PCR, it could also be demonstrated that the viral load in the gizzard was higher than in the liver, emphasising a certain aberrant tissue tropism of FAdV-1. The finding that lesions can also be induced in older birds up to 53 d of age, completes the range of experimental data. Altogether, the animal experiments in combination with the applied laboratory methods, especially the confirmation of FAdV-1 virus in histological lesions from where it could be isolated, confirmed the aetiology of AGE and the fulfilment of Koch's Postulates. Furthermore, the results indicate that the pathogenesis of AGE is somewhat different to IBH and HHS with consequences on protection. The absence of lesions following oral reinfection (Ono et al ., 2004 ; Grafl et al ., 2014 ) highlights the importance of a local immune response and closes the circle with the initial observation reported by Clemmer 50 years ago (Clemmer, 1965 ). Taxonomy FAdVs are non-enveloped, double-strand DNA viruses which belong to the genus Aviadenovirus within the family Adenoviridae (Harrach et al ., 2011 ). They are separated into 5 different species (FAdV-A to FAdV-E) with 12 different serotypes (Hess, 2000 ). The grouping into 5 different species was originally suggested by Zsak and Kisary ( 1981 ) who digested the DNA of the 12 FAdV serotypes with restriction enzymes and obtained 5 different patterns, identical to the later species A–E. In the older literature, the family Adenoviridae was split into two genera only, Mast- and Aviadenovirus, reflecting the origin of those viruses, either from mammals or birds. The latter ones were further separated into three different groups (I–III) to address genomic and biological differences between FAdVs, the haemorrhagic enteritis virus of turkeys (HEV) and the egg drop syndrome virus (EDSV). Although substantial differences between members of the three groups (e.g. host specificities, pathogenesis and antigenicity) were already known for some time, the complete sequence of the EDSV genome demonstrated a closer phylogenetic relationship to viruses isolated from mammals in comparison with FAdV questioning the existing taxonomy (Hess et al ., 1997 ). In the actual taxonomy, characterised by genera containing viruses from different animal species, such similarities are considered and prioritised over the origin and host. Field reports Based on the existing field reports, FAdVs can induce three different diseases, adenoviral gizzard erosion (AGE), hydropericardium-hepatitis syndrome (HHS) and inclusion body hepatitis (IBH) (Hess, 2013 ). Comprehensive epidemiological studies in which genomic analyses were performed indicate that certain species/serotypes can be isolated from a specific disease (Schachner et al ., 2016 ). Whereas AGE is mainly reported in connection to FAdV-1 (species A), virulent strains of FAdV-4 (species C) induce HHS and various serotypes of FAdV-D and FAdV-E are etiological agents of IBH. Although such epidemiological studies indicate a link between aviadenoviruses and a certain disease, it needs to be mentioned that FAdVs are also present in clinically healthy birds with mixed infections of different serotypes again confirmed in recent reports (Kaján et al ., 2013 ; Niczyporuk, 2016 ). This underlines the importance of precise laboratory investigations in order to establish a robust link between detection of virus and disease. Various FAdVs can be isolated from a wide range of birds, ranging from poultry species to wild birds, indicating low host specificity. Like in chickens, FAdV infections in other bird species might occur without clinical signs but the appearance of virulent FAdV-4 in pigeons and ducks in coincidence with severe clinical signs and high mortality indicates the risk of such a spread (Naeem and Akram, 1995 ; Hess, 2013 ; Chen et al ., 2016 ). Clinical signs due to FAdV are mainly noticed in young birds up to 5 weeks of age. Since the first description by Yates and Fry ( 1957 ), vertical transmission of FAdV from breeders to progeny is of special importance for spreading FAdV and the induction of disease in progenies (Toro et al ., 2001 ; Grgic et al ., 2006 ; Grafl et al ., 2012 ). An impact on breeder performance with reduced egg production and hatchability was reported in cases of vertical transmission or due to infection with virulent FAdV-4 (Christensen and Saifuddin, 1989 ; Abe et al ., 1998 ; Kim et al ., 2008 ; Grafl et al ., 2012 ). Introduction of FAdVs into a flock can also occur via horizontal transmission, but very often the source of entrance could not be resolved due to the fact that no accurate samples were available. Serum samples are of special importance to determine the infectious status of breeders and to prove vertical transmission in a serum neutralisation test using the virus from the diseased progenies. Based on field data and experimental infections (see below), it was the general perception for a long time that a co-infection with an immunosuppressive virus (either infectious bursal disease virus (IBDV) or chicken anemia virus (CAV)) was needed for clinical manifestation of an FAdV-induced disease, mainly IBH and HHS. However, earlier reports about IBH in New Zealand had already indicated that IBH can be a primary disease which was confirmed in a series of more recent reports of IBH outbreaks in Canada, Australia and Japan (Christensen and Saifuddin, 1989 ; Gomis et al ., 2006 ; Nakamura et al ., 2011 ; Steer et al ., 2011 ). In addition, the prevalence of FAdV does not coincide with the presence of IBDV or CAV (Eregae et al ., 2014 ). However, as immunosuppression is an important trigger for IBH and HHS, special care should be taken to protect birds accordingly. First reports about IBH date back to 1963 when Helmboldt and Frazier ( 1963 ) described inclusion bodies in chicken livers with unknown significance. Later on, various studies aimed to isolate the relevant agent and FAdVs were isolated and typed by different research groups (reviewed by McFerran and Adair, 1977 ). A larger number of IBH outbreaks were reported from Canada (Pettit and Carlson, 1972 ) and Iraq (Al-Sheikhly and Mutalib, 1979 ) based on histological diagnosis until the disease was reported from New Zealand (Saifuddin et al ., 1992 ) and Australia (Erny et al ., 1991 ), predominantly caused by FAdV-8. Single case reports were published until about 10 years ago when the number of outbreaks in geographically different areas worldwide increased substantially (Gomis et al ., 2006 ; Ojkic et al ., 2008 a , 2008 b ; Lim et al ., 2011 ; Nakamura et al ., 2011 ; Steer et al ., 2011 ; Choi et al ., 2012 ; Kaján et al ., 2013 ; Maartens et al ., 2015 ; Zhao et al ., 2015 ; Niczyporuk, 2016 ; Schachner et al ., 2016 ). The clinical picture of IBH is characterised by sudden onset of mortality in 1–5-week-old birds. Mortality varies greatly between 1% and 30%, indicating that numerous factors might influence the disease. The majority of field cases were reported from broilers with severe hepatitis noticed during post- mortem investigations, sometimes accompanied with an atrophy of the bursa of Fabricius. Histological changes in the kidneys and inclusion bodies in the pancreas have also been noticed together with hypoglycaemia (Goodwin et al ., 1993 ; Wilson et al ., 2010 ). In 1987, HHS was first described in Pakistan and later on in other Asian and Arabian countries and some parts of Middle and Latin America (Anjum et al ., 1989 ; Hess et al ., 1999 ). Clinical signs and pathomorphological lesions of HHS are similar to IBH, except that they are more severe. In addition, hydropericardium is noticeable characterised by a straw-coloured fluid in the pericardial sac. Exceptionally, clinical signs with 6.4% mortality in 35-week-old broiler breeders were reported (Abe et al ., 1998 ). Several reviews are available describing the clinical signs together with pathomorphological and histological lesions (Ganesh and Raghavan, 2000 ; Balamurugan and Kataria, 2004 ; Asthana et al ., 2013 ). Mixed pathologies, especially for HHS and IBH, are frequently reported but the presence of a hydropericardium in combination with a somewhat higher mortality is a strong indication for HHS. Circulating virulent FAdV-4 viruses inducing mixed pathologies of HHS and/or IBH have been reported from various Asian countries (Lim et al ., 2011 ; Mittal et al ., 2014 ; Zhao et al ., 2015 ). AGE is a rather new disease mainly noticed in broilers, although Grimes et al . ( 1977 ) already reported AGE in the context of an FAdV infection during an IBH outbreak without further investigations. Later on, Tanimura et al . ( 1993 ) noticed gizzard erosions with haemorrhages in the proventriculus of 10-week-old pullets. Inclusion bodies were demonstrated in the gizzard together with degeneration and desquamation of the keratinoid layer and necrosis of the epithelium. Clinically, AGE can already be differentiated from HHS and IBH due to the somewhat lower mortality. A slightly elevated mortality with higher selection rate was reported but the disease might go unnoticed, despite the fact that 50% of the birds can have lesions at the slaughterhouse leading to a higher condemnation rate (Ono et al ., 2001 , 2003 ; Grafl et al ., 2012 ). The disease has so far been reported from Europe and Asia, with the majority of reports identifying FAdV-1 as etiological agent. As FAdV-1 is very widespread and as gizzard erosions can have various aetiologies (Gjevre et al ., 2013 ), specific diagnostic methods should be applied to characterise FAdVs and to demonstrate the virus in the pathomorphological lesions. In addition, demonstration of specific antibodies is helpful to confirm the aetiology. Experimental studies focusing on the type of bird Although the field studies described above indicate a link between certain FAdVs and disease, the fact that FAdVs are also isolated from clinically healthy birds is a severe complication to fulfil Koch's Postulates. The mechanism behind this is hardly understood and so far the genetic background of FAdVs in context of pathogenicity was only targeted in a single study highlighting the importance of the fibre protein for pathogenicity of FAdV-E viruses (Pallister et al ., 1996 ). In the previous section, it was already outlined that IBH and HHS are somewhat similar with regard to the appearance in the field. Consequently, they share certain principles with regard to experimental trials, also mentioned in the different reviews cited above. Soon after the first description of IBH in the field, Clemmer ( 1965 , 1972 ) reported an age resistance based upon virus excretion, following oral infection of chickens, at either 1-d-old or 45 d of age, with FAdV-1. The virus was mainly confined to the gastrointestinal tract and no lesions were noticed. Interestingly, he also noticed that birds infected at 12 d of age were refractory to a second infection 33 d later. Age resistance was confirmed later on by several authors who used different routes of infection, mainly intramuscular and subcutaneous at two different time points in birds up to 21 d of age, in order to reproduce IBH (Cook, 1974 b ; Nakamura et al ., 2000 ; Lim et al ., 2011 ; Dar et al ., 2012 ). A very virulent FAdV-4 isolated from a broiler breeder hen suffering from HHS induced 70% mortality in 15-month-old SPF hens, the oldest birds ever used in experimental studies, with 100% mortality in 1-d-old birds independent of the infection route (Nakamura et al ., 1999 ). A different dose of the same virus was used in various studies to reproduce IBH (Erny et al ., 1991 ; Mendelson et al ., 1995 ; Nakamura et al ., 1999 ; Dar et al ., 2012 ). Differences became more significant as birds were getting older (> 1 week of age) indicating a negative correlation between age and a lower viral dose. However, virulent FAdV-E viruses given intranasally to 1-d-old birds at a low dose of 5 TCID 50 were able to induce IBH (Erny et al ., 1991 ). As an outcome of available studies, it can be concluded that after 1 week of age an invasive route, most often intramuscular, is needed to induce clinical signs characterised by apathy, huddling of birds and mortality. This was also demonstrated in the first study reproducing HHS in SPF chicks with plaque-purified FAdV (Mazaheri et al ., 1998 ). Initial experiments to reproduce HHS were done in commercial broilers with a less well-characterised overall infectious status (Anjum, 1990 ; Chandra et al ., 1997 ). The application of organ homogenates reflects the uncertainties at that time about the true aetiology of HHS, although an adenovirus was already demonstrated by electron microscopy. Different to FAdV-1 mentioned above, other FAdV strains were more widespread in the organism following oral and intranasal infection of 1-d-old birds (Cook, 1983 ). Viruses could be recovered from the respiratory system, gonads, liver, spleen, bursa of Fabricius and some FAdVs were even recovered from the brain, although replication in the later tissue was questioned. Highest viral loads were noticed in different parts of the digestive tract, either proventriculus, caecum or ileum, which, together with the ceacal tonsils are the organs of virus persistence, something also noticed by measuring viral antigen by ELISA in numerous organs (Saifuddin and Wilks, 1991 ). Based upon detailed assessment of macroscopic and histological lesions, virulent IBH viruses induce most severe changes between 4 and 7 d postinfection (Steer et al ., 2015 ). Co-infection experiments with either IBDV or CAV indicated that reproduction of IBH depends on a compromised immune system (Fadly et al ., 1976 ; Von Bülow et al ., 1986 ). The importance of a fully functional immune system was also confirmed in an experimental study demonstrating significant differences between chemically immunosuppressed chickens versus untreated birds (Nakamura et al ., 2003 ). However, infection of SPF birds with virulent FAdV-4 demonstrated a severe impact of FAdV itself on lymphocyte subpopulations in the thymus and bursa of Fabricius, although the true nature and mechanism still need to be elucidated (Schonewille et al ., 2008 ). Furthermore, progenies investigated from intramuscularly infected serologically negative layer breeders developed microscopic lesions in the liver irrespective of a CAV co-infection confirming the primary pathogenicity of FAdV after vertical transmission (Toro et al ., 2001 ). In an earlier experimental study, Grimes et al . (1978) noticed a necrotising pancreatitis, something also reported from the field. In a recent study, detailed histological investigations of liver and pancreas together with an assessment of clinical chemistry analytes were combined, altogether correlating very well, which indicates that the pancreas is an important target organ in IBH pathogenesis (Matos et al ., 2016 b ). As a consequence of this finding, we hypothesised that the type of bird is of importance for the outcome of an experimental infection. This was confirmed in another study in which much more severe clinical signs in SPF broilers in comparison with SPF layers, characterised by hypoglycaemia and severe pathological lesions in the pancreas, were noticed (Matos et al ., 2016 a ). Such results might help to explain why IBH outbreaks in fast-growing broilers, who are physiologically very different from layers, are more frequently reported, as mentioned above. And it indicates that experiments performed decades ago, although different kinds of SPF birds were used (Cook, 1974 a ), are difficult to compare with current studies, considering the substantial recent progress in breeding and the accompanying change in bird metabolism. The majority of experimental studies to reproduce AGE were performed in SPF White Leghorn layers (Okuda et al ., 2001 b , 2004 ; Nakamura et al ., 2002 ; Ono et al ., 2004 , 2007 ; Domanska-Blicharz et al ., 2011 ). Whereas mortality was only noticed in one study (Domanska-Blicharz et al ., 2011 ) all the others did not report severe clinical signs. However, in all of those studies it was possible to induce lesions in the gizzard similar to those described from field outbreaks. Lesions were characterised by erosion of the koilin layer accompanied with an inflammation or ulceration of the gizzard mucosa, which peaked around 10 d postinfection. In all studies, such lesions were successfully reproduced by oral infection with field isolates characterised as FAdV-1, except in one study where a FAdV-8 strain was applied and lesions in the gizzard were less severe (Okuda et al ., 2004 ). If intramuscular or intravenous application were used, more severe lesions were noticed including the induction of IBH with the FAdV-8 isolate. Soon after the initial reproduction of AGE in SPF layers, Okuda et al . ( 2001 a ) reproduced the disease in commercial broilers due to the assumption that layer-type chickens might be an inappropriate model. Despite the fact that the commercial birds had maternal antibodies, which were no longer present at 5 weeks of age, it was possible to induce severe lesions and, different to SPF layers, a drop in body weight gain. Such findings were confirmed by our own investigations in SPF broilers, which showed a more pronounced effect on body weight than commercial birds with maternal antibodies (Grafl et al ., 2013 ). Applying real-time PCR, it could also be demonstrated that the viral load in the gizzard was higher than in the liver, emphasising a certain aberrant tissue tropism of FAdV-1. The finding that lesions can also be induced in older birds up to 53 d of age, completes the range of experimental data. Altogether, the animal experiments in combination with the applied laboratory methods, especially the confirmation of FAdV-1 virus in histological lesions from where it could be isolated, confirmed the aetiology of AGE and the fulfilment of Koch's Postulates. Furthermore, the results indicate that the pathogenesis of AGE is somewhat different to IBH and HHS with consequences on protection. The absence of lesions following oral reinfection (Ono et al ., 2004 ; Grafl et al ., 2014 ) highlights the importance of a local immune response and closes the circle with the initial observation reported by Clemmer 50 years ago (Clemmer, 1965 ). Conclusions and outlook Based on the work of Robert Koch at the end of the nineteenth century, criteria were published which should be applied to determine the pathogenic potential of a certain microorganism, in order to define its status as a pathogen. The strength of such criteria is reflected by the fact that they are named "Postulates" and they still symbolise the basic principles of host–pathogen interaction and act as a gold standard in infection biology. Since the first description of parasites, bacteria and viruses, laboratory techniques and methodologies have improved considerably. Genetic tools and the whole panel of techniques supplied by molecular biology and gene technology can nowadays be applied to characterise microorganisms and their life cycle more precisely, taken together these techniques are helpful to resolve and refine aetiologies. Despite this, the interaction of certain microorganisms with the host is poorly understood and studies to clarify functional aspects are still in their infancy. As a consequence, numerous questions remain to be addressed in order to resolve basic mechanisms influencing pathogenicity as summarised in this article and outlined in the Figure for a parasite, bacterium and virus. H. meleagridis is a good example of how complex the host–pathogen interaction can be, considering that additional bacteria are needed to establish infection and to reproduce the disease. Resolving this interaction is also of vital importance for the field, considering the use of antimicrobial substances with (un-)targeted influence on the microbiota in vivo . As a consequence of this, more attention has to be paid in the future to include a broader range of parameters involved in pathogenicity, including microbiota (Byrd and Segre, 2016 ). Nevertheless, changes in husbandry and management procedures might influence the appearance of certain microorganisms and the severity of clinical signs, altogether not in the focus of Koch's Postulates. Figure. Parameters influencing experimental host–pathogen interaction of H. meleagridis, Gallibacterium anatis and fowl aviadenoviruses. In recent years, legislation and regulations about animal experiments became stricter and ethical issues are of increasing importance with the focus on three Rs, refinement, replacement and reduction. Without doubt, certain animal experiments cited above would never pass an ethical committee today or would have been accepted for publication. Although regulations became much stricter in recent years, and that one out of two turkeys stolen in an initial animal experiment to reproduce histomonosis (Graybill and Smith, 1920 ) seems bizarre, animal research today – and in the future – will face constant challenges. Harmonisation and standardisation of animal experiments has a certain priority to compare results more accurately, keeping in mind that certain variables will always remain. Exchange of inocula and precise protocols would help to increase robustness – and acceptance – of findings. Publishing of "negative" results is not widely practiced due to the low acceptance in the scientific community but it would help to prevent duplication of animal experiments. Furthermore, the examples given here also highlight the need for animal experiments as the pathogen–host interaction cannot be substituted by in vitro technologies. However, in order to improve the outcome of animal experiments, the design and sampling schemes should be critically reviewed in order to include different disciplines. Combining expertise from different areas, infection biology, genetics, nutrition and husbandry will largely fulfil this demand. Altogether, it should help to elucidate aetiologies in a broader context, something not in the scope of Robert Koch in the nineteenth century. Despite this, numerous difficulties will remain to mimic the complex situation of a chicken house in an experimental setting. Disclosure statement No potential conflict of interest was reported by the author.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5208045/

Inhibitors of the Metalloproteinase Anthrax Lethal Factor

Bacillus anthracis , a rod shaped, spore forming, gram positive bacteria, is the etiological agent of anthrax. B. anthracis virulence is partly attributable to two secreted bipartite protein toxins, which act inside host cells to disrupt signaling pathways important for host defense against infection. These toxins may also directly contribute to mortality in late stage infection. The zinc-dependent metalloproteinase anthrax lethal factor (LF) is a critical component of one of these protein toxins and a prime target for inhibitor development to produce anthrax therapeutics. Here, we describe recent efforts to identify specific and potent LF inhibitors. Derivatization of peptide substrate analogs bearing zinc-binding groups has produced potent and specific LF inhibitors, and X-ray crystallography of LF-inhibitor complexes has provided insight into features required for high affinity binding. Novel inhibitor scaffolds have been identified through several approaches, including fragment-based drug discovery, virtual screening, and high-throughput screening of diverse compound libraries. Lastly, efforts to discover LF inhibitors have led to the development of new screening strategies, such as the use of full-length proteins as substrates, that may prove useful for other proteases as well. Overall, these efforts have led to a collection of chemically and mechanistically diverse molecules capable of inhibiting LF activity in vitro and in cells, as well as in animal models of anthrax infection.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9980421/

Generational differences in the relationship between media exposure and health behaviors during COVID-19 pandemic

Based on a questionnaire survey ( N = 857), this study analyzed generational differences in the public health behaviors of COVID-19 and provided an explanation for generational differences from the perspective of media exposure. There are significant differences in media exposure and health behaviors between the Mesozoic generation (35–55) and the young generation (18–34) during the lull. The Mesozoic generation paid greater attention to information on pandemics. Consequently, their health behaviors surpass that of the young generation. On the basis of social cognitive theory and protection motivation theory, this study develops a mediating model of media exposure on health behaviors, demonstrating that media exposure can influence health behaviors through the mediating effects of perceived severity, self-efficacy, and response efficacy, but not via perceived susceptibility. Moreover, a moderated mediation study found that generation moderates the indirect effect of media exposure on health behaviors via perceived susceptibility. Media exposure influences Mesozoic healthy behaviors positively by decreasing their perceived susceptibility. The implication of this study is that the development of health communication theory must account for generational differences and disease-specific characteristics. 1. Introduction The relentless invasion of the COVID-19 pandemic has drastically altered the spring of 2020, and China was the first nation to be affected. It is the most critical public health emergency since the formation of New China, with the quickest spread, the broadest infectious spectrum, and the most challenging prevention and management ( Xinhuanet., 2020 ). A public health emergency is a situation in which a health threat causes an imminent risk or serious harm to a large population ( Haffajee et al., 2014 ). The public receives a great deal of pertinent information, instructing them to wear masks, take temperature, wash their hands and disinfect more often, stay indoors, etc. Existing research on SARS and MERS has demonstrated that different demographic variables are associated with distinct prevention behaviors in infectious diseases ( Brug et al., 2004 ; Glanz and Bishop, 2010 ). At the start of the COVID-19 outbreak, however, "how to persuade parents to wear masks" topped the trending search terms on major social media platforms such like Weibo. Under this issue, many young people complained that their parents paid little attention to COVID-19 and related similar experiences. Some individuals remarked, "If it were not for this pandemic, we might not realize how challenging it is to connect with our parents. They still go out without wearing masks and even mock us for making a fuss." In addition, research has indicated that during an outbreak of COVID-19, young people are more prone to adopt severe preventive measures and are more likely to express their thoughts on the Internet ( Chu et al., 2020 ). Generational differences in health behaviors are prominent, which some scholars have called "intergenerational battles" ( Tang, 2020 ). why are there generational differences in health behaviors? What are the characteristics and reasons for generational differences? These are the main issues that the study wants to explore. When public health emergencies arise, people seek information through many channels, with media coverage of the events as the most crucial source ( Holland et al., 2012 ). The Measurement of how people are "exposed" to media content is essential to understanding media use and its effects ( De Vreese and Neijens, 2016 ). Media exposure influences people's perception of the threat, which may ultimately determine their response to the crisis ( Coleman and Thorson, 2002 ). Several studies have shown generational differences in media exposure ( Xue et al., 2018 ). The literature on media exposure and health behaviors focuses primarily on nonurgent risks, with few studies examining protective actions during a public health emergency ( Slater et al., 2007 ; Siu, 2008 ). the media exposure of the public during public health emergencies was ignored. Consequently, our study attempts to fill this gap. In addition, media exposure encompasses the audience's contact frequency and substance. However, most relevant studies ( Coleman, 1993 ; Dougall et al., 2005 ) only examined the frequency of exposure. Therefore, this study will analyze the effects of media exposure from the perspectives of exposure frequency and exposure extensity, which refers to the amount of information the audience is exposed to, enabling them to get a more comprehensive understanding of pandemics ( Li, 2018 ). Besides, the majority of studies mainly relied on legacy media while excluding interpersonal communication ( Zhang et al., 2020 ). This investigation will focus on media exposure at the mass, group organization, and interpersonal levels. Dutta and Zoller (2009) classify health communication research as post-positivistic, interpretative, critical, and cultural. Based on the tradition of social psychology, the post-positivistic approach emphasizes the analysis of communication and social and psychological variables to explain and predict health behaviors ( Dutta and Zoller, 2009 ; Thompson, 2011 ). This approach holds a prominent position in the field of health communication research. Under the post-positivistic approach, health communication extensively uses behavioral science theories, such as social cognitive theory and protection motivation theory. And these two theories focus on the effects of communication on the four Social-Cognitive variables of perceived severity, perceived susceptibility, self-efficacy, and response efficacy. In summary, this research concludes by examining generational differences in health behaviors concerning media exposure and individual psychological and cognitive aspects. The conclusion describes the characteristics of generational differences in health behaviors as well as the mechanisms that provide an impact. It can further illuminate theories on the influence mechanisms between media exposure and health behaviors and improve future health communication effects. 2. Literature review 2.1. Social-cognitive predictors of health behaviors Various theories of health behavior, including social cognitive theory, protective motivation theory, the extended parallel process model, the health belief model, and the theory of planned behavior, all suggest that socio-cognitive psychology substantially affects health behavior. Bandura (1986) proposed, from the standpoint of individual cognition, the social cognitive theory, which held that health behaviors are influenced by two cognitive variables: self-efficacy and outcome expectations. Self-efficacy, a central notion of social cognitive theory, relates to a person's perception of their capacity to engage in essential health activities ( Bandura, 1997 ). This idea proposes that strengthening an individual's self-efficacy can effectively enhance health practices ( Bandura, 2004 ). Schunk and Usher (2019) suggest that cognitive elements should incorporate beliefs, perceptions, and emotions. However, previous empirical research has frequently just examined self-efficacy and outcome expectations ( Boateng et al., 2016 ). According to Glanz and Bishop (2010) , the social cognitive theory is the most often utilized theory in health behavior research. Protection motivation theory proposes, based on social cognitive theory, that the intention to conduct a protective behavior is determined by two concurrent cognitive and partially emotional processes: one is threat appraisal, which refers to an individual's evaluation of the potential risk. The threat appraisal consisted of two variables: perceived severity and perceived susceptibility. The coping appraisal refers to an individual's evaluation of his or her ability to deal with danger and typically consists of the variables self-efficacy and response efficacy ( Milne et al., 2000 ). According to the hypothesis, perceived susceptibility, perceived severity, response efficacy, and self-efficacy might favorably influence health behavior ( Prentice-Dunn and Rogers, 1986 ). In addition, empirical research has demonstrated that the protection motivation theory is frequently applied to preventive health behaviors such as physical activity, cancer screening, and substance addiction and possesses superior predictive value ( Witte, 1994 ; Roberto et al., 2007 ; Gaston and Prapavessis, 2014 ). Regarding risk perception and health behaviors, perceived severity refers to the assumption that the consequences of contracting the disease are severe for the individual and others. And perceived susceptibility is a person's perception of their likelihood of experiencing a risk or contracting an ailment or sickness ( Tanner et al., 1991 ). Previous research has demonstrated that both factors significantly influence health behavior adoption ( Kasmaei et al., 2014 ). Regarding efficacy and health practices, Since Bandura (1986) established self-efficacy, numerous empirical researches have demonstrated that self-efficacy positively predicts preventative disease practices ( McCann et al., 1995 ). Response efficacy is related to self-efficacy and refers to an individual's conviction in the success of steps to lower health risks ( Witte, 1994 ). The greater a person's perception of a preventive measure's efficacy, the more likely they are to adopt the practice ( Floyd et al., 2000 ). Numerous studies have demonstrated that response efficacy increases the propensity to protect oneself and others ( Lwin et al., 2010 ). The study, therefore, focuses primarily on the public's preventive health activities during the COVID-19 pandemic and suggests the following hypothesis: H1 : Perceived susceptibility affects health behaviors positively. H2 : Perceived severity affects health behaviors positively. H3 : Self-efficacy affects health behaviors positively. H4 : response efficacy affects health behaviors positively. 2.2. Media exposure and health behavior The social cognitive theory proposed a "triadic interaction model" including personal factors, behavior, and the environment ( Bandura, 1998 ). The consideration of environmental factors in social cognitive theory includes both the physical and social environment ( Casper, 2001 ). Additionally, someone pointed out that the protection motivation theory focuses primarily on the influence of personal factors on health behavior and disregards environmental elements ( Lebek et al., 2014 ). Media exposure is a critical socio-environmental factor ( Narayan, 2013 ). The media significantly alter public health perceptions and encourage health behavior ( Mullins et al., 2008 ). Studies demonstrate that mass media health messages can have favorable behavioral impacts ( Wakefield et al., 2010 ). Through meta-analysis, Laranjo et al. (2015) determined that social media use can encourage individual behavior change. Consequently, this study integrates social cognitive theory and protection motivation theory to examine how media exposure influences health behavior by working on intrinsic cognitive mechanisms. On the one hand, the media is the primary source of risk perception ( Keown, 1989 ). Researchers have discovered that exposure to the news media influences the impression of influenza H1N1 risk ( Lin and Lagoe, 2013 ; Oh et al., 2015 ). Other research has demonstrated that exposure to health-related news influences people's perceptions of health threats and induces behavioral responses ( Wei et al., 2008 ). In addition, El-Toukhy (2015) found that social media exposure to disease information altered the perception of disease severity and susceptibility. Exposure to COVID-19 material from both mass media and social media enhances perceived severity, perceived susceptibility, and COVID-19 preventative behaviors ( Ranjit et al., 2021 ; Truong et al., 2022 ). However, on the other hand, Bandura (1977) believes four key sources produce self-efficacy: mastery experiences, vicarious experiences, verbal persuasion, and physiological and affective states. Vicarious experiences and verbal persuasion highlight the impact of external factors on self-efficacy. Undoubtedly, the media may contribute to disseminating vicarious experiences and implementing verbal persuasion ( Gibbons et al., 2010 ). Several studies have demonstrated that media exposure to health-related information can increase an individual's self-efficacy. For instance, Bass et al. (2006) discovered a statistically significant positive association between Internet usage and self-efficacy. Two months of exposure to health information resulted in a considerable rise in self-efficacy among cancer patients, according to Lee et al. (2008) . Response efficacy, which relates to the effectiveness of protective behaviors, is also influenced by external factors, including vicarious experience and verbal persuasion. Therefore, it is plausible to hypothesize that media exposure is also an external factor influencing response efficacy. In addition, a study confirms that during the COVID-19 pandemic, media exposure can indirectly influence public health behaviors via the mediation effects of self-efficacy and response efficacy ( Ma, 2022 ). The paper primarily proposes the following hypotheses: H5 : media exposure influences health behaviors positively through the mediation of perceived susceptibility. H6 : media exposure influences health behaviors positively via the moderating effect of perceived severity. H7 : media exposure influences health behaviors positively via the mediating effect of response efficacy. H8 : media exposure influences health behaviors positively through the mediation of self-efficacy. 2.3. Generational differences A generation is a recognizable group that shares birth years, age range, and critical life experiences throughout crucial developmental phases ( Kupperschmidt, 2000 ). Due to their similar location, people share comparable experiences and hence generate similar thoughts, experiences, and behavior patterns ( Mannheim, 2002 ). Additionally, these unique life experiences distinguish one generation from the next ( Jurkiewicz and Brown, 1998 ). Consequently, generational differences refer to the differences in cognition, attitude, and behavior choice across various generations. According to research in the field of communication, there are discernible generational differences in media exposure. Regarding media types, the old choose newspapers and television to receive information ( Lauf, 2001 ), while the young prefer the Internet and other electronic media ( Pierce et al., 1990 ). In terms of media content, a study ( Dou et al., 2006 ) reveals that the Chinese × generation pays more attention to television series and other amusement programs and less attention to economic news and other information programs than prior generations. In addition, scholars consider the consequences of media exposure on various generations' cognition, attitudes, and actions. Putnam (2000) discovered that young heavy Internet users in the United States were more separated from public life, less engaged in social activities, and less trustworthy of their peers. Some research, focusing on health behaviors has shown that the digital divide created by generational differences has a significant impact on people's health levels ( Viswanath and Kreuter, 2007 ; Hong et al., 2017 ). Moreover, researchers have demonstrated that the influence of media on risk perception varies between populations ( Sussman et al., 1989 ; Snyder and Rouse, 1995 ). According to Zhou and Yang (2020) , the generational gap in the adoption and use of digital media influences the generational gap in "knowing, believing, and doing" regarding health. However, previous research on health behavior mostly tended to consider respondents as a whole, neglecting the diverse effects on distinct populations. Therefore, it is impossible to generalize whether media exposure to risk information about the COVID-19 pandemic influences relevant preventive health behaviors across generations. Consequently, this study expects that the mediating role of the aforementioned intrinsic cognitive factors in media exposure and health behaviors varies between generations as shown in Figure 1 , and asks the following research questions: RQ1: Are there significant generational differences in COVID-19 media exposure? RQ2: Are there significant generational differences in COVID-19-preventive health behaviors? RQ3: Are the mediating roles of intrinsic cognitive factors (perceived severity, perceived susceptibility, self-efficacy, response efficacy) in media exposure and health behaviors moderated varies between generations? Figure 1 The Moderated mediation model to test the influence of generation on the mediated relationship between media exposure and health behaviors. 2.1. Social-cognitive predictors of health behaviors Various theories of health behavior, including social cognitive theory, protective motivation theory, the extended parallel process model, the health belief model, and the theory of planned behavior, all suggest that socio-cognitive psychology substantially affects health behavior. Bandura (1986) proposed, from the standpoint of individual cognition, the social cognitive theory, which held that health behaviors are influenced by two cognitive variables: self-efficacy and outcome expectations. Self-efficacy, a central notion of social cognitive theory, relates to a person's perception of their capacity to engage in essential health activities ( Bandura, 1997 ). This idea proposes that strengthening an individual's self-efficacy can effectively enhance health practices ( Bandura, 2004 ). Schunk and Usher (2019) suggest that cognitive elements should incorporate beliefs, perceptions, and emotions. However, previous empirical research has frequently just examined self-efficacy and outcome expectations ( Boateng et al., 2016 ). According to Glanz and Bishop (2010) , the social cognitive theory is the most often utilized theory in health behavior research. Protection motivation theory proposes, based on social cognitive theory, that the intention to conduct a protective behavior is determined by two concurrent cognitive and partially emotional processes: one is threat appraisal, which refers to an individual's evaluation of the potential risk. The threat appraisal consisted of two variables: perceived severity and perceived susceptibility. The coping appraisal refers to an individual's evaluation of his or her ability to deal with danger and typically consists of the variables self-efficacy and response efficacy ( Milne et al., 2000 ). According to the hypothesis, perceived susceptibility, perceived severity, response efficacy, and self-efficacy might favorably influence health behavior ( Prentice-Dunn and Rogers, 1986 ). In addition, empirical research has demonstrated that the protection motivation theory is frequently applied to preventive health behaviors such as physical activity, cancer screening, and substance addiction and possesses superior predictive value ( Witte, 1994 ; Roberto et al., 2007 ; Gaston and Prapavessis, 2014 ). Regarding risk perception and health behaviors, perceived severity refers to the assumption that the consequences of contracting the disease are severe for the individual and others. And perceived susceptibility is a person's perception of their likelihood of experiencing a risk or contracting an ailment or sickness ( Tanner et al., 1991 ). Previous research has demonstrated that both factors significantly influence health behavior adoption ( Kasmaei et al., 2014 ). Regarding efficacy and health practices, Since Bandura (1986) established self-efficacy, numerous empirical researches have demonstrated that self-efficacy positively predicts preventative disease practices ( McCann et al., 1995 ). Response efficacy is related to self-efficacy and refers to an individual's conviction in the success of steps to lower health risks ( Witte, 1994 ). The greater a person's perception of a preventive measure's efficacy, the more likely they are to adopt the practice ( Floyd et al., 2000 ). Numerous studies have demonstrated that response efficacy increases the propensity to protect oneself and others ( Lwin et al., 2010 ). The study, therefore, focuses primarily on the public's preventive health activities during the COVID-19 pandemic and suggests the following hypothesis: H1 : Perceived susceptibility affects health behaviors positively. H2 : Perceived severity affects health behaviors positively. H3 : Self-efficacy affects health behaviors positively. H4 : response efficacy affects health behaviors positively. 2.2. Media exposure and health behavior The social cognitive theory proposed a "triadic interaction model" including personal factors, behavior, and the environment ( Bandura, 1998 ). The consideration of environmental factors in social cognitive theory includes both the physical and social environment ( Casper, 2001 ). Additionally, someone pointed out that the protection motivation theory focuses primarily on the influence of personal factors on health behavior and disregards environmental elements ( Lebek et al., 2014 ). Media exposure is a critical socio-environmental factor ( Narayan, 2013 ). The media significantly alter public health perceptions and encourage health behavior ( Mullins et al., 2008 ). Studies demonstrate that mass media health messages can have favorable behavioral impacts ( Wakefield et al., 2010 ). Through meta-analysis, Laranjo et al. (2015) determined that social media use can encourage individual behavior change. Consequently, this study integrates social cognitive theory and protection motivation theory to examine how media exposure influences health behavior by working on intrinsic cognitive mechanisms. On the one hand, the media is the primary source of risk perception ( Keown, 1989 ). Researchers have discovered that exposure to the news media influences the impression of influenza H1N1 risk ( Lin and Lagoe, 2013 ; Oh et al., 2015 ). Other research has demonstrated that exposure to health-related news influences people's perceptions of health threats and induces behavioral responses ( Wei et al., 2008 ). In addition, El-Toukhy (2015) found that social media exposure to disease information altered the perception of disease severity and susceptibility. Exposure to COVID-19 material from both mass media and social media enhances perceived severity, perceived susceptibility, and COVID-19 preventative behaviors ( Ranjit et al., 2021 ; Truong et al., 2022 ). However, on the other hand, Bandura (1977) believes four key sources produce self-efficacy: mastery experiences, vicarious experiences, verbal persuasion, and physiological and affective states. Vicarious experiences and verbal persuasion highlight the impact of external factors on self-efficacy. Undoubtedly, the media may contribute to disseminating vicarious experiences and implementing verbal persuasion ( Gibbons et al., 2010 ). Several studies have demonstrated that media exposure to health-related information can increase an individual's self-efficacy. For instance, Bass et al. (2006) discovered a statistically significant positive association between Internet usage and self-efficacy. Two months of exposure to health information resulted in a considerable rise in self-efficacy among cancer patients, according to Lee et al. (2008) . Response efficacy, which relates to the effectiveness of protective behaviors, is also influenced by external factors, including vicarious experience and verbal persuasion. Therefore, it is plausible to hypothesize that media exposure is also an external factor influencing response efficacy. In addition, a study confirms that during the COVID-19 pandemic, media exposure can indirectly influence public health behaviors via the mediation effects of self-efficacy and response efficacy ( Ma, 2022 ). The paper primarily proposes the following hypotheses: H5 : media exposure influences health behaviors positively through the mediation of perceived susceptibility. H6 : media exposure influences health behaviors positively via the moderating effect of perceived severity. H7 : media exposure influences health behaviors positively via the mediating effect of response efficacy. H8 : media exposure influences health behaviors positively through the mediation of self-efficacy. 2.3. Generational differences A generation is a recognizable group that shares birth years, age range, and critical life experiences throughout crucial developmental phases ( Kupperschmidt, 2000 ). Due to their similar location, people share comparable experiences and hence generate similar thoughts, experiences, and behavior patterns ( Mannheim, 2002 ). Additionally, these unique life experiences distinguish one generation from the next ( Jurkiewicz and Brown, 1998 ). Consequently, generational differences refer to the differences in cognition, attitude, and behavior choice across various generations. According to research in the field of communication, there are discernible generational differences in media exposure. Regarding media types, the old choose newspapers and television to receive information ( Lauf, 2001 ), while the young prefer the Internet and other electronic media ( Pierce et al., 1990 ). In terms of media content, a study ( Dou et al., 2006 ) reveals that the Chinese × generation pays more attention to television series and other amusement programs and less attention to economic news and other information programs than prior generations. In addition, scholars consider the consequences of media exposure on various generations' cognition, attitudes, and actions. Putnam (2000) discovered that young heavy Internet users in the United States were more separated from public life, less engaged in social activities, and less trustworthy of their peers. Some research, focusing on health behaviors has shown that the digital divide created by generational differences has a significant impact on people's health levels ( Viswanath and Kreuter, 2007 ; Hong et al., 2017 ). Moreover, researchers have demonstrated that the influence of media on risk perception varies between populations ( Sussman et al., 1989 ; Snyder and Rouse, 1995 ). According to Zhou and Yang (2020) , the generational gap in the adoption and use of digital media influences the generational gap in "knowing, believing, and doing" regarding health. However, previous research on health behavior mostly tended to consider respondents as a whole, neglecting the diverse effects on distinct populations. Therefore, it is impossible to generalize whether media exposure to risk information about the COVID-19 pandemic influences relevant preventive health behaviors across generations. Consequently, this study expects that the mediating role of the aforementioned intrinsic cognitive factors in media exposure and health behaviors varies between generations as shown in Figure 1 , and asks the following research questions: RQ1: Are there significant generational differences in COVID-19 media exposure? RQ2: Are there significant generational differences in COVID-19-preventive health behaviors? RQ3: Are the mediating roles of intrinsic cognitive factors (perceived severity, perceived susceptibility, self-efficacy, response efficacy) in media exposure and health behaviors moderated varies between generations? Figure 1 The Moderated mediation model to test the influence of generation on the mediated relationship between media exposure and health behaviors. 3. Method 3.1. Participants and procedures From June 28 to July 4, 2020, we conducted a survey using the Tencent questionnaire platform 1 to evaluate the hypotheses. The total sample consisted of 857 Chinese citizens. In the pre-test phase, ambiguous and difficult-to-understand questions were altered based on audience comments. In addition, it is important to note that people's psychological cognition and health behaviors fluctuate at various pandemic stages. When the questionnaire was issued, the pandemic in China had entered a lull. A June outbreak in Beijing raised anxiety, but the situation is again under control. Wenhong Zhang stated in an interview on July 9 that, based on the epidemiological history, the occasional confirmed case is typical and does not result in a rapid spread. In terms of the procedures, First, an independent sample t-test was adopted for analyzing the health behaviors and media exposure of the young and Mesozoic generations. We then test the association between variables using multiple regression analysis. In addition, to verify the hypotheses proposed, we built a moderated mediation model. an indirect effects analysis was performed with Hayes's (2009) method, testing standard errors via bootstrapping using Preacher and Hayes's SPSS macro. And finally, the moderating effect of generations, for both paths of mediating effects, is examined utilizing model 58 in PROCESS. The general characteristics of the study participants are shown in Table 1 . Males made up 47.3% of the sample (405) while females made up 52.7% (452). The majority (73.3%) lived in urban regions, with 71 (8.3%) in junior high school or lower, 149 (17.4%) in high school and technical secondary school, 232 (27.1%) in college, 39.3% (337) having earned a university degree, and others with master's and doctoral degrees. Participants were questioned about any recently confirmed instances in their home. 28% of respondents indicated yes. Table 1 Descriptive statistical analysis of samples. Category Variable N (%) Gender Male 405 47.3 Female 452 52.7 Total 857 100 Education level Junior high school or lower 71 8.3 High school, technical secondary school 149 17.4 College 232 27.1 Undergraduate 337 39.3 Postgraduate 68 7.9 Total 857 100 Residence Urban 628 73.3 Rural 229 26.7 Total 857 100 Exist any newly confirmed cases in your region? Yes 247 28.8 No 610 71.2 Total 857 100 3.2. Measurements Media exposure: frequency of access to news about the COVID-19 pandemic and extensity of news messages accessed from the COVID-19 pandemic ( Li, 2018 ). In accordance with Li (2018) , the extensity of media exposure during a pandemic was determined by how comprehensively one accessed the following news messages: (a) international pandemic situation; (b) domestic pandemic situation; (c) the severe impact of the pandemic (e.g., on individuals, regions, and countries); (d) government prevention and control measures; and (e) knowledge of pandemic prevention and popularization ( α = 0.819). The frequency of media exposure was measured by the number of times individuals accessed news about the COVID-19 pandemic via the following media channels: (a) Channels of mass communication; (b) Interpersonal channels; (c) Organizational channels; and (d) Social media channels ( α = 0.734). The frequency and extensity of media exposure were measured using a 5-point Likert scale (1 = never, 5 = frequently). After calculating the scale's weight by principal component analysis, the total score was then determined. Threat appraisal and Coping appraisal: Refer to the scale created and validated by Witte (1994) and use principal component analysis to derive factors for 12 items. There was a total of four components, the KMO value was 0.763, Bartlett's sphericity test level was 0.000, and the explainable variance was 70.75%. The four factors are as follows: perceived susceptibility, a total of three items, including "I am at risk of contracting Covid-19" ( α = 0.897); perceived severity, a total of three items, including "I believe once I have Covid-19 it may be life-threatening" ( α = 0.709); self-efficacy, a total of two items, including "I think my physical fitness can resist the virus" ( α = 0.674); response efficacy, a total four items in all, including "I believe wearing masks and engaging in other preventive actions can effectively contain the pandemic" ( α = 0.788). Health behaviors: During the pandemic, the media promotes preventative health behaviors including wearing masks, frequent hand washing, frequent disinfection, and avoiding gatherings. After the incident, some experts reiterated the significance of using public chopsticks or serving chopsticks. In addition, the media widely publicized the advantages of using public chopsticks. Respondents scored their self-assessment on preventive behavior measures, such as wearing masks, washing hands, disinfecting furnishings or workspaces, avoiding gathering activities, and utilizing public chopsticks (1–5 points for each item, α = 0.819). Generation is the central variable in our investigation. The division of generations occurs in various ways. This study refers fully to Xue et al.'s (2018) practice of dividing generations based on variations in media use and the practice of separating generations based on differences in preventive behaviors ( Kim and Crimmins, 2020 ), dividing the interviewees into two generations: the young generation, inhabitants under the age of 34, and the Mesozoic generation, residents between the ages of 35 and 55. Due to the limits of online questionnaires, it is not possible to collect data on a large number of inhabitants beyond the age of 55. Hence this study focuses on the young generation (18–34) and Mesozoic generation (35–55). 3.1. Participants and procedures From June 28 to July 4, 2020, we conducted a survey using the Tencent questionnaire platform 1 to evaluate the hypotheses. The total sample consisted of 857 Chinese citizens. In the pre-test phase, ambiguous and difficult-to-understand questions were altered based on audience comments. In addition, it is important to note that people's psychological cognition and health behaviors fluctuate at various pandemic stages. When the questionnaire was issued, the pandemic in China had entered a lull. A June outbreak in Beijing raised anxiety, but the situation is again under control. Wenhong Zhang stated in an interview on July 9 that, based on the epidemiological history, the occasional confirmed case is typical and does not result in a rapid spread. In terms of the procedures, First, an independent sample t-test was adopted for analyzing the health behaviors and media exposure of the young and Mesozoic generations. We then test the association between variables using multiple regression analysis. In addition, to verify the hypotheses proposed, we built a moderated mediation model. an indirect effects analysis was performed with Hayes's (2009) method, testing standard errors via bootstrapping using Preacher and Hayes's SPSS macro. And finally, the moderating effect of generations, for both paths of mediating effects, is examined utilizing model 58 in PROCESS. The general characteristics of the study participants are shown in Table 1 . Males made up 47.3% of the sample (405) while females made up 52.7% (452). The majority (73.3%) lived in urban regions, with 71 (8.3%) in junior high school or lower, 149 (17.4%) in high school and technical secondary school, 232 (27.1%) in college, 39.3% (337) having earned a university degree, and others with master's and doctoral degrees. Participants were questioned about any recently confirmed instances in their home. 28% of respondents indicated yes. Table 1 Descriptive statistical analysis of samples. Category Variable N (%) Gender Male 405 47.3 Female 452 52.7 Total 857 100 Education level Junior high school or lower 71 8.3 High school, technical secondary school 149 17.4 College 232 27.1 Undergraduate 337 39.3 Postgraduate 68 7.9 Total 857 100 Residence Urban 628 73.3 Rural 229 26.7 Total 857 100 Exist any newly confirmed cases in your region? Yes 247 28.8 No 610 71.2 Total 857 100 3.2. Measurements Media exposure: frequency of access to news about the COVID-19 pandemic and extensity of news messages accessed from the COVID-19 pandemic ( Li, 2018 ). In accordance with Li (2018) , the extensity of media exposure during a pandemic was determined by how comprehensively one accessed the following news messages: (a) international pandemic situation; (b) domestic pandemic situation; (c) the severe impact of the pandemic (e.g., on individuals, regions, and countries); (d) government prevention and control measures; and (e) knowledge of pandemic prevention and popularization ( α = 0.819). The frequency of media exposure was measured by the number of times individuals accessed news about the COVID-19 pandemic via the following media channels: (a) Channels of mass communication; (b) Interpersonal channels; (c) Organizational channels; and (d) Social media channels ( α = 0.734). The frequency and extensity of media exposure were measured using a 5-point Likert scale (1 = never, 5 = frequently). After calculating the scale's weight by principal component analysis, the total score was then determined. Threat appraisal and Coping appraisal: Refer to the scale created and validated by Witte (1994) and use principal component analysis to derive factors for 12 items. There was a total of four components, the KMO value was 0.763, Bartlett's sphericity test level was 0.000, and the explainable variance was 70.75%. The four factors are as follows: perceived susceptibility, a total of three items, including "I am at risk of contracting Covid-19" ( α = 0.897); perceived severity, a total of three items, including "I believe once I have Covid-19 it may be life-threatening" ( α = 0.709); self-efficacy, a total of two items, including "I think my physical fitness can resist the virus" ( α = 0.674); response efficacy, a total four items in all, including "I believe wearing masks and engaging in other preventive actions can effectively contain the pandemic" ( α = 0.788). Health behaviors: During the pandemic, the media promotes preventative health behaviors including wearing masks, frequent hand washing, frequent disinfection, and avoiding gatherings. After the incident, some experts reiterated the significance of using public chopsticks or serving chopsticks. In addition, the media widely publicized the advantages of using public chopsticks. Respondents scored their self-assessment on preventive behavior measures, such as wearing masks, washing hands, disinfecting furnishings or workspaces, avoiding gathering activities, and utilizing public chopsticks (1–5 points for each item, α = 0.819). Generation is the central variable in our investigation. The division of generations occurs in various ways. This study refers fully to Xue et al.'s (2018) practice of dividing generations based on variations in media use and the practice of separating generations based on differences in preventive behaviors ( Kim and Crimmins, 2020 ), dividing the interviewees into two generations: the young generation, inhabitants under the age of 34, and the Mesozoic generation, residents between the ages of 35 and 55. Due to the limits of online questionnaires, it is not possible to collect data on a large number of inhabitants beyond the age of 55. Hence this study focuses on the young generation (18–34) and Mesozoic generation (35–55). 4. Results 4.1. Descriptive statistics and variance analysis Table 2 reveals that the content of media exposure ( M = 4.16; SD = 0.68) is extensive and the frequency of media exposure is high, indicating that people continue to pay close attention to the COVID-19 pandemic during the calm phase. In addition, public health behaviors have a high score ( M = 4.11; SD = 0.80), which demonstrates their voluntary adherence to healthy behavior norms. Moreover, response efficacy ( M = 4.25; SD = 0.73) was the highest perception of the pandemic, followed by perceived severity ( M = 3.62; SD = 0.97), self-efficacy ( M = 3.33; SD = 0.97) and perceived susceptibility ( M = 1.84; SD = 1.01). With the pandemic effectively under control, the number of confirmed cases in all but a few regions have been reduced to zero. Therefore, the perceived susceptibility of individuals is not high. And The analysis of correlation between variables also gives conditions for further regression and mediation analyses. According to Table 2 , in addition to perceived susceptibility, perceived severity, self-efficacy, and response efficacy are positively related to the frequency ( r = 0.18; r = 0.44; r = 0.36) and the extensity ( r = 0.27; r = 0.20; r = 0.42) of media exposure and health behaviors ( r = 0.23; r = 0.23; r = 0.47). However, there is a negative correlation between perceived susceptibility and self-efficacy ( r = −0.07), response efficacy ( r = −0.07), which will be discussed further in the subsequent analysis. Table 2 Mean value, standard deviation and correlation coefficient of each variable. Variables M SD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1. Frequency 3.88 0.74 / 0.56 ** 0.30 ** −0.17 0.18 ** 0.18 ** 0.36 ** 0.12 0.44 −0.52 −0.03 2. Extensity 4.16 0.68 / 0.41 ** 0.03 0.27 ** 0.20 ** 0.42 ** 0.66 0.38 −0.14 ** −0.04 3. Behaviors 4.11 0.80 / −0.06 0.23 ** 0.23 ** 0.47 ** 0.95 ** −0.04 −0.05 −0.03 4. Susceptibility 1.84 1.01 / 0.31 ** −0.07 * −0.07 * −0.07 * −0.05 −0.06 −0.74 * 5. Severity 3.62 0.97 / −0.05 0.32 ** −0.01 −0.08 * −0.05 −0.05 6. Self-efficacy 3.33 0.97 / 0.28 ** 0.06 0.04 −0.11 ** −0.02 7. Response efficacy 4.25 0.73 / 0.02 0.05 −0.10 ** 0.02 8. Gender / / / −0.04 −0.04 −0.02 9. Education level / / / −0.21 ** −0.19 ** 10. Residence / / / 0.15 ** 11. Regional risk / / / * p < 0.05, ** p < 0.01. The independent sample t -tests were then used to assess the generational differences in media exposure and health behaviors between the young and Mesozoic generations. Regarding media exposure frequency, there were no discernible changes between the two generations. Specifically, as indicated in Table 3 , there is a significant difference between the Mesozoic and young generations in terms of interpersonal media exposure channels ( t (857) = −1.97, p = 0.05). Mesozoic exposure frequency on interpersonal channels ( M = 3.66; SD = 1.05) is substantially greater than that of young individuals ( M = 3.53; SD = 0.97). The average difference in score is −0.138 (d = −0.13), 95%CI = [−0.275.0.000]. Moreover, there is a significant difference between these two generations on organizational channels ( t (857) = −3.22, p = 0.001). The frequency of Mesozoic exposure to organizational channels ( M = 3.62; SD = 1.12) is substantially more than that of the young ( M = 3.37; SD = 1.11). The average difference in score is −0.249 ( d = −0.22), 95 percent CI = [−0.401, –0.097]. And there is a substantial difference between the two generations in terms of media exposure intensity ( t (857) = −4.14, p < 0.001). The score of the Mesozoic public ( M = 4.27; SD = 0.68) is higher than that of the young ( M = 4.08; SD = 0.67), The average score difference is −0.19 ( d = −0.28). 95%CI = [−0.287, –0.102]. During the pandemic pause, the Mesozoic generation was substantially more interested in pandemic-related news than the young generation. Table 3 An analysis of differences in media exposure between generations. Young generation Mesozoic generation Sig. Mass communication channels 4.22 ± 0.93 4.25 ± 0.89 0.64 Interpersonal channels 3.53 ± 0.97 3.66 ± 1.05 0.05 Organizational channels 3.37 ± 1.11 3.62 ± 1.12 0.001 Social media channels 4.28 ± 0.84 4.19 ± 0.95 0.13 In addition, the results reveal noteworthy changes in health behaviors between the two generations ( t (777.95) = −2.08, p = 0.004). The behavior score of the Mesozoic ( M = 4.24; SD = 0.72) is significantly higher than that of the young ( M = 4.09; SD = 0.79) The average difference in scores is −0.15 ( d = −0.20). 95% CI = [−0.283, –0.070]. Specifically, as demonstrated in Table 4 , the Mesozoic outperformed the young regarding frequent hand washing, avoidance of gathering activities, and use of public chopsticks. This conclusion is opposite to the mockery made at the onset of the pandemic by the younger generation, who complained that their parents and elders were unwilling to take preventative precautions. It also suggests that there are still generational differences in health behaviors during the relative calm after the pandemic. Table 4 An analysis of differences in health behaviors between generations. Young generation Mesozoic generation Sig. Wearing masks 4.22 ± 0.93 4.25 ± 0.89 0.46 Frequent hand washing 4.33 ± 0.87 4.53 ± 0.76 0.001 Frequent disinfection 3.86 ± 1.13 3.96 ± 1.06 0.18 Avoiding gathering activities 4.21 ± 0.96 4.38 ± 0.88 0.008 Using public chopsticks 3.77 ± 1.22 4.01 ± 1.14 0.003 4.2. The mediating effects of cognitive factors The first four hypotheses predicted that health behaviors would be positively related to perceived severity, perceived susceptibility, self-efficacy, and response efficacy. These hypotheses were tested using multiple linear regression while controlling for participant gender, education level, area, and regional risk. An F-test of the model, F (8, 948) = 36.17, p < 0.001, Adjusted R 2 = 0.247 was significant. See Table 5 for full information. Perceived severity ( β = 0.12, p < 0.001), self-efficacy ( β = 0.12, p < 0.001) and response efficacy ( β = 0.40, p < 0.001) all exhibit substantial beneficial effects on health behaviors, however perceived susceptibility has a negative influence on health behaviors ( β = −0.07, p = 0.039 < 0.05). Thus, hypotheses 2, 3, and 4 are supported, while hypothesis 1 is not. Regarding the control variables, multiple linear regression analysis reveals that gender substantially influences health behaviors ( β = 0.15, p = 0.015 < 0.05). This indicates that women's health behaviors are superior to men's. In addition, education level has a marginally significant negative effect on health behaviors ( β = −0.05, p = 0.072), meaning that the health behaviors performance of the public with a higher education background is not as excellent as that of the public with a lower education background. Lastly, the data indicates that regional risk and whether a location is urban or rural have no meaningful effect on health behaviors. Table 5 Results of multivariate linear analysis for perceived susceptibility, perceived severity, self-efficacy and response efficacy on preventative health behaviors. Variables β SE t p Adjusted R 2 Regional risk −0.09 0.07 −1.35 0.176 Area 0.01 0.07 0.10 0.921 Education level −0.05 0.03 −1.80 0.072 Gender 0.15 0.06 2.45 0.015 Perceived susceptibility −0.07 0.03 −2.06 0.039 Perceived severity 0.12 0.03 3.59 <0.001 Self-efficacy 0.12 0.03 3.71 <0.001 Response efficacy 0.40 0.03 11.75 <0.001 0.247 The figures are standard coefficients. Furthermore, bootstrapped confidence intervals (at the 0.05 level with 1,000 re-samples) were examined to check the indirect effect. If the confidence interval does not contain zero, it indicates a significant indirect effect. Indirect effects of media exposure and health behavior accounted for 47%. The results showed that media exposure indirectly influenced health behaviors by perceived severity (H6; 95% CI [0.002, 0.028]), self-efficacy (H7; 95% CI [0.01, 0.03]), response efficacy (H8; 95% CI [0.08, 0.14]), but not by perceived susceptibility (H5). In addition, the path represented by H8 has the most substantial mediation impact. Thus, through increasing response efficacy, media exposure can better improve the health behaviors of individuals ( Table 6 ). Table 6 Testing the mediation effect of media exposure on health behavior through response efficacy, self-efficacy, perceived severity, and perceived susceptibility. Effect BootSE BootLLCI BootULCI Relative effect ratio TOTAL 0.14 0.02 0.11 0.18 47% A1 0.11 0.02 0.08 0.14 37% A2 0.02 0.01 0.01 0.03 7% A3 0.01 0.01 0.002 0.028 2% A4 0.001 0.002 −0.002 0.005 (C1 = A1–A2) 0.09 0.02 0.06 0.13 (C1 = A1–A3) 0.09 0.02 0.06 0.12 The figures are standard coefficients; A1 = response efficacy; A2 = self-efficacy; A3 = perceived severity; A4 = perceived susceptibility. 4.3. The moderating effect of generation Model 58 in PROCESS was utilized to evaluate the moderated mediation model to answer RQ3. The findings revealed that generation moderated both of the routes represented by H8. The results are shown in Table 7 . Interaction of media exposure and generation predicts perceived susceptibility, β = −0.10, SE = 0.05, p = 0.05. Interaction between perceived susceptibility and generation predicts health behaviors considerably, β = −0.13, SE = 0.06, p < 0.05. The mediated conditional effect on perceived susceptibility was negative for the Mesozoic generation, β = −0.09, SE = 0.04, 95%CI [−0.17, −0.004], whereas it was not significant for the young generation. Additionally, the conditional effect of perceived susceptibility on health behavior was negative for the Mesozoic generation, β = −0.15, SE = 0.05, 95%CI [−0.24, −0.05], but insignificant for the young generation. Table 7 Moderated mediation analysis. Predictors Mediator = perceived susceptibility DV = health behaviors β SE β SE Intercept −0.05 0.11 −0.02 0.09 Response efficacy −0.18 *** 0.04 0.32 *** 0.03 Self-efficacy 0.0001 0.03 0.10 *** 0.03 Perceived severity 0.38 *** 0.03 0.11 *** 0.03 Media exposure 0.11 0.08 0.15 *** 0.03 Generation 0.03 0.07 0.07 0.06 Media exposure * Generation −0.10 * 0.05 – – Perceived susceptibility – – 0.12 0.09 Perceived susceptibility * Generation – – −0.13 * 0.06 Direct and indirect effects Coefficient 95% CI Coefficient 95% CI Conditional effects Young generation 0.01 −0.06, 0.08 −0.01 −0.09, 0.06 Mesozoic generation −0.09 * −0.17, −0.004 −0.15 ** −0.24, −0.05 Conditional indirect effects Young generation −0.0002 −0.003, 0.003 Mesozoic generation 0.01 0.0009, 0.0284 Index of moderated mediation 0.01 0.0005, 0.0286 Coefficients presented are standardized estimates. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Moreover, the indices of moderated mediation differed from zero for health behaviors (coefficients were 0.01). This indicated that the indirect effects of media exposure through perceived susceptibility on health behaviors differed for young and Mesozoic generations. For the Mesozoic generation, the indirect effect of media exposure on health behavior was positive, coefficient = 0.01, SE = 0.01, 95%CI [0.0009, 0.0284]. However, For the young generation, the indirect effect of media exposure on health behavior was insignificant. The above reflects the differential effect of the applicability of protection motivation theory among generations in public health events. 4.1. Descriptive statistics and variance analysis Table 2 reveals that the content of media exposure ( M = 4.16; SD = 0.68) is extensive and the frequency of media exposure is high, indicating that people continue to pay close attention to the COVID-19 pandemic during the calm phase. In addition, public health behaviors have a high score ( M = 4.11; SD = 0.80), which demonstrates their voluntary adherence to healthy behavior norms. Moreover, response efficacy ( M = 4.25; SD = 0.73) was the highest perception of the pandemic, followed by perceived severity ( M = 3.62; SD = 0.97), self-efficacy ( M = 3.33; SD = 0.97) and perceived susceptibility ( M = 1.84; SD = 1.01). With the pandemic effectively under control, the number of confirmed cases in all but a few regions have been reduced to zero. Therefore, the perceived susceptibility of individuals is not high. And The analysis of correlation between variables also gives conditions for further regression and mediation analyses. According to Table 2 , in addition to perceived susceptibility, perceived severity, self-efficacy, and response efficacy are positively related to the frequency ( r = 0.18; r = 0.44; r = 0.36) and the extensity ( r = 0.27; r = 0.20; r = 0.42) of media exposure and health behaviors ( r = 0.23; r = 0.23; r = 0.47). However, there is a negative correlation between perceived susceptibility and self-efficacy ( r = −0.07), response efficacy ( r = −0.07), which will be discussed further in the subsequent analysis. Table 2 Mean value, standard deviation and correlation coefficient of each variable. Variables M SD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1. Frequency 3.88 0.74 / 0.56 ** 0.30 ** −0.17 0.18 ** 0.18 ** 0.36 ** 0.12 0.44 −0.52 −0.03 2. Extensity 4.16 0.68 / 0.41 ** 0.03 0.27 ** 0.20 ** 0.42 ** 0.66 0.38 −0.14 ** −0.04 3. Behaviors 4.11 0.80 / −0.06 0.23 ** 0.23 ** 0.47 ** 0.95 ** −0.04 −0.05 −0.03 4. Susceptibility 1.84 1.01 / 0.31 ** −0.07 * −0.07 * −0.07 * −0.05 −0.06 −0.74 * 5. Severity 3.62 0.97 / −0.05 0.32 ** −0.01 −0.08 * −0.05 −0.05 6. Self-efficacy 3.33 0.97 / 0.28 ** 0.06 0.04 −0.11 ** −0.02 7. Response efficacy 4.25 0.73 / 0.02 0.05 −0.10 ** 0.02 8. Gender / / / −0.04 −0.04 −0.02 9. Education level / / / −0.21 ** −0.19 ** 10. Residence / / / 0.15 ** 11. Regional risk / / / * p < 0.05, ** p < 0.01. The independent sample t -tests were then used to assess the generational differences in media exposure and health behaviors between the young and Mesozoic generations. Regarding media exposure frequency, there were no discernible changes between the two generations. Specifically, as indicated in Table 3 , there is a significant difference between the Mesozoic and young generations in terms of interpersonal media exposure channels ( t (857) = −1.97, p = 0.05). Mesozoic exposure frequency on interpersonal channels ( M = 3.66; SD = 1.05) is substantially greater than that of young individuals ( M = 3.53; SD = 0.97). The average difference in score is −0.138 (d = −0.13), 95%CI = [−0.275.0.000]. Moreover, there is a significant difference between these two generations on organizational channels ( t (857) = −3.22, p = 0.001). The frequency of Mesozoic exposure to organizational channels ( M = 3.62; SD = 1.12) is substantially more than that of the young ( M = 3.37; SD = 1.11). The average difference in score is −0.249 ( d = −0.22), 95 percent CI = [−0.401, –0.097]. And there is a substantial difference between the two generations in terms of media exposure intensity ( t (857) = −4.14, p < 0.001). The score of the Mesozoic public ( M = 4.27; SD = 0.68) is higher than that of the young ( M = 4.08; SD = 0.67), The average score difference is −0.19 ( d = −0.28). 95%CI = [−0.287, –0.102]. During the pandemic pause, the Mesozoic generation was substantially more interested in pandemic-related news than the young generation. Table 3 An analysis of differences in media exposure between generations. Young generation Mesozoic generation Sig. Mass communication channels 4.22 ± 0.93 4.25 ± 0.89 0.64 Interpersonal channels 3.53 ± 0.97 3.66 ± 1.05 0.05 Organizational channels 3.37 ± 1.11 3.62 ± 1.12 0.001 Social media channels 4.28 ± 0.84 4.19 ± 0.95 0.13 In addition, the results reveal noteworthy changes in health behaviors between the two generations ( t (777.95) = −2.08, p = 0.004). The behavior score of the Mesozoic ( M = 4.24; SD = 0.72) is significantly higher than that of the young ( M = 4.09; SD = 0.79) The average difference in scores is −0.15 ( d = −0.20). 95% CI = [−0.283, –0.070]. Specifically, as demonstrated in Table 4 , the Mesozoic outperformed the young regarding frequent hand washing, avoidance of gathering activities, and use of public chopsticks. This conclusion is opposite to the mockery made at the onset of the pandemic by the younger generation, who complained that their parents and elders were unwilling to take preventative precautions. It also suggests that there are still generational differences in health behaviors during the relative calm after the pandemic. Table 4 An analysis of differences in health behaviors between generations. Young generation Mesozoic generation Sig. Wearing masks 4.22 ± 0.93 4.25 ± 0.89 0.46 Frequent hand washing 4.33 ± 0.87 4.53 ± 0.76 0.001 Frequent disinfection 3.86 ± 1.13 3.96 ± 1.06 0.18 Avoiding gathering activities 4.21 ± 0.96 4.38 ± 0.88 0.008 Using public chopsticks 3.77 ± 1.22 4.01 ± 1.14 0.003 4.2. The mediating effects of cognitive factors The first four hypotheses predicted that health behaviors would be positively related to perceived severity, perceived susceptibility, self-efficacy, and response efficacy. These hypotheses were tested using multiple linear regression while controlling for participant gender, education level, area, and regional risk. An F-test of the model, F (8, 948) = 36.17, p < 0.001, Adjusted R 2 = 0.247 was significant. See Table 5 for full information. Perceived severity ( β = 0.12, p < 0.001), self-efficacy ( β = 0.12, p < 0.001) and response efficacy ( β = 0.40, p < 0.001) all exhibit substantial beneficial effects on health behaviors, however perceived susceptibility has a negative influence on health behaviors ( β = −0.07, p = 0.039 < 0.05). Thus, hypotheses 2, 3, and 4 are supported, while hypothesis 1 is not. Regarding the control variables, multiple linear regression analysis reveals that gender substantially influences health behaviors ( β = 0.15, p = 0.015 < 0.05). This indicates that women's health behaviors are superior to men's. In addition, education level has a marginally significant negative effect on health behaviors ( β = −0.05, p = 0.072), meaning that the health behaviors performance of the public with a higher education background is not as excellent as that of the public with a lower education background. Lastly, the data indicates that regional risk and whether a location is urban or rural have no meaningful effect on health behaviors. Table 5 Results of multivariate linear analysis for perceived susceptibility, perceived severity, self-efficacy and response efficacy on preventative health behaviors. Variables β SE t p Adjusted R 2 Regional risk −0.09 0.07 −1.35 0.176 Area 0.01 0.07 0.10 0.921 Education level −0.05 0.03 −1.80 0.072 Gender 0.15 0.06 2.45 0.015 Perceived susceptibility −0.07 0.03 −2.06 0.039 Perceived severity 0.12 0.03 3.59 <0.001 Self-efficacy 0.12 0.03 3.71 <0.001 Response efficacy 0.40 0.03 11.75 <0.001 0.247 The figures are standard coefficients. Furthermore, bootstrapped confidence intervals (at the 0.05 level with 1,000 re-samples) were examined to check the indirect effect. If the confidence interval does not contain zero, it indicates a significant indirect effect. Indirect effects of media exposure and health behavior accounted for 47%. The results showed that media exposure indirectly influenced health behaviors by perceived severity (H6; 95% CI [0.002, 0.028]), self-efficacy (H7; 95% CI [0.01, 0.03]), response efficacy (H8; 95% CI [0.08, 0.14]), but not by perceived susceptibility (H5). In addition, the path represented by H8 has the most substantial mediation impact. Thus, through increasing response efficacy, media exposure can better improve the health behaviors of individuals ( Table 6 ). Table 6 Testing the mediation effect of media exposure on health behavior through response efficacy, self-efficacy, perceived severity, and perceived susceptibility. Effect BootSE BootLLCI BootULCI Relative effect ratio TOTAL 0.14 0.02 0.11 0.18 47% A1 0.11 0.02 0.08 0.14 37% A2 0.02 0.01 0.01 0.03 7% A3 0.01 0.01 0.002 0.028 2% A4 0.001 0.002 −0.002 0.005 (C1 = A1–A2) 0.09 0.02 0.06 0.13 (C1 = A1–A3) 0.09 0.02 0.06 0.12 The figures are standard coefficients; A1 = response efficacy; A2 = self-efficacy; A3 = perceived severity; A4 = perceived susceptibility. 4.3. The moderating effect of generation Model 58 in PROCESS was utilized to evaluate the moderated mediation model to answer RQ3. The findings revealed that generation moderated both of the routes represented by H8. The results are shown in Table 7 . Interaction of media exposure and generation predicts perceived susceptibility, β = −0.10, SE = 0.05, p = 0.05. Interaction between perceived susceptibility and generation predicts health behaviors considerably, β = −0.13, SE = 0.06, p < 0.05. The mediated conditional effect on perceived susceptibility was negative for the Mesozoic generation, β = −0.09, SE = 0.04, 95%CI [−0.17, −0.004], whereas it was not significant for the young generation. Additionally, the conditional effect of perceived susceptibility on health behavior was negative for the Mesozoic generation, β = −0.15, SE = 0.05, 95%CI [−0.24, −0.05], but insignificant for the young generation. Table 7 Moderated mediation analysis. Predictors Mediator = perceived susceptibility DV = health behaviors β SE β SE Intercept −0.05 0.11 −0.02 0.09 Response efficacy −0.18 *** 0.04 0.32 *** 0.03 Self-efficacy 0.0001 0.03 0.10 *** 0.03 Perceived severity 0.38 *** 0.03 0.11 *** 0.03 Media exposure 0.11 0.08 0.15 *** 0.03 Generation 0.03 0.07 0.07 0.06 Media exposure * Generation −0.10 * 0.05 – – Perceived susceptibility – – 0.12 0.09 Perceived susceptibility * Generation – – −0.13 * 0.06 Direct and indirect effects Coefficient 95% CI Coefficient 95% CI Conditional effects Young generation 0.01 −0.06, 0.08 −0.01 −0.09, 0.06 Mesozoic generation −0.09 * −0.17, −0.004 −0.15 ** −0.24, −0.05 Conditional indirect effects Young generation −0.0002 −0.003, 0.003 Mesozoic generation 0.01 0.0009, 0.0284 Index of moderated mediation 0.01 0.0005, 0.0286 Coefficients presented are standardized estimates. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Moreover, the indices of moderated mediation differed from zero for health behaviors (coefficients were 0.01). This indicated that the indirect effects of media exposure through perceived susceptibility on health behaviors differed for young and Mesozoic generations. For the Mesozoic generation, the indirect effect of media exposure on health behavior was positive, coefficient = 0.01, SE = 0.01, 95%CI [0.0009, 0.0284]. However, For the young generation, the indirect effect of media exposure on health behavior was insignificant. The above reflects the differential effect of the applicability of protection motivation theory among generations in public health events. 5. Conclusion and discussion Firstly, for RQ1 and RQ2 provided in this study, the independent sample t -test results revealed that the young and Mesozoic had substantial generational differences in media exposure extensity and health behaviors. After the virus is controlled, the young generation's media attention swiftly moves to other issues, while the Mesozoic continues to pay close attention to pandemic-related information. In addition, the Mesozoic generation is more likely to get the relevant information through organizational and interpersonal channels. Therefore, they are more likely to use knowledge about the pandemic in dinner conversations. In addition, research has demonstrated that interpersonal pathways are crucial for encouraging beneficial behavior changes ( Yang and Chao, 2021 ). As a result of the Mesozoic's heightened media attention, their health behaviors were superior to those of the young. As wearing a mask is a mandatory code of conduct in many public places, there is no evident age difference in this regard. However, there are significant generational differences in avoiding gathering activities, washing hands and disinfection, and using public chopsticks. In addition, how can it be explained that young people will complain online about their parents and elders not adopting the appropriate preventive measures in the early stages of the pandemic, when the virus is very contagious, in contrast to the study's findings? On the one hand, generational differences in health behaviors may show up in a variety of ways depending on the stage of the outbreak. However, as was already indicated, research has shown that during the pandemic, young people expressed their thoughts on contentious subjects more frequently online. The Mesozoic generation may suffer from widespread aphasia, and conclusions drawn from Internet public opinion may not be accurate reflections of reality. Then, based on social cognitive theory and protection motivation theory, this research examines the impact of social-cognitive predictors on health behaviors and then develops a mediating model of media exposure on health behaviors. Multiple regression analysis indicated that perceived severity (H2), self-efficacy (H3), and response efficacy (H4) all had favorable effects on health behaviors, but contrary to expectations, perceived susceptibility (H1) had an adverse impact on health behaviors. And media exposure can influence health behaviors via the mediating effects of perceived severity (H6), self-efficacy (H7), and response efficacy (H8), but not via perceived susceptibility (H5), of which the path (H8) is the most influential. This indicates that media exposure is most effective at influencing health behaviors by improving their response efficacy during flattening periods. In addition, for RQ3, moderated mediation analysis revealed that generation moderates the indirect influence of media exposure on health behaviors via perceived susceptibility. Media exposure had a positive indirect effect on the health behavior of the Mesozoic generation. However, this indirect effect was not substantial for the young population. Specifically, media exposure adversely affected the Mesozoic's perceived susceptibility, which has a negative effect on their health behaviors. Thus, media exposure positively affects Mesozoic health behaviors by reducing their perceived susceptibility. At the time of the study, the pandemic in China had reached a plateau, and except for sporadic confirmed cases, most areas had been cleared of confirmed cases. Therefore, the media is no longer a source of risk information but instead emphasizes the pandemic's positive status and prevention knowledge. During this period, the Mesozoic continues to pay close attention to information on the pandemic, thereby decreasing their susceptibility. What 's more, the relationship between risk perception and health behaviors is complex. Previous studies have inconsistent conclusions on the effects of perceived susceptibility and perceived severity on health behaviors. Both negative and positive associations were found in the studies investigating the relationship between risk perceptions and behaviors. Through meta-analysis, the researchers believe that a considerable part of these inconsistent conclusions is methodological issues, such as replacing behavior with behavior intentions, not setting risk conditions, etc. ( Brewer et al., 2007 ). Some experts have also indicated that optimism bias influences respondents' evaluations of health threats ( Weinstein, 1987 ). The optimism bias may lessen the perceived need to avoid unfavorable outcomes by engaging in healthy practices ( Larsman et al., 2012 ). Druică et al. (2020) define optimism bias as the tendency to estimate a lower likelihood of experiencing negative health events than others. COVID-19 is a pandemic with a long incubation period, highly contagious, and highly dependent on crowd interaction for transmission, making all members of society universally susceptible compared to other health topics such as skin cancer ( Yi et al., 2020 ). However, the perceived susceptibility measure in the study centered on the evaluation of oneself being infected with the virus, and the findings revealed a low perceived susceptibility ( M = 1.84; SD = 1.01). And new research has confirmed the optimism bias of the COVID-19 instance in China ( Today.uconn.edu, 2020 ). In light of this, it is feasible to speculate that there is an optimism bias in the public's perception of the current risk. Both Druică et al. (2020) and Chowdhury et al. (2014) found that optimism bias increases with age. Hence, the effect of susceptibility on health behaviors may be more strongly adversely moderated by optimism bias in the Mesozoic generation, reducing their intention to engage in health behaviors. In addition, a multiple regression study revealed that education level has a marginally significant negative influence on health behaviors. And the variables' correlation analysis (shown in Table 2 ) revealed that education level was adversely associated with perceived severity. This indicates that those with higher levels of education are more hopeful about the pandemic situation in the country, hence decreasing their willingness to engage in health activities. A comparable study ( Zhang et al., 2020 ) also revealed that persons with relatively low levels of education exhibited increased anxiety and concern for themselves during the pandemic. This may have a convincing explanation according to the extended parallel process model. In line with protective motivation theory, the extended parallel process model validates the positive impacts of perceived severity, perceived susceptibility, self-efficacy, and response efficacy on health behaviors ( Witte and Allen, 2000 ). Nonetheless, it claims that individuals do not develop additional cognitive or affective responses when the perceived threat is low and that people's preventative behaviors are only driven when they perceive a sufficient level of threat in response to risk information. Furthermore, the implication of this study is that the development of health communication theory must take into account the different effects of generations and the disease-specific characteristics. Future study can build and enhance the existing theory by testing the applicability of each variable in specific situations. And when the current pandemic enters a lull and the Chinese government continues to stress the importance of maintaining healthy preventative behaviors, effective health communication is crucial. In this sense, we propose that positive information about the pandemic should be shared alongside risk information in order to heighten the public's risk perception and encourage preventive behaviors. Moreover, in future health communication, due to systematic differences between generations in terms of external environmental exposure and cognitive-psychological factors, risk communication should focus on refined and precise services, and differentiated measures should be taken for various groups in terms of media channels and media content. For instance, to persuade the Mesozoic generation, the interpersonal and organizational channels should be emphasized, whereas, for the young generation, government officials can use social media to widely disseminate information about the pandemic and adopt novel content forms to attract their attention. Since optimism bias is one of the primary barriers to engaging in risk reduction practices, future risk communication programs should explore ways to correct this misunderstanding. In conclusion, the main limitations of this article are reflected in: First, because of the use of cross-sectional data, the causal effect relationship cannot be adequately tested. Meanwhile, the actual behavior data cannot be obtained through self-assessment questionnaire. The behavior measurement in the questionnaire actually measures attitudes and concepts toward health behaviors. Additionally, due to the limitations of online surveys, it was impossible to pay attention to the old generation, that is, the public above 55, and only compared the Mesozoic and the young generation. As marginalized groups utilizing new media, their media exposure and health behaviors in public health events deserve consideration; Lastly, generation is a topic worthy of consideration, and explaining generational differences in health behavior due to media exposure is only one perspective. To attempt a fuller understanding of generational difference in health behavior, it will be important to do additional qualitative research on topics such as generational differences in culture. Some researchers suggest cultural differences may exist in the association between risk perception and health behavior ( Lau et al., 2010 ). Data availability statement The raw data supporting the conclusions of this article will be made available by the authors, without undue reservation. Author contributions RH contributed to the conception, data analysis, and manuscript writing of the study. JH contributed to parts of the conception, data analysis, and manuscript writing of the study. HZ contributed to the literature obtaining and analysis, manuscript writing, and performed the analysis with constructive discussions of the study. All authors contributed to the article and approved the submitted version. Funding This work was supported by National Social Science Foundation Art Project: Research on Creative Transformation and Innovative Development of Traditional Culture in Jiangnan. Project Approval Number: 20BH153. Conflict of interest The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest. Publisher's note All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2858080/

Anti-V3 Monoclonal Antibodies Display Broad Neutralizing Activities against Multiple HIV-1 Subtypes

Background The V3 loop of the HIV-1 envelope (Env) glycoprotein gp120 was identified as the "principal neutralizing domain" of HIV-1, but has been considered too variable to serve as a neutralizing antibody (Ab) target. Structural and immunochemical data suggest, however, that V3 contains conserved elements which explain its role in binding to virus co-receptors despite its sequence variability. Despite this evidence of V3 conservation, the ability of anti-V3 Abs to neutralize a significant proportion of HIV-1 isolates from different subtypes (clades) has remained controversial. Methods HIV-1 neutralization experiments were conducted in two independent laboratories to test human anti-V3 monoclonal Abs (mAbs) against pseudoviruses (psVs) expressing Envs of diverse HIV-1 subtypes from subjects with acute and chronic infections. Neutralization was defined by 50% inhibitory concentrations (IC 50 ), and was statistically assessed based on the area under the neutralization titration curves (AUC). Results Using AUC analyses, statistically significant neutralization was observed by ≥1 anti-V3 mAbs against 56/98 (57%) psVs expressing Envs of diverse subtypes, including subtypes A, AG, B, C and D. Even when the 10 Tier 1 psVs tested were excluded from the analysis, significant neutralization was detected by ≥1 anti-V3 mAbs against 46/88 (52%) psVs from diverse HIV-1 subtypes. Furthermore, 9/24 (37.5%) Tier 2 viruses from the clade B and C standard reference panels were neutralized by ≥1 anti-V3 mAbs. Each anti-V3 mAb tested was able to neutralize 28–42% of the psVs tested. By IC 50 criteria, 40/98 (41%) psVs were neutralized by ≥1 anti-V3 mAbs. Conclusions Using standard and new statistical methods of data analysis, 6/7 anti-V3 human mAbs displayed cross-clade neutralizing activity and revealed that a significant proportion of viruses can be neutralized by anti-V3 Abs. The new statistical method for analysis of neutralization data provides many advantages to previously used analyses. Background The V3 loop of the HIV-1 envelope (Env) glycoprotein gp120 was identified as the "principal neutralizing domain" of HIV-1, but has been considered too variable to serve as a neutralizing antibody (Ab) target. Structural and immunochemical data suggest, however, that V3 contains conserved elements which explain its role in binding to virus co-receptors despite its sequence variability. Despite this evidence of V3 conservation, the ability of anti-V3 Abs to neutralize a significant proportion of HIV-1 isolates from different subtypes (clades) has remained controversial. Methods HIV-1 neutralization experiments were conducted in two independent laboratories to test human anti-V3 monoclonal Abs (mAbs) against pseudoviruses (psVs) expressing Envs of diverse HIV-1 subtypes from subjects with acute and chronic infections. Neutralization was defined by 50% inhibitory concentrations (IC 50 ), and was statistically assessed based on the area under the neutralization titration curves (AUC). Results Using AUC analyses, statistically significant neutralization was observed by ≥1 anti-V3 mAbs against 56/98 (57%) psVs expressing Envs of diverse subtypes, including subtypes A, AG, B, C and D. Even when the 10 Tier 1 psVs tested were excluded from the analysis, significant neutralization was detected by ≥1 anti-V3 mAbs against 46/88 (52%) psVs from diverse HIV-1 subtypes. Furthermore, 9/24 (37.5%) Tier 2 viruses from the clade B and C standard reference panels were neutralized by ≥1 anti-V3 mAbs. Each anti-V3 mAb tested was able to neutralize 28–42% of the psVs tested. By IC 50 criteria, 40/98 (41%) psVs were neutralized by ≥1 anti-V3 mAbs. Conclusions Using standard and new statistical methods of data analysis, 6/7 anti-V3 human mAbs displayed cross-clade neutralizing activity and revealed that a significant proportion of viruses can be neutralized by anti-V3 Abs. The new statistical method for analysis of neutralization data provides many advantages to previously used analyses. Introduction Gp120, the surface subunit of the HIV-1 envelope (Env) glycoprotein, is a critical target for antibodies (Abs) that neutralize the virus and prevent infection (reviewed in [1] ). Gp120 is bound non-covalently to the transmembrane subunit gp41, and the two glycoproteins are expressed on the virion surface as heterotrimers. Gp120 serves as the virus attachment protein by binding to CD4 and the chemokine receptors CCR5 or CXCR4. Because of these crucial functions in the virus infectious process, it is logical that gp120 is a desired target for neutralizing Abs. However, gp120 displays astonishing agility in evading Ab neutralization [2] , [3] , [4] , [5] , [6] . Indeed, HIV-1 gp120 is notorious for its genetic and antigenic variability, while at the same time, its conserved regions are poorly immunogenic and/or are not accessible on the surface of the virion at all times [5] , [7] , [8] , [9] , [10] , [11] , [12] . Conserved Ab epitopes on gp120 have been identified based on their recognition by broadly neutralizing human mAbs (reviewed in [13] ). Not surprisingly, these epitopes are located in the Env regions critical for virus infectivity, which include the CD4-binding site and the chemokine-receptor binding site which encompasses the stem of the second variable (V2) loop, the third variable (V3) loop, and the bridging sheet [14] , [15] , [16] , [17] , [18] , [19] . Recent analyses of serum Abs from HIV-1+ subjects further confirm the importance of the epitopes in these receptor binding sites as targets of broadly neutralizing Abs [20] , [21] , [22] , [23] . The present study evaluates the breadth and potency of virus neutralization by mAbs specific for epitopes in the V3 loop. The V3 loop was identified in the late 1980s as the principle neutralizing domain of HIV-1 [24] , but was considered an inappropriate target for vaccines because this region, as its name indicates, is characterized by extreme sequence variability. This concept was supported by early studies showing that anti-V3 Abs raised in peptide-immunized goats and in HIV-1-infected chimpanzees were "type-specific", as they were restricted in their reactivity among a limited number of laboratory-adapted virus strains. [25] , [26] . Other studies further showed that V3 epitopes were cryptic or masked in many HIV-1 clinical isolates due to occlusion by glycans, the V1/V2 loops, and possibly other unidentified elements [9] , [27] , [28] , [29] . In contrast, however, several studies demonstrated that mAbs and polyclonal serum Abs against V3 can display significant degrees of cross-neutralization against viruses within a single subtype and among multiple subtypes [7] , [17] , [18] , [27] , [30] , [31] , [32] . Given the fact that V3 is a part of gp120 that interacts with the chemokine receptors [33] , [34] and that it determines CCR5 or CXCR4 usage [35] , [36] , [37] , [38] , V3 must retain conserved structural elements despite its sequence variation, and it must be exposed, at least transiently, to enable virus binding to the chemokine receptors. These features are likely to account for the ability of many anti-V3 Abs to recognize and neutralize diverse HIV-1 isolates. More recently, a variety of studies have demonstrated that V3 is a structurally conserved domain. Thus, crystallographic and NMR studies show conserved features of V3 when bound to several human anti-V3 mAbs [37] , [39] , [40] , [41] , [42] . These structural studies are consistent with the single structure available for V3 in the context of gp120 [43] , and they provide an explanation for how anti-V3 Abs can tolerate sequence changes in their epitopes, react immunochemically with a variety of V3 peptides and Env proteins, and display cross-clade neutralizing activity against primary isolates and pseudoviruses (psVs) [17] , [18] , [23] , [30] , [32] , [44] . Nevertheless, the proportion of diverse viruses which anti-V3 Abs can neutralize and their breadth and potency against viruses from the various HIV-1 subtypes (clades) and from patients at different stages of infection remain controversial. To address this issue in a comprehensive manner, HIV-1 neutralization experiments were conducted in two independent labs to test seven anti-V3 mAbs which were selected because they had previously been shown to display potent and cross-clade neutralizing activity [17] , [18] , [19] , [45] . These mAbs were tested against a panel of 98 pseudoviruses (psVs) expressing Envs of HIV-1 subtypes A, AG, B, C, and D from patients with acute and chronic HIV-1 infections. Positive neutralization was determined for each mAb/psV pair on the basis of the commonly used cut-off criterion, the 50% mAb inhibitory concentration (IC 50 ). In addition, a new statistically-based criterion was used which takes into account (a) the area under the mAb titration curve (AUC), (b) the slope of the titration curve, (c) the background neutralization from irrelevant control mAbs, and (d) the background from a control psV expressing Env from the amphotropic murine leukemia virus (aMLV). Materials and Methods Ethics Statement The study was approved by the IRB of New York University School of Medicine. All subjects gave written informed consent. Monoclonal antibodies The seven human anti-V3 mAbs examined in this study were developed using previously described cellular techniques [17] , [18] , [19] , [45] , [46] . In brief, Epstein-Barr virus transformed peripheral blood mononuclear cells from HIV-1-infected subjects producing V3-specific Abs were fused with the heteromyeloma SHM-D33, and the resulting hybridomas were cloned to monoclonality. Except for mAb 447-52D (designated here as 447) which was selected using a V3 MN peptide, the anti-V3 mAbs were selected using murine leukemia virus gp70-based fusion proteins (FPs) containing V3 loops from viruses of subtypes A or B [19] , [47] . These seven anti-V3 mAbs were selected from among >50 anti-V3 mAbs generated in our lab to represent the most potent and cross-reactive neutralizing anti-V3. Human mAbs specific for parvovirus B19 [48] or the anthrax protective antigen (PA) were used as negative controls. The anti-PA mAbs were produced by cellular methods from cells derived from two different volunteers who received an experimental vaccine consisting of recombinant PA antigen (Gorny et al., unpublished data). All mAbs were purified from culture supernatants by protein A or protein G chromatography. Table 1 summarizes the properties of the mAbs tested in this study. The 11 mAbs were sent to the laboratories where the functional assays were performed without any designation of their specificities. 10.1371/journal.pone.0010254.t001 Table 1 Characteristics of human mAbs used for this study. mAbs Specificity Isotype Subtype of the infecting virus Country of origin Reference 2191 V3 IgG1 λ B USA [19] 2219 V3 IgG1 λ B USA [19] 2557 V3 IgG1 λ CRF02_AG Cameroon [18] 2558 V3 IgG1 λ CRF02_AG Cameroon [18] 3074 V3 IgG1 λ CRF02_AG Cameroon [18] 3869 V3 IgG1 λ nd Cameroon [46] 447 V3 IgG3 λ B USA [17] , [45] 860 parvovirus IgG1 λ - USA [48] 1418 parvovirus IgG1 κ - USA [48] 3685 Anthrax, PA IgG1 λ - USA § 3706 Anthrax, PA IgG1 λ - USA § nd – not determined. PA – protective antigen of anthrax. §– Gorny et al., unpublished data. Neutralization assay with U87 target cells The PhenoSense™ HIV neutralization assay was performed by Monogram Biosciences, Inc. using the U87 target cell line expressing CD4, CCR5, and CXCR4, as previously described [32] , [49] . The U87 cell line was generated by Dr. Nathaniel Landau (New York University School of Medicine, New York, NY). This single round replication assay was used to test 57 psVs expressing cloned Env gene populations extracted from viruses in patients' plasma. The psVs were first treated with 2- or 3-fold serial dilutions of mAbs starting from 50 µg/ml, and then incubated with the U87 cells. After 72 hr, the levels of virus infection were assessed by measuring luciferase activity. In this assay, the anti-parvovirus mAb 860-55D (designated here as 860) and an aMLV Env-expressing psV were used as negative controls, whereas psVs expressing cloned Envs of SF162, JR-CSF, and NL4.3 were tested as positive controls. Neutralization assay with TZM.bl target cells Neutralizing activities of the anti-V3 mAbs against 41 psVs bearing single cloned Envs from neutralization-sensitive viruses (Tier 1), from clade B and clade C primary isolates from recent infections (Tier 2), and viruses from chronic infections were measured using the TZM.bl cell line as target cells, as previously described [50] , [51] , [52] . Similar to the U87 assay described above, 2-fold serial dilutions of mAbs were prepared starting from 50 µg/ml and used to treat psVs. The mAb/psV mixtures were then incubated with the TZM.bl target cells, and luciferase activity measured 48 hr later. MAbs specific for parvovirus B19 (1418 and 860) or anthrax protective antigen (3685 and 3706) were tested as negative controls for this set of experiments. Analyses of neutralization data For each mAb/psV combination, a polynomial regression (quadratic) model was used to best fit the titration curve. From each fitted titration curve, the IC 50 and area under the curve (AUC) values were estimated to quantify neutralization potency. The IC 50 value denotes the mAb concentration that corresponds with 50% neutralization in each fitted titration curve. AUC, on the other hand, is defined as an integration of the fitted curve over a chosen concentration range divided by the concentration range. AUC can be interpreted as the average neutralization within the given concentration range, with 1 as the maximal value representing 100% neutralization across the entire concentration range specified. To allow for comparison among different experiments and different assays, AUC values were calculated over a fixed range of mAb concentrations (0.39–50 µg/ml). For each mAb/psV combination, we tested the none-zero null hypothesis that AUC was less than or equal to a constant c using the Wald test. The constant c was calculated as the mean AUC plus 2 standard deviations from the negative controls (aMLV and/or irrelevant mAbs) achieved in each set of experiments. The c values for the U87 and TZM.bl experiments were 0.06 and 0.18, respectively. The one-sided Wald test that takes into account the AUC and its variance determined whether neutralizing activity of each test mAb/psV combination was statistically significant at the confidence level of 0.001. However, because the AUC values summarize the titration curves without assuming a sigmoidal curve shape, an additional criterion was used to ensure the detection of dose-dependent neutralization among the titration curves with relatively low AUC values (AUC≤ constant c+0.15), i.e., the presence of a positive slope between 30 and 40 µg/ml of mAb. All computations were done with free statistical software R ( http://www.r-project.org/ ), except for the t test or the non-parametric one-way ANOVA test which were performed using the GraphPad Prism 4 software to compare mean AUC values from the designated data subsets. Ethics Statement The study was approved by the IRB of New York University School of Medicine. All subjects gave written informed consent. Monoclonal antibodies The seven human anti-V3 mAbs examined in this study were developed using previously described cellular techniques [17] , [18] , [19] , [45] , [46] . In brief, Epstein-Barr virus transformed peripheral blood mononuclear cells from HIV-1-infected subjects producing V3-specific Abs were fused with the heteromyeloma SHM-D33, and the resulting hybridomas were cloned to monoclonality. Except for mAb 447-52D (designated here as 447) which was selected using a V3 MN peptide, the anti-V3 mAbs were selected using murine leukemia virus gp70-based fusion proteins (FPs) containing V3 loops from viruses of subtypes A or B [19] , [47] . These seven anti-V3 mAbs were selected from among >50 anti-V3 mAbs generated in our lab to represent the most potent and cross-reactive neutralizing anti-V3. Human mAbs specific for parvovirus B19 [48] or the anthrax protective antigen (PA) were used as negative controls. The anti-PA mAbs were produced by cellular methods from cells derived from two different volunteers who received an experimental vaccine consisting of recombinant PA antigen (Gorny et al., unpublished data). All mAbs were purified from culture supernatants by protein A or protein G chromatography. Table 1 summarizes the properties of the mAbs tested in this study. The 11 mAbs were sent to the laboratories where the functional assays were performed without any designation of their specificities. 10.1371/journal.pone.0010254.t001 Table 1 Characteristics of human mAbs used for this study. mAbs Specificity Isotype Subtype of the infecting virus Country of origin Reference 2191 V3 IgG1 λ B USA [19] 2219 V3 IgG1 λ B USA [19] 2557 V3 IgG1 λ CRF02_AG Cameroon [18] 2558 V3 IgG1 λ CRF02_AG Cameroon [18] 3074 V3 IgG1 λ CRF02_AG Cameroon [18] 3869 V3 IgG1 λ nd Cameroon [46] 447 V3 IgG3 λ B USA [17] , [45] 860 parvovirus IgG1 λ - USA [48] 1418 parvovirus IgG1 κ - USA [48] 3685 Anthrax, PA IgG1 λ - USA § 3706 Anthrax, PA IgG1 λ - USA § nd – not determined. PA – protective antigen of anthrax. §– Gorny et al., unpublished data. Neutralization assay with U87 target cells The PhenoSense™ HIV neutralization assay was performed by Monogram Biosciences, Inc. using the U87 target cell line expressing CD4, CCR5, and CXCR4, as previously described [32] , [49] . The U87 cell line was generated by Dr. Nathaniel Landau (New York University School of Medicine, New York, NY). This single round replication assay was used to test 57 psVs expressing cloned Env gene populations extracted from viruses in patients' plasma. The psVs were first treated with 2- or 3-fold serial dilutions of mAbs starting from 50 µg/ml, and then incubated with the U87 cells. After 72 hr, the levels of virus infection were assessed by measuring luciferase activity. In this assay, the anti-parvovirus mAb 860-55D (designated here as 860) and an aMLV Env-expressing psV were used as negative controls, whereas psVs expressing cloned Envs of SF162, JR-CSF, and NL4.3 were tested as positive controls. Neutralization assay with TZM.bl target cells Neutralizing activities of the anti-V3 mAbs against 41 psVs bearing single cloned Envs from neutralization-sensitive viruses (Tier 1), from clade B and clade C primary isolates from recent infections (Tier 2), and viruses from chronic infections were measured using the TZM.bl cell line as target cells, as previously described [50] , [51] , [52] . Similar to the U87 assay described above, 2-fold serial dilutions of mAbs were prepared starting from 50 µg/ml and used to treat psVs. The mAb/psV mixtures were then incubated with the TZM.bl target cells, and luciferase activity measured 48 hr later. MAbs specific for parvovirus B19 (1418 and 860) or anthrax protective antigen (3685 and 3706) were tested as negative controls for this set of experiments. Analyses of neutralization data For each mAb/psV combination, a polynomial regression (quadratic) model was used to best fit the titration curve. From each fitted titration curve, the IC 50 and area under the curve (AUC) values were estimated to quantify neutralization potency. The IC 50 value denotes the mAb concentration that corresponds with 50% neutralization in each fitted titration curve. AUC, on the other hand, is defined as an integration of the fitted curve over a chosen concentration range divided by the concentration range. AUC can be interpreted as the average neutralization within the given concentration range, with 1 as the maximal value representing 100% neutralization across the entire concentration range specified. To allow for comparison among different experiments and different assays, AUC values were calculated over a fixed range of mAb concentrations (0.39–50 µg/ml). For each mAb/psV combination, we tested the none-zero null hypothesis that AUC was less than or equal to a constant c using the Wald test. The constant c was calculated as the mean AUC plus 2 standard deviations from the negative controls (aMLV and/or irrelevant mAbs) achieved in each set of experiments. The c values for the U87 and TZM.bl experiments were 0.06 and 0.18, respectively. The one-sided Wald test that takes into account the AUC and its variance determined whether neutralizing activity of each test mAb/psV combination was statistically significant at the confidence level of 0.001. However, because the AUC values summarize the titration curves without assuming a sigmoidal curve shape, an additional criterion was used to ensure the detection of dose-dependent neutralization among the titration curves with relatively low AUC values (AUC≤ constant c+0.15), i.e., the presence of a positive slope between 30 and 40 µg/ml of mAb. All computations were done with free statistical software R ( http://www.r-project.org/ ), except for the t test or the non-parametric one-way ANOVA test which were performed using the GraphPad Prism 4 software to compare mean AUC values from the designated data subsets. Results Comparison of AUC and IC 50 values for identifying virus-neutralizing activities of anti-V3 mAbs in the U87 assay In the first set of experiments, six of the anti-V3 mAbs (2191, 2219, 2557, 2558, 3074, and 3869) were tested against a panel of 57 psVs prepared by Monogram Biosciences, Inc. to express Env populations from patients' plasma viruses when infection was due to HIV-1 subtypes A, B, C, or D; anti-V3 mAb 447 was tested against a subset of 26 psVs from this same panel. The panel of 57 psVs was chosen at Monogram to represent Envs from different subtypes, from subjects in different geographic areas, infected by different routes and at different stages of infection, i.e., from acutely-infected and chronically-infected subjects with different profiles of disease progression (rapid progressors and long-term non-progressors). In addition to the 57 psVs, four psVs prepared from single cloned Envs of SF162, JR-CSF, NL4.3, and aMLV were tested as positive and negative controls. The target cell line used in this set of experiments was CD4+CCR5+CXCR4+ U87. To determine the neutralization in each mAb/psV combination, both the AUC and IC 50 values were calculated from each neutralization titration curve. Figure 1 shows neutralization curves for mAb 2191 against nine representative psVs, including the negative psV control aMLV and the positive control SF162 psV; the corresponding AUC and IC 50 values are also shown. Based on the statistical analyses of the AUC values described in the Materials and Methods , the neutralization curves for mAb 2191 against psVs SF162, Acute-B-011, Chronic-B-034, Chronic-B-029, A-015, and Acute-B-016 are classified as positive (i.e., significant neutralization, p50% neutralization at the highest mAb concentration tested (50 µg/ml), for many combinations, 50% neutralization was not attained at this concentration even though dose-response relationships were displayed by the neutralization curves which were clearly above background (see below). 10.1371/journal.pone.0010254.g002 Figure 2 Neutralization curves of anti-V3 mAbs against representative HIV-1 psVs tested using the U87 target cell. Seven anti-V3 mAbs (2191, 2219, 2557, 2558, 3074, 3869, and 447) were tested for neutralization against HIV-1 pseudoviruses using the U87 cell line as target cells. MAb 860, specific for parvovirus, and a pseudovirus expressing the aMLV Env were used as negative controls in this assay. The titration curves from eight selected psVs and the aMLV psV control are shown. Curve fitting was performed using the polynomial regression (quadratic) model described in Materials and Methods . Fifty percent neutralization is denoted by the dashed line. Virus nomenclature is denoted as described in Figure 1 . When IC 50 values were calculated for all mAb/psV combinations tested in the U87 assay system ( Figure 3 ), 18 of the 57 (32%) psVs were neutralized by one or more anti-V3 mAbs at ≤50 µg/ml, with IC 50 values ranging from 2.65 to 42.73 µg/ml. Statistical analysis was then performed using the AUC method described above. Figure 4 shows the same neutralization matrix as that shown in Figure 3 but with AUC values. The AUC values of all mAb/psV combinations tested, including the negative and positive controls, ranged from −0.17 to 1.00. Significant neutralization was observed against 33 out of 57 (58%) psVs by ≥1 anti-V3 mAbs. Note that significant neutralization was not determined by a particular cut-off value, but rather by the Wald test and the slope criteria described in the Materials and Methods section. Therefore, neutralization curves with the same AUC values may not be equally significant due to differences in the slopes and the variance of the fitted curves. 10.1371/journal.pone.0010254.g003 Figure 3 The IC 50 values of anti-V3 mAbs against 57 HIV-1 pseudoviruses tested using the U87 target cell line. The IC 50 values were estimated from the titration curves of all mAb/psV combinations and are highlighted according to the color-coded scale. Pseudoviruses expressing Envs of JRCSF, NL3.4, and SF162 were tested as positive controls, whereas the irrelevant anti-parvovirus mAb 860 and aMLV Env-expressing psV were used as negative controls. When 50% neutralization was not achieved at the highest mAb concentration tested (50 µg/ml), the IC 50 values are shown as >50. 10.1371/journal.pone.0010254.g004 Figure 4 The AUC values of anti-V3 mAbs against 57 HIV-1 pseudoviruses tested using the U87 target cell line. AUC values were estimated from the titration curves as described in the Materials and Methods section. Statistically significant neutralization at p80% were frequently observed. However, the background values from the negative control mAbs were also higher in the TZM.bl assay than those generated in the U87-based experiments ( Figure 5 vs. Figure 2 ). Comparably high background levels of neutralization were also observed with the other three negative control mAbs tested in the TZM.bl assay (data not shown). One should note, however, that the high background levels observed in the TZM.bl assay might be attributable to the particular psVs tested in the panel and not only to the assay or target cells. For instance, background neutralization of >20% was consistently observed with psVs ZM214M.PL15 and HXB2, but not with psVs MW965.26, 242-14, and H035.18 ( Figure 5 ). 10.1371/journal.pone.0010254.g005 Figure 5 Neutralization curves of anti-V3 mAbs against representative HIV-1 psVs tested using the TZM.bl target cell line. Seven anti-V3 mAbs were tested against HIV-1 psVs in the TZM.bl experiment. The titration curves observed against nine selected viruses are shown. The background neutralization observed with the irrelevant control mAb 860 is also shown for comparison. Curve fitting was performed using the polynomial regression (quadratic) model described in Materials and Methods . Fifty percent neutralization is denoted by the dashed line. When 50% neutralization was used as a cut-off for positive neutralization with the TZM.bl experimental data, 22 of 41 (54%) psVs were neutralized, with IC 50 values for neutralizing mAbs ranging from 50. Four different irrelevant mAbs (860, 1418, 3685, and 3706) were used as negative controls in this experiment with comparable results, but only the mAb 860 data are shown. 10.1371/journal.pone.0010254.g007 Figure 7 The AUC values of anti-V3 mAbs against 41 HIV-1 pseudoviruses tested using the TZM.bl target cell line. The AUC values were calculated from the titration curves as described in the Materials and Methods section. All mAb/psV pairs with statistically significant neutralization at p50% neutralization at the highest mAb concentration tested (50 µg/ml), for many combinations, 50% neutralization was not attained at this concentration even though dose-response relationships were displayed by the neutralization curves which were clearly above background (see below). 10.1371/journal.pone.0010254.g002 Figure 2 Neutralization curves of anti-V3 mAbs against representative HIV-1 psVs tested using the U87 target cell. Seven anti-V3 mAbs (2191, 2219, 2557, 2558, 3074, 3869, and 447) were tested for neutralization against HIV-1 pseudoviruses using the U87 cell line as target cells. MAb 860, specific for parvovirus, and a pseudovirus expressing the aMLV Env were used as negative controls in this assay. The titration curves from eight selected psVs and the aMLV psV control are shown. Curve fitting was performed using the polynomial regression (quadratic) model described in Materials and Methods . Fifty percent neutralization is denoted by the dashed line. Virus nomenclature is denoted as described in Figure 1 . When IC 50 values were calculated for all mAb/psV combinations tested in the U87 assay system ( Figure 3 ), 18 of the 57 (32%) psVs were neutralized by one or more anti-V3 mAbs at ≤50 µg/ml, with IC 50 values ranging from 2.65 to 42.73 µg/ml. Statistical analysis was then performed using the AUC method described above. Figure 4 shows the same neutralization matrix as that shown in Figure 3 but with AUC values. The AUC values of all mAb/psV combinations tested, including the negative and positive controls, ranged from −0.17 to 1.00. Significant neutralization was observed against 33 out of 57 (58%) psVs by ≥1 anti-V3 mAbs. Note that significant neutralization was not determined by a particular cut-off value, but rather by the Wald test and the slope criteria described in the Materials and Methods section. Therefore, neutralization curves with the same AUC values may not be equally significant due to differences in the slopes and the variance of the fitted curves. 10.1371/journal.pone.0010254.g003 Figure 3 The IC 50 values of anti-V3 mAbs against 57 HIV-1 pseudoviruses tested using the U87 target cell line. The IC 50 values were estimated from the titration curves of all mAb/psV combinations and are highlighted according to the color-coded scale. Pseudoviruses expressing Envs of JRCSF, NL3.4, and SF162 were tested as positive controls, whereas the irrelevant anti-parvovirus mAb 860 and aMLV Env-expressing psV were used as negative controls. When 50% neutralization was not achieved at the highest mAb concentration tested (50 µg/ml), the IC 50 values are shown as >50. 10.1371/journal.pone.0010254.g004 Figure 4 The AUC values of anti-V3 mAbs against 57 HIV-1 pseudoviruses tested using the U87 target cell line. AUC values were estimated from the titration curves as described in the Materials and Methods section. Statistically significant neutralization at p80% were frequently observed. However, the background values from the negative control mAbs were also higher in the TZM.bl assay than those generated in the U87-based experiments ( Figure 5 vs. Figure 2 ). Comparably high background levels of neutralization were also observed with the other three negative control mAbs tested in the TZM.bl assay (data not shown). One should note, however, that the high background levels observed in the TZM.bl assay might be attributable to the particular psVs tested in the panel and not only to the assay or target cells. For instance, background neutralization of >20% was consistently observed with psVs ZM214M.PL15 and HXB2, but not with psVs MW965.26, 242-14, and H035.18 ( Figure 5 ). 10.1371/journal.pone.0010254.g005 Figure 5 Neutralization curves of anti-V3 mAbs against representative HIV-1 psVs tested using the TZM.bl target cell line. Seven anti-V3 mAbs were tested against HIV-1 psVs in the TZM.bl experiment. The titration curves observed against nine selected viruses are shown. The background neutralization observed with the irrelevant control mAb 860 is also shown for comparison. Curve fitting was performed using the polynomial regression (quadratic) model described in Materials and Methods . Fifty percent neutralization is denoted by the dashed line. When 50% neutralization was used as a cut-off for positive neutralization with the TZM.bl experimental data, 22 of 41 (54%) psVs were neutralized, with IC 50 values for neutralizing mAbs ranging from 50. Four different irrelevant mAbs (860, 1418, 3685, and 3706) were used as negative controls in this experiment with comparable results, but only the mAb 860 data are shown. 10.1371/journal.pone.0010254.g007 Figure 7 The AUC values of anti-V3 mAbs against 41 HIV-1 pseudoviruses tested using the TZM.bl target cell line. The AUC values were calculated from the titration curves as described in the Materials and Methods section. All mAb/psV pairs with statistically significant neutralization at p<0.001 are color-coded according to the designated scale. The irrelevant anti-parvovirus mAb 1418 was used together with three other control mAbs (data not shown) as negative controls. Using the AUC analysis, the Tier 1, Tier 2, and chronic viruses showed different patterns of neutralization by the anti-V3 mAbs in the TZM.bl assay. All 10 of 10 Tier 1 psVs with Envs from subtypes A, AG, B and C were neutralized by ≥1 anti-V3 mAbs ( Figure 7 ). Indeed, a single anti-V3 mAb (3074) was able to neutralize all of the 10 Tier 1 psVs, while each of the remaining six anti-V3 mAbs neutralized 5 to 9 of the 10 Tier 1 psVs. The AUC values achieved against the Tier 1 psVs were high, with a median of 0.78 (range 0.24 to 1.00) for all positive mAb/psV combinations. Moreover, 20 of the 70 mAb/Tier 1 psV combinations had AUC values of 0.90 to 1.00. One or more anti-V3 mAbs were also able to neutralize six of 12 (50%) clade B Tier 2 psVs, with a median AUC value of 0.35 (range 0.23–0.91) for all the positive mAb/psV combinations. These data parallel those shown above ( Figure 4 ) in which anti-V3 mAbs neutralized 12 of the 17 (71%) subtype B psVs with Envs derived from acutely-infected patients tested in the U87 assay, a group of psVs that meet the criteria for Tier 2 viruses. Among the seven chronic subtype B psVs tested in the TZM.bl assay, four (57%) were also neutralized by ≥1 anti-V3 mAbs (median AUC = 0.37, range 0.24–0.67) ( Figure 7 ). In comparison, 90% of psVs with subtype B Envs from chronically-infected progressors and long-term non-progressors tested in the U87 assay were neutralized by anti-V3 mAbs ( Figure 4 ). The results in the two assays show qualitatively that anti-V3 mAbs can neutralize Tier 2 psVs from clade B as well as psVs derived from the viruses of chronically-infected individuals. The quantitative differences between the two assays may be attributable to the particular panel of psVs tested. Among 12 psVs with clade C Tier 2 subtype C Envs, statistically significant neutralization was achieved against three (ZM233M.PB6, ZM109F.PB4, and CAP210.2.00E8) in the TZM.bl assay. The neutralization of ZM233M.PB6 and ZM109F.PB4 was mediated by three and four anti-V3 mAbs, respectively, while CAP201.2.00E8 was neutralized by only one (mAb 3074) ( Figure 7 ). In contrast, 8 of 10 (80%) subtype C psVs were neutralized by these same anti-V3 mAbs in the U87 experimental set ( Figure 4 ). Here the comparison is not as direct, since the clade C Tier 2 panel used in the TZM.bl assay was derived from individuals recently infected with subtype C viruses, whereas the Envs of clade C psVs tested in the U87 experiments came from individuals whose date of infection was not known, but were likely to be in the chronic stage of infection. Combined data from the U87 and TZM.bl experiments demonstrate broad neutralizing activities of anti-V3 mAbs across Envs from different subtypes and from different stages of infection By applying the same AUC-based statistical analyses to the two independent experiments, we observed that, 56 of 98 (57%) psVs tested were neutralized significantly by ≥1 anti-V3 mAbs ( Table 2 ). These 56 sensitive psVs expressed Envs of diverse subtypes, including subtypes A, AG, B, C and D. Even when the 10 Tier 1 psVs were excluded from the combined data, significant neutralization was detected by ≥1 anti-V3 mAbs against 46 of 88 (52%) psVs from subtypes A, B, C and D. Furthermore, 9 of 24 (37.5%) Tier 2 viruses from the clade B and C standard panels were neutralized by ≥1 anti-V3 mAbs. Hence, the ability of anti-V3 mAbs to neutralize across different subtypes is observed consistently in both U87 and TZM.bl experiments. This establishes the ability of many anti-V3 mAbs to display cross-clade neutralizing activity and demonstrates conclusively that anti-V3 Abs can be broad in their reactivity and are not exclusively type- or clade-specific. 10.1371/journal.pone.0010254.t002 Table 2 Summary of data on psV neutralization by anti V3 mAbs. Env subtype Category or stage of infection No. psVs neutralized * Total psVs tested % neutralized Assay All 56 98 57% U87 & TZM.bl All except Tier 1 46 88 52% U87 & TZM.bl A, AG, B & C Tier 1 10 10 100% TZM.bl B & C Tier 2 9 24 38% TZM.bl B Acute 12 17 71% U87 B Tier 2 6 12 50% TZM.bl B Chronic (Progressor & LTNP) 9 10 90% U87 B Chronic 4 7 57% TZM.bl A unknown 3 10 30% U87 C Tier 2 3 12 25% TZM.bl C unknown 8 10 80% U87 D unknown 1 10 10% U87 *Positive neutralization defined by p<0.001 in AUC analysis with ≥1 anti-V3 mAb(s). Subtype B psVs with Envs from viruses derived from chronically- and acutely-infected subjects were compared for neutralization sensitivity by anti-V3 mAbs. The data from both U87 and TZM.bl experimental sets consistently show that anti-V3 mAbs were effective against significant fractions of psVs with Envs from either chronic or acute infections. In the U87 experiments, 90% (9/10) and 71% (12/17) of psVs with Envs from chronic and acute infections, respectively, were neutralized by ≥1 anti-V3 mAbs ( Figure 4 and Table 2 ). The mAbs showed a trend toward better potency against psVs with chronic Envs (AUC = 0.12 to 0.54; median  = 0.30) than against acute Envs (AUC = 0.10 to 0.46; median  = 0.23); this difference did not reach statistical significance. In the TZM.bl experiments, psVs with subtype B Envs from both chronic (4/7 [57%]) and acute (Tier 2; 6/12 [50%]) infections were also sensitive to neutralization by anti-V3 mAbs ( Figure 7 and Table 2 ), and there was essentially no difference in the potency of the mAbs against viruses with chronic Envs (AUC = 0.24–0.67, median  = 0.37) vs. those with acute Envs (Tier 2; AUC = 0.23–0.91, median  = 0.35). Different anti-V3 mAbs display unique patterns of neutralization Each anti-V3 mAb tested was able to neutralize 28–42% of the 98 psVs tested, whereas the four anti-parvovirus and -anthrax mAbs used as negative controls did not neutralize any of the psVs. However, the data in Figures 4 and 7 clearly show that each anti-V3 mAb displays a unique pattern of psV neutralization. To illustrate these distinct patterns of neutralization, data from three mAbs, 2191, 3074, and 447, are described in detail this section. Based on statistical analyses of the AUC data, mAb 2191 was found to neutralize the highest proportions of psVs, and this was consistently observed in both the U87 and TZM.bl assays ( Figures 4 and 7 ). Twenty-four of 57 (42%) and 17 of 41 (41%) psVs in the respective panels were significantly neutralized by mAb 2191. Importantly, this single mAb displays neutralizing activity across multiple subtypes, including psVs carrying Envs from Tier 1, Tier 2, acute and chronic viruses from subtype B, from Tier 2 and chronic viruses from subtype C, from chronic clade A and D viruses, and from Tier 1 AG viruses. The frequency of subtype B psVs neutralized by mAb 2191 (which was derived from a clade B-infected individual) was greater than that for the non-B psVs, and the potency against the subtype B psVs was also notably stronger. This inter-subtype neutralizing activity was not unique to mAb 2191. The other five anti-V3 mAbs (2219, 2557, 2558, 3074, and 3869) were also effective against psVs expressing different Env subtypes, as they each neutralized 28–36% of the 98 psVs tested at levels that were statistically significant. These data demonstrate that a single anti-V3 mAb has the capacity to mediate neutralization against HIV-1 of diverse subtypes. Previous studies have shown that anti-V3 mAbs derived from African donors infected with HIV-1 isolates of non-B subtypes show different patterns of psV neutralization than those derived from subtypes B-infected subjects, and that the non-B derived mAbs have a tendency to exhibit broader and more potent neutralization against non-B viruses [18] . Of the four non-B derived mAbs studied here, mAbs 3074 and 3869 exhibited remarkable neutralization patterns: these two mAbs neutralized eight of the 10 subtype C psVs in the U87 experiments ( Figure 4 ). MAb 3074, for example, which was derived from a clade AG-infected individual, displayed considerable breadth, neutralizing 7 of 10 clade C psVs with AUC values ranging from 0.17 to 0.46 ( Figure 4 ); when 50% neutralization was achieved, IC 50 values ranged between 8.51 and 24.20 µg/ml ( Figure 3 ). This mAb also neutralized two clade C Tier 2 psVs tested in the TZM.bl experiments, with AUC values of 0.27 and 0.34 ( Figure 7 ). Using the IC 50 criterion, three clade C Tier 2 viruses were neutralized, with IC 50 values of 7.33 to 41.48 µg/ml ( Figure 6 ). In contrast, the neutralization of mAb 3074 against acute, chronic, and Tier 2 subtype B psVs was more sporadic and less potent. These data provide clear evidence for the distinct and complementary specificities of neutralizing activities mediated by the individual anti-V3 mAbs and suggest that increased breadth of virus neutralization can be attained by combinations of selected anti-V3 mAbs. In contrast to the six anti-V3 mAbs described above, the anti-V3 mAb 447, which has, until now, been considered as the prototypic anti-V3 mAb, displays more limited breadth of neutralization across subtypes. Although mAb 447 significantly neutralized 27/65 (42%) psVs in the U87 and TZM.bl experiments, it was effective mainly against psVs with subtype B and Tier 1 Envs ( Figures 4 and 7 ). This is strikingly similar to the data published previously showing that mAb 447 neutralized 38% and 45% of various clade B psVs panels but a very small proportion of psVs from other subtypes [30] , [31] , The data suggest that mAb 447 tends to be a "clade B-specific" anti-V3 mAb, and is clearly distinct from the other much more broadly reactive anti-V3 mAbs tested in these studies. This finding is consistent with previously published data showing that the V3 motif critical for mAb 447 recognition is the presence of Arg 315 (R) at the GPGR arch of the V3 crown [40] , [44] , [53] and that this motif is generally restricted to subtype B viruses, whereas the typical sequence at the V3 arch of the other subtypes is GPGQ. Discussion By testing seven different anti-V3 mAbs against 98 psVs with either single cloned Envs or cloned Env populations in two independent laboratories, and utilizing neutralization assays with different target cells, this study has demonstrated the ability of human anti-V3 mAbs to neutralize diverse HIV-1 strains from multiple subtypes derived from patients at different stages of infection. Overall, the data show that 57% of the 98 psVs tested were sensitive to neutralization by one or more of the seven anti-V3 mAbs. Any single anti-V3 mAb was capable of neutralizing 28–42% of these psVs. Given the reactivity of these monoclonal reagents, the data suggest that polyclonal anti-V3 Ab responses will neutralize an even greater proportion of HIV-1 isolates than any single anti-V3 mAb or cocktail of anti-V3 mAbs. Indeed, this hypothesis is corroborated by recent findings showing that sera from rabbits that were primed with gp120 DNA and boosted with a V3-fusion protein exhibited a greater breadth of neutralizing activity than pools of anti-V3 mAbs [32] . The accumulated data on the breadth of the neutralizing activity of anti-V3 mAbs, from immune sera induced with a vaccine focusing the Ab response on V3 and from polyclonal serum anti-V3 Abs from infected individuals [54] suggest that V3 is one of the Env epitopes of HIV-1 that should be targeted by vaccines. The extent of cross-reactivity displayed by the anti-V3 mAbs is not surprising in light of the structural and bioinformatics data published in recent years which show the presence of several conserved structural elements in the V3 loop. Huang et al. [43] demonstrated three regions of the V3 loop: a base which is attached to the gp120 core, a flexible stem, and a crown, consisting of ∼14 amino acids at the center of the loop which contains all epitopes recognized by anti-V3 mAbs [40] , [41] , [42] , [44] , [55] , [56] , [57] . One of the conserved features of the V3 crown is the presence of the GPG motif at the tip of the loop that propels the distal tip of the V3 crown to adopt a unique β-hairpin structure. MAb 447, for example, interacts with this conserved GPG turn via hydrophobic interactions, and with the main chain of the N-terminal V3 β-strand flanking the GPG turn, rendering this mAb unaffected by side-chain differences in the highly variable V3 N-terminal β-strand [40] , [42] , [53] . These studies also reveal that the reactivity of mAb 447 is restricted by a polar interaction with the side chain of the R residue in the GPGR motif found mainly among viruses of subtype B but infrequently in other subtypes. From the crystal structures of V3 peptides bound by different mAbs, additional conserved elements in the V3 epitopes have been identified that provide the structural basis for anti-V3 cross-reactivity. The cross-reactivity of mAb 2219, for example, is due to its ability to recognize conserved residues on the hydrophobic face of V3, composed of residues flanking the GPG tip [41] , and further studies indicate that the 2219 epitope occurs in 30% of worldwide isolates [53] . Additional data based on viral bioinformatics and modeling studies demonstrate that the variability in V3 is, in fact, restricted to a small zone on the surface of the hydrophilic face of the V3 loop β-hairpin [58] . Thus, there is considerable structural conservation of V3, which is consistent with the requirement for V3 to participate in coreceptor binding regardless of the amino acid sequence variability this region displays. It is noteworthy that the breadth attained by individual anti-V3 mAbs assessed by IC 50 values, i.e., 28% to 42% against 98 psVs, is not dissimilar to that of other broadly neutralizing mAbs such as b12 and 2G12 which, respectively, neutralized 35% and 32% of 162 viruses tested in the same U87 assay and assessed by the same criterion [15] . It is also comparable with the breadth of neutralization recently reported for mAb HGN194, which recognizes a conserved epitope in the V3 crown [59] . The anti-MPER mAbs 2F5 and 4E10 show broader activity (60% and 98%, respectively), as do the newly isolated mAbs PG9 (79%) and PG16 (73%) that recognize quaternary neutralizing epitopes composed of portions of the V2 and V3 loops on HIV-1 virions. As noted above, however, the polyclonal response to a neutralizing domain such as V3 or the CD4 binding site may have much greater breadth than that displayed by any single mAb, or indeed, by a cocktail of mAbs. The issue of the concentration of individual mAbs and polyclonal Abs needed for protection in vivo has received much attention, and the consensus has undergone vast changes as new data have emerged. Whereas early passive immunization experiments with mAbs suggested that extremely high levels of serum Ab concentrations were needed for protection [60] , [61] , recent data from a SHIV/macaque model suggest that as little as 30–60 µg/ml of an effective mAb may be sufficient to protect against a low dose challenge, comparable to that occurring in nature [62] . Thus, the levels of potency offered by the various broadly neutralizing anti-gp41 and gp120 mAbs, including those specific for V3, may well offer the requisite protection given their median in vitro IC 50 values of <30 µg/ml (see Results and [15] ). In addition to providing data documenting the breadth and potency of anti-V3 mAbs, this study demonstrates the utility of a new method for objective statistical analysis of neutralization data. In the past, low levels of Ab-mediated neutralization have been essentially overlooked, as neutralizing activities have conventionally been presented as the titers or Ab concentrations required to reach various arbitrary neutralization levels; indeed, inhibitory Ab concentrations for 40–100% neutralization have been used in various HIV studies. If background levels for negative controls approach 50% neutralization, as in the case of the TZM.bl assay (see the Figure 5 panel showing data from assays with the negative control mAb 1418), then using IC 50 values approximate statistical significance and little neutralizing activity is missed. This agrees with a recent report demonstrating a high correlation of IC 50 titers with partial AUC values (defined as the areas of the titration curves measured between 20 and 100% neutralization) for a large panel of psVs tested using TZM.bl target cells [63] . Thus, in the data from the TZM.bl assay, the IC 50 values and AUC analysis show, respectively, 54% and 56% of psVs neutralized by one or more anti-V3 mAbs. However, if, as in the case of the U87 assay, background levels rarely exceed 20% neutralization (see the Figure 2 panel showing data from assays with the negative control mAb 860), then using IC 50 values censor all of the data between background and 50%, resulting in an underestimate of neutralizing activity. In this latter case, the use of AUC more comprehensively assesses neutralizing activity. In the data from the U87 assay, the proportions of psVs neutralized are 32% and 58% when analyzed by IC 50 and AUC, respectively. Thus, one advantage of using the AUC method is its ability to detect low levels of neutralizing activity that might otherwise be missed and might be biologically relevant. There are several additional advantages to the AUC analysis of neutralization data. 1) It allows statistically-based assessment of all neutralization data, with no preconceived cut-off points. This method takes into account the entire data from each titration curve, the background neutralization for a given assay, and the slope of the curve. It then utilizes a statistical test to determine significant activity. 2) The AUC summarizes neutralization responses across a range of Ab concentrations without requiring assumptions about the sigmoidal shape of the titration curve. Indeed, the majority of neutralization curves are not sigmoidal ( Figures 1 , 2 , and 5 ). 3) AUC does not rely on a single point in various neutralization curves which may or may not be in the linear portion of each of the curves. 4) All data are used, and none are censored, Thus, Abs that do not attain the selected level of neutralization at the highest concentration tested (e.g. 50 µg/ml) are not "censored", i.e., listed as "<50". And, 5) a uniform, AUC-based statistical test can be applied for analysis and comparison of multiple data sets from independent experiments. This approach may therefore prove useful for analyses of neutralization data from preclinical and clinical trials that evaluate incremental improvements in the designs of candidate HIV/AIDS vaccines as they are being optimized.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7416586/

The Consequences of COVID-19 and Other Disasters for Wildlife and Biodiversity

We review the economic channels by which the COVID-19 pandemic and subsequent policy responses may affect wildlife and biodiversity. The pandemic is put in the context of more than 5,000 disease outbreaks, natural disasters, recessions and armed conflicts in a sample of 21 high biodiversity countries. The most salient feature of the pandemic is its creation of multiple income shocks to rural and coastal households in biodiverse countries, correlated across sectors of activities and spatially. Various research and policy opportunities and challenges are explored . Introduction The COVID-19 pandemic is a stochastic shock simultaneously affecting individuals, households, firms and institutions globally. As of July 2020, more than 11 million cases of infections and 500,000 deaths have been confirmed worldlwide (Johns Hopkins University Coronavirus Resource Center 2020 ), and the daily case count is increasing exponentially. The policy response has been equally sweeping. International travel restrictions and lockdowns have significantly curtailed economic activity and USD$9 trillion in emergency fiscal measures have been deployed by 198 countries (IMF 2020 ). 1 For the first time in 60 years, the global output of emerging economies is set to contract (World Bank 2020b ). It is well established that poverty and food insecurity are primary drivers of biodiversity loss (Dasgupta and Mäler 1995 ; Dasgupta et al. 2001 ; Barrett et al. 2011 ). The compounded effects of disease and economic disruption are threatening to throw between 70 and 100 million additional people into poverty (World Bank 2020e ), and the United Nations World Food Program ( 2020 ) warns that an extra 130 million people could face acute food insecurity by the end of 2020 (nearly double the pre-pandemic number). It is impossible to predict the course that the disease will take, how deeply and for how long the recession will last, or whether the pandemic will spur major changes in national policies and the general world economic order. Yet, many of the short term impacts already observed raise the possibility of significant consequences for land use, wildlife and biodiversity. People are getting gravely ill and, amid a generalized economic downturn, the demand for natural resources has dropped, nature tourism has been halted, supply networks have been disrupted, and policies have already been implemented to curtail the harvesting and trade of wild animals. We list many more short term effects of the pandemic in Sect. 2 , organizing them by economic pathways that can trigger biodiversity loss. In Sect. 3 , we place the pandemic in the context of the background risks faced by households in a sample of 21 low and middle income countries with high biodiversity. The tally of disease outbreaks, economic shocks, natural disasters, armed conflicts, and political crises reveals more than 5,000 shocks since 1970. Research linking these types of shocks to natural resource use and biodiversity loss is instructive. However, the most salient feature of the pandemic is perhaps that it imposes a multiplicity of correlated shocks to many sectors of the economy, to several coping strategies of rural poor, and to nearly all regions of the globe. This raises many interesting new research questions and opportunities, but also poses methodological challenges for modelers and empirical researchers alike. Policy-making in times of great uncertainty will also be daunting. The last two sections of the paper reflect on these topics. Short Term Impacts of the COVID-19 Pandemic Impacts of the pandemic on wildlife and biodiversity are propagated through economic pathways. Even the direct threat that the virus poses to the health of Great Apes and other species is the result of humans handling live animals and how we are spreading the disease (Kazi et al. 2020 ; Chandrashekar et al. 2020 ; Gibbons 2020 ; CBSNews 2020 ). On a macroeconomic scale, the global economic slowdown has decreased the demand for many industrially produced commodities and thus reduced direct extractive pressures on the environment. However, the net effects at the local level must account for the myriad of complementarities and substitution possibilities related to the deployment of labor effort, consumption decisions, or the intertemporal tradeoffs inherent to the timing of investments in productive assets, human capital or savings. As such, we organize the short term impacts around what may be described loosely as the components of a dynamic general equilibrium bioeconomic model of a small open economy subject to stochastic shocks (Conrad and Rondeau 2020 ). This structure, in which a local economy obtains products and services from natural capital, is easily reconciled with the direct and indirect drivers of biodiversity loss identified by the Millenium Ecosystem Assessment ( 2005 ). The study of such complex systems tells us that even seemingly small short-lived perturbations can produce dramatic changes in future outcomes (Ngonghala et al. 2014 ). Thus, the import of the list of short term impacts lies not in keeping a score of positive and negative short term effects, but rather, in recognizing that the pandemic sums up to a multi-pronged, system-wide series of correlated shocks. Impacts on the Productive Capacity of Households Disease Burden COVID-19 is a new addition to the disease burden of rural households. At the time of writing, the case incidence is still rapidly increasing in biodiversity-rich Africa, Latin America and on the Indian sub-continent (Bruce-Lockhart, Anna 2020 ). The disease incapacitates productive adults and causes excess mortality, reducing household income. Wardens and conservation officers are affected, reducing conservation work and enforcement against illegal resource extraction (International Fund for Animal Welfare 2020 ). Significant Change to Production Conditions Rhinoceros and elephant poaching syndicates have expanded operations into areas where there are normally too many wildlife-viewing tourists for them to operate undetected (Save The Rhino Foundation 2020 ; Sishi and Cocks 2020 ). The sudden absence of tourists has also been cited as a factor in poaching incidents in India (Karmakar 2020 ) and to explain a surge in illegal logging in Tunisia (Foroudi 2020 ). The absence of tourists effectively modifies the production function of poachers by opening more territory and increasing the available stock of the target resource. A general increase in labor availability is also a likely contributing factor. Finding themselves without income, millions of migrant workers (international and internal) have returned to rural areas throughout the developing world (Kinetz 2020 ; Ellis-Petersen and Chaurasia 2020 ; Bank 2020 ; Chávez Yacila and Turkewitz 2020 ; Chulov M and Safi M 2020 ). This arrival increases the total amount of labor time available in local resource-dependent economies. It also increases the local demand for food and other needs. The World Bank warns that many returning migrants will fall into poverty and threaten food security in their home villages (Kray and Shetty 2020 ). Demand/Price Shocks for Households as Producers The rapid onset of a global recession has affected the demand for many goods exported by resource rich developing countries. Drops in demand reduce prices and production, constrain the sectors of activity that local workers can engage in, and lower wage income. A sharp decline in the demand for natural resources commodities (US Energy Information Administration 2020 ) resulted in a significant drop in prices. The Bank of Canada's Commodity Price Index declined by 41% between January and April (Bank of Canada 2020 ). U.S. crude oil prices even went negative for the first time in history (BBC News 2020 ). Early reporting by the U.N. Food and Agriculture Organization paints a complex set of impacts to the world fisheries (FAO 2020 ). The demand for fresh fish has been volatile but generally down. On the other hand, consumer demand for canned goods was up significantly in the early days of the pandemic. Worldwide, high seas commercial fisheries landings were down 6.5% but small scale fisheries were most seriously disrupted by the closure of fresh food markets. Some countries have experienced very different impacts. In Peru for instance (the world's largest producer of fishmeal), commercial fishing effort dropped by 80% after the announcement of self-isolation rules despite fishing being excluded from mandatory lockdowns (Arony 2020 ). The FAO indicates that the pandemic threatens to make women, migrant fishers and fish workers economically vulnerable. By the end of April 2020, all countries had put in place travel restrictions and domestic lock-down orders, effectively halting all tourism (United Nations World Tourism Organisation 2020 ; Airports Council International 2020 ). The prospect of a prolonged loss of income from nature and wildlife tourism threatens to undo decades of development work aimed at creating sustainable community-based conservation strategies. Developing countries with biodiversity hotspots are left particularly vulnerable. Nature-based tourism represents more than 10% of the economies of Kenya, Tanzania, South Africa, and Namibia. Nineteen small island nations derive more than 20% of their GDP directly from tourism, where the main attractions are beaches and reef-based activities (Coke-Hamilton, Pamela 2020 ). Direct tourism fees are the primary source of funding for national parks and reserves in most developing countries ($142 million in Africa alone in 2013 according to the World Tourism Organization ( 2015 ). The sudden loss of revenue forced the layoff of wardens and rangers in Zimbabwe and other countries (International Fund for Animal Welfare 2020 ). Lockdown measures have created financial emergencies at zoos and wildlife rehabilitation centers, resulting in layoffs of caretakers and further endangering species like the Orangutan of Borneo (Gokkon, Basten 2020 ; CTVNews 2020 ). The pandemic has bolstered the demand for Traditional Chinese Medicine (TCM). In particular, the Chinese government has endorsed the use of dried bear bile for COVID-19 (The Economist 2020 ). No claim is made by Chinese authorities that TCM ingredients have therapeutic value but widespread beliefs in their properties are shifting demand upwards. For suppliers of TCM, increased demand/price makes their production more attractive. 2 Disruptions of Institutions and Supply Chains The combination of illnesses, border closures, lockdowns and other policies has resulted in disruptions to trade relationships and markets, shifting the conditions under which producers operate and affecting the relative marginal value of labor in different sectors. As previously mentioned, lockdown orders and self-distancing rules have made it difficult for small scale fishers to sell their fresh catch. In addition, a variety of bans and restrictions on wildlife trade (with exceptions for TCM) have been imposed in China since the onset of the pandemic. These policies directly affect the economics of bushmeat hunting and trade and may shift consumer preferences over time. Impacts on Households as Consumers All disruptions impacting the ability of households to produce and generate income feed directly into their budget, endogenously modifying immediate demand within the local economy. Also disrupted are their ability to save and invest in lasting capital like education or farming equipment, with repercussions on the long term dynamics of bioeconomic systems. One potentially very significant shock to rural economies and resources is a dramatic fall in remittances sent home from migrant workers. The World Bank projects that international remittances will fall by 20% in 2020. For the world's fifteen low or middle income countries designated as megadiverse (UNEP 2020 ), pre-pandemic remittances averaged 2.1% of GDP (World Bank 2020a , f ). For them, the expected shortfall for the year exceeds $50 billion. Remittances originating from within a country are not accounted for in these statistics but should also be expected to decline, further reducing household income. Impacts on the Productive Capacity of Households Disease Burden COVID-19 is a new addition to the disease burden of rural households. At the time of writing, the case incidence is still rapidly increasing in biodiversity-rich Africa, Latin America and on the Indian sub-continent (Bruce-Lockhart, Anna 2020 ). The disease incapacitates productive adults and causes excess mortality, reducing household income. Wardens and conservation officers are affected, reducing conservation work and enforcement against illegal resource extraction (International Fund for Animal Welfare 2020 ). Significant Change to Production Conditions Rhinoceros and elephant poaching syndicates have expanded operations into areas where there are normally too many wildlife-viewing tourists for them to operate undetected (Save The Rhino Foundation 2020 ; Sishi and Cocks 2020 ). The sudden absence of tourists has also been cited as a factor in poaching incidents in India (Karmakar 2020 ) and to explain a surge in illegal logging in Tunisia (Foroudi 2020 ). The absence of tourists effectively modifies the production function of poachers by opening more territory and increasing the available stock of the target resource. A general increase in labor availability is also a likely contributing factor. Finding themselves without income, millions of migrant workers (international and internal) have returned to rural areas throughout the developing world (Kinetz 2020 ; Ellis-Petersen and Chaurasia 2020 ; Bank 2020 ; Chávez Yacila and Turkewitz 2020 ; Chulov M and Safi M 2020 ). This arrival increases the total amount of labor time available in local resource-dependent economies. It also increases the local demand for food and other needs. The World Bank warns that many returning migrants will fall into poverty and threaten food security in their home villages (Kray and Shetty 2020 ). Demand/Price Shocks for Households as Producers The rapid onset of a global recession has affected the demand for many goods exported by resource rich developing countries. Drops in demand reduce prices and production, constrain the sectors of activity that local workers can engage in, and lower wage income. A sharp decline in the demand for natural resources commodities (US Energy Information Administration 2020 ) resulted in a significant drop in prices. The Bank of Canada's Commodity Price Index declined by 41% between January and April (Bank of Canada 2020 ). U.S. crude oil prices even went negative for the first time in history (BBC News 2020 ). Early reporting by the U.N. Food and Agriculture Organization paints a complex set of impacts to the world fisheries (FAO 2020 ). The demand for fresh fish has been volatile but generally down. On the other hand, consumer demand for canned goods was up significantly in the early days of the pandemic. Worldwide, high seas commercial fisheries landings were down 6.5% but small scale fisheries were most seriously disrupted by the closure of fresh food markets. Some countries have experienced very different impacts. In Peru for instance (the world's largest producer of fishmeal), commercial fishing effort dropped by 80% after the announcement of self-isolation rules despite fishing being excluded from mandatory lockdowns (Arony 2020 ). The FAO indicates that the pandemic threatens to make women, migrant fishers and fish workers economically vulnerable. By the end of April 2020, all countries had put in place travel restrictions and domestic lock-down orders, effectively halting all tourism (United Nations World Tourism Organisation 2020 ; Airports Council International 2020 ). The prospect of a prolonged loss of income from nature and wildlife tourism threatens to undo decades of development work aimed at creating sustainable community-based conservation strategies. Developing countries with biodiversity hotspots are left particularly vulnerable. Nature-based tourism represents more than 10% of the economies of Kenya, Tanzania, South Africa, and Namibia. Nineteen small island nations derive more than 20% of their GDP directly from tourism, where the main attractions are beaches and reef-based activities (Coke-Hamilton, Pamela 2020 ). Direct tourism fees are the primary source of funding for national parks and reserves in most developing countries ($142 million in Africa alone in 2013 according to the World Tourism Organization ( 2015 ). The sudden loss of revenue forced the layoff of wardens and rangers in Zimbabwe and other countries (International Fund for Animal Welfare 2020 ). Lockdown measures have created financial emergencies at zoos and wildlife rehabilitation centers, resulting in layoffs of caretakers and further endangering species like the Orangutan of Borneo (Gokkon, Basten 2020 ; CTVNews 2020 ). The pandemic has bolstered the demand for Traditional Chinese Medicine (TCM). In particular, the Chinese government has endorsed the use of dried bear bile for COVID-19 (The Economist 2020 ). No claim is made by Chinese authorities that TCM ingredients have therapeutic value but widespread beliefs in their properties are shifting demand upwards. For suppliers of TCM, increased demand/price makes their production more attractive. 2 Disruptions of Institutions and Supply Chains The combination of illnesses, border closures, lockdowns and other policies has resulted in disruptions to trade relationships and markets, shifting the conditions under which producers operate and affecting the relative marginal value of labor in different sectors. As previously mentioned, lockdown orders and self-distancing rules have made it difficult for small scale fishers to sell their fresh catch. In addition, a variety of bans and restrictions on wildlife trade (with exceptions for TCM) have been imposed in China since the onset of the pandemic. These policies directly affect the economics of bushmeat hunting and trade and may shift consumer preferences over time. Impacts on Households as Consumers All disruptions impacting the ability of households to produce and generate income feed directly into their budget, endogenously modifying immediate demand within the local economy. Also disrupted are their ability to save and invest in lasting capital like education or farming equipment, with repercussions on the long term dynamics of bioeconomic systems. One potentially very significant shock to rural economies and resources is a dramatic fall in remittances sent home from migrant workers. The World Bank projects that international remittances will fall by 20% in 2020. For the world's fifteen low or middle income countries designated as megadiverse (UNEP 2020 ), pre-pandemic remittances averaged 2.1% of GDP (World Bank 2020a , f ). For them, the expected shortfall for the year exceeds $50 billion. Remittances originating from within a country are not accounted for in these statistics but should also be expected to decline, further reducing household income. Disease Burden COVID-19 is a new addition to the disease burden of rural households. At the time of writing, the case incidence is still rapidly increasing in biodiversity-rich Africa, Latin America and on the Indian sub-continent (Bruce-Lockhart, Anna 2020 ). The disease incapacitates productive adults and causes excess mortality, reducing household income. Wardens and conservation officers are affected, reducing conservation work and enforcement against illegal resource extraction (International Fund for Animal Welfare 2020 ). Significant Change to Production Conditions Rhinoceros and elephant poaching syndicates have expanded operations into areas where there are normally too many wildlife-viewing tourists for them to operate undetected (Save The Rhino Foundation 2020 ; Sishi and Cocks 2020 ). The sudden absence of tourists has also been cited as a factor in poaching incidents in India (Karmakar 2020 ) and to explain a surge in illegal logging in Tunisia (Foroudi 2020 ). The absence of tourists effectively modifies the production function of poachers by opening more territory and increasing the available stock of the target resource. A general increase in labor availability is also a likely contributing factor. Finding themselves without income, millions of migrant workers (international and internal) have returned to rural areas throughout the developing world (Kinetz 2020 ; Ellis-Petersen and Chaurasia 2020 ; Bank 2020 ; Chávez Yacila and Turkewitz 2020 ; Chulov M and Safi M 2020 ). This arrival increases the total amount of labor time available in local resource-dependent economies. It also increases the local demand for food and other needs. The World Bank warns that many returning migrants will fall into poverty and threaten food security in their home villages (Kray and Shetty 2020 ). Demand/Price Shocks for Households as Producers The rapid onset of a global recession has affected the demand for many goods exported by resource rich developing countries. Drops in demand reduce prices and production, constrain the sectors of activity that local workers can engage in, and lower wage income. A sharp decline in the demand for natural resources commodities (US Energy Information Administration 2020 ) resulted in a significant drop in prices. The Bank of Canada's Commodity Price Index declined by 41% between January and April (Bank of Canada 2020 ). U.S. crude oil prices even went negative for the first time in history (BBC News 2020 ). Early reporting by the U.N. Food and Agriculture Organization paints a complex set of impacts to the world fisheries (FAO 2020 ). The demand for fresh fish has been volatile but generally down. On the other hand, consumer demand for canned goods was up significantly in the early days of the pandemic. Worldwide, high seas commercial fisheries landings were down 6.5% but small scale fisheries were most seriously disrupted by the closure of fresh food markets. Some countries have experienced very different impacts. In Peru for instance (the world's largest producer of fishmeal), commercial fishing effort dropped by 80% after the announcement of self-isolation rules despite fishing being excluded from mandatory lockdowns (Arony 2020 ). The FAO indicates that the pandemic threatens to make women, migrant fishers and fish workers economically vulnerable. By the end of April 2020, all countries had put in place travel restrictions and domestic lock-down orders, effectively halting all tourism (United Nations World Tourism Organisation 2020 ; Airports Council International 2020 ). The prospect of a prolonged loss of income from nature and wildlife tourism threatens to undo decades of development work aimed at creating sustainable community-based conservation strategies. Developing countries with biodiversity hotspots are left particularly vulnerable. Nature-based tourism represents more than 10% of the economies of Kenya, Tanzania, South Africa, and Namibia. Nineteen small island nations derive more than 20% of their GDP directly from tourism, where the main attractions are beaches and reef-based activities (Coke-Hamilton, Pamela 2020 ). Direct tourism fees are the primary source of funding for national parks and reserves in most developing countries ($142 million in Africa alone in 2013 according to the World Tourism Organization ( 2015 ). The sudden loss of revenue forced the layoff of wardens and rangers in Zimbabwe and other countries (International Fund for Animal Welfare 2020 ). Lockdown measures have created financial emergencies at zoos and wildlife rehabilitation centers, resulting in layoffs of caretakers and further endangering species like the Orangutan of Borneo (Gokkon, Basten 2020 ; CTVNews 2020 ). The pandemic has bolstered the demand for Traditional Chinese Medicine (TCM). In particular, the Chinese government has endorsed the use of dried bear bile for COVID-19 (The Economist 2020 ). No claim is made by Chinese authorities that TCM ingredients have therapeutic value but widespread beliefs in their properties are shifting demand upwards. For suppliers of TCM, increased demand/price makes their production more attractive. 2 Disruptions of Institutions and Supply Chains The combination of illnesses, border closures, lockdowns and other policies has resulted in disruptions to trade relationships and markets, shifting the conditions under which producers operate and affecting the relative marginal value of labor in different sectors. As previously mentioned, lockdown orders and self-distancing rules have made it difficult for small scale fishers to sell their fresh catch. In addition, a variety of bans and restrictions on wildlife trade (with exceptions for TCM) have been imposed in China since the onset of the pandemic. These policies directly affect the economics of bushmeat hunting and trade and may shift consumer preferences over time. Impacts on Households as Consumers All disruptions impacting the ability of households to produce and generate income feed directly into their budget, endogenously modifying immediate demand within the local economy. Also disrupted are their ability to save and invest in lasting capital like education or farming equipment, with repercussions on the long term dynamics of bioeconomic systems. One potentially very significant shock to rural economies and resources is a dramatic fall in remittances sent home from migrant workers. The World Bank projects that international remittances will fall by 20% in 2020. For the world's fifteen low or middle income countries designated as megadiverse (UNEP 2020 ), pre-pandemic remittances averaged 2.1% of GDP (World Bank 2020a , f ). For them, the expected shortfall for the year exceeds $50 billion. Remittances originating from within a country are not accounted for in these statistics but should also be expected to decline, further reducing household income. A Broader View of Shocks and Biodiversity This section has two objectives. First, we step back from the specifics of the current pandemic to situate it and the long list of short term impacts in the broader context of different risks faced by households in biodiversity-rich countries. This includes other disease outbreaks, natural disasters, armed conflicts, major political crises as well as recessions and financial crises. Second, we briefly explore what can be learned from the literature by studying the links between past random events in these categories, household responses, and impacts on nature and biodiversity. Random Shocks You Can Count On Poor households at the interface of nature are not strangers to negative income shocks. In a series of detailed surveys, 64% of 7978 households in the rural areas of 24 developing countries reported suffering at least one negative income shock in the previous 12 months (Wunder et al. 2014 ). Common shocks included wage loss, crop failure, loss of livestock, other asset losses, serious illness, and death. Similarly, communities dependent on small-scale fisheries report that their vulnerability to diseases is one of the principal threats to their livelihood (Béné and Friend 2011 ; Mills et al. 2011 ). Figure 1 presents a different perspective on risks aggregated at the national level for a sample of 15 developing countries designated as "megadiverse", and 6 others with "biodiversity hotspots" and a heavy reliance on ecotourism. These 21 countries are recognized as among the most biodiverse in the world, but the grouping remains a convenience sample standing in for a larger class of low to mid income biodiversity-rich countries. The NGO Conservation International identifies thirty-six biodiversity hotspots covering 2.4% of earth's surface and 43% of endemic animal species, overlapping with 142 nations (Conservation International 2020 ; Mittermeier et al. 2011 ). "Megadiverse country" is a formal designation recognized by the United Nations and given to the top 17 most biodiverse nations of the world (UNEP 2020 ). Together, megadiverse countries hold more than two thirds of all non-fish invertebrate species and three quarters of all plant species. Only the USA and Australia have developed economies and they are omitted from the list for this reason. Fig. 1 Shocks in a sample of biodiversity-rich developing countries—1970–2020 Each country in Fig. 1 has two rows presenting data in a time sequence. The first row reports occurrences of natural disasters and disease outbreaks. In a country-year cell, the background is shaded if one or more natural disaster were recorded that year. The cell is also marked by a "X" or " X " if one or more disease outbreaks occurred respectively. The second row reports occurrences of armed conflicts/political crises (shaded cells) and economic/financial crises (red vertical line pattern). An event that spans multiple years is recorded for its entire duration in the grid but counted only once in the total tally of events. The data set underlying Fig. 1 was assembled for this paper and remains preliminary. Although we took a systematic approach, it is not yet fully validated nor ready for formal statistical or econometric analysis. Thus, we introduce Fig. 1 as a synopsis of the data to convey the extent to which human populations in biodiverse countries of the global South are subjected to negative random shocks. 3 Over the period 1970–2020, we record a total of 5014 events. By far the most common type of events is natural disasters (3947 events). These include droughts, floods, extreme temperatures, insect infestations, landslides, earthquakes, volcanic activity, and wildfires. An event is included in the source data (the EM-DAT database) if it resulted in 10 or more deaths or if 100 or more people were affected/injured or made homeless. On average, a country experienced 3.8 natural disasters per year. Half of all natural disasters affected more than 10,000 people, and of the 419 events affecting more than one million people, 40% were caused by floods, 28% by tropical cyclones, and 19% by drought. With 498 events, armed conflicts and major political crises are the next most numerous. Armed conflicts took place at some point in 18 of the 21 countries in the sample. A conflict is included when more than 25 battle deaths have been recorded (Pettersson et al. 2019 ; Gleditsch et al. 2002 ). Major political crises such as the ongoing crisis in Venezuela are only counted when they have been broadly recognized as having destabilized a country's political and economic systems. The criterion for including epidemics and disease outbreaks in our data is somewhat less precise. This owes to variations in definitions used by different reporting agencies and research groups. An additional complication comes from the fact that a majority of the 453 disease outbreaks reported Fig. 1 involve endemic diseases such as malaria and denge. Figure 1 does not report endemic diseases per say, but it does include notable outbreaks documented in the literature as events where the incidence of cases significantly exceeded a country's normal baseline level (WHO 2020b ). In the case of malaria, for instance, El Niño years are often associated with significantly higher prevalence, leading health agencies and researchers to declare outbreaks (Gagnon et al. 2002 ). We include these events when experts have determined that they are distinguishable from the usual prevalence of a disease. Finally, we count 116 instances of economic recessions or financial crises as determined by the OECD or IMF. Most countries in the sample suffered from the 1982 economic recession. Latin America was most affected, leading to the 1980s being dubbed the "lost decade" (Kose 2015 ). The 1997 Asian financial crisis also reverberated throughout Latin America and Africa (Monitor and Outlook 1998 ). The 2008–2009 global recession affected half of the sample. It is worth noting that natural disasters often spark disease outbreaks (Kouadio et al. 2012 ) and may also lead to conflicts or economic crises. Hence, one should expect that the data harbor some degree of correlation between risk categories, and indeed, that in some cases, there exists a causal relationship between them. 4 How will the incomplete data look by the end of the year (or in the next few years)? With continued exponential growth of COVID-19 cases across the developing world, all countries in the sample will have suffered a national level epidemic. Second, all countries (possibly with the exception of China) are expected to fall into recession. At no time has this happened in the previous 50 years. Finally, natural disasters and other crises will continue to occur. Unsurprisingly, this paints 2020 as an exceptional year at the country level, leaving us no empirical basis to fully predict the compounding effects of so much disruption. Yet, studies of the impacts of each of the four categories of shocks presented in Fig. 1 remain useful to discern general patterns. Responses to Shocks in Bioeconomic Systems Diseases It is well documented that cumulative disease burden plays a direct role in the creation and maintenance of poverty traps, and hinders the economic growth of poor countries (Ngonghala et al. 2014 ; Bloom et al. 1998 ; Bleakley 2007 ; Hibbs and Olsson 2004 ; Sachs and Malaney 2002 ). Households in low to mid-income biodiverse countries already contend with high rates of morbidity and mortality from diseases such as malaria, HIV/AIDS, tuberculosis and a long list of other tropical diseases (Mathers and Loncar 2006 ). Even though HIV/AIDS is not included in Fig. 1 , its documented impacts on conservation are nearly identical to the short term observations made above for COVID-19: increased poaching and use of natural medicines, increased illness and death of park rangers and conservation workers, and diversion of public funds away from conservation efforts (Rija et al. 2013 ). At the household level, diseases contribute to food insecurity and reliance on natural resources (Yager et al. 2011 ). For example, Völker and Waibel ( 2010 ) find that health shocks increase the likelihood of forest production by rural households in Vietnam; and McSweeney ( 2004 ) reports that indigenous households in Honduras are more likely to sell forest products when afflicted by illness, but less likely following a death or during a long-lasting sickness. Epidemics also scare visitors away. The World Travel and Tourism Council ( 2020 ) estimates the worldwide economic impact of H1N1 on global tourism at US$55 billion. The SARS outbreak imposed losses $30-50 billion on the four affected countries. The Ebola epidemic reduced tourism to East Africa for over two years after the epidemic was declared over, and even affected countries that did not record any infections (Novelli et al. 2018 ). It took between 10 and 19 months after the end of these epidemics for the number of visitors to return to normal. COVID-19 may continue to scare away tourists from nature destinations for some time, but continued travel restrictions and the possibility that travel insurance may not cover COVID-19 treatment pose new hurdles to the recovery of nature-based tourism. Economic and Financial Crises Evidence of the impact of the 2008–2009 recession on biodiversity comes from individual case studies. They point to a reallocation of labor towards natural resource extraction across a broad spectrum of countries and locations: increased illegal shellfish harvesting in Spain (Ballesteros and Rodríguez-Rodríguez 2019 ); reversion to poaching and slash and burn forestry in Cameroon (Sayer et al. 2012 ); and a tripling of the rate deforestation due to artisanal gold mining in the Amazon (Asner et al. 2013 ). World Bank data show that remittances declined by 5.2% during the 2008–2009 recession (Sirkeci et al. 2012 ) (roughly one fourth the expected decrease attributable to the pandemic). The decrease in transfers seriously affected food security in Nepal (Tiwari and Joshi 2012 ). In Mexico, households with lower levels of remittances were more likely to depend on natural resource extraction and other environmental income (López-Feldman and Chávez 2017 ). Armed Conflicts/Political Crises The study of armed conflicts is particularly pertinent to the current situation because of the broad disruptions that they impose. Banerjee and Duflo ( 2020 ) recently compared the pandemic to a war. Over the period 1950-2000, 80% of armed conflicts around the world took place in areas classified as biodiversity hotspots (Hanson et al. 2009 ). Gaynor et al. ( 2016 ) reviews the impacts of 144 conflicts on conservation. They find predominantly negative effects on wildlife, habitat, and conservation. The behavior of households whose lives are disrupted by conflicts is found to be the primary source of impacts on the environment. The channels of impacts on wildlife parallel the short term effects of the pandemic: high resource extraction, poaching and high bushmeat demand by displaced people; disruption of food supply networks; reduced household investments; and reduced ability of local governments and NGOs to manage conservation areas in the face of lost tourism revenue and international support. Similarly, major political crises in Latin America have contributed to poor rural governance and mass emigration, leading to higher rates of land clearance and resource extraction (Wolff 2007 ; Caraballo-Arias et al. 2018 ; Combaz 2020 ). Natural Disasters Small-scale farmers at the interface of nature are often affected by pests, floods and droughts. For instance, peasants in the Peruvian Amazon increase their reliance on forest resources, including upland cropping, fishing, and the harvesting of non-timber forest products following flooding events (Takasaki et al. 2004 ). Wunder et al. ( 2014 ) finds that only a minority of households in a panel of 23 biodiverse countries regularly rely on forests to fill seasonal periods of high labor availability and in response to external shocks. However, Noack et al. ( 2019 ) finds from the same data that the reallocation of effort towards extracting from common pool resources during periods of drought is nonetheless statistically significant. The general conclusion that one may draw from the literature on household risk management and impact alleviation is that households try to maintain a diversified portfolio of income sources (agriculture, animal husbandry, wage income, natural resource extraction for home consumption or trading, the receipt of remittances from family members, etc.). Where feasible, households smooth their consumption over time, but the diversification of their income sources and consumption smoothing are hindered by incomplete markets and a lack of access to financial instruments such as crop insurance and personal credit. Households' responses to stochastic shocks do not always imply increased reliance on wildlife and nature, but it is a common coping strategy. Random Shocks You Can Count On Poor households at the interface of nature are not strangers to negative income shocks. In a series of detailed surveys, 64% of 7978 households in the rural areas of 24 developing countries reported suffering at least one negative income shock in the previous 12 months (Wunder et al. 2014 ). Common shocks included wage loss, crop failure, loss of livestock, other asset losses, serious illness, and death. Similarly, communities dependent on small-scale fisheries report that their vulnerability to diseases is one of the principal threats to their livelihood (Béné and Friend 2011 ; Mills et al. 2011 ). Figure 1 presents a different perspective on risks aggregated at the national level for a sample of 15 developing countries designated as "megadiverse", and 6 others with "biodiversity hotspots" and a heavy reliance on ecotourism. These 21 countries are recognized as among the most biodiverse in the world, but the grouping remains a convenience sample standing in for a larger class of low to mid income biodiversity-rich countries. The NGO Conservation International identifies thirty-six biodiversity hotspots covering 2.4% of earth's surface and 43% of endemic animal species, overlapping with 142 nations (Conservation International 2020 ; Mittermeier et al. 2011 ). "Megadiverse country" is a formal designation recognized by the United Nations and given to the top 17 most biodiverse nations of the world (UNEP 2020 ). Together, megadiverse countries hold more than two thirds of all non-fish invertebrate species and three quarters of all plant species. Only the USA and Australia have developed economies and they are omitted from the list for this reason. Fig. 1 Shocks in a sample of biodiversity-rich developing countries—1970–2020 Each country in Fig. 1 has two rows presenting data in a time sequence. The first row reports occurrences of natural disasters and disease outbreaks. In a country-year cell, the background is shaded if one or more natural disaster were recorded that year. The cell is also marked by a "X" or " X " if one or more disease outbreaks occurred respectively. The second row reports occurrences of armed conflicts/political crises (shaded cells) and economic/financial crises (red vertical line pattern). An event that spans multiple years is recorded for its entire duration in the grid but counted only once in the total tally of events. The data set underlying Fig. 1 was assembled for this paper and remains preliminary. Although we took a systematic approach, it is not yet fully validated nor ready for formal statistical or econometric analysis. Thus, we introduce Fig. 1 as a synopsis of the data to convey the extent to which human populations in biodiverse countries of the global South are subjected to negative random shocks. 3 Over the period 1970–2020, we record a total of 5014 events. By far the most common type of events is natural disasters (3947 events). These include droughts, floods, extreme temperatures, insect infestations, landslides, earthquakes, volcanic activity, and wildfires. An event is included in the source data (the EM-DAT database) if it resulted in 10 or more deaths or if 100 or more people were affected/injured or made homeless. On average, a country experienced 3.8 natural disasters per year. Half of all natural disasters affected more than 10,000 people, and of the 419 events affecting more than one million people, 40% were caused by floods, 28% by tropical cyclones, and 19% by drought. With 498 events, armed conflicts and major political crises are the next most numerous. Armed conflicts took place at some point in 18 of the 21 countries in the sample. A conflict is included when more than 25 battle deaths have been recorded (Pettersson et al. 2019 ; Gleditsch et al. 2002 ). Major political crises such as the ongoing crisis in Venezuela are only counted when they have been broadly recognized as having destabilized a country's political and economic systems. The criterion for including epidemics and disease outbreaks in our data is somewhat less precise. This owes to variations in definitions used by different reporting agencies and research groups. An additional complication comes from the fact that a majority of the 453 disease outbreaks reported Fig. 1 involve endemic diseases such as malaria and denge. Figure 1 does not report endemic diseases per say, but it does include notable outbreaks documented in the literature as events where the incidence of cases significantly exceeded a country's normal baseline level (WHO 2020b ). In the case of malaria, for instance, El Niño years are often associated with significantly higher prevalence, leading health agencies and researchers to declare outbreaks (Gagnon et al. 2002 ). We include these events when experts have determined that they are distinguishable from the usual prevalence of a disease. Finally, we count 116 instances of economic recessions or financial crises as determined by the OECD or IMF. Most countries in the sample suffered from the 1982 economic recession. Latin America was most affected, leading to the 1980s being dubbed the "lost decade" (Kose 2015 ). The 1997 Asian financial crisis also reverberated throughout Latin America and Africa (Monitor and Outlook 1998 ). The 2008–2009 global recession affected half of the sample. It is worth noting that natural disasters often spark disease outbreaks (Kouadio et al. 2012 ) and may also lead to conflicts or economic crises. Hence, one should expect that the data harbor some degree of correlation between risk categories, and indeed, that in some cases, there exists a causal relationship between them. 4 How will the incomplete data look by the end of the year (or in the next few years)? With continued exponential growth of COVID-19 cases across the developing world, all countries in the sample will have suffered a national level epidemic. Second, all countries (possibly with the exception of China) are expected to fall into recession. At no time has this happened in the previous 50 years. Finally, natural disasters and other crises will continue to occur. Unsurprisingly, this paints 2020 as an exceptional year at the country level, leaving us no empirical basis to fully predict the compounding effects of so much disruption. Yet, studies of the impacts of each of the four categories of shocks presented in Fig. 1 remain useful to discern general patterns. Responses to Shocks in Bioeconomic Systems Diseases It is well documented that cumulative disease burden plays a direct role in the creation and maintenance of poverty traps, and hinders the economic growth of poor countries (Ngonghala et al. 2014 ; Bloom et al. 1998 ; Bleakley 2007 ; Hibbs and Olsson 2004 ; Sachs and Malaney 2002 ). Households in low to mid-income biodiverse countries already contend with high rates of morbidity and mortality from diseases such as malaria, HIV/AIDS, tuberculosis and a long list of other tropical diseases (Mathers and Loncar 2006 ). Even though HIV/AIDS is not included in Fig. 1 , its documented impacts on conservation are nearly identical to the short term observations made above for COVID-19: increased poaching and use of natural medicines, increased illness and death of park rangers and conservation workers, and diversion of public funds away from conservation efforts (Rija et al. 2013 ). At the household level, diseases contribute to food insecurity and reliance on natural resources (Yager et al. 2011 ). For example, Völker and Waibel ( 2010 ) find that health shocks increase the likelihood of forest production by rural households in Vietnam; and McSweeney ( 2004 ) reports that indigenous households in Honduras are more likely to sell forest products when afflicted by illness, but less likely following a death or during a long-lasting sickness. Epidemics also scare visitors away. The World Travel and Tourism Council ( 2020 ) estimates the worldwide economic impact of H1N1 on global tourism at US$55 billion. The SARS outbreak imposed losses $30-50 billion on the four affected countries. The Ebola epidemic reduced tourism to East Africa for over two years after the epidemic was declared over, and even affected countries that did not record any infections (Novelli et al. 2018 ). It took between 10 and 19 months after the end of these epidemics for the number of visitors to return to normal. COVID-19 may continue to scare away tourists from nature destinations for some time, but continued travel restrictions and the possibility that travel insurance may not cover COVID-19 treatment pose new hurdles to the recovery of nature-based tourism. Economic and Financial Crises Evidence of the impact of the 2008–2009 recession on biodiversity comes from individual case studies. They point to a reallocation of labor towards natural resource extraction across a broad spectrum of countries and locations: increased illegal shellfish harvesting in Spain (Ballesteros and Rodríguez-Rodríguez 2019 ); reversion to poaching and slash and burn forestry in Cameroon (Sayer et al. 2012 ); and a tripling of the rate deforestation due to artisanal gold mining in the Amazon (Asner et al. 2013 ). World Bank data show that remittances declined by 5.2% during the 2008–2009 recession (Sirkeci et al. 2012 ) (roughly one fourth the expected decrease attributable to the pandemic). The decrease in transfers seriously affected food security in Nepal (Tiwari and Joshi 2012 ). In Mexico, households with lower levels of remittances were more likely to depend on natural resource extraction and other environmental income (López-Feldman and Chávez 2017 ). Armed Conflicts/Political Crises The study of armed conflicts is particularly pertinent to the current situation because of the broad disruptions that they impose. Banerjee and Duflo ( 2020 ) recently compared the pandemic to a war. Over the period 1950-2000, 80% of armed conflicts around the world took place in areas classified as biodiversity hotspots (Hanson et al. 2009 ). Gaynor et al. ( 2016 ) reviews the impacts of 144 conflicts on conservation. They find predominantly negative effects on wildlife, habitat, and conservation. The behavior of households whose lives are disrupted by conflicts is found to be the primary source of impacts on the environment. The channels of impacts on wildlife parallel the short term effects of the pandemic: high resource extraction, poaching and high bushmeat demand by displaced people; disruption of food supply networks; reduced household investments; and reduced ability of local governments and NGOs to manage conservation areas in the face of lost tourism revenue and international support. Similarly, major political crises in Latin America have contributed to poor rural governance and mass emigration, leading to higher rates of land clearance and resource extraction (Wolff 2007 ; Caraballo-Arias et al. 2018 ; Combaz 2020 ). Natural Disasters Small-scale farmers at the interface of nature are often affected by pests, floods and droughts. For instance, peasants in the Peruvian Amazon increase their reliance on forest resources, including upland cropping, fishing, and the harvesting of non-timber forest products following flooding events (Takasaki et al. 2004 ). Wunder et al. ( 2014 ) finds that only a minority of households in a panel of 23 biodiverse countries regularly rely on forests to fill seasonal periods of high labor availability and in response to external shocks. However, Noack et al. ( 2019 ) finds from the same data that the reallocation of effort towards extracting from common pool resources during periods of drought is nonetheless statistically significant. The general conclusion that one may draw from the literature on household risk management and impact alleviation is that households try to maintain a diversified portfolio of income sources (agriculture, animal husbandry, wage income, natural resource extraction for home consumption or trading, the receipt of remittances from family members, etc.). Where feasible, households smooth their consumption over time, but the diversification of their income sources and consumption smoothing are hindered by incomplete markets and a lack of access to financial instruments such as crop insurance and personal credit. Households' responses to stochastic shocks do not always imply increased reliance on wildlife and nature, but it is a common coping strategy. Diseases It is well documented that cumulative disease burden plays a direct role in the creation and maintenance of poverty traps, and hinders the economic growth of poor countries (Ngonghala et al. 2014 ; Bloom et al. 1998 ; Bleakley 2007 ; Hibbs and Olsson 2004 ; Sachs and Malaney 2002 ). Households in low to mid-income biodiverse countries already contend with high rates of morbidity and mortality from diseases such as malaria, HIV/AIDS, tuberculosis and a long list of other tropical diseases (Mathers and Loncar 2006 ). Even though HIV/AIDS is not included in Fig. 1 , its documented impacts on conservation are nearly identical to the short term observations made above for COVID-19: increased poaching and use of natural medicines, increased illness and death of park rangers and conservation workers, and diversion of public funds away from conservation efforts (Rija et al. 2013 ). At the household level, diseases contribute to food insecurity and reliance on natural resources (Yager et al. 2011 ). For example, Völker and Waibel ( 2010 ) find that health shocks increase the likelihood of forest production by rural households in Vietnam; and McSweeney ( 2004 ) reports that indigenous households in Honduras are more likely to sell forest products when afflicted by illness, but less likely following a death or during a long-lasting sickness. Epidemics also scare visitors away. The World Travel and Tourism Council ( 2020 ) estimates the worldwide economic impact of H1N1 on global tourism at US$55 billion. The SARS outbreak imposed losses $30-50 billion on the four affected countries. The Ebola epidemic reduced tourism to East Africa for over two years after the epidemic was declared over, and even affected countries that did not record any infections (Novelli et al. 2018 ). It took between 10 and 19 months after the end of these epidemics for the number of visitors to return to normal. COVID-19 may continue to scare away tourists from nature destinations for some time, but continued travel restrictions and the possibility that travel insurance may not cover COVID-19 treatment pose new hurdles to the recovery of nature-based tourism. Economic and Financial Crises Evidence of the impact of the 2008–2009 recession on biodiversity comes from individual case studies. They point to a reallocation of labor towards natural resource extraction across a broad spectrum of countries and locations: increased illegal shellfish harvesting in Spain (Ballesteros and Rodríguez-Rodríguez 2019 ); reversion to poaching and slash and burn forestry in Cameroon (Sayer et al. 2012 ); and a tripling of the rate deforestation due to artisanal gold mining in the Amazon (Asner et al. 2013 ). World Bank data show that remittances declined by 5.2% during the 2008–2009 recession (Sirkeci et al. 2012 ) (roughly one fourth the expected decrease attributable to the pandemic). The decrease in transfers seriously affected food security in Nepal (Tiwari and Joshi 2012 ). In Mexico, households with lower levels of remittances were more likely to depend on natural resource extraction and other environmental income (López-Feldman and Chávez 2017 ). Armed Conflicts/Political Crises The study of armed conflicts is particularly pertinent to the current situation because of the broad disruptions that they impose. Banerjee and Duflo ( 2020 ) recently compared the pandemic to a war. Over the period 1950-2000, 80% of armed conflicts around the world took place in areas classified as biodiversity hotspots (Hanson et al. 2009 ). Gaynor et al. ( 2016 ) reviews the impacts of 144 conflicts on conservation. They find predominantly negative effects on wildlife, habitat, and conservation. The behavior of households whose lives are disrupted by conflicts is found to be the primary source of impacts on the environment. The channels of impacts on wildlife parallel the short term effects of the pandemic: high resource extraction, poaching and high bushmeat demand by displaced people; disruption of food supply networks; reduced household investments; and reduced ability of local governments and NGOs to manage conservation areas in the face of lost tourism revenue and international support. Similarly, major political crises in Latin America have contributed to poor rural governance and mass emigration, leading to higher rates of land clearance and resource extraction (Wolff 2007 ; Caraballo-Arias et al. 2018 ; Combaz 2020 ). Natural Disasters Small-scale farmers at the interface of nature are often affected by pests, floods and droughts. For instance, peasants in the Peruvian Amazon increase their reliance on forest resources, including upland cropping, fishing, and the harvesting of non-timber forest products following flooding events (Takasaki et al. 2004 ). Wunder et al. ( 2014 ) finds that only a minority of households in a panel of 23 biodiverse countries regularly rely on forests to fill seasonal periods of high labor availability and in response to external shocks. However, Noack et al. ( 2019 ) finds from the same data that the reallocation of effort towards extracting from common pool resources during periods of drought is nonetheless statistically significant. The general conclusion that one may draw from the literature on household risk management and impact alleviation is that households try to maintain a diversified portfolio of income sources (agriculture, animal husbandry, wage income, natural resource extraction for home consumption or trading, the receipt of remittances from family members, etc.). Where feasible, households smooth their consumption over time, but the diversification of their income sources and consumption smoothing are hindered by incomplete markets and a lack of access to financial instruments such as crop insurance and personal credit. Households' responses to stochastic shocks do not always imply increased reliance on wildlife and nature, but it is a common coping strategy. Research Opportunities and Challenge In light of the number of risks that households in biodiverse countries must face, it might be tempting to see the COVID-19 pandemic as "just" another shock. It is perturbing households from their equilibrium behavior and they can be expected to absorb the negative shock with existing mitigation strategies. General wisdom from accumulated knowledge would then suggest that the pandemic will often result in increased reliance on natural resources, bringing with it the strong possibility of habitat loss, increased harvesting and heightened risks of biodiversity loss. However, the pandemic is not like other random events. For many nature-dependent economies, it disaggregates into a large number of disturbances to many economic variables and functions. This brings many research opportunities but also poses some difficult challenges. Insofar as the pandemic is a unique event, it raises research questions that could not be answered until now. How does a complete shutdown of wildlife tourism change a local community's attitude towards community-based conservation programs? What is the value of the protection afforded to wildlife by the presence of visitors to protected areas? Will prohibiting the trade in wildlife in China be effective at reducing harvesting, change consumer preferences or limit the risks of zoonotic diseases? How does the sudden return of migrant workers to rural areas modify household's labor allocation strategies? How does it affect the ability of local communities to resolve resource conflicts? Each of the short term impacts listed in Sect. 2 generates many new research opportunities. The multiplicity of impacts will make it challenging for many modeling exercises. For instance, if many parts of a household's portfolio of activities is affected, the standard ceteris paribus assumption of partial analysis will no longer be tenable and a general equilibrium approach may be required to analyze households' decisions. At a micro level, households may decide or be forced to completely modify their decision-making process, adopt new parameters (e.g. rate of time preferences) or entirely new strategies (Barrett and Carter 2013 ; Singh et al. 1986 ). In addition, many empirical challenges will arise. The simultaneity of shocks brings endogeneity issues, for instance, and no obvious identification strategy may satisfactorily determine causality. Time-series data may no longer exhibit standard assumptions (e.g. ergodicity, stationarity). It will also take some time to establish which impacts of the pandemic are purely transitory (e.g. will all migrant workers eventually returning to cities), and which ones are permanent (e.g. change in preferences for bushmeat following trade bans). If we admit the possibility that the pandemic is causing permanent changes to key components of bioeconomic systems, we must also face the reality that many results from past research have become inherently less reliable for modeling, forecasting and policy design. As we often rely on accumulated knowledge, it will be necessary to better assess the relevance and validity of past assumptions and acknowledge that many of our future results will be subject to greater margins of error. The value of simply redoing past empirical studies has suddenly gone up since previous results may now be obsolete. The down side of this is that it will be much more difficult for our discipline to demonstrate the replicability of our empirical work (Ferraro and Shukla 2020 ). Where new results differ from previous ones, it might not be possible to ascertain whether the differences are attributable to actual changes resulting from the pandemic or to a methodological failure. While it might be easiest to deploy existing methods, there is also room, and perhaps a need, for bold new experimentation. For instance, the possibility that a package of policies may work better than individual ones in breaking the vicious circle between poverty and environmental degradation in different settings could be analyzed using a multiple-setting-multiple-country set up similar to the approach deployed by Banerjee et al. ( 2015 ) to study multifaceted programs to alleviate poverty. It would be useful, for instance, to better understand how cash transfers to rural households modify wildlife hunting effort and to compare this to various combinations of general cash transfers, conservation payments, wildlife conflict alleviation payments or individual job training/skills development. Randomized Control Trials in a particular region would enable an assessment of treatment effects and scaling these up to apply a standardized research protocol across different regions or countries would allow better comparative studies and accelerate learning. Further extending the approach to different natural resources (eg. wildlife harvesting vs. artisanal fisheries) may then reveal the extent to which the fundamental properties of certain mechanisms are robust across space and settings. A similar coordinated approach could be adopted to deploy micro-level field experiments, to study behavioral responses and collect survey data in conjunction with biological assessments of the state of local natural resources. Another valuable initiative would be to establish new longitudinal studies. Existing longitudinal studies such as the World Bank's Living Standards Measurement Surveys (World Bank 2020d ) work by CGIAR (CGIAR 2020 ) and ICRISAT (ICRISAT 2020 ) should soon detect some of the effects of the pandemic. Unfortunately, the countries and variables covered yield insufficient detail to study interactions between household decisions and surrounding natural resources, and little or none on the state of those resources. New panel data collections that cover natural resource use in detail and that also contain data on the state of natural assets would make it possible to monitor the evolution of complex systems over time, test for stability of parameters, monitor the emergence of poverty traps on environmental indicators, and much more. Adjusting ongoing data collections or creating large new ones would require concerted efforts and take a long time to bear fruits. The professional criteria that we use to define academic success do not properly incentivize such long term endeavors. This militates in favor of organizing a large consortium of economists and scientists in collaboration with an international agency that can ensure continuity and house the data in the public domain. Policy Challenges and Opportunities Part of the current public discourse on COVID-19 expresses a strong desire to "return to normal". Indeed, there is a need to reestablish pre-pandemic economic conditions. It is also necessary to resume local development efforts, research projects and community-based conservation initiatives. The resumption of anti-poaching efforts, a renewed commitment to fisheries monitoring, and enforcement of illegal logging statutes are all areas where resumption of pre-pandemic activities could help reduce pressure on wildlife and biodiversity. However, given the depth of the crisis, it would be optimistic to think that returning to business as usual will be sufficient to meet the challenges ahead. Tweaking existing policies at the margin will remain helpful but it is not likely to allow rural households to meet their current and future needs without further degrading natural assets. Besides, the trajectory of many (if not most) bioeconomic systems in the pre-pandemic "normal" was already compromising ecological functions, reducing wildlife and fish stocks, and threatening livelihoods. The harsh reality remains that little can prevent habitat destruction and biodiversity loss if the fundamentals of poverty and food insecurity are not addressed, and if better alternatives are not available for local populations. To that effect, there is an emerging chorus of voices calling to seize this moment in history to husher in transformational policies aimed at alleviating both poverty (Banerjee and Duflo 2020 ) and environmental degradation (Stiglitz 2020 ). In the short run, Banerjee and Duflo ( 2020 ) and Ravallion ( 2020 ) call for a rapid and forward-looking response, as the pandemic creates war-like conditions demanding a large fiscal response. It is encouraging that large expansionary fiscal and credit policies have been advocated for developing countries and that international institutions have pledged to support their administration (World Bank 2020c ). The short-run objectives should be to maintain or restore the food purchasing power of poor households through in-kind or cash transfers delivered on a large scale. Cash transfers may be preferable, but food aid may be more effective in areas where economic activity has been drastically reduced by lockdowns, or where local disruptions of the food supply from the virus or natural disasters compound the severity of the pandemic. The locust plague currently devastating East Africa is a prime example. Where food is in short supply, cash could only increase the price of available products and encourage bushmeat hunting. Many countries already have safety nets such as workfare or cash transfers (Ravallion 2016 ). Existing systems can be improved and made available to greater segments of the population. Enhancements could also specifically target regions with specific biodiversity conservation goals. Deploying conservation payments linked to specific conservation indicators (e.g. number of wild animal carcasses counted at local markets, hectares of uncleared forest, etc.), or to the adoption of given technologies (e.g. species-specific fishing gear to avoid by-catch) are opportunities to support local populations and simultaneously promoet better resource stewardship. For the longer term, policies that reduce the economic uncertainty faced by households, lower their risk-adjusted discount rate, and allow them to more efficiently invest in longer term economic strategies must be considered. This can be accomplished with generalized income support programs but also via more targeted approaches like crop insurance, investments in improved farming techniques, general economic diversification and achieving higher educational attainment. However, because the loss of biodiversity is a decentralized problem with global ramifications, slowing the rate of decline will remain difficult without a much stronger commitment to international cooperation. Strengthening the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES) and the International Whaling Commission, addressing climate change, and developing more stringent agreements to monitor illegal fishing and regulate landings from fisheries that operate in international waters are all key to making progress. It may be difficult to be optimistic about the prospects of greater international coordination and cooperation, but existing agreements and new initiatives like the FAO's multi-stakeholders framework for eradicating poverty in small scale fisheries (FAO 2015 ) provide the basis for action. There is perhaps one transformational approach to policy making that would only require deploying basic economic principles. Nations around the world continue to directly and indirectly subsidize natural resource exploration, extraction, land conversion and other activities harmful to biodiversity, with a welfare cost estimated in the trillions of dollars annually (United Nations 2020 ; Coady et al. 2019 ; van Beers and van den Bergh 2001 ). A serious commitment by national governments and international organizations to stop subsidizing activities that generate negative externalities would follow basic principles of efficiency, but could also deeply reshape our impact on nature (Stiglitz 2020 ). Properly taxing externalities and subsidizing economic activities that produce positive externalities sounds basic because, after all, it is. We must remain mindful of the fact that any change to complex dynamic bioeconomic systems can have deep, unintended and lasting impacts. However, if the COVID-19 pandemic spurs governments to rethink fiscal and international organizations to reorient aid dollars away from ecologically harmful subsidies, then perhaps the pandemic will have served one positive purpose.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1449223/

Jacobson v Massachusetts at 100 Years: Police Power and Civil Liberties in Tension

A century ago, the US Supreme Court in Jacobson v Massachusetts upheld the exercise of the police power to protect the public's health. Despite intervening scientific and legal advances, public health practitioners still struggle with Jacobson's basic tension between individual liberty and the common good. In affirming Massachusetts' compulsory vaccination law, the Court established a floor of constitutional protections that consists of 4 standards: necessity, reasonable means, proportionality, and harm avoidance. Under Jacobson , the courts are to support public health matters insofar as these standards are respected. If the Court today were to decide Jacobson once again, the analysis would likely differ—to account for developments in constitutional law—but the outcome would certainly reaffirm the basic power of government to safeguard the public's health.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4626594/

Global gene expression by Bacillus anthracis during growth in mammalian blood

During the late stages of systemic anthrax, Bacillus anthracis grows rapidly in the host bloodstream. To identify potential genes necessary for this observed rapid growth, we defined the transcriptional profile of B. anthracis during in vitro growth in bovine blood. Genome-wide transcriptome analysis indicated that B. anthracis undergoes significant changes in its transcriptome profile during growth in blood, including the differential regulation of genes associated both with metabolism and known virulence factors. Collectively, these data provide a framework for future studies identifying specific B. anthracis factors required for growth in the mammalian bloodstream.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7176176/

Rapid Detection of Bioterrorism Pathogens

Introduction Pathogen identification is a crucial first defense against bioterrorism. A major emphasis of our national biodefense strategy is to establish fast, accurate and sensitive assays for diagnosis of infectious disease agents likely to be used in a bioterrorist event. The Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health's National Institute of Allergy and Infectious Diseases have identified three priority classes or "select agents" of pathogens and toxins. These are designated A, B, and C, and are likely candidates since they can be easily disseminated, usually in aerosol form, require small numbers of organisms or molecules to cause disease, and result in rapid morbidity and mortality. The challenge for most infectious diseases specialists is that these agents are rarely encountered in normal practice, many are seen in remote outbreaks in distant countries, and one (smallpox) has been eradicated with the last case observed several decades ago. As our first line of defense, the vast majority of physicians may not be able to distinguish the early events of a bioterrorist event from other atypical pneumonias or cutaneous infections. The challenge of rapid pathogen or toxin recognition is to aid physicians in the diagnostic process and to help identify at an early stage a potential deliberate outbreak [ 1 ]. Such assays will ensure early and appropriate treatment of infected patients, and will alert public health authorities and law enforcement to help contain an outbreak. A major lesson of the October 2001 anthrax outbreak was that aggressive therapeutic intervention saves lives, since highly virulent organisms like anthrax can respond well to antimicrobial therapy when diagnosed in the early stages [ 2 , 3 ]. Unfortunately, the early signs and symptoms of many of these diseases are nonspecific so it is critical that highly sensitive and reliable tools are available to identify infected individuals. The first step toward effective patient and public health control is to identify rapidly the infecting pathogen and its source. Some of these select agents are highly transmissible in the early stages of disease and it is critical to identify infected patients to limit the risk to the remainder of the population. In some cases, such as hemorrhagic fever with Ebola virus, it is hypothesized that patients become infected through contact with an infected animal. Yet, the natural reservoir of the virus is unknown, as is the manner in which the virus first appears in a human at the start of an outbreak [ 4 ]. Whether the initial source can be elucidated or not, rapid diagnostic procedures are critical to support infection control measures that monitor and limit the spread of infectious diseases agents [ 5 , 6 ]. Finally, accurately defining the scope and progression of an infectious disease outbreak helps mobilize resources more efficiently and eases public anxiety that can lead to panic [ 7 ]. Limitation of Conventional Diagnostics Rapid clinical diagnosis and aggressive preemptive therapy can limit the fatalities associated with a biological agent of mass destruction [ 8 , 9 ]. Most clinical laboratories, however, still rely upon culture-based technology with phenotypic endpoints, approved by FDA and/or CDC. These assays can take several days for definitive results. In addition to time delays, these techniques often lack adequate sensitivity and specificity and some organisms are difficult to isolate in culture. Delays often translate into the initiation of empiric therapy in the absence of positive pathogen identification. The problem is not limited to a bioterrorism outbreak as hospital and public health laboratories, confounded by inadequate and slow methodology for pathogen detection, often have difficulty identifying pathogens. When occurring with very ill and/or immunocompromised patients, these delays can increase morbidity and mortality. In a bioterrorist event, like many naturally occurring disease outbreaks, there is a need to obtain rapid pathogen identification from clinical specimens but also from environmental specimens to minimize fomite-based transmission. Time delays measured in days can prevent adequate public health measures from being instituted to contain an outbreak. Such delays also subject exposed individuals to needless stress and anxiety. The inadequacy of phenotypic-based diagnostic assays is illustrated graphically by the "gold standard" public health laboratory-testing algorithm that was in place for positive identification of Bacillus anthracis from environmental samples during the October 2001 anthrax outbreak (Fig. 16.1a ). A complicated matrix of phenotypic and biochemical assays required 3–5 days for a positive endpoint. What was needed was a streamlined approach that could progress from primary specimen to a positive or negative outcome in a matter of hours or less (Fig. 16.1b ). Rapid diagnostics have finally come of age and offer exceptional promise in this regard for accurate pathogen identification. Fig. 16.1 ( a ) Schemes for identification of Bacillus anthracis . New York City Department of Health interpretation algorithm for identification of Bacillus anthracis from environmental samples based on CDC guidelines. ( b ) Desired pathway for identification of Bacillus anthracis Rapid Identification Methods Rapid identification assays can be loosely divided into tests that either utilize antigen-antibody or other antibody-specific binding to identify a specific pathogen or genetic tests that identify pathogen-specific DNA or RNA sequences. Serologies: Antigen–Antibody Interactions Serological techniques have been invaluable for detecting active infections with organisms that are difficult to culture and for documenting previous infection/immunity. While conventional serodiagnosis has a limited ability to detect acute infections with select agents, it is invaluable for monitoring disease kinetics and dispersion of these agents within exposed or high-risk populations, especially where asymptomatic infections are frequent. Such information is crucial to therapeutic intervention and prophylaxis, as well as to isolation protocols in the context of a biological attack. Serodiagnosis is particularly useful for mass screening of infectious diseases because such techniques are generally simple to perform, inexpensive and amenable to high throughput technologies. The assay takes advantage of the exquisite sensitivity and specificity of antigen-antibody interactions. Antigen capture assays represent a somewhat more recent addition to serological techniques. These methods have been useful for rapidly diagnosing acute infections where antigen levels are relatively high, especially in the urine where they may be concentrated. The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) has become the workhorse of most clinical laboratories. It relies on specific antigen-antibody interactions to identify a pathogen [ 10 ]. Typically, a preliminary test can be performed quickly, usually within 3–4 h. A positive ELISA test can be confirmed by performing a Western Blot with target-specific antibodies or by an immunofluorescent antibody (IFA). Unfortunately, pathogen antigen production or a host antibody response is not always robust enough to permit reliable testing, especially in the early stages of an infection. In addition, a false positive result with an ELISA test can occur due to interference from other antibodies. Although the ELISA test is highly specific, an antibody response may not be detected in either the early or late stages of a disease. Improved sensitivity may be obtained by expanding the class of antibodies detected to IgG, IgA and/or IgM classes of antibodies [ 11 ]. ELISA platforms are especially well suited for toxin detection and, when combined with procedures such as time-resolved fluorometry, sensitivities of 4–20 pg/mL can be obtained in a typical 2 h assay for molecules such as botulinum type A or B neurotoxin and Staphylococcus aureus enterotoxin B [ 12 ]. A newer format for antigen-antibody detection where the detector antibody is labeled by chemiluminescence facilitates an even greater sensitivity [ 13 ]. In one approach, target antigen is first complexed to paramagnetic beads coated with capture antibody and then identified using a detector antibody. An electrochemical flow cell with photon detector is used to detect the target-antibody interactions with detection limits approaching 200 fmol/L and dynamic ranges of six orders of magnitude [ 10 ]. More recently, a novel type of biosensor for rapid pathogen identification has been described using B cells as sensing elements. This system know as CANARY (cellular analysis and notification of antigen risks and yields) utilizes B lymphocytes genetically engineered to express both cytosolic aquorin, a calcium-sensitive bioluminescent protein, and membrane bound antibodies specific for a given pathogen or toxin [ 14 ]. Interactions of antigen with antibody elevate intracellular calcium levels resulting in light emission by the cytosolic aquorin molecules. The system responds in a fashion that is more rapid, sensitive, and specific than most antigen detection systems, and has been shown to detect Yersinia pestis in less than 3 min at levels of 50 colony forming units [ 14 ]. Antigen–Non-Antibody Target Interactions In recent years, the recognition that pathogens can evoke specific T-cell responses has been used to develop assays such those used in the enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) T-SPOT TB ® and Quantiferon-TB for the diagnosis of latent tuberculosis infection. The exquisite sensitivity of these assays in which signature TB peptides elicit specific interferon gamma release makes them applicable to immunosuppressed individuals, while the specificity of the assay overcomes problems such as prior vaccination with Bacille Calmette-Guérin (BCG). These assays cannot distinguish between drug sensitive and resistant forms of TB, but are particularly valuable in following diseases transmission in settings where multidrug resistant (MDR) or extremely drug resistant (XDR) strains are prevalent. Enzymatic activity has been used for some time in the detection of microorganisms. For example, the presence of significant levels of Helicobacter pylori in gastric secretions has been made using the detection of urease activity of the bacillus. Although bacterial urease production is not unique to H. pylori , the other urea producers are not found in the human stomach, the site of replication of H. pylori . An example of a bioterrorism antigen detection system utilizing a specific enzymatic interaction with a substrate rather than binding to an antibody is the micromechanosensor reported by Liu, et al. [ 15 ]. The functional nature of a toxin is detected utilizing microfabricated cantilevers [ 16 ]. In this proof of concept model, botulinum neurotoxin B is detected by its activity as a endopeptidase, cleaving its neurotarget synaptobrevin 2 (also referred to as VAMP 2). The reporting system detects the large change in resonance frequency of the vibrations of the cantilever following release of the agarose bead, which is bound to the cantilever by synaptobrevin. The cantalever system is most sensitive in gaseous or vacuum milieus and the fluid medium damps the vibration to some degree. It can detect botulinum toxin at 8 nM concentration within 15 min and is applicable to on-chip electronic technology that greatly increases sensitivity. Genetics: Exploiting Genomic Differences Genomic differences between microbes offer an alternative to culturing for detection and identification of pathogens by providing species-specific DNA targets that can be accurately resolved by molecular methodology. Nucleic acid-based molecular approaches for pathogen identification overcome many of the deficiencies associated with conventional methods by exploiting both large- and small-scale genomic differences between organisms. Polymerase chain reaction (PCR)-based amplification of highly conserved ribosomal RNA (rRNA) genes, intergenic sequences, and specific toxin genes is currently the most reliable approach for identification of bacterial, fungal and many viral pathogenic agents. When combined with microarray or fluorescence-based oligonucleotide detection systems, these molecular approaches provide quantitative, high fidelity analysis [ 8 , 17 , 18 ]. Most importantly, these genetic probing systems offer rapid turn around time (1–6 h) and are suitable for high throughput, automated multiplex operations critical for use in clinical diagnostic laboratories. The need for rapid diagnostics was never more apparent than during the severe acute respiratory syndrome (SARS) epidemic of the spring of 2003. In the early stages of the epidemic, physicians and public health officials were relatively helpless to contain a fast moving, globally spreading epidemic of severe atypical pneumonia caused by an unknown respiratory agent. Once the viral agent was identified, genomic sequences of the SARS coronavirus (CoV) were used to develop a diagnostic assay within days that rapidly (within 1–2 h) and reliably identified the SARS CoV in a range of clinical and environmental specimens [ 19 ]. Armed with molecular tools, physicians and public health officials in China and Canada, hit hardest by the disease, could confirm the cause of rapidly spreading atypical pneumonias, monitor virus levels in patients and explore potential sources for the outbreak [ 20 – 23 ]. This single event highlighted the importance of rapid molecular diagnostics in outbreak control and disease management, signaling the arrival of a new era in diagnostics. Attributes of a Comprehensive Diagnostic Test An effective diagnostic assay must be rapid, sensitive and specific as well as being simple and robust to facilitate use in clinical and public health laboratories. Assays should detect a wide variety of pathogens and, where possible, have capacity to detect "designer" organisms (heterologously expressed toxin or virulence genes) created through recombinant technologies. Genetic-based molecular assays are currently in development that not only include all category A through C pathogen and toxin genes but also include a wide range of common bacteria, viruses and fungi. With this approach, it is possible to recognize in clinical (respiratory secretions, blood, urine, tissue), environmental (including letters, nasal swabs and hair) and food or water samples the presence of a pathogenic organism that is present as a homogeneous population or is cloaked by dispersion within a large population of nonpathogenic organisms. It is also possible to detect unnatural events such as the expression of a lethal toxin gene (such as a botulinum toxin genes) in a recipient nonpathogenic organism such as Escherichia coli or Bacillus subtilis . Similarly, a mixed powder containing anthrax-laden spores in a background of 99.9% B. subtilis spores would be perceived as harmless, until the 0.1% B. anthracis component began to cause disease. Such complex mixtures can be easily resolved by molecular diagnostics. Specificity and sensitivity are also key elements of the diagnostic assay. When specific probes are used, they must be shown to interact only with their designated targets to avoid false positive responses. The advent of real-time self-reporting probes capable of allele-specific sequence discrimination at the level of a single nucleotide allows these probes to react with exceptional fidelity [ 24 , 25 ]. Sensitivity is a major requirement especially because in early stages of a disease few pathogens may be present for detection. Some pathogens like Francisella tularensis , the etiological agent of tularemia, need only a few organisms to cause lethal disease [ 26 ]. DNA Microarrays Microarrays of nucleic acids were developed to utilize the enormous amount of information provided by genome projects but have clear potential in mass screening and diagnostics [ 27 , 28 ]. A microarray allows thousands of targets to be analyzed simultaneously, being particularly useful for novel virus identification and characterization. Microarrays consist of gene and genome-specific nucleic acid fragments, either cloned gene segments or long (70–80 mers) oligonucleotides, which are fixed to a glass slide or other solid matrix such as those used for computer chips [ 29 ]. One such product is the GeneChip®, a high density, oligonucleotide-based DNA array developed at Affymetrix. Target DNA or RNA is labeled and hybridized to complementary DNA sequences on the microarray. Scanning lasers are used to detect high affinity interactions and each addressable position corresponds to a known target. The application of this maturing technology may be best illustrated during the outbreak of SARS during early 2003. To assist in trying to identity the pathogen, the CDC referred specimens containing the unknown agent to many laboratories, including that of Dr. Joseph DeRisi. DeRisi had developed a microarray chip called Virochip containing nucleic acids specific for numerous viruses known to cause human disease. Hybridization of the unknown virus genome segments to the chip revealed the presence of a previously uncharacterized coronavirus. Subsequent molecular characterization and phylogenetic sequence comparisons confirmed that the virus was a new member of this family [ 30 , 31 ]. Microarray technology is powerful but also expensive, technically demanding and labor intensive. Amplifying the sample above background is critical to achieve dependable results. A highly purified nucleic acid sample is best for the assay as interfering substances may limit hybridization. False positive interactions can usually be minimized through careful microarray development with suitable redundancy of targets. It is best, however, to verify independently "positive hits" with a different technique. Like any hybridization-based assay, target specificity is critical, although absolute fidelity can be fine tuned. Allele-specificity at the level of single nucleotide changes can be desirable for subtyping of species [ 32 ]. The ability to detect imperfect matches within a family is equally desirable for the discovery of new disease agents and variants of old ones (SARS CoV). Of course, genetic microarrays like other genetic approaches can detect the presence of toxin genes, but they cannot be used to directly detect toxins. A trend toward fully automated microfluidic applications involving chip-based capillary electrophoresis that can perform in-line reagent dispensing, hybridization, and detection significantly reduces sample sizes and improves accuracy [ 33 ]. The combination of array hybridization followed by direct viral sequence recovery provides a general strategy for the rapid identification and characterization of novel viruses and emerging infectious diseases. The ability of DNA microarrays to identify either multiple gene targets from single or multiple pathogens in a single sample has the capacity to transform detection of emerging pathogens. It is particularly useful to evaluate rapidly changing disease agents such as influenza [ 34 ]. New platforms such as the GreeneChipPm, which is a panmicrobial microarray comprising 29,455 sixty-mer oligonucleotides, is suitable for comprehensive detection of a wide range of vertebrate viruses, bacteria, fungi, and parasites [ 35 ]. This technology has the potential to transform blood testing by providing an integrated platform for comprehensive testing that replaces multiple individual assays [ 35 , 36 ]. Real-Time Probes The simplest PCR form involves the use of specific primers to amplify a known target fragment of DNA or RNA and detection the product with an intercalating dye. This approach relies upon the specificity of linear DNA-DNA or DNA-RNA hybridization probes in the amplification process. Probe-target hybridization is highly temperature dependent, however, and, depending on the nucleotide composition of the probe, random annealing can pose a problem. Sequences with high G + C contents are especially vulnerable since the temperature profile for annealing is shifted and false priming may occur. In general, standard PCR-based amplification is insufficient for identification purposes due to relatively high levels of false positive results. A solution to this problem is the use of fluorescent probes such as the 5′ endonuclease, adjacent linear and hairpin oligoprobes and the self-fluorescing amplicons that require high fidelity binding to target sequences for detection [ 18 , 37 – 39 ]. Such high fidelity probes, especially self-reporting probes, have additional advantages in that both PCR amplification and detection can be done in a sealed tube, greatly reducing the possibility of contamination. They can also be used in real-time assays in which product formation is continuously monitored and validated. This is an important consideration for a clinical microbiology lab because PCR amplification has the potential to amplify small amounts of target DNA from contaminating organisms or even human DNA. Real-time PCR does not require post-PCR sample handling, preventing potential PCR product carry-over contamination and facilitating high throughput assays. Real-time PCR assays using high fidelity probes are also rapid (0.5–2 h), quantitative and have a large dynamic range exceeding 1 million-fold of starting target. Probing systems including LightCycler TM [ 40 , 41 ], TaqMan TM [ 42 ] and Molecular Beacons [ 24 , 43 ] are widely used to identify pathogens in real-time assays. The LightCycler system measures the fluorescence resonance energy transfer (FRET) between two linear oligonucleotide probes labeled with different fluorophores in a glass capillary tube format. The probes are hybridized to the target in a head-to-tail motif during the annealing stage of the PCR which bring the fluorophores in a close proximity, causing a transfer of energy resulting in an emission of a detectable fluorescent light. TaqMan probes are linear oligonucleotides that contain a 5′ reporter dye and 3′ acceptor with overlapping emission-absorption spectra. The reporter dye remains quenched by the 3′ acceptor, while hybridized to its target. Cleavage of the 5′ reporter by 5′ nuclease activity of Taq DNA polymerase results in strong fluorescence signals. TaqMan can be utilized in a 96 well format, amenable to high throughput screening. One limitation of FRET-based systems is that multiplexing is more limited since several quenchers in the same reaction are required and spectral overlap can be a problem. Molecular Beacons are small, single stranded nucleic acid hairpin probes that brightly fluoresce when bound to their targets [ 43 ]. The probes possess a stem and loop structure in which the loop contains a complementary target sequence. The stem forms by the annealing of short complementary nucleotide sequence arms adjacent to the target sequence. A fluorophore is covalently linked to one end of the stem sequence with a quencher covalently linked to the other end. In free solution, Molecular Beacons do not fluoresce because the stem structure keeps the fluorophore close to the quencher and fluorescence energy is absorbed and released as heat. In the presence of target DNA, however, the loop sequence anneals to the target and a probe-target hybrid is formed forcing the stems containing the fluorophore and quencher apart, and fluorescence occurs. Molecular Beacons are better suited than most linear probes to monitor authentic amplicons in PCR reactions because a single nucleotide mismatch can prevent a Molecular Beacon from binding to its target and lighting up [ 24 ]. Both TaqMan and Molecular Beacons can detect single nucleotide changes and are highly suitable for allelic discrimination [ 24 , 44 ]. Multiplex Assays A single multiplex reaction assay that combines numerous probes and is capable of identifying multiple pathogens is a more efficient and cost-effective approach for a clinical microbiology lab, greatly expanding the capacity of pathogens being surveyed. Multiplex assays require that probes representing different targets can be reliably resolved in the same reaction tube or well. Typically, different probes are labeled with a range of fluorophores that have unique emission spectra that can be discerned with discrete optics or dispersed onto an array for detection. When dealing with fluorophores, the spectral properties of the probe-target hybrid must be significantly different from the unbound probes to permit unambiguous probe identification. LightCycler TM , TaqMan TM and Molecular Beacon probes are all suitable for multiplex assays. The ability to multiplex PCR by probe color and melting temperature (T(m)) greatly expands the power of real-time analysis. Novel labeling techniques are evolving quickly that will allow more than 50 targets to be simultaneously evaluated in a single reaction. For example, MassTag PCR, which has been used detect viral hemorrhagic fever, is a multiplex assay in which microbial gene targets are coded by a library of 64 distinct mass tags. Nucleic acids are amplified by multiplex PCR using up to 64 primers, each labeled by a photo-cleavable link with a different molecular weight tag. After separation of the amplification products from unincorporated primers and release of the mass tags from the amplicons by UV irradiation, tag identity is analyzed by mass spectrometry [ 45 ]. Target Selection A number of target sequences have been proposed for the identification of pathogens likely to be used in a bioterrorist event. Some targets are specific to a single species, subspecies, toxin or virulence factor (Table 16.1 ). Other targets can be used more generally such as ribosomal RNA (rRNA) genes or heat shock genes. These genes contain highly conserved DNA sequences (usually required for function) interspaced with variable regions that have been widely utilized in species-specific genetic assays. Ribosomal genes in fungi and bacteria have conserved sequences that are ideal for universal primer targeting, contain variable sequence regions that are species-specific, and are present in high copy-number tandem repeats [ 46 ]. The gene for the small-subunit ribosomal RNA (16 S-like) has been especially useful in evolutionary studies of distant phylogenetic relationships, remaining quite stable during evolution of all organisms [ 47 ]. The 16 S-like ribosomal genes can be amplified from total DNA isolated from essentially any organism using a single set of primers recognizing the conserved regions of the gene. Table 16.1 Targets for real-time detection of toxins and secretion systems Name Organism Gene(s) Ricin R. communis RTA & RTB Staphylococcus Enterotoxin B S. aureus entB Botulinum A C. botulism BoNT/A Botulinum B C. botulism BoNT/B Botulinum C C. botulism BN/C1 Botulinum D C. botulism BoNT/D Botulinum E C. botulism BotE Botulinum F C. botulism BotF Botulinum G C. botulism BoNT/G Difficile A C. difficile ToxA Difficile B C. difficile ToxB Perfrigens Type A C. perfrigens cpE Epsilon toxin C. perfrigens extD Shiga toxin 1 & 2 E. coli STX1 & 2 Listeriolysin L. monocytogenes hly1 Diptheria C. diphtheriae Tox Yersinia translocon proteins Yersinia spp. YorB, YorD, LcrV Pseudomonas translocon proteins P. aeruginosa PopB, PopD, PcrV Shigella translocon proteins S. flexneri IpaB, IpaC EPEC translocon proteins E. coli EspB, EspD Salmonella translocon proteins Salmonella spp. AF056246 Xanthamonas translocon protein X. campestris HrpF DNA or RNA from a wide variety of organisms can be amplified using a single set of "universal" PCR primers that bind to conserved regions of these genes. Species determination may then be performed by analyzing the species-specific sequences contained in regions within the resulting amplicons [ 48 ]. There are advantages to both types of targets. Specific targets can be detected in samples that are heavily contaminated with nonpathogenic bacteria. They also make it possible to detect virulence factors inserted into normally innocuous bacteria. "Universal" target amplification approaches have the advantage that they can be more easily multiplexed. A single set of primers serves to amplify multiple species, permitting the development of more general diagnostic assays. The same two approaches can be used to develop targets for viral detection assays, although "universal primers" are generally more restricted to bacteria, fungi and specific families of viruses. Sample Processing Sample processing development is an integral component of a successful diagnostic program. During a bioterrorist event, depending on its size and duration, a public health lab may need to process tens of thousands of specimens. Rapid nucleic acid extraction from clinical and environmental samples will be critical for downstream molecular evaluation. Extraction of genetic materials must be automated, ultrasensitive and have high throughput capability to process and organize large sample populations. The detection of nucleic acids from infecting microorganisms or viruses in whole blood, tissues, respiratory secretions, urine, and other body fluids can be influenced by numerous factors. Sample preparation depends on the type of biological material that vary in consistency and viscosity. Highly viscous samples (such as mucous) can be difficult to handle and process. Bacterial and fungal spores are encased in a heat and largely chemical resistant shell, making the isolation of nucleic acids troublesome. New cell and spore disruption techniques involving mechanical, chemical, enzymatic and thermal treatments have improved extraction efficiencies markedly [ 48 – 51 ]. All of these procedures are suitable for robotic high throughput processing. When possible, liquid biological samples should be centrifuged to concentrate bacteria, spores and fungi prior to nucleic acid extraction, increasing purity and efficiency. Anticoagulants such as EDTA, heparin or citrate can limit product formation by interfering with the PCR as can large excesses of free genomic DNA. Differential surface-based binding procedures have been developed to purify and concentrate target DNA away from genomic DNA and host-associated inhibitors, improving sensitivity. Magnetic bead technology is an ideal choice for nucleic acid isolation and purification because of its greater affinity for nucleic acids than other conventional methods. It reduces the risk of sample cross contamination found in other extraction methods by eliminating centrifugation and other manual steps during the extraction and purification process. Magnetic bead based nucleic acid extraction can be performed from micro (<100 μL) volume samples, is completely automated for high throughput and can rapidly isolate purified nucleic acid in about 1 h. Commercial systems such as MagNA Pure LC TM , KingFisher TM and NucliSens easyMAG™ are readily available in clinical laboratories for extraction of both DNA and RNA from a wide range of pathogenic bacteria, viruses and fungi present in clinical samples. These standardized products allow for highly efficient target capture and are scalable over a wide range of nucleic acid levels. The GeneXpert® System is a bench-top sized fully self-contained microfluidic system for sample extraction and nucleic acid detection. The Cepheid MIDAS II (microfluidic DNA analysis system) provides rapid, on-site testing for bioterror pathogens from environmental samples. It automatically processes biological samples, extracts the nucleic acid, and prepares it for testing. The system then transfers the extracted nucleic acid and PCR reagents to a real-time thermal cycler with eight independently programmable reaction sites. All of the critical processes of the analysis are performed in a closed microfluidic system, including post-analysis clean-up and decontamination. This technique allows for continuous, automated operation over an extended time with an assay time is less than 30 min for pathogen detection. Validation of Diagnostic Assays One of the primary outcomes of rapid diagnostics development is to facilitate therapeutic intervention by detecting infectious agents early in infection. This goal requires that a new molecular detection technique be optimized for both sensitivity and specificity, and be validated. An important consideration is to be able to quantitatively compare culture and antigen-based detection in individuals with molecular probes. Once molecular diagnostic approaches are validated, the new diagnostic tools can be refined and used to assess earlier predictors of disease such as elevated temperature or measurable immunological responses. Ideally, validation of a new diagnostic should occur by statistically demonstrating its equivalence or superiority to conventional detection methodology on clinical samples. Typically, such validations are best determined from clinical specimens obtained from patients in endemic areas of disease. For most select agents, human infections are rare and occur in remote regions outside the USA, making validation on human populations impractical. A partial solution is to use well-developed animal infection models to both optimize and provide initial validation for new diagnostic tools. The primary advantage of an animal infection model is that infection and progression of disease can be more precisely defined. The goal of optimization studies in animals is to achieve the highest possible level of detection while maintaining fidelity of identification in the absence of false positives. Serologies: Antigen–Antibody Interactions Serological techniques have been invaluable for detecting active infections with organisms that are difficult to culture and for documenting previous infection/immunity. While conventional serodiagnosis has a limited ability to detect acute infections with select agents, it is invaluable for monitoring disease kinetics and dispersion of these agents within exposed or high-risk populations, especially where asymptomatic infections are frequent. Such information is crucial to therapeutic intervention and prophylaxis, as well as to isolation protocols in the context of a biological attack. Serodiagnosis is particularly useful for mass screening of infectious diseases because such techniques are generally simple to perform, inexpensive and amenable to high throughput technologies. The assay takes advantage of the exquisite sensitivity and specificity of antigen-antibody interactions. Antigen capture assays represent a somewhat more recent addition to serological techniques. These methods have been useful for rapidly diagnosing acute infections where antigen levels are relatively high, especially in the urine where they may be concentrated. The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) has become the workhorse of most clinical laboratories. It relies on specific antigen-antibody interactions to identify a pathogen [ 10 ]. Typically, a preliminary test can be performed quickly, usually within 3–4 h. A positive ELISA test can be confirmed by performing a Western Blot with target-specific antibodies or by an immunofluorescent antibody (IFA). Unfortunately, pathogen antigen production or a host antibody response is not always robust enough to permit reliable testing, especially in the early stages of an infection. In addition, a false positive result with an ELISA test can occur due to interference from other antibodies. Although the ELISA test is highly specific, an antibody response may not be detected in either the early or late stages of a disease. Improved sensitivity may be obtained by expanding the class of antibodies detected to IgG, IgA and/or IgM classes of antibodies [ 11 ]. ELISA platforms are especially well suited for toxin detection and, when combined with procedures such as time-resolved fluorometry, sensitivities of 4–20 pg/mL can be obtained in a typical 2 h assay for molecules such as botulinum type A or B neurotoxin and Staphylococcus aureus enterotoxin B [ 12 ]. A newer format for antigen-antibody detection where the detector antibody is labeled by chemiluminescence facilitates an even greater sensitivity [ 13 ]. In one approach, target antigen is first complexed to paramagnetic beads coated with capture antibody and then identified using a detector antibody. An electrochemical flow cell with photon detector is used to detect the target-antibody interactions with detection limits approaching 200 fmol/L and dynamic ranges of six orders of magnitude [ 10 ]. More recently, a novel type of biosensor for rapid pathogen identification has been described using B cells as sensing elements. This system know as CANARY (cellular analysis and notification of antigen risks and yields) utilizes B lymphocytes genetically engineered to express both cytosolic aquorin, a calcium-sensitive bioluminescent protein, and membrane bound antibodies specific for a given pathogen or toxin [ 14 ]. Interactions of antigen with antibody elevate intracellular calcium levels resulting in light emission by the cytosolic aquorin molecules. The system responds in a fashion that is more rapid, sensitive, and specific than most antigen detection systems, and has been shown to detect Yersinia pestis in less than 3 min at levels of 50 colony forming units [ 14 ]. Antigen–Non-Antibody Target Interactions In recent years, the recognition that pathogens can evoke specific T-cell responses has been used to develop assays such those used in the enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) T-SPOT TB ® and Quantiferon-TB for the diagnosis of latent tuberculosis infection. The exquisite sensitivity of these assays in which signature TB peptides elicit specific interferon gamma release makes them applicable to immunosuppressed individuals, while the specificity of the assay overcomes problems such as prior vaccination with Bacille Calmette-Guérin (BCG). These assays cannot distinguish between drug sensitive and resistant forms of TB, but are particularly valuable in following diseases transmission in settings where multidrug resistant (MDR) or extremely drug resistant (XDR) strains are prevalent. Enzymatic activity has been used for some time in the detection of microorganisms. For example, the presence of significant levels of Helicobacter pylori in gastric secretions has been made using the detection of urease activity of the bacillus. Although bacterial urease production is not unique to H. pylori , the other urea producers are not found in the human stomach, the site of replication of H. pylori . An example of a bioterrorism antigen detection system utilizing a specific enzymatic interaction with a substrate rather than binding to an antibody is the micromechanosensor reported by Liu, et al. [ 15 ]. The functional nature of a toxin is detected utilizing microfabricated cantilevers [ 16 ]. In this proof of concept model, botulinum neurotoxin B is detected by its activity as a endopeptidase, cleaving its neurotarget synaptobrevin 2 (also referred to as VAMP 2). The reporting system detects the large change in resonance frequency of the vibrations of the cantilever following release of the agarose bead, which is bound to the cantilever by synaptobrevin. The cantalever system is most sensitive in gaseous or vacuum milieus and the fluid medium damps the vibration to some degree. It can detect botulinum toxin at 8 nM concentration within 15 min and is applicable to on-chip electronic technology that greatly increases sensitivity. Genetics: Exploiting Genomic Differences Genomic differences between microbes offer an alternative to culturing for detection and identification of pathogens by providing species-specific DNA targets that can be accurately resolved by molecular methodology. Nucleic acid-based molecular approaches for pathogen identification overcome many of the deficiencies associated with conventional methods by exploiting both large- and small-scale genomic differences between organisms. Polymerase chain reaction (PCR)-based amplification of highly conserved ribosomal RNA (rRNA) genes, intergenic sequences, and specific toxin genes is currently the most reliable approach for identification of bacterial, fungal and many viral pathogenic agents. When combined with microarray or fluorescence-based oligonucleotide detection systems, these molecular approaches provide quantitative, high fidelity analysis [ 8 , 17 , 18 ]. Most importantly, these genetic probing systems offer rapid turn around time (1–6 h) and are suitable for high throughput, automated multiplex operations critical for use in clinical diagnostic laboratories. The need for rapid diagnostics was never more apparent than during the severe acute respiratory syndrome (SARS) epidemic of the spring of 2003. In the early stages of the epidemic, physicians and public health officials were relatively helpless to contain a fast moving, globally spreading epidemic of severe atypical pneumonia caused by an unknown respiratory agent. Once the viral agent was identified, genomic sequences of the SARS coronavirus (CoV) were used to develop a diagnostic assay within days that rapidly (within 1–2 h) and reliably identified the SARS CoV in a range of clinical and environmental specimens [ 19 ]. Armed with molecular tools, physicians and public health officials in China and Canada, hit hardest by the disease, could confirm the cause of rapidly spreading atypical pneumonias, monitor virus levels in patients and explore potential sources for the outbreak [ 20 – 23 ]. This single event highlighted the importance of rapid molecular diagnostics in outbreak control and disease management, signaling the arrival of a new era in diagnostics. Attributes of a Comprehensive Diagnostic Test An effective diagnostic assay must be rapid, sensitive and specific as well as being simple and robust to facilitate use in clinical and public health laboratories. Assays should detect a wide variety of pathogens and, where possible, have capacity to detect "designer" organisms (heterologously expressed toxin or virulence genes) created through recombinant technologies. Genetic-based molecular assays are currently in development that not only include all category A through C pathogen and toxin genes but also include a wide range of common bacteria, viruses and fungi. With this approach, it is possible to recognize in clinical (respiratory secretions, blood, urine, tissue), environmental (including letters, nasal swabs and hair) and food or water samples the presence of a pathogenic organism that is present as a homogeneous population or is cloaked by dispersion within a large population of nonpathogenic organisms. It is also possible to detect unnatural events such as the expression of a lethal toxin gene (such as a botulinum toxin genes) in a recipient nonpathogenic organism such as Escherichia coli or Bacillus subtilis . Similarly, a mixed powder containing anthrax-laden spores in a background of 99.9% B. subtilis spores would be perceived as harmless, until the 0.1% B. anthracis component began to cause disease. Such complex mixtures can be easily resolved by molecular diagnostics. Specificity and sensitivity are also key elements of the diagnostic assay. When specific probes are used, they must be shown to interact only with their designated targets to avoid false positive responses. The advent of real-time self-reporting probes capable of allele-specific sequence discrimination at the level of a single nucleotide allows these probes to react with exceptional fidelity [ 24 , 25 ]. Sensitivity is a major requirement especially because in early stages of a disease few pathogens may be present for detection. Some pathogens like Francisella tularensis , the etiological agent of tularemia, need only a few organisms to cause lethal disease [ 26 ]. DNA Microarrays Microarrays of nucleic acids were developed to utilize the enormous amount of information provided by genome projects but have clear potential in mass screening and diagnostics [ 27 , 28 ]. A microarray allows thousands of targets to be analyzed simultaneously, being particularly useful for novel virus identification and characterization. Microarrays consist of gene and genome-specific nucleic acid fragments, either cloned gene segments or long (70–80 mers) oligonucleotides, which are fixed to a glass slide or other solid matrix such as those used for computer chips [ 29 ]. One such product is the GeneChip®, a high density, oligonucleotide-based DNA array developed at Affymetrix. Target DNA or RNA is labeled and hybridized to complementary DNA sequences on the microarray. Scanning lasers are used to detect high affinity interactions and each addressable position corresponds to a known target. The application of this maturing technology may be best illustrated during the outbreak of SARS during early 2003. To assist in trying to identity the pathogen, the CDC referred specimens containing the unknown agent to many laboratories, including that of Dr. Joseph DeRisi. DeRisi had developed a microarray chip called Virochip containing nucleic acids specific for numerous viruses known to cause human disease. Hybridization of the unknown virus genome segments to the chip revealed the presence of a previously uncharacterized coronavirus. Subsequent molecular characterization and phylogenetic sequence comparisons confirmed that the virus was a new member of this family [ 30 , 31 ]. Microarray technology is powerful but also expensive, technically demanding and labor intensive. Amplifying the sample above background is critical to achieve dependable results. A highly purified nucleic acid sample is best for the assay as interfering substances may limit hybridization. False positive interactions can usually be minimized through careful microarray development with suitable redundancy of targets. It is best, however, to verify independently "positive hits" with a different technique. Like any hybridization-based assay, target specificity is critical, although absolute fidelity can be fine tuned. Allele-specificity at the level of single nucleotide changes can be desirable for subtyping of species [ 32 ]. The ability to detect imperfect matches within a family is equally desirable for the discovery of new disease agents and variants of old ones (SARS CoV). Of course, genetic microarrays like other genetic approaches can detect the presence of toxin genes, but they cannot be used to directly detect toxins. A trend toward fully automated microfluidic applications involving chip-based capillary electrophoresis that can perform in-line reagent dispensing, hybridization, and detection significantly reduces sample sizes and improves accuracy [ 33 ]. The combination of array hybridization followed by direct viral sequence recovery provides a general strategy for the rapid identification and characterization of novel viruses and emerging infectious diseases. The ability of DNA microarrays to identify either multiple gene targets from single or multiple pathogens in a single sample has the capacity to transform detection of emerging pathogens. It is particularly useful to evaluate rapidly changing disease agents such as influenza [ 34 ]. New platforms such as the GreeneChipPm, which is a panmicrobial microarray comprising 29,455 sixty-mer oligonucleotides, is suitable for comprehensive detection of a wide range of vertebrate viruses, bacteria, fungi, and parasites [ 35 ]. This technology has the potential to transform blood testing by providing an integrated platform for comprehensive testing that replaces multiple individual assays [ 35 , 36 ]. Real-Time Probes The simplest PCR form involves the use of specific primers to amplify a known target fragment of DNA or RNA and detection the product with an intercalating dye. This approach relies upon the specificity of linear DNA-DNA or DNA-RNA hybridization probes in the amplification process. Probe-target hybridization is highly temperature dependent, however, and, depending on the nucleotide composition of the probe, random annealing can pose a problem. Sequences with high G + C contents are especially vulnerable since the temperature profile for annealing is shifted and false priming may occur. In general, standard PCR-based amplification is insufficient for identification purposes due to relatively high levels of false positive results. A solution to this problem is the use of fluorescent probes such as the 5′ endonuclease, adjacent linear and hairpin oligoprobes and the self-fluorescing amplicons that require high fidelity binding to target sequences for detection [ 18 , 37 – 39 ]. Such high fidelity probes, especially self-reporting probes, have additional advantages in that both PCR amplification and detection can be done in a sealed tube, greatly reducing the possibility of contamination. They can also be used in real-time assays in which product formation is continuously monitored and validated. This is an important consideration for a clinical microbiology lab because PCR amplification has the potential to amplify small amounts of target DNA from contaminating organisms or even human DNA. Real-time PCR does not require post-PCR sample handling, preventing potential PCR product carry-over contamination and facilitating high throughput assays. Real-time PCR assays using high fidelity probes are also rapid (0.5–2 h), quantitative and have a large dynamic range exceeding 1 million-fold of starting target. Probing systems including LightCycler TM [ 40 , 41 ], TaqMan TM [ 42 ] and Molecular Beacons [ 24 , 43 ] are widely used to identify pathogens in real-time assays. The LightCycler system measures the fluorescence resonance energy transfer (FRET) between two linear oligonucleotide probes labeled with different fluorophores in a glass capillary tube format. The probes are hybridized to the target in a head-to-tail motif during the annealing stage of the PCR which bring the fluorophores in a close proximity, causing a transfer of energy resulting in an emission of a detectable fluorescent light. TaqMan probes are linear oligonucleotides that contain a 5′ reporter dye and 3′ acceptor with overlapping emission-absorption spectra. The reporter dye remains quenched by the 3′ acceptor, while hybridized to its target. Cleavage of the 5′ reporter by 5′ nuclease activity of Taq DNA polymerase results in strong fluorescence signals. TaqMan can be utilized in a 96 well format, amenable to high throughput screening. One limitation of FRET-based systems is that multiplexing is more limited since several quenchers in the same reaction are required and spectral overlap can be a problem. Molecular Beacons are small, single stranded nucleic acid hairpin probes that brightly fluoresce when bound to their targets [ 43 ]. The probes possess a stem and loop structure in which the loop contains a complementary target sequence. The stem forms by the annealing of short complementary nucleotide sequence arms adjacent to the target sequence. A fluorophore is covalently linked to one end of the stem sequence with a quencher covalently linked to the other end. In free solution, Molecular Beacons do not fluoresce because the stem structure keeps the fluorophore close to the quencher and fluorescence energy is absorbed and released as heat. In the presence of target DNA, however, the loop sequence anneals to the target and a probe-target hybrid is formed forcing the stems containing the fluorophore and quencher apart, and fluorescence occurs. Molecular Beacons are better suited than most linear probes to monitor authentic amplicons in PCR reactions because a single nucleotide mismatch can prevent a Molecular Beacon from binding to its target and lighting up [ 24 ]. Both TaqMan and Molecular Beacons can detect single nucleotide changes and are highly suitable for allelic discrimination [ 24 , 44 ]. Multiplex Assays A single multiplex reaction assay that combines numerous probes and is capable of identifying multiple pathogens is a more efficient and cost-effective approach for a clinical microbiology lab, greatly expanding the capacity of pathogens being surveyed. Multiplex assays require that probes representing different targets can be reliably resolved in the same reaction tube or well. Typically, different probes are labeled with a range of fluorophores that have unique emission spectra that can be discerned with discrete optics or dispersed onto an array for detection. When dealing with fluorophores, the spectral properties of the probe-target hybrid must be significantly different from the unbound probes to permit unambiguous probe identification. LightCycler TM , TaqMan TM and Molecular Beacon probes are all suitable for multiplex assays. The ability to multiplex PCR by probe color and melting temperature (T(m)) greatly expands the power of real-time analysis. Novel labeling techniques are evolving quickly that will allow more than 50 targets to be simultaneously evaluated in a single reaction. For example, MassTag PCR, which has been used detect viral hemorrhagic fever, is a multiplex assay in which microbial gene targets are coded by a library of 64 distinct mass tags. Nucleic acids are amplified by multiplex PCR using up to 64 primers, each labeled by a photo-cleavable link with a different molecular weight tag. After separation of the amplification products from unincorporated primers and release of the mass tags from the amplicons by UV irradiation, tag identity is analyzed by mass spectrometry [ 45 ]. Target Selection A number of target sequences have been proposed for the identification of pathogens likely to be used in a bioterrorist event. Some targets are specific to a single species, subspecies, toxin or virulence factor (Table 16.1 ). Other targets can be used more generally such as ribosomal RNA (rRNA) genes or heat shock genes. These genes contain highly conserved DNA sequences (usually required for function) interspaced with variable regions that have been widely utilized in species-specific genetic assays. Ribosomal genes in fungi and bacteria have conserved sequences that are ideal for universal primer targeting, contain variable sequence regions that are species-specific, and are present in high copy-number tandem repeats [ 46 ]. The gene for the small-subunit ribosomal RNA (16 S-like) has been especially useful in evolutionary studies of distant phylogenetic relationships, remaining quite stable during evolution of all organisms [ 47 ]. The 16 S-like ribosomal genes can be amplified from total DNA isolated from essentially any organism using a single set of primers recognizing the conserved regions of the gene. Table 16.1 Targets for real-time detection of toxins and secretion systems Name Organism Gene(s) Ricin R. communis RTA & RTB Staphylococcus Enterotoxin B S. aureus entB Botulinum A C. botulism BoNT/A Botulinum B C. botulism BoNT/B Botulinum C C. botulism BN/C1 Botulinum D C. botulism BoNT/D Botulinum E C. botulism BotE Botulinum F C. botulism BotF Botulinum G C. botulism BoNT/G Difficile A C. difficile ToxA Difficile B C. difficile ToxB Perfrigens Type A C. perfrigens cpE Epsilon toxin C. perfrigens extD Shiga toxin 1 & 2 E. coli STX1 & 2 Listeriolysin L. monocytogenes hly1 Diptheria C. diphtheriae Tox Yersinia translocon proteins Yersinia spp. YorB, YorD, LcrV Pseudomonas translocon proteins P. aeruginosa PopB, PopD, PcrV Shigella translocon proteins S. flexneri IpaB, IpaC EPEC translocon proteins E. coli EspB, EspD Salmonella translocon proteins Salmonella spp. AF056246 Xanthamonas translocon protein X. campestris HrpF DNA or RNA from a wide variety of organisms can be amplified using a single set of "universal" PCR primers that bind to conserved regions of these genes. Species determination may then be performed by analyzing the species-specific sequences contained in regions within the resulting amplicons [ 48 ]. There are advantages to both types of targets. Specific targets can be detected in samples that are heavily contaminated with nonpathogenic bacteria. They also make it possible to detect virulence factors inserted into normally innocuous bacteria. "Universal" target amplification approaches have the advantage that they can be more easily multiplexed. A single set of primers serves to amplify multiple species, permitting the development of more general diagnostic assays. The same two approaches can be used to develop targets for viral detection assays, although "universal primers" are generally more restricted to bacteria, fungi and specific families of viruses. Sample Processing Sample processing development is an integral component of a successful diagnostic program. During a bioterrorist event, depending on its size and duration, a public health lab may need to process tens of thousands of specimens. Rapid nucleic acid extraction from clinical and environmental samples will be critical for downstream molecular evaluation. Extraction of genetic materials must be automated, ultrasensitive and have high throughput capability to process and organize large sample populations. The detection of nucleic acids from infecting microorganisms or viruses in whole blood, tissues, respiratory secretions, urine, and other body fluids can be influenced by numerous factors. Sample preparation depends on the type of biological material that vary in consistency and viscosity. Highly viscous samples (such as mucous) can be difficult to handle and process. Bacterial and fungal spores are encased in a heat and largely chemical resistant shell, making the isolation of nucleic acids troublesome. New cell and spore disruption techniques involving mechanical, chemical, enzymatic and thermal treatments have improved extraction efficiencies markedly [ 48 – 51 ]. All of these procedures are suitable for robotic high throughput processing. When possible, liquid biological samples should be centrifuged to concentrate bacteria, spores and fungi prior to nucleic acid extraction, increasing purity and efficiency. Anticoagulants such as EDTA, heparin or citrate can limit product formation by interfering with the PCR as can large excesses of free genomic DNA. Differential surface-based binding procedures have been developed to purify and concentrate target DNA away from genomic DNA and host-associated inhibitors, improving sensitivity. Magnetic bead technology is an ideal choice for nucleic acid isolation and purification because of its greater affinity for nucleic acids than other conventional methods. It reduces the risk of sample cross contamination found in other extraction methods by eliminating centrifugation and other manual steps during the extraction and purification process. Magnetic bead based nucleic acid extraction can be performed from micro (<100 μL) volume samples, is completely automated for high throughput and can rapidly isolate purified nucleic acid in about 1 h. Commercial systems such as MagNA Pure LC TM , KingFisher TM and NucliSens easyMAG™ are readily available in clinical laboratories for extraction of both DNA and RNA from a wide range of pathogenic bacteria, viruses and fungi present in clinical samples. These standardized products allow for highly efficient target capture and are scalable over a wide range of nucleic acid levels. The GeneXpert® System is a bench-top sized fully self-contained microfluidic system for sample extraction and nucleic acid detection. The Cepheid MIDAS II (microfluidic DNA analysis system) provides rapid, on-site testing for bioterror pathogens from environmental samples. It automatically processes biological samples, extracts the nucleic acid, and prepares it for testing. The system then transfers the extracted nucleic acid and PCR reagents to a real-time thermal cycler with eight independently programmable reaction sites. All of the critical processes of the analysis are performed in a closed microfluidic system, including post-analysis clean-up and decontamination. This technique allows for continuous, automated operation over an extended time with an assay time is less than 30 min for pathogen detection. Attributes of a Comprehensive Diagnostic Test An effective diagnostic assay must be rapid, sensitive and specific as well as being simple and robust to facilitate use in clinical and public health laboratories. Assays should detect a wide variety of pathogens and, where possible, have capacity to detect "designer" organisms (heterologously expressed toxin or virulence genes) created through recombinant technologies. Genetic-based molecular assays are currently in development that not only include all category A through C pathogen and toxin genes but also include a wide range of common bacteria, viruses and fungi. With this approach, it is possible to recognize in clinical (respiratory secretions, blood, urine, tissue), environmental (including letters, nasal swabs and hair) and food or water samples the presence of a pathogenic organism that is present as a homogeneous population or is cloaked by dispersion within a large population of nonpathogenic organisms. It is also possible to detect unnatural events such as the expression of a lethal toxin gene (such as a botulinum toxin genes) in a recipient nonpathogenic organism such as Escherichia coli or Bacillus subtilis . Similarly, a mixed powder containing anthrax-laden spores in a background of 99.9% B. subtilis spores would be perceived as harmless, until the 0.1% B. anthracis component began to cause disease. Such complex mixtures can be easily resolved by molecular diagnostics. Specificity and sensitivity are also key elements of the diagnostic assay. When specific probes are used, they must be shown to interact only with their designated targets to avoid false positive responses. The advent of real-time self-reporting probes capable of allele-specific sequence discrimination at the level of a single nucleotide allows these probes to react with exceptional fidelity [ 24 , 25 ]. Sensitivity is a major requirement especially because in early stages of a disease few pathogens may be present for detection. Some pathogens like Francisella tularensis , the etiological agent of tularemia, need only a few organisms to cause lethal disease [ 26 ]. DNA Microarrays Microarrays of nucleic acids were developed to utilize the enormous amount of information provided by genome projects but have clear potential in mass screening and diagnostics [ 27 , 28 ]. A microarray allows thousands of targets to be analyzed simultaneously, being particularly useful for novel virus identification and characterization. Microarrays consist of gene and genome-specific nucleic acid fragments, either cloned gene segments or long (70–80 mers) oligonucleotides, which are fixed to a glass slide or other solid matrix such as those used for computer chips [ 29 ]. One such product is the GeneChip®, a high density, oligonucleotide-based DNA array developed at Affymetrix. Target DNA or RNA is labeled and hybridized to complementary DNA sequences on the microarray. Scanning lasers are used to detect high affinity interactions and each addressable position corresponds to a known target. The application of this maturing technology may be best illustrated during the outbreak of SARS during early 2003. To assist in trying to identity the pathogen, the CDC referred specimens containing the unknown agent to many laboratories, including that of Dr. Joseph DeRisi. DeRisi had developed a microarray chip called Virochip containing nucleic acids specific for numerous viruses known to cause human disease. Hybridization of the unknown virus genome segments to the chip revealed the presence of a previously uncharacterized coronavirus. Subsequent molecular characterization and phylogenetic sequence comparisons confirmed that the virus was a new member of this family [ 30 , 31 ]. Microarray technology is powerful but also expensive, technically demanding and labor intensive. Amplifying the sample above background is critical to achieve dependable results. A highly purified nucleic acid sample is best for the assay as interfering substances may limit hybridization. False positive interactions can usually be minimized through careful microarray development with suitable redundancy of targets. It is best, however, to verify independently "positive hits" with a different technique. Like any hybridization-based assay, target specificity is critical, although absolute fidelity can be fine tuned. Allele-specificity at the level of single nucleotide changes can be desirable for subtyping of species [ 32 ]. The ability to detect imperfect matches within a family is equally desirable for the discovery of new disease agents and variants of old ones (SARS CoV). Of course, genetic microarrays like other genetic approaches can detect the presence of toxin genes, but they cannot be used to directly detect toxins. A trend toward fully automated microfluidic applications involving chip-based capillary electrophoresis that can perform in-line reagent dispensing, hybridization, and detection significantly reduces sample sizes and improves accuracy [ 33 ]. The combination of array hybridization followed by direct viral sequence recovery provides a general strategy for the rapid identification and characterization of novel viruses and emerging infectious diseases. The ability of DNA microarrays to identify either multiple gene targets from single or multiple pathogens in a single sample has the capacity to transform detection of emerging pathogens. It is particularly useful to evaluate rapidly changing disease agents such as influenza [ 34 ]. New platforms such as the GreeneChipPm, which is a panmicrobial microarray comprising 29,455 sixty-mer oligonucleotides, is suitable for comprehensive detection of a wide range of vertebrate viruses, bacteria, fungi, and parasites [ 35 ]. This technology has the potential to transform blood testing by providing an integrated platform for comprehensive testing that replaces multiple individual assays [ 35 , 36 ]. Real-Time Probes The simplest PCR form involves the use of specific primers to amplify a known target fragment of DNA or RNA and detection the product with an intercalating dye. This approach relies upon the specificity of linear DNA-DNA or DNA-RNA hybridization probes in the amplification process. Probe-target hybridization is highly temperature dependent, however, and, depending on the nucleotide composition of the probe, random annealing can pose a problem. Sequences with high G + C contents are especially vulnerable since the temperature profile for annealing is shifted and false priming may occur. In general, standard PCR-based amplification is insufficient for identification purposes due to relatively high levels of false positive results. A solution to this problem is the use of fluorescent probes such as the 5′ endonuclease, adjacent linear and hairpin oligoprobes and the self-fluorescing amplicons that require high fidelity binding to target sequences for detection [ 18 , 37 – 39 ]. Such high fidelity probes, especially self-reporting probes, have additional advantages in that both PCR amplification and detection can be done in a sealed tube, greatly reducing the possibility of contamination. They can also be used in real-time assays in which product formation is continuously monitored and validated. This is an important consideration for a clinical microbiology lab because PCR amplification has the potential to amplify small amounts of target DNA from contaminating organisms or even human DNA. Real-time PCR does not require post-PCR sample handling, preventing potential PCR product carry-over contamination and facilitating high throughput assays. Real-time PCR assays using high fidelity probes are also rapid (0.5–2 h), quantitative and have a large dynamic range exceeding 1 million-fold of starting target. Probing systems including LightCycler TM [ 40 , 41 ], TaqMan TM [ 42 ] and Molecular Beacons [ 24 , 43 ] are widely used to identify pathogens in real-time assays. The LightCycler system measures the fluorescence resonance energy transfer (FRET) between two linear oligonucleotide probes labeled with different fluorophores in a glass capillary tube format. The probes are hybridized to the target in a head-to-tail motif during the annealing stage of the PCR which bring the fluorophores in a close proximity, causing a transfer of energy resulting in an emission of a detectable fluorescent light. TaqMan probes are linear oligonucleotides that contain a 5′ reporter dye and 3′ acceptor with overlapping emission-absorption spectra. The reporter dye remains quenched by the 3′ acceptor, while hybridized to its target. Cleavage of the 5′ reporter by 5′ nuclease activity of Taq DNA polymerase results in strong fluorescence signals. TaqMan can be utilized in a 96 well format, amenable to high throughput screening. One limitation of FRET-based systems is that multiplexing is more limited since several quenchers in the same reaction are required and spectral overlap can be a problem. Molecular Beacons are small, single stranded nucleic acid hairpin probes that brightly fluoresce when bound to their targets [ 43 ]. The probes possess a stem and loop structure in which the loop contains a complementary target sequence. The stem forms by the annealing of short complementary nucleotide sequence arms adjacent to the target sequence. A fluorophore is covalently linked to one end of the stem sequence with a quencher covalently linked to the other end. In free solution, Molecular Beacons do not fluoresce because the stem structure keeps the fluorophore close to the quencher and fluorescence energy is absorbed and released as heat. In the presence of target DNA, however, the loop sequence anneals to the target and a probe-target hybrid is formed forcing the stems containing the fluorophore and quencher apart, and fluorescence occurs. Molecular Beacons are better suited than most linear probes to monitor authentic amplicons in PCR reactions because a single nucleotide mismatch can prevent a Molecular Beacon from binding to its target and lighting up [ 24 ]. Both TaqMan and Molecular Beacons can detect single nucleotide changes and are highly suitable for allelic discrimination [ 24 , 44 ]. Multiplex Assays A single multiplex reaction assay that combines numerous probes and is capable of identifying multiple pathogens is a more efficient and cost-effective approach for a clinical microbiology lab, greatly expanding the capacity of pathogens being surveyed. Multiplex assays require that probes representing different targets can be reliably resolved in the same reaction tube or well. Typically, different probes are labeled with a range of fluorophores that have unique emission spectra that can be discerned with discrete optics or dispersed onto an array for detection. When dealing with fluorophores, the spectral properties of the probe-target hybrid must be significantly different from the unbound probes to permit unambiguous probe identification. LightCycler TM , TaqMan TM and Molecular Beacon probes are all suitable for multiplex assays. The ability to multiplex PCR by probe color and melting temperature (T(m)) greatly expands the power of real-time analysis. Novel labeling techniques are evolving quickly that will allow more than 50 targets to be simultaneously evaluated in a single reaction. For example, MassTag PCR, which has been used detect viral hemorrhagic fever, is a multiplex assay in which microbial gene targets are coded by a library of 64 distinct mass tags. Nucleic acids are amplified by multiplex PCR using up to 64 primers, each labeled by a photo-cleavable link with a different molecular weight tag. After separation of the amplification products from unincorporated primers and release of the mass tags from the amplicons by UV irradiation, tag identity is analyzed by mass spectrometry [ 45 ]. Target Selection A number of target sequences have been proposed for the identification of pathogens likely to be used in a bioterrorist event. Some targets are specific to a single species, subspecies, toxin or virulence factor (Table 16.1 ). Other targets can be used more generally such as ribosomal RNA (rRNA) genes or heat shock genes. These genes contain highly conserved DNA sequences (usually required for function) interspaced with variable regions that have been widely utilized in species-specific genetic assays. Ribosomal genes in fungi and bacteria have conserved sequences that are ideal for universal primer targeting, contain variable sequence regions that are species-specific, and are present in high copy-number tandem repeats [ 46 ]. The gene for the small-subunit ribosomal RNA (16 S-like) has been especially useful in evolutionary studies of distant phylogenetic relationships, remaining quite stable during evolution of all organisms [ 47 ]. The 16 S-like ribosomal genes can be amplified from total DNA isolated from essentially any organism using a single set of primers recognizing the conserved regions of the gene. Table 16.1 Targets for real-time detection of toxins and secretion systems Name Organism Gene(s) Ricin R. communis RTA & RTB Staphylococcus Enterotoxin B S. aureus entB Botulinum A C. botulism BoNT/A Botulinum B C. botulism BoNT/B Botulinum C C. botulism BN/C1 Botulinum D C. botulism BoNT/D Botulinum E C. botulism BotE Botulinum F C. botulism BotF Botulinum G C. botulism BoNT/G Difficile A C. difficile ToxA Difficile B C. difficile ToxB Perfrigens Type A C. perfrigens cpE Epsilon toxin C. perfrigens extD Shiga toxin 1 & 2 E. coli STX1 & 2 Listeriolysin L. monocytogenes hly1 Diptheria C. diphtheriae Tox Yersinia translocon proteins Yersinia spp. YorB, YorD, LcrV Pseudomonas translocon proteins P. aeruginosa PopB, PopD, PcrV Shigella translocon proteins S. flexneri IpaB, IpaC EPEC translocon proteins E. coli EspB, EspD Salmonella translocon proteins Salmonella spp. AF056246 Xanthamonas translocon protein X. campestris HrpF DNA or RNA from a wide variety of organisms can be amplified using a single set of "universal" PCR primers that bind to conserved regions of these genes. Species determination may then be performed by analyzing the species-specific sequences contained in regions within the resulting amplicons [ 48 ]. There are advantages to both types of targets. Specific targets can be detected in samples that are heavily contaminated with nonpathogenic bacteria. They also make it possible to detect virulence factors inserted into normally innocuous bacteria. "Universal" target amplification approaches have the advantage that they can be more easily multiplexed. A single set of primers serves to amplify multiple species, permitting the development of more general diagnostic assays. The same two approaches can be used to develop targets for viral detection assays, although "universal primers" are generally more restricted to bacteria, fungi and specific families of viruses. Sample Processing Sample processing development is an integral component of a successful diagnostic program. During a bioterrorist event, depending on its size and duration, a public health lab may need to process tens of thousands of specimens. Rapid nucleic acid extraction from clinical and environmental samples will be critical for downstream molecular evaluation. Extraction of genetic materials must be automated, ultrasensitive and have high throughput capability to process and organize large sample populations. The detection of nucleic acids from infecting microorganisms or viruses in whole blood, tissues, respiratory secretions, urine, and other body fluids can be influenced by numerous factors. Sample preparation depends on the type of biological material that vary in consistency and viscosity. Highly viscous samples (such as mucous) can be difficult to handle and process. Bacterial and fungal spores are encased in a heat and largely chemical resistant shell, making the isolation of nucleic acids troublesome. New cell and spore disruption techniques involving mechanical, chemical, enzymatic and thermal treatments have improved extraction efficiencies markedly [ 48 – 51 ]. All of these procedures are suitable for robotic high throughput processing. When possible, liquid biological samples should be centrifuged to concentrate bacteria, spores and fungi prior to nucleic acid extraction, increasing purity and efficiency. Anticoagulants such as EDTA, heparin or citrate can limit product formation by interfering with the PCR as can large excesses of free genomic DNA. Differential surface-based binding procedures have been developed to purify and concentrate target DNA away from genomic DNA and host-associated inhibitors, improving sensitivity. Magnetic bead technology is an ideal choice for nucleic acid isolation and purification because of its greater affinity for nucleic acids than other conventional methods. It reduces the risk of sample cross contamination found in other extraction methods by eliminating centrifugation and other manual steps during the extraction and purification process. Magnetic bead based nucleic acid extraction can be performed from micro (<100 μL) volume samples, is completely automated for high throughput and can rapidly isolate purified nucleic acid in about 1 h. Commercial systems such as MagNA Pure LC TM , KingFisher TM and NucliSens easyMAG™ are readily available in clinical laboratories for extraction of both DNA and RNA from a wide range of pathogenic bacteria, viruses and fungi present in clinical samples. These standardized products allow for highly efficient target capture and are scalable over a wide range of nucleic acid levels. The GeneXpert® System is a bench-top sized fully self-contained microfluidic system for sample extraction and nucleic acid detection. The Cepheid MIDAS II (microfluidic DNA analysis system) provides rapid, on-site testing for bioterror pathogens from environmental samples. It automatically processes biological samples, extracts the nucleic acid, and prepares it for testing. The system then transfers the extracted nucleic acid and PCR reagents to a real-time thermal cycler with eight independently programmable reaction sites. All of the critical processes of the analysis are performed in a closed microfluidic system, including post-analysis clean-up and decontamination. This technique allows for continuous, automated operation over an extended time with an assay time is less than 30 min for pathogen detection. Validation of Diagnostic Assays One of the primary outcomes of rapid diagnostics development is to facilitate therapeutic intervention by detecting infectious agents early in infection. This goal requires that a new molecular detection technique be optimized for both sensitivity and specificity, and be validated. An important consideration is to be able to quantitatively compare culture and antigen-based detection in individuals with molecular probes. Once molecular diagnostic approaches are validated, the new diagnostic tools can be refined and used to assess earlier predictors of disease such as elevated temperature or measurable immunological responses. Ideally, validation of a new diagnostic should occur by statistically demonstrating its equivalence or superiority to conventional detection methodology on clinical samples. Typically, such validations are best determined from clinical specimens obtained from patients in endemic areas of disease. For most select agents, human infections are rare and occur in remote regions outside the USA, making validation on human populations impractical. A partial solution is to use well-developed animal infection models to both optimize and provide initial validation for new diagnostic tools. The primary advantage of an animal infection model is that infection and progression of disease can be more precisely defined. The goal of optimization studies in animals is to achieve the highest possible level of detection while maintaining fidelity of identification in the absence of false positives. In Place and on the Horizon Rapid advances in the genomic sequencing of bacteria and viruses over the past few years have made it possible to consider sequencing the genomes of all pathogens affecting humans as well as the crops and livestock upon which our lives depend. The Chem-Bio Non-Proliferation program of the US Department of Energy began a large-scale effort of pathogen detection in early 2000 in an effort to provide biosecurity at the 2002 Winter Olympic Games in Salt Lake City, Utah [ 52 , 53 ]. Molecular assays were developed at the Lawrence Livermore National Lab for likely bioterrorist agents by utilizing whole genome comparison methods to recognize unique regions of pathogen genomes suitable for identification. Genetic-based rapid assays were developed for all major threat list agents for which adequate genomic sequence is available, as well as for other pathogens requested by various government agencies. The assays were validated by CDC and were used at the 2002 Winter Olympics [ 52 , 53 ]. The program continues to add new pathogens to expand the diversity of the detection platform. The Olympic air monitoring utilized 15–20 monitor stations over an area centered on Salt Lake City. Filters were removed on a 4 h basis and tested for genome fragments of bioterrorism pathogens. During the screening period, a sample collected at the city airport was positive by initial screening. The airport was alerted regarding the potential for evacuation, but confirmatory tests were negative [ 53 ]; the cause of the false positive test result was not specified. In 2003, the US Department of Homeland Security expanded this program into BioWatch, a multicity (initially 20) program. From this "early warning" system, there has been one report of a positive assay. The incident originated in Houston, Texas where air filters detected genomic evidence of F. tularensis , the cause of tularemia, on air monitoring filters between October 4 and 6, 2003 [ 54 ]; subsequent assays were negative. The source of the positive test was not clear but tularemia is endemic in the state. The $60 million/year system was expanded to 31 cities in late 2003. Yet, it has been criticized for being unable to detect small releases of pathogens [ 55 ]. In July 2003, the United States Postal Service employed at mail processing centers a high throughput Bio-agent Detection System (BDS) developed by Northrop Grumman Company. The automated system samples air from critical points around the mail sorting machines. The air is drawn through a spinning membrane of chemically enhanced water that removes contaminants. DNA is then sampled by PCR probing methodology developed by Cepheid, Inc. The system is fully automated with run completion in 30 min. If a biological agent is detected, a system alert is generated that that shuts down operations. BDS was developed initially for anthrax, but it is being expanded to include other pathogens and will be adapted for toxins, as well. The Science Applications International Corporation is developing a biosensor that combines advanced genomic and signal processing techniques to identify all known, newly emergent, and bioengineered pathogens (including all viruses, bacteria, fungi and protozoa). Known as TIGER (triangulation identification for genetic evaluation of risks), the biosensor uses mass spectrometry to determine the mass of core genetic material selectively extracted from a pathogen. TIGER uses specialized algorithms to read a pathogen's genetic signature. The sensor then checks the pathogen's mass against the masses of known pathogens in its database. This system differs from most antibody-based biosensors that cannot detect unknown or bioengineered pathogens. An antibody-based microarray, which can be fabricated with a wide range of pathogen or toxin-specific antibodies, is a rapidly emerging approach that hold great promise for disease detection proteomics [ 56 ]. Similarly, mass spectrometry-based proteomics is emerging as an important tool, which can be used to study protein-protein interactions on a small and proteome-wide scale and generate quantitative protein profiles from diverse species [ 57 , 58 ]. The ability of mass spectrometry to identify accurately thousands of proteins from complex samples will continue to improve and impact biology and medicine [ 57 ]. Direct nucleic acid detection methods may not be sufficiently sensitive to detect pathogens that are either present at low levels in body fluids or tissues. A promising approach to assess host-pathogen interactions at a very early stage of infection is to develop a signature for the host's immunological response. Both PCR and antigen capture assays require the presence of the causative agent. A number of recent studies suggest that there is a pathogen-specific difference in the innate host immune response and that these differences are detectible by transcriptional profiling with DNA microarrays [ 59 ]. In this approach, a molecular immunological signature or bar code-like response would be generated that corresponds to a given pathogen. In conclusion, rapid advances in diagnostic technology have facilitated real-time multiplex detection of a wide range of human pathogens. A range of platforms are now available in clinical and public health laboratories with the most advanced chip-based detection systems largely confined to academia. Finally, as miniaturization of technology is a rising trend, it is likely that many of the diagnostic platforms will also emerge in deployment of handheld point-of-care devices suitable for rapid detection of agents of bioterrorism or naturally occurring epidemic diseases.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7151914/

Acute Pneumonia

Host Defenses and Pathogenesis The lung is constantly exposed to the mixture of gases, particulate material, and microbes that constitute inspired air. Although the lower respiratory tract has traditionally been considered sterile, recent investigations using culture-independent techniques have shown in normal healthy individuals there is a similar microbiota in the upper and lower respiratory tract, although with a lower concentration of microorganisms within the lung. 3 A more complex microbiota has been demonstrated in individuals with chronic obstructive pulmonary disease and those with cystic fibrosis, and there can be significant variations in the microbiota at different locations within the lungs of individuals. 4 , 5 The development of acute pulmonary infection appears to arise when there is a defect in host defenses, exposure to a particularly virulent microorganism, or an overwhelming inoculum. Infectious agents gain entry to the lower respiratory tract through aspiration of upper airway resident microbiota, inhalation of aerosolized material, and, less frequently, metastatic seeding of the lung from blood. Pulmonary Defense Systems The pulmonary defense system involves both innate and adaptive immunity, including anatomic and mechanical barriers, humoral immunity, cell-mediated immunity, and phagocyte activity ( Table 69-2 ). 6 , 7 The upper airways, including the nasopharynx, oropharynx, and larynx, are the sites first exposed to inhaled microorganisms. The nasal mucosa contains ciliated epithelium and mucus-producing cells. Mechanical clearance of entrapped organisms occurs through the nasopharynx via expulsion or swallowing. In the oropharynx, the flow of saliva, sloughing of epithelial cells, local production of complement, and bacterial interference from resident microbiota serve as important factors in local host defense. Secretory immunoglobulin A (IgA) is the major immunoglobulin produced in the upper airways and accounts for 10% of the total protein of nasal secretions. It possesses antibacterial and antiviral activity despite being a relatively poor opsonin. Despite some controversy, low IgA levels are probably not associated with increased bacterial infection. IgG and IgM enter the airways predominantly via transudation from the blood. Their roles in bacterial opsonization, complement activation, agglutination, and neutralization activity are similar to those noted in serum. TABLE 69-2 Pulmonary Host Defenses Adherence of microorganisms to epithelial surfaces of the upper airways is a critical initial step in colonization and subsequent infection. Changes in fibronectin secretion and in binding characteristics of epithelium for various lectins occur as a response to underlying diseases. This may help to explain why colonization occurs in some clinical settings and not in others. Particles greater than 10 µm are efficiently filtered by the hair in the anterior nares or impact onto mucosal surfaces because of the configuration of the upper airways and the nasal turbinates. The cough and epiglottic reflexes also keep large particulate matter from reaching the central airways. The trachea and conducting airways of the transbronchial tree are usually effective in entrapping particles from 2 to 10 µm. The sharp angles at which the central airways branch cause particles to impact on mucosal surfaces, where they are entrapped by endobronchial mucus. Once entrapped, particles are removed by ciliated epithelium to the oropharynx. Epithelial cells, which line the conducting airways, submucosal glands, and alveoli, produce airway surface liquid, which is a complex mixture of proteins and peptides mixed with plasma transudate. Airway surface liquid contains lysozyme, lactoferrin, and secretory leukocyte proteinase inhibitor, all of which possess microbicidal activity. 8 Respiratory epithelial cells produce other potent antimicrobial peptides, including cathelicidins and β-defensins. These peptides possess individual antimicrobial activity as well as synergistic antimicrobial activity with each other. In addition, the β-defensins may act as chemokines for memory T cells and dendritic cells, thereby serving as a link between the innate and adaptive immune systems. Most bacteria are 0.5 to 2 µm. This size particle may reach the terminal airways and alveoli. No mucociliary apparatus exists at this level, yet a variety of humoral and cell-mediated host defenses function here. The alveolar-lining fluid contains surfactant, fibronectin, IgG, and complement, all of which are effective opsonins. Surfactant is composed of several components (SP-A, SP-B, SP-C, SP-D) that serve to increase the microbicidal capacity of macrophages. These compounds may also affect free-radical production and lymphocyte activity. 9 SP-A and SP-D are collectins, which are a family of collagenous carbohydrate-binding proteins. These proteins bind a variety of organisms, including viruses, gram-negative and gram-positive bacteria, mycobacteria, and fungi, which may decrease their virulence or enhance phagocytosis by neutrophils and alveolar macrophages. 10 Free fatty acids, lysozyme, iron-binding proteins, and defensins are also present and may be directly microbicidal. Phagocytic cells including macrophages and neutrophils play a major role in pulmonary host defense. Four distinct populations of macrophages exist in the lung and vary in their location and function. 11 , 12 The alveolar macrophage is located in the alveolar-lining fluid at the interphase between air and lung tissue. It serves as the resident phagocytic cell in the lower airway and is the first phagocyte encountered by inert particles and potential pathogens entering the lung via inspired air. Alveolar macrophages play several critical roles. 7 As phagocytic cells, they can eliminate certain organisms. If the numbers of organisms increase beyond the macrophages' capability to handle them or if the organisms involved are particularly virulent (e.g., Pseudomonas aeruginosa ), the macrophage becomes a mediator of an inflammatory response by producing cytokines that recruit neutrophils into the lung. 13 Interstitial macrophages are located in the lung connective tissue and serve as both phagocytic cells and antigen-processing cells. Dendritic cells derive from monocytes and are located within the epithelium of the trachea, conducting airways, terminal airways, alveolar septa, pulmonary vasculature, and visceral pleura. These cells are therefore positioned to interact with antigens in inhaled air. Dendritic cells (and a specialized subpopulation termed Langerhans cells ) possess an enhanced capacity to capture, process, and present class II antigens. They can migrate to lymphoid tissue, where they can stimulate T-cell immune responses. Dendritic cells can also produce a variety of cytokines and chemokines, including interleukin (IL)-12, which serves to stimulate B-cell immune function. 14 The intravascular macrophage is located in the capillary endothelial cells. These cells are actively phagocytic and remove foreign or damaged material entering the lungs via the bloodstream. Neutrophil recruitment is crucial for the inflammatory response in the lung. The mechanisms involved in the initial detection of organisms in the lung and the generation and subsequent resolution of a response to them are now being more clearly delineated. 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 Other lung parenchymal cells may also help regulate the inflammatory response. 21 In addition to epithelial cells, interstitial macrophages, and dendritic cells, endothelial cells, pulmonary smooth muscle cells, and fibroblasts produce both proinflammatory (e.g., colony-stimulating factors, chemokines) and anti-inflammatory (IL-10) factors. Microorganisms express molecular recognition patterns that are unique and different from that of the host. Pattern recognition receptor families such as Toll-like receptors are present on epithelioid cells, alveolar macrophages, dendritic cells, as well as other cells that are located in strategic areas of the lung and either individually or in groups serve to recognize molecular patterns of invading organisms. 21 This recognition leads to the generation of early-response cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-I that then activate transcription factors such as mitogen-activated protein kinase, phosphoinositide 3-kinase, nuclear factor kappa B (NF-κB), and interferon-regulatory factors. These transcription factors serve as a common pathway for pattern recognition receptors and orchestrate the development of the inflammatory response by mediating the transcription of chemokines, adhesin molecules, and other cytokines. This signal cascade serves two purposes. The first is to generate and maintain the inflammatory response to recruit neutrophils into areas of microbial invasion. The other goal is to activate anti-inflammatory response mediators, which lead to the shedding of receptors, neutralization of cytokines, and inhibition of macrophage recruitment, which all serve to ensure that the inflammatory response is held in check and that noninvolved areas of lung are not injured. It is this balance of pro­inflammatory and anti-inflammatory cytokines and effector molecules that allows for sterilization of an infected area of lung without gross destruction of the lung itself. In addition, it is now recognized that polymorphisms and defects are not uncommonly found for both pattern recognition receptors and the inflammatory and anti-inflammatory mediators and that these genetic variations can contribute to an individual's susceptibility to pneumonia. 20 Cell-mediated immunity via lymphocytes and macrophages is central to adaptive immune responses in the lung and is especially important against certain pathogens, including viruses and intracellular organisms that can survive within pulmonary macrophages (e.g., Mycobacterium, Legionella ). 12 Lymphocytes within the lung are found along the epithelial surfaces (LES), as well as within the interstitial and intravascular spaces. LES cells are predominantly memory T cells and interact both with epithelial cells and dendritic cells. Interstitial cells are similarly predominantly T cells but with a different CD4/CD8 ratio than seen with that of either LES cells or intravascular lymphocytes and with an abundance of natural killer cells. In addition, although uncommon in adults, in childhood there are organized lymphoid tissue collections in the lung located in follicles along the bronchial tree termed bronchus-associated lymphoid tissue (BALT) collections. BALT collections appear to be morphologically similar to Peyer's patches in the intestine and are similarly associated with both the vasculature and the mucosal epithelium. Inhaled antigens therefore are able to cross the epithelial surface and immediately encounter cells involved with antigen processing. Once these antigens are processed and presented, B and T lymphocytes localize and are stimulated to become memory cells and effector cells, with antibody production occurring in this tissue. Antigens inhaled into the alveolus and captured by antigen-presenting cells subsequently activate intra-alveolar lymphoid cells. These cells can stimulate the migration of memory lymphocytes into the area, leading to a localized accumulation of antigen-specific T and B lymphocytes, many of which possess effector cell function. As is true in other anatomic areas, binding of T cells to endothelium is a critical first step in the inflammatory process and is mediated by the interaction of leukocyte function–associated antigen (LFA)-1 integrins on the lymphocyte cell surface with ligands exposed by endothelium in areas of inflammation (intercellular adhesion molecules 1 and 2 and vascular cell adhesion molecule 1). Expression of these ligands on pulmonary endothelium is upregulated by inflammatory mediators such as IL-1, interferon-γ, and TNF-α, as well as by bacterial lipopolysaccharides. Lymphocytes in the lung have several major roles in the lung, including the production of antibody, cytotoxic activity (including killing of virally infected cells), production of inflammatory mediators, and mediation of immune tolerance. The lung contains a variety of cytotoxic T cells, including natural killer cells (antigen nonrestricted), antibody-dependent cytotoxic cells, and antigen-restricted cytotoxic cells. Pulmonary T cells produce a large number of cytokines. Mouse models suggest that unstimulated T cells produce mainly IL-2. After stimulation and conversion to memory T cells, two distinct groupings of cytokines are produced. The helper T-cell 1 (Th1) and 2 (Th2) pattern of cytokine production noted in murine models occurs in humans, although it appears to be less restrictive. Th1 cells produce interferon-γ, IL-2, IL-6, and IL-10 and contribute to cell-mediated immunity, whereas Th2 cells produce IL-4, IL-5, IL-10, and IL-13 and contribute to humoral immune function. Furthermore, IL-3, TNF-α, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, and chemokines are secreted by both Th1 and Th2 phenotypes. Th1 cells are involved in cell-mediated inflammatory reactions, whereas Th2 cells stimulate antibody production, especially IgE, and stimulate eosinophil activity. However, there appears to be both Th1 and Th2 responses in many immune responses. The interaction of T-regulatory cells with mucosal dendritic cells appears to mediate the phenomenon of immune tolerance in the lung. Impairment of Pulmonary Defenses The defenses of the lung, when they are functioning normally, are extremely efficient in maintaining low microbial concentrations in the lower airways. However, a number of factors are known to interfere with these defenses and predispose the host to infection. Alterations in the level of consciousness from any cause (stroke, seizures, drug intoxication, anesthesia, alcohol abuse, and even normal sleep) can compromise epiglottic closure and lead to aspiration of oropharyngeal microbiota into the lower respiratory tract. 22 Cigarette smoke, perhaps the most common agent involved in compromising natural pulmonary defense mechanisms, disrupts mucociliary transport as well as altering macrophage B- and T-lymphocyte functionality. 23 , 24 Alcohol not only impairs the cough and epiglottic reflexes but also has been associated with increased colonization of the oropharynx with aerobic gram-negative bacilli, decreased mobilization of neutrophils, abnormal phagocyte oxidative metabolism, and abnormal chemotaxis. 25 , 26 Alcohol effectively blocks the TNF response to endotoxin, with decreased recruitment of neutrophils to the lung. Furthermore, alcohol enhances monocyte production of 1L-10, a cytokine with anti-inflammatory properties. 27 Infections with Mycoplasma pneumoniae or Haemophilus influenzae may interfere with normal ciliary function. 28 Viruses may actually destroy respiratory epithelium and may disrupt normal ciliary activity. Neutrophil function, including chemotaxis, phagocytosis, and stimulation of oxidative metabolism and alveolar macrophage function, may also be inhibited by certain viral infections. 29 Sepsis associated with extrapulmonary infections may undermine lung defense mechanisms. In animal models, exposure to lipopolysaccharide or endotoxin decreases lung clearance of a bacterial challenge. 30 Infection with human immunodeficiency virus (HIV) compromises many of the components of pulmonary host defense. Quantitative defects involve the naïve CD4 T cells initially, with the memory CD4 T cells depleted more rapidly later in infection. Functional defects caused by the virus include impaired response to remote recall antigens, inhibited response to soluble antigen followed in time by decreased T-cell response to alloantigens and mitogens, impaired IL-2 and interferon-γ production, and decreased immunoglobulin production. 31 In BALT, destruction of dendritic cells and degeneration of lymphoid follicles have been noted. Defective antigen presentation by dendritic cells has also been observed. Abnormal chemotaxis, phagocytosis, and oxidative metabolism in neutrophils of patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) have been described. Iatrogenic manipulations that bypass or interfere with the usual host defenses of the upper airways (endotracheal tubes, nasogastric tubes, and respiratory therapy machinery) all predispose to infection. 32 A variety of commonly prescribed drugs including aspirin, erythromycin, and aminophylline have been shown to alter host defenses in vitro or in models, but the clinical significance of this is uncertain. 33 , 34 Recent data with macrolides suggest that they have immunomodulatory activity that could have beneficial effects in some settings. 35 Other classes of agents, including proton pump inhibitors, histamine type 2 (H2) receptor antagonists, and antipsychotic agents, have been associated with pneumonia in population-based studies, although the associations have been challenged and the exact pathophysiologic mechanisms have not been determined. 36 , 37 , 38 Other factors that impair pulmonary host defenses include hypoxemia, acidosis, toxic inhalations, pulmonary edema, uremia, malnutrition, immunosuppressive agents, and mechanical obstruction. 39 , 40 , 41 Recent clinical studies have also shown an increased risk for pneumonia with therapeutic hypothermia now being used for management of cardiac arrest and head trauma. 42 Older adults are at increased risk for the development of pneumonia (see Chapter 315). Although numerous factors play an important role in this regard, including an increased number and increased severity of underlying diseases and an increased number of hospitalizations, there are age-related impairments in host defenses. 43 Less effective mucociliary clearance and abnormal elastic recoil may lead to less effective coughing and clearing of the upper airways. Some populations of elderly patients have an increased incidence of microaspiration. Changes in humoral immunity and cell-mediated immune function have been documented in older persons, although their role in the development of infection remains unclear. Immune dysregulation has been shown to occur in the elderly such that low-grade inflammation occurs in the lung in the absence of clinically detectable infection. 44 Recurrent episodes of bacterial pneumonia suggest the presence of specific predisposing factors. 45 In children and young adults, recurrent pneumonia is associated with defects in host defenses, including recurrent aspiration, asthma, congenital cardiac or pulmonary disease, and altered immune function. 46 , 47 , 48 , 49 Congenital defects in ciliary activity and cystic fibrosis are other clinical entities associated with recurrent pneumonia in young persons. 50 , 51 Structural lung abnormalities such as bronchiectasis and pulmonary sequestration are also important predisposing factors for both younger and older patient populations. As more has become known about the molecular basis of the inflammatory response, it has become clear that a variety of genetic polymorphisms exist that are associated with predisposition to the development of pneumonia. It is important to recognize that these defects may be associated with a narrow range of potential pathogens, which may aid in the identification of the defect. 17 , 20 Although most congenital defects in host defenses appear in childhood, common variable hypogammaglobulinemia may first appear in adulthood with recurrent pneumonia. Acquired host defense defects are more varied and include malignancies (lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma), infection (AIDS), and iatrogenic causes (immune suppression associated with solid-organ or marrow transplantation, cancer chemotherapy, high-dose cortico­steroid treatment, and TNF inhibitors). Underlying respiratory tract disorders such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), bronchiectasis, adult-onset cystic fibrosis, bronchopulmonary sequestration, and tracheobronchomegaly may present as pneumonia. Bronchial obstruction due to intrinsic compression (adenocarcinoma) or extrinsic compression (lymphadenopathy due to sarcoidosis or malignancy) has also been associated with recurrent episodes of pneumonia. Underlying diseases that predispose to aspiration lead to an increased incidence of pneumonia. These may be associated with gastrointestinal diseases (tracheoesophageal fistula, esophageal diverticula, esophageal reflux, esophageal stricture), neuromuscular disorders (myasthenia gravis, dementia, amyotrophic lateral sclerosis), and cancer of the head and neck. Most systemic illnesses, including chronic renal failure, diabetes, and sickle cell disease, have been associated with pneumonia. Pulmonary Defense Systems The pulmonary defense system involves both innate and adaptive immunity, including anatomic and mechanical barriers, humoral immunity, cell-mediated immunity, and phagocyte activity ( Table 69-2 ). 6 , 7 The upper airways, including the nasopharynx, oropharynx, and larynx, are the sites first exposed to inhaled microorganisms. The nasal mucosa contains ciliated epithelium and mucus-producing cells. Mechanical clearance of entrapped organisms occurs through the nasopharynx via expulsion or swallowing. In the oropharynx, the flow of saliva, sloughing of epithelial cells, local production of complement, and bacterial interference from resident microbiota serve as important factors in local host defense. Secretory immunoglobulin A (IgA) is the major immunoglobulin produced in the upper airways and accounts for 10% of the total protein of nasal secretions. It possesses antibacterial and antiviral activity despite being a relatively poor opsonin. Despite some controversy, low IgA levels are probably not associated with increased bacterial infection. IgG and IgM enter the airways predominantly via transudation from the blood. Their roles in bacterial opsonization, complement activation, agglutination, and neutralization activity are similar to those noted in serum. TABLE 69-2 Pulmonary Host Defenses Adherence of microorganisms to epithelial surfaces of the upper airways is a critical initial step in colonization and subsequent infection. Changes in fibronectin secretion and in binding characteristics of epithelium for various lectins occur as a response to underlying diseases. This may help to explain why colonization occurs in some clinical settings and not in others. Particles greater than 10 µm are efficiently filtered by the hair in the anterior nares or impact onto mucosal surfaces because of the configuration of the upper airways and the nasal turbinates. The cough and epiglottic reflexes also keep large particulate matter from reaching the central airways. The trachea and conducting airways of the transbronchial tree are usually effective in entrapping particles from 2 to 10 µm. The sharp angles at which the central airways branch cause particles to impact on mucosal surfaces, where they are entrapped by endobronchial mucus. Once entrapped, particles are removed by ciliated epithelium to the oropharynx. Epithelial cells, which line the conducting airways, submucosal glands, and alveoli, produce airway surface liquid, which is a complex mixture of proteins and peptides mixed with plasma transudate. Airway surface liquid contains lysozyme, lactoferrin, and secretory leukocyte proteinase inhibitor, all of which possess microbicidal activity. 8 Respiratory epithelial cells produce other potent antimicrobial peptides, including cathelicidins and β-defensins. These peptides possess individual antimicrobial activity as well as synergistic antimicrobial activity with each other. In addition, the β-defensins may act as chemokines for memory T cells and dendritic cells, thereby serving as a link between the innate and adaptive immune systems. Most bacteria are 0.5 to 2 µm. This size particle may reach the terminal airways and alveoli. No mucociliary apparatus exists at this level, yet a variety of humoral and cell-mediated host defenses function here. The alveolar-lining fluid contains surfactant, fibronectin, IgG, and complement, all of which are effective opsonins. Surfactant is composed of several components (SP-A, SP-B, SP-C, SP-D) that serve to increase the microbicidal capacity of macrophages. These compounds may also affect free-radical production and lymphocyte activity. 9 SP-A and SP-D are collectins, which are a family of collagenous carbohydrate-binding proteins. These proteins bind a variety of organisms, including viruses, gram-negative and gram-positive bacteria, mycobacteria, and fungi, which may decrease their virulence or enhance phagocytosis by neutrophils and alveolar macrophages. 10 Free fatty acids, lysozyme, iron-binding proteins, and defensins are also present and may be directly microbicidal. Phagocytic cells including macrophages and neutrophils play a major role in pulmonary host defense. Four distinct populations of macrophages exist in the lung and vary in their location and function. 11 , 12 The alveolar macrophage is located in the alveolar-lining fluid at the interphase between air and lung tissue. It serves as the resident phagocytic cell in the lower airway and is the first phagocyte encountered by inert particles and potential pathogens entering the lung via inspired air. Alveolar macrophages play several critical roles. 7 As phagocytic cells, they can eliminate certain organisms. If the numbers of organisms increase beyond the macrophages' capability to handle them or if the organisms involved are particularly virulent (e.g., Pseudomonas aeruginosa ), the macrophage becomes a mediator of an inflammatory response by producing cytokines that recruit neutrophils into the lung. 13 Interstitial macrophages are located in the lung connective tissue and serve as both phagocytic cells and antigen-processing cells. Dendritic cells derive from monocytes and are located within the epithelium of the trachea, conducting airways, terminal airways, alveolar septa, pulmonary vasculature, and visceral pleura. These cells are therefore positioned to interact with antigens in inhaled air. Dendritic cells (and a specialized subpopulation termed Langerhans cells ) possess an enhanced capacity to capture, process, and present class II antigens. They can migrate to lymphoid tissue, where they can stimulate T-cell immune responses. Dendritic cells can also produce a variety of cytokines and chemokines, including interleukin (IL)-12, which serves to stimulate B-cell immune function. 14 The intravascular macrophage is located in the capillary endothelial cells. These cells are actively phagocytic and remove foreign or damaged material entering the lungs via the bloodstream. Neutrophil recruitment is crucial for the inflammatory response in the lung. The mechanisms involved in the initial detection of organisms in the lung and the generation and subsequent resolution of a response to them are now being more clearly delineated. 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 Other lung parenchymal cells may also help regulate the inflammatory response. 21 In addition to epithelial cells, interstitial macrophages, and dendritic cells, endothelial cells, pulmonary smooth muscle cells, and fibroblasts produce both proinflammatory (e.g., colony-stimulating factors, chemokines) and anti-inflammatory (IL-10) factors. Microorganisms express molecular recognition patterns that are unique and different from that of the host. Pattern recognition receptor families such as Toll-like receptors are present on epithelioid cells, alveolar macrophages, dendritic cells, as well as other cells that are located in strategic areas of the lung and either individually or in groups serve to recognize molecular patterns of invading organisms. 21 This recognition leads to the generation of early-response cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-I that then activate transcription factors such as mitogen-activated protein kinase, phosphoinositide 3-kinase, nuclear factor kappa B (NF-κB), and interferon-regulatory factors. These transcription factors serve as a common pathway for pattern recognition receptors and orchestrate the development of the inflammatory response by mediating the transcription of chemokines, adhesin molecules, and other cytokines. This signal cascade serves two purposes. The first is to generate and maintain the inflammatory response to recruit neutrophils into areas of microbial invasion. The other goal is to activate anti-inflammatory response mediators, which lead to the shedding of receptors, neutralization of cytokines, and inhibition of macrophage recruitment, which all serve to ensure that the inflammatory response is held in check and that noninvolved areas of lung are not injured. It is this balance of pro­inflammatory and anti-inflammatory cytokines and effector molecules that allows for sterilization of an infected area of lung without gross destruction of the lung itself. In addition, it is now recognized that polymorphisms and defects are not uncommonly found for both pattern recognition receptors and the inflammatory and anti-inflammatory mediators and that these genetic variations can contribute to an individual's susceptibility to pneumonia. 20 Cell-mediated immunity via lymphocytes and macrophages is central to adaptive immune responses in the lung and is especially important against certain pathogens, including viruses and intracellular organisms that can survive within pulmonary macrophages (e.g., Mycobacterium, Legionella ). 12 Lymphocytes within the lung are found along the epithelial surfaces (LES), as well as within the interstitial and intravascular spaces. LES cells are predominantly memory T cells and interact both with epithelial cells and dendritic cells. Interstitial cells are similarly predominantly T cells but with a different CD4/CD8 ratio than seen with that of either LES cells or intravascular lymphocytes and with an abundance of natural killer cells. In addition, although uncommon in adults, in childhood there are organized lymphoid tissue collections in the lung located in follicles along the bronchial tree termed bronchus-associated lymphoid tissue (BALT) collections. BALT collections appear to be morphologically similar to Peyer's patches in the intestine and are similarly associated with both the vasculature and the mucosal epithelium. Inhaled antigens therefore are able to cross the epithelial surface and immediately encounter cells involved with antigen processing. Once these antigens are processed and presented, B and T lymphocytes localize and are stimulated to become memory cells and effector cells, with antibody production occurring in this tissue. Antigens inhaled into the alveolus and captured by antigen-presenting cells subsequently activate intra-alveolar lymphoid cells. These cells can stimulate the migration of memory lymphocytes into the area, leading to a localized accumulation of antigen-specific T and B lymphocytes, many of which possess effector cell function. As is true in other anatomic areas, binding of T cells to endothelium is a critical first step in the inflammatory process and is mediated by the interaction of leukocyte function–associated antigen (LFA)-1 integrins on the lymphocyte cell surface with ligands exposed by endothelium in areas of inflammation (intercellular adhesion molecules 1 and 2 and vascular cell adhesion molecule 1). Expression of these ligands on pulmonary endothelium is upregulated by inflammatory mediators such as IL-1, interferon-γ, and TNF-α, as well as by bacterial lipopolysaccharides. Lymphocytes in the lung have several major roles in the lung, including the production of antibody, cytotoxic activity (including killing of virally infected cells), production of inflammatory mediators, and mediation of immune tolerance. The lung contains a variety of cytotoxic T cells, including natural killer cells (antigen nonrestricted), antibody-dependent cytotoxic cells, and antigen-restricted cytotoxic cells. Pulmonary T cells produce a large number of cytokines. Mouse models suggest that unstimulated T cells produce mainly IL-2. After stimulation and conversion to memory T cells, two distinct groupings of cytokines are produced. The helper T-cell 1 (Th1) and 2 (Th2) pattern of cytokine production noted in murine models occurs in humans, although it appears to be less restrictive. Th1 cells produce interferon-γ, IL-2, IL-6, and IL-10 and contribute to cell-mediated immunity, whereas Th2 cells produce IL-4, IL-5, IL-10, and IL-13 and contribute to humoral immune function. Furthermore, IL-3, TNF-α, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, and chemokines are secreted by both Th1 and Th2 phenotypes. Th1 cells are involved in cell-mediated inflammatory reactions, whereas Th2 cells stimulate antibody production, especially IgE, and stimulate eosinophil activity. However, there appears to be both Th1 and Th2 responses in many immune responses. The interaction of T-regulatory cells with mucosal dendritic cells appears to mediate the phenomenon of immune tolerance in the lung. Impairment of Pulmonary Defenses The defenses of the lung, when they are functioning normally, are extremely efficient in maintaining low microbial concentrations in the lower airways. However, a number of factors are known to interfere with these defenses and predispose the host to infection. Alterations in the level of consciousness from any cause (stroke, seizures, drug intoxication, anesthesia, alcohol abuse, and even normal sleep) can compromise epiglottic closure and lead to aspiration of oropharyngeal microbiota into the lower respiratory tract. 22 Cigarette smoke, perhaps the most common agent involved in compromising natural pulmonary defense mechanisms, disrupts mucociliary transport as well as altering macrophage B- and T-lymphocyte functionality. 23 , 24 Alcohol not only impairs the cough and epiglottic reflexes but also has been associated with increased colonization of the oropharynx with aerobic gram-negative bacilli, decreased mobilization of neutrophils, abnormal phagocyte oxidative metabolism, and abnormal chemotaxis. 25 , 26 Alcohol effectively blocks the TNF response to endotoxin, with decreased recruitment of neutrophils to the lung. Furthermore, alcohol enhances monocyte production of 1L-10, a cytokine with anti-inflammatory properties. 27 Infections with Mycoplasma pneumoniae or Haemophilus influenzae may interfere with normal ciliary function. 28 Viruses may actually destroy respiratory epithelium and may disrupt normal ciliary activity. Neutrophil function, including chemotaxis, phagocytosis, and stimulation of oxidative metabolism and alveolar macrophage function, may also be inhibited by certain viral infections. 29 Sepsis associated with extrapulmonary infections may undermine lung defense mechanisms. In animal models, exposure to lipopolysaccharide or endotoxin decreases lung clearance of a bacterial challenge. 30 Infection with human immunodeficiency virus (HIV) compromises many of the components of pulmonary host defense. Quantitative defects involve the naïve CD4 T cells initially, with the memory CD4 T cells depleted more rapidly later in infection. Functional defects caused by the virus include impaired response to remote recall antigens, inhibited response to soluble antigen followed in time by decreased T-cell response to alloantigens and mitogens, impaired IL-2 and interferon-γ production, and decreased immunoglobulin production. 31 In BALT, destruction of dendritic cells and degeneration of lymphoid follicles have been noted. Defective antigen presentation by dendritic cells has also been observed. Abnormal chemotaxis, phagocytosis, and oxidative metabolism in neutrophils of patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) have been described. Iatrogenic manipulations that bypass or interfere with the usual host defenses of the upper airways (endotracheal tubes, nasogastric tubes, and respiratory therapy machinery) all predispose to infection. 32 A variety of commonly prescribed drugs including aspirin, erythromycin, and aminophylline have been shown to alter host defenses in vitro or in models, but the clinical significance of this is uncertain. 33 , 34 Recent data with macrolides suggest that they have immunomodulatory activity that could have beneficial effects in some settings. 35 Other classes of agents, including proton pump inhibitors, histamine type 2 (H2) receptor antagonists, and antipsychotic agents, have been associated with pneumonia in population-based studies, although the associations have been challenged and the exact pathophysiologic mechanisms have not been determined. 36 , 37 , 38 Other factors that impair pulmonary host defenses include hypoxemia, acidosis, toxic inhalations, pulmonary edema, uremia, malnutrition, immunosuppressive agents, and mechanical obstruction. 39 , 40 , 41 Recent clinical studies have also shown an increased risk for pneumonia with therapeutic hypothermia now being used for management of cardiac arrest and head trauma. 42 Older adults are at increased risk for the development of pneumonia (see Chapter 315). Although numerous factors play an important role in this regard, including an increased number and increased severity of underlying diseases and an increased number of hospitalizations, there are age-related impairments in host defenses. 43 Less effective mucociliary clearance and abnormal elastic recoil may lead to less effective coughing and clearing of the upper airways. Some populations of elderly patients have an increased incidence of microaspiration. Changes in humoral immunity and cell-mediated immune function have been documented in older persons, although their role in the development of infection remains unclear. Immune dysregulation has been shown to occur in the elderly such that low-grade inflammation occurs in the lung in the absence of clinically detectable infection. 44 Recurrent episodes of bacterial pneumonia suggest the presence of specific predisposing factors. 45 In children and young adults, recurrent pneumonia is associated with defects in host defenses, including recurrent aspiration, asthma, congenital cardiac or pulmonary disease, and altered immune function. 46 , 47 , 48 , 49 Congenital defects in ciliary activity and cystic fibrosis are other clinical entities associated with recurrent pneumonia in young persons. 50 , 51 Structural lung abnormalities such as bronchiectasis and pulmonary sequestration are also important predisposing factors for both younger and older patient populations. As more has become known about the molecular basis of the inflammatory response, it has become clear that a variety of genetic polymorphisms exist that are associated with predisposition to the development of pneumonia. It is important to recognize that these defects may be associated with a narrow range of potential pathogens, which may aid in the identification of the defect. 17 , 20 Although most congenital defects in host defenses appear in childhood, common variable hypogammaglobulinemia may first appear in adulthood with recurrent pneumonia. Acquired host defense defects are more varied and include malignancies (lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma), infection (AIDS), and iatrogenic causes (immune suppression associated with solid-organ or marrow transplantation, cancer chemotherapy, high-dose cortico­steroid treatment, and TNF inhibitors). Underlying respiratory tract disorders such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), bronchiectasis, adult-onset cystic fibrosis, bronchopulmonary sequestration, and tracheobronchomegaly may present as pneumonia. Bronchial obstruction due to intrinsic compression (adenocarcinoma) or extrinsic compression (lymphadenopathy due to sarcoidosis or malignancy) has also been associated with recurrent episodes of pneumonia. Underlying diseases that predispose to aspiration lead to an increased incidence of pneumonia. These may be associated with gastrointestinal diseases (tracheoesophageal fistula, esophageal diverticula, esophageal reflux, esophageal stricture), neuromuscular disorders (myasthenia gravis, dementia, amyotrophic lateral sclerosis), and cancer of the head and neck. Most systemic illnesses, including chronic renal failure, diabetes, and sickle cell disease, have been associated with pneumonia. Clinical Evaluation History The history should attempt to define (1) symptoms consistent with the diagnosis of pneumonia, (2) the clinical setting in which the pneumonia takes place, (3) defects in host defense that could predispose to the development of pneumonia, and (4) possible exposures to specific pathogens. Respiratory symptoms are commonly encountered in primary care practices but are usually not associated with pneumonia. Analysis of data over 9 years from 1980 to 1994 found that between 5 and 10 million primary care visits each year were for cough, with only 4% to 6% of these visits linked to pneumonia. 52 Therefore, a serious effort should be made to differentiate pneumonia from other clinical entities with which it may be confused. The predominant clinical findings of pneumonia related to the respiratory tract should be sought, including cough, sputum production, dyspnea, chest pain, and fever. 53 It should also be recognized that nonrespiratory symptoms are commonly present, including fatigue, sweats, headache, nausea, and myalgia, and occasionally abdominal pain and diarrhea. 54 With increasing age, both respiratory and nonrespiratory symptoms of pneumonia become less frequent. Unfortunately, symptoms at presentation elucidated by a careful history may not always be able to distinguish pneumonia from other respiratory problems. Specific etiologic agents of pneumonia have been associated with certain underlying diseases and patient populations. Pneumonia due to M. pneumoniae occurs more often in younger people, but it may be a cause of pneumonia in older patients severe enough to require hospitalization. 55 Gram-negative bacterial pneumonia tends to occur in older adults, especially those who are debilitated with comorbid diseases or are ill enough to require management in an intensive care unit (ICU). Tuberculosis should be suspected in the homeless, those infected with HIV, those who come from developing countries where tuberculosis is prevalent, and those who have been exposed to others with the disease. Staphylococcal pneumonia classically has been noted during epidemics of influenza. 56 Over the past 20 years, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has grown in importance as a cause of ventilator-associated pneumonia (VAP). In addition, since the late 1990s, strains of community-acquired MRSA have emerged as infrequent but important causes of CAP. 57 , 58 Pneumonia has been noted to occur with increased frequency in patients with a variety of underlying disorders such as congestive heart failure, diabetes, alcoholism, and COPD. In one series of 292 patients with pneumonia, only 18% were found to have no underlying disease. 59 Certain lifestyle factors have also been associated with an increased risk for pneumonia. These include cigarette smoking; alcohol use, especially in males; contact with children and pets; and living in a household with more than 10 people. 60 Viral upper respiratory tract infections can predispose to pneumonia and may be associated with more severe disease. 61 , 62 Recent dental manipulations, sedative overdoses, seizures, alcoholism, or loss of consciousness for any reason should raise the suspicion for anaerobic infection caused by aspiration of oral contents. 22 Special note needs to be made of the relationship between pneumonia and patients with COPD. 63 Although well-controlled studies are lacking, it does appear that patients with COPD have an increased incidence of pneumonia. However, because the tracheobronchial tree is often colonized with Streptococcus pneumoniae and H. influenzae, it has been difficult to distinguish clearly between colonization and infection in many studies. Although these organisms play an important role as etiologic agents of pneumonia in this patient population, most of the clinical studies were carried out before it was recognized that other, less common pathogens also play a significant role in causing disease. The roles of Moraxella catarrhalis, Legionella, Chlamydia, and aerobic gram-negative rods including P. aeruginosa have been established. 63 , 64 , 65 Cystic fibrosis is commonly associated with Pseudomonas and staphylococcal pulmonary infections. 51 Burkholderia spp., Stenotrophomonas spp., Achromobacter xylosoxidans, and atypical mycobacteria are also important pulmonary pathogens in this setting. Pulmonary alveolar proteinosis can be associated with Nocardia infection. Patients infected with HIV are at high risk for the development of pulmonary infections. 66 , 67 , 68 , 69 Although the incidence of pneumonia has decreased notably in the developed world with the advent of highly active antiretroviral therapy, pneumonia remains a common HIV complication. Principal risk factors for pneumonia in this population include low current CD4 + count, nadir CD4 + count, injection drug use, smoking, increasing age, and lack of highly active antiretroviral therapy and anti- Pneumocystis prophylaxis. 67 , 70 In considering the etiology of pulmonary infection in patients infected with HIV, geographic exposures, demographic characteristics of the patient, and the degree of immune suppression need to be considered. With the development of highly active antiretroviral therapy (HAART) and effective prophylactic strategies, the incidence of Pneumocystis jirovecii pneumonia in patients with AIDS has decreased from 70% to 80% to less than 1 per 100 patient-years. 71 It is now predominantly seen in individuals who have a CD4 + count less than 100/mm 3 and are either unaware of having HIV infection or are not receiving care. 69 Bacterial pneumonia was a significant complication for HIV-infected individuals and in the pre-antiretroviral era with an incidence 5- to 10-fold that seen in the general population; and the incidence of invasive pneumococcal disease is more than 50-fold higher in HIV-infected patients than in non–HIV-infected controls. 70 , 72 The incidence of these infections has now notably decreased, although there remains a high risk in patients not on treatment. 69 The incidence of pneumonia due to P. aeruginosa and S. aureus has also been notably higher in HIV-infected patients. 69 Although relatively less common in the developed world, in developing countries, Mycobacterium tuberculosis is now viewed as the major pulmonary pathogen in patients with AIDS. 68 The use of HAART has led to a decreased incidence of AIDS, but its overall importance as a pulmonary pathogen remains. In the severely immunosuppressed HIV population, fungal infections can play a major role, and depending on the patient's exposure history, cryptococcosis, histoplasmosis, blastomycosis, and coccidioidomycosis should be considered. In patients infected with HIV, the relationship between the degree of immune suppression using the CD4 + count as a marker and the specific etiology of pneumonia deserves emphasis. Bacterial pneumonia and pulmonary tuberculosis usually occur when the CD4 + count is less than 400/µL, with increased risk when the count falls below 200 cells/µL. 73 Pneumocystis and disseminated tuberculosis are associated with CD4 + counts below 200/mm 3 , and disseminated nontuberculous mycobacterial and fungal infections occur with CD4 + counts less than 50 to 100/mm 3 . 73 Pulmonary infections in HIV-infected patients are discussed in more detail in Chapter 125. Pneumonia developing in hospitalized patients often involves Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, and S. aureus, organisms that are unusual in community-acquired disease. 74 Pneumonia in older adults, especially those who are bedridden or who have chronic diseases, had been believed to be more often associated with gram-negative bacilli than is pneumonia in younger populations, but this association remains unclear. 75 , 76 In general, elderly patients most frequently have infection due to S. pneumoniae, nontypeable strains of H. influenzae, M. catarrhalis, or aspiration pneumonia. Recently, it has been recognized that patients with outpatient contact with the health care system develop pneumonia with etiologic agents that may be seen in both CAP and nosocomial pneumonia. 77 , 78 Increased importance of MRSA, aerobic gram-negative rods including P. aeruginosa, and mixed aerobic/anaerobic organisms due to aspiration are associated with this new syndrome of health care–associated pneumonia (HCAP) (see further discussion under "Pneumonia Syndromes"). Important aspects of a patient's history that may suggest specific potential infectious agents include occupational, animal, and travel history ( Table 69-3 ). A carefully obtained history may also suggest the presence of noninfectious pulmonary disease, such as tumors, sarcoidosis, granulomatosis with polyangiitis (previously known as Wegener's granulomatosis), or pulmonary emboli; all may masquerade as pneumonia. TABLE 69-3 Pneumonia: Etiology Suggested by Exposure History EXPOSURE HISTORY INFECTIOUS AGENT Exposure to concurrent illness in school dormitory or household setting Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae Environmental Exposures Exposure to contaminated aerosols (e.g., air coolers, hospital water supply) Legionnaires' disease Exposure to goat hair, raw wool, animal hides Anthrax Ingestion of unpasteurized milk Brucellosis Exposure to bat droppings (caving) or dust from soil enriched with bird droppings Histoplasmosis Exposure to water contaminated with animal urine Leptospirosis Exposure to rodent droppings, urine, saliva Hantavirus Potential bioterrorism exposure Anthrax, plague, tularemia Zoonotic Exposures Employment as abattoir work or veterinarian Brucellosis Exposure to cattle, goats, pigs Anthrax, brucellosis Exposure to ground squirrels, chipmunks, rabbits, prairie dogs, rats in Africa or southwestern United States Plague Hunting or exposure to rabbits, foxes, squirrels Tularemia Bites from flies or ticks Tularemia Exposure to birds (parrots, budgerigars, cockatoos, pigeons, turkeys) Psittacosis Exposure to infected dogs and cats Pasteurella multocida, Q fever (Coxiella burnetii) Exposure to infected goats, cattle, sheep, domestic animals, and their secretions (milk, amniotic fluid, placenta, feces) Q fever (C. burnetii) Travel Exposures Residence in or travel to San Joaquin Valley, southern California, southwestern Texas, southern Arizona, New Mexico Coccidioidomycosis Residence in or travel to Mississippi or Ohio river valleys, Caribbean, central America, or Africa Histoplasmosis, blastomycosis Residence in or travel to southern China SARS, avian influenza Residence in or travel to Arabian peninsula MERS-CoV Residence in or travel to Southeast Asia Paragonimiasis, melioidosis Residence in or travel to West Indies, Australia, or Guam Melioidosis MERS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus; SARS, severe acute respiratory syndrome. Physical Examination Most, but not all, patients with pneumonia look ill, sometimes acutely. They may be breathing with accessory muscles. Elderly patients may appear apathetic. Fever is reported to be present in 65% to 90% of patients with pneumonia. It may be sustained, remittent, or at times hectic. Fever patterns per se, however, are not useful for establishing a specific diagnosis. Oral temperature assessment should be avoided to reduce error caused by rapid mouth breathing. Recording of postural changes in blood pressure and pulse rate is useful in assessing hydration and intravascular fluid volume. The pulse usually increases by 10 beats/min for every degree (centigrade) of temperature elevation. A pulse-temperature deficit (e.g., a relative bradycardia for the amount of fever) should suggest viral infection, mycoplasmal infection, chlamydial infection, tularemia, or infection with Legionella. Cyanosis, a rapid respiratory rate, the use of accessory muscles of respiration, sternal retraction, and nasal flaring suggest serious respiratory compromise. Cutaneous abscesses or "track marks" from injection drug use may signal a source of bacteremia with subsequent pneumonia via hematogenous spread. Bullous myringitis is an infrequent but significant finding in mycoplasmal pneumonia. The presence of poor dentition should suggest a mixed infection due to aspiration of anaerobes and aerobes that colonize the oropharynx. Although edentulous patients may develop anaerobic pneumonia as a result of aspiration, it is uncommon. 79 Examination of the thorax may reveal "splinting," or an inspiratory lag on the side of the lesion, that is suggestive of bacterial pneumonia. Early in the disease process, definite signs of pulmonary involvement may be lacking or may be manifest only as fine rales. Chest examination may reveal these early signs of pneumonia even though the chest radiograph is normal. Evidence of consolidation (dullness on percussion, bronchial breath sounds, and E to A changes) is highly suggestive of bacterial infection but may be absent in two thirds of patients ill enough to be hospitalized and may be absent more often in patients treated as outpatients. 80 Patients with mycoplasmal or viral infection may exhibit few abnormalities on physical examination despite the presence of impressive infiltrates on the chest radiograph. The overall usefulness of the history and physical examination to detect the presence of pneumonia has been questioned. 81 The probability of detecting pneumonia varies with the patient population, the prevalence of pneumonia in that population, the threshold values for defining a vital sign as abnormal, and the ability of the clinician to detect abnormal physical findings. However, a great deal of interobserver variation has been shown to exist. In one series, three examiners seeing the same patients could not consistently agree on the physical examination findings. The diagnosis of pneumonia could be made with a sensitivity of only 47% to 69% and with a specificity of 50% to 75%. 81 Rare findings such as egophony and asymmetrical chest movements have a high predictive value for pneumonia but occur so infrequently that they are of limited utility. Several studies have assessed the utility of clinical prediction rules for the presence or absence of pneumonia based on multiple physical findings. 53 The absence of any vital sign abnormalities (i.e., respiratory rate >20 breaths/min, heart rate >100 beats/minute, and temperature >37.8° C [100° F]) has been associated with a less than 1% chance of a patient's having pneumonia, assuming a pneumonia prevalence of 5% in the population under study. In contrast, a constellation of cough, fever, tachycardia, decreased breath sounds, and crackles raises the possibility of pneumonia being present to between 40% and 50%. Therefore, although variable and nondefinitive, a complete history and physical examination may be extremely helpful in guiding the workup of pneumonia. Diagnostic Testing Clinical features derived from a careful history and physical examination, and confirmed by radiographic imaging of the chest that shows a pulmonary infiltrate, suggest the presence of pneumonia. The role of microbiologic tests to identify the specific cause is an important, although controversial, element of care. Most empirical antibiotic regimens are successful in the therapy for CAP, especially mild to moderate cases. Studies comparing empirical therapy with laboratory-guided pathogen-directed care have shown no differences in efficacy, although increased side effects were noted in the patients receiving empirical therapy. 82 Efforts to determine the specific cause of CAP are justified by the fact that they (1) may enable the clinician to narrow the antibiotic spectrum by using fewer agents, thereby decreasing exposure of the patient to potential side effects and potentially reducing the development of resistance; (2) may aid in the specific antibiotic choice for an individual patient depending on the specific epidemiology of infection and the specific resistance patterns of the locale; and (3) may identify pathogens not usually suspected and therefore not usually covered by empirical therapy. On a broader scale, identifying specific causes may help define new agents, trends in antibiotic resistance in established agents, and epidemiology of infectious outbreaks. The combined use of the standard microbiologic testing in conjunction with nucleic amplification assays can now define the etiology of CAP in up to 89% of cases. 83 The most recent guidelines from the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society (IDSA/ATS) have suggested diagnostic testing "whenever the result is likely to change individual antibiotic management" or in patients in whom "the diagnostic yield is thought to be greatest." 84 Sputum Examination and Examination of Other Respiratory Tract Samples Microscopic examination and culture of expectorated sputum remain the mainstays of the laboratory evaluation of pneumonia despite ongoing controversy concerning their sensitivity and specificity. Of patients admitted to the hospital with CAP, 40% to 60% will not be able to produce sputum. Of those that do, between 40% to 60% of samples may be judged to be inadequate for further study because of oropharyngeal contamination. 85 , 86 Many patients have received antibiotics before the studies are carried out, which drastically reduces the diagnostic yield. A variety of organisms cannot be detected by Gram stain, including Legionella spp., Mycoplasma spp., and Chlamydia spp. However, in patients who produce sputum of adequate quality to be examined (minimal or no oropharyngeal contamination), and who have not received prior antibiotics, diagnostic yields of 80% for sputum Gram stain have been reported in the small fraction of patients with bacteremic S. pneumoniae pneumonia. 87 Despite its pitfalls, the sputum Gram stain is noninvasive, can be performed no risk to the patient, and under the right circumstances may aid in the diagnosis and choice of empirical therapy in patients with CAP. 88 , 89 Examination of the sputum should include observation of the color, amount, consistency, and odor of the specimen. Mucopurulent sputum is most commonly found with bacterial pneumonia or bronchitis. However, sputum of a similar nature has been described in one third to one half of patients with mycoplasmal or adenovirus infections. 90 Scant or watery sputum is more often noted with these and other atypical pneumonias. "Rusty" sputum suggests alveolar involvement and has been most commonly (although not solely) associated with pneumococcal pneumonia. 91 Dark red, mucoid sputum (currant-jelly sputum) suggests Friedlander's pneumonia caused by encapsulated Klebsiella pneumoniae ( Fig. 69-1 ). 92 Foul-smelling sputum is associated with mixed anaerobic infections most commonly seen with aspiration. 79 FIGURE 69-1 "Currant-jelly" sputum associated with Klebsiella pneumoniae pneumonia. To maximize the diagnostic yield of the sputum examination, only samples with minimal oropharyngeal contamination should be reviewed. Although there are no definitive guidelines, the number of neutrophils and epithelial cells should be quantitated under low power (×100), with further examination reserved for samples containing 25 or more neutrophils and 10 or fewer epithelial cells. 93 Samples with more epithelial cells and fewer neutrophils are usually nondiagnostic and should be discarded. The morphologic and staining characteristics of any bacteria seen should be recorded and an estimate made of the predominant organisms ( FIGURE 69-2 , FIGURE 69-3 , FIGURE 69-4 , FIGURE 69-5 , FIGURE 69-6 ). When no bacterial predominance exists, this should be noted as well. FIGURE 69-2 Expectorated sputum with gram-positive, lancet-shaped diplococci from a patient with pneumococcal pneumonia. FIGURE 69-3 Expectorated sputum demonstrating a positive quellung reaction in a patient with pneumococcal pneumonia. FIGURE 69-4 Expectorated sputum with gram-negative coccobacillary forms (arrows) from a patient with Haemophilus influenzae pneumonia. FIGURE 69-5 Expectorated sputum with clusters of gram-positive cocci in a patient with Staphylococcus aureus pneumonia. FIGURE 69-6 Expectorated sputum with gram-negative rods in a patient with Klebsiella pneumoniae pneumonia. In the appropriate clinical setting, a predominance of gram-positive, lancet-shaped diplococci should suggest pneumococcal infection (see Fig. 69-2 ). When strict criteria for Gram stain positivity are used (the finding of a predominant organism or more than 10 gram-positive, lancet-shaped diplococci per oil immersion field [×1000], or both), the specificity of the Gram stain for identifying pneumococci has been shown to be 85%, with a sensitivity of 62%. 94 Because pneumococci may be part of the nasopharyngeal microbiota in 10% to 50% of healthy adults and often colonize the lower airways in patients with chronic bronchitis, identification of the organism does not mean that it is the cause of disease. 95 However, it is our experience that the large number of pneumococci necessary to produce a positive Gram stain is unusual in carriers. Microscopic sputum examination can be helpful to identify organisms other than pneumococci. The finding of small gram-negative coccobacillary organisms on sputum Gram stain is characteristic of H. influenzae (see Fig. 69-4 ). However, the sensitivity of the sputum Gram stain for detecting H. influenzae is usually less than that for S. pneumoniae and has been reported to be 40% to 80%. Staphylococci appear as gram-positive cocci in tetrads and grapelike clusters (see Fig. 69-5 ). Organisms of mixed morphology are characteristic of anaerobic infection. Few bacteria are seen with legionnaires' disease, Mycoplasma pneumonia, and viral pneumonia. Examination of induced sputum obtained after patients undergo nebulizer treatment with 3% saline solution has been a useful means of diagnosing Pneumocystis pneumonia in patients with AIDS. The use of commercially available monoclonal antibodies or Giemsa's, Gomori's methenamine silver, or toluidine blue O stains has led to a diagnosis in up to 50% of cases, making more aggressive diagnostic procedures unnecessary. Special sputum staining techniques are important in identifying other organisms such as mycobacteria ( Fig. 69-7 ). FIGURE 69-7 Expectorated sputum with acid-fast bacilli in a patient infected with Mycobacterium tuberculosis. Sputum culture as a means of diagnosing pneumonia is as controversial as the sputum Gram stain. Not all patients with pneumonia will produce sputum. Even when they do, studies of patients with bacteremic pneumococcal pneumonia have found sputum culture positivity rates varying between 29% and 94%. 87 Similarly, only 35% to 73% of sputum cultures are positive with proven H. influenzae pneumonia. 96 , 97 Both S. pneumoniae and H. influenzae are relatively fastidious and the sensitivity of cultures decreases with the prior use of antibiotics or with delays in transport of specimens to the clinical microbiology laboratory. Beyond these concerns with test sensitivity, sputum cultures have frequently been shown to yield more bacterial species than more invasive methods of obtaining respiratory tract secretions. 98 A lack of correlation between findings from sputum culture and findings from blood cultures and serologic studies has been observed. Several key parameters have been identified in efforts to maximize the diagnostic yield from sputum culture. Procurement of adequate sputum samples is an essential first step. With increasing numbers of epithelial cells and decreasing numbers of neutrophils, an increased amount of oropharyngeal contamination is present, as indicated by the isolation of more bacterial species. The presence of alveolar macrophages does not alter the bacteriologic findings when substantial numbers of epithelial cells are present, indicating that otherwise adequate samples of sputum can be contaminated with oropharyngeal contents and thereby rendered nondiagnostic. This type of initial screening has proved helpful in differentiating adequate sputum samples from saliva, thereby increasing the diagnostic yield of sputum culture. When culture of sputum is delayed, the isolation of pneumococci is less likely because of overgrowth by oropharyngeal microbiota. Rapid processing of samples is therefore another important factor leading to higher diagnostic yield. Some reports suggest that with adequate sputum samples and prompt culture of specimens, the diagnostic yield of the sputum culture may be improved. 87 Antigen detection in respiratory secretions has been used for more than 2 decades to try to maximize the diagnostic yield of sputum, especially for infections caused by S. pneumoniae, Pneumocystis, Legionella pneumophila, and a variety of respiratory viruses. The direct fluorescent antibody assays for L. pneumophila and Pneumocystis jirovecii are the most commonly utilized, with sensitivities of 25% to 75% for Legionella and 80% for Pneumocystis. 99 , 100 The sensitivity for Pneumocystis may be less for patients with causes of immunosuppression other than HIV disease. 101 Specificities of approximately 90% have been reported in the assays for each pathogen. Non- pneumophila and pneumophila non–serogroup 1 strains of Legionella may be missed in these assays, and the test needs to be performed by experienced technologists. For other organisms such as Chlamydia, problems with colonization versus infection, varying sensitivities, and cross-reactivity with nonpathogens have limited the usefulness of the study. Detection of microbial nucleic acid in respiratory tract secretions, both nasopharyngeal and sputum, remains an area of ongoing study. 102 , 103 , 104 Nucleic acid amplification assays, especially polymerase chain reaction (PCR) are particularly attractive because they have the capability of detecting minute amounts of material from potential pathogens, do not appear to be greatly influenced by prior antibiotic therapy, and can be performed quickly. Whereas a variety of PCR techniques have been described, U.S. Food and Drug Administration (FDA)-licensed assays exist for only M. tuberculosis, Legionella spp., and respiratory viruses. Assays for more commonly encountered organisms such as S. pneumoniae, H. influenzae, Mycoplasma, and Chlamydia spp. have been developed, but lack of standardization and difficulty in determining true infection from colonization remain problematic. False-negative results have been reported because of the presence of natural inhibitors. Although the PCR assay has been used to detect P. jirovecii, published studies have detected positive results in the setting of negative cultures and absence of clinical features of infection. PCR techniques have been used to identify DNA from M. tuberculosis in both sputum and lavage fluid. Sensitivities of 90% to 100% have been seen with patients who are acid-fast bacilli (AFB) smear positive, and results are reported as 50% to 70% in patients who are AFB smear negative; specificities as high as 99% have been noted. However, PCR assay may remain persistently positive in patients recently treated for tuberculosis and with no apparent active disease. Several individual pathogen and multiplex real-time PCR assay systems have become commercially available for the detection of community respiratory viruses. 103 The test systems differ for viral pathogens that they detect, and "in-house" assays for select pathogens are frequently not FDA approved. Available assays can detect influenza A, influenza B, parainfluenza viruses, respiratory syncytial virus (RSV), human metapneumovirus, coronaviruses, rhinoviruses, and bocavirus in respiratory secretions with high sensitivity and specificity for the presence of viral nucleic acid. However, it is unclear if positive results indicate upper rather than lower respiratory tract infection, colonization, or true infection of the lung or even the presence of infectious virus particles. Overall, these molecular assays have clear utility for research purposes. 61 , 83 However, they remain expensive, and although they may be of benefit in the management of severely ill hospitalized patients and in select clinical settings, the cost-effectiveness for the general management of acute pneumonia has not yet been defined. Fiberoptic Bronchoscopy Although the sputum examination should always be included in the initial evaluation of patients with pneumonia, it may be inadequate for a presumptive diagnosis, particularly in the immunocompromised host or the patient on mechanical ventilation in whom there is a broader range of potential pathogens. Fiberoptic bronchoscopy allows for the collection of lower respiratory tract cultures through the use of protected brush catheters and the performance of either or both bronchoalveolar lavage (BAL) and transbronchial biopsy. 105 BAL, in which a segment of the lung is washed with sterile fluid, samples approximately 100 million alveoli and consequently examines a larger segment of the lung than either the protected specimen brush or a transbronchial biopsy. The use of the protected brush catheter and quantitative culturing of material obtained from the procedure have both minimized the problem of oropharyngeal contamination and helped to differentiate colonization from true infection. Approximately 10 6 to 10 8 organisms per milliliter are present in lung tissue involved with pneumonia. Accounting for dilution of samples, a bacterial count of more than 10 3 to 10 4 has been used as a breakpoint for determining the clinical significance of an isolate. When studied prospectively early in the course of CAP, bronchoscopy has yielded a diagnosis in approximately 50% of patients. 106 Bronchoscopy with a protected specimen brush has been shown to have sensitivities as high as 82% to 100% and as low as 36% with specificities as high as 60% to 77% and as low as 50% for the diagnosis of bacterial pneumonia. 107 , 108 , 109 Differences in exclusion and inclusion criteria, different definitions of pneumonia, and the acceptance or rejection of patients with recent antibiotic changes may explain the different results. 110 The use of antibiotics markedly diminishes the diagnostic yield of the procedure. Most bacterial species initially found by a protected specimen brush are undetectable after 72 hours of antibiotic therapy, and the majority of organisms found are resistant to the antibiotics given. These may have no role in the infection. However, in a patient with ongoing pneumonia despite antibiotic therapy, bronchoscopy with a protected specimen brush should pick up resistant organisms that may be playing a role in infection. 107 BAL has also been used for the diagnosis of atypical pneumonias, including those caused by Legionella species and M. pneumoniae. False-negative findings are seen in up to 30% to 40% of patients, which may reflect the fact that bacterial counts may differ by 50-fold in areas of infected lung versus noninfected adjacent areas, making the sampling site an important consideration. Other possible explanations include prior antibiotic use, technique problems, and, in some cases, an early stage of pneumonia in which bacterial numbers are not yet high enough to reach the breakpoint of the procedure. Bronchoscopy with BAL has been particularly valued for the immunocompromised host, including patients with AIDS. In patients with AIDS, diagnostic yields for Pneumocystis pneumonia of 89% to 98% have been reported. 111 Excellent yields have also been noted in detecting cytomegalovirus in patients with AIDS, as well as in bone marrow and solid-organ transplant recipients, although detection of this agent alone does not prove it as the cause of pneumonia. 112 The high degree of immunosuppression in these patient populations permits high levels of the pathogens to flourish, which makes their detection easier. BAL has also been shown to be useful for diagnosis of pulmonary M. tuberculosis and fungal infections. Culture of BAL material has a sensitivity of approximately 85% for M. tuberculosis, even in the setting of negative culture of expectorated sputum and gastric aspirate samples. 113 With the use of strict diagnostic definitions, performance of PCR and galactomannan assays on BAL has approximate sensitivities and specificities of 77% and 93% for invasive pulmonary aspergillosis. 114 Bronchoscopy with calcofluor staining and fungal culture can also be helpful in the diagnosis of pulmonary histoplasmosis, cryptococcosis, and coccidioidomycosis. 105 , 115 , 116 Both bronchoscopy and BAL have been used widely in patients with ventilator-associated pneumonia (VAP). 117 The "bacteriologic strategy" recommended in the IDSA/ATS guideline on VAP recommended bronchoscopy, BAL, or endobronchial aspiration to establish the presence or absence of pulmonary infection as well as to determine the specific etiology. 77 A prospective multicenter trial found that the use of bronchoscopy with BAL and quantitative culture did not improve clinical outcomes as compared with nonquantitative culture of endotracheal secretions. 118 Bronchoscopy is not without risk. It can induce respiratory failure and the need for mechanical ventilation in hypoxemic patients. There is a risk for bleeding with both the use of protected brush catheters and transbronchial biopsies, as well as a lesser risk for pneumothorax. In patients with gram-negative pneumonia, a sepsis-like picture with increased temperature and decreased mean arterial pressure may follow the procedure. It should not usually be considered in patients with CAP unless the infection is severe or unresolving or a clear failure of antibiotic therapy is encountered, suggesting an occult process such as a concern of a minor obstructing lesion or a foreign body not seen on diagnostic imaging. 105 Other Techniques A variety of less invasive techniques have been used in attempts to determine the cause of pneumonia without resorting to bronchoscopy. Blind endotracheal suctioning with quantitative cultures has compared favorably with bronchoscopic procedures in investigation of VAP in some studies. 119 With a threshold of greater than 10 5 colony-forming units (CFU)/mL, the sensitivity for predicting VAP was comparable to that of lavage or protected brush procedures, although the specificity was somewhat lower. 119 Furthermore, no differences in mortality, length of ICU stay, or duration of mechanical ventilation were noted when quantitative endotracheal cultures were used as the sole means of diagnosis compared with BAL and protected specimen brushing. Others have reported false-negative rates of over 30% and many more organisms isolated by endotracheal suctioning than by brushing. 120 In addition, in the setting of VAP, concern remains about sampling error, as well as the potential for differing pathogens in different lung segments. At present, none of these techniques has been shown to increase the accuracy in diagnosing VAP, and studies of clinical outcome have found that mortality from VAP is unchanged independent of whether bronchoscopic or nonbronchoscopic procedures are used for diagnosis. 121 , 122 Lung Biopsy Direct means of obtaining diagnostic material in patients with pneumonia include percutaneous lung aspiration, transbronchial lung biopsy, video-assisted thoracoscopy, and open lung biopsy. These procedures are usually reserved for cases of severe pneumonia in impaired hosts and in pediatric populations, in whom sputum is not routinely available. Biopsy procedures are rarely indicated in the previously well patient with acute pneumonia. The indications and usefulness of these invasive procedures remain controversial. Blind lung aspiration has provided a diagnostic yield of 30% to 82% in adults and children with diffuse lung infiltrates, although false-negative rates of up to 18% have been reported. 98 , 123 , 124 Computed tomographic (CT)-guided percutaneous lung aspiration has been shown to be effective in diagnosing focal fungal infections in the transplant population. 125 Bleeding and pneumothorax have been reported as major complications in 5% to 39% of procedures. 123 Open lung biopsy remains the definitive invasive procedure for making an etiologic diagnosis of pneumonia in immunosuppressed patients, with diagnostic yields of 60% to 100%. 126 , 127 In immunocompromised patients, the incidence of unexpected diagnoses that can lead to a change in treatment can be over 50%, although the clinical utility seems significantly lower in the immunocompetent population. 127 The incidence of pneumothorax and bleeding is usually less than 10%, even in patients who are thrombocytopenic. 126 Examination of Pleural Effusions The characteristics of pleural effusions and their importance in the differential diagnosis of pulmonary disease are discussed in Chapter 70. Pleural effusion or parapneumonic effusion will occur in 20% to 40% of hospitalized patients with pneumonia, and the incidence of severe pleural involvement has been increasing in recent years. 128 , 129 , 130 The incidence of pleural effusions associated with pneumonia varies with the etiologic agent, from 40% to 57% with pneumococci, to 50% to 70% with gram-negative bacilli, and up to 95% with β-hemolytic streptococci. 91 , 131 Pleural fluid cultures, when positive, are specific for the organism causing the underlying pneumonia. Furthermore, analysis of pleural fluid may play a major role in determining when drainage is necessary as well as differentiating other causes of pul­monary infiltrates that may mimic bacterial pneumonia, including tuberculosis, tumors, pulmonary emboli, and collagen vascular diseases. If neutrophils are not the predominant cell type seen in the pleural space, a diagnosis other than bacterial pneumonia should be sought. Pleural biopsy specimens from patients with acute bacterial pneumonia are nonspecific and are therefore of little use in the differential diagnosis. Parapneumonic effusions can be divided into three stages. 128 , 131 The first stage or exudative stage is culture negative, has a pH of greater than 7.2, glucose level greater than 60 mg/dL, and a lactate dehydrogenase level that is less than three times the upper limit of normal. This stage is due to pulmonary interstitial fluid entering the pleural space and increased permeability of the capillaries in the pleura. These uncomplicated pleural effusions usually resolve with therapy for the underlying disease. Without appropriate therapy, pleural effusions become infected with the organisms causing the underlying pneumonia and develop into the second stage or fibropurulent stage. This stage is associated with positive microbial cultures, pH less than 7.2, glucose level less than 60 mg/dL, and lactate dehydrogenase level that is greater than three times the upper limit of normal. Such complicated pleural effusions require drainage. The most sensitive finding in determining if a pleural effusion needs drainage is a pleural fluid pH less than 7.2. This usually occurs before the other chemical parameters associated with complicated pleural effusions develop. 128 If pH is used to determine if an effusion is to be drained, it must be measured with a blood gas machine, not a pH meter or pH indicator strip, which can be inaccurate. If left untreated, fibropurulent pleural effusions will develop into stage three effusions in which a thick pleural rind is formed that restricts normal lung expansion. Empyema is defined as pus in the pleural space and represents a late manifestation of complicated pleural effusions. The presence of empyema mandates draining the pleural space. Complicated pleural effusions can have a positive culture result in up to 24% of cases, making thoracentesis and culture of fluid a valuable means of making an etiologic diagnosis of the underlying pneumonia. 132 , 133 Other diagnostic tools have proven useful in identifying organisms associated with pleural effusions. PCR technology can be useful in detecting M. tuberculosis as well as defining the etiology in culture-negative cases. 133 , 134 Adenosine deaminase, an enzyme associated with lymphocytes, may also be used to detect M. tuberculosis, with both sensitivity and specificity of over 90%. 135 , 136 Blood Culture, Serologic Studies, and Urine Studies, Including Antigen Detection Blood cultures are positive in between 4% and 17% of patients hospitalized with CAP, with the frequency of positive results increasing with the severity of illness. 83 , 106 , 137 , 138 , 139 Recent studies have suggested that positive blood cultures add little to the management of patients hospitalized with CAP and are not predictive of increased mortality. 140 , 141 , 142 However, the presence of true-positive blood cultures is highly specific, may be helpful in narrowing antibiotic use, and may identify the presence of unusual organisms that would not be adequately covered by routine empirical antibiotic coverage. 143 , 144 Recent work has shown that several clinical features can be used to predict patients with a higher likelihood of having bacteremia. 138 , 139 In particular, patients who have two or more of the findings of chronic liver disease, pleuritic pain, tachycardia, tachypnea, or systolic hypotension and the absence of prior antibiotic therapy have at least a 14% incidence of bacteremia, with a bacteremia incidence of up to 63% in those with four or more of these findings. 139 It is clear that blood cultures should be obtained before antibiotic administration in all patients with CAP ill enough to be hospitalized who have two or more of these features, as well as in those patients who are immunocompromised, those being admitted with HCAP, or those who acquire pneumonia in the hospital. The IDSA and ATS have also recommended blood cultures for patients being admitted to an ICU or who have a cavitary lesion, leukopenia, active alcohol abuse, asplenia, a positive pneumococcal urinary antigen, or a pleural effusion. 84 Furthermore, because the etiology of pneumonia is not always determined, assessment of clinical response to initial therapy is important, and blood cultures should be obtained in patients not responding to antibiotic therapy. 144 A variety of assays have been utilized to detect pathogens that have been difficult to isolate using routine culture techniques. Serologic assays have been used to diagnose infections caused by Legionella spp., M. pneumoniae, Chlamydia spp., and Coxiella burnetii. The sensitivity and specificity of the assays vary, and their overall usefulness in making a rapid diagnosis is limited. The Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and the Laboratory Centre for Disease Control (LCDC) have established diagnostic standards for Chlamydia assays. 145 Microimmunofluorescence (MIF) for serum chlamydial antigens has been recommended, although enzyme immunoassays are also available and may be more sensitive and specific. 146 For the MIF assay, an IgM titer of greater than 1 : 16 or a fourfold rise in IgG value is used to define positivity. Use of a single IgG value is not viewed as a definitive test. Because the present assays show day-to-day variation, it has been suggested that acute and convalescent titers be assayed at the same time. A fourfold rise in IgG rather than a single clinical titer is accepted as a positive test for M. pneumoniae. 147 Although an elevated IgM titer suggests a recent infection, reinfection with Mycoplasma occurs frequently and a rise of IgM may not always be seen. 148 Cold agglutinins may be elevated in infections with M. pneumoniae. Titers greater than or equal to 1 : 4 are suggestive of M. pneumoniae infection. For both mycoplasmal and chlamydial infections, nucleic amplification technologies are being examined as alternative diagnostic modalities. 145 , 147 , 149 S. pneumoniae produces a variety of antigens and surface markers that are type or species specific. 150 Although both antigen and antibody detection methods in serum have been studied, none has become clinically significant. PCR techniques have been applied to whole blood for the detection of pneumococci, but the assays remain experimental. 151 Serum assays for cryptococcal capsular antigen have relatively low sensitivity for cryptococcal pneumonia but are highly specific and of benefit in the management of immunocompromised patients as well as immunocompetent individuals suspected of infection with Cryptococcus gatti. 152 Serum assays for (1→3)-β- d -glucan, a component of the cell wall of fungi except for Cryptococcus spp. and Zygomycetes, have high specificity for invasive fungal infections and can be used for detection of invasive pulmonary aspergillosis in immunocompromised hosts, as well as for the detection of pneumonia due to the endemic fungi Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, and Blastomyces dermatitidis in patients with appropriate geographic exposure. 153 , 154 , 155 In addition, β- d -glucan is also a component of the cell wall of P. jirovecii, and serum assays have a sensitivity of over 95% and specificity over 80% for Pneumocystis pneumonia in both HIV-positive and HIV-negative immunocompromised patients. 154 , 156 A variety of cytokines are released into the circulation as a result of infection. 157 , 158 , 159 , 160 Evidence suggests that these biomarkers may be useful adjuncts in diagnosing pneumonia and predicting severity of disease. 157 , 158 , 159 , 160 The calcitonin family of gene products, especially procalcitonin, C-reactive protein, and soluble triggering receptor expressed on myeloid cells (STREP-1), have been the markers most often associated with pneumonia. Procalcitonin appears to be the earliest marker to appear during the course of infection. Clinical trials have now found that the presence of an elevated procalcitonin level (>0.25 to 0.5 µg/L) can be used to identify patients requiring treatment for pneumonia and, based on whether levels fall, how long antibiotics should be continued without increasing the risk for an adverse outcome. 161 , 162 , 163 Procalcitonin has also been used as a gauge of pneumonia-related mortality. 164 C-reactive protein is an acute-phase reactant produced in the liver as a response to a variety of stimuli, including infection. Normal values of less than 10 mg/L are unusual in patients with pneumonia and can be used to exclude the diagnosis. Levels of 100 mg/L or greater suggest the diagnosis of pneumonia and have been associated with an increased 30-day mortality and a greater likelihood of need for ventilator or vasopressor support (i.e., severe pneumonia). 160 In comparative trials, C-reactive protein appears to have a better ability to define infection and procalcitonin the clinical severity, although definitive studies are lacking. 159 Other cytokines studied include IL-6 and TNF-α, but their correlations with pneumonia appear less consistent. Cortisol levels have also been shown to predict the severity of pneumonia and the chance of survival. 165 , 166 Although the clinical trials with procalcitonin have shown a reduction in antibiotic costs, there can be significant expense in performing these biomarker assays, and large-scale randomized studies of their cost-effectiveness are lacking. Thus, their role in diagnosis and severity assessment in pneumonia has not been clearly defined. Antigen detection in urine rather than blood or sputum has become a successful means of detecting some important pulmonary pathogens. Soluble L. pneumophila antigen can be detected in urine using a commercially available enzyme immunoassay. Although it is useful only for detecting L. pneumophila serogroup 1, this assay offers the advantage of being rapid and noninvasive and has a sensitivity of 80% to 95% and a specificity estimated to be 99%. 99 An additional relative limitation of this assay is that antigenuria may persist for weeks to months after therapy. An immunochromatographic membrane test has been developed to detect the C polysaccharide cell wall antigen found in all S. pneumoniae in urine of patients with pneumonia (Binax NOW). 167 This has been reported to be an extremely useful means of diagnosing pneumococcal pneumonia. Using a variety of standard diagnostic tests as controls, overall sensitivities of 65.5% to 100%, specificities of 94% to 100%, and positive predictive values of 62% have been noted. 168 , 169 , 170 Sensitivities have, in general, been high in bacteremia episodes, with the yields increased slightly by concentrating the urine. The test is not affected by the prior use of antibiotics. Potential problems with the urinary antigen assay include weakly positive results caused by nonpneumococcal organisms, false-positive results in children with nasopharyngeal carriage rather than true infection, and positive results lasting for weeks after the infection has resolved. 169 , 171 Shortfalls of the test are that no organism is isolated and no antibiotic susceptibilities can be carried out. In addition, retrospective analysis has not found an impact of the routine use of the test on antibiotic prescribing practices for patients with suspected pneumonia, suggesting that its use be reserved for research purposes or situations such as unresolving or worsening infection in which defining the precise cause of pneumonia is clinically important. 172 Radiologic Examination Chest radiography plays a critical role in the diagnosis of pneumonia, and for many it represents the gold standard of making a clinical diagnosis. The differential diagnosis of respiratory complaints and abnormal physical findings includes upper and lower respiratory tract infection as well as an array of noninfectious entities. Demonstration of an abnormal chest radiograph with pulmonary infiltrates consistent with pneumonia differentiates a patient population that may benefit from antibiotic therapy from the populations that will not. Because overuse of antibiotics for therapy for upper respiratory tract infections has been documented and may contribute to the growing problem of antibiotic resistance, identifying patients who really should be receiving antibiotic therapy is clearly of importance. The chest radiograph is readily available, is reasonably reliable (despite interobserver variability), and should be obtained in most patients suspected of having pneumonia. 84 , 173 , 174 The extent and nature of radiographic abnormalities may define patients who are more seriously ill and may need close monitoring. The patterns of infiltrates found on chest radiographs in patients with pneumonia usually are not helpful in making a specific etiologic diagnosis ( Fig. 69-8A and B ). 174 However, certain features may be of some diagnostic aid. Lobar consolidation, cavitation, and large pleural effusions support a bacterial cause ( Figs. 69-9 and 69-10 ). Most lobar pneumonias are pneumococcal, although pneumococcal pneumonias are not necessarily lobar. When bilateral diffuse involvement is noted, Pneumocystis pneumonia, Legionella pneumonia, or a primary viral pneumonia should be suspected. Staphylococcal pneumonia may result from infection metastasizing from a primary focus unrelated to the lung. In these cases, multiple nodular infiltrates throughout the lung may be seen. Staphylococci may cause marked necrosis of lung tissue with ill-defined thin-walled cavities (pneumatoceles), bronchopleural fistulas, and empyema, especially in children ( Fig. 69-11 ). S. aureus producing the Panton-Valentine leukocidin, whether methicillin resistant or not, is associated with necrotizing pneumonia with multilobar cavitary lesions and is frequently associated with pleural effusions and empyema. 175 , 176 Although pneumatoceles are diagnostically significant findings in staphylococcal pneumonia, they may be seen in pneumonias with other causes, including K. pneumoniae, H. influenzae, S. pneumoniae, and, more rarely, Pneumocystis. Pulmonary infections due to Pseudomonas may cavitate. Pseudomonas and other gram-negative bacilli most commonly cause lower lobe pneumonia. FIGURE 69-8 A, Normal chest radiograph. B, Patchy infiltrate representing bronchopneumonia in a patient with Streptococcus pneumoniae infection. FIGURE 69-9 A, Chest radiograph showing dense left lower consolidation consistent with bacterial pneumonia, in this case caused by Streptococcus pneumoniae. B, Lateral radiograph of a patient with left lower lobe pneumococcal pneumonia. FIGURE 69-10 Chest radiographs showing a large left pleural effusion in a patient with Klebsiella pneumoniae pneumonia. FIGURE 69-11 Pneumatocele formation in the left upper lobe of a patient with staphylococcal pneumonia. Aspiration pneumonia should be considered along with gram-negative and staphylococcal pneumonias as a source of necrotizing pneumonia, cavitation, and empyema. Aspiration pneumonia commonly involves either the superior segment or the basilar segment of either lower lobe or the posterior segment of the upper lobes, depending on whether aspiration occurred in the dependent or the upright position. Chronic aspiration most commonly results in bilateral lower lobe pneumonia, although it may involve one side more than the other. Viral infection of the lower airway involves respiratory epithelium and parenchyma adjacent to terminal respiratory bronchioles. Diffuse hemorrhagic congestion of alveolar septa may occur as well. 177 The radiographic concomitants of these pathologic findings usually involve patchy areas of peribronchial ground-glass opacity, airspace consolidation, and poorly defined small nodules. Diffuse and localized involvement with both interstitial and alveolar patterns has been noted ( Fig. 69-12 ). 177 There is little radiologic distinction between the various viral causes of pneumonia. Influenza pneumonia is associated with poorly defined, patchy airspace consolidation with rapid confluence. Varicella pneumonia usually involves peribronchial involvement with nodular infiltrates. Adenovirus, herpes simplex virus, and cytomegalovirus, all of which are more common in immunocompromised hosts, may be associated with diffuse bilateral bronchopneumonia, areas of overinflation, atelectasis, and nodular opacities. Lobar or subsegmental consolidation mimicking bacterial pneumonia may also be seen in patients infected with adenovirus and herpes simplex virus. Hantavirus pneumonia usually presents as interstitial edema, which may progress to consolidation representing a pulmonary capillary leak syndrome. Bilateral involvement and pleural effusion are common and when present are associated with a worse clinical outcome. 178 Both the severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus and a newer novel coronavirus identified in 2012 can cause pneumonia that begins predominantly with bilateral interstitial basilar infiltrates and progresses to severe symmetrical airspace disease. 179 , 180 , 181 Other recently defined viral pulmonary pathogens are the human metapneumovirus and bocavirus. Most cases of human metapneumovirus infection involve upper respiratory tract infections in children; pneumonia in adults has been described. 182 , 183 Multilobar infiltrates have been noted in 50% of cases, and pleural effusions are not uncommon. Bocavirus pneumonia is more frequently reported in children and has been associated with patchy or interstitial infiltrates that are similar to those found with other common respiratory virus infections. 184 FIGURE 69-12 Bilateral involvement with a mixed interstitial-alveolar pattern in a patient with viral pneumonia. Mycoplasmal pneumonia often manifests as an interstitial pattern in a peribronchial and perivascular distribution. 185 Consolidation is noted in approximately 38% of patients, usually in the lower lobe. Once this consolidation stage is reached, radiologic differentiation between bacterial and mycoplasmal pneumonia is difficult. Cavitation is rare, although pleural effusions may be seen in approximately 20% of cases. 185 , 186 Chlamydia pneumonia e predominantly causes unilobar disease associated with air bronchograms. 174 Legionnaires' disease may initially present as a radiographic picture similar to that of mycoplasmal pneumonia. A patchy interstitial or finely nodular pattern is seen in the lower lobe. 187 However, unlike the situation with mycoplasmal pneumonia, pneumonia with more than two-lobe involvement is commonly seen. Rapid progression and pleural effusions are also common. Pneumonia caused by Legionella micdadei may present as pulmonary nodules, either single or multiple, as well as segmental infiltrates. As in pneumonia caused by L. pneumophila, rapid radiologic progression of the disease is characteristic. 188 High-resolution CT has been shown to improve radiographic characterization of lung infection. 189 , 190 , 191 In the immunocompetent host, chest CT is most helpful in evaluating recurrent pneumonia or infections unresponsive to therapy. Pneumonia developing behind an obstruction caused by tumors or other masses and lung abscess may also be better defined by CT than by routine chest radiographs. 189 Compared with a routine chest radiograph, high-resolution CT detects lung abnormalities more often and does a better job in defining disease in the upper and lower lobes and in the lingula. However, exposure to more radiation (the radiation from one CT scan equals that from six to seven chest radiographs) and the increased expense (approximately seven times the cost of a chest radiograph) has limited its use as the initial radiographic procedure. Furthermore, it is unclear if all abnormalities found on the chest CT scan truly represent pneumonia. 190 In the immunocompromised host in whom infection is only one of the possible causes of abnormal chest radiographs, chest CT or one of its variations, such as spiral CT or high-resolution CT, may aid in better defining a "questionable" chest radiograph and may be helpful in localizing involved areas of lung as a guide to biopsy procedures. CT scans are also more sensitive in defining parenchymal disease in the ICU setting. Certain infections, such as those caused by Aspergillus, M. tuberculosis, and Pneumocystis, have characteristic appearances on CT that in the correct clinical setting may make invasive procedures unnecessary. Both ultrasound and CT imaging may be more sensitive in defining pleural effusions than plain radiographs. 191 Techniques such as perfusion magnetic resonance imaging have been shown to be able to differentiate pneumonia from COPD and pulmonary emboli. The clinical utility of these techniques remains to be defined. Nuclear medicine procedures have been used to detect pneumonia. These procedures include gallium-67 citrate scans, indium 111–labeled granulocyte scans, technetium-99m diethylenetriaminepentaacetic acid aerosol clearance, and 18 F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography. 192 These procedures have been used in patients with AIDS to define the presence of lung infection in the absence of abnormal chest radiographs. In patients with AIDS, diffuse uptake of gallium is usually seen with Pneumocystis infection but may also be seen with infection caused by Mycobacterium avium-intracellulare complex, cytomegalovirus, and Cryptococcus neoformans and in patients with lymphoma. Localized uptake may be associated with bacterial disease. Focal uptake corresponding to lymph node areas has been associated with infection with M. avium-intracellulare complex and M. tuberculosis and with lymphoma. History The history should attempt to define (1) symptoms consistent with the diagnosis of pneumonia, (2) the clinical setting in which the pneumonia takes place, (3) defects in host defense that could predispose to the development of pneumonia, and (4) possible exposures to specific pathogens. Respiratory symptoms are commonly encountered in primary care practices but are usually not associated with pneumonia. Analysis of data over 9 years from 1980 to 1994 found that between 5 and 10 million primary care visits each year were for cough, with only 4% to 6% of these visits linked to pneumonia. 52 Therefore, a serious effort should be made to differentiate pneumonia from other clinical entities with which it may be confused. The predominant clinical findings of pneumonia related to the respiratory tract should be sought, including cough, sputum production, dyspnea, chest pain, and fever. 53 It should also be recognized that nonrespiratory symptoms are commonly present, including fatigue, sweats, headache, nausea, and myalgia, and occasionally abdominal pain and diarrhea. 54 With increasing age, both respiratory and nonrespiratory symptoms of pneumonia become less frequent. Unfortunately, symptoms at presentation elucidated by a careful history may not always be able to distinguish pneumonia from other respiratory problems. Specific etiologic agents of pneumonia have been associated with certain underlying diseases and patient populations. Pneumonia due to M. pneumoniae occurs more often in younger people, but it may be a cause of pneumonia in older patients severe enough to require hospitalization. 55 Gram-negative bacterial pneumonia tends to occur in older adults, especially those who are debilitated with comorbid diseases or are ill enough to require management in an intensive care unit (ICU). Tuberculosis should be suspected in the homeless, those infected with HIV, those who come from developing countries where tuberculosis is prevalent, and those who have been exposed to others with the disease. Staphylococcal pneumonia classically has been noted during epidemics of influenza. 56 Over the past 20 years, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has grown in importance as a cause of ventilator-associated pneumonia (VAP). In addition, since the late 1990s, strains of community-acquired MRSA have emerged as infrequent but important causes of CAP. 57 , 58 Pneumonia has been noted to occur with increased frequency in patients with a variety of underlying disorders such as congestive heart failure, diabetes, alcoholism, and COPD. In one series of 292 patients with pneumonia, only 18% were found to have no underlying disease. 59 Certain lifestyle factors have also been associated with an increased risk for pneumonia. These include cigarette smoking; alcohol use, especially in males; contact with children and pets; and living in a household with more than 10 people. 60 Viral upper respiratory tract infections can predispose to pneumonia and may be associated with more severe disease. 61 , 62 Recent dental manipulations, sedative overdoses, seizures, alcoholism, or loss of consciousness for any reason should raise the suspicion for anaerobic infection caused by aspiration of oral contents. 22 Special note needs to be made of the relationship between pneumonia and patients with COPD. 63 Although well-controlled studies are lacking, it does appear that patients with COPD have an increased incidence of pneumonia. However, because the tracheobronchial tree is often colonized with Streptococcus pneumoniae and H. influenzae, it has been difficult to distinguish clearly between colonization and infection in many studies. Although these organisms play an important role as etiologic agents of pneumonia in this patient population, most of the clinical studies were carried out before it was recognized that other, less common pathogens also play a significant role in causing disease. The roles of Moraxella catarrhalis, Legionella, Chlamydia, and aerobic gram-negative rods including P. aeruginosa have been established. 63 , 64 , 65 Cystic fibrosis is commonly associated with Pseudomonas and staphylococcal pulmonary infections. 51 Burkholderia spp., Stenotrophomonas spp., Achromobacter xylosoxidans, and atypical mycobacteria are also important pulmonary pathogens in this setting. Pulmonary alveolar proteinosis can be associated with Nocardia infection. Patients infected with HIV are at high risk for the development of pulmonary infections. 66 , 67 , 68 , 69 Although the incidence of pneumonia has decreased notably in the developed world with the advent of highly active antiretroviral therapy, pneumonia remains a common HIV complication. Principal risk factors for pneumonia in this population include low current CD4 + count, nadir CD4 + count, injection drug use, smoking, increasing age, and lack of highly active antiretroviral therapy and anti- Pneumocystis prophylaxis. 67 , 70 In considering the etiology of pulmonary infection in patients infected with HIV, geographic exposures, demographic characteristics of the patient, and the degree of immune suppression need to be considered. With the development of highly active antiretroviral therapy (HAART) and effective prophylactic strategies, the incidence of Pneumocystis jirovecii pneumonia in patients with AIDS has decreased from 70% to 80% to less than 1 per 100 patient-years. 71 It is now predominantly seen in individuals who have a CD4 + count less than 100/mm 3 and are either unaware of having HIV infection or are not receiving care. 69 Bacterial pneumonia was a significant complication for HIV-infected individuals and in the pre-antiretroviral era with an incidence 5- to 10-fold that seen in the general population; and the incidence of invasive pneumococcal disease is more than 50-fold higher in HIV-infected patients than in non–HIV-infected controls. 70 , 72 The incidence of these infections has now notably decreased, although there remains a high risk in patients not on treatment. 69 The incidence of pneumonia due to P. aeruginosa and S. aureus has also been notably higher in HIV-infected patients. 69 Although relatively less common in the developed world, in developing countries, Mycobacterium tuberculosis is now viewed as the major pulmonary pathogen in patients with AIDS. 68 The use of HAART has led to a decreased incidence of AIDS, but its overall importance as a pulmonary pathogen remains. In the severely immunosuppressed HIV population, fungal infections can play a major role, and depending on the patient's exposure history, cryptococcosis, histoplasmosis, blastomycosis, and coccidioidomycosis should be considered. In patients infected with HIV, the relationship between the degree of immune suppression using the CD4 + count as a marker and the specific etiology of pneumonia deserves emphasis. Bacterial pneumonia and pulmonary tuberculosis usually occur when the CD4 + count is less than 400/µL, with increased risk when the count falls below 200 cells/µL. 73 Pneumocystis and disseminated tuberculosis are associated with CD4 + counts below 200/mm 3 , and disseminated nontuberculous mycobacterial and fungal infections occur with CD4 + counts less than 50 to 100/mm 3 . 73 Pulmonary infections in HIV-infected patients are discussed in more detail in Chapter 125. Pneumonia developing in hospitalized patients often involves Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, and S. aureus, organisms that are unusual in community-acquired disease. 74 Pneumonia in older adults, especially those who are bedridden or who have chronic diseases, had been believed to be more often associated with gram-negative bacilli than is pneumonia in younger populations, but this association remains unclear. 75 , 76 In general, elderly patients most frequently have infection due to S. pneumoniae, nontypeable strains of H. influenzae, M. catarrhalis, or aspiration pneumonia. Recently, it has been recognized that patients with outpatient contact with the health care system develop pneumonia with etiologic agents that may be seen in both CAP and nosocomial pneumonia. 77 , 78 Increased importance of MRSA, aerobic gram-negative rods including P. aeruginosa, and mixed aerobic/anaerobic organisms due to aspiration are associated with this new syndrome of health care–associated pneumonia (HCAP) (see further discussion under "Pneumonia Syndromes"). Important aspects of a patient's history that may suggest specific potential infectious agents include occupational, animal, and travel history ( Table 69-3 ). A carefully obtained history may also suggest the presence of noninfectious pulmonary disease, such as tumors, sarcoidosis, granulomatosis with polyangiitis (previously known as Wegener's granulomatosis), or pulmonary emboli; all may masquerade as pneumonia. TABLE 69-3 Pneumonia: Etiology Suggested by Exposure History EXPOSURE HISTORY INFECTIOUS AGENT Exposure to concurrent illness in school dormitory or household setting Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae Environmental Exposures Exposure to contaminated aerosols (e.g., air coolers, hospital water supply) Legionnaires' disease Exposure to goat hair, raw wool, animal hides Anthrax Ingestion of unpasteurized milk Brucellosis Exposure to bat droppings (caving) or dust from soil enriched with bird droppings Histoplasmosis Exposure to water contaminated with animal urine Leptospirosis Exposure to rodent droppings, urine, saliva Hantavirus Potential bioterrorism exposure Anthrax, plague, tularemia Zoonotic Exposures Employment as abattoir work or veterinarian Brucellosis Exposure to cattle, goats, pigs Anthrax, brucellosis Exposure to ground squirrels, chipmunks, rabbits, prairie dogs, rats in Africa or southwestern United States Plague Hunting or exposure to rabbits, foxes, squirrels Tularemia Bites from flies or ticks Tularemia Exposure to birds (parrots, budgerigars, cockatoos, pigeons, turkeys) Psittacosis Exposure to infected dogs and cats Pasteurella multocida, Q fever (Coxiella burnetii) Exposure to infected goats, cattle, sheep, domestic animals, and their secretions (milk, amniotic fluid, placenta, feces) Q fever (C. burnetii) Travel Exposures Residence in or travel to San Joaquin Valley, southern California, southwestern Texas, southern Arizona, New Mexico Coccidioidomycosis Residence in or travel to Mississippi or Ohio river valleys, Caribbean, central America, or Africa Histoplasmosis, blastomycosis Residence in or travel to southern China SARS, avian influenza Residence in or travel to Arabian peninsula MERS-CoV Residence in or travel to Southeast Asia Paragonimiasis, melioidosis Residence in or travel to West Indies, Australia, or Guam Melioidosis MERS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus; SARS, severe acute respiratory syndrome. Physical Examination Most, but not all, patients with pneumonia look ill, sometimes acutely. They may be breathing with accessory muscles. Elderly patients may appear apathetic. Fever is reported to be present in 65% to 90% of patients with pneumonia. It may be sustained, remittent, or at times hectic. Fever patterns per se, however, are not useful for establishing a specific diagnosis. Oral temperature assessment should be avoided to reduce error caused by rapid mouth breathing. Recording of postural changes in blood pressure and pulse rate is useful in assessing hydration and intravascular fluid volume. The pulse usually increases by 10 beats/min for every degree (centigrade) of temperature elevation. A pulse-temperature deficit (e.g., a relative bradycardia for the amount of fever) should suggest viral infection, mycoplasmal infection, chlamydial infection, tularemia, or infection with Legionella. Cyanosis, a rapid respiratory rate, the use of accessory muscles of respiration, sternal retraction, and nasal flaring suggest serious respiratory compromise. Cutaneous abscesses or "track marks" from injection drug use may signal a source of bacteremia with subsequent pneumonia via hematogenous spread. Bullous myringitis is an infrequent but significant finding in mycoplasmal pneumonia. The presence of poor dentition should suggest a mixed infection due to aspiration of anaerobes and aerobes that colonize the oropharynx. Although edentulous patients may develop anaerobic pneumonia as a result of aspiration, it is uncommon. 79 Examination of the thorax may reveal "splinting," or an inspiratory lag on the side of the lesion, that is suggestive of bacterial pneumonia. Early in the disease process, definite signs of pulmonary involvement may be lacking or may be manifest only as fine rales. Chest examination may reveal these early signs of pneumonia even though the chest radiograph is normal. Evidence of consolidation (dullness on percussion, bronchial breath sounds, and E to A changes) is highly suggestive of bacterial infection but may be absent in two thirds of patients ill enough to be hospitalized and may be absent more often in patients treated as outpatients. 80 Patients with mycoplasmal or viral infection may exhibit few abnormalities on physical examination despite the presence of impressive infiltrates on the chest radiograph. The overall usefulness of the history and physical examination to detect the presence of pneumonia has been questioned. 81 The probability of detecting pneumonia varies with the patient population, the prevalence of pneumonia in that population, the threshold values for defining a vital sign as abnormal, and the ability of the clinician to detect abnormal physical findings. However, a great deal of interobserver variation has been shown to exist. In one series, three examiners seeing the same patients could not consistently agree on the physical examination findings. The diagnosis of pneumonia could be made with a sensitivity of only 47% to 69% and with a specificity of 50% to 75%. 81 Rare findings such as egophony and asymmetrical chest movements have a high predictive value for pneumonia but occur so infrequently that they are of limited utility. Several studies have assessed the utility of clinical prediction rules for the presence or absence of pneumonia based on multiple physical findings. 53 The absence of any vital sign abnormalities (i.e., respiratory rate >20 breaths/min, heart rate >100 beats/minute, and temperature >37.8° C [100° F]) has been associated with a less than 1% chance of a patient's having pneumonia, assuming a pneumonia prevalence of 5% in the population under study. In contrast, a constellation of cough, fever, tachycardia, decreased breath sounds, and crackles raises the possibility of pneumonia being present to between 40% and 50%. Therefore, although variable and nondefinitive, a complete history and physical examination may be extremely helpful in guiding the workup of pneumonia. Diagnostic Testing Clinical features derived from a careful history and physical examination, and confirmed by radiographic imaging of the chest that shows a pulmonary infiltrate, suggest the presence of pneumonia. The role of microbiologic tests to identify the specific cause is an important, although controversial, element of care. Most empirical antibiotic regimens are successful in the therapy for CAP, especially mild to moderate cases. Studies comparing empirical therapy with laboratory-guided pathogen-directed care have shown no differences in efficacy, although increased side effects were noted in the patients receiving empirical therapy. 82 Efforts to determine the specific cause of CAP are justified by the fact that they (1) may enable the clinician to narrow the antibiotic spectrum by using fewer agents, thereby decreasing exposure of the patient to potential side effects and potentially reducing the development of resistance; (2) may aid in the specific antibiotic choice for an individual patient depending on the specific epidemiology of infection and the specific resistance patterns of the locale; and (3) may identify pathogens not usually suspected and therefore not usually covered by empirical therapy. On a broader scale, identifying specific causes may help define new agents, trends in antibiotic resistance in established agents, and epidemiology of infectious outbreaks. The combined use of the standard microbiologic testing in conjunction with nucleic amplification assays can now define the etiology of CAP in up to 89% of cases. 83 The most recent guidelines from the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society (IDSA/ATS) have suggested diagnostic testing "whenever the result is likely to change individual antibiotic management" or in patients in whom "the diagnostic yield is thought to be greatest." 84 Sputum Examination and Examination of Other Respiratory Tract Samples Microscopic examination and culture of expectorated sputum remain the mainstays of the laboratory evaluation of pneumonia despite ongoing controversy concerning their sensitivity and specificity. Of patients admitted to the hospital with CAP, 40% to 60% will not be able to produce sputum. Of those that do, between 40% to 60% of samples may be judged to be inadequate for further study because of oropharyngeal contamination. 85 , 86 Many patients have received antibiotics before the studies are carried out, which drastically reduces the diagnostic yield. A variety of organisms cannot be detected by Gram stain, including Legionella spp., Mycoplasma spp., and Chlamydia spp. However, in patients who produce sputum of adequate quality to be examined (minimal or no oropharyngeal contamination), and who have not received prior antibiotics, diagnostic yields of 80% for sputum Gram stain have been reported in the small fraction of patients with bacteremic S. pneumoniae pneumonia. 87 Despite its pitfalls, the sputum Gram stain is noninvasive, can be performed no risk to the patient, and under the right circumstances may aid in the diagnosis and choice of empirical therapy in patients with CAP. 88 , 89 Examination of the sputum should include observation of the color, amount, consistency, and odor of the specimen. Mucopurulent sputum is most commonly found with bacterial pneumonia or bronchitis. However, sputum of a similar nature has been described in one third to one half of patients with mycoplasmal or adenovirus infections. 90 Scant or watery sputum is more often noted with these and other atypical pneumonias. "Rusty" sputum suggests alveolar involvement and has been most commonly (although not solely) associated with pneumococcal pneumonia. 91 Dark red, mucoid sputum (currant-jelly sputum) suggests Friedlander's pneumonia caused by encapsulated Klebsiella pneumoniae ( Fig. 69-1 ). 92 Foul-smelling sputum is associated with mixed anaerobic infections most commonly seen with aspiration. 79 FIGURE 69-1 "Currant-jelly" sputum associated with Klebsiella pneumoniae pneumonia. To maximize the diagnostic yield of the sputum examination, only samples with minimal oropharyngeal contamination should be reviewed. Although there are no definitive guidelines, the number of neutrophils and epithelial cells should be quantitated under low power (×100), with further examination reserved for samples containing 25 or more neutrophils and 10 or fewer epithelial cells. 93 Samples with more epithelial cells and fewer neutrophils are usually nondiagnostic and should be discarded. The morphologic and staining characteristics of any bacteria seen should be recorded and an estimate made of the predominant organisms ( FIGURE 69-2 , FIGURE 69-3 , FIGURE 69-4 , FIGURE 69-5 , FIGURE 69-6 ). When no bacterial predominance exists, this should be noted as well. FIGURE 69-2 Expectorated sputum with gram-positive, lancet-shaped diplococci from a patient with pneumococcal pneumonia. FIGURE 69-3 Expectorated sputum demonstrating a positive quellung reaction in a patient with pneumococcal pneumonia. FIGURE 69-4 Expectorated sputum with gram-negative coccobacillary forms (arrows) from a patient with Haemophilus influenzae pneumonia. FIGURE 69-5 Expectorated sputum with clusters of gram-positive cocci in a patient with Staphylococcus aureus pneumonia. FIGURE 69-6 Expectorated sputum with gram-negative rods in a patient with Klebsiella pneumoniae pneumonia. In the appropriate clinical setting, a predominance of gram-positive, lancet-shaped diplococci should suggest pneumococcal infection (see Fig. 69-2 ). When strict criteria for Gram stain positivity are used (the finding of a predominant organism or more than 10 gram-positive, lancet-shaped diplococci per oil immersion field [×1000], or both), the specificity of the Gram stain for identifying pneumococci has been shown to be 85%, with a sensitivity of 62%. 94 Because pneumococci may be part of the nasopharyngeal microbiota in 10% to 50% of healthy adults and often colonize the lower airways in patients with chronic bronchitis, identification of the organism does not mean that it is the cause of disease. 95 However, it is our experience that the large number of pneumococci necessary to produce a positive Gram stain is unusual in carriers. Microscopic sputum examination can be helpful to identify organisms other than pneumococci. The finding of small gram-negative coccobacillary organisms on sputum Gram stain is characteristic of H. influenzae (see Fig. 69-4 ). However, the sensitivity of the sputum Gram stain for detecting H. influenzae is usually less than that for S. pneumoniae and has been reported to be 40% to 80%. Staphylococci appear as gram-positive cocci in tetrads and grapelike clusters (see Fig. 69-5 ). Organisms of mixed morphology are characteristic of anaerobic infection. Few bacteria are seen with legionnaires' disease, Mycoplasma pneumonia, and viral pneumonia. Examination of induced sputum obtained after patients undergo nebulizer treatment with 3% saline solution has been a useful means of diagnosing Pneumocystis pneumonia in patients with AIDS. The use of commercially available monoclonal antibodies or Giemsa's, Gomori's methenamine silver, or toluidine blue O stains has led to a diagnosis in up to 50% of cases, making more aggressive diagnostic procedures unnecessary. Special sputum staining techniques are important in identifying other organisms such as mycobacteria ( Fig. 69-7 ). FIGURE 69-7 Expectorated sputum with acid-fast bacilli in a patient infected with Mycobacterium tuberculosis. Sputum culture as a means of diagnosing pneumonia is as controversial as the sputum Gram stain. Not all patients with pneumonia will produce sputum. Even when they do, studies of patients with bacteremic pneumococcal pneumonia have found sputum culture positivity rates varying between 29% and 94%. 87 Similarly, only 35% to 73% of sputum cultures are positive with proven H. influenzae pneumonia. 96 , 97 Both S. pneumoniae and H. influenzae are relatively fastidious and the sensitivity of cultures decreases with the prior use of antibiotics or with delays in transport of specimens to the clinical microbiology laboratory. Beyond these concerns with test sensitivity, sputum cultures have frequently been shown to yield more bacterial species than more invasive methods of obtaining respiratory tract secretions. 98 A lack of correlation between findings from sputum culture and findings from blood cultures and serologic studies has been observed. Several key parameters have been identified in efforts to maximize the diagnostic yield from sputum culture. Procurement of adequate sputum samples is an essential first step. With increasing numbers of epithelial cells and decreasing numbers of neutrophils, an increased amount of oropharyngeal contamination is present, as indicated by the isolation of more bacterial species. The presence of alveolar macrophages does not alter the bacteriologic findings when substantial numbers of epithelial cells are present, indicating that otherwise adequate samples of sputum can be contaminated with oropharyngeal contents and thereby rendered nondiagnostic. This type of initial screening has proved helpful in differentiating adequate sputum samples from saliva, thereby increasing the diagnostic yield of sputum culture. When culture of sputum is delayed, the isolation of pneumococci is less likely because of overgrowth by oropharyngeal microbiota. Rapid processing of samples is therefore another important factor leading to higher diagnostic yield. Some reports suggest that with adequate sputum samples and prompt culture of specimens, the diagnostic yield of the sputum culture may be improved. 87 Antigen detection in respiratory secretions has been used for more than 2 decades to try to maximize the diagnostic yield of sputum, especially for infections caused by S. pneumoniae, Pneumocystis, Legionella pneumophila, and a variety of respiratory viruses. The direct fluorescent antibody assays for L. pneumophila and Pneumocystis jirovecii are the most commonly utilized, with sensitivities of 25% to 75% for Legionella and 80% for Pneumocystis. 99 , 100 The sensitivity for Pneumocystis may be less for patients with causes of immunosuppression other than HIV disease. 101 Specificities of approximately 90% have been reported in the assays for each pathogen. Non- pneumophila and pneumophila non–serogroup 1 strains of Legionella may be missed in these assays, and the test needs to be performed by experienced technologists. For other organisms such as Chlamydia, problems with colonization versus infection, varying sensitivities, and cross-reactivity with nonpathogens have limited the usefulness of the study. Detection of microbial nucleic acid in respiratory tract secretions, both nasopharyngeal and sputum, remains an area of ongoing study. 102 , 103 , 104 Nucleic acid amplification assays, especially polymerase chain reaction (PCR) are particularly attractive because they have the capability of detecting minute amounts of material from potential pathogens, do not appear to be greatly influenced by prior antibiotic therapy, and can be performed quickly. Whereas a variety of PCR techniques have been described, U.S. Food and Drug Administration (FDA)-licensed assays exist for only M. tuberculosis, Legionella spp., and respiratory viruses. Assays for more commonly encountered organisms such as S. pneumoniae, H. influenzae, Mycoplasma, and Chlamydia spp. have been developed, but lack of standardization and difficulty in determining true infection from colonization remain problematic. False-negative results have been reported because of the presence of natural inhibitors. Although the PCR assay has been used to detect P. jirovecii, published studies have detected positive results in the setting of negative cultures and absence of clinical features of infection. PCR techniques have been used to identify DNA from M. tuberculosis in both sputum and lavage fluid. Sensitivities of 90% to 100% have been seen with patients who are acid-fast bacilli (AFB) smear positive, and results are reported as 50% to 70% in patients who are AFB smear negative; specificities as high as 99% have been noted. However, PCR assay may remain persistently positive in patients recently treated for tuberculosis and with no apparent active disease. Several individual pathogen and multiplex real-time PCR assay systems have become commercially available for the detection of community respiratory viruses. 103 The test systems differ for viral pathogens that they detect, and "in-house" assays for select pathogens are frequently not FDA approved. Available assays can detect influenza A, influenza B, parainfluenza viruses, respiratory syncytial virus (RSV), human metapneumovirus, coronaviruses, rhinoviruses, and bocavirus in respiratory secretions with high sensitivity and specificity for the presence of viral nucleic acid. However, it is unclear if positive results indicate upper rather than lower respiratory tract infection, colonization, or true infection of the lung or even the presence of infectious virus particles. Overall, these molecular assays have clear utility for research purposes. 61 , 83 However, they remain expensive, and although they may be of benefit in the management of severely ill hospitalized patients and in select clinical settings, the cost-effectiveness for the general management of acute pneumonia has not yet been defined. Fiberoptic Bronchoscopy Although the sputum examination should always be included in the initial evaluation of patients with pneumonia, it may be inadequate for a presumptive diagnosis, particularly in the immunocompromised host or the patient on mechanical ventilation in whom there is a broader range of potential pathogens. Fiberoptic bronchoscopy allows for the collection of lower respiratory tract cultures through the use of protected brush catheters and the performance of either or both bronchoalveolar lavage (BAL) and transbronchial biopsy. 105 BAL, in which a segment of the lung is washed with sterile fluid, samples approximately 100 million alveoli and consequently examines a larger segment of the lung than either the protected specimen brush or a transbronchial biopsy. The use of the protected brush catheter and quantitative culturing of material obtained from the procedure have both minimized the problem of oropharyngeal contamination and helped to differentiate colonization from true infection. Approximately 10 6 to 10 8 organisms per milliliter are present in lung tissue involved with pneumonia. Accounting for dilution of samples, a bacterial count of more than 10 3 to 10 4 has been used as a breakpoint for determining the clinical significance of an isolate. When studied prospectively early in the course of CAP, bronchoscopy has yielded a diagnosis in approximately 50% of patients. 106 Bronchoscopy with a protected specimen brush has been shown to have sensitivities as high as 82% to 100% and as low as 36% with specificities as high as 60% to 77% and as low as 50% for the diagnosis of bacterial pneumonia. 107 , 108 , 109 Differences in exclusion and inclusion criteria, different definitions of pneumonia, and the acceptance or rejection of patients with recent antibiotic changes may explain the different results. 110 The use of antibiotics markedly diminishes the diagnostic yield of the procedure. Most bacterial species initially found by a protected specimen brush are undetectable after 72 hours of antibiotic therapy, and the majority of organisms found are resistant to the antibiotics given. These may have no role in the infection. However, in a patient with ongoing pneumonia despite antibiotic therapy, bronchoscopy with a protected specimen brush should pick up resistant organisms that may be playing a role in infection. 107 BAL has also been used for the diagnosis of atypical pneumonias, including those caused by Legionella species and M. pneumoniae. False-negative findings are seen in up to 30% to 40% of patients, which may reflect the fact that bacterial counts may differ by 50-fold in areas of infected lung versus noninfected adjacent areas, making the sampling site an important consideration. Other possible explanations include prior antibiotic use, technique problems, and, in some cases, an early stage of pneumonia in which bacterial numbers are not yet high enough to reach the breakpoint of the procedure. Bronchoscopy with BAL has been particularly valued for the immunocompromised host, including patients with AIDS. In patients with AIDS, diagnostic yields for Pneumocystis pneumonia of 89% to 98% have been reported. 111 Excellent yields have also been noted in detecting cytomegalovirus in patients with AIDS, as well as in bone marrow and solid-organ transplant recipients, although detection of this agent alone does not prove it as the cause of pneumonia. 112 The high degree of immunosuppression in these patient populations permits high levels of the pathogens to flourish, which makes their detection easier. BAL has also been shown to be useful for diagnosis of pulmonary M. tuberculosis and fungal infections. Culture of BAL material has a sensitivity of approximately 85% for M. tuberculosis, even in the setting of negative culture of expectorated sputum and gastric aspirate samples. 113 With the use of strict diagnostic definitions, performance of PCR and galactomannan assays on BAL has approximate sensitivities and specificities of 77% and 93% for invasive pulmonary aspergillosis. 114 Bronchoscopy with calcofluor staining and fungal culture can also be helpful in the diagnosis of pulmonary histoplasmosis, cryptococcosis, and coccidioidomycosis. 105 , 115 , 116 Both bronchoscopy and BAL have been used widely in patients with ventilator-associated pneumonia (VAP). 117 The "bacteriologic strategy" recommended in the IDSA/ATS guideline on VAP recommended bronchoscopy, BAL, or endobronchial aspiration to establish the presence or absence of pulmonary infection as well as to determine the specific etiology. 77 A prospective multicenter trial found that the use of bronchoscopy with BAL and quantitative culture did not improve clinical outcomes as compared with nonquantitative culture of endotracheal secretions. 118 Bronchoscopy is not without risk. It can induce respiratory failure and the need for mechanical ventilation in hypoxemic patients. There is a risk for bleeding with both the use of protected brush catheters and transbronchial biopsies, as well as a lesser risk for pneumothorax. In patients with gram-negative pneumonia, a sepsis-like picture with increased temperature and decreased mean arterial pressure may follow the procedure. It should not usually be considered in patients with CAP unless the infection is severe or unresolving or a clear failure of antibiotic therapy is encountered, suggesting an occult process such as a concern of a minor obstructing lesion or a foreign body not seen on diagnostic imaging. 105 Other Techniques A variety of less invasive techniques have been used in attempts to determine the cause of pneumonia without resorting to bronchoscopy. Blind endotracheal suctioning with quantitative cultures has compared favorably with bronchoscopic procedures in investigation of VAP in some studies. 119 With a threshold of greater than 10 5 colony-forming units (CFU)/mL, the sensitivity for predicting VAP was comparable to that of lavage or protected brush procedures, although the specificity was somewhat lower. 119 Furthermore, no differences in mortality, length of ICU stay, or duration of mechanical ventilation were noted when quantitative endotracheal cultures were used as the sole means of diagnosis compared with BAL and protected specimen brushing. Others have reported false-negative rates of over 30% and many more organisms isolated by endotracheal suctioning than by brushing. 120 In addition, in the setting of VAP, concern remains about sampling error, as well as the potential for differing pathogens in different lung segments. At present, none of these techniques has been shown to increase the accuracy in diagnosing VAP, and studies of clinical outcome have found that mortality from VAP is unchanged independent of whether bronchoscopic or nonbronchoscopic procedures are used for diagnosis. 121 , 122 Lung Biopsy Direct means of obtaining diagnostic material in patients with pneumonia include percutaneous lung aspiration, transbronchial lung biopsy, video-assisted thoracoscopy, and open lung biopsy. These procedures are usually reserved for cases of severe pneumonia in impaired hosts and in pediatric populations, in whom sputum is not routinely available. Biopsy procedures are rarely indicated in the previously well patient with acute pneumonia. The indications and usefulness of these invasive procedures remain controversial. Blind lung aspiration has provided a diagnostic yield of 30% to 82% in adults and children with diffuse lung infiltrates, although false-negative rates of up to 18% have been reported. 98 , 123 , 124 Computed tomographic (CT)-guided percutaneous lung aspiration has been shown to be effective in diagnosing focal fungal infections in the transplant population. 125 Bleeding and pneumothorax have been reported as major complications in 5% to 39% of procedures. 123 Open lung biopsy remains the definitive invasive procedure for making an etiologic diagnosis of pneumonia in immunosuppressed patients, with diagnostic yields of 60% to 100%. 126 , 127 In immunocompromised patients, the incidence of unexpected diagnoses that can lead to a change in treatment can be over 50%, although the clinical utility seems significantly lower in the immunocompetent population. 127 The incidence of pneumothorax and bleeding is usually less than 10%, even in patients who are thrombocytopenic. 126 Examination of Pleural Effusions The characteristics of pleural effusions and their importance in the differential diagnosis of pulmonary disease are discussed in Chapter 70. Pleural effusion or parapneumonic effusion will occur in 20% to 40% of hospitalized patients with pneumonia, and the incidence of severe pleural involvement has been increasing in recent years. 128 , 129 , 130 The incidence of pleural effusions associated with pneumonia varies with the etiologic agent, from 40% to 57% with pneumococci, to 50% to 70% with gram-negative bacilli, and up to 95% with β-hemolytic streptococci. 91 , 131 Pleural fluid cultures, when positive, are specific for the organism causing the underlying pneumonia. Furthermore, analysis of pleural fluid may play a major role in determining when drainage is necessary as well as differentiating other causes of pul­monary infiltrates that may mimic bacterial pneumonia, including tuberculosis, tumors, pulmonary emboli, and collagen vascular diseases. If neutrophils are not the predominant cell type seen in the pleural space, a diagnosis other than bacterial pneumonia should be sought. Pleural biopsy specimens from patients with acute bacterial pneumonia are nonspecific and are therefore of little use in the differential diagnosis. Parapneumonic effusions can be divided into three stages. 128 , 131 The first stage or exudative stage is culture negative, has a pH of greater than 7.2, glucose level greater than 60 mg/dL, and a lactate dehydrogenase level that is less than three times the upper limit of normal. This stage is due to pulmonary interstitial fluid entering the pleural space and increased permeability of the capillaries in the pleura. These uncomplicated pleural effusions usually resolve with therapy for the underlying disease. Without appropriate therapy, pleural effusions become infected with the organisms causing the underlying pneumonia and develop into the second stage or fibropurulent stage. This stage is associated with positive microbial cultures, pH less than 7.2, glucose level less than 60 mg/dL, and lactate dehydrogenase level that is greater than three times the upper limit of normal. Such complicated pleural effusions require drainage. The most sensitive finding in determining if a pleural effusion needs drainage is a pleural fluid pH less than 7.2. This usually occurs before the other chemical parameters associated with complicated pleural effusions develop. 128 If pH is used to determine if an effusion is to be drained, it must be measured with a blood gas machine, not a pH meter or pH indicator strip, which can be inaccurate. If left untreated, fibropurulent pleural effusions will develop into stage three effusions in which a thick pleural rind is formed that restricts normal lung expansion. Empyema is defined as pus in the pleural space and represents a late manifestation of complicated pleural effusions. The presence of empyema mandates draining the pleural space. Complicated pleural effusions can have a positive culture result in up to 24% of cases, making thoracentesis and culture of fluid a valuable means of making an etiologic diagnosis of the underlying pneumonia. 132 , 133 Other diagnostic tools have proven useful in identifying organisms associated with pleural effusions. PCR technology can be useful in detecting M. tuberculosis as well as defining the etiology in culture-negative cases. 133 , 134 Adenosine deaminase, an enzyme associated with lymphocytes, may also be used to detect M. tuberculosis, with both sensitivity and specificity of over 90%. 135 , 136 Blood Culture, Serologic Studies, and Urine Studies, Including Antigen Detection Blood cultures are positive in between 4% and 17% of patients hospitalized with CAP, with the frequency of positive results increasing with the severity of illness. 83 , 106 , 137 , 138 , 139 Recent studies have suggested that positive blood cultures add little to the management of patients hospitalized with CAP and are not predictive of increased mortality. 140 , 141 , 142 However, the presence of true-positive blood cultures is highly specific, may be helpful in narrowing antibiotic use, and may identify the presence of unusual organisms that would not be adequately covered by routine empirical antibiotic coverage. 143 , 144 Recent work has shown that several clinical features can be used to predict patients with a higher likelihood of having bacteremia. 138 , 139 In particular, patients who have two or more of the findings of chronic liver disease, pleuritic pain, tachycardia, tachypnea, or systolic hypotension and the absence of prior antibiotic therapy have at least a 14% incidence of bacteremia, with a bacteremia incidence of up to 63% in those with four or more of these findings. 139 It is clear that blood cultures should be obtained before antibiotic administration in all patients with CAP ill enough to be hospitalized who have two or more of these features, as well as in those patients who are immunocompromised, those being admitted with HCAP, or those who acquire pneumonia in the hospital. The IDSA and ATS have also recommended blood cultures for patients being admitted to an ICU or who have a cavitary lesion, leukopenia, active alcohol abuse, asplenia, a positive pneumococcal urinary antigen, or a pleural effusion. 84 Furthermore, because the etiology of pneumonia is not always determined, assessment of clinical response to initial therapy is important, and blood cultures should be obtained in patients not responding to antibiotic therapy. 144 A variety of assays have been utilized to detect pathogens that have been difficult to isolate using routine culture techniques. Serologic assays have been used to diagnose infections caused by Legionella spp., M. pneumoniae, Chlamydia spp., and Coxiella burnetii. The sensitivity and specificity of the assays vary, and their overall usefulness in making a rapid diagnosis is limited. The Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and the Laboratory Centre for Disease Control (LCDC) have established diagnostic standards for Chlamydia assays. 145 Microimmunofluorescence (MIF) for serum chlamydial antigens has been recommended, although enzyme immunoassays are also available and may be more sensitive and specific. 146 For the MIF assay, an IgM titer of greater than 1 : 16 or a fourfold rise in IgG value is used to define positivity. Use of a single IgG value is not viewed as a definitive test. Because the present assays show day-to-day variation, it has been suggested that acute and convalescent titers be assayed at the same time. A fourfold rise in IgG rather than a single clinical titer is accepted as a positive test for M. pneumoniae. 147 Although an elevated IgM titer suggests a recent infection, reinfection with Mycoplasma occurs frequently and a rise of IgM may not always be seen. 148 Cold agglutinins may be elevated in infections with M. pneumoniae. Titers greater than or equal to 1 : 4 are suggestive of M. pneumoniae infection. For both mycoplasmal and chlamydial infections, nucleic amplification technologies are being examined as alternative diagnostic modalities. 145 , 147 , 149 S. pneumoniae produces a variety of antigens and surface markers that are type or species specific. 150 Although both antigen and antibody detection methods in serum have been studied, none has become clinically significant. PCR techniques have been applied to whole blood for the detection of pneumococci, but the assays remain experimental. 151 Serum assays for cryptococcal capsular antigen have relatively low sensitivity for cryptococcal pneumonia but are highly specific and of benefit in the management of immunocompromised patients as well as immunocompetent individuals suspected of infection with Cryptococcus gatti. 152 Serum assays for (1→3)-β- d -glucan, a component of the cell wall of fungi except for Cryptococcus spp. and Zygomycetes, have high specificity for invasive fungal infections and can be used for detection of invasive pulmonary aspergillosis in immunocompromised hosts, as well as for the detection of pneumonia due to the endemic fungi Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, and Blastomyces dermatitidis in patients with appropriate geographic exposure. 153 , 154 , 155 In addition, β- d -glucan is also a component of the cell wall of P. jirovecii, and serum assays have a sensitivity of over 95% and specificity over 80% for Pneumocystis pneumonia in both HIV-positive and HIV-negative immunocompromised patients. 154 , 156 A variety of cytokines are released into the circulation as a result of infection. 157 , 158 , 159 , 160 Evidence suggests that these biomarkers may be useful adjuncts in diagnosing pneumonia and predicting severity of disease. 157 , 158 , 159 , 160 The calcitonin family of gene products, especially procalcitonin, C-reactive protein, and soluble triggering receptor expressed on myeloid cells (STREP-1), have been the markers most often associated with pneumonia. Procalcitonin appears to be the earliest marker to appear during the course of infection. Clinical trials have now found that the presence of an elevated procalcitonin level (>0.25 to 0.5 µg/L) can be used to identify patients requiring treatment for pneumonia and, based on whether levels fall, how long antibiotics should be continued without increasing the risk for an adverse outcome. 161 , 162 , 163 Procalcitonin has also been used as a gauge of pneumonia-related mortality. 164 C-reactive protein is an acute-phase reactant produced in the liver as a response to a variety of stimuli, including infection. Normal values of less than 10 mg/L are unusual in patients with pneumonia and can be used to exclude the diagnosis. Levels of 100 mg/L or greater suggest the diagnosis of pneumonia and have been associated with an increased 30-day mortality and a greater likelihood of need for ventilator or vasopressor support (i.e., severe pneumonia). 160 In comparative trials, C-reactive protein appears to have a better ability to define infection and procalcitonin the clinical severity, although definitive studies are lacking. 159 Other cytokines studied include IL-6 and TNF-α, but their correlations with pneumonia appear less consistent. Cortisol levels have also been shown to predict the severity of pneumonia and the chance of survival. 165 , 166 Although the clinical trials with procalcitonin have shown a reduction in antibiotic costs, there can be significant expense in performing these biomarker assays, and large-scale randomized studies of their cost-effectiveness are lacking. Thus, their role in diagnosis and severity assessment in pneumonia has not been clearly defined. Antigen detection in urine rather than blood or sputum has become a successful means of detecting some important pulmonary pathogens. Soluble L. pneumophila antigen can be detected in urine using a commercially available enzyme immunoassay. Although it is useful only for detecting L. pneumophila serogroup 1, this assay offers the advantage of being rapid and noninvasive and has a sensitivity of 80% to 95% and a specificity estimated to be 99%. 99 An additional relative limitation of this assay is that antigenuria may persist for weeks to months after therapy. An immunochromatographic membrane test has been developed to detect the C polysaccharide cell wall antigen found in all S. pneumoniae in urine of patients with pneumonia (Binax NOW). 167 This has been reported to be an extremely useful means of diagnosing pneumococcal pneumonia. Using a variety of standard diagnostic tests as controls, overall sensitivities of 65.5% to 100%, specificities of 94% to 100%, and positive predictive values of 62% have been noted. 168 , 169 , 170 Sensitivities have, in general, been high in bacteremia episodes, with the yields increased slightly by concentrating the urine. The test is not affected by the prior use of antibiotics. Potential problems with the urinary antigen assay include weakly positive results caused by nonpneumococcal organisms, false-positive results in children with nasopharyngeal carriage rather than true infection, and positive results lasting for weeks after the infection has resolved. 169 , 171 Shortfalls of the test are that no organism is isolated and no antibiotic susceptibilities can be carried out. In addition, retrospective analysis has not found an impact of the routine use of the test on antibiotic prescribing practices for patients with suspected pneumonia, suggesting that its use be reserved for research purposes or situations such as unresolving or worsening infection in which defining the precise cause of pneumonia is clinically important. 172 Radiologic Examination Chest radiography plays a critical role in the diagnosis of pneumonia, and for many it represents the gold standard of making a clinical diagnosis. The differential diagnosis of respiratory complaints and abnormal physical findings includes upper and lower respiratory tract infection as well as an array of noninfectious entities. Demonstration of an abnormal chest radiograph with pulmonary infiltrates consistent with pneumonia differentiates a patient population that may benefit from antibiotic therapy from the populations that will not. Because overuse of antibiotics for therapy for upper respiratory tract infections has been documented and may contribute to the growing problem of antibiotic resistance, identifying patients who really should be receiving antibiotic therapy is clearly of importance. The chest radiograph is readily available, is reasonably reliable (despite interobserver variability), and should be obtained in most patients suspected of having pneumonia. 84 , 173 , 174 The extent and nature of radiographic abnormalities may define patients who are more seriously ill and may need close monitoring. The patterns of infiltrates found on chest radiographs in patients with pneumonia usually are not helpful in making a specific etiologic diagnosis ( Fig. 69-8A and B ). 174 However, certain features may be of some diagnostic aid. Lobar consolidation, cavitation, and large pleural effusions support a bacterial cause ( Figs. 69-9 and 69-10 ). Most lobar pneumonias are pneumococcal, although pneumococcal pneumonias are not necessarily lobar. When bilateral diffuse involvement is noted, Pneumocystis pneumonia, Legionella pneumonia, or a primary viral pneumonia should be suspected. Staphylococcal pneumonia may result from infection metastasizing from a primary focus unrelated to the lung. In these cases, multiple nodular infiltrates throughout the lung may be seen. Staphylococci may cause marked necrosis of lung tissue with ill-defined thin-walled cavities (pneumatoceles), bronchopleural fistulas, and empyema, especially in children ( Fig. 69-11 ). S. aureus producing the Panton-Valentine leukocidin, whether methicillin resistant or not, is associated with necrotizing pneumonia with multilobar cavitary lesions and is frequently associated with pleural effusions and empyema. 175 , 176 Although pneumatoceles are diagnostically significant findings in staphylococcal pneumonia, they may be seen in pneumonias with other causes, including K. pneumoniae, H. influenzae, S. pneumoniae, and, more rarely, Pneumocystis. Pulmonary infections due to Pseudomonas may cavitate. Pseudomonas and other gram-negative bacilli most commonly cause lower lobe pneumonia. FIGURE 69-8 A, Normal chest radiograph. B, Patchy infiltrate representing bronchopneumonia in a patient with Streptococcus pneumoniae infection. FIGURE 69-9 A, Chest radiograph showing dense left lower consolidation consistent with bacterial pneumonia, in this case caused by Streptococcus pneumoniae. B, Lateral radiograph of a patient with left lower lobe pneumococcal pneumonia. FIGURE 69-10 Chest radiographs showing a large left pleural effusion in a patient with Klebsiella pneumoniae pneumonia. FIGURE 69-11 Pneumatocele formation in the left upper lobe of a patient with staphylococcal pneumonia. Aspiration pneumonia should be considered along with gram-negative and staphylococcal pneumonias as a source of necrotizing pneumonia, cavitation, and empyema. Aspiration pneumonia commonly involves either the superior segment or the basilar segment of either lower lobe or the posterior segment of the upper lobes, depending on whether aspiration occurred in the dependent or the upright position. Chronic aspiration most commonly results in bilateral lower lobe pneumonia, although it may involve one side more than the other. Viral infection of the lower airway involves respiratory epithelium and parenchyma adjacent to terminal respiratory bronchioles. Diffuse hemorrhagic congestion of alveolar septa may occur as well. 177 The radiographic concomitants of these pathologic findings usually involve patchy areas of peribronchial ground-glass opacity, airspace consolidation, and poorly defined small nodules. Diffuse and localized involvement with both interstitial and alveolar patterns has been noted ( Fig. 69-12 ). 177 There is little radiologic distinction between the various viral causes of pneumonia. Influenza pneumonia is associated with poorly defined, patchy airspace consolidation with rapid confluence. Varicella pneumonia usually involves peribronchial involvement with nodular infiltrates. Adenovirus, herpes simplex virus, and cytomegalovirus, all of which are more common in immunocompromised hosts, may be associated with diffuse bilateral bronchopneumonia, areas of overinflation, atelectasis, and nodular opacities. Lobar or subsegmental consolidation mimicking bacterial pneumonia may also be seen in patients infected with adenovirus and herpes simplex virus. Hantavirus pneumonia usually presents as interstitial edema, which may progress to consolidation representing a pulmonary capillary leak syndrome. Bilateral involvement and pleural effusion are common and when present are associated with a worse clinical outcome. 178 Both the severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus and a newer novel coronavirus identified in 2012 can cause pneumonia that begins predominantly with bilateral interstitial basilar infiltrates and progresses to severe symmetrical airspace disease. 179 , 180 , 181 Other recently defined viral pulmonary pathogens are the human metapneumovirus and bocavirus. Most cases of human metapneumovirus infection involve upper respiratory tract infections in children; pneumonia in adults has been described. 182 , 183 Multilobar infiltrates have been noted in 50% of cases, and pleural effusions are not uncommon. Bocavirus pneumonia is more frequently reported in children and has been associated with patchy or interstitial infiltrates that are similar to those found with other common respiratory virus infections. 184 FIGURE 69-12 Bilateral involvement with a mixed interstitial-alveolar pattern in a patient with viral pneumonia. Mycoplasmal pneumonia often manifests as an interstitial pattern in a peribronchial and perivascular distribution. 185 Consolidation is noted in approximately 38% of patients, usually in the lower lobe. Once this consolidation stage is reached, radiologic differentiation between bacterial and mycoplasmal pneumonia is difficult. Cavitation is rare, although pleural effusions may be seen in approximately 20% of cases. 185 , 186 Chlamydia pneumonia e predominantly causes unilobar disease associated with air bronchograms. 174 Legionnaires' disease may initially present as a radiographic picture similar to that of mycoplasmal pneumonia. A patchy interstitial or finely nodular pattern is seen in the lower lobe. 187 However, unlike the situation with mycoplasmal pneumonia, pneumonia with more than two-lobe involvement is commonly seen. Rapid progression and pleural effusions are also common. Pneumonia caused by Legionella micdadei may present as pulmonary nodules, either single or multiple, as well as segmental infiltrates. As in pneumonia caused by L. pneumophila, rapid radiologic progression of the disease is characteristic. 188 High-resolution CT has been shown to improve radiographic characterization of lung infection. 189 , 190 , 191 In the immunocompetent host, chest CT is most helpful in evaluating recurrent pneumonia or infections unresponsive to therapy. Pneumonia developing behind an obstruction caused by tumors or other masses and lung abscess may also be better defined by CT than by routine chest radiographs. 189 Compared with a routine chest radiograph, high-resolution CT detects lung abnormalities more often and does a better job in defining disease in the upper and lower lobes and in the lingula. However, exposure to more radiation (the radiation from one CT scan equals that from six to seven chest radiographs) and the increased expense (approximately seven times the cost of a chest radiograph) has limited its use as the initial radiographic procedure. Furthermore, it is unclear if all abnormalities found on the chest CT scan truly represent pneumonia. 190 In the immunocompromised host in whom infection is only one of the possible causes of abnormal chest radiographs, chest CT or one of its variations, such as spiral CT or high-resolution CT, may aid in better defining a "questionable" chest radiograph and may be helpful in localizing involved areas of lung as a guide to biopsy procedures. CT scans are also more sensitive in defining parenchymal disease in the ICU setting. Certain infections, such as those caused by Aspergillus, M. tuberculosis, and Pneumocystis, have characteristic appearances on CT that in the correct clinical setting may make invasive procedures unnecessary. Both ultrasound and CT imaging may be more sensitive in defining pleural effusions than plain radiographs. 191 Techniques such as perfusion magnetic resonance imaging have been shown to be able to differentiate pneumonia from COPD and pulmonary emboli. The clinical utility of these techniques remains to be defined. Nuclear medicine procedures have been used to detect pneumonia. These procedures include gallium-67 citrate scans, indium 111–labeled granulocyte scans, technetium-99m diethylenetriaminepentaacetic acid aerosol clearance, and 18 F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography. 192 These procedures have been used in patients with AIDS to define the presence of lung infection in the absence of abnormal chest radiographs. In patients with AIDS, diffuse uptake of gallium is usually seen with Pneumocystis infection but may also be seen with infection caused by Mycobacterium avium-intracellulare complex, cytomegalovirus, and Cryptococcus neoformans and in patients with lymphoma. Localized uptake may be associated with bacterial disease. Focal uptake corresponding to lymph node areas has been associated with infection with M. avium-intracellulare complex and M. tuberculosis and with lymphoma. Pneumonia Syndromes Acute Community-Acquired Pneumonia A long list of bacterial, fungal, viral, and protozoal agents may cause pneumonia. Because initial evaluation rarely results in a specific etiologic diagnosis, antibiotic therapy is usually begun empirically. Defining pneumonia syndromes on the basis of clinical, epidemiologic, radiographic, and laboratory parameters, with a limited number of organisms commonly associated with each syndrome, has helped the clinician to select rational empirical therapy for the most likely organisms involved. Many of the syndromes have overlapping signs and symptoms, which at times makes clear identification of a specific syndrome in an individual impossible. 193 , 194 Increases in numbers of patients living longer, more and varied comorbidities, the increasing use of biologic immunomodulators such as TNF inhibitors, and expanded contact with various aspects of the health care system have led to a wider array of presentations, etiologic agents, and strategies for empirical therapy. Newly described microbial agents are being recognized as potential causes of CAP. Subgrouping syndromes under the general description of CAP may be made based on patient age, severity of illness, comorbidities, need for hospitalization, and epidemiologic setting. Patients with acute CAP are usually in their middle 50s to late 60s. Peak incidences of disease in general occurs in midwinter and early spring, although disease due to Legionella is more frequent in the summer. 195 Still, there is no "pneumonia season" and disease takes place throughout the year. Most patients (58% to 89%) have one or more chronic underlying diseases. Immunosuppression related to malignancy, neutropenia, the chronic use of corticosteroids or other myelosuppressive agents, or HIV infection is being increasingly observed. 194 , 196 Classically, CAP presents as a sudden onset of a chill followed by fever, pleuritic chest pain, and cough that produces mucopurulent sputum. The signs, symptoms, and physical findings vary according to the age of the patient, therapy with antibiotics before presentation, and the severity of illness. Patients typically present after several days of symptoms. 197 Cough is noted in more than 80% to 90% of patients and is productive in over 60%. 197 , 198 , 199 , 200 Chest pain is present in 35% to 48% of cases, chills in 40% to 70%, and hemoptysis in approximately 15%. 197 , 198 , 200 A variety of nonrespiratory symptoms are associated with pneumonia, including fatigue (91%), anorexia (71%), sweats (69%), and nausea (41%). 54 Both respiratory and nonrespiratory findings occur less frequently in older age groups. 54 Physical examination reveals fever in 68% to 78% of patients but may be seen less commonly in older populations. Tachypnea (respiratory rate >24 to 30 breaths/min) is noted in 45% to 69% of patients and may be more frequently seen in older age groups. 54 Tachycardia (pulse rate >100 beats/min) is noted in 45%. Rales are noted in approximately 70% of patients, and signs of consolidation in 20% 197 ; but no combination of physical findings has been found to be adequate to confirm a diagnosis of pneumonia. 53 Most commonly, the white blood cell count is in the range of 15,000 to 35,000/mm 3 and the differential cell count reveals an increased number of juvenile forms. Leukopenia may be noted and is a poor prognostic sign. 84 The hematocrit and the red blood cell indices are usually normal. Sputum is thick and purulent and may be rust colored. The sputum Gram stain reveals numerous neutrophils and bacteria, often with a single organism predominating. Chest films show areas of parenchymal involvement, usually with an alveolar-filling process. There is moderate hypoxemia due to ventilation-perfusion abnormalities. Even with rigorous laboratory evaluation and using definitions of definite, probable, and possible causes, a microbiologic diagnosis may be made in 40% to 75% of cases of CAP. 55 , 201 , 202 In the past, 40% to 80% of cases of acute CAP were caused by S. pneumoniae. 88 Whereas the pneumococcus remains perhaps the most important cause of pneumonia, more recent published reports have indicated that its relative importance has diminished. 203 It has been defined as the cause of pneumonia in as few as 6% of ambulatory patients and only 55% of hospitalized patients. 201 , 202 It has been hypothesized that the apparent decreased incidence of pneumococcal pneumonia is related to recognition of newer pathogens and diminished use and performance of microbiologic studies. 88 However, through a herd immunity effect, the increasing use of pneumococcal vaccine in children appears to be reducing the incidence of pneumococcal disease in adults and children. 204 , 205 Severe pneumococcal infections, including pneumonia, have been associated with prior splenectomy due either to trauma or to staging for Hodgkin's disease, abnormal immunoglobulin responses (myeloma, lymphoma, HIV infection), and functional asplenia due to systemic lupus erythematosus or marrow transplant. 206 , 207 An estimated 5% to 7% of cases of acute CAP appear to be caused by H. influenzae. 201 , 202 , 203 The true incidence of this organism is obscured by the difficulty of isolating it from sputum and identifying it in sputum that has been Gram stained and by the difficulty of distinguishing colonization from infection. The age of patients, presence of underlying disease, and presentation are similar to those of pneumococcal disease. Although the use of the H. influenzae conjugate vaccine has decreased the incidence of invasive disease caused by H. influenzae type b, there is a strikingly increased incidence of invasive disease including pneumonia caused by nontypeable strains. In one recent series, over 50% of isolates from patients with invasive H. influenzae diseases were nontypeable. 208 S. aureus has accounted for 1% to 2% of acute CAP cases, 201 , 202 , 203 and takes on increased importance as a cause of pneumonia in older adults and in those with influenza. 56 Patients who develop postinfluenza pneumonia are usually younger and have less underlying disease than most other patients with CAP. Although it had been believed that bacterial pneumonia in the setting of influenza develops after clinical influenza, studies during the 2009 H1N1 pandemic indicate that bacterial coinfection most likely arises at the peak of viral replication, with patients presenting an average of 6 days after symptom onset. 56 An elevated white blood cell count with a shift to the left, physical signs of pulmonary consolidation, and radiographic evidence of focal parenchymal disease develop, and the sputum Gram stain is consistent with bacterial pneumonia. S. aureus may also cause pneumonia hematogenously, producing multiple bilateral round lesions that will frequently cavitate. Although this presentation has been characteristically associated with right-sided endocarditis in injection drug users, it can also be seen in association with infections of intravascular catheters and with staphylococcal soft tissue infections. 209 , 210 As noted previously, since the late 1990s there has been an increase in the incidence of pneumonia due to community-associated S. aureus strains. 57 , 176 Patients have been young, had few if any comorbidities, and usually presented after a flulike illness with high fevers, leukopenia, tachycardia, tachypnea, hemoptysis, and rapid evolution on radiography to multilobar disease. These cases appear to be associated with S. aureus strains carrying the Panton-Valentine leukocidin toxin, regardless of whether they are methicillin resistant. 211 The adult respiratory distress syndrome has been a frequent complication in such cases, and mortality rates of over 50% have occurred. 176 Aerobic gram-negative bacteria, exclusive of H. influenzae, and mixed aerobic and anaerobic infections cause most of the remaining cases of acute CAP. Gram-negative rods may cause anywhere from 2% to 10% of pneumonia cases . Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, and Enterobacter spp. are the most often isolated organisms. 201 , 202 , 203 , 212 Gram-negative bacilli are particularly important pathogens in older adults, especially those with chronic underlying disease and those who are bedridden and recently hospitalized. Pseudomonas infection should be suspected in patients with pulmonary comorbidities and recent hospital stays. Legionella spp. are the most important water-related pulmonary pathogens in the United States with regard to mortality and morbidity. The importance of Legionella spp. in causing pneumonia has varied greatly in different geographic areas, with incidences ranging from 0.6% to 23%. 193 , 194 , 197 , 203 , 213 Since 2003, an increased incidence of legionellosis has been observed in the United States, especially on the East Coast. 214 Although infection may occur at any age, those aged 45 to 64 now appear to be at greatest risk. The presence of a high fever (>40° C [104° F]), male sex, previous β-lactam therapy, multilobar involvement, rapid progression of radiographic abnormalities, a need for intensive care, gastrointestinal and neurologic abnormalities, elevated liver enzyme levels, and increased creatinine levels have all been associated with Legionella pneumonia. 194 , 213 However, no clinical features reliably distinguish Legionella pneumonia from that caused by other bacteria. Moraxella catarrhalis has also been identified as a cause of pneumonia. 201 , 202 , 203 , 215 The overall incidence of disease caused by this bacterium is low, but it is an important pathogen in older adults with COPD and various forms of immunosuppression. As discussed later, a number of additional pathogens, including M. pneumoniae, Chlamydia spp., C. burnetii, and community respiratory viruses can cause an atypical pneumonia syndrome. In addition, it is not infrequent for a patient to have pneumonia either sequentially or concurrently due to several pathogens, such as influenza virus or C. pneumoniae infection being followed by infection with S. pneumoniae. 203 Community-Acquired Pneumonia in the Older Adult Pneumonia in the elderly has become an increasingly important clinical entity as the world's population has aged. 216 Pneumonia is one of the leading reasons for hospitalization in those 65 and older and represents a major cause of morbidity and mortality. In some series, pneumonia represents the leading cause of death in this population (see Chapter 315). For those older than the age of 60, pneumonia is a predictor of increased mortality after the specific episode has resolved and for several years thereafter. 217 The clinical presentation of pneumonia in older adults (especially those >80 years) may be subtler than in younger populations, with more gradual onset of symptoms and fever and the classic signs of pneumonia. 54 , 76 , 194 Fever occurs less commonly in older adults, and temperature elevation is muted. The classic findings of cough, fever, and dyspnea may be absent in over half of older adults. 75 , 218 Chills and rigors may be less frequently seen as well. Tachypnea (respiratory rate >24 to 30 breaths/min) and rales are more frequent findings in older adults and have been observed in up to 65% of patients. 54 , 76 Non­respiratory symptoms may be the major presenting feature. The initial presentation of older adults with pneumonia may include decline in functional status, weakness, subtle changes in mental status, and anorexia or abdominal pain. It has been suggested that the nonspecific presentation of pneumonia in older adults may result in great part from the prevalence of dementia in this population. 218 Bacteremia, development of in-hospital complications, and death are more frequent in older populations. 76 , 219 Specific etiologic diagnoses are made less frequently in older adults, with 20% to 50% of patients having an etiologic agent defined. 76 The absence of productive cough and common prior use of antibiotics may explain this observation. Causes have varied in different series depending on the means of diagnosis, the patient population studied (outpatient vs. institutionalized older adults), and the geographic location. In general, the cause of CAP in the older population follows the general trend of infection in younger populations. S. pneumoniae remains the predominant organism, accounting for 20% to 60% of cases, and there is an increased frequency of aspiration pneumonia. 76 , 216 H. influenzae, usually a nontypeable strain, is frequently the second most common agent, accounting for 5% to 10% of episodes. 76 , 220 The importance of other aerobic gram-negative bacilli in causing pneumonia in older adults remains a question, in part because the criteria for diagnosis of true pneumonia versus colonization vary. In most recent studies, 1% to 3% of cases of pneumonia have been attributed to non- Haemophilus gram-negative bacilli. Although increased oropharyngeal colonization with aerobic gram-negative bacilli has been documented in the older population and is believed to be a predisposition to development of pneumonia caused by these organisms, colonization appears to be related to debility of the patient rather than age. 221 Other factors reported to be associated with increasing colonization with gram-negative organisms include prior use of antibiotics, severe bronchopulmonary disease, decreased activity, alcoholism, and incontinence. 212 In this regard, one recent study of apparent aspiration pneumonia in a nursing home population older than 65 years of age that utilized protected bronchoalveolar lavage to define the microbiologic etiology identified gram-negative bacteria as the primary pathogen in 49%, followed by mixed anaerobes in 16%. 222 Older adults are at greater risk for infection with group B streptococci, M. catarrhalis, and Legionella species, although the overall incidence of these agents in the older population is relatively low. Legionella has been described as a cause of severe pneumonia in the elderly. Polymicrobial infections and pneumonia due to aspiration have both been noted to occur more frequently in older adults. 75 , 76 It is unclear which agents cause atypical pneumonia in the older population. Most series suggest that M. pneumoniae pneumonia is unusual, although it has been documented by other investigators to be a significant cause of pneumonia leading to hospitalization in older adults. 55 , 75 , 76 It is not clear if this significant variation is related to differing epidemiologic characteristics of study populations or accuracy of diagnostic methods. Chlamydia infections appear commonly in the older population and may cause up to 32% of cases of pneumonia, although again there is a significant variation in incidence in differing studies. 55 , 76 , 223 Viral agents play an important role as causes of pneumonia in the elderly, although historically their role has been underestimated, given the difficulty in culturing them and the relative insensitivity of serologic tests. 224 With the development of more sensitive nucleic acid amplification tests such as the reverse-transcriptase PCR assay, their role as causes of pneumonia has begun to be more clearly defined. 224 , 225 Recent studies have suggested a viral cause in up to one third of patients hospitalized with pneumonia, with significantly more viral infections noted in the older age groups (median age, 76 years). 225 , 226 Influenza A and B, RSV, human metapneumovirus, parainfluenza virus, and coronavirus are the most frequently identified viral pathogens. Recent studies indicate that up to half of the patients with a viral pathogen identified will have concurrent bacterial infection, and multiple concurrent viral pathogens also can be seen. 226 Rhinoviruses have not been defined as a direct cause of pneumonia but have been found in patients with severe pneumococcal disease and in vitro have shown increased adherence of S. pneumoniae to human tracheal epithelial cells. 226 , 227 These findings raise the question as to whether some viruses play a role as facilitators for bacterial infection rather than roles as true pulmonary pathogens. Clinically, viral pneumonia in the elderly cannot be differentiated from bacterial pneumonia by clinical, routine laboratory, or radiologic parameters. As with bacterial disease, the signs of viral pneumonia may be subtle and may only involve fever and altered mental status. 224 Dyspnea, wheezing, and productive cough are commonly observed. Myalgia, while commonly found with most viral causes, is most often seen with influenza. Bronchospasm and wheezing may be more commonly seen with RSV. 224 Nursing Home Pneumonia Residents of skilled nursing facilities represent an important subpopulation of older adults at risk for pneumonia. Pneumonia has been reported to be the second most frequent infection in this setting, carries the highest mortality of any infection in this population, and is a common cause for hospitalization. 228 , 229 Silent aspiration is a major risk factor, as are poor functional status, nasogastric feeding, confusion, the presence of obstructive lung disease, the presence of a tracheostomy, and advancing age. 230 Key modifiable risk factors are inadequate oral care and swallowing difficulties. 231 The subtle presentation noted in other older adult populations occurs in those in a nursing home setting. S. pneumoniae had been considered the predominant cause, but newer studies have identified respiratory viruses and C. pneumoniae as frequent pathogens, as well as S. aureus and gram-negative bacilli in those with severe pneumonia. 223 , 230 Outbreaks of pneumonia have occurred in nursing homes and have involved Legionella, Chlamydia , influenza, parainfluenza, RSV, and rhinovirus. 232 , 233 Severe Community-Acquired Pneumonia Approximately10% of patients with CAP will develop severe disease, as defined by admission to an ICU owing to the presence of shock requiring vasopressors or respiratory failure requiring mechanical ventilation. 234 Early identification of patients who are at higher risk for developing severe pneumonia is important because these patients have a higher mortality rate and require more supportive care. Furthermore, patients with severe pneumonia are infected with a different spectrum of etiologic agents and would therefore benefit from different empirical antibiotic strategies than patients with less severe disease. Advanced age, presence of significant comorbidities, nursing home residence, immunosuppression, and altered mental status have all been believed to be associated with the development of severe CAP. 234 Approximately one third of patients with severe pneumonia would have been previously healthy. S. pneumoniae was the organism classically associated with severe pneumonia. However, in patients requiring ICU admission there is an increased incidence of S. aureus, L. pneumophila, gram-negative bacilli (especially Klebsiella spp.), and H. influenzae. 203 , 235 , 236 In addition, Pneumocystis is increasingly being recognized as a cause of severe pneumonia in non–HIV-infected patients who have impaired cell-mediated immunity due to organ transplantation, malignancy, severe malnutrition, or receipt of immunosuppressive therapies, including corticosteroids, antineoplastic chemotherapeutic agents, as well as newer agents including TNF-α inhibitors and rituximab. 237 , 238 , 239 As with CAP in general, there can be significant geographic differences in the relative incidence of differing pathogens. A meta-analysis of 127 studies published through 1995 indicated an overall mortality rate for CAP of 13.7%, but it was 36.5% for patients with disease severe enough to require ICU care. 240 Prognostic risk factors for death included male sex, pleuritic chest pain, hypothermia, systolic hypotension, tachypnea, diabetes mellitus, neoplastic disease, neurologic disease, bacteremia, leukopenia, and multilobar radiographic pulmonary infiltrates. Although shock or respiratory failure are usually evident and serve as major criteria for defining severe pneumonia, patients without these findings may also benefit from ICU care. During the past 2 decades a number of prediction rules have been developed to assess severity and prognosis of patients with pneumonia, including but not limited to the pneumonia severity index (PSI), 234 the confusion, urea, respiratory rate, low blood pressure (CURB) score, 241 the CURB plus age older than 65 (CURB-65), 242 the CURB-65 score without the urea level (CRB-65), 243 the severe community-acquired pneumonia (SCAP) score, 244 the SMART-COP score, 245 and the risk of early admission to the Intensive care unit (REA-ICU) index. 246 These rules vary in complexity as well as their sensitivity and specificity for defining the need for ICU care but use a combination of factors, including age, gender, comorbid conditions, vital sign parameters, and laboratory and radiographic findings, to predict either the need for ICU care or the patients' prognosis. Further use of these scoring systems is discussed under "Therapy." Health Care–Associated Pneumonia In the past, a basic distinction in the epidemiology of pneumonia has been whether the infection developed in the community or in the hospital. The distinction was clinically relevant because the importance of various etiologic agents differed, as did antibiotic susceptibilities. Consequently, the guidelines for empirical antibiotic therapy differed depending on where the infection developed. Because an increased amount of health care delivery has been shifted to the outpatient setting, even complex medical conditions may be handled without hospitalization. Subsequently, a growing number of patients develop pneumonia after extensive outpatient contact with various aspects of the health care system. This has led to a blurring of the distinction between CAP and nosocomial pneumonia. Recently, it has been recognized that HCAP represents a distinct syndrome that is a hybrid of CAP and hospital-acquired pneumonia (HAP). 77 , 78 , 247 The exact definition used in studies has varied, but in general it has been defined as pneumonia developing in patients who have been hospitalized for 2 or more days within 90 days of developing infection; patients attending hospital or hemodialysis clinics; patients receiving intravenous antibiotic therapy, wound care, or chemotherapy at home within 30 days of developing infection; and residents of long-term care facilities or nursing homes. 77 Aerobic gram-negative bacilli including P. aeruginosa, S. pneumoniae, S. aureus including MRSA, and mixed aerobic-anaerobic pathogens associated with aspiration have been most commonly reported. 78 , 248 The role of S. pneumoniae has been variable, but in general it appears to play a lesser role than in patients with classic CAP. Overall mortality appears to be higher in patients with HCAP (10.3% to 19.8%) than in CAP (4.3% to 10%) and generally comparable to that of HAP. 78 , 247 , 248 It is not clear whether this is due to increased comorbidities in patients, more virulent organisms causing infection, an increased incidence of inappropriate antibiotic usage in the first 48 hours of care, or some combination of these factors. Atypical Pneumonia Syndrome By the late 1930s, most of the main bacterial causes of pneumonia had been defined. In 1938, Hobart Reimann described a small number of patients with a clinical picture that was atypical in that episodes began as a mild respiratory tract illness that was followed by pneumonia with dyspnea and cough without sputum. 249 Subsequent investigations have shown that this syndrome can be seen with a number of different pathogens, with M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila, and respiratory viruses being the most significant. Other agents such as Chlamydia psittaci, Francisella tularensis, M. tuberculosis, and C. burnetii may also cause atypical pneumonia. In patients with AIDS, Pneumocystis and nontuberculous mycobacteria should also be included. Although some series report that almost 50% of patients with CAP demonstrate serologic evidence of mycoplasmal or chlamydial pneumonia, or both, other series suggest an incidence of 7% to 28%. 55 , 83 , 193 , 197 , 250 , 251 , 252 The differing incidence of mycoplasmal and chlamydial disease in differing studies may be related to the presence of epidemics by these pathogens during study periods, as well as the diagnostic methodologies utilized. As noted earlier, the relative frequency of these pathogens also varies with disease severity. Historically, the epidemiology and clinical features of the atypical pneumonias were believed to be sufficiently distinct to differentiate them clearly from other causes of CAP. It is now clear that differentiation between atypical agents and typical bacterial causes of CAP is imprecise. 193 M. pneumoniae may account for 10% to 30% of cases of CAP, with the highest percentage noted in patients well enough to be treated as outpatients, and several studies performed in North America and Europe suggest cyclic epidemics every 3 to 5 years. 147 It is most likely to occur in children older than 5 years, adolescents, and young adults. The majority of cases occur in those younger than 40 years of age, although it can cause pneumonia requiring hospitalization in those older than 60. 55 , 147 , 253 An increased incidence of disease and true epidemics has been documented in relatively enclosed populations of young adults at military bases, colleges, and boarding schools. Although the disease severity may be mild, owing to the long incubation of approximately 3 weeks, these outbreaks can be quite prolonged. Mycoplasmal infection occurs throughout the year, although a relative increase in incidence is noted in the late summer and fall. The course of infection with M. pneumoniae is characterized by up to 10 days of symptoms before presentation, as is true with many of the other agents involved in atypical pneumonia. In its classic form, mycoplasmal infection presents as constitutional symptoms and a progression from the upper to the lower respiratory tract. Sore throat is often the initial finding. Up to one third of patients may have ear symptoms. Although bullous myringitis has been historically linked to mycoplasmal infection, this appears to be a rare finding. Fever, malaise, coryza, headache, and protracted nonproductive cough represent the major clinical findings. Pleuritic chest pain, splinting, and respiratory distress are not usually seen. Moist or crepitant rales may be heard. Sputum production is variable, and the sputum is purulent in one third to one half of the cases. Gram stain and culture of sputum usually reveal mouth microbiota. White blood cell counts greater than 10,000/mm 3 are uncommon, occurring in approximately 20% of the patients. 90 An elevated sedimentation rate is noted in about 25% of the cases. Pulmonary involvement seen on radiographs is commonly more extensive than the physical examination would indicate. Unilateral or bilateral patchy infiltrates in one or more segments, usually in the lower lobes, are noted in a bronchial or peribronchial distribution. Upper lobe involvement and pleural effusions are less common but may be seen in up to 20% to 30% of cases. 185 , 186 Progression of the radiographic picture, despite a stable clinical picture, may be seen. The overall clinical course in most cases is benign. Disappearance of constitutional symptoms is usually noted in the first and second weeks, although cough and radiographic changes may persist for several weeks. Occasionally, M. pneumoniae infection presents as severe CAP that requires intensive care. 254 A large number of extrapulmonary manifestations may occur with M. pneumoniae infection, including involvement of skin, central nervous system, blood, and kidneys (see Chapter 185). C. pneumoniae has emerged as an important cause of atypical pneumonia and may account for 6% to 20% of all CAP cases. 55 , 83 , 193 , 197 , 250 , 251 , 252 It is often seen in conjunction with other pathogens. 255 Although disease is uncommon in those younger than 5 years, serologic evidence of infection has been noted in more than 50% of adults, and more recent studies suggest an important role for Chlamydia in CAP in those older than 65 years of age. 55 , 76 , 223 , 256 Disease usually occurs sporadically, although epidemics have been well documented. The majority of infections are either asymptomatic or produce mild symptoms. As with mycoplasmal infection, sore throat and hoarseness herald the onset of pneumonia, although the progression of symptoms appears slower than that noted with mycoplasmal or viral pneumonia. Cough may begin after several days to weeks, suggesting a biphasic illness. Hoarseness and sinus tenderness appear more commonly than in patients infected with Mycoplasma or viruses. The white blood cell count is rarely elevated. Pneumonia with C. pneumoniae is usually mild, although complete recovery may be slow. Cough and malaise may persist for weeks to months. Reinfection occurs and appears to be milder than primary infection and is usually not associated with pneumonia. Chronic and latent infections have also been described. Infection with C. pneumoniae has been associated with exacerbations of COPD and asthma. In general, few features distinguish chlamydial pneumonia from infection caused by other atypical agents or other bacteria. C. pneumoniae infections have been associated with extrapulmonary manifestations, including otitis, sinusitis, pericarditis, myo­carditis, and endocarditis. It has also been associated with coronary artery disease, although the definite relationship remains unclear (see Chapter 184). Of the viral agents associated with atypical pneumonia in adults, influenza A and B, adenovirus types 3, 4, and 7 (especially in military recruits), human metapneumovirus, RSV (especially in older adult and immunosuppressed patients), and parainfluenza virus have been considered to be the most common. 182 , 183 , 224 , 225 , 257 The advent of multiplex real-time PCR assays is now rapidly expanding our understanding of the role of viral pathogens in acute pneumonia and has shown that rhinoviruses and coronaviruses can be significant pathogens in adults and that human bocavirus and human metapneumovirus are causative in children younger than 5 years of age. 258 , 259 , 260 , 261 Moreover, the presence of two or more viral pathogens is not uncommon. Other viral agents that are less common causes of pneumonia include enteroviruses, parechoviruses, all the herpesviruses, hantaviruses, mimiviruses, and measles. 262 Epidemic disease is predominantly linked to influenza, but the SARS coronavirus caused worldwide disease in 2002 and 2003, and a second similar coronavirus, the Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), which can cause severe pneumonia, was identified in 2012 (see Chapter 157). 181 Elderly patients, especially those with comorbidities, are frequently the population at greatest risk for viral pneumonias. Legionella is now recognized as an important cause of the atypical pneumonia syndrome, although patients infected with Legionella may also present with the syndrome of acute bacterial CAP. The incidence of pneumonia varies regionally, but it can account for up to 8% of cases involving hospitalization. 203 Legionella spp. are among the top three to four organisms causing pneumonia that require care in an ICU. 203 , 235 , 236 An international study found that L. pneumophila causes more than 90% of cases of Legionella pneumonia, with approximately 84% of all cases caused by L. pneumophila serogroup 1. 263 Inhalation of aerosolized organisms after exposure to environmental reservoirs, such as fresh water and moist soil, has been the usual means of acquiring the organism, although aspiration is now thought to be an alternate route of infection. 264 Cigarette smoking, chronic lung disease, and immunosuppression are consistently noted risk factors for the development of disease. Although early symptoms of malaise, muscle aches, headaches, and nonproductive cough resemble the onset of a viral syndrome, the rapid progression of pulmonary symptoms and relatively high fever, often exceeding 40° C (104° F), is noteworthy. 264 L. pneumophila pneumonia is associated with a variety of extrapulmonary findings and laboratory abnormalities, including mental status changes, abdominal complaints (loose stools or diarrhea), headache, bradycardia, elevation of hepatic enzyme levels, hypophosphatemia, hyponatremia, elevated serum lactate dehydrogenase levels, and elevated serum creatinine levels. These findings mostly reflect the severity of the pneumonia rather than specificity to Legionella infections. Extrapulmonary infection is unusual, but when it does occur it usually involves the heart, with myocarditis, pericarditis, and a postcardiotomy-like syndrome. 264 Unfortunately, none of these findings distinguishes between pneumonia due to L. pneumophila, other atypical agents, or more typical bacterial pathogens. Similarly, radiographic manifestations do not distinguish Legionella infections from those of other causes. Patchy interstitial infiltrates, or nodular infiltrates that may progress rapidly even with adequate therapy, are characteristic. Pleural effusions may be noted in up to one third of patients. Pneumonia in the Setting of Aspiration The clinical setting in which aspiration occurs includes any disease state in which consciousness is altered and the normal gag and swallowing reflexes are abnormal; illnesses predisposing to dysphagia either from neurologic disease or upper gastrointestinal tract disease or surgery; or conditions leading to mechanical disruption of glottic closure such as tracheostomy or nasogastric tubes. A recent prospective population-based study in a Canadian province analyzed 1946 patients hospitalized for pneumonia and identified aspiration as the cause in 10% of cases from the community and in 30% of cases from continuing care facilities. 265 In the community setting, 43% of the cases were related to an impaired level of consciousness due to alcohol, drugs, or hepatic failure and 35% of cases were due to dysphagia. In continuing care facilities, the predominant risk factor was dysphagia from neurologic disease in 72% of cases, with impaired level of consciousness the major risk factor for an additional 22% of patients. The pathogenesis of lung injury due to acid aspiration has been delineated. 266 , 267 The presence of acidic contents in the lung induces the release of proinflammatory cytokines, including TNF-α and IL-8. These and other cytokines recruit neutrophils into the lung. Activated neutrophils appear to be the key mediators of acute lung injury after acid aspiration, although a role for complement has also been demonstrated. 268 Although aspiration may be a witnessed event, the majority of episodes are silent and are brought to medical attention by their sequelae. 267 Three major syndromes are recognized as a consequence of aspiration: chemical pneumonitis, bronchial obstruction secondary to aspiration of particulate matter, and bacterial aspiration pneumonia. Aspiration may be associated with the acute respiratory distress syndrome, atelectasis, bronchial hyperreactivity, and fibrosis. Although chemical pneumonitis and mechanical obstruction usually cause acute symptoms, aspiration pneumonia is more insidious, with symptoms usually occurring gradually several days after the initial episode of aspiration. Pneumonitis, necrotizing pneumonia, abscess, and empyema are common. Symptoms often include fever, weight loss, and productive cough. Foul-smelling or putrid sputum occurs commonly. 269 Anemia and an elevated white blood cell count are frequent associated findings. The bacteriologic findings in aspiration pneumonia reflect the microbiota of the oropharynx, and the importance of periodontal disease in this regard has been noted. Studies performed in the 1970s on patients with indolent disease using the technique of transtracheal aspiration and analysis in anaerobic research laboratories documented anaerobic involvement in the majority of cases either alone or in combination with oral aerobic or facultative anaerobes. 270 Bacteroides spp., Porphyromonas spp., Prevotella melaninogenica, Fusobacterium spp., and anaerobic gram-positive cocci are the predominant anaerobes isolated. In community-acquired aspiration pneumonia, Streptococcus spp. and H. influenzae are the most common aerobic isolates. In contrast, gram-negative bacilli (including P. aeruginosa ) and S. aureus are the most commonly isolated aerobes from nosocomial aspiration pneumonia including VAP, as well as pneumonia occurring in nursing home patients. 77 , 222 Eosinophilic Pneumonias Pulmonary infiltrates with eosinophilia (PIE), also called eosinophilic pneumonia, is a syndrome associated with a variety of clinical entities, only some of which have an infectious cause. 271 Pulmonary eosinophilia with transient, peripheral pulmonary infiltrates and minimal symptoms (Löffler's syndrome) has been associated with Ascaris, Strongyloides, and hookworm infections. Ascaris is probably the leading parasitic cause of the syndrome worldwide. Prolonged pulmonary eosinophilia associated with weight loss, fever, cough, and dyspnea may be due to tuberculosis, brucellosis, psittacosis, coccidioidomycosis, histoplasmosis, and parasitic infections including ascariasis, strongyloidiasis, paragonimiasis, echinococcosis, visceral larval migrans, cutaneous larva migrans, and infections with Schistosoma, Dirofilaria immitis, and Ancylostoma species. Noninfectious causes include drug allergy, sarcoidosis, eosinophilic leukemia, Hodgkin's disease, paraneoplastic syndromes, and hypersensitivity pneumonitis (e.g., pigeon breeders' disease). A PIE syndrome has been associated with Pneumocystis pneumonia. 272 Acute eosinophilic pneumonia is a distinct clinical entity occurring in younger (20- to 45-year-old), otherwise healthy individuals. 273 It is marked by the acute onset of dyspnea, nonproductive cough, fever, severe hypoxia, and chest pain and can require ICU care and mechanical ventilation. Although leukocytosis is common, peripheral eosinophilia is typically minimal. Bilateral, diffuse pulmonary infiltrates are common. Radiographic abnormalities usually begin as interstitial infiltrates that progress to alveolar infiltrates. Chest CT reveals bilateral opacities. BAL yields marked (27% to 81%) eosinophilia, which is the diagnostic feature of the disease. Although most patients have received antibiotics, rapid stabilization occurs with corticosteroid use. It has been suggested that chronic eosinophilic pneumonia may represent a unique clinical entity that may be on a continuum between asthma and Churg-Strauss syndrome. 274 A subacute onset of cough, dyspnea, fever, and weight loss associated with peripheral eosinophilia are the common features. Unlike the situation in acute eosinophilic pneumonia, respiratory failure is rare. Peripheral as well as migratory infiltrates are commonly seen on radiographs. Interstitial infiltrate and alveolar exudates with a predominance of eosinophils are characteristic pathologic features. A rapid response to corticosteroids has been reported. Tropical pulmonary eosinophilia consists of myalgia, fatigue, weight loss, and anorexia associated with cough, frequently with nocturnal exacerbations, wheezing, dyspnea, and marked peripheral eosinophilia in patients who have lived in or visited the tropics. Most cases are believed to represent immunologic hyperresponsiveness to microfilarial infection with Wuchereria bancrofti or Brugia malayi. Radiographic changes are distinctive and include increased interstitial markings with 2- to 4-mm nodules throughout the lungs with preferential involvement of the bases. Therapy is with diethylcarbamazine (see Chapter 289). Other causes of PIE syndrome include bronchopulmonary mycosis, which should be suspected when a patient with PIE presents with asthma in conjunction with bronchiectasis, recurrent expectoration of brown mucus plugs, and peripheral eosinophilia. 271 , 275 Although predominantly associated with chronic bronchial colonization with Aspergillus species, it can be seen in conjunction with other fungi such as Scedosporium apiospermum and Cladosporium herbarum. Patients with the Churg-Strauss syndrome frequently have eosinophilia along with allergic angiitis and granulomatosis and present with asthma, diffuse pulmonary infiltrates, and multiorgan involvement. Hypereosinophilic syndrome, eosinophilic granuloma (also known as primary pulmonary Langerhans cell histiocytosis granulomatosis), bronchiolitis obliterans organizing pneumonia, Sjögren's syndrome, and postirradiation pneumonitis are unusual cases of pulmonary infiltrates with eosinophilia. Hospital-Acquired Pneumonia HAP has been the second most common cause of nosocomial infection and is associated with significant morbidity and mortality. 276 , 277 It is a leading cause of infection-related deaths in hospitalized patients, with attributable mortality rates of 20% to 33% reported. Higher mortality rates have been observed when patients are bacteremic or have pneumonia caused by P. aeruginosa or Acinetobacter spp. The morbidity associated with nosocomial pneumonia includes longer hospital stays (average, 7 to 9 days) and an estimated attributable cost of approximately $24,000. 77 , 278 Risk factors for the development of nosocomial pneumonia have been categorized as patient related, infection control related, or intervention related. Patient-related risk factors include age older than 70 years, severe underlying disease, malnutrition, coma, metabolic acidosis, and the presence of any of a number of comorbid illnesses (e.g., COPD, alcoholism, azotemia, central nervous system dysfunction). Infection control–related risk factors include a lack of hand hygiene and glove-use practices and the use of contaminated respiratory equipment. Intervention-related risk factors involve those procedures and therapies that undermine normal host defenses or allow the host to be exposed to large inocula of bacteria. Sedatives and narcotics may lead to aspiration; corticosteroids and cytotoxic agents blunt the normal host response to infection; and the prolonged use of antibiotics engenders resistance. Surgical procedures, especially involving the chest and abdomen, are associated with changes in host defenses that predispose to pneumonia. The use of ventilator support is perhaps the greatest risk factor for the development of nosocomial pneumonia, with VAP occurring in 9% to 40% of intubated patients. 276 Data suggest that there is a 1% to 3% per day risk for developing pneumonia while on a ventilator, with a higher risk during the first 5 days of intubation. 279 The use of antacids and H2 blockers that raise the gastric pH has been shown to increase stomach colonization with aerobic gram-negative rods. 280 Whether this leads to an increase in nosocomial pneumonia remains controversial. 36 , 37 The percentage of patients with VAP caused by organisms initially found in the stomach ranges from 0% to 55%. 280 Aerobic gram-negative bacilli cause 50% to 60% of cases of nosocomial pneumonia, with members of the Enterobacteriaceae ( K. pneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens, Acinetobacter spp., Enterobacter spp.) and Pseudomonas species accounting for the majority of these. 74 There is an increasing prevalence of high-level antibiotic resistance among these gram-negative bacilli, and the relative incidence of pneumonia due to multidrug-resistant bacteria varies between institutions and occasionally between units within an institution. 276 Risk factors for such pathogens include the length of hospitalization, prior antibiotic exposure, and local epidemiologic factors. S. aureus causes 13% to 40% of nosocomial pneumonia, and MRSA is now a major pathogen in this setting. 74 , 77 In contrast to their prominent role in CAP, S. pneumoniae and H. influenzae together cause only 5% to 15% of nosocomial pneumonias in most studies and are predominantly seen in infections developing early in the hospital course. There is only limited information comparing the bacteriology of VAP and non–ventilator-associated HAP, but the available data indicate that the general distribution of aerobic pathogens is relatively comparable, although there is an increase in the relative prevalence of gram-negative pathogens in patients with VAP, particularly nonenteric gram-negative bacilli. 74 , 281 Although the use of sedatives, feeding tubes, and endotracheal tubes are all risk factors for the development of aspiration pneumonia, the lack of support for anaerobic microbiologic testing has led to a paucity of data on the roles of anaerobic bacteria in HAP. 267 One study performed in the early 1970s at a veterans hospital with bacteriologic analysis in a research laboratory documented anaerobes in up to 35% of cases of nosocomial pneumonia, and a second, more recent study identified anaerobes in conjunctions with aerobic microbiota in 23% of patients with VAP. 282 , 283 These organisms should be considered when aspiration is likely to have occurred. Pneumonia caused by Legionella species may occur sporadically or as part of outbreaks. The respiratory viruses influenza, parainfluenza, adenovirus, and RSV can cause sporadic nosocomial pneumonia as well as occasional institutional outbreaks. There has been the recognition that herpes simplex virus and cytomegalovirus can reactivate and be identified in patients with severe VAP or the adult respiratory distress syndrome. The significance of this reactivation remains uncertain at this time. 276 Recent consensus guidelines have been established concerning the risks, etiology, diagnostic workup, and therapies for nosocomial pneumonia and VAP. 77 A more in-depth review is presented in Chapter 303. Pneumonia in the Immunosuppressed Host Pneumonia in the immunocompromised host is perhaps the most complex of all the pneumonia syndromes, because it represents the interaction of host defense defects engendered by the underlying disease as well as the chemotherapy of that disease, exposure to potential pathogens in the community and within the hospital setting, and reactivation of infectious processes that had previously been dormant. CAP, atypical pneumonia, aspiration pneumonia, and nosocomial pneumonia all take place in the compromised host. A large number of bacterial, fungal, viral, and noninfectious causes must be considered (see further discussion in Chapters 309 to 313Chapter 309Chapter 310Chapter 311Chapter 312Chapter 313). Acute Community-Acquired Pneumonia A long list of bacterial, fungal, viral, and protozoal agents may cause pneumonia. Because initial evaluation rarely results in a specific etiologic diagnosis, antibiotic therapy is usually begun empirically. Defining pneumonia syndromes on the basis of clinical, epidemiologic, radiographic, and laboratory parameters, with a limited number of organisms commonly associated with each syndrome, has helped the clinician to select rational empirical therapy for the most likely organisms involved. Many of the syndromes have overlapping signs and symptoms, which at times makes clear identification of a specific syndrome in an individual impossible. 193 , 194 Increases in numbers of patients living longer, more and varied comorbidities, the increasing use of biologic immunomodulators such as TNF inhibitors, and expanded contact with various aspects of the health care system have led to a wider array of presentations, etiologic agents, and strategies for empirical therapy. Newly described microbial agents are being recognized as potential causes of CAP. Subgrouping syndromes under the general description of CAP may be made based on patient age, severity of illness, comorbidities, need for hospitalization, and epidemiologic setting. Patients with acute CAP are usually in their middle 50s to late 60s. Peak incidences of disease in general occurs in midwinter and early spring, although disease due to Legionella is more frequent in the summer. 195 Still, there is no "pneumonia season" and disease takes place throughout the year. Most patients (58% to 89%) have one or more chronic underlying diseases. Immunosuppression related to malignancy, neutropenia, the chronic use of corticosteroids or other myelosuppressive agents, or HIV infection is being increasingly observed. 194 , 196 Classically, CAP presents as a sudden onset of a chill followed by fever, pleuritic chest pain, and cough that produces mucopurulent sputum. The signs, symptoms, and physical findings vary according to the age of the patient, therapy with antibiotics before presentation, and the severity of illness. Patients typically present after several days of symptoms. 197 Cough is noted in more than 80% to 90% of patients and is productive in over 60%. 197 , 198 , 199 , 200 Chest pain is present in 35% to 48% of cases, chills in 40% to 70%, and hemoptysis in approximately 15%. 197 , 198 , 200 A variety of nonrespiratory symptoms are associated with pneumonia, including fatigue (91%), anorexia (71%), sweats (69%), and nausea (41%). 54 Both respiratory and nonrespiratory findings occur less frequently in older age groups. 54 Physical examination reveals fever in 68% to 78% of patients but may be seen less commonly in older populations. Tachypnea (respiratory rate >24 to 30 breaths/min) is noted in 45% to 69% of patients and may be more frequently seen in older age groups. 54 Tachycardia (pulse rate >100 beats/min) is noted in 45%. Rales are noted in approximately 70% of patients, and signs of consolidation in 20% 197 ; but no combination of physical findings has been found to be adequate to confirm a diagnosis of pneumonia. 53 Most commonly, the white blood cell count is in the range of 15,000 to 35,000/mm 3 and the differential cell count reveals an increased number of juvenile forms. Leukopenia may be noted and is a poor prognostic sign. 84 The hematocrit and the red blood cell indices are usually normal. Sputum is thick and purulent and may be rust colored. The sputum Gram stain reveals numerous neutrophils and bacteria, often with a single organism predominating. Chest films show areas of parenchymal involvement, usually with an alveolar-filling process. There is moderate hypoxemia due to ventilation-perfusion abnormalities. Even with rigorous laboratory evaluation and using definitions of definite, probable, and possible causes, a microbiologic diagnosis may be made in 40% to 75% of cases of CAP. 55 , 201 , 202 In the past, 40% to 80% of cases of acute CAP were caused by S. pneumoniae. 88 Whereas the pneumococcus remains perhaps the most important cause of pneumonia, more recent published reports have indicated that its relative importance has diminished. 203 It has been defined as the cause of pneumonia in as few as 6% of ambulatory patients and only 55% of hospitalized patients. 201 , 202 It has been hypothesized that the apparent decreased incidence of pneumococcal pneumonia is related to recognition of newer pathogens and diminished use and performance of microbiologic studies. 88 However, through a herd immunity effect, the increasing use of pneumococcal vaccine in children appears to be reducing the incidence of pneumococcal disease in adults and children. 204 , 205 Severe pneumococcal infections, including pneumonia, have been associated with prior splenectomy due either to trauma or to staging for Hodgkin's disease, abnormal immunoglobulin responses (myeloma, lymphoma, HIV infection), and functional asplenia due to systemic lupus erythematosus or marrow transplant. 206 , 207 An estimated 5% to 7% of cases of acute CAP appear to be caused by H. influenzae. 201 , 202 , 203 The true incidence of this organism is obscured by the difficulty of isolating it from sputum and identifying it in sputum that has been Gram stained and by the difficulty of distinguishing colonization from infection. The age of patients, presence of underlying disease, and presentation are similar to those of pneumococcal disease. Although the use of the H. influenzae conjugate vaccine has decreased the incidence of invasive disease caused by H. influenzae type b, there is a strikingly increased incidence of invasive disease including pneumonia caused by nontypeable strains. In one recent series, over 50% of isolates from patients with invasive H. influenzae diseases were nontypeable. 208 S. aureus has accounted for 1% to 2% of acute CAP cases, 201 , 202 , 203 and takes on increased importance as a cause of pneumonia in older adults and in those with influenza. 56 Patients who develop postinfluenza pneumonia are usually younger and have less underlying disease than most other patients with CAP. Although it had been believed that bacterial pneumonia in the setting of influenza develops after clinical influenza, studies during the 2009 H1N1 pandemic indicate that bacterial coinfection most likely arises at the peak of viral replication, with patients presenting an average of 6 days after symptom onset. 56 An elevated white blood cell count with a shift to the left, physical signs of pulmonary consolidation, and radiographic evidence of focal parenchymal disease develop, and the sputum Gram stain is consistent with bacterial pneumonia. S. aureus may also cause pneumonia hematogenously, producing multiple bilateral round lesions that will frequently cavitate. Although this presentation has been characteristically associated with right-sided endocarditis in injection drug users, it can also be seen in association with infections of intravascular catheters and with staphylococcal soft tissue infections. 209 , 210 As noted previously, since the late 1990s there has been an increase in the incidence of pneumonia due to community-associated S. aureus strains. 57 , 176 Patients have been young, had few if any comorbidities, and usually presented after a flulike illness with high fevers, leukopenia, tachycardia, tachypnea, hemoptysis, and rapid evolution on radiography to multilobar disease. These cases appear to be associated with S. aureus strains carrying the Panton-Valentine leukocidin toxin, regardless of whether they are methicillin resistant. 211 The adult respiratory distress syndrome has been a frequent complication in such cases, and mortality rates of over 50% have occurred. 176 Aerobic gram-negative bacteria, exclusive of H. influenzae, and mixed aerobic and anaerobic infections cause most of the remaining cases of acute CAP. Gram-negative rods may cause anywhere from 2% to 10% of pneumonia cases . Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, and Enterobacter spp. are the most often isolated organisms. 201 , 202 , 203 , 212 Gram-negative bacilli are particularly important pathogens in older adults, especially those with chronic underlying disease and those who are bedridden and recently hospitalized. Pseudomonas infection should be suspected in patients with pulmonary comorbidities and recent hospital stays. Legionella spp. are the most important water-related pulmonary pathogens in the United States with regard to mortality and morbidity. The importance of Legionella spp. in causing pneumonia has varied greatly in different geographic areas, with incidences ranging from 0.6% to 23%. 193 , 194 , 197 , 203 , 213 Since 2003, an increased incidence of legionellosis has been observed in the United States, especially on the East Coast. 214 Although infection may occur at any age, those aged 45 to 64 now appear to be at greatest risk. The presence of a high fever (>40° C [104° F]), male sex, previous β-lactam therapy, multilobar involvement, rapid progression of radiographic abnormalities, a need for intensive care, gastrointestinal and neurologic abnormalities, elevated liver enzyme levels, and increased creatinine levels have all been associated with Legionella pneumonia. 194 , 213 However, no clinical features reliably distinguish Legionella pneumonia from that caused by other bacteria. Moraxella catarrhalis has also been identified as a cause of pneumonia. 201 , 202 , 203 , 215 The overall incidence of disease caused by this bacterium is low, but it is an important pathogen in older adults with COPD and various forms of immunosuppression. As discussed later, a number of additional pathogens, including M. pneumoniae, Chlamydia spp., C. burnetii, and community respiratory viruses can cause an atypical pneumonia syndrome. In addition, it is not infrequent for a patient to have pneumonia either sequentially or concurrently due to several pathogens, such as influenza virus or C. pneumoniae infection being followed by infection with S. pneumoniae. 203 Community-Acquired Pneumonia in the Older Adult Pneumonia in the elderly has become an increasingly important clinical entity as the world's population has aged. 216 Pneumonia is one of the leading reasons for hospitalization in those 65 and older and represents a major cause of morbidity and mortality. In some series, pneumonia represents the leading cause of death in this population (see Chapter 315). For those older than the age of 60, pneumonia is a predictor of increased mortality after the specific episode has resolved and for several years thereafter. 217 The clinical presentation of pneumonia in older adults (especially those >80 years) may be subtler than in younger populations, with more gradual onset of symptoms and fever and the classic signs of pneumonia. 54 , 76 , 194 Fever occurs less commonly in older adults, and temperature elevation is muted. The classic findings of cough, fever, and dyspnea may be absent in over half of older adults. 75 , 218 Chills and rigors may be less frequently seen as well. Tachypnea (respiratory rate >24 to 30 breaths/min) and rales are more frequent findings in older adults and have been observed in up to 65% of patients. 54 , 76 Non­respiratory symptoms may be the major presenting feature. The initial presentation of older adults with pneumonia may include decline in functional status, weakness, subtle changes in mental status, and anorexia or abdominal pain. It has been suggested that the nonspecific presentation of pneumonia in older adults may result in great part from the prevalence of dementia in this population. 218 Bacteremia, development of in-hospital complications, and death are more frequent in older populations. 76 , 219 Specific etiologic diagnoses are made less frequently in older adults, with 20% to 50% of patients having an etiologic agent defined. 76 The absence of productive cough and common prior use of antibiotics may explain this observation. Causes have varied in different series depending on the means of diagnosis, the patient population studied (outpatient vs. institutionalized older adults), and the geographic location. In general, the cause of CAP in the older population follows the general trend of infection in younger populations. S. pneumoniae remains the predominant organism, accounting for 20% to 60% of cases, and there is an increased frequency of aspiration pneumonia. 76 , 216 H. influenzae, usually a nontypeable strain, is frequently the second most common agent, accounting for 5% to 10% of episodes. 76 , 220 The importance of other aerobic gram-negative bacilli in causing pneumonia in older adults remains a question, in part because the criteria for diagnosis of true pneumonia versus colonization vary. In most recent studies, 1% to 3% of cases of pneumonia have been attributed to non- Haemophilus gram-negative bacilli. Although increased oropharyngeal colonization with aerobic gram-negative bacilli has been documented in the older population and is believed to be a predisposition to development of pneumonia caused by these organisms, colonization appears to be related to debility of the patient rather than age. 221 Other factors reported to be associated with increasing colonization with gram-negative organisms include prior use of antibiotics, severe bronchopulmonary disease, decreased activity, alcoholism, and incontinence. 212 In this regard, one recent study of apparent aspiration pneumonia in a nursing home population older than 65 years of age that utilized protected bronchoalveolar lavage to define the microbiologic etiology identified gram-negative bacteria as the primary pathogen in 49%, followed by mixed anaerobes in 16%. 222 Older adults are at greater risk for infection with group B streptococci, M. catarrhalis, and Legionella species, although the overall incidence of these agents in the older population is relatively low. Legionella has been described as a cause of severe pneumonia in the elderly. Polymicrobial infections and pneumonia due to aspiration have both been noted to occur more frequently in older adults. 75 , 76 It is unclear which agents cause atypical pneumonia in the older population. Most series suggest that M. pneumoniae pneumonia is unusual, although it has been documented by other investigators to be a significant cause of pneumonia leading to hospitalization in older adults. 55 , 75 , 76 It is not clear if this significant variation is related to differing epidemiologic characteristics of study populations or accuracy of diagnostic methods. Chlamydia infections appear commonly in the older population and may cause up to 32% of cases of pneumonia, although again there is a significant variation in incidence in differing studies. 55 , 76 , 223 Viral agents play an important role as causes of pneumonia in the elderly, although historically their role has been underestimated, given the difficulty in culturing them and the relative insensitivity of serologic tests. 224 With the development of more sensitive nucleic acid amplification tests such as the reverse-transcriptase PCR assay, their role as causes of pneumonia has begun to be more clearly defined. 224 , 225 Recent studies have suggested a viral cause in up to one third of patients hospitalized with pneumonia, with significantly more viral infections noted in the older age groups (median age, 76 years). 225 , 226 Influenza A and B, RSV, human metapneumovirus, parainfluenza virus, and coronavirus are the most frequently identified viral pathogens. Recent studies indicate that up to half of the patients with a viral pathogen identified will have concurrent bacterial infection, and multiple concurrent viral pathogens also can be seen. 226 Rhinoviruses have not been defined as a direct cause of pneumonia but have been found in patients with severe pneumococcal disease and in vitro have shown increased adherence of S. pneumoniae to human tracheal epithelial cells. 226 , 227 These findings raise the question as to whether some viruses play a role as facilitators for bacterial infection rather than roles as true pulmonary pathogens. Clinically, viral pneumonia in the elderly cannot be differentiated from bacterial pneumonia by clinical, routine laboratory, or radiologic parameters. As with bacterial disease, the signs of viral pneumonia may be subtle and may only involve fever and altered mental status. 224 Dyspnea, wheezing, and productive cough are commonly observed. Myalgia, while commonly found with most viral causes, is most often seen with influenza. Bronchospasm and wheezing may be more commonly seen with RSV. 224 Nursing Home Pneumonia Residents of skilled nursing facilities represent an important subpopulation of older adults at risk for pneumonia. Pneumonia has been reported to be the second most frequent infection in this setting, carries the highest mortality of any infection in this population, and is a common cause for hospitalization. 228 , 229 Silent aspiration is a major risk factor, as are poor functional status, nasogastric feeding, confusion, the presence of obstructive lung disease, the presence of a tracheostomy, and advancing age. 230 Key modifiable risk factors are inadequate oral care and swallowing difficulties. 231 The subtle presentation noted in other older adult populations occurs in those in a nursing home setting. S. pneumoniae had been considered the predominant cause, but newer studies have identified respiratory viruses and C. pneumoniae as frequent pathogens, as well as S. aureus and gram-negative bacilli in those with severe pneumonia. 223 , 230 Outbreaks of pneumonia have occurred in nursing homes and have involved Legionella, Chlamydia , influenza, parainfluenza, RSV, and rhinovirus. 232 , 233 Severe Community-Acquired Pneumonia Approximately10% of patients with CAP will develop severe disease, as defined by admission to an ICU owing to the presence of shock requiring vasopressors or respiratory failure requiring mechanical ventilation. 234 Early identification of patients who are at higher risk for developing severe pneumonia is important because these patients have a higher mortality rate and require more supportive care. Furthermore, patients with severe pneumonia are infected with a different spectrum of etiologic agents and would therefore benefit from different empirical antibiotic strategies than patients with less severe disease. Advanced age, presence of significant comorbidities, nursing home residence, immunosuppression, and altered mental status have all been believed to be associated with the development of severe CAP. 234 Approximately one third of patients with severe pneumonia would have been previously healthy. S. pneumoniae was the organism classically associated with severe pneumonia. However, in patients requiring ICU admission there is an increased incidence of S. aureus, L. pneumophila, gram-negative bacilli (especially Klebsiella spp.), and H. influenzae. 203 , 235 , 236 In addition, Pneumocystis is increasingly being recognized as a cause of severe pneumonia in non–HIV-infected patients who have impaired cell-mediated immunity due to organ transplantation, malignancy, severe malnutrition, or receipt of immunosuppressive therapies, including corticosteroids, antineoplastic chemotherapeutic agents, as well as newer agents including TNF-α inhibitors and rituximab. 237 , 238 , 239 As with CAP in general, there can be significant geographic differences in the relative incidence of differing pathogens. A meta-analysis of 127 studies published through 1995 indicated an overall mortality rate for CAP of 13.7%, but it was 36.5% for patients with disease severe enough to require ICU care. 240 Prognostic risk factors for death included male sex, pleuritic chest pain, hypothermia, systolic hypotension, tachypnea, diabetes mellitus, neoplastic disease, neurologic disease, bacteremia, leukopenia, and multilobar radiographic pulmonary infiltrates. Although shock or respiratory failure are usually evident and serve as major criteria for defining severe pneumonia, patients without these findings may also benefit from ICU care. During the past 2 decades a number of prediction rules have been developed to assess severity and prognosis of patients with pneumonia, including but not limited to the pneumonia severity index (PSI), 234 the confusion, urea, respiratory rate, low blood pressure (CURB) score, 241 the CURB plus age older than 65 (CURB-65), 242 the CURB-65 score without the urea level (CRB-65), 243 the severe community-acquired pneumonia (SCAP) score, 244 the SMART-COP score, 245 and the risk of early admission to the Intensive care unit (REA-ICU) index. 246 These rules vary in complexity as well as their sensitivity and specificity for defining the need for ICU care but use a combination of factors, including age, gender, comorbid conditions, vital sign parameters, and laboratory and radiographic findings, to predict either the need for ICU care or the patients' prognosis. Further use of these scoring systems is discussed under "Therapy." Health Care–Associated Pneumonia In the past, a basic distinction in the epidemiology of pneumonia has been whether the infection developed in the community or in the hospital. The distinction was clinically relevant because the importance of various etiologic agents differed, as did antibiotic susceptibilities. Consequently, the guidelines for empirical antibiotic therapy differed depending on where the infection developed. Because an increased amount of health care delivery has been shifted to the outpatient setting, even complex medical conditions may be handled without hospitalization. Subsequently, a growing number of patients develop pneumonia after extensive outpatient contact with various aspects of the health care system. This has led to a blurring of the distinction between CAP and nosocomial pneumonia. Recently, it has been recognized that HCAP represents a distinct syndrome that is a hybrid of CAP and hospital-acquired pneumonia (HAP). 77 , 78 , 247 The exact definition used in studies has varied, but in general it has been defined as pneumonia developing in patients who have been hospitalized for 2 or more days within 90 days of developing infection; patients attending hospital or hemodialysis clinics; patients receiving intravenous antibiotic therapy, wound care, or chemotherapy at home within 30 days of developing infection; and residents of long-term care facilities or nursing homes. 77 Aerobic gram-negative bacilli including P. aeruginosa, S. pneumoniae, S. aureus including MRSA, and mixed aerobic-anaerobic pathogens associated with aspiration have been most commonly reported. 78 , 248 The role of S. pneumoniae has been variable, but in general it appears to play a lesser role than in patients with classic CAP. Overall mortality appears to be higher in patients with HCAP (10.3% to 19.8%) than in CAP (4.3% to 10%) and generally comparable to that of HAP. 78 , 247 , 248 It is not clear whether this is due to increased comorbidities in patients, more virulent organisms causing infection, an increased incidence of inappropriate antibiotic usage in the first 48 hours of care, or some combination of these factors. Atypical Pneumonia Syndrome By the late 1930s, most of the main bacterial causes of pneumonia had been defined. In 1938, Hobart Reimann described a small number of patients with a clinical picture that was atypical in that episodes began as a mild respiratory tract illness that was followed by pneumonia with dyspnea and cough without sputum. 249 Subsequent investigations have shown that this syndrome can be seen with a number of different pathogens, with M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila, and respiratory viruses being the most significant. Other agents such as Chlamydia psittaci, Francisella tularensis, M. tuberculosis, and C. burnetii may also cause atypical pneumonia. In patients with AIDS, Pneumocystis and nontuberculous mycobacteria should also be included. Although some series report that almost 50% of patients with CAP demonstrate serologic evidence of mycoplasmal or chlamydial pneumonia, or both, other series suggest an incidence of 7% to 28%. 55 , 83 , 193 , 197 , 250 , 251 , 252 The differing incidence of mycoplasmal and chlamydial disease in differing studies may be related to the presence of epidemics by these pathogens during study periods, as well as the diagnostic methodologies utilized. As noted earlier, the relative frequency of these pathogens also varies with disease severity. Historically, the epidemiology and clinical features of the atypical pneumonias were believed to be sufficiently distinct to differentiate them clearly from other causes of CAP. It is now clear that differentiation between atypical agents and typical bacterial causes of CAP is imprecise. 193 M. pneumoniae may account for 10% to 30% of cases of CAP, with the highest percentage noted in patients well enough to be treated as outpatients, and several studies performed in North America and Europe suggest cyclic epidemics every 3 to 5 years. 147 It is most likely to occur in children older than 5 years, adolescents, and young adults. The majority of cases occur in those younger than 40 years of age, although it can cause pneumonia requiring hospitalization in those older than 60. 55 , 147 , 253 An increased incidence of disease and true epidemics has been documented in relatively enclosed populations of young adults at military bases, colleges, and boarding schools. Although the disease severity may be mild, owing to the long incubation of approximately 3 weeks, these outbreaks can be quite prolonged. Mycoplasmal infection occurs throughout the year, although a relative increase in incidence is noted in the late summer and fall. The course of infection with M. pneumoniae is characterized by up to 10 days of symptoms before presentation, as is true with many of the other agents involved in atypical pneumonia. In its classic form, mycoplasmal infection presents as constitutional symptoms and a progression from the upper to the lower respiratory tract. Sore throat is often the initial finding. Up to one third of patients may have ear symptoms. Although bullous myringitis has been historically linked to mycoplasmal infection, this appears to be a rare finding. Fever, malaise, coryza, headache, and protracted nonproductive cough represent the major clinical findings. Pleuritic chest pain, splinting, and respiratory distress are not usually seen. Moist or crepitant rales may be heard. Sputum production is variable, and the sputum is purulent in one third to one half of the cases. Gram stain and culture of sputum usually reveal mouth microbiota. White blood cell counts greater than 10,000/mm 3 are uncommon, occurring in approximately 20% of the patients. 90 An elevated sedimentation rate is noted in about 25% of the cases. Pulmonary involvement seen on radiographs is commonly more extensive than the physical examination would indicate. Unilateral or bilateral patchy infiltrates in one or more segments, usually in the lower lobes, are noted in a bronchial or peribronchial distribution. Upper lobe involvement and pleural effusions are less common but may be seen in up to 20% to 30% of cases. 185 , 186 Progression of the radiographic picture, despite a stable clinical picture, may be seen. The overall clinical course in most cases is benign. Disappearance of constitutional symptoms is usually noted in the first and second weeks, although cough and radiographic changes may persist for several weeks. Occasionally, M. pneumoniae infection presents as severe CAP that requires intensive care. 254 A large number of extrapulmonary manifestations may occur with M. pneumoniae infection, including involvement of skin, central nervous system, blood, and kidneys (see Chapter 185). C. pneumoniae has emerged as an important cause of atypical pneumonia and may account for 6% to 20% of all CAP cases. 55 , 83 , 193 , 197 , 250 , 251 , 252 It is often seen in conjunction with other pathogens. 255 Although disease is uncommon in those younger than 5 years, serologic evidence of infection has been noted in more than 50% of adults, and more recent studies suggest an important role for Chlamydia in CAP in those older than 65 years of age. 55 , 76 , 223 , 256 Disease usually occurs sporadically, although epidemics have been well documented. The majority of infections are either asymptomatic or produce mild symptoms. As with mycoplasmal infection, sore throat and hoarseness herald the onset of pneumonia, although the progression of symptoms appears slower than that noted with mycoplasmal or viral pneumonia. Cough may begin after several days to weeks, suggesting a biphasic illness. Hoarseness and sinus tenderness appear more commonly than in patients infected with Mycoplasma or viruses. The white blood cell count is rarely elevated. Pneumonia with C. pneumoniae is usually mild, although complete recovery may be slow. Cough and malaise may persist for weeks to months. Reinfection occurs and appears to be milder than primary infection and is usually not associated with pneumonia. Chronic and latent infections have also been described. Infection with C. pneumoniae has been associated with exacerbations of COPD and asthma. In general, few features distinguish chlamydial pneumonia from infection caused by other atypical agents or other bacteria. C. pneumoniae infections have been associated with extrapulmonary manifestations, including otitis, sinusitis, pericarditis, myo­carditis, and endocarditis. It has also been associated with coronary artery disease, although the definite relationship remains unclear (see Chapter 184). Of the viral agents associated with atypical pneumonia in adults, influenza A and B, adenovirus types 3, 4, and 7 (especially in military recruits), human metapneumovirus, RSV (especially in older adult and immunosuppressed patients), and parainfluenza virus have been considered to be the most common. 182 , 183 , 224 , 225 , 257 The advent of multiplex real-time PCR assays is now rapidly expanding our understanding of the role of viral pathogens in acute pneumonia and has shown that rhinoviruses and coronaviruses can be significant pathogens in adults and that human bocavirus and human metapneumovirus are causative in children younger than 5 years of age. 258 , 259 , 260 , 261 Moreover, the presence of two or more viral pathogens is not uncommon. Other viral agents that are less common causes of pneumonia include enteroviruses, parechoviruses, all the herpesviruses, hantaviruses, mimiviruses, and measles. 262 Epidemic disease is predominantly linked to influenza, but the SARS coronavirus caused worldwide disease in 2002 and 2003, and a second similar coronavirus, the Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), which can cause severe pneumonia, was identified in 2012 (see Chapter 157). 181 Elderly patients, especially those with comorbidities, are frequently the population at greatest risk for viral pneumonias. Legionella is now recognized as an important cause of the atypical pneumonia syndrome, although patients infected with Legionella may also present with the syndrome of acute bacterial CAP. The incidence of pneumonia varies regionally, but it can account for up to 8% of cases involving hospitalization. 203 Legionella spp. are among the top three to four organisms causing pneumonia that require care in an ICU. 203 , 235 , 236 An international study found that L. pneumophila causes more than 90% of cases of Legionella pneumonia, with approximately 84% of all cases caused by L. pneumophila serogroup 1. 263 Inhalation of aerosolized organisms after exposure to environmental reservoirs, such as fresh water and moist soil, has been the usual means of acquiring the organism, although aspiration is now thought to be an alternate route of infection. 264 Cigarette smoking, chronic lung disease, and immunosuppression are consistently noted risk factors for the development of disease. Although early symptoms of malaise, muscle aches, headaches, and nonproductive cough resemble the onset of a viral syndrome, the rapid progression of pulmonary symptoms and relatively high fever, often exceeding 40° C (104° F), is noteworthy. 264 L. pneumophila pneumonia is associated with a variety of extrapulmonary findings and laboratory abnormalities, including mental status changes, abdominal complaints (loose stools or diarrhea), headache, bradycardia, elevation of hepatic enzyme levels, hypophosphatemia, hyponatremia, elevated serum lactate dehydrogenase levels, and elevated serum creatinine levels. These findings mostly reflect the severity of the pneumonia rather than specificity to Legionella infections. Extrapulmonary infection is unusual, but when it does occur it usually involves the heart, with myocarditis, pericarditis, and a postcardiotomy-like syndrome. 264 Unfortunately, none of these findings distinguishes between pneumonia due to L. pneumophila, other atypical agents, or more typical bacterial pathogens. Similarly, radiographic manifestations do not distinguish Legionella infections from those of other causes. Patchy interstitial infiltrates, or nodular infiltrates that may progress rapidly even with adequate therapy, are characteristic. Pleural effusions may be noted in up to one third of patients. Pneumonia in the Setting of Aspiration The clinical setting in which aspiration occurs includes any disease state in which consciousness is altered and the normal gag and swallowing reflexes are abnormal; illnesses predisposing to dysphagia either from neurologic disease or upper gastrointestinal tract disease or surgery; or conditions leading to mechanical disruption of glottic closure such as tracheostomy or nasogastric tubes. A recent prospective population-based study in a Canadian province analyzed 1946 patients hospitalized for pneumonia and identified aspiration as the cause in 10% of cases from the community and in 30% of cases from continuing care facilities. 265 In the community setting, 43% of the cases were related to an impaired level of consciousness due to alcohol, drugs, or hepatic failure and 35% of cases were due to dysphagia. In continuing care facilities, the predominant risk factor was dysphagia from neurologic disease in 72% of cases, with impaired level of consciousness the major risk factor for an additional 22% of patients. The pathogenesis of lung injury due to acid aspiration has been delineated. 266 , 267 The presence of acidic contents in the lung induces the release of proinflammatory cytokines, including TNF-α and IL-8. These and other cytokines recruit neutrophils into the lung. Activated neutrophils appear to be the key mediators of acute lung injury after acid aspiration, although a role for complement has also been demonstrated. 268 Although aspiration may be a witnessed event, the majority of episodes are silent and are brought to medical attention by their sequelae. 267 Three major syndromes are recognized as a consequence of aspiration: chemical pneumonitis, bronchial obstruction secondary to aspiration of particulate matter, and bacterial aspiration pneumonia. Aspiration may be associated with the acute respiratory distress syndrome, atelectasis, bronchial hyperreactivity, and fibrosis. Although chemical pneumonitis and mechanical obstruction usually cause acute symptoms, aspiration pneumonia is more insidious, with symptoms usually occurring gradually several days after the initial episode of aspiration. Pneumonitis, necrotizing pneumonia, abscess, and empyema are common. Symptoms often include fever, weight loss, and productive cough. Foul-smelling or putrid sputum occurs commonly. 269 Anemia and an elevated white blood cell count are frequent associated findings. The bacteriologic findings in aspiration pneumonia reflect the microbiota of the oropharynx, and the importance of periodontal disease in this regard has been noted. Studies performed in the 1970s on patients with indolent disease using the technique of transtracheal aspiration and analysis in anaerobic research laboratories documented anaerobic involvement in the majority of cases either alone or in combination with oral aerobic or facultative anaerobes. 270 Bacteroides spp., Porphyromonas spp., Prevotella melaninogenica, Fusobacterium spp., and anaerobic gram-positive cocci are the predominant anaerobes isolated. In community-acquired aspiration pneumonia, Streptococcus spp. and H. influenzae are the most common aerobic isolates. In contrast, gram-negative bacilli (including P. aeruginosa ) and S. aureus are the most commonly isolated aerobes from nosocomial aspiration pneumonia including VAP, as well as pneumonia occurring in nursing home patients. 77 , 222 Eosinophilic Pneumonias Pulmonary infiltrates with eosinophilia (PIE), also called eosinophilic pneumonia, is a syndrome associated with a variety of clinical entities, only some of which have an infectious cause. 271 Pulmonary eosinophilia with transient, peripheral pulmonary infiltrates and minimal symptoms (Löffler's syndrome) has been associated with Ascaris, Strongyloides, and hookworm infections. Ascaris is probably the leading parasitic cause of the syndrome worldwide. Prolonged pulmonary eosinophilia associated with weight loss, fever, cough, and dyspnea may be due to tuberculosis, brucellosis, psittacosis, coccidioidomycosis, histoplasmosis, and parasitic infections including ascariasis, strongyloidiasis, paragonimiasis, echinococcosis, visceral larval migrans, cutaneous larva migrans, and infections with Schistosoma, Dirofilaria immitis, and Ancylostoma species. Noninfectious causes include drug allergy, sarcoidosis, eosinophilic leukemia, Hodgkin's disease, paraneoplastic syndromes, and hypersensitivity pneumonitis (e.g., pigeon breeders' disease). A PIE syndrome has been associated with Pneumocystis pneumonia. 272 Acute eosinophilic pneumonia is a distinct clinical entity occurring in younger (20- to 45-year-old), otherwise healthy individuals. 273 It is marked by the acute onset of dyspnea, nonproductive cough, fever, severe hypoxia, and chest pain and can require ICU care and mechanical ventilation. Although leukocytosis is common, peripheral eosinophilia is typically minimal. Bilateral, diffuse pulmonary infiltrates are common. Radiographic abnormalities usually begin as interstitial infiltrates that progress to alveolar infiltrates. Chest CT reveals bilateral opacities. BAL yields marked (27% to 81%) eosinophilia, which is the diagnostic feature of the disease. Although most patients have received antibiotics, rapid stabilization occurs with corticosteroid use. It has been suggested that chronic eosinophilic pneumonia may represent a unique clinical entity that may be on a continuum between asthma and Churg-Strauss syndrome. 274 A subacute onset of cough, dyspnea, fever, and weight loss associated with peripheral eosinophilia are the common features. Unlike the situation in acute eosinophilic pneumonia, respiratory failure is rare. Peripheral as well as migratory infiltrates are commonly seen on radiographs. Interstitial infiltrate and alveolar exudates with a predominance of eosinophils are characteristic pathologic features. A rapid response to corticosteroids has been reported. Tropical pulmonary eosinophilia consists of myalgia, fatigue, weight loss, and anorexia associated with cough, frequently with nocturnal exacerbations, wheezing, dyspnea, and marked peripheral eosinophilia in patients who have lived in or visited the tropics. Most cases are believed to represent immunologic hyperresponsiveness to microfilarial infection with Wuchereria bancrofti or Brugia malayi. Radiographic changes are distinctive and include increased interstitial markings with 2- to 4-mm nodules throughout the lungs with preferential involvement of the bases. Therapy is with diethylcarbamazine (see Chapter 289). Other causes of PIE syndrome include bronchopulmonary mycosis, which should be suspected when a patient with PIE presents with asthma in conjunction with bronchiectasis, recurrent expectoration of brown mucus plugs, and peripheral eosinophilia. 271 , 275 Although predominantly associated with chronic bronchial colonization with Aspergillus species, it can be seen in conjunction with other fungi such as Scedosporium apiospermum and Cladosporium herbarum. Patients with the Churg-Strauss syndrome frequently have eosinophilia along with allergic angiitis and granulomatosis and present with asthma, diffuse pulmonary infiltrates, and multiorgan involvement. Hypereosinophilic syndrome, eosinophilic granuloma (also known as primary pulmonary Langerhans cell histiocytosis granulomatosis), bronchiolitis obliterans organizing pneumonia, Sjögren's syndrome, and postirradiation pneumonitis are unusual cases of pulmonary infiltrates with eosinophilia. Hospital-Acquired Pneumonia HAP has been the second most common cause of nosocomial infection and is associated with significant morbidity and mortality. 276 , 277 It is a leading cause of infection-related deaths in hospitalized patients, with attributable mortality rates of 20% to 33% reported. Higher mortality rates have been observed when patients are bacteremic or have pneumonia caused by P. aeruginosa or Acinetobacter spp. The morbidity associated with nosocomial pneumonia includes longer hospital stays (average, 7 to 9 days) and an estimated attributable cost of approximately $24,000. 77 , 278 Risk factors for the development of nosocomial pneumonia have been categorized as patient related, infection control related, or intervention related. Patient-related risk factors include age older than 70 years, severe underlying disease, malnutrition, coma, metabolic acidosis, and the presence of any of a number of comorbid illnesses (e.g., COPD, alcoholism, azotemia, central nervous system dysfunction). Infection control–related risk factors include a lack of hand hygiene and glove-use practices and the use of contaminated respiratory equipment. Intervention-related risk factors involve those procedures and therapies that undermine normal host defenses or allow the host to be exposed to large inocula of bacteria. Sedatives and narcotics may lead to aspiration; corticosteroids and cytotoxic agents blunt the normal host response to infection; and the prolonged use of antibiotics engenders resistance. Surgical procedures, especially involving the chest and abdomen, are associated with changes in host defenses that predispose to pneumonia. The use of ventilator support is perhaps the greatest risk factor for the development of nosocomial pneumonia, with VAP occurring in 9% to 40% of intubated patients. 276 Data suggest that there is a 1% to 3% per day risk for developing pneumonia while on a ventilator, with a higher risk during the first 5 days of intubation. 279 The use of antacids and H2 blockers that raise the gastric pH has been shown to increase stomach colonization with aerobic gram-negative rods. 280 Whether this leads to an increase in nosocomial pneumonia remains controversial. 36 , 37 The percentage of patients with VAP caused by organisms initially found in the stomach ranges from 0% to 55%. 280 Aerobic gram-negative bacilli cause 50% to 60% of cases of nosocomial pneumonia, with members of the Enterobacteriaceae ( K. pneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens, Acinetobacter spp., Enterobacter spp.) and Pseudomonas species accounting for the majority of these. 74 There is an increasing prevalence of high-level antibiotic resistance among these gram-negative bacilli, and the relative incidence of pneumonia due to multidrug-resistant bacteria varies between institutions and occasionally between units within an institution. 276 Risk factors for such pathogens include the length of hospitalization, prior antibiotic exposure, and local epidemiologic factors. S. aureus causes 13% to 40% of nosocomial pneumonia, and MRSA is now a major pathogen in this setting. 74 , 77 In contrast to their prominent role in CAP, S. pneumoniae and H. influenzae together cause only 5% to 15% of nosocomial pneumonias in most studies and are predominantly seen in infections developing early in the hospital course. There is only limited information comparing the bacteriology of VAP and non–ventilator-associated HAP, but the available data indicate that the general distribution of aerobic pathogens is relatively comparable, although there is an increase in the relative prevalence of gram-negative pathogens in patients with VAP, particularly nonenteric gram-negative bacilli. 74 , 281 Although the use of sedatives, feeding tubes, and endotracheal tubes are all risk factors for the development of aspiration pneumonia, the lack of support for anaerobic microbiologic testing has led to a paucity of data on the roles of anaerobic bacteria in HAP. 267 One study performed in the early 1970s at a veterans hospital with bacteriologic analysis in a research laboratory documented anaerobes in up to 35% of cases of nosocomial pneumonia, and a second, more recent study identified anaerobes in conjunctions with aerobic microbiota in 23% of patients with VAP. 282 , 283 These organisms should be considered when aspiration is likely to have occurred. Pneumonia caused by Legionella species may occur sporadically or as part of outbreaks. The respiratory viruses influenza, parainfluenza, adenovirus, and RSV can cause sporadic nosocomial pneumonia as well as occasional institutional outbreaks. There has been the recognition that herpes simplex virus and cytomegalovirus can reactivate and be identified in patients with severe VAP or the adult respiratory distress syndrome. The significance of this reactivation remains uncertain at this time. 276 Recent consensus guidelines have been established concerning the risks, etiology, diagnostic workup, and therapies for nosocomial pneumonia and VAP. 77 A more in-depth review is presented in Chapter 303. Pneumonia in the Immunosuppressed Host Pneumonia in the immunocompromised host is perhaps the most complex of all the pneumonia syndromes, because it represents the interaction of host defense defects engendered by the underlying disease as well as the chemotherapy of that disease, exposure to potential pathogens in the community and within the hospital setting, and reactivation of infectious processes that had previously been dormant. CAP, atypical pneumonia, aspiration pneumonia, and nosocomial pneumonia all take place in the compromised host. A large number of bacterial, fungal, viral, and noninfectious causes must be considered (see further discussion in Chapters 309 to 313Chapter 309Chapter 310Chapter 311Chapter 312Chapter 313). Therapy The first decision confronting the clinician is whether the patient presenting with respiratory symptoms in fact has pneumonia. The difficulties in establishing a diagnosis on clinical grounds and the potential problem of overprescribing empirical antibiotics for all patients with respiratory findings have been reviewed. A chest radiograph is usually necessary to establish a definitive diagnosis of pneumonia and should be performed in patients considered ill enough to be considered for hospitalization. 284 The next decisions are whether the patient is to be hospitalized and if so whether the patient needs admission to an ICU, both of which have consequences as to the level of treatment, the cost of care, and associated iatrogenesis. Inpatient management can increase the cost of care for CAP up to 25-fold, is less desirable to patients, and for low-risk patients is associated with comparable clinical outcomes. 285 , 286 , 287 Numerous severity assessment tools have now been developed to identify patients with more severe disease requiring hospitalization or ICU admission. 234 , 241 , 242 , 243 , 244 , 245 , 246 The earlier assessment tools incorporated a combination of clinical, epidemiologic, laboratory, and radiographic parameters to assess; and the more recently developed tools have focused on clinical parameters alone that can be evaluated at the bedside. One of the earliest developed and most widely used assessment tool is the PORT score, also known as the pneumonia severity index (PSI). 234 This system uses 20 clinical parameters in categories of age, presence of comorbidities, vital sign abnormalities, and laboratory and radiologic findings. Based on a point system, five prognostic groups (I to V) were defined. The lowest scores (group I) are associated with low mortality (0.1%) and the highest scores (group V) are associated with the highest mortality (27%). As a guideline for hospitalization, patients in groups I and II are usually treated as outpatients, patients in group III are in a "borderline" group, and patients in groups IV and V are admitted to either a routine ward or ICU. The PORT score or PSI has been validated and widely endorsed. 84 , 288 , 289 A randomized controlled trial has confirmed that patients in PSI groups II or III who do not have respiratory failure, complicated pleural effusions, or unstable comorbid conditions have comparable clinical outcomes whether managed as inpatients or outpatients. 286 A limitation of the PSI system is its relative complexity, and several alternative scoring systems have now been developed that utilize more readily obtainable parameters. These include the CURB score, the CURB plus age greater than 65 score (CURB-65), and the CURB-65 score without the urea level (CRB-65). 241 , 242 , 243 The CURB score was formulated from the British Thoracic Society (BTS) study and uses four clinical parameters, which include new onset of confusion, urea level greater than 7 mmol/L, respiratory rate greater than 30 breaths/min, and systolic blood pressure less than 90 mm Hg or a diastolic blood pressure less than 60 mm Hg. The presence of two or more criteria suggested an increased mortality and defined severe pneumonia. The CURB-65 score, which was developed later, added age older than 65 years to the system with the presence of more than three parameters leading to prediction of increased mortality, and the CRB-65 modified this index to eliminate inclusion of blood urea determination, making the index free of laboratory testing and allowing for patient assessment completely at the bedside. There have been several comparative trials of the various severity-assessment indices assessing their utility. 290 These indicate that the PSI, CURB-65, and CRB-65 tools appear relatively comparable in predicting high and low mortality groupings. Both the IDSA/ATS and BTS guidelines now support the use of these three severity illness scores for the assessment of patients with CAP. 84 , 284 The CRB-65 that does not require laboratory testing appears optimal for community or primary care settings. There is evidence that the use of these severity assessment indices is increasing the percentage of patients with CAP who are receiving outpatient treatment. 291 However, it is critical to recognize that any severity assessment index serves only as a guideline, not as an absolute. Clinical judgment regarding presence of other comorbid conditions, hypoxia, stability of the home situation, ability to take oral medications, reliability in taking medication, likelihood of returning for follow-up, and likelihood of calling for help when needed all play a role in deciding whether a patient can be treated at home or in a hospital. In addition, the initial validation studies for the PSI, CURB-65, and CRB-65 indexes excluded patients who were HIV infected or otherwise immunocompromised or who had recently been hospitalized. There have recently been several studies on the utility of these indices for patients with HCAP that indicate that they can be used for such patients who are not immunocompromised, 292 , 293 but the data are still very limited for HCAP and these indices are not applicable for immunocompromised patients. The PSI, CURB-65, and CRB-65 indices all predict the risk for mortality due to CAP and not the appropriate level of inpatient care required for a patient. As noted previously, approximately 10% of patients with CAP are admitted to ICUs. Several additional indices have more recently been devised to define those patients who could benefit from this level of care. These include the severe community-acquired pneumonia (SCAP) score, the SMART-COP score, and the risk of early admission to the intensive care unit (REA-ICU) index. 244 , 245 , 246 In addition, the IDSA/ATS guideline has recommended major and minor criteria to define patients who should be directly admitted to an ICU that have now been independently validated. 84 , 294 The major criteria are either septic shock requiring vasopressor support or acute respiratory failure requiring invasive mechanical ventilation. The presence of three of the following minor criteria also were indicative of the need for ICU care: increased respiratory rate greater than or equal to 30 breaths/min, low Pa o 2 /fraction of inspired oxygen ratio (≤250), multilobar infiltrates, confusion/disorientation, uremia (blood urea nitrogen level ≥20 mg/dL), leukopenia (white blood cell count 7 yr old Inpatient (All Ages) Fully Immunized against S. pneumoniae and H. influenzae , and Low Local Level of Antibiotic Resistance in S. pneumoniae Presumed bacterial Ampicillin or penicillin G or ceftriaxone or cefotaxime; add vancomycin or clindamycin for suspected community-associated MRSA Presumed atypical Azithromycin (add β-lactam, if diagnosis of atypical pneumonia is in doubt); or clarithromycin or erythromycin; or doxycycline for children >7 yr old; or levofloxacin for children who have reached growth maturity or who cannot tolerate macrolides Not Fully Immunized against S. pneumoniae and H. influenzae , or High Local Level of Antibiotic Resistance in S. pneumoniae Presumed bacterial Ceftriaxone or cefotaxime; addition of vancomycin or clindamycin for suspected community-associated MRSA; alternative: levofloxacin; addition of vancomycin or clindamycin for suspected community-associated MRSA Presumed atypical Azithromycin (add β-lactam if diagnosis in doubt); or clarithromycin or erythromycin; or doxycycline for children >7 yr old; or levofloxacin for children who have reached growth maturity or who cannot tolerate macrolides MRSA, methicillin-resistant S. aureus. Adapted from Bradley JS, Byington CL, Shah SS, et al. The management of community-acquired pneumonia in infants and children older than 3 months of age: clinical practice guidelines by the Pediatric Infectious Diseases Society and the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 2011;53:e25-e76. For a patient who does not require hospitalization and for whom no clear distinction between typical (e.g., pneumococcal) and atypical (mycoplasmal, chlamydial) pneumonia can be made, both types of organisms should be covered. Risks for the presence of drug-resistant S. pneumoniae should be assessed. Use of previous anti­biotics, especially a β-lactam, macrolide, or fluoroquinolone in the prior 3 to 6 months, as well as residence in a long-term care facility are predictive of the presence of resistance to β-lactams, macrolides, and fluoroquinolones. 306 , 307 , 308 Where risk for drug-resistant S. pneumoniae infection is low, oral β-lactam agents (high-dose amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, cefuroxime axetil), azalides/macrolides (azithromycin, clarithromycin, or erythromycin), or respiratory tract quinolones (levofloxacin, gemifloxacin, moxifloxacin) are all adequate choices. Doxycycline and trimethoprim-sulfamethoxazole may be used, but there is concern for an increasing incidence of resistance to both of these agents in strains of pneumococci. 84 , 284 Increased resistance to the azalide/macrolide agents due to blockage of the ribosomal binding area encoded by the ermB gene is also becoming a problem in S. pneumoniae, and therapeutic failures have been noted. 309 Although it has been suggested that these agents may be used as long as the resistance rate is less than 25%, recent analysis suggests that that resistance level is too high and will be associated with increased morbidity and mortality. 310 For patients with an increased risk for poor outcome because of age or underlying disease, or when the risk for infection with resistant pneumococci exists owing to prior antibiotic use, the respiratory tract quinolones are the agents most likely to be effective. They currently are active against more than 99% of strains of S. pneumoniae, including penicillin-resistant strains, and they have the added benefit of activity against atypical agents. Although increasing resistance is a potential problem with an increased use of quinolones, it has not yet emerged as a significant problem. A β-lactam plus a macrolide is a comparable regimen. Regardless of the initial choice of antibiotic, once an organism is isolated, coverage should be narrowed down, if possible, on the basis of susceptibility test results. Patients who are ill enough to require hospitalization should be treated with parenteral agents that cover the likely pathogens. Whether there is a benefit for antibiotic combinations in this setting remains an ongoing question. Combination therapy with β-lactam antibiotics and macrolides, especially azithromycin, had been associated in some studies with decreased mortality and decreased length of hospital stay. However, this benefit has been decreased or not apparent in randomized controlled trials or studies addressing guideline-concordant therapy. 311 , 312 , 313 In addition, the potential slight benefit of combination therapy with azithromycin is counterbalanced by a small increased risk for sudden death due to cardiovascular events in individuals with preexisting cardiovascular risk factors. 314 , 315 , 316 Our choice for most individuals would be a β-lactam (ceftriaxone or cefotaxime) plus azithromycin except in patients at high risk for cardiovascular disease when a respiratory fluoroquinolone seems preferable. If there are factors that suggest a specific etiology, or a Gram stain is revealing, specific antibiotic coverage should be used. Although these regimens represent the basic course of therapy, specific clinical circumstances may warrant variation. For example, S. aureus pneumonia including community-associated MRSA should be considered during an influenza outbreak even though S. pneumoniae is still the major etiologic agent. Agents with activity against MRSA should be utilized if there is reason to suspect its presence as the cause of pneumonia. Linezolid and vancomycin are the best-studied agents for treatment of MRSA pneumonia, and clindamycin has also appeared effective in children. 305 , 317 A prospective controlled trial comparing linezolid and vancomycin with HAP or HCAP due to MRSA found a better initial clinical outcome for patients treated with linezolid but no difference in mortality at 60 days. 318 A new cephalosporin, ceftaroline, has good in vitro activity against MRSA isolates and may prove to be another alternative for treatment of MRSA pneumonia, although clinical trials of its use in this setting are not currently available. 319 Should the patient be found to have methicillin-susceptible S. aureus pneumonia, treatment with nafcillin or oxacillin is preferred. Current clinical efficacy data on the use of trimethoprim-sulfamethoxazole, fluoroquinolones, doxycycline, or tigecycline for treatment of staphylococcal pneumonia are not available. Where anaerobic aspiration pneumonia is a possibility, such as in patients developing pneumonia after loss of consciousness due to drugs, alcohol, or neurologic disease, agents with activity against oral anaerobes are needed, including ampicillin-sulbactam or clindamycin. Otherwise, clinical trials suggest that targeted anaerobic coverage is not required for the majority of cases of CAP. 84 Aerobic gram-negative bacilli including P. aeruginosa cause 7% to 18% of CAP cases. Risk factors previously noted for gram-negative pneumonia should therefore be sought. When gram-negative bacilli are suspected, infection with P. aeruginosa should be a concern and therapy with an antipseudomonal β-lactam compound (e.g., cefepime, ceftazidime, piperacillin-tazobactam, imipenem, or meropenem) is a reasonable choice. When Pseudomonas involvement can be excluded, agents such as cefotaxime, ceftriaxone, or ertapenem could be considered. Debate exists as to whether combination therapy with both a β-lactam agent and either an aminoglycoside or quinolone will improve the outcome of gram-negative pneumonia. Data exist to support both sides of the controversy, although there is increasing evidence that initial combination therapy decreases the risk for initially inappropriate therapy. 320 , 321 , 322 , 323 We favor initial combination therapy for patients who are severely ill, at least until culture results from sputum and blood are available to confirm that an agent is being given with in vitro activity against the presumed organisms. In patients who are allergic to penicillin, aztreonam with a respiratory tract fluoroquinolone, with or without an aminoglycoside, could be used. In the patient admitted to an ICU, therapy should be directed against S. pneumoniae, penicillin-resistant strains, Legionella spp., gram-negative rods, and M. pneumoniae. If infection with P. aeruginosa is unlikely (no recent hospitalization, no recent antibiotic use, no pulmonary comorbidities, no gram-negative rods on Gram stain), a β-lactam plus either an azalide/macrolide or a respiratory tract fluoroquinolone would be therapies of first choice. Ceftriaxone or cefotaxime would be reasonable choices for the β-lactam. When Pseudomonas infection cannot be excluded, an antipseudomonal β-lactam (cefepime, imipenem, meropenem, doripenem, or piperacillin-tazobactam) plus a respiratory tract fluoroquinolone or azalide/macrolide could be used. We favor cefepime or piperacillin-tazobactam plus a respiratory tract fluoroquinolone. An aminoglycoside could be added as a third agent for synergy against Pseudomonas. Evidence in the literature favoring one regimen over any other is lacking. Timing of Antibiotics In 1997, a retrospective review of more than 14,000 Medicare patient hospitalizations suggested that antibiotic therapy given within 8 hours of presentation was associated with a decreased mortality. 324 A second retrospective study of similar design in 2004 showed that antibiotics given within 4 hours of presentation would result in lower mortality. 325 Neither study corrected for the cause of the pneumonia nor the antibiotics used. Despite the lack of a prospective randomized study, advising and regulatory agencies, including the Joint Commission and the Centers for Medicare and Medicaid Services, began to use the 4-hour rule as a core quality measure. Subsequent studies found that attempting to meet this performance standard led to increased misdiagnoses and potentially inappropriate antibiotic prescribing in emergency department patients, and failure of hospitals to meet this standard was not associated with an increase in inpatient mortality in patients admitted with CAP. 326 , 327 , 328 This hospital performance standard has subsequently been eliminated. Still, there is strong evidence that delays in antibiotic therapy can impact the outcome of patients with sepsis. 329 The IDSA/ATS guidelines currently recommend that antibiotic therapy for pneumonia should be started as soon as the diagnosis is considered likely. 84 Duration of Treatment and Use of Clinical Practice Guidelines Until recently, the duration of antibiotic therapy for pneumonia has been based on anecdotal patterns of behavior. There have been few studies addressing the appropriate duration of treatment, but the classic 10- to 14-day duration of care is unsupported by evidence. 330 Recent data now indicate that clinical stability (defined as normalization of previously abnormal physiologic parameters, including heart rate, respiratory rate, oxygenation, blood pressure, mental state, and ability to care for oneself) occurs relatively quickly for patients hospitalized with CAP (see Table 69-6 ). 331 Most physiologic abnormalities will correct in 2 to 3 days, and normalization of all physiologic abnormalities generally occurs in 5 to 7 days. Patients with more severe illness generally take longer to stabilize. The addition of monitoring for an at least 50% reduction in C-reactive protein has been suggested as an additional measure to define clinical stability but appeared beneficial only for patients with severe disease, and the cost-effectiveness of this approach has not been assessed. 332 Overall, once stability is achieved, clinical relapses serious enough to require ICU care occur less than 1% of the time. TABLE 69-6 Evidence of Clinical Stability Temperature ≤37.8° C (100° F) Pulse ≤100 beats/min Respiratory rate ≤24 breaths/min Systolic blood pressure ≥90 mm Hg Arterial oxygen saturation ≥90% or P o 2 ≥60 mm Hg on room air Ability to maintain oral intake Normal mental status Data from Halm EA, Fine MJ, Marrie TJ, et al. Time to clinical stability in patients hospitalized with community-acquired pneumonia: implications for practice guidelines. JAMA. 1998;279:1452-1457; and Mandell LA, Wunderink RG, Anzueto A, et al. Infectious Diseases Society of America/American Thoracic Society consensus guidelines on the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis. 2007;44(suppl 2):S27-S72. Oral antibiotic therapy is safe after clinical stability has been reached even in patients with severe CAP. 333 , 334 , 335 There is no clear usefulness of observing a patient within the hospital after a switch to oral therapy. 336 However, it is important to recognize that discharging patients before stability has been reached may lead to increased rehospitalization and death. 337 , 338 Using the same definitions of clinical stability, it has been shown that the greater the number of factors remaining abnormal at discharge, the greater is the chance of readmission or death. There are few studies on the duration of therapy for pneumonia that are prospective, well-controlled, use the same antibiotic and dosing schedule, and only vary the duration of therapy. However, these few studies have found that a period of less than 7 days and as short as 3 days of azithromycin is just as effective as longer durations of therapy for mild to moderate CAP. 339 , 340 With age, presence of underlying comorbidities including immune compromise, and more virulent pathogens, clinical stability may be delayed; therefore, duration of antibiotic therapy may be lengthened. Currently, for adult patients with CAP the IDSA/ATS guidelines recommend a minimum of at least 5 days of antibiotic therapy, with the patient being afebrile for between 48 and 72 hours and lacking no more than one sign of clinical stability. 84 Similarly, the BTS guidelines recommend 7 days of appropriate antibiotic therapy for patients with low- or moderate-severity CAP treated either as outpatients or inpatients. 284 Longer therapy should be considered for patients who have high-severity disease, bacteremic S. aureus pneumonia, or cavitary disease. The Pediatric Infectious Disease Society/IDSA guidelines for CAP in children note that 10 days of treatment is best studied in children, although shorter course treatment is likely effective. 305 Although early studies found limited benefit to concordance of process of care measures and clinical outcomes in pneumonia, more recent evidence indicates that compliance with clinical practice guidelines for both CAP and HCAP is associated with decreased inpatient mortality and inpatient length of stay. 142 , 312 , 313 , 341 , 342 , 343 , 344 The use of inpatient critical pathways based on clinical practice guidelines can reduce inpatient length of stay without increasing adverse effects. 288 , 345 , 346 Once discharged, outpatient follow-up should be coordinated, because most patients with CAP will have some related residual symptoms, including fever, cough, shortness of breath, chest pain, sputum production, fatigue, or gastrointestinal symptoms. Comorbidities, particularly cardiopulmonary or neurologic disease, are the most frequent reason for subsequent early readmission among patients who achieve clinical stability. 338 , 347 Adjunctive Therapy A robust inflammatory response to an invading pathogen can lead to a potentially worse outcome in pneumonia, and the use of anti-inflammatory agents could have potential benefits, as demonstrated with the improved outcome with the addition of corticosteroid therapy for Pneumocystis pneumonia. The macrolide family has been shown to have in vitro immunomodulatory activity, which may contribute to their efficacy in CAP. 348 A number of randomized controlled trials have now investigated the efficacy of corticosteroid therapy for CAP using differing dosages and agents. To date there is no evidence of an impact on overall mortality, although corticosteroids may shorten overall inpatient length of stay by 1 day. 349 , 350 Statins also possess anti-inflammatory properties, and their impact on CAP has been assessed in observational studies. Although there was initial suggestive evidence of benefit, those studies were not randomized and did not control for other potentially important variables, such as underlying health or socioeconomic status. 351 A more recent study that controlled for these factors found no impact of recent statin use on the incidence of severe sepsis or mortality from CAP. 352 Although other adjunctive therapies have been described, including the use of activated protein C, noninvasive mechanical ventilation, anticoagulants, immunoglobulin, granulocyte colony-stimulating factor, probiotics, chest physiotherapy, antiplatelet drugs, over-the-counter cough medications, β 2 -agonists, inhaled nitric oxide, and angiotensin-converting enzyme inhibitors, in clinical trials none of these approaches has been shown to have a significant role in therapy. 353 Antimicrobial Therapy Although mild cases can be self-limited, the use of antimicrobial agents is the mainstay of treatment of pneumonia. In reducing the microbial burden, antimicrobial therapy can reduce the duration of illness, risk for complications, and the mortality rate. If diagnostic studies, as described previously, yield a likely cause, specific narrow-spectrum therapy can be initiated. However, for most patients, a specific diagnosis cannot be established with certainty prior to the onset of therapy and an antibiotic regimen must be selected empirically. In addition to targeting the likely expected pathogens, primary considerations in selecting specific agents for treating pneumonia are the intrapulmonary penetration of differing agents and the pharmacokinetic and pharmacodynamic characteristics. With a few exceptions, most commercially available antimicrobial agents achieve adequate intrapulmonary concentrations to be used for treatment of pneumonia, although there can be significant differences in tissue penetration. 295 One agent, daptomycin, has been shown to bind to pulmonary surfactant, thereby decreasing its efficacy in treating pneumonia. 296 Pharmacokinetics and pharmacodynamics are important in defining appropriate antibiotic dosing. β-Lactam compounds are time-dependent killers; when a penicillin, cephalosporin, or carbapenem is being used, the active drug levels need to be above the minimal inhibitory concentration (MIC) of the organism being treated for 40% to 50% of the dosing interval for an optimal outcome. 297 , 298 Parenteral administration of aminoglycosides leads to low concentration in bronchial fluids, and when given using traditional dosing serum peak levels of at least 6 µg/mL for gentamicin or tobramycin and 24 µg/mL for amikacin are needed for successful outcomes in treating gram-negative pneumonia. 299 However, as aminoglycosides show concentration-dependent killing with a significant postantibiotic effect, improved clinical outcomes can be achieved by using pharmacodynamic modeling to optimize dosing. 297 , 300 A retrospective pharmacodynamic/pharmacokinetic analysis of the efficacy of vancomycin for treatment of S. aureus pneumonia indicated that clinical cure correlates with a 24-hour area under the curve (AUC)/MIC ratio of greater than or equal to 400 and indicates that optimal dosing should target a vancomycin trough level of 15 to 20 µg/mL. 301 , 302 Unfortunately, even this high-level vancomycin therapy may not be effective in treating strains of S. aureus that have MICs greater than or equal to 2 µg/mL. 303 The empirical antimicrobial regimen selected to treat acute pneumonia is dependent on the clinical situation. Several professional societies including the IDSA, the ATS, the BTS, and the Pediatric Infectious Disease Society have now developed guidelines for management of CAP, and the IDSA and ATS have published joint guidelines on managing HAP, VAP, and HCAP in adults. 77 , 84 , 284 , 304 , 305 For adults with CAP, the IDSA/ATS guidelines and BTS both recommend stratifying patients for outpatient versus inpatient treatment based on PSI or CURB-65 scoring systems, although the BTS recommends the use of the CRB-65 score for patients seen in the community or primary care setting. In all of the guidelines, recognition of the most likely etiologic agent in any given clinical situation and recognition of the organisms most likely to cause morbidity and mortality are emphasized. Finally, prevalence of common antibiotic resistance patterns and risks of acquisition are recognized. Empirical antibiotic therapy for CAP in children and adults, as well as for HCAP, is reviewed in Tables 69-4 and 69-5 . The reader is referred to Chapter 303 for recommendations for empirical management of HAP. TABLE 69-4 Guide to Empirical Choice of Antimicrobial Agent for Treating Adult Patients with Community-Acquired Pneumonia or Health Care–Acquired Pneumonia PATIENT CHARACTERISTICS PREFERRED TREATMENT OPTIONS Outpatient Previously Healthy No recent antibiotic therapy Macrolide a or doxycycline (100 mg 2 times/day) Recent antibiotic therapy b A respiratory fluoroquinolone c alone, an advanced macrolide d plus oral β-lactam e Comorbidities (COPD, Diabetes, Renal Failure or Congestive Heart Failure, or Malignancy) No recent antibiotic therapy An advanced macrolide plus oral β-lactam or a respiratory fluoroquinolone Recent antibiotic therapy A respiratory fluoroquinolone alone or an advanced macrolide plus a β-lactam Suspected aspiration with infection Amoxicillin-clavulanate or clindamycin (600 mg IV q8h or 300 mg PO q6h) Influenza with bacterial superinfection Vancomycin, linezolid, or other coverage for MRSA, including community-acquired MRSA f Inpatient Medical Ward No recent antibiotic therapy A respiratory fluoroquinolone alone or an advanced macrolide plus an intravenous β-lactam g Recent antibiotic therapy An advanced macrolide plus an intravenous β-lactam, or a respiratory fluoroquinolone alone (regimen selected will depend on nature of recent antibiotic therapy) Intensive Care Unit (ICU) Pseudomonas infection is not a concern A β-lactam g plus either an advanced macrolide or a respiratory fluoroquinolone Pseudomonas infection is not a concern but patient has a β-lactam allergy A respiratory fluoroquinolone, with or without clindamycin Pseudomonas infection is a concern h (cystic fibrosis, impaired host defenses) Either (1) an antipseudomonal β-lactam i plus ciprofloxacin (400 mg IV q8h or 750 mg PO q12h), or (2) an antipseudomonal agent plus an aminoglycoside j plus a respiratory fluoroquinolone or a macrolide Pseudomonas infection is a concern but the patient has a β-lactam allergy Aztreonam (2 g IV q8h) plus aminoglycoside plus a respiratory fluoroquinolone Health Care–Associated Pneumonia k — Either (1) an antipseudomonal β-lactam plus ciprofloxacin or levofloxacin or (2) an antipseudomonal agent plus an aminoglycoside plus a respiratory fluoroquinolone or a macrolide plus vancomycin or linezolid (for MRSA coverage) COPD, chronic obstructive pulmonary disease; MRSA, methicillin-resistant S. aureus . Note: All dosages are usual adult doses and may require adjustment in relation to renal or hepatic function, a patient's body mass index, or drug-drug interactions. a Azithromycin, clarithromycin, or erythromycin. b That is, the patient was given a course of antibiotic(s) for treatment of any infection within the past 3 months, excluding the current episode of infection. Such treatment is a risk factor for drug-resistant Streptococcus pneumoniae and possibly for infection with gram-negative bacilli. Depending on the class of antibiotics recently given, one or another of the suggested options may be selected. Recent use of a fluoroquinolone should dictate selection of a nonfluoroquinolone regimen and vice versa. c Moxifloxacin (400 mg once daily), gemifloxacin (320 mg once daily), or levofloxacin (750 mg once daily). d Azithromycin (500 mg once daily), clarithromycin (250-500 mg twice daily), erythromycin (250-500 mg four times a day). e High-dose amoxicillin (1 g three times a day), high-dose amoxicillin-clavulanate (2 g twice daily), cefpodoxime (200 mg twice daily), or cefuroxime (500 mg twice daily). f Vancomycin dosing should target a vancomycin trough level of 15 to 20 µg/mL; linezolid (600 mg twice daily). g Cefotaxime (1-2 g IV q4-8h), ceftriaxone (1 g IV daily), ampicillin (1-2 g IV q4-6h), ampicillin-sulbactam (1.5-3 g IV q6h), or ertapenem (1 g IV daily). h Risk factors for Pseudomonas infection include severe structural lung disease (e.g., bronchiectasis) and recent antibiotic therapy, health care–associated exposures or stay in hospital (especially in the ICU). For patients with community-acquired pneumonia in the ICU, coverage for S. pneumoniae and Legionella species must always be considered. i Piperacillin (3 g IV q4h), piperacillin-tazobactam (3.375 g IV q6h), imipenem (500-1000 mg IV q6h), meropenem (1-2 g IV q8h), ceftazidime (2 g IV q6-8h), or cefepime (1-2 g IV q8h) are excellent β-lactams and are adequate for most S. pneumoniae and H. influenzae infections. They may be preferred when there is concern for relatively unusual pathogens of community-acquired pneumonia, such as P. aeruginosa, Klebsiella species, and other gram-negative bacteria. j Data suggest that older adults receiving aminoglycosides have worse outcomes. Traditionally dosed aminoglycosides should achieve peak levels of at least 8 µg/mL for gentamicin or tobramycin and 25-35 µg/mL for amikacin and troughs less than 2 µg/mL for gentamicin and tobramycin and less than 10 µg/mL for amikacin. Once-daily dosing for gentamicin or tobramycin is 7 mg/kg IV with trough target 7 yr old Inpatient (All Ages) Fully Immunized against S. pneumoniae and H. influenzae , and Low Local Level of Antibiotic Resistance in S. pneumoniae Presumed bacterial Ampicillin or penicillin G or ceftriaxone or cefotaxime; add vancomycin or clindamycin for suspected community-associated MRSA Presumed atypical Azithromycin (add β-lactam, if diagnosis of atypical pneumonia is in doubt); or clarithromycin or erythromycin; or doxycycline for children >7 yr old; or levofloxacin for children who have reached growth maturity or who cannot tolerate macrolides Not Fully Immunized against S. pneumoniae and H. influenzae , or High Local Level of Antibiotic Resistance in S. pneumoniae Presumed bacterial Ceftriaxone or cefotaxime; addition of vancomycin or clindamycin for suspected community-associated MRSA; alternative: levofloxacin; addition of vancomycin or clindamycin for suspected community-associated MRSA Presumed atypical Azithromycin (add β-lactam if diagnosis in doubt); or clarithromycin or erythromycin; or doxycycline for children >7 yr old; or levofloxacin for children who have reached growth maturity or who cannot tolerate macrolides MRSA, methicillin-resistant S. aureus. Adapted from Bradley JS, Byington CL, Shah SS, et al. The management of community-acquired pneumonia in infants and children older than 3 months of age: clinical practice guidelines by the Pediatric Infectious Diseases Society and the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 2011;53:e25-e76. For a patient who does not require hospitalization and for whom no clear distinction between typical (e.g., pneumococcal) and atypical (mycoplasmal, chlamydial) pneumonia can be made, both types of organisms should be covered. Risks for the presence of drug-resistant S. pneumoniae should be assessed. Use of previous anti­biotics, especially a β-lactam, macrolide, or fluoroquinolone in the prior 3 to 6 months, as well as residence in a long-term care facility are predictive of the presence of resistance to β-lactams, macrolides, and fluoroquinolones. 306 , 307 , 308 Where risk for drug-resistant S. pneumoniae infection is low, oral β-lactam agents (high-dose amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, cefuroxime axetil), azalides/macrolides (azithromycin, clarithromycin, or erythromycin), or respiratory tract quinolones (levofloxacin, gemifloxacin, moxifloxacin) are all adequate choices. Doxycycline and trimethoprim-sulfamethoxazole may be used, but there is concern for an increasing incidence of resistance to both of these agents in strains of pneumococci. 84 , 284 Increased resistance to the azalide/macrolide agents due to blockage of the ribosomal binding area encoded by the ermB gene is also becoming a problem in S. pneumoniae, and therapeutic failures have been noted. 309 Although it has been suggested that these agents may be used as long as the resistance rate is less than 25%, recent analysis suggests that that resistance level is too high and will be associated with increased morbidity and mortality. 310 For patients with an increased risk for poor outcome because of age or underlying disease, or when the risk for infection with resistant pneumococci exists owing to prior antibiotic use, the respiratory tract quinolones are the agents most likely to be effective. They currently are active against more than 99% of strains of S. pneumoniae, including penicillin-resistant strains, and they have the added benefit of activity against atypical agents. Although increasing resistance is a potential problem with an increased use of quinolones, it has not yet emerged as a significant problem. A β-lactam plus a macrolide is a comparable regimen. Regardless of the initial choice of antibiotic, once an organism is isolated, coverage should be narrowed down, if possible, on the basis of susceptibility test results. Patients who are ill enough to require hospitalization should be treated with parenteral agents that cover the likely pathogens. Whether there is a benefit for antibiotic combinations in this setting remains an ongoing question. Combination therapy with β-lactam antibiotics and macrolides, especially azithromycin, had been associated in some studies with decreased mortality and decreased length of hospital stay. However, this benefit has been decreased or not apparent in randomized controlled trials or studies addressing guideline-concordant therapy. 311 , 312 , 313 In addition, the potential slight benefit of combination therapy with azithromycin is counterbalanced by a small increased risk for sudden death due to cardiovascular events in individuals with preexisting cardiovascular risk factors. 314 , 315 , 316 Our choice for most individuals would be a β-lactam (ceftriaxone or cefotaxime) plus azithromycin except in patients at high risk for cardiovascular disease when a respiratory fluoroquinolone seems preferable. If there are factors that suggest a specific etiology, or a Gram stain is revealing, specific antibiotic coverage should be used. Although these regimens represent the basic course of therapy, specific clinical circumstances may warrant variation. For example, S. aureus pneumonia including community-associated MRSA should be considered during an influenza outbreak even though S. pneumoniae is still the major etiologic agent. Agents with activity against MRSA should be utilized if there is reason to suspect its presence as the cause of pneumonia. Linezolid and vancomycin are the best-studied agents for treatment of MRSA pneumonia, and clindamycin has also appeared effective in children. 305 , 317 A prospective controlled trial comparing linezolid and vancomycin with HAP or HCAP due to MRSA found a better initial clinical outcome for patients treated with linezolid but no difference in mortality at 60 days. 318 A new cephalosporin, ceftaroline, has good in vitro activity against MRSA isolates and may prove to be another alternative for treatment of MRSA pneumonia, although clinical trials of its use in this setting are not currently available. 319 Should the patient be found to have methicillin-susceptible S. aureus pneumonia, treatment with nafcillin or oxacillin is preferred. Current clinical efficacy data on the use of trimethoprim-sulfamethoxazole, fluoroquinolones, doxycycline, or tigecycline for treatment of staphylococcal pneumonia are not available. Where anaerobic aspiration pneumonia is a possibility, such as in patients developing pneumonia after loss of consciousness due to drugs, alcohol, or neurologic disease, agents with activity against oral anaerobes are needed, including ampicillin-sulbactam or clindamycin. Otherwise, clinical trials suggest that targeted anaerobic coverage is not required for the majority of cases of CAP. 84 Aerobic gram-negative bacilli including P. aeruginosa cause 7% to 18% of CAP cases. Risk factors previously noted for gram-negative pneumonia should therefore be sought. When gram-negative bacilli are suspected, infection with P. aeruginosa should be a concern and therapy with an antipseudomonal β-lactam compound (e.g., cefepime, ceftazidime, piperacillin-tazobactam, imipenem, or meropenem) is a reasonable choice. When Pseudomonas involvement can be excluded, agents such as cefotaxime, ceftriaxone, or ertapenem could be considered. Debate exists as to whether combination therapy with both a β-lactam agent and either an aminoglycoside or quinolone will improve the outcome of gram-negative pneumonia. Data exist to support both sides of the controversy, although there is increasing evidence that initial combination therapy decreases the risk for initially inappropriate therapy. 320 , 321 , 322 , 323 We favor initial combination therapy for patients who are severely ill, at least until culture results from sputum and blood are available to confirm that an agent is being given with in vitro activity against the presumed organisms. In patients who are allergic to penicillin, aztreonam with a respiratory tract fluoroquinolone, with or without an aminoglycoside, could be used. In the patient admitted to an ICU, therapy should be directed against S. pneumoniae, penicillin-resistant strains, Legionella spp., gram-negative rods, and M. pneumoniae. If infection with P. aeruginosa is unlikely (no recent hospitalization, no recent antibiotic use, no pulmonary comorbidities, no gram-negative rods on Gram stain), a β-lactam plus either an azalide/macrolide or a respiratory tract fluoroquinolone would be therapies of first choice. Ceftriaxone or cefotaxime would be reasonable choices for the β-lactam. When Pseudomonas infection cannot be excluded, an antipseudomonal β-lactam (cefepime, imipenem, meropenem, doripenem, or piperacillin-tazobactam) plus a respiratory tract fluoroquinolone or azalide/macrolide could be used. We favor cefepime or piperacillin-tazobactam plus a respiratory tract fluoroquinolone. An aminoglycoside could be added as a third agent for synergy against Pseudomonas. Evidence in the literature favoring one regimen over any other is lacking. Timing of Antibiotics In 1997, a retrospective review of more than 14,000 Medicare patient hospitalizations suggested that antibiotic therapy given within 8 hours of presentation was associated with a decreased mortality. 324 A second retrospective study of similar design in 2004 showed that antibiotics given within 4 hours of presentation would result in lower mortality. 325 Neither study corrected for the cause of the pneumonia nor the antibiotics used. Despite the lack of a prospective randomized study, advising and regulatory agencies, including the Joint Commission and the Centers for Medicare and Medicaid Services, began to use the 4-hour rule as a core quality measure. Subsequent studies found that attempting to meet this performance standard led to increased misdiagnoses and potentially inappropriate antibiotic prescribing in emergency department patients, and failure of hospitals to meet this standard was not associated with an increase in inpatient mortality in patients admitted with CAP. 326 , 327 , 328 This hospital performance standard has subsequently been eliminated. Still, there is strong evidence that delays in antibiotic therapy can impact the outcome of patients with sepsis. 329 The IDSA/ATS guidelines currently recommend that antibiotic therapy for pneumonia should be started as soon as the diagnosis is considered likely. 84 Duration of Treatment and Use of Clinical Practice Guidelines Until recently, the duration of antibiotic therapy for pneumonia has been based on anecdotal patterns of behavior. There have been few studies addressing the appropriate duration of treatment, but the classic 10- to 14-day duration of care is unsupported by evidence. 330 Recent data now indicate that clinical stability (defined as normalization of previously abnormal physiologic parameters, including heart rate, respiratory rate, oxygenation, blood pressure, mental state, and ability to care for oneself) occurs relatively quickly for patients hospitalized with CAP (see Table 69-6 ). 331 Most physiologic abnormalities will correct in 2 to 3 days, and normalization of all physiologic abnormalities generally occurs in 5 to 7 days. Patients with more severe illness generally take longer to stabilize. The addition of monitoring for an at least 50% reduction in C-reactive protein has been suggested as an additional measure to define clinical stability but appeared beneficial only for patients with severe disease, and the cost-effectiveness of this approach has not been assessed. 332 Overall, once stability is achieved, clinical relapses serious enough to require ICU care occur less than 1% of the time. TABLE 69-6 Evidence of Clinical Stability Temperature ≤37.8° C (100° F) Pulse ≤100 beats/min Respiratory rate ≤24 breaths/min Systolic blood pressure ≥90 mm Hg Arterial oxygen saturation ≥90% or P o 2 ≥60 mm Hg on room air Ability to maintain oral intake Normal mental status Data from Halm EA, Fine MJ, Marrie TJ, et al. Time to clinical stability in patients hospitalized with community-acquired pneumonia: implications for practice guidelines. JAMA. 1998;279:1452-1457; and Mandell LA, Wunderink RG, Anzueto A, et al. Infectious Diseases Society of America/American Thoracic Society consensus guidelines on the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis. 2007;44(suppl 2):S27-S72. Oral antibiotic therapy is safe after clinical stability has been reached even in patients with severe CAP. 333 , 334 , 335 There is no clear usefulness of observing a patient within the hospital after a switch to oral therapy. 336 However, it is important to recognize that discharging patients before stability has been reached may lead to increased rehospitalization and death. 337 , 338 Using the same definitions of clinical stability, it has been shown that the greater the number of factors remaining abnormal at discharge, the greater is the chance of readmission or death. There are few studies on the duration of therapy for pneumonia that are prospective, well-controlled, use the same antibiotic and dosing schedule, and only vary the duration of therapy. However, these few studies have found that a period of less than 7 days and as short as 3 days of azithromycin is just as effective as longer durations of therapy for mild to moderate CAP. 339 , 340 With age, presence of underlying comorbidities including immune compromise, and more virulent pathogens, clinical stability may be delayed; therefore, duration of antibiotic therapy may be lengthened. Currently, for adult patients with CAP the IDSA/ATS guidelines recommend a minimum of at least 5 days of antibiotic therapy, with the patient being afebrile for between 48 and 72 hours and lacking no more than one sign of clinical stability. 84 Similarly, the BTS guidelines recommend 7 days of appropriate antibiotic therapy for patients with low- or moderate-severity CAP treated either as outpatients or inpatients. 284 Longer therapy should be considered for patients who have high-severity disease, bacteremic S. aureus pneumonia, or cavitary disease. The Pediatric Infectious Disease Society/IDSA guidelines for CAP in children note that 10 days of treatment is best studied in children, although shorter course treatment is likely effective. 305 Although early studies found limited benefit to concordance of process of care measures and clinical outcomes in pneumonia, more recent evidence indicates that compliance with clinical practice guidelines for both CAP and HCAP is associated with decreased inpatient mortality and inpatient length of stay. 142 , 312 , 313 , 341 , 342 , 343 , 344 The use of inpatient critical pathways based on clinical practice guidelines can reduce inpatient length of stay without increasing adverse effects. 288 , 345 , 346 Once discharged, outpatient follow-up should be coordinated, because most patients with CAP will have some related residual symptoms, including fever, cough, shortness of breath, chest pain, sputum production, fatigue, or gastrointestinal symptoms. Comorbidities, particularly cardiopulmonary or neurologic disease, are the most frequent reason for subsequent early readmission among patients who achieve clinical stability. 338 , 347 Adjunctive Therapy A robust inflammatory response to an invading pathogen can lead to a potentially worse outcome in pneumonia, and the use of anti-inflammatory agents could have potential benefits, as demonstrated with the improved outcome with the addition of corticosteroid therapy for Pneumocystis pneumonia. The macrolide family has been shown to have in vitro immunomodulatory activity, which may contribute to their efficacy in CAP. 348 A number of randomized controlled trials have now investigated the efficacy of corticosteroid therapy for CAP using differing dosages and agents. To date there is no evidence of an impact on overall mortality, although corticosteroids may shorten overall inpatient length of stay by 1 day. 349 , 350 Statins also possess anti-inflammatory properties, and their impact on CAP has been assessed in observational studies. Although there was initial suggestive evidence of benefit, those studies were not randomized and did not control for other potentially important variables, such as underlying health or socioeconomic status. 351 A more recent study that controlled for these factors found no impact of recent statin use on the incidence of severe sepsis or mortality from CAP. 352 Although other adjunctive therapies have been described, including the use of activated protein C, noninvasive mechanical ventilation, anticoagulants, immunoglobulin, granulocyte colony-stimulating factor, probiotics, chest physiotherapy, antiplatelet drugs, over-the-counter cough medications, β 2 -agonists, inhaled nitric oxide, and angiotensin-converting enzyme inhibitors, in clinical trials none of these approaches has been shown to have a significant role in therapy. 353 Prevention Vaccination against influenza and S. pneumoniae are important interventions in preventing pneumonia. In older adults, influenza vaccine can decrease the incidence of hospitalization, pneumonia, and mortality; and efficacy has been demonstrated over 10 consecutive influenza seasons. 354 , 355 Influenza vaccine is suggested for any person 6 months of age or older who, because of age or underlying disease, is at risk for influenza-related complications. This includes persons older than 50 years; nursing home residents; people with chronic pulmonary or cardiac disease, or with chronic diseases such as diabetes, renal failure, or hematologic disorders; patients who are immunosuppressed; those taking chronic salicylate therapy; and women in their second or third trimester of pregnancy. Health care workers, workers in nursing homes, and those who provide care to older adults or debilitated persons should also be targeted for influenza vaccination. 356 A 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine and both 7-valent and 13-valent pneumococcal conjugate vaccines are licensed in the United States. Although there are good clinical data showing that these vaccines provide protection against bacteremia and invasive pneumococcal disease, there are as yet no data showing the efficacy of these vaccines in preventing pneumonia. 357 , 358 Both the 23-valent pneumococcal polysaccharide and the 13-valent pneumococcal conjugate vaccines have now been approved for use in adults older than 50 years of age, and pneumococcal vaccine is recommended for patients older than 65 and those who have recovered from CAP. Further discussion of the efficacy of these vaccines is provided in Chapter 201. Active smoking is a clear risk factor for bacterial pneumonia, and promoting smoking cessation should be a component of pneumonia prevention. 60 , 359 , 360

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7603432/

Sanitization During and After COVID-19 Pandemic: A Short Review

Sanitization is a preventive and strategic method to contain the spread of SARS-CoV2. Since there is no foolproof method to tackle the present COVID-19 pandemic, sanitization has a central role to play. The present article briefly reviews various methods of sanitization for individuals, surfaces and ambience. The article reviews different approaches toward sanitization and examines the historicity of the methods employed. Introduction On 11 February 2020, WHO announced the name of the new disease from the virus of Coronaviridae family in the Nidovirales order known as the "COVID-19". The virus is named corona (Latin name crown) due to the presence of the crown-like structure on its outer surface (Shereen et al. 2020 ). The symptoms of COVID-19 may include fever, coughing, shortness of breath, sure throat, runny nose, etc. Chamola et al. ( 2020 ) list the common symptoms. There are three different routes of the transmission of COVID-19 viruses from the contagious person to a healthy person. These are the direct route, indirect contact, and airborne transmission (Fig. 1 ). Figure 1 lists the route of transmission and possible sanitization employed.The direct mode transmission implies the transfers of virus between infected and susceptible hosts via person-to-person contact. While the indirect mode of transmission indicates the transmission of the virus from the objects used by the infected person or the immediate environment of the infected individual (WHO 2020a ; Ong et al. 2020 ). The airborne transmission of the virus occurs through the droplet spray formed during natural human exhalation flows (Asadi et al. 2020 ). Fig. 1 Routes of COVID 19 transmission and their mode of sanitization Ordinary breathing and speech generate a large amount of potentially infectious aerosols (Asadi et al. 2020 ; Duguid 1946 ; Papineni and Rosenthal 1997 ). The particle generated during human exhalation flows such as coughing, sneezing, and breathing are two-phase buoyant jet emerging from the mouth and/or nose (Mittal et al. 2020 ; Tang et al. 2013 ). Asadi et al. ( 2019 ) reported that the rate of particle emission during normal human speech is up to 50 particles/s. Further, the velocity, number, and size distribution of the infectious droplet play an important role in virus transmission. The number of particles and their velocity is a function of the different modes of breathing, speech loudness, sneezing, and coughing (Mittal et al. 2020 ; Asadi et al. 2019 ). Natural human breathing and talking produce a jet velocity of 4.5 m/s (Tang et al. 2013 ). Han et al. ( 2013 ) determined the size distribution of sneeze droplets exhaled immediately at the mouth and observed that a sneeze produces an order of 10 4 droplets moving with an average velocity of 20 m/s. Coughing produces 10–100 times lesser droplets than sneezing. The cough droplets travel with a lesser velocity of approximately 10 m/s (Asadi et al. 2019 ; Mittal et al. 2020 ). The average diameter of a coronavirus is 65–125 nm (Shereen et al. 2020 ). The respiratory droplets are in the size of  > 5–10 μm (WHO 2020c ), i.e., one small viral droplet carrier can hold around 77 Coronaviruses. Further, the rate of particle emerging during human exhalation flows would be around 77 × 50 ≈ 3850 viruses/s. These airborne viruses contaminate the ambience and settle on surfaces. Huang et al. ( 2020 ) explain how fomites formed from deposited droplets are potentially infectious. The pathways for infection explained by Huang et al. ( 2020 ) creates a need for an understanding of the process of reducing the fomites and virus laden airborne droplets to break the spread of COVID-19. Diwan et al. ( 2020 ) simulated dry cough and showed a drop in temperataure of cough-fluid along with a lateral spread of flow due to turbulent entrainment. Dbouk and Drikakis ( 2020 ) used multiphase computational fluid dynamics to explain the airborne droplet transmission of viruses. They examined ambience contamination at different wind speeds by taking into account humidity, dispersion, phase change, and droplet interactions. Bhardwaj and Agrawal ( 2020 ) analysed the drying time of respiratory droplets from COVID-19 infected subjects. Their work explains the relationship of evaporative rate of a droplet and the spread of COVID-19. This indirectly hints at the capacity of the infected surface in spreading the virus. Since salivary droplets take longer time to evaporate than water droplets—the works of Bhardwaj and Agrawal ( 2020 ) and Dbouk and Drikakis ( 2020 ) caution about the viral spread from droplet bearing ambience and surfaces. At present, there are no vaccines available and it is of utmost importance to curb the deadly coronavirus spread by prevention and protection itself. Although social distancing has contained the spread of virus as a passive mechanism, a pragmatic look at the method to contain the virus by disinfecting and deactivating it is necessary. Almost all areas of research have come forward on a war footing and contributed towards the know-how to mitigate the spread and restore a regular life. By the time, vaccine is developed and distributed there is a need to protect ourselves and prevent the virus from further harming people. Sanitization has so far played an important role in containing the spread and in restoring everyday life albeit on a smaller scale. The mechanism involved in sanitization uses either one or both of these steps: (i) mechanical or thermal treatment and/or (ii) use of virucidal/anti-microbial agents to decontaminate the body part, object or surfaces. The overall sanitizing action is to weaken the virus by depleting the lipid membrane using a disinfectant and remove it from the surface. We briefly review the existing measures of sanitizing individuals, objects and spaces to inhibit the virus's life and to stop/break the spread of viruses. Figure 1 explains the transmission routes along with the categories of sanitization. Figure 2 gives a detailed list of methods used for sanitization and disinfection of COVID-19 infected people, objects and spaces. Fig. 2 Categories of sanitization to contain the spread of COVID 19 In the following section, we review the different categories of sanitization and stress on the developments done so far. We propose the possible methods of improvement and acknowledge the harm of obsessive use of any particular sanitization process. Individual Sanitization Sanitization is a pragmatic approach to tackle the issues associated with infection and contamination. The crucial requirement of sanitization in recent pandemic paves an area of active research to cater to any health crisis in the future spread of unpredictable disease(s). Sanitization as an area of interdisciplinary research needs a central focus in the longer run. One should address the community level spread of disease at individual scales before handling it on a social scale. Individual sanitization helps in reducing the mammoth spread of virus and prevents it from taking a colossal shape for the society as a whole. Crowd is made of individuals who are a part of a crowd, so it is incumbent on every individual to act for the benefit of the larger group. Masks and etiquettes of sneezing have largely been promoted since the outbreak of a pandemic. Different regulatory bodies have also stressed the central role of hand sanitization. Hand Sanitization For the disinfection of the hand, alcohol-based hand rub or soap with water are preferred (WHO 2020b ). The alcohol-based hand rubs are mainly formulated with ethanol, propan-2-ol or propan-1-ol. Some of the hand sanitizers also contain additional chemicals such as triclosan, chlorhexidine digluconate, benzalkonium chloride, polyhexanide, hydrogen peroxide, DDAC, peracetic acid, and/or octenidine dihydrochloride (Kampf 2018 ). Alcohol based hand rubs inactivate the virus (Kratzel et al. 2020 ). Hand wash containing 62–70% alcohol has been found to be effective in inactivating avian flu influenza A H5NI virus (Bondi et al. 2007 ). Pradhan et al. ( 2020 ) suggests some commercially available sanitizers and provides details about their chemical constituents. However, there are the localities lacking alcohol-based sanitizer or water and soap facilities. It is the usual practice of using ash, mud, and or rubbing of hand on the ground in rural areas of the Indian subcontinent (Hoque and Briend 1991 ). A survey in Kolkata India reported that 41% of slum residents and 26% of rural villagers use ash for hand washing (Anuradha et al. 1999 ; Ray et al. 2006 ). Mathur ( 2011 ) explains the importance of hand hygiene and elaborates the methods for hand washing. Mathur ( 2011 ) has recommended rinsing of hand with water, lathering with soap and then washing with running water followed by drying with single use towel or hot air blower. Miller et al. ( 2011 ) studied the effects of wash time, friction and soap on hand sanitization and concluded that washing ones hand running water with friction for 20 s is effective with marginal improvement on using soap. In the process of hand sanitization, mechanical removal is followed by disinfection using sanitizing agents. The sanitizing agents like alcohol and soap inactivate the virus by destroying the lipid membrane and exposing the intracellular content (Jing et al. 2020 ). Jing et al. ( 2020 ) have listed five different types of hand sanitizers: (i) gel, (ii) foam, (iii) cream, (iv) spray and (v) wipes. They explain the mechanism of inactivation of the viruses and bacteria using sanitizers and highlight the adverse effect of excessive use on the epidermis. Contact dermatitis and deterioration of lipid barriers of the skin are serious concern of excessive use of sanitizers. Emami et al. ( 2020 ) too explains the problematic effects of non-standard formulas for alcohol based hand sanitizers in causing skin dryness and irritation. Overuse of surfactants and soaps too harm the epidermis by negatively affecting the lipids, proteins and keratin composition. Hoque and Briend ( 1991 ) analyse the efficacy of different hand washing using ash, soap, mud, or plain water. They found that mud and ash are even more efficient than soap. In addition, there are the studies suggesting that the soil and ash may be used as hand disinfectants (Pittet et al. 2009 ; WHO 2020b ). Bloomfield and Nath ( 2009 ) reviews the efficacy of mud and ash in removing the pathogens. Hand hygiene is a product of proper mechanism of hand washing, which include removal of microbes using soap or other materials, rubbing to remove dislodge the microbes, use of clean water for rinsing and drying. The efficacy of mud is directly dependent on the cleanness and dryness of the soil used for washing and the mechanical action of rubbing during hand washing. The obvious drawbacks for mud is that contaminated mud can transmit many other forms of disease. Baker et al. ( 2014 ) tested the role of pH value of ash and water slurry and found that preparing the ash and water slurries increases the pH value, which inactivates the pathogens. Alternate non-alcohol based hand sanitization is important for patients undergoing alcohol treatment. De Sousa ( 2020 ) presented a case of 43 years old (on abstinence using 250 mg of disulfiram per day) who experienced Disulfiram Ethanol Reaction (DER) due to excessive exposure to alcohol based sanitizers. Although the allergic reaction was due to inhaled alcohol, the medical case hints at the damage excessive use can cause especially in a confined and poorly ventilated space (Huynh-Delerme et al. 2012 ; Brewer and Streel 2020 ). Hand sanitization and other modes of sanitization that use surfactants and disinfectants are bound to create a sludge of surfactant overload on the water bodies. Earlier work by Lewis ( 1991 ) has reviewed the effect of surfactant toxicity on aquatic animals. Xue et al. ( 2012 ) investigated the toxic effect of surfactant and disinfectant on rats and explained how the lungs and kidneys are vulnerable organs. Oral Precautions With masks, being a mandatory precaution during this pandemic active sanitization of inspired and expired air is required. Huang et al. ( 2020 ) suggested chemical modulation of respiratory exhales to impregnate the virion-laden droplets with anti-viral/sanitizing molecules. Panda et al. ( 2020 ) propose a modified anatomical facemask that clubs heat and moisture exchanger bacterial/viral filter (HME + bv) with the anatomical face mask. Anitviral and virucidal tendencies of fatty acids and lipids against viruses (Hilmarson et al. 2007 ) have been an area of research which seems to provide tangible protective measures against COVID-19 (Park and Gallagher 2017 ; Ghaffari et al. 2020 ). Dayrit and Newport ( 2020 ) have suggested the antiviral characteristic of Lauric acid found in coconut oil as a safeguard against the virus. Ministry of AYUSH, Government of India ( 2020 ), suggests nasal applications of coconut oil as a protective measure. Although the claim is traditional and untested, the science in support of antiviral nature of fatty oils can be used as a prop of AYUSH's suggestion as an added protective measure along with facemasks. The traditional practice of oil pulling too can be used alongside masks to capitalise on the virucidal ability of fatty acid. Alongside the proposed active sanitization of breath flows regular cleaning and disinfection of masks is important. Cloth facemasks can be detergent washed and cleaned. Special masks need care and disinfection using one or many methods listed under different headings below. N95 masks have found wide use as medical masks and they need regular disinfection and decontamination. Mackenzie ( 2020 ) proposes the following methods to disinfect and reuse N95 masks: (i) ultraviolet irradiation, (ii) fumigation, (iii) hot water heating, (iv) steaming and (v) baking. Microwave, alcohol and bleach destroys the effectiveness of N95 masks. Saini et al. ( 2020 ) has developed a vaporised hydrogen peroxide based decontamination method for PPE, coveralls and N-95 masks. It has been shown using scanning electron microscopy (SEM) that the treatment alters neither the permeability nor the fibre thickness. Li et al. ( 2020a , b ) proposed steam treatment of surgical and N95 masks. Ji et al. ( 2020 ) lists the treatment level required to get acceptable filtration and antimicrobial performance for various methods of decontamination of masks. Vaporised hydrogen peroxide requires around 10–30 min, microwave generated steam (for microwave models: 1100–1250 W) needs 2 min, microwave steam bags (for microwave model: 1100 W with 60 mL tap water in the bags) needs 90 s and moist heat incubation needs treatment for 15–30 min at 60 °C. Rubio-Romero et al. ( 2020 ) too have reported vaporised hydrogen peroxide, ultraviolet radiation, moist and dry heat to be effective. Zulauf et al. ( 2020 ) have proposed use of microwave-generated steam to decontaminate N95 masks using commonly available materials like glass container, commercial mesh bag, rubber band a 1100 W commercially available microwave. They have established that the process of decontamination retains the respirator fit and function. The methods established for sanitizing facemasks, need an optimal operation. Over exposure of any of the above-mentioned processes, will deteriorate the filtration function and fitness of the masks. Hand Sanitization For the disinfection of the hand, alcohol-based hand rub or soap with water are preferred (WHO 2020b ). The alcohol-based hand rubs are mainly formulated with ethanol, propan-2-ol or propan-1-ol. Some of the hand sanitizers also contain additional chemicals such as triclosan, chlorhexidine digluconate, benzalkonium chloride, polyhexanide, hydrogen peroxide, DDAC, peracetic acid, and/or octenidine dihydrochloride (Kampf 2018 ). Alcohol based hand rubs inactivate the virus (Kratzel et al. 2020 ). Hand wash containing 62–70% alcohol has been found to be effective in inactivating avian flu influenza A H5NI virus (Bondi et al. 2007 ). Pradhan et al. ( 2020 ) suggests some commercially available sanitizers and provides details about their chemical constituents. However, there are the localities lacking alcohol-based sanitizer or water and soap facilities. It is the usual practice of using ash, mud, and or rubbing of hand on the ground in rural areas of the Indian subcontinent (Hoque and Briend 1991 ). A survey in Kolkata India reported that 41% of slum residents and 26% of rural villagers use ash for hand washing (Anuradha et al. 1999 ; Ray et al. 2006 ). Mathur ( 2011 ) explains the importance of hand hygiene and elaborates the methods for hand washing. Mathur ( 2011 ) has recommended rinsing of hand with water, lathering with soap and then washing with running water followed by drying with single use towel or hot air blower. Miller et al. ( 2011 ) studied the effects of wash time, friction and soap on hand sanitization and concluded that washing ones hand running water with friction for 20 s is effective with marginal improvement on using soap. In the process of hand sanitization, mechanical removal is followed by disinfection using sanitizing agents. The sanitizing agents like alcohol and soap inactivate the virus by destroying the lipid membrane and exposing the intracellular content (Jing et al. 2020 ). Jing et al. ( 2020 ) have listed five different types of hand sanitizers: (i) gel, (ii) foam, (iii) cream, (iv) spray and (v) wipes. They explain the mechanism of inactivation of the viruses and bacteria using sanitizers and highlight the adverse effect of excessive use on the epidermis. Contact dermatitis and deterioration of lipid barriers of the skin are serious concern of excessive use of sanitizers. Emami et al. ( 2020 ) too explains the problematic effects of non-standard formulas for alcohol based hand sanitizers in causing skin dryness and irritation. Overuse of surfactants and soaps too harm the epidermis by negatively affecting the lipids, proteins and keratin composition. Hoque and Briend ( 1991 ) analyse the efficacy of different hand washing using ash, soap, mud, or plain water. They found that mud and ash are even more efficient than soap. In addition, there are the studies suggesting that the soil and ash may be used as hand disinfectants (Pittet et al. 2009 ; WHO 2020b ). Bloomfield and Nath ( 2009 ) reviews the efficacy of mud and ash in removing the pathogens. Hand hygiene is a product of proper mechanism of hand washing, which include removal of microbes using soap or other materials, rubbing to remove dislodge the microbes, use of clean water for rinsing and drying. The efficacy of mud is directly dependent on the cleanness and dryness of the soil used for washing and the mechanical action of rubbing during hand washing. The obvious drawbacks for mud is that contaminated mud can transmit many other forms of disease. Baker et al. ( 2014 ) tested the role of pH value of ash and water slurry and found that preparing the ash and water slurries increases the pH value, which inactivates the pathogens. Alternate non-alcohol based hand sanitization is important for patients undergoing alcohol treatment. De Sousa ( 2020 ) presented a case of 43 years old (on abstinence using 250 mg of disulfiram per day) who experienced Disulfiram Ethanol Reaction (DER) due to excessive exposure to alcohol based sanitizers. Although the allergic reaction was due to inhaled alcohol, the medical case hints at the damage excessive use can cause especially in a confined and poorly ventilated space (Huynh-Delerme et al. 2012 ; Brewer and Streel 2020 ). Hand sanitization and other modes of sanitization that use surfactants and disinfectants are bound to create a sludge of surfactant overload on the water bodies. Earlier work by Lewis ( 1991 ) has reviewed the effect of surfactant toxicity on aquatic animals. Xue et al. ( 2012 ) investigated the toxic effect of surfactant and disinfectant on rats and explained how the lungs and kidneys are vulnerable organs. Oral Precautions With masks, being a mandatory precaution during this pandemic active sanitization of inspired and expired air is required. Huang et al. ( 2020 ) suggested chemical modulation of respiratory exhales to impregnate the virion-laden droplets with anti-viral/sanitizing molecules. Panda et al. ( 2020 ) propose a modified anatomical facemask that clubs heat and moisture exchanger bacterial/viral filter (HME + bv) with the anatomical face mask. Anitviral and virucidal tendencies of fatty acids and lipids against viruses (Hilmarson et al. 2007 ) have been an area of research which seems to provide tangible protective measures against COVID-19 (Park and Gallagher 2017 ; Ghaffari et al. 2020 ). Dayrit and Newport ( 2020 ) have suggested the antiviral characteristic of Lauric acid found in coconut oil as a safeguard against the virus. Ministry of AYUSH, Government of India ( 2020 ), suggests nasal applications of coconut oil as a protective measure. Although the claim is traditional and untested, the science in support of antiviral nature of fatty oils can be used as a prop of AYUSH's suggestion as an added protective measure along with facemasks. The traditional practice of oil pulling too can be used alongside masks to capitalise on the virucidal ability of fatty acid. Alongside the proposed active sanitization of breath flows regular cleaning and disinfection of masks is important. Cloth facemasks can be detergent washed and cleaned. Special masks need care and disinfection using one or many methods listed under different headings below. N95 masks have found wide use as medical masks and they need regular disinfection and decontamination. Mackenzie ( 2020 ) proposes the following methods to disinfect and reuse N95 masks: (i) ultraviolet irradiation, (ii) fumigation, (iii) hot water heating, (iv) steaming and (v) baking. Microwave, alcohol and bleach destroys the effectiveness of N95 masks. Saini et al. ( 2020 ) has developed a vaporised hydrogen peroxide based decontamination method for PPE, coveralls and N-95 masks. It has been shown using scanning electron microscopy (SEM) that the treatment alters neither the permeability nor the fibre thickness. Li et al. ( 2020a , b ) proposed steam treatment of surgical and N95 masks. Ji et al. ( 2020 ) lists the treatment level required to get acceptable filtration and antimicrobial performance for various methods of decontamination of masks. Vaporised hydrogen peroxide requires around 10–30 min, microwave generated steam (for microwave models: 1100–1250 W) needs 2 min, microwave steam bags (for microwave model: 1100 W with 60 mL tap water in the bags) needs 90 s and moist heat incubation needs treatment for 15–30 min at 60 °C. Rubio-Romero et al. ( 2020 ) too have reported vaporised hydrogen peroxide, ultraviolet radiation, moist and dry heat to be effective. Zulauf et al. ( 2020 ) have proposed use of microwave-generated steam to decontaminate N95 masks using commonly available materials like glass container, commercial mesh bag, rubber band a 1100 W commercially available microwave. They have established that the process of decontamination retains the respirator fit and function. The methods established for sanitizing facemasks, need an optimal operation. Over exposure of any of the above-mentioned processes, will deteriorate the filtration function and fitness of the masks. Space Sanitization Sanitization for surfaces and for ambience can tackle the spread of COVID-19 virus in professional and domestic spaces. The following sections briefly review the required sanitization process. Surface Treatment A spray of respiratory droplets from an infected individual may also land on surfaces where the virus could remain viable and can serve as a source of transmission (WHO 2020a ; b , c ). The study by Kampf et al. ( 2020 ) shows that viruses can persist on surfaces from 2 h to 9 days. The survival time depends on the type of surface, relative humidity, temperature, and the strain of the virus (WHO 2020b ; Dbouk and Drikakis 2020 ). Doremalen et al. ( 2020 ) determined the stability of the COVID-19 virus and their decay rate on different surfaces (plastics, stainless steel, copper, and cardboard). They reported that viruses on plastics and stainless surfaces could be viable for up to 72 h. While, on copper and cardboard surface, the virus is less stable and can survive only for 4 h and 24 h, respectively. Furthermore, the same study reported that the virus titer reduces with time. Kampf et al. ( 2020 ) have reported the persistence of various stains of viruses on a different type of intimate surface. These surfaces infected with viruses are fomites and provide the indirect route of transmission. The contaminated surfaces can be decontaminated within a minute using common surface disinfection procedures with 62–71% ethanol, 0.5% hydrogen peroxide, or 0.1% sodium hypochlorite (WHO 2020b ; Kampf et al. 2020 ). Further, the same study explains that the degree of effectiveness of all the surface disinfect is dependent on their concentration and exposure time. Therefore, it is imperative to clean the surface with soap and water before applying any surface disinfectant. In a review on intervention to prevent COVID-19 Pradhan et al. ( 2020 ), provide the 'list N' based disinfectants as per the United States Environmental Protection Agency (USEPA). Although the disinfectants have not been specifically tested for COVID-19, USEPA expects them to be effective based on their demonstrated performance against other hard to kill viruses. Doremalen et al. ( 2020 ) reported that the half-life of SARs-COV 2 on stainless steel was 5.6 h and it was 6.8 h on plastic. The half-life is lesser on copper surfaces, indicating that in the long run copperization and copper plating to be a safer alternative for metal surfaces of daily use. The following methods can be adopted for sanitizing surfaces: (i) mops, (ii) sprays and (iii) UV Led based treatment. Wet Mops Chemical disinfectants applied to floors, doorknobs, table surfaces and surfaces in domestic and office use can be used to deactivate the corona spread. The measure to contain the spread of virus needs application of a fluid layer that has disinfectant added to it. One can wash the surfaces with water, soap and/or USEPA identified disinfectants. The film formed after washing would be thicker because water spreads and attains thickness according to the capillary length (a = \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$$\surd (\gamma / ho g)$$\end{document} √ ( γ / ρ g ) where \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$$\gamma$$\end{document} γ is surface tension and ρ is the density of water), since beyond this the gravity effect helps in spreading the fluid over the surface (De Gennes et al. 2013 ). For water air interface, the capillary length is 2.71 mm, which is much larger than the size of one virus (~ nm). One can use mopping to uniformly spread the water-disinfectant fluid mixture. Using a mop one can shear the fluid in a thin film (~μm); this will have dual effect of reducing the envelope of water around the corona virus and at the same time create a film of disinfectant on the surface being sanitised. The process will even lead to an increase in the evaporation rate since the fluid film will evaporate faster than the fluid layer. So mopping is an efficient sanitization mechanism. Andersen et al. ( 2009 ) compared the effectiveness of (i) dry, (ii) spray, (iii) moist and (iv) wet mopping, in removing organic materials from hospital room floors. Wet and moist mopping out performed all other methods. Wet mops moistened with disinfectants perform the dual role of mechanical removal and disinfection due to inactivation of the virus. Untreated sanitizing fluid and wet mops can be a counterproductive method of sanitization, since the used mop will become an active carrier of pathogens. Westwood et al. ( 1971 ) recommended regular laundering and drying of wet mops for proper decontamination. The process also helps avoid overuse of disinfectants for sanitization. Overuse of disinfectants can harm the environment, besides having other drawbacks mentioned earlier in section " Hand Sanitization ". Jets and Sprays Surfaces that are not accessible for mopping can be cleaned using jets and sprays. An aerosol created using disinfectant and the base fluid combination can be used to spray the inaccessible areas. The nanometer-sized corona embedded in micron sized cough droplets can easily reach inaccessible areas when an infected person coughs or sneezes. So a proper use of spray and jet should be employed to disinfect such inaccessible surfaces. Misters and wide-angle nozzles used in aeroponics can be employed for spray formation. Still, the spread of the sessile droplets on the surface will heavily depend on the coagulation of droplets and the curvature of the surface. Schneiderman and Cartee ( 2020 ) suggest a two-step method of disinfection: cleaning the surface followed by spray. Better disinfection is obtained when large dust particles on the surfaces are removed using wipes or detergent followed by spraying of EPA-registered disinfectant. Cadnum et al. ( 2015 ) have demonstrated the use of 1.4% improved hydrogen peroxide spray for soft surfaces and inaccessible parts to reduce contamination. The process does not need any mechanical wiping. UV LED-Based Treatment As explained earlier for disinfecting N95 masks (Mackenzie 2020 ) ultraviolent irradiation is an option to disinfect and decontaminate surfaces and inanimate objects, like clothes, utensils, medical instruments. Tseng and Li ( 2007 ) demonstrated the susceptibility of SARS-CoV at various relative humidity. The effect of ultraviolet germicidal irradiation to inactivate surface viruses were demonstrated. Kim and Kang ( 2018 ) measured the effectiveness of UVC LED in inactivating viruses. Moore in an article in ieeespectrum (dated 16th April 2020) explains how UVC LED makers claim to eliminate corona virus using a 30 s dose from a 3 cm distance. Although the UVC LEDs are useful in decontaminating influenza viruses including the recent novel coronavirus, their effectiveness decreases with increasing relative humidity (Tseng and Li 2007 ; McDevitt et al. 2012 ). Ambience Treatment The contagiousness of COVID-19 is acute due to its long half-life and airborne spread. Exhaled breathe from infected person, cough, sneeze, etc., aid in infecting the air (Dbouk and Drikakis 2020 ). Li et al. ( 2020a , b ) used airflow simulations to establish the evidence of probable aerosol transmission of SARS-CoV-2. This vulnerability of an ambience and associated likelihood of transmission of the virus by airborne route creates the necessity for ambience sanitization. On a colony or street level, infected areas and containment zone become difficult regions for human involved sanitization. The use of technology especially the newly evolving area of UAV is an apt alternative. Agriculture spraying drones can be used for the sanitization of public places (Fig. 3 ). It can carry upto16 litres spraying tank and can cover a 100,000 square meter area (Singla 2020 ). Smaller ambience can be sanitised by (i) fogging, (ii) fumigation and (iii) ventilation and filtering of contaminated air. Treatment of an area using fogging and fumigation need proper ventilation as recommended in the study of the aerodynamics of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals (Liu et al. 2020 ). Similar environmental contamination has been reported in two healthcare settings of South Korea (Ryu et al. 2020 ). USEPA does not recommend use of chemical disinfectants for fumigation and fogging unless the product label specifically permits such practice (FAQ-USEPA 2020 ). Fig. 3 Application of drones for sanitization during COVID-19 pandemic (Singla 2020 ) Fumigation Fumigants have been traditionally employed for a long time for their germicidal tendencies (Chen et al. 2013 ). Appendix 3 of an edited volume on Anthrax for humans and animals (Turnbull 2008 ) explains the sporicidal tendencies of fumigants and provides details about the methods, disinfectants and safety measures for fumigation. Numerous research in the past have focused on the virucidal tendencies of fumigants. Fumigation using ozone gas (Tanaka et al. 2009 ) and chlorine dioxide (Miura and Shibata 2010 ) have been found to be effective for the influenza virus. Human noroviruses (HuNoV) which also transmits through human contact and contaminated surfaces can be disinfected using hydrogen peroxide fumigant (Zonta et al. 2016 ). Cha et al. ( 2016 ) tested the use of paraformaldehyde for highly pathogenic avian influenza (HPAI) virus as a fumigant to decontaminate surfaces in laboratory settings. Meszaros et al. ( 2005 ) recommends use of vaporised hydrogen peroxide (VHP) as a safer alternative than formaldehyde especially to decontaminate enclosed areas. McDonnell et al. ( 2007 ) used (i) dehumidification, (ii) conditioning, (iii) disinfection and (iv) aeration and ventilation as four stages of fumigation using VHP units. As mentioned earlier, Mackenzie ( 2020 ) explains the use of hydrogen peroxide as a fumigant to disinfect N95 masks. Since most of the fumigants proposed earlier are for closed room disinfection, fluid dynamical investigation can help model and design an efficient fumigation unit. Chayaprasert et al. ( 2010 ) provides a CFD based modelling approach for structural fumigation. Open-air fumigation of bigger areas are risk prone due to tangential toxicity of the disinfectants employed. If there is an alternate, safer and non-toxic fumigant, a full air fumigation can be employed using the concept proposed by Xu et al. ( 1997 ). Any fumigation method employs chemical disinfectant and has potential risk for people around. It is advisable to properly ventilate the ambience and renew the air before human use. Fogging The fogging device spray disinfectant mist of various particle sizes and disperse into the air as aerosol (fog). It can be used for both surface and ambience sanitization. The effectiveness of the generator depends on the particle size, humidity, and contact time of disinfectant (Burfoot et al. 1999 ). Hoffmann et al. ( 2008 ) reported that the droplet size of the aerosol is one of the most significant factors that decide the success of spraying insecticide. The fogging technique is frequently used in agriculture for the application of pesticide (WHO 2003 ), mosquito control (Rose 2001 ), and the food industry (Burfoot et al. 1999 ). In addition, fogging is used for generating the seeding particles (sizes 0.2–5 μm) application in particle image velocimetry technique (Presser et al. 2006 ; Anufriev et al. 2013 ; van Hout et al. 2018 ). The fogging technique is a rapid approach to control the outbreak of the infectious disease in epidemic situations and to control flying insect pests or vectors (WHO 2003 ). This technique requires the minimum exposure time to kill the insect or disease's virus (Chung et al. 2001 ). However, it is an expensive method and may not be perfect for all situations (WHO 2003 ). Lal et al. ( 2020 ) suggested that sanitization of surface of OPD rooms through the fogging technique is not an effective method during the COVID-19 epidemic, as it does not properly clean the affected surface. During COVID-19 epidemic, it is used for the decontamination of the suspected area, which cannot be properly cleaned with mopping. According to Hoffmann et al. ( 2008 ), there are two types of ground or aerial sprayers: thermal and cold fog generators. Thermal fog requires a carrier fluid generally oil to dilute the concentration of insecticide. A hot gas heats the oil decreasing its viscosity which emerges from the fog generator's nozzle as a vapour (Fig. 4 a). Whereas spray from the cold fog is generated by mechanical means without using any heat source (WHO 2003 ) (Fig. 4 b). The selection of the type of fog generator depends on the applications, such as type of space and accessibility of the target area (WHO 2003 ). The size of the aerosol coming out from the nozzle should be in the range of 10–30 μm, which can remain in the atmosphere for a longer time (Himel 1971 ; WHO 2003 ; Hoffmann et al. 2008 ). Even with the limitations attached to fogging it is an alternative to disinfect closed ambience using approved disinfectants (FAQ-USEPA 2020 ). Fig. 4 Type of the fog generator (WHO 2003 ) Ventilation and Filtering Contaminated Air Understanding the flow pattern in a building is an important necessity to manage the quality of indoor airs and to have an efficient exchange of air with the surroundings. The air flow inside, stratification and buoyancy induced due to temperature define the driving mechanism for natural ventilation (Linden 1999 ). The case of infection due to aerosol transmitted SARS-CoV2 in a restaurant (Li et al. 2020a , b ) and two Wuhan hospitals (Liu et al. 2020 ) due to poor ventilation necessitate a need of proper ventilation with adequate air filtering. Villafruela et al. ( 2013 ) employed computational fluid dynamics to propose a design of ventilation system for isolation rooms. The relative location of air droplets and outlet was analysed. The overall study accounted for renewal of air, risk of airborne transmission and removal of contaminant. Novoselac and Srebric ( 2003 ) reported that the choice of ventilation strategy defined the correlations between the removal of contaminant and air-exchange efficiency. Singh and Tripathi ( 2020 ) propose experimental and computational fluid dynamics models to establish an understanding for improved ventilation design for hospitals, isolation rooms and enclosed spaces. Better ventilation when combined with efficient filtering of air will help sanitize and improve the quality of air in living rooms and isolation rooms. USEPA too recommends the use of proper ventilation and suggests the use of air purifiers and at the same time stresses their effectiveness only— "when used along with other best practices recommended by the Centers for Disease Control and Prevention". Ultraviolet C treatment of air is another technique that can be used to decontaminate ambience. The characteristics employed is similar to the method stated earlier for surface treatment. McDevitt et al. ( 2012 ) proposed use of UV-C for air disinfection in public buildings and contain the spread of influenza virus in the air. In addition to the sanitization processes listed above, public places have seen sprouting of sanitization chambers or disinfection tunnel. Although this is not a preferred public space sanitization mode as explained by Biswal et al. ( 2020 ). The disinfection tunnel can be installed at crowded public places such as shopping malls, vegetable markets, hospitals, industry, etc. The entry of the people to the common place should be restricted through the tunnel only. The design of tunnel in such a way that it even allows a man ridded on two-wheelers. There are two type of tunnel has been developed (Biswal et al. 2020 ): (i) a static type tunnel in which person stays inside the tunnel for 10–15 min and a disinfectant sprayed from the nozzle, (ii) a dynamic type of disinfectant tunnel where individuals walk in 16–25 ft long passage and disinfectant is sprayed throughout the path. The spray used in the tunnel is sodium hypochlorite solution (Biswal et al. 2020 ). Defence Research and Development Organisation (DRDO) laboratory developed 'Personalised Sanitization Enclosure' working with mist spray of chemical solution (DRDO 2020 ). Plast Grup, a Turkish firm modified a hotel shower system into a sanitization device (Dereagzi 2020 ). The device named Ikarus uses chemical disinfectants, ultraviolet cleaning and has in built body temperature detection unit using thermal camera. A report by Malaysian Health Technology Assessment Section (MaHTAS) under Ministry of Health (Malaysia) tabulates different types of sanitization chamber developed in Turkey, China, Indonesia, Thailand, Malayasia and India (MaHTAS 2020 ). This report did not find any evidence for the effectiveness of sanitization tunnels. Biswal et al. ( 2020 ) warms against developing complacence and avoidance of other difficult and cumbersome modes of sanitization especially due to excessive use of disinfection tunnel. Surface Treatment A spray of respiratory droplets from an infected individual may also land on surfaces where the virus could remain viable and can serve as a source of transmission (WHO 2020a ; b , c ). The study by Kampf et al. ( 2020 ) shows that viruses can persist on surfaces from 2 h to 9 days. The survival time depends on the type of surface, relative humidity, temperature, and the strain of the virus (WHO 2020b ; Dbouk and Drikakis 2020 ). Doremalen et al. ( 2020 ) determined the stability of the COVID-19 virus and their decay rate on different surfaces (plastics, stainless steel, copper, and cardboard). They reported that viruses on plastics and stainless surfaces could be viable for up to 72 h. While, on copper and cardboard surface, the virus is less stable and can survive only for 4 h and 24 h, respectively. Furthermore, the same study reported that the virus titer reduces with time. Kampf et al. ( 2020 ) have reported the persistence of various stains of viruses on a different type of intimate surface. These surfaces infected with viruses are fomites and provide the indirect route of transmission. The contaminated surfaces can be decontaminated within a minute using common surface disinfection procedures with 62–71% ethanol, 0.5% hydrogen peroxide, or 0.1% sodium hypochlorite (WHO 2020b ; Kampf et al. 2020 ). Further, the same study explains that the degree of effectiveness of all the surface disinfect is dependent on their concentration and exposure time. Therefore, it is imperative to clean the surface with soap and water before applying any surface disinfectant. In a review on intervention to prevent COVID-19 Pradhan et al. ( 2020 ), provide the 'list N' based disinfectants as per the United States Environmental Protection Agency (USEPA). Although the disinfectants have not been specifically tested for COVID-19, USEPA expects them to be effective based on their demonstrated performance against other hard to kill viruses. Doremalen et al. ( 2020 ) reported that the half-life of SARs-COV 2 on stainless steel was 5.6 h and it was 6.8 h on plastic. The half-life is lesser on copper surfaces, indicating that in the long run copperization and copper plating to be a safer alternative for metal surfaces of daily use. The following methods can be adopted for sanitizing surfaces: (i) mops, (ii) sprays and (iii) UV Led based treatment. Wet Mops Chemical disinfectants applied to floors, doorknobs, table surfaces and surfaces in domestic and office use can be used to deactivate the corona spread. The measure to contain the spread of virus needs application of a fluid layer that has disinfectant added to it. One can wash the surfaces with water, soap and/or USEPA identified disinfectants. The film formed after washing would be thicker because water spreads and attains thickness according to the capillary length (a = \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$$\surd (\gamma / ho g)$$\end{document} √ ( γ / ρ g ) where \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$$\gamma$$\end{document} γ is surface tension and ρ is the density of water), since beyond this the gravity effect helps in spreading the fluid over the surface (De Gennes et al. 2013 ). For water air interface, the capillary length is 2.71 mm, which is much larger than the size of one virus (~ nm). One can use mopping to uniformly spread the water-disinfectant fluid mixture. Using a mop one can shear the fluid in a thin film (~μm); this will have dual effect of reducing the envelope of water around the corona virus and at the same time create a film of disinfectant on the surface being sanitised. The process will even lead to an increase in the evaporation rate since the fluid film will evaporate faster than the fluid layer. So mopping is an efficient sanitization mechanism. Andersen et al. ( 2009 ) compared the effectiveness of (i) dry, (ii) spray, (iii) moist and (iv) wet mopping, in removing organic materials from hospital room floors. Wet and moist mopping out performed all other methods. Wet mops moistened with disinfectants perform the dual role of mechanical removal and disinfection due to inactivation of the virus. Untreated sanitizing fluid and wet mops can be a counterproductive method of sanitization, since the used mop will become an active carrier of pathogens. Westwood et al. ( 1971 ) recommended regular laundering and drying of wet mops for proper decontamination. The process also helps avoid overuse of disinfectants for sanitization. Overuse of disinfectants can harm the environment, besides having other drawbacks mentioned earlier in section " Hand Sanitization ". Jets and Sprays Surfaces that are not accessible for mopping can be cleaned using jets and sprays. An aerosol created using disinfectant and the base fluid combination can be used to spray the inaccessible areas. The nanometer-sized corona embedded in micron sized cough droplets can easily reach inaccessible areas when an infected person coughs or sneezes. So a proper use of spray and jet should be employed to disinfect such inaccessible surfaces. Misters and wide-angle nozzles used in aeroponics can be employed for spray formation. Still, the spread of the sessile droplets on the surface will heavily depend on the coagulation of droplets and the curvature of the surface. Schneiderman and Cartee ( 2020 ) suggest a two-step method of disinfection: cleaning the surface followed by spray. Better disinfection is obtained when large dust particles on the surfaces are removed using wipes or detergent followed by spraying of EPA-registered disinfectant. Cadnum et al. ( 2015 ) have demonstrated the use of 1.4% improved hydrogen peroxide spray for soft surfaces and inaccessible parts to reduce contamination. The process does not need any mechanical wiping. UV LED-Based Treatment As explained earlier for disinfecting N95 masks (Mackenzie 2020 ) ultraviolent irradiation is an option to disinfect and decontaminate surfaces and inanimate objects, like clothes, utensils, medical instruments. Tseng and Li ( 2007 ) demonstrated the susceptibility of SARS-CoV at various relative humidity. The effect of ultraviolet germicidal irradiation to inactivate surface viruses were demonstrated. Kim and Kang ( 2018 ) measured the effectiveness of UVC LED in inactivating viruses. Moore in an article in ieeespectrum (dated 16th April 2020) explains how UVC LED makers claim to eliminate corona virus using a 30 s dose from a 3 cm distance. Although the UVC LEDs are useful in decontaminating influenza viruses including the recent novel coronavirus, their effectiveness decreases with increasing relative humidity (Tseng and Li 2007 ; McDevitt et al. 2012 ). Wet Mops Chemical disinfectants applied to floors, doorknobs, table surfaces and surfaces in domestic and office use can be used to deactivate the corona spread. The measure to contain the spread of virus needs application of a fluid layer that has disinfectant added to it. One can wash the surfaces with water, soap and/or USEPA identified disinfectants. The film formed after washing would be thicker because water spreads and attains thickness according to the capillary length (a = \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$$\surd (\gamma / ho g)$$\end{document} √ ( γ / ρ g ) where \documentclass[12pt]{minimal} sepackage{amsmath} sepackage{wasysym} sepackage{amsfonts} sepackage{amssymb} sepackage{amsbsy} sepackage{mathrsfs} sepackage{upgreek} \setlength{\oddsidemargin}{-69pt} egin{document}$$\gamma$$\end{document} γ is surface tension and ρ is the density of water), since beyond this the gravity effect helps in spreading the fluid over the surface (De Gennes et al. 2013 ). For water air interface, the capillary length is 2.71 mm, which is much larger than the size of one virus (~ nm). One can use mopping to uniformly spread the water-disinfectant fluid mixture. Using a mop one can shear the fluid in a thin film (~μm); this will have dual effect of reducing the envelope of water around the corona virus and at the same time create a film of disinfectant on the surface being sanitised. The process will even lead to an increase in the evaporation rate since the fluid film will evaporate faster than the fluid layer. So mopping is an efficient sanitization mechanism. Andersen et al. ( 2009 ) compared the effectiveness of (i) dry, (ii) spray, (iii) moist and (iv) wet mopping, in removing organic materials from hospital room floors. Wet and moist mopping out performed all other methods. Wet mops moistened with disinfectants perform the dual role of mechanical removal and disinfection due to inactivation of the virus. Untreated sanitizing fluid and wet mops can be a counterproductive method of sanitization, since the used mop will become an active carrier of pathogens. Westwood et al. ( 1971 ) recommended regular laundering and drying of wet mops for proper decontamination. The process also helps avoid overuse of disinfectants for sanitization. Overuse of disinfectants can harm the environment, besides having other drawbacks mentioned earlier in section " Hand Sanitization ". Jets and Sprays Surfaces that are not accessible for mopping can be cleaned using jets and sprays. An aerosol created using disinfectant and the base fluid combination can be used to spray the inaccessible areas. The nanometer-sized corona embedded in micron sized cough droplets can easily reach inaccessible areas when an infected person coughs or sneezes. So a proper use of spray and jet should be employed to disinfect such inaccessible surfaces. Misters and wide-angle nozzles used in aeroponics can be employed for spray formation. Still, the spread of the sessile droplets on the surface will heavily depend on the coagulation of droplets and the curvature of the surface. Schneiderman and Cartee ( 2020 ) suggest a two-step method of disinfection: cleaning the surface followed by spray. Better disinfection is obtained when large dust particles on the surfaces are removed using wipes or detergent followed by spraying of EPA-registered disinfectant. Cadnum et al. ( 2015 ) have demonstrated the use of 1.4% improved hydrogen peroxide spray for soft surfaces and inaccessible parts to reduce contamination. The process does not need any mechanical wiping. UV LED-Based Treatment As explained earlier for disinfecting N95 masks (Mackenzie 2020 ) ultraviolent irradiation is an option to disinfect and decontaminate surfaces and inanimate objects, like clothes, utensils, medical instruments. Tseng and Li ( 2007 ) demonstrated the susceptibility of SARS-CoV at various relative humidity. The effect of ultraviolet germicidal irradiation to inactivate surface viruses were demonstrated. Kim and Kang ( 2018 ) measured the effectiveness of UVC LED in inactivating viruses. Moore in an article in ieeespectrum (dated 16th April 2020) explains how UVC LED makers claim to eliminate corona virus using a 30 s dose from a 3 cm distance. Although the UVC LEDs are useful in decontaminating influenza viruses including the recent novel coronavirus, their effectiveness decreases with increasing relative humidity (Tseng and Li 2007 ; McDevitt et al. 2012 ). Ambience Treatment The contagiousness of COVID-19 is acute due to its long half-life and airborne spread. Exhaled breathe from infected person, cough, sneeze, etc., aid in infecting the air (Dbouk and Drikakis 2020 ). Li et al. ( 2020a , b ) used airflow simulations to establish the evidence of probable aerosol transmission of SARS-CoV-2. This vulnerability of an ambience and associated likelihood of transmission of the virus by airborne route creates the necessity for ambience sanitization. On a colony or street level, infected areas and containment zone become difficult regions for human involved sanitization. The use of technology especially the newly evolving area of UAV is an apt alternative. Agriculture spraying drones can be used for the sanitization of public places (Fig. 3 ). It can carry upto16 litres spraying tank and can cover a 100,000 square meter area (Singla 2020 ). Smaller ambience can be sanitised by (i) fogging, (ii) fumigation and (iii) ventilation and filtering of contaminated air. Treatment of an area using fogging and fumigation need proper ventilation as recommended in the study of the aerodynamics of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals (Liu et al. 2020 ). Similar environmental contamination has been reported in two healthcare settings of South Korea (Ryu et al. 2020 ). USEPA does not recommend use of chemical disinfectants for fumigation and fogging unless the product label specifically permits such practice (FAQ-USEPA 2020 ). Fig. 3 Application of drones for sanitization during COVID-19 pandemic (Singla 2020 ) Fumigation Fumigants have been traditionally employed for a long time for their germicidal tendencies (Chen et al. 2013 ). Appendix 3 of an edited volume on Anthrax for humans and animals (Turnbull 2008 ) explains the sporicidal tendencies of fumigants and provides details about the methods, disinfectants and safety measures for fumigation. Numerous research in the past have focused on the virucidal tendencies of fumigants. Fumigation using ozone gas (Tanaka et al. 2009 ) and chlorine dioxide (Miura and Shibata 2010 ) have been found to be effective for the influenza virus. Human noroviruses (HuNoV) which also transmits through human contact and contaminated surfaces can be disinfected using hydrogen peroxide fumigant (Zonta et al. 2016 ). Cha et al. ( 2016 ) tested the use of paraformaldehyde for highly pathogenic avian influenza (HPAI) virus as a fumigant to decontaminate surfaces in laboratory settings. Meszaros et al. ( 2005 ) recommends use of vaporised hydrogen peroxide (VHP) as a safer alternative than formaldehyde especially to decontaminate enclosed areas. McDonnell et al. ( 2007 ) used (i) dehumidification, (ii) conditioning, (iii) disinfection and (iv) aeration and ventilation as four stages of fumigation using VHP units. As mentioned earlier, Mackenzie ( 2020 ) explains the use of hydrogen peroxide as a fumigant to disinfect N95 masks. Since most of the fumigants proposed earlier are for closed room disinfection, fluid dynamical investigation can help model and design an efficient fumigation unit. Chayaprasert et al. ( 2010 ) provides a CFD based modelling approach for structural fumigation. Open-air fumigation of bigger areas are risk prone due to tangential toxicity of the disinfectants employed. If there is an alternate, safer and non-toxic fumigant, a full air fumigation can be employed using the concept proposed by Xu et al. ( 1997 ). Any fumigation method employs chemical disinfectant and has potential risk for people around. It is advisable to properly ventilate the ambience and renew the air before human use. Fogging The fogging device spray disinfectant mist of various particle sizes and disperse into the air as aerosol (fog). It can be used for both surface and ambience sanitization. The effectiveness of the generator depends on the particle size, humidity, and contact time of disinfectant (Burfoot et al. 1999 ). Hoffmann et al. ( 2008 ) reported that the droplet size of the aerosol is one of the most significant factors that decide the success of spraying insecticide. The fogging technique is frequently used in agriculture for the application of pesticide (WHO 2003 ), mosquito control (Rose 2001 ), and the food industry (Burfoot et al. 1999 ). In addition, fogging is used for generating the seeding particles (sizes 0.2–5 μm) application in particle image velocimetry technique (Presser et al. 2006 ; Anufriev et al. 2013 ; van Hout et al. 2018 ). The fogging technique is a rapid approach to control the outbreak of the infectious disease in epidemic situations and to control flying insect pests or vectors (WHO 2003 ). This technique requires the minimum exposure time to kill the insect or disease's virus (Chung et al. 2001 ). However, it is an expensive method and may not be perfect for all situations (WHO 2003 ). Lal et al. ( 2020 ) suggested that sanitization of surface of OPD rooms through the fogging technique is not an effective method during the COVID-19 epidemic, as it does not properly clean the affected surface. During COVID-19 epidemic, it is used for the decontamination of the suspected area, which cannot be properly cleaned with mopping. According to Hoffmann et al. ( 2008 ), there are two types of ground or aerial sprayers: thermal and cold fog generators. Thermal fog requires a carrier fluid generally oil to dilute the concentration of insecticide. A hot gas heats the oil decreasing its viscosity which emerges from the fog generator's nozzle as a vapour (Fig. 4 a). Whereas spray from the cold fog is generated by mechanical means without using any heat source (WHO 2003 ) (Fig. 4 b). The selection of the type of fog generator depends on the applications, such as type of space and accessibility of the target area (WHO 2003 ). The size of the aerosol coming out from the nozzle should be in the range of 10–30 μm, which can remain in the atmosphere for a longer time (Himel 1971 ; WHO 2003 ; Hoffmann et al. 2008 ). Even with the limitations attached to fogging it is an alternative to disinfect closed ambience using approved disinfectants (FAQ-USEPA 2020 ). Fig. 4 Type of the fog generator (WHO 2003 ) Ventilation and Filtering Contaminated Air Understanding the flow pattern in a building is an important necessity to manage the quality of indoor airs and to have an efficient exchange of air with the surroundings. The air flow inside, stratification and buoyancy induced due to temperature define the driving mechanism for natural ventilation (Linden 1999 ). The case of infection due to aerosol transmitted SARS-CoV2 in a restaurant (Li et al. 2020a , b ) and two Wuhan hospitals (Liu et al. 2020 ) due to poor ventilation necessitate a need of proper ventilation with adequate air filtering. Villafruela et al. ( 2013 ) employed computational fluid dynamics to propose a design of ventilation system for isolation rooms. The relative location of air droplets and outlet was analysed. The overall study accounted for renewal of air, risk of airborne transmission and removal of contaminant. Novoselac and Srebric ( 2003 ) reported that the choice of ventilation strategy defined the correlations between the removal of contaminant and air-exchange efficiency. Singh and Tripathi ( 2020 ) propose experimental and computational fluid dynamics models to establish an understanding for improved ventilation design for hospitals, isolation rooms and enclosed spaces. Better ventilation when combined with efficient filtering of air will help sanitize and improve the quality of air in living rooms and isolation rooms. USEPA too recommends the use of proper ventilation and suggests the use of air purifiers and at the same time stresses their effectiveness only— "when used along with other best practices recommended by the Centers for Disease Control and Prevention". Ultraviolet C treatment of air is another technique that can be used to decontaminate ambience. The characteristics employed is similar to the method stated earlier for surface treatment. McDevitt et al. ( 2012 ) proposed use of UV-C for air disinfection in public buildings and contain the spread of influenza virus in the air. In addition to the sanitization processes listed above, public places have seen sprouting of sanitization chambers or disinfection tunnel. Although this is not a preferred public space sanitization mode as explained by Biswal et al. ( 2020 ). The disinfection tunnel can be installed at crowded public places such as shopping malls, vegetable markets, hospitals, industry, etc. The entry of the people to the common place should be restricted through the tunnel only. The design of tunnel in such a way that it even allows a man ridded on two-wheelers. There are two type of tunnel has been developed (Biswal et al. 2020 ): (i) a static type tunnel in which person stays inside the tunnel for 10–15 min and a disinfectant sprayed from the nozzle, (ii) a dynamic type of disinfectant tunnel where individuals walk in 16–25 ft long passage and disinfectant is sprayed throughout the path. The spray used in the tunnel is sodium hypochlorite solution (Biswal et al. 2020 ). Defence Research and Development Organisation (DRDO) laboratory developed 'Personalised Sanitization Enclosure' working with mist spray of chemical solution (DRDO 2020 ). Plast Grup, a Turkish firm modified a hotel shower system into a sanitization device (Dereagzi 2020 ). The device named Ikarus uses chemical disinfectants, ultraviolet cleaning and has in built body temperature detection unit using thermal camera. A report by Malaysian Health Technology Assessment Section (MaHTAS) under Ministry of Health (Malaysia) tabulates different types of sanitization chamber developed in Turkey, China, Indonesia, Thailand, Malayasia and India (MaHTAS 2020 ). This report did not find any evidence for the effectiveness of sanitization tunnels. Biswal et al. ( 2020 ) warms against developing complacence and avoidance of other difficult and cumbersome modes of sanitization especially due to excessive use of disinfection tunnel. Fumigation Fumigants have been traditionally employed for a long time for their germicidal tendencies (Chen et al. 2013 ). Appendix 3 of an edited volume on Anthrax for humans and animals (Turnbull 2008 ) explains the sporicidal tendencies of fumigants and provides details about the methods, disinfectants and safety measures for fumigation. Numerous research in the past have focused on the virucidal tendencies of fumigants. Fumigation using ozone gas (Tanaka et al. 2009 ) and chlorine dioxide (Miura and Shibata 2010 ) have been found to be effective for the influenza virus. Human noroviruses (HuNoV) which also transmits through human contact and contaminated surfaces can be disinfected using hydrogen peroxide fumigant (Zonta et al. 2016 ). Cha et al. ( 2016 ) tested the use of paraformaldehyde for highly pathogenic avian influenza (HPAI) virus as a fumigant to decontaminate surfaces in laboratory settings. Meszaros et al. ( 2005 ) recommends use of vaporised hydrogen peroxide (VHP) as a safer alternative than formaldehyde especially to decontaminate enclosed areas. McDonnell et al. ( 2007 ) used (i) dehumidification, (ii) conditioning, (iii) disinfection and (iv) aeration and ventilation as four stages of fumigation using VHP units. As mentioned earlier, Mackenzie ( 2020 ) explains the use of hydrogen peroxide as a fumigant to disinfect N95 masks. Since most of the fumigants proposed earlier are for closed room disinfection, fluid dynamical investigation can help model and design an efficient fumigation unit. Chayaprasert et al. ( 2010 ) provides a CFD based modelling approach for structural fumigation. Open-air fumigation of bigger areas are risk prone due to tangential toxicity of the disinfectants employed. If there is an alternate, safer and non-toxic fumigant, a full air fumigation can be employed using the concept proposed by Xu et al. ( 1997 ). Any fumigation method employs chemical disinfectant and has potential risk for people around. It is advisable to properly ventilate the ambience and renew the air before human use. Fogging The fogging device spray disinfectant mist of various particle sizes and disperse into the air as aerosol (fog). It can be used for both surface and ambience sanitization. The effectiveness of the generator depends on the particle size, humidity, and contact time of disinfectant (Burfoot et al. 1999 ). Hoffmann et al. ( 2008 ) reported that the droplet size of the aerosol is one of the most significant factors that decide the success of spraying insecticide. The fogging technique is frequently used in agriculture for the application of pesticide (WHO 2003 ), mosquito control (Rose 2001 ), and the food industry (Burfoot et al. 1999 ). In addition, fogging is used for generating the seeding particles (sizes 0.2–5 μm) application in particle image velocimetry technique (Presser et al. 2006 ; Anufriev et al. 2013 ; van Hout et al. 2018 ). The fogging technique is a rapid approach to control the outbreak of the infectious disease in epidemic situations and to control flying insect pests or vectors (WHO 2003 ). This technique requires the minimum exposure time to kill the insect or disease's virus (Chung et al. 2001 ). However, it is an expensive method and may not be perfect for all situations (WHO 2003 ). Lal et al. ( 2020 ) suggested that sanitization of surface of OPD rooms through the fogging technique is not an effective method during the COVID-19 epidemic, as it does not properly clean the affected surface. During COVID-19 epidemic, it is used for the decontamination of the suspected area, which cannot be properly cleaned with mopping. According to Hoffmann et al. ( 2008 ), there are two types of ground or aerial sprayers: thermal and cold fog generators. Thermal fog requires a carrier fluid generally oil to dilute the concentration of insecticide. A hot gas heats the oil decreasing its viscosity which emerges from the fog generator's nozzle as a vapour (Fig. 4 a). Whereas spray from the cold fog is generated by mechanical means without using any heat source (WHO 2003 ) (Fig. 4 b). The selection of the type of fog generator depends on the applications, such as type of space and accessibility of the target area (WHO 2003 ). The size of the aerosol coming out from the nozzle should be in the range of 10–30 μm, which can remain in the atmosphere for a longer time (Himel 1971 ; WHO 2003 ; Hoffmann et al. 2008 ). Even with the limitations attached to fogging it is an alternative to disinfect closed ambience using approved disinfectants (FAQ-USEPA 2020 ). Fig. 4 Type of the fog generator (WHO 2003 ) Ventilation and Filtering Contaminated Air Understanding the flow pattern in a building is an important necessity to manage the quality of indoor airs and to have an efficient exchange of air with the surroundings. The air flow inside, stratification and buoyancy induced due to temperature define the driving mechanism for natural ventilation (Linden 1999 ). The case of infection due to aerosol transmitted SARS-CoV2 in a restaurant (Li et al. 2020a , b ) and two Wuhan hospitals (Liu et al. 2020 ) due to poor ventilation necessitate a need of proper ventilation with adequate air filtering. Villafruela et al. ( 2013 ) employed computational fluid dynamics to propose a design of ventilation system for isolation rooms. The relative location of air droplets and outlet was analysed. The overall study accounted for renewal of air, risk of airborne transmission and removal of contaminant. Novoselac and Srebric ( 2003 ) reported that the choice of ventilation strategy defined the correlations between the removal of contaminant and air-exchange efficiency. Singh and Tripathi ( 2020 ) propose experimental and computational fluid dynamics models to establish an understanding for improved ventilation design for hospitals, isolation rooms and enclosed spaces. Better ventilation when combined with efficient filtering of air will help sanitize and improve the quality of air in living rooms and isolation rooms. USEPA too recommends the use of proper ventilation and suggests the use of air purifiers and at the same time stresses their effectiveness only— "when used along with other best practices recommended by the Centers for Disease Control and Prevention". Ultraviolet C treatment of air is another technique that can be used to decontaminate ambience. The characteristics employed is similar to the method stated earlier for surface treatment. McDevitt et al. ( 2012 ) proposed use of UV-C for air disinfection in public buildings and contain the spread of influenza virus in the air. In addition to the sanitization processes listed above, public places have seen sprouting of sanitization chambers or disinfection tunnel. Although this is not a preferred public space sanitization mode as explained by Biswal et al. ( 2020 ). The disinfection tunnel can be installed at crowded public places such as shopping malls, vegetable markets, hospitals, industry, etc. The entry of the people to the common place should be restricted through the tunnel only. The design of tunnel in such a way that it even allows a man ridded on two-wheelers. There are two type of tunnel has been developed (Biswal et al. 2020 ): (i) a static type tunnel in which person stays inside the tunnel for 10–15 min and a disinfectant sprayed from the nozzle, (ii) a dynamic type of disinfectant tunnel where individuals walk in 16–25 ft long passage and disinfectant is sprayed throughout the path. The spray used in the tunnel is sodium hypochlorite solution (Biswal et al. 2020 ). Defence Research and Development Organisation (DRDO) laboratory developed 'Personalised Sanitization Enclosure' working with mist spray of chemical solution (DRDO 2020 ). Plast Grup, a Turkish firm modified a hotel shower system into a sanitization device (Dereagzi 2020 ). The device named Ikarus uses chemical disinfectants, ultraviolet cleaning and has in built body temperature detection unit using thermal camera. A report by Malaysian Health Technology Assessment Section (MaHTAS) under Ministry of Health (Malaysia) tabulates different types of sanitization chamber developed in Turkey, China, Indonesia, Thailand, Malayasia and India (MaHTAS 2020 ). This report did not find any evidence for the effectiveness of sanitization tunnels. Biswal et al. ( 2020 ) warms against developing complacence and avoidance of other difficult and cumbersome modes of sanitization especially due to excessive use of disinfection tunnel. Object Sanitization The genres of sanitization mentioned earlier can be directly and/or indirectly applied for object sanitization. Ultraviolent irradiation and cleaning of surfaces using approved disinfectants are crucial modes of sanitization of objects in domestic and office spaces. Marinella ( 2020 ) proposes the use of alcohol wipes to disinfect stethoscopes. Similarly, alcohol based soap/detergent wipes can be used to clean tables, computers and other inanimate objects. Clothes can be sanitized by proper wash. Vegetables and fruits can be sanitized using water, although alcohol based vegetable wash are becoming news too. So far, there is no conclusive proof of their added effectiveness over normal wash of vegetables and fruits using water. As explained in the section on hand washing, rubbing is an effective mode of cleaning due to which the pathogens are dislodged and later soap brings out minimal improvement (Miller et al. 2011 ). Similarly, vegetables are decontaminated by rubbing properly under running water tap. The process will use the frictional mode of dislodging any contamination and running tap water will remove it from the surface. The drawback is, this process removes any viral trace from the vegetable and fruit peel but does not inactivate it. Conclusion The centrality of sanitization as a means of controlling the spread of pandemic is established when we evaluate the methods of sanitization employed to contain the COVID-19 pandemic. The categorisation of sanitization depends on the routes of infection. Three possible routes of infection (i) direct, (ii) indirect and (iii) airborne transmission have been identified as the cause of spread of this pandemic. Individual, object and space sanitization are needed to contain the spread of COVID-19. The end goal of any sanitization process is to remove the virus and inactivate it. Mechanical removal, thermal treatment and chemical disinfection are used in isolation or in combination in the listed categories of sanitization. On an individual level, hand washing and oral hygiene are highly recommended. Hand washing employs rubbing of hands and use of mud, ash, soaps or alcohol based hand sanitizer. Masks have become an inalienable part of attire to stop the spread of virus and sanitization of masks has become a scientific concern. Heat treatment like baking, microwave steam heating; UV irradiation and chemical treatment using vaporised hydrogen peroxide, ozone gas have been recommended. Spaces and objects can be disinfected using mops/wipes, jets and sprays, UVC irradiation, fogging and fumigation. Ventilation and filtering of contaminated air is an important means of sanitizing high-risk zones like hospitals and restaurants. Since the majority of the processes come with added risks to health due to chemical or radiation overuse, a balanced and non-obsessive sanitization behaviour is recommended. Sanitization based research is a void where technologies and research other than those focused on chemical disinfectants can play a crucial role. Fluid dynamics (Bhardwaj and Agrawal 2020 ), LEDs (Tseng and Li 2007 ; McDevitt et al. 2012 ), surface treatment using carbon nanotubes (Kashyap and Saha 2020 ), nanocarbons like activated fullerene (Siddiquie et al. 2020 ) and TiO 2 nanoparticles hydrophobic coating (Mahapatra et al. 2020 ) along with many more strands of science need to focus and contribute to an area as common as sanitization.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1151968/

Protective Antigen and Toxin Neutralization Antibody Patterns in Anthrax Vaccinees Undergoing Serial Plasmapheresis

Recipients of licensed anthrax vaccine (AVA; Biothrax) could serve as a source of hyperimmune plasma and immunoglobulin for therapy and prophylaxis. We measured serum antibodies during serial weekly to biweekly plasmapheresis in 38 individuals previously vaccinated with 4 to 27 doses of AVA. Immunoglobulin G (IgG) to protective antigen (PA) and toxin neutralization assay (TNA) antibody levels were highly correlated ( r = 0.86930 and P < 0.0001 for anti-PA concentration versus TNA concentration). Significant decreases in antibody titer and concentration were observed over time when compared for the number of days from the last AVA injection ( P < 0.0001 for both anti-PA and TNA concentration) and for the number of days from the first plasmapheresis ( P = 0.0007 for anti-PA concentration and P = 0.0025 for TNA concentration). The rate of the decrease in total IgG concentration (half-life [ t 1/2 ] = 198.90 days after first plasmapheresis) was significantly less than the decrease in anti-PA IgG ( t 1/2 = 63.53 days) ( P < 0.0001), indicating that the reduction in anti-PA IgG was more likely due to natural decay than plasmapheresis. The time since the last injection and the time after initial plasmapheresis are important elements in considering an optimal schedule for collecting anthrax hyperimmune plasma. Good correlation between IgG to PA and TNA antibodies suggests that the anti-PA enzyme-linked immunosorbent assay can be used as a high-throughput screen for functional immune reactivity in donor plasma units.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2978719/

Transient Increase in Cyclic AMP Localized to Macrophage Phagosomes

Cyclic AMP (cAMP) regulates many biological processes and cellular functions. The importance of spatially localized intracellular gradients of cAMP is increasingly appreciated. Previous work in macrophages has shown that cAMP is produced during phagocytosis and that elevated cAMP levels suppress host defense functions, including generation of proinflammatory mediators, phagocytosis and killing. However, the spatial and kinetic characteristics of cAMP generation in phagocytosing macrophages have yet to be examined. Using a Förster resonance energy transfer (FRET)-based cAMP biosensor, we measured the generation of cAMP in live macrophages. We detected no difference in bulk intracellular cAMP levels between resting cells and cells actively phagocytosing IgG-opsonized particles. However, analysis with the biosensor revealed a rapid decrease in FRET signal corresponding to a transient burst of cAMP production localized to the forming phagosome. cAMP levels returned to baseline after the particle was internalized. These studies indicate that localized increases in cAMP accompany phagosome formation and provide a framework for a more complete understanding of how cAMP regulates macrophage host defense functions. Introduction Resident macrophages are essential in containing and controlling infections by recognizing and destroying invading pathogens. Phagocytosis, the process by which macrophages internalize microbes, apoptotic cells and small particles, is a highly regulated process mediated via phagocytic receptors, such as Fcγ receptors [1] , pattern recognition receptors such as Toll-like receptors [2] , and complement receptors [3] . Once internalized, microbes are confined to an organelle known as the phagosome, which allows them to be targeted for killing by a variety of microbicidal mechanisms while remaining segregated from the rest of the cell [4] . One important regulator of macrophage function is the second messenger, cyclic adenosine monophosphate (cAMP) [5] . The generation of cAMP is initiated when a ligand binds to a G protein-coupled receptor, stimulating the enzyme adenylyl cyclase (AC) to catalyze the cyclization of ATP. The production of cAMP within the cell is tightly regulated, in part through activities of cytoplasmic phosphodiesterases (PDEs) [6] . The intracellular signaling of cAMP is coordinated primarily through two effector molecules: protein kinase A (PKA) and exchange proteins directly activated by cAMP (Epac) [7] . Previous work has shown that PKA and Epac can have distinct, redundant, or even opposing effects within the same cell, and both play important roles in modulating host defense functions in macrophages [8] , [9] . cAMP serves as a negative regulator of phagocyte function [10] and elevated cAMP levels are associated with suppression of innate immune functions including the production of pro-inflammatory mediators, phagocytosis, and microbial killing [5] . Early biochemical and fixed cell microscopy studies indicated that intracellular cAMP production in macrophages and neutrophils increases during phagocytosis [11] , [12] , [13] , [14] , through regulation by PDEs [15] . More recent work has shown that PDEs play an important role in creating discrete subcellular pools of cAMP within the cell, with higher levels of cAMP found at the plasma membrane and within the nucleus and lower levels in the cytosol [16] . Studies employing classical biochemical and fixed-cell microscopy approaches [17] obtain suboptimal kinetic and spatial resolution of cAMP pools. In recent years, the use of techniques based on Förster resonance energy transfer (FRET) have allowed monitoring of cAMP levels in live cells [18] . This provides better spatial and kinetic information about intracellular cAMP dynamics [19] . FRET microscopy has demonstrated that cAMP compartmentalization plays an important role in mediating intracellular signaling events [20] , [21] , [22] . A wide range of cAMP biosensors have been utilized, and these differ considerably in their localization, dynamic range, temporal resolution and signal-to-noise ratios [18] . Other quantitative fluorescence microscopic studies have allowed the component activities of phagocytosis to be resolved into distinct and characteristic patterns [23] , [24] , [25] . Some activities are restricted to the early processes, such as extension of the phagocytic cup, while other activities correspond to later processes such as cup closure. To improve the temporal resolution of cAMP signaling during phagocytosis and to put cAMP signaling in the context of other signaling activities, this study used an Epac-based biosensor and FRET microscopy to measure localized changes in this second messenger during Fcγ receptor-mediated phagocytosis by macrophages. Although no differences in total cellular cAMP levels were detectable, either biochemically or by FRET live-cell microscopy, a transient burst of cAMP production was demonstrable in the immediate vicinity of the forming phagosome. Materials and Methods Cell culture and transfection RAW264.7 macrophage-like cells (American Type Culture Collection) were cultured as previously described [24] . To prepare for microscopy, cells were plated at ∼5×10 5 cells per coverslip (25 mm circular, No. 1.5) and transfected with plasmids using Roche FuGENE 6 according to the manufacturer's protocol (Roche Diagnostics). Coverslips were assembled into temperature-controlled chambers and cells were cultured in Ringers buffer [24] . To measure phagocytosis, opsonized sheep erythrocytes were prepared and added to the macrophages as previously described [26] . Plasmids and protein purification The Epac1-camps plasmid [27] (generously provided by Martin Lohse, University of Wurzburg) was either used directly or its YFP domain was mutated to Citrine (YFP-Q69M) by the Quickchange Method (Stratagene). In addition, plasmids for monomeric CFP (mCFP), monomeric citrine (mCit), linked mCFP-YFP (G4) and linked mCFP-mCit (C4) were also used as experimental and ratiometric controls [28] . All DNA sequences were confirmed at the University of Michigan DNA Sequencing Core. cAMP biochemical assay RAW264.7 cells were cultured overnight and incubated with the AC activator forskolin (200 µM) or the Bacillus anthracis Edema Toxin (EdTx) (1.0 µg/ml protective antigen and 0.5 µg/ml edema factor; BEI Resources, Manassas, VA), a microbial AC [29] , for the indicated time intervals. During the last 20 min of the incubation, opsonized sRBCs were added at a ratio of 20∶1. After treatments, cells were lysed with 0.1 M HCl and intracellular cAMP levels were determined by ELISA according to manufacturer's instructions (Cayman Chemical) [30] . Image acquisition and processing Images were collected using a wide field Nikon Eclipse TE-300 inverted microscope as previously described [31] . Excitation and emission filters were positioned to visualize mCFP (I D ): excitation (ex) 430±12.5 nm, emission (em) 470±15 nm; mCit or YFP (I A ): ex 500±10 nm, em 535±15 nm; and FRET (I F ): ex 430±12.5, em 535±15 nm. A series of four images (phase-contrast, I D , I A , and I F ) were recorded every 30 seconds. The FRET calculator (Center for Live Cell Imaging, University of Michigan, available on request) was used to perform image processing based on the equations of FRET stoichiometry [28] . Briefly, I D , I A , and I F images were corrected first by subtracting camera noise (bias correction) and then for unevenness in the field of illumination (shading correction). FRET calibration constants were obtained for the microscope using images of cells expressing mCit, mCFP and the control linked mCFP-mCit molecule (C4 control). The calibrated microscope was then used to calculate a corrected fluorescence FRET image (E A ), which reports FRET efficiency corrected for variations in cell thickness. To measure relative changes in donor and acceptor photobleaching. the molar ratio of mCit to CFP (R I ) was calculated for each image. Particle tracking and processing The particle tracking algorithm in the FRET calculator was used to measure differences in E A and R I at and around the forming phagosome (regions R1-R5), and in the total cell (T C ), in cells expressing either Epac-camps or C4 control. A 2.3 µm radius circular region (R1) was drawn around the target erythrocyte and 4 additional concentric regions with radii of 4.6 µm (R2), 6.9 µm (R3), 9.2 µm (R4) and 11.5 µm (R5) were drawn. The target was tracked on the phase-contrast image throughout the time series and was used to position the measurement circles. To synchronize multiple phagocytic events, the beginning of phagocytosis was identified in each time series as the first frame in which pseudopod extension and cup formation were detectable (as seen in the I A image). To account for differential photobleaching of donor and acceptor, E A for each concentric region (R1-R5) was divided by E A for the entire cell (T C ). To determine differences between background FRET and intracellular cAMP production, the normalized E A Epac-camps R1-R5 was subtracted from the corresponding normalized E A C4 R1-R5 images. To verify that observed changes were not due to acceptor photobleaching, the same analysis was performed using the R I images from C4 control- and Epac-camps-expressing cells. Statistical analysis Data are presented as mean ± SEM and were analyzed with the Prism 4.0 statistical program (GraphPad Software). The group means for different treatments were compared by ANOVA. When significant differences were identified, individual comparisons were subsequently analyzed using an unpaired t test with Bonferroni correction. Statistical significance was set at a p value <0.05. Cell culture and transfection RAW264.7 macrophage-like cells (American Type Culture Collection) were cultured as previously described [24] . To prepare for microscopy, cells were plated at ∼5×10 5 cells per coverslip (25 mm circular, No. 1.5) and transfected with plasmids using Roche FuGENE 6 according to the manufacturer's protocol (Roche Diagnostics). Coverslips were assembled into temperature-controlled chambers and cells were cultured in Ringers buffer [24] . To measure phagocytosis, opsonized sheep erythrocytes were prepared and added to the macrophages as previously described [26] . Plasmids and protein purification The Epac1-camps plasmid [27] (generously provided by Martin Lohse, University of Wurzburg) was either used directly or its YFP domain was mutated to Citrine (YFP-Q69M) by the Quickchange Method (Stratagene). In addition, plasmids for monomeric CFP (mCFP), monomeric citrine (mCit), linked mCFP-YFP (G4) and linked mCFP-mCit (C4) were also used as experimental and ratiometric controls [28] . All DNA sequences were confirmed at the University of Michigan DNA Sequencing Core. cAMP biochemical assay RAW264.7 cells were cultured overnight and incubated with the AC activator forskolin (200 µM) or the Bacillus anthracis Edema Toxin (EdTx) (1.0 µg/ml protective antigen and 0.5 µg/ml edema factor; BEI Resources, Manassas, VA), a microbial AC [29] , for the indicated time intervals. During the last 20 min of the incubation, opsonized sRBCs were added at a ratio of 20∶1. After treatments, cells were lysed with 0.1 M HCl and intracellular cAMP levels were determined by ELISA according to manufacturer's instructions (Cayman Chemical) [30] . Image acquisition and processing Images were collected using a wide field Nikon Eclipse TE-300 inverted microscope as previously described [31] . Excitation and emission filters were positioned to visualize mCFP (I D ): excitation (ex) 430±12.5 nm, emission (em) 470±15 nm; mCit or YFP (I A ): ex 500±10 nm, em 535±15 nm; and FRET (I F ): ex 430±12.5, em 535±15 nm. A series of four images (phase-contrast, I D , I A , and I F ) were recorded every 30 seconds. The FRET calculator (Center for Live Cell Imaging, University of Michigan, available on request) was used to perform image processing based on the equations of FRET stoichiometry [28] . Briefly, I D , I A , and I F images were corrected first by subtracting camera noise (bias correction) and then for unevenness in the field of illumination (shading correction). FRET calibration constants were obtained for the microscope using images of cells expressing mCit, mCFP and the control linked mCFP-mCit molecule (C4 control). The calibrated microscope was then used to calculate a corrected fluorescence FRET image (E A ), which reports FRET efficiency corrected for variations in cell thickness. To measure relative changes in donor and acceptor photobleaching. the molar ratio of mCit to CFP (R I ) was calculated for each image. Particle tracking and processing The particle tracking algorithm in the FRET calculator was used to measure differences in E A and R I at and around the forming phagosome (regions R1-R5), and in the total cell (T C ), in cells expressing either Epac-camps or C4 control. A 2.3 µm radius circular region (R1) was drawn around the target erythrocyte and 4 additional concentric regions with radii of 4.6 µm (R2), 6.9 µm (R3), 9.2 µm (R4) and 11.5 µm (R5) were drawn. The target was tracked on the phase-contrast image throughout the time series and was used to position the measurement circles. To synchronize multiple phagocytic events, the beginning of phagocytosis was identified in each time series as the first frame in which pseudopod extension and cup formation were detectable (as seen in the I A image). To account for differential photobleaching of donor and acceptor, E A for each concentric region (R1-R5) was divided by E A for the entire cell (T C ). To determine differences between background FRET and intracellular cAMP production, the normalized E A Epac-camps R1-R5 was subtracted from the corresponding normalized E A C4 R1-R5 images. To verify that observed changes were not due to acceptor photobleaching, the same analysis was performed using the R I images from C4 control- and Epac-camps-expressing cells. Statistical analysis Data are presented as mean ± SEM and were analyzed with the Prism 4.0 statistical program (GraphPad Software). The group means for different treatments were compared by ANOVA. When significant differences were identified, individual comparisons were subsequently analyzed using an unpaired t test with Bonferroni correction. Statistical significance was set at a p value <0.05. Results Biochemical and FRET-based cAMP measurements in macrophages To verify that changes in cAMP levels could be detected using these methods, RAW cells were incubated with forskolin for 20 min or EdTx for 3 h (based on pilot studies showing that these incubation times yielded maximal increases in cAMP) in the presence or absence of an opsonized phagocytic target ( Figure 1A ). cAMP was not detectable by ELISA in untreated RAW cells, but increased to measurable levels following addition of either forskolin or EdTx. EdTx resulted in 7.5-fold greater levels of cAMP than did forskolin. The addition of a phagocytic target had no effect on total cAMP levels measured in macrophages otherwise incubated with forskolin or EdTx alone ( Figure 1A ). 10.1371/journal.pone.0013962.g001 Figure 1 Changes in cAMP measured by biochemical and FRET microscopic methods in macrophages. A. RAW cells were plated overnight at 2×10 6 cells per well and stimulated with 200 µM forskolin for 20 min or with EdTx for 3 h. During the final 20 min incubation, either PBS (blank bars) or opsonized sRBCs (open bars) were added to cells as indicated. Total cAMP was quantified as described in material and methods . Data represent the mean ± SEM. B. and C. Cells expressing C4 control (B) or the Epac-camps biosensor (C) were either analyzed directly or following treatment with the indicated compounds. The relative amount of FRET after each condition was determined and the results are graphed as mean ± SEM (n = 50–100 cells per condition). D. A representative phase-contrast (top) and corresponding E A image (bottom) of an untreated or EdTx-treated macrophage. Color bar indicates scale of ratio and scale bar is 10 µm. To localize cAMP in live macrophages, we used a previously described biosensor, Epac-camps, which distributes uniformly through cytoplasm in cells [27] . Binding of cAMP causes a conformational change in Epac-camps, resulting in a decreased FRET signal [27] . Preliminary studies optimized the Epac-camps biosensor for measuring cAMP in macrophages during phagocytosis. Preliminary experiments using the linked mCFP-YFP (G4) revealed cAMP-independent changes in FRET during phagocytosis. We reasoned that these changes in FRET signal resulted from decreases in cytoplasmic pH near forming phagosomes, as YFP fluorescence can be affected by cytoplasmic pH [23] . We therefore improved the mCFP-YFP Epac-camps by creating a single point mutation in its YFP domain (Q69M), creating a mCFP-mCIT Epac-camps biosensor that was relatively unaffected by fluctuations in cytoplasmic pH [28] . RAW cells were transfected with either the C4 control plasmid (mCFP covalently linked to mCit) or the mCFP-mCit Epac-camps biosensor and FRET was detected as the processed E A image. E A in cells transfected with the C4 control plasmid was 0.448±0.004 ( Figure 1B ). Likewise, cells transfected with the modified Epac-camps biosensor had a measured E A value of 0.254±0.002 ( Figure 1C ). When cells were incubated with forskolin, E A decreased 5% in Epac-camps-expressing cells, indicating an increase in intracellular cAMP. E A of control C4-expressing cells was unchanged after incubation with forskolin. Furthermore, EdTx treatment produced a 10% decrease in E A in Epac-camps-expressing cells, but no change in the control cells. Thus, the biosensor-derived measurements confirmed the biochemical data indicating that EdTx was a more potent enhancer of intracellular cAMP than was forskolin. Attempts to measure decreases in intracellular cAMP elicited by incubating cells with an adenylyl cyclase inhibitor (SQ-22536) and a Gαi-coupled ligand, leukotriene B 4 . did not detect any increases in FRET signal under either of these conditions This indicated that resting cellular cAMP levels are on the low end of the probe's dynamic range, such that most probe molecules in cytoplasm do not contain bound cAMP. Thus, a decrease in cAMP concentrations would not be reported by the Epac-camps biosensor. Our data thus confirm that RAW cells can make cAMP in response to stimulation and cAMP increases at the whole cell level can be measured both biochemically and by using a FRET-based cAMP biosensor. Effects of macrophage phagocytosis on total cellular cAMP levels Having verified that changes in intracellular cAMP could be measured in live cells using the modified Epac-camps biosensor, we next examined cAMP levels in macrophages during phagocytosis. RAW cells were transfected with either the control C4 plasmid or the plasmid encoding the Epac-camps biosensor, and the total cellular FRET was measured in individual cells during 20 min incubations with or without opsonized sRBCs ( Figure 2 ). Intracellular expression levels of the C4 control and the Epac-camps biosensor were similar to each other. Additionally, all transfected cells bound and internalized opsonized targets at rates similar to non-transfected cells (internalization completed within approximately 7 min). During imaging of live cells, the total cell E A decreased slightly over time ( Figure 2A ) in both the Epac-camps and the C4 control cells, indicating acceptor photobleaching. This was supported by measurements of R I , which also indicated minor photobleaching. However, the rates of decrease in E A were the same for C4 control and the Epac-camps. Addition of opsonized targets did not produce significant changes in total E A values or the rates of E A decrease due to photobleaching ( Figure 2B ). 10.1371/journal.pone.0013962.g002 Figure 2 No change in total cAMP during phagocytosis. RAW cells were transfected with plasmids for C4 control or the Epac-camps biosensor. Total cellular E A was measured over time and plotted relative to the first measured value. A. Measurements of unfed macrophages showed small decreases in FRET, indicating selective photobleaching of mCit. B. Transfected cells were fed opsonized targets and phagocytosis was synchronized as described in material and methods . No significant changes in cAMP were detectable during phagocytosis. Results are shown as mean ± SEM of 4–7 cells. To investigate whether the number of particles ingested correlated with changes in intracellular cAMP concentrations, macrophages were incubated with opsonized sRBCs for 1 h and then cAMP was measured using FRET microscopy ( Figure 3 ). Calculation of E A as a function of the number of ingested particles revealed that total cellular cAMP levels were constant at all phagocytic loads ( Figures 3A and B ). 10.1371/journal.pone.0013962.g003 Figure 3 Levels of intracellular cAMP are independent of the number of particles phagocytosed. RAW cells were plated at 5×10 5 cells per coverslip and transfected with plasmids encoding the C4 control (A) or the mCFP-mCit Epac-camps biosensor (B). Opsonized sRBCs were then added to the cultures and cells were permitted to phagocytose for 1 h at 37°C. Non-ingested sRBCs were washed away and the images were collected and analyzed. There was no significant correlation between E A and the number of sRBCs ingested in the C4 control (A, p = 0.5509) or Epac-camps (B, p = 0.7879) cells, when analyzed by linear regression (n = 50–52 cells per condition). Levels of cAMP near forming phagosomes We next examined subregions of cells to determine whether cAMP levels increased near the forming phagosomes. Cell expressing either C4 control or Epac-camps were incubated with opsonized sRBCs and the amount of total cellular FRET as well as the FRET in concentric regions of interest around the forming phagosome were measured. The results were plotted as the difference between signals from Epac-camps and C4 control cells in each of the subregions, processed for both E A ( Figure 4A ) and R I ( Figure 4B ). The interaction between the opsonized target and cellular Fcγ receptors resulted in a transient gradient of cAMP radiating from the forming phagosome. This was indicated by significant changes in E A in Epac-camps-expressing cells. Regions closest to the phagosome (R1 and R2) exhibited significantly elevated cAMP ( Figure 4A and D ). Levels of cAMP increased at the plasma membrane approximately 1 min after the initiation of phagocytosis, remained high for several minutes, and then returned to baseline levels following completion of phagosome formation. We observed no changes in E A in cells expressing C4 control ( Figure 4C ), confirming that the changes observed in Epac-camps-expressing cells were indeed due to changes in intracellular cAMP. In addition, the mCit/mCFP ratio R I did not change significantly during phagocytosis by Epac-camps-expressing cells ( Figure 4B ), further indicating that the changes in E A did not reflect selective photobleaching of fluorescent proteins. 10.1371/journal.pone.0013962.g004 Figure 4 Transient burst of cAMP at the developing phagosome. RAW cells expressing C4 or the Epac-camps biosensor were fed opsonized targets and component images for phase-contrast and FRET were taken every 30 sec to capture the phagocytic process from initiation to closure of the phagocytic cup. A. and B. Left insert: A phase-contrast (top) and corresponding E A image (bottom) of intact live macrophages transfected with C4 control (A) or Epac-camps (B), from the designated time intervals. Right inserts: One minute time course of a magnified portion of the cell transfected with the specified plasmid (beginning immediately after the sRBCs were added to the culture). The red circle denotes the location of the opsonized sRBC on the E A image. Color bar indicates scale of ratio and scale bar is 10 µm in the left insert and 5 µm.in the right insert C. To normalize for non-specific cAMP-mediated effects during phagocytosis, the data are shown as the phagosome-specific difference in E A between C4 control and Epac-camps (ec) biosensor-expressing cells. (ie., (E A(C4-phago) /E A(C4-cell) ) − (E A(ec-phago) /E A(ec-cell) ); n = 10 cells) D. To verify that the differences seen between cells transfected with the C4 control construct and the Epac-camps construct were not due to selective bleaching of one of the fluorescent proteins, the R I values are plotted (ie., (R I(C4-phago) /R I(C4-cell) ) − (R I(ec-phago) /R I(ec-cell) )). Biochemical and FRET-based cAMP measurements in macrophages To verify that changes in cAMP levels could be detected using these methods, RAW cells were incubated with forskolin for 20 min or EdTx for 3 h (based on pilot studies showing that these incubation times yielded maximal increases in cAMP) in the presence or absence of an opsonized phagocytic target ( Figure 1A ). cAMP was not detectable by ELISA in untreated RAW cells, but increased to measurable levels following addition of either forskolin or EdTx. EdTx resulted in 7.5-fold greater levels of cAMP than did forskolin. The addition of a phagocytic target had no effect on total cAMP levels measured in macrophages otherwise incubated with forskolin or EdTx alone ( Figure 1A ). 10.1371/journal.pone.0013962.g001 Figure 1 Changes in cAMP measured by biochemical and FRET microscopic methods in macrophages. A. RAW cells were plated overnight at 2×10 6 cells per well and stimulated with 200 µM forskolin for 20 min or with EdTx for 3 h. During the final 20 min incubation, either PBS (blank bars) or opsonized sRBCs (open bars) were added to cells as indicated. Total cAMP was quantified as described in material and methods . Data represent the mean ± SEM. B. and C. Cells expressing C4 control (B) or the Epac-camps biosensor (C) were either analyzed directly or following treatment with the indicated compounds. The relative amount of FRET after each condition was determined and the results are graphed as mean ± SEM (n = 50–100 cells per condition). D. A representative phase-contrast (top) and corresponding E A image (bottom) of an untreated or EdTx-treated macrophage. Color bar indicates scale of ratio and scale bar is 10 µm. To localize cAMP in live macrophages, we used a previously described biosensor, Epac-camps, which distributes uniformly through cytoplasm in cells [27] . Binding of cAMP causes a conformational change in Epac-camps, resulting in a decreased FRET signal [27] . Preliminary studies optimized the Epac-camps biosensor for measuring cAMP in macrophages during phagocytosis. Preliminary experiments using the linked mCFP-YFP (G4) revealed cAMP-independent changes in FRET during phagocytosis. We reasoned that these changes in FRET signal resulted from decreases in cytoplasmic pH near forming phagosomes, as YFP fluorescence can be affected by cytoplasmic pH [23] . We therefore improved the mCFP-YFP Epac-camps by creating a single point mutation in its YFP domain (Q69M), creating a mCFP-mCIT Epac-camps biosensor that was relatively unaffected by fluctuations in cytoplasmic pH [28] . RAW cells were transfected with either the C4 control plasmid (mCFP covalently linked to mCit) or the mCFP-mCit Epac-camps biosensor and FRET was detected as the processed E A image. E A in cells transfected with the C4 control plasmid was 0.448±0.004 ( Figure 1B ). Likewise, cells transfected with the modified Epac-camps biosensor had a measured E A value of 0.254±0.002 ( Figure 1C ). When cells were incubated with forskolin, E A decreased 5% in Epac-camps-expressing cells, indicating an increase in intracellular cAMP. E A of control C4-expressing cells was unchanged after incubation with forskolin. Furthermore, EdTx treatment produced a 10% decrease in E A in Epac-camps-expressing cells, but no change in the control cells. Thus, the biosensor-derived measurements confirmed the biochemical data indicating that EdTx was a more potent enhancer of intracellular cAMP than was forskolin. Attempts to measure decreases in intracellular cAMP elicited by incubating cells with an adenylyl cyclase inhibitor (SQ-22536) and a Gαi-coupled ligand, leukotriene B 4 . did not detect any increases in FRET signal under either of these conditions This indicated that resting cellular cAMP levels are on the low end of the probe's dynamic range, such that most probe molecules in cytoplasm do not contain bound cAMP. Thus, a decrease in cAMP concentrations would not be reported by the Epac-camps biosensor. Our data thus confirm that RAW cells can make cAMP in response to stimulation and cAMP increases at the whole cell level can be measured both biochemically and by using a FRET-based cAMP biosensor. Effects of macrophage phagocytosis on total cellular cAMP levels Having verified that changes in intracellular cAMP could be measured in live cells using the modified Epac-camps biosensor, we next examined cAMP levels in macrophages during phagocytosis. RAW cells were transfected with either the control C4 plasmid or the plasmid encoding the Epac-camps biosensor, and the total cellular FRET was measured in individual cells during 20 min incubations with or without opsonized sRBCs ( Figure 2 ). Intracellular expression levels of the C4 control and the Epac-camps biosensor were similar to each other. Additionally, all transfected cells bound and internalized opsonized targets at rates similar to non-transfected cells (internalization completed within approximately 7 min). During imaging of live cells, the total cell E A decreased slightly over time ( Figure 2A ) in both the Epac-camps and the C4 control cells, indicating acceptor photobleaching. This was supported by measurements of R I , which also indicated minor photobleaching. However, the rates of decrease in E A were the same for C4 control and the Epac-camps. Addition of opsonized targets did not produce significant changes in total E A values or the rates of E A decrease due to photobleaching ( Figure 2B ). 10.1371/journal.pone.0013962.g002 Figure 2 No change in total cAMP during phagocytosis. RAW cells were transfected with plasmids for C4 control or the Epac-camps biosensor. Total cellular E A was measured over time and plotted relative to the first measured value. A. Measurements of unfed macrophages showed small decreases in FRET, indicating selective photobleaching of mCit. B. Transfected cells were fed opsonized targets and phagocytosis was synchronized as described in material and methods . No significant changes in cAMP were detectable during phagocytosis. Results are shown as mean ± SEM of 4–7 cells. To investigate whether the number of particles ingested correlated with changes in intracellular cAMP concentrations, macrophages were incubated with opsonized sRBCs for 1 h and then cAMP was measured using FRET microscopy ( Figure 3 ). Calculation of E A as a function of the number of ingested particles revealed that total cellular cAMP levels were constant at all phagocytic loads ( Figures 3A and B ). 10.1371/journal.pone.0013962.g003 Figure 3 Levels of intracellular cAMP are independent of the number of particles phagocytosed. RAW cells were plated at 5×10 5 cells per coverslip and transfected with plasmids encoding the C4 control (A) or the mCFP-mCit Epac-camps biosensor (B). Opsonized sRBCs were then added to the cultures and cells were permitted to phagocytose for 1 h at 37°C. Non-ingested sRBCs were washed away and the images were collected and analyzed. There was no significant correlation between E A and the number of sRBCs ingested in the C4 control (A, p = 0.5509) or Epac-camps (B, p = 0.7879) cells, when analyzed by linear regression (n = 50–52 cells per condition). Levels of cAMP near forming phagosomes We next examined subregions of cells to determine whether cAMP levels increased near the forming phagosomes. Cell expressing either C4 control or Epac-camps were incubated with opsonized sRBCs and the amount of total cellular FRET as well as the FRET in concentric regions of interest around the forming phagosome were measured. The results were plotted as the difference between signals from Epac-camps and C4 control cells in each of the subregions, processed for both E A ( Figure 4A ) and R I ( Figure 4B ). The interaction between the opsonized target and cellular Fcγ receptors resulted in a transient gradient of cAMP radiating from the forming phagosome. This was indicated by significant changes in E A in Epac-camps-expressing cells. Regions closest to the phagosome (R1 and R2) exhibited significantly elevated cAMP ( Figure 4A and D ). Levels of cAMP increased at the plasma membrane approximately 1 min after the initiation of phagocytosis, remained high for several minutes, and then returned to baseline levels following completion of phagosome formation. We observed no changes in E A in cells expressing C4 control ( Figure 4C ), confirming that the changes observed in Epac-camps-expressing cells were indeed due to changes in intracellular cAMP. In addition, the mCit/mCFP ratio R I did not change significantly during phagocytosis by Epac-camps-expressing cells ( Figure 4B ), further indicating that the changes in E A did not reflect selective photobleaching of fluorescent proteins. 10.1371/journal.pone.0013962.g004 Figure 4 Transient burst of cAMP at the developing phagosome. RAW cells expressing C4 or the Epac-camps biosensor were fed opsonized targets and component images for phase-contrast and FRET were taken every 30 sec to capture the phagocytic process from initiation to closure of the phagocytic cup. A. and B. Left insert: A phase-contrast (top) and corresponding E A image (bottom) of intact live macrophages transfected with C4 control (A) or Epac-camps (B), from the designated time intervals. Right inserts: One minute time course of a magnified portion of the cell transfected with the specified plasmid (beginning immediately after the sRBCs were added to the culture). The red circle denotes the location of the opsonized sRBC on the E A image. Color bar indicates scale of ratio and scale bar is 10 µm in the left insert and 5 µm.in the right insert C. To normalize for non-specific cAMP-mediated effects during phagocytosis, the data are shown as the phagosome-specific difference in E A between C4 control and Epac-camps (ec) biosensor-expressing cells. (ie., (E A(C4-phago) /E A(C4-cell) ) − (E A(ec-phago) /E A(ec-cell) ); n = 10 cells) D. To verify that the differences seen between cells transfected with the C4 control construct and the Epac-camps construct were not due to selective bleaching of one of the fluorescent proteins, the R I values are plotted (ie., (R I(C4-phago) /R I(C4-cell) ) − (R I(ec-phago) /R I(ec-cell) )). Discussion This study investigated the spatial and temporal dynamics of cAMP in live phagocytosing macrophages. Using cAMP FRET biosensors, we show that levels of cAMP rise quickly at the nascent phagocytic cup and return to baseline following internalization of the particle. The timing of this localized rise in cAMP indicates that it contributes to phagosome formation. Previous studies measuring cAMP in phagocytes with biochemical assays and fixed-cell microscopy were limited in their temporal resolution. Using radioimmunoassays, total cAMP was measured at different time points during Fcγ receptor-mediated phagocytosis in neutrophils or Kupffer cells. Increases in total cAMP were observed between 30 sec and 15 min after addition of an opsonized target and those levels returned to baseline after 3 and 60 min [11] , [12] , [13] . Studies of fixed neutrophils using an antibody against cAMP showed a uniform distribution of cAMP throughout the cytoplasm of unstimulated cells [14] . Upon phagocytic challenge with an opsonized target, higher concentrations of cAMP were localized to the forming phagosome [14] . The FRET microscopic method introduced here has the advantages of providing high specificity for cAMP and good temporal and spatial resolution. Its disadvantages include a weak signal and a small dynamic range. Mutation of YFP to Citrine in Epac-camps improved the probe's specificity for cAMP by reducing potential artifacts resulting from local fluctuations in cytoplasmic pH. The probe was bright enough to permit image acquisition every 30 seconds, allowing measurement of localized increases in cAMP throughout the 7- to 8-minute process of phagocytosis. However, like most linked FRET biosensors, the Epac-camps probe exhibited a limited dynamic range. Binding of cAMP to Epac-camps resulted in a small decrease in FRET efficiency: the fluorescent proteins are bright but the measurable shift in FRET is a weak signal. Such small differences in FRET efficiency can be problematic when trying to detect localized signals surrounded by cytoplasm, especially in thick cells. Moreover, the maximum and minimum FRET efficiencies reported by the biosensor are restricted to the small range of cAMP concentrations above and below the binding affinity of Epac. The weak signal and small dynamic range of Epac-camps explain why the decrease in FRET signals from cells treated with EdTx or forskolin were less dramatic than the increases in signals reported by the biochemical assay. Likewise, the failure of the probe to report decreases in cAMP concentrations indicates that concentrations of cAMP in unstimulated macrophages are at or below the lower limit of detection by Epac-camps. Thus, the probes were adequate to report transient increases in cAMP near forming phagosomes but would have likely missed smaller foci of elevated cAMP or any local decrease in cAMP. Although we did not observe any differences in bulk cAMP during macrophage phagocytosis by RAW macrophages ( Figure 2 ), a transient increase in cAMP was localized to the forming phagosome ( Figure 4 ). Previous work has shown that elevated cAMP inhibits both internalization of opsonized particles [32] and the recruitment of proteins necessary for pathogen destruction [9] . Although only the phagocytosis of opsonized sRBCs was utilized in this assay, we hypothesize that there would also be different levels of cAMP generated in response to other internalized particles, particularity bacteria. Previous work has shown using fixed-cell microscopy and biochemical assays that cAMP is transiently localized to the forming phagosome when the cells are ingesting opsonized zymosan particles [11] , [12] , [13] , [14] , [15] . Additionally, increased levels of cAMP have been linked to reduced actin assembly, inhibition of phagosome-lysosome fusion and acidification, and increased intraphagosomal growth of pathogens [33] . For these reasons, our results showing transient elevation of cAMP during the initial formation of the phagosome appear surprising. It is possible that a transient and localized burst of cAMP plays a role in mediating phagosome formation, although further studies will be necessary to clarify the functional importance of this finding. Additional work is also needed to further elucidate the spatial and kinetic effects of cAMP on phagosome trafficking and eventual pathogen destruction. The regulation of intracellular cAMP is essential to a variety of signal transduction events within cells. Previous work has shown a correlation between the amount of cAMP produced at the phagosome and the ability of the cell to internalize and kill an invading pathogen [33] . The importance of cAMP as a negative regulator of phagocyte function is further indicated by the fact that several pathogenic microorganisms elevate cAMP in target host cells [5] . Pathogens use cAMP to disable phagocytosis, intracellular killing and inflammatory mediator generation, thus allowing the pathogen to gain an advantage against the host. Perhaps premature elevation of cAMP by toxins or immunomodulatory compounds inhibits phagocytosis by prematurely inactivating essential early activities. These studies extend our understanding of cAMP signaling in phagocytosing macrophages by putting its dynamics into the context of signaling for phagocytosis. This is essential for understanding host pathogen interactions and the immunomodulatory effects of therapeutic agents that modulate cAMP levels.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5983249/

A Genomic and Proteomic Approach to Identify and Quantify the Expressed Bacillus thuringiensis Proteins in the Supernatant and Parasporal Crystal

The combined analysis of genomic and proteomic data allowed us to determine which cry and vip genes are present in a Bacillus thuringiensis ( Bt ) isolate and which ones are being expressed. Nine Bt isolates were selected from Spanish collections of Bt based on their vip1 and vip2 gene content. As a first step, nine isolates were analyzed by PCR to select those Bt isolates that contained genes with the lowest similarity to already described vip1 and vip2 genes (isolates E-SE10.2 and O-V84.2). Two selected isolates were subjected to a combined genomic and proteomic analysis. The results showed that the Bt isolate E-SE10.2 codifies for two new vegetative proteins, Vip2Ac-like_1 and Sip1Aa-like_1, that do not show expression differences at 24 h vs. 48 h and are expressed in a low amount. The Bt isolate O-V84.2 codifies for three new vegetative proteins, Vip4Aa-like_1, Vip4Aa-like_2, and Vip2Ac-like_2, that are marginally expressed. The Vip4Aa-like_1 protein was two-fold more abundant at 24 h vs. 48 h, while the Vip4Aa-like_2 was detected only at 24 h. For Vip2Ac-like_2, no differences in expression were found at 24 h vs. 48 h. Moreover, the parasporal crystal of the E-SE10.2 isolate contains a single type of crystal protein, Cry23Aa-like, while the parasporal crystal from O-V84.2 contains three kinds of crystal proteins: 7.0–9.8% weight of Cry45Aa-like proteins, 35–37% weight of Cry32-like proteins and 2.8–4.3% weight of Cry73-like protein. 1. Introduction Bacillus thuringiensis ( Bt ) is an entomopathogenic bacterium that produces several types of insecticidal proteins, such as Cry, Cyt, Vip, Sip, Mtx-like, and Bin-like proteins, along with other virulence factors contributing to its pathogenicity [ 1 , 2 ]. The Vip proteins are a family of proteins that are secreted during the vegetative growth phase and that have been classified into four groups according to their sequence homology: Vip1, Vip2, Vip3, and Vip4 [ 2 ]. Because of repeated applications of Bt sprays and the widespread adoption of Bt -crops (transgenic crops protected from insects by the expression of cry and/or vip3 genes), some insect populations have developed resistance to Bt toxins [ 3 , 4 , 5 , 6 ]. Therefore, in this arms race against insects, it is necessary to explore the potential of new insecticidal proteins for pest control. A series of approaches have been used for isolating novel insecticidal protein genes from Bt , such as PCR, which has further evolved into specific applications to mining new insecticidal genes, such as PCR hybridization, PCR-RFLP, E-PCR and PCRSSCP [ 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ]. In addition, the construction of Bt DNA libraries, followed by screening by Western Blotting or a hybridization-based method, has also been used to detect novel insecticidal protein genes [ 12 , 13 , 14 ]. The PCR approaches being used to detect vip genes are based on the presence of conserved blocks in the DNA sequence of these genes [ 11 , 15 ] and most of the studies have focused on genes from the vip3 family. Therefore, the PCR approach is limited to finding vip genes with enough homology to the primers used. An additional problem with the PCR approach is that it does not provide the full length of the new vip genes. On the other hand, the library-based methods are time-consuming and laborious. The next generation sequencing (NGS) allows rapid sequencing of entire genomes at a low cost-effective ratio [ 16 , 17 ]. The number of Bt whole genomes that have been sequenced has increased quickly in the past decade. To date, 459 Bt strains have been sequenced, with a mean genome size ranging from 5.3 MB to 6.7 MB and a mean guanine-cytosine content (GC content) between 34% and 35% ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Bacillus+thuringiensis ). The combination of the low cost NGS with the development of many freeware tools has enabled the rapid detection of insecticidal protein genes at the genome level. On the other hand, the development of the mass spectrometry (MS)-based proteomics has enabled the detection of proteins from complex mixtures from different stages of a microorganism [ 18 ]. The combination of the genomic and proteomic approaches is a very successful approach for validation and correction of predicted genomic coding information in a wide variety of organisms [ 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ]. In this study, the identity of vip genes has been determined in nine Bt isolates which were candidates to harboring new vip1 and vip2 genes (Vip1 and Vip2 constitute a binary toxin and their genes are normally located in an operon). Two of these isolates, which were found to carry vip -type genes with a similarity lower than 45% to already reported genes, were subjected to whole genome sequencing and to different kinds of proteomic analysis to determine and estimate the relative abundance of the expressed insecticidal protein genes. 2. Results 2.1. Identification of Vip1-, Vip2-, and Vip4-Type Genes To identify the specific genes within the vip1 and vip2 gene families, a strategy based on PCR-Sanger Sequencing was used. A first PCR with "screening primers" was performed to confirm the presence of vip genes. The results showed that the nine isolates were positive for the presence of a vip1-type gene, and that seven were positive for the presence of a vip2-type gene ( Table 1 ). Those samples that gave positive for a determined gene type were subjected to a second PCR with "typing primers" to narrow down the identity of the gene. The results allowed us to classify the isolates into two types of isolates containing a vip1–vip2 gene pair: those with a gene pair with high similarity (>95%) to vip2Bb (KR065728)– vip1Bb (KR065727) (V-J20.2 and V-LE1.1), and those with a gene pair with high similarity to vip2Ac (KR065726)– vip1Ca (KR065725) (V-V54.26, V-V54.31, E-TE7.43, E-TE16.5 and E-TE18.40). In addition to these two categories, two isolates were identified to contain just a single vip gene with low similarity to all reported ones; one had the highest similarity to vip1Bb (E-SE10.2) and the other had the highest similarity to vip1Da (O-V84.2), which was later shown to belong to the vip4Aa family ( Table 1 ). 2.2. Genome Sequencing of the Bt Isolates E-SE10.2 and O-V84.2, Contig Assembly and Gene Annotation Whole genome sequencing of the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 resulted in 10,401,436 high quality reads for the Bt isolate E-SE10.2 and 9,210,116 high quality reads for the Bt isolate O-V84.2, with an average length of 150 bp for both Bt isolates. For the E-SE10.2 isolate, the 97.4% of the reads were assembled in 222 scaffolds while for the O-V84.2 isolate the 98.2% of the reads were assembled in 249 scaffolds. For the E-SE10.2 isolate, the results of the assembled paired reads were as follows: genome size of 6.1 Mb, N50 was 71 kb, the GC content 36%, and the longest scaffold length was 258 kb. For the O-V84.2 isolate, the genome size was 6.3 Mb, N50 was 123 kb, the GC content 36%, and the longest scaffold length was 336 kb. Coding sequence prediction of the assembled reads showed that the 222 scaffolds of the E-SE10.2 isolate defined 6156 coding sequences (CDS) and that the 249 scaffolds of the O-V84.2 isolate defined 6457 CDS. For both isolates, the CDS represented the 79% of the length of the bacterial genome, and contained 71.5% of annotated genes, 28.5% of hypothetical genes, and 60–68 tRNAs ( Table 2 ). In addition, for both isolates, 60% of the CDS could be associated to a subsystem category, being more abundant the ones associated with amino acids and derivatives, carbohydrates, protein metabolism, and cofactors, prostetic groups and pigments, in decreasing order ( Figure S1 ). Regarding the insecticidal protein genes present in the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2, the results indicated a total of 24 coding sequences (6 in E-SE10.2 and 18 in O-V84.2) ( Table 3 ). For the Bt isolate E-SE10.2, four out of the six sequences showed homology to a vip gene, one to a sip gene and one to a cry gene ( Table 3 ). In the case of the Bt isolate O-V84.2, 10 out of the 18 sequences showed homology to a vip gene, one to a sip gene and seven to a cry gene ( Table 3 ). 2.3. Global Analysis of the Proteins Identified by in Gel Digestion LC/MSMS Analysis of the Bt Isolates E-SE10.2 and O-V84.2 To determine the proteins that are being expressed in the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2, an LC/MSMS analysis was done. By this method, we first screened the protein content in the concentrated supernatants and in the parasporal crystals at three growth phases, two during the log phase of growth (Phase T1 at 24 h and Phase T2 at 48 h), and one in the stationary phase when the crystal is formed (Phase T3 at 72 h). In the concentrated supernatant at Phase T1, 627 and 225 proteins were identified for E-SE10.2 and O-V84.2, respectively, while, at Phase T2, the number of proteins identified were 637 and 530, respectively. In the case of the proteins identified in the solubilized crystal (Phase T3), the numbers were 512 and 185, respectively. A total of 1791 and 940, respectively, were identified considering the three growth phases together and this represents about the 29.03% and 14.55% of the respective predicted proteins from the genomic data for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2. The pairwise comparison of the identified proteins at the T1, T2 and T3 growth phases showed that the shared expressed proteins of the T1-T2, T2-T3, and T1-T3 phases were 406 and 160, 221 and 73, 219 and 33, respectively, for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2. The identified proteins of Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 at the three growth phases were classified according to their gene ontology (GO) terms ( Figure S2 ). 2.4. Protein Identification of the Expressed Predicted Putative Insecticidal Protein Genes To determine if the predicted insecticidal protein genes are being expressed, the protein expression was assessed by proteomic analysis. We considered a positive identification only those proteins that were identified with both Protein Pilot v4.5 and Mascot algorithms in at least two of the replicates. Considering the two isolates together, we found a total of five secretable proteins (Vip-like and Sip-like) and eight crystal proteins (Cry-like and Mtx-like) ( Table 4 and Tables S1–S3 ). For the E-SE10.2 isolate, only three out of the six putative insecticidal protein genes automatically annotated were found to be expressed ( Table 3 ), and 10 out of 18, in the case of the O-V84.2 isolate (the seven Cry proteins, the Vip2Ac-like_2 protein, and the two Vip4-like proteins). Regarding the Vip2Ac-like_3 protein, it was detected just in one replicate with Mascot ( Table 4 and Table S3 ) and the Sip1Aa-like_2 protein was detected in two replicates, but in one of them only with Mascot ( Table 4 , Tables S1 and S3 ) and, therefore, the Vip2Ac-like_3 and Sip1Aa-like_2 proteins were not considered a positive identification. According to the similarity to the closest homolog, the Vip2Ac-like, Vip4Aa-like, Cry32Aa-like and Sip1Aa-like_2 proteins could be considered new Bt -like proteins (different to Cry, Vip or Sip because of a similarity lower than 45%). Regarding the Cry45Aa-like, Cry73Aa-like, Cry23Aa-like and Sip1Aa-like-1 proteins, according to the similarity to the closest homolog (between 45% and 75%), they could be considered new protein families of their respective reference proteins (e.g., with a different number) ( Table 3 ). Regarding the subcellular localization of the putative insecticidal proteins, we performed an LC/MSMS analysis with the concentrated culture supernatants and with the solubilized crystal proteins ( Table 4 ). In the supernatant of the culture broth, we could detect at 24 h and 48 h the Vip2Ac-like_1, Sip1Aa-like_1 and Cry23Aa-like proteins in the Bt isolate E-SE10.2. For the Bt isolate O-V84.2, we detected Vip4Aa-like_1, Vip4Aa-like_2 and Vip2Ac-like_2 proteins at 24 h, whereas, at 48 h, we detected Vip4Aa-like_1 and Vip2Ac-like_2 proteins ( Table 4 ). In the fraction of solubilized crystal proteins, we detected the Cry23Aa-like protein in the Bt isolate E-SE10.2, while, for the Bt isolate O-V84.2, we detected the Cry45Aa-like_1, Cry45Aa-like_2, Cry45Aa-like_3, Cry32Ea-like, Cry32Eb-like, Cry32Da-like and Cry73Aa-like proteins. The putative insecticidal proteins identified in the supernatant and solubilized crystal agree with the prediction of the SignalIP server 4.0, except for the Cry23Aa-like protein which has been found in the supernatant and in the crystal even though it does not contain signal peptide to be exported out of the cell ( Table 4 ). 2.5. Gene synteny, Conserved Domains and Phylogenetic Analysis of the Expressed Putative Insecticidal Protein Genes In the E-SE10.2 isolate, the vip2Ac-like_1 gene was found in an operon together with a non-expressed vip1Bb-like gene, with the peculiarity that the vip1Bb-like gene was upstream of the vip2Ac-like_1 ( Figure 1 ), contrary to the general relative location of vip1 and vip2 genes in operons. The cry32Aa-like gene was found in an operon with a predicted truncated cry37-like gene. In the O-V84.2 isolate, the genes for the Vip2Ac-like_2, Vip4Aa-like_1, and Vip4Aa-like_2 proteins were found in operons containing the pairs vip2Ac-like_2 – vip4Aa-like_1 and vip2Ac-like_3 – vip4Aa-like_2 ( Figure 1 ). Regarding the cry genes of this isolate, they were found in different scaffolds with different transcription origins ( Figure 1 ). The phylogenetic analysis of the Vip-like and Sip1-like proteins indicate that the Vip4-like, Vip2-like, and Sip1Aa-like_2 create a basal branch in their respective families ( Figure 2 ). Regarding the Cry proteins, the Cry32E-like, Cry45Aa-like, Cry73Aa-like, and Cry23Aa-like proteins fall into their respective clusters, whereas the Cry32Da-like protein falls into the Cry66A cluster ( Figure 3 ). The analysis of the sequences revealed that the vip4Aa-like_1 and vip4Aa-like_2 showed the predicted conserved domains of the PA14 superfamily and the clostridial binary toxin B/anthrax toxin PA, which are present in the Vip1 proteins. The vip2Ac-like_1 , vip2Ac-like_2 and vip2Ac-like_3 genes showed the predicted conserved domain Vip2 superfamily, which is present in the Vip2 proteins. Moreover, vip2Ac-like_2 showed the predicted conserved domain anthrax toxin lethal factor (ATLF) and vip2Ac-like_3 showed one of the two Vip2 superfamily conserved domains present in the Vip2 proteins. The sip1Aa-like genes ( sip1Aa-like_1 and sip1Aa-like_2 ) showed the predicted conserved domain of the MTX superfamily which is present in the Lysinibacillus sphearicus and Clostridium perfringens . Regarding the Cry-like proteins, the analysis of the sequences revealed that the cry23Aa - like gene and the cry45Aa-like genes ( cry45Aa-like_1 , cry45Aa-like_2 , and cry45Aa-like_3 have a similarity of 75% to each other) showed the predicted conserved domain MTX. Among the cry32-like genes, cry32Ea-like and cry32Da-like showed a similarity of 88% to each other (at the amino acid level) and both carried the predicted conserved domains Endotoxin_N, Endotoxin_M, and Delta_Endotoxin_C, which are typical of the three-domain Cry proteins. The cry32Eb-like gene showed low similarity to the other two cry32-like genes (61% amino acid similarity to cry32Ea-like and 64% amino acid similarity to cry32Da-like ) and did not show any conserved domains. The cry73Aa-like gene also showed the predicted conserved domains Endotoxin_N, Endotoxin_M, and Delta_Endotoxin_C. 2.6. Relative Abundance of the Putative Insecticidal Proteins in the Supernatant and in the Crystal of the Bt Isolates E-SE10.2 and O-V84.2 To determine the relative abundance of the putative insecticidal protein genes in the supernatants and crystals of the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2, we performed two types of analyses: first, an emPAI analysis to determine the relative abundance within a same replicate at a given time ( Table 5 and Table S3 ); and, second, a label free analysis to compare between different times in the log phase (T1 vs. T2) ( Table 6 and Table S4 ). The results showed that the putative vegetative insecticidal proteins were minimally expressed in the supernatant of both Bt isolates, being the most abundant protein flagellin FlaA ( Table 5 ). In the Bt isolate E-SE10.2, among the putative insecticidal proteins found in the supernatant, the most abundant in all replicates was the Cry23Aa-like protein. In contrast, for O-V84.2, all secretable proteins were similarly represented ( Table 5 ). Regarding the relative abundance of the proteins in the solubilized crystals, the crystal of E-SE10.2 contained only the Cry23Aa-like protein. In the case of O-V84.2, the percent weight corresponding to Cry proteins was close to the 50% of the solubilized proteins from the crystal ( Table 5 ), being the most abundant, by far, the Cry32Ea-like protein. To be able to compare the expression level of the proteins between 24 h and 48 h, a label free analysis was performed ( Table 6 and Table S4 ). Only the putative insecticidal proteins Vip4Aa-like_1 and Vip4Aa-like_2, from the Bt isolate O-V84.2, showed significant differences at the two growth phases ( Table 5 and Table 6 ). The former increased two-fold at 48 h compared to 24 h ( Table 6 ), and the latter was only found at 24 h but not at 48 h ( Table 5 ). The other proteins found in the supernatant did not show statistical differences in their production at 24 h vs. 48 h. 2.1. Identification of Vip1-, Vip2-, and Vip4-Type Genes To identify the specific genes within the vip1 and vip2 gene families, a strategy based on PCR-Sanger Sequencing was used. A first PCR with "screening primers" was performed to confirm the presence of vip genes. The results showed that the nine isolates were positive for the presence of a vip1-type gene, and that seven were positive for the presence of a vip2-type gene ( Table 1 ). Those samples that gave positive for a determined gene type were subjected to a second PCR with "typing primers" to narrow down the identity of the gene. The results allowed us to classify the isolates into two types of isolates containing a vip1–vip2 gene pair: those with a gene pair with high similarity (>95%) to vip2Bb (KR065728)– vip1Bb (KR065727) (V-J20.2 and V-LE1.1), and those with a gene pair with high similarity to vip2Ac (KR065726)– vip1Ca (KR065725) (V-V54.26, V-V54.31, E-TE7.43, E-TE16.5 and E-TE18.40). In addition to these two categories, two isolates were identified to contain just a single vip gene with low similarity to all reported ones; one had the highest similarity to vip1Bb (E-SE10.2) and the other had the highest similarity to vip1Da (O-V84.2), which was later shown to belong to the vip4Aa family ( Table 1 ). 2.2. Genome Sequencing of the Bt Isolates E-SE10.2 and O-V84.2, Contig Assembly and Gene Annotation Whole genome sequencing of the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 resulted in 10,401,436 high quality reads for the Bt isolate E-SE10.2 and 9,210,116 high quality reads for the Bt isolate O-V84.2, with an average length of 150 bp for both Bt isolates. For the E-SE10.2 isolate, the 97.4% of the reads were assembled in 222 scaffolds while for the O-V84.2 isolate the 98.2% of the reads were assembled in 249 scaffolds. For the E-SE10.2 isolate, the results of the assembled paired reads were as follows: genome size of 6.1 Mb, N50 was 71 kb, the GC content 36%, and the longest scaffold length was 258 kb. For the O-V84.2 isolate, the genome size was 6.3 Mb, N50 was 123 kb, the GC content 36%, and the longest scaffold length was 336 kb. Coding sequence prediction of the assembled reads showed that the 222 scaffolds of the E-SE10.2 isolate defined 6156 coding sequences (CDS) and that the 249 scaffolds of the O-V84.2 isolate defined 6457 CDS. For both isolates, the CDS represented the 79% of the length of the bacterial genome, and contained 71.5% of annotated genes, 28.5% of hypothetical genes, and 60–68 tRNAs ( Table 2 ). In addition, for both isolates, 60% of the CDS could be associated to a subsystem category, being more abundant the ones associated with amino acids and derivatives, carbohydrates, protein metabolism, and cofactors, prostetic groups and pigments, in decreasing order ( Figure S1 ). Regarding the insecticidal protein genes present in the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2, the results indicated a total of 24 coding sequences (6 in E-SE10.2 and 18 in O-V84.2) ( Table 3 ). For the Bt isolate E-SE10.2, four out of the six sequences showed homology to a vip gene, one to a sip gene and one to a cry gene ( Table 3 ). In the case of the Bt isolate O-V84.2, 10 out of the 18 sequences showed homology to a vip gene, one to a sip gene and seven to a cry gene ( Table 3 ). 2.3. Global Analysis of the Proteins Identified by in Gel Digestion LC/MSMS Analysis of the Bt Isolates E-SE10.2 and O-V84.2 To determine the proteins that are being expressed in the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2, an LC/MSMS analysis was done. By this method, we first screened the protein content in the concentrated supernatants and in the parasporal crystals at three growth phases, two during the log phase of growth (Phase T1 at 24 h and Phase T2 at 48 h), and one in the stationary phase when the crystal is formed (Phase T3 at 72 h). In the concentrated supernatant at Phase T1, 627 and 225 proteins were identified for E-SE10.2 and O-V84.2, respectively, while, at Phase T2, the number of proteins identified were 637 and 530, respectively. In the case of the proteins identified in the solubilized crystal (Phase T3), the numbers were 512 and 185, respectively. A total of 1791 and 940, respectively, were identified considering the three growth phases together and this represents about the 29.03% and 14.55% of the respective predicted proteins from the genomic data for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2. The pairwise comparison of the identified proteins at the T1, T2 and T3 growth phases showed that the shared expressed proteins of the T1-T2, T2-T3, and T1-T3 phases were 406 and 160, 221 and 73, 219 and 33, respectively, for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2. The identified proteins of Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 at the three growth phases were classified according to their gene ontology (GO) terms ( Figure S2 ). 2.4. Protein Identification of the Expressed Predicted Putative Insecticidal Protein Genes To determine if the predicted insecticidal protein genes are being expressed, the protein expression was assessed by proteomic analysis. We considered a positive identification only those proteins that were identified with both Protein Pilot v4.5 and Mascot algorithms in at least two of the replicates. Considering the two isolates together, we found a total of five secretable proteins (Vip-like and Sip-like) and eight crystal proteins (Cry-like and Mtx-like) ( Table 4 and Tables S1–S3 ). For the E-SE10.2 isolate, only three out of the six putative insecticidal protein genes automatically annotated were found to be expressed ( Table 3 ), and 10 out of 18, in the case of the O-V84.2 isolate (the seven Cry proteins, the Vip2Ac-like_2 protein, and the two Vip4-like proteins). Regarding the Vip2Ac-like_3 protein, it was detected just in one replicate with Mascot ( Table 4 and Table S3 ) and the Sip1Aa-like_2 protein was detected in two replicates, but in one of them only with Mascot ( Table 4 , Tables S1 and S3 ) and, therefore, the Vip2Ac-like_3 and Sip1Aa-like_2 proteins were not considered a positive identification. According to the similarity to the closest homolog, the Vip2Ac-like, Vip4Aa-like, Cry32Aa-like and Sip1Aa-like_2 proteins could be considered new Bt -like proteins (different to Cry, Vip or Sip because of a similarity lower than 45%). Regarding the Cry45Aa-like, Cry73Aa-like, Cry23Aa-like and Sip1Aa-like-1 proteins, according to the similarity to the closest homolog (between 45% and 75%), they could be considered new protein families of their respective reference proteins (e.g., with a different number) ( Table 3 ). Regarding the subcellular localization of the putative insecticidal proteins, we performed an LC/MSMS analysis with the concentrated culture supernatants and with the solubilized crystal proteins ( Table 4 ). In the supernatant of the culture broth, we could detect at 24 h and 48 h the Vip2Ac-like_1, Sip1Aa-like_1 and Cry23Aa-like proteins in the Bt isolate E-SE10.2. For the Bt isolate O-V84.2, we detected Vip4Aa-like_1, Vip4Aa-like_2 and Vip2Ac-like_2 proteins at 24 h, whereas, at 48 h, we detected Vip4Aa-like_1 and Vip2Ac-like_2 proteins ( Table 4 ). In the fraction of solubilized crystal proteins, we detected the Cry23Aa-like protein in the Bt isolate E-SE10.2, while, for the Bt isolate O-V84.2, we detected the Cry45Aa-like_1, Cry45Aa-like_2, Cry45Aa-like_3, Cry32Ea-like, Cry32Eb-like, Cry32Da-like and Cry73Aa-like proteins. The putative insecticidal proteins identified in the supernatant and solubilized crystal agree with the prediction of the SignalIP server 4.0, except for the Cry23Aa-like protein which has been found in the supernatant and in the crystal even though it does not contain signal peptide to be exported out of the cell ( Table 4 ). 2.5. Gene synteny, Conserved Domains and Phylogenetic Analysis of the Expressed Putative Insecticidal Protein Genes In the E-SE10.2 isolate, the vip2Ac-like_1 gene was found in an operon together with a non-expressed vip1Bb-like gene, with the peculiarity that the vip1Bb-like gene was upstream of the vip2Ac-like_1 ( Figure 1 ), contrary to the general relative location of vip1 and vip2 genes in operons. The cry32Aa-like gene was found in an operon with a predicted truncated cry37-like gene. In the O-V84.2 isolate, the genes for the Vip2Ac-like_2, Vip4Aa-like_1, and Vip4Aa-like_2 proteins were found in operons containing the pairs vip2Ac-like_2 – vip4Aa-like_1 and vip2Ac-like_3 – vip4Aa-like_2 ( Figure 1 ). Regarding the cry genes of this isolate, they were found in different scaffolds with different transcription origins ( Figure 1 ). The phylogenetic analysis of the Vip-like and Sip1-like proteins indicate that the Vip4-like, Vip2-like, and Sip1Aa-like_2 create a basal branch in their respective families ( Figure 2 ). Regarding the Cry proteins, the Cry32E-like, Cry45Aa-like, Cry73Aa-like, and Cry23Aa-like proteins fall into their respective clusters, whereas the Cry32Da-like protein falls into the Cry66A cluster ( Figure 3 ). The analysis of the sequences revealed that the vip4Aa-like_1 and vip4Aa-like_2 showed the predicted conserved domains of the PA14 superfamily and the clostridial binary toxin B/anthrax toxin PA, which are present in the Vip1 proteins. The vip2Ac-like_1 , vip2Ac-like_2 and vip2Ac-like_3 genes showed the predicted conserved domain Vip2 superfamily, which is present in the Vip2 proteins. Moreover, vip2Ac-like_2 showed the predicted conserved domain anthrax toxin lethal factor (ATLF) and vip2Ac-like_3 showed one of the two Vip2 superfamily conserved domains present in the Vip2 proteins. The sip1Aa-like genes ( sip1Aa-like_1 and sip1Aa-like_2 ) showed the predicted conserved domain of the MTX superfamily which is present in the Lysinibacillus sphearicus and Clostridium perfringens . Regarding the Cry-like proteins, the analysis of the sequences revealed that the cry23Aa - like gene and the cry45Aa-like genes ( cry45Aa-like_1 , cry45Aa-like_2 , and cry45Aa-like_3 have a similarity of 75% to each other) showed the predicted conserved domain MTX. Among the cry32-like genes, cry32Ea-like and cry32Da-like showed a similarity of 88% to each other (at the amino acid level) and both carried the predicted conserved domains Endotoxin_N, Endotoxin_M, and Delta_Endotoxin_C, which are typical of the three-domain Cry proteins. The cry32Eb-like gene showed low similarity to the other two cry32-like genes (61% amino acid similarity to cry32Ea-like and 64% amino acid similarity to cry32Da-like ) and did not show any conserved domains. The cry73Aa-like gene also showed the predicted conserved domains Endotoxin_N, Endotoxin_M, and Delta_Endotoxin_C. 2.6. Relative Abundance of the Putative Insecticidal Proteins in the Supernatant and in the Crystal of the Bt Isolates E-SE10.2 and O-V84.2 To determine the relative abundance of the putative insecticidal protein genes in the supernatants and crystals of the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2, we performed two types of analyses: first, an emPAI analysis to determine the relative abundance within a same replicate at a given time ( Table 5 and Table S3 ); and, second, a label free analysis to compare between different times in the log phase (T1 vs. T2) ( Table 6 and Table S4 ). The results showed that the putative vegetative insecticidal proteins were minimally expressed in the supernatant of both Bt isolates, being the most abundant protein flagellin FlaA ( Table 5 ). In the Bt isolate E-SE10.2, among the putative insecticidal proteins found in the supernatant, the most abundant in all replicates was the Cry23Aa-like protein. In contrast, for O-V84.2, all secretable proteins were similarly represented ( Table 5 ). Regarding the relative abundance of the proteins in the solubilized crystals, the crystal of E-SE10.2 contained only the Cry23Aa-like protein. In the case of O-V84.2, the percent weight corresponding to Cry proteins was close to the 50% of the solubilized proteins from the crystal ( Table 5 ), being the most abundant, by far, the Cry32Ea-like protein. To be able to compare the expression level of the proteins between 24 h and 48 h, a label free analysis was performed ( Table 6 and Table S4 ). Only the putative insecticidal proteins Vip4Aa-like_1 and Vip4Aa-like_2, from the Bt isolate O-V84.2, showed significant differences at the two growth phases ( Table 5 and Table 6 ). The former increased two-fold at 48 h compared to 24 h ( Table 6 ), and the latter was only found at 24 h but not at 48 h ( Table 5 ). The other proteins found in the supernatant did not show statistical differences in their production at 24 h vs. 48 h. 3. Discussion A screening of Spanish collections of Bt isolates was undertaken to search for novel members of the Vip family. As a result, nine Bt isolates were selected for harboring new binary insecticidal protein genes of the vip1/vip2 family [ 11 ]. As a first step, the PCR-Sanger Sequencing approach revealed new alleles of already described vip1 and vip2 genes ( vip2Ac2-vip1Ca2 and vip2Bb4-vip1Bb3 ) and two sequences with low similarity to the vip1Bb1 (from the Bt isolate E-SE10.2) and vip4Aa1 (from the Bt isolate O-V84.2) genes. In a second step, the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 were subjected to whole genome sequencing with the Illumina HiSeq-PE150 sequencing platform. Then, the genomes of E-SE10.2 and O-V84.2 were assembled in 222 and 249 scaffolds codifying for 6156 CDS and 6457 CDS, respectively. The CDS predicted for both genomes represented close to the 99% of the total number of genes predicted in the genomes. In addition, from this 99% of the predicted CDS, 28% belonged to hypothetical genes and 72% to annotated genes by the Rast server. Moreover, the results obtained from the automated annotation indicated that both Bt genomes had a similar subsystems category distribution ( Figure S1 ). The supernatants at 24 h (growth Phase T1) and 48 h (growth Phase T2) and the crystal proteins (growth Phase T3) of both Bt isolates were also analyzed and annotated with GO terms ( Figure S2 ). The quantity of the proteins expressed at the three different growth phases for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 were 10.2–3.5% and 10.4–8.2%, 8.3–2.8%, respectively, of their genome encoded sequences. This low percentage of expressed proteins detected indicates that, in our experimental conditions, we only detect a small part of the predicted proteins by the genome data prediction, a phenomenon that has also been found in other studies [ 21 , 22 ]. The low percentage of detected expressed proteins should not be interpreted as that the rest of the proteins cannot be expressed, since they could do it under different growth conditions. Considering both isolates together, the number of annotated proteins in each growth phase, T1, T2 and T3, was 42.3%, 49.8% and 56.9%, respectively. The distribution of the GO terms over the different growth phases is similar in the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 ( Figure S2 ). The most common and abundant GO terms in all the phases (cellular biosynthetic process, organic substance biosynthetic process, cellular nitrogen compound metabolic process, and organonitrogen compound metabolic process) indicate that both Bt isolates metabolize the carbon and nitrogen in the media to produce all the organic and organonitrogen compounds that they need ( Figure S2 ). The specific GO term macromolecule metabolic process of the T3 growth phase indicates that both Bt isolates express proteins of a relatively high molecular mass, such as the Cry-like proteins detected ( Figure S2 ). Regarding the predicted insecticidal protein genes in both Bt genomes, we were able to find some of the predicted gene products: one new couple of binary Vip-like proteins (Vip2Ac-like_1-Vip4Aa-like_1), two new Vip-like proteins (Vip2Ac-like_1 and Vip4Aa-like_2), one Sip1A-like protein (Sip1A-like_1), and eight Crystal-like proteins (Cry23A-like, Cry45Aa-like_1, Cry45Aa-like_2, Cry45Aa-like_3, Cry32Ea-like, Cry32eDa-like, Cry32Eb-like and Cry73Aa-like) ( Table 4 ). The discrepancies of the protein identification between the replicates can be attributed to metabolic flow changes in cells during development, resulting from enzyme-related changes or that some proteins exist with extremely low abundances such that they cannot be detected by MS. To determine if the detected Bt-like proteins are being secreted or that they form inclusion bodies, we performed an LC/MSMS analysis with the supernatant (24 h and 48 h) and solubilized crystal proteins. In the supernatant of both Bt isolates at 24 h, the Vip4Aa-like_1, Vip4Aa-like_2, Vip2Ac-like_1, Vip2Ac-like_2, and Sip1Aa-like_1 proteins were detected, while at 48 h only Vip4Aa-like_1, Vip2Ac-like_1, Vip2Ac-like_2, and Sip1Aa-like_1 were detected. Again, the extremely low abundance of these proteins might be responsible for the differences found at 24 h and 48 h. Regarding the Vip4Aa-like proteins, this is the first time that there has been demonstrated that they are expressed and secreted to the medium in the log phase. Regarding the crystal proteins, they were found in the crystal of both Bt isolates, except for the Cry23Aa-like, which was also found in the supernatant at 24 h and 48 h. The detection of the Cry23Aa-like protein and sporulation factors (Stage V sporulation protein, spore coat protein B, spore coat polysaccharide biosynthesis protein spsB and spore coat polysaccharide synthesis) in the supernatant at 24 h (and also at 48 h) of the Bt isolate E-SE10.2 indicates that the cells already started the sporulation process. The relative abundance of the Bt-like proteins was estimated in the supernatant and the parasporal crystal in both Bt isolates. In the supernatant (24 h and 48 h) of both Bt isolates, the Vip-like, Sip1-like and Cry23Aa-like were marginally expressed. Regarding the crystal proteins in the Bt isolate O-V84.2, the Cry-like proteins represent around the half of the total crystal weight, while for the Bt isolate E-SE10.2, the Cry23Aa-like protein represents between 2.5% and 30% of the crystal weight. The high variability observed in the amount of Cry23Aa-like could be due to the different replicates are not in the same time point of the sporulation process. The crystal composition of the Bt isolate O-V84.2 was also determined for those proteins with a percentage of similarity lower than 45%. The crystal was composed by four kinds of proteins: 7.0–9.8% Cry45-like proteins (Cry45Aa-like_1, Cry45Aa-like_2 and Cry45Aa-like_3), 30.4–30.5% Cry32-like proteins (Cry32Ea-like and Cry32Da-like), 5.0–6.2% Cry32Eb-like, and 2.8–4.25% Cry73Aa-like, while the Bt isolate E-SE10.2 only produced the Cry23Aa-like protein. The expression levels of the Vip-like, Sip1-like and Cry23Aa-like proteins were compared between 24 h and 48 h. The amount of Vip4Aa-like_1 protein was increased two-fold at 24 h vs. 48 h, while the Vip4Aa-like_2 was only detected at 24 h. As regard to the rest of the proteins (Vip2Ac-like, Sip1A-like, and Cry23A-like proteins), no differences in expression were observed. These results suggest that the Vip4Aa-like_2, Vip2A-like and Sip1A-like proteins were expressed at the 24 h while the Vip4Aa-like_1 was expressed later at the end of the 24 h and the beginning of the 48 h periods. 4. Conclusions In summary, the combined use of the genomic and proteomic data allowed us to determine which of the identified insecticidal protein genes, present in the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2, are being expressed and, if so, at which relative abundance. Considering the two Bt isolates together, we were able to identify five new insecticidal protein genes that are expressed within the first 24 h, except for vip4Aa-like _ 1 , which is expressed after the 24 h. In the parasporal crystals, we found nine new crystal proteins. The spore/crystal mixture of the Bt isolate E-SE10.2 contains solely the Cry23Aa-like protein, while the crystal of the Bt isolate O-V84.2 contains four kinds of Cry proteins: Cry45-like, Cry32-like, Cry32Eb-like, and Cry73Aa-like. 5. Materials and Methods 5.1. Bacterial Strains and Growth Conditions for DNA Analysis Nine Bt isolates from a Spanish collection, known to carry vip1 and vip2 genes, were selected for this study [ 11 ]. For further gene identification of the vip1 and vip2 genes, the Bt isolates were grown in 4 mL LB medium overnight (ON) at 29 °C and 200 rpm. For the whole genome sequencing, only those Bt isolates with vip1 and vip2 genes with less than 60% similarity to already described vip1 and vip2 genes were chosen. The isolates were grown in 10 mL LB medium until OD of 0.6 at 29 °C and 200 rpm. 5.2. Genomic DNA Preparation Total genomic DNA used for gene identification (GI) was isolated from a single colony of the Bt isolates. Cells were collected at 9000× g for 10 min at 4 °C and the pellet was washed in 2 mL of TE buffer (1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0). The pellet was dissolved in 200 μL of TEL buffer (TE buffer + 4 mg/mL lysozyme) and further incubated at 37 °C for 30 min. Then, 400 μL of lysis solution (0.2 M NaOH, 1% SDS) was added. After gentle mixing, 300 μL of the neutralization buffer (3 M KAc, pH 5.5) was added and the mixture incubated for 5 min on ice. The mixture was centrifuged at 14,000× g for 15 min at 4 °C and the supernatant was transferred to a new tube. One volume of cold 100% ethanol was added and the samples kept at −20 °C for 16 h. The samples were centrifuged at 14,000× g for 15 min at 4 °C and the supernatant was transferred to a new tube and the pellet washed with 1 mL of cold 70% ethanol. The pellet was dried with the Eppendorf concentrator 5301 for 5 min at 42 °C and solubilized in 50 μL of TE buffer. Total genomic DNA, used for whole genome sequencing (WGS), was purified as described in the manufacturer instructions of the DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen. The DNA for GI was quantified using Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), while for WGS, the DNA was measured with a Qubit Fluorimetrer. In addition, the integrity of the DNA for GI and WGS was evaluated by agarose gel electrophoresis (1% agarose). 5.3. Identification of Vip1- and Vip2-Type Genes Identification of vip1 and vip2 genes was performed with primer pairs designed from conserved regions within the vip1 and vip2 gene families, respectively. A first PCR with "screening primers" [ 11 ] was performed to confirm the presence of vip genes. With the positive samples, a second PCR was performed with the "typing primers" [ 11 , 23 ] for the identification of the vip1 and vip2 genes. PCR reactions contained, in a final volume of 25 μL, 100 ng of the DNA template, 0.25 U of Biotools polymerase (Biotools), 2.5 μL of 10-fold reaction buffer, 10 mM of each dNTPs, and 0.3 µM of the corresponding primers ( vip1sc , vip2sc , vip2 typing [ 11 ] or vip1 typing [ 23 ]). PCR amplifications were carried out in an Eppendorf Mastercycler thermal cycler as follows: 5 min denaturation at 95 °C, 35 cycles of amplification (1 min denaturation at 94 °C, 1 min of annealing at 45 °C, and 2 min of extension at 72 °C), and an extra extension step of 10 min at 72 °C. To determine the similarity of the amplified sequences to already described vip1 and vip2 genes, the PCR products obtained with the "typing primers" (or with the "screening primers" for those samples that did not give amplification with the "typing primers") were ligated into the pGEM ® -T Easy plasmid (Promega), cloned in Escherichia coli DH10β, and sequenced. DNA sequence analysis and contig assembly was performed using DNAstar v5 and NCBI BLAST tools (Blastx) [ 24 ]. 5.4. Genome Sequencing, Assembly and Annotation Analysis Genome Sequencing for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 was performed with the Illumina HiSeq-PE150 sequencing platform (Novogene S.L Hong Kong, China). From the clean reads (without adapters, low quality, N and duplication) provided by Novogene S.L., first we evaluated the quality of the data with FastQC software (0.11.5, Babraham Bioinformatics Institute, Cambridge, Cambridgeshire, United Kingdom, 2016). Then, the reads were assembled with SoapdeNovo2 (kmer size 35 and genome size 5,600,000 bp) and the gaps were closed with GapCloser (maximum read length 150, overlap 25 bp and thread number 1) [ 25 ]. The assembled reads were annotated with Rast server ( Figure S1 ) and the coding sequence (CDS) prediction was performed with the Glimmer v2 [ 26 ]. First, the predicted genes were filtered against a customized Bt protein database ( https://sourceforge.net/projects/bt-proteindatabase/files/Btdatabase/ ) with Blastx (genetic code bacteria and archaea, e-value 0.001 and word size 6) to select those CDS with homology to the Bt toxins [ 24 ]. Next, the putative insecticidal protein genes were compared against the Non-Redundant database and only the concordant results along the customized Bt protein database and Non-Redundant database were selected as true positive. Moreover, for the selected putative insecticidal genes, prediction of conserved domains was carried out with CD-search [ 27 ] and the gene sinteny was determined in the assembled sequences. 5.5. Sample Preparation for in Gel Digestion LC/MSMS Analysis and Insecticidal Activity of Bt Isolates A single colony of Bt was grown in 100 mL of LB at 29 °C for 24 h and 48 h for detection of the secretable proteins, while for the detection of proteins in the parasporal crystal the culture was grown in 100 mL of CCY at 29 °C until culture sporulation (72 h). The supernatant of Bt was concentrated by trichloroacetic acid (TCA) precipitation. Briefly, the cells were collected at 6000× g for 15 min at 4 °C and filtered through sterile 0.45 μm cellulose acetate filters (GE Healthcare Life Sciences). The sample was incubated with 10% TCA (final concentration) and kept at 4 °C for 24 h. Then, the sample was centrifuged at 16,000× g for 20 min at 4 °C. The pellet was washed with 100 mL of cold acetone (−18 °C), centrifuged at 16,000× g for 20 min at 4 °C, and let dry at room temperature for 5 min. The precipitated proteins were solubilized in 50 mM carbonate buffer containing 10 mM dithiothreitol (pH 11.3) for 48 h, with two buffer changes ( Figure S3 ). Crystals (together with spores) were separated by centrifugation at 6000× g for 12 min at 4 °C. The pellet containing the parasporal crystals was washed three times with ice cold solution A (1 M NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM PMSF, 1% Triton X-100) and centrifuged at 17,000× g for 12 min at 4 °C between washes. The pellet was then washed three times with ice cold solution B (10 mM KCl) and centrifuged at 24,000× g for 15 min at 4 °C. The crystals in the final pellet were solubilized in 20 mL of 50 mM carbonate buffer containing 10 mM dithiothreitol (pH 11.3) by incubation at room temperature for 2 h with continuous shaking ( Figure S3 ). Concentration of the proteins in the supernatant and in the solubilized crystals was estimated with the Bradford method [ 28 ]. The purity of the expressed proteins in the supernatant and the crystal was analyzed by SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ( Figure S3 ). 5.6. In Gel Digestion LC/MSMS Analysis The detection of the expression of the putative insecticidal proteins was done by LC/MSMS at the proteomics facility of the SCSIE (Servei Central de Suport a la Investigació Experimental), at the University of Valencia, Spain. First, a 1D SDS-PAGE (without resolving gel) was performed with 30 µg of total protein in three replicates of the concentrated supernatant (24 h and 48 h) and solubilized crystal proteins. The bands were cut out and in gel digested with 500 ng sequencing grade trypsin (Promega). The digestion was stopped with trifluoroacetic acid (TFA, 1% final concentration). After subjecting the samples to a double extraction with acetonitrile (ACN), all the peptide solutions were dried in a rotatory evaporator. Samples were solubilized with 50 μL of 2% ACN, 0.1% TFA. A sample aliquot of 5 μL was loaded onto a trap column (NanoLC Column, 3 µ C18-CL, 350 µm × 0.5 mm, Eksigent) and desalted with 0.1% TFA at 3 μL/min for 5 min. The peptides were then loaded onto an analytical column (LC Column, 3 µ C18-CL, 75 µm × 12 cm, Nikkyo) equilibrated in 5% ACN 0.1% formic acid (FA). The elution was carried out with a linear gradient of 5–35% B in A for 30 min (A: 0.1% FA; B: ACN, 0.1% FA) at a flow rate of 0.3 μL/min. Peptides were analyzed in a nanoESI qQTOF (5600 TripleTOF, ABSCIEX) mass spectrometer. Eluted peptides were ionized applying 2.8 kV to the spray emitter. Analysis was carried out in a data-dependent mode (DDA). Survey MS1 scans were acquired from 350 to 1250 m / z for 250 ms. The quadrupole resolution was set to "UNIT" for MS2 experiments, which were acquired 100–1500 m / z for 50 ms in "high sensitivity" mode. The following switch criteria were used: charge: 2+ to 5+; minimum intensity; 70 counts per second (cps). Up to 25 ions were selected for fragmentation after each survey scan and the collision energy was automatically selected by the instrument according to the following equation: |CE| = (slope) × ( m / z ) + (intercept); Charge (Unknown, 1, 2, 3, 4, 5), Slope (0.0575, 0.0575, 0.0625, 0.0625, 0.0625, 0.0625), Intercept (9, 9, −3, −3, −6, −6) 5.7. Protein Identification of the in Gel Digestion LC/MSMS Analysis with Paragon Algorithm and Mascot The MS/MS information of three replicates of the concentrated supernatant (24 h and 48 h) and solubilized crystal proteins were sent to Paragon algorithm [ 29 ] via the Protein Pilot v 4.5 (ABSciex). Protein Pilot v 4.5 default parameters were used to generate peak list directly from the 5600 TripleTof Sciex. The Paragon algorithm of Protein Pilot v 4.5 was used to search in a homemade database that was created combining all the coding sequences predicted by Glimmer v2 software for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2; the new database was named Bt _combined ( https://sourceforge.net/projects/bt-combined/files/Bt_combined/ ). The search in the respective protein database was done with the following parameters: trypsin specificity, cys-alkylation, and the search effort set to through. To avoid using the same spectral evidence in more than one protein, the identified proteins were grouped based on MS/MS spectra (proteins sharing MS/MS spectra are grouped, regardless of the peptide sequence assigned) by the Protein-Pilot Progroup algorithm. A protein group in a Progroup Report is a set of proteins that share some physical evidence, the formation of protein groups in Pro Group was guided entirely by observed peptides only and the unobserved regions of protein sequence play no role in explaining the data ( Tables S1 and S2 ). The protein within each group which can explain more spectral data is that protein shown as the primary protein of the group. Only the proteins of the group for which there is individual evidence (unique peptides with enough confidence) are also listed ( Tables S1 and S2 ). In addition, to support the identification of the Protein Pilot v 4.5 (ABSciex) and estimate the relative production of the insecticidal proteins in the three replicates of the concentrated supernatant and solubilized crystal proteins, a series of Mascot MS/MS ion searches with the output of the 5600 TripleTof Sciex were done with the Bt _combined protein database. The following parameters were used: MS/MS "ion search", enzyme "trypsin", fixed modifications "carbamidomethyl (C)", variable modifications "deamidated (NQ) and oxidation (M)", mass values "monoisotopic", protein mass "unrestricted", peptide mass tolerance "50 ppm", fragment mass tolerance "0.6 Da", max miss cleavages "1", instrument type "ESI-QUAD-TOF", number of queries for E-SE10.2 "(Supernatant 24 h: R1 7468, R2 8755, R3 7682; Supernatant 48 h: R1 9, 243, R2 8602, R38,286; Crystal: R1 6779, R2 7173 R3 7790)" and for O-V84.2 "(Supernatant 24 h: R1 3708, R2 4459, R3 3536 Supernatant 48 h: R1 6016, R2 6654, R3 6123; Crystal: R1 5206 R2 5206 R3 4476)", significance threshold " p -value 95% and with maximum 50 peptides for protein. For the protein library construction of the global analysis, a joint search with the Bt _combined protein database was performed with the three replicates of the concentrated supernatant (24 h and 48 h) and solubilized crystal proteins ( Table S5 ). In the case of the specific conditions analysis (Supernatant: E-SE10.2 24 h vs. 48 h, and O-V84.2 24 h vs. 48 h), a joint search with the Bt _combined protein database was performed with the three replicates of the concentrated supernatant ( Table S4 ). The search in the respective analysis was done with the following parameters: trypsin specificity, cys-alkylation, and the search effort set to through. First, a global analysis was done to study grouped data analysis and samples distribution. A joined search with all the samples was performed with the Peak View 1.1 that identified 1816 proteins and the quantitative data obtained was analyzed with Marker View 1.3. Briefly, for the grouped data analysis, a PCA analysis was done with the non-normalized area of the peaks and with the area peaks corrected by the total areas sum. In the case of the samples distribution, a PCA analysis was done with the area of the peaks corrected by the total areas sum ( Table S5 ). For the specific conditions analysis, a specific search with Peak View 1.1 was done with the respective samples to study the statistical significant differences. The quantitative data was analyzed with Marker View 1.3. Prior to data analysis of the E-SE10.2 24 h vs. 48 h, and O-V84.2 24 h vs. 48 h, we applied a normalization by total areas sum, and then a grouped data analysis with PCA analysis was done. A student's t -test statistical analysis with the concentrated supernatant (E-SE10.2 24 h vs. 48 h, and O-V84.2 24 h vs. 48 h) was performed to determine the differentially expressed proteins between two experimental conditions with the Marker View 3.1 software ( Table S4 ). 5.1. Bacterial Strains and Growth Conditions for DNA Analysis Nine Bt isolates from a Spanish collection, known to carry vip1 and vip2 genes, were selected for this study [ 11 ]. For further gene identification of the vip1 and vip2 genes, the Bt isolates were grown in 4 mL LB medium overnight (ON) at 29 °C and 200 rpm. For the whole genome sequencing, only those Bt isolates with vip1 and vip2 genes with less than 60% similarity to already described vip1 and vip2 genes were chosen. The isolates were grown in 10 mL LB medium until OD of 0.6 at 29 °C and 200 rpm. 5.2. Genomic DNA Preparation Total genomic DNA used for gene identification (GI) was isolated from a single colony of the Bt isolates. Cells were collected at 9000× g for 10 min at 4 °C and the pellet was washed in 2 mL of TE buffer (1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0). The pellet was dissolved in 200 μL of TEL buffer (TE buffer + 4 mg/mL lysozyme) and further incubated at 37 °C for 30 min. Then, 400 μL of lysis solution (0.2 M NaOH, 1% SDS) was added. After gentle mixing, 300 μL of the neutralization buffer (3 M KAc, pH 5.5) was added and the mixture incubated for 5 min on ice. The mixture was centrifuged at 14,000× g for 15 min at 4 °C and the supernatant was transferred to a new tube. One volume of cold 100% ethanol was added and the samples kept at −20 °C for 16 h. The samples were centrifuged at 14,000× g for 15 min at 4 °C and the supernatant was transferred to a new tube and the pellet washed with 1 mL of cold 70% ethanol. The pellet was dried with the Eppendorf concentrator 5301 for 5 min at 42 °C and solubilized in 50 μL of TE buffer. Total genomic DNA, used for whole genome sequencing (WGS), was purified as described in the manufacturer instructions of the DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen. The DNA for GI was quantified using Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), while for WGS, the DNA was measured with a Qubit Fluorimetrer. In addition, the integrity of the DNA for GI and WGS was evaluated by agarose gel electrophoresis (1% agarose). 5.3. Identification of Vip1- and Vip2-Type Genes Identification of vip1 and vip2 genes was performed with primer pairs designed from conserved regions within the vip1 and vip2 gene families, respectively. A first PCR with "screening primers" [ 11 ] was performed to confirm the presence of vip genes. With the positive samples, a second PCR was performed with the "typing primers" [ 11 , 23 ] for the identification of the vip1 and vip2 genes. PCR reactions contained, in a final volume of 25 μL, 100 ng of the DNA template, 0.25 U of Biotools polymerase (Biotools), 2.5 μL of 10-fold reaction buffer, 10 mM of each dNTPs, and 0.3 µM of the corresponding primers ( vip1sc , vip2sc , vip2 typing [ 11 ] or vip1 typing [ 23 ]). PCR amplifications were carried out in an Eppendorf Mastercycler thermal cycler as follows: 5 min denaturation at 95 °C, 35 cycles of amplification (1 min denaturation at 94 °C, 1 min of annealing at 45 °C, and 2 min of extension at 72 °C), and an extra extension step of 10 min at 72 °C. To determine the similarity of the amplified sequences to already described vip1 and vip2 genes, the PCR products obtained with the "typing primers" (or with the "screening primers" for those samples that did not give amplification with the "typing primers") were ligated into the pGEM ® -T Easy plasmid (Promega), cloned in Escherichia coli DH10β, and sequenced. DNA sequence analysis and contig assembly was performed using DNAstar v5 and NCBI BLAST tools (Blastx) [ 24 ]. 5.4. Genome Sequencing, Assembly and Annotation Analysis Genome Sequencing for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2 was performed with the Illumina HiSeq-PE150 sequencing platform (Novogene S.L Hong Kong, China). From the clean reads (without adapters, low quality, N and duplication) provided by Novogene S.L., first we evaluated the quality of the data with FastQC software (0.11.5, Babraham Bioinformatics Institute, Cambridge, Cambridgeshire, United Kingdom, 2016). Then, the reads were assembled with SoapdeNovo2 (kmer size 35 and genome size 5,600,000 bp) and the gaps were closed with GapCloser (maximum read length 150, overlap 25 bp and thread number 1) [ 25 ]. The assembled reads were annotated with Rast server ( Figure S1 ) and the coding sequence (CDS) prediction was performed with the Glimmer v2 [ 26 ]. First, the predicted genes were filtered against a customized Bt protein database ( https://sourceforge.net/projects/bt-proteindatabase/files/Btdatabase/ ) with Blastx (genetic code bacteria and archaea, e-value 0.001 and word size 6) to select those CDS with homology to the Bt toxins [ 24 ]. Next, the putative insecticidal protein genes were compared against the Non-Redundant database and only the concordant results along the customized Bt protein database and Non-Redundant database were selected as true positive. Moreover, for the selected putative insecticidal genes, prediction of conserved domains was carried out with CD-search [ 27 ] and the gene sinteny was determined in the assembled sequences. 5.5. Sample Preparation for in Gel Digestion LC/MSMS Analysis and Insecticidal Activity of Bt Isolates A single colony of Bt was grown in 100 mL of LB at 29 °C for 24 h and 48 h for detection of the secretable proteins, while for the detection of proteins in the parasporal crystal the culture was grown in 100 mL of CCY at 29 °C until culture sporulation (72 h). The supernatant of Bt was concentrated by trichloroacetic acid (TCA) precipitation. Briefly, the cells were collected at 6000× g for 15 min at 4 °C and filtered through sterile 0.45 μm cellulose acetate filters (GE Healthcare Life Sciences). The sample was incubated with 10% TCA (final concentration) and kept at 4 °C for 24 h. Then, the sample was centrifuged at 16,000× g for 20 min at 4 °C. The pellet was washed with 100 mL of cold acetone (−18 °C), centrifuged at 16,000× g for 20 min at 4 °C, and let dry at room temperature for 5 min. The precipitated proteins were solubilized in 50 mM carbonate buffer containing 10 mM dithiothreitol (pH 11.3) for 48 h, with two buffer changes ( Figure S3 ). Crystals (together with spores) were separated by centrifugation at 6000× g for 12 min at 4 °C. The pellet containing the parasporal crystals was washed three times with ice cold solution A (1 M NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM PMSF, 1% Triton X-100) and centrifuged at 17,000× g for 12 min at 4 °C between washes. The pellet was then washed three times with ice cold solution B (10 mM KCl) and centrifuged at 24,000× g for 15 min at 4 °C. The crystals in the final pellet were solubilized in 20 mL of 50 mM carbonate buffer containing 10 mM dithiothreitol (pH 11.3) by incubation at room temperature for 2 h with continuous shaking ( Figure S3 ). Concentration of the proteins in the supernatant and in the solubilized crystals was estimated with the Bradford method [ 28 ]. The purity of the expressed proteins in the supernatant and the crystal was analyzed by SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ( Figure S3 ). 5.6. In Gel Digestion LC/MSMS Analysis The detection of the expression of the putative insecticidal proteins was done by LC/MSMS at the proteomics facility of the SCSIE (Servei Central de Suport a la Investigació Experimental), at the University of Valencia, Spain. First, a 1D SDS-PAGE (without resolving gel) was performed with 30 µg of total protein in three replicates of the concentrated supernatant (24 h and 48 h) and solubilized crystal proteins. The bands were cut out and in gel digested with 500 ng sequencing grade trypsin (Promega). The digestion was stopped with trifluoroacetic acid (TFA, 1% final concentration). After subjecting the samples to a double extraction with acetonitrile (ACN), all the peptide solutions were dried in a rotatory evaporator. Samples were solubilized with 50 μL of 2% ACN, 0.1% TFA. A sample aliquot of 5 μL was loaded onto a trap column (NanoLC Column, 3 µ C18-CL, 350 µm × 0.5 mm, Eksigent) and desalted with 0.1% TFA at 3 μL/min for 5 min. The peptides were then loaded onto an analytical column (LC Column, 3 µ C18-CL, 75 µm × 12 cm, Nikkyo) equilibrated in 5% ACN 0.1% formic acid (FA). The elution was carried out with a linear gradient of 5–35% B in A for 30 min (A: 0.1% FA; B: ACN, 0.1% FA) at a flow rate of 0.3 μL/min. Peptides were analyzed in a nanoESI qQTOF (5600 TripleTOF, ABSCIEX) mass spectrometer. Eluted peptides were ionized applying 2.8 kV to the spray emitter. Analysis was carried out in a data-dependent mode (DDA). Survey MS1 scans were acquired from 350 to 1250 m / z for 250 ms. The quadrupole resolution was set to "UNIT" for MS2 experiments, which were acquired 100–1500 m / z for 50 ms in "high sensitivity" mode. The following switch criteria were used: charge: 2+ to 5+; minimum intensity; 70 counts per second (cps). Up to 25 ions were selected for fragmentation after each survey scan and the collision energy was automatically selected by the instrument according to the following equation: |CE| = (slope) × ( m / z ) + (intercept); Charge (Unknown, 1, 2, 3, 4, 5), Slope (0.0575, 0.0575, 0.0625, 0.0625, 0.0625, 0.0625), Intercept (9, 9, −3, −3, −6, −6) 5.7. Protein Identification of the in Gel Digestion LC/MSMS Analysis with Paragon Algorithm and Mascot The MS/MS information of three replicates of the concentrated supernatant (24 h and 48 h) and solubilized crystal proteins were sent to Paragon algorithm [ 29 ] via the Protein Pilot v 4.5 (ABSciex). Protein Pilot v 4.5 default parameters were used to generate peak list directly from the 5600 TripleTof Sciex. The Paragon algorithm of Protein Pilot v 4.5 was used to search in a homemade database that was created combining all the coding sequences predicted by Glimmer v2 software for the Bt isolates E-SE10.2 and O-V84.2; the new database was named Bt _combined ( https://sourceforge.net/projects/bt-combined/files/Bt_combined/ ). The search in the respective protein database was done with the following parameters: trypsin specificity, cys-alkylation, and the search effort set to through. To avoid using the same spectral evidence in more than one protein, the identified proteins were grouped based on MS/MS spectra (proteins sharing MS/MS spectra are grouped, regardless of the peptide sequence assigned) by the Protein-Pilot Progroup algorithm. A protein group in a Progroup Report is a set of proteins that share some physical evidence, the formation of protein groups in Pro Group was guided entirely by observed peptides only and the unobserved regions of protein sequence play no role in explaining the data ( Tables S1 and S2 ). The protein within each group which can explain more spectral data is that protein shown as the primary protein of the group. Only the proteins of the group for which there is individual evidence (unique peptides with enough confidence) are also listed ( Tables S1 and S2 ). In addition, to support the identification of the Protein Pilot v 4.5 (ABSciex) and estimate the relative production of the insecticidal proteins in the three replicates of the concentrated supernatant and solubilized crystal proteins, a series of Mascot MS/MS ion searches with the output of the 5600 TripleTof Sciex were done with the Bt _combined protein database. The following parameters were used: MS/MS "ion search", enzyme "trypsin", fixed modifications "carbamidomethyl (C)", variable modifications "deamidated (NQ) and oxidation (M)", mass values "monoisotopic", protein mass "unrestricted", peptide mass tolerance "50 ppm", fragment mass tolerance "0.6 Da", max miss cleavages "1", instrument type "ESI-QUAD-TOF", number of queries for E-SE10.2 "(Supernatant 24 h: R1 7468, R2 8755, R3 7682; Supernatant 48 h: R1 9, 243, R2 8602, R38,286; Crystal: R1 6779, R2 7173 R3 7790)" and for O-V84.2 "(Supernatant 24 h: R1 3708, R2 4459, R3 3536 Supernatant 48 h: R1 6016, R2 6654, R3 6123; Crystal: R1 5206 R2 5206 R3 4476)", significance threshold " p -value 95% and with maximum 50 peptides for protein. For the protein library construction of the global analysis, a joint search with the Bt _combined protein database was performed with the three replicates of the concentrated supernatant (24 h and 48 h) and solubilized crystal proteins ( Table S5 ). In the case of the specific conditions analysis (Supernatant: E-SE10.2 24 h vs. 48 h, and O-V84.2 24 h vs. 48 h), a joint search with the Bt _combined protein database was performed with the three replicates of the concentrated supernatant ( Table S4 ). The search in the respective analysis was done with the following parameters: trypsin specificity, cys-alkylation, and the search effort set to through. First, a global analysis was done to study grouped data analysis and samples distribution. A joined search with all the samples was performed with the Peak View 1.1 that identified 1816 proteins and the quantitative data obtained was analyzed with Marker View 1.3. Briefly, for the grouped data analysis, a PCA analysis was done with the non-normalized area of the peaks and with the area peaks corrected by the total areas sum. In the case of the samples distribution, a PCA analysis was done with the area of the peaks corrected by the total areas sum ( Table S5 ). For the specific conditions analysis, a specific search with Peak View 1.1 was done with the respective samples to study the statistical significant differences. The quantitative data was analyzed with Marker View 1.3. Prior to data analysis of the E-SE10.2 24 h vs. 48 h, and O-V84.2 24 h vs. 48 h, we applied a normalization by total areas sum, and then a grouped data analysis with PCA analysis was done. A student's t -test statistical analysis with the concentrated supernatant (E-SE10.2 24 h vs. 48 h, and O-V84.2 24 h vs. 48 h) was performed to determine the differentially expressed proteins between two experimental conditions with the Marker View 3.1 software ( Table S4 ).

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9149372/

Efficacy and Mechanism of Thymol/KGM/LG Edible Coating Solution on Inhibition of Mucor circinelloides Isolated From Okra

With the increasing demand and quality requirement for the natural nutritious food in modern society, okra has attracted much attention because of its high nutritional value and remarkable functionality. However, the occurrence of postharvest diseases of fresh okra severely limited the application and the value of okra. Therefore, in this study, the dominant pathogens causing postharvest diseases such as soft rot were isolated from naturally decaying okra. It was identified as Mucor circinelloides by its morphological characteristics and standard internal transcribed spacer ribosomal DNA sequence. Furthermore, the biological characteristics of M. circinelloides were studied, and the inhibitory effect of thymol/KGM/LG (TKL) edible coating solution on M. circinelloides and its possible mechanism was discussed. In addition, TKL edible coating solution had a dose-dependent inhibitory effect on M. circinelloides , with a 50% inhibitory concentration (EC50) of 113.55 mg/L. The TKL edible coating solution at 960 mg/L of thymol completely inhibited mycelial growth and spore germination of M. circinelloides . The results showed that the best carbon source of M. circinelloides was maltose, the best nitrogen source was beef extract and potassium nitrate, the best pH was 6, the best temperature was 28°C, the best NaCl concentration was 0.5%, and the light was conducive to the growth of M. circinelloides . It was also observed by scanning electron microscope (SEM) that TKL was more likely to destroy the cell wall integrity of M. circinelloides , inhibit spore morphology and change mycelium structure. Meanwhile, the activity of chitinase (CHI), an enzyme related to cell wall synthesis of M. circinelloides , was significantly decreased after being treated by TKL with thymol at 100 mg/L (TKL100). The content of Malondialdehyde (MDA) in M. circinelloides decreased significantly from 12 h to 48 h, which may cause oxidative damage to the cell membrane. The activity polygalacturonase (PG), pectin methylgalacturonase (PMG), and cellulase (Cx) of M. circinelloides decreased significantly. Therefore, the results showed that TKL had a good bacteriostatic effect on okra soft rot pathogen, and the main bacteriostatic mechanism might be the damage of cell membrane, degradation of the cell wall, inhibition of metabolic activities, and reduction of metabolites, which is helpful to further understand the inhibitory effect of TKL on okra soft rot pathogen and its mechanism. Introduction Okra is a valuable herb of the genus okra in the mallow family, which is widely grown in tropical and subtropical regions ( Dantas et al., 2021 ). Okra has many medicinal properties, such as antifatigue, enhancing immunity, protecting the liver and kidney, reducing lung injury, antihypertension, lowering blood lipid, lowering blood pressure, anticancer, and so on ( Elkhalifa et al., 2021a ). Young okra pods are commonly eaten as vegetables and raw materials for polysaccharide extraction, okra seeds are utilized for oil and protein extraction, and aging fruit pods are served as animal feed ( Fekadu Gemede, 2015 ). In particular, young okra pods are delicious, tender and lubricating, low in energy, free of oil, and contains high okra polysaccharide, rich in carotene, vitamin C, a variety of B vitamins and mineral elements such as Fe, Mn, and Zn, as well as rich phenolic compounds, such as oligocatechin and hydroxybenzoic acid derivatives ( Elkhalifa et al., 2021b ; Uddin Zim et al., 2021 ). However, due to the various microbial factors and plant characteristics, okra is particularly susceptible to spoilage during postharvest storage ( Tsado, 2015 ). For example, fungal rot caused by Fusarium Solani ( Kwon and Jee, 2005 ; Kapadiya et al., 2014 ) and brown rot caused by Anthrax pathogen genus ( Farrag, 2011 ). Studies have found that the tissue of okra is easy to soften after the harvest, and the juice oozes out and becomes mildew and rot, temporarily called soft rot, which causes great economic loss of okra ( Tohyama et al., 1995 ). However, the limited studies that reported the causes of postharvest soft rot of okra, and the related pathogenic mechanism and control. In recent decades, the plant extracts have been widely used in the prevention of fruit and vegetable diseases and the development of green fruit and vegetable preservatives, they are aromatic and volatile components extracted from specific plant parts, most of which have antifungal effects ( Kaur et al., 2021 ). The common monomer plants such as cinnamaldehyde ( Li et al., 2019 ; Han et al., 2021 ), carvacrol ( Chen et al., 2021 ), menthol ( Yang et al., 2020 ), thymol, and vanillin ( Florencia Bambace et al., 2019 ) have been applied to the control of fruit and vegetable diseases and preservations and achieved good results ( Hyldgaard et al., 2012 ; Nazzaro et al., 2013 ). It is worth mentioning that thymol has been applied in various forms to the prevention and control of diseases and storage of fruits and vegetables in recent years, especially for the prevention and control of postharvest soft rot and brown spot ( Sun et al., 2021 ; Selvam et al., 2022 ). In addition, thymol has been approved by the United States Food and Drug Administration (FDA) for use in foods as a food additive, and it is also the European Commission has registered oils, is a recognized safety material, non-toxic side effects on the mammalian physiological system, can be used as a flavoring agent and preservative in food, are widely used in pharmaceutical, food and beverage production ( Nagoor Meeran et al., 2017 ). Unfortunately, thymol is unstable, water-insoluble and it has unsatisfactory properties. Encapsulation of thymol into microcapsules is one of the effective alternatives to overcome these shortcomings ( Serna-Escolano et al., 2020 ). This study first isolated the main pathogenic bacteria in postharvest soft rot in okra, and with thymol, emulsifier, β-cyclodextrin, and polyethylene glycol (PEG), namely, PEG6000, as the main raw materials mixed in proportion, thymol microcapsule preparation was done by spray drying powder, which was supplemented with konjac glucomannan (KGM) and low acyl knot gels (LG) that were prepared from the matrix liquid, thymol/KGM/LG (TKL) edible coating solution was formed. At present, the laboratory where we worked on this study has applied for the relevant invention patent, "A kind of thymol compound biological coating preservative and its preparation method and application" (CN202010919222.9). And using TKL as an antibacterial substance, the inhibitory effect on the main pathogenic bacteria of okra soft rot was further explored., and preliminarily explore the related antifungal mechanism. It provides a new idea and method for disease control and postharvest storage of okra and is expected to reduce the loss caused by postharvest fresh okra decay and improve economic benefits. Materials and Methods Materials and Chemicals Fresh okra was grown in Chengdu country, Sichuan Province, China, and it was harvested. The spoiled okra was provided to isolate the pathogen in the Sichuan Agricultural University of China. Potato dextrose agar (PDA) (Beijing AoBoXing bio-tech Co. Ltd., Beijing, China) was used as the culture media. Thymol (98.00% purity) was purchased from Shanghai Ron Reagent or Shanghai Yien Chemical Technology. All other chemicals and reagents were of analytical grade and they were purchased from Chengdu Cologne Chemical Reagent Company (Chengdu, China). Thymol microcapsule powder was equipped with 1-L thymol microcapsule emulsion, a total of 5.28-g thymol; 10-g emulsifier; β-cyclodextrin, 123.15 g; PEG6000, 61.57 g; and 1-L ultra-pure water. The β-cyclodextrin was dissolved in 500-ml hot water over 75°C and then stirred in a magnetic stirrer (80°C) at 600 rpm/min. Also, PEG was dissolved by adding 300-ml hot water over 75°C in a high-speed stirrer at 1000 rpm/min and then placed in an ultrasonic cleaning tank for 15 min to exhaust. After the emulsifier was dissolved in 200-ml hot water over 75°C, the temperature was kept warm in a 60°C water bath. The exhaust PEG solution was added into the β-cyclodextrin solution, and the magnetic stirrer temperature was controlled over 75°C, 600 rpm/min, and stirred for 30 min. Also, adjusted the temperature to 60°C. Added emulsifier solution holding at about 60°C until uniform solution was arrived at. Then cool downed to about 40°C, and added core material (two drops per second). After stirring for 3 h (40°C, 600 rpm/min), microcapsule powder was obtained after spray drying. The effective content of muscimol in the prepared microcapsules was 26.1 mg/g. The preparation of membrane matrix solution was as follows: Boiled 500-ml ultrapure water along with 0.125-g KGM and 0.25-g LG. High-speed agitator (1,200–1,600 rpm/min), stirred for 30 min; added 0.2 g calcium stearate lactate and continued to stir for 5–10 min. Covered with plastic wrap and brought to a boil. The uniform membrane solution was obtained by ultrasound for 30 min (60°C, 80 W). The TKL mother liquor was equipped with 10-ml uniform membrane matrix solution along with 1.88679-g of microcapsule powder; after mixing, a centrifugation for 30 min and vortex for 5–10 min to obtain uniform mother liquor (concentration of 5 mg/ml); the TKL with different concentration gradients was diluted with membrane matrix. Isolation and Identification of Pathogens According to the plant tissues separation method ( Jogee et al., 2017 ), the spoiled okra about 6 mm 2 was excised from diseased berries with a sterile blade at the junction of the diseased and healthy sarcocarp. Each piece of sarcocarp was washed in sterile double-distilled water (SDW) and it was disinfested in 75% ethanol for 30 s and 1% sodium hypochlorite for 30 s, and then it was rinsed three times in SDW. After an incubation at 28°C for 48 h, the micromorphological characteristics of the colonies were observed, namely, color, growth diameter, texture, mycelial size, and conidial shape of the colonies. After the purification, the fungi were cultured on PDA and stored at 4°C for subsequent identification. The mycelia of the tested strains were scraped and cultured at 28°C for 1–2 days on a PDA plate, and DNA was extracted using TSINGKE Plant DNA Extraction Kit (universal type). The extracted DNA samples were diluted and used as polymerase chain reaction (PCR) template and 1 × TSE101 gold mix for the amplification. The components of the amplification system were as follows: 1 × TSE101 gold Mix 45 μL, ITS1 (10P) 2 μL, ITS4 (10P) 2 μL, DNA template 1 μL. The reaction conditions were as follows: 98°C 2 min, 98°C 10 s, 56°C 10 s, 72°C 10 s/kB, 35 cycles; 72°C for 5 min, stored at 4°C. The amplified PCR products were subjected to agarose gel electrophoresis (2 μL sample + 6 μL bromophenol blue) at 300-V voltage for 12 min to obtain the identification gel pattern. The PCR products will be prepared for generation sequencing (sequencing primer is ITS). The work was commissioned by the Chengdu Branch of Beijing Qingqing Biotechnology Co., Ltd. Contig express was used to join the sequencing results, and the inaccurate parts at both ends were removed. The spliced sequences were compared in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (bla. NCBI. nLM. Nih.gov ), and the species with the highest homology were selected to construct the related phylogenetic tree using MEGA 5.02 software. Pathogenicity Determination A 6-mm M. circinelloides was inoculated into healthy okra by puncture inoculation. A sterile PDA (6 mm) was used as blank groups and inoculated into okra by puncture inoculation, which was cultured in a constant temperature incubator at 28°C. The postharvest symptom of M. circinelloides on okra was observed, which was confirmed as pathogenic bacteria compared with blank. Observation of Biological Characteristics of Pathogenic Bacteria The isolated and identified pathogenic bacteria were inoculated on a PDA plate for a dark culture at 28°C for 3–7 days, and bacteria cakes with diameters of 6 mm were taken to a PDA medium. The different carbon and nitrogen sources, temperature, pH value, NaCl concentration, and light conditions were set up in the experiment. After 3–5 days, the colony diameter was measured by the cross-crossing method. The effects of carbon and nitrogen sources on the colony growth and sporulation were studied. Eight carbon sources were tested using the Sabouraud Dextrose Agar medium as the basal medium as follows: Glucose, maltose, agarose, lactose, starch, fructose, sucrose, and soluble sugar. Five kinds of medium were prepared by replacing the carbon sources with equal amounts of glucose. Six nitrogen sources were selected as follows: Urea, ammonium nitrate, peptone, potassium nitrate, ammonium sulfate, and beef extract, according to the amount of peptone replacement. The cake was transferred to the plate center with different carbon and nitrogen sources, and a dark culture was conducted at 28°C. The influence of culture temperature on colony growth and sporulation was studied. The cakes were transferred to the center of a new PDA plate and placed in the dark culture at 15, 24, 28, and 35°C, respectively. The influence of pH on the colony growth and the spore production was studied. The pH value of the PDA medium was adjusted with 0.1 mol/L hydrochloric acid and 0.1 mol/L sodium hydroxide solution. After sterilization, the prepared cake was transferred to the center of the PDA plate with different pH values (5.0, 6.0, 7.0, 8.0, and 9.0). A dark culture at 28°C was conducted. The effects of light conditions on the colony growth and the sporulation. The light conditions were set as a dark culture; a light culture and an alternating light and dark cultures (light and dark for 12 h each); PDA culture medium; and the culture temperature were maintained at 28°C. The effects of different NaCl (%) on colony growth and spore production were studied. The colony diameter was determined by using PDA medium containing 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, and 3.0% NaCl at 28°C for 72 h. The in vitro of Antifungal Activity of Thymol/KGM/LG on Mycelial Growth and Spore Germination The effects of the different concentrations of TKL on the growth of pathogenic bacteria were determined by the growth rate method. Also, 0, 400, 800, 1,600, and 2,000 μl of 5-mg/ml TKL mother solution (the solvent was polysaccharide membrane matrix, and the control group was PDA and blank PDA with 1-ml membrane matrix) were added into 100-ml PDA medium, respectively. The final mass concentration of thymol was 0, 20, 40, 60, 80, and 100 mg/L, respectively, and then mixed into sterile Petri dishes for later use. A sterile hole punch with a diameter of 6 mm was used to make holes of 6 mm diameter in different concentrations of TKL Petri dishes and control Petri dishes, respectively. Then a sterile hole punch with a diameter of 6 mm was used to cut bacterial cakes from pathogen dishes cultured for 2 days, and the cakes were embedded in the holes of TKL Petri dishes with different concentrations of TKL and control Petri dishes. The culture dish was placed in a constant temperature incubator at 28°C for 3–5 days. The colony diameter was measured by the cross-crossing method, and the inhibition rate of TKL coating on mycelial radial growth was calculated according to the formula below. Growth ⁢ Inhibition ⁢ rate % = Colony ⁢ diameter ⁢ of ⁢ control ⁢ group ⁢ ( mm ) - Colony ⁢ diameter ⁢ of ⁢ treatment ⁢ group ⁢ ( mm ) Colony ⁢ diameter ⁢ of ⁢ control ⁢ group ⁢ ( mm ) × 100 % Distilled water, film-forming matrix, and anhydrous ethanol were used as the negative control, and thymol ethanol solution with equal concentration was used as the positive control. A 200-μL of the prepared spore solution (10 5 CFU/ml) was placed in a 96-well plate, and the final concentrations of thymol were 0, 40, 80, 100, 120, 240, 480, 960, 1920 mg/L, respectively. The treated 96-well plates were placed in a constant temperature and humidity incubator for 72 h at 28°C, and the OD600 value of each treatment was detected by a microplate tester. The inhibitory effect of thymol on the growth of pathogenic bacteria was measured by the value. The minimum inhibitory concentration (MIC) of thymol on the growth of pathogenic bacteria was obtained according to the inhibitory effect. Inhibition of Thymol/KGM/LG on the Mycelia Weight of Mucor circinelloides (1) Preparation medium (PDA liquid): Peeled potatoes, diced and weighed 200 g; boiled with 1 L of ultra-pure water for 20–30 min; filtered with two layers of gauze; and the filtrate was taken. Added 20-g glucose; dissolved it in a constant volume to 1 L; packed it separately in 250-ml and 500-ml conical bottles, 100 ml each, and sterilized. When cooling to about 55°C, added 5% tartaric acid or 10% lactic acid (filtration sterilization), adjust pH to 3.5. (2) Determination of fungal growth curve: (I) Preparation of bacterial suspension: Added 5 ml normal saline to the activated bacterial species incline. Scraped off the bacterial lichen or spores with inoculation ring to make bacterial suspension or spore suspension, dilute counting, suspension controlled at 10 5 –10 6 CFU/ml. (II) Fungi were cultured in a 50 ml liquid medium in a 300-ml conical flask, and TKL was added to the experimental group. The concentration of thymol in the liquid medium was 100 mg/L, and 50-μL fungal suspension or spore suspension (10 6 CFU/ml) was inoculated in the shaking table at 28–30°C for 140 rpm/min. The growth of fungi was measured by the dry weight method. The triangular flask was taken out at intervals of 12 or 24 h (48 h or according to the actual growth of bacteria), and the culture medium was pumped and filtered on quantitative filter paper. The medium was baked at 60°C until it reaches a constant weight, and the dry weight of the bacteria was weighed. The dry weight of mycelia = the weight of membrane after dry weight of membrane before filtration. (III) The growth curve according to the incubation time (h) and dry weight (g) was drawn. The Effects of Thymol/KGM/LG on the Structure of Pathogenic Bacteria Were Observed by Scanning Electron Microscope Cover fragment culture of bacteria: (1) Water agar plate cooling set aside. Melted PDA solid medium to a liquid state, and kept the temperature of 50–60°C, which was poured into the plate; picked up the sterile cover glass with tweezers, gently dipped it into the melted PDA medium, and quickly pulled it out. A very thin medium film was adhered to the cover glass and solidify in a moment. (2) Placed cover slides horizontally on the surface of a flat plate containing sterile 1.5% water agar. Placed a maximum of four cover slides on a flat plate, but be careful not to allow them to overlap with each other. The agar with 1.5% solid water mainly acted as a wet chamber, which was providing humidity during the fungal growth. (3) Inoculated the fungus in the center of the cover glass with medium film with an inoculation needle (click lightly). All the above steps were carried out under aseptic conditions, covering the lid, and culture for 48 h in the incubator at 28°C 90% RH constant temperature and humidity (culture time is different for different strains, the specific end of culture was the beginning of spore production). (4) After the strains were matured, the cover glass was removed and put into a sterile empty medium. A 2% glutaraldehyde was dropped on the cover glass (light drops, and the entire colony and spores were submerged) and fixed for 2 h in a refrigerator at 4°C. (5) Removed the cover glass and wash it with sterile phosphate buffered solution (PBS) solution in a sterile Petri dish three times, 10 min each; Then soak in 1% osmium solution at 4°C for 2 h (this step could be omitted). The sample was placed in 50, 70, 95, and 100% alcohol to dehydrate and replace; the time was generally 10–15 min for each grade. Iso–amyl acetate was substituted at 4°C for 20 min. All these soaking steps were carried out in clean Petri dishes at 4°C. (6) Placed the cover glass after a treatment in a clean Petri dish (labeled Petri dish), and placed it at –80°C for rapid pre-cooling for 12 h (overnight). (7) The samples were freeze-dried in a vacuum (36–48 h) and treated with vacuum gold plating before scanning electron microscopy. After critical point drying and coating, the results were observed by scanning electron microscope and photographed (equipment model: ELECTRON microscope; United States FEIF50 energy spectrum: United States EDAX OCTANE SUPER. This step was operated by Etesting company). The method could observe the fungal spores and mycelia in the natural state. Effects of Thymol/KGM/LG on the Intracellular Structure and Enzyme Activity of Mucor circinelloids Configure medium (PDA liquid): Configured potato glucose liquid medium according to the corresponding requirements. Cultivation of fungi and preparation of bacterial suspension. A 5-ml normal saline was added to the inclined plane of activated bacterial species, and bacterial suspension or spore suspension was prepared by scraping off the bacterial lichen or spores with inoculating ring, and the suspension was controlled at 10 5 –10 6 CFU/ml. The fungi were cultured and filled with 50-ml liquid medium in a 300 ml Conical flask, which was divided into (i) experimental group and (ii) blank control group. The experimental group was added with 600-μl 5-mg/ml TKL coating solution, and the thymol concentration in the PDB medium was 100 mg/L and mixed evenly. Inoculated with 50-μL fungal suspension or spore suspension (10 5 –10 6 CFU/ml) and cultured in a 28°C 140 rpm/min shaking table. The samples were taken at 24 h for the first time and at intervals of 12 h for 24, 36, 48, and 60 h. The culture medium was filtered, the thallus was cleaned, and then frozen with liquid nitrogen and stored in a refrigerator at −80°C for future use. In sample preparation, the frozen thistle was ground into fine powder under the condition of low temperature maintained by liquid nitrogen. A 1 g of thistle powder was added into 9 ml of pre-cooled PBS (0.01 M, pH 7.4) solution, centrifuged at 4°C for 30 min at 5,000 g , and the supernatant could be detected. The enzyme activity was determined by MDA, PG, PMG, β-1.3-glucanase, chitinase (CHI), and Cx kits (these kits were purchased from Jiangxi Jingmei Biotechnology Co., Ltd, Yancheng city, Jiangsu Province, China.). Statistical Analysis The results were expressed as means ± standard deviation (SD) of five independent replicates, with no significant difference between treatment and experimental variables. Statistically significant differences between the mean values were analyzed with one-way analysis of variance (ANOVA) and Duncan's multi-range test using SPSS 25.0 (IBM, NY, United States). Differences at p < 0.05 were indicated significant. Materials and Chemicals Fresh okra was grown in Chengdu country, Sichuan Province, China, and it was harvested. The spoiled okra was provided to isolate the pathogen in the Sichuan Agricultural University of China. Potato dextrose agar (PDA) (Beijing AoBoXing bio-tech Co. Ltd., Beijing, China) was used as the culture media. Thymol (98.00% purity) was purchased from Shanghai Ron Reagent or Shanghai Yien Chemical Technology. All other chemicals and reagents were of analytical grade and they were purchased from Chengdu Cologne Chemical Reagent Company (Chengdu, China). Thymol microcapsule powder was equipped with 1-L thymol microcapsule emulsion, a total of 5.28-g thymol; 10-g emulsifier; β-cyclodextrin, 123.15 g; PEG6000, 61.57 g; and 1-L ultra-pure water. The β-cyclodextrin was dissolved in 500-ml hot water over 75°C and then stirred in a magnetic stirrer (80°C) at 600 rpm/min. Also, PEG was dissolved by adding 300-ml hot water over 75°C in a high-speed stirrer at 1000 rpm/min and then placed in an ultrasonic cleaning tank for 15 min to exhaust. After the emulsifier was dissolved in 200-ml hot water over 75°C, the temperature was kept warm in a 60°C water bath. The exhaust PEG solution was added into the β-cyclodextrin solution, and the magnetic stirrer temperature was controlled over 75°C, 600 rpm/min, and stirred for 30 min. Also, adjusted the temperature to 60°C. Added emulsifier solution holding at about 60°C until uniform solution was arrived at. Then cool downed to about 40°C, and added core material (two drops per second). After stirring for 3 h (40°C, 600 rpm/min), microcapsule powder was obtained after spray drying. The effective content of muscimol in the prepared microcapsules was 26.1 mg/g. The preparation of membrane matrix solution was as follows: Boiled 500-ml ultrapure water along with 0.125-g KGM and 0.25-g LG. High-speed agitator (1,200–1,600 rpm/min), stirred for 30 min; added 0.2 g calcium stearate lactate and continued to stir for 5–10 min. Covered with plastic wrap and brought to a boil. The uniform membrane solution was obtained by ultrasound for 30 min (60°C, 80 W). The TKL mother liquor was equipped with 10-ml uniform membrane matrix solution along with 1.88679-g of microcapsule powder; after mixing, a centrifugation for 30 min and vortex for 5–10 min to obtain uniform mother liquor (concentration of 5 mg/ml); the TKL with different concentration gradients was diluted with membrane matrix. Isolation and Identification of Pathogens According to the plant tissues separation method ( Jogee et al., 2017 ), the spoiled okra about 6 mm 2 was excised from diseased berries with a sterile blade at the junction of the diseased and healthy sarcocarp. Each piece of sarcocarp was washed in sterile double-distilled water (SDW) and it was disinfested in 75% ethanol for 30 s and 1% sodium hypochlorite for 30 s, and then it was rinsed three times in SDW. After an incubation at 28°C for 48 h, the micromorphological characteristics of the colonies were observed, namely, color, growth diameter, texture, mycelial size, and conidial shape of the colonies. After the purification, the fungi were cultured on PDA and stored at 4°C for subsequent identification. The mycelia of the tested strains were scraped and cultured at 28°C for 1–2 days on a PDA plate, and DNA was extracted using TSINGKE Plant DNA Extraction Kit (universal type). The extracted DNA samples were diluted and used as polymerase chain reaction (PCR) template and 1 × TSE101 gold mix for the amplification. The components of the amplification system were as follows: 1 × TSE101 gold Mix 45 μL, ITS1 (10P) 2 μL, ITS4 (10P) 2 μL, DNA template 1 μL. The reaction conditions were as follows: 98°C 2 min, 98°C 10 s, 56°C 10 s, 72°C 10 s/kB, 35 cycles; 72°C for 5 min, stored at 4°C. The amplified PCR products were subjected to agarose gel electrophoresis (2 μL sample + 6 μL bromophenol blue) at 300-V voltage for 12 min to obtain the identification gel pattern. The PCR products will be prepared for generation sequencing (sequencing primer is ITS). The work was commissioned by the Chengdu Branch of Beijing Qingqing Biotechnology Co., Ltd. Contig express was used to join the sequencing results, and the inaccurate parts at both ends were removed. The spliced sequences were compared in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (bla. NCBI. nLM. Nih.gov ), and the species with the highest homology were selected to construct the related phylogenetic tree using MEGA 5.02 software. Pathogenicity Determination A 6-mm M. circinelloides was inoculated into healthy okra by puncture inoculation. A sterile PDA (6 mm) was used as blank groups and inoculated into okra by puncture inoculation, which was cultured in a constant temperature incubator at 28°C. The postharvest symptom of M. circinelloides on okra was observed, which was confirmed as pathogenic bacteria compared with blank. Observation of Biological Characteristics of Pathogenic Bacteria The isolated and identified pathogenic bacteria were inoculated on a PDA plate for a dark culture at 28°C for 3–7 days, and bacteria cakes with diameters of 6 mm were taken to a PDA medium. The different carbon and nitrogen sources, temperature, pH value, NaCl concentration, and light conditions were set up in the experiment. After 3–5 days, the colony diameter was measured by the cross-crossing method. The effects of carbon and nitrogen sources on the colony growth and sporulation were studied. Eight carbon sources were tested using the Sabouraud Dextrose Agar medium as the basal medium as follows: Glucose, maltose, agarose, lactose, starch, fructose, sucrose, and soluble sugar. Five kinds of medium were prepared by replacing the carbon sources with equal amounts of glucose. Six nitrogen sources were selected as follows: Urea, ammonium nitrate, peptone, potassium nitrate, ammonium sulfate, and beef extract, according to the amount of peptone replacement. The cake was transferred to the plate center with different carbon and nitrogen sources, and a dark culture was conducted at 28°C. The influence of culture temperature on colony growth and sporulation was studied. The cakes were transferred to the center of a new PDA plate and placed in the dark culture at 15, 24, 28, and 35°C, respectively. The influence of pH on the colony growth and the spore production was studied. The pH value of the PDA medium was adjusted with 0.1 mol/L hydrochloric acid and 0.1 mol/L sodium hydroxide solution. After sterilization, the prepared cake was transferred to the center of the PDA plate with different pH values (5.0, 6.0, 7.0, 8.0, and 9.0). A dark culture at 28°C was conducted. The effects of light conditions on the colony growth and the sporulation. The light conditions were set as a dark culture; a light culture and an alternating light and dark cultures (light and dark for 12 h each); PDA culture medium; and the culture temperature were maintained at 28°C. The effects of different NaCl (%) on colony growth and spore production were studied. The colony diameter was determined by using PDA medium containing 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, and 3.0% NaCl at 28°C for 72 h. The in vitro of Antifungal Activity of Thymol/KGM/LG on Mycelial Growth and Spore Germination The effects of the different concentrations of TKL on the growth of pathogenic bacteria were determined by the growth rate method. Also, 0, 400, 800, 1,600, and 2,000 μl of 5-mg/ml TKL mother solution (the solvent was polysaccharide membrane matrix, and the control group was PDA and blank PDA with 1-ml membrane matrix) were added into 100-ml PDA medium, respectively. The final mass concentration of thymol was 0, 20, 40, 60, 80, and 100 mg/L, respectively, and then mixed into sterile Petri dishes for later use. A sterile hole punch with a diameter of 6 mm was used to make holes of 6 mm diameter in different concentrations of TKL Petri dishes and control Petri dishes, respectively. Then a sterile hole punch with a diameter of 6 mm was used to cut bacterial cakes from pathogen dishes cultured for 2 days, and the cakes were embedded in the holes of TKL Petri dishes with different concentrations of TKL and control Petri dishes. The culture dish was placed in a constant temperature incubator at 28°C for 3–5 days. The colony diameter was measured by the cross-crossing method, and the inhibition rate of TKL coating on mycelial radial growth was calculated according to the formula below. Growth ⁢ Inhibition ⁢ rate % = Colony ⁢ diameter ⁢ of ⁢ control ⁢ group ⁢ ( mm ) - Colony ⁢ diameter ⁢ of ⁢ treatment ⁢ group ⁢ ( mm ) Colony ⁢ diameter ⁢ of ⁢ control ⁢ group ⁢ ( mm ) × 100 % Distilled water, film-forming matrix, and anhydrous ethanol were used as the negative control, and thymol ethanol solution with equal concentration was used as the positive control. A 200-μL of the prepared spore solution (10 5 CFU/ml) was placed in a 96-well plate, and the final concentrations of thymol were 0, 40, 80, 100, 120, 240, 480, 960, 1920 mg/L, respectively. The treated 96-well plates were placed in a constant temperature and humidity incubator for 72 h at 28°C, and the OD600 value of each treatment was detected by a microplate tester. The inhibitory effect of thymol on the growth of pathogenic bacteria was measured by the value. The minimum inhibitory concentration (MIC) of thymol on the growth of pathogenic bacteria was obtained according to the inhibitory effect. Inhibition of Thymol/KGM/LG on the Mycelia Weight of Mucor circinelloides (1) Preparation medium (PDA liquid): Peeled potatoes, diced and weighed 200 g; boiled with 1 L of ultra-pure water for 20–30 min; filtered with two layers of gauze; and the filtrate was taken. Added 20-g glucose; dissolved it in a constant volume to 1 L; packed it separately in 250-ml and 500-ml conical bottles, 100 ml each, and sterilized. When cooling to about 55°C, added 5% tartaric acid or 10% lactic acid (filtration sterilization), adjust pH to 3.5. (2) Determination of fungal growth curve: (I) Preparation of bacterial suspension: Added 5 ml normal saline to the activated bacterial species incline. Scraped off the bacterial lichen or spores with inoculation ring to make bacterial suspension or spore suspension, dilute counting, suspension controlled at 10 5 –10 6 CFU/ml. (II) Fungi were cultured in a 50 ml liquid medium in a 300-ml conical flask, and TKL was added to the experimental group. The concentration of thymol in the liquid medium was 100 mg/L, and 50-μL fungal suspension or spore suspension (10 6 CFU/ml) was inoculated in the shaking table at 28–30°C for 140 rpm/min. The growth of fungi was measured by the dry weight method. The triangular flask was taken out at intervals of 12 or 24 h (48 h or according to the actual growth of bacteria), and the culture medium was pumped and filtered on quantitative filter paper. The medium was baked at 60°C until it reaches a constant weight, and the dry weight of the bacteria was weighed. The dry weight of mycelia = the weight of membrane after dry weight of membrane before filtration. (III) The growth curve according to the incubation time (h) and dry weight (g) was drawn. The Effects of Thymol/KGM/LG on the Structure of Pathogenic Bacteria Were Observed by Scanning Electron Microscope Cover fragment culture of bacteria: (1) Water agar plate cooling set aside. Melted PDA solid medium to a liquid state, and kept the temperature of 50–60°C, which was poured into the plate; picked up the sterile cover glass with tweezers, gently dipped it into the melted PDA medium, and quickly pulled it out. A very thin medium film was adhered to the cover glass and solidify in a moment. (2) Placed cover slides horizontally on the surface of a flat plate containing sterile 1.5% water agar. Placed a maximum of four cover slides on a flat plate, but be careful not to allow them to overlap with each other. The agar with 1.5% solid water mainly acted as a wet chamber, which was providing humidity during the fungal growth. (3) Inoculated the fungus in the center of the cover glass with medium film with an inoculation needle (click lightly). All the above steps were carried out under aseptic conditions, covering the lid, and culture for 48 h in the incubator at 28°C 90% RH constant temperature and humidity (culture time is different for different strains, the specific end of culture was the beginning of spore production). (4) After the strains were matured, the cover glass was removed and put into a sterile empty medium. A 2% glutaraldehyde was dropped on the cover glass (light drops, and the entire colony and spores were submerged) and fixed for 2 h in a refrigerator at 4°C. (5) Removed the cover glass and wash it with sterile phosphate buffered solution (PBS) solution in a sterile Petri dish three times, 10 min each; Then soak in 1% osmium solution at 4°C for 2 h (this step could be omitted). The sample was placed in 50, 70, 95, and 100% alcohol to dehydrate and replace; the time was generally 10–15 min for each grade. Iso–amyl acetate was substituted at 4°C for 20 min. All these soaking steps were carried out in clean Petri dishes at 4°C. (6) Placed the cover glass after a treatment in a clean Petri dish (labeled Petri dish), and placed it at –80°C for rapid pre-cooling for 12 h (overnight). (7) The samples were freeze-dried in a vacuum (36–48 h) and treated with vacuum gold plating before scanning electron microscopy. After critical point drying and coating, the results were observed by scanning electron microscope and photographed (equipment model: ELECTRON microscope; United States FEIF50 energy spectrum: United States EDAX OCTANE SUPER. This step was operated by Etesting company). The method could observe the fungal spores and mycelia in the natural state. Effects of Thymol/KGM/LG on the Intracellular Structure and Enzyme Activity of Mucor circinelloids Configure medium (PDA liquid): Configured potato glucose liquid medium according to the corresponding requirements. Cultivation of fungi and preparation of bacterial suspension. A 5-ml normal saline was added to the inclined plane of activated bacterial species, and bacterial suspension or spore suspension was prepared by scraping off the bacterial lichen or spores with inoculating ring, and the suspension was controlled at 10 5 –10 6 CFU/ml. The fungi were cultured and filled with 50-ml liquid medium in a 300 ml Conical flask, which was divided into (i) experimental group and (ii) blank control group. The experimental group was added with 600-μl 5-mg/ml TKL coating solution, and the thymol concentration in the PDB medium was 100 mg/L and mixed evenly. Inoculated with 50-μL fungal suspension or spore suspension (10 5 –10 6 CFU/ml) and cultured in a 28°C 140 rpm/min shaking table. The samples were taken at 24 h for the first time and at intervals of 12 h for 24, 36, 48, and 60 h. The culture medium was filtered, the thallus was cleaned, and then frozen with liquid nitrogen and stored in a refrigerator at −80°C for future use. In sample preparation, the frozen thistle was ground into fine powder under the condition of low temperature maintained by liquid nitrogen. A 1 g of thistle powder was added into 9 ml of pre-cooled PBS (0.01 M, pH 7.4) solution, centrifuged at 4°C for 30 min at 5,000 g , and the supernatant could be detected. The enzyme activity was determined by MDA, PG, PMG, β-1.3-glucanase, chitinase (CHI), and Cx kits (these kits were purchased from Jiangxi Jingmei Biotechnology Co., Ltd, Yancheng city, Jiangsu Province, China.). Statistical Analysis The results were expressed as means ± standard deviation (SD) of five independent replicates, with no significant difference between treatment and experimental variables. Statistically significant differences between the mean values were analyzed with one-way analysis of variance (ANOVA) and Duncan's multi-range test using SPSS 25.0 (IBM, NY, United States). Differences at p < 0.05 were indicated significant. Results Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria The lesions of soft rot okra were disseminated from the surface to the inside and spread to the surrounding areas, showing black–brown to black, with depression and folds on the surface, brown plaque and a large number of mycelia, extravasation of juice, obvious soft tissue, and the pathogenic tissue changed from green to black–brown ( Figure 1A ). Then the entire tissue rotted away. After 7 days, the pathogen colonies on PDA were round and grayish–white with soft, fluffy, and grayish–white texture ( Figure 1B ). The aerial mycelia radiate from the center to the periphery. The mycelia were transparent and spaced, curly, and folded. Oval spores produced a pale–yellow spore pile; the spore was a single colorless, transparent, spore head into grain shape, and light yellow one ( Figure 1C ). FIGURE 1 Symptoms of soft rot of okra (A) , and morphological (B,C) characteristics of the isolated pathogen, as well as its phylogenetic tree (D) , and observation of okra reverse connection (E,F) . (A) Symptoms on the surface of diseased okra; (B) colonies of pathogen cultured for 5 days at 28°C; (C) mycelia of pathogen and 100× magnification; (D) phylogenetic analysis of DNA sequences obtained from fragments of the ITS rDNA from the isolate along with the reference sequences from NCBI. The analysis was conducted using the maximum likelihood method. The scale bar represents 0.01% substitutions of nucleotide. (E) Okra symptoms were observed 36 h after the puncture inoculation. (F) Okra symptoms were observed 36 h after puncture inoculation. To further identify the isolated pathogen, ITS 1-5.8S-ITS region 4 was sequenced. The ITS sequence was preliminarily analyzed and compared with NCBI sequences with a similarity greater than 99% using BLAST, and two sets of exogenous sequences were introduced; MEGA 5.02 software was used to construct the phylogenetic tree and analyze the sequence using the maximum likelihood method. According to the sequence comparison of the ITS1-5.8S-ITS4 region, the isolated pathogenic bacteria had the highest similarity with M. circinelloides ( Figure 1D ). Pathogenicity Determination The pathogen M. circinelloide , which caused okra soft rot, was verified by the method of cake puncture inoculation and pathogenicity test. The brown spots appeared on the okra surface at 36 h ( Figure 1E ), and mycelium began to distribute in tissues at 60 h ( Figure 1F ), softening, decay and depression appeared in tissues, and the surface color became dark, which were disease spots. At the same time, the mycelium penetrated the internal tissues, resulting in an internal decay. Biological Characteristics of Mucor circinelloides The effects of different carbon sources on colony growth are discussed as follows: The pathogenic bacteria could grow on all the above eight carbon sources, but there were differences in the growth of different carbon sources ( Figure 2A ). Also, M. circinelloides grew fastest when maltose was used as a carbon source; the colony diameter reached 69.07 ± 0.85 mm after incubation at 28°C for 3 days, followed by fructose ( p < 0.05), sucrose, glucose, and lactose that had no significant difference; starch and soluble sugar also had no significant difference; and agarose grew the slowest when used as carbon source. In conclusion, there were certain differences in the absorption and utilization capacity of pathogenic bacteria to different carbon sources. FIGURE 2 Biological characteristics of M. circinelloides (A–F) . (A) Effects of different carbon sources on growth of M. circinelloides . (B) Effects of different nitrogen sources on growth of M. circinelloides ; (C) Effects of different pH on growth of M. circinelloides . (D) Effects of different NaCl concentrations on the growth of M. circinelloides . (E) Effects of different light conditions on growth of M. circinelloides . (F) Effects of different temperatures on the growth of M. circinelloides . The effects of different nitrogen sources on bacterial colony growth are discussed as follows: The pathogenic bacteria could grow on the above six nitrogen sources, but there were significant differences among different nitrogen sources ( Figure 2B ). Among them, M. circinelloides had the best mycelium growth on beef extract and potassium nitrate ( p < 0.05), followed by ammonium sulfate, peptone, ammonium nitrate, and urea. Among them, the growth rate on urea was the slowest, and the growth rate was much lower than that of other groups. Therefore, the best nitrogen sources are potassium nitrate and beef extract. The effects of different pH on colony growth are discussed as follows: Mucor circinelloides could grow well in the Ph range of 5.0–9.0 ( Figure 2C ). When there was a pH of 6.0, the colony diameter was the largest and the mycelial growth rate was relatively the highest ( p < 0.05), it could be seen that pH 6.0 was the optimal pH value for mycelium growth; M. circinelloides might be suitable to grow in an acidic environment. The effects of different NaCl (%) on colony growth are discussed as follows: Mucor circinelloides could grow well in the range of 0–2.0% NaCl concentration ( Figure 2D ). When the concentration is 0.5%, the colony diameter reaches the maximum ( p < 0.05), the mycelium growth rate was relatively the highest, and there was no significant difference between 2.0% and the blank group. Also, 1.0 and 1.5% could significantly promote growth. Therefore, the addition of NaCl less than 2% in the culture medium may be beneficial to the growth of M. circinelloides . The effects of different light conditions on colony growth are discussed as follows: See Figure 2E . Under full light, the colony diameter was the largest, but there was no significant difference with a half-light, and there was a significant difference with full darkness ( p < 0.05), indicating that light was beneficial to the growth of M. circinelloides . The effects of different temperatures on colony growth are discussed as follows: See Figure 2F . As can be seen from the figure, M. circinelloides can grow in the temperature range of 15–37°C. The optimum growth temperature of M. circinelloides mycelia was 28°C ( p < 0.05); too high or too low temperature might inhibit its growth and reproduction. Inhibitory Effect of Thymol/KGM/LG on Mucor circinelloides in vitro We evaluated the antifungal activity of TKL against M. circinelloides , which was sensitive to thymol in TKL. Compared with the untreated group, the growth of M. circinelloides treated with different concentrations of TKL was inhibited, and the higher the concentration, the better was the inhibition effect. The results showed that 20–120-mg/L TKL edible coating solution had a significant effect on the growth of mycelia ( p < 0.05; Table 1 and Figure 3A ), and the median inhibitory concentration was 113.55-mg/L. According to the RESULTS of OD600 value, 40–960 mg/L TKL could significantly inhibit the conidial germination of M. circinelloides ( Figure 3B ). With the increase of concentration, the inhibition effect became better. When the concentration reached 960 mg/L, TKL could completely inhibit the conidial germination. TABLE 1 Inhibitory effect of different concentrations of Thymol/KGM/LG on Mucor circinelloides . Bacteriostatic agents Thymol concentration The fungus diameter Inhibition rate (%) CK 0 mg/L 77.65 ± 1.65 ab 0.00 TKL (0) 0 mg/L 86.26 ± 0.84 a –12.01 TKL (20) 20 mg/L 76.21 ± 1.09 ab 2.01 TKL (40) 40 mg/L 70.64 ± 1.70 bc 9.79 TKL (60) 60 mg/L 64.09 ± 2.39 cd 18.94 TKL (80) 80 mg/L 50.91 ± 2.46 de 37.32 TKL (100) 100 mg/L 45.95 ± 0.77 ef 44.25 TKL (120) 120 mg/L 38.80 ± 0.58 f 54.23 Measurement of colony diameter and data are the mean (±SD) of five independent analyses. Columns with different letters at each concentration indicate significant differences according to Duncan's multiple range tests at p < 0.05. FIGURE 3 Effect of different concentrations of thymol on mycelial growth (A) and spore germination (B) of M. circinelloides . Values are the average of the replicates for all the analyses . (A) Inhibitory effect of different concentrations of TKL on M. circinelloides ; (B) Inhibitory effects of different concentrations of TKL on spore germination of M. circinelloides . Effects of Thymol/KGM/LG on the Growth Cycle of Mucor circinelloides The growth of M. circinelloides could be divided into four stages ( Figure 4 ), which were lagging stage (0–36 h), logarithmic stage (36–84 h), stable stage (84–120 h), and declining stage (120–196 h). Mucor circinelloides grew rapidly. When it grew stronger, it would reproduce at about 24 h, entered the growth peak at 36 h, reached the growth limit at 84 h, entered the stable stage, and entered the decline stage at 108 h. However, after the treatment with 100-mg/L TKL edible coating solution, the four growth stages of M. circinelloides were delayed hysteresis (0–48 h), logarithmic phase (48–96 h), stationary phase (96–108 h), and declination phase (108–196 h). At 48 h, the growth rate and growth limit decreased, and the dry weight of mycelia was only 75% of that of the control group ( p < 0.05), the stable period shortens, and the decline rate becomes faster. FIGURE 4 Effects of TKL100 on the growth cycle of M. circinelloides . Used Scanning Electron Microscope to Observe the Effect of Thymol/KGM/LG on the Structure of Mucor circinelloides A scanning electron microscope (SEM) was used to observe that the normal mycelia of M. circinelloides were relatively smooth and club-like, with few curls and folds ( Figure 5A ). Meanwhile, the spores were smooth and flat as a whole, in the shape of a football ( Figure 5C ). However, after TKL100 treatment, the mycelia of M. circinelloides showed shrinkage, rough and curly surface, and even fracture ( Figure 5B ). In addition, after the treatment with TKL100, the spores were significantly smaller and their surface was rough and crinkled ( Figure 5D ). FIGURE 5 SEM was used to observe the effect of TKL on the structure of M. circinelloides (A–D) . (A1–A3) Healthy mycelia, the magnitudes of 200×, 1,000×, 2,000×; (B1–B3) Mycelia treated with TKL100, the magnitudes of 200×, 1,000×, 2,000×; (C1–C3) Normal spores, the magnitudes of 200×, 1,000×, 2,000×; (D1–D3) , Spores treated with TKL100, the magnitudes of 200×, 1,000×, 2,000×. Effects of Thymol/KGM/LG on Mucor circinelloides Related Enzyme Activities Under the aging or stress conditions, the microorganisms often undergo membrane lipid peroxidation. Malondialdehyde (MDA) was the final decomposition product of membrane lipid peroxidation, and its content could reflect the degree of stress injury of microorganisms ( Wu et al., 2020 ). See Figure 6A ; the MDA content of M. circinelloides treated with TKL100 for 12, 24, and 36 h was significantly higher than that of the control group ( p < 0.05), but significantly lower than the control at 48 h. FIGURE 6 Effects of TKL on M. circinelloides related enzyme activities, MDA (A) , CHI (B) , β-1, 3-glucanase (C) , PG (D) , Cx (E) , and PMG (F) . (A) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, MDA changes. (B) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, CHI changes. (C) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, β-1, 3-glucanase changes. (D) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, PG changes. (E) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, Cx changes. (F) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, PMG changes. Error bars are ±SD of the means. In some cases, the error bar is obscured by the symbol. Columns with different letters at each time point indicate significant differences according to Duncan's multiple range tests at P < 0.05. The main components of the fungal cell wall are polysaccharides, which mainly included chitin, cellulose, and glucan ( Chakraborty et al., 2021 ). As CHI could catalyze the hydrolysis of chitin, β-1, 3-glucanase could catalyze the hydrolysis of β-1, 3-glucoside bond. Therefore, when the activities of CHI and β-1, 3-glucanase in cells were increased, the important components of the cell wall were reduced and the cell wall structure is damaged ( Zhang et al., 2021 ). In the metabolic process of M. circinelloides , chitin hydrolase can also be produced by M. circinelloides itself, but the enzyme activity was low and closely related to cell wall degradation. When TKL100 was induced, the activity of chitin hydrolase in cells increased continuously, and with the extension of induction time, the activity of the enzyme increased rapidly at first and then slowly. In the whole treatment stage (see Figure 6B ) the CHI activity of the TKL100 group was higher than that of the control group, and the CHI activity of the TKL100 group was about 1.84 times that of the control group, reaching 5.05 U/L ( p < 0.05). However, after 12, 36, and 60 h treatment with TKL100 (see Figure 6C ), β-1, 3-glucanase content was significantly decreased ( p < 0.05), and there was no significant difference with the control group at 24 h. Therefore, TKL100 may induce the production of CHI to promote the degradation of the M. circinelloides cell wall. Polygalacturonase (PG) and cellulase (Cx) are fungal metabolites that could promote degradation of the plant cell wall, resulting in plant cell damage and disease generation ( Pandaranayaka et al., 2019 ; Osés-Ruiz et al., 2021 ). As can be seen from the figure, the activity of PG decreased significantly after the treatment with TK100 throughout the whole culture cycle, especially after treatment for 60 h ( Figure 6D ), the activity of PG decreased by 18.7% compared with the control group ( p < 0.05). Therefore, TKL100 might inhibit PG synthesis and M. circinelloides metabolism. After the treatment with TKL100 ( Figure 6E ), there was no significant difference in Cx activity at 12 h, but after the treatment with TKL100 for 24, 36, and 48 h, Cx gradually decreased, showing a significant difference from the control group. After 60 h of treatment, the Cx activity of the TKL100 group was only 60.8% of that of the control group, seriously inhibiting the synthesis of Cx. It could be concluded that TKL100 may inhibit the metabolic activities of M. circinelloides . Pectin methylgalacturonase (PMG) is also one of the metabolites of mold, which could usually dissolve the cell wall of plant cells, resulting in the rupture and death of the plant cells, resulting in corresponding diseases. After TKL100 treatment ( Figure 6F ), PMG activity gradually decreased to 28.8% of the control group at 48 h ( p < 0.05), but at 60 h, the activity of PMG in the TKL100 treatment group began to increase, and there was no significant difference between the TKL100 treatment group and control group. Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria The lesions of soft rot okra were disseminated from the surface to the inside and spread to the surrounding areas, showing black–brown to black, with depression and folds on the surface, brown plaque and a large number of mycelia, extravasation of juice, obvious soft tissue, and the pathogenic tissue changed from green to black–brown ( Figure 1A ). Then the entire tissue rotted away. After 7 days, the pathogen colonies on PDA were round and grayish–white with soft, fluffy, and grayish–white texture ( Figure 1B ). The aerial mycelia radiate from the center to the periphery. The mycelia were transparent and spaced, curly, and folded. Oval spores produced a pale–yellow spore pile; the spore was a single colorless, transparent, spore head into grain shape, and light yellow one ( Figure 1C ). FIGURE 1 Symptoms of soft rot of okra (A) , and morphological (B,C) characteristics of the isolated pathogen, as well as its phylogenetic tree (D) , and observation of okra reverse connection (E,F) . (A) Symptoms on the surface of diseased okra; (B) colonies of pathogen cultured for 5 days at 28°C; (C) mycelia of pathogen and 100× magnification; (D) phylogenetic analysis of DNA sequences obtained from fragments of the ITS rDNA from the isolate along with the reference sequences from NCBI. The analysis was conducted using the maximum likelihood method. The scale bar represents 0.01% substitutions of nucleotide. (E) Okra symptoms were observed 36 h after the puncture inoculation. (F) Okra symptoms were observed 36 h after puncture inoculation. To further identify the isolated pathogen, ITS 1-5.8S-ITS region 4 was sequenced. The ITS sequence was preliminarily analyzed and compared with NCBI sequences with a similarity greater than 99% using BLAST, and two sets of exogenous sequences were introduced; MEGA 5.02 software was used to construct the phylogenetic tree and analyze the sequence using the maximum likelihood method. According to the sequence comparison of the ITS1-5.8S-ITS4 region, the isolated pathogenic bacteria had the highest similarity with M. circinelloides ( Figure 1D ). Pathogenicity Determination The pathogen M. circinelloide , which caused okra soft rot, was verified by the method of cake puncture inoculation and pathogenicity test. The brown spots appeared on the okra surface at 36 h ( Figure 1E ), and mycelium began to distribute in tissues at 60 h ( Figure 1F ), softening, decay and depression appeared in tissues, and the surface color became dark, which were disease spots. At the same time, the mycelium penetrated the internal tissues, resulting in an internal decay. Biological Characteristics of Mucor circinelloides The effects of different carbon sources on colony growth are discussed as follows: The pathogenic bacteria could grow on all the above eight carbon sources, but there were differences in the growth of different carbon sources ( Figure 2A ). Also, M. circinelloides grew fastest when maltose was used as a carbon source; the colony diameter reached 69.07 ± 0.85 mm after incubation at 28°C for 3 days, followed by fructose ( p < 0.05), sucrose, glucose, and lactose that had no significant difference; starch and soluble sugar also had no significant difference; and agarose grew the slowest when used as carbon source. In conclusion, there were certain differences in the absorption and utilization capacity of pathogenic bacteria to different carbon sources. FIGURE 2 Biological characteristics of M. circinelloides (A–F) . (A) Effects of different carbon sources on growth of M. circinelloides . (B) Effects of different nitrogen sources on growth of M. circinelloides ; (C) Effects of different pH on growth of M. circinelloides . (D) Effects of different NaCl concentrations on the growth of M. circinelloides . (E) Effects of different light conditions on growth of M. circinelloides . (F) Effects of different temperatures on the growth of M. circinelloides . The effects of different nitrogen sources on bacterial colony growth are discussed as follows: The pathogenic bacteria could grow on the above six nitrogen sources, but there were significant differences among different nitrogen sources ( Figure 2B ). Among them, M. circinelloides had the best mycelium growth on beef extract and potassium nitrate ( p < 0.05), followed by ammonium sulfate, peptone, ammonium nitrate, and urea. Among them, the growth rate on urea was the slowest, and the growth rate was much lower than that of other groups. Therefore, the best nitrogen sources are potassium nitrate and beef extract. The effects of different pH on colony growth are discussed as follows: Mucor circinelloides could grow well in the Ph range of 5.0–9.0 ( Figure 2C ). When there was a pH of 6.0, the colony diameter was the largest and the mycelial growth rate was relatively the highest ( p < 0.05), it could be seen that pH 6.0 was the optimal pH value for mycelium growth; M. circinelloides might be suitable to grow in an acidic environment. The effects of different NaCl (%) on colony growth are discussed as follows: Mucor circinelloides could grow well in the range of 0–2.0% NaCl concentration ( Figure 2D ). When the concentration is 0.5%, the colony diameter reaches the maximum ( p < 0.05), the mycelium growth rate was relatively the highest, and there was no significant difference between 2.0% and the blank group. Also, 1.0 and 1.5% could significantly promote growth. Therefore, the addition of NaCl less than 2% in the culture medium may be beneficial to the growth of M. circinelloides . The effects of different light conditions on colony growth are discussed as follows: See Figure 2E . Under full light, the colony diameter was the largest, but there was no significant difference with a half-light, and there was a significant difference with full darkness ( p < 0.05), indicating that light was beneficial to the growth of M. circinelloides . The effects of different temperatures on colony growth are discussed as follows: See Figure 2F . As can be seen from the figure, M. circinelloides can grow in the temperature range of 15–37°C. The optimum growth temperature of M. circinelloides mycelia was 28°C ( p < 0.05); too high or too low temperature might inhibit its growth and reproduction. Inhibitory Effect of Thymol/KGM/LG on Mucor circinelloides in vitro We evaluated the antifungal activity of TKL against M. circinelloides , which was sensitive to thymol in TKL. Compared with the untreated group, the growth of M. circinelloides treated with different concentrations of TKL was inhibited, and the higher the concentration, the better was the inhibition effect. The results showed that 20–120-mg/L TKL edible coating solution had a significant effect on the growth of mycelia ( p < 0.05; Table 1 and Figure 3A ), and the median inhibitory concentration was 113.55-mg/L. According to the RESULTS of OD600 value, 40–960 mg/L TKL could significantly inhibit the conidial germination of M. circinelloides ( Figure 3B ). With the increase of concentration, the inhibition effect became better. When the concentration reached 960 mg/L, TKL could completely inhibit the conidial germination. TABLE 1 Inhibitory effect of different concentrations of Thymol/KGM/LG on Mucor circinelloides . Bacteriostatic agents Thymol concentration The fungus diameter Inhibition rate (%) CK 0 mg/L 77.65 ± 1.65 ab 0.00 TKL (0) 0 mg/L 86.26 ± 0.84 a –12.01 TKL (20) 20 mg/L 76.21 ± 1.09 ab 2.01 TKL (40) 40 mg/L 70.64 ± 1.70 bc 9.79 TKL (60) 60 mg/L 64.09 ± 2.39 cd 18.94 TKL (80) 80 mg/L 50.91 ± 2.46 de 37.32 TKL (100) 100 mg/L 45.95 ± 0.77 ef 44.25 TKL (120) 120 mg/L 38.80 ± 0.58 f 54.23 Measurement of colony diameter and data are the mean (±SD) of five independent analyses. Columns with different letters at each concentration indicate significant differences according to Duncan's multiple range tests at p < 0.05. FIGURE 3 Effect of different concentrations of thymol on mycelial growth (A) and spore germination (B) of M. circinelloides . Values are the average of the replicates for all the analyses . (A) Inhibitory effect of different concentrations of TKL on M. circinelloides ; (B) Inhibitory effects of different concentrations of TKL on spore germination of M. circinelloides . Effects of Thymol/KGM/LG on the Growth Cycle of Mucor circinelloides The growth of M. circinelloides could be divided into four stages ( Figure 4 ), which were lagging stage (0–36 h), logarithmic stage (36–84 h), stable stage (84–120 h), and declining stage (120–196 h). Mucor circinelloides grew rapidly. When it grew stronger, it would reproduce at about 24 h, entered the growth peak at 36 h, reached the growth limit at 84 h, entered the stable stage, and entered the decline stage at 108 h. However, after the treatment with 100-mg/L TKL edible coating solution, the four growth stages of M. circinelloides were delayed hysteresis (0–48 h), logarithmic phase (48–96 h), stationary phase (96–108 h), and declination phase (108–196 h). At 48 h, the growth rate and growth limit decreased, and the dry weight of mycelia was only 75% of that of the control group ( p < 0.05), the stable period shortens, and the decline rate becomes faster. FIGURE 4 Effects of TKL100 on the growth cycle of M. circinelloides . Used Scanning Electron Microscope to Observe the Effect of Thymol/KGM/LG on the Structure of Mucor circinelloides A scanning electron microscope (SEM) was used to observe that the normal mycelia of M. circinelloides were relatively smooth and club-like, with few curls and folds ( Figure 5A ). Meanwhile, the spores were smooth and flat as a whole, in the shape of a football ( Figure 5C ). However, after TKL100 treatment, the mycelia of M. circinelloides showed shrinkage, rough and curly surface, and even fracture ( Figure 5B ). In addition, after the treatment with TKL100, the spores were significantly smaller and their surface was rough and crinkled ( Figure 5D ). FIGURE 5 SEM was used to observe the effect of TKL on the structure of M. circinelloides (A–D) . (A1–A3) Healthy mycelia, the magnitudes of 200×, 1,000×, 2,000×; (B1–B3) Mycelia treated with TKL100, the magnitudes of 200×, 1,000×, 2,000×; (C1–C3) Normal spores, the magnitudes of 200×, 1,000×, 2,000×; (D1–D3) , Spores treated with TKL100, the magnitudes of 200×, 1,000×, 2,000×. Effects of Thymol/KGM/LG on Mucor circinelloides Related Enzyme Activities Under the aging or stress conditions, the microorganisms often undergo membrane lipid peroxidation. Malondialdehyde (MDA) was the final decomposition product of membrane lipid peroxidation, and its content could reflect the degree of stress injury of microorganisms ( Wu et al., 2020 ). See Figure 6A ; the MDA content of M. circinelloides treated with TKL100 for 12, 24, and 36 h was significantly higher than that of the control group ( p < 0.05), but significantly lower than the control at 48 h. FIGURE 6 Effects of TKL on M. circinelloides related enzyme activities, MDA (A) , CHI (B) , β-1, 3-glucanase (C) , PG (D) , Cx (E) , and PMG (F) . (A) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, MDA changes. (B) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, CHI changes. (C) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, β-1, 3-glucanase changes. (D) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, PG changes. (E) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, Cx changes. (F) After TKL100 treatment for 24, 36, 48, and 60 h, compared with the control group, PMG changes. Error bars are ±SD of the means. In some cases, the error bar is obscured by the symbol. Columns with different letters at each time point indicate significant differences according to Duncan's multiple range tests at P < 0.05. The main components of the fungal cell wall are polysaccharides, which mainly included chitin, cellulose, and glucan ( Chakraborty et al., 2021 ). As CHI could catalyze the hydrolysis of chitin, β-1, 3-glucanase could catalyze the hydrolysis of β-1, 3-glucoside bond. Therefore, when the activities of CHI and β-1, 3-glucanase in cells were increased, the important components of the cell wall were reduced and the cell wall structure is damaged ( Zhang et al., 2021 ). In the metabolic process of M. circinelloides , chitin hydrolase can also be produced by M. circinelloides itself, but the enzyme activity was low and closely related to cell wall degradation. When TKL100 was induced, the activity of chitin hydrolase in cells increased continuously, and with the extension of induction time, the activity of the enzyme increased rapidly at first and then slowly. In the whole treatment stage (see Figure 6B ) the CHI activity of the TKL100 group was higher than that of the control group, and the CHI activity of the TKL100 group was about 1.84 times that of the control group, reaching 5.05 U/L ( p < 0.05). However, after 12, 36, and 60 h treatment with TKL100 (see Figure 6C ), β-1, 3-glucanase content was significantly decreased ( p < 0.05), and there was no significant difference with the control group at 24 h. Therefore, TKL100 may induce the production of CHI to promote the degradation of the M. circinelloides cell wall. Polygalacturonase (PG) and cellulase (Cx) are fungal metabolites that could promote degradation of the plant cell wall, resulting in plant cell damage and disease generation ( Pandaranayaka et al., 2019 ; Osés-Ruiz et al., 2021 ). As can be seen from the figure, the activity of PG decreased significantly after the treatment with TK100 throughout the whole culture cycle, especially after treatment for 60 h ( Figure 6D ), the activity of PG decreased by 18.7% compared with the control group ( p < 0.05). Therefore, TKL100 might inhibit PG synthesis and M. circinelloides metabolism. After the treatment with TKL100 ( Figure 6E ), there was no significant difference in Cx activity at 12 h, but after the treatment with TKL100 for 24, 36, and 48 h, Cx gradually decreased, showing a significant difference from the control group. After 60 h of treatment, the Cx activity of the TKL100 group was only 60.8% of that of the control group, seriously inhibiting the synthesis of Cx. It could be concluded that TKL100 may inhibit the metabolic activities of M. circinelloides . Pectin methylgalacturonase (PMG) is also one of the metabolites of mold, which could usually dissolve the cell wall of plant cells, resulting in the rupture and death of the plant cells, resulting in corresponding diseases. After TKL100 treatment ( Figure 6F ), PMG activity gradually decreased to 28.8% of the control group at 48 h ( p < 0.05), but at 60 h, the activity of PMG in the TKL100 treatment group began to increase, and there was no significant difference between the TKL100 treatment group and control group. Discussion The isolated pathogens were inoculated into sterilized okra. The results showed that after the inoculation at 28°C for 36 h, brown spots appeared on the okra surface due to pathogen infection. After that, the lesion expanded rapidly, and at 60 h, the surface was wrinkled, softened, depressed, and rotten. The outer skin gradually darkened and turned dark brown. A large number of gray mycelia appeared in the pathogenic site and even spread to the seeds inside okra. Through morphological and molecular identification, the pathogen of okra soft rot was identified as M. circinelloides . So far, as far as we know, okra soft rot symptoms and the pathogen M. circinelloides have not been reported. Thymol is extracted from essential oils such as thyme, thyme, oregano, and clove basil. It has antiseptic and antioxidation effects ( Nzeako et al., 2006 ). Studies have shown that thymol has a strong inhibitory effect on a variety of plant pathogens, such as Magnaporthe Grisea , Fusarium graminearum , etc. ( Zhou et al., 2021 ), followed by thymol has a good antifungal effect on brown rot bacteria ( Zhang et al., 2019 ). Essential oils of thyme and its main components (about 47.59% thymol) ( Borugă et al., 2014 ) have antifungal effects on aspergillus and penicillium ( Sokolić-Mihalak et al., 2012 ; Pinto et al., 2021 ). Medina et al. found that chitosan thymol nanoparticles in the edible film had a good inhibitory effect on Botrytis cinerea during the storage of blueberry fruits ( Medina et al., 2019 ). Thymol – HP-β-cyclodextrin microcapsules could control acid rot pathogen Geotrichum Citri-Aurantii in citrus fruits ( Serna-Escolano et al., 2020 ). The antifungal mechanism of thymol might be the inhibition of pathogen growth and spore germination, the direct effect on phospholipid and protein degradation ( Jung et al., 2021 ), and the inhibition of ergosterol biosynthesis to change the permeability of cell membrane and caused obvious damage to the cell wall and plasma membrane ( Galotto et al., 2016 ), cytoplasmic disintegration and organelle death ( Kowalczyk et al., 2020 ). In addition, some studies have shown that thymol can change cell membrane permeability and inhibit microbial growth by inducing membrane lipid peroxidation ( Nagoor Meeran et al., 2017 ), and it can also inhibit the growth of bocinia cinerea by destroying cell membrane morphology and causing electrolyte leakage ( Nazzaro et al., 2013 ; Folle et al., 2021 ). In addition, it affects the activity of endometrial proteins such as enzymes and receptors. After entering the cell membrane, thymol interacts with its embedded proteins through various non-specific mechanisms, resulting in changes in conformation and activity of internal and membrane proteins ( Khan et al., 2021 ). Thymol (30 μg/ml) significantly inhibited the mycelial growth and spore germination of B. cinerea ( Shin et al., 2014 ). It was found that TKL could significantly inhibit the growth, reproduction, and spore germination of M. circinelloides . At the same time, after 100 mg/L TKL treatment, the M. circinelloides delay period was prolonged, 48 h into the growth stage, the growth rate decreased, the growth limit decreased twice, the stable period shortened, the decline rate became faster. A TEM observation showed that compared with the control group, the mycelia of M. circinelloides showed the shrinkage with rough surfaces and even fracture after treatment with TKL100, and the spores became significantly smaller with shrinkage and surface depression. These results indicated that TKL could damage the structure of M. circinelloides and inhibit spore germination. In addition, the results listed in Table 1 showed that the inhibition rate of the TKL (0) group was –12.01%, which may be because the thymol-free membrane matrix was added to the PDA medium in TKL (0) treatment group. The main raw materials for preparing membrane matrix were polysaccharides, which may provide additional carbon sources for M. circinelloides . It promoted the growth and spread of the mycelia of M. circinelloides . To explore the effects of TKL on the M. circinelloides membrane, MDA content was determined. The fact that the higher the oxidation level (MDA content) of the mold membrane system, the higher the activity of antioxidative damage-related enzymes was with the accumulation of MDA in cells. Therefore, the MDA content can reflect the injury degree of the mycobacterium somatic membrane to a certain extent. After TKL treatment, MDA content increased significantly at 12–48 h, but decreased sharply at 60 h, even lower than the control, indicating that TKL induced peroxidation of M. circinelloides membrane at 12–48 h, resulting in certain damage. However, at 60 h, M. circinelloides had a certain stress resistance to TKL stimulation, indicating a potential self-repair mechanism. Therefore, it can be concluded that TKL100 treatment may cause membrane damage of M. circinelloides in the early stage of 0–36 h culture, accelerate the degree of peroxidation, and generate more MDA. However, at 48 h, M. circinelloides developed resistance to TKL100 and increased tolerance, suggesting a potential self-repair mechanism ( Vellanki et al., 2020 ). Three enzymes, PG, PMG, and Cx, are the plant cell wall degrading enzymes (CWDE) and can be produced by a variety of plant disease bacteria, usually as metabolites of plant disease bacteria, such as rice sheath blight pathogen ag1-IA Kuhn ( Datta et al., 2021 ); the infection of host plants by Botrytis spp. Also found that R. solanacearum secretes CWDE during host infection, including Cx and PMG ( Huang et al., 2019 ; Yang et al., 2021 ). The plant disease bacteria metabolize to produce plant cell wall degradation enzymes, resulting in plant cell damage and infiltration, resulting in related plant diseases. After TKL treatment, the activity of PG and Cx of M. circinelloides showed a decreasing trend, while PMG showed a decreasing trend first and then increasing. The activity of PG and Cx decreased most significantly at 60 h and decreased most significantly at 48 h PMG. The late decrease of PMG activity may be due to the production of tolerance and stress resistance of bacteria, while the extreme decrease of PMG in the control group may be due to insufficient substrate, and some bacteria begin to decline. Therefore, TKL may inhibit the metabolism of M. circinelloides , resulting in the production of its metabolites. The main components of the fungal cell wall are polysaccharides, including chitin, cellulose, glucan, and so on ( Kang et al., 2018 ; Chakraborty et al., 2021 ). AS CHI can catalyze the hydrolysis of chitin, β-1, 3-glucanase can catalyze the hydrolysis of β-1, 3-glucoside bond. Therefore, when the activity of CHI and β-1, 3-glucanase is increased, the important components of the cell wall are reduced and the cell wall structure is destroyed. In the metabolic process of M. circinelloides , chitin hydrolase can also be produced by M. circinelloides itself, but the activity is low and closely related to cell wall degradation. After the TKL treatment, the CHI content of M. circinelloides continued to increase, but the β-1, 3-glucanase content did not change regularly after TKL100 treatment. Therefore, TKL100 can also induce the generation of CHI and promote the degradation of the M. circinelloides cell wall to achieve the bacteriostatic effect. Conclusion The results showed that M. circinelloides was the main pathogenic pathogen of postharvest soft rot of okra. The optimum carbon source of M. circinelloides is maltose, and the optimum nitrogen source is beef extract and potassium nitrate. The optimum pH is 6, and it is suitable for the growth of M. circinelloides under acidic conditions. The optimum temperature is 15–37°C, and the optimum temperature is 28°C. The low concentrations of NaCl and light were beneficial to its growth. First, the TKL had a good antifungal effect on M. circinelloides , and the antifungal mechanism was mainly to inhibit fungal growth, metabolism, and spore germination. Second, it can induce peroxidation of the cell membrane and promote degradation of the cell wall. The TKL is a potential natural bacteriostatic material, which has a good potential in postharvest disease control and storage of okra, but its bacteriostatic mechanism needs further study. Data Availability Statement The raw data supporting the conclusions of this article will be made available by the authors, without undue reservation. Ethics Statement Written informed consent was obtained from the individual(s) for the publication of any potentially identifiable images or data included in this article. Author Contributions QZ and WQ designed the study and revised the final version to be published. QZ, JY, ZW, JD, PH, LL, JW, and XH performed the experiments. QZ drafted the manuscript, wrote, and revised the manuscript. All authors contributed to the article and approved the submitted version. Conflict of Interest The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest. Publisher's Note All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher. Funding This work was supported by the Sichuan Science and Technology Program (2019YFN0174, 2020YFN0149, 2020JDRC0111, 2021JDRC0030, and 2021YJ0262) and the Open Fund of Sichuan Provincial Key Laboratory for the Development of Special Biological Resources in Dry and Hot River Valley (GR-2020-E-01).

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3580430/

The gene expression profiles of induced pluripotent stem cells from individuals with childhood cerebral adrenoleukodystrophy are consistent with proposed mechanisms of pathogenesis

Introduction X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a complex disorder with variable expressivity that affects the nervous, adrenocortical and male reproductive systems. Although ABCD1 mutations are known to provide the genetic basis for X-ALD, its pathogenesis is not fully elucidated. While elevated very long chain fatty acid (VLCFA) levels in blood and reduced VLCFA catabolic activity in cultured fibroblasts are biomarkers used to identify ABCD1 mutation carriers, the roles peroxisomal lipid metabolism play in disease etiology are unknown. Methods Primary skin fibroblasts from two male patients with the childhood cerebral form of the disease (CCALD) caused by ABCD1 frameshift or missense mutations and three healthy donors were transduced with retroviral vectors expressing the OCT4, SOX2, KLF4 and c- MYC factors. Candidate induced pluripotent stem cells (iPSCs) were subject to global gene expression, DNA methylation, DNA copy number variation, and genotyping analysis and tested for pluripotency through in vitro differentiation and teratoma formation. Saturated VLCFA (sVLCFA) and plasmalogen levels in primary fibroblasts and iPSCs from healthy donors as well as CCALD patients were determined through mass spectroscopy. Results Skin fibroblasts from CCALD patients and healthy donors were reprogrammed into validated iPSCs. Unlike fibroblasts, CCALD patient iPSCs show differentially expressed genes (DEGs) relevant to both peroxisome abundance and neuroinflammation. Also, in contrast to fibroblasts, iPSCs from patients showed no significant difference in sVLCFA levels relative to those from controls. In all cell types, the plasmalogen levels tested did not correlate with ABCD1 mutation status. Conclusion Normal ABCD1 gene function is not required for reprogramming skin fibroblasts into iPSCs or maintaining pluripotency. Relative to DEGs found in fibroblasts, DEGs uncovered in comparisons of CCALD patient and control iPSCs are more consistent with major hypotheses regarding disease pathogenesis. These DEGs were independent of differences in sVLCFA levels, which did not vary according to ABCD1 mutation status. The highlighted genes provide new leads for pathogenic mechanisms that can be explored in animal models and human tissue specimens. We suggest that these iPSC resources will have applications that include assisting efforts to identify genetic and environmental modifiers and screening for therapeutic interventions tailored towards affected cell populations and patient genotypes. Introduction X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a complex disorder with variable expressivity that affects the nervous, adrenocortical and male reproductive systems. Although ABCD1 mutations are known to provide the genetic basis for X-ALD, its pathogenesis is not fully elucidated. While elevated very long chain fatty acid (VLCFA) levels in blood and reduced VLCFA catabolic activity in cultured fibroblasts are biomarkers used to identify ABCD1 mutation carriers, the roles peroxisomal lipid metabolism play in disease etiology are unknown. Methods Primary skin fibroblasts from two male patients with the childhood cerebral form of the disease (CCALD) caused by ABCD1 frameshift or missense mutations and three healthy donors were transduced with retroviral vectors expressing the OCT4, SOX2, KLF4 and c- MYC factors. Candidate induced pluripotent stem cells (iPSCs) were subject to global gene expression, DNA methylation, DNA copy number variation, and genotyping analysis and tested for pluripotency through in vitro differentiation and teratoma formation. Saturated VLCFA (sVLCFA) and plasmalogen levels in primary fibroblasts and iPSCs from healthy donors as well as CCALD patients were determined through mass spectroscopy. Results Skin fibroblasts from CCALD patients and healthy donors were reprogrammed into validated iPSCs. Unlike fibroblasts, CCALD patient iPSCs show differentially expressed genes (DEGs) relevant to both peroxisome abundance and neuroinflammation. Also, in contrast to fibroblasts, iPSCs from patients showed no significant difference in sVLCFA levels relative to those from controls. In all cell types, the plasmalogen levels tested did not correlate with ABCD1 mutation status. Conclusion Normal ABCD1 gene function is not required for reprogramming skin fibroblasts into iPSCs or maintaining pluripotency. Relative to DEGs found in fibroblasts, DEGs uncovered in comparisons of CCALD patient and control iPSCs are more consistent with major hypotheses regarding disease pathogenesis. These DEGs were independent of differences in sVLCFA levels, which did not vary according to ABCD1 mutation status. The highlighted genes provide new leads for pathogenic mechanisms that can be explored in animal models and human tissue specimens. We suggest that these iPSC resources will have applications that include assisting efforts to identify genetic and environmental modifiers and screening for therapeutic interventions tailored towards affected cell populations and patient genotypes. Introduction X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a complex disorder caused by mutations in the ABCD1 gene that encodes an integral peroxisome membrane protein belonging to the ATP-binding cassette transporter superfamily [ 1 - 4 ]. X-ALD primarily affects the nervous system, adrenal cortex and testes with highly variable clinical presentations that are influenced by modifier genes and the environment [ 2 , 3 ]. Males with ABCD1 mutations develop childhood cerebral ALD (CCALD) about 33% of the time and adult onset adrenomyeloneuropathy (AMN) about 45% of the time [ 2 , 3 ]. CCALD patients typically show symptoms between five and nine years of age with rapid cerebral demyelination and adrenocortical atrophy. Within a few years of onset, they suffer dementia and progressive neurological deficits that eventually lead to death. In contrast, AMN patients show a later onset of disease (20 to 40 years of age) and present with adrenal insufficiency, a distal axonopathy in the spinal cord and peripheral neuropathy that results in progressive spastic paraparesis with debilitating end stage disease [ 2 , 3 ]. Approximately 10% of hemizygotes develop primary adrenocortical insufficiency (Addison's disease) with no evidence of nervous system dysfunction [ 2 , 3 ]. Disease prognosis is challenging since mutations do not correlate with clinical phenotypes [ 5 ] and male siblings with the same ABCD1 mutation, including monozygotic male twins [ 6 , 7 ], can have dramatically different clinical presentations [ 8 ]. Although hemizygotes typically show the most severe clinical manifestations of disease, about half of female ABCD1 mutation carriers develop AMN-like symptoms later in life [ 2 , 3 ]. The molecular mechanisms underlying the inflammatory brain demyelination found in CCALD patients are not fully understood. It has been hypothesized to be related to the accumulation of saturated very long chain fatty acids (sVLCFAs) in specific central nervous system (CNS) cell types (for example, oligodendrocytes and microglial cells) and/or lipid classes (for example, ganglioside, phosphatidylcholine and cholesterol ester fractions) [ 9 - 11 ]. Other hypotheses have focused on the roles of oxidative stress [ 12 - 16 ], myelin sheath integrity [ 17 ], oligodendrocyte apoptosis and microglial cell activation [ 1 , 2 ], and CNS cell membrane receptors [ 18 ]. Here, we report the generation and genomic characterization of CCALD patient-specific induced pluripotent stem cell (iPSC) model systems that can provide a platform to investigate cell autonomous processes relevant to X-ALD pathogenesis. The gene expression and biochemical profiles of these patient-specific iPSCs provide a novel perspective that supports the leading hypotheses regarding disease pathogenesis. Furthermore, our resources provide a first step required for the development and interpretation of patient-specific model systems that investigate genetic modifiers, environmental risk factors and non-cell autonomous processes relevant to the etiology of X-ALD. Materials and methods Cell culture conditions Primary dermal fibroblast cultures from CCALD patients and controls were obtained from the Peroxisomal Disease Laboratory at the Kennedy Krieger Institute and Coriell Institute Cell Repositories, respectively. All cells described herein were cultured at 37°C with 5% CO 2 . Human primary dermal fibroblasts and mitomycin inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were cultured in fibroblast media (DMEM supplemented with 10% FBS, L-glutamine, penicillin/streptomycin, vitamin solution, and essential and nonessential amino acids (Life technologies, Foster City, CA, USA)), as previously described [ 19 ]. iPSCs were cultured on a layer of mitomycin C-inactivated MEF feeder cells in iPSC medium (DMEM:F12 medium supplemented with 20% KSR, L-glutamine, penicillin/streptomycin, nonessential amino acids, β-mecaptoethanol and bFGF (Life technologies, Foster City, CA, USA)) [ 20 , 21 ]. Cell reprogramming Five different pMX retroviral vectors designed to deliver green fluorescent protein (GFP) and human OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC cDNA sequences were obtained from Addgene (Cambridge, MA, USA) [ 20 , 21 ]. Primary human fibroblasts were twice transduced with a mixture of all five retroviruses as described [ 20 , 21 ]. Transduction efficiency was evaluated by GFP expression. After four days, cells were re-plated onto MEF feeders and cultured in hESC medium containing 1 mM valproic acid [ 22 ]. By four weeks, candidate iPSC colonies were manually picked and clonally expanded [ 20 , 21 ]. A full list of the analyses conducted on each of the candidate iPSCs is described below and provided in Additional file 1 . Protein pluripotency biomarker analysis Alkaline phosphatase staining was performed using the leukocyte alkaline phosphatase kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). For immunostaining, cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 20 minutes, permeabilized with 1% Triton X-100 for 5 minutes except for surface marker staining, and blocked in 1% BSA in 1 × PBS for 1 hour at room temperature. Primary antibody staining was performed at 4°C overnight with antibodies against OCT4 and NANOG (goat polyclonal IgG against human, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), SOX2 (goat polyclonal IgG against mouse, rat and human) and SSEA4 (mouse monoclonal IgG 3 against human, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), TRA-1-60 (mouse monoclonal IgM against human, Millipore, Billerica, MA, USA), TuJ1 (rabbit monoclonal IgG 1 against mammalian, Covance Research Products, Princeton, NJ, USA), α-SMA (mouse monoclonal IgG 2a against human, mouse and so on, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), and AFP (mouse monoclonal IgG 2a against human, pig and canine, Life technologies, Foster City, CA, USA). Secondary antibody staining was performed at room temperature for one hour with appropriate fluorescence conjugated secondary antibodies from Life technologies, Foster City, CA, USA and Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA. Nuclei were visualized by staining with 100 ng/ml DAPI (Life technologies, Foster City, CA, USA). Gene expression profiling Total RNA samples (100 ng per sample) were converted into biotin-labeled cRNA targets (Affymetrix GeneChip ® IVT Labeling Kit, Santa Clara, CA, USA), processed and analyzed on Affymetrix Human Genome 133A 2.0 or 133 Plus 2.0 GeneChips, as previously described [ 19 ]. Using WebArray software (San Diego, CA, USA), we applied the RMA algorithm to generate log2-transformed gene expression values and linear model statistical analysis (limma) to identify differentially expressed genes (DEGs) with false discovery rates (FDRs) calculated using the spacings LOESS histogram (SPLOSH) method [ 23 , 24 ] (Additional file 2 ). We performed hierarchical clustering analysis using Partek Genomics Suite software (St. Louis, MO, USA). We conducted GeneOntology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analyses using WebGestalt software (Nashville, TN, USA) [ 25 - 27 ]. We used the DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) v6.7 bioinformatics resource [ 28 ] for the annotation of gene functions. Scaled gene expression scores and .cel files are available at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) repository under Series Accession Number GSE34308. DNA methylation profiling Genomic DNA was extracted from cultured cells as described [ 29 , 30 ] and analyzed on 450 K Infinium Methylation BeadChips (Illumina, San Diego, CA, USA), which interrogate the methylation status of over 485,000 CpG sites distributed across the human genome. The resulting data were analyzed using GenomeStudio software (that is, unmethylated to fully methylated) for each locus (Additional file 3 ). Bisulfite DNA sequencing was conducted as previously described [ 29 , 30 ]. Genotyping and copy number analysis Genomic DNA from cultured cells was also analyzed using Human CytoSNP-12 Infinium HD BeadChips (Illumina) that interrogate the genotypes of 299,140 human single nucleotide polymorphisms (SNPs). Data filtering and analysis were performed in GenomeStudio (Illumina). Copy number analysis was performed using CNVPartition version 2.4.4 with a confidence threshold set at 50 and a minimum of 10 SNP probes per CNV region, as previously described [ 31 ]. In multiple samples, we performed the global genotyping analysis two independent times and only assigned a copy number change (CNC) if both analyses were in agreement (Additional file 4 ). Dideoxysequencing of ABCD1 exons 1, 8 and 9 was performed as previously described [ 32 , 33 ]. In vitro differentiation and teratoma assays iPSCs were detached from culture dishes with collagenase IV, maintained in suspension to induce embryoid body (EB) formation and subjected to an in vitro differentiation procedure, as described [ 34 , 35 ]. For teratoma analysis, iPSCs from a confluent 10 cm 2 plate were harvested and subcutaneously injected to the dorsal flanks of immunodeficient (SCID) mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA), as described [ 34 ]. Nine weeks after injection, teratomas were excised, fixed in 10% formalin, sectioned and stained with hematoxylin and eosin. Lipid analysis We used liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to measure C26:0-lysophosphorylcholine and phosphatidylethanolamine (PE) plasmalogen levels in cell lysates processed by methanol extraction as described in reference [ 36 ]. Herein, C26:0-lysophosphorylcholine measurements were used to evaluate VLCFA levels. The tetradeuterated analog of 1-O-hexadecyl-2-lysn-sn-3 phosphorylcholine was used to quantify PE plasmalogens. PE plasmalogens were identified based on the fragmentation patterns reported in reference [ 37 ]. Cell culture conditions Primary dermal fibroblast cultures from CCALD patients and controls were obtained from the Peroxisomal Disease Laboratory at the Kennedy Krieger Institute and Coriell Institute Cell Repositories, respectively. All cells described herein were cultured at 37°C with 5% CO 2 . Human primary dermal fibroblasts and mitomycin inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were cultured in fibroblast media (DMEM supplemented with 10% FBS, L-glutamine, penicillin/streptomycin, vitamin solution, and essential and nonessential amino acids (Life technologies, Foster City, CA, USA)), as previously described [ 19 ]. iPSCs were cultured on a layer of mitomycin C-inactivated MEF feeder cells in iPSC medium (DMEM:F12 medium supplemented with 20% KSR, L-glutamine, penicillin/streptomycin, nonessential amino acids, β-mecaptoethanol and bFGF (Life technologies, Foster City, CA, USA)) [ 20 , 21 ]. Cell reprogramming Five different pMX retroviral vectors designed to deliver green fluorescent protein (GFP) and human OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC cDNA sequences were obtained from Addgene (Cambridge, MA, USA) [ 20 , 21 ]. Primary human fibroblasts were twice transduced with a mixture of all five retroviruses as described [ 20 , 21 ]. Transduction efficiency was evaluated by GFP expression. After four days, cells were re-plated onto MEF feeders and cultured in hESC medium containing 1 mM valproic acid [ 22 ]. By four weeks, candidate iPSC colonies were manually picked and clonally expanded [ 20 , 21 ]. A full list of the analyses conducted on each of the candidate iPSCs is described below and provided in Additional file 1 . Protein pluripotency biomarker analysis Alkaline phosphatase staining was performed using the leukocyte alkaline phosphatase kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). For immunostaining, cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 20 minutes, permeabilized with 1% Triton X-100 for 5 minutes except for surface marker staining, and blocked in 1% BSA in 1 × PBS for 1 hour at room temperature. Primary antibody staining was performed at 4°C overnight with antibodies against OCT4 and NANOG (goat polyclonal IgG against human, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), SOX2 (goat polyclonal IgG against mouse, rat and human) and SSEA4 (mouse monoclonal IgG 3 against human, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), TRA-1-60 (mouse monoclonal IgM against human, Millipore, Billerica, MA, USA), TuJ1 (rabbit monoclonal IgG 1 against mammalian, Covance Research Products, Princeton, NJ, USA), α-SMA (mouse monoclonal IgG 2a against human, mouse and so on, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), and AFP (mouse monoclonal IgG 2a against human, pig and canine, Life technologies, Foster City, CA, USA). Secondary antibody staining was performed at room temperature for one hour with appropriate fluorescence conjugated secondary antibodies from Life technologies, Foster City, CA, USA and Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA. Nuclei were visualized by staining with 100 ng/ml DAPI (Life technologies, Foster City, CA, USA). Gene expression profiling Total RNA samples (100 ng per sample) were converted into biotin-labeled cRNA targets (Affymetrix GeneChip ® IVT Labeling Kit, Santa Clara, CA, USA), processed and analyzed on Affymetrix Human Genome 133A 2.0 or 133 Plus 2.0 GeneChips, as previously described [ 19 ]. Using WebArray software (San Diego, CA, USA), we applied the RMA algorithm to generate log2-transformed gene expression values and linear model statistical analysis (limma) to identify differentially expressed genes (DEGs) with false discovery rates (FDRs) calculated using the spacings LOESS histogram (SPLOSH) method [ 23 , 24 ] (Additional file 2 ). We performed hierarchical clustering analysis using Partek Genomics Suite software (St. Louis, MO, USA). We conducted GeneOntology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analyses using WebGestalt software (Nashville, TN, USA) [ 25 - 27 ]. We used the DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) v6.7 bioinformatics resource [ 28 ] for the annotation of gene functions. Scaled gene expression scores and .cel files are available at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) repository under Series Accession Number GSE34308. DNA methylation profiling Genomic DNA was extracted from cultured cells as described [ 29 , 30 ] and analyzed on 450 K Infinium Methylation BeadChips (Illumina, San Diego, CA, USA), which interrogate the methylation status of over 485,000 CpG sites distributed across the human genome. The resulting data were analyzed using GenomeStudio software (that is, unmethylated to fully methylated) for each locus (Additional file 3 ). Bisulfite DNA sequencing was conducted as previously described [ 29 , 30 ]. Genotyping and copy number analysis Genomic DNA from cultured cells was also analyzed using Human CytoSNP-12 Infinium HD BeadChips (Illumina) that interrogate the genotypes of 299,140 human single nucleotide polymorphisms (SNPs). Data filtering and analysis were performed in GenomeStudio (Illumina). Copy number analysis was performed using CNVPartition version 2.4.4 with a confidence threshold set at 50 and a minimum of 10 SNP probes per CNV region, as previously described [ 31 ]. In multiple samples, we performed the global genotyping analysis two independent times and only assigned a copy number change (CNC) if both analyses were in agreement (Additional file 4 ). Dideoxysequencing of ABCD1 exons 1, 8 and 9 was performed as previously described [ 32 , 33 ]. In vitro differentiation and teratoma assays iPSCs were detached from culture dishes with collagenase IV, maintained in suspension to induce embryoid body (EB) formation and subjected to an in vitro differentiation procedure, as described [ 34 , 35 ]. For teratoma analysis, iPSCs from a confluent 10 cm 2 plate were harvested and subcutaneously injected to the dorsal flanks of immunodeficient (SCID) mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA), as described [ 34 ]. Nine weeks after injection, teratomas were excised, fixed in 10% formalin, sectioned and stained with hematoxylin and eosin. Lipid analysis We used liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to measure C26:0-lysophosphorylcholine and phosphatidylethanolamine (PE) plasmalogen levels in cell lysates processed by methanol extraction as described in reference [ 36 ]. Herein, C26:0-lysophosphorylcholine measurements were used to evaluate VLCFA levels. The tetradeuterated analog of 1-O-hexadecyl-2-lysn-sn-3 phosphorylcholine was used to quantify PE plasmalogens. PE plasmalogens were identified based on the fragmentation patterns reported in reference [ 37 ]. Results Derivation of candidate iPSCs from CCALD patient fibroblasts Primary skin fibroblast cultures from three healthy donors and two CCALD patients (Table 1 ) were infected with retroviruses designed to express the human OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC genes (Methods). We observed iPSC-like colonies for two weeks and clonally expanded TRA-1-60 positive colonies for four weeks, consistent with prior reports of reprogramming skin fibroblasts from healthy human donors [ 38 ]. All candidate iPSC colonies maintained the expected morphological features and expressed protein biomarkers of pluripotency (Figure 1A , Additional file 1 ). Table 1 Skin fibroblast and iPS cell donor information Fibroblast ID Prior ID Status iPS cell ID# Genotype Control1 AG05838 Healthy female, age 36 yr, passage 6 for reprogramming Control1-iPS1 Control1-iPS2 Control1-iPS3 Control 1-iPS4 Presumed wild type Control2 AG09599 Healthy female, age 30 yr, passage 8.5 for reprogramming Control2-iPS1 Control2-iPS2 Control2-iPS3 Control2-iPS4 Presumed wild type Control3 AG13153 Healthy male, age 30 yr, passage 9.5 for reprogramming Control2-iPS1 Presumed wild type CCALD1 216212 Male CCALD patient Age 9 yr, passage 8 for reprogramming CCALD1-iPS1 CCALD1-iPS2 CCALD1-iPS3 CCALD1-iPS4 hemizygous ABCD1 c. 253_254insC; p.P84 CCALD2 306463 Male CCALD patient Age 11 yr, passage 8 for reprogramming CCALD2-iPS1 hemizygous ABCD1 c.1847C > T; p.A616V Figure 1 Characterization of iPSCs from patient with CCALD . (A) Representative images of alkaline phosphatase (AP) staining and pluripotency protein biomarker immunostaining analysis of childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient induced pluripotent stem cell (iPSCs) are presented. (B) Representative CCALD iPSCs were subject to in vitro differentiation (Materials and methods) and cell lineages derived from all three germ layers were identified by immunostaining, as depicted. Antibodies against Tuj1, αSMA and AFP were used to identify cells of ectodermal, mesodermal, and endodermal origin, respectively. (C) Histological analysis of teratomas derived from representative CCALD iPSC clones from two patients is provided. Evidence of cell lineages derived from all three germ layers is provided. C, Cartilage tissue; G, Glandular tissue; N, Neural rosettes; P, pigment neuroepithelium. Scale bar = 50 μm. Genotypes and DNA copy number profiles of iPSCs We confirmed that the patient iPSCs had the expected mutant ABCD1 genotypes and that control iPSCs lacked these specific ABCD1 mutations by dideoxysequencing. As determined by BeadArray analysis, the genotypes of over 290,000 SNPs in iPSCs and original fibroblasts were > 99.9% concordant. Based on the same genotyping data, we did not detect copy number changes (CNCs, that is, insertions or deletions greater than 10-kb in length) in patient CCALD1-1, CCALD1-2 and CCALD2-1 iPSCs or Control1-3, Control1-4 and Control2-1 iPSCs (Additional file 4 ). Consistent with prior reports of reprogrammed human cells [ 39 - 41 ], we detected CNCs in 8/14 (57%) iPSCs analyzed (Additional file 4 ). These iPSCs had one (CCALD1-3, CCALD1-4 and Control2-3), two (Control1-2 and Control3-1), three (Control2-2 and Control2-4) or five (Control1-1) separate genomic regions affected by a CNC (Additional file 4 ). Gene expression profiles of CCALD and control donor cells We validated the robust expression of previously reported iPSC signature genes in control and CCALD donor-derived iPSCs and skin fibroblasts [ 38 ] based on a subset of the data generated from global expression profiling of over 18,000 transcripts (Figure 2A ). Unsupervised hierarchical clustering analysis based on the expression of preselected pluripotency biomarkers or the most variable transcripts (that is, coefficient of variation (CV) > 0.10 across all samples)) produced two distinct clusters consisting of skin fibroblasts and the iPSCs (Figure 1 and Additional file 5 ). Figure 2 The gene expression and DNA methylation profiles of fibroblasts and iPSCs . (A) A dendrogram generated based on the unsupervised hierarchical clustering analysis of gene expression data from childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and control fibroblasts and induced pluripotent stem cells (iPSCs) is provided. The analysis was based on data from 672 probe sets producing log2-tranformed gene expression scores with coefficient of variation (CV) > 0.25 and conducted using average linkage and Euclidean distance; (B) A dendrogram generated based on the unsupervised hierarchical clustering analysis of DNA methylation data from CCALD patient and control fibroblasts and iPSCs is provided. Data from 7,493 DNA methylation assays interrogating autosomal CpG loci with CV > 0.5 and the fifth largest and smallest β-values being > 0.6 and 1.2-fold change, FDR 47,000 transcripts) using cultured skin fibroblasts from five healthy control donors and five CCALD patients. In these studies, we identified 127 DEGs (44 with lower and 83 with higher expression in patient relative to control fibroblasts) (Additional File 6 ). Based on GeneOntology (GO) analysis, we found a total of 13 functional categories enriched (≥ 4 genes, B-H corrected P 0.8) in all samples in the remaining group (fibroblasts and iPSCs). We identified 266 distinct genes proximal to at least one DML with approximately half of them (49%) being poorly expressed ( 1.5-fold change, FDR 60 th percentile in the hypomethylated state). In contrast, we only found five robust DMLs in comparisons of two patient and three control fibroblasts and one robust DML in comparisons of five patient and nine control iPSCs (Additional file 13 ). The DML present in the iPSC analysis was also present in the fibroblast analysis, with higher methylation being found in all CCALD patients relative to control donor cells regardless of ABCD1 mutation status. This shared DML was proximal to the PRDM15 gene, whose expression was not interrogated in our global GeneChip gene expression assays. The remaining four DMLs in fibroblasts were proximal to the PAX3, CCDC140, UTRN and BAIAP2 genes. All three of the genes interrogated by our GeneChip expression assays ( PAX3, UTRN and BAIAP ) were poorly expressed in all fibroblasts regardless of ABCD1 mutation status. Local gene expression is not substantially affected by CNCs found in iPSCs To begin to address the influence that CNCs present in iPSC have on their transcriptome, we focused on the expression profiles of genes residing in the affected genomic regions. A total of 11 amplified segments containing 22 unique genes were found in 8 iPSCs. Only six of these unique genes showed elevated expression in the amplified relative to the diploid samples (that is, a > 1.2-fold increase relative to the mean expression scores of diploid samples and falling outside their range). This included the ID1 gene in CCALD1-3, WWC1 gene in CCALD1-4, and IQCA1, CXCR7, SQLE and KIAA0196 genes in Control1-1. Three iPSCs (Control2-2, Control2-4 and Control3-1) showed evidence of having at least one genomic deletion, with evidence in each case that one allele was retained. Collectively, five unique genes were present in the four deleted genomic regions in these iPSCs. There was no evidence of reduced expression in the samples with reduced copy number (that is, > 1.2-fold decrease relative to the mean expression scores of diploid samples and falling outside their range). Amplified or deleted segments show no differences in DNA methylation status A total of 745 DNA methylation assays interrogated loci located within amplified regions present in control or patient iPSCs. In all cases, the DNA methylation status of such genomic regions was similar regardless of whether it was in the diploid or amplified state. In fact, we observed no evidence of a block of DNA methylation change associated with a CNC (that is, three or more contiguous assays wherein the β-value of the amplified segment was greater than 0.2 units outside the range of the diploid samples). Next, we accessed the methylation status of genomic regions subject to a loss of copy number in iPSCs. A total of 79 DNA methylation assays interrogate loci with the genomic regions of heterozygous deletion. The affected samples included Control2-iPS2 (chr13:q14.2), Control2-iPS4 (chr2:q33.3) and Control3-iPS1 (chr3:p14.2 and chr5:p15.2). Again, we observed no evidence of a block of DNA methylation change associated with a CNC (that is, three or more contiguous assays wherein the β-value of the deleted segment fell more than 0.2 units outside the range of the diploid samples). Derivation of candidate iPSCs from CCALD patient fibroblasts Primary skin fibroblast cultures from three healthy donors and two CCALD patients (Table 1 ) were infected with retroviruses designed to express the human OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC genes (Methods). We observed iPSC-like colonies for two weeks and clonally expanded TRA-1-60 positive colonies for four weeks, consistent with prior reports of reprogramming skin fibroblasts from healthy human donors [ 38 ]. All candidate iPSC colonies maintained the expected morphological features and expressed protein biomarkers of pluripotency (Figure 1A , Additional file 1 ). Table 1 Skin fibroblast and iPS cell donor information Fibroblast ID Prior ID Status iPS cell ID# Genotype Control1 AG05838 Healthy female, age 36 yr, passage 6 for reprogramming Control1-iPS1 Control1-iPS2 Control1-iPS3 Control 1-iPS4 Presumed wild type Control2 AG09599 Healthy female, age 30 yr, passage 8.5 for reprogramming Control2-iPS1 Control2-iPS2 Control2-iPS3 Control2-iPS4 Presumed wild type Control3 AG13153 Healthy male, age 30 yr, passage 9.5 for reprogramming Control2-iPS1 Presumed wild type CCALD1 216212 Male CCALD patient Age 9 yr, passage 8 for reprogramming CCALD1-iPS1 CCALD1-iPS2 CCALD1-iPS3 CCALD1-iPS4 hemizygous ABCD1 c. 253_254insC; p.P84 CCALD2 306463 Male CCALD patient Age 11 yr, passage 8 for reprogramming CCALD2-iPS1 hemizygous ABCD1 c.1847C > T; p.A616V Figure 1 Characterization of iPSCs from patient with CCALD . (A) Representative images of alkaline phosphatase (AP) staining and pluripotency protein biomarker immunostaining analysis of childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient induced pluripotent stem cell (iPSCs) are presented. (B) Representative CCALD iPSCs were subject to in vitro differentiation (Materials and methods) and cell lineages derived from all three germ layers were identified by immunostaining, as depicted. Antibodies against Tuj1, αSMA and AFP were used to identify cells of ectodermal, mesodermal, and endodermal origin, respectively. (C) Histological analysis of teratomas derived from representative CCALD iPSC clones from two patients is provided. Evidence of cell lineages derived from all three germ layers is provided. C, Cartilage tissue; G, Glandular tissue; N, Neural rosettes; P, pigment neuroepithelium. Scale bar = 50 μm. Genotypes and DNA copy number profiles of iPSCs We confirmed that the patient iPSCs had the expected mutant ABCD1 genotypes and that control iPSCs lacked these specific ABCD1 mutations by dideoxysequencing. As determined by BeadArray analysis, the genotypes of over 290,000 SNPs in iPSCs and original fibroblasts were > 99.9% concordant. Based on the same genotyping data, we did not detect copy number changes (CNCs, that is, insertions or deletions greater than 10-kb in length) in patient CCALD1-1, CCALD1-2 and CCALD2-1 iPSCs or Control1-3, Control1-4 and Control2-1 iPSCs (Additional file 4 ). Consistent with prior reports of reprogrammed human cells [ 39 - 41 ], we detected CNCs in 8/14 (57%) iPSCs analyzed (Additional file 4 ). These iPSCs had one (CCALD1-3, CCALD1-4 and Control2-3), two (Control1-2 and Control3-1), three (Control2-2 and Control2-4) or five (Control1-1) separate genomic regions affected by a CNC (Additional file 4 ). Gene expression profiles of CCALD and control donor cells We validated the robust expression of previously reported iPSC signature genes in control and CCALD donor-derived iPSCs and skin fibroblasts [ 38 ] based on a subset of the data generated from global expression profiling of over 18,000 transcripts (Figure 2A ). Unsupervised hierarchical clustering analysis based on the expression of preselected pluripotency biomarkers or the most variable transcripts (that is, coefficient of variation (CV) > 0.10 across all samples)) produced two distinct clusters consisting of skin fibroblasts and the iPSCs (Figure 1 and Additional file 5 ). Figure 2 The gene expression and DNA methylation profiles of fibroblasts and iPSCs . (A) A dendrogram generated based on the unsupervised hierarchical clustering analysis of gene expression data from childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and control fibroblasts and induced pluripotent stem cells (iPSCs) is provided. The analysis was based on data from 672 probe sets producing log2-tranformed gene expression scores with coefficient of variation (CV) > 0.25 and conducted using average linkage and Euclidean distance; (B) A dendrogram generated based on the unsupervised hierarchical clustering analysis of DNA methylation data from CCALD patient and control fibroblasts and iPSCs is provided. Data from 7,493 DNA methylation assays interrogating autosomal CpG loci with CV > 0.5 and the fifth largest and smallest β-values being > 0.6 and 1.2-fold change, FDR 47,000 transcripts) using cultured skin fibroblasts from five healthy control donors and five CCALD patients. In these studies, we identified 127 DEGs (44 with lower and 83 with higher expression in patient relative to control fibroblasts) (Additional File 6 ). Based on GeneOntology (GO) analysis, we found a total of 13 functional categories enriched (≥ 4 genes, B-H corrected P 0.8) in all samples in the remaining group (fibroblasts and iPSCs). We identified 266 distinct genes proximal to at least one DML with approximately half of them (49%) being poorly expressed ( 1.5-fold change, FDR 60 th percentile in the hypomethylated state). In contrast, we only found five robust DMLs in comparisons of two patient and three control fibroblasts and one robust DML in comparisons of five patient and nine control iPSCs (Additional file 13 ). The DML present in the iPSC analysis was also present in the fibroblast analysis, with higher methylation being found in all CCALD patients relative to control donor cells regardless of ABCD1 mutation status. This shared DML was proximal to the PRDM15 gene, whose expression was not interrogated in our global GeneChip gene expression assays. The remaining four DMLs in fibroblasts were proximal to the PAX3, CCDC140, UTRN and BAIAP2 genes. All three of the genes interrogated by our GeneChip expression assays ( PAX3, UTRN and BAIAP ) were poorly expressed in all fibroblasts regardless of ABCD1 mutation status. Local gene expression is not substantially affected by CNCs found in iPSCs To begin to address the influence that CNCs present in iPSC have on their transcriptome, we focused on the expression profiles of genes residing in the affected genomic regions. A total of 11 amplified segments containing 22 unique genes were found in 8 iPSCs. Only six of these unique genes showed elevated expression in the amplified relative to the diploid samples (that is, a > 1.2-fold increase relative to the mean expression scores of diploid samples and falling outside their range). This included the ID1 gene in CCALD1-3, WWC1 gene in CCALD1-4, and IQCA1, CXCR7, SQLE and KIAA0196 genes in Control1-1. Three iPSCs (Control2-2, Control2-4 and Control3-1) showed evidence of having at least one genomic deletion, with evidence in each case that one allele was retained. Collectively, five unique genes were present in the four deleted genomic regions in these iPSCs. There was no evidence of reduced expression in the samples with reduced copy number (that is, > 1.2-fold decrease relative to the mean expression scores of diploid samples and falling outside their range). Amplified or deleted segments show no differences in DNA methylation status A total of 745 DNA methylation assays interrogated loci located within amplified regions present in control or patient iPSCs. In all cases, the DNA methylation status of such genomic regions was similar regardless of whether it was in the diploid or amplified state. In fact, we observed no evidence of a block of DNA methylation change associated with a CNC (that is, three or more contiguous assays wherein the β-value of the amplified segment was greater than 0.2 units outside the range of the diploid samples). Next, we accessed the methylation status of genomic regions subject to a loss of copy number in iPSCs. A total of 79 DNA methylation assays interrogate loci with the genomic regions of heterozygous deletion. The affected samples included Control2-iPS2 (chr13:q14.2), Control2-iPS4 (chr2:q33.3) and Control3-iPS1 (chr3:p14.2 and chr5:p15.2). Again, we observed no evidence of a block of DNA methylation change associated with a CNC (that is, three or more contiguous assays wherein the β-value of the deleted segment fell more than 0.2 units outside the range of the diploid samples). Discussion X-ALD is a complex peroxisomal disorder with variable expressivity. Although its primary genetic basis has been known for some time [ 1 - 4 ], the exact nature of X-ALD pathogenesis and its genetic and environmental modifiers have not been elucidated. Here, we generated iPSC resources for the longer-term purpose of developing novel tissue culture models for elucidating the pathogenesis of X-ALD and screening for more effective drug therapies. In keeping with prior reports [ 63 ], skin fibroblasts from ABCD1 mutation carriers can be reprogrammed to form iPSCs with the hallmark molecular properties of pluripotency, including the expression of appropriate gene and protein biomarkers and changes in DNA methylation levels, as summarized in Additional file 1 . Patient iPSCs could be differentiated into embryoid bodies and differentiated in vitro into representative cell types of all three germ layers. Most importantly, patient iPSCs formed teratomas with evidence of cell types from all three germ layers. Consistent with prior reports [ 64 - 66 ], we identified de novo CNCs over 10-kb in length in approximately half of our iPSCs. These CNCs were only found in healthy donor iPSCs and not those generated from patient cells (Additional file 4 ). The observed genomic deletions always provided evidence of affecting only one allele and genomic amplifications always involved a limited increase in copy number (three to four copies maximum). Due to the fact that we conducted global expression and DNA methylation analyses on these samples, we could investigate the effects that these CNCs have on the expression of genes located within affected genomic segments. In almost all circumstances, their expression levels were within the range of diploid samples. Although multiple factors likely contribute to these observations, we favor the explanation that this primarily reflects the effects of selection whereby CNCs are only tolerated in iPSCs if they involve genomic regions that do not influence the initiation of reprogramming or maintenance of pluripotency. As a result of our genomic characterization of these cell resources, we acquired global gene expression data from patient and control fibroblasts. Many DEGs were previously reported to be associated with the site of biopsy [ 45 ]. This is reasonable given that the patient and control fibroblasts were acquired from different institutions even though all biopsies involved the upper limbs of donors. We sought to determine if there was enrichment for functional categories or biological processes in the DEGs, keeping in mind the limitations of using cultured cells to study complex diseases involving interactions between multiple organ systems. Only very broad functional categories or KEGG pathways were highlighted in these analyses, with none of them showing a direct relation to disease. Since there are likely to be gaps in public databases of processes relevant to peroxisome biology and X-ALD pathogenesis, we conducted a manual inspection of gene annotations provided by the DAVID bioinformatics resource and found multiple DEGs involved in immune related processes, but only two ( CBLB and RAB27A ) of these genes were not associated with the site of biopsy. CBLB plays a critical role in antigen-induced immune tolerance and Cblb -deficient mice immunized with myelin basic protein are more susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a model for multiple sclerosis [ 67 , 68 ]. RAB27A mutations can lead to an uncontrolled T lymphocyte and macrophage activation syndrome in humans, with some individuals showing possible leukocyte brain infiltration [ 69 ]. In one Saudi Arabian kindred, RAB27 mutations were associated with immunodeficiency and progressive demyelination of brain white matter [ 70 ]. The DEGs found in patient and control iPSCs did not overlap with those found in fibroblasts and instead were consistent with several leading hypotheses regarding X-ALD pathogenesis. This suggests that the reprogramming process can minimize the confounding influence the site of skin biopsy has on the gene expression profiles of cultured fibroblasts. In particular, we highlight the reduced expression of PEX11B , a major controller of peroxisome proliferation and neuroinflammatory genes, in patient relative to control iPSCs. Pex11B null mice show several pathologic features, including neuronal migration defects, enhanced neuronal apoptosis, developmental delay, hypotonia and neonatal lethality [ 71 ]. Despite these severe phenotypes, Pex11B null mice displays only mild defects in peroxisomal fatty acid beta-oxidation and ether lipid biosynthesis [ 71 ]. Intriguingly, the deletion of a single Pex11B allele leads to a slightly increased number of peroxisomes, increased levels of oxidative stress in brain tissue, and neuronal cell death in mice [ 72 ]. In addition, the ULK1 , whose yeast homolog plays a critical role in the autophagy-mediated peroxisome turnover [ 50 ], showed higher expression in CCALD patient relative to control iPSCs. It is tempting to speculate that if nervous and immune system cells of ABCD1 mutation carriers indeed have aberrant PEX11B and ULK1 activity, this could lead to differences in peroxisome abundance and/or activity that increase reactive oxygen species (ROS) levels and promote X-ALD pathogenesis. It remains to be determined if ABCD1 mutation carriers have abnormal peroxisome abundance in their pertinent nervous and immune system cells and tissues. In a similar vein, the increased NAAA, THBS1, BSG ( aka CD147 aka EMMPRIN ) and NOTCH1 gene expression in patients relative to control iPSCs is supportive of hypotheses regarding a predisposition to neuroinflammation that is a prelude to devastating autoimmune responses. NAAA hydrolyzes palmitoylethanolamide (PEA), a naturally occurring lipid amide that, when administered as a drug, inhibits inflammatory responses [ 56 ]. In principle, increasing leukocyte NAAA levels could reduce PEA levels and promote inflammation. In fact, a chemical inhibitor of NAAA function attenuates inflammation and tissue damage and improves recovery of motor function in mice with spinal cord trauma [ 56 ]. Intriguingly, CD200 has been proposed to play a role in the immune privileged status of the CNS when CD200-mediated immune suppression occurs via neuron-microglial as well as glial-glial interactions in inflammatory conditions [ 73 ]. THBS1 is linked to neuroinflammatory processes involving astrocyte and microglia through its role in processing and activating the TGF-β ligand [ 74 ] and is also implicated in responses to oxidative stress [ 75 ]. Likewise, Notch1 is involved in microglial associated inflammation [ 76 ]. Also of relevance are emerging reports that BSG acts a master regulator of matrix metalloproteinases (MMP) implicated in most diseases involving neuroinflammation and thus has been proposed to play a role in the immune-privileged status of the CNS [ 77 ]. Although we highlight the possible implications of the gene expression profiles observed in patient iPSCs, we note alternative hypotheses regarding their origins and biological significance. While the iPSCs described in this study have the hallmark properties of pluripotency, their gene expression profiles could reflect subtle ABCD1 mutation status-dependent differences in their predisposition to differentiate into specific cell types and lineages. Comparisons of the gene expression profiles of mature cell types derived from patient- and healthy donor-derived iPSCs will be especially informative. The persistence or elimination of groups of DEGs reflective of biological processes and pathways could provide a means of assessing the tissue specificity of disease and enhance the ability to discern biologically informative gene expression signatures from noise resulting from confounding variables, such as tissue culture conditions. Although ABCD1 mutation carriers show elevated sVLCFA levels in their blood and urine and reduced sVLCFA catabolic activity in their cultured fibroblasts, the role of sVLCFA in disease pathogenesis is still under discussion. The significance of decreased plasmalogen levels in the patients' brain white matter also is unclear [ 44 , 78 ]. As expected, CCALD patient fibroblasts had elevated VLCFA levels, but similar PE plasmalogen levels, relative to those from healthy donors (Figure 3A, C ). Likewise, iPSCs from CCALD patient and healthy control donors also showed similar PE plasmalogen levels (Figure 3D ). The fact that all patient and control iPSCs tested had low VLCFA levels, based on C26:0-lysophosphorylcholine measurements, (Figure 3B ) is puzzling, yet consistent with prior reports [ 63 ]. VLCFA levels are determined by their rate of synthesis (that is, catalyzed by fatty acid elongating enzyme ELOVL1 [ 79 ]), degradation (affected by ABCD1 and ABCD2 function [ 80 ]) and uptake of these fatty acids from the culture medium. As such, one hypothesis is that the rate of VLCFA synthesis is lower in iPSCs relative to fibroblasts under the culture conditions evaluated. Consistent with this hypothesis and prior reports [ 63 ], the expression of the ELOVL1 gene was significantly lower (2.6-fold, FDR < 2.2 × 10 -9 ) in iPSCs relative to fibroblasts. Nevertheless, we note that ELOVL1 was not differentially expressed in patient relative to control fibroblasts or iPSCs. An alternate hypothesis that the ABCD2 gene is compensating for the impaired ABCD1 function in patient iPSCs; however, ABCD2 was not differentially expressed in patient relative to control fibroblasts or iPSCs. This does not preclude the possibilities that ABCD2 activity is being increased on the protein level or that another gene is playing a major role in significantly lowering VLCFA levels in CCALD iPSCs. We also note a prior hypothesis that the rapid growth rate of iPSCs could reduce their VLCFA levels, independent of their ABCD1 mutation status [ 63 ]. Fibroblasts have altered morphology and slowed growth in iPSC media relative to fibroblast media, which according to the growth rate hypothesis could contribute to their reduced VLCFA levels. Given that iPSCs can rapidly differentiate in fibroblast media, iPSC growth media provides an imperfect, but necessary, compromise in direct comparisons between cultured fibroblasts and iPSCs. We note the potential contribution of MEF feeder cells to iPSC lipid profiles and the advantages of using feeder-free media in future experiments. Future applications and directions The impending implementation of newborn screening for X-ALD based on blood lipid profiles will increase the demand for model systems to screen for more effective therapeutic interventions [ 36 , 81 ]. Early detection would provide physicians with a window of opportunity to treat presymptomatic patients prior to the development of CCALD, and may also prevent or delay AMN onset. Therapeutic interventions, such as Lorenzo's Oil, help prevent the onset of cerebral disease in some individuals, but are not effective for the majority of CCALD patients and, likewise, there are no effective options for AMN [ 75 - 77 ]. A compelling attribute of iPSC model systems is that they represent the exact ABCD1 mutations found in the patient population and thus provide an opportunity to test therapeutic agents tailored to a patient's genotype in cell populations most affected by disease. Examples of genotype-dependent therapeutic strategies include nonsense suppressor drugs [ 33 ] and molecular chaperones [ 82 ] for individuals with nonsense and missense mutations, respectively. The fact that CCALD iPSCs show gene expression profiles similar to those derived from healthy controls may reflect the fact that X-ALD clinical symptoms do not manifest at birth but, instead, occur in early childhood or later in life. Given that ABCD1 mutant mice show clinical aspects of X-ALD with increasing age [ 83 ], it is possible that later passage CCALD iPSCs and their derivatives may manifest gene expression profiles and/or functional properties more consistent with disease pathogenesis and progression. In this regard, a comparison of the properties of iPSCs and their derivatives previously obtained from other CCALD and AMN patients [ 63 ] as a function of in vitro passage number could be informative. Despite the promise of iPSC approaches, it will remain a significant challenge to generate and optimize in vitro model systems for X-ALD and other complex disorders that involve multiple organ systems as well as unknown gene-environment interactions and genetic modifiers. Future applications and directions The impending implementation of newborn screening for X-ALD based on blood lipid profiles will increase the demand for model systems to screen for more effective therapeutic interventions [ 36 , 81 ]. Early detection would provide physicians with a window of opportunity to treat presymptomatic patients prior to the development of CCALD, and may also prevent or delay AMN onset. Therapeutic interventions, such as Lorenzo's Oil, help prevent the onset of cerebral disease in some individuals, but are not effective for the majority of CCALD patients and, likewise, there are no effective options for AMN [ 75 - 77 ]. A compelling attribute of iPSC model systems is that they represent the exact ABCD1 mutations found in the patient population and thus provide an opportunity to test therapeutic agents tailored to a patient's genotype in cell populations most affected by disease. Examples of genotype-dependent therapeutic strategies include nonsense suppressor drugs [ 33 ] and molecular chaperones [ 82 ] for individuals with nonsense and missense mutations, respectively. The fact that CCALD iPSCs show gene expression profiles similar to those derived from healthy controls may reflect the fact that X-ALD clinical symptoms do not manifest at birth but, instead, occur in early childhood or later in life. Given that ABCD1 mutant mice show clinical aspects of X-ALD with increasing age [ 83 ], it is possible that later passage CCALD iPSCs and their derivatives may manifest gene expression profiles and/or functional properties more consistent with disease pathogenesis and progression. In this regard, a comparison of the properties of iPSCs and their derivatives previously obtained from other CCALD and AMN patients [ 63 ] as a function of in vitro passage number could be informative. Despite the promise of iPSC approaches, it will remain a significant challenge to generate and optimize in vitro model systems for X-ALD and other complex disorders that involve multiple organ systems as well as unknown gene-environment interactions and genetic modifiers. Conclusions We have reprogrammed skin fibroblasts from CCALD patients and control donor primary fibroblasts into iPSCs that show all the fundamental hallmark molecular and cellular properties of pluripotency. The DEGs found in comparisons of patient- and healthy donor-derived iPSCs are consistent with emerging hypotheses regarding the role of peroxisomes, oxidative stress and neuroinflammation in the pathogenesis of X-ALD. Given that the sVLFCA profiles of the patient iPSCs are similar to those of control iPSCs, these gene expression profiles are not dependent on the presence of the hallmark lipid biomarkers of disease. Additional gene expression and functional analyses involving differentiated cell types derived from CCALD and control iPSCs could be especially informative given our preliminary results. This would include cell types related to the CNS (for example, oligodendrocytes, astrocytes and microglia), adrenocortical and male reproductive (for example, Leydig and Sertoli cells) aspects of disease. Furthermore, investigations involving patient tissue samples and animal models are required in order to determine if the observed fibroblast and iPSC gene expression profiles are reflective of pathogenic mechanisms or are simply specific to our cultured cells. Abbreviations AMN: adrenomyeloneuropathy; CCALD: childhood cerebral adrenoleukodystrophy; CNC: copy number change; CNS: central nervous system; CV: coefficient of variation; DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole; DAVID: Database for Annotation: Visualization and Integrated Discovery; DEGs: differentially expressed genes; DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium; DML: differentially methylated loci; EAE: experimental autoimmune encephalomyelitis; EB: embryoid body; ES: embryonic stem; FBS: fetal bovine serum; FDRs: false discovery rates; GFP: green fluorescent protein; GO: GeneOntology; iPSC: induced pluripotent stem cell; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; LC-MS/MS: liquid chromatography-tandem mass spectrometry; LPC: lysophosphatidylcholine; MEFs: mouse embryonic fibroblasts; MMP: matrix metalloproteinases; NCBI: National Center for Biotechnology Information; PE: phosphatidylethanolamine; PEA: palmitoylethanolamide; ROS: reactive oxygen species; SNPs: single nucleotide polymorphisms; sVLCFA: saturated very long chain fatty acid(s); X-ALD: X-linked adrenoleukodystrophy. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors' contributions XMW and WYY derived the iPSCs from patient and healthy donor fibroblast cultures and conducted immunostaining analysis of protein pluripotency biomarkers. XMW conducted all the global gene expression, genetic and epigenetic analyses. PZ assisted XMW in the teratoma analysis and also provided technical advice in cellular reprogramming and maintaining iPSCs. WL provided technical advice in cellular reprogramming and maintaining iPSCs. DS supervised the histological analysis of teratomas and advised XMW in the data analysis. SJS carried out the biochemical analyses in this project. JGH and XMW were involved in the overall design and conception of the project, statistical analysis of all data sets and wrote the manuscript with the help of all the other authors. All authors read and approved the final manuscript. Acknowledgements We thank P. Watkins, G. Raymond, N. Braverman and R. Pelikan for thoughtful discussion and/or assistance in data analysis. We thank D. Weisenberger and D. Van Den Berg at the USC Epigenome Center for conducting the Illumina BeadArray DNA methylation and SNP genotyping assays and for advice in data analysis. This study was funded by the National Institutes of Health (GM072447 and GM072447-S1) and a California Institute of Regenerative Medicine Pre-doctoral Training Grant (WYY). Supplementary Material Additional file 1 Characterization of candidate induced pluripotent stem cells (iPSCs) . A complete listing of the protein, genetic, epigenetic, and cell differentiation assays performed on the iPSCs described in this study is provided. Click here for file Additional file 2 Log-transformed gene expression scores from childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and healthy donor control fibroblasts and induced pluripotent stem cells (iPSCs) . A complete list of log-transformed gene expression scores from CCALD patient and healthy donor control fibroblasts and iPSCs is provided. Click here for file Additional file 3 DNA methylation assay beta-values from childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and healthy donor control fibroblasts and induced pluripotent stem cells (iPSCs) . A partial list of DNA methylation assay beta-values from CCALD patient and healthy donor control fibroblasts and iPSCs is provided. Click here for file Additional file 4 Molecular karyotyping analysis of induced pluripotent stem cells (iPSCs) . A full list of copy number changes detected in the iPSCs described in this study is provided. Click here for file Additional file 5 Hierarchical clustering analysis gene expression data from childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and control fibroblasts and induced pluripotent stem cells (iPSCs) based on pluripotency genes . The analysis was based on gene expression data from 30 pluripotency genes reported in reference [ 41 ] and performed with average-linkage and Euclidean distance. Click here for file Additional file 6 Differential gene expression between childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and healthy donor control fibroblasts . A complete list of all gene expression scores and differentially expressed genes (DEGs) between CCALD patient and healthy donor control fibroblasts is provided. Click here for file Additional file 7 Gene Ontology (GO) analysis of differentially expressed genes (DEGs) between childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and healthy donor control fibroblasts . GO analysis of DEGs between CCALD patient and healthy donor control fibroblasts is provided. Click here for file Additional file 8 The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) annotation of differentially expressed genes (DEGs) found in childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and control donor fibroblasts . DAVID annotation of DEGs found in CCALD patient and control donor fibroblasts is provided. Click here for file Additional file 9 Differential gene expression between childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and healthy donor control iPSCs . A complete list of differentially expressed genes (DEGs) between CCALD patient and healthy donor control induced pluripotent stem cells (iPSCs) is provided. Click here for file Additional file 10 Gene Ontology (GO) analysis of differentially expressed genes (DEGs) between childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and healthy donor control induced pluripotent stem cells (iPSCs) . GO analysis of DEGs between CCALD patient and healthy donor control iPSCs is provided. Click here for file Additional file 11 Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) annotation of differentially expressed genes (DEGs) found in childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCALD) patient and control donor induced pluripotent stem cells (iPSCs) . DAVID annotation of DEGs found in CCALD patient and control donor iPSCs is provided. Click here for file Additional file 12 Differentially methylated loci (DML) between fibroblasts and induced pluripotent stem cells (iPSCs) . A complete list of DML between fibroblasts and iPSCs is provided. Click here for file Additional file 13 Differentially methylated loci (DML) between patient and control fibroblasts and induced pluripotent stem cells (iPSCs) . A complete list of DML between patient and control fibroblasts and iPSCs is provided. Click here for file

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9085418/

Design and synthesis of N-substituted perylene diimide based low band gap polymers for organic solar cell applications †

In this study, we report on the synthesis and device studies of a series of new copolymers containing N-substituted perylene dimide and dioctylfluorene units as part of the main backbone. A facile synthetic approach avoiding non-selective bromination was used to synthesize the monomer M1 by the reaction of perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride with 2-amino-7-bromo-9,9-dioctylfluorene. The copolymers P1 and P2 were synthesized by Suzuki polycondensation of M1 with 2,2′-(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2,7-diyl)bis(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane) M2 and 9-(heptadecan-9-yl)-2,7-bis(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-9 H -carbazole M3, respectively. The copolymer P3 was synthesized by direct arylation polymerization of M1 with 4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ]-1,2,5-thiadiazole M4. All the copolymers showed thermal stability greater than 380 °C as evidenced from thermogravimetric analysis. The copolymers exhibited a narrow optical band gap (1.80–2.08 eV) with their UV-visible absorption spectra extending up to the NIR region and they are found to be suitable for use in OSC applications. The molecular weights of the polymers P1–P3 were found to be in the range of 10.68 to 16.02 kg mol −1 as measured from GPC analysis. The surface morphology of the active layers based on P1/P2/P3:P3HT blend films was investigated by AFM and the rms values from height images range from 0.65 to 2.90 nm. The polymers were blended with P3HT to fabricate BHJ solar cells in three different weight ratios i.e. 1 : 1, 1.5 : 1 and 2 : 1 and the best power conversion efficiency was observed for the binary film of P3:P3HT blend device in a 1 : 1 weight ratio which reached up to 1.96% with a V oc of 0.55 V, J sc of 10.12 mA cm −2 and FF of 34.63% which is among the highest reported for BHJ solar cells with N-substituted PDI based acceptors. Introduction Organic solar cells (OSCs) are a promising alternative to the inorganic silicon based devices due to their low cost, ease of fabrication, flexibility and light weight. 1,2 During the past decade, fullerene and its derivatives have been extensively investigated as electron acceptors for OSCs, PC 61 BM and PC 71 BM in particular. 3 However, these acceptors suffer from some drawbacks such as limited light absorption in the visible region, high cost, instability of surface morphology in the blend films, difficulty in synthesis and purification and limited energy level tunability. 4,5 To overcome these challenges, there has been lot of reports in the recent literature on the design of non-fullerene based acceptors 6,7 with broader absorption, readily tunable energy levels, and ease of synthesis and purification. 8,9 Solution processable, non-fullerene bulk heterojunction (BHJ) solar cells with power conversion efficiencies (PCEs) > 8% have recently been reported which indicate the potential of non-fullerene electron acceptors. 10,11 Perylene diimides (PDIs) are the most widely studied class of non-fullerene acceptors in OSCs 12,13 because of their large electron mobility with probable generation of a highly conducting path along their π–π stacking axis due to their strong tendency to form ordered aggregates and low-lying frontier energy levels. 14 PDIs are also advantageous due to their high absorption ability, high photochemical and optical stability, reversible redox properties, ease of synthetic modification and excellent environmental/thermal stability. 15–17 PDI based molecules and polymers have progressively attracted significant attention in applications such as light-emitting diodes, 18 sensors, 19 organic field-effect transistors, 20,21 light-harvesting arrays, 22 molecular wires, 23 photochromic materials 24 and photovoltaic cells. 25,26 Further, in PDI unit, the optical, electrochemical and charge transport properties can be tailored by introduction of appropriate substituents at the N-positions 26,27 or at the perylene bay positions, 28,29 offering wider scope for tuning the optical as well as processing properties. 30 Janssen and co-workers were the first to demonstrate the use of N-substituted PDI based polymers in OSCs. 31 Mikroyannidis et al. 32 synthesized alternating phenylenevinylene copolymer with PDI moiety along the backbone by Heck coupling reaction for use as an acceptor in OSCs. This copolymer acts as an n-type organic semiconductor with electron mobility of ∼0.85 × 10 −2 cm −2 V −1 s −1 . A blend device consisting of the above acceptor copolymer and a poly(3-phenyl hydrazonethiophene) donor resulted in a PCE of 1.67% that further increased to 2.32% by thermal treatment and reported one of the best efficiency for N-substituted PDI polymers. In 2011, Z. Liang et al. 33 developed a variety of photo stable polymers containing poly(ethylene glycol) or poly(propylene glycol) segments in the N-substituted PDI backbone and used as acceptor in a PSC with poly(3-hexylthiophene) (P3HT) as donor. The polymer/P3HT (1 : 1 ratio) blend device gave a PCE of 0.1% with low J sc of only 0.6 mA cm −2 . The low performance was attributed to the improper film morphology and low charge transport in the polymer blend. W. Fu et al. , 34 Jin et al. 35 and Koyuncu et al. 36 have recently demonstrated the use of PDI based polymers as acceptor material in BHJ solar cells with moderate power conversion efficiency. The N-substitution at imide position of PDI can affect the solubility and molecular packing of the polymer in the solid state, without influencing the conjugation effect of the PDI backbone and thus the opto-electrochemical properties. In our efforts to develop PDI based acceptors for use in BHJ solar cells, we herein describe the synthesis of a novel N-substituted PDI based monomer and its alternating donor and acceptor type copolymers containing flourene, carbazole and thiophene–benzothiadiazole–thiophene moieties with tunable electrochemical and optical properties and examine their performances in OSCs. In this work, we report the synthesis of three new polymers P1, P2 and P3 obtained either by Suzuki or direct arylation polymerization reactions. 37,38 The optical, electrochemical properties and OSCs application of these copolymers were carefully investigated and correlated with their chemical structures. Experimental Materials The solvents dimethylsulfoxide (DMSO), dimethyl acetamide, chloroform (CHCl 3 ), methanol (CH 3 OH), acetone, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran (THF) and toluene were dried and distilled by well known standard procedures 39 and kept in a glovebox for further use. Fluorene (1), 4,7-dibromobenzo[ c ]-1,2,5-thiadiazole (7), 9-(heptadecan-9-yl)-2,7-bis(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-9 H -carbazole (M3) and perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride were purchased from Sigma-Aldrich (USA) and was used directly without purification. 2-Bromo-9,9-dioctylfluorene (2), 2-bromo-7-nitro-9,9-dioctylfluorene (3), 2-amino-7-bromo-9,9-dioctylfluorene (4), 2,7-dibromo-9,9-dioctyl-9 H -fluorene (5) and 4,4,5,5-tetramethyl-2-(4-octylthiophene-2-yl)-1,3,2-dioxaborolane (6) were synthesized by reported literature procedures. 40–42 2,2′-(9,9-Dioctyl-9 H -fluoren-2,7-diyl)bis(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane) (M2) and 4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ]-1,2,5-thiadiazole (M4) were synthesized by reported methods with modified reaction conditions and improved yields 43,44 (details were given in ESI †). General measurements and characterization The monomers were analysed for C, H and N using a Perkin-Elmer 2400 Series II elemental analyser. The 1 H and 13 C NMR spectral data were recorded on a Bruker spectrospin DPX-400 spectrometer operating at 400.13 MHz and 100.61 MHz, respectively. The chemical shifts are referenced to CDCl 3 solvent (7.26 and 77.0 ppm for 1 H and 13 C NMR, respectively) relative to tetramethylsilane (TMS). Fourier transform infrared (FT-IR) spectra were obtained on KBr disks in the range of 4000–450 cm −1 using a Thermo Scientific Nicolet 6700 FT-IR spectrometer. Ultraviolet-visible spectra were measured in solution and in film on a Perkin-Elmer Lambda 1050 UV-visible spectrophotometer. Thermogravimetric analysis (TGA) was performed on a Perkin Elmer Pyris 6 thermal analysis system under N 2 atmosphere at a heating rate of 20 °C min −1 . The molecular weight determination was carried out on a Waters series 1515 gel permeation chromatograph (GPC) equipped with WATERS 1515 column. The measurement was performed using THF as eluent at a flow rate of 0.5 mL min −1 at 30 °C and samples were prepared in THF (1 mg mL −1 ). The number-average molecular weight ( M n ), weight-average molecular weight ( M w ) and dispersities ( Đ = M w / M n ) of the polymers were determined using calibration curves obtained from polystyrene standards. Cyclic voltammograms (CV) for electrochemical properties were recorded by using a Zehnar Zehnnium potentiostat-galvanostat instrument with a glassy carbon working electrode, a platinum counter electrode and a Ag/AgCl reference electrode. The surface morphology of the blended films was investigated by atomic force microscopy (AFM) using a Nanoscope Bruker icon dimension with scan Asyst in the tapping mode. MALDI-TOF MS spectrum of M1 was recorded on an ultraflextreme Bruker Daltonics TOF system in HCCA matrix. Synthetic procedures for synthesis of monomer and polymers Monomer synthesis Synthesis of 2,9-bis(7-bromo-9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthrax[2,1,9-def:6,510-d,e,f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )tetraone (M1) Perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride (1.0 g, 2.54 mmol), 4 (2.5 g, 5.16 mmol), anhydrous zinc acetate (0.42 g, 2.25 mmol) and imidazole (5.0 g, 73.44 mmol) were stirred under N 2 atmosphere first at 100 °C for 12 h and then at 160 °C for an additional 12 h. The progress of the reaction was monitored by thin layer chromatography (TLC) using CHCl 3 . The reaction mixture was then allowed to cool to ca. 80 °C and poured into 150 mL of 1 N aqueous hydrochloric acid solution. The red brown precipitate was filtered and washed sequentially with 0.5 N HCl (2 × 20 mL), distilled water (2 × 20 mL) and CH 3 OH (3 × 20 mL). The solid was dissolved in CHCl 3 (30 mL), washed with distilled water (30 mL) and dried over anhydrous Na 2 SO 4 . The solvent was evaporated on a rotary evaporator and the crude product was purified by column chromatography (silica gel, CHCl 3 ) to obtain M1 as a red brown solid. Yield: 3.0 g, 90%. Anal. calc. for C 82 H 88 N 2 O 4 Br 2 : C, 74.31%; H, 6.69%; N, 2.11%. Found: C, 74.61%; H, 6.47%; N, 2.21%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.73 (d, 4H, J = 8.0 Hz) 8.61 (d, 4H, J = 8.0 Hz) 7.83 (d, 2H, J = 8.0 Hz) 7.61 (d, 2H, J = 8.0 Hz) 7.51–7.49 (m, 4H) 7.37–7.33 (m, 4H) 2.03–1.90 (m, 8H) 1.26–1.11 (m, 40H) 0.84 (t, 12H, J = 7.2 Hz) 0.72 (m, 8H). 13 C NMR (100.61 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 162.1, 152.4, 150.3, 139.3, 138.3, 133.1, 133.0, 130.2, 129.1, 128.1, 126.7, 125.3, 124.9, 122.6, 122.4, 122.0, 120.4, 119.4, 54.6, 38.8, 30.8, 28.9, 28.6, 28.2, 28.1, 22.7, 21.6, 13.1. MALDI-TOF MS: calc. for C 82 H 88 N 2 O 4 Br 2 : 1325.40; found 1325.58 (M + ). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2925, 2852, 1705, 1664, 1593, 1458, 1354, 1253, 1062, 796, 653. UV-vis spectrum λ max (THF)/nm: 455, 485 and 520. Polymers synthesis Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -9,9-dioctyl-9 H -fluorene] (P1) M1 (0.20 g, 0.15 mmol), M2 (0.10 g, 0.15 mmol), potassium carbonate (0.13 g dissolved in 0.45 mL of distilled water), Pd(PPh 3 ) 4 (3.48 mg, 2 mol%) and a phase transfer catalyst Aliquat 336 (3 drops) were added to N 2 purged mixture of water : toluene (1 : 6) (1.75 mL). The mixture was refluxed at 100 °C with stirring for 48 h under N 2 atmosphere and then an end capping agent, bromobenzene (0.79 μL, 5 mol%) was added to the mixture and heated for an additional 6 h followed by addition of phenyl boronic acid (0.92 mg, 5 mol%) with further heating for an additional 6 h. The reaction mixture was cooled to room temperature and poured drop wise into CH 3 OH (200 mL) to precipitate out the polymer. The polymer was isolated by filtration and purified by Soxhlet extraction with CH 3 OH, acetone and CHCl 3 successively. The polymer extract from CHCl 3 was concentrated on a rotary evaporated and reprecipitated from CH 3 OH (100 mL). The dried polymer P1 was obtained as a red brown solid. Yield: 0.19 g, 81%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.70 (br, 4H) 8.54 (br, 4H), 7.84–7.69 (br, 12H) 7.49–7.38 (br, 6H) 2.05–1.85 (br, 12H) 1.15 (br, 72H) 0.83 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2926, 2853, 1705, 1668, 1593, 1462, 1352, 1253, 1120, 813, 745. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 341, 502 and 951. GPC analysis (PS standard): M w = 14.77 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.53. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -9-(heptadecan-9-yl)-9 H -carbazole] (P2) P2 was synthesized by a similar procedure as for P1 using M1 (0.20 g, 0.15 mmol), M3 (0.10 g, 0.15 mmol), potassium carbonate (0.13 g dissolved in 0.45 mL of distilled water), Pd(PPh 3 ) 4 (3.48 mg, 2 mol%), phase transfer catalyst Aliquat 336 (3 drops), water : toluene (1 : 6) (1.75 mL), bromobenzene (0.79 μL, 5 mol%) and phenyl boronic acid (0.92 mg, 5 mol%). P2 was obtained as a brown solid. Yield: 0.18 g, 77%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.72 (br, 4H) 8.56 (br, 4H) 8.20–7.71 (br, 12H) 7.52–7.29 (br, 6H) 4.69 (s, 1H) 2.05–1.68 (br, 12H) 1.18 (br, 72H) 0.83 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2924, 2852, 1704, 1669, 1564, 1457, 1351, 1261, 1093, 1019, 865, 700. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 354, 516 and 954. GPC analysis (PS standard): M w = 10.68 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.28. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ][1,2,5]thiadiazole] (P3) Pivalic acid (4.62 mg, 30 mol%) and caesium carbonate (0.12 g, 0.38 mmol) were added to a mixture of M1 (0.20 g, 0.15 mmol) and M4 (0.08 g, 0.15 mmol) in anhydrous N , N -dimethylacetamide (1.5 mL, 0.1 M) with constant stirring at room temperature. The reaction mixture was purged with N 2 for 15 minutes, followed by addition of palladium acetate (3.39 mg, 10 mol%). The reaction mixture was heated at 100 °C for 72 h under N 2 atmosphere which was then cooled to room temperature and poured drop wise into cold CH 3 OH (200 mL) to precipitate the polymer. The isolated polymer was further purified by using Soxhlet extraction steps similar to that of P1. The polymer collected in CHCl 3 was concentrated and precipitated from CH 3 OH (100 mL) again, to get P3 as a dark red brown solid. Yield: 0.19 g, 75%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.63 (br, 4H) 8.50 (br, 4H) 8.02 (br, 2H) 7.76 (br, 4H) 7.53–7.43 (br, 8H) 7.18 (br, 2H) 2.62 (br, 4H) 1.89–1.64 (br, 8H) 1.18 (br, 72H) 0.76 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2920, 2852, 1705, 1663, 1580, 1456, 1353, 1261, 1092, 1023, 866, 802, 695. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 329, 520, 784 and 878. GPC analysis (PS standard): M w = 16.02 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.29. Fabrication of organic solar cell devices Poly(3,4-ethylenedioxythiophene):poly(styrenesulfonate) (PEDOT:PSS), regioregular poly(3-hexylthiophene) (P3HT) and 1,2-dichlorobenzene (DCB) were purchased from Sigma-Aldrich and used without further purification. PEDOT:PSS was filtered through 0.45 μm PVDF filter before use. The active layer was prepared by mixing P1, P2 or P3 and P3HT in three different weight ratios of 1 : 1, 1.5 : 1 and 2 : 1 in DCB and all solutions were filtered through a 0.45 μm PTFE filter before use. PSCs were fabricated with a structure of ITO/PEDOT:PSS/polymer/P3HT/Al using a standard solution processing method. Patterned indium tin oxide (ITO)-coated glass substrates were cleaned using labolene soap solution, deionized water, acetone and isopropyl alcohol with ultrasonic treatment each for 30 minutes at 50 °C. The cleaned ITO substrates were nitrogen dried and preheated in an oven at 100 °C for 60 minutes before oxygen plasma treatment for 15 minutes. A layer of PEDOT doped with PSS was spin-coated (3500 rpm for 45 seconds) on cleaned ITO surface, followed by annealing at 150 °C for 30 minutes. Then active layer of blend solution of P3HT:P1 or P2 or P3 (new accepters) in DCB was spin casted (1000 rpm for 30 seconds) on the top of PEDOT:PSS layer and then annealed at 150 °C for 10 minutes. At the end, aluminium electrode (100 nm) was deposited through a shadow mask using thermal evaporation on top of the photoactive layer. All the devices were fabricated and tested in air without any encapsulation. J – V characteristics of PSCs were measured using a Keithley 2440 source meter, under AM 1.5 G illumination of Oriel Sol 3A class AAA solar simulator. The simulator was calibrated using a NREL certified Si solar cell. Materials The solvents dimethylsulfoxide (DMSO), dimethyl acetamide, chloroform (CHCl 3 ), methanol (CH 3 OH), acetone, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran (THF) and toluene were dried and distilled by well known standard procedures 39 and kept in a glovebox for further use. Fluorene (1), 4,7-dibromobenzo[ c ]-1,2,5-thiadiazole (7), 9-(heptadecan-9-yl)-2,7-bis(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-9 H -carbazole (M3) and perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride were purchased from Sigma-Aldrich (USA) and was used directly without purification. 2-Bromo-9,9-dioctylfluorene (2), 2-bromo-7-nitro-9,9-dioctylfluorene (3), 2-amino-7-bromo-9,9-dioctylfluorene (4), 2,7-dibromo-9,9-dioctyl-9 H -fluorene (5) and 4,4,5,5-tetramethyl-2-(4-octylthiophene-2-yl)-1,3,2-dioxaborolane (6) were synthesized by reported literature procedures. 40–42 2,2′-(9,9-Dioctyl-9 H -fluoren-2,7-diyl)bis(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane) (M2) and 4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ]-1,2,5-thiadiazole (M4) were synthesized by reported methods with modified reaction conditions and improved yields 43,44 (details were given in ESI †). General measurements and characterization The monomers were analysed for C, H and N using a Perkin-Elmer 2400 Series II elemental analyser. The 1 H and 13 C NMR spectral data were recorded on a Bruker spectrospin DPX-400 spectrometer operating at 400.13 MHz and 100.61 MHz, respectively. The chemical shifts are referenced to CDCl 3 solvent (7.26 and 77.0 ppm for 1 H and 13 C NMR, respectively) relative to tetramethylsilane (TMS). Fourier transform infrared (FT-IR) spectra were obtained on KBr disks in the range of 4000–450 cm −1 using a Thermo Scientific Nicolet 6700 FT-IR spectrometer. Ultraviolet-visible spectra were measured in solution and in film on a Perkin-Elmer Lambda 1050 UV-visible spectrophotometer. Thermogravimetric analysis (TGA) was performed on a Perkin Elmer Pyris 6 thermal analysis system under N 2 atmosphere at a heating rate of 20 °C min −1 . The molecular weight determination was carried out on a Waters series 1515 gel permeation chromatograph (GPC) equipped with WATERS 1515 column. The measurement was performed using THF as eluent at a flow rate of 0.5 mL min −1 at 30 °C and samples were prepared in THF (1 mg mL −1 ). The number-average molecular weight ( M n ), weight-average molecular weight ( M w ) and dispersities ( Đ = M w / M n ) of the polymers were determined using calibration curves obtained from polystyrene standards. Cyclic voltammograms (CV) for electrochemical properties were recorded by using a Zehnar Zehnnium potentiostat-galvanostat instrument with a glassy carbon working electrode, a platinum counter electrode and a Ag/AgCl reference electrode. The surface morphology of the blended films was investigated by atomic force microscopy (AFM) using a Nanoscope Bruker icon dimension with scan Asyst in the tapping mode. MALDI-TOF MS spectrum of M1 was recorded on an ultraflextreme Bruker Daltonics TOF system in HCCA matrix. Synthetic procedures for synthesis of monomer and polymers Monomer synthesis Synthesis of 2,9-bis(7-bromo-9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthrax[2,1,9-def:6,510-d,e,f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )tetraone (M1) Perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride (1.0 g, 2.54 mmol), 4 (2.5 g, 5.16 mmol), anhydrous zinc acetate (0.42 g, 2.25 mmol) and imidazole (5.0 g, 73.44 mmol) were stirred under N 2 atmosphere first at 100 °C for 12 h and then at 160 °C for an additional 12 h. The progress of the reaction was monitored by thin layer chromatography (TLC) using CHCl 3 . The reaction mixture was then allowed to cool to ca. 80 °C and poured into 150 mL of 1 N aqueous hydrochloric acid solution. The red brown precipitate was filtered and washed sequentially with 0.5 N HCl (2 × 20 mL), distilled water (2 × 20 mL) and CH 3 OH (3 × 20 mL). The solid was dissolved in CHCl 3 (30 mL), washed with distilled water (30 mL) and dried over anhydrous Na 2 SO 4 . The solvent was evaporated on a rotary evaporator and the crude product was purified by column chromatography (silica gel, CHCl 3 ) to obtain M1 as a red brown solid. Yield: 3.0 g, 90%. Anal. calc. for C 82 H 88 N 2 O 4 Br 2 : C, 74.31%; H, 6.69%; N, 2.11%. Found: C, 74.61%; H, 6.47%; N, 2.21%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.73 (d, 4H, J = 8.0 Hz) 8.61 (d, 4H, J = 8.0 Hz) 7.83 (d, 2H, J = 8.0 Hz) 7.61 (d, 2H, J = 8.0 Hz) 7.51–7.49 (m, 4H) 7.37–7.33 (m, 4H) 2.03–1.90 (m, 8H) 1.26–1.11 (m, 40H) 0.84 (t, 12H, J = 7.2 Hz) 0.72 (m, 8H). 13 C NMR (100.61 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 162.1, 152.4, 150.3, 139.3, 138.3, 133.1, 133.0, 130.2, 129.1, 128.1, 126.7, 125.3, 124.9, 122.6, 122.4, 122.0, 120.4, 119.4, 54.6, 38.8, 30.8, 28.9, 28.6, 28.2, 28.1, 22.7, 21.6, 13.1. MALDI-TOF MS: calc. for C 82 H 88 N 2 O 4 Br 2 : 1325.40; found 1325.58 (M + ). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2925, 2852, 1705, 1664, 1593, 1458, 1354, 1253, 1062, 796, 653. UV-vis spectrum λ max (THF)/nm: 455, 485 and 520. Polymers synthesis Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -9,9-dioctyl-9 H -fluorene] (P1) M1 (0.20 g, 0.15 mmol), M2 (0.10 g, 0.15 mmol), potassium carbonate (0.13 g dissolved in 0.45 mL of distilled water), Pd(PPh 3 ) 4 (3.48 mg, 2 mol%) and a phase transfer catalyst Aliquat 336 (3 drops) were added to N 2 purged mixture of water : toluene (1 : 6) (1.75 mL). The mixture was refluxed at 100 °C with stirring for 48 h under N 2 atmosphere and then an end capping agent, bromobenzene (0.79 μL, 5 mol%) was added to the mixture and heated for an additional 6 h followed by addition of phenyl boronic acid (0.92 mg, 5 mol%) with further heating for an additional 6 h. The reaction mixture was cooled to room temperature and poured drop wise into CH 3 OH (200 mL) to precipitate out the polymer. The polymer was isolated by filtration and purified by Soxhlet extraction with CH 3 OH, acetone and CHCl 3 successively. The polymer extract from CHCl 3 was concentrated on a rotary evaporated and reprecipitated from CH 3 OH (100 mL). The dried polymer P1 was obtained as a red brown solid. Yield: 0.19 g, 81%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.70 (br, 4H) 8.54 (br, 4H), 7.84–7.69 (br, 12H) 7.49–7.38 (br, 6H) 2.05–1.85 (br, 12H) 1.15 (br, 72H) 0.83 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2926, 2853, 1705, 1668, 1593, 1462, 1352, 1253, 1120, 813, 745. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 341, 502 and 951. GPC analysis (PS standard): M w = 14.77 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.53. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -9-(heptadecan-9-yl)-9 H -carbazole] (P2) P2 was synthesized by a similar procedure as for P1 using M1 (0.20 g, 0.15 mmol), M3 (0.10 g, 0.15 mmol), potassium carbonate (0.13 g dissolved in 0.45 mL of distilled water), Pd(PPh 3 ) 4 (3.48 mg, 2 mol%), phase transfer catalyst Aliquat 336 (3 drops), water : toluene (1 : 6) (1.75 mL), bromobenzene (0.79 μL, 5 mol%) and phenyl boronic acid (0.92 mg, 5 mol%). P2 was obtained as a brown solid. Yield: 0.18 g, 77%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.72 (br, 4H) 8.56 (br, 4H) 8.20–7.71 (br, 12H) 7.52–7.29 (br, 6H) 4.69 (s, 1H) 2.05–1.68 (br, 12H) 1.18 (br, 72H) 0.83 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2924, 2852, 1704, 1669, 1564, 1457, 1351, 1261, 1093, 1019, 865, 700. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 354, 516 and 954. GPC analysis (PS standard): M w = 10.68 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.28. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ][1,2,5]thiadiazole] (P3) Pivalic acid (4.62 mg, 30 mol%) and caesium carbonate (0.12 g, 0.38 mmol) were added to a mixture of M1 (0.20 g, 0.15 mmol) and M4 (0.08 g, 0.15 mmol) in anhydrous N , N -dimethylacetamide (1.5 mL, 0.1 M) with constant stirring at room temperature. The reaction mixture was purged with N 2 for 15 minutes, followed by addition of palladium acetate (3.39 mg, 10 mol%). The reaction mixture was heated at 100 °C for 72 h under N 2 atmosphere which was then cooled to room temperature and poured drop wise into cold CH 3 OH (200 mL) to precipitate the polymer. The isolated polymer was further purified by using Soxhlet extraction steps similar to that of P1. The polymer collected in CHCl 3 was concentrated and precipitated from CH 3 OH (100 mL) again, to get P3 as a dark red brown solid. Yield: 0.19 g, 75%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.63 (br, 4H) 8.50 (br, 4H) 8.02 (br, 2H) 7.76 (br, 4H) 7.53–7.43 (br, 8H) 7.18 (br, 2H) 2.62 (br, 4H) 1.89–1.64 (br, 8H) 1.18 (br, 72H) 0.76 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2920, 2852, 1705, 1663, 1580, 1456, 1353, 1261, 1092, 1023, 866, 802, 695. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 329, 520, 784 and 878. GPC analysis (PS standard): M w = 16.02 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.29. Monomer synthesis Synthesis of 2,9-bis(7-bromo-9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthrax[2,1,9-def:6,510-d,e,f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )tetraone (M1) Perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride (1.0 g, 2.54 mmol), 4 (2.5 g, 5.16 mmol), anhydrous zinc acetate (0.42 g, 2.25 mmol) and imidazole (5.0 g, 73.44 mmol) were stirred under N 2 atmosphere first at 100 °C for 12 h and then at 160 °C for an additional 12 h. The progress of the reaction was monitored by thin layer chromatography (TLC) using CHCl 3 . The reaction mixture was then allowed to cool to ca. 80 °C and poured into 150 mL of 1 N aqueous hydrochloric acid solution. The red brown precipitate was filtered and washed sequentially with 0.5 N HCl (2 × 20 mL), distilled water (2 × 20 mL) and CH 3 OH (3 × 20 mL). The solid was dissolved in CHCl 3 (30 mL), washed with distilled water (30 mL) and dried over anhydrous Na 2 SO 4 . The solvent was evaporated on a rotary evaporator and the crude product was purified by column chromatography (silica gel, CHCl 3 ) to obtain M1 as a red brown solid. Yield: 3.0 g, 90%. Anal. calc. for C 82 H 88 N 2 O 4 Br 2 : C, 74.31%; H, 6.69%; N, 2.11%. Found: C, 74.61%; H, 6.47%; N, 2.21%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.73 (d, 4H, J = 8.0 Hz) 8.61 (d, 4H, J = 8.0 Hz) 7.83 (d, 2H, J = 8.0 Hz) 7.61 (d, 2H, J = 8.0 Hz) 7.51–7.49 (m, 4H) 7.37–7.33 (m, 4H) 2.03–1.90 (m, 8H) 1.26–1.11 (m, 40H) 0.84 (t, 12H, J = 7.2 Hz) 0.72 (m, 8H). 13 C NMR (100.61 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 162.1, 152.4, 150.3, 139.3, 138.3, 133.1, 133.0, 130.2, 129.1, 128.1, 126.7, 125.3, 124.9, 122.6, 122.4, 122.0, 120.4, 119.4, 54.6, 38.8, 30.8, 28.9, 28.6, 28.2, 28.1, 22.7, 21.6, 13.1. MALDI-TOF MS: calc. for C 82 H 88 N 2 O 4 Br 2 : 1325.40; found 1325.58 (M + ). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2925, 2852, 1705, 1664, 1593, 1458, 1354, 1253, 1062, 796, 653. UV-vis spectrum λ max (THF)/nm: 455, 485 and 520. Synthesis of 2,9-bis(7-bromo-9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthrax[2,1,9-def:6,510-d,e,f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )tetraone (M1) Perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride (1.0 g, 2.54 mmol), 4 (2.5 g, 5.16 mmol), anhydrous zinc acetate (0.42 g, 2.25 mmol) and imidazole (5.0 g, 73.44 mmol) were stirred under N 2 atmosphere first at 100 °C for 12 h and then at 160 °C for an additional 12 h. The progress of the reaction was monitored by thin layer chromatography (TLC) using CHCl 3 . The reaction mixture was then allowed to cool to ca. 80 °C and poured into 150 mL of 1 N aqueous hydrochloric acid solution. The red brown precipitate was filtered and washed sequentially with 0.5 N HCl (2 × 20 mL), distilled water (2 × 20 mL) and CH 3 OH (3 × 20 mL). The solid was dissolved in CHCl 3 (30 mL), washed with distilled water (30 mL) and dried over anhydrous Na 2 SO 4 . The solvent was evaporated on a rotary evaporator and the crude product was purified by column chromatography (silica gel, CHCl 3 ) to obtain M1 as a red brown solid. Yield: 3.0 g, 90%. Anal. calc. for C 82 H 88 N 2 O 4 Br 2 : C, 74.31%; H, 6.69%; N, 2.11%. Found: C, 74.61%; H, 6.47%; N, 2.21%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.73 (d, 4H, J = 8.0 Hz) 8.61 (d, 4H, J = 8.0 Hz) 7.83 (d, 2H, J = 8.0 Hz) 7.61 (d, 2H, J = 8.0 Hz) 7.51–7.49 (m, 4H) 7.37–7.33 (m, 4H) 2.03–1.90 (m, 8H) 1.26–1.11 (m, 40H) 0.84 (t, 12H, J = 7.2 Hz) 0.72 (m, 8H). 13 C NMR (100.61 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 162.1, 152.4, 150.3, 139.3, 138.3, 133.1, 133.0, 130.2, 129.1, 128.1, 126.7, 125.3, 124.9, 122.6, 122.4, 122.0, 120.4, 119.4, 54.6, 38.8, 30.8, 28.9, 28.6, 28.2, 28.1, 22.7, 21.6, 13.1. MALDI-TOF MS: calc. for C 82 H 88 N 2 O 4 Br 2 : 1325.40; found 1325.58 (M + ). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2925, 2852, 1705, 1664, 1593, 1458, 1354, 1253, 1062, 796, 653. UV-vis spectrum λ max (THF)/nm: 455, 485 and 520. Polymers synthesis Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -9,9-dioctyl-9 H -fluorene] (P1) M1 (0.20 g, 0.15 mmol), M2 (0.10 g, 0.15 mmol), potassium carbonate (0.13 g dissolved in 0.45 mL of distilled water), Pd(PPh 3 ) 4 (3.48 mg, 2 mol%) and a phase transfer catalyst Aliquat 336 (3 drops) were added to N 2 purged mixture of water : toluene (1 : 6) (1.75 mL). The mixture was refluxed at 100 °C with stirring for 48 h under N 2 atmosphere and then an end capping agent, bromobenzene (0.79 μL, 5 mol%) was added to the mixture and heated for an additional 6 h followed by addition of phenyl boronic acid (0.92 mg, 5 mol%) with further heating for an additional 6 h. The reaction mixture was cooled to room temperature and poured drop wise into CH 3 OH (200 mL) to precipitate out the polymer. The polymer was isolated by filtration and purified by Soxhlet extraction with CH 3 OH, acetone and CHCl 3 successively. The polymer extract from CHCl 3 was concentrated on a rotary evaporated and reprecipitated from CH 3 OH (100 mL). The dried polymer P1 was obtained as a red brown solid. Yield: 0.19 g, 81%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.70 (br, 4H) 8.54 (br, 4H), 7.84–7.69 (br, 12H) 7.49–7.38 (br, 6H) 2.05–1.85 (br, 12H) 1.15 (br, 72H) 0.83 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2926, 2853, 1705, 1668, 1593, 1462, 1352, 1253, 1120, 813, 745. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 341, 502 and 951. GPC analysis (PS standard): M w = 14.77 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.53. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -9-(heptadecan-9-yl)-9 H -carbazole] (P2) P2 was synthesized by a similar procedure as for P1 using M1 (0.20 g, 0.15 mmol), M3 (0.10 g, 0.15 mmol), potassium carbonate (0.13 g dissolved in 0.45 mL of distilled water), Pd(PPh 3 ) 4 (3.48 mg, 2 mol%), phase transfer catalyst Aliquat 336 (3 drops), water : toluene (1 : 6) (1.75 mL), bromobenzene (0.79 μL, 5 mol%) and phenyl boronic acid (0.92 mg, 5 mol%). P2 was obtained as a brown solid. Yield: 0.18 g, 77%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.72 (br, 4H) 8.56 (br, 4H) 8.20–7.71 (br, 12H) 7.52–7.29 (br, 6H) 4.69 (s, 1H) 2.05–1.68 (br, 12H) 1.18 (br, 72H) 0.83 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2924, 2852, 1704, 1669, 1564, 1457, 1351, 1261, 1093, 1019, 865, 700. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 354, 516 and 954. GPC analysis (PS standard): M w = 10.68 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.28. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ][1,2,5]thiadiazole] (P3) Pivalic acid (4.62 mg, 30 mol%) and caesium carbonate (0.12 g, 0.38 mmol) were added to a mixture of M1 (0.20 g, 0.15 mmol) and M4 (0.08 g, 0.15 mmol) in anhydrous N , N -dimethylacetamide (1.5 mL, 0.1 M) with constant stirring at room temperature. The reaction mixture was purged with N 2 for 15 minutes, followed by addition of palladium acetate (3.39 mg, 10 mol%). The reaction mixture was heated at 100 °C for 72 h under N 2 atmosphere which was then cooled to room temperature and poured drop wise into cold CH 3 OH (200 mL) to precipitate the polymer. The isolated polymer was further purified by using Soxhlet extraction steps similar to that of P1. The polymer collected in CHCl 3 was concentrated and precipitated from CH 3 OH (100 mL) again, to get P3 as a dark red brown solid. Yield: 0.19 g, 75%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.63 (br, 4H) 8.50 (br, 4H) 8.02 (br, 2H) 7.76 (br, 4H) 7.53–7.43 (br, 8H) 7.18 (br, 2H) 2.62 (br, 4H) 1.89–1.64 (br, 8H) 1.18 (br, 72H) 0.76 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2920, 2852, 1705, 1663, 1580, 1456, 1353, 1261, 1092, 1023, 866, 802, 695. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 329, 520, 784 and 878. GPC analysis (PS standard): M w = 16.02 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.29. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -9,9-dioctyl-9 H -fluorene] (P1) M1 (0.20 g, 0.15 mmol), M2 (0.10 g, 0.15 mmol), potassium carbonate (0.13 g dissolved in 0.45 mL of distilled water), Pd(PPh 3 ) 4 (3.48 mg, 2 mol%) and a phase transfer catalyst Aliquat 336 (3 drops) were added to N 2 purged mixture of water : toluene (1 : 6) (1.75 mL). The mixture was refluxed at 100 °C with stirring for 48 h under N 2 atmosphere and then an end capping agent, bromobenzene (0.79 μL, 5 mol%) was added to the mixture and heated for an additional 6 h followed by addition of phenyl boronic acid (0.92 mg, 5 mol%) with further heating for an additional 6 h. The reaction mixture was cooled to room temperature and poured drop wise into CH 3 OH (200 mL) to precipitate out the polymer. The polymer was isolated by filtration and purified by Soxhlet extraction with CH 3 OH, acetone and CHCl 3 successively. The polymer extract from CHCl 3 was concentrated on a rotary evaporated and reprecipitated from CH 3 OH (100 mL). The dried polymer P1 was obtained as a red brown solid. Yield: 0.19 g, 81%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.70 (br, 4H) 8.54 (br, 4H), 7.84–7.69 (br, 12H) 7.49–7.38 (br, 6H) 2.05–1.85 (br, 12H) 1.15 (br, 72H) 0.83 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2926, 2853, 1705, 1668, 1593, 1462, 1352, 1253, 1120, 813, 745. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 341, 502 and 951. GPC analysis (PS standard): M w = 14.77 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.53. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -9-(heptadecan-9-yl)-9 H -carbazole] (P2) P2 was synthesized by a similar procedure as for P1 using M1 (0.20 g, 0.15 mmol), M3 (0.10 g, 0.15 mmol), potassium carbonate (0.13 g dissolved in 0.45 mL of distilled water), Pd(PPh 3 ) 4 (3.48 mg, 2 mol%), phase transfer catalyst Aliquat 336 (3 drops), water : toluene (1 : 6) (1.75 mL), bromobenzene (0.79 μL, 5 mol%) and phenyl boronic acid (0.92 mg, 5 mol%). P2 was obtained as a brown solid. Yield: 0.18 g, 77%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.72 (br, 4H) 8.56 (br, 4H) 8.20–7.71 (br, 12H) 7.52–7.29 (br, 6H) 4.69 (s, 1H) 2.05–1.68 (br, 12H) 1.18 (br, 72H) 0.83 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2924, 2852, 1704, 1669, 1564, 1457, 1351, 1261, 1093, 1019, 865, 700. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 354, 516 and 954. GPC analysis (PS standard): M w = 10.68 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.28. Synthesis of poly[2,9-bis(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthra[2,1,9-def:6,5,10-d′e′f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )-tetraone- alt -4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ][1,2,5]thiadiazole] (P3) Pivalic acid (4.62 mg, 30 mol%) and caesium carbonate (0.12 g, 0.38 mmol) were added to a mixture of M1 (0.20 g, 0.15 mmol) and M4 (0.08 g, 0.15 mmol) in anhydrous N , N -dimethylacetamide (1.5 mL, 0.1 M) with constant stirring at room temperature. The reaction mixture was purged with N 2 for 15 minutes, followed by addition of palladium acetate (3.39 mg, 10 mol%). The reaction mixture was heated at 100 °C for 72 h under N 2 atmosphere which was then cooled to room temperature and poured drop wise into cold CH 3 OH (200 mL) to precipitate the polymer. The isolated polymer was further purified by using Soxhlet extraction steps similar to that of P1. The polymer collected in CHCl 3 was concentrated and precipitated from CH 3 OH (100 mL) again, to get P3 as a dark red brown solid. Yield: 0.19 g, 75%. 1 H NMR (400.13 MHz, CDCl 3 , 25 °C vs. TMS) δ : 8.63 (br, 4H) 8.50 (br, 4H) 8.02 (br, 2H) 7.76 (br, 4H) 7.53–7.43 (br, 8H) 7.18 (br, 2H) 2.62 (br, 4H) 1.89–1.64 (br, 8H) 1.18 (br, 72H) 0.76 (br, 18H). FT-IR (KBr disk, ν max /cm −1 ): 2920, 2852, 1705, 1663, 1580, 1456, 1353, 1261, 1092, 1023, 866, 802, 695. UV-vis spectrum λ max (film)/nm: 329, 520, 784 and 878. GPC analysis (PS standard): M w = 16.02 kg mol −1 . Dispersity ( Đ ): 1.29. Fabrication of organic solar cell devices Poly(3,4-ethylenedioxythiophene):poly(styrenesulfonate) (PEDOT:PSS), regioregular poly(3-hexylthiophene) (P3HT) and 1,2-dichlorobenzene (DCB) were purchased from Sigma-Aldrich and used without further purification. PEDOT:PSS was filtered through 0.45 μm PVDF filter before use. The active layer was prepared by mixing P1, P2 or P3 and P3HT in three different weight ratios of 1 : 1, 1.5 : 1 and 2 : 1 in DCB and all solutions were filtered through a 0.45 μm PTFE filter before use. PSCs were fabricated with a structure of ITO/PEDOT:PSS/polymer/P3HT/Al using a standard solution processing method. Patterned indium tin oxide (ITO)-coated glass substrates were cleaned using labolene soap solution, deionized water, acetone and isopropyl alcohol with ultrasonic treatment each for 30 minutes at 50 °C. The cleaned ITO substrates were nitrogen dried and preheated in an oven at 100 °C for 60 minutes before oxygen plasma treatment for 15 minutes. A layer of PEDOT doped with PSS was spin-coated (3500 rpm for 45 seconds) on cleaned ITO surface, followed by annealing at 150 °C for 30 minutes. Then active layer of blend solution of P3HT:P1 or P2 or P3 (new accepters) in DCB was spin casted (1000 rpm for 30 seconds) on the top of PEDOT:PSS layer and then annealed at 150 °C for 10 minutes. At the end, aluminium electrode (100 nm) was deposited through a shadow mask using thermal evaporation on top of the photoactive layer. All the devices were fabricated and tested in air without any encapsulation. J – V characteristics of PSCs were measured using a Keithley 2440 source meter, under AM 1.5 G illumination of Oriel Sol 3A class AAA solar simulator. The simulator was calibrated using a NREL certified Si solar cell. Results and discussion Synthesis and characterization of monomers and polymers The synthetic approach toward the monomer, M1 is shown in Scheme 1 , whereas for M2 and M4 are shown in Scheme S1. †The synthesis of the target monomers 2,9-bis(7-bromo-9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthrax[2,1,9-def:6,510-d,e,f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )tetraone (M1), 2,2′-(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2,7-diyl)bis(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane) (M2) and 4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ]-1,2,5-thiadiazole (M4) were carried out as follows: in the first step bromination followed by alkylation of fluorene 1 in presence of N-bromosuccinimide (NBS) and n -octyl bromide, respectively, yielded 2-bromo-9,9-dioctylfluorene 2 (90%) which on nitration in the second step followed by reduction gave 2-amino-7-bromo-9,9-dioctylfluorene 4 in 74% overall yield. 40 Reaction of 4 with perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride in the presence of imidazole and anhydrous zinc acetate on heating at 160 °C under N 2 atmosphere resulted in M1 in 90% yield. Bromination of 1 in presence of bromine gave dibromofluorene which on alkylation with n -octyl bromide using tetrabutylammonium hydroxide at 80 °C gave 2,7-dibromo-9,9-dioctyl-9 H -fluorene 5 in 90% yield. 45 Reaction of 5 in presence of Pd(dppf)Cl 2 and potassium acetate with bis(pinacolato)diboron under N 2 atmosphere at 105 °C resulted in M2 (70% yield). Reaction of 7 with 6 in toluene/THF under N 2 atmosphere in presence of sodium carbonate, Pd(PPh 3 ) 4 and tetrabutylammonium hydroxide gave M4 in 80% yield. Scheme 1 Synthetic routes to design intermediates and monomer M1. The structures of intermediates and monomers (M1, M2 and M4) were confirmed by NMR, FT-IR spectroscopy and elemental analysis. MALDI-TOF MS and UV-vis spectroscopy were also carried out to characterise M1. In the aromatic region of the 1 H NMR spectrum of M1, there are two doublets of equal intensity at 8.73 and 8.61 ppm, which correspond to protons of the PDI unit. The presence of two doublet (7.83 and 7.61 ppm) and two multiplet (7.51–7.49 and 7.37–7.33 ppm) signals of equal intensity can be attributed to the two fluorene moieties attached to PDI unit. The disappearance of NH 2 protons from intermediate 4 and the slight shift in the chemical shift of perylene protons compared to perylene dianhydride, further confirm the structure. The aliphatic region of the 1 H NMR spectrum constitute the signals of the alkyl substituents on the fluorene moieties and the ratio between integrated intensities of aromatic and aliphatic regions of the spectrum is consistent with the proposed structure of M1 (Fig. S1 †). In 13 C NMR spectrum of M1, the C Created by potrace 1.16, written by Peter Selinger 2001-2019 O peaks of the PDI unit appear at 162.1 ppm. The presence of 17 signals in the down field region in the range of 152.4–119.4 ppm correspond to 44 different aromatic carbon atoms and the signals in the range of 54.6–13.1 ppm account for the different aliphatic carbon atoms of the alkyl chains attached to the fluorene moieties confirming the structure of M1 (Fig. S2 †). The FT-IR spectrum of M1 clearly shows the presence of characteristic aromatic C–H stretching appearing at 2925 cm −1 , aliphatic C–H stretching appeared at 2852 cm −1 , O CN stretching at 1705 and 1664 cm −1 , C C stretching appeared at 1593 cm −1 and C–N stretching appeared at 1354 cm −1 and found similar as reported for other PDI derivatives. 46 The UV-vis spectrum of M1 ( Fig. 1 ) in THF, having three clearly distinguishable peaks in the region of 400–550 nm, which showed their absorption maxima at λ max = 455, 485 and 520 nm consistent with the reported absorption spectra of PDI based monomers. 47 The above peaks are found match with different vibrational modes (2 ← 0, 1 ← 0 and 0 ← 0, respectively) combined with the PDI main transition dipole moment, 48 which is lined up along the long axis of the molecule. The more direct and supporting evidence for M1 was obtained from the MALDI-TOF MS spectrum shown in Fig. S3, †where it can be seen that the experimental mass agrees well with the calculated mass. Fig. 1 Normalized absorbance spectrum of M1 in THF solution. The 1 H and 13 C NMR spectra of M2 and M4 are shown in Fig. S4–S7 †and found to be in agreement with reported literature although in this work, M2 and M4 were synthesized by modified procedures with improved yield. 43,44 N-substituted PDI based polymers P1 and P2 were synthesized by using Suzuki polymerization 49 whereas P3 was synthesized by direct arylation polymerization. 50 Their synthetic routes are outlined in Scheme 2 . The Suzuki polycondensation reaction of M1 with M2 or M3 in the presence of Pd(PPh 3 ) 4 , potassium carbonate and Aliquat 336 in mixture of toluene-water at 100 °C under N 2 atmosphere resulted in P1 (81% yield) and P2 (77% yield) respectively, whereas P3 was synthesized by direct arylation polymerization of M1 with M4 in presence of pivalic acid, palladium acetate and caesium carbonate using N , N -dimethylacetamide at 100 °C under N 2 atmosphere in 80% yield. The purifications of the synthesized polymers were carried out by precipitation in cold CH 3 OH than after Soxhlet extractions and finally reprecipitation from CH 3 OH. Scheme 2 Synthetic routes to design of polymers P1–P3. The polymeric structures of P1–P3 were confirmed with 1 H NMR and FT-IR spectroscopy and their 1 H NMR spectra are shown in Fig. S8–S10. †In 1 H NMR spectra of P1–P3, the peaks at 8.63–7.29 ppm correspond to the aromatic protons whereas the peaks at 2.62–1.15 ppm can be attributed to CH 2 groups of alkyl chain. The signals in the range of 0.83–0.76 ppm arise from terminal CH 3 of alkyl substituent. The 1 H NMR spectrum of P2 showed a singlet at 4.69 ppm confirming the presence of carbazole moiety in the polymeric chain. In P3, the signal at 7.18 ppm corresponds to aromatic protons of the benzothiadiazole moiety and at 2.62 ppm to the CH 2 protons directly attached to thiophene units. The measured proton intensities agree well with the structures of P1–P3. The molecular weights and dispersities of P1–P3 were determined by GPC against monodisperse polystyrene standards with THF as the eluent using the totalchrom software and their results are summarized in Table 1 . The GPC measurements indicate that these polymers have weight-averaged molecular weights ( M w ) of 14.77, 10.68 and 16.02 kg mol −1 with a narrow PDI of 1.53, 1.28 and 1.29 for P1, P2 and P3, respectively. The thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning colorimetry (DSC) studies were performed to determine the thermal properties of the polymers P1–P3 ( Table 1 ). DSC curves of polymers reveal that no transitions were observed during the heating and cooling cycles whereas TGA analysis shows the onset decomposition temperature ( T 5 ) higher than 380 °C at 5% weight loss. This suggested that the thermal stability of the polymers is sufficient for application in OSCs. The TGA graphs of the polymers are shown in Fig. S11. †The polymers P1–P3 are found to be soluble in chlorinated solvents as well as in toluene and THF. Molecular weights and thermal properties of polymers P1–P3 Polymers M w a (kg mol −1 ) M n b (kg mol −1 ) PDI c ( M w / M n ) T 5 d (°C) P1 14.77 9.66 1.53 381 P2 10.68 8.32 1.28 458 P3 16.02 12.42 1.29 380 a Weight-average molecular weight. b Number-average molecular weight. c Polydispersity index. d Onset decomposition temperature (5% weight loss). Optical properties The UV-visible absorption spectroscopy was performed in THF solution and thin film to understand the optical properties of polymers P1–P3. Fig. 2 shows the absorption spectra of all polymers whereas their related data are given in Table 2 . The polymers P1–P3 ( Fig. 2a ) exhibited their absorption maxima in the range of 300 to 520 nm in THF solution. In these ranges, two clearly defined absorption bands were noticed, the first between 300 to 352 nm and the second in the range of 510 to 520 nm. These absorption bands located at lower wavelength can be assigned to π–π* transitions from the conjugated backbones localized on the donor or acceptor, whereas the higher wavelength absorption band can be assigned to intramolecular charge transfer (ICT) transitions inherent to the D–A system. 51 While comparing to film spectra with solution, the absorption maxima were red shifted with broadened area owing to strong inter-chain interaction and π–π stacking in the solid state which are beneficial for charge transport. 52 The solution and film spectra of polymers have almost the same absorption maxima in the range of 502 to 520 nm and are very close to the monomer M1 due to the presence of the same PDI unit in all the polymers. Such close values in absorption maxima in monomer and polymers were also reported in other PDI based polymers. 53,54 The absorption spectra of the three polymers in film ( Fig. 2b ) showed absorption maxima at near infrared (NIR) region, 951 nm for P1, 954 nm for P2 and 784 nm with a shoulder at 878 nm for P3. These absorptions at NIR region are relatively broad and weak in the range of 750 to 1000 nm and can be attributed to ICT between D–A units and simultaneously can increase the number of photons absorbed under solar radiation. The use of an OPV material that absorbs light in the NIR region and even above 1000 nm could increase the efficiency of devices in OSC applications. 55 In the film spectrum, the absorption maximum at 520 nm of P3 was found to be slightly red shifted by ca . 10 nm as compared to solution indicating good intermolecular ordering in the solid state. 56 The optical band gaps ( E opt g ) of all the polymers were estimated from λ edge of the thin film absorption spectra and found to be in the range of 1.80–2.08 eV. The absorption intensity and optical band gap value of P3 are observed to be higher than those of P2 which may be due to the incorporation of carbazole unit into the polymer backbone of P2 leading to enhanced conjugation. 57 Further the presence of bulky octyl substituents in the thiophene units probably twist atom induce the main chain of P3 leading to decrease coplanarity and intramolecular conjugation in solid state of the polymer. 58 All the polymers displayed comparable optical band gap values with literature values as reported for N-substituted PDI based alternating copolymers containing thiophene (2.0 eV), 36 oligothiophene (1.63–1.97 eV) 59 and phenylenevinylene (1.66 eV) units. 32 The narrower band gaps of P1–P3 can be assigned to well organised and planar structure of the conjugated polymers. Fig. 2 Normalized absorbance spectra of P1, P2 and P3 (a) in THF solution and (b) films. Optical and electrochemical properties of polymers P1–P3 Polymers λ max a (nm) E opt g (eV) b ( λ edge /nm) c Energy levels (eV) Solution Film E HOMO d E LUMO e P1 339, 519 341, 502, 951 2.08 (597) −5.66 −3.58 P2 352, 520 354, 516, 954 1.80 (688) −5.37 −3.57 P3 300, 510 329, 520, 784, 878 1.88 (660) −5.50 −3.62 a UV-vis absorption maxima in THF solution and film. b Optical band gap E opt g = 1240/ λ edge . c Onset of thin films absorption spectra. d Calculated by equation HOMO = E opt g + LUMO (eV). e Calculated from the onset reduction potential. Electrochemical properties The cyclic voltammetry (CV) studied were carried out to investigate the electrochemical properties of the polymers P1–P3 using films on a glassy carbon working electrode (made by drop casting of their concentrated solution in CHCl 3 ) in CH 3 CN solution having [ n Bu 4 N] + [ClO 4 ] − (0.1 mol L −1 ) as electrolyte at a scan rate of 50 mV s −1 . The voltammograms are shown in Fig. 3 and the results are summarized in Table 2 . The highest occupied molecular orbital (HOMO) and lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) energy levels were calculated by combining both absorption spectroscopy and CV. The LUMO energy levels were calculated from the first reduction onset potential using as reported equation E LUMO = −e ( E red + 4.4) eV and the HOMO energy levels were determined by E opt g plus LUMO energy levels. 60 Fig. 3 Cyclic voltammetry curves of polymers P1–P3. As displayed in Fig. 3 , all the polymers show one or two reversible or quasi-reversible reduction and oxidation waves. The HOMO energy levels were calculated to be in the range of −5.37 to −5.66 eV for P1–P3, which are in remarkably good compliance with the ideal range of HOMO energy levels for achieving high air stability and high open-circuit voltage ( V oc ) in OSCs. 61 In comparison to the HOMO energy level of P3 (−5.50 eV), P1 and P2 (−5.66 and −5.37 eV, respectively) exhibit high lying and low lying HOMO energy levels by ca . 0.16 eV and 0.13 eV, respectively. The LUMO energy levels were calculated as −3.58 eV for P1, −3.57 eV for P2 and −3.62 eV for P3. The LUMO energy levels of P1 and P2 are almost comparable whereas P3 has slightly high lying LUMO energy level which can be due to the combined effect of two thiophene and one benzothiadiazole units. The HOMO and LUMO energy levels of P1–P3 are found to be comparable with that of alternating phenylenevinylene polymer with PDI unit (HOMO and LUMO energy levels at −5.75 and −3.95 eV, respectively), which has shown one of the highest efficiency (PCE upto 2.32%) reported for N-substituted PDI based polymers. 32 The comparable LUMO energy level values of P1–P3 illustrate that they can be used as n-type materials in OSCs. Organic solar cell applications BHJ solar cell devices were fabricated by blending the polymers P1–P3 and P3HT with the device configuration of ITO/PEDOT:PSS/polymer:P3HT/Al and a pixel area of 0.04 cm 2 (for detail, see device fabrication) where PEDOT:PSS was used to modify the ITO electrode and to act as a hole-transporting layer. P3HT was used as the donor and N-substituted PDI based polymers P1–P3 as the acceptor to design the photoactive layers. DCB was used as a processing solvent since it was reported to afford the perfect quality of blended films. 62 The OSC device performance was optimized in three different binary compositions of P1/P2/P3:P3HT weight ratios i.e. 1 : 1, 1.5 : 1 and 2 : 1 to achieve best PCE. The current density versus voltage ( J – V ) curves of the OSCs fabricated with the optimized D : A ratio are shown in Fig. 4 and their corresponding open-circuit voltage ( V oc ), short-circuit current ( J sc ), fill factor (FF) and PCE are listed in Table 3 . The photovoltaic performances of PSCs are greatly influenced by film morphology of P1–P3 and P3HT since the data from photovoltaic studies reveal that the 1 : 1 weight ratio of P1/P2/P3:P3HT blends exhibit higher PCEs (0.82%, 1.22% and 1.96%, respectively) in comparison to other weight ratios i.e. 1.5 : 1 and 2 : 1 blends (PCEs ranges from 0.23 to 1.11%), suggesting a further increase of polymer content and decrease of P3HT content in the photoactive layer had an unfavourable impact on both J sc and FF resulting in an overall decrease in PCE. The high polymer and low P3HT content in blend films probably attributed to the improper thickness of photo-active layer leading to higher current leakage, which in turn account for the poor photovoltaic performances observed in devices. The relatively better performance of 1 : 1 P1/P2/P3:P3HT blends can be due to more favourable film morphology and proper thickness of the active layers with smoothened surface having lower rms values (1.79, 1.67 and 0.65 nm, respectively). The PCE for the binary 1 : 1 film of P3:P3HT blend device reached upto 1.96% (highest among all devices in all tested ratios) with V oc of 0.55 V, J sc of 10.12 mA cm −2 and a FF of 34.63%. In comparison, P1:P3HT/P2:P3HT devices (for ratio 1 : 1) showed PCEs of 1.22/0.82%, V oc of 0.59/0.49 V, J sc of 6.70/6.43 mAcm −2 and FF of 25.83/30.81%, respectively. The higher efficiency obtained with P3 based device can be attributed to higher J sc and FF owing to better conjugation and broader absorption spectrum of polymer. J sc ideally correlates with the energetic difference between HOMO–LUMO energy levels of D–A segments of blend films and consequently relates to the exciton dissociation. Comparing OPV devices constructed with 1 : 1 weight ratio, P3 blend shows a higher J sc of 10.12 mA cm −2 relative to P1 and P2 ( J sc of 6.70 and 6.43 mA cm −2 , respectively) analogues and hence higher value of exciton dissociation which could be the reason for higher PCE in P3 based OSC. However in the present study, the V oc , J sc , FF and PCE show a linear trend with all the tested weight ratios of P1/P2/P3:P3HT blend films, since these photovoltaic device properties are influenced by other features such as molecular structure, charge transport and the surface morphology of the blended films as well. Even though the device performances of the N-substituted PDI based polymers were low, these are comparable to some of the previously reported for the BHJ photovoltaic devices based on a blend of tris(thienylenevinylene)-substituted polythiophene and poly[perylene diimide- alt -bis(dithienothiophene)]. 63 The PCEs of these devices are less than that reported for blend device of alternating phenylenevinylene copolymer with PDI unit and a poly(3-phenylhydrazonethiophene) donor, which resulted a PCE of 2.32%. The improvement was attributed to thermal annealing of the blend film which initiate the fine mixing morphology of two components and the higher hole mobility in the films. 32 However, the lower PCE in our devices in comparison to the above reported device efficiency is primarily restricted by the low values of V oc and FF. The low values of FF of our devices can be attributed to the electron traps present in polymer phase which contributes to the recombination losses. The high FF values of the solar cell devices can be achieved by better fabrication or design with proper selection of device engineering strategies, 64,65 improving morphology of photoactive layer with controlled thermal treatment 66 and proper selection of processing additives. 67 It was reported that additives are useful to enhance the miscibility between two components of the photoactive layer and found necessary for optimizing photovoltaic device performances by increasing FF. 68 The PCEs obtained for N-substituted PDI based polymers are limited of their application in OSCs due to reduced exciton dissociation efficiency and/or increased charge recombination. Therefore, further experiments are in progress to improve the photocurrent for OSCs to achieve better PCE by modifying the structure as well as improving the surface morphology of the blend films. Fig. 4 J – V curves of the OSCs based on (a) P1:P3HT and (b) P2:P3HT and (c) P3:P3HT. Photovoltaic properties of polymers P1–P3 Polymers Ratio J sc (mA cm −2 ) V oc (V) FF (%) PCE (%) Roughness (rms) Polymer : P3HT P1 1 : 1 6.43 0.49 25.83 0.82 1.79 P1 1.5 : 1 5.82 0.51 24.79 0.74 2.34 P1 2 : 1 5.21 0.45 24.03 0.57 2.85 P2 1 : 1 6.70 0.59 30.81 1.22 1.67 P2 1.5 : 1 3.94 0.60 21.26 0.51 2.43 P2 2 : 1 1.62 0.66 21.41 0.23 2.90 P3 1 : 1 10.12 0.55 34.63 1.96 0.65 P3 1.5 : 1 6.32 0.56 31.22 1.11 1.44 P3 2 : 1 5.98 0.55 24.21 0.80 2.66 Morphological studies The surface morphology of the photoactive layer in the BHJ solar cells was found to be an important aspect to control the charge carrier transport into blend films and impact on the performance of OSCs. 69 To further understand the different photovoltaic performance of PSCs based on P1/P2/P3:P3HT blend films, atomic force microscopy (AFM) studies were carried out to investigate the morphology of the active layers using tapping mode. Fig. 5 shows topographic images and phase images for P1:P3HT, P2:P3HT and P3:P3HT blend films in DCB solution for 1 : 1 weight ratio whereas other topographic images and phase images for remaining 1.5 : 1 and 2 : 1 weight ratios are given in Fig. S12. †The root-mean-square (rms) roughnesses of these films measured from topographic images are in range of 0.65 to 2.90 nm. In all AFM images, we observed a phase-separated interpenetrating network with sizable P3HT domains. Some of phase-separation are important and necessary for systematic formation of free carriers to generate optimal photovoltaic properties of PSCs. 70 The phase images of P1:P3HT, P2:P3HT and P3:P3HT blend films in the ratio of 1 : 1 are quite different (rms roughness 1.79, 1.67 and 0.65 nm, respectively) and revealed that the P3HT domains in the P3:P3HT blend film were smaller than those in the P1:P3HT and P2:P3HT blend films, indicating better compatibility between the P3HT and polymer in case of P3. This can be attributed to the high solubility and feasible solution processability of thiophene–benzothiadiazole–thiophene 71 containing polymer P3 which may allow easier incorporation of P3HT into polymer matrix. Among all blend films, more uniform morphology (rms 0.65 nm) with lower defect density and larger aggregation domains was observed for P3:P3HT blend film in 1 : 1 ratio, which is favourable to electron transport leading to the highest PCE 1.96% with highest FF value (34.63%). However, the P1/P2/P3:P3HT blend films in the ratio of 1 : 1 each showed more intermixed, smooth and homogeneous morphology in comparison to 1.5 : 1 and 2 : 1 blend films. The blend films with weight ratios of 1.5 : 1 and 2 : 1 show higher rms values ranges from 1.44 to 2.43 nm and ranges from 2.66 to 2.90 nm, respectively and therefore exhibit larger domain size resulting in ineffective exciton dissociation and lower PCE. The phase images (Fig. S12 †) of P1/P2/P3:P3HT blend films having weight ratios of 1.5 : 1 and 2 : 1 also support the above assertion. However, the distribution of P3HT units in the polymer for P1/P2/P3:P3HT blend films was less uniform for 1.5 : 1 and 2 : 1 ratio as the polymer content is increased (weight% of polymer are 60% and 66.67%, respectively) and in respect of polymer the P3HT content decreased (weight% of P3HT are 40% and 33.33%, respectively), the films became more coarser owing to poor solubility, high molecular stacking and electrostatic interactions resulting in self-aggregation of polymers with reduced compatibility with P3HT. 72 The 1 : 1 blend ratio of P1:P3HT, P2:P3HT and P3:P3HT gave optimal morphology in films for charge transport and correlates well with the observed device performances and their data are summarized in Table 3 . Fig. 5 AFM topographic (left) and phase (right) images of P1/P2/P3:P3HT blend films. Synthesis and characterization of monomers and polymers The synthetic approach toward the monomer, M1 is shown in Scheme 1 , whereas for M2 and M4 are shown in Scheme S1. †The synthesis of the target monomers 2,9-bis(7-bromo-9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2-yl)anthrax[2,1,9-def:6,510-d,e,f′]diisoquinoline-1,3,8,10(2 H ,9 H )tetraone (M1), 2,2′-(9,9-dioctyl-9 H -fluoren-2,7-diyl)bis(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane) (M2) and 4,7-bis(4-octylthiophen-2-yl)benzo[ c ]-1,2,5-thiadiazole (M4) were carried out as follows: in the first step bromination followed by alkylation of fluorene 1 in presence of N-bromosuccinimide (NBS) and n -octyl bromide, respectively, yielded 2-bromo-9,9-dioctylfluorene 2 (90%) which on nitration in the second step followed by reduction gave 2-amino-7-bromo-9,9-dioctylfluorene 4 in 74% overall yield. 40 Reaction of 4 with perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride in the presence of imidazole and anhydrous zinc acetate on heating at 160 °C under N 2 atmosphere resulted in M1 in 90% yield. Bromination of 1 in presence of bromine gave dibromofluorene which on alkylation with n -octyl bromide using tetrabutylammonium hydroxide at 80 °C gave 2,7-dibromo-9,9-dioctyl-9 H -fluorene 5 in 90% yield. 45 Reaction of 5 in presence of Pd(dppf)Cl 2 and potassium acetate with bis(pinacolato)diboron under N 2 atmosphere at 105 °C resulted in M2 (70% yield). Reaction of 7 with 6 in toluene/THF under N 2 atmosphere in presence of sodium carbonate, Pd(PPh 3 ) 4 and tetrabutylammonium hydroxide gave M4 in 80% yield. Scheme 1 Synthetic routes to design intermediates and monomer M1. The structures of intermediates and monomers (M1, M2 and M4) were confirmed by NMR, FT-IR spectroscopy and elemental analysis. MALDI-TOF MS and UV-vis spectroscopy were also carried out to characterise M1. In the aromatic region of the 1 H NMR spectrum of M1, there are two doublets of equal intensity at 8.73 and 8.61 ppm, which correspond to protons of the PDI unit. The presence of two doublet (7.83 and 7.61 ppm) and two multiplet (7.51–7.49 and 7.37–7.33 ppm) signals of equal intensity can be attributed to the two fluorene moieties attached to PDI unit. The disappearance of NH 2 protons from intermediate 4 and the slight shift in the chemical shift of perylene protons compared to perylene dianhydride, further confirm the structure. The aliphatic region of the 1 H NMR spectrum constitute the signals of the alkyl substituents on the fluorene moieties and the ratio between integrated intensities of aromatic and aliphatic regions of the spectrum is consistent with the proposed structure of M1 (Fig. S1 †). In 13 C NMR spectrum of M1, the C Created by potrace 1.16, written by Peter Selinger 2001-2019 O peaks of the PDI unit appear at 162.1 ppm. The presence of 17 signals in the down field region in the range of 152.4–119.4 ppm correspond to 44 different aromatic carbon atoms and the signals in the range of 54.6–13.1 ppm account for the different aliphatic carbon atoms of the alkyl chains attached to the fluorene moieties confirming the structure of M1 (Fig. S2 †). The FT-IR spectrum of M1 clearly shows the presence of characteristic aromatic C–H stretching appearing at 2925 cm −1 , aliphatic C–H stretching appeared at 2852 cm −1 , O CN stretching at 1705 and 1664 cm −1 , C C stretching appeared at 1593 cm −1 and C–N stretching appeared at 1354 cm −1 and found similar as reported for other PDI derivatives. 46 The UV-vis spectrum of M1 ( Fig. 1 ) in THF, having three clearly distinguishable peaks in the region of 400–550 nm, which showed their absorption maxima at λ max = 455, 485 and 520 nm consistent with the reported absorption spectra of PDI based monomers. 47 The above peaks are found match with different vibrational modes (2 ← 0, 1 ← 0 and 0 ← 0, respectively) combined with the PDI main transition dipole moment, 48 which is lined up along the long axis of the molecule. The more direct and supporting evidence for M1 was obtained from the MALDI-TOF MS spectrum shown in Fig. S3, †where it can be seen that the experimental mass agrees well with the calculated mass. Fig. 1 Normalized absorbance spectrum of M1 in THF solution. The 1 H and 13 C NMR spectra of M2 and M4 are shown in Fig. S4–S7 †and found to be in agreement with reported literature although in this work, M2 and M4 were synthesized by modified procedures with improved yield. 43,44 N-substituted PDI based polymers P1 and P2 were synthesized by using Suzuki polymerization 49 whereas P3 was synthesized by direct arylation polymerization. 50 Their synthetic routes are outlined in Scheme 2 . The Suzuki polycondensation reaction of M1 with M2 or M3 in the presence of Pd(PPh 3 ) 4 , potassium carbonate and Aliquat 336 in mixture of toluene-water at 100 °C under N 2 atmosphere resulted in P1 (81% yield) and P2 (77% yield) respectively, whereas P3 was synthesized by direct arylation polymerization of M1 with M4 in presence of pivalic acid, palladium acetate and caesium carbonate using N , N -dimethylacetamide at 100 °C under N 2 atmosphere in 80% yield. The purifications of the synthesized polymers were carried out by precipitation in cold CH 3 OH than after Soxhlet extractions and finally reprecipitation from CH 3 OH. Scheme 2 Synthetic routes to design of polymers P1–P3. The polymeric structures of P1–P3 were confirmed with 1 H NMR and FT-IR spectroscopy and their 1 H NMR spectra are shown in Fig. S8–S10. †In 1 H NMR spectra of P1–P3, the peaks at 8.63–7.29 ppm correspond to the aromatic protons whereas the peaks at 2.62–1.15 ppm can be attributed to CH 2 groups of alkyl chain. The signals in the range of 0.83–0.76 ppm arise from terminal CH 3 of alkyl substituent. The 1 H NMR spectrum of P2 showed a singlet at 4.69 ppm confirming the presence of carbazole moiety in the polymeric chain. In P3, the signal at 7.18 ppm corresponds to aromatic protons of the benzothiadiazole moiety and at 2.62 ppm to the CH 2 protons directly attached to thiophene units. The measured proton intensities agree well with the structures of P1–P3. The molecular weights and dispersities of P1–P3 were determined by GPC against monodisperse polystyrene standards with THF as the eluent using the totalchrom software and their results are summarized in Table 1 . The GPC measurements indicate that these polymers have weight-averaged molecular weights ( M w ) of 14.77, 10.68 and 16.02 kg mol −1 with a narrow PDI of 1.53, 1.28 and 1.29 for P1, P2 and P3, respectively. The thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning colorimetry (DSC) studies were performed to determine the thermal properties of the polymers P1–P3 ( Table 1 ). DSC curves of polymers reveal that no transitions were observed during the heating and cooling cycles whereas TGA analysis shows the onset decomposition temperature ( T 5 ) higher than 380 °C at 5% weight loss. This suggested that the thermal stability of the polymers is sufficient for application in OSCs. The TGA graphs of the polymers are shown in Fig. S11. †The polymers P1–P3 are found to be soluble in chlorinated solvents as well as in toluene and THF. Molecular weights and thermal properties of polymers P1–P3 Polymers M w a (kg mol −1 ) M n b (kg mol −1 ) PDI c ( M w / M n ) T 5 d (°C) P1 14.77 9.66 1.53 381 P2 10.68 8.32 1.28 458 P3 16.02 12.42 1.29 380 a Weight-average molecular weight. b Number-average molecular weight. c Polydispersity index. d Onset decomposition temperature (5% weight loss). Optical properties The UV-visible absorption spectroscopy was performed in THF solution and thin film to understand the optical properties of polymers P1–P3. Fig. 2 shows the absorption spectra of all polymers whereas their related data are given in Table 2 . The polymers P1–P3 ( Fig. 2a ) exhibited their absorption maxima in the range of 300 to 520 nm in THF solution. In these ranges, two clearly defined absorption bands were noticed, the first between 300 to 352 nm and the second in the range of 510 to 520 nm. These absorption bands located at lower wavelength can be assigned to π–π* transitions from the conjugated backbones localized on the donor or acceptor, whereas the higher wavelength absorption band can be assigned to intramolecular charge transfer (ICT) transitions inherent to the D–A system. 51 While comparing to film spectra with solution, the absorption maxima were red shifted with broadened area owing to strong inter-chain interaction and π–π stacking in the solid state which are beneficial for charge transport. 52 The solution and film spectra of polymers have almost the same absorption maxima in the range of 502 to 520 nm and are very close to the monomer M1 due to the presence of the same PDI unit in all the polymers. Such close values in absorption maxima in monomer and polymers were also reported in other PDI based polymers. 53,54 The absorption spectra of the three polymers in film ( Fig. 2b ) showed absorption maxima at near infrared (NIR) region, 951 nm for P1, 954 nm for P2 and 784 nm with a shoulder at 878 nm for P3. These absorptions at NIR region are relatively broad and weak in the range of 750 to 1000 nm and can be attributed to ICT between D–A units and simultaneously can increase the number of photons absorbed under solar radiation. The use of an OPV material that absorbs light in the NIR region and even above 1000 nm could increase the efficiency of devices in OSC applications. 55 In the film spectrum, the absorption maximum at 520 nm of P3 was found to be slightly red shifted by ca . 10 nm as compared to solution indicating good intermolecular ordering in the solid state. 56 The optical band gaps ( E opt g ) of all the polymers were estimated from λ edge of the thin film absorption spectra and found to be in the range of 1.80–2.08 eV. The absorption intensity and optical band gap value of P3 are observed to be higher than those of P2 which may be due to the incorporation of carbazole unit into the polymer backbone of P2 leading to enhanced conjugation. 57 Further the presence of bulky octyl substituents in the thiophene units probably twist atom induce the main chain of P3 leading to decrease coplanarity and intramolecular conjugation in solid state of the polymer. 58 All the polymers displayed comparable optical band gap values with literature values as reported for N-substituted PDI based alternating copolymers containing thiophene (2.0 eV), 36 oligothiophene (1.63–1.97 eV) 59 and phenylenevinylene (1.66 eV) units. 32 The narrower band gaps of P1–P3 can be assigned to well organised and planar structure of the conjugated polymers. Fig. 2 Normalized absorbance spectra of P1, P2 and P3 (a) in THF solution and (b) films. Optical and electrochemical properties of polymers P1–P3 Polymers λ max a (nm) E opt g (eV) b ( λ edge /nm) c Energy levels (eV) Solution Film E HOMO d E LUMO e P1 339, 519 341, 502, 951 2.08 (597) −5.66 −3.58 P2 352, 520 354, 516, 954 1.80 (688) −5.37 −3.57 P3 300, 510 329, 520, 784, 878 1.88 (660) −5.50 −3.62 a UV-vis absorption maxima in THF solution and film. b Optical band gap E opt g = 1240/ λ edge . c Onset of thin films absorption spectra. d Calculated by equation HOMO = E opt g + LUMO (eV). e Calculated from the onset reduction potential. Electrochemical properties The cyclic voltammetry (CV) studied were carried out to investigate the electrochemical properties of the polymers P1–P3 using films on a glassy carbon working electrode (made by drop casting of their concentrated solution in CHCl 3 ) in CH 3 CN solution having [ n Bu 4 N] + [ClO 4 ] − (0.1 mol L −1 ) as electrolyte at a scan rate of 50 mV s −1 . The voltammograms are shown in Fig. 3 and the results are summarized in Table 2 . The highest occupied molecular orbital (HOMO) and lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) energy levels were calculated by combining both absorption spectroscopy and CV. The LUMO energy levels were calculated from the first reduction onset potential using as reported equation E LUMO = −e ( E red + 4.4) eV and the HOMO energy levels were determined by E opt g plus LUMO energy levels. 60 Fig. 3 Cyclic voltammetry curves of polymers P1–P3. As displayed in Fig. 3 , all the polymers show one or two reversible or quasi-reversible reduction and oxidation waves. The HOMO energy levels were calculated to be in the range of −5.37 to −5.66 eV for P1–P3, which are in remarkably good compliance with the ideal range of HOMO energy levels for achieving high air stability and high open-circuit voltage ( V oc ) in OSCs. 61 In comparison to the HOMO energy level of P3 (−5.50 eV), P1 and P2 (−5.66 and −5.37 eV, respectively) exhibit high lying and low lying HOMO energy levels by ca . 0.16 eV and 0.13 eV, respectively. The LUMO energy levels were calculated as −3.58 eV for P1, −3.57 eV for P2 and −3.62 eV for P3. The LUMO energy levels of P1 and P2 are almost comparable whereas P3 has slightly high lying LUMO energy level which can be due to the combined effect of two thiophene and one benzothiadiazole units. The HOMO and LUMO energy levels of P1–P3 are found to be comparable with that of alternating phenylenevinylene polymer with PDI unit (HOMO and LUMO energy levels at −5.75 and −3.95 eV, respectively), which has shown one of the highest efficiency (PCE upto 2.32%) reported for N-substituted PDI based polymers. 32 The comparable LUMO energy level values of P1–P3 illustrate that they can be used as n-type materials in OSCs. Organic solar cell applications BHJ solar cell devices were fabricated by blending the polymers P1–P3 and P3HT with the device configuration of ITO/PEDOT:PSS/polymer:P3HT/Al and a pixel area of 0.04 cm 2 (for detail, see device fabrication) where PEDOT:PSS was used to modify the ITO electrode and to act as a hole-transporting layer. P3HT was used as the donor and N-substituted PDI based polymers P1–P3 as the acceptor to design the photoactive layers. DCB was used as a processing solvent since it was reported to afford the perfect quality of blended films. 62 The OSC device performance was optimized in three different binary compositions of P1/P2/P3:P3HT weight ratios i.e. 1 : 1, 1.5 : 1 and 2 : 1 to achieve best PCE. The current density versus voltage ( J – V ) curves of the OSCs fabricated with the optimized D : A ratio are shown in Fig. 4 and their corresponding open-circuit voltage ( V oc ), short-circuit current ( J sc ), fill factor (FF) and PCE are listed in Table 3 . The photovoltaic performances of PSCs are greatly influenced by film morphology of P1–P3 and P3HT since the data from photovoltaic studies reveal that the 1 : 1 weight ratio of P1/P2/P3:P3HT blends exhibit higher PCEs (0.82%, 1.22% and 1.96%, respectively) in comparison to other weight ratios i.e. 1.5 : 1 and 2 : 1 blends (PCEs ranges from 0.23 to 1.11%), suggesting a further increase of polymer content and decrease of P3HT content in the photoactive layer had an unfavourable impact on both J sc and FF resulting in an overall decrease in PCE. The high polymer and low P3HT content in blend films probably attributed to the improper thickness of photo-active layer leading to higher current leakage, which in turn account for the poor photovoltaic performances observed in devices. The relatively better performance of 1 : 1 P1/P2/P3:P3HT blends can be due to more favourable film morphology and proper thickness of the active layers with smoothened surface having lower rms values (1.79, 1.67 and 0.65 nm, respectively). The PCE for the binary 1 : 1 film of P3:P3HT blend device reached upto 1.96% (highest among all devices in all tested ratios) with V oc of 0.55 V, J sc of 10.12 mA cm −2 and a FF of 34.63%. In comparison, P1:P3HT/P2:P3HT devices (for ratio 1 : 1) showed PCEs of 1.22/0.82%, V oc of 0.59/0.49 V, J sc of 6.70/6.43 mAcm −2 and FF of 25.83/30.81%, respectively. The higher efficiency obtained with P3 based device can be attributed to higher J sc and FF owing to better conjugation and broader absorption spectrum of polymer. J sc ideally correlates with the energetic difference between HOMO–LUMO energy levels of D–A segments of blend films and consequently relates to the exciton dissociation. Comparing OPV devices constructed with 1 : 1 weight ratio, P3 blend shows a higher J sc of 10.12 mA cm −2 relative to P1 and P2 ( J sc of 6.70 and 6.43 mA cm −2 , respectively) analogues and hence higher value of exciton dissociation which could be the reason for higher PCE in P3 based OSC. However in the present study, the V oc , J sc , FF and PCE show a linear trend with all the tested weight ratios of P1/P2/P3:P3HT blend films, since these photovoltaic device properties are influenced by other features such as molecular structure, charge transport and the surface morphology of the blended films as well. Even though the device performances of the N-substituted PDI based polymers were low, these are comparable to some of the previously reported for the BHJ photovoltaic devices based on a blend of tris(thienylenevinylene)-substituted polythiophene and poly[perylene diimide- alt -bis(dithienothiophene)]. 63 The PCEs of these devices are less than that reported for blend device of alternating phenylenevinylene copolymer with PDI unit and a poly(3-phenylhydrazonethiophene) donor, which resulted a PCE of 2.32%. The improvement was attributed to thermal annealing of the blend film which initiate the fine mixing morphology of two components and the higher hole mobility in the films. 32 However, the lower PCE in our devices in comparison to the above reported device efficiency is primarily restricted by the low values of V oc and FF. The low values of FF of our devices can be attributed to the electron traps present in polymer phase which contributes to the recombination losses. The high FF values of the solar cell devices can be achieved by better fabrication or design with proper selection of device engineering strategies, 64,65 improving morphology of photoactive layer with controlled thermal treatment 66 and proper selection of processing additives. 67 It was reported that additives are useful to enhance the miscibility between two components of the photoactive layer and found necessary for optimizing photovoltaic device performances by increasing FF. 68 The PCEs obtained for N-substituted PDI based polymers are limited of their application in OSCs due to reduced exciton dissociation efficiency and/or increased charge recombination. Therefore, further experiments are in progress to improve the photocurrent for OSCs to achieve better PCE by modifying the structure as well as improving the surface morphology of the blend films. Fig. 4 J – V curves of the OSCs based on (a) P1:P3HT and (b) P2:P3HT and (c) P3:P3HT. Photovoltaic properties of polymers P1–P3 Polymers Ratio J sc (mA cm −2 ) V oc (V) FF (%) PCE (%) Roughness (rms) Polymer : P3HT P1 1 : 1 6.43 0.49 25.83 0.82 1.79 P1 1.5 : 1 5.82 0.51 24.79 0.74 2.34 P1 2 : 1 5.21 0.45 24.03 0.57 2.85 P2 1 : 1 6.70 0.59 30.81 1.22 1.67 P2 1.5 : 1 3.94 0.60 21.26 0.51 2.43 P2 2 : 1 1.62 0.66 21.41 0.23 2.90 P3 1 : 1 10.12 0.55 34.63 1.96 0.65 P3 1.5 : 1 6.32 0.56 31.22 1.11 1.44 P3 2 : 1 5.98 0.55 24.21 0.80 2.66 Morphological studies The surface morphology of the photoactive layer in the BHJ solar cells was found to be an important aspect to control the charge carrier transport into blend films and impact on the performance of OSCs. 69 To further understand the different photovoltaic performance of PSCs based on P1/P2/P3:P3HT blend films, atomic force microscopy (AFM) studies were carried out to investigate the morphology of the active layers using tapping mode. Fig. 5 shows topographic images and phase images for P1:P3HT, P2:P3HT and P3:P3HT blend films in DCB solution for 1 : 1 weight ratio whereas other topographic images and phase images for remaining 1.5 : 1 and 2 : 1 weight ratios are given in Fig. S12. †The root-mean-square (rms) roughnesses of these films measured from topographic images are in range of 0.65 to 2.90 nm. In all AFM images, we observed a phase-separated interpenetrating network with sizable P3HT domains. Some of phase-separation are important and necessary for systematic formation of free carriers to generate optimal photovoltaic properties of PSCs. 70 The phase images of P1:P3HT, P2:P3HT and P3:P3HT blend films in the ratio of 1 : 1 are quite different (rms roughness 1.79, 1.67 and 0.65 nm, respectively) and revealed that the P3HT domains in the P3:P3HT blend film were smaller than those in the P1:P3HT and P2:P3HT blend films, indicating better compatibility between the P3HT and polymer in case of P3. This can be attributed to the high solubility and feasible solution processability of thiophene–benzothiadiazole–thiophene 71 containing polymer P3 which may allow easier incorporation of P3HT into polymer matrix. Among all blend films, more uniform morphology (rms 0.65 nm) with lower defect density and larger aggregation domains was observed for P3:P3HT blend film in 1 : 1 ratio, which is favourable to electron transport leading to the highest PCE 1.96% with highest FF value (34.63%). However, the P1/P2/P3:P3HT blend films in the ratio of 1 : 1 each showed more intermixed, smooth and homogeneous morphology in comparison to 1.5 : 1 and 2 : 1 blend films. The blend films with weight ratios of 1.5 : 1 and 2 : 1 show higher rms values ranges from 1.44 to 2.43 nm and ranges from 2.66 to 2.90 nm, respectively and therefore exhibit larger domain size resulting in ineffective exciton dissociation and lower PCE. The phase images (Fig. S12 †) of P1/P2/P3:P3HT blend films having weight ratios of 1.5 : 1 and 2 : 1 also support the above assertion. However, the distribution of P3HT units in the polymer for P1/P2/P3:P3HT blend films was less uniform for 1.5 : 1 and 2 : 1 ratio as the polymer content is increased (weight% of polymer are 60% and 66.67%, respectively) and in respect of polymer the P3HT content decreased (weight% of P3HT are 40% and 33.33%, respectively), the films became more coarser owing to poor solubility, high molecular stacking and electrostatic interactions resulting in self-aggregation of polymers with reduced compatibility with P3HT. 72 The 1 : 1 blend ratio of P1:P3HT, P2:P3HT and P3:P3HT gave optimal morphology in films for charge transport and correlates well with the observed device performances and their data are summarized in Table 3 . Fig. 5 AFM topographic (left) and phase (right) images of P1/P2/P3:P3HT blend films. Conclusions In the present work, an efficient and facile route was developed to synthesize the new N-substituted PDI based monomer M1. Three novel N-substituted PDI based low band gap polymers P1, P2 and P3 were synthesized by using palladium catalysed polycondensation reactions for organic solar cell applications. The structures of M1 and the newly designed polymers were confirmed by NMR, FT-IR and UV-vis spectroscopy. Polymers were further characterized by CV and GPC. The polymers exhibit good solubility in common organic solvents and thermal stability with T 5 higher than 380 °C at 5% weight loss. The absorption spectra of P1–P3 were broad and extended up to about 954 nm in to the NIR region with shorter wavelength maxima in the range of 502 to 520 nm and E opt g in the range of 1.80–2.08 eV. GPC studies revealed that all the polymers have good molecular weight ( M w ) ranging from 10.68 to 16.02 kg mol −1 . From cyclic voltammetric studies, it was found that the HOMO energy levels ranged from −5.37 to −5.66 eV whereas the LUMO energy levels ranged from −3.57 to −3.62 eV. P1/P2/P3:P3HT based BHJs were fabricated in three different weight ratios i.e. 1 : 1, 1.5 : 1 and 2 : 1 by solution processing and it was found that the weight ratio of 1 : 1 for binary P3:P3HT blend is the most optimal system and showed a J sc of 10.12 mA cm −2 , a V oc of 0.55 V and FF of 34.63% with an PCE of 1.96% which is among the highest reported for PDI based BHJ solar cells. Further, the high polymer and low P3HT content in blend films adversely affect the film morphology of the photo-active layer resulting in charge recombination and current leakage owing to micro-phase separation and aggregation of polymer which in turn lead to low photovoltaic performances of PSCs based on 1.5 : 1 and 2 : 1 weight ratio. Conflicts of interest There are no conflicts of interest to declare. Supplementary Material RA-008-C8RA05232H-s001

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3713824/

Pandemic Influenza Planning, United States, 1978–2008

During the past century, 4 influenza pandemics occurred. After the emergence of a novel influenza virus of swine origin in 1976, national, state, and local US public health authorities began planning efforts to respond to future pandemics. Several events have since stimulated progress in public health emergency planning: the 1997 avian influenza A(H5N1) outbreak in Hong Kong, China; the 2001 anthrax attacks in the United States; the 2003 outbreak of severe acute respiratory syndrome; and the 2003 reemergence of influenza A(H5N1) virus infection in humans. We outline the evolution of US pandemic planning since the late 1970s, summarize planning accomplishments, and explain their ongoing importance. The public health community's response to the 2009 influenza A(H1N1)pdm09 pandemic demonstrated the value of planning and provided insights into improving future plans and response efforts. Preparedness planning will enhance the collective, multilevel response to future public health crises. Historical Background Influenza pandemics occur when an animal influenza virus to which humans have no or limited immunity acquires the ability, through genetic reassortment or mutation, to cause sustained human-to-human transmission leading to community-wide outbreaks ( 1 ). The existence of a pandemic is currently determined by the extent of disease spread, not by the lethality of the disease caused by the novel virus ( 2 ). During the twentieth century, influenza pandemics occurred in 1918, 1957, and 1968. The 1918 pandemic, known as the "Spanish flu" pandemic, was unique in that the highest number of deaths was among young, healthy persons. Excess mortality in the United States during the 1918 pandemic was estimated at 546,000 deaths ( 3 ). The pandemics in 1957 and 1968, although associated with death rates greater than those for seasonal influenza epidemics ( 3 ), were far less devastating than the 1918 pandemic. Before 1976, public health planning for pandemics primarily occurred in response to detection of a novel influenza virus. This reactive mode continued despite the framework outlined in 1960 by US Surgeon General L.E. Burney for responding to the next pandemic. That framework involved recognition of the pandemic (i.e., surveillance), manufacture and distribution of vaccine, and identification of research needs ( 4 ). Large-scale infectious disease response planning may have been hampered by the tacit assumption that the government's public health resources were better directed to other priorities. In January 1976, a novel swine-origin influenza virus emerged among soldiers at Fort Dix, New Jersey ( 5 ); 1 soldier died, and an estimated 230 were infected. The emergence of influenza virus of swine origin at Fort Dix led to the decision to mount a national immunization program ( 6 ). The following events occurred subsequent to this decision: Congress funded vaccine production and liability indemnification of manufacturers, vaccine was produced, a mass immunization campaign commenced, and 45.65 million persons were vaccinated in the United States ( 7 ). Initial fears that the virus would cause a pandemic did not materialize: sustained transmission did not occur outside of Fort Dix. The vaccination campaign began in October 1976 and was halted in December because of initial reports of a rare association between the so-called "swine flu" vaccine and Guillain-Barré syndrome; the association was later confirmed ( 7 ). An influential policy review of the "swine flu affair" (i.e., the campaign to immunize the US population against a possible epidemic) identified several critical needs for future planning: 1) a more cautious approach to interpreting limited data and communicating risk to the public, 2) greater investment in research and preparedness, 3) clearer operational responsibilities within the federal government, 4) clear communication between planners at all levels of government, 5) strengthened local capacity for plan implementation, and 6) improved mechanisms for program evaluation ( 8 ). In November 1977, separate from the Fort Dix outbreak, a strain of human influenza A(H1N1) virus reemerged in the former Soviet Union, northeastern China, and Hong Kong, China, even though the virus had not circulated since 1957. This strain primarily affected young persons, and caused mild illness ( 9 ). The virus was found to be closely related to a 1950 A(H1N1) strain but dissimilar to the 1957 strain, suggesting that this 1977 outbreak strain had been preserved since 1950 ( 9 ). The confluence of fears of a possible pandemic in 1976 followed by the reemergence of a new strain of circulating seasonal influenza virus in 1977 led to focused pandemic planning efforts in the United States. The primary purpose of this article is to describe US pandemic planning during 1978–2008, just before the onset of the influenza A(H1N1)pdm09 pandemic in April 2009. We believe that understanding the historical and policy context within which the A(H1N1)pdm09 pandemic occurred is helpful in assessing the implications of pandemic planning for responses to future pandemics and for ongoing infectious disease preparedness efforts. Sources We conducted searches of the medical literature and key websites (e.g., www.pandemicflu.gov ) for peer-reviewed manuscripts and published governmental plans relevant to pandemic planning during 1978–2008. We also consulted authors' personal files and the Internet for records of speeches, national and international conference proceedings, and other unpublished original source documents. In addition to published survey data concerning local and state response planning ( 10 , 11 ), we sought unpublished data from the Association of State and Territorial Health Officials, the National Association of County and City Health Officials (NACCHO), and the Council of State and Territorial Epidemiologists (CSTE). Chronology of US Pandemic Planning A historical overview of key milestones in US pandemic planning is provided in the Table . In 1977, a federal interagency working group on influenza was formed at the request of the deputy assistant secretary for health in the Department of Health, Education, and Welfare, partly in recognition of the need for greater cooperation across government "silos." The interagency group included representatives from the Center for Disease Control (CDC; renamed Centers for Disease Control and Prevention in 1992), the National Institutes of Health, the Food and Drug Administration (FDA), and the Department of Defense. Under CDC leadership, the work group drafted the first US pandemic plan, which was released in 1978 and included recommendations for annual influenza immunization of persons at high risk, strengthening of surveillance, expanding research, and establishing a planning and policy mechanism ( 12 ). Table Timeline of selected key events in pandemic planning, United States, 1978–2008 Year Event Outcome or follow-up 1978 First US pandemic plan, drafted by Federal Interagency Working Group on Influenza Planning workgroup and its process assisted in strategy for addressing 1977–78 influenza A(H1N1) outbreak. 1983 Revision of 1978 US pandemic plan The revised plan laid groundwork for subsequent planning documents. 1988 Institute of Medicine report, The Future of Public Health* The report recognized the need to improve public health surveillance and response. 1992 Options for the Control of Influenza II meeting, Courchevel, France The meeting led to formation of the US Federal interagency Group on Influenza Pandemic Preparedness and Emergency Response in 1993. 1997 Publication of elements of the US pandemic preparedness plan in Journal of Infectious Disease The report updated the action plan, and a further update was published in 2002 in Clinical Infectious Diseases. 1998 CDC emerging infectious disease strategic plan update†Pandemic influenza was noted as an emerging infection. 1999 Council of State and Territorial Epidemiologists survey data published Enhanced influenza surveillance was recognized as a cornerstone of pandemic preparedness. 1999 World Health Organization Guidelines for Regional and National Planning The World Health Organization strongly recommended all countries establish National Pandemic Planning Committees. 2001 Anthrax-related bioterrorism in the United States The federal response increased state/local preparedness funding. 2003 Severe acute respiratory syndrome outbreaks worldwide The outbreak led to a globally coordinated response to emerging respiratory pathogens. 2003 Initial detection of human avian influenza A(H5N1) cases in China and Vietnam The outbreak enhanced attention to pandemic preparedness by Department of Health and Human Services and the US government, accompanied by additional funding. 2005 Department of Health and Human Services pandemic strategic plan The plan engendered multiple subsequent high-level policy documents and plans from the US government. 2006 Implementation plan for the national strategy for pandemic influenza This plan led to action steps and a timeline for all pandemic planning pillar areas. 2007 Pandemic influenza vaccine allocation guidance‡ This document preceded the 2009 influenza A(H1N1)pdm09 vaccine recommendations * http://iom.edu/Reports/1988/The-Future-of-Public-Health.aspx †www.cdc.gov/mmwr/PDF/rr/rr4715.pdf ‡ www.flu.gov/images/reports/pi_vaccine_allocation_guidance.pdf The plan was revised in 1983 to include a new recommendation to develop means to distribute and use influenza antiviral drugs (R.A. Strikas, pers. comm.). Even before completion of the pandemic plan, participants of a 1977 conference on influenza, held by the secretary of the Department of Health, Education, and Welfare, recommended continued federal support for influenza vaccination, particularly to increase vaccination levels of persons at high risk, to improve pandemic preparedness. In addition, CDC implemented a federally funded seasonal influenza immunization program, which purchased 3.4 and 2.4 million vaccine doses for the 1978–79 and 1979–80 influenza seasons, respectively, of which ≈1 million and >1.4 million doses, respectively, were administered. Initial plans were to purchase 8–9 million doses of vaccine. However, budget constraints limited vaccine purchases and ended the program after 1980 ( 13 , 14 ). The next major event leading to further US pandemic planning was 1986 legislation creating the National Vaccine Program Office (NVPO), which was given a mandate to coordinate federal vaccine-related activities. At the Options for the Control of Influenza II meeting held in 1992, a consensus report identified the core components of pandemic preparedness: surveillance, vaccines, antiviral drugs, nonmedical/personal hygiene measures, communications, and enhanced annual seasonal influenza vaccination programs ( 15 ). In 1993, NVPO formed the federal interagency Group on Influenza Pandemic Preparedness and Emergency Response (GrIPPE). The group, which included nonfederal consultants and representatives from CDC, FDA, the National Institutes of Health, and the Department of Defense, drafted a pandemic planning framework that was published in 1997 ( 16 ) and updated by federal staff in 2002 ( 17 ). The GrIPPE-initiated planning documents emphasized the need for enhancements to influenza surveillance, vaccine production and distribution, antiviral drugs, influenza research, and emergency preparedness. Perhaps the most consequential outcome of GrIPPE was the creation of a core group of public health experts dedicated to pandemic planning. Global events helped accelerate interest in pandemic planning. In 1997, Hong Kong recorded the first outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infections in humans. Virus was transmitted from infected chickens directly to humans, and 6 of 18 persons with confirmed infection died. In late 1997, >1.5 million chickens were culled throughout Hong Kong as part of successful efforts to stem the outbreak ( 18 ). This event, combined with the 2003 reemergence of A(H5N1) virus, led to concerns that the next pandemic would be caused by spread of A(H5N1) virus through Asia into Africa and Europe. In the United States, despite the crucial role of state and local authorities in implementing pandemic plans, a 1995 CSTE survey indicated that 40 state and local health officials convened in September 1996 in Atlanta and identified 4 "pillars" deemed most critical for state and local pandemic preparedness efforts: 1) surveillance, 2) vaccine delivery, 3) communication and coordination, and 4) emergency response. From this meeting and subsequent subgroup meetings dedicated to the 4 pillar areas, critical elements of draft state and local guidelines were developed by January 1997. Four states (Connecticut, Missouri, New Mexico, and New York) and 1 local area (East Windsor Township, New Jersey) were selected by the state Project Steering Committee—primarily on the basis of the identification of a key project leader within each jurisdiction—and funded to pilot test the draft guidelines; 1 additional state, Maine, volunteered to test the draft guidelines without CSTE support. These 5 states conducted pilot tests during February and March 1998 and submitted results to CSTE. Findings were discussed on April 7–8, 1998, at a meeting in Atlanta. The major outcomes from pilot testing were the following recommendations: 1) a fifth pillar area, guidance for use of antiviral drugs, should be added to the guide; 2) the format of the guidelines should be more in concert with the national plan ( 18 ); and 3) all states should receive the revised guidelines to enable development of state-specific plans (R.A. Strikas, pers. comm.). These 3 issues were discussed at the Association of State and Territorial Health Officials/NACCHO annual meeting in September 1998 and incorporated into the state and local pandemic influenza planning guidelines (R.A. Strikas, pers. comm.), which were then further revised. California, Maryland, Minnesota, and South Carolina were funded through CSTE to develop state plans and submitted their model plans in April 2000. A national pandemic influenza steering committee was subsequently formed; it was comprised of immunization program managers, emergency preparedness personnel, and representatives from CDC, CSTE, NACCHO, and the Association of Public Health Laboratories ( 19 ). A national steering committee was a logical extension as the planning process moved from a federal to a national effort. In 2000, federal funding increased the number of states engaged in pandemic plan development. Florida, Indiana, Massachusetts, New Hampshire, and New Jersey were funded to complete plans by March 2001. In January 2001, Kansas, Washington, Nebraska, Connecticut, and New York were funded to develop plans by March 2002 ( 11 ). Throughout this process, all states received the same nominal level of funding support, which was typically used to convene a statewide stakeholders meeting. Elements critical to the planning process included technical support provided by the national steering committee and the identification of a key public health professional within each state who assumed responsibility for leading and coordinating planning efforts. Arkansas, Arizona, and Oregon concurrently developed plans of their own accord; West Virginia, Tennessee (1999), and Pennsylvania (1999) had already developed plans. Ultimately, funds were sought for every state to develop a plan. At this early stage in the planning process, the importance of disseminating information to the broader public health community was recognized. On February 25, 1999, and July 13, 2000, CDC presented satellite videoconferences on influenza pandemic preparedness for states and local areas, which were viewed by >7,000 and ≈6,000 participants, respectively. State and local public health staff engaged in development of pandemic plans participated in the broadcasts. At a meeting of state and local planners sponsored by CSTE and CDC in Atlanta on September 12–13, 2000, detailed discussions were held regarding 1) a scenario of how an influenza pandemic might affect states in 2001; 2) how states should enhance surveillance; 3) how vaccination priorities should be determined, and 4) other national and federal pandemic planning issues, such as infection control, patient triage, and antiviral drug usage (R.A. Strikas, pers. comm.). After the September 11, 2001, terrorist attacks on the United States, public health preparedness emerged as a priority of the federal government. In 2001, bioterrorism emergency funding support was provided to all states to assist in the nation's response to the anthrax attacks. The 2003 reemergence of avian influenza A(H5N1) infections in humans fundamentally altered the scale of pandemic preparedness. As the A(H5N1) virus spread to more countries in East and Southeast Asia during 2004–2005, concern grew among senior policymakers and public health experts that the world was on the verge of an influenza pandemic. A(H5N1) infection in humans primarily resulted from exposure to ill poultry and had a case–fatality rate of ≈60%. Substantial federal funding was provided for federal-level planning, procurement of countermeasures (e.g., vaccines and antiviral drugs), development of countermeasures, and state and local pandemic preparedness efforts ( 20 ). State health departments eventually received $550 million to prepare for an influenza pandemic. Additional high-level policy engagement by the US federal government included the National Strategy for Pandemic Influenza, which was announced in November 2005 ( 21 ), and the White House's National Implementation Plan, which was published in May 2006 and addressed federal planning and response strategies: international transport and border control; protection of human and animal health; and security and continuity of operations issues ( 22 ). In 2006, the Biomedical Advanced Research and Development Authority (BARDA) was established within the Department of Health and Human Services in response to the growing need for a centralized effort to coordinate research, development, and procurement of countermeasures against potential natural or intentional public health emergencies ( 23 ). BARDA preparations for a possible A(H5N1) pandemic included development of a stockpile of influenza vaccines produced by using strains circulating in poultry and wild birds in Asia ( 24 ). In addition, the US government began to purchase influenza antiviral medications for the Strategic National Stockpile sufficient to treat 25% of the US population. Additional investments were initiated to procure ventilators and personal protective equipment, such as respirators. The US government also initiated an advanced development agenda for vaccines, therapeutics, and diagnostics. BARDA co-invested with industry to modernize vaccine production methods, with the 5-year aim of creating the capacity to produce sufficient vaccine to protect the entire US population within 6 months of the onset of an influenza pandemic ( 22 ). The US government invested in modernizing diagnostic technologies for public health laboratories. In September 2008, FDA approved specific PCR tests for a panel of influenza diagnostics to be used in CDC reference laboratories in the United States and Department of Defense laboratories around the world. This diagnostic test panel will detect and identify A(H5N1) infections and distinguish novel influenza virus infection from infection with seasonal A, B, and A(H1) and A(H3) influenza viruses. BARDA and CDC awarded contracts in November 2006 for development and evaluation of clinical point-of-care rapid diagnostics to identify seasonal influenza viruses and A(H5N1) viruses ( 25 ). Beginning with its first published pandemic plan in 1999 ( 26 ), the World Health Organization globally promoted pandemic planning among member states, with continued planning efforts thereafter ( 27 ). The International Partnership on Avian and Pandemic Influenza was formed to coordinate support for developing countries' efforts to control the spread of A(H5N1) virus and to prepare for an influenza pandemic. This international body convened a series of meetings beginning in January 2006; these efforts generated hundreds of millions of dollars in pledges to support global pandemic preparedness and promoted a level of visibility and readiness that would not otherwise have been possible. In addition to direct financial assistance, the US government provided technical assistance to help countries develop capacities for rapid response, laboratory diagnosis, and surveillance. The federal government recognized that the foundation for domestic pandemic response rests with state and local governments; thus, the 2005 Department of Health and Human Services strategy and the White House strategy and implementation plan called for major efforts in planning, exercising, and refining state and local preparedness. The 2006 Pandemic and All-Hazards Preparedness Act called for a review of comprehensive state pandemic preparedness plans. The federal government reviewed and scored the plans and released the results to the public in January 2009 ( 28 ); preparedness levels varied across states and across the domains that were scored. In 2008, as part of its local health profile survey, NACCHO queried local health departments about emergency preparedness and planning activities they had undertaken during the past year ( 29 ): 89% of 2,332 responding health departments said they had developed or updated pandemic influenza preparedness plans, and 86% said they had participated in tabletop drills or exercises. In addition, 76% had updated their written response plan on the basis of a postexercise after-action report, 72% had participated in a functional drill, and 49% had participated in a full-scale drill or exercise. A total of 68% of local health departments had reviewed existing state legal authorities for isolation and quarantine, and 46% had assessed the emergency preparedness competencies of staff. Only 1% of local health departments did none of the above. Evolution of the Pillars of Pandemic Preparedness The 4 pandemic planning pillars—surveillance, vaccine and antiviral drug delivery, emergency response, and communication—are a solid foundation for pandemic preparation. Although state pandemic plans may have different structures, reliance on these pillars has remained more or less constant across jurisdictions and over time. The major contemporary developments in these core areas are summarized below. Surveillance, including rapid detection of human infection with novel influenza viruses, remains a cornerstone of pandemic response. This need has been recognized since the early stage of state- and local-based planning ( 10 ). Improvements in diagnostic technology have enabled confirmation of infection with novel influenza viruses within hours rather than weeks. Human infection with a novel influenza virus became a nationally notifiable disease in 2007, and since then, an increased number of infections have been detected ( 30 ). Virologic surveillance is also used to determine which seasonal viruses are circulating and thus provides information for seasonal vaccine strain selection. Systems to measure the effect of seasonal influenza (i.e., pediatric deaths, hospitalizations, and syndromic surveillance) have also been enhanced. These systems have been further adapted to measure the effect of pandemic influenza ( 31 ). The need to maintain ongoing surveillance for novel influenza viruses (e.g., viruses of swine or avian origin) in humans and animals exemplifies the One Health concept ( 32 ). In recognition that vaccine might be in short supply during the early phase of a pandemic, federal vaccine allocation guidelines were published in 2008 ( 33 ). These guidelines laid the groundwork for the pandemic vaccine priority-group recommendations put forth during the 2009 A(H1N1)pdm09 pandemic ( 34 ). Antiviral medications are critical to a pandemic response, particularly in the interval between recognition of the pandemic and the availability of vaccine. Plans for using these countermeasures have stressed the need for early treatment of affected persons and assumed that the drugs would be scarce. It was recognized at the 1996 CSTE meeting that close coordination between emergency response staff and public health authorities is needed to develop and implement effective state and local influenza response plans. This recognition has strengthened over time. Although, states were initially not allowed to use bioterrorism funds awarded in 2001 to support pandemic planning, key emergency management concepts, including the all-hazards approach and unified incident command, were eventually integrated into planning efforts ( 35 ). Communication, more than ever, is a fundamental component of any response effort. Timely, transparent, and proactive communication is critical, paticularly in the early stages of a confirmed or suspected outbreak, when factual information is limited and the public demand for information and guidance is high. Continuous media coverage and the evolving role of social media ( 36 ) must be used to enhance communication to and from the public, particularly concerning new or evolving recommendations for disease control. Conclusions Pandemic planning since 2005 had a direct and obvious effect on the response to the 2009 influenza A(H1N1)pdm09 pandemic; however, pandemic preparedness has been a feature of public health since the late 1970s. Coordinated state and federal planning processes have been a consistent feature of that planning. The pillars of pandemic planning response have remained conceptually constant: surveillance; vaccination and delivery of other medical countermeasures; emergency response coordination; and communications. Although the 2009 A(H1N1)pdm09 pandemic spread globally within a matter of weeks, a 1918-like pandemic did not materialize. Nonetheless, this most recent pandemic resulted in ≈12,500 deaths in the United States, ≈90% of which occurred in persons <65 years of age ( 37 ). In the wake of this pandemic, the challenge in preparedness is to sustain the interest of private and public sectors in planning for a large-scale outbreak that may have a much more severe effect at a time that cannot be predicted. Recent assessments of state level epidemiology capacity revealed potentially critical gaps in personnel and training needed for a rapid response to an epidemic ( 38 ). There will be a need for continued commitments to support state, local, and national planning for the next infectious disease emergency. A comprehensive, coordinated, and effective response cannot be built at the time of a crisis. For future planning and response efforts, sufficient resources are required to sustain the public health response infrastructure developed during the past decade. An effective response to a pandemic requires at least 4 distinct elements. First, material resources, such as vaccines, antiviral drugs, and personal protective equipment are essential. Second, a commitment to planning, exercising, and refining plans is necessary. Third, a sufficiently large and robustly trained workforce is the basis of any response. Fourth, a commitment to improvement is crucial. This concept extends from continuously improving plans and training to ensuring that scientific advances are incorporated into procurement and planning. One of the main lessons from the history of influenza is to expect the unexpected. Plans and training should be flexible and designed to respond to various levels of disease severity or newly identified pathogens. Benefits from pandemic preparedness will enhance our collective public health response to the next infectious disease crisis.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2213032/

Anthrax toxins suppress T lymphocyte activation by disrupting antigen receptor signaling

Anthrax is an infection caused by pathogenic strains of Bacillus anthracis , which secretes a three-component toxic complex consisting of protective antigen (PA), edema factor (EF), and lethal factor (LF). PA forms binary complexes with either LF or EF and mediates their entry into host cells. Although the initial phases of bacterial growth occur in the lymph node, the host fails to mount an effective immune response. Here, we show that LT and ET are potent suppressors of human T cell activation and proliferation triggered through the antigen receptor. Both LT and ET inhibit the mitogen-activated protein and stress kinase pathways, and both toxins inhibit activation of NFAT and AP-1, two transcription factors essential for cytokine gene expression. These data identify a novel strategy of immune evasion by B. anthracis , based on both effector subunits of the toxic complex, and targeted to a key cellular component of adaptive immunity. Results AND Discussion Commitment to T cell activation is characterized by the temporally regulated expression of genes encoding proteins that include transcription factors, cell surface receptors, and cytokines. The end of the commitment phase is marked by expression of IL-2 and IL-2R, which initiate an autocrine proliferation loop resulting in clonal expansion of antigen-specific T cells ( 16 ). To determine the effect of LT or ET on T cell activation, human PBLs were treated for 6 h with PA or PA in combination with varying amounts of LF or EF. After washing, cells were stimulated by TCR/CD3 ligation for 16–24 h. Trypan blue exclusion showed that neither toxin affected cell viability to a significant extent, even at the highest concentration used (not depicted). Surface expression of CD69, an early activation marker, and of CD25, the high affinity subunit of the IL-2 receptor, was measured by flow cytometry. Both LT and ET inhibited the expression of both CD69 ( Fig. 1 A) and CD25 ( Fig. 1 B) in a dose-responsive fashion. No effect was observed when cells were treated with PA, LF, or EF alone (not depicted). The specificity of these activities was confirmed by using selective inhibitors of LF and EF. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), a specific LF inhibitor ( 17 ), and adefovir dipivoxil, a specific EF inhibitor ( 18 ), selectively reversed the effect of LF and EF, respectively ( Fig. 1 C and not depicted). Remarkably, when LT and ET were used together at the lowest concentration, which alone affected only weakly CD69 expression, a significant inhibition was observed, indicating a synergism of the two toxins ( Fig. 1 D). The effect of anthrax toxins on cytokine production was assessed by quantitating the levels of IFN-γ, IL-2, IL-5, and TNFα in the culture supernatants of cells treated as described before and incubated for 30 h. As shown in Fig. 1 E, both LF and EF profoundly inhibited cytokine expression, further underlining the suppressive effect of anthrax toxins on T cell activation. Figure 1. Anthrax toxins suppress T cell activation. Flow cytometric analysis of CD69 (A) or CD25 (B) expression on PBLs activated for 16–24 h by CD3 cross-linking in the presence or absence of 200 ng/ml PA and the indicated concentrations of either LF or EF. (C) CD69 expression on PBLs activated for 16 h by CD3 cross-linking in the presence or absence of 200 ng/ml PA and 10 ng/ml LF or EF, in combination with 10 μM EGCG or 5 μM adefovir dipivoxil. EGCG or adefovir dipivoxil alone did not affect CD69/CD25 expression either on quiescent or activated cells (not depicted). The inhibitory effect of LF on CD69/CD25 expression was not affected by adefovir dipivoxil, nor the effect of EF by EGCG (not depicted). (D) CD69 expression on PBLs activated for 16 h by CD3 cross-linking in the presence or absence of 200 ng/ml PA and 10 ng/ml LF or 10 pg/ml EF, either alone or in combination. Representative experiments are shown ( n ≥ 3). (E) Quantitation of cytokines (pg/ml) in the supernatants of PBLs activated for 30 h by CD3 cross-linking in the presence or absence of 200 ng/ml PA and the indicated concentrations of LF or EF (μg/ml) ( n = 2). Error bars, SD. Long-term effects of the anthrax toxins on T cell proliferation were assayed by flow cytometric analysis of PBLs treated with LT or ET for 6 h and loaded, after washing, with the fluorescent vital dye, CFSE, which binds irreversibly to cellular proteins, followed by activation by TCR/CD3 cross-linking. TCR-dependent T cell proliferation was first detectable 48 h after activation (not depicted) and, by 72 h, a significant proportion of T lymphocytes was dividing, with up to three rounds of division. LT, and to an even larger extent ET, markedly inhibited cell proliferation ( Fig. 2 ). Figure 2. Suppression of T cell proliferation by anthrax toxins. Flow cytometric analysis of CFSE-labeled PBLs stimulated for 72 and 96 h by CD3 cross-linking (α-CD3) in the presence or absence of 200 ng/ml PA and 10 ng/ml (LF10, EF10) or 1 ng/ml (LF1, EF1) LF or EF. CFSE fluorescence was analyzed on gated CD3 + cells. CFSE staining in unstimulated CD3 + cells is shown as an unshaded histogram. The percentage of CD3 + cells having undergone proliferation is indicated. Data from a representative experiment are shown ( n ≥ 3). For each experiment, proliferation was monitored at 24, 48, 72, 96, 120, and 148 h. LF cleaves MAPKKs, including MEK1/2 and MKK3/4/6/7 ( 6 – 8 ), which are the intermediate members of the MAP and stress kinase cascades initiated by the small GTPases Ras and Rho/Rac/cdc42, respectively ( 19 ). Cleavage occurs within the NH 2 -terminal proline-rich region preceding the kinase domain, thus disrupting a sequence involved in the protein–protein interactions required for activation of their downstream MAPK targets ( 20 , 21 ). The effect of LT on the integrity and activation of MEK1/2 was assessed. PBLs were treated for 6 h with either LT or ET, washed, and activated by TCR/CD3 cross-linking for 5 min. Cells were lysed, and postnuclear supernatants were subjected to immunoblot analysis using anti-MEK1/2 antibodies. Fig. 3 A shows that PBL treatment with LT resulted in the conversion of MEK1/2 to a higher electrophoretic mobility form consistent with removal of a NH 2 -terminal, ∼800 Da fragment. ET had no effect, and the shift in apparent MW was inhibited by EGCG, which blocks the proteolytic cleavage of MEKs by LF ( 17 ), but not by adefovir dipivoxil ( Fig. 3 A and not depicted). In agreement with these results, immunoblot analysis of the stripped filters with an antibody that specifically recognizes the NH 2 terminus of MEK2 showed that the MEK2-specific immunoreactivity was significantly reduced in LT-treated PBLs, but not in PBLs treated with LT in the presence of EGCG, nor in ET-treated PBLs (not depicted). Probing the same lysates with antibodies against phosphorylated, active MEK1/2 showed that MEK1/2 phosphorylation was not impaired by LT ( Fig. 3, A and G ), consistent with the fact that MAPKK cleavage does not affect the site of interaction with Raf, its upstream kinase, nor its phosphorylation sites ( 22 ). Furthermore, Ras activation was not affected, as shown by pulldown assays using a GST-Raf fusion, which interacts with GTP-bound, active Ras ( Fig. 3 B). Alternatively, activation of Erk, the MAPK downstream of MEK, was profoundly inhibited by LT. This effect was selectively reversed by EGCG, but not by adefovir dipivoxil ( Fig. 3, C and G , and not depicted). Furthermore, in agreement with the capacity of LF to cleave a wide panel of MAPKKs ( 8 ), activation of the stress-kinases JNK and p38, which is mediated by MKK4/7 and MKK3/6, respectively ( 19 ), was also blocked by LT ( Fig. 3, D, E, and G ). Figure 3. Anthrax toxins disrupt MAP and stress kinase activation. Immunoblot analysis of postnuclear supernatants from PBLs activated for 5 min by CD3 cross-linking (α-CD3) in the presence or absence of 0.2–2 μg/ml PA and 1–10 μg/ml LF or EF, in combination with 10 μM EGCG or 5 μM adefovir dipivoxil. Immunoblots were performed with antibodies against the phosphorylated, active forms of MEK (A), Erk (C), JNK (D), or p38 (E). Filters were stripped and reprobed with anti-MEK (A), Erk (C), tubulin (D), or p38 (E) antibodies. Arrows indicate the full-length and cleaved forms of MEK (A). The inhibitory effects of LF were not affected by adefovir dipivoxil, nor the effect of EF by EGCG (not depicted). Neither EGCG nor adefovir dipivoxil had any effect on MAP or stress kinase activity in untreated, nonstimulated or anti-CD3–stimulated cells (not depicted). Representative experiments are shown ( n ≥ 3). (B, left) Immunoblot analysis using anti-Ras mAb of in vitro binding assays to agarose-bound GST-Raf of postnuclear supernatants from PBLs activated as described before in the presence or absence of 200 ng/ml PA and 10 μg/ml LF. Total cell lysates separated on the same gel are shown (right). (F) Quantitation of cAMP in lysates of PBLs treated with 2 μg/ml PA and 1 μg/ml EF, in the presence or absence of 5 μM adefovir dipivoxil. Error bars, SD. (G) Densitometric analysis of data from multiple experiments on the effects of LT and ET on Erk, JNK, p38, and MEK phosphorylation, in the absence or presence of EGCG or adefovir dipivoxil. The results are shown as the percentage of the phosphorylation levels of each kinase in anti-CD3–stimulated PBLs (100%) after normalization to the respective controls. Interestingly, although ET did not affect the integrity of MEK1/2, it significantly reduced its activation ( Fig. 3, A and G ), as well as Erk activation ( Fig. 3, C and G ). PBL treatment with ET resulted in increased intracellular cAMP, which was blocked by adefovir dipivoxil ( Fig. 3 F). The PKA-dependent inhibitory effect of cAMP on the activation of Raf ( 23 ), the serine-threonine kinase upstream of MEK, is likely to underlie the inhibition of MEK activation by ET. MEK/Erk inhibition by ET was reversed by adefovir dipivoxil but not by EGCG ( Fig. 3, A, C, and G , and not depicted). These results highlight MEK as a point of convergence of the immunosuppressive activities of LT and ET. Of note, TCR-dependent JNK activation ( Fig. 3, D and G ), but not p38 activation ( Fig. 3, E and G ), was also impaired in cells treated with ET, suggesting a selectivity in the inhibitory activity of ET for specific MAP/stress-kinase cascades. MAP kinases link triggering of surface receptors to gene transcription ( 13 , 19 ). The transcription factor NFAT plays a crucial role in the transcriptional regulation of several cytokine-encoding genes, including the genes for IL-2 and IL-2R ( 24 ). NFAT is composed of a nuclear subunit, AP-1, which is activated by MAPKs, and a cytosolic subunit, which translocates into the nucleus to assemble with AP-1 after dephosphorylation by the phosphatase calcineurin. The latter is activated by the elevation in intracellular [Ca 2+ ] i triggered by TCR engagement ( 24 ). The effect of anthrax toxins on TCR-dependent NFAT activation was determined using a reporter Jurkat T cell line stably transfected with a construct encoding luciferase under the control of a trimer of the NFAT binding site on the IL-2 gene promoter. Consistent with the requirement for MAP and stress kinases in NFAT activation ( 24 , 25 ), LT inhibited NFAT–driven luciferase expression in a dose-dependent fashion, and this effect was prevented by EGCG ( Fig. 4 A). Inhibition of NFAT activation by LT resulted, at least in part, from AP-1 inhibition by the toxin, as shown in transient transfection experiments using an AP1/luciferase reporter ( Fig. 4 A). However, LT did not affect the Ca 2+ –calcineurin pathway. Indeed, LT had no effect on TCR-dependent NFAT translocation to the nucleus, as determined by confocal microscopy of Jurkat cells transiently transfected with a NFAT–GFP fusion ( Fig. 4 B). Furthermore, LT did not affect [Ca 2+ ] i flux triggered by TCR/CD3 ligation in PBLs (not depicted). Figure 4. Inhibition of TCR-dependent NFAT and AP-1 activation by anthrax toxins. (A) Relative luciferase activity in NF-AT/luciferase reporter Jurkat cells (left) or Jurkat cells transiently transfected with an AP-1/luciferase reporter (right), activated by CD3 cross-linking in the presence or absence of 200 ng/ml PA and the indicated concentrations of LF or EF and, where indicated, 10 μM EGCG. The data are expressed as percentage of luciferase activity induced by CD3 cross-linking (100%) ( n ≥ 3 for NFAT, n = 3 for AP-1). Error bars, SD. (B) Confocal microscopy of Jurkat cells transiently transfected with a NFAT/GFP expression construct, either unstimulated (0) or activated by CD3 cross-linking for 30 min, in the absence or presence of 200 ng/ml PA and 1 μg/ml LF or EF. Percentage of cells showing nuclear staining in a representative experiment were as follows: no activation, 0%; CD3XL, 72.5%; LT, 9.4%; ET, 4.0%; CD3XL + LT, 68.0%; CD3XL + ET, 71.9% (no. of GFP + cells scored ≥50). TCR-dependent NFAT activation was also inhibited by ET, albeit only at the highest dose used ( Fig. 4 A). This effect appears dependent on the capacity of ET to block Erk and JNK, which control AP-1 activation ( 19 ), as AP-1–driven luciferase expression was also inhibited by ET ( Fig. 4 A), whereas NFAT/GFP nuclear translocation was not affected by the toxin ( Fig. 4 B). Of note, a combination of PA with 10 ng/ml EF and 10 pg/ml LF, which alone did not affect NFAT–driven luciferase expression, resulted in significant inhibition of NFAT activation ( Fig. 4 A), indicating a synergism of the two toxins. Interestingly, as opposed to NFAT, AP-1 activation was inhibited also at lower ET concentrations ( Fig. 4 B). The lack of effect of ET on the activation of p38, which is implicated in the control of NFAT, but not AP-1 activity ( 25 ), is likely to underlie the different sensitivity of the two transcription factors to ET. The present results identify T lymphocytes as a novel cellular target of anthrax toxins and show that the intracellular activities of both LT and ET converge in these cells on the signaling cascade initiated by the TCR, resulting in suppression of cell activation and proliferation. Although the causal role of the anthrax toxic complex in the advanced phase of infection has been largely elucidated, the failure of the host to mount an effective immune response is as yet elusive. Adaptive immunity is initiated in the lymph node, where vegetative bacteria are released from infected macrophages and can be taken up by dendritic cells, processed, and presented to T cells. LT has been shown recently to interfere with MAPK signaling in dendritic cells, thereby suppressing their maturation and capacity to prime adaptive responses ( 12 ). The data reported here highlight T lymphocytes as direct cellular targets of both LT and ET. The two toxins cooperatively inhibit T cell activation at very low concentrations, similar to those expected in the early stages of infection. By suppressing the activation of both dendritic cells and T cells, which together are responsible for initiating adaptive immune responses, B. anthracis has evolved a highly effective strategy of immune evasion. MATERIALS AND METHODS Cells, reagents, and antibodies Cells included the T lymphoma Jurkat line and a stably transfected Jurkat line expressing luciferase under the control of a trimer of the distal NFAT binding site on the IL-2 promoter ( 26 ). PBLs were purified from the whole blood of healthy donors by density gradient centrifugation and subsequent depletion of monocytes by adherence. Phospho-specific antibodies recognizing the active forms of MEK1/2, Erk1/2, JNK, and p38, and anti-MEK1/2 antibodies were obtained from Cell Signaling Technology; anti-p38 and anti-Erk antibodies, as well as an anti-MEK2 antibody specific for its NH 2 terminus, were obtained from Santa Cruz Biotechnology, Inc.; antitubulin mAb was obtained from Amersham Biosciences. Fluorochrome-labeled anti-CD3, anti-CD69, and anti-CD25 mAb were obtained from Becton Dickinson. IgG from OKT3 (anti-CD3; American Type Culture Collection) hybridoma supernatants were protein G purified. Unlabeled secondary antibodies were from Cappel and peroxidase-labeled antibodies were obtained from Amersham Biosciences. Sepharose-conjugated GST-Raf and anti-Ras mAb were from Upstate Biotechnology. PA and LF were expressed and purified as described previously ( 27 ). The EF gene from the plasmid pMMA187 ( 28 ) was PCR amplified using the following primers: 5′-AAAGGATCCTCCATGAATGAACATTACACTGAG-3′ (forward) and 5′-AAAGAGCTCTTATTTTTCATCCATAATTTTTTGG-3′ (reverse). The PCR fragment obtained was digested with BamHI and SacI and inserted in pRSET A (Invitrogen). The cloned sequence was confirmed by DNA sequencing. The protein was expressed as NH 2 -terminal His-tag fusion in BL21 DE3 (Novagen Inc.) and purified by Ni-charged Hitrap chelating (Amersham Biosciences). EGCG was purchased from Sigma-Aldrich and adefovir dipivoxil was synthesized and supplied by Gilead Sciences Inc. Cells were plated at 5 × 10 6 cells/ml in RPMI 1640 supplemented with 7.5% FCS complete medium, added with LT and/or ET, and incubated at 37°C for 6 h. EGCG was preincubated with LT or ET for 15 min at 37°C before addition to the cells. Cells were preincubated with adefovir dipivoxil at 37°C for 2–6 h before addition of LT or ET. Activations, in vitro binding assays, immunoblots, luciferase assays, and cytokine and cAMP measurements For immunoblot and in vitro binding experiments, activations by TCR/CD3 ligation were performed by incubating cells with anti-CD3 mAb and secondary antibodies for 5 min at 37°C as described previously ( 29 ). For analysis of CD69/CD25 and luciferase expression, cells were activated by CD3 cross-linking on secondary antibody-coated plates ( 29 ) and processed for flow cytometry 16–24 h after activation. NFAT/luciferase reporter Jurkat cells were collected 16 h after activation and processed for luciferase assays ( 29 ). In vitro binding assays and immunoblots were performed as described previously ( 30 ) and quantitated by laser densitometry (Kodak Digital Science Electrophoresis Documentation and Analysis System 120). Intracellular cAMP was quantitated by enzyme-linked immunoassay (Biotrak EIA; Amersham Biosciences). Cytokines were measured using the Human Cytokine ELISA kit obtained from Bender MedSystems. Transfections, confocal microscopy, and flow cytometry Jurkat cells were transiently transfected with the plasmid pEGFP/NFAT-1D ( 31 ) or an AP-1/luciferase reporter using a modification of the DEAE/dextran procedure as described previously ( 29 ). Confocal microscopy was performed on a confocal microscope (Microsystems; Leica). CD3, CD69, and CD25 surface expression was quantitated by flow cytometry using fluorochrome-labeled mAb. Samples were processed using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson). T cell proliferation was measured by flow cytometric analysis of CFSE-labeled cells, counterstained with anti-CD3 mAb as described previously ( 30 ). Cells were analyzed 24–172 h after stimulation. Intracellular flux of calcium ions was measured as described previously ( 29 ) using FF-fluo-4 (Molecular Probes). Cells, reagents, and antibodies Cells included the T lymphoma Jurkat line and a stably transfected Jurkat line expressing luciferase under the control of a trimer of the distal NFAT binding site on the IL-2 promoter ( 26 ). PBLs were purified from the whole blood of healthy donors by density gradient centrifugation and subsequent depletion of monocytes by adherence. Phospho-specific antibodies recognizing the active forms of MEK1/2, Erk1/2, JNK, and p38, and anti-MEK1/2 antibodies were obtained from Cell Signaling Technology; anti-p38 and anti-Erk antibodies, as well as an anti-MEK2 antibody specific for its NH 2 terminus, were obtained from Santa Cruz Biotechnology, Inc.; antitubulin mAb was obtained from Amersham Biosciences. Fluorochrome-labeled anti-CD3, anti-CD69, and anti-CD25 mAb were obtained from Becton Dickinson. IgG from OKT3 (anti-CD3; American Type Culture Collection) hybridoma supernatants were protein G purified. Unlabeled secondary antibodies were from Cappel and peroxidase-labeled antibodies were obtained from Amersham Biosciences. Sepharose-conjugated GST-Raf and anti-Ras mAb were from Upstate Biotechnology. PA and LF were expressed and purified as described previously ( 27 ). The EF gene from the plasmid pMMA187 ( 28 ) was PCR amplified using the following primers: 5′-AAAGGATCCTCCATGAATGAACATTACACTGAG-3′ (forward) and 5′-AAAGAGCTCTTATTTTTCATCCATAATTTTTTGG-3′ (reverse). The PCR fragment obtained was digested with BamHI and SacI and inserted in pRSET A (Invitrogen). The cloned sequence was confirmed by DNA sequencing. The protein was expressed as NH 2 -terminal His-tag fusion in BL21 DE3 (Novagen Inc.) and purified by Ni-charged Hitrap chelating (Amersham Biosciences). EGCG was purchased from Sigma-Aldrich and adefovir dipivoxil was synthesized and supplied by Gilead Sciences Inc. Cells were plated at 5 × 10 6 cells/ml in RPMI 1640 supplemented with 7.5% FCS complete medium, added with LT and/or ET, and incubated at 37°C for 6 h. EGCG was preincubated with LT or ET for 15 min at 37°C before addition to the cells. Cells were preincubated with adefovir dipivoxil at 37°C for 2–6 h before addition of LT or ET. Activations, in vitro binding assays, immunoblots, luciferase assays, and cytokine and cAMP measurements For immunoblot and in vitro binding experiments, activations by TCR/CD3 ligation were performed by incubating cells with anti-CD3 mAb and secondary antibodies for 5 min at 37°C as described previously ( 29 ). For analysis of CD69/CD25 and luciferase expression, cells were activated by CD3 cross-linking on secondary antibody-coated plates ( 29 ) and processed for flow cytometry 16–24 h after activation. NFAT/luciferase reporter Jurkat cells were collected 16 h after activation and processed for luciferase assays ( 29 ). In vitro binding assays and immunoblots were performed as described previously ( 30 ) and quantitated by laser densitometry (Kodak Digital Science Electrophoresis Documentation and Analysis System 120). Intracellular cAMP was quantitated by enzyme-linked immunoassay (Biotrak EIA; Amersham Biosciences). Cytokines were measured using the Human Cytokine ELISA kit obtained from Bender MedSystems. Transfections, confocal microscopy, and flow cytometry Jurkat cells were transiently transfected with the plasmid pEGFP/NFAT-1D ( 31 ) or an AP-1/luciferase reporter using a modification of the DEAE/dextran procedure as described previously ( 29 ). Confocal microscopy was performed on a confocal microscope (Microsystems; Leica). CD3, CD69, and CD25 surface expression was quantitated by flow cytometry using fluorochrome-labeled mAb. Samples were processed using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson). T cell proliferation was measured by flow cytometric analysis of CFSE-labeled cells, counterstained with anti-CD3 mAb as described previously ( 30 ). Cells were analyzed 24–172 h after stimulation. Intracellular flux of calcium ions was measured as described previously ( 29 ) using FF-fluo-4 (Molecular Probes).

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1949399/

Bacillus anthracis secretome time course under host-simulated conditions and identification of immunogenic proteins

Background The secretion time course of Bacillus anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) during early, mid, and late log phase were investigated under conditions that simulate those encountered in the host. All of the identified proteins were analyzed by different software algorithms to characterize their predicted mode of secretion and cellular localization. In addition, immunogenic proteins were identified using sera from humans with cutaneous anthrax. Results A total of 275 extracellular proteins were identified by a combination of LC MS/MS and MALDI-TOF MS. All of the identified proteins were analyzed by SignalP, SecretomeP, PSORT, LipoP, TMHMM, and PROSITE to characterize their predicted mode of secretion, cellular localization, and protein domains. Fifty-three proteins were predicted by SignalP to harbor the cleavable N-terminal signal peptides and were therefore secreted via the classical Sec pathway. Twenty-three proteins were predicted by SecretomeP for secretion by the alternative Sec pathway characterized by the lack of typical export signal. In contrast to SignalP and SecretomeP predictions, PSORT predicted 171 extracellular proteins, 7 cell wall-associated proteins, and 6 cytoplasmic proteins. Moreover, 51 proteins were predicted by LipoP to contain putative Sec signal peptides (38 have SpI sites), lipoprotein signal peptides (13 have SpII sites), and N-terminal membrane helices (9 have transmembrane helices). The TMHMM algorithm predicted 25 membrane-associated proteins with one to ten transmembrane helices. Immunogenic proteins were also identified using sera from patients who have recovered from anthrax. The charge variants (83 and 63 kDa) of protective antigen (PA) were the most immunodominant secreted antigens, followed by charge variants of enolase and transketolase. Conclusion This is the first description of the time course of protein secretion for the pathogen Bacillus anthracis . Time course studies of protein secretion and accumulation may be relevant in elucidation of the progression of pathogenicity, identification of therapeutics and diagnostic markers, and vaccine development. This study also adds to the continuously growing list of identified Bacillus anthracis secretome proteins. Background The secretion time course of Bacillus anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) during early, mid, and late log phase were investigated under conditions that simulate those encountered in the host. All of the identified proteins were analyzed by different software algorithms to characterize their predicted mode of secretion and cellular localization. In addition, immunogenic proteins were identified using sera from humans with cutaneous anthrax. Results A total of 275 extracellular proteins were identified by a combination of LC MS/MS and MALDI-TOF MS. All of the identified proteins were analyzed by SignalP, SecretomeP, PSORT, LipoP, TMHMM, and PROSITE to characterize their predicted mode of secretion, cellular localization, and protein domains. Fifty-three proteins were predicted by SignalP to harbor the cleavable N-terminal signal peptides and were therefore secreted via the classical Sec pathway. Twenty-three proteins were predicted by SecretomeP for secretion by the alternative Sec pathway characterized by the lack of typical export signal. In contrast to SignalP and SecretomeP predictions, PSORT predicted 171 extracellular proteins, 7 cell wall-associated proteins, and 6 cytoplasmic proteins. Moreover, 51 proteins were predicted by LipoP to contain putative Sec signal peptides (38 have SpI sites), lipoprotein signal peptides (13 have SpII sites), and N-terminal membrane helices (9 have transmembrane helices). The TMHMM algorithm predicted 25 membrane-associated proteins with one to ten transmembrane helices. Immunogenic proteins were also identified using sera from patients who have recovered from anthrax. The charge variants (83 and 63 kDa) of protective antigen (PA) were the most immunodominant secreted antigens, followed by charge variants of enolase and transketolase. Conclusion This is the first description of the time course of protein secretion for the pathogen Bacillus anthracis . Time course studies of protein secretion and accumulation may be relevant in elucidation of the progression of pathogenicity, identification of therapeutics and diagnostic markers, and vaccine development. This study also adds to the continuously growing list of identified Bacillus anthracis secretome proteins. Background Bacillus anthracis is a Gram-positive spore-forming bacterium that is the etiologic agent of anthrax [ 1 ]. During the course of infection, the virulent spores germinate to become vegetative cells. The bacterium secretes two major virulence factors, the bipartite edema and lethal toxins that are encoded by plasmid pXO1 [ 1 - 3 ]. The common component of both toxins is the protective antigen (PA) which is not toxic by itself. PA binds a specific receptor on the host cells and translocates the edema factor (EF) and lethal factor (LF) inside the cells where they exert their damaging action. Transcription of the genes coding for these virulence factors has been shown to be coordinately induced by bicarbonate-CO 2 . High CO 2 tension is believed to simulate conditions encountered within the host [ 4 ]. In addition, the effect of temperature has been shown to be important for toxin production but not for production of antiphagocytic capsule, whose synthesis is encoded by genes on plasmid pXO2 [ 5 ]. Thus, when B. anthracis is cultured at 37°C in a bicarbonate-containing minimal medium, toxin production is enhanced. The composition and identification of B. anthracis extracellular proteins (secretome) has been the subject of recent proteomic studies [ 6 - 9 ]. In B. cereus , a close relative of B. anthracis , most of these secreted proteins include collagenases, phospholipases, hemolysins, proteases, and enterotoxins that are positively regulated by plcR [ 10 ]. However, a non-sense mutation inactivates a homolog of this gene in B. anthracis resulting in a significant reduction of these secreted proteins [ 1 , 11 , 12 ]. Using 2-DE and MALDI-TOF MS, Chitlaru et al . [ 6 ] have identified 64 extracellular proteins in a virulent B. anthracis strain, of which 50 exhibit export signal peptides. Thirty-one of these secreted proteins harbor features that are characteristic of virulence determinants suggesting that in addition to the "classic" lethal and edema toxins, a large number of proteins may be essential for B. anthracis virulence [ 6 ]. Additionally, in minimal medium under high CO 2 tension, the presence of the plasmids led to the enhanced secretion of 12 chromosome-encoded and 5 pXO1 encoded proteins. Ten of the chromosome-encoded proteins could not be detected in the absence of the plasmids. These results suggest distinct plasmid and chromosome CO 2 -dependent crosstalk mechanisms that modulate extracellular proteolytic activities. Likewise, Antelmann et al . [ 7 ] have identified 64 extracellular proteins in the non-virulent B. anthracis strain UM23C1-2 (pXO1 - /pXO2 - ), 29 of which were predicted to be secreted. The remainder of the extracellular proteins were predicted to be associated with the cell wall or the cytosol. Based on the nature of B. anthracis secretome, it was suggested that this organism is adapted to life in a protein-rich environment due to the presence of a variety of proteases, peptidases, peptide-binding proteins, as well as enzymes required for the metabolism of amino acids. It was also proposed that these secreted proteases and peptidases could be useful targets for the development of improved vaccines. In another study, Gohar et al . [ 8 ] compared the fully cured B. anthracis extracellular proteomes to two other members of the B. cereus group, B. cereus and B. thuringiensis , that were also cured of their plasmids. The secretomes of the three species included both cell wall and cytosolic proteins that are similar in all three species. However, whereas the extracellular proteins of B. cereus and B. thuringiensis contained a large number of secreted proteins such as degradative enzymes and toxins, those of B. anthracis contained only one secreted protein, a metalloprotease InhA1. These results are in contrast to those reported by Chitlaru et al . [ 6 ] and Antelmann et al . [ 7 ] where 31 and 29 secreted proteins were identified in the culture filtrate of fully cured B. anthracis cells, respectively. Using minimal medium under high CO 2 tension, a comparative analysis of the extracellular proteomes of three isogenic strains of B. anthracis that differed solely in their plasmid content was conducted by Lamonica et al . [ 9 ]. In this study, the use of SignalP for the prediction of cellular function and location of each protein indicated that most of the identified proteins were either cell wall-associated or cytoplasmic in the fully cured strain, RA3:00. The present study characterized the time course of protein secretion and accumulation in the culture of B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ). Secretion patterns at the different time points are due not only to differentially expressed proteins at various phases of exponential growth, but also to the accumulation of proteins in the culture and their stability therein. Particular focus was placed on the analysis of protein secretion during the exponential growth phase to preclude the identification of proteins that may have been caused by bacterial lysis. In addition, computer assisted comparative analysis using 2D Phoretix of the cytosol with the secretome at16 hr under induced conditions was performed. LC MS/MS was used as a complementary tool in identifying proteins that were not amenable to MALDI-TOF MS, significantly increasing the number of identified secreted proteins. The data from this analysis add to the growing list of identified proteins in the secretome database of B. anthracis and help in further identifying key pathways associated with virulence. Furthermore, immunogenic proteins, or the immunome, of the secretome were identified using sera from human patients infected with cutaneous anthrax. Identification of these immunodominant antigens is essential for development of more efficacious and safer vaccines against anthrax. Results Time course of protein secretion The extracellular proteomes of B. anthracis strain RA3R were analyzed at three time points during the exponential growth phase, i.e. , early (6 hr), mid (10 hr) and late log (16 hr) under induced, host-simulated conditions (Fig. 1 ). 2D Phoretix computer-assisted analysis of 2-DE average gels revealed that the number of protein spots increased from 54 spots at 6 hr to 308 spots at 10 hr and to 536 spots at 16 hr. (Figs. 2A–C ). In contrast, the number of protein spots at 16 hr under uninduced condition (Fig. 3 ) is only 178 or 33% of the total number under induced condition (Fig. 4 ). The S-layer proteins Sap (surface array protein) and EA1 (extractable antigen 1), PA, and enolase were the predominant proteins that increased in secretion (Fig. 5 ). Other highly expressed proteins include alkyl hydroperoxide reductase, chaperonin 60kDa, phosphoglycerate isomerase, sulfatase, manganese superoxide dismutase, and a zinc-binding lipoprotein. Figure 1 Growth curve for B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) in R medium under host simulated conditions (induced). Secretome proteins were harvested at time points 6, 10, and 16 hrs as indicated by the arrows. Figure 2 2-DE gel images of SYPRO Ruby-stained secretome proteins of toxigenic, non-encapsulated B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) from pH 4 to 7 at 6 hr (A), 10 hr (B) and 16 hr (C) after inoculation under conditions that simulate those found inside the host (induced), and (D) Western blot analysis of immunogenic extracellular proteins at 16 hr using sera from patients infected with cutaneous anthrax. Spot numbers refer to additional file 1 . Figure 3 Annotated 2-DE gel image of SYPRO Ruby-stained secretome proteins of B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) at 16 hr after inoculation under laboratory conditions (uninduced). Spot numbers refer to additional file 1 . Figure 4 Annotated 2-DE gel image of SYPRO Ruby-stained secretome proteins of B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) at 16 hr after inoculation under host simulated conditions (induced). Spot numbers refer to additional file 1 . Figure 5 Relative protein expression of differentially expressed extracellular proteins of B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) during exponential growth at 6 hr (green bars), 10 hr (red bars) and 16 hr (yellow bars), based on spot size and pixel intensity. The relative amount of each protein was determined using the 2D Phoretix software. The protein numbers refer to additional file 1 . Extracellular proteins A total of 275 proteins were identified in the extracellular proteome by a combination of MALDI-TOF MS and LC MS/MS (Fig. 3 / 4 , additional file 1 ). MALDI-TOF MS analysis has identified 52 proteins of which 47 were also identified by LC MS/MS analysis. In contrast, 270 proteins were identified by LC MS/MS. This indicates that the combined use of MALDI-TOF MS and LC MS/MS has significantly increased the total number of identified proteins in the extracellular proteome, which has also been observed in the analysis of the proteome of other bacteria such as Mycobacterium tuberculosis [ 13 ] and Brucella abortus [ 14 ]. The B. anthracis secretome proteins were also grouped into major cellular functions (Fig. 6 ). Half of all identified secretome proteins are involved in energy metabolism (17.8%), protein synthesis (10.9%), cellular structure (8.7%), or are hypothetical (13%). This distribution is significantly different from role category predictions of all genes theoretically encoded by B. anthracis . Some groups were overrepresented or underrepresented relative to the theoretical total B. anthracis proteome, where energy metabolism accounts for 5.2%, protein synthesis is 2.4%, cellular structure is 7.1%, and hypothetical proteins are 40.6% of all cellular proteins. The role category predictions of B. anthracis were obtained from The Institute for Genomic Research website [ 15 ]. Figure 6 Role category pie chart showing the percentage of all identified B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) secretome proteins in each role family. Some of the secretome proteins have metabolic functions that would typically place them in the cytoplasm. However, 2-DE secretome and cytosol subproteomes show distinct, significantly different patterns from another (Fig. 7 ). Using MALDI-TOF MS the protein spots in the cytosol were identified, the relative protein spot intensities analyzed, and their ratio to each other determined. These results were used for computer assisted comparison of cytosol and secretome 2-DE gels. Out of the 489 unique protein spots in the cytosol, 56 are more than two-fold up regulated, 84 are more than two-fold down regulated, and 177 proteins spots have no corresponding spot in the secretome (Fig. 7B ). If protein spots in the secretome were simply the result of cell lysis, not only should their relative position on the gel be the same between the cytosol and the secretome, but the ratio of the proteins to each other in each subproteome should be the same in both. The results show that two thirds of all protein spot positions as well as relative abundances are distinctively different between the cytosol and secretome. Therefore, cell lysis can be excluded as the major contributor to the protein accumulation in the secretome. The extracellular proteins were further analyzed using various bioinformatics software programs, such as SignalP, SecretomeP, PSORT, LipoP, TMHMM, and PROSITE for predicting protein secretion and localization. Figure 7 (A) 2-DE gel image of SYPRO Ruby-stained cytosol proteins of toxigenic, non-encapsulated B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) from pH 4 to 7 at 16 hr under induced conditions. (B) 2D Phoretix comparative analysis of the cytosol with the secretome at 16 hr under induced conditions. Proteins encircled in red are more than two fold up-regulated, proteins encircled in yellow are more than two fold down-regulated, proteins encircled in green are between these limits, and proteins encircled in blue are unmatched between the two sub proteomes. Classical Sec pathway A total of 53 proteins were predicted by SignalP to be secreted in the classical Sec pathway, which is characterized by the presence of a signal peptide [ 16 , 17 ] (additional file 1 ). Of the 53 proteins containing the signal peptides, 38 proteins have the cleavage site for signal peptidase I (SpI). These proteins are predicted to be secreted into the external environment, because they lack additional retention signals. However, 10 proteins have the cleavage site for signal peptidase II (SpII) and the retention signals for lipid anchors while three proteins were predicted to have transmembrane helices (TMH). These proteins are predicted to have an extracytoplasmic but cell-associated location. LipoP predictions discriminate between lipoprotein signal peptides, other signal peptides, and N-terminal membrane helices with 93% accuracy in Gram positive bacteria [ 18 ]. In contrast to LipoP, TMHMM predicted 25 integral membrane proteins with one to ten transmembrane helices [ 19 ] (additional file 1 ). TMHMM predicts transmembrane protein topology with a hidden Markov model with a 98% accuracy. Additional predictions using PROSITE identified several secreted proteins that are also know to be associated with the bacterial cell wall by S-layer homology domains or lipoprotein lipid attachment sites [ 7 , 20 ]. No cell wall associated proteins with LPXTG-motifs were found in the secretome. Despite its name, the LPXTG-motif cell wall anchor domain protein does not contain such a domain. In fact, it contains a NEAT domain that might be involved in the transport of iron. Alternative Sec pathway Twenty-three proteins were predicted by SecretomeP to be secreted by the non-classical Sec Pathway characterized by the lack of typical export signals [ 21 ]. In contrast to the predictions of SignalP and SecretomeP, PSORT [ 22 ] predicted 171 extracellular proteins, 7 cell wall-associated proteins, and 6 cytoplasmic proteins. Using the whole genome of B. anthracis , Binnewies et al . have calculated that the Bacillus anthracis Ames strain has 6% secreted proteins predicted using SecretomeP, 3% using LipoP, and 6% using SignalP [ 23 ]. Immunogenic extracellular proteins The main immunogenic proteins detected by 2-DE Western blot analysis using sera from humans infected with cutaneous anthrax include the 83 and 63 kDa charge variants of protective antigen (PA), followed by charge variants of enolase and transketolase (Fig. 2D ). The protective antigen produced in vivo has a molecular mass of 83 kDa and is subsequently cleaved by cell-associated protease activity resulting in a 63 kDa protein that binds the lethal factor to form lethal toxin [ 24 ]. Notably, 17 charge and mass variants of PA were detected. These include five charge variants of the 83 kDa PA isoforms, seven charge variants of the 63 kDa PA isoforms and five charge variants of the 37 kDa PA isoforms. Charge variants of PA have been reported previously. Their generation was due to the spontaneous deamidation of asparagine residues which is dependent on pH, temperature, primary sequence ("nearest neighbor" effect) and protein conformation [ 25 ]. Charge variants of enolase and transketolase were also noted. Enolase has also been reported previously as component of the B. anthracis spore [ 26 ] and as one of the immunodominant spore antigens [ 27 ]. Other minor immunogenic proteins were also detected by 2-DE Western blot analysis but were not identified. Time course of protein secretion The extracellular proteomes of B. anthracis strain RA3R were analyzed at three time points during the exponential growth phase, i.e. , early (6 hr), mid (10 hr) and late log (16 hr) under induced, host-simulated conditions (Fig. 1 ). 2D Phoretix computer-assisted analysis of 2-DE average gels revealed that the number of protein spots increased from 54 spots at 6 hr to 308 spots at 10 hr and to 536 spots at 16 hr. (Figs. 2A–C ). In contrast, the number of protein spots at 16 hr under uninduced condition (Fig. 3 ) is only 178 or 33% of the total number under induced condition (Fig. 4 ). The S-layer proteins Sap (surface array protein) and EA1 (extractable antigen 1), PA, and enolase were the predominant proteins that increased in secretion (Fig. 5 ). Other highly expressed proteins include alkyl hydroperoxide reductase, chaperonin 60kDa, phosphoglycerate isomerase, sulfatase, manganese superoxide dismutase, and a zinc-binding lipoprotein. Figure 1 Growth curve for B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) in R medium under host simulated conditions (induced). Secretome proteins were harvested at time points 6, 10, and 16 hrs as indicated by the arrows. Figure 2 2-DE gel images of SYPRO Ruby-stained secretome proteins of toxigenic, non-encapsulated B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) from pH 4 to 7 at 6 hr (A), 10 hr (B) and 16 hr (C) after inoculation under conditions that simulate those found inside the host (induced), and (D) Western blot analysis of immunogenic extracellular proteins at 16 hr using sera from patients infected with cutaneous anthrax. Spot numbers refer to additional file 1 . Figure 3 Annotated 2-DE gel image of SYPRO Ruby-stained secretome proteins of B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) at 16 hr after inoculation under laboratory conditions (uninduced). Spot numbers refer to additional file 1 . Figure 4 Annotated 2-DE gel image of SYPRO Ruby-stained secretome proteins of B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) at 16 hr after inoculation under host simulated conditions (induced). Spot numbers refer to additional file 1 . Figure 5 Relative protein expression of differentially expressed extracellular proteins of B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) during exponential growth at 6 hr (green bars), 10 hr (red bars) and 16 hr (yellow bars), based on spot size and pixel intensity. The relative amount of each protein was determined using the 2D Phoretix software. The protein numbers refer to additional file 1 . Extracellular proteins A total of 275 proteins were identified in the extracellular proteome by a combination of MALDI-TOF MS and LC MS/MS (Fig. 3 / 4 , additional file 1 ). MALDI-TOF MS analysis has identified 52 proteins of which 47 were also identified by LC MS/MS analysis. In contrast, 270 proteins were identified by LC MS/MS. This indicates that the combined use of MALDI-TOF MS and LC MS/MS has significantly increased the total number of identified proteins in the extracellular proteome, which has also been observed in the analysis of the proteome of other bacteria such as Mycobacterium tuberculosis [ 13 ] and Brucella abortus [ 14 ]. The B. anthracis secretome proteins were also grouped into major cellular functions (Fig. 6 ). Half of all identified secretome proteins are involved in energy metabolism (17.8%), protein synthesis (10.9%), cellular structure (8.7%), or are hypothetical (13%). This distribution is significantly different from role category predictions of all genes theoretically encoded by B. anthracis . Some groups were overrepresented or underrepresented relative to the theoretical total B. anthracis proteome, where energy metabolism accounts for 5.2%, protein synthesis is 2.4%, cellular structure is 7.1%, and hypothetical proteins are 40.6% of all cellular proteins. The role category predictions of B. anthracis were obtained from The Institute for Genomic Research website [ 15 ]. Figure 6 Role category pie chart showing the percentage of all identified B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) secretome proteins in each role family. Some of the secretome proteins have metabolic functions that would typically place them in the cytoplasm. However, 2-DE secretome and cytosol subproteomes show distinct, significantly different patterns from another (Fig. 7 ). Using MALDI-TOF MS the protein spots in the cytosol were identified, the relative protein spot intensities analyzed, and their ratio to each other determined. These results were used for computer assisted comparison of cytosol and secretome 2-DE gels. Out of the 489 unique protein spots in the cytosol, 56 are more than two-fold up regulated, 84 are more than two-fold down regulated, and 177 proteins spots have no corresponding spot in the secretome (Fig. 7B ). If protein spots in the secretome were simply the result of cell lysis, not only should their relative position on the gel be the same between the cytosol and the secretome, but the ratio of the proteins to each other in each subproteome should be the same in both. The results show that two thirds of all protein spot positions as well as relative abundances are distinctively different between the cytosol and secretome. Therefore, cell lysis can be excluded as the major contributor to the protein accumulation in the secretome. The extracellular proteins were further analyzed using various bioinformatics software programs, such as SignalP, SecretomeP, PSORT, LipoP, TMHMM, and PROSITE for predicting protein secretion and localization. Figure 7 (A) 2-DE gel image of SYPRO Ruby-stained cytosol proteins of toxigenic, non-encapsulated B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) from pH 4 to 7 at 16 hr under induced conditions. (B) 2D Phoretix comparative analysis of the cytosol with the secretome at 16 hr under induced conditions. Proteins encircled in red are more than two fold up-regulated, proteins encircled in yellow are more than two fold down-regulated, proteins encircled in green are between these limits, and proteins encircled in blue are unmatched between the two sub proteomes. Classical Sec pathway A total of 53 proteins were predicted by SignalP to be secreted in the classical Sec pathway, which is characterized by the presence of a signal peptide [ 16 , 17 ] (additional file 1 ). Of the 53 proteins containing the signal peptides, 38 proteins have the cleavage site for signal peptidase I (SpI). These proteins are predicted to be secreted into the external environment, because they lack additional retention signals. However, 10 proteins have the cleavage site for signal peptidase II (SpII) and the retention signals for lipid anchors while three proteins were predicted to have transmembrane helices (TMH). These proteins are predicted to have an extracytoplasmic but cell-associated location. LipoP predictions discriminate between lipoprotein signal peptides, other signal peptides, and N-terminal membrane helices with 93% accuracy in Gram positive bacteria [ 18 ]. In contrast to LipoP, TMHMM predicted 25 integral membrane proteins with one to ten transmembrane helices [ 19 ] (additional file 1 ). TMHMM predicts transmembrane protein topology with a hidden Markov model with a 98% accuracy. Additional predictions using PROSITE identified several secreted proteins that are also know to be associated with the bacterial cell wall by S-layer homology domains or lipoprotein lipid attachment sites [ 7 , 20 ]. No cell wall associated proteins with LPXTG-motifs were found in the secretome. Despite its name, the LPXTG-motif cell wall anchor domain protein does not contain such a domain. In fact, it contains a NEAT domain that might be involved in the transport of iron. Alternative Sec pathway Twenty-three proteins were predicted by SecretomeP to be secreted by the non-classical Sec Pathway characterized by the lack of typical export signals [ 21 ]. In contrast to the predictions of SignalP and SecretomeP, PSORT [ 22 ] predicted 171 extracellular proteins, 7 cell wall-associated proteins, and 6 cytoplasmic proteins. Using the whole genome of B. anthracis , Binnewies et al . have calculated that the Bacillus anthracis Ames strain has 6% secreted proteins predicted using SecretomeP, 3% using LipoP, and 6% using SignalP [ 23 ]. Immunogenic extracellular proteins The main immunogenic proteins detected by 2-DE Western blot analysis using sera from humans infected with cutaneous anthrax include the 83 and 63 kDa charge variants of protective antigen (PA), followed by charge variants of enolase and transketolase (Fig. 2D ). The protective antigen produced in vivo has a molecular mass of 83 kDa and is subsequently cleaved by cell-associated protease activity resulting in a 63 kDa protein that binds the lethal factor to form lethal toxin [ 24 ]. Notably, 17 charge and mass variants of PA were detected. These include five charge variants of the 83 kDa PA isoforms, seven charge variants of the 63 kDa PA isoforms and five charge variants of the 37 kDa PA isoforms. Charge variants of PA have been reported previously. Their generation was due to the spontaneous deamidation of asparagine residues which is dependent on pH, temperature, primary sequence ("nearest neighbor" effect) and protein conformation [ 25 ]. Charge variants of enolase and transketolase were also noted. Enolase has also been reported previously as component of the B. anthracis spore [ 26 ] and as one of the immunodominant spore antigens [ 27 ]. Other minor immunogenic proteins were also detected by 2-DE Western blot analysis but were not identified. Discussion The secretome of B. anthracis has been the subject of recent proteomic studies [ 6 - 9 ]. Interest in its study comes from the fact that several secreted proteins of B. anthracis are known virulence factors ( e.g. , PA, EF, LF). Other secreted proteins may potentially be involved in the adherence of the bacteria to host cells while some may be required for the suppression of the host's defense mechanisms. While several of the virulence proteins have been identified by recent proteomic studies [ 6 , 7 ], the time course of protein secretion by a toxigenic but non-encapsulated strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) under host simulated conditions has not been reported. In this study, the dynamics of secretion of several proteins were investigated at different time points during the exponential growth phase of B. anthracis . The same collection points have been used previously by Lamonica et al . [ 9 ] for the isolation of secretome proteins. Chitlaru et al . [ 6 ] and Antelmann et al . [ 7 ] isolated secretome proteins at analogous growth stages as well. As shown in Fig. 5 , the rate of protein secretion varies for each protein. It should be noted that at 6 hours, PA has the highest rate of secretion of all secreted proteins. Since PA is a major component of the anthrax toxin, its high secretion rate at this early time point confirms the critical role this protein plays during the onset of anthrax pathogenesis. Two other proteins that were detected in high abundance in the culture supernatant are the S-layer proteins, EA1 and Sap, both of which are components of the cell wall. Both proteins contain a signal peptide followed by three SLH (S-layer homology) anchoring domains and are considered major surface antigens. The amount of these two proteins was highest at the 16-hour time point compared to the other identified extracellular proteins. It has been previously described that Sap is sequentially replaced by EA1 [ 28 ]. This rapid S-layer turnover results in the release and spillover of these proteins into the secretome. Several of the secretome proteins have metabolic functions that would typically place them in the cytoplasm. This is similar to the results by Antelmann et al . [ 7 ] in which more than half of the identified secretome proteins were associated with the cell wall or cytosol. We also identified 25 proteins that were predicted to have transmembrane helices which would typically associate them to the cell wall. All but one of these proteins were predicted to be secreted by SignalP or SecretomeP and half of these proteins have also been identified before as a natural component of the secretome (see additional file 1 ). Extracellular accumulation of B. anthracis proteins Combined analysis using SignalP and SecretomeP of the B. anthracis secreted proteins indicated that 28% of the detected proteins are extracellular whereas 62% are predicted to be extracellular using PSORT. The remaining proteins were predicted to be cytoplasmic since they lacked known export signals or are cell-associated because they have membrane-anchoring or cell wall retention signals. Using LipoP, some of the proteins are predicted to be bound at the trans surface of the cytoplasmic membrane. Contrary to their predicted location, a number of proteins with retention signals for covalent or non-covalent attachment to the cell walls were also found in the extracellular environment. While bioinformatics tools are useful for predicting cellular function and localization, considerable variation exists in the number of proteins that were predicted to be extracellular, cytoplasmic, or membrane bound. This is expected because each of these bioinformatics tools uses different algorithms and assumptions in their predictions. Further empirical studies are therefore required to verify the precise location of proteins for which conflicting predictions are noted. Immunogenic extracellular proteins The use of sera from human patients infected with cutaneous anthrax confirmed the high immunogenicity of PA in the secreted proteins of the toxigenic but non-encapsulated B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ). Although several mass and charge variants of PA were detected, the most immunogenic are the 63 and 83 kDa charge variants. In addition to PA, the major component of AVA (anthrax vaccine adsorbed), enolase and transketolase were found to be highly immunogenic. AVA is an alum precipitate prepared from B. anthracis culture filtrates and is a licensed vaccine currently used to protect humans against anthrax. Enolase was also described previously as part of the AVA culture filtrate [ 29 ]. AVA preparations contain contaminating proteins whose benefits are not known, but the presence of the highly immunogenic enolase in this formulation might contribute to its protective immunity over a vaccine containing just PA. The membrane proteins Sap and EA1 were also found in the secretome by Chitlaru et al . [ 6 ] and Antelmann et al . [ 7 ] as the most abundant extracellular cell wall proteins. Both proteins were reported as major surface antigens and potential vaccine carriers in vivo [ 30 , 31 ]. EA1 and Sap are also major components of AVA [ 29 ] and are associated with a variety of functions ranging from evasion of host recognition, cell adhesion and resistance, and phagocytosis [ 1 , 32 , 33 ]. Interestingly no reactivity to these proteins was observed using sera from patients with subcutaneous anthrax infection. Overall fewer immunogenic proteins were detected using human sera from patients infected with cutaneous anthrax than in a recent study by Chitlaru et al . [ 30 ] who used experimentally challenged rabbit and guinea pig sera. There is a quantitative and qualitative difference between sera from recovering humans and sera from multiple challenged animals. Since with human sera enolase and transketolase were major immunogens beside PA, they might be promising candidates for next generation anthrax subunit vaccines besides the newly identified proteins using animal sera [ 30 ]. Extracellular accumulation of B. anthracis proteins Combined analysis using SignalP and SecretomeP of the B. anthracis secreted proteins indicated that 28% of the detected proteins are extracellular whereas 62% are predicted to be extracellular using PSORT. The remaining proteins were predicted to be cytoplasmic since they lacked known export signals or are cell-associated because they have membrane-anchoring or cell wall retention signals. Using LipoP, some of the proteins are predicted to be bound at the trans surface of the cytoplasmic membrane. Contrary to their predicted location, a number of proteins with retention signals for covalent or non-covalent attachment to the cell walls were also found in the extracellular environment. While bioinformatics tools are useful for predicting cellular function and localization, considerable variation exists in the number of proteins that were predicted to be extracellular, cytoplasmic, or membrane bound. This is expected because each of these bioinformatics tools uses different algorithms and assumptions in their predictions. Further empirical studies are therefore required to verify the precise location of proteins for which conflicting predictions are noted. Immunogenic extracellular proteins The use of sera from human patients infected with cutaneous anthrax confirmed the high immunogenicity of PA in the secreted proteins of the toxigenic but non-encapsulated B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ). Although several mass and charge variants of PA were detected, the most immunogenic are the 63 and 83 kDa charge variants. In addition to PA, the major component of AVA (anthrax vaccine adsorbed), enolase and transketolase were found to be highly immunogenic. AVA is an alum precipitate prepared from B. anthracis culture filtrates and is a licensed vaccine currently used to protect humans against anthrax. Enolase was also described previously as part of the AVA culture filtrate [ 29 ]. AVA preparations contain contaminating proteins whose benefits are not known, but the presence of the highly immunogenic enolase in this formulation might contribute to its protective immunity over a vaccine containing just PA. The membrane proteins Sap and EA1 were also found in the secretome by Chitlaru et al . [ 6 ] and Antelmann et al . [ 7 ] as the most abundant extracellular cell wall proteins. Both proteins were reported as major surface antigens and potential vaccine carriers in vivo [ 30 , 31 ]. EA1 and Sap are also major components of AVA [ 29 ] and are associated with a variety of functions ranging from evasion of host recognition, cell adhesion and resistance, and phagocytosis [ 1 , 32 , 33 ]. Interestingly no reactivity to these proteins was observed using sera from patients with subcutaneous anthrax infection. Overall fewer immunogenic proteins were detected using human sera from patients infected with cutaneous anthrax than in a recent study by Chitlaru et al . [ 30 ] who used experimentally challenged rabbit and guinea pig sera. There is a quantitative and qualitative difference between sera from recovering humans and sera from multiple challenged animals. Since with human sera enolase and transketolase were major immunogens beside PA, they might be promising candidates for next generation anthrax subunit vaccines besides the newly identified proteins using animal sera [ 30 ]. Conclusion The work presented here is the first description of the time course of protein secretion for B. anthracis grown under host-simulated conditions. The combined use of two types of mass spectroscopy led to the identification of 275 proteins and their secretion patterns during the exponential growth phase of B. anthracis . While the secretome contained several predictable proteins ( e.g . PA, LF, Sap, and EA1) many proteins were identified which would not be expected in the secretome such as proteins involved in energy metabolism and protein translation. The discovery of proteins in the secretome that are traditionally thought to be strictly cytosolic has often been assumed to result from contamination. However, this may not be true since cytosolic proteins, such as aldolase, enolase, elongation factor G, and various dehydrogenases, have also been detected in the secretome of group A streptococci [ 34 ], mycobacteria [ 35 , 36 ], and B. subtilis [ 37 ]. Some proteins may be cytoplasmic at one point of the cell cycle and secreted via pathways which are yet to be understood during other stages of the cell cycle. While prediction software are a good tool to characterize a large group of proteins, different algorithms give diverging results. It is far more difficult to accurately predict a precise location within a cell of non-classical secretory proteins than to recognize proteins which are secreted by a signal peptide. The ultimate proof is to empirically validate their results. This study helps to bridge the gap between pure in silico prediction and in vivo observation. This study also identified the major immunoreactive proteins of the B. anthracis secretome using 2-DE Western blot analysis from humans infected with the pathogen. These proteins included the expected PA as well as enolase and transkelolase. The immunoreactive secretome proteins contribute to the list of other B. anthracis immunogenic proteins that were idenfied in other subproteomes or life-stages of the infectious agent. This knowledge will ultimately lead to the development of a more-specific, safer, and highly efficacious vaccine against B. anthracis . In addition, the identification of early high abundance secretome proteins may aid in the development of detection and diagnostic kits for those cases, where the direct capture of the pathogen is not possible. Methods Bacterial strain and culture conditions An attenuated derivative strain of B. anthracis , RA3R (pXO1 + /pXO2 - ), was used. A loop was streaked on BHI agar overnight (16 hr) at 37°C. A single colony was transferred to 2 ml R medium [ 4 ] and approximately 1 ml of the resulting suspension was immediately transferred in 100 ml R medium supplemented with 0.25% [wt/vol] glucose. The flask was mixed gently and fitted with a BugStopper (Whatman Inc., Clifton, NJ) sterile venting closure. The culture was incubated at 37°C with shaking at 120 rpm for 5 to 6 hr. Following this growth period, 5 ml of the culture was transferred to a 250-ml sterile, vented, canted Falcon tissue culture flask containing 70 ml R medium with 0.25% [wt/vol] glucose and 0.85% [wt/vol] sodium bicarbonate. The composition of the R-medium in mg/l is: L-tryptophan, 35; glycine, 65; L-cystine, 25; L-tyrosine, 144; L-lysine, 230; L-valine, 173; L-leucine, 230; L-isoleucine, 170; L-threonine, 120; L-methionine, 73; L-aspartic acid, 184; sodium L-glutamate, 612; L-proline, 43; L-histidine-hydrochloride, 55; L-arginine-hydrochloride, 125; L-phenylalanine, 125; L-serine, 235; thiamine-hydrochloride, 1.0; CaCl 2 2H 2 0, 7.4; MgSO 4 H 2 0, 9.9; MnSO 4 H 2 0, 0.9; K 2 HPO 4 , 3,000; uracil, 1.4; and adenine sulfate, 2.1, pH 8.0. The culture was grown for 6 to 16 hr at 37°C under 5% CO 2 in a humid incubator according to Ristroph et al . [ 4 ] to simulate conditions encountered in the host. The pH at the end of the incubation period rises to pH 8.15. During this time the cells are in the exponential growth phase, between lag- and stationary- phase. Uninduced cultures were grown in R medium without the addition of sodium bicarbonate and without CO 2 supplementation. Preparation of extracellular protein fraction Culture filtrates (secretomes) were collected at 6 hr (early log phase), 10 hr (mid log phase), and 16 hr (late log phase) time points based on the growth curve for B. anthracis in R medium, as determined by OD 595 readings. The culture filtrates were centrifuged for 10 min and the supernatant containing the extracellular proteins was passed through a 0.45-μm filter to remove any suspended vegetative cells. The culture filtrates were concentrated using Jumbosep, Macrosep, and Microsep filters with a 10 kDa cutoff (Pall Inc., East Hills, NY). Ice-cold trichloroacetic acid (TCA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) was then added to a final concentration of 10% TCA (vol/vol), chilled on ice for 45 min, and then centrifuged for 45 min. The resultant pellet was washed with 3 ml acetone and centrifuged. The pellet containing the secretome proteins was resuspended in 100 μl of 7 M urea, 2 M thiourea, 1% 3-(4-heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl-dimethylammoniopropanesulfonate, and 40 mM Tris prior to IEF. The protein concentration of the extracellular protein extract was determined using the Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Bovine serum albumin was used as the standard for determination of protein concentration. 2-DE and Western blot analysis 2-DE was carried out with the ElectrophoretIQ3 system and following the manufacturer's protocols (Proteome Systems, Woburn, MA). One-hundred μg of proteins were separated by IEF on 11 cm (pH 4 to 7) linear IPG strips. After 12 hr rehydration, the following focusing parameters were applied: 50 μA per strip, linear voltage increase over 8 hr from 100 V to 10,000 V, and then held at 10,000 V for 10 hr. After IEF, IPG strips were equilibrated in equilibration buffer and applied onto a 6–15% gradient SDS-PAGE. Gels were electrophoresed for 1.5 hr at 500 V and stained with Sypro Ruby (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for gel analysis or with ProteomIQ Blue (Proteome Systems) for MALDI-TOF MS analysis. Four replicate 2-DE gels of each sample were used for computer analysis using Phoretix 2D Expression software (Nonlinear Dynamics) and MALDI-TOF MS. Following automatic spot detection on quadruple gels using Phoretix 2D Expression's detection algorithm, gels were manually warped and their common spots were matched to generate average gels. Immunoblotting was conducted according to Towbin et al . [ 38 ]. Proteins on 2-DE gels were transferred to PVDF membranes using Towbin buffer (0.025 M trisma base in 0.192 M glycine) with 20% methanol at 100 V for 30 min. After transfer, the PVDF membrane was washed twice for 5 min each in 0.01% Tween-20 in PBS (PBST) and blocked with 0.2% I-Block (Tropix, Bedford, MA) for 1 hr. To identify immunogenic proteins, the PVDF membranes were washed three times with PBST for 5 min and then probed with a 1:1000 dilution of sera pooled from patients who recovered from cutaneous anthrax. The PVDF membrane was washed three times with PBST and incubated with 1:5000 dilution of appropriate secondary antibody. Chemiluminescent signals were visualized using the Western Lightning reagents (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Corresponding sera from uninfected humans were used as controls (Cambrex, Charles City, IA). Three replicate blots were used for computer analysis using the Phoretix 2D Expression software to identify the immunogenic proteins. In-gel trypsin digestion and MALDI-TOF MS Protein spots were excised, washed, and trypsin digested from 2-DE gels according to manufacturer's instructions using the Xcise robotic workstation (Shimadzu Biotech, Columbia, MD). Briefly, gel plugs were washed with 50 mM ammonium bicarbonate and 50% acetonitrile (ACN), dried, and treated with 1.6 μg/ml of trypsin in 50 mM ammonium bicarbonate at 37°C overnight. Tryptic peptides were applied to a MALDI-TOF MS plate in a solution of 10 mg/ml alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 0.1% trifluoroacetic acid and 50% ACN. MS spectra were obtained using an Axima-CFR plus (Shimadzu Biotech) in a positive ion reflectron mode and analyzed against the theoretical spectra of B. anthracis strain Ames, using the Mascot Daemon software package (Matrix Science, Boston, MA). The search parameters were: maximum of one missed cleavage by trypsin, fixed modification of oxidation, charged state of + 1, and mass tolerance of ± 0.5 Da. Protein identification by LC MS/MS All LC MS/MS analyses were performed using an Agilent 1100 nanopump system coupled with a Vydac C18 reverse phase column (75 μM) (Agilent, Santa Clara, CA) and a QTRAP 2000 LC MS/MS system (Applied Biosystems, Foster City, CA) outfitted with a nanospray source and controlled with Analyst 1.4.1 software. Proteins were prepared for digestion using heat denaturation and a modified organic-aqueous digestion method as described before [ 14 ]. Each digested and desalted sample was re-suspended in 10 μl of Buffer A (95% water, 5% ACN, 0.1% formic acid). Each sample (7 μl) was loaded onto the LC MS/MS system and analyzed using an independent data acquisition method with the following parameters: single enhanced mass spectra (EMS, 500–1500 m/z) from which the three most intense peaks were subjected to an enhanced resolution, from which ions with a charge state of + 2 to + 4 were subjected to an enhanced product ion [EPI (MS/MS)] scan. Once the three most intense peaks were subjected to downstream analysis, they were ignored for a period of 60 sec. LC gradient was 5–60% Buffer B (95% ACN, 5% water, 0.1% formic acid) over 35 min. General parameter settings are as follows (curtain gas: 15.00, collision gas: High, ion spray: 2200 v, interface heater: on, declustering potential: 30, entrance potential: 10, collision energy: 10, rolling collision energy). All MS/MS data were searched against the theoretical spectra of B. anthracis Ames using the MASCOT software (Matrix Science). The search parameters used were: maximum of one missed cleavage by trypsin, fixed modification of oxidized methionine, charge state of + 2 and + 3, an MS tolerance of ± 1.2 Da and an MS/MS tolerance of ± 0.8 Da. Only protein identifications that met or exceeded the minimal MOWSE score of 22 were included in additional file 1 . Bacterial strain and culture conditions An attenuated derivative strain of B. anthracis , RA3R (pXO1 + /pXO2 - ), was used. A loop was streaked on BHI agar overnight (16 hr) at 37°C. A single colony was transferred to 2 ml R medium [ 4 ] and approximately 1 ml of the resulting suspension was immediately transferred in 100 ml R medium supplemented with 0.25% [wt/vol] glucose. The flask was mixed gently and fitted with a BugStopper (Whatman Inc., Clifton, NJ) sterile venting closure. The culture was incubated at 37°C with shaking at 120 rpm for 5 to 6 hr. Following this growth period, 5 ml of the culture was transferred to a 250-ml sterile, vented, canted Falcon tissue culture flask containing 70 ml R medium with 0.25% [wt/vol] glucose and 0.85% [wt/vol] sodium bicarbonate. The composition of the R-medium in mg/l is: L-tryptophan, 35; glycine, 65; L-cystine, 25; L-tyrosine, 144; L-lysine, 230; L-valine, 173; L-leucine, 230; L-isoleucine, 170; L-threonine, 120; L-methionine, 73; L-aspartic acid, 184; sodium L-glutamate, 612; L-proline, 43; L-histidine-hydrochloride, 55; L-arginine-hydrochloride, 125; L-phenylalanine, 125; L-serine, 235; thiamine-hydrochloride, 1.0; CaCl 2 2H 2 0, 7.4; MgSO 4 H 2 0, 9.9; MnSO 4 H 2 0, 0.9; K 2 HPO 4 , 3,000; uracil, 1.4; and adenine sulfate, 2.1, pH 8.0. The culture was grown for 6 to 16 hr at 37°C under 5% CO 2 in a humid incubator according to Ristroph et al . [ 4 ] to simulate conditions encountered in the host. The pH at the end of the incubation period rises to pH 8.15. During this time the cells are in the exponential growth phase, between lag- and stationary- phase. Uninduced cultures were grown in R medium without the addition of sodium bicarbonate and without CO 2 supplementation. Preparation of extracellular protein fraction Culture filtrates (secretomes) were collected at 6 hr (early log phase), 10 hr (mid log phase), and 16 hr (late log phase) time points based on the growth curve for B. anthracis in R medium, as determined by OD 595 readings. The culture filtrates were centrifuged for 10 min and the supernatant containing the extracellular proteins was passed through a 0.45-μm filter to remove any suspended vegetative cells. The culture filtrates were concentrated using Jumbosep, Macrosep, and Microsep filters with a 10 kDa cutoff (Pall Inc., East Hills, NY). Ice-cold trichloroacetic acid (TCA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) was then added to a final concentration of 10% TCA (vol/vol), chilled on ice for 45 min, and then centrifuged for 45 min. The resultant pellet was washed with 3 ml acetone and centrifuged. The pellet containing the secretome proteins was resuspended in 100 μl of 7 M urea, 2 M thiourea, 1% 3-(4-heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl-dimethylammoniopropanesulfonate, and 40 mM Tris prior to IEF. The protein concentration of the extracellular protein extract was determined using the Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Bovine serum albumin was used as the standard for determination of protein concentration. 2-DE and Western blot analysis 2-DE was carried out with the ElectrophoretIQ3 system and following the manufacturer's protocols (Proteome Systems, Woburn, MA). One-hundred μg of proteins were separated by IEF on 11 cm (pH 4 to 7) linear IPG strips. After 12 hr rehydration, the following focusing parameters were applied: 50 μA per strip, linear voltage increase over 8 hr from 100 V to 10,000 V, and then held at 10,000 V for 10 hr. After IEF, IPG strips were equilibrated in equilibration buffer and applied onto a 6–15% gradient SDS-PAGE. Gels were electrophoresed for 1.5 hr at 500 V and stained with Sypro Ruby (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for gel analysis or with ProteomIQ Blue (Proteome Systems) for MALDI-TOF MS analysis. Four replicate 2-DE gels of each sample were used for computer analysis using Phoretix 2D Expression software (Nonlinear Dynamics) and MALDI-TOF MS. Following automatic spot detection on quadruple gels using Phoretix 2D Expression's detection algorithm, gels were manually warped and their common spots were matched to generate average gels. Immunoblotting was conducted according to Towbin et al . [ 38 ]. Proteins on 2-DE gels were transferred to PVDF membranes using Towbin buffer (0.025 M trisma base in 0.192 M glycine) with 20% methanol at 100 V for 30 min. After transfer, the PVDF membrane was washed twice for 5 min each in 0.01% Tween-20 in PBS (PBST) and blocked with 0.2% I-Block (Tropix, Bedford, MA) for 1 hr. To identify immunogenic proteins, the PVDF membranes were washed three times with PBST for 5 min and then probed with a 1:1000 dilution of sera pooled from patients who recovered from cutaneous anthrax. The PVDF membrane was washed three times with PBST and incubated with 1:5000 dilution of appropriate secondary antibody. Chemiluminescent signals were visualized using the Western Lightning reagents (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Corresponding sera from uninfected humans were used as controls (Cambrex, Charles City, IA). Three replicate blots were used for computer analysis using the Phoretix 2D Expression software to identify the immunogenic proteins. In-gel trypsin digestion and MALDI-TOF MS Protein spots were excised, washed, and trypsin digested from 2-DE gels according to manufacturer's instructions using the Xcise robotic workstation (Shimadzu Biotech, Columbia, MD). Briefly, gel plugs were washed with 50 mM ammonium bicarbonate and 50% acetonitrile (ACN), dried, and treated with 1.6 μg/ml of trypsin in 50 mM ammonium bicarbonate at 37°C overnight. Tryptic peptides were applied to a MALDI-TOF MS plate in a solution of 10 mg/ml alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 0.1% trifluoroacetic acid and 50% ACN. MS spectra were obtained using an Axima-CFR plus (Shimadzu Biotech) in a positive ion reflectron mode and analyzed against the theoretical spectra of B. anthracis strain Ames, using the Mascot Daemon software package (Matrix Science, Boston, MA). The search parameters were: maximum of one missed cleavage by trypsin, fixed modification of oxidation, charged state of + 1, and mass tolerance of ± 0.5 Da. Protein identification by LC MS/MS All LC MS/MS analyses were performed using an Agilent 1100 nanopump system coupled with a Vydac C18 reverse phase column (75 μM) (Agilent, Santa Clara, CA) and a QTRAP 2000 LC MS/MS system (Applied Biosystems, Foster City, CA) outfitted with a nanospray source and controlled with Analyst 1.4.1 software. Proteins were prepared for digestion using heat denaturation and a modified organic-aqueous digestion method as described before [ 14 ]. Each digested and desalted sample was re-suspended in 10 μl of Buffer A (95% water, 5% ACN, 0.1% formic acid). Each sample (7 μl) was loaded onto the LC MS/MS system and analyzed using an independent data acquisition method with the following parameters: single enhanced mass spectra (EMS, 500–1500 m/z) from which the three most intense peaks were subjected to an enhanced resolution, from which ions with a charge state of + 2 to + 4 were subjected to an enhanced product ion [EPI (MS/MS)] scan. Once the three most intense peaks were subjected to downstream analysis, they were ignored for a period of 60 sec. LC gradient was 5–60% Buffer B (95% ACN, 5% water, 0.1% formic acid) over 35 min. General parameter settings are as follows (curtain gas: 15.00, collision gas: High, ion spray: 2200 v, interface heater: on, declustering potential: 30, entrance potential: 10, collision energy: 10, rolling collision energy). All MS/MS data were searched against the theoretical spectra of B. anthracis Ames using the MASCOT software (Matrix Science). The search parameters used were: maximum of one missed cleavage by trypsin, fixed modification of oxidized methionine, charge state of + 2 and + 3, an MS tolerance of ± 1.2 Da and an MS/MS tolerance of ± 0.8 Da. Only protein identifications that met or exceeded the minimal MOWSE score of 22 were included in additional file 1 . Abbreviations 2-DE: two-dimension gel electrophoresis ACN: acetonitrile EF: edema factor IEF: isoelectric focusing LC: liquid chromatography LF: lethal factor MALDI-TOF: matrix assisted laser desorption/ionization time of flight MS: mass spectrometry MS/MS: tandem mass spectrometry PA: protective antigen SLH S-layer homology Competing interests The author(s) declare that they have no competing interests. Authors' contributions AW carried out the secretome preparation, data analysis, conceived the study, and helped drafting the manuscript. CVM drafted the manuscript and participated in design of the study. JPC and TA performed the MALDI-TOF and LC MS/MS analysis. RC performed the 2D Phoretix comparative analysis. CD and JW performed the 2D gel electrophoresis and Western blotting. SPK and ASK participated in the design of the study, and VGD participated in the design of the study and helped to draft the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. Supplementary Material Additional file 1 Secretome proteins of B. anthracis strain RA3R (pXO1 + /pXO2 - ) at 16 hr, as identified by MALDI-TOF and LC MS/MS Click here for file Acknowledgements We thank Dr. Xudong Liang of the University of Minnesota for the gift of the sera from patients infected with cutaneous anthrax. Thisresearch was supported bya contract with the US Army RDECOM ACQ CTR (#W911NF-05-C-0047) as part of the BioSPICE initiative.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1828967/

Strain-Specific Single-Nucleotide Polymorphism Assays for the Bacillus anthracis Ames Strain † ▿

Highly precise diagnostics and forensic assays can be developed through a combination of evolutionary analysis and the exhaustive examination of genomic sequences. In Bacillus anthracis , whole-genome sequencing efforts revealed ca. 3,500 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) among eight different strains and evolutionary analysis provides the identification of canonical SNPs. We have previously shown that SNPs are highly evolutionarily stable, and the clonal nature of B. anthracis makes them ideal signatures for subtyping this pathogen. Here we identified SNPs that define the lineage of B. anthracis that contains the Ames strain, the strain used in the 2001 bioterrorist attacks in the United States. Sequencing and real-time PCR were used to validate these SNPs across B. anthracis strains, including (i) 88 globally and genetically diverse isolates; (ii) isolates that were shown to be genetic relatives of the Ames strain by multiple-locus variable number tandem repeat analysis (MLVA); and (iii) several different lab stocks of the Ames strain, including a clinical isolate from the 2001 letter attack. Six SNPs were found to be highly specific for the Ames strain; four on the chromosome, one on the pX01 plasmid, and one on the pX02 plasmid. All six SNPs differentiated the B. anthracis Ames strain from the 88 unique B. anthracis strains, while five of the six separated Ames from its close genetic relatives. The use of these SNPs coupled with real-time PCR allows specific and sensitive (<100 fg of template DNA) identification of the Ames strain. This evolutionary and genomics-based approach provides an effective means for the discovery of strain-specific SNPs in B. anthracis .

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9775414/

LAMP-Based Point-of-Care Biosensors for Rapid Pathogen Detection

Seeking optimized infectious pathogen detection tools is of primary importance to lessen the spread of infections, allowing prompt medical attention for the infected. Among nucleic-acid-based sensing techniques, loop-mediated isothermal amplification is a promising method, as it provides rapid, sensitive, and specific detection of microbial and viral pathogens and has enormous potential to transform current point-of-care molecular diagnostics. In this review, the advances in LAMP-based point-of-care diagnostics assays developed during the past few years for rapid and sensitive detection of infectious pathogens are outlined. The numerous detection methods of LAMP-based biosensors are discussed in an end-point and real-time manner with ideal examples. We also summarize the trends in LAMP-on-a-chip modalities, such as classical microfluidic, paper-based, and digital LAMP, with their merits and limitations. Finally, we provide our opinion on the future improvement of on-chip LAMP methods. This review serves as an overview of recent breakthroughs in the LAMP approach and their potential for use in the diagnosis of existing and emerging diseases. 1. Introduction Point-of-care (POC) testing is performed at the time and location of the healthcare-receiving patients, enabling early-stage diagnosis and prompt medical decisions. Such tests are ideal for environments with limited resources, since they are affordable, need little in the way of equipment, and do away with the requirement for patient follow-up examinations. Nucleic-acid amplification tests (NAATs) play an important role in POC diagnosis by delivering pathogen detections at relatively low concentrations, which allows control of infections spreading at the very early stage [ 1 ]. In NAATs, the polymerase chain (PCR) reaction is the most commonly used technique and remains a gold standard. However, the dependence on complex thermal cycling, sophisticated instruments, skilled technical personnel, and long reaction time impedes its use in resource-poor settings and for rapid POC testing. Additionally, the advancement of PCR-based approaches for onsite diagnostics is further hampered by non-specific amplification and a higher risk of false positives [ 1 , 2 ]. Numerous state-of-the-art technologies have been developed in recent years for rapid pathogen detection, such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [ 3 ], surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) [ 4 ], surface plasmon resonance (SPR) [ 5 ], electrochemical biosensors [ 6 ], and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) [ 7 ]. Although these technologies are promising, they are currently unable to fully address the difficulties associated with pathogen detection, since their implementation in areas with low resources is hampered by the needs for extensive pre-processing, sophisticated equipment, and pricey labelling. There is still a demand for developing integrated biosensors that offer rapid and precise detection of infectious pathogens with high sensitivity [ 8 ]. Isothermal nucleic acid amplification tests (iNAATs) have been developed as an alternative and alluring method for highly accurate, quick, and economically efficient nucleic acid amplification [ 9 ]. Isothermal amplification (IA) works with a constant temperature (35–65 °C) with a reaction time of 60–90 min. Therefore, it only requires simple hardware for heating and is easy to integrate with a microfluidic device. In addition, IA has higher tolerance toward enzyme inhibitors, making this a robust amplification method [ 10 ]. This method includes loop-mediated isothermal amplification (LAMP) [ 11 ], recombinase polymerase amplification (RPA) [ 12 ], rolling circle amplification (RCA) [ 13 ], nucleic-acid-sequence-based amplification (NASBA) [ 14 ], and helicase-dependent amplification (HDA) [ 15 ]. Among them, LAMP is considered the most promising and robust due to the formation of large copy numbers in a short period (20–30 min) from low concentrations of target molecules. In particular, the amount of amplicon produced from a LAMP reaction is >50-fold more than any other PCR-based amplification technique. LAMP also has the potential to amplify multiple sizes of target DNA ranging from 130–300 bp, delivering amplification for versatile DNA of pathogens [ 11 ]. The reverse transcription LAMP (RT-LAMP) technique is employed to amplify RNA molecules using a reverse transcriptase enzyme to synthesize cDNA out of RNA. LAMP has additional advantages compared to other IA; for example: (i) RPA requires a recombinase enzyme, a protein for single-stranded DNA binding, and a polymerase enzyme for strand displacement, but in LAMP, a single DNA polymerase enzyme is used [ 16 ]; (ii) LAMP is a one-step reaction process, whereas in RCA, an additional ligation step is required before the amplification [ 17 ]; (iii) LAMP amplifies both DNA and RNA molecules—however, NASBA is used to amplify only RNA molecules [ 10 ]; (iv) unlike other IA methods, LAMP uses 4–6 primers makes it highly specific [ 18 ]; and (v) LAMP also exhibits very high tolerance to polymerase inhibitors, making it highly desirable for direct analysis of body fluids and other clinical samples, without further sample enrichments [ 19 , 20 ]. In addition, the handy design guidelines of LAMP attracted more users, which helped with creating a strong research database over the past two decades. Furthermore, the patent-free status makes LAMP available for the development of commercial products for rapid and onsite diagnosis of infectious diseases at POC. In the past decade, significant progress has been made in LAMP-based POC biosensors, whereas numerous detection techniques, such as colorimetric, electrochemical, lateral flow, optical, and smartphone-based methods, have been developed for the detection of LAMP amplicons. LAMP-based methods and their applications in food safety have been reviewed previously [ 21 , 22 ], but not in clinical settings specifically. Within the article's scope, we thoroughly discuss the recent developments of LAMP-based POC modalities for sensing infectious pathogens, plus the detection method of LAMP amplicons based on the end-point and real-time monitoring. The advantages and disadvantages of LAMP-based systems and the lab-on-chip (LOC) design are also demonstrated and clarified by examples for each method. 2. Overview of the LAMP Assay 2.1. Principle Isothermal amplification (IA) is a simple, rapid, and efficient method that can accumulate nucleic acid at a constant temperature without using additional advanced high-tech equipment. Due to the operational simplicity, IA methods are easy to integrate with microfluidic chips to develop rapid, sensitive, and onsite POC diagnostic tools [ 9 ]. Among the IA methods developed during 1991–2006, LAMP has risen as a rapid, robust, and highly specific nucleic acid amplification technique with the ability to generate a large number of products within a short time in a single-step reaction. LAMP was first reported in the year 2000 by Notomi et al. [ 11 ], and since, it has gained popularity in research, clinical, and industrial applications and emerged as an alternative to conventional PCR by eliminating the dependence on an expensive thermocycler. Additionally, the high tolerance of LAMP towards the enzyme inhibitors makes it a suitable candidate for onsite detection of clinical and biological samples without any sample enrichment. Unlike conventional PCR, LAMP requires four specific primers targeting six distinct regions (F3c, F1c, F2c, B2c, B1c, and B3c) on the DNA, providing enhanced specificity. This set of primers includes two inner primers called forward inner primer (FIP) and backward inner primer (BIP), whereas F3 and B3 are two outer primers, also known as "displacement primers" [ 23 ]. Figure 1 displays the mechanism of the LAMP reaction [ 24 ]. Both the inner primers FIP and BIP consist of hybridization sequences, F2 and F1c and B2 and B1c, respectively. The inner primers contain a unique "fold back" arrangement that creates stem–loop motifs for self-priming [ 11 ]. LAMP amplification can be split into two steps, i.e., the structure creation and the cyclic amplification. LAMP benefits from a DNA polymerase with strand-displacing activity, which avoids the need for a complex heat cycling step for dsDNA denaturation between each amplification cycle. In the first step, the F2 of the inner primer binds with the F2c of the target stand, initiating DNA synthesis due to the polymerase activity. Next, the F3 of the outer primer binds with F3c, followed by the displacement of the freshly synthesized DNA and the release of the target DNA. The released strand containing complementary F1 and F1c regions gives rise to a stem–loop structure. In the 3′ ends, another stem–loop structure will be formed under a similar mechanism to BIP and B3, forming a "dumbbell"-like structure. This "dumbbell structure" will undergo self-priming and serve as a starting material for the cyclic amplification step. As a result, LAMP produces a significant number of amplicons in a rapid period. Due to these characteristics, LAMP is well-suited for usage in POC biosensors that feature simplicity, resilience, miniature, and ease of operation. 2.2. Primer Design In addition to the four basic primers (FIP, BIP, F3, and B3), LAMP utilizes two other loop primers, the forward loop primer (LF) and backward loop primer (LB) [ 18 ], for the acceleration of the amplification and reduction of the time to one-third of the usual. The loop region is typically situated between B1–B2 and F1–F2 of the dumbbell structure, providing additional initiation sites for LAMP. The basic principles of LAMP primer designs are as follows: (i) there should be a minimum distance of 40–60 bases between F2 and F1c and B2 and B1c for enough space to generate loop primers; (ii) repeats of dinucleotides (e.g., AGAGAG) and repetition of a single nucleotide more than three times (e.g., ATTTT) should be avoided, as it can cause a mispriming; (iii) three or more runs of Gs should be avoided, as it may raise an issue with primer synthesis and purification; (iv) to avoid the secondary structure formation, the 3′ ends of the designed primers should not be AT-rich or complementary to one another; (v) the Tm for the primer pairs (e.g., F2 and B2) should be similar to a maximum temperature difference of 5 °C, and the F1c and B1c should have a higher Tm than F2 and B2 for the immediate formation of the stem–loop structures; (vi) in the case of GC-rich primers, the melting temperature (Tm) should be about 60–65 °C, and in the case of AT-rich primers, it should be around 55–60 °C. A relatively higher Tm is required for GC-rich primers due to the formation of a higher number of hydrogen bonds. The Tm of the primers is calculated using Equation (1); (vii) to obtain higher stability of the primers, the Δ G values of the 5′ ends of F1c/B1c and 3′ ends of F2/B2 and F3/B3, should be less than −4 kcal/mol; and (viii) to eliminate the formation of secondary structures, the 3′ ends should not be AT-rich [ 25 ]. NUPACK software (version 4.0, created by Prof. Niles A. Pierce and his team, Copyright© 2006–2022 California Institute of Technology, http://www.nupack.org/partition/new , accessed on 20 July 2022) is used to analyse putative secondary structures, and primer dimer production and hybridization stability [ 26 ]. In addition to that, reports suggest that the integration of poly T linkers (TTTT) between F2 and F1c of FIP and between B2 and B1c of BIP can improve the reaction speed by loop formation [ 27 ]. (1) T m = Δ H Δ S ° + R · l n C T X − 273.15 where R is the gas constant 1.9872 × 10 −3 kcal K −1 mol −1 ; the number in the second term, −273.15, is a conversion factor from K to °C; C T is the total molar concentration (M) of the strands; and X is considered four for non-self-complementary duplexes. Primer explorer V5 ( http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html , accessed on 20 July 2022) is the most commonly used software for LAMP primer design. The selected target region should be 200–2000 bp in length, and the saved sequence can only be uploaded in FASTA, .txt, or GenBank format. The steps for designing LAMP primers using Primer Explorer V5 are as follows: (i) launch the program, upload the correct format of the sequence file, and click on "Primer Design" to display the regions of the target sequences; (ii) click on "Generate" to get the designed primers of the best five primer options for a particular gene sequence; (iii) choose the primer set with the highest Δ G value for dimerization and click on "Display" to exhibit the designed primer list in a new window; (iv) select the primer with a Δ G value of ≤−4 kcal/mol at the 5′ end of F1c/B1c and at the 3′ end of F2/B2 and F3/B3 and click on "Confirm" to obtain the particular primer details; (v) after choosing the appropriate primer set, click on "Primer information" to save the file for loop-primer generation, and then click on "Save" to download the primer sequences in a Word/Excel document; (vi) to generate the loop primers, re-launch the software and upload the saved file from step (v); (vii) click on "Primer Design" to display the LF and LB in the target sequence; (viii) next, click on "Generate," followed by "Display," to obtain the designed LF and LB primers in a new window; (ix) choose the loop primer pair with the highest Δ G value for dimerization and click on "Confirm" to display the primer details; (x) finally, choose the loop primers with lowest Δ G value at 3′ end and click on "Save" to download the primers. BLAST tool ( www.ncbi.nlm.nih.gov , accessed on 20 July 2022) is used to check the specificity of each of the designed primers. The designed primer should display high specificity for the targeted gene sequence. The software also provides advanced settings with the flexibility of choosing AT and GC-rich options and the desired Tm to design target-specific customized primers. Nevertheless, it is not advised to change the lengths of primers. Primer explorer V5 is an easy-to-use online tool for LAMP primer design; however, it has some limitations—e.g., (i) simultaneous design of the loop primer is not possible; (ii) it only allows a gene sequence up to 2000 bp; (iii) besides ATGC, it does not support any other IUPAX characters; and (iv) it allows only one execution process. Apart from the primer explorer, multiple online primer design software tools are available, such as Premier Biosoft, Optigene LAMP designer, NEB LAMP primer designer tool, and more. Several methods have been published in recent years for designing target-based primers. For example, Zhang et al. [ 28 ] developed a novel Python script for designing LAMP-based variant-specific probes to detect cancer mutations, evaluated using the sequences of ESR1 p.E380Q and ESR1 p.Y537S cancer-specific mutations, as the algorithm generates the two best primer sets for the respective target with an input of the DNA sequence. In another work, Jia et al. [ 29 ] presented a whole genome-based LAMP primer design (GLAPD) tool, which can be downloaded using the following website: http://cgm.sjtu.edu.cn/GLAPD/ or https://github.com/jiqingxiaoxi/GLAPD.git (accessed on 20 July 2022) and http://cgm.sjtu.edu.cn/GLAPD/online/ (accessed on 20 July 2022). It is a novel approach that uses complete genomes to create LAMP primers for a set of target genomes for rapid detection of foodborne pathogens, which yielded similar results to Primer explorer V5 with the same nucleotide sequences. Additionally, a theoretical approach was developed by Savonnet et al. [ 30 ], who studied the dynamics of LAMP's second stage from the fundamentals of reaction rates to deduce physio-chemical properties from the experimental signal development. The dumbbell structure used in the study skipped the first stage of the LAMP. This model anticipates that the concentration of amplification products will rise according to a logistic function. 2.3. Features for Rapid Pathogen Detection Due to the formation of high copy numbers (~10 9 ) in a short period (<1 h), LAMP has been considered one of the most efficient and popular diagnostics tools used for rapid pathogen detection. The inner primer plays a crucial role in LAMP, as it has brought a lot of benefits for making LAMP a robust, rapid, and advanced amplification method. Essentially, the strand displacement of the inner primer occurs at a constant temperature (60–65 °C), eliminating the need for complex thermal cycling and making LAMP a suitable candidate for POC devices with its simple design and rapidness. The stem–loop structure provides amplification based on self-priming, allowing the production of large numbers of amplicons independent of template DNA strands. Hence, this produces a high copy number of DNA in a short period, enabling rapid target detection with very high sensitivity. LAMP provides a high tolerance towards the inhibitors, reducing the effort of sample pre-treatment. Therefore, the ideal of a simple LAMP-based "sample-in-result-out" POC device is feasible. Compared to other methods, LAMP uses 4–6 different primers targeting six distinctive regions, making it highly specific. A mismatch with any target sequences will lead to a negative amplification, eliminating the chances of non-specific amplification. It is reported that the LAMP assay may possess higher sensitivity compared to the gold-standard PCR. It can have a detection limit as low as five copies per reaction [ 31 ]. Hence, LAMP can be used for early disease diagnosis and to contain the spread of infectious pathogens. Furthermore, the production of pyrophosphate molecules during LAMP enables visual identification of the target, making the detection method easy and simple without using any expensive instrumentation. As another factor, LAMP produces polymerized target DNA with various base pair lengths from 300 to 25 kb [ 11 ]. This large number of amplified nucleic acids could increase the viscosity of solutions. This micro-level viscosity change can be detected by an advanced and ultrasensitive particle-imaging technique called rotational diffusometry, bringing down the detection time to less than 10 min [ 32 ]. A detailed discussion is included in Section 3.1.5 . Another fascinating tool named CRISPR/Cas system [ 33 ] has been integrated with LAMP for rapid detection of pathogenic nucleic acids (NA) with very high sensitivity [ 34 ]. First, the Cas protein (Cas9, Cas12, and Cas13) forms a complex with a special RNA sequence called CRISPR-RNA (crRNA), activated once it binds to the specific target RNA/DNA, triggering the cleaving mechanism of Cas protein. Subsequently, this activated complex cleaves the reporter probe carrying a fluorophore and a quencher, releasing significant fluorescence. The detection can be performed via monitoring fluorescence and in lateral-flow strips [ 35 , 36 ]. Recently, CRISPR, in combination with RT-LAMP, has been investigated for rapid and highly accurate POC diagnosis of COVID-19 [ 37 , 38 ]. Due to the simplicity of LAMP operation, these ultra-sensitive and highly accurate state-of-the-art detection techniques are integrated easily, making LAMP a rapid and sensitive pathogen detection tool. In the next section, we discuss the various end-points and the real-time detection methods for monitoring LAMP reactions. 2.1. Principle Isothermal amplification (IA) is a simple, rapid, and efficient method that can accumulate nucleic acid at a constant temperature without using additional advanced high-tech equipment. Due to the operational simplicity, IA methods are easy to integrate with microfluidic chips to develop rapid, sensitive, and onsite POC diagnostic tools [ 9 ]. Among the IA methods developed during 1991–2006, LAMP has risen as a rapid, robust, and highly specific nucleic acid amplification technique with the ability to generate a large number of products within a short time in a single-step reaction. LAMP was first reported in the year 2000 by Notomi et al. [ 11 ], and since, it has gained popularity in research, clinical, and industrial applications and emerged as an alternative to conventional PCR by eliminating the dependence on an expensive thermocycler. Additionally, the high tolerance of LAMP towards the enzyme inhibitors makes it a suitable candidate for onsite detection of clinical and biological samples without any sample enrichment. Unlike conventional PCR, LAMP requires four specific primers targeting six distinct regions (F3c, F1c, F2c, B2c, B1c, and B3c) on the DNA, providing enhanced specificity. This set of primers includes two inner primers called forward inner primer (FIP) and backward inner primer (BIP), whereas F3 and B3 are two outer primers, also known as "displacement primers" [ 23 ]. Figure 1 displays the mechanism of the LAMP reaction [ 24 ]. Both the inner primers FIP and BIP consist of hybridization sequences, F2 and F1c and B2 and B1c, respectively. The inner primers contain a unique "fold back" arrangement that creates stem–loop motifs for self-priming [ 11 ]. LAMP amplification can be split into two steps, i.e., the structure creation and the cyclic amplification. LAMP benefits from a DNA polymerase with strand-displacing activity, which avoids the need for a complex heat cycling step for dsDNA denaturation between each amplification cycle. In the first step, the F2 of the inner primer binds with the F2c of the target stand, initiating DNA synthesis due to the polymerase activity. Next, the F3 of the outer primer binds with F3c, followed by the displacement of the freshly synthesized DNA and the release of the target DNA. The released strand containing complementary F1 and F1c regions gives rise to a stem–loop structure. In the 3′ ends, another stem–loop structure will be formed under a similar mechanism to BIP and B3, forming a "dumbbell"-like structure. This "dumbbell structure" will undergo self-priming and serve as a starting material for the cyclic amplification step. As a result, LAMP produces a significant number of amplicons in a rapid period. Due to these characteristics, LAMP is well-suited for usage in POC biosensors that feature simplicity, resilience, miniature, and ease of operation. 2.2. Primer Design In addition to the four basic primers (FIP, BIP, F3, and B3), LAMP utilizes two other loop primers, the forward loop primer (LF) and backward loop primer (LB) [ 18 ], for the acceleration of the amplification and reduction of the time to one-third of the usual. The loop region is typically situated between B1–B2 and F1–F2 of the dumbbell structure, providing additional initiation sites for LAMP. The basic principles of LAMP primer designs are as follows: (i) there should be a minimum distance of 40–60 bases between F2 and F1c and B2 and B1c for enough space to generate loop primers; (ii) repeats of dinucleotides (e.g., AGAGAG) and repetition of a single nucleotide more than three times (e.g., ATTTT) should be avoided, as it can cause a mispriming; (iii) three or more runs of Gs should be avoided, as it may raise an issue with primer synthesis and purification; (iv) to avoid the secondary structure formation, the 3′ ends of the designed primers should not be AT-rich or complementary to one another; (v) the Tm for the primer pairs (e.g., F2 and B2) should be similar to a maximum temperature difference of 5 °C, and the F1c and B1c should have a higher Tm than F2 and B2 for the immediate formation of the stem–loop structures; (vi) in the case of GC-rich primers, the melting temperature (Tm) should be about 60–65 °C, and in the case of AT-rich primers, it should be around 55–60 °C. A relatively higher Tm is required for GC-rich primers due to the formation of a higher number of hydrogen bonds. The Tm of the primers is calculated using Equation (1); (vii) to obtain higher stability of the primers, the Δ G values of the 5′ ends of F1c/B1c and 3′ ends of F2/B2 and F3/B3, should be less than −4 kcal/mol; and (viii) to eliminate the formation of secondary structures, the 3′ ends should not be AT-rich [ 25 ]. NUPACK software (version 4.0, created by Prof. Niles A. Pierce and his team, Copyright© 2006–2022 California Institute of Technology, http://www.nupack.org/partition/new , accessed on 20 July 2022) is used to analyse putative secondary structures, and primer dimer production and hybridization stability [ 26 ]. In addition to that, reports suggest that the integration of poly T linkers (TTTT) between F2 and F1c of FIP and between B2 and B1c of BIP can improve the reaction speed by loop formation [ 27 ]. (1) T m = Δ H Δ S ° + R · l n C T X − 273.15 where R is the gas constant 1.9872 × 10 −3 kcal K −1 mol −1 ; the number in the second term, −273.15, is a conversion factor from K to °C; C T is the total molar concentration (M) of the strands; and X is considered four for non-self-complementary duplexes. Primer explorer V5 ( http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html , accessed on 20 July 2022) is the most commonly used software for LAMP primer design. The selected target region should be 200–2000 bp in length, and the saved sequence can only be uploaded in FASTA, .txt, or GenBank format. The steps for designing LAMP primers using Primer Explorer V5 are as follows: (i) launch the program, upload the correct format of the sequence file, and click on "Primer Design" to display the regions of the target sequences; (ii) click on "Generate" to get the designed primers of the best five primer options for a particular gene sequence; (iii) choose the primer set with the highest Δ G value for dimerization and click on "Display" to exhibit the designed primer list in a new window; (iv) select the primer with a Δ G value of ≤−4 kcal/mol at the 5′ end of F1c/B1c and at the 3′ end of F2/B2 and F3/B3 and click on "Confirm" to obtain the particular primer details; (v) after choosing the appropriate primer set, click on "Primer information" to save the file for loop-primer generation, and then click on "Save" to download the primer sequences in a Word/Excel document; (vi) to generate the loop primers, re-launch the software and upload the saved file from step (v); (vii) click on "Primer Design" to display the LF and LB in the target sequence; (viii) next, click on "Generate," followed by "Display," to obtain the designed LF and LB primers in a new window; (ix) choose the loop primer pair with the highest Δ G value for dimerization and click on "Confirm" to display the primer details; (x) finally, choose the loop primers with lowest Δ G value at 3′ end and click on "Save" to download the primers. BLAST tool ( www.ncbi.nlm.nih.gov , accessed on 20 July 2022) is used to check the specificity of each of the designed primers. The designed primer should display high specificity for the targeted gene sequence. The software also provides advanced settings with the flexibility of choosing AT and GC-rich options and the desired Tm to design target-specific customized primers. Nevertheless, it is not advised to change the lengths of primers. Primer explorer V5 is an easy-to-use online tool for LAMP primer design; however, it has some limitations—e.g., (i) simultaneous design of the loop primer is not possible; (ii) it only allows a gene sequence up to 2000 bp; (iii) besides ATGC, it does not support any other IUPAX characters; and (iv) it allows only one execution process. Apart from the primer explorer, multiple online primer design software tools are available, such as Premier Biosoft, Optigene LAMP designer, NEB LAMP primer designer tool, and more. Several methods have been published in recent years for designing target-based primers. For example, Zhang et al. [ 28 ] developed a novel Python script for designing LAMP-based variant-specific probes to detect cancer mutations, evaluated using the sequences of ESR1 p.E380Q and ESR1 p.Y537S cancer-specific mutations, as the algorithm generates the two best primer sets for the respective target with an input of the DNA sequence. In another work, Jia et al. [ 29 ] presented a whole genome-based LAMP primer design (GLAPD) tool, which can be downloaded using the following website: http://cgm.sjtu.edu.cn/GLAPD/ or https://github.com/jiqingxiaoxi/GLAPD.git (accessed on 20 July 2022) and http://cgm.sjtu.edu.cn/GLAPD/online/ (accessed on 20 July 2022). It is a novel approach that uses complete genomes to create LAMP primers for a set of target genomes for rapid detection of foodborne pathogens, which yielded similar results to Primer explorer V5 with the same nucleotide sequences. Additionally, a theoretical approach was developed by Savonnet et al. [ 30 ], who studied the dynamics of LAMP's second stage from the fundamentals of reaction rates to deduce physio-chemical properties from the experimental signal development. The dumbbell structure used in the study skipped the first stage of the LAMP. This model anticipates that the concentration of amplification products will rise according to a logistic function. 2.3. Features for Rapid Pathogen Detection Due to the formation of high copy numbers (~10 9 ) in a short period (<1 h), LAMP has been considered one of the most efficient and popular diagnostics tools used for rapid pathogen detection. The inner primer plays a crucial role in LAMP, as it has brought a lot of benefits for making LAMP a robust, rapid, and advanced amplification method. Essentially, the strand displacement of the inner primer occurs at a constant temperature (60–65 °C), eliminating the need for complex thermal cycling and making LAMP a suitable candidate for POC devices with its simple design and rapidness. The stem–loop structure provides amplification based on self-priming, allowing the production of large numbers of amplicons independent of template DNA strands. Hence, this produces a high copy number of DNA in a short period, enabling rapid target detection with very high sensitivity. LAMP provides a high tolerance towards the inhibitors, reducing the effort of sample pre-treatment. Therefore, the ideal of a simple LAMP-based "sample-in-result-out" POC device is feasible. Compared to other methods, LAMP uses 4–6 different primers targeting six distinctive regions, making it highly specific. A mismatch with any target sequences will lead to a negative amplification, eliminating the chances of non-specific amplification. It is reported that the LAMP assay may possess higher sensitivity compared to the gold-standard PCR. It can have a detection limit as low as five copies per reaction [ 31 ]. Hence, LAMP can be used for early disease diagnosis and to contain the spread of infectious pathogens. Furthermore, the production of pyrophosphate molecules during LAMP enables visual identification of the target, making the detection method easy and simple without using any expensive instrumentation. As another factor, LAMP produces polymerized target DNA with various base pair lengths from 300 to 25 kb [ 11 ]. This large number of amplified nucleic acids could increase the viscosity of solutions. This micro-level viscosity change can be detected by an advanced and ultrasensitive particle-imaging technique called rotational diffusometry, bringing down the detection time to less than 10 min [ 32 ]. A detailed discussion is included in Section 3.1.5 . Another fascinating tool named CRISPR/Cas system [ 33 ] has been integrated with LAMP for rapid detection of pathogenic nucleic acids (NA) with very high sensitivity [ 34 ]. First, the Cas protein (Cas9, Cas12, and Cas13) forms a complex with a special RNA sequence called CRISPR-RNA (crRNA), activated once it binds to the specific target RNA/DNA, triggering the cleaving mechanism of Cas protein. Subsequently, this activated complex cleaves the reporter probe carrying a fluorophore and a quencher, releasing significant fluorescence. The detection can be performed via monitoring fluorescence and in lateral-flow strips [ 35 , 36 ]. Recently, CRISPR, in combination with RT-LAMP, has been investigated for rapid and highly accurate POC diagnosis of COVID-19 [ 37 , 38 ]. Due to the simplicity of LAMP operation, these ultra-sensitive and highly accurate state-of-the-art detection techniques are integrated easily, making LAMP a rapid and sensitive pathogen detection tool. In the next section, we discuss the various end-points and the real-time detection methods for monitoring LAMP reactions. 3. LAMP Detection Methods 3.1. End-Point Detection 3.1.1. Colorimetric Detection Colorimetric detection of LAMP products can be divided into two categories: turbidity and use of dye. During the LAMP reaction, deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs) reacts with magnesium sulphate (MgSO 4 ) to yield a white precipitate of magnesium pyrophosphate (Mg 2 P 2 O 7 ), increasing the solution's turbidity [ 39 ]. No additional read-out instrument is required, as the change in turbidity can be determined by the human eye. Garg et al. [ 40 ] introduced successful LAMP-based turbidimetric detection of Mycobacterium leprae targeting the 16s rRNA gene. Likewise, similar studies reported the detection of multiple pathogens—for instance, Clostridium botulinum [ 41 ], Streptococcus pneumoniae [ 42 ], and Streptococcus agalactiae [ 43 ]. However, this method provides low sensitivity, as the faint product can easily be misjudged. As alternatives to the turbidity method, molecular probes are employed for the colorimetric detection of LAMP products. The most common colorimetric indicators are metal-ion indicator dyes, namely, calcein, hyroxynapthol blue (HNB) plus eriochrome black T (EBT), pH-sensitive dyes (phenol red, neutral red), and other fluorescence probes. These dyes provide a significant change in colour with the presence of LAMP amplicons but do not inhibit the amplification process [ 44 ]. Therefore, they can be added at the beginning of the LAMP reaction. Additionally, various DNA intercalating dyes, such as SYBR Green I, propidium iodide (PI), and SYTO-81, are used to detect the LAMP product with high sensitivity and can be easily monitored under visible light or UV regions. HNB and calcein are the most commonly used dsye for the colorimetric detection of LAMP. Initially, calcein binds with Mn 2+ ions, which quenches its fluorescence activity, and the LAMP reaction mixture appears orange in colour. Then, Mn 2+ ions form a complex with pyrophosphate P 2 O 7 4− during the amplification process, hence recovering the green fluorescence. In addition, the fluorescence signal is further enhanced by calcein–Mg 2+ complex formation [ 39 ]. Similarly, HNB shows a change in colour from purple to blue due to the reduction in Mg 2+ ions' concentration [ 44 ]. Zhu et al. [ 45 ] developed a capillary-array-based POC platform combining LAMP for the detection of the African swine fever virus (ASFV) by targeting five different genes (D1133L, B962L, B646L, G1340L, and C717R). The capillary array is named "Hive chip" due to its hive-like shape, where the reagents are loaded and distributed inside the chip by capillary forces. Direct blood samples treated with sodium hydroxide were used for LAMP without any further DNA extraction and showed a LOD of 50 copies/µL over an assay time of 70 min by using calcein dye. In another work, Yao et al. [ 46 ] designed a PDMS-made, portable, self-driven microfluidic chip enabling automatic and rapid loading of samples for RT-LAMP. The system can detect eight vector-borne viruses, including Chikungunya virus (CHIKV) and Dengue virus (DENV). Calcein-based colorimetric detection achieved a LOD of 100 copies for CHIKV and DENV-1 in just 50 min, including 3 min for self-powered sample loading and 45 min for RT-LAMP. Furthermore, the developed method tested using 120 mosquito samples and 50 clinical samples provided consistent results with RT-PCR analysis. Similarly, another self-driven POC microfluidic platform was developed as a combination with LAMP for rapid colorimetric detection of blood-borne pathogens empowered by calcein. Reagents can be loaded into the self-driven chip within 12 min. After 50 min LAMP, results were recorded and monitored using a smartphone camera. Multiplex detection of three pathogens, namely, human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B (HBV), and hepatitis C virus (HCV), with a LOD of 2 copies/µL, was achieved with a turnaround time of 65 min [ 47 ]. Jin et al. [ 48 ] devised a self-priming compartmentalization (SPC) microfluidic platform for HNB-based naked-eye detection of food-borne pathogens. The self-filling of the microfluidic LAMP platform was achieved by negative pressure. On top of that, the closed wells eliminated cross-contamination to ensure accuracy. Simultaneous detection of six food-borne pathogens was realized through the SPC device with a detection limit of 10 2 –10 3 CFU/mL in an assay time of 60 min. In another effort, Deng et al. [ 49 ] reported a LAMP-based, portable, and self-contained device for POC diagnosis of the SARS-CoV-2 virus. A disposable cartridge consisting of a PDMS-based microfluidic chip was designed to perform reagent transportation, viral lysis, and a RT-LAMP reaction ( Figure 2 A). Microchip operation was controlled by a battery-operated, Arduino-based microcontroller with a size of 6 × 9 × 4 cm 3 . The pocket-size device obtained colorimetric detection of 300 copies of RNA per reaction with a sample-to-answer time of 30 min. During LAMP, a pH-sensitive dye can sense the amplified DNA molecule through the solution's pH, which becomes lower due to the products [ 50 ]. For example, a POC diagnostic method was developed for rapid and sensitive detection of Clostridium tyrobutyricum in milk using pH-sensitive Cresol Red dye ( Figure 2 B). DNA extraction was achieved by chemical lysis, which eliminates the time-consuming multistep purification process. A LOD of ~2 spores/mL was achieved by direct visualization of colour change from red to yellow in contaminated milk samples with high sensitivity and specificity [ 51 ]. Ye et al. [ 52 ] developed a glass fibre paper-based POC diagnostic tool capable of RNA extraction in 5 min, the isothermal amplification of the target gene in just 25 min, and a visual readout of the final product. This low-cost paper disc obtained a LOD of 1 × 10 3 copies/mL for rotavirus A with very high specificity by employing pH-sensitive neutral red dye. Furthermore, this paper device was tested with 48 clinical samples and showed a comparable detection sensitivity to the gold-standard, RT-PCR. In another study, Song et al. [ 53 ] developed rapid, low-cost, easy-to-use self-testing kits for COVID-19 by direct naked-eye detection of colorimetric test results ( Figure 2 C). The complete workflow, including sample collection, RNA purification, isothermal amplification of target genes in a thermos, and visual analysis of results takes less than 60 min. The following lyophilization protocol allows long-term storage of RT-LAMP reagents at room temperature for 10 days. A LOD of 100 RNA copies/reaction was achieved with 99% specificity. The dye SYBR Green I, which exhibits a visible colour change under white light (reddish-orange to yellowish-green) and fluoresces in the ultraviolet regions has been used in the past for monitoring LAMP reactions. For example, Wang et al. [ 54 ] reported the detection of Fusarium proliferatum with a LOD of 10 pg/µL in 30 min. Additionally, a SYBR Green I-based LAMP assay was used for the detection of Listeria monocytogenes ( L. monocytogenes ), [ 55 ] Enterocytozoon hepatopenaei , [ 56 ] Milk vetch dwarf virus [ 57 ], and Bacillus anthracis [ 58 ]. Recently, Oliveira et al. [ 59 ] reported RT-LAMP-based detection of SARS-CoV-2 in a fully integrated and automated POC device. SYBR green I was used for the colorimetric detection of the viral genome with a LOD of 10 −3 copies/reaction. Clinical samples tested using this developed protocol correlated well with real-time qPCR, demonstrating a reliable tool for rapid COVID-19 diagnosis in resource-limited regions. In another effort, an RT-LAMP integrated polycarbonate-based POC testing device was developed for multiplex detection of SARS-CoV-2 and influenza A H1N1 virus within 50 min ( Figure 2 D). This multiplexed platform allows reagent mixing and preparation without any power outlets or pipetting. A ball-based valve system was used for sample delivery, enabling paper-based RNA enrichment and reagent preparation. Colorimetric detection for SARS-CoV-2 and H1N1 virus was achieved with LODs of 2 and 6 genomes per reaction, respectively. Furthermore, this device can detect virus particles from clinical and environmental samples [ 60 ]. Bokelmann et al. [ 61 ] presented the Cap-iLAMP acronym for capturing and an improved loop-mediated isothermal amplification method for smartphone-based colorimetric detection of SARS-CoV-2 from gargle lavage samples ( Figure 2 E). This bulk testing method utilizing the hybridization capture for RNA purification enables a detection sensitivity of 500 copies/reaction within 55 min. Cap-iLAMP eliminates false positives by allowing single-positive specimens to be identified in pools of 25 negative samples, lowering the reagent cost for each test to less than ~1 Euro per person. Colorimetric detection eliminates the use of expensive readers and signal processing units, making it low-cost and easy to operate. However, it is qualitative, and obtaining quantitative analysis remains challenging. Figure 2 LAMP-based biosensors using dye detection. ( A ) A self-contained device diagnosis of SARS-CoV-2 virus with a disposable cartridge and an Arduino-based reusable microcontrolling unit. ( B ) Schematic representation of Clostridium tyrobutyricum in milk at POC. ( C ) Illustration of a thermos-based home test for COVID-19. ( D ) Polycarbonate POC testing device with a ball-based valve system for sample delivery and reagent preparation. ( E ) Workflow of Cap-iLAMP. Reproduced with permission from references [ 49 , 51 , 53 , 60 , 61 ]. Copyright 2021 and 2022 Springer Nature, 2021 American Chemical Society, 2021 MDPI. 3.1.2. Electrochemical Detection Electrochemical sensors have demonstrated promising benefits, such as rapid detection with high sensitivity and selectivity for developing POC diagnostic tools [ 62 , 63 ]. They have been extensively explored for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) [ 64 , 65 ], nucleic acids, and their amplified products over the past few decades [ 66 , 67 , 68 ]. Integration of LAMP with electrochemical sensors can provide fast and ultra-sensitive detection of various analytes by measuring the oxidation reduction in the electro-active molecules due to the interaction with the LAMP product. Another strategy involves the immobilization of the probe on the surface of the working electrode with a redox reporter, which can monitor the electrochemical signals by linear-sweep voltammetry (LSV) [ 69 ], square-wave voltammetry (SWV) [ 70 ], differential-pulse voltammetry (DPV) [ 71 ], or conductivity [ 72 ]. The LAMP product can be detected after the reaction or monitored in real-time through electrochemical sensors [ 73 ]. Regarding real-time detection, numerous redox molecules, including methylene blue (MB) and ruthenium hexamine, can be used, as they do not inhibit DNA amplification [ 21 ]. However, some of them, namely, Hoechst 23458, may impede the LAMP reaction and are unusable for instantaneous sensing [ 74 ]. Jaroenram et al. [ 75 ] detected the LAMP amplicons on a screen-printed graphene electrode (SPGE) using an in-house mini potentiostat device to measure the cyclic voltammogram displayed on an LCD screen with Hoechst-33258 as the electrochemical redox agent ( Figure 3 A). The assay had a LOD of 40 CFU/reaction for Mycobacterium tuberculosis with a turnaround time of 65 min. A similar electrode system and a portable potentiostat device were used to detect the LAMP product of Vibrio parahaemolyticus ( V. parahaemolyticus ) with a detection limit of 0.3 CFU per 25 g of raw seafood in 45 min [ 76 ]. In another effort, Fu et al. [ 77 ] developed a LAMP-based electrochemical sensor for Group B Streptococci (GBS), which demonstrated a broad detection range of 1 fg µL −1 to 100 pg µL −1 . Thiolated β-cyclodextrin (SH-β-CD) was immobilized onto the AuNPs@MoS 2 -modified glassy electrode surface via Au–S bonding. Thus, the ferrocene (Fc)-modified primers enable the binding of the amplified product via a host–guest interaction between Fc and β-CD ( Figure 3 B). MB was used as a redox agent to produce a strong electrochemical signal during the interaction with the LAMP product, yielding a low detection limit of 0.23 fg µL −1 . In another study, Zamani et al. [ 78 ] introduced a CRISPR/Cas12a activation-based sensor for the human papillomavirus (HPV) virus, which achieved a LOD of 10 4 copies of DNA per reaction. A methylene-blue-tagged oligo was immobilized on a gold-leaf electrode ( Figure 3 C). Square-wave voltammetry (SWV) was used for electrochemical readouts of methylene-blue-tagged oligos by Cas12a enzyme activity. Other studies employed a combination of digoxigenin-labelled nucleotides (DIG-dUTPs)-based LAMP and streptavidin-modified magnetic beads for the separation and amperometric detection of HPV16 and HPV18 in a carbon-based electrode system. After a successful LAMP reaction, the resulted amplicons were incubated with the modified magnetic beads, followed by anti-DIG Ab conjugated with horseradish peroxidase (HRP). The magnetic beads were concentrated on the electrode's surface using a magnet, and amperometric monitoring of the HRP reaction was performed [ 79 ]. In the next attempt, 61 cervical samples for both genotypes were screened and validated with real-time PCR and commercial HPV tests such as INNO-LiPA and COBAS. The system had 90% accuracy [ 80 ]. Recently, Ramírez-Chavarría et al. [ 81 ] proposed a LAMP-based low-cost electrochemical sensor for specific detection of a SARS-CoV-2 gene sequence, in which RT-LAMP is performed on a disposable test strip consisting of a screen-printed electrode. Methylene blue was used as an electrochemical redox probe to deliver a diffusion-controlled current during the interaction with LAMP products, as square-wave voltammetry (SWV) was chosen for electrochemical readouts. The test strips showed a detection sensitivity of ~2.5 × 10 −6 ng/µL, along with high specificity and reproducibility. 3.1.3. Lateral Flow Assay Detection Lateral flow tests (LFTs) were used extensively in recent years for LAMP-based rapid POC diagnostics tests. The test line on the lateral flow assay strip catches biotin-labelled LAMP amplicons hybridized with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labelled DNA probes, which later bind to gold-based anti-FITC antibodies to create a legible output. Non-hybridized FITC probes attach to gold-labelled anti-FITC antibodies, generating a biotin-free double complex that travels from the test to the control line. The detection sensitivity with extracted genomic DNA was 600 fg/reaction for Mycoplasma pneumoniae [ 82 ], 100 fg/reaction for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) [ 83 ], and Pseudomonas aeruginosa [ 84 ] 630 fg/reaction for V. parahaemolyticus [ 85 ] and 13.5 fg/µL for Salmonella [ 86 ]. For obtaining a higher sensitivity and accuracy, nanomaterials and enzymatic enhancements were investigated by various research groups. For example, Shi et al. [ 87 ] developed a propidium monoazide (PMA) based nanozyme strip for viable detection of L. monocytogenes with a LOD of 10 CFU/mL. The color change was further enhanced by an enzymatic reaction between the nanozyme and DAB/H 2 O 2 (enzyme substrate). Gold nanoparticles were replaced by Fe 3 O 4 nanoparticles, which provided better dispersibility. In another work, A quantum dot nanobead-based LFT was developed by Shang et al. [ 88 ] for quantitative detection of S. typhimurium ( S. typhimurium ). The visual LOD of 10 3 CFU/mL achieved a linear range of 10 2 –10 8 CFU/mL, 10-fold higher than AuNPs labelled strips. Yang et al. [ 89 ] reported polymer nanoparticles lateral flow biosensors in combination with LAMP for the detection of Brucella abortus targeting BruAb2_0168 gene. The assay achieved a LOD of 100 fg/reaction with a turnaround time of 85 min. Additionally, a multiplex LAMP-based LFT was reported for the detection of two malaria-causing parasites, viz. , Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum , where FITC and digoxigenin-labelled probes hybridized with the LAMP amplicons having a complementary nucleotide sequence ( Figure 4 A). A clear band was visualized on the strip within 60 min for both species. Detection sensitivity reached 0.15 pg/µL for extracted genomic DNA [ 90 ]. LFT combined with RT-LAMP has been proven to be a promising tool for rapid diagnosis of COVID-19 at POC. A polymerase-nanoparticle-based LFT coupled with RT-LAMP was designed by Zhu et al. [ 91 ] for the simultaneous detection of specific genes from the SARS-CoV-2 genome using two sets of LAMP primers in a single reaction tube. The primers for ORF1ab and N genes were labelled with FITC and digoxin, respectively, with an additional biotin tag. Immunoreaction between FITC, digoxin, and biotin-labelled duplex LAMP amplicons with anti-FITC/digoxin in the test line produced a characteristic crimson band that enables the multiplex detection of both genes with a LOD of 12 copies/reaction. The entire process, from sample collection to the results, was accomplished within 1 h. In another work, a palm-sized, portable microfluidic platform integrated with a pregnancy test strip (PTSs) was developed for POC diagnosis of the SARS-CoV-2 genome ( Figure 4 B). Highly specific human chorionic gonadotropin probes (hCG-p) were designed to hybridize with the specific loop region of the RT-LAMP amplicons, and thus to be unable to move through the PTSs and appear only on the control line on the strip. Ultrasensitive detection with a LOD of 0.5 copy/µL was achieved with an assay time of 120 min by on-site naked-eye visualization [ 92 ]. LAMP provides specific amplification of the target, and lateral flow sensors offer a cheap and easy readout method. Therefore, LAMP combined with LFTs has enormous potential for creating POC diagnostic platforms. This technique can be combined with microfluidic platforms to allow high-throughput analysis while removing the possibility of cross-contamination. Figure 4 LAMP-based lateral flow biosensors. ( A ) Outline of the lateral flow strip for detection of LAMP amplicons. ( B ) A portable microfluidic platform integrated with a pregnancy test strip (PTSs) for POC diagnosis of COVID-19. Reproduced with permission from references [ 90 , 92 ]. Copyright 2021 American Chemical Society, 2022 MDPI. 3.1.4. Optical Detection Optical devices have emerged as an alternative solution and are extensively used in the end-point detection of LAMP products. Optical sensors and instruments, such as a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) [ 93 ], surface plasmon resonance (SPR) [ 94 ], and surface-enhanced Raman scattering (SERS) [ 95 ], have been used for monitoring LAMP amplicons. Chun et al. [ 96 ] designed a detection method for food-borne pathogens using a CMOS sensor and white LED light by integrating retroreflective Janus particle (RJP) and LAMP, which achieved a LOD of 10 2 CFU for S. typhimurium . A DNA probe immobilized on the RJPs was injected into the LAMP product, resulting in a hybridized sandwich structure formation between the LAMP product and RJPs ( Figure 5 A). In another work, a smartphone-based image processing method was applied in sensing food-borne pathogens using SYTO-9, which yielded a LOD of 6 copies/µL for L. monocytogenes [ 97 ]. Surface plasmon resonance is an optical method used in the past for LAMP detection [ 94 ]. LAMP, combined with SPR imaging, was reported by Nawattanapaiboon et al. [ 98 ] for the detection of MRSA in clinical samples. A bio-functionalized array was fabricated by immobilizing biotinylated probes using self-assembled monolayer surfaces (SAMs), which allowed multiplex detection of fem B and mec A genes of MRSA and obtained a LOD of 10 copies per microliter sample. In another effort, gold nanoprobes, complementary to F2 and F1C, were modified for SPR-based detection of LAMP [ 99 ]. This assay achieved a detection limit of 20 CFU/mL for Salmonella typhi in 30 min. Over the past few years, LAMP-integrated surface-enhanced Raman scattering (SERS) gained tremendous popularity in nucleic acid amplification tests (NAATs) due to its high sensitivity and reproducibility [ 95 ]. Draz and Lu [ 100 ] reported a LAMP-combined SERS assay for the rapid and sensitive detection of Salmonella enterica ( S. enterica ), in which the Raman active gold nanoprobes consisted of modified AuNPs with cy5/DNA probes for SERS detection of the LAMP products. The assay achieved a detection limit of 66 CFU/mL for Salmonella enteritidis , showing 100-fold higher sensitivity than conventional PCR. In addition, the assay expressed high specificity, as the detection of Salmonella was validated from contaminated milk samples. In another work, a microdroplet-based LAMP was paired with SERS to detect pathogens from the food matrix [ 101 ]. As displayed in Figure 5 B, multifunctional AuNPs consisted of the following components: Raman reporter 1-naphthalenethiol, with glutathione (GSH) as a complexing agent and thiolated polyethylene glycol as a stabilizer. Due to the complexation of the carboxylic acid group of glutathione and pyrophosphate, the AuNPs aggregated and were then used to detect the target, which provided an enhanced SERS signal, resulting in the detection of L. monocytogenes with a sensitivity of 3.6 × 10 2 CFU/mL in the milk sample. Figure 5 Optical detection methods of LAMP amplicons. ( A ) Schematic representation of retroreflective Janus particle−based biosensor. ( B ) Detection of LAMP amplified DNA using SERS. Reproduced with permission from references [ 96 , 101 ]. Copyright 2018 American Chemical Society, 2020 MDPI. 3.1.5. Diffusometric Method The combination of LAMP with diffusometry, a technique based on the simple principle of Brownian motion of microscopic particles, has emerged in recent years as a method of sensitive and rapid detection of infectious pathogens [ 32 ]. According to the Stokes–Einstein equation, particle diffusion is inversely proportional to the sample viscosity. Therefore, the microlevel viscosity change due to the presence of LAMP amplicons is determined by analysing the series of particle images. Clayton et al. [ 102 ] reported the LAMP combined particle diffusometry method for the detection of blood-borne pathogens, as 200 nm fluorescent polystyrene particles were imaged with a CCD camera and analysed with a cross-correlation algorithm to detect the amplified DNA from Staphylococcus aureus ( S. aureus ) and Klebsiella pneumoniae . One year later, they successfully detected a single cell of Vibrio cholerae in a pure water sample in just 20 min using particle diffusometry [ 103 ]. Their assay displayed 10-fold higher sensitivity than the gold-standard, real-time LAMP. On the other hand, Das et al. [ 104 ]. developed a Janus particle-enabled rotational diffusometric sensor paired with LAMP for Escherichia coli ( E. coli ) gDNA. Analysis of 300 images of blinking signals from 1 µm sized half-fluorescent half-gold functionalized Janus particles via a cross-correlation algorithm obtained a LOD of 48.2 pg/µL of E. coli gDNA in just 10 min, with a sample volume as low as 2 µL. In the follow-up article, the authors reported the detection of SARS-CoV-2 nsp-2 cDNA in a recombinant plasmid with a LOD of 70 ag/µL in 10 min using rotational diffusometry combined with LAMP [ 105 ]. It 10-fold higher sensitivity compared to the gold standard: real-time PCR. In another strategy, a smartphone-based POC device was developed for end-point detection of LAMP amplicons using particle diffusometry. This device was used to detect Vibrio cholerae [ 106 ] and Plasmodium falciparum [ 107 ] with a LOD of 6 cells/reaction (0.66 aM) in 35 min and a LOD of 3 parasites/μL from a blood sample in 45 min, respectively. The device consists of a 3D-printed platform with a microscopic lens, an LED light, and a smartphone to take a video of the amplified sample with fluorescent beads. At a later date, Colbert et al. [ 108 ] modified this device further and reported the detection of SARS-CoV-2 using RT-LAMP. A portable heating unit and a microfluidic chip for performing RT-LAMP and sample analysis were further integrated into the device. This platform was capable of detecting 30 copies/µL of SARS-CoV-2 extracted RNA and 35 × 10 4 virus copies/mL in diluted saliva. A comparison between various end-point detection methods of LAMP amplicons is summarized in Table 1 . 3.2. Real-Time Detection 3.2.1. Electrochemical Detection Real-time detection of LAMP products provides quantitative results without an additional sample preparation step. This saves time, limits the chances of false positives due to cross-contamination, and also delivers the advantage of extensive sample analysis with high accuracy. Thus, the LAMP-integrated real-time detection method can be used for the development of a portable, miniaturized POC diagnostic tool. The electrochemical detection method has been extensively used in real-time and quantitative analysis of LAMP amplicons ( Table 2 ). Martin et al. [ 109 ] developed a LAMP-based electrochemical readout device for the detection of 48 samples in a real-time manner ( Figure 6 A). The device consists of a multiplexed potentiostat which enables simultaneous measurement of square-wave voltammetric responses for four different redox reporters, viz, [Os-(bpy) 2 dppz] 2+ , PhP, MB, and Ru(NH 3 ) 6 3+ . A LOD of as low as 2 copies/reaction was achieved for Flavobacterium columnare in just 30 min. In another work, Gosselin et al. [ 110 ] reported a screen-printed pH-sensitive polyaniline (PAni)-based electrode with an Ag/AgCl reference electrode for real-time detection of the LAMP assay of Bacillus thuringiensis with a LOD of 10 copies of DNA per reaction ( Figure 6 B). The PAni-based electrode detects the change in solution pH due to the polymerase enzyme activity during the LAMP reaction. A portable electronic acquisition card was used to obtain the potentiometric readouts, making this a suitable candidate for POC diagnostics of LAMP-based detection methods. Another LAMP-integrated, portable electrochemical device was developed for the detection of hepatitis B virus (HBV) DNA with a LOD of 6.18 fg/µL [ 111 ]. The drop-cell consisted of a platinum (Pt) working electrode connected to a potentiostat placed in a water bath. Methylene blue was used as a redox indicator to monitor the real-time electrochemical signals and the decrease in current due to the binding of MB with LAMP amplicons being measured by square-wave voltammetry (SWV). Similarly, Huang et al. [ 112 ] established a fully integrated electrochemical device combined with LAMP for the detection of E. coli O157:H7 and S. enterica targeting the vt and invA genes, respectively. The device was integrated with a gold electrode, and the redox molecule MB was used for electrochemical signal generation. The assay achieved a detection limit of LOD of 10 and 1 DNA copy per reaction in just 30 min for E. coli O157:H7 and S. enterica , respectively. This research group later developed a bis-intercalating redox reagent for real-time electrochemical qualitative analysis of LAMP amplicons. The redox probe was synthesized using two naphthoquinone-imidazole (NQIM) molecules which are covalently bonded by a linker group (R). This system achieved a LOD of single-copy Salmonella DNA in just 10 min [ 113 ]. 3.2.2. Smartphone-Based Real-Time Detection It is an alternative method for the real-time monitoring of LAMP amplicons. This can be achieved by analysing the RGB value of the series of images captured during the amplification. The change in colour value is determined by using turbidity, colorimetric, and fluorescent dye. For example, Priye et al. [ 114 ] developed a portable LAMP device equipped with a smartphone for real-time detection of Neisseria gonorrhoeae ( N. gonorrhoeae ). This method utilizes the chromaticity-luminance methodology to measure the fluorescence intensity of the amplified LAMP product, which delivered a detection sensitivity of 3.5 copies/10 μL sample. Similarly, Wang et al. [ 115 ] developed an on-chip POC device integrated with LAMP for viable S. typhimurium detection using a smartphone-based real-time turbidity method. The Salmonella cells were mixed with propidium monoazide (PMA) and anti- Salmonella capture antibody-coated magnetic nanoparticles for the pre-treatment of dead bacterial DNA. The system was capable of detecting 14 CFU/mL of S. typhimurium in chicken meat within 90 min. Another smartphone-based quantitative molecular diagnostic platform was developed for the real-time colorimetric defection of LAMP assay [ 116 ] ( Figure 6 C). This low-cost and portable device was successful in the quantitative analysis of HPV DNA from saliva and vaginal swabs and HIV RNA from plasma samples. In another study, Thio et al. [ 117 ] developed a lab-on-a-smartphone (LOS) platform integrated with a plasmonic-enhanced optoelectrowetting (OEW) device for monitoring bacterial contamination in environmental water samples. The integration of the OEW enables pumpless droplet manipulation for on-chip sample preparation. It utilizes the smartphone camera as an optical detector for the colorimetric study through red–green–blue (RGB) analysis using the image processing application. This advanced device delivers real-time detection of E. coli in just 30 min. In another work, Nguyen et al. [ 118 ] developed a 3D-printed, portable smartphone-based integrated genetic unit (i-Gene) for the POC diagnostics of infectious pathogens. The LAMP amplification was performed on a microfluidic chip and the heater for LAMP was powered by the smartphone ( Figure 6 D). The smartphone was powered by a 5.0 V power bank. Eriochrome Black T (EBT) was used for colorimetric detection of the LAMP reaction. Upon gene amplification, the colour change of the sample was visualized in real-time by the CMOS sensor of the smartphone camera, enabling sensitive detection of E. coli O157:H7 with a LOD of 10 copies/µL in just 60 min. In the same year, they developed a smartphone application for the colorimetric detection of LAMP and measured the DNA copy number in the test sample using a calibration curve plotted to form the known template concentration vs. threshold time [ 119 ] ( Figure 6 E). This fully integrated smartphone-based device is an ultimate solution for the POC testing of infectious pathogens and early disease control, especially in developing countries and resource-limited situations. Two years later, this group developed an Internet of Things (IoT)-based portable, lightweight (320 g), and miniaturized diagnostic device for rapid COVID-19 screening [ 120 ]. This fully automated device was powered by a portable battery and operated with a smartphone. An integrated microfluidic chip was utilized for viral lysis, RNA extraction, and RT-LAMP reaction targeting multiple genes (N, E, and As1e genes) of SARS-CoV-2. RT-LAMP was monitored in real-time by measuring the fluorescence intensities via a CMOS sensor upon excitation with a 488 nm wavelength of LED light. The recorded data were processed and analysed by a microprocessor installed in the device and wirelessly transferred and displayed on the smartphone. A LOD of 20 copies/µL was achieved with an assay time of 65 min using SYBR green dye. biosensors-12-01068-t002_Table 2 Table 2 LAMP-based real-time detection methods. Technique Pathogen Signal Transduction Material Detection Method Time LOD Reference Electrochemical Salmonella Bis-NQIM-R (naphthoquinone- imidazole) Differential pulse voltammetry (DPV) 10 min 1 copy/reaction [ 113 ] Flavobacterium columnare [Os-(bpy) 2 dppz] 2+ , PhP and MB and Ru(NH 3 ) 6 3+ Square wave voltammetry (SWV) 30 min 2 copies/reaction [ 109 ] E. coli O157:H7 S. enterica Methylene blue Differential pulse voltammetry (DPV) 30 min 10 copies/reaction 1 copy/reaction [ 112 ] Hepatitis B virus Methylene blue Square wave voltammetry (SWV) 60 min 6.18 fg/µL [ 111 ] Smartphone-based E. coli O157:H7 Eriochrome Black T (EBT) Colorimetric 60 min 10 copies/μL [ 118 ] N. gonorrhoeae SYTO Fluorescence 40 min 3.5 copies per 10 μL [ 115 ] SARS-CoV-2 SYBR Fluorescence 65 min 20 copies/ μL [ 120 ] Figure 6 LAMP−based real-time detection modalities. ( A , A1 ) Overview of the electrochemical readout device for real−time monitoring of LAMP reactions; ( A2 ) PCR thermocycler attached with a flat Peltier-heating block with two 72-pin connectors; ( A3 ) electrochemical microplate consisting 48 wells; ( A4 ) PCB interface carrying the multiplexed potentiostat's electronic circuitry; ( A5 ) specialized software to extract the electrochemical response from each microwell and pilot the PCB interface. ( B ) Screen-printed pH-sensitive polyaniline (PAni)-based electrode for real-time detection of LAMP. ( C ) Hue-based detection of HPV and HIV by a "smart connected pathogen tracer" (SCPT) device. ( D ) Schematic illustration of smartphone-integrated i-Gene analyser and its inside view. ( E ) 3D schematics of i−Genbox for real-time detection of infectious pathogens. Reproduced with permission from references [ 109 , 110 , 116 , 118 , 119 ]. Copyright 2016, 2017, 2020 American Chemical Society, 2020 Springer Nature. 3.1. End-Point Detection 3.1.1. Colorimetric Detection Colorimetric detection of LAMP products can be divided into two categories: turbidity and use of dye. During the LAMP reaction, deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs) reacts with magnesium sulphate (MgSO 4 ) to yield a white precipitate of magnesium pyrophosphate (Mg 2 P 2 O 7 ), increasing the solution's turbidity [ 39 ]. No additional read-out instrument is required, as the change in turbidity can be determined by the human eye. Garg et al. [ 40 ] introduced successful LAMP-based turbidimetric detection of Mycobacterium leprae targeting the 16s rRNA gene. Likewise, similar studies reported the detection of multiple pathogens—for instance, Clostridium botulinum [ 41 ], Streptococcus pneumoniae [ 42 ], and Streptococcus agalactiae [ 43 ]. However, this method provides low sensitivity, as the faint product can easily be misjudged. As alternatives to the turbidity method, molecular probes are employed for the colorimetric detection of LAMP products. The most common colorimetric indicators are metal-ion indicator dyes, namely, calcein, hyroxynapthol blue (HNB) plus eriochrome black T (EBT), pH-sensitive dyes (phenol red, neutral red), and other fluorescence probes. These dyes provide a significant change in colour with the presence of LAMP amplicons but do not inhibit the amplification process [ 44 ]. Therefore, they can be added at the beginning of the LAMP reaction. Additionally, various DNA intercalating dyes, such as SYBR Green I, propidium iodide (PI), and SYTO-81, are used to detect the LAMP product with high sensitivity and can be easily monitored under visible light or UV regions. HNB and calcein are the most commonly used dsye for the colorimetric detection of LAMP. Initially, calcein binds with Mn 2+ ions, which quenches its fluorescence activity, and the LAMP reaction mixture appears orange in colour. Then, Mn 2+ ions form a complex with pyrophosphate P 2 O 7 4− during the amplification process, hence recovering the green fluorescence. In addition, the fluorescence signal is further enhanced by calcein–Mg 2+ complex formation [ 39 ]. Similarly, HNB shows a change in colour from purple to blue due to the reduction in Mg 2+ ions' concentration [ 44 ]. Zhu et al. [ 45 ] developed a capillary-array-based POC platform combining LAMP for the detection of the African swine fever virus (ASFV) by targeting five different genes (D1133L, B962L, B646L, G1340L, and C717R). The capillary array is named "Hive chip" due to its hive-like shape, where the reagents are loaded and distributed inside the chip by capillary forces. Direct blood samples treated with sodium hydroxide were used for LAMP without any further DNA extraction and showed a LOD of 50 copies/µL over an assay time of 70 min by using calcein dye. In another work, Yao et al. [ 46 ] designed a PDMS-made, portable, self-driven microfluidic chip enabling automatic and rapid loading of samples for RT-LAMP. The system can detect eight vector-borne viruses, including Chikungunya virus (CHIKV) and Dengue virus (DENV). Calcein-based colorimetric detection achieved a LOD of 100 copies for CHIKV and DENV-1 in just 50 min, including 3 min for self-powered sample loading and 45 min for RT-LAMP. Furthermore, the developed method tested using 120 mosquito samples and 50 clinical samples provided consistent results with RT-PCR analysis. Similarly, another self-driven POC microfluidic platform was developed as a combination with LAMP for rapid colorimetric detection of blood-borne pathogens empowered by calcein. Reagents can be loaded into the self-driven chip within 12 min. After 50 min LAMP, results were recorded and monitored using a smartphone camera. Multiplex detection of three pathogens, namely, human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B (HBV), and hepatitis C virus (HCV), with a LOD of 2 copies/µL, was achieved with a turnaround time of 65 min [ 47 ]. Jin et al. [ 48 ] devised a self-priming compartmentalization (SPC) microfluidic platform for HNB-based naked-eye detection of food-borne pathogens. The self-filling of the microfluidic LAMP platform was achieved by negative pressure. On top of that, the closed wells eliminated cross-contamination to ensure accuracy. Simultaneous detection of six food-borne pathogens was realized through the SPC device with a detection limit of 10 2 –10 3 CFU/mL in an assay time of 60 min. In another effort, Deng et al. [ 49 ] reported a LAMP-based, portable, and self-contained device for POC diagnosis of the SARS-CoV-2 virus. A disposable cartridge consisting of a PDMS-based microfluidic chip was designed to perform reagent transportation, viral lysis, and a RT-LAMP reaction ( Figure 2 A). Microchip operation was controlled by a battery-operated, Arduino-based microcontroller with a size of 6 × 9 × 4 cm 3 . The pocket-size device obtained colorimetric detection of 300 copies of RNA per reaction with a sample-to-answer time of 30 min. During LAMP, a pH-sensitive dye can sense the amplified DNA molecule through the solution's pH, which becomes lower due to the products [ 50 ]. For example, a POC diagnostic method was developed for rapid and sensitive detection of Clostridium tyrobutyricum in milk using pH-sensitive Cresol Red dye ( Figure 2 B). DNA extraction was achieved by chemical lysis, which eliminates the time-consuming multistep purification process. A LOD of ~2 spores/mL was achieved by direct visualization of colour change from red to yellow in contaminated milk samples with high sensitivity and specificity [ 51 ]. Ye et al. [ 52 ] developed a glass fibre paper-based POC diagnostic tool capable of RNA extraction in 5 min, the isothermal amplification of the target gene in just 25 min, and a visual readout of the final product. This low-cost paper disc obtained a LOD of 1 × 10 3 copies/mL for rotavirus A with very high specificity by employing pH-sensitive neutral red dye. Furthermore, this paper device was tested with 48 clinical samples and showed a comparable detection sensitivity to the gold-standard, RT-PCR. In another study, Song et al. [ 53 ] developed rapid, low-cost, easy-to-use self-testing kits for COVID-19 by direct naked-eye detection of colorimetric test results ( Figure 2 C). The complete workflow, including sample collection, RNA purification, isothermal amplification of target genes in a thermos, and visual analysis of results takes less than 60 min. The following lyophilization protocol allows long-term storage of RT-LAMP reagents at room temperature for 10 days. A LOD of 100 RNA copies/reaction was achieved with 99% specificity. The dye SYBR Green I, which exhibits a visible colour change under white light (reddish-orange to yellowish-green) and fluoresces in the ultraviolet regions has been used in the past for monitoring LAMP reactions. For example, Wang et al. [ 54 ] reported the detection of Fusarium proliferatum with a LOD of 10 pg/µL in 30 min. Additionally, a SYBR Green I-based LAMP assay was used for the detection of Listeria monocytogenes ( L. monocytogenes ), [ 55 ] Enterocytozoon hepatopenaei , [ 56 ] Milk vetch dwarf virus [ 57 ], and Bacillus anthracis [ 58 ]. Recently, Oliveira et al. [ 59 ] reported RT-LAMP-based detection of SARS-CoV-2 in a fully integrated and automated POC device. SYBR green I was used for the colorimetric detection of the viral genome with a LOD of 10 −3 copies/reaction. Clinical samples tested using this developed protocol correlated well with real-time qPCR, demonstrating a reliable tool for rapid COVID-19 diagnosis in resource-limited regions. In another effort, an RT-LAMP integrated polycarbonate-based POC testing device was developed for multiplex detection of SARS-CoV-2 and influenza A H1N1 virus within 50 min ( Figure 2 D). This multiplexed platform allows reagent mixing and preparation without any power outlets or pipetting. A ball-based valve system was used for sample delivery, enabling paper-based RNA enrichment and reagent preparation. Colorimetric detection for SARS-CoV-2 and H1N1 virus was achieved with LODs of 2 and 6 genomes per reaction, respectively. Furthermore, this device can detect virus particles from clinical and environmental samples [ 60 ]. Bokelmann et al. [ 61 ] presented the Cap-iLAMP acronym for capturing and an improved loop-mediated isothermal amplification method for smartphone-based colorimetric detection of SARS-CoV-2 from gargle lavage samples ( Figure 2 E). This bulk testing method utilizing the hybridization capture for RNA purification enables a detection sensitivity of 500 copies/reaction within 55 min. Cap-iLAMP eliminates false positives by allowing single-positive specimens to be identified in pools of 25 negative samples, lowering the reagent cost for each test to less than ~1 Euro per person. Colorimetric detection eliminates the use of expensive readers and signal processing units, making it low-cost and easy to operate. However, it is qualitative, and obtaining quantitative analysis remains challenging. Figure 2 LAMP-based biosensors using dye detection. ( A ) A self-contained device diagnosis of SARS-CoV-2 virus with a disposable cartridge and an Arduino-based reusable microcontrolling unit. ( B ) Schematic representation of Clostridium tyrobutyricum in milk at POC. ( C ) Illustration of a thermos-based home test for COVID-19. ( D ) Polycarbonate POC testing device with a ball-based valve system for sample delivery and reagent preparation. ( E ) Workflow of Cap-iLAMP. Reproduced with permission from references [ 49 , 51 , 53 , 60 , 61 ]. Copyright 2021 and 2022 Springer Nature, 2021 American Chemical Society, 2021 MDPI. 3.1.2. Electrochemical Detection Electrochemical sensors have demonstrated promising benefits, such as rapid detection with high sensitivity and selectivity for developing POC diagnostic tools [ 62 , 63 ]. They have been extensively explored for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) [ 64 , 65 ], nucleic acids, and their amplified products over the past few decades [ 66 , 67 , 68 ]. Integration of LAMP with electrochemical sensors can provide fast and ultra-sensitive detection of various analytes by measuring the oxidation reduction in the electro-active molecules due to the interaction with the LAMP product. Another strategy involves the immobilization of the probe on the surface of the working electrode with a redox reporter, which can monitor the electrochemical signals by linear-sweep voltammetry (LSV) [ 69 ], square-wave voltammetry (SWV) [ 70 ], differential-pulse voltammetry (DPV) [ 71 ], or conductivity [ 72 ]. The LAMP product can be detected after the reaction or monitored in real-time through electrochemical sensors [ 73 ]. Regarding real-time detection, numerous redox molecules, including methylene blue (MB) and ruthenium hexamine, can be used, as they do not inhibit DNA amplification [ 21 ]. However, some of them, namely, Hoechst 23458, may impede the LAMP reaction and are unusable for instantaneous sensing [ 74 ]. Jaroenram et al. [ 75 ] detected the LAMP amplicons on a screen-printed graphene electrode (SPGE) using an in-house mini potentiostat device to measure the cyclic voltammogram displayed on an LCD screen with Hoechst-33258 as the electrochemical redox agent ( Figure 3 A). The assay had a LOD of 40 CFU/reaction for Mycobacterium tuberculosis with a turnaround time of 65 min. A similar electrode system and a portable potentiostat device were used to detect the LAMP product of Vibrio parahaemolyticus ( V. parahaemolyticus ) with a detection limit of 0.3 CFU per 25 g of raw seafood in 45 min [ 76 ]. In another effort, Fu et al. [ 77 ] developed a LAMP-based electrochemical sensor for Group B Streptococci (GBS), which demonstrated a broad detection range of 1 fg µL −1 to 100 pg µL −1 . Thiolated β-cyclodextrin (SH-β-CD) was immobilized onto the AuNPs@MoS 2 -modified glassy electrode surface via Au–S bonding. Thus, the ferrocene (Fc)-modified primers enable the binding of the amplified product via a host–guest interaction between Fc and β-CD ( Figure 3 B). MB was used as a redox agent to produce a strong electrochemical signal during the interaction with the LAMP product, yielding a low detection limit of 0.23 fg µL −1 . In another study, Zamani et al. [ 78 ] introduced a CRISPR/Cas12a activation-based sensor for the human papillomavirus (HPV) virus, which achieved a LOD of 10 4 copies of DNA per reaction. A methylene-blue-tagged oligo was immobilized on a gold-leaf electrode ( Figure 3 C). Square-wave voltammetry (SWV) was used for electrochemical readouts of methylene-blue-tagged oligos by Cas12a enzyme activity. Other studies employed a combination of digoxigenin-labelled nucleotides (DIG-dUTPs)-based LAMP and streptavidin-modified magnetic beads for the separation and amperometric detection of HPV16 and HPV18 in a carbon-based electrode system. After a successful LAMP reaction, the resulted amplicons were incubated with the modified magnetic beads, followed by anti-DIG Ab conjugated with horseradish peroxidase (HRP). The magnetic beads were concentrated on the electrode's surface using a magnet, and amperometric monitoring of the HRP reaction was performed [ 79 ]. In the next attempt, 61 cervical samples for both genotypes were screened and validated with real-time PCR and commercial HPV tests such as INNO-LiPA and COBAS. The system had 90% accuracy [ 80 ]. Recently, Ramírez-Chavarría et al. [ 81 ] proposed a LAMP-based low-cost electrochemical sensor for specific detection of a SARS-CoV-2 gene sequence, in which RT-LAMP is performed on a disposable test strip consisting of a screen-printed electrode. Methylene blue was used as an electrochemical redox probe to deliver a diffusion-controlled current during the interaction with LAMP products, as square-wave voltammetry (SWV) was chosen for electrochemical readouts. The test strips showed a detection sensitivity of ~2.5 × 10 −6 ng/µL, along with high specificity and reproducibility. 3.1.3. Lateral Flow Assay Detection Lateral flow tests (LFTs) were used extensively in recent years for LAMP-based rapid POC diagnostics tests. The test line on the lateral flow assay strip catches biotin-labelled LAMP amplicons hybridized with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labelled DNA probes, which later bind to gold-based anti-FITC antibodies to create a legible output. Non-hybridized FITC probes attach to gold-labelled anti-FITC antibodies, generating a biotin-free double complex that travels from the test to the control line. The detection sensitivity with extracted genomic DNA was 600 fg/reaction for Mycoplasma pneumoniae [ 82 ], 100 fg/reaction for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) [ 83 ], and Pseudomonas aeruginosa [ 84 ] 630 fg/reaction for V. parahaemolyticus [ 85 ] and 13.5 fg/µL for Salmonella [ 86 ]. For obtaining a higher sensitivity and accuracy, nanomaterials and enzymatic enhancements were investigated by various research groups. For example, Shi et al. [ 87 ] developed a propidium monoazide (PMA) based nanozyme strip for viable detection of L. monocytogenes with a LOD of 10 CFU/mL. The color change was further enhanced by an enzymatic reaction between the nanozyme and DAB/H 2 O 2 (enzyme substrate). Gold nanoparticles were replaced by Fe 3 O 4 nanoparticles, which provided better dispersibility. In another work, A quantum dot nanobead-based LFT was developed by Shang et al. [ 88 ] for quantitative detection of S. typhimurium ( S. typhimurium ). The visual LOD of 10 3 CFU/mL achieved a linear range of 10 2 –10 8 CFU/mL, 10-fold higher than AuNPs labelled strips. Yang et al. [ 89 ] reported polymer nanoparticles lateral flow biosensors in combination with LAMP for the detection of Brucella abortus targeting BruAb2_0168 gene. The assay achieved a LOD of 100 fg/reaction with a turnaround time of 85 min. Additionally, a multiplex LAMP-based LFT was reported for the detection of two malaria-causing parasites, viz. , Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum , where FITC and digoxigenin-labelled probes hybridized with the LAMP amplicons having a complementary nucleotide sequence ( Figure 4 A). A clear band was visualized on the strip within 60 min for both species. Detection sensitivity reached 0.15 pg/µL for extracted genomic DNA [ 90 ]. LFT combined with RT-LAMP has been proven to be a promising tool for rapid diagnosis of COVID-19 at POC. A polymerase-nanoparticle-based LFT coupled with RT-LAMP was designed by Zhu et al. [ 91 ] for the simultaneous detection of specific genes from the SARS-CoV-2 genome using two sets of LAMP primers in a single reaction tube. The primers for ORF1ab and N genes were labelled with FITC and digoxin, respectively, with an additional biotin tag. Immunoreaction between FITC, digoxin, and biotin-labelled duplex LAMP amplicons with anti-FITC/digoxin in the test line produced a characteristic crimson band that enables the multiplex detection of both genes with a LOD of 12 copies/reaction. The entire process, from sample collection to the results, was accomplished within 1 h. In another work, a palm-sized, portable microfluidic platform integrated with a pregnancy test strip (PTSs) was developed for POC diagnosis of the SARS-CoV-2 genome ( Figure 4 B). Highly specific human chorionic gonadotropin probes (hCG-p) were designed to hybridize with the specific loop region of the RT-LAMP amplicons, and thus to be unable to move through the PTSs and appear only on the control line on the strip. Ultrasensitive detection with a LOD of 0.5 copy/µL was achieved with an assay time of 120 min by on-site naked-eye visualization [ 92 ]. LAMP provides specific amplification of the target, and lateral flow sensors offer a cheap and easy readout method. Therefore, LAMP combined with LFTs has enormous potential for creating POC diagnostic platforms. This technique can be combined with microfluidic platforms to allow high-throughput analysis while removing the possibility of cross-contamination. Figure 4 LAMP-based lateral flow biosensors. ( A ) Outline of the lateral flow strip for detection of LAMP amplicons. ( B ) A portable microfluidic platform integrated with a pregnancy test strip (PTSs) for POC diagnosis of COVID-19. Reproduced with permission from references [ 90 , 92 ]. Copyright 2021 American Chemical Society, 2022 MDPI. 3.1.4. Optical Detection Optical devices have emerged as an alternative solution and are extensively used in the end-point detection of LAMP products. Optical sensors and instruments, such as a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) [ 93 ], surface plasmon resonance (SPR) [ 94 ], and surface-enhanced Raman scattering (SERS) [ 95 ], have been used for monitoring LAMP amplicons. Chun et al. [ 96 ] designed a detection method for food-borne pathogens using a CMOS sensor and white LED light by integrating retroreflective Janus particle (RJP) and LAMP, which achieved a LOD of 10 2 CFU for S. typhimurium . A DNA probe immobilized on the RJPs was injected into the LAMP product, resulting in a hybridized sandwich structure formation between the LAMP product and RJPs ( Figure 5 A). In another work, a smartphone-based image processing method was applied in sensing food-borne pathogens using SYTO-9, which yielded a LOD of 6 copies/µL for L. monocytogenes [ 97 ]. Surface plasmon resonance is an optical method used in the past for LAMP detection [ 94 ]. LAMP, combined with SPR imaging, was reported by Nawattanapaiboon et al. [ 98 ] for the detection of MRSA in clinical samples. A bio-functionalized array was fabricated by immobilizing biotinylated probes using self-assembled monolayer surfaces (SAMs), which allowed multiplex detection of fem B and mec A genes of MRSA and obtained a LOD of 10 copies per microliter sample. In another effort, gold nanoprobes, complementary to F2 and F1C, were modified for SPR-based detection of LAMP [ 99 ]. This assay achieved a detection limit of 20 CFU/mL for Salmonella typhi in 30 min. Over the past few years, LAMP-integrated surface-enhanced Raman scattering (SERS) gained tremendous popularity in nucleic acid amplification tests (NAATs) due to its high sensitivity and reproducibility [ 95 ]. Draz and Lu [ 100 ] reported a LAMP-combined SERS assay for the rapid and sensitive detection of Salmonella enterica ( S. enterica ), in which the Raman active gold nanoprobes consisted of modified AuNPs with cy5/DNA probes for SERS detection of the LAMP products. The assay achieved a detection limit of 66 CFU/mL for Salmonella enteritidis , showing 100-fold higher sensitivity than conventional PCR. In addition, the assay expressed high specificity, as the detection of Salmonella was validated from contaminated milk samples. In another work, a microdroplet-based LAMP was paired with SERS to detect pathogens from the food matrix [ 101 ]. As displayed in Figure 5 B, multifunctional AuNPs consisted of the following components: Raman reporter 1-naphthalenethiol, with glutathione (GSH) as a complexing agent and thiolated polyethylene glycol as a stabilizer. Due to the complexation of the carboxylic acid group of glutathione and pyrophosphate, the AuNPs aggregated and were then used to detect the target, which provided an enhanced SERS signal, resulting in the detection of L. monocytogenes with a sensitivity of 3.6 × 10 2 CFU/mL in the milk sample. Figure 5 Optical detection methods of LAMP amplicons. ( A ) Schematic representation of retroreflective Janus particle−based biosensor. ( B ) Detection of LAMP amplified DNA using SERS. Reproduced with permission from references [ 96 , 101 ]. Copyright 2018 American Chemical Society, 2020 MDPI. 3.1.5. Diffusometric Method The combination of LAMP with diffusometry, a technique based on the simple principle of Brownian motion of microscopic particles, has emerged in recent years as a method of sensitive and rapid detection of infectious pathogens [ 32 ]. According to the Stokes–Einstein equation, particle diffusion is inversely proportional to the sample viscosity. Therefore, the microlevel viscosity change due to the presence of LAMP amplicons is determined by analysing the series of particle images. Clayton et al. [ 102 ] reported the LAMP combined particle diffusometry method for the detection of blood-borne pathogens, as 200 nm fluorescent polystyrene particles were imaged with a CCD camera and analysed with a cross-correlation algorithm to detect the amplified DNA from Staphylococcus aureus ( S. aureus ) and Klebsiella pneumoniae . One year later, they successfully detected a single cell of Vibrio cholerae in a pure water sample in just 20 min using particle diffusometry [ 103 ]. Their assay displayed 10-fold higher sensitivity than the gold-standard, real-time LAMP. On the other hand, Das et al. [ 104 ]. developed a Janus particle-enabled rotational diffusometric sensor paired with LAMP for Escherichia coli ( E. coli ) gDNA. Analysis of 300 images of blinking signals from 1 µm sized half-fluorescent half-gold functionalized Janus particles via a cross-correlation algorithm obtained a LOD of 48.2 pg/µL of E. coli gDNA in just 10 min, with a sample volume as low as 2 µL. In the follow-up article, the authors reported the detection of SARS-CoV-2 nsp-2 cDNA in a recombinant plasmid with a LOD of 70 ag/µL in 10 min using rotational diffusometry combined with LAMP [ 105 ]. It 10-fold higher sensitivity compared to the gold standard: real-time PCR. In another strategy, a smartphone-based POC device was developed for end-point detection of LAMP amplicons using particle diffusometry. This device was used to detect Vibrio cholerae [ 106 ] and Plasmodium falciparum [ 107 ] with a LOD of 6 cells/reaction (0.66 aM) in 35 min and a LOD of 3 parasites/μL from a blood sample in 45 min, respectively. The device consists of a 3D-printed platform with a microscopic lens, an LED light, and a smartphone to take a video of the amplified sample with fluorescent beads. At a later date, Colbert et al. [ 108 ] modified this device further and reported the detection of SARS-CoV-2 using RT-LAMP. A portable heating unit and a microfluidic chip for performing RT-LAMP and sample analysis were further integrated into the device. This platform was capable of detecting 30 copies/µL of SARS-CoV-2 extracted RNA and 35 × 10 4 virus copies/mL in diluted saliva. A comparison between various end-point detection methods of LAMP amplicons is summarized in Table 1 . 3.1.1. Colorimetric Detection Colorimetric detection of LAMP products can be divided into two categories: turbidity and use of dye. During the LAMP reaction, deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs) reacts with magnesium sulphate (MgSO 4 ) to yield a white precipitate of magnesium pyrophosphate (Mg 2 P 2 O 7 ), increasing the solution's turbidity [ 39 ]. No additional read-out instrument is required, as the change in turbidity can be determined by the human eye. Garg et al. [ 40 ] introduced successful LAMP-based turbidimetric detection of Mycobacterium leprae targeting the 16s rRNA gene. Likewise, similar studies reported the detection of multiple pathogens—for instance, Clostridium botulinum [ 41 ], Streptococcus pneumoniae [ 42 ], and Streptococcus agalactiae [ 43 ]. However, this method provides low sensitivity, as the faint product can easily be misjudged. As alternatives to the turbidity method, molecular probes are employed for the colorimetric detection of LAMP products. The most common colorimetric indicators are metal-ion indicator dyes, namely, calcein, hyroxynapthol blue (HNB) plus eriochrome black T (EBT), pH-sensitive dyes (phenol red, neutral red), and other fluorescence probes. These dyes provide a significant change in colour with the presence of LAMP amplicons but do not inhibit the amplification process [ 44 ]. Therefore, they can be added at the beginning of the LAMP reaction. Additionally, various DNA intercalating dyes, such as SYBR Green I, propidium iodide (PI), and SYTO-81, are used to detect the LAMP product with high sensitivity and can be easily monitored under visible light or UV regions. HNB and calcein are the most commonly used dsye for the colorimetric detection of LAMP. Initially, calcein binds with Mn 2+ ions, which quenches its fluorescence activity, and the LAMP reaction mixture appears orange in colour. Then, Mn 2+ ions form a complex with pyrophosphate P 2 O 7 4− during the amplification process, hence recovering the green fluorescence. In addition, the fluorescence signal is further enhanced by calcein–Mg 2+ complex formation [ 39 ]. Similarly, HNB shows a change in colour from purple to blue due to the reduction in Mg 2+ ions' concentration [ 44 ]. Zhu et al. [ 45 ] developed a capillary-array-based POC platform combining LAMP for the detection of the African swine fever virus (ASFV) by targeting five different genes (D1133L, B962L, B646L, G1340L, and C717R). The capillary array is named "Hive chip" due to its hive-like shape, where the reagents are loaded and distributed inside the chip by capillary forces. Direct blood samples treated with sodium hydroxide were used for LAMP without any further DNA extraction and showed a LOD of 50 copies/µL over an assay time of 70 min by using calcein dye. In another work, Yao et al. [ 46 ] designed a PDMS-made, portable, self-driven microfluidic chip enabling automatic and rapid loading of samples for RT-LAMP. The system can detect eight vector-borne viruses, including Chikungunya virus (CHIKV) and Dengue virus (DENV). Calcein-based colorimetric detection achieved a LOD of 100 copies for CHIKV and DENV-1 in just 50 min, including 3 min for self-powered sample loading and 45 min for RT-LAMP. Furthermore, the developed method tested using 120 mosquito samples and 50 clinical samples provided consistent results with RT-PCR analysis. Similarly, another self-driven POC microfluidic platform was developed as a combination with LAMP for rapid colorimetric detection of blood-borne pathogens empowered by calcein. Reagents can be loaded into the self-driven chip within 12 min. After 50 min LAMP, results were recorded and monitored using a smartphone camera. Multiplex detection of three pathogens, namely, human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B (HBV), and hepatitis C virus (HCV), with a LOD of 2 copies/µL, was achieved with a turnaround time of 65 min [ 47 ]. Jin et al. [ 48 ] devised a self-priming compartmentalization (SPC) microfluidic platform for HNB-based naked-eye detection of food-borne pathogens. The self-filling of the microfluidic LAMP platform was achieved by negative pressure. On top of that, the closed wells eliminated cross-contamination to ensure accuracy. Simultaneous detection of six food-borne pathogens was realized through the SPC device with a detection limit of 10 2 –10 3 CFU/mL in an assay time of 60 min. In another effort, Deng et al. [ 49 ] reported a LAMP-based, portable, and self-contained device for POC diagnosis of the SARS-CoV-2 virus. A disposable cartridge consisting of a PDMS-based microfluidic chip was designed to perform reagent transportation, viral lysis, and a RT-LAMP reaction ( Figure 2 A). Microchip operation was controlled by a battery-operated, Arduino-based microcontroller with a size of 6 × 9 × 4 cm 3 . The pocket-size device obtained colorimetric detection of 300 copies of RNA per reaction with a sample-to-answer time of 30 min. During LAMP, a pH-sensitive dye can sense the amplified DNA molecule through the solution's pH, which becomes lower due to the products [ 50 ]. For example, a POC diagnostic method was developed for rapid and sensitive detection of Clostridium tyrobutyricum in milk using pH-sensitive Cresol Red dye ( Figure 2 B). DNA extraction was achieved by chemical lysis, which eliminates the time-consuming multistep purification process. A LOD of ~2 spores/mL was achieved by direct visualization of colour change from red to yellow in contaminated milk samples with high sensitivity and specificity [ 51 ]. Ye et al. [ 52 ] developed a glass fibre paper-based POC diagnostic tool capable of RNA extraction in 5 min, the isothermal amplification of the target gene in just 25 min, and a visual readout of the final product. This low-cost paper disc obtained a LOD of 1 × 10 3 copies/mL for rotavirus A with very high specificity by employing pH-sensitive neutral red dye. Furthermore, this paper device was tested with 48 clinical samples and showed a comparable detection sensitivity to the gold-standard, RT-PCR. In another study, Song et al. [ 53 ] developed rapid, low-cost, easy-to-use self-testing kits for COVID-19 by direct naked-eye detection of colorimetric test results ( Figure 2 C). The complete workflow, including sample collection, RNA purification, isothermal amplification of target genes in a thermos, and visual analysis of results takes less than 60 min. The following lyophilization protocol allows long-term storage of RT-LAMP reagents at room temperature for 10 days. A LOD of 100 RNA copies/reaction was achieved with 99% specificity. The dye SYBR Green I, which exhibits a visible colour change under white light (reddish-orange to yellowish-green) and fluoresces in the ultraviolet regions has been used in the past for monitoring LAMP reactions. For example, Wang et al. [ 54 ] reported the detection of Fusarium proliferatum with a LOD of 10 pg/µL in 30 min. Additionally, a SYBR Green I-based LAMP assay was used for the detection of Listeria monocytogenes ( L. monocytogenes ), [ 55 ] Enterocytozoon hepatopenaei , [ 56 ] Milk vetch dwarf virus [ 57 ], and Bacillus anthracis [ 58 ]. Recently, Oliveira et al. [ 59 ] reported RT-LAMP-based detection of SARS-CoV-2 in a fully integrated and automated POC device. SYBR green I was used for the colorimetric detection of the viral genome with a LOD of 10 −3 copies/reaction. Clinical samples tested using this developed protocol correlated well with real-time qPCR, demonstrating a reliable tool for rapid COVID-19 diagnosis in resource-limited regions. In another effort, an RT-LAMP integrated polycarbonate-based POC testing device was developed for multiplex detection of SARS-CoV-2 and influenza A H1N1 virus within 50 min ( Figure 2 D). This multiplexed platform allows reagent mixing and preparation without any power outlets or pipetting. A ball-based valve system was used for sample delivery, enabling paper-based RNA enrichment and reagent preparation. Colorimetric detection for SARS-CoV-2 and H1N1 virus was achieved with LODs of 2 and 6 genomes per reaction, respectively. Furthermore, this device can detect virus particles from clinical and environmental samples [ 60 ]. Bokelmann et al. [ 61 ] presented the Cap-iLAMP acronym for capturing and an improved loop-mediated isothermal amplification method for smartphone-based colorimetric detection of SARS-CoV-2 from gargle lavage samples ( Figure 2 E). This bulk testing method utilizing the hybridization capture for RNA purification enables a detection sensitivity of 500 copies/reaction within 55 min. Cap-iLAMP eliminates false positives by allowing single-positive specimens to be identified in pools of 25 negative samples, lowering the reagent cost for each test to less than ~1 Euro per person. Colorimetric detection eliminates the use of expensive readers and signal processing units, making it low-cost and easy to operate. However, it is qualitative, and obtaining quantitative analysis remains challenging. Figure 2 LAMP-based biosensors using dye detection. ( A ) A self-contained device diagnosis of SARS-CoV-2 virus with a disposable cartridge and an Arduino-based reusable microcontrolling unit. ( B ) Schematic representation of Clostridium tyrobutyricum in milk at POC. ( C ) Illustration of a thermos-based home test for COVID-19. ( D ) Polycarbonate POC testing device with a ball-based valve system for sample delivery and reagent preparation. ( E ) Workflow of Cap-iLAMP. Reproduced with permission from references [ 49 , 51 , 53 , 60 , 61 ]. Copyright 2021 and 2022 Springer Nature, 2021 American Chemical Society, 2021 MDPI. 3.1.2. Electrochemical Detection Electrochemical sensors have demonstrated promising benefits, such as rapid detection with high sensitivity and selectivity for developing POC diagnostic tools [ 62 , 63 ]. They have been extensively explored for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) [ 64 , 65 ], nucleic acids, and their amplified products over the past few decades [ 66 , 67 , 68 ]. Integration of LAMP with electrochemical sensors can provide fast and ultra-sensitive detection of various analytes by measuring the oxidation reduction in the electro-active molecules due to the interaction with the LAMP product. Another strategy involves the immobilization of the probe on the surface of the working electrode with a redox reporter, which can monitor the electrochemical signals by linear-sweep voltammetry (LSV) [ 69 ], square-wave voltammetry (SWV) [ 70 ], differential-pulse voltammetry (DPV) [ 71 ], or conductivity [ 72 ]. The LAMP product can be detected after the reaction or monitored in real-time through electrochemical sensors [ 73 ]. Regarding real-time detection, numerous redox molecules, including methylene blue (MB) and ruthenium hexamine, can be used, as they do not inhibit DNA amplification [ 21 ]. However, some of them, namely, Hoechst 23458, may impede the LAMP reaction and are unusable for instantaneous sensing [ 74 ]. Jaroenram et al. [ 75 ] detected the LAMP amplicons on a screen-printed graphene electrode (SPGE) using an in-house mini potentiostat device to measure the cyclic voltammogram displayed on an LCD screen with Hoechst-33258 as the electrochemical redox agent ( Figure 3 A). The assay had a LOD of 40 CFU/reaction for Mycobacterium tuberculosis with a turnaround time of 65 min. A similar electrode system and a portable potentiostat device were used to detect the LAMP product of Vibrio parahaemolyticus ( V. parahaemolyticus ) with a detection limit of 0.3 CFU per 25 g of raw seafood in 45 min [ 76 ]. In another effort, Fu et al. [ 77 ] developed a LAMP-based electrochemical sensor for Group B Streptococci (GBS), which demonstrated a broad detection range of 1 fg µL −1 to 100 pg µL −1 . Thiolated β-cyclodextrin (SH-β-CD) was immobilized onto the AuNPs@MoS 2 -modified glassy electrode surface via Au–S bonding. Thus, the ferrocene (Fc)-modified primers enable the binding of the amplified product via a host–guest interaction between Fc and β-CD ( Figure 3 B). MB was used as a redox agent to produce a strong electrochemical signal during the interaction with the LAMP product, yielding a low detection limit of 0.23 fg µL −1 . In another study, Zamani et al. [ 78 ] introduced a CRISPR/Cas12a activation-based sensor for the human papillomavirus (HPV) virus, which achieved a LOD of 10 4 copies of DNA per reaction. A methylene-blue-tagged oligo was immobilized on a gold-leaf electrode ( Figure 3 C). Square-wave voltammetry (SWV) was used for electrochemical readouts of methylene-blue-tagged oligos by Cas12a enzyme activity. Other studies employed a combination of digoxigenin-labelled nucleotides (DIG-dUTPs)-based LAMP and streptavidin-modified magnetic beads for the separation and amperometric detection of HPV16 and HPV18 in a carbon-based electrode system. After a successful LAMP reaction, the resulted amplicons were incubated with the modified magnetic beads, followed by anti-DIG Ab conjugated with horseradish peroxidase (HRP). The magnetic beads were concentrated on the electrode's surface using a magnet, and amperometric monitoring of the HRP reaction was performed [ 79 ]. In the next attempt, 61 cervical samples for both genotypes were screened and validated with real-time PCR and commercial HPV tests such as INNO-LiPA and COBAS. The system had 90% accuracy [ 80 ]. Recently, Ramírez-Chavarría et al. [ 81 ] proposed a LAMP-based low-cost electrochemical sensor for specific detection of a SARS-CoV-2 gene sequence, in which RT-LAMP is performed on a disposable test strip consisting of a screen-printed electrode. Methylene blue was used as an electrochemical redox probe to deliver a diffusion-controlled current during the interaction with LAMP products, as square-wave voltammetry (SWV) was chosen for electrochemical readouts. The test strips showed a detection sensitivity of ~2.5 × 10 −6 ng/µL, along with high specificity and reproducibility. 3.1.3. Lateral Flow Assay Detection Lateral flow tests (LFTs) were used extensively in recent years for LAMP-based rapid POC diagnostics tests. The test line on the lateral flow assay strip catches biotin-labelled LAMP amplicons hybridized with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labelled DNA probes, which later bind to gold-based anti-FITC antibodies to create a legible output. Non-hybridized FITC probes attach to gold-labelled anti-FITC antibodies, generating a biotin-free double complex that travels from the test to the control line. The detection sensitivity with extracted genomic DNA was 600 fg/reaction for Mycoplasma pneumoniae [ 82 ], 100 fg/reaction for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) [ 83 ], and Pseudomonas aeruginosa [ 84 ] 630 fg/reaction for V. parahaemolyticus [ 85 ] and 13.5 fg/µL for Salmonella [ 86 ]. For obtaining a higher sensitivity and accuracy, nanomaterials and enzymatic enhancements were investigated by various research groups. For example, Shi et al. [ 87 ] developed a propidium monoazide (PMA) based nanozyme strip for viable detection of L. monocytogenes with a LOD of 10 CFU/mL. The color change was further enhanced by an enzymatic reaction between the nanozyme and DAB/H 2 O 2 (enzyme substrate). Gold nanoparticles were replaced by Fe 3 O 4 nanoparticles, which provided better dispersibility. In another work, A quantum dot nanobead-based LFT was developed by Shang et al. [ 88 ] for quantitative detection of S. typhimurium ( S. typhimurium ). The visual LOD of 10 3 CFU/mL achieved a linear range of 10 2 –10 8 CFU/mL, 10-fold higher than AuNPs labelled strips. Yang et al. [ 89 ] reported polymer nanoparticles lateral flow biosensors in combination with LAMP for the detection of Brucella abortus targeting BruAb2_0168 gene. The assay achieved a LOD of 100 fg/reaction with a turnaround time of 85 min. Additionally, a multiplex LAMP-based LFT was reported for the detection of two malaria-causing parasites, viz. , Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum , where FITC and digoxigenin-labelled probes hybridized with the LAMP amplicons having a complementary nucleotide sequence ( Figure 4 A). A clear band was visualized on the strip within 60 min for both species. Detection sensitivity reached 0.15 pg/µL for extracted genomic DNA [ 90 ]. LFT combined with RT-LAMP has been proven to be a promising tool for rapid diagnosis of COVID-19 at POC. A polymerase-nanoparticle-based LFT coupled with RT-LAMP was designed by Zhu et al. [ 91 ] for the simultaneous detection of specific genes from the SARS-CoV-2 genome using two sets of LAMP primers in a single reaction tube. The primers for ORF1ab and N genes were labelled with FITC and digoxin, respectively, with an additional biotin tag. Immunoreaction between FITC, digoxin, and biotin-labelled duplex LAMP amplicons with anti-FITC/digoxin in the test line produced a characteristic crimson band that enables the multiplex detection of both genes with a LOD of 12 copies/reaction. The entire process, from sample collection to the results, was accomplished within 1 h. In another work, a palm-sized, portable microfluidic platform integrated with a pregnancy test strip (PTSs) was developed for POC diagnosis of the SARS-CoV-2 genome ( Figure 4 B). Highly specific human chorionic gonadotropin probes (hCG-p) were designed to hybridize with the specific loop region of the RT-LAMP amplicons, and thus to be unable to move through the PTSs and appear only on the control line on the strip. Ultrasensitive detection with a LOD of 0.5 copy/µL was achieved with an assay time of 120 min by on-site naked-eye visualization [ 92 ]. LAMP provides specific amplification of the target, and lateral flow sensors offer a cheap and easy readout method. Therefore, LAMP combined with LFTs has enormous potential for creating POC diagnostic platforms. This technique can be combined with microfluidic platforms to allow high-throughput analysis while removing the possibility of cross-contamination. Figure 4 LAMP-based lateral flow biosensors. ( A ) Outline of the lateral flow strip for detection of LAMP amplicons. ( B ) A portable microfluidic platform integrated with a pregnancy test strip (PTSs) for POC diagnosis of COVID-19. Reproduced with permission from references [ 90 , 92 ]. Copyright 2021 American Chemical Society, 2022 MDPI. 3.1.4. Optical Detection Optical devices have emerged as an alternative solution and are extensively used in the end-point detection of LAMP products. Optical sensors and instruments, such as a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) [ 93 ], surface plasmon resonance (SPR) [ 94 ], and surface-enhanced Raman scattering (SERS) [ 95 ], have been used for monitoring LAMP amplicons. Chun et al. [ 96 ] designed a detection method for food-borne pathogens using a CMOS sensor and white LED light by integrating retroreflective Janus particle (RJP) and LAMP, which achieved a LOD of 10 2 CFU for S. typhimurium . A DNA probe immobilized on the RJPs was injected into the LAMP product, resulting in a hybridized sandwich structure formation between the LAMP product and RJPs ( Figure 5 A). In another work, a smartphone-based image processing method was applied in sensing food-borne pathogens using SYTO-9, which yielded a LOD of 6 copies/µL for L. monocytogenes [ 97 ]. Surface plasmon resonance is an optical method used in the past for LAMP detection [ 94 ]. LAMP, combined with SPR imaging, was reported by Nawattanapaiboon et al. [ 98 ] for the detection of MRSA in clinical samples. A bio-functionalized array was fabricated by immobilizing biotinylated probes using self-assembled monolayer surfaces (SAMs), which allowed multiplex detection of fem B and mec A genes of MRSA and obtained a LOD of 10 copies per microliter sample. In another effort, gold nanoprobes, complementary to F2 and F1C, were modified for SPR-based detection of LAMP [ 99 ]. This assay achieved a detection limit of 20 CFU/mL for Salmonella typhi in 30 min. Over the past few years, LAMP-integrated surface-enhanced Raman scattering (SERS) gained tremendous popularity in nucleic acid amplification tests (NAATs) due to its high sensitivity and reproducibility [ 95 ]. Draz and Lu [ 100 ] reported a LAMP-combined SERS assay for the rapid and sensitive detection of Salmonella enterica ( S. enterica ), in which the Raman active gold nanoprobes consisted of modified AuNPs with cy5/DNA probes for SERS detection of the LAMP products. The assay achieved a detection limit of 66 CFU/mL for Salmonella enteritidis , showing 100-fold higher sensitivity than conventional PCR. In addition, the assay expressed high specificity, as the detection of Salmonella was validated from contaminated milk samples. In another work, a microdroplet-based LAMP was paired with SERS to detect pathogens from the food matrix [ 101 ]. As displayed in Figure 5 B, multifunctional AuNPs consisted of the following components: Raman reporter 1-naphthalenethiol, with glutathione (GSH) as a complexing agent and thiolated polyethylene glycol as a stabilizer. Due to the complexation of the carboxylic acid group of glutathione and pyrophosphate, the AuNPs aggregated and were then used to detect the target, which provided an enhanced SERS signal, resulting in the detection of L. monocytogenes with a sensitivity of 3.6 × 10 2 CFU/mL in the milk sample. Figure 5 Optical detection methods of LAMP amplicons. ( A ) Schematic representation of retroreflective Janus particle−based biosensor. ( B ) Detection of LAMP amplified DNA using SERS. Reproduced with permission from references [ 96 , 101 ]. Copyright 2018 American Chemical Society, 2020 MDPI. 3.1.5. Diffusometric Method The combination of LAMP with diffusometry, a technique based on the simple principle of Brownian motion of microscopic particles, has emerged in recent years as a method of sensitive and rapid detection of infectious pathogens [ 32 ]. According to the Stokes–Einstein equation, particle diffusion is inversely proportional to the sample viscosity. Therefore, the microlevel viscosity change due to the presence of LAMP amplicons is determined by analysing the series of particle images. Clayton et al. [ 102 ] reported the LAMP combined particle diffusometry method for the detection of blood-borne pathogens, as 200 nm fluorescent polystyrene particles were imaged with a CCD camera and analysed with a cross-correlation algorithm to detect the amplified DNA from Staphylococcus aureus ( S. aureus ) and Klebsiella pneumoniae . One year later, they successfully detected a single cell of Vibrio cholerae in a pure water sample in just 20 min using particle diffusometry [ 103 ]. Their assay displayed 10-fold higher sensitivity than the gold-standard, real-time LAMP. On the other hand, Das et al. [ 104 ]. developed a Janus particle-enabled rotational diffusometric sensor paired with LAMP for Escherichia coli ( E. coli ) gDNA. Analysis of 300 images of blinking signals from 1 µm sized half-fluorescent half-gold functionalized Janus particles via a cross-correlation algorithm obtained a LOD of 48.2 pg/µL of E. coli gDNA in just 10 min, with a sample volume as low as 2 µL. In the follow-up article, the authors reported the detection of SARS-CoV-2 nsp-2 cDNA in a recombinant plasmid with a LOD of 70 ag/µL in 10 min using rotational diffusometry combined with LAMP [ 105 ]. It 10-fold higher sensitivity compared to the gold standard: real-time PCR. In another strategy, a smartphone-based POC device was developed for end-point detection of LAMP amplicons using particle diffusometry. This device was used to detect Vibrio cholerae [ 106 ] and Plasmodium falciparum [ 107 ] with a LOD of 6 cells/reaction (0.66 aM) in 35 min and a LOD of 3 parasites/μL from a blood sample in 45 min, respectively. The device consists of a 3D-printed platform with a microscopic lens, an LED light, and a smartphone to take a video of the amplified sample with fluorescent beads. At a later date, Colbert et al. [ 108 ] modified this device further and reported the detection of SARS-CoV-2 using RT-LAMP. A portable heating unit and a microfluidic chip for performing RT-LAMP and sample analysis were further integrated into the device. This platform was capable of detecting 30 copies/µL of SARS-CoV-2 extracted RNA and 35 × 10 4 virus copies/mL in diluted saliva. A comparison between various end-point detection methods of LAMP amplicons is summarized in Table 1 . 3.2. Real-Time Detection 3.2.1. Electrochemical Detection Real-time detection of LAMP products provides quantitative results without an additional sample preparation step. This saves time, limits the chances of false positives due to cross-contamination, and also delivers the advantage of extensive sample analysis with high accuracy. Thus, the LAMP-integrated real-time detection method can be used for the development of a portable, miniaturized POC diagnostic tool. The electrochemical detection method has been extensively used in real-time and quantitative analysis of LAMP amplicons ( Table 2 ). Martin et al. [ 109 ] developed a LAMP-based electrochemical readout device for the detection of 48 samples in a real-time manner ( Figure 6 A). The device consists of a multiplexed potentiostat which enables simultaneous measurement of square-wave voltammetric responses for four different redox reporters, viz, [Os-(bpy) 2 dppz] 2+ , PhP, MB, and Ru(NH 3 ) 6 3+ . A LOD of as low as 2 copies/reaction was achieved for Flavobacterium columnare in just 30 min. In another work, Gosselin et al. [ 110 ] reported a screen-printed pH-sensitive polyaniline (PAni)-based electrode with an Ag/AgCl reference electrode for real-time detection of the LAMP assay of Bacillus thuringiensis with a LOD of 10 copies of DNA per reaction ( Figure 6 B). The PAni-based electrode detects the change in solution pH due to the polymerase enzyme activity during the LAMP reaction. A portable electronic acquisition card was used to obtain the potentiometric readouts, making this a suitable candidate for POC diagnostics of LAMP-based detection methods. Another LAMP-integrated, portable electrochemical device was developed for the detection of hepatitis B virus (HBV) DNA with a LOD of 6.18 fg/µL [ 111 ]. The drop-cell consisted of a platinum (Pt) working electrode connected to a potentiostat placed in a water bath. Methylene blue was used as a redox indicator to monitor the real-time electrochemical signals and the decrease in current due to the binding of MB with LAMP amplicons being measured by square-wave voltammetry (SWV). Similarly, Huang et al. [ 112 ] established a fully integrated electrochemical device combined with LAMP for the detection of E. coli O157:H7 and S. enterica targeting the vt and invA genes, respectively. The device was integrated with a gold electrode, and the redox molecule MB was used for electrochemical signal generation. The assay achieved a detection limit of LOD of 10 and 1 DNA copy per reaction in just 30 min for E. coli O157:H7 and S. enterica , respectively. This research group later developed a bis-intercalating redox reagent for real-time electrochemical qualitative analysis of LAMP amplicons. The redox probe was synthesized using two naphthoquinone-imidazole (NQIM) molecules which are covalently bonded by a linker group (R). This system achieved a LOD of single-copy Salmonella DNA in just 10 min [ 113 ]. 3.2.2. Smartphone-Based Real-Time Detection It is an alternative method for the real-time monitoring of LAMP amplicons. This can be achieved by analysing the RGB value of the series of images captured during the amplification. The change in colour value is determined by using turbidity, colorimetric, and fluorescent dye. For example, Priye et al. [ 114 ] developed a portable LAMP device equipped with a smartphone for real-time detection of Neisseria gonorrhoeae ( N. gonorrhoeae ). This method utilizes the chromaticity-luminance methodology to measure the fluorescence intensity of the amplified LAMP product, which delivered a detection sensitivity of 3.5 copies/10 μL sample. Similarly, Wang et al. [ 115 ] developed an on-chip POC device integrated with LAMP for viable S. typhimurium detection using a smartphone-based real-time turbidity method. The Salmonella cells were mixed with propidium monoazide (PMA) and anti- Salmonella capture antibody-coated magnetic nanoparticles for the pre-treatment of dead bacterial DNA. The system was capable of detecting 14 CFU/mL of S. typhimurium in chicken meat within 90 min. Another smartphone-based quantitative molecular diagnostic platform was developed for the real-time colorimetric defection of LAMP assay [ 116 ] ( Figure 6 C). This low-cost and portable device was successful in the quantitative analysis of HPV DNA from saliva and vaginal swabs and HIV RNA from plasma samples. In another study, Thio et al. [ 117 ] developed a lab-on-a-smartphone (LOS) platform integrated with a plasmonic-enhanced optoelectrowetting (OEW) device for monitoring bacterial contamination in environmental water samples. The integration of the OEW enables pumpless droplet manipulation for on-chip sample preparation. It utilizes the smartphone camera as an optical detector for the colorimetric study through red–green–blue (RGB) analysis using the image processing application. This advanced device delivers real-time detection of E. coli in just 30 min. In another work, Nguyen et al. [ 118 ] developed a 3D-printed, portable smartphone-based integrated genetic unit (i-Gene) for the POC diagnostics of infectious pathogens. The LAMP amplification was performed on a microfluidic chip and the heater for LAMP was powered by the smartphone ( Figure 6 D). The smartphone was powered by a 5.0 V power bank. Eriochrome Black T (EBT) was used for colorimetric detection of the LAMP reaction. Upon gene amplification, the colour change of the sample was visualized in real-time by the CMOS sensor of the smartphone camera, enabling sensitive detection of E. coli O157:H7 with a LOD of 10 copies/µL in just 60 min. In the same year, they developed a smartphone application for the colorimetric detection of LAMP and measured the DNA copy number in the test sample using a calibration curve plotted to form the known template concentration vs. threshold time [ 119 ] ( Figure 6 E). This fully integrated smartphone-based device is an ultimate solution for the POC testing of infectious pathogens and early disease control, especially in developing countries and resource-limited situations. Two years later, this group developed an Internet of Things (IoT)-based portable, lightweight (320 g), and miniaturized diagnostic device for rapid COVID-19 screening [ 120 ]. This fully automated device was powered by a portable battery and operated with a smartphone. An integrated microfluidic chip was utilized for viral lysis, RNA extraction, and RT-LAMP reaction targeting multiple genes (N, E, and As1e genes) of SARS-CoV-2. RT-LAMP was monitored in real-time by measuring the fluorescence intensities via a CMOS sensor upon excitation with a 488 nm wavelength of LED light. The recorded data were processed and analysed by a microprocessor installed in the device and wirelessly transferred and displayed on the smartphone. A LOD of 20 copies/µL was achieved with an assay time of 65 min using SYBR green dye. biosensors-12-01068-t002_Table 2 Table 2 LAMP-based real-time detection methods. Technique Pathogen Signal Transduction Material Detection Method Time LOD Reference Electrochemical Salmonella Bis-NQIM-R (naphthoquinone- imidazole) Differential pulse voltammetry (DPV) 10 min 1 copy/reaction [ 113 ] Flavobacterium columnare [Os-(bpy) 2 dppz] 2+ , PhP and MB and Ru(NH 3 ) 6 3+ Square wave voltammetry (SWV) 30 min 2 copies/reaction [ 109 ] E. coli O157:H7 S. enterica Methylene blue Differential pulse voltammetry (DPV) 30 min 10 copies/reaction 1 copy/reaction [ 112 ] Hepatitis B virus Methylene blue Square wave voltammetry (SWV) 60 min 6.18 fg/µL [ 111 ] Smartphone-based E. coli O157:H7 Eriochrome Black T (EBT) Colorimetric 60 min 10 copies/μL [ 118 ] N. gonorrhoeae SYTO Fluorescence 40 min 3.5 copies per 10 μL [ 115 ] SARS-CoV-2 SYBR Fluorescence 65 min 20 copies/ μL [ 120 ] Figure 6 LAMP−based real-time detection modalities. ( A , A1 ) Overview of the electrochemical readout device for real−time monitoring of LAMP reactions; ( A2 ) PCR thermocycler attached with a flat Peltier-heating block with two 72-pin connectors; ( A3 ) electrochemical microplate consisting 48 wells; ( A4 ) PCB interface carrying the multiplexed potentiostat's electronic circuitry; ( A5 ) specialized software to extract the electrochemical response from each microwell and pilot the PCB interface. ( B ) Screen-printed pH-sensitive polyaniline (PAni)-based electrode for real-time detection of LAMP. ( C ) Hue-based detection of HPV and HIV by a "smart connected pathogen tracer" (SCPT) device. ( D ) Schematic illustration of smartphone-integrated i-Gene analyser and its inside view. ( E ) 3D schematics of i−Genbox for real-time detection of infectious pathogens. Reproduced with permission from references [ 109 , 110 , 116 , 118 , 119 ]. Copyright 2016, 2017, 2020 American Chemical Society, 2020 Springer Nature. 3.2.1. Electrochemical Detection Real-time detection of LAMP products provides quantitative results without an additional sample preparation step. This saves time, limits the chances of false positives due to cross-contamination, and also delivers the advantage of extensive sample analysis with high accuracy. Thus, the LAMP-integrated real-time detection method can be used for the development of a portable, miniaturized POC diagnostic tool. The electrochemical detection method has been extensively used in real-time and quantitative analysis of LAMP amplicons ( Table 2 ). Martin et al. [ 109 ] developed a LAMP-based electrochemical readout device for the detection of 48 samples in a real-time manner ( Figure 6 A). The device consists of a multiplexed potentiostat which enables simultaneous measurement of square-wave voltammetric responses for four different redox reporters, viz, [Os-(bpy) 2 dppz] 2+ , PhP, MB, and Ru(NH 3 ) 6 3+ . A LOD of as low as 2 copies/reaction was achieved for Flavobacterium columnare in just 30 min. In another work, Gosselin et al. [ 110 ] reported a screen-printed pH-sensitive polyaniline (PAni)-based electrode with an Ag/AgCl reference electrode for real-time detection of the LAMP assay of Bacillus thuringiensis with a LOD of 10 copies of DNA per reaction ( Figure 6 B). The PAni-based electrode detects the change in solution pH due to the polymerase enzyme activity during the LAMP reaction. A portable electronic acquisition card was used to obtain the potentiometric readouts, making this a suitable candidate for POC diagnostics of LAMP-based detection methods. Another LAMP-integrated, portable electrochemical device was developed for the detection of hepatitis B virus (HBV) DNA with a LOD of 6.18 fg/µL [ 111 ]. The drop-cell consisted of a platinum (Pt) working electrode connected to a potentiostat placed in a water bath. Methylene blue was used as a redox indicator to monitor the real-time electrochemical signals and the decrease in current due to the binding of MB with LAMP amplicons being measured by square-wave voltammetry (SWV). Similarly, Huang et al. [ 112 ] established a fully integrated electrochemical device combined with LAMP for the detection of E. coli O157:H7 and S. enterica targeting the vt and invA genes, respectively. The device was integrated with a gold electrode, and the redox molecule MB was used for electrochemical signal generation. The assay achieved a detection limit of LOD of 10 and 1 DNA copy per reaction in just 30 min for E. coli O157:H7 and S. enterica , respectively. This research group later developed a bis-intercalating redox reagent for real-time electrochemical qualitative analysis of LAMP amplicons. The redox probe was synthesized using two naphthoquinone-imidazole (NQIM) molecules which are covalently bonded by a linker group (R). This system achieved a LOD of single-copy Salmonella DNA in just 10 min [ 113 ]. 3.2.2. Smartphone-Based Real-Time Detection It is an alternative method for the real-time monitoring of LAMP amplicons. This can be achieved by analysing the RGB value of the series of images captured during the amplification. The change in colour value is determined by using turbidity, colorimetric, and fluorescent dye. For example, Priye et al. [ 114 ] developed a portable LAMP device equipped with a smartphone for real-time detection of Neisseria gonorrhoeae ( N. gonorrhoeae ). This method utilizes the chromaticity-luminance methodology to measure the fluorescence intensity of the amplified LAMP product, which delivered a detection sensitivity of 3.5 copies/10 μL sample. Similarly, Wang et al. [ 115 ] developed an on-chip POC device integrated with LAMP for viable S. typhimurium detection using a smartphone-based real-time turbidity method. The Salmonella cells were mixed with propidium monoazide (PMA) and anti- Salmonella capture antibody-coated magnetic nanoparticles for the pre-treatment of dead bacterial DNA. The system was capable of detecting 14 CFU/mL of S. typhimurium in chicken meat within 90 min. Another smartphone-based quantitative molecular diagnostic platform was developed for the real-time colorimetric defection of LAMP assay [ 116 ] ( Figure 6 C). This low-cost and portable device was successful in the quantitative analysis of HPV DNA from saliva and vaginal swabs and HIV RNA from plasma samples. In another study, Thio et al. [ 117 ] developed a lab-on-a-smartphone (LOS) platform integrated with a plasmonic-enhanced optoelectrowetting (OEW) device for monitoring bacterial contamination in environmental water samples. The integration of the OEW enables pumpless droplet manipulation for on-chip sample preparation. It utilizes the smartphone camera as an optical detector for the colorimetric study through red–green–blue (RGB) analysis using the image processing application. This advanced device delivers real-time detection of E. coli in just 30 min. In another work, Nguyen et al. [ 118 ] developed a 3D-printed, portable smartphone-based integrated genetic unit (i-Gene) for the POC diagnostics of infectious pathogens. The LAMP amplification was performed on a microfluidic chip and the heater for LAMP was powered by the smartphone ( Figure 6 D). The smartphone was powered by a 5.0 V power bank. Eriochrome Black T (EBT) was used for colorimetric detection of the LAMP reaction. Upon gene amplification, the colour change of the sample was visualized in real-time by the CMOS sensor of the smartphone camera, enabling sensitive detection of E. coli O157:H7 with a LOD of 10 copies/µL in just 60 min. In the same year, they developed a smartphone application for the colorimetric detection of LAMP and measured the DNA copy number in the test sample using a calibration curve plotted to form the known template concentration vs. threshold time [ 119 ] ( Figure 6 E). This fully integrated smartphone-based device is an ultimate solution for the POC testing of infectious pathogens and early disease control, especially in developing countries and resource-limited situations. Two years later, this group developed an Internet of Things (IoT)-based portable, lightweight (320 g), and miniaturized diagnostic device for rapid COVID-19 screening [ 120 ]. This fully automated device was powered by a portable battery and operated with a smartphone. An integrated microfluidic chip was utilized for viral lysis, RNA extraction, and RT-LAMP reaction targeting multiple genes (N, E, and As1e genes) of SARS-CoV-2. RT-LAMP was monitored in real-time by measuring the fluorescence intensities via a CMOS sensor upon excitation with a 488 nm wavelength of LED light. The recorded data were processed and analysed by a microprocessor installed in the device and wirelessly transferred and displayed on the smartphone. A LOD of 20 copies/µL was achieved with an assay time of 65 min using SYBR green dye. biosensors-12-01068-t002_Table 2 Table 2 LAMP-based real-time detection methods. Technique Pathogen Signal Transduction Material Detection Method Time LOD Reference Electrochemical Salmonella Bis-NQIM-R (naphthoquinone- imidazole) Differential pulse voltammetry (DPV) 10 min 1 copy/reaction [ 113 ] Flavobacterium columnare [Os-(bpy) 2 dppz] 2+ , PhP and MB and Ru(NH 3 ) 6 3+ Square wave voltammetry (SWV) 30 min 2 copies/reaction [ 109 ] E. coli O157:H7 S. enterica Methylene blue Differential pulse voltammetry (DPV) 30 min 10 copies/reaction 1 copy/reaction [ 112 ] Hepatitis B virus Methylene blue Square wave voltammetry (SWV) 60 min 6.18 fg/µL [ 111 ] Smartphone-based E. coli O157:H7 Eriochrome Black T (EBT) Colorimetric 60 min 10 copies/μL [ 118 ] N. gonorrhoeae SYTO Fluorescence 40 min 3.5 copies per 10 μL [ 115 ] SARS-CoV-2 SYBR Fluorescence 65 min 20 copies/ μL [ 120 ] Figure 6 LAMP−based real-time detection modalities. ( A , A1 ) Overview of the electrochemical readout device for real−time monitoring of LAMP reactions; ( A2 ) PCR thermocycler attached with a flat Peltier-heating block with two 72-pin connectors; ( A3 ) electrochemical microplate consisting 48 wells; ( A4 ) PCB interface carrying the multiplexed potentiostat's electronic circuitry; ( A5 ) specialized software to extract the electrochemical response from each microwell and pilot the PCB interface. ( B ) Screen-printed pH-sensitive polyaniline (PAni)-based electrode for real-time detection of LAMP. ( C ) Hue-based detection of HPV and HIV by a "smart connected pathogen tracer" (SCPT) device. ( D ) Schematic illustration of smartphone-integrated i-Gene analyser and its inside view. ( E ) 3D schematics of i−Genbox for real-time detection of infectious pathogens. Reproduced with permission from references [ 109 , 110 , 116 , 118 , 119 ]. Copyright 2016, 2017, 2020 American Chemical Society, 2020 Springer Nature. 4. LAMP-Based Point-of-Care Biosensors 4.1. LAMP-on-a-Chip 4.1.1. Classical Microfluidic Chip Controlling the spread of a contagious disease demands extensive rapid testing. This may lead to a risk of cross-contamination and further transmission of the infection. Additionally, the large amount of sample requirement makes the diagnosis process expensive and limits mass testing. The introduction of microfluidic devices can overcome this limitation and provide a "sample-in-result-out" route in a protected environment. Integration of LAMP with an advanced microfluidic chip further enhances the analysis and delivers rapid and highly specific detection with very high sensitivity. In recent years, LAMP-on-a-chip has emerged as an advanced solution for POC diagnostics for contagious diseases. Polymethyl methacrylate (PMMA) and poly-dimethylsiloxane (PDMS)-based classical microfluidic chips are the most common examples of LAMP-on-a-chip modalities. Here, we summarize the recent advances in LAMP-integrated microfluidic devices. Trinh et al. [ 121 ] developed a LAMP-based foldable microdevice for the detection of multiple foodborne pathogens. This device is made up of a polycarbonate thin film with two different sections for LAMP reaction and analyte detection ( Figure 7 A). The reaction part is enclosed with 2-hydroxyethyl agarose containing the LAMP reagents for their long-term storage and maintenance. It can successfully store the LAMP reagents for up to 45 days. On-chip amplification is performed by using a graphene-based heater. The assay achieved a LOD of 2.5 × 10 2 copies/reaction in 30 min. In another study, Fu et al. [ 122 ] developed a LAMP assay using the most probable number (MNP) for the quantification of E. coli and Enterococcus spp. in a PMMA chip. The assay achieved a LOD of 4 copies/well in 35 min. A LAMP-integrated POC microdevice coupled with gold nanoparticles was developed by Sivakumar et al. [ 123 ] for the detection of Enterococcus faecium and SARS-CoV-2 plasmids. In the presence of LAMP product, the gold chloride is reduced to red-coloured gold nanoparticles under UV light, providing a detection limit of 42 fg/µL for COVID-19 plasmids in just 10 min. In another effort, a fully integrated rotary valve-assisted microfluidic device was developed for the DNA extraction, amplification, and detection of V. parahaemolyticus and spiked shrimp with a LOD of 3.1 × 10 1 copies per reaction in 80 min [ 124 ] ( Figure 7 B). The CRISPR/Cas12a method was used for the detection of the LAMP amplicons. The fluorescence signal of the amplified product was recorded in real-time PCR. The detection cost per test was less than 4 USD. At a later time, a classical microfluidic device was developed by Tian et al. [ 125 ] for the detection of Cryptococcal meningitis (CM). The five-layer microfluidic module provided cellular lysis, DNA extraction, and purification for the isothermal amplification. LAMP was performed in a portable bead consisting of lyophilized reagents. This module can be utilized as an auxiliary tool for the middle and late phases of CM and to confirm instances with ambiguous lateral flow assay (LFA) results in the early stages of CM diagnosis. Recently, microfluidic devices are also integrated with RT-LAMP for the detection of the highly infectious SARS-CoV-2 virus. For example, Mateos et al. [ 126 ] devised a PMMA-made, integrated microfluidic chip for magnetic bead-based RNA extraction and RT-LAMP reaction targeting ORF1a and N gene of SARS-CoV-2. The microchip contains a large chamber for sample loading, followed by seven wash chambers and a detection chamber. The use of a greater number of wash chambers delivers high-purity RNA extraction and eliminates carryover contaminations. This device achieved a detection sensitivity of 470 copies/mL with a turn-around time of 60 min. This simple-to-use platform delivers rapid and accurate detection of SARS-CoV-2 and could be used for mass screening of COVID-19 at POC. Similarly, Jhou et al. [ 127 ] designed an RT-LAMP-based integrated microfluidic platform (IMP) for real-time detection of the SARS-CoV-2 virus. This automated platform consists of a PDMS-based microfluidic chip for viral lysis and RNA extraction, and a heating module for RT-LAMP. Liquid samples were transported inside the chip via micropumps and valves by creating a gauge pressure difference, controlled by a fluidic control module, and also functioned as micromixers for mixing the reagents. The calcein-based fluorescent detection obtained a LOD of 5 × 10 3 copies of viral RNA per reaction in 90 min. The LAMP-on-a-chip system also provides the advantage of multiplex detection, maintaining the virtue of LAMP. For example, Liu et al. [ 128 ] developed a fully automated centrifugal chip for the simultaneous detection of five different bacteria. The automated design provided the bacterial cell lysis, DNA purification, LAMP reaction, and the end point colorimetric detection of the samples with a LOD of 10 copies/µL in just 70 min. Bead-beating-based mechanical lysis was used to substitute the chemical lysis. A colour sensor was used with a white LED light for on-chip LAMP readouts. Meanwhile, a disc-shaped dual-sample microfluidic chip made out of PMMA was developed by Jin et al. [ 129 ] for multiplex detection of 10 waterborne bacteria. The microfluidic disc was equipped with a centrifugal module that enables the reagent to flow through the channel. The real-time fluorescence resulted from a LOD ranging from 7.92 × 10 −3 to 9.54 × 10 −1 pg per reaction in 35 min, demonstrating high specificity and reproducibility. In another study, a centrifugal chip-based, fully integrated portable genetic analyser was developed for multiplex RT-LAMP [ 130 ]. The centrifugal chip allowed the detection of 10 samples in one run. The chip consisted of 10 aliquoting chambers which were connected with zigzag aliquoting channels and a glass filter column for RNA extraction. The structure of the disc is shown in Figure 7 C. A passive valve was used between the aliquoting chamber and the glass filter column to manipulate the fluid flow. Capillary pressure enabled the automatic sample distribution in aliquoting chambers, and the subsequent washing and elution of samples were achieved by centrifugal protocols. Each sample had three reaction chambers on the chip, preloaded with freeze-dried LAMP primers for simultaneous amplification of ORF1ab, N, and S genes. To prevent sample evaporation, the reaction chamber was blocked by wax. The fluorescence signals of the amplified products were recorded, and the three target genes of SARS-CoV-2 in 10 samples were detected with a LOD of 20 copies/µL with a turnaround time of 90 min. 4.1.2. Paper-Based Chips Conventional microfluidic devices often require additional pumping and micro-valves for fluid movements. This increases their operational complexity, use of raw materials, and overall cost. However, paper-based and paper–polymer hybrid microfluidic devices have emerged as an alternative solution, due to their high biocompatibility with nucleic acids and proteins, ease of fabrication, and low production cost [ 131 ]. Additionally, the capillary force can eliminate the use of micropumps and other bulky equipment. Rodriguez et al. developed a low-cost, sample-to-answer paper-based molecular diagnostic assay integrated with RT-LAMP for the detection of H1N1 from human nasopharyngeal swabs with high sensitivity. The RNA extraction from the clinical samples and purification, followed by the RT-LAMP reaction, was performed in the paper device. Naked eye detection on lateral flow strips delivered a LOD of 10 6 copies/mL within just 45 min, which is 10-fold more sensitive than the current immunoassay technique [ 132 ]. In another work. a cellulose-based paper microchip was developed by Roy et al. [ 133 ] for the detection of microbes in porcine meat ( Figure 7 D). Amplified LAMP product was detected in a wax-printed cellulose paper-based microchip using crystal violet dye. This low-cost colorimetric assay delivered rapid and highly sensitive detection of Bacillus subtilis and Sus scrofa with LODs of 10 pg/μL (2.2 × 10 3 copies/μL) and 1 pg/μL (3.43 × 10 −1 copies/μL), respectively. Similarly, Kaarj et al. [ 134 ] designed a wax-printed G4 cellulose paper chip in combination with RT-LAMP for POC diagnosis of Zika virus from water, urine, and diluted blood plasma. The paper chip was divided into two parts: the sample-loading region and the detection/amplification area. The sample containing the spiked viral particles was transferred into the loading region, and the sample moved through the channel via capillary action. The detection area was placed on a hot plate, and the RT-LAMP reagents were added. A LOD as low as 1 copy/µL was achieved with smartphone-based colorimetric detection in 15 min from the biological samples. In another effort, Batule et al. [ 135 ] demonstrated a two-step strategy for viral RNA extraction, followed by isothermal amplification and detection in a paper substrate. In the first step, a nitrocellulose-based paper strip was used for the extraction of viral RNA from serum within 5 min. In the next step, RT-LAMP was performed in the paper chip consisting of four reaction chambers connected via a fluidic channel and pre-loaded with reaction pads. The RT-LAMP reagents, including the reverse transcriptase, primers, Bst polymerase, and the dye for visual detection, were dry stored in the reaction pad. The assay achieved detection limits of 1 copy and 10 copies of three different RNA particles (e.g., zika, chikungunya, and dengue) in phosphate buffer solution (PBS) and serum, respectively. The whole process of RNA extraction and detection was completed within 1 h. Paper-polymer-based hybrid microfluidic devices also obtained high attention and were applied in the detection of microbial infections. Pang et al. [ 136 ] reported a hybrid microfluidic platform based on PDMS/paper for the detection of food-borne pathogens. The microdevice contained three LAMP reaction chambers connected by microchannels, including one for a negative control. The paper disc was pre-loaded with LAMP reagents and placed in the reaction chambers. The high gas solubility of PDMS enables the self-priming of samples. The use of mixed dye delivered visual detection of the final product with a LOD of 10 3 CFU/mL for S. aureus and V. parahaemolyticus . Similarly, Trinh et al. [ 137 ] developed a paper-embedded foldable microdevice for naked-eye detection of Salmonella spp. with a LOD of 10 2 CFU/mL from milk samples in 65 min. The microdevice consisting of three sections attached with a sealing film was able to perform nucleic acid extraction, LAMP reaction, and colorimetric detection. The sample and reaction chambers were placed up of polycarbonate consisting of nine chambers, pre-loaded with LAMP reagent cellulose paper. The fuchsin-coated paper strip was used in the detection layer, where it changed colour to purple in cases of positive LAMP. Another LAMP-integrated paper-based microdevice was reported with a spinning mechanism for the detection of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) [ 138 ]. The stationary part consisted of a PDMS chip for LAMP amplification. The spinning part was installed with a three-glass microfiber treated with sodium hydroxide for DNA extraction and another three-glass microfiber treated with phenolphthalein for the colorimetric detection of the LAMP amplicons ( Figure 7 E). This device was capable of detecting 10 2 CFU/mL of VRE in tap water in 45 min. In another strategy, a foldable paper microdevice was developed by Dinh et al. [ 139 ] to perform on-chip LAMP amplification. The polymerized Safranin O interacts with LAMP amplicons, resulting in a dark red solution. Limits of detection of 10 −4 ng/µL and 10 2 CFU/mL were achieved for SARS-CoV-2 plasmid and E. faecium in just 60 min. In a similar approach, a paper-based microfluidic chip was developed by Zhang et al. [ 140 ] for colorimetric detection of foodborne bacteria E. coli O157:H7. This microchip was further utilized for on-chip detection of Salmonella spp. from milk samples. Bacterial cell lysis was executed through thermal shock at 90 °C for 5 min. The detection was performed by calcein dye embedded in the reaction chamber, delivering LODs of 13.4 pg/µL and 12 CFU/mL for E. coli O157:H7 and Salmonella spp., respectively. To summarize, the paper-based tests meet the criteria for POC diagnostic tools and have the potential to be used in the early and onsite diagnosis of infectious diseases. 4.1.3. Fully Integrated Chips Microfluidics chips integrated with nucleic acid extraction, purification, and LAMP amplification are suitable candidates for on-site detection, especially in resource-limited regions. In past years, researchers have attempted to develop microdevices integrated with sample pre-treatment functionalities, including the isothermal amplification in a single microfluidic device. Materials such as a magnetic bead, silica bead, glass filter membrane, and FTA card were used for nucleic acid extraction and purification. Guo et al. [ 141 ] designed a microfluidic chip integrated with silica-based solid-phase extraction (SPE) of bacterial genomic DNA and LAMP amplification for the detection of three different bacteria, including E. coli O157:H7, MRSA, and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA). The microchip consisted of two channels: one for sample loading, and the other one for performing the washing step. Both channels were loaded with a micro-valve to control the fluid flow. The extracted genomic DNA was only allowed to pass through the SPE chamber, and the silica beads were blocked in the micro-pillars. A detection limit of 10 2 CFU/100 µL was achieved for three specific genes, rfb E, spa , and mec A, with a turnaround time of 2 h. Another LAMP-based, nucleic-acid-extraction-integrated lab-on-a-disc platform was developed by Loo et al. [ 142 ] to deliver a sample-to-result solution. A silica membrane was used for on-chip solid-phase extraction and purification of the bacterial DNA. The fluid flow in the microfluidic disc was controlled by the centrifugation force. Real-time fluorescence monitoring employed by SYTO-9 fluorescent dye provided a detection limit of 10 3 CFU/mL for Mycobacterium tuberculosis in sputum and 10 2 CFU/mL of Acinetobacter baumanii (Ab) in blood. The entire process can be performed by this microfluidic platform in less than 120 min, and multiple samples can be analysed simultaneously. Similarly, Park et al. [ 143 ] devised a compact-disc, rotary microfluidic device integrating nucleic acid extraction based on glass microbeads, chambers for LAMP reaction, and three separate lateral flows strips for simultaneous detection of multiple food-borne pathogens in contaminated milk or water samples. The glass microbeads were loaded in the microchannels where the genomic DNA was adsorbed on silica via hydrogen bonding, in the presence of chaotropic salts. DNA extraction in the microfluidic disc was confirmed by using a FAM-labelled artificial DNA probe. Buffer transport was achieved by the centrifugal speed, and the sample flow was controlled with the help of multiple siphons and a circular capillary valve. Target genes of S. typhimurium and V. parahaemolyticus were simultaneously detected with a LOD of 50 CFU with an assay time of 80 min. Although these integrated microfluidic discs are capable of fully automated, rapid, and sensitive detection of pathogens in a multiplex manner, the treatment of large sample volumes is still a major drawback. To solve that problem, an integrated centrifugal microfluidic chip was designed for LAMP-based multiplex detection of food-borne bacteria with a sample volume of up to 1 mL. The microdevice consisted of two major parts: a 3D-printed cartridge for LAMP reagent storage and a centrifugal disc to release the solutions into the microdevice, which is controlled by disc rotation. To absorb the washing solution and the extra sample, a super-absorbent polymer (SAP) was installed in the washing chamber, which eventually allowed the use of samples up to 1 mL. Twenty reaction chambers were used in each part of the chip, enabling simultaneous detection of multiple samples in one run. Bead-based DNA extraction allowed the full automation of the process, and the colorimetric detection of three bacteria ( E. coli O157:H7, S. typhimurium , and V. parahaemolyticus ) was performed within 1 h with a LOD of 10 2 cells/mL [ 144 ]. A Flinders Technology Associates (FTA) card-embedded sliding hybrid microfluidic device was developed, consisting of three layers, to perform the DNA extraction, LAMP reaction, and bacterial detection simultaneously ( Figure 7 F). An FTA card was used for bacterial DNA extraction and purification. Colorimetric analysis was performed using a fuchsin-based method which eventually detects Salmonella spp. and E. coli O157:H7 with a LOD of 30 CFU/sample and S. aureus with a LOD of 3 × 10 2 CFU/sample in 75 min [ 145 ]. Similarly, a 3D-paper-based microfluidic device inspired by a pop-up greeting card was developed for the detection of VRE [ 146 ]. The FTA card was installed on the top for the DNA extraction, and the PDMS chip served as the LAMP reaction chamber ( Figure 7 G). The paper was coated with concentrated nail polish to prevent the sample flow throughout the paper by modifying the porous structure. A pH-sensitive chemosensor delivered a detection of VRE with a LOD of 10 2 CFU/mL from raw milk samples in 45 min. Another microfluidic platform was designed by Tsai et al. [ 147 ] and integrated with an electromagnet for viral lysis, RNA extraction, and detection of SARS-CoV-2 by RT-LAMP in real time. The electromagnets enabled the bead-based RNA extraction and the mixing of the reagents. The assay achieved a detection limit of 5000 viral copies per reaction within 82 min. Table 3 listed the recently developed LAMP-on-a-chip modalities and provides a comparison between them. Figure 7 LAMP-on-a-chip biosensors. ( A ) Schematic workflow of graphene-heater-integrated polycarbonate-based foldable microdevice. ( B ) Structural overview of a rotary valve-assisted fluidic chip. ( C ) Centrifugal microfluidic disc for multiplex RT-LAMP. ( D ) Schematic workflow of colorimetric detection of LAMP amplicons on a wax-printed paper microdevice. ( E ) Working principle of paper-based microdevice with a spinning mechanism. ( F ) Structural overview of FTA card-based fully integrated slidable paper microdevice. ( G ) Illustration of a pop-up, paper-based, fully integrated microfluidic platform. Reproduced with permission from references [ 121 , 124 , 130 , 133 , 138 , 145 , 146 ]. Copyright 2017, 2019, 2021 American Chemical Society; and 2019, 2021, and 2022 Elsevier. biosensors-12-01068-t003_Table 3 Table 3 Summary of LAMP-based microfluidic platforms. Technique Target Pathogen Material Readout Time LOD Reference Classical DNA Salmonella spp. E. coli O157:H7 Polycarbonate Colorimetric 30 min 2.5 × 10 2 copies/mL [ 121 ] DNA E. coli and Enterococcus spp. PMMA Colorimetric 35 min 4 copies/well [ 122 ] DNA V. parahaemolyticus PMMA Fluorescence 80 min 3.1 × 10 1 copies/reaction [ 124 ] RNA SARS-CoV-2 PMMA Fluorescence 90 min 20 copies/µL [ 130 ] Paper-based DNA Sus scrofa (porcine) Bacillus subtilis Cellulose paper Colorimetric 10 min 18 min 3.43 × 10 −1 copies/μL 2.2 × 10 3 copies/μL [ 133 ] DNA Salmonella spp. Polydopamine coated paper-polycarbonate Colorimetric 65 min 1 × 10 2 CFU/mL [ 137 ] DNA VRE Paper-PDMS Colorimetric 45 min 10 2 CFU/mL [ 138 ] RNA Zika virus G4-cellulose paper Colorimetric 15 min 1 copy/µL [ 134 ] Integrated chips DNA E. coli O157:H7, MRSA, MSSA Silica beads-PMMA Fluorescence 2 h 10 2 CFU/100 µL [ 141 ] DNA S. typhimurium and V. parahaemolyticus Glass microbeads-PPMA Colorimetric 80 min 50 CFU [ 143 ] DNA VRE FTA card-PDMS Colorimetric 45 min 10 2 CFU/mL [ 146 ] RNA SARS-CoV-2 Magnetic beads Fluorescence 82 min 5000 copies/reaction [ 147 ] 4.2. Digital LAMP In recent years, digital LAMP (dLAMP) has gained popularity for the accurate measurement of nucleic acids within a sample. Based on the sample separation, dLAMP can be categorized into two groups: droplet-based digital LAMP (ddLAMP) and well-plate-based dLAMP. Both methods rely on separating the sample into thousands of nanolitre-sized droplets containing one target molecule each. The sample droplets can be created by suspending them in oil or loading the sample into a microwell and sealing with oil or a lid. The number of target molecules can be quantified by analysing the number of droplets that display a positive signal. Amplification results are analysed by digital image processing or flow cytometry. Gansen et al. [ 148 ] reported the first sample self-digitization (SD) chip-based digital LAMP (dLAMP) for amplification and detection of a single DNA/RNA molecule in a stationary droplet. The chip was replicated in PDMS containing 5000 microwells. Droplets were created by mixing oil and the sample through air pressure, and the LAMP was performed at 65 °C. The device showed adequate size homogeneity and low sample consumption. Using this concept, Wang et al. [ 149 ] reported the detection of 14 high-risk HVP in clinical samples with very high specificity and accuracy ( Figure 8 A). Alternatively, Zhu et al. [ 150 ] developed a self-priming compartmentalization (SPC) chip to perform digital LAMP analysis. The vacuum generated via degassing the air-dissolved PDMS chip provided the pumping force for the sample and oil flow in the chip. This allowed the droplet creation and self-compartmentalization of the sample without using microvalves and other control systems. A LOD of 1 × 10 3 CFU/mL for V. parahaemolyticus in contaminated food samples was achieved with this device [ 151 ] ( Figure 8 B). However, long-term preservation of a vacuum may not be possible, which will impede self-priming. To overcome this problem, Ma et al. [ 152 ] proposed a hydrophilic film-coated self-driven PDMS chip to conduct dLAMP. The hydrophilic film enables automatic sample manipulation in the chip via capillary forces. Under such conditions, the assay achieved the LOD of 11 copies per 30 µL sample for VRE within 30 min of the LAMP reaction. Meanwhile, a droplet-based microfluidic device for dLAMP was developed by Rane et al. [ 153 ] for the detection of N. gonorrhoeae . A continuous flow of oil and the sample through the cross microchannel generated 100,000 droplets per 110 min with a size of 10 picolitres, containing the single nucleic acid and LAMP reagent ( Table 4 ). These droplets were moved toward the heating region for LAMP amplification. Calcein dye-based fluorescent detection using confocal fluorescent spectroscopy delivered a LOD of 600 copies/µL. Droplet-based digital LAMP requires a highly trained workforce with experience in microfluidics and sophisticated instruments. Therefore, to make ddLAMP more convenient, Yuan et al. [ 154 ] designed a "Handifluidics" device integrating the LAMP mixture emulsification, incubation region, and fluorescence detection of the amplified product ( Figure 8 C). A manually operated syringe was used to generate monodispersed droplets in a PDMS chip. The emulsified LAMP droplets were collected in the droplet container and heated in the water bath at 63 °C to perform the LAMP. Fluorescent microscopy was used to quantify the target with a LOD of 10 DNA copies/µL. In another effort, Cao et al. [ 155 ] developed a microscale, hydrogel-chip-integrated, miniaturized dLAMP device for the detection of λDNA templates with a LOD of 1 copy/µL. The chip contains more than 10,000 microgels capable of self-partitioning the DNA molecules ( Figure 8 D). The platform was integrated with a heater for LAMP reaction, and the image analysis was performed using a smartphone-based digital readout. Similarly, Hu et al. [ 156 ] created a portable sample-to-result digital LAMP platform that incorporated nucleic acid extraction and smartphone imaging-based fluorescence detection ( Figure 8 E). Surface-tension-assisted immiscible phase filtration (IFAST) was used to extract nucleic acids. Negative pressure mixing and sample partitioning were achieved using a spiral mixing channel and a flow-focusing droplet production mechanism. This device was capable of detecting low-abundance cfDNA and EGFR L858R mutation. The suggested device can provide a low-cost, simply produced, and user-friendly solution for POC tests of nucleic acid in resource-limited situations. "SlipChip" is another microfluidic platform where two plates are connected [ 157 ]. The bottom layer contains an array of microchambers and ducts. The top layer consists of wells and acts as a cover. The sample is loaded in the top-layer wells through microchannels and mixed with the preloaded reagents in the bottom chambers by slipping the top plate. This platform eliminates the use of pumps and valves and also enables multiplex detection with a sample volume in pico/nanolitres. Through a similar approach, Sun et al. [ 158 ] reported a SlipChip device for the detection of HIV RNA by performing digital two-step RT-LAMP. First, single RNA molecules were compartmentalized using Poisson distribution and the corresponding cDNA was synthesized. Later, those cDNAs were subjected to LAMP amplification. This two-step dRT-LAMP obtained 10-fold higher efficiency compared to the single-step RT-LAMP. Similarly, a self-partitioning SlipChip (sp-SlipChip) platform was developed for the quantification of HPV in clinical samples. The chip utilizes the capillary pressure to undergo self-partition for independent droplet creation. The reagent was loaded into a "chain-of-pearls"-shaped channel in the bottom plate. A salinized hydrophobic top plate containing the expansion channel is moved by manual slipping and aligned with the bottom channels. The difference in capillary pressure breaks down the fluid and self-partitions it into individual droplets [ 159 ]. Therefore, a precise alignment of the microchannels can be eliminated, making this device a promising point-of-care diagnostics tool for infectious pathogens. In conclusion, including dLAMP in a sample-to-answer microfluidic device has a lot of promise for achieving speedy and sensitive detection. Figure 8 Schematic illustration of digital LAMP methods for detection of LAMP amplicons. ( A ) Self-digitization dLAMP chip. ( B ) Self-compartmentalization microfluidic chip for digital detection of VP. ( C ) Handifluidics ddLAMP device integrated with LAMP mixture emulsification. ( D ) Microscale hydrogel chip integrated dLAMP device. ( E ) Smartphone imaging-based dLAMP device. Reproduced with permission from references [ 149 , 151 , 154 , 155 , 156 ]. Copyright 2017, 2020, and 2021 American Chemical Society. biosensors-12-01068-t004_Table 4 Table 4 Comparisons of various digital LAMP modalities. Target Pathogen Reaction Chamber Type No. of Chambers Sample Volume LOD References DNA Streptococcus pneumoniae Droplet 6500 ~2.3 nL 10 copies/μL [ 154 ] λDNA EGFR L858R mutation Droplet 10,000 ~1 nL 1 copy/μL [ 155 ] DNA N. gonorrhoeae Droplet 100,000 ~10 pL 600 copies/µL [ 153 ] Plasmid HPV Microwells 4480 ~4.5 nL 1 fg/μL [ 159 ] DNA VRE Microwells 736 ~22.6 nL 11 copies/30 μL [ 152 ] DNA Β-lactin Microwells 384 ~6 nL -- [ 150 ] 4.1. LAMP-on-a-Chip 4.1.1. Classical Microfluidic Chip Controlling the spread of a contagious disease demands extensive rapid testing. This may lead to a risk of cross-contamination and further transmission of the infection. Additionally, the large amount of sample requirement makes the diagnosis process expensive and limits mass testing. The introduction of microfluidic devices can overcome this limitation and provide a "sample-in-result-out" route in a protected environment. Integration of LAMP with an advanced microfluidic chip further enhances the analysis and delivers rapid and highly specific detection with very high sensitivity. In recent years, LAMP-on-a-chip has emerged as an advanced solution for POC diagnostics for contagious diseases. Polymethyl methacrylate (PMMA) and poly-dimethylsiloxane (PDMS)-based classical microfluidic chips are the most common examples of LAMP-on-a-chip modalities. Here, we summarize the recent advances in LAMP-integrated microfluidic devices. Trinh et al. [ 121 ] developed a LAMP-based foldable microdevice for the detection of multiple foodborne pathogens. This device is made up of a polycarbonate thin film with two different sections for LAMP reaction and analyte detection ( Figure 7 A). The reaction part is enclosed with 2-hydroxyethyl agarose containing the LAMP reagents for their long-term storage and maintenance. It can successfully store the LAMP reagents for up to 45 days. On-chip amplification is performed by using a graphene-based heater. The assay achieved a LOD of 2.5 × 10 2 copies/reaction in 30 min. In another study, Fu et al. [ 122 ] developed a LAMP assay using the most probable number (MNP) for the quantification of E. coli and Enterococcus spp. in a PMMA chip. The assay achieved a LOD of 4 copies/well in 35 min. A LAMP-integrated POC microdevice coupled with gold nanoparticles was developed by Sivakumar et al. [ 123 ] for the detection of Enterococcus faecium and SARS-CoV-2 plasmids. In the presence of LAMP product, the gold chloride is reduced to red-coloured gold nanoparticles under UV light, providing a detection limit of 42 fg/µL for COVID-19 plasmids in just 10 min. In another effort, a fully integrated rotary valve-assisted microfluidic device was developed for the DNA extraction, amplification, and detection of V. parahaemolyticus and spiked shrimp with a LOD of 3.1 × 10 1 copies per reaction in 80 min [ 124 ] ( Figure 7 B). The CRISPR/Cas12a method was used for the detection of the LAMP amplicons. The fluorescence signal of the amplified product was recorded in real-time PCR. The detection cost per test was less than 4 USD. At a later time, a classical microfluidic device was developed by Tian et al. [ 125 ] for the detection of Cryptococcal meningitis (CM). The five-layer microfluidic module provided cellular lysis, DNA extraction, and purification for the isothermal amplification. LAMP was performed in a portable bead consisting of lyophilized reagents. This module can be utilized as an auxiliary tool for the middle and late phases of CM and to confirm instances with ambiguous lateral flow assay (LFA) results in the early stages of CM diagnosis. Recently, microfluidic devices are also integrated with RT-LAMP for the detection of the highly infectious SARS-CoV-2 virus. For example, Mateos et al. [ 126 ] devised a PMMA-made, integrated microfluidic chip for magnetic bead-based RNA extraction and RT-LAMP reaction targeting ORF1a and N gene of SARS-CoV-2. The microchip contains a large chamber for sample loading, followed by seven wash chambers and a detection chamber. The use of a greater number of wash chambers delivers high-purity RNA extraction and eliminates carryover contaminations. This device achieved a detection sensitivity of 470 copies/mL with a turn-around time of 60 min. This simple-to-use platform delivers rapid and accurate detection of SARS-CoV-2 and could be used for mass screening of COVID-19 at POC. Similarly, Jhou et al. [ 127 ] designed an RT-LAMP-based integrated microfluidic platform (IMP) for real-time detection of the SARS-CoV-2 virus. This automated platform consists of a PDMS-based microfluidic chip for viral lysis and RNA extraction, and a heating module for RT-LAMP. Liquid samples were transported inside the chip via micropumps and valves by creating a gauge pressure difference, controlled by a fluidic control module, and also functioned as micromixers for mixing the reagents. The calcein-based fluorescent detection obtained a LOD of 5 × 10 3 copies of viral RNA per reaction in 90 min. The LAMP-on-a-chip system also provides the advantage of multiplex detection, maintaining the virtue of LAMP. For example, Liu et al. [ 128 ] developed a fully automated centrifugal chip for the simultaneous detection of five different bacteria. The automated design provided the bacterial cell lysis, DNA purification, LAMP reaction, and the end point colorimetric detection of the samples with a LOD of 10 copies/µL in just 70 min. Bead-beating-based mechanical lysis was used to substitute the chemical lysis. A colour sensor was used with a white LED light for on-chip LAMP readouts. Meanwhile, a disc-shaped dual-sample microfluidic chip made out of PMMA was developed by Jin et al. [ 129 ] for multiplex detection of 10 waterborne bacteria. The microfluidic disc was equipped with a centrifugal module that enables the reagent to flow through the channel. The real-time fluorescence resulted from a LOD ranging from 7.92 × 10 −3 to 9.54 × 10 −1 pg per reaction in 35 min, demonstrating high specificity and reproducibility. In another study, a centrifugal chip-based, fully integrated portable genetic analyser was developed for multiplex RT-LAMP [ 130 ]. The centrifugal chip allowed the detection of 10 samples in one run. The chip consisted of 10 aliquoting chambers which were connected with zigzag aliquoting channels and a glass filter column for RNA extraction. The structure of the disc is shown in Figure 7 C. A passive valve was used between the aliquoting chamber and the glass filter column to manipulate the fluid flow. Capillary pressure enabled the automatic sample distribution in aliquoting chambers, and the subsequent washing and elution of samples were achieved by centrifugal protocols. Each sample had three reaction chambers on the chip, preloaded with freeze-dried LAMP primers for simultaneous amplification of ORF1ab, N, and S genes. To prevent sample evaporation, the reaction chamber was blocked by wax. The fluorescence signals of the amplified products were recorded, and the three target genes of SARS-CoV-2 in 10 samples were detected with a LOD of 20 copies/µL with a turnaround time of 90 min. 4.1.2. Paper-Based Chips Conventional microfluidic devices often require additional pumping and micro-valves for fluid movements. This increases their operational complexity, use of raw materials, and overall cost. However, paper-based and paper–polymer hybrid microfluidic devices have emerged as an alternative solution, due to their high biocompatibility with nucleic acids and proteins, ease of fabrication, and low production cost [ 131 ]. Additionally, the capillary force can eliminate the use of micropumps and other bulky equipment. Rodriguez et al. developed a low-cost, sample-to-answer paper-based molecular diagnostic assay integrated with RT-LAMP for the detection of H1N1 from human nasopharyngeal swabs with high sensitivity. The RNA extraction from the clinical samples and purification, followed by the RT-LAMP reaction, was performed in the paper device. Naked eye detection on lateral flow strips delivered a LOD of 10 6 copies/mL within just 45 min, which is 10-fold more sensitive than the current immunoassay technique [ 132 ]. In another work. a cellulose-based paper microchip was developed by Roy et al. [ 133 ] for the detection of microbes in porcine meat ( Figure 7 D). Amplified LAMP product was detected in a wax-printed cellulose paper-based microchip using crystal violet dye. This low-cost colorimetric assay delivered rapid and highly sensitive detection of Bacillus subtilis and Sus scrofa with LODs of 10 pg/μL (2.2 × 10 3 copies/μL) and 1 pg/μL (3.43 × 10 −1 copies/μL), respectively. Similarly, Kaarj et al. [ 134 ] designed a wax-printed G4 cellulose paper chip in combination with RT-LAMP for POC diagnosis of Zika virus from water, urine, and diluted blood plasma. The paper chip was divided into two parts: the sample-loading region and the detection/amplification area. The sample containing the spiked viral particles was transferred into the loading region, and the sample moved through the channel via capillary action. The detection area was placed on a hot plate, and the RT-LAMP reagents were added. A LOD as low as 1 copy/µL was achieved with smartphone-based colorimetric detection in 15 min from the biological samples. In another effort, Batule et al. [ 135 ] demonstrated a two-step strategy for viral RNA extraction, followed by isothermal amplification and detection in a paper substrate. In the first step, a nitrocellulose-based paper strip was used for the extraction of viral RNA from serum within 5 min. In the next step, RT-LAMP was performed in the paper chip consisting of four reaction chambers connected via a fluidic channel and pre-loaded with reaction pads. The RT-LAMP reagents, including the reverse transcriptase, primers, Bst polymerase, and the dye for visual detection, were dry stored in the reaction pad. The assay achieved detection limits of 1 copy and 10 copies of three different RNA particles (e.g., zika, chikungunya, and dengue) in phosphate buffer solution (PBS) and serum, respectively. The whole process of RNA extraction and detection was completed within 1 h. Paper-polymer-based hybrid microfluidic devices also obtained high attention and were applied in the detection of microbial infections. Pang et al. [ 136 ] reported a hybrid microfluidic platform based on PDMS/paper for the detection of food-borne pathogens. The microdevice contained three LAMP reaction chambers connected by microchannels, including one for a negative control. The paper disc was pre-loaded with LAMP reagents and placed in the reaction chambers. The high gas solubility of PDMS enables the self-priming of samples. The use of mixed dye delivered visual detection of the final product with a LOD of 10 3 CFU/mL for S. aureus and V. parahaemolyticus . Similarly, Trinh et al. [ 137 ] developed a paper-embedded foldable microdevice for naked-eye detection of Salmonella spp. with a LOD of 10 2 CFU/mL from milk samples in 65 min. The microdevice consisting of three sections attached with a sealing film was able to perform nucleic acid extraction, LAMP reaction, and colorimetric detection. The sample and reaction chambers were placed up of polycarbonate consisting of nine chambers, pre-loaded with LAMP reagent cellulose paper. The fuchsin-coated paper strip was used in the detection layer, where it changed colour to purple in cases of positive LAMP. Another LAMP-integrated paper-based microdevice was reported with a spinning mechanism for the detection of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) [ 138 ]. The stationary part consisted of a PDMS chip for LAMP amplification. The spinning part was installed with a three-glass microfiber treated with sodium hydroxide for DNA extraction and another three-glass microfiber treated with phenolphthalein for the colorimetric detection of the LAMP amplicons ( Figure 7 E). This device was capable of detecting 10 2 CFU/mL of VRE in tap water in 45 min. In another strategy, a foldable paper microdevice was developed by Dinh et al. [ 139 ] to perform on-chip LAMP amplification. The polymerized Safranin O interacts with LAMP amplicons, resulting in a dark red solution. Limits of detection of 10 −4 ng/µL and 10 2 CFU/mL were achieved for SARS-CoV-2 plasmid and E. faecium in just 60 min. In a similar approach, a paper-based microfluidic chip was developed by Zhang et al. [ 140 ] for colorimetric detection of foodborne bacteria E. coli O157:H7. This microchip was further utilized for on-chip detection of Salmonella spp. from milk samples. Bacterial cell lysis was executed through thermal shock at 90 °C for 5 min. The detection was performed by calcein dye embedded in the reaction chamber, delivering LODs of 13.4 pg/µL and 12 CFU/mL for E. coli O157:H7 and Salmonella spp., respectively. To summarize, the paper-based tests meet the criteria for POC diagnostic tools and have the potential to be used in the early and onsite diagnosis of infectious diseases. 4.1.3. Fully Integrated Chips Microfluidics chips integrated with nucleic acid extraction, purification, and LAMP amplification are suitable candidates for on-site detection, especially in resource-limited regions. In past years, researchers have attempted to develop microdevices integrated with sample pre-treatment functionalities, including the isothermal amplification in a single microfluidic device. Materials such as a magnetic bead, silica bead, glass filter membrane, and FTA card were used for nucleic acid extraction and purification. Guo et al. [ 141 ] designed a microfluidic chip integrated with silica-based solid-phase extraction (SPE) of bacterial genomic DNA and LAMP amplification for the detection of three different bacteria, including E. coli O157:H7, MRSA, and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA). The microchip consisted of two channels: one for sample loading, and the other one for performing the washing step. Both channels were loaded with a micro-valve to control the fluid flow. The extracted genomic DNA was only allowed to pass through the SPE chamber, and the silica beads were blocked in the micro-pillars. A detection limit of 10 2 CFU/100 µL was achieved for three specific genes, rfb E, spa , and mec A, with a turnaround time of 2 h. Another LAMP-based, nucleic-acid-extraction-integrated lab-on-a-disc platform was developed by Loo et al. [ 142 ] to deliver a sample-to-result solution. A silica membrane was used for on-chip solid-phase extraction and purification of the bacterial DNA. The fluid flow in the microfluidic disc was controlled by the centrifugation force. Real-time fluorescence monitoring employed by SYTO-9 fluorescent dye provided a detection limit of 10 3 CFU/mL for Mycobacterium tuberculosis in sputum and 10 2 CFU/mL of Acinetobacter baumanii (Ab) in blood. The entire process can be performed by this microfluidic platform in less than 120 min, and multiple samples can be analysed simultaneously. Similarly, Park et al. [ 143 ] devised a compact-disc, rotary microfluidic device integrating nucleic acid extraction based on glass microbeads, chambers for LAMP reaction, and three separate lateral flows strips for simultaneous detection of multiple food-borne pathogens in contaminated milk or water samples. The glass microbeads were loaded in the microchannels where the genomic DNA was adsorbed on silica via hydrogen bonding, in the presence of chaotropic salts. DNA extraction in the microfluidic disc was confirmed by using a FAM-labelled artificial DNA probe. Buffer transport was achieved by the centrifugal speed, and the sample flow was controlled with the help of multiple siphons and a circular capillary valve. Target genes of S. typhimurium and V. parahaemolyticus were simultaneously detected with a LOD of 50 CFU with an assay time of 80 min. Although these integrated microfluidic discs are capable of fully automated, rapid, and sensitive detection of pathogens in a multiplex manner, the treatment of large sample volumes is still a major drawback. To solve that problem, an integrated centrifugal microfluidic chip was designed for LAMP-based multiplex detection of food-borne bacteria with a sample volume of up to 1 mL. The microdevice consisted of two major parts: a 3D-printed cartridge for LAMP reagent storage and a centrifugal disc to release the solutions into the microdevice, which is controlled by disc rotation. To absorb the washing solution and the extra sample, a super-absorbent polymer (SAP) was installed in the washing chamber, which eventually allowed the use of samples up to 1 mL. Twenty reaction chambers were used in each part of the chip, enabling simultaneous detection of multiple samples in one run. Bead-based DNA extraction allowed the full automation of the process, and the colorimetric detection of three bacteria ( E. coli O157:H7, S. typhimurium , and V. parahaemolyticus ) was performed within 1 h with a LOD of 10 2 cells/mL [ 144 ]. A Flinders Technology Associates (FTA) card-embedded sliding hybrid microfluidic device was developed, consisting of three layers, to perform the DNA extraction, LAMP reaction, and bacterial detection simultaneously ( Figure 7 F). An FTA card was used for bacterial DNA extraction and purification. Colorimetric analysis was performed using a fuchsin-based method which eventually detects Salmonella spp. and E. coli O157:H7 with a LOD of 30 CFU/sample and S. aureus with a LOD of 3 × 10 2 CFU/sample in 75 min [ 145 ]. Similarly, a 3D-paper-based microfluidic device inspired by a pop-up greeting card was developed for the detection of VRE [ 146 ]. The FTA card was installed on the top for the DNA extraction, and the PDMS chip served as the LAMP reaction chamber ( Figure 7 G). The paper was coated with concentrated nail polish to prevent the sample flow throughout the paper by modifying the porous structure. A pH-sensitive chemosensor delivered a detection of VRE with a LOD of 10 2 CFU/mL from raw milk samples in 45 min. Another microfluidic platform was designed by Tsai et al. [ 147 ] and integrated with an electromagnet for viral lysis, RNA extraction, and detection of SARS-CoV-2 by RT-LAMP in real time. The electromagnets enabled the bead-based RNA extraction and the mixing of the reagents. The assay achieved a detection limit of 5000 viral copies per reaction within 82 min. Table 3 listed the recently developed LAMP-on-a-chip modalities and provides a comparison between them. Figure 7 LAMP-on-a-chip biosensors. ( A ) Schematic workflow of graphene-heater-integrated polycarbonate-based foldable microdevice. ( B ) Structural overview of a rotary valve-assisted fluidic chip. ( C ) Centrifugal microfluidic disc for multiplex RT-LAMP. ( D ) Schematic workflow of colorimetric detection of LAMP amplicons on a wax-printed paper microdevice. ( E ) Working principle of paper-based microdevice with a spinning mechanism. ( F ) Structural overview of FTA card-based fully integrated slidable paper microdevice. ( G ) Illustration of a pop-up, paper-based, fully integrated microfluidic platform. Reproduced with permission from references [ 121 , 124 , 130 , 133 , 138 , 145 , 146 ]. Copyright 2017, 2019, 2021 American Chemical Society; and 2019, 2021, and 2022 Elsevier. biosensors-12-01068-t003_Table 3 Table 3 Summary of LAMP-based microfluidic platforms. Technique Target Pathogen Material Readout Time LOD Reference Classical DNA Salmonella spp. E. coli O157:H7 Polycarbonate Colorimetric 30 min 2.5 × 10 2 copies/mL [ 121 ] DNA E. coli and Enterococcus spp. PMMA Colorimetric 35 min 4 copies/well [ 122 ] DNA V. parahaemolyticus PMMA Fluorescence 80 min 3.1 × 10 1 copies/reaction [ 124 ] RNA SARS-CoV-2 PMMA Fluorescence 90 min 20 copies/µL [ 130 ] Paper-based DNA Sus scrofa (porcine) Bacillus subtilis Cellulose paper Colorimetric 10 min 18 min 3.43 × 10 −1 copies/μL 2.2 × 10 3 copies/μL [ 133 ] DNA Salmonella spp. Polydopamine coated paper-polycarbonate Colorimetric 65 min 1 × 10 2 CFU/mL [ 137 ] DNA VRE Paper-PDMS Colorimetric 45 min 10 2 CFU/mL [ 138 ] RNA Zika virus G4-cellulose paper Colorimetric 15 min 1 copy/µL [ 134 ] Integrated chips DNA E. coli O157:H7, MRSA, MSSA Silica beads-PMMA Fluorescence 2 h 10 2 CFU/100 µL [ 141 ] DNA S. typhimurium and V. parahaemolyticus Glass microbeads-PPMA Colorimetric 80 min 50 CFU [ 143 ] DNA VRE FTA card-PDMS Colorimetric 45 min 10 2 CFU/mL [ 146 ] RNA SARS-CoV-2 Magnetic beads Fluorescence 82 min 5000 copies/reaction [ 147 ] 4.1.1. Classical Microfluidic Chip Controlling the spread of a contagious disease demands extensive rapid testing. This may lead to a risk of cross-contamination and further transmission of the infection. Additionally, the large amount of sample requirement makes the diagnosis process expensive and limits mass testing. The introduction of microfluidic devices can overcome this limitation and provide a "sample-in-result-out" route in a protected environment. Integration of LAMP with an advanced microfluidic chip further enhances the analysis and delivers rapid and highly specific detection with very high sensitivity. In recent years, LAMP-on-a-chip has emerged as an advanced solution for POC diagnostics for contagious diseases. Polymethyl methacrylate (PMMA) and poly-dimethylsiloxane (PDMS)-based classical microfluidic chips are the most common examples of LAMP-on-a-chip modalities. Here, we summarize the recent advances in LAMP-integrated microfluidic devices. Trinh et al. [ 121 ] developed a LAMP-based foldable microdevice for the detection of multiple foodborne pathogens. This device is made up of a polycarbonate thin film with two different sections for LAMP reaction and analyte detection ( Figure 7 A). The reaction part is enclosed with 2-hydroxyethyl agarose containing the LAMP reagents for their long-term storage and maintenance. It can successfully store the LAMP reagents for up to 45 days. On-chip amplification is performed by using a graphene-based heater. The assay achieved a LOD of 2.5 × 10 2 copies/reaction in 30 min. In another study, Fu et al. [ 122 ] developed a LAMP assay using the most probable number (MNP) for the quantification of E. coli and Enterococcus spp. in a PMMA chip. The assay achieved a LOD of 4 copies/well in 35 min. A LAMP-integrated POC microdevice coupled with gold nanoparticles was developed by Sivakumar et al. [ 123 ] for the detection of Enterococcus faecium and SARS-CoV-2 plasmids. In the presence of LAMP product, the gold chloride is reduced to red-coloured gold nanoparticles under UV light, providing a detection limit of 42 fg/µL for COVID-19 plasmids in just 10 min. In another effort, a fully integrated rotary valve-assisted microfluidic device was developed for the DNA extraction, amplification, and detection of V. parahaemolyticus and spiked shrimp with a LOD of 3.1 × 10 1 copies per reaction in 80 min [ 124 ] ( Figure 7 B). The CRISPR/Cas12a method was used for the detection of the LAMP amplicons. The fluorescence signal of the amplified product was recorded in real-time PCR. The detection cost per test was less than 4 USD. At a later time, a classical microfluidic device was developed by Tian et al. [ 125 ] for the detection of Cryptococcal meningitis (CM). The five-layer microfluidic module provided cellular lysis, DNA extraction, and purification for the isothermal amplification. LAMP was performed in a portable bead consisting of lyophilized reagents. This module can be utilized as an auxiliary tool for the middle and late phases of CM and to confirm instances with ambiguous lateral flow assay (LFA) results in the early stages of CM diagnosis. Recently, microfluidic devices are also integrated with RT-LAMP for the detection of the highly infectious SARS-CoV-2 virus. For example, Mateos et al. [ 126 ] devised a PMMA-made, integrated microfluidic chip for magnetic bead-based RNA extraction and RT-LAMP reaction targeting ORF1a and N gene of SARS-CoV-2. The microchip contains a large chamber for sample loading, followed by seven wash chambers and a detection chamber. The use of a greater number of wash chambers delivers high-purity RNA extraction and eliminates carryover contaminations. This device achieved a detection sensitivity of 470 copies/mL with a turn-around time of 60 min. This simple-to-use platform delivers rapid and accurate detection of SARS-CoV-2 and could be used for mass screening of COVID-19 at POC. Similarly, Jhou et al. [ 127 ] designed an RT-LAMP-based integrated microfluidic platform (IMP) for real-time detection of the SARS-CoV-2 virus. This automated platform consists of a PDMS-based microfluidic chip for viral lysis and RNA extraction, and a heating module for RT-LAMP. Liquid samples were transported inside the chip via micropumps and valves by creating a gauge pressure difference, controlled by a fluidic control module, and also functioned as micromixers for mixing the reagents. The calcein-based fluorescent detection obtained a LOD of 5 × 10 3 copies of viral RNA per reaction in 90 min. The LAMP-on-a-chip system also provides the advantage of multiplex detection, maintaining the virtue of LAMP. For example, Liu et al. [ 128 ] developed a fully automated centrifugal chip for the simultaneous detection of five different bacteria. The automated design provided the bacterial cell lysis, DNA purification, LAMP reaction, and the end point colorimetric detection of the samples with a LOD of 10 copies/µL in just 70 min. Bead-beating-based mechanical lysis was used to substitute the chemical lysis. A colour sensor was used with a white LED light for on-chip LAMP readouts. Meanwhile, a disc-shaped dual-sample microfluidic chip made out of PMMA was developed by Jin et al. [ 129 ] for multiplex detection of 10 waterborne bacteria. The microfluidic disc was equipped with a centrifugal module that enables the reagent to flow through the channel. The real-time fluorescence resulted from a LOD ranging from 7.92 × 10 −3 to 9.54 × 10 −1 pg per reaction in 35 min, demonstrating high specificity and reproducibility. In another study, a centrifugal chip-based, fully integrated portable genetic analyser was developed for multiplex RT-LAMP [ 130 ]. The centrifugal chip allowed the detection of 10 samples in one run. The chip consisted of 10 aliquoting chambers which were connected with zigzag aliquoting channels and a glass filter column for RNA extraction. The structure of the disc is shown in Figure 7 C. A passive valve was used between the aliquoting chamber and the glass filter column to manipulate the fluid flow. Capillary pressure enabled the automatic sample distribution in aliquoting chambers, and the subsequent washing and elution of samples were achieved by centrifugal protocols. Each sample had three reaction chambers on the chip, preloaded with freeze-dried LAMP primers for simultaneous amplification of ORF1ab, N, and S genes. To prevent sample evaporation, the reaction chamber was blocked by wax. The fluorescence signals of the amplified products were recorded, and the three target genes of SARS-CoV-2 in 10 samples were detected with a LOD of 20 copies/µL with a turnaround time of 90 min. 4.1.2. Paper-Based Chips Conventional microfluidic devices often require additional pumping and micro-valves for fluid movements. This increases their operational complexity, use of raw materials, and overall cost. However, paper-based and paper–polymer hybrid microfluidic devices have emerged as an alternative solution, due to their high biocompatibility with nucleic acids and proteins, ease of fabrication, and low production cost [ 131 ]. Additionally, the capillary force can eliminate the use of micropumps and other bulky equipment. Rodriguez et al. developed a low-cost, sample-to-answer paper-based molecular diagnostic assay integrated with RT-LAMP for the detection of H1N1 from human nasopharyngeal swabs with high sensitivity. The RNA extraction from the clinical samples and purification, followed by the RT-LAMP reaction, was performed in the paper device. Naked eye detection on lateral flow strips delivered a LOD of 10 6 copies/mL within just 45 min, which is 10-fold more sensitive than the current immunoassay technique [ 132 ]. In another work. a cellulose-based paper microchip was developed by Roy et al. [ 133 ] for the detection of microbes in porcine meat ( Figure 7 D). Amplified LAMP product was detected in a wax-printed cellulose paper-based microchip using crystal violet dye. This low-cost colorimetric assay delivered rapid and highly sensitive detection of Bacillus subtilis and Sus scrofa with LODs of 10 pg/μL (2.2 × 10 3 copies/μL) and 1 pg/μL (3.43 × 10 −1 copies/μL), respectively. Similarly, Kaarj et al. [ 134 ] designed a wax-printed G4 cellulose paper chip in combination with RT-LAMP for POC diagnosis of Zika virus from water, urine, and diluted blood plasma. The paper chip was divided into two parts: the sample-loading region and the detection/amplification area. The sample containing the spiked viral particles was transferred into the loading region, and the sample moved through the channel via capillary action. The detection area was placed on a hot plate, and the RT-LAMP reagents were added. A LOD as low as 1 copy/µL was achieved with smartphone-based colorimetric detection in 15 min from the biological samples. In another effort, Batule et al. [ 135 ] demonstrated a two-step strategy for viral RNA extraction, followed by isothermal amplification and detection in a paper substrate. In the first step, a nitrocellulose-based paper strip was used for the extraction of viral RNA from serum within 5 min. In the next step, RT-LAMP was performed in the paper chip consisting of four reaction chambers connected via a fluidic channel and pre-loaded with reaction pads. The RT-LAMP reagents, including the reverse transcriptase, primers, Bst polymerase, and the dye for visual detection, were dry stored in the reaction pad. The assay achieved detection limits of 1 copy and 10 copies of three different RNA particles (e.g., zika, chikungunya, and dengue) in phosphate buffer solution (PBS) and serum, respectively. The whole process of RNA extraction and detection was completed within 1 h. Paper-polymer-based hybrid microfluidic devices also obtained high attention and were applied in the detection of microbial infections. Pang et al. [ 136 ] reported a hybrid microfluidic platform based on PDMS/paper for the detection of food-borne pathogens. The microdevice contained three LAMP reaction chambers connected by microchannels, including one for a negative control. The paper disc was pre-loaded with LAMP reagents and placed in the reaction chambers. The high gas solubility of PDMS enables the self-priming of samples. The use of mixed dye delivered visual detection of the final product with a LOD of 10 3 CFU/mL for S. aureus and V. parahaemolyticus . Similarly, Trinh et al. [ 137 ] developed a paper-embedded foldable microdevice for naked-eye detection of Salmonella spp. with a LOD of 10 2 CFU/mL from milk samples in 65 min. The microdevice consisting of three sections attached with a sealing film was able to perform nucleic acid extraction, LAMP reaction, and colorimetric detection. The sample and reaction chambers were placed up of polycarbonate consisting of nine chambers, pre-loaded with LAMP reagent cellulose paper. The fuchsin-coated paper strip was used in the detection layer, where it changed colour to purple in cases of positive LAMP. Another LAMP-integrated paper-based microdevice was reported with a spinning mechanism for the detection of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) [ 138 ]. The stationary part consisted of a PDMS chip for LAMP amplification. The spinning part was installed with a three-glass microfiber treated with sodium hydroxide for DNA extraction and another three-glass microfiber treated with phenolphthalein for the colorimetric detection of the LAMP amplicons ( Figure 7 E). This device was capable of detecting 10 2 CFU/mL of VRE in tap water in 45 min. In another strategy, a foldable paper microdevice was developed by Dinh et al. [ 139 ] to perform on-chip LAMP amplification. The polymerized Safranin O interacts with LAMP amplicons, resulting in a dark red solution. Limits of detection of 10 −4 ng/µL and 10 2 CFU/mL were achieved for SARS-CoV-2 plasmid and E. faecium in just 60 min. In a similar approach, a paper-based microfluidic chip was developed by Zhang et al. [ 140 ] for colorimetric detection of foodborne bacteria E. coli O157:H7. This microchip was further utilized for on-chip detection of Salmonella spp. from milk samples. Bacterial cell lysis was executed through thermal shock at 90 °C for 5 min. The detection was performed by calcein dye embedded in the reaction chamber, delivering LODs of 13.4 pg/µL and 12 CFU/mL for E. coli O157:H7 and Salmonella spp., respectively. To summarize, the paper-based tests meet the criteria for POC diagnostic tools and have the potential to be used in the early and onsite diagnosis of infectious diseases. 4.1.3. Fully Integrated Chips Microfluidics chips integrated with nucleic acid extraction, purification, and LAMP amplification are suitable candidates for on-site detection, especially in resource-limited regions. In past years, researchers have attempted to develop microdevices integrated with sample pre-treatment functionalities, including the isothermal amplification in a single microfluidic device. Materials such as a magnetic bead, silica bead, glass filter membrane, and FTA card were used for nucleic acid extraction and purification. Guo et al. [ 141 ] designed a microfluidic chip integrated with silica-based solid-phase extraction (SPE) of bacterial genomic DNA and LAMP amplification for the detection of three different bacteria, including E. coli O157:H7, MRSA, and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA). The microchip consisted of two channels: one for sample loading, and the other one for performing the washing step. Both channels were loaded with a micro-valve to control the fluid flow. The extracted genomic DNA was only allowed to pass through the SPE chamber, and the silica beads were blocked in the micro-pillars. A detection limit of 10 2 CFU/100 µL was achieved for three specific genes, rfb E, spa , and mec A, with a turnaround time of 2 h. Another LAMP-based, nucleic-acid-extraction-integrated lab-on-a-disc platform was developed by Loo et al. [ 142 ] to deliver a sample-to-result solution. A silica membrane was used for on-chip solid-phase extraction and purification of the bacterial DNA. The fluid flow in the microfluidic disc was controlled by the centrifugation force. Real-time fluorescence monitoring employed by SYTO-9 fluorescent dye provided a detection limit of 10 3 CFU/mL for Mycobacterium tuberculosis in sputum and 10 2 CFU/mL of Acinetobacter baumanii (Ab) in blood. The entire process can be performed by this microfluidic platform in less than 120 min, and multiple samples can be analysed simultaneously. Similarly, Park et al. [ 143 ] devised a compact-disc, rotary microfluidic device integrating nucleic acid extraction based on glass microbeads, chambers for LAMP reaction, and three separate lateral flows strips for simultaneous detection of multiple food-borne pathogens in contaminated milk or water samples. The glass microbeads were loaded in the microchannels where the genomic DNA was adsorbed on silica via hydrogen bonding, in the presence of chaotropic salts. DNA extraction in the microfluidic disc was confirmed by using a FAM-labelled artificial DNA probe. Buffer transport was achieved by the centrifugal speed, and the sample flow was controlled with the help of multiple siphons and a circular capillary valve. Target genes of S. typhimurium and V. parahaemolyticus were simultaneously detected with a LOD of 50 CFU with an assay time of 80 min. Although these integrated microfluidic discs are capable of fully automated, rapid, and sensitive detection of pathogens in a multiplex manner, the treatment of large sample volumes is still a major drawback. To solve that problem, an integrated centrifugal microfluidic chip was designed for LAMP-based multiplex detection of food-borne bacteria with a sample volume of up to 1 mL. The microdevice consisted of two major parts: a 3D-printed cartridge for LAMP reagent storage and a centrifugal disc to release the solutions into the microdevice, which is controlled by disc rotation. To absorb the washing solution and the extra sample, a super-absorbent polymer (SAP) was installed in the washing chamber, which eventually allowed the use of samples up to 1 mL. Twenty reaction chambers were used in each part of the chip, enabling simultaneous detection of multiple samples in one run. Bead-based DNA extraction allowed the full automation of the process, and the colorimetric detection of three bacteria ( E. coli O157:H7, S. typhimurium , and V. parahaemolyticus ) was performed within 1 h with a LOD of 10 2 cells/mL [ 144 ]. A Flinders Technology Associates (FTA) card-embedded sliding hybrid microfluidic device was developed, consisting of three layers, to perform the DNA extraction, LAMP reaction, and bacterial detection simultaneously ( Figure 7 F). An FTA card was used for bacterial DNA extraction and purification. Colorimetric analysis was performed using a fuchsin-based method which eventually detects Salmonella spp. and E. coli O157:H7 with a LOD of 30 CFU/sample and S. aureus with a LOD of 3 × 10 2 CFU/sample in 75 min [ 145 ]. Similarly, a 3D-paper-based microfluidic device inspired by a pop-up greeting card was developed for the detection of VRE [ 146 ]. The FTA card was installed on the top for the DNA extraction, and the PDMS chip served as the LAMP reaction chamber ( Figure 7 G). The paper was coated with concentrated nail polish to prevent the sample flow throughout the paper by modifying the porous structure. A pH-sensitive chemosensor delivered a detection of VRE with a LOD of 10 2 CFU/mL from raw milk samples in 45 min. Another microfluidic platform was designed by Tsai et al. [ 147 ] and integrated with an electromagnet for viral lysis, RNA extraction, and detection of SARS-CoV-2 by RT-LAMP in real time. The electromagnets enabled the bead-based RNA extraction and the mixing of the reagents. The assay achieved a detection limit of 5000 viral copies per reaction within 82 min. Table 3 listed the recently developed LAMP-on-a-chip modalities and provides a comparison between them. Figure 7 LAMP-on-a-chip biosensors. ( A ) Schematic workflow of graphene-heater-integrated polycarbonate-based foldable microdevice. ( B ) Structural overview of a rotary valve-assisted fluidic chip. ( C ) Centrifugal microfluidic disc for multiplex RT-LAMP. ( D ) Schematic workflow of colorimetric detection of LAMP amplicons on a wax-printed paper microdevice. ( E ) Working principle of paper-based microdevice with a spinning mechanism. ( F ) Structural overview of FTA card-based fully integrated slidable paper microdevice. ( G ) Illustration of a pop-up, paper-based, fully integrated microfluidic platform. Reproduced with permission from references [ 121 , 124 , 130 , 133 , 138 , 145 , 146 ]. Copyright 2017, 2019, 2021 American Chemical Society; and 2019, 2021, and 2022 Elsevier. biosensors-12-01068-t003_Table 3 Table 3 Summary of LAMP-based microfluidic platforms. Technique Target Pathogen Material Readout Time LOD Reference Classical DNA Salmonella spp. E. coli O157:H7 Polycarbonate Colorimetric 30 min 2.5 × 10 2 copies/mL [ 121 ] DNA E. coli and Enterococcus spp. PMMA Colorimetric 35 min 4 copies/well [ 122 ] DNA V. parahaemolyticus PMMA Fluorescence 80 min 3.1 × 10 1 copies/reaction [ 124 ] RNA SARS-CoV-2 PMMA Fluorescence 90 min 20 copies/µL [ 130 ] Paper-based DNA Sus scrofa (porcine) Bacillus subtilis Cellulose paper Colorimetric 10 min 18 min 3.43 × 10 −1 copies/μL 2.2 × 10 3 copies/μL [ 133 ] DNA Salmonella spp. Polydopamine coated paper-polycarbonate Colorimetric 65 min 1 × 10 2 CFU/mL [ 137 ] DNA VRE Paper-PDMS Colorimetric 45 min 10 2 CFU/mL [ 138 ] RNA Zika virus G4-cellulose paper Colorimetric 15 min 1 copy/µL [ 134 ] Integrated chips DNA E. coli O157:H7, MRSA, MSSA Silica beads-PMMA Fluorescence 2 h 10 2 CFU/100 µL [ 141 ] DNA S. typhimurium and V. parahaemolyticus Glass microbeads-PPMA Colorimetric 80 min 50 CFU [ 143 ] DNA VRE FTA card-PDMS Colorimetric 45 min 10 2 CFU/mL [ 146 ] RNA SARS-CoV-2 Magnetic beads Fluorescence 82 min 5000 copies/reaction [ 147 ] 4.2. Digital LAMP In recent years, digital LAMP (dLAMP) has gained popularity for the accurate measurement of nucleic acids within a sample. Based on the sample separation, dLAMP can be categorized into two groups: droplet-based digital LAMP (ddLAMP) and well-plate-based dLAMP. Both methods rely on separating the sample into thousands of nanolitre-sized droplets containing one target molecule each. The sample droplets can be created by suspending them in oil or loading the sample into a microwell and sealing with oil or a lid. The number of target molecules can be quantified by analysing the number of droplets that display a positive signal. Amplification results are analysed by digital image processing or flow cytometry. Gansen et al. [ 148 ] reported the first sample self-digitization (SD) chip-based digital LAMP (dLAMP) for amplification and detection of a single DNA/RNA molecule in a stationary droplet. The chip was replicated in PDMS containing 5000 microwells. Droplets were created by mixing oil and the sample through air pressure, and the LAMP was performed at 65 °C. The device showed adequate size homogeneity and low sample consumption. Using this concept, Wang et al. [ 149 ] reported the detection of 14 high-risk HVP in clinical samples with very high specificity and accuracy ( Figure 8 A). Alternatively, Zhu et al. [ 150 ] developed a self-priming compartmentalization (SPC) chip to perform digital LAMP analysis. The vacuum generated via degassing the air-dissolved PDMS chip provided the pumping force for the sample and oil flow in the chip. This allowed the droplet creation and self-compartmentalization of the sample without using microvalves and other control systems. A LOD of 1 × 10 3 CFU/mL for V. parahaemolyticus in contaminated food samples was achieved with this device [ 151 ] ( Figure 8 B). However, long-term preservation of a vacuum may not be possible, which will impede self-priming. To overcome this problem, Ma et al. [ 152 ] proposed a hydrophilic film-coated self-driven PDMS chip to conduct dLAMP. The hydrophilic film enables automatic sample manipulation in the chip via capillary forces. Under such conditions, the assay achieved the LOD of 11 copies per 30 µL sample for VRE within 30 min of the LAMP reaction. Meanwhile, a droplet-based microfluidic device for dLAMP was developed by Rane et al. [ 153 ] for the detection of N. gonorrhoeae . A continuous flow of oil and the sample through the cross microchannel generated 100,000 droplets per 110 min with a size of 10 picolitres, containing the single nucleic acid and LAMP reagent ( Table 4 ). These droplets were moved toward the heating region for LAMP amplification. Calcein dye-based fluorescent detection using confocal fluorescent spectroscopy delivered a LOD of 600 copies/µL. Droplet-based digital LAMP requires a highly trained workforce with experience in microfluidics and sophisticated instruments. Therefore, to make ddLAMP more convenient, Yuan et al. [ 154 ] designed a "Handifluidics" device integrating the LAMP mixture emulsification, incubation region, and fluorescence detection of the amplified product ( Figure 8 C). A manually operated syringe was used to generate monodispersed droplets in a PDMS chip. The emulsified LAMP droplets were collected in the droplet container and heated in the water bath at 63 °C to perform the LAMP. Fluorescent microscopy was used to quantify the target with a LOD of 10 DNA copies/µL. In another effort, Cao et al. [ 155 ] developed a microscale, hydrogel-chip-integrated, miniaturized dLAMP device for the detection of λDNA templates with a LOD of 1 copy/µL. The chip contains more than 10,000 microgels capable of self-partitioning the DNA molecules ( Figure 8 D). The platform was integrated with a heater for LAMP reaction, and the image analysis was performed using a smartphone-based digital readout. Similarly, Hu et al. [ 156 ] created a portable sample-to-result digital LAMP platform that incorporated nucleic acid extraction and smartphone imaging-based fluorescence detection ( Figure 8 E). Surface-tension-assisted immiscible phase filtration (IFAST) was used to extract nucleic acids. Negative pressure mixing and sample partitioning were achieved using a spiral mixing channel and a flow-focusing droplet production mechanism. This device was capable of detecting low-abundance cfDNA and EGFR L858R mutation. The suggested device can provide a low-cost, simply produced, and user-friendly solution for POC tests of nucleic acid in resource-limited situations. "SlipChip" is another microfluidic platform where two plates are connected [ 157 ]. The bottom layer contains an array of microchambers and ducts. The top layer consists of wells and acts as a cover. The sample is loaded in the top-layer wells through microchannels and mixed with the preloaded reagents in the bottom chambers by slipping the top plate. This platform eliminates the use of pumps and valves and also enables multiplex detection with a sample volume in pico/nanolitres. Through a similar approach, Sun et al. [ 158 ] reported a SlipChip device for the detection of HIV RNA by performing digital two-step RT-LAMP. First, single RNA molecules were compartmentalized using Poisson distribution and the corresponding cDNA was synthesized. Later, those cDNAs were subjected to LAMP amplification. This two-step dRT-LAMP obtained 10-fold higher efficiency compared to the single-step RT-LAMP. Similarly, a self-partitioning SlipChip (sp-SlipChip) platform was developed for the quantification of HPV in clinical samples. The chip utilizes the capillary pressure to undergo self-partition for independent droplet creation. The reagent was loaded into a "chain-of-pearls"-shaped channel in the bottom plate. A salinized hydrophobic top plate containing the expansion channel is moved by manual slipping and aligned with the bottom channels. The difference in capillary pressure breaks down the fluid and self-partitions it into individual droplets [ 159 ]. Therefore, a precise alignment of the microchannels can be eliminated, making this device a promising point-of-care diagnostics tool for infectious pathogens. In conclusion, including dLAMP in a sample-to-answer microfluidic device has a lot of promise for achieving speedy and sensitive detection. Figure 8 Schematic illustration of digital LAMP methods for detection of LAMP amplicons. ( A ) Self-digitization dLAMP chip. ( B ) Self-compartmentalization microfluidic chip for digital detection of VP. ( C ) Handifluidics ddLAMP device integrated with LAMP mixture emulsification. ( D ) Microscale hydrogel chip integrated dLAMP device. ( E ) Smartphone imaging-based dLAMP device. Reproduced with permission from references [ 149 , 151 , 154 , 155 , 156 ]. Copyright 2017, 2020, and 2021 American Chemical Society. biosensors-12-01068-t004_Table 4 Table 4 Comparisons of various digital LAMP modalities. Target Pathogen Reaction Chamber Type No. of Chambers Sample Volume LOD References DNA Streptococcus pneumoniae Droplet 6500 ~2.3 nL 10 copies/μL [ 154 ] λDNA EGFR L858R mutation Droplet 10,000 ~1 nL 1 copy/μL [ 155 ] DNA N. gonorrhoeae Droplet 100,000 ~10 pL 600 copies/µL [ 153 ] Plasmid HPV Microwells 4480 ~4.5 nL 1 fg/μL [ 159 ] DNA VRE Microwells 736 ~22.6 nL 11 copies/30 μL [ 152 ] DNA Β-lactin Microwells 384 ~6 nL -- [ 150 ] 5. Application of LAMP in Clinical Diagnosis Access to high-quality medical care and technologies is still a major issue in resource-constrained places, particularly in low- and middle-income countries. Therefore, it is crucial to develop POC devices that offer affordable, trustworthy, and quick screening of medical diseases outside of the laboratory setting. The World Health Organization (WHO) has established standards for assessing POC diagnostic platforms, with an acronym "ASSURED"—meaning they should have the following qualities: being low-cost/affordable, highly sensitive and specific (very low false positive), user-friendly (anyone can use), rapid/robust, high-tech equipment-free, and deliverable (portable). Due to its operational simplicity, LAMP is one of the best candidates to fulfil these criteria. Therefore, LAMP has been massively used in molecular diagnostics for various infectious diseases, especially during the time of COVID-19. For example, Song et al. [ 160 ] developed an instrument-free, two-stage isothermal amplification method called Penn-RAMP, combining reverse-transcription recombinase polymerase amplification (RT-RPA) and LAMP for the detection of SARS-CoV-2, targeting ORF1ab gene with improved efficiency. In this method, the RT-RPA is performed first in the cap of a reaction tube. The reaction was carried out at 38 °C with nasopharyngeal swabs and saliva samples. F3 and B3 LAMP primers and a recombinase polymerase enzyme were used for the RPA reaction. After 15–20 min, the RPA reaction mixture was transferred to the pre-loaded LAMP mixture in the same reaction tube. In the second stage, the LAMP reaction was performed at 63 °C for 40 min. RPA and LAMP mixtures were maintained in a 1:9 ratio to prevent LAMP inhibition due to RPA contents. The assay provided a LOD of 5 copies/reaction with a 10-fold higher sensitivity than RT-LAMP. Hence, Penn-RAMP overcomes the individual limitations of RPA and LAMP and delivers higher sensitivity. Additionally, integration of the CRISPR/Cas diagnostic method with LAMP provides the detection of pathogenic nucleic acids with high sensitivity and specificity. For example, Joung et al. [ 161 ] have developed STOPCovid (SHERLOCK testing in one-pot for COVID-19), a CRISPR/Cas-based one-pot detection method of SARS-CoV-2 combined with RT-LAMP. In this method, first, the viral RNA is isothermally amplified; then the amplicons are cleaved by a CRISPR-mediated reporter and sequentially detected. Viral RNA is extracted by thermal lysis at 60 °C for 10 min in a commercial lysis buffer. Thus, this method eliminates the additional viral RNA extraction step. After a 60 min reaction, the final product is identified by lateral flow strip or fluorescent reporter. The assay achieved a LOD of 100 copies/reaction in just 70 min. It also delivered very high accuracy (11/12) for clinical samples. Similarly, Broughton et al. [ 162 ] reported a rapid RT-LAMP-based SARS-CoV-2 detection platform named DETECTR (SARS-CoV-2 DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter) with integrated CRISPR/Cas12 detection. This assay performs the RT-LAMP targeting of N (nucleoprotein) and E (envelop) genes of SARS-CoV-2, followed by Cas12 recognition of predetermined viral RNA sequences and virus detection on a lateral flow strip upon cleavage of the reporter molecule. A LOD of 10 copies/µL was achieved in just 40 min. Clinical samples were tested by extracting RNA from oropharyngeal/nasopharyngeal swabs of COVID-19 patients. The DETECTR assay showed 95% accuracy relative to the gold standard, RT-PCR. FDA-Approved LAMP-Based Devices Various LAMP-based commercial POC test kits for SARS-CoV-2 were developed and received emergency use authorization (EUA) from the U.S. Food and Drug Administration (FDA). The Lucira COVID-19 All-in-one Test Kit was developed by Lucira Health Inc. [ 163 ] and received the EUA on 17 November 2020 for prescription domestic COVID-19 testing [ 164 ], and on 9 April 2021, the Lucira Check-it COVID-19 Test received authorization by the FDA for non-prescription home use [ 165 ]. It utilizes the RT-LAMP by targeting the N-gene of SARS-CoV-2 RNA. The colorimetric detection based on the pH change of the sample due to LAMP delivers the detection within 30 min. The nasal swab is dissolved in the elution buffer, which provides the viral lysis at room temperature. The buffer solution dissolves the preloaded lyophilized reagents, and the colorimetric readout is delivered by an electronic and optical element in the test kit. No pumps are needed because the device uses capillary flow and gravity, and it just has one user-activated valve. The heater and optics are located on a single PCB. A LOD of 2700 copies/swab was achieved for Lucira Check-It, with a detection accuracy of 98%. Similarly, Detect Inc. combined RT-LAMP with lateral flow technology and developed the Detect COVID-19 test kit [ 166 ]. This test kit targets the ORF1ab gene of the SARS-CoV-2 viral genome. The Detect Hub is used in conjunction with the disposable test tube and collection buffer. After connecting, the Detect Hub must be kept aside for 65 min before the test can be conducted, likely to stabilize the system. The RT-LAMP reaction will begin automatically when the tube has been inserted into the Detect Hub. The amplification takes about 55 min, followed by a lateral flow assay for 10 min, and the read-out of the result is performed using the Detect app on a smartphone. The kit provides a human positive control to confirm the appropriate sample collection and the viral RNA extraction. Although the Detect COVID-19 test is intended to be used at home, only healthcare professionals could purchase IFU. On 11 April 2022, the FDA issued a letter of authorization to Detect Inc. [ 167 ]. The test may be used at home without a prescription. Table 5 listed the recently developed LAMP-based molecular diagnostic methods for SARS-CoV-2 detection and provides a comparison between them. biosensors-12-01068-t005_Table 5 Table 5 RT-LAMP-based methods for COVID-19 diagnosis. Method Target Gene Time Sensitivity Specimen (Swab Type) LOD EUA by FDA Price Per Unit STOP Covid [ 161 ] N gene 70 min 91.6% Nasopharyngeal and oropharyngeal swabs 100 copies/reaction No $40 USD Penn-RAMP [ 160 ] ORF1ab and N gene 60 min 84% Nasopharyngeal swab and saliva 5 copies/reaction No NA DETECTR [ 162 ] N and E gene 40 min 95% Nasopharyngeal and oropharyngeal swabs 10 copies/µL No NA iSCAN [ 168 ] N and E gene 60 min 86% Nasopharyngeal swab 10 copies/sample No $2–5 USD iLACO [ 169 ] ORF1ab gene 40 min 89.9% -- 10 copies/µL No NA Lucira Check-it [ 165 ] N gene 30 min 98% Nasal swab 2700 copies/swab Yes $68 USD Detect COVID-19 test [ 166 ] ORF1ab gene 65 min 95% Nasal swab 800 copies/mL Yes $55 USD Metrix COVID-19 test [ 170 ] ORF1ab and N gene 30 min 95% Nasal swabs and saliva 667 copies/mL Yes NA DxLab COVID-19 test [ 171 ] M gene 25 min 95% Nasal swab 3000 copies/swab Yes NA FDA-Approved LAMP-Based Devices Various LAMP-based commercial POC test kits for SARS-CoV-2 were developed and received emergency use authorization (EUA) from the U.S. Food and Drug Administration (FDA). The Lucira COVID-19 All-in-one Test Kit was developed by Lucira Health Inc. [ 163 ] and received the EUA on 17 November 2020 for prescription domestic COVID-19 testing [ 164 ], and on 9 April 2021, the Lucira Check-it COVID-19 Test received authorization by the FDA for non-prescription home use [ 165 ]. It utilizes the RT-LAMP by targeting the N-gene of SARS-CoV-2 RNA. The colorimetric detection based on the pH change of the sample due to LAMP delivers the detection within 30 min. The nasal swab is dissolved in the elution buffer, which provides the viral lysis at room temperature. The buffer solution dissolves the preloaded lyophilized reagents, and the colorimetric readout is delivered by an electronic and optical element in the test kit. No pumps are needed because the device uses capillary flow and gravity, and it just has one user-activated valve. The heater and optics are located on a single PCB. A LOD of 2700 copies/swab was achieved for Lucira Check-It, with a detection accuracy of 98%. Similarly, Detect Inc. combined RT-LAMP with lateral flow technology and developed the Detect COVID-19 test kit [ 166 ]. This test kit targets the ORF1ab gene of the SARS-CoV-2 viral genome. The Detect Hub is used in conjunction with the disposable test tube and collection buffer. After connecting, the Detect Hub must be kept aside for 65 min before the test can be conducted, likely to stabilize the system. The RT-LAMP reaction will begin automatically when the tube has been inserted into the Detect Hub. The amplification takes about 55 min, followed by a lateral flow assay for 10 min, and the read-out of the result is performed using the Detect app on a smartphone. The kit provides a human positive control to confirm the appropriate sample collection and the viral RNA extraction. Although the Detect COVID-19 test is intended to be used at home, only healthcare professionals could purchase IFU. On 11 April 2022, the FDA issued a letter of authorization to Detect Inc. [ 167 ]. The test may be used at home without a prescription. Table 5 listed the recently developed LAMP-based molecular diagnostic methods for SARS-CoV-2 detection and provides a comparison between them. biosensors-12-01068-t005_Table 5 Table 5 RT-LAMP-based methods for COVID-19 diagnosis. Method Target Gene Time Sensitivity Specimen (Swab Type) LOD EUA by FDA Price Per Unit STOP Covid [ 161 ] N gene 70 min 91.6% Nasopharyngeal and oropharyngeal swabs 100 copies/reaction No $40 USD Penn-RAMP [ 160 ] ORF1ab and N gene 60 min 84% Nasopharyngeal swab and saliva 5 copies/reaction No NA DETECTR [ 162 ] N and E gene 40 min 95% Nasopharyngeal and oropharyngeal swabs 10 copies/µL No NA iSCAN [ 168 ] N and E gene 60 min 86% Nasopharyngeal swab 10 copies/sample No $2–5 USD iLACO [ 169 ] ORF1ab gene 40 min 89.9% -- 10 copies/µL No NA Lucira Check-it [ 165 ] N gene 30 min 98% Nasal swab 2700 copies/swab Yes $68 USD Detect COVID-19 test [ 166 ] ORF1ab gene 65 min 95% Nasal swab 800 copies/mL Yes $55 USD Metrix COVID-19 test [ 170 ] ORF1ab and N gene 30 min 95% Nasal swabs and saliva 667 copies/mL Yes NA DxLab COVID-19 test [ 171 ] M gene 25 min 95% Nasal swab 3000 copies/swab Yes NA 6. Limitations of LAMP Despite its numerous advantages, LAMP exhibits several flaws that need to be fixed. In comparison with conventional PCR, LAMP exhibits less versatility in molecular biological applications. For example, LAMP produces a large-sized DNA chain, which impedes its utility in cloning and other biological applications [ 172 ]. Furthermore, the final product of LAMP is cauliflower-like DNA in diverse sizes, leading to the formation of smears or multiple banding on the gel. However, in the PCR, the final product appeared to be a single band. Hence, specific product identification on the gel is not possible in LAMP [ 173 ]. Other limitations of LAMP are discussed in this section. 6.1. Cross-Interference in Multiplex Detection Multiplex detection in LAMP is still challenging due to its complex operational design, the specific primer requirement for every particular target sequence, and the formation of amplicons with multiple sizes. Conventional methods for enabling multiplex LAMP (mLAMP) involve adding an endonuclease recognition site to the LAMP primers, and then the digested amplicons are identified based on their sizes. However, the inadequate digestions of the amplified products produce multiple bands in the gel electrophoresis for each target, making multiplex LAMP detection challenging [ 174 ]. Other methods developed for mLAMP detection use molecular barcoding [ 175 ] and aptamer-modified gold nanoparticles [ 176 ]. However, the post-product detection processes are time-consuming, and the use of expensiveness of the sequencing tools and reagents increases the overall operation cost and prevents their use in wide applications. In addition, the post-amplification processing comprises a high risk of carry-over contaminations [ 39 ]. In real-time PCR, the DNA intercalating dye (such as SYBR Green) is used for the detection of a specific target gene sequence in a multiplex manner, and the amplified product is distinguished through melting curve analysis. However, the melting curve analysis cannot be used with LAMP due to the formation of products with multiple structures. Additionally, the strand displacement principle for DNA synthesis disables the use of probe-based detection. Furthermore, LAMP uses three primer pairs for each target, resulting in competition between the primers for Bst polymerase and other substrates, including dNTPs, MgSO 4, etc. Thus, optimizing the reaction conditions in mLAMP is challenging. However, designing a microfluidic chip with multiple reaction chambers should be able to overcome the above-mentioned limitations and provide detection of LAMP in a multiplex manner, by putting primers in various reaction wells for different targets. Microfluidic discs and paper chips are the perfect candidates for mLAMP. 6.2. Uncertainty of Primer Design LAMP uses 4–6 primers that target 6–8 distinct regions in the small target segment with a distance of 120–160 bases between F2 and B2 and 40–60 bases between 5′ ends of F1 and F2 [ 11 ]. Therefore, primer design for specific targets with short sequences and a high number of mutations, especially in the case of RNA viruses, is still challenging. Primer Explorer V5 is the most commonly used online software for LAMP primer design. However, in certain cases, online primer design software is exposed to various restrictions and is unable to select the desired target sites, making primer design complicated. Hence, the primer design has to be performed manually. The position of the loop primers is also critical in primer design. The loop primers must be placed precisely between the B2–B1c and the F2–F1c sites, and should be oriented in a specific direction [ 18 ]. These substantial limitations on their arrangement disable the loop primer generation in some instances. Thus, different primer sets have to be chosen for loop primer generation. In addition, to find out the optimum performing primer for a particular sequence, multiple designs have to be selected, and the efficiency of the primer needs to be checked by trial and error. Furthermore, the use of large size (30–40 bases for FIP and BIP) and multiple primers elevates the chances of self-hybridization of the primers. This leads to the formation of a self-amplified product without any template, providing false-positive results [ 177 ]. In such cases, a redesign of the primer is recommended. 6.3. Carry-Over Contamination Carry-over contaminations are a major drawback in LAMP due to the high volatility and product stability. Hence, unintended false-positive results are obtained in non-template controls [ 39 , 178 , 179 , 180 ]. Due to its high sensitivity, the LAMP reaction may produce false-positive results, even if only a little of the DNA from the amplification product is present. To prevent such cross-contamination, the use of laminar airflow for LAMP sample preparation and separate pipettes and filter tips are highly recommended. In addition, the opening of the reaction tubes containing the LAMP product and the post-amplification processes should be performed in an area isolated from the reagent preparation place. The reaction tubes should be closed immediately after the LAMP detection and disposed of in sealed double plastic bags. Autoclaving of the reaction tubes should be avoided to prevent the dispersion of the amplified product [ 39 ]. 6.1. Cross-Interference in Multiplex Detection Multiplex detection in LAMP is still challenging due to its complex operational design, the specific primer requirement for every particular target sequence, and the formation of amplicons with multiple sizes. Conventional methods for enabling multiplex LAMP (mLAMP) involve adding an endonuclease recognition site to the LAMP primers, and then the digested amplicons are identified based on their sizes. However, the inadequate digestions of the amplified products produce multiple bands in the gel electrophoresis for each target, making multiplex LAMP detection challenging [ 174 ]. Other methods developed for mLAMP detection use molecular barcoding [ 175 ] and aptamer-modified gold nanoparticles [ 176 ]. However, the post-product detection processes are time-consuming, and the use of expensiveness of the sequencing tools and reagents increases the overall operation cost and prevents their use in wide applications. In addition, the post-amplification processing comprises a high risk of carry-over contaminations [ 39 ]. In real-time PCR, the DNA intercalating dye (such as SYBR Green) is used for the detection of a specific target gene sequence in a multiplex manner, and the amplified product is distinguished through melting curve analysis. However, the melting curve analysis cannot be used with LAMP due to the formation of products with multiple structures. Additionally, the strand displacement principle for DNA synthesis disables the use of probe-based detection. Furthermore, LAMP uses three primer pairs for each target, resulting in competition between the primers for Bst polymerase and other substrates, including dNTPs, MgSO 4, etc. Thus, optimizing the reaction conditions in mLAMP is challenging. However, designing a microfluidic chip with multiple reaction chambers should be able to overcome the above-mentioned limitations and provide detection of LAMP in a multiplex manner, by putting primers in various reaction wells for different targets. Microfluidic discs and paper chips are the perfect candidates for mLAMP. 6.2. Uncertainty of Primer Design LAMP uses 4–6 primers that target 6–8 distinct regions in the small target segment with a distance of 120–160 bases between F2 and B2 and 40–60 bases between 5′ ends of F1 and F2 [ 11 ]. Therefore, primer design for specific targets with short sequences and a high number of mutations, especially in the case of RNA viruses, is still challenging. Primer Explorer V5 is the most commonly used online software for LAMP primer design. However, in certain cases, online primer design software is exposed to various restrictions and is unable to select the desired target sites, making primer design complicated. Hence, the primer design has to be performed manually. The position of the loop primers is also critical in primer design. The loop primers must be placed precisely between the B2–B1c and the F2–F1c sites, and should be oriented in a specific direction [ 18 ]. These substantial limitations on their arrangement disable the loop primer generation in some instances. Thus, different primer sets have to be chosen for loop primer generation. In addition, to find out the optimum performing primer for a particular sequence, multiple designs have to be selected, and the efficiency of the primer needs to be checked by trial and error. Furthermore, the use of large size (30–40 bases for FIP and BIP) and multiple primers elevates the chances of self-hybridization of the primers. This leads to the formation of a self-amplified product without any template, providing false-positive results [ 177 ]. In such cases, a redesign of the primer is recommended. 6.3. Carry-Over Contamination Carry-over contaminations are a major drawback in LAMP due to the high volatility and product stability. Hence, unintended false-positive results are obtained in non-template controls [ 39 , 178 , 179 , 180 ]. Due to its high sensitivity, the LAMP reaction may produce false-positive results, even if only a little of the DNA from the amplification product is present. To prevent such cross-contamination, the use of laminar airflow for LAMP sample preparation and separate pipettes and filter tips are highly recommended. In addition, the opening of the reaction tubes containing the LAMP product and the post-amplification processes should be performed in an area isolated from the reagent preparation place. The reaction tubes should be closed immediately after the LAMP detection and disposed of in sealed double plastic bags. Autoclaving of the reaction tubes should be avoided to prevent the dispersion of the amplified product [ 39 ]. 7. Conclusions and Perspectives LAMP is a robust, powerful, and unique nucleic acid amplification technique that utilizes the strand displacement activity in an isothermal setting, thereby improving the limitations of PCR by eliminating the complex thermal cycling process. Therefore, miniaturization of LAMP is ideal in comparison with PCR. LAMP can be considered a promising technique for next-generation POC devices due to its excellent sensitivity (10–100 times higher than conventional PCR and 500–1000 times higher than rapid antigen and antibody detection), rapidity, resilience, and specificity; and its ease of use in real-world applications [ 181 ]. In this review, the recent developments on LAMP-based POC platforms integrated with microfluidic devices for rapid detection of infectious diseases and their detection mechanisms were explained in detail with suitable examples. Among the various detection methods, colorimetric and electrochemical detection methods are extensively used for LAMP amplicon detection. LAMP-based lateral flow immunoassay test kits also have emerged as rapid POC tests for various infectious pathogens, including COVID-19. Numerous smartphone-based fully automated devices have also been developed for sample-to-answer solutions. PDMS/PMMA, paper-based, and hybrid microfluidic chips are proven to be attractive tools for the development of the low-cost, rapid LAMP-based tests at POC. In addition, digital LAMP provides an accurate quantification of nucleic acid within the sample and eliminates the cross-contamination between samples. Furthermore, novel detection approaches such as bioluminescence [ 182 ] and giant magnetoresistance (GMR) [ 183 ] have been developed for the detection of LAMP reactions. 7.1. Alternative Methods Enzyme-free isothermal amplification methods, such as hybridization chain reaction (HCR)-based POC sensors, could be an alternative technique. HCR works at room temperature; therefore, the use of a heating device is eliminated, making the overall operation process simple [ 184 ]. The amplified product can be detected by colorimetric, fluorometric, or electrochemical methods [ 185 ]. In recent years, the HCR method has emerged as a sensitive tool for infectious disease diagnosis [ 186 , 187 , 188 ]. Apart from that, other isothermal amplifications, including RCA and RPA, have been employed in multiplex detection with great sensitivity and versatile assay design [ 189 , 190 ]. RPA is performed with a temperature range of 32–42 °C and a rapid reaction time of 20 min [ 191 ]. RPA was also combined with LAMP to develop a hybrid assay in a microfluidic device for the simultaneous detection of 16 infectious pathogen nucleic acids, including ZIKA, HIV, and HPV [ 192 ]. Integration of these isothermal amplification methods in a microfluidic device can deliver a simple and rapid POC diagnostic tool for pathogenic nucleic acid detection. 7.2. Future Directions LAMP is useful for diagnosing a wide range of pathogenic infections, including those of bacteria, viruses, and parasites. According to studies, the technique can detect and analyse pathogens in a sensitive, time-efficient, and POC manner. Nevertheless, there is still a lot of space for developments in LAMP-based POC diagnosis. Since LAMP is prone to producing significant nonspecific amplification, it is vital to develop novel methods for enhancing its specificity, particularly by utilizing nanomaterials that reduce nonspecific amplification [ 193 ]. To enhance sensitivity and performance, LAMP can be combined with other advanced diagnostic methods. For example, Pang et al. [ 194 ] developed a single-tube assay combining RT-LAMP with CRISPR/Cas12a for the diagnosis of COVID-19 targeting the N and E genes of viral RNA. The single-tube analysis was achieved by conducting RT-LAMP in the tube and loading the CRISPR Cas12a reagents in the lid of the reaction tube. After a 30 min RT-LAMP reaction, the CRISPR reagents were blended with LAMP amplicons by flipping the tube. The crRNA recognizes the specific sequence of the amplicons that initiated the Cas12a activity. A smartphone-based fluorescence analysis enabled the detection of SARS-CoV-2 with a LOD of 30 copies/µL in just 40 min. Furthermore, exothermic chemical-reaction-based electricity-free cartridges can eliminate reliance on electrical power and offer an accurate test without access to specialized facilities [ 189 ]. The entire workflow, from sample preparation to target identification, should ideally be compacted and integrated with the on-chip LAMP system. However, developing a fully automated sample-to-result microfluidic device requires the incorporation of micro-pumps and valves, which makes the chip fabrication and the operational process complicated. Microfluidic platforms made up of paper and capillaries make appealing substrates for LAMP amplification when creating straightforward, affordable molecular experiments, especially for applications in remote or resource-constrained locations. The paper/polymer-based hybrid systems are also capable of holding reagents in dried form for a long period, solving the problems of storing and transporting the reagents [ 195 ]. Microfluidic chip design with multiple reaction wells for an individual target can enable multiplex detection in a single reaction [ 130 ]. Droplet-based dLAMP can overcome carry-over contamination by sealing the individual sample droplets in oil [ 154 ]. Otherwise, one could design sealed microwells for amplification to circumvent the regent escape [ 159 ]. Droplet dLAMP can also allow multiplexing by separating the individual targets into separate droplets [ 158 ]. Overall, on-chip nucleic acid extraction, purification, and rapid sensing technology integrated with LAMP-based microfluidic modalities is the ideal candidate for POC diagnostics assays, capable of delivering high throughput and rapid pathogen detection in a multiplex manner, which reduces operation costs, analysis time, and carryover contaminations. 7.1. Alternative Methods Enzyme-free isothermal amplification methods, such as hybridization chain reaction (HCR)-based POC sensors, could be an alternative technique. HCR works at room temperature; therefore, the use of a heating device is eliminated, making the overall operation process simple [ 184 ]. The amplified product can be detected by colorimetric, fluorometric, or electrochemical methods [ 185 ]. In recent years, the HCR method has emerged as a sensitive tool for infectious disease diagnosis [ 186 , 187 , 188 ]. Apart from that, other isothermal amplifications, including RCA and RPA, have been employed in multiplex detection with great sensitivity and versatile assay design [ 189 , 190 ]. RPA is performed with a temperature range of 32–42 °C and a rapid reaction time of 20 min [ 191 ]. RPA was also combined with LAMP to develop a hybrid assay in a microfluidic device for the simultaneous detection of 16 infectious pathogen nucleic acids, including ZIKA, HIV, and HPV [ 192 ]. Integration of these isothermal amplification methods in a microfluidic device can deliver a simple and rapid POC diagnostic tool for pathogenic nucleic acid detection. 7.2. Future Directions LAMP is useful for diagnosing a wide range of pathogenic infections, including those of bacteria, viruses, and parasites. According to studies, the technique can detect and analyse pathogens in a sensitive, time-efficient, and POC manner. Nevertheless, there is still a lot of space for developments in LAMP-based POC diagnosis. Since LAMP is prone to producing significant nonspecific amplification, it is vital to develop novel methods for enhancing its specificity, particularly by utilizing nanomaterials that reduce nonspecific amplification [ 193 ]. To enhance sensitivity and performance, LAMP can be combined with other advanced diagnostic methods. For example, Pang et al. [ 194 ] developed a single-tube assay combining RT-LAMP with CRISPR/Cas12a for the diagnosis of COVID-19 targeting the N and E genes of viral RNA. The single-tube analysis was achieved by conducting RT-LAMP in the tube and loading the CRISPR Cas12a reagents in the lid of the reaction tube. After a 30 min RT-LAMP reaction, the CRISPR reagents were blended with LAMP amplicons by flipping the tube. The crRNA recognizes the specific sequence of the amplicons that initiated the Cas12a activity. A smartphone-based fluorescence analysis enabled the detection of SARS-CoV-2 with a LOD of 30 copies/µL in just 40 min. Furthermore, exothermic chemical-reaction-based electricity-free cartridges can eliminate reliance on electrical power and offer an accurate test without access to specialized facilities [ 189 ]. The entire workflow, from sample preparation to target identification, should ideally be compacted and integrated with the on-chip LAMP system. However, developing a fully automated sample-to-result microfluidic device requires the incorporation of micro-pumps and valves, which makes the chip fabrication and the operational process complicated. Microfluidic platforms made up of paper and capillaries make appealing substrates for LAMP amplification when creating straightforward, affordable molecular experiments, especially for applications in remote or resource-constrained locations. The paper/polymer-based hybrid systems are also capable of holding reagents in dried form for a long period, solving the problems of storing and transporting the reagents [ 195 ]. Microfluidic chip design with multiple reaction wells for an individual target can enable multiplex detection in a single reaction [ 130 ]. Droplet-based dLAMP can overcome carry-over contamination by sealing the individual sample droplets in oil [ 154 ]. Otherwise, one could design sealed microwells for amplification to circumvent the regent escape [ 159 ]. Droplet dLAMP can also allow multiplexing by separating the individual targets into separate droplets [ 158 ]. Overall, on-chip nucleic acid extraction, purification, and rapid sensing technology integrated with LAMP-based microfluidic modalities is the ideal candidate for POC diagnostics assays, capable of delivering high throughput and rapid pathogen detection in a multiplex manner, which reduces operation costs, analysis time, and carryover contaminations.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4728128/

Two-subunit DNA escort mechanism and inactive subunit bypass in an ultra-fast ring ATPase

SpoIIIE is a homo-hexameric dsDNA translocase responsible for completing chromosome segregation in Bacillus subtilis . Here, we use a single-molecule approach to monitor SpoIIIE translocation when challenged with neutral-backbone DNA and non-hydrolyzable ATP analogs. We show that SpoIIIE makes multiple essential contacts with phosphates on the 5'→3' strand in the direction of translocation. Using DNA constructs with two neutral-backbone segments separated by a single charged base pair, we deduce that SpoIIIE's step size is 2 bp. Finally, experiments with non-hydrolyzable ATP analogs suggest that SpoIIIE can operate with non-consecutive inactive subunits. We propose a two-subunit escort translocation mechanism that is strict enough to enable SpoIIIE to track one DNA strand, yet sufficiently compliant to permit the motor to bypass inactive subunits without arrest. We speculate that such a flexible mechanism arose for motors that, like SpoIIIE, constitute functional bottlenecks where the inactivation of even a single motor can be lethal for the cell. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.001 Introduction The ASCE [Additional Strand Conserved E (glutamate)] division of oligomeric, ring-shaped NTPases encompasses a diverse range of enzymes that function as molecular motors ( Lyubimov et al., 2011 ). Within the ASCE division, the FtsK/SpoIIIE family of motors is involved in the fundamental process of DNA segregation prior to cell division. During the Bacillus subtilis sporulation lifecycle, an asymmetric division septum closes around one of the sister chromatids before complete chromosome segregation, trapping about two-thirds of the chromosome in the mother cell compartment ( Burton et al., 2007 ; Wu and Errington, 1994 ). To complete chromosome segregation, SpoIIIE must translocate the DNA from the mother cell into the forespore. SpoIIIE and its closely related Escherichia coli homologue FtsK, contain an N-terminal transmembrane domain that anchors the protein to the division septum, a long unstructured polypeptide linker and a C-terminal-soluble motor domain consisting of subdomains α, β, and γ ( Barre, 2007 ). Subdomains α and β adopt a RecA-like fold containing ATP binding and hydrolysis motifs ( Massey et al., 2006 ), while subdomain γ imparts translocation directionality to the motor (sequence dependence) ( Besprozvannaya et al., 2013 ; Lee et al., 2012 ; Löwe et al., 2008 ; Ptacin et al., 2006 ; 2008 ). Crystallography and electron microscopy studies indicate that both FtsK and SpoIIIE form homo-hexameric rings, and that double-stranded DNA (dsDNA) is threaded through their central pore ( Cattoni, et al., 2014 ; Cattoni et al., 2013 ; Massey et al., 2006 ). A distinguishing characteristic of SpoIIIE/FtsK is their enormous translocation velocity (∼5 kbp/s) and their ability to work against high forces ( Ptacin et al., 2008 ; Saleh et al., 2004 ). Previous single-molecule studies of these motors focused primarily on investigating the mechanism of sequence recognition and translocation direction reversal ( Lee et al., 2012 ; Pease et al., 2005 ; Ptacin et al., 2006 ; 2008 ; Saleh et al., 2004 ), studying how they strip off DNA-bound proteins ( Lee et al., 2014 ; Marquis et al., 2008 ), and determining the amount of supercoils introduced in the DNA during translocation ( Saleh et al., 2005 ). However, many fundamental aspects of these motors' operation remain poorly understood: How does the motor interact with its DNA track during translocation? What is the motor step size? How does the motor coordinate the activity of its individual subunits? How is the subunit coordination mechanism optimized for the motor's specific biological task? To answer these questions, we used single-molecule manipulation and measurement techniques. Using modified DNA with a neutral backbone, we show that SpoIIIE makes critical electrostatic contacts with the phosphate backbone on the 5'→3' strand in the direction of translocation. This observation indicates that the individual subunits operate in a well-defined sequential order around the ring. To determine the SpoIIIE step size, we challenged the motor to translocate a DNA molecule containing two neutral segments of variable lengths separated by a charged base pair. This hybrid construct revealed the periodicity of motor–DNA interactions, suggesting that each SpoIIIE subunit takes a 2-bp step per ATP hydrolyzed. Experiments where non-hydrolyzable nucleotides were used to probe the intersubunit coordination within the motor suggest that SpoIIIE can tolerate non-consecutive inactive subunits, implying a degree of flexibility in the sequential operation of the motor. Finally, we propose a two-subunit DNA escort model that can rationalize all these data and that correctly predicts the degree of supercoiling introduced by SpoIIIE during translocation. Results To monitor DNA translocation by SpoIIIE, we used a single-molecule assay developed previously ( Smith et al., 2003 ). Briefly, a DNA-coated bead was held in an optical trap while a SpoIIIE-coated bead was held on a micropipette ( Figure 1a ); SpoIIIE engaged the DNA when the beads were in close proximity, and translocated the DNA only in the presence of ATP. The DNA was held under constant tension by continuously adjusting the trap position as translocation proceeded. At saturating [ATP] (3 mM) and a low force (5 pN) SpoIIIE translocated DNA at ∼4 kbp/s ( Figure 6—figure supplement 1 ), in agreement with previously reported rates in vivo ( Burton et al., 2007 ) and in vitro ( Ptacin et al., 2008 ). Control experiments indicate that a single SpoIIIE motor was attached to the DNA tether: (i) Protein concentration was titrated until activity was observed for only one of every ∼5 pairs of beads tested, thus reducing the likelihood that a single bead contained multiple active SpoIIIE motors. (ii) At high forces, SpoIIIE loses its grip on DNA and slips. These slipping events occurred in one fast rip, not in several steps, indicating that a single motor– DNA interaction is disrupted in each case ( Figure 1—figure supplement 1 ). 10.7554/eLife.09224.003 Figure 1. Probing SpoIIIE-DNA interactions with neutral DNA inserts. (a) Experimental geometry of the optical tweezers assay. Neutral MeP DNA (red) was placed roughly 4 kb away from the end of the dsDNA tether (blue) that is attached to the optically trapped bead. ( b ) Sample traces of individual SpoIIIE motors translocating on DNA with a 30-bp dsMeP insert (magenta). Control experiments with DNA containing no MeP inserts are shown in green. Inset: detailed view of motor's attempts to cross the neutral insert. All experiments were conducted at 3 mM ATP and a constant force of 5 pN. Traces were offset vertically to line-up the pause-like regions. Phosphate and MeP groups are represented as blue and red circles respectively. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.003 10.7554/eLife.09224.004 Figure 1—figure supplement 1. A single SpoIIIE ring translocates DNA in single-molecule experiments.. We performed control experiments in 'passive mode' where the optical trap position is fixed. As SpoIIIE translocates the DNA tether, it pulls the bead away from the trap, causing the tension in the DNA to increase. Upon reaching a certain force, SpoIIIE loses its grip on DNA and slips (red arrows), then resumes translocation from zero force. The fact that each slip occurs in a single, nearly instantaneous step indicates that a single SpoIIIE ring is translocating the DNA. Unfiltered 1-kHz data is shown. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.004 SpoIIIE makes critical contacts with the DNA phosphate backbone during translocation Modified inserts such as ssDNA, dsDNA with interstrand cross-links, dsDNA with abasic sites, and so on, have been previously used in single-molecule experiments to probe how dsDNA translocases interact with their nucleic-acid track ( Aathavan et al., 2009 ; Stanley et al., 2006 ). To investigate how SpoIIIE interacts with its substrate, we designed DNA constructs containing a modified insert with a methyl-phosphonate (MeP) backbone ( Figure 1b ), which preserves the base pairing and overall structure of B-form DNA ( Strauss and Maher, 1994 ). We first monitored SpoIIIE translocation along a substrate containing a 30-bp double-stranded MeP (dsMeP) insert, several times longer than the expected step size of the motor. Upon reaching the insert, SpoIIIE undergoes multiple slips followed by translocation recoveries ( Figure 1b inset), revealing that it makes several attempts to cross the neutral segment. Despite these attempts, SpoIIIE failed to traverse the 30-bp dsMeP segment ( Figure 1b ), indicating that motor interactions with the negatively charged phosphates are critical for translocation. Depending on the step size of the motor, and the manner in which it interacts with the DNA, the motor should be able to easily traverse short dsMeP inserts up to some critical length. To determine this length, we designed dsMeP inserts of varying size and recorded the motor's ability to cross each insert ( Figure 2a ). We found that SpoIIIE can traverse dsMeP segments of 2 bp, 3 bp, and 4 bp with near-100% probability ( Figure 2a ), but the traversal probability sharply drops to ∼50% for dsMeP inserts of 5 bp ( Figure 2b ). Importantly, this sharp reduction in insert crossing probability is accompanied by a dramatic increase in the average traversal time ( Figure 2c ). Note that further increasing the dsMeP insert length from 5 bp to 7 bp does not significantly increase the mean traversal time ( Figure 2c ). Taken together, these data show that 5 bp is the minimum length of dsMeP required to disrupt processive translocation by SpoIIIE, and indicate that SpoIIIE makes periodic electrostatic contacts with the DNA every 5 bp or less. 10.7554/eLife.09224.005 Figure 2. Monitoring SpoIIIE crossing of contiguous MeP inserts. (a) Sample traces of SpoIIIE translocating on DNA with dsMeP inserts of 2 bp (blue), 3 bp (green), 4 bp (magenta), and 5 bp (black). ( b ) Traversal probability for dsMeP inserts of various length. Note the sharp decrease in traversal probability between 4-bp and 5-bp inserts. Error-bars represent the 68% CI estimated via bootstrapping. ( c ) Mean traversal time for dsMeP inserts of various length. Note the large increase in traversal time between 4-bp and 5-bp inserts. Error-bars represent the SEM. P values calculated with a two-tailed Fisher exact test. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.005 Note that in rare instances (1 out of 32 molecules, Table 1 ), SpoIIIE managed to traverse the 30-bp dsMeP insert, albeit after several seconds of repeated crossing attempts ( Figure 1b ). A slightly higher traversal probability (∼8%) was recorded for the 10-bp dsMeP insert ( Figure 2b ). The dynamics of slipping and re-translocation ( Figure 1b , inset) at the neutral insert and the lengthy traversal times for dsMeP inserts of 5 bp or longer ( Figure 2c ) suggest that, given a sufficient number of traversal attempts, SpoIIIE can cross even relatively long stretches of dsMeP (10–30 bp). The drop in traversal probability for longer dsMeP inserts suggests that the motor can hold onto MeP DNA for a short amount of time during which it can either step forward, or lose its grip on the neutral DNA. In other words, forward translocation along the MeP insert is in kinetic competition with backward slipping ( Aathavan et al., 2009 ). As a result, to traverse longer MeP inserts, the motor must execute a correspondingly larger number of consecutive productive power-strokes. We hypothesize that other types of motor–DNA interactions (e.g. steric) enable the motor to traverse the neutral insert given an arbitrarily large number of crossing attempts. In support of this idea, the φ29 ring ATPase has been shown to require electrostatic contacts with the DNA every 10 phosphates, but relies on steric, non-specific interactions to exert force and translocate the DNA in-between those electrostatic contacts ( Aathavan et al., 2009 ). 10.7554/eLife.09224.006 Table 1. MeP traversal statistics. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.006 DNA construct Successful crossings Failed crossings Total traces ssMeP modification 30 base 3'→5' MeP 23 1 24 30 base 5'→3' MeP 6 22 28 dsMeP Modific ation 2 bp dsMeP 21 1 22 3 bp dsMeP 16 0 16 4 bp dsMeP 21 3 24 5 bp dsMeP 13 13 26 7 bp dsMeP 3 9 12 10 bp dsMeP 1 19 20 30 bp dsMeP 1 31 32 Length o f M eP Probe S egment * 4 bp dsMeP probe 7 16 23 3 bp dsMeP probe 9 16 25 2 bp dsMeP probe 6 18 24 1 bp dsMeP probe 33 4 37 All MeP data was gathered under 5 pN of opposing force and [ATP] = 3 mM. *All MeP probe segments carry a 4 bp dsMeP modification upstream of the probe. SpoIIIE tracks the 5'→3' strand in the direction of translocation To determine whether SpoIIIE tracks the phosphate backbone of one or both DNA strands, we repeated the above experiment with 30-base inserts where phosphates on either strand were selectively neutralized. 23 out of 24 SpoIIIE molecules traversed the insert containing MeP on the 3'→5' strand in the direction of translocation ( Figure 3a , orange traces), compared to only 6 out of 28 SpoIIIE molecules that crossed the insert with a neutral backbone on the 5'→3' strand ( Figure 3a , magenta traces). Strikingly, the traversals of the insert with a neutral 3'→5' strand were very fast (similar to translocation along unmodified DNA), whereas the traversals of the insert with a neutralized 5'→3' strand required 5–50 s, likely involving several crossing attempts. These results clearly indicate that SpoIIIE makes essential electrostatic contacts selectively with the charged backbone on the 5'→3' strand in the direction of translocation. 10.7554/eLife.09224.007 Figure 3. SpoIIIE favors phosphate interactions on the 5'-3' strand in the direction of translocation. (a) Sample traces of SpoIIIE translocating on DNA with 30 bp of neutral DNA on either the 3'-5' strand (orange traces) or the 5'-3' strand (magenta traces) in the direction of translocation. (b) Cartoon illustrating a hypothetical sequential model in which the DNA backbone is handed off between adjacent subunits within a hexameric ring. For clarity only one strand of dsDNA is shown. A highlighted backbone phosphate (yellow) is in contact with a motor subunit (magenta). In general, the motor step size in such a model can be anything less than 10 bp. Here we illustrate the model using a 2-bp step size. After one motor subunit (magenta) executes its power-stroke, the helical backbone of the dsDNA's will be shifted, positioning the phosphate backbone in close proximity to the next subunit poised to fire. (c) Cartoon illustrating a hypothetical model in which a 10-bp burst enables a hexameric ring ATPase to maintain phosphate contacts on the same DNA strand. Initially, a single subunit (magenta) is contacting the phosphate backbone (yellow). After a 10 bp burst, the motor has traversed nearly a full helical turn on dsDNA, bringing the phosphate backbone back in register with the same ATPase subunit. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.007 Strand tracking favors a sequential ATP hydrolysis model for SpoIIIE The observation that SpoIIIE tracks only one of the DNA strands imposes geometric constraints on how the DNA is handed off from subunit to subunit during translocation. Strand-tracking is inconsistent with a stochastic coordination mechanism in which the six ATPase subunits execute their power-strokes at random. In such a mechanism, the subunit poised to fire is unlikely to be aligned with the tracked strand and will therefore not engage the DNA substrate. Since the DNA is held under constant tension in our experiments, a stochastically coordinated ATPase ring is expected to slip frequently, contrary to our observations. Two possible scenarios are consistent with strand–tracking: (i) Subunits hydrolyze ATP and execute their power-strokes sequentially around the ring, such that after every power-stroke the subunit scheduled to fire next is properly aligned to interact with the phosphate backbone of the tracked strand ( Figure 3b ). In this scenario, the SpoIIIE subunits would fire consecutively (subunit 1 fires, followed by subunit 2, followed by subunit 3, etc). After subunit 1 executes its power-stroke, the helical geometry of the DNA will position the phosphate backbone of the tracked strand in close proximity to subunit 2, depending on the step size of the motor ( Massey et al., 2006 ; Strick and Quessada-Vial, 2006 ). Thus, motor-DNA contacts would proceed from one subunit to the next in an ordinal fashion. (ii) The motor translocates DNA in increments of 10–11 bp, which closely matches the helical periodicity of dsDNA (10.4–10.5 bp/pitch). This mechanism would ensure that after each translocation event, the motor contacts the same strand after traversing one full helical turn along the DNA ( Figure 3c ). Such a mechanism is employed by the φ29 ring ATPase, which translocates DNA in 10-bp bursts and contacts the DNA backbone on the same strand every 10 base pairs ( Aathavan et al., 2009 ). The data presented above indicate that SpoIIIE makes periodic contacts with the same DNA strand every five base pairs or less and are consistent only with the sequential ATP hydrolysis mechanism outlined in scenario (i). MeP stepping stone constructs suggest that SpoIIIE has a step size of 2 bp In order to rationalize how SpoIIIE easily traverses 4 bp of neutral DNA, but has difficulty crossing 5 bp of neutral DNA ( Figure 2b ), we considered several motor-DNA contact models. To be consistent with the observation that SpoIIIE tracks only one DNA strand ( Figure 3a ), all potential models require that SpoIIIE subunits fire in a well-defined sequential order around the ring ( Figure 4a ). Furthermore, since electrostatic interactions with the backbone on one strand are critical for maintaining the motor's grip on DNA, we reason that at least one electrostatic contact between the motor and the phosphate backbone is needed for SpoIIIE to maintain a stable grip on its DNA substrate. Finally, the pool of potential models can be further narrowed by making an assumption about the state of dsDNA inside the central pore of SpoIIIE during translocation. Although no ring-shaped dsDNA translocase has been co-crystallized with its substrate, it is thought that dsDNA is not significantly distorted within the central pore of ring ATPases ( Massey et al., 2006 ; Sun et al., 2008 ). For example, the central channel of the FtsK ring can fully accommodate a single, undistorted B-form dsDNA strand ( Massey et al., 2006 ). Therefore, we considered models where the helical pitch of dsDNA inside the SpoIIIE channel is similar to that of B-form DNA (10.5 bp/turn). Expanding our models to include a distorted helix similar to A-form DNA (11.0 bp/turn) would require only minor corrections and would not affect the overall predictions of these models. 10.7554/eLife.09224.008 Figure 4. Possible SpoIIIE translocation models capable of crossing 4 bp of dsMeP. ( a ) Cartoon illustrating the sequential firing of subunits A–F of SpoIIIE as it approaches a 4 bp insert of dsMeP. ( b ) Possible translocation models (i–v) depicting the interaction between SpoIIIE subunits (A–F) and DNA; in all models subunits fire in a sequential order (A→B→C→D→E→F→A etc). For clarity, we show only the backbone the DNA strand tracked by SpoIIIE. Phosphate and MeP groups are shown in blue and red, respectively. A solid line connecting a SpoIIIE subunit to the backbone represents a stable electrostatic interaction; a dashed line represents a disrupted interaction. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.008 Five models ( Figure 4b i–v ) are consistent with the results of the dsMeP experiments ( Figure 2 ) and satisfy the conditions listed above: (i) At any time, only one subunit contacts one phosphate on DNA ( Figure 4b i ); this model requires a 5-bp step size to cross a 4-bp MeP insert. (ii) Only one subunit contacts two adjacent DNA phosphates at any time ( Figure 4b ii ); this model requires a 4-bp step size to clear a 4-bp MeP insert. (iii) At any time, two neighboring subunits each contact one DNA phosphate; this model requires a 3-bp step size to clear a 4-bp MeP insert ( Figure 4b iii ). (iv) At any time, two neighboring subunits each contact two adjacent DNA phosphates; this model requires a 2-bp step size to cross a 4-bp MeP insert ( Figure 4b iv ). We disfavor models where SpoIIIE subunit simultaneously contact more than two consecutive phosphate groups on the DNA backbone, and models where three or more consecutive subunits contact the DNA backbone because such models would require large motor/DNA distortions. Finally, we also considered a translocation model similar to the mechanisms proposed for the E1 and Rho helicases ( Enemark and Joshua-Tor, 2006 ; Thomsen and Berger, 2009 ), (v) at any time five subunits contact five consecutive DNA phosphates; this model requires a 1-bp step size to cross a 4-bp insert ( Figure 4b v ). Although this E1/Rho-like model requires significant motor/DNA distortions (5 SpoIIIE subunits span an arc of 300° while five consecutive phosphates in dsDNA span an arc of ∼170°), it is in principle consistent with the data from Figure 2 . While we cannot rule out more complex models that may involve non-consecutive subunits simultaneously contacting the DNA, or stochastic bursts consisting of multiple, rapid consecutive steps ( Cordova et al., 2014 ; Sen et al., 2013 ), we favor the more parsimonious models presented here. To distinguish among the models proposed above and to determine SpoIIIE's step size, we challenged the motor with inserts containing a 4-bp MeP segment ('register'), followed by 1 bp of regular DNA ('stepping-stone') that is in turn followed by a variable-length MeP segment ('probe') of 1–4 bp ( Figure 5a ). Because SpoIIIE easily crosses up to 4 bp of neutral DNA, the 4-bp register is meant to align the stepping phase of SpoIIIE with the stepping-stone segment. Motors that are not in perfect register with the stepping-stone should not establish electrostatic contacts with DNA and will either slip backward or stall. The motors that successfully traverse the entire insert should land on the stepping-stone in a 'front-foot-first' configuration—wherein only the leading motor-DNA contact is securely established—and should be able to cross a probe segment of length equal to the step size minus 1 bp ( Figure 5b ). We found that SpoIIIE traversed a 1-bp neutral probe with near-100% probability ( Figure 5c orange traces), inconsistent with the 5 subunit contact model ( Figure 5b v ). The crossing probability sharply drops to ∼25% for 2-bp, 3-bp, or 4-bp neutral probes ( Figure 5c , magenta traces and Figure 5d ). As seen in Figure 5b , only model iv can easily cross a 1-bp probe but not probes of 2 bp or longer. In this model, two consecutive SpoIIIE subunits each contact two adjacent phosphates, and DNA is translocated in 2-bp steps ( Figure 5b iv ). A 2-bp step size is in good agreement with both enzymatic and structural studies of the related dsDNA translocase FtsK, which translocates 1.6–2.1 bp per ATP hydrolyzed ( Graham et al., 2010 ; Massey et al., 2006 ). 10.7554/eLife.09224.009 Figure 5. Deducing SpoIIIE's step size using 'stepping-stone' MeP constructs. ( a ) The design of 'stepping-stone' constructs. Each insert consists of a register segment with 4 bp of neutral DNA, followed by one regular DNA base ('stepping-stone'), and a probe segment with x bp of neutral DNA. For clarity, only the DNA strand tracked by SpoIIIE is shown. ( b ) Diagrams illustrating the longest probe segment that can be traversed by the models depicted in Figure 4b. Model (i) should traverse a probe segment of at most 4 bp, whereas model (v) cannot traverse even a probe of 1 bp. (c) Sample traces of SpoIIIE translocating on DNA with 'stepping-stone' inserts containing a 1-bp probe (orange) or a 2-bp probe (magenta). ( d ) Traversal probability for stepping-stone constructs with various probe lengths. Error-bars show the 68% CI estimated via bootstrapping. p values were calculated using a two-tailed Fisher exact test. ( e ) Diagram illustrating how model (iv) can successfully traverse a 'stepping-stone' insert with a probe of 1 bp. The star marks the subunit executing the power-stroke. Once a subunit fires, it cannot fire again (gray shading) and must eventually disengage from the DNA (subunit shown as making no interactions with DNA). ( f ) Diagram showing why model (iv) fails to cross a 'stepping-stone' insert with a probe of 2 bp. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.009 10.7554/eLife.09224.010 Figure 5—figure supplement 1. Crossing predictions of the E1/Rho-like translocation models. Diagram illustrating two different scenarios of how the E1/Rho-like translocation model would cope with a MeP stepping stone insert. In this model subunits fire in a well-defined sequential order (firing subunit denoted by the yellow star) and move by 1 bp on DNA, whereas the remaining subunits escort the DNA during the translocation process. If the ATPase subunits have to fire in a strictly sequential order, a subunit cannot fire multiple consecutive times, or fire out of order, and is grayed out after firing. A motor operating via a strictly sequential E1/Rho-like translocation mechanism is not capable of crossing a MeP stepping stone insert with a 1-bp probe (frame 8), contrary to our observations ( Figure 5c–d ). If the same ATPase subunit could fire out of order several times in a row, the motor should traverse a MeP stepping stone insert with a 4-bp probe (inset), again inconsistent with our findings ( Figure 5c–d ). DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.010 Figure 5e illustrates how model iv enables SpoIIIE to cross the insert with a 1-bp probe. The first three frames illustrate the sequential firing of subunits A, B, and C, all of which maintain at least one anchoring contact with the phosphate backbone. Because subunit D cannot make electrostatic contacts with the backbone, it fails to propel the DNA upon firing ( Figure 5e , frame 5). As a result, no other subunit can establish new contacts with the DNA backbone. After subunit E translocates the DNA by 2 bp, subunit F can now latch onto a negatively charged phosphate and continue to translocate DNA. Figure 5f illustrates how this model copes with a 2-bp MeP probe: subunit F cannot anchor itself onto the DNA, causing the motor to pause and eventually slip (as shown in Figure 5c , magenta traces). This two-subunit DNA escort model requires one subunit to execute the power stroke while an adjacent subunit maintains its phosphate contacts during this power-stroke, escorting the DNA through the ring. In this model, the ATPase subunits translocate the DNA sequentially around the ring in a highly coordinated fashion that enables SpoIIIE to track one DNA strand. There is increasing structural evidence for this type of motor mechanism involving 'translocating' subunits and 'escorting' subunits; examples include the E.coli's Rho helicase ( Thomsen and Berger, 2009 ) and the papillomavirus E1 helicase ( Enemark and Joshua-Tor, 2006 ). However, unlike the E1/Rho mechanisms, which employ four escorting subunits, the SpoIIIE translocation model proposed here requires only one escorting subunit. Nucleotides stabilize the SpoIIIE-DNA interactions To quantify the strength of the motor–DNA interaction, we measured the force at which SpoIIIE loses its grip on DNA. In a buffer lacking nucleotides, SpoIIIE could bind to DNA and form tethers between the trapped bead and the micropipette-held bead. Manual pulling experiments revealed that these tethers rupture at ∼3 pN ( Figure 7—figure supplement 1 , apo), suggesting that apo-SpoIIIE does not interact strongly with DNA. In buffers containing only ADP or ATPγS, SpoIIIE could bind to DNA, forming tethers that rupture at ∼15 and ∼25 pN, respectively ( Figure 7—figure supplement 1 ). These results indicate that nucleotides stabilize motor–DNA interactions and suggest that only nucleotide-bound subunits are capable of forming stable electrostatic contacts with the DNA phosphate backbone. The SpoIIIE ring can operate with non-consecutive inactive subunits To further investigate how individual SpoIIIE subunits coordinate their ATP hydrolysis activity, we monitored DNA translocation in a saturating [ATP] buffer that contained ATPγS – a nucleotide analog that is hydrolyzed very slowly. Structural studies of FtsK indicate that ATPγS binds to the same catalytic pocket as ATP ( Massey et al., 2006 ), suggesting that ATPγS should act as a competitive inhibitor to ATP binding for the SpoIIIE/FtsK family of ring ATPases. We observe that ATPγS induces SpoIIIE pausing ( Figure 6a ) and reduces the pause-free translocation velocity ( Figure 6—figure supplement 1a ). This reduction in pause-free velocity is well described by a simple competitive inhibition mechanism ( Figure 6—figure supplement 1b ). Similar results were obtained with a non-hydrolyzable ATP analog–AMP-PNP ( Figure 6—figure supplement 1c–d ). Taken together, these results indicate that nucleotide analogs induce SpoIIIE pausing by binding to a subset of ring subunits and arresting them in a pre-hydrolysis state. 10.7554/eLife.09224.011 Figure 6. SpoIIIE pauses when two consecutive subunits are bound to ATPγS. ( a ) Sample SpoIIIE traces acquired at different [ATPγS] and 3mM ATP. Pauses are highlighted in red. ( b ) Mean duration of the ATPγS-induced pauses extracted from fitting the pause duration distribution to an exponential. Error-bars represent the 95% CI of the fit. Insert: histogram of pause durations at 750 μM ATPγS and 3 mM ATP and the exponential fit to this distribution. ( c ) The density of ATPγS-induced pauses at various [ATPγS] and 3mM ATP. Error-bars represent the SEM. ( d ) Pause density versus [ATPγS] corrected to account for missed pauses (black symbols). Error-bars represent the SEM. The shaded regions illustrate the predictions for a sequential hydrolysis model where SpoIIIE pauses when n consecutive subunits are bound to ATPγS. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.011 10.7554/eLife.09224.012 Figure 6—figure supplement 1. SpoIIIE activity inhibition with ATP analogs. ( a ) Pause-free velocity versus opposing force for various [ATPγS] and 3mM ATP. Error-bars represent the SEM. ( b ) Degree of pause-free velocity inhibition i = 1-v ([ATPγS])/v max versus [ATPγS] at 3 mM [ATP] and 5 pN of opposing force. The dashed curve represents the fit to the competitive inhibition model (inset) with K i = 124 ± 20 µM. ( c ) Pause-free velocity versus opposing force at 3 mM [ATP] in the absence of any nucleotide analogs (black), in the presence 500 µM [ATPγS] (green), or in the presence of 500 µM [AMP-PNP] (pink). Error bars represent the SEM. ( d ) Pause density measured at 3 mM [ATP] and various [ATPγS] (blue symbols). Experiments were also performed with 3 mM [ATP] and 0.5 mM [AMP-PNP] (red symbol). Error bars represent the SEM. ( e ) Pause density versus opposing force at 3 mM [ATP] and 1 mM [ATPγS]. ( f ) Mean lifetime of ATPγS-induced pauses calculated from single-exponential fits to the pause duration distribution at 3 mM [ATP] and 1 mM [ATPγS]. Error bars represent the 95% CI of the fits. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.012 To determine how many analog-bound subunits are required to arrest DNA translocation, we measured the density and duration of ATPγS-induced pauses as a function of [ATPγS]. The density and duration of analog-induced pauses does not depend on external force ( Figure 6—figure supplement 1e–f ), consequently pauses detected at all forces were pooled together. Given the spatio-temporal resolution of our experiments, we could reliably detect pauses longer than 30 ms at 125 –250 μM ATPγS, 50 ms at 375–500 μM ATPγS, and 75 ms at 750–1000 μM ATPγS. However, regardless of the shortest detectable pause duration and the ATPγS concentration, the distribution of measured pause durations was well described by a single exponential decay ( Figure 6b , inset) with the same characteristic life-time of ∼35 ms ( Figure 6b ). The fact that the characteristic life-time does not depend on ATPγS concentration suggests that all analog-induced pauses are drawn from the same distribution. Furthermore, the single-exponential dependence of the pause duration distribution indicates that the exit from the paused state is governed by a single rate-limiting event—presumably the exchange of an ATPγS molecule with one ATP which is present in saturating concentrations, as proposed for other ring ATPases ( Chistol et al., 2012 ; Sen et al., 2013 ). Despite the fact that we cannot detect analog-induced pauses shorter than a certain cutoff (30–75 ms), we can estimate the number of missed pauses—and therefore the true pause density—from the measured pause density ( Figure 6c ) and the characteristic life-time derived from the pause distribution ( Figure 6b ), assuming that the single-exponential distribution holds for pauses shorter than the cutoff ( Hodges et al., 2009 ) (see 'Materials and methods'). The MeP experiments support a sequential nucleotide hydrolysis model. Therefore, to explain the density of ATPγS-induced pauses, we considered a sequentially coordinated hexameric ATPase ring that pauses whenever n consecutive subunits are bound to ATPγS (1 ≤ n ≤6). The pause density ( PD ) can be analytically expressed in terms of the motor's pause-free velocity ( v pf ), the ATPγS dissociation rate ( k off ), and the probability that the motor is paused ( P pause )—which is proportional to the concentrations and dissociation constants of ATP and ATPγS (Materials and methods), as follows: P D = k o f f v p f · P p a u s e ( 1 - P P a u s e ) Figure 6d shows the expected pause density predicted for different n values. For example, n =1 (green shaded region) corresponds to a sequentially coordinated ring that pauses whenever a single subunit is bound to ATPγS; n =2 (blue shaded region) corresponds to a sequentially coordinated ring that pauses when two consecutive subunits are both bound to ATPγS, and so on. The ATPγS pause-density data corrected to account for missed pauses ( Figure 6d black symbols) are best described by the model in which two (n =2 ) consecutive analog-bound subunits are required to induce a pause in the motor ( Figure 6d , blue-shaded region). In other words, analysis of the pause density indicates that the motor can operate processively with non-consecutive inactive subunits but not with two or more consecutive subunits. This conclusion is further supported by the observation that FtsK hexamers readily bypass individual catalytically inactive ATPase subunits ( Crozat et al., 2010 ). SpoIIIE makes critical contacts with the DNA phosphate backbone during translocation Modified inserts such as ssDNA, dsDNA with interstrand cross-links, dsDNA with abasic sites, and so on, have been previously used in single-molecule experiments to probe how dsDNA translocases interact with their nucleic-acid track ( Aathavan et al., 2009 ; Stanley et al., 2006 ). To investigate how SpoIIIE interacts with its substrate, we designed DNA constructs containing a modified insert with a methyl-phosphonate (MeP) backbone ( Figure 1b ), which preserves the base pairing and overall structure of B-form DNA ( Strauss and Maher, 1994 ). We first monitored SpoIIIE translocation along a substrate containing a 30-bp double-stranded MeP (dsMeP) insert, several times longer than the expected step size of the motor. Upon reaching the insert, SpoIIIE undergoes multiple slips followed by translocation recoveries ( Figure 1b inset), revealing that it makes several attempts to cross the neutral segment. Despite these attempts, SpoIIIE failed to traverse the 30-bp dsMeP segment ( Figure 1b ), indicating that motor interactions with the negatively charged phosphates are critical for translocation. Depending on the step size of the motor, and the manner in which it interacts with the DNA, the motor should be able to easily traverse short dsMeP inserts up to some critical length. To determine this length, we designed dsMeP inserts of varying size and recorded the motor's ability to cross each insert ( Figure 2a ). We found that SpoIIIE can traverse dsMeP segments of 2 bp, 3 bp, and 4 bp with near-100% probability ( Figure 2a ), but the traversal probability sharply drops to ∼50% for dsMeP inserts of 5 bp ( Figure 2b ). Importantly, this sharp reduction in insert crossing probability is accompanied by a dramatic increase in the average traversal time ( Figure 2c ). Note that further increasing the dsMeP insert length from 5 bp to 7 bp does not significantly increase the mean traversal time ( Figure 2c ). Taken together, these data show that 5 bp is the minimum length of dsMeP required to disrupt processive translocation by SpoIIIE, and indicate that SpoIIIE makes periodic electrostatic contacts with the DNA every 5 bp or less. 10.7554/eLife.09224.005 Figure 2. Monitoring SpoIIIE crossing of contiguous MeP inserts. (a) Sample traces of SpoIIIE translocating on DNA with dsMeP inserts of 2 bp (blue), 3 bp (green), 4 bp (magenta), and 5 bp (black). ( b ) Traversal probability for dsMeP inserts of various length. Note the sharp decrease in traversal probability between 4-bp and 5-bp inserts. Error-bars represent the 68% CI estimated via bootstrapping. ( c ) Mean traversal time for dsMeP inserts of various length. Note the large increase in traversal time between 4-bp and 5-bp inserts. Error-bars represent the SEM. P values calculated with a two-tailed Fisher exact test. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.005 Note that in rare instances (1 out of 32 molecules, Table 1 ), SpoIIIE managed to traverse the 30-bp dsMeP insert, albeit after several seconds of repeated crossing attempts ( Figure 1b ). A slightly higher traversal probability (∼8%) was recorded for the 10-bp dsMeP insert ( Figure 2b ). The dynamics of slipping and re-translocation ( Figure 1b , inset) at the neutral insert and the lengthy traversal times for dsMeP inserts of 5 bp or longer ( Figure 2c ) suggest that, given a sufficient number of traversal attempts, SpoIIIE can cross even relatively long stretches of dsMeP (10–30 bp). The drop in traversal probability for longer dsMeP inserts suggests that the motor can hold onto MeP DNA for a short amount of time during which it can either step forward, or lose its grip on the neutral DNA. In other words, forward translocation along the MeP insert is in kinetic competition with backward slipping ( Aathavan et al., 2009 ). As a result, to traverse longer MeP inserts, the motor must execute a correspondingly larger number of consecutive productive power-strokes. We hypothesize that other types of motor–DNA interactions (e.g. steric) enable the motor to traverse the neutral insert given an arbitrarily large number of crossing attempts. In support of this idea, the φ29 ring ATPase has been shown to require electrostatic contacts with the DNA every 10 phosphates, but relies on steric, non-specific interactions to exert force and translocate the DNA in-between those electrostatic contacts ( Aathavan et al., 2009 ). 10.7554/eLife.09224.006 Table 1. MeP traversal statistics. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.006 DNA construct Successful crossings Failed crossings Total traces ssMeP modification 30 base 3'→5' MeP 23 1 24 30 base 5'→3' MeP 6 22 28 dsMeP Modific ation 2 bp dsMeP 21 1 22 3 bp dsMeP 16 0 16 4 bp dsMeP 21 3 24 5 bp dsMeP 13 13 26 7 bp dsMeP 3 9 12 10 bp dsMeP 1 19 20 30 bp dsMeP 1 31 32 Length o f M eP Probe S egment * 4 bp dsMeP probe 7 16 23 3 bp dsMeP probe 9 16 25 2 bp dsMeP probe 6 18 24 1 bp dsMeP probe 33 4 37 All MeP data was gathered under 5 pN of opposing force and [ATP] = 3 mM. *All MeP probe segments carry a 4 bp dsMeP modification upstream of the probe. SpoIIIE tracks the 5'→3' strand in the direction of translocation To determine whether SpoIIIE tracks the phosphate backbone of one or both DNA strands, we repeated the above experiment with 30-base inserts where phosphates on either strand were selectively neutralized. 23 out of 24 SpoIIIE molecules traversed the insert containing MeP on the 3'→5' strand in the direction of translocation ( Figure 3a , orange traces), compared to only 6 out of 28 SpoIIIE molecules that crossed the insert with a neutral backbone on the 5'→3' strand ( Figure 3a , magenta traces). Strikingly, the traversals of the insert with a neutral 3'→5' strand were very fast (similar to translocation along unmodified DNA), whereas the traversals of the insert with a neutralized 5'→3' strand required 5–50 s, likely involving several crossing attempts. These results clearly indicate that SpoIIIE makes essential electrostatic contacts selectively with the charged backbone on the 5'→3' strand in the direction of translocation. 10.7554/eLife.09224.007 Figure 3. SpoIIIE favors phosphate interactions on the 5'-3' strand in the direction of translocation. (a) Sample traces of SpoIIIE translocating on DNA with 30 bp of neutral DNA on either the 3'-5' strand (orange traces) or the 5'-3' strand (magenta traces) in the direction of translocation. (b) Cartoon illustrating a hypothetical sequential model in which the DNA backbone is handed off between adjacent subunits within a hexameric ring. For clarity only one strand of dsDNA is shown. A highlighted backbone phosphate (yellow) is in contact with a motor subunit (magenta). In general, the motor step size in such a model can be anything less than 10 bp. Here we illustrate the model using a 2-bp step size. After one motor subunit (magenta) executes its power-stroke, the helical backbone of the dsDNA's will be shifted, positioning the phosphate backbone in close proximity to the next subunit poised to fire. (c) Cartoon illustrating a hypothetical model in which a 10-bp burst enables a hexameric ring ATPase to maintain phosphate contacts on the same DNA strand. Initially, a single subunit (magenta) is contacting the phosphate backbone (yellow). After a 10 bp burst, the motor has traversed nearly a full helical turn on dsDNA, bringing the phosphate backbone back in register with the same ATPase subunit. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.007 Strand tracking favors a sequential ATP hydrolysis model for SpoIIIE The observation that SpoIIIE tracks only one of the DNA strands imposes geometric constraints on how the DNA is handed off from subunit to subunit during translocation. Strand-tracking is inconsistent with a stochastic coordination mechanism in which the six ATPase subunits execute their power-strokes at random. In such a mechanism, the subunit poised to fire is unlikely to be aligned with the tracked strand and will therefore not engage the DNA substrate. Since the DNA is held under constant tension in our experiments, a stochastically coordinated ATPase ring is expected to slip frequently, contrary to our observations. Two possible scenarios are consistent with strand–tracking: (i) Subunits hydrolyze ATP and execute their power-strokes sequentially around the ring, such that after every power-stroke the subunit scheduled to fire next is properly aligned to interact with the phosphate backbone of the tracked strand ( Figure 3b ). In this scenario, the SpoIIIE subunits would fire consecutively (subunit 1 fires, followed by subunit 2, followed by subunit 3, etc). After subunit 1 executes its power-stroke, the helical geometry of the DNA will position the phosphate backbone of the tracked strand in close proximity to subunit 2, depending on the step size of the motor ( Massey et al., 2006 ; Strick and Quessada-Vial, 2006 ). Thus, motor-DNA contacts would proceed from one subunit to the next in an ordinal fashion. (ii) The motor translocates DNA in increments of 10–11 bp, which closely matches the helical periodicity of dsDNA (10.4–10.5 bp/pitch). This mechanism would ensure that after each translocation event, the motor contacts the same strand after traversing one full helical turn along the DNA ( Figure 3c ). Such a mechanism is employed by the φ29 ring ATPase, which translocates DNA in 10-bp bursts and contacts the DNA backbone on the same strand every 10 base pairs ( Aathavan et al., 2009 ). The data presented above indicate that SpoIIIE makes periodic contacts with the same DNA strand every five base pairs or less and are consistent only with the sequential ATP hydrolysis mechanism outlined in scenario (i). MeP stepping stone constructs suggest that SpoIIIE has a step size of 2 bp In order to rationalize how SpoIIIE easily traverses 4 bp of neutral DNA, but has difficulty crossing 5 bp of neutral DNA ( Figure 2b ), we considered several motor-DNA contact models. To be consistent with the observation that SpoIIIE tracks only one DNA strand ( Figure 3a ), all potential models require that SpoIIIE subunits fire in a well-defined sequential order around the ring ( Figure 4a ). Furthermore, since electrostatic interactions with the backbone on one strand are critical for maintaining the motor's grip on DNA, we reason that at least one electrostatic contact between the motor and the phosphate backbone is needed for SpoIIIE to maintain a stable grip on its DNA substrate. Finally, the pool of potential models can be further narrowed by making an assumption about the state of dsDNA inside the central pore of SpoIIIE during translocation. Although no ring-shaped dsDNA translocase has been co-crystallized with its substrate, it is thought that dsDNA is not significantly distorted within the central pore of ring ATPases ( Massey et al., 2006 ; Sun et al., 2008 ). For example, the central channel of the FtsK ring can fully accommodate a single, undistorted B-form dsDNA strand ( Massey et al., 2006 ). Therefore, we considered models where the helical pitch of dsDNA inside the SpoIIIE channel is similar to that of B-form DNA (10.5 bp/turn). Expanding our models to include a distorted helix similar to A-form DNA (11.0 bp/turn) would require only minor corrections and would not affect the overall predictions of these models. 10.7554/eLife.09224.008 Figure 4. Possible SpoIIIE translocation models capable of crossing 4 bp of dsMeP. ( a ) Cartoon illustrating the sequential firing of subunits A–F of SpoIIIE as it approaches a 4 bp insert of dsMeP. ( b ) Possible translocation models (i–v) depicting the interaction between SpoIIIE subunits (A–F) and DNA; in all models subunits fire in a sequential order (A→B→C→D→E→F→A etc). For clarity, we show only the backbone the DNA strand tracked by SpoIIIE. Phosphate and MeP groups are shown in blue and red, respectively. A solid line connecting a SpoIIIE subunit to the backbone represents a stable electrostatic interaction; a dashed line represents a disrupted interaction. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.008 Five models ( Figure 4b i–v ) are consistent with the results of the dsMeP experiments ( Figure 2 ) and satisfy the conditions listed above: (i) At any time, only one subunit contacts one phosphate on DNA ( Figure 4b i ); this model requires a 5-bp step size to cross a 4-bp MeP insert. (ii) Only one subunit contacts two adjacent DNA phosphates at any time ( Figure 4b ii ); this model requires a 4-bp step size to clear a 4-bp MeP insert. (iii) At any time, two neighboring subunits each contact one DNA phosphate; this model requires a 3-bp step size to clear a 4-bp MeP insert ( Figure 4b iii ). (iv) At any time, two neighboring subunits each contact two adjacent DNA phosphates; this model requires a 2-bp step size to cross a 4-bp MeP insert ( Figure 4b iv ). We disfavor models where SpoIIIE subunit simultaneously contact more than two consecutive phosphate groups on the DNA backbone, and models where three or more consecutive subunits contact the DNA backbone because such models would require large motor/DNA distortions. Finally, we also considered a translocation model similar to the mechanisms proposed for the E1 and Rho helicases ( Enemark and Joshua-Tor, 2006 ; Thomsen and Berger, 2009 ), (v) at any time five subunits contact five consecutive DNA phosphates; this model requires a 1-bp step size to cross a 4-bp insert ( Figure 4b v ). Although this E1/Rho-like model requires significant motor/DNA distortions (5 SpoIIIE subunits span an arc of 300° while five consecutive phosphates in dsDNA span an arc of ∼170°), it is in principle consistent with the data from Figure 2 . While we cannot rule out more complex models that may involve non-consecutive subunits simultaneously contacting the DNA, or stochastic bursts consisting of multiple, rapid consecutive steps ( Cordova et al., 2014 ; Sen et al., 2013 ), we favor the more parsimonious models presented here. To distinguish among the models proposed above and to determine SpoIIIE's step size, we challenged the motor with inserts containing a 4-bp MeP segment ('register'), followed by 1 bp of regular DNA ('stepping-stone') that is in turn followed by a variable-length MeP segment ('probe') of 1–4 bp ( Figure 5a ). Because SpoIIIE easily crosses up to 4 bp of neutral DNA, the 4-bp register is meant to align the stepping phase of SpoIIIE with the stepping-stone segment. Motors that are not in perfect register with the stepping-stone should not establish electrostatic contacts with DNA and will either slip backward or stall. The motors that successfully traverse the entire insert should land on the stepping-stone in a 'front-foot-first' configuration—wherein only the leading motor-DNA contact is securely established—and should be able to cross a probe segment of length equal to the step size minus 1 bp ( Figure 5b ). We found that SpoIIIE traversed a 1-bp neutral probe with near-100% probability ( Figure 5c orange traces), inconsistent with the 5 subunit contact model ( Figure 5b v ). The crossing probability sharply drops to ∼25% for 2-bp, 3-bp, or 4-bp neutral probes ( Figure 5c , magenta traces and Figure 5d ). As seen in Figure 5b , only model iv can easily cross a 1-bp probe but not probes of 2 bp or longer. In this model, two consecutive SpoIIIE subunits each contact two adjacent phosphates, and DNA is translocated in 2-bp steps ( Figure 5b iv ). A 2-bp step size is in good agreement with both enzymatic and structural studies of the related dsDNA translocase FtsK, which translocates 1.6–2.1 bp per ATP hydrolyzed ( Graham et al., 2010 ; Massey et al., 2006 ). 10.7554/eLife.09224.009 Figure 5. Deducing SpoIIIE's step size using 'stepping-stone' MeP constructs. ( a ) The design of 'stepping-stone' constructs. Each insert consists of a register segment with 4 bp of neutral DNA, followed by one regular DNA base ('stepping-stone'), and a probe segment with x bp of neutral DNA. For clarity, only the DNA strand tracked by SpoIIIE is shown. ( b ) Diagrams illustrating the longest probe segment that can be traversed by the models depicted in Figure 4b. Model (i) should traverse a probe segment of at most 4 bp, whereas model (v) cannot traverse even a probe of 1 bp. (c) Sample traces of SpoIIIE translocating on DNA with 'stepping-stone' inserts containing a 1-bp probe (orange) or a 2-bp probe (magenta). ( d ) Traversal probability for stepping-stone constructs with various probe lengths. Error-bars show the 68% CI estimated via bootstrapping. p values were calculated using a two-tailed Fisher exact test. ( e ) Diagram illustrating how model (iv) can successfully traverse a 'stepping-stone' insert with a probe of 1 bp. The star marks the subunit executing the power-stroke. Once a subunit fires, it cannot fire again (gray shading) and must eventually disengage from the DNA (subunit shown as making no interactions with DNA). ( f ) Diagram showing why model (iv) fails to cross a 'stepping-stone' insert with a probe of 2 bp. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.009 10.7554/eLife.09224.010 Figure 5—figure supplement 1. Crossing predictions of the E1/Rho-like translocation models. Diagram illustrating two different scenarios of how the E1/Rho-like translocation model would cope with a MeP stepping stone insert. In this model subunits fire in a well-defined sequential order (firing subunit denoted by the yellow star) and move by 1 bp on DNA, whereas the remaining subunits escort the DNA during the translocation process. If the ATPase subunits have to fire in a strictly sequential order, a subunit cannot fire multiple consecutive times, or fire out of order, and is grayed out after firing. A motor operating via a strictly sequential E1/Rho-like translocation mechanism is not capable of crossing a MeP stepping stone insert with a 1-bp probe (frame 8), contrary to our observations ( Figure 5c–d ). If the same ATPase subunit could fire out of order several times in a row, the motor should traverse a MeP stepping stone insert with a 4-bp probe (inset), again inconsistent with our findings ( Figure 5c–d ). DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.010 Figure 5e illustrates how model iv enables SpoIIIE to cross the insert with a 1-bp probe. The first three frames illustrate the sequential firing of subunits A, B, and C, all of which maintain at least one anchoring contact with the phosphate backbone. Because subunit D cannot make electrostatic contacts with the backbone, it fails to propel the DNA upon firing ( Figure 5e , frame 5). As a result, no other subunit can establish new contacts with the DNA backbone. After subunit E translocates the DNA by 2 bp, subunit F can now latch onto a negatively charged phosphate and continue to translocate DNA. Figure 5f illustrates how this model copes with a 2-bp MeP probe: subunit F cannot anchor itself onto the DNA, causing the motor to pause and eventually slip (as shown in Figure 5c , magenta traces). This two-subunit DNA escort model requires one subunit to execute the power stroke while an adjacent subunit maintains its phosphate contacts during this power-stroke, escorting the DNA through the ring. In this model, the ATPase subunits translocate the DNA sequentially around the ring in a highly coordinated fashion that enables SpoIIIE to track one DNA strand. There is increasing structural evidence for this type of motor mechanism involving 'translocating' subunits and 'escorting' subunits; examples include the E.coli's Rho helicase ( Thomsen and Berger, 2009 ) and the papillomavirus E1 helicase ( Enemark and Joshua-Tor, 2006 ). However, unlike the E1/Rho mechanisms, which employ four escorting subunits, the SpoIIIE translocation model proposed here requires only one escorting subunit. Nucleotides stabilize the SpoIIIE-DNA interactions To quantify the strength of the motor–DNA interaction, we measured the force at which SpoIIIE loses its grip on DNA. In a buffer lacking nucleotides, SpoIIIE could bind to DNA and form tethers between the trapped bead and the micropipette-held bead. Manual pulling experiments revealed that these tethers rupture at ∼3 pN ( Figure 7—figure supplement 1 , apo), suggesting that apo-SpoIIIE does not interact strongly with DNA. In buffers containing only ADP or ATPγS, SpoIIIE could bind to DNA, forming tethers that rupture at ∼15 and ∼25 pN, respectively ( Figure 7—figure supplement 1 ). These results indicate that nucleotides stabilize motor–DNA interactions and suggest that only nucleotide-bound subunits are capable of forming stable electrostatic contacts with the DNA phosphate backbone. The SpoIIIE ring can operate with non-consecutive inactive subunits To further investigate how individual SpoIIIE subunits coordinate their ATP hydrolysis activity, we monitored DNA translocation in a saturating [ATP] buffer that contained ATPγS – a nucleotide analog that is hydrolyzed very slowly. Structural studies of FtsK indicate that ATPγS binds to the same catalytic pocket as ATP ( Massey et al., 2006 ), suggesting that ATPγS should act as a competitive inhibitor to ATP binding for the SpoIIIE/FtsK family of ring ATPases. We observe that ATPγS induces SpoIIIE pausing ( Figure 6a ) and reduces the pause-free translocation velocity ( Figure 6—figure supplement 1a ). This reduction in pause-free velocity is well described by a simple competitive inhibition mechanism ( Figure 6—figure supplement 1b ). Similar results were obtained with a non-hydrolyzable ATP analog–AMP-PNP ( Figure 6—figure supplement 1c–d ). Taken together, these results indicate that nucleotide analogs induce SpoIIIE pausing by binding to a subset of ring subunits and arresting them in a pre-hydrolysis state. 10.7554/eLife.09224.011 Figure 6. SpoIIIE pauses when two consecutive subunits are bound to ATPγS. ( a ) Sample SpoIIIE traces acquired at different [ATPγS] and 3mM ATP. Pauses are highlighted in red. ( b ) Mean duration of the ATPγS-induced pauses extracted from fitting the pause duration distribution to an exponential. Error-bars represent the 95% CI of the fit. Insert: histogram of pause durations at 750 μM ATPγS and 3 mM ATP and the exponential fit to this distribution. ( c ) The density of ATPγS-induced pauses at various [ATPγS] and 3mM ATP. Error-bars represent the SEM. ( d ) Pause density versus [ATPγS] corrected to account for missed pauses (black symbols). Error-bars represent the SEM. The shaded regions illustrate the predictions for a sequential hydrolysis model where SpoIIIE pauses when n consecutive subunits are bound to ATPγS. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.011 10.7554/eLife.09224.012 Figure 6—figure supplement 1. SpoIIIE activity inhibition with ATP analogs. ( a ) Pause-free velocity versus opposing force for various [ATPγS] and 3mM ATP. Error-bars represent the SEM. ( b ) Degree of pause-free velocity inhibition i = 1-v ([ATPγS])/v max versus [ATPγS] at 3 mM [ATP] and 5 pN of opposing force. The dashed curve represents the fit to the competitive inhibition model (inset) with K i = 124 ± 20 µM. ( c ) Pause-free velocity versus opposing force at 3 mM [ATP] in the absence of any nucleotide analogs (black), in the presence 500 µM [ATPγS] (green), or in the presence of 500 µM [AMP-PNP] (pink). Error bars represent the SEM. ( d ) Pause density measured at 3 mM [ATP] and various [ATPγS] (blue symbols). Experiments were also performed with 3 mM [ATP] and 0.5 mM [AMP-PNP] (red symbol). Error bars represent the SEM. ( e ) Pause density versus opposing force at 3 mM [ATP] and 1 mM [ATPγS]. ( f ) Mean lifetime of ATPγS-induced pauses calculated from single-exponential fits to the pause duration distribution at 3 mM [ATP] and 1 mM [ATPγS]. Error bars represent the 95% CI of the fits. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.012 To determine how many analog-bound subunits are required to arrest DNA translocation, we measured the density and duration of ATPγS-induced pauses as a function of [ATPγS]. The density and duration of analog-induced pauses does not depend on external force ( Figure 6—figure supplement 1e–f ), consequently pauses detected at all forces were pooled together. Given the spatio-temporal resolution of our experiments, we could reliably detect pauses longer than 30 ms at 125 –250 μM ATPγS, 50 ms at 375–500 μM ATPγS, and 75 ms at 750–1000 μM ATPγS. However, regardless of the shortest detectable pause duration and the ATPγS concentration, the distribution of measured pause durations was well described by a single exponential decay ( Figure 6b , inset) with the same characteristic life-time of ∼35 ms ( Figure 6b ). The fact that the characteristic life-time does not depend on ATPγS concentration suggests that all analog-induced pauses are drawn from the same distribution. Furthermore, the single-exponential dependence of the pause duration distribution indicates that the exit from the paused state is governed by a single rate-limiting event—presumably the exchange of an ATPγS molecule with one ATP which is present in saturating concentrations, as proposed for other ring ATPases ( Chistol et al., 2012 ; Sen et al., 2013 ). Despite the fact that we cannot detect analog-induced pauses shorter than a certain cutoff (30–75 ms), we can estimate the number of missed pauses—and therefore the true pause density—from the measured pause density ( Figure 6c ) and the characteristic life-time derived from the pause distribution ( Figure 6b ), assuming that the single-exponential distribution holds for pauses shorter than the cutoff ( Hodges et al., 2009 ) (see 'Materials and methods'). The MeP experiments support a sequential nucleotide hydrolysis model. Therefore, to explain the density of ATPγS-induced pauses, we considered a sequentially coordinated hexameric ATPase ring that pauses whenever n consecutive subunits are bound to ATPγS (1 ≤ n ≤6). The pause density ( PD ) can be analytically expressed in terms of the motor's pause-free velocity ( v pf ), the ATPγS dissociation rate ( k off ), and the probability that the motor is paused ( P pause )—which is proportional to the concentrations and dissociation constants of ATP and ATPγS (Materials and methods), as follows: P D = k o f f v p f · P p a u s e ( 1 - P P a u s e ) Figure 6d shows the expected pause density predicted for different n values. For example, n =1 (green shaded region) corresponds to a sequentially coordinated ring that pauses whenever a single subunit is bound to ATPγS; n =2 (blue shaded region) corresponds to a sequentially coordinated ring that pauses when two consecutive subunits are both bound to ATPγS, and so on. The ATPγS pause-density data corrected to account for missed pauses ( Figure 6d black symbols) are best described by the model in which two (n =2 ) consecutive analog-bound subunits are required to induce a pause in the motor ( Figure 6d , blue-shaded region). In other words, analysis of the pause density indicates that the motor can operate processively with non-consecutive inactive subunits but not with two or more consecutive subunits. This conclusion is further supported by the observation that FtsK hexamers readily bypass individual catalytically inactive ATPase subunits ( Crozat et al., 2010 ). Discussion Secondary motor-DNA interactions We have shown that SpoIIIE translocates DNA by making crucial anchoring contacts with the negatively charged phosphate groups on one DNA strand. Although electrostatic interactions with the backbone of the 5'→3' strand in the direction of translocation are the principal mode of motor-substrate contact, we surmise that other types of interactions (e.g. steric) play a secondary role in maintaining SpoIIIE's grip on DNA. This inference explains why we observe small but non-zero traversal probabilities for neutral inserts of 10–30 bp, much longer than the expected motor step size ( Figure 2b ). Interestingly, SpoIIIE is more likely to traverse 30-bp inserts with a neutral backbone only on the 5'→3' strand (6 out of 28 molecules) than 30-bp inserts with a neutral backbone on both strands (1 out of 32 molecules) ( Table 1 ). To explain this discrepancy, we speculate that during translocation, in addition to the essential electrostatic interactions with the 5'→3' strand, the SpoIIIE ring may also interact very weakly with charges on the 3'→5' strand. These secondary interactions could be mediated by parts of the motor other than the pore loops which execute the power – stroke. MeP is not expected to cause significant DNA distortions Prior experiments on MeP DNA have established that certain patterns of neutral and charged bases can introduce large DNA distortions. An asymmetric neutralization of the phosphate backbone whereby one 'face' of the dsDNA helix had its charges removed (e.g. neutralizing bases 1-3 on one strand and bases 3-6 on the other strand) results in DNA bending toward the direction of the neutralized region ( Strauss and Maher, 1994 ). However, a symmetric neutralization of the phosphate backbone, whereby the phosphates on both strands were uniformly neutralized, resulted in no significant DNA distortions ( Strauss and Maher, 1994 ). We do not expect the MeP DNA constructs used in this study to introduce significant distortions on the double helix for two reasons: (1) Magnesium ions were present in the experimental buffer at a sufficiently high concentration (10 mM), which had been demonstrated to mitigate the effect of DNA distortions due to asymmetric phosphate neutralization ( Strauss and Maher, 1994 ). (2) In designing the MeP inserts used in this study, care was taken to avoid an asymmetric neutralization of the phosphate backbone. The majority of the experiments with MeP inserts tested in this study utilized dsMeP modifications. Thus, the backbone neutralization was symmetrically distributed and therefore not expected to cause significant DNA distortions. We tested only two single-stranded MeP/DNA hybrid constructs, with 30 consecutive neutralized bases on either strand, covering nearly three full helical turns of the DNA. Because the backbone neutralization was distributed evenly in all directions around the DNA helix, the charge neutralization should be symmetrical, and therefore, it is not expected to introduce significant DNA distortions. DNA translocation model To rationalize the results of the MeP experiments, we propose a minimal translocation model in which SpoIIIE subunits fire sequentially around the ring, each subunit translocates 2 bp of DNA per power-stroke, at least two consecutive ATPase subunits contact the backbone of one DNA strand, and each subunit contacts two consecutive backbone phosphates. To be consistent with the results of the stepping-stone insert experiments ( Figure 5c–d ), our two-subunit translocation-escort model requires that subunits fire in a well- defined sequential fashion (A, B, C, D, E, F, A, B, C etc) and a subunit cannot fire multiple times in a row or out of order. SpoIIIE does not employ the E1/Rho-like translocation model The structures of homo-hexameric helicases E1 and Rho co-crystallized with their single-stranded nucleic acid substrates strongly support a translocation mechanism where five motor subunits contact five consecutive phosphates on the ssDNA/ssRNA backbone ( Enemark and Joshua-Tor, 2006 ; Thomsen and Berger, 2009 ), and the hydrolysis of one ATP is coupled to the translocation of one nucleotide. Although an E1/Rho-like mechanism could potentially rationalize how SpoIIIE easily traverses a dsMeP insert of 4 bp but not 5 bp ( Figure 2 ), such a model predicts that the motor would fail to traverse a stepping-stone construct with a 1-bp MeP probe ( Figure 5b v ). Even if the E1/Rho-like model did allow a subunit to fire several times in a row, such a model would still be inconsistent with the stepping stone data ( Figure 5—figure supplement 1 ). Strand-tracking in a dsDNA translocase It was previously reported that SpoIIIE supercoils plasmid DNA in vitro , and strand/groove-tracking was proposed to explain this observation ( Bath et al., 2000 ). Magnetic tweezers measurements of DNA supercoiling during translocation ruled out a groove-tracking mechanism for FtsK ( Saleh et al., 2005 ). Here, we show that SpoIIIE does indeed track one DNA strand by making specific electrostatic contacts with backbone phosphates on the 5'→3' strand in the direction of translocation, a feature reported for other RecA-like NTPases: the φ29 packaging motor, DnaB, and Rho ( Aathavan et al., 2009 ; Itsathitphaisarn et al., 2012 ; Thomsen and Berger, 2009 ). Unlike the φ29 ATPase, which translocates dsDNA, DnaB, and Rho are single-stranded nucleic acid translocases, and therefore track one strand by default. Interestingly, both SpoIIIE and the φ29 ATPase encircle dsDNA, positioning multiple subunits in close proximity to the dsDNA helix, while they still possess the ability to discriminate one strand from the other. How these dsDNA translocases achieve strand discrimination remains unclear. Several studies have demonstrated that certain skewed sequences (i.e. sequences whose presence is biased on the leading vs. the lagging strand) impart directionality to FtsK/SpoIIIE translocation ( Besprozvannaya et al., 2013 ; Cattoni et al., 2013 ; Lee et al., 2012 ; Levy et al., 2005 ; Löwe et al., 2008 ). It is tempting to imagine that the strand tracking mechanism presented here could be used by SpoIIIE to read these skewed sequences (i.e. the SpoIIIE Recognition Sequences, SRS). However, the γ domains of SpoIIIE have been shown to be required for reading the SRS ( Ptacin et al., 2008 ) and co-crystal structures of dsDNA with the domain γ reveals it interacting with both DNA strands at the backbone, the major and minor grooves, and individual bases ( Löwe et al., 2008 ). We consider it unlikely therefore, that SpoIIIE enlists the strand-tracking mechanism described here for SRS sequence recognition. The motor-DNA symmetry mismatch should give rise to DNA supercoiling The electrostatic interactions between SpoIIIE and the DNA backbone are likely to have two main purposes in vivo : (i) They serve a load-bearing function by providing SpoIIIE with the grip necessary to strip-bound proteins off the DNA at the high speeds at which the motor operates ( Marquis et al., 2008 ); and (ii) They enable the motor to supercoil the DNA during translocation. The later arises from the symmetry mismatch between the angles spanned by two adjacent SpoIIIE subunits and the angle that separates the phosphates contacted by the motor during a 2-bp step. Figure 7a depicts the SpoIIIE-DNA complex as seen from the N terminus of the motor; in this view, SpoIIIE translocates DNA toward the viewer ( Massey et al., 2006 ). In the two-subunit DNA escort model, the DNA is handed over from one subunit to the next and, for each 2-bp step, the motor-DNA contacts rotate clockwise around the ring by 60°. However, since B-form DNA has a helical pitch of 10.4 bp/turn ( Wang, 1979 ), the dsDNA backbone rotates clockwise by 69° for every 2 bp. Therefore, after each motor step, a counter-clockwise 9° rotation of the DNA relative to the motor is required to align the phosphate backbone with the next translocating subunit. As a result, the two-subunit escort model predicts that SpoIIIE should introduce one supercoil for every ∼80 bp of DNA translocated. The magnitude and direction of this prediction is consistent with both in vivo measurements ( Nicholson and Setlow, 1990 ) and in vitro single-molecule experiments. Indeed, magnetic tweezers experiments revealed that SpoIIIE supercoils DNA by one turn per 100 ± 10 bp of DNA translocated (Jerod Ptacin and Marcelo Nollman, personal communication). It was previously reported that strand tracking by the φ29 ATPase, another ring-shaped dsDNA motor, also leads to DNA supercoiling ( Liu et al., 2014 ). The results presented here for SpoIIIE suggest that DNA supercoiling may be a general feature of ring-shaped dsDNA motors that track one strand. The amount and direction of supercoiling should depend on the (i) the helical pitch of dsDNA, (ii) the periodicity of motor-DNA contacts (step size), and (iii) the motor's inter-subunit coordination mechanism. 10.7554/eLife.09224.013 Figure 7. Two-subunit DNA escort model. ( a ) Diagram illustrating how SpoIIIE supercoils DNA while tracking the phosphate backbone of one DNA strand. Neighboring subunits in the SpoIIIE hexamer are spaced by 60°; consecutive DNA phosphates are spaced by ∼34°; and the backbone contacts of two adjacent subunits are separated by ∼69°. After a 2-bp translocation step, a 9-degree counter-clockwise rotation of the DNA relative to the motor is needed to align the next translocating subunit and the nearest pair of backbone phosphates. ( b ) Diagram of the SpoIIIE hexamer illustrating how the two-subunit DNA escort model enables the motor to bypass an ATPγS-bound subunit (red). For simplicity, only one DNA strand is shown (orange). DNA is translocated out of the page, and each subunit interacts with two neighboring phosphates. The star marks the subunit slated to execute the power-stroke. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.013 10.7554/eLife.09224.014 Figure 7—figure supplement 1. Assessing the strength of the SpoIIIE–DNA interaction in the presence of different nucleotides. To probe the strength of the motor-DNA interaction in the presence of different nucleotides, we pulled on single SpoIIIE-DNA complexes in a nucleotide-free buffer (Apo state, green), 1mM [ATPγS] (cyan), and 1mM [ADP] (orange) and measured the mean pull force, that is, the average force at which the tether ruptured. Error bars represent the SEM. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.014 In vivo measurements indicate that, during B. subtilis sporulation, the DNA is negatively supercoiled by 1 turn per 97 ± 6 bp in the forespore and 1 turn per 140 ± 10 bp in the mother cell ( Nicholson and Setlow, 1990 ). Since SpoIIIE is anchored at the septum during sporulation and the B. subtilis DNA is circular, the two-subunit escort model predicts that SpoIIIE translocation should introduce one negative supercoil in the forespore and one positive supercoil in the mother cell for every ∼80 bp translocated. We surmise that the SpoIIIE mechanism is fine tuned to deliver DNA to the forespore in the appropriate negative supercoiled state, similar to what has been proposed for FtsK ( Saleh et al., 2005 ). This mechanism may help to conserve cellular resources by minimizing the amount of maintenance performed by topoisomerases/gyrases, a strategy that may provide a significant advantage in the harsh conditions that prompt sporulation (i.e., starvation). SpoIIIE/FtsK rings can tolerate non-consecutive inactive subunits The results of ATPγS experiments suggest that SpoIIIE can processively translocate DNA with non-consecutive inactive subunits. This conclusion can be rationalized by the two-subunit DNA escort model proposed above: having two adjacent ATPase subunits simultaneously contact the DNA enables the motor to continue translocating if either of the two subunits is inactive, but not when both are disabled. Figure 7b illustrates how the two-subunit DNA escort model can bypass the ATPγS-bound subunit B: (i) subunit A fires and translocates DNA while subunit B escorts the DNA, (ii) the analog-bound subunit B fails to fire while subunit C was poised to escort the DNA (iii) subunit C then fires and translocates the DNA, handing it over to subunit D. During this step, subunit B, which remains bound to ATPγS, escorts the DNA for subunit C. Our conclusions agree with the results of a single-molecule study by Crozat et al., which found that FtsK hexamers with two diametrically opposed inactive subunits translocated DNA as fast as wildtype hexamers ( Crozat et al., 2010 ). The authors of that study proposed a sequential DNA escort mechanism in which at least three motor subunits contact the DNA at any given time. The ATPγS experiments presented here provide additional evidence that SpoIIIE/FtsK motors can bypass individual inactive subunits. Moreover, the strand-tracking behavior reported here for SpoIIIE strongly favors a model in which ring subunits fire sequentially, a key aspect of the DNA escort mechanism proposed here and in the Crozat et al study. This study presents evidence for a type of inter-subunit coordination in ASCE ring NTPases where subunit firing is highly coordinated around the ring, yet the motor possesses sufficient flexibility to bypass non-consecutive inactive subunits. How is this mechanism optimized for the specific biological task of SpoIIIE? In vivo , SpoIIIE is present in low copy numbers during sporulation, with only two motors responsible for the vital task of chromosome translocation at any given time ( Burton et al., 2007 ; Yen Shin et al., 2015 ). As a result, each SpoIIIE ring functions as a single-molecule bottleneck for this process, where the failure of either motor is likely to be lethal for the cell. The coordination mechanism proposed here can potentially explain how B. subtilis safeguards against the failure of individual motor subunits during sporulation. We speculate that other ASCE motors that also represent single-points of failure may have evolved into similar flexible operations. Secondary motor-DNA interactions We have shown that SpoIIIE translocates DNA by making crucial anchoring contacts with the negatively charged phosphate groups on one DNA strand. Although electrostatic interactions with the backbone of the 5'→3' strand in the direction of translocation are the principal mode of motor-substrate contact, we surmise that other types of interactions (e.g. steric) play a secondary role in maintaining SpoIIIE's grip on DNA. This inference explains why we observe small but non-zero traversal probabilities for neutral inserts of 10–30 bp, much longer than the expected motor step size ( Figure 2b ). Interestingly, SpoIIIE is more likely to traverse 30-bp inserts with a neutral backbone only on the 5'→3' strand (6 out of 28 molecules) than 30-bp inserts with a neutral backbone on both strands (1 out of 32 molecules) ( Table 1 ). To explain this discrepancy, we speculate that during translocation, in addition to the essential electrostatic interactions with the 5'→3' strand, the SpoIIIE ring may also interact very weakly with charges on the 3'→5' strand. These secondary interactions could be mediated by parts of the motor other than the pore loops which execute the power – stroke. MeP is not expected to cause significant DNA distortions Prior experiments on MeP DNA have established that certain patterns of neutral and charged bases can introduce large DNA distortions. An asymmetric neutralization of the phosphate backbone whereby one 'face' of the dsDNA helix had its charges removed (e.g. neutralizing bases 1-3 on one strand and bases 3-6 on the other strand) results in DNA bending toward the direction of the neutralized region ( Strauss and Maher, 1994 ). However, a symmetric neutralization of the phosphate backbone, whereby the phosphates on both strands were uniformly neutralized, resulted in no significant DNA distortions ( Strauss and Maher, 1994 ). We do not expect the MeP DNA constructs used in this study to introduce significant distortions on the double helix for two reasons: (1) Magnesium ions were present in the experimental buffer at a sufficiently high concentration (10 mM), which had been demonstrated to mitigate the effect of DNA distortions due to asymmetric phosphate neutralization ( Strauss and Maher, 1994 ). (2) In designing the MeP inserts used in this study, care was taken to avoid an asymmetric neutralization of the phosphate backbone. The majority of the experiments with MeP inserts tested in this study utilized dsMeP modifications. Thus, the backbone neutralization was symmetrically distributed and therefore not expected to cause significant DNA distortions. We tested only two single-stranded MeP/DNA hybrid constructs, with 30 consecutive neutralized bases on either strand, covering nearly three full helical turns of the DNA. Because the backbone neutralization was distributed evenly in all directions around the DNA helix, the charge neutralization should be symmetrical, and therefore, it is not expected to introduce significant DNA distortions. DNA translocation model To rationalize the results of the MeP experiments, we propose a minimal translocation model in which SpoIIIE subunits fire sequentially around the ring, each subunit translocates 2 bp of DNA per power-stroke, at least two consecutive ATPase subunits contact the backbone of one DNA strand, and each subunit contacts two consecutive backbone phosphates. To be consistent with the results of the stepping-stone insert experiments ( Figure 5c–d ), our two-subunit translocation-escort model requires that subunits fire in a well- defined sequential fashion (A, B, C, D, E, F, A, B, C etc) and a subunit cannot fire multiple times in a row or out of order. SpoIIIE does not employ the E1/Rho-like translocation model The structures of homo-hexameric helicases E1 and Rho co-crystallized with their single-stranded nucleic acid substrates strongly support a translocation mechanism where five motor subunits contact five consecutive phosphates on the ssDNA/ssRNA backbone ( Enemark and Joshua-Tor, 2006 ; Thomsen and Berger, 2009 ), and the hydrolysis of one ATP is coupled to the translocation of one nucleotide. Although an E1/Rho-like mechanism could potentially rationalize how SpoIIIE easily traverses a dsMeP insert of 4 bp but not 5 bp ( Figure 2 ), such a model predicts that the motor would fail to traverse a stepping-stone construct with a 1-bp MeP probe ( Figure 5b v ). Even if the E1/Rho-like model did allow a subunit to fire several times in a row, such a model would still be inconsistent with the stepping stone data ( Figure 5—figure supplement 1 ). Strand-tracking in a dsDNA translocase It was previously reported that SpoIIIE supercoils plasmid DNA in vitro , and strand/groove-tracking was proposed to explain this observation ( Bath et al., 2000 ). Magnetic tweezers measurements of DNA supercoiling during translocation ruled out a groove-tracking mechanism for FtsK ( Saleh et al., 2005 ). Here, we show that SpoIIIE does indeed track one DNA strand by making specific electrostatic contacts with backbone phosphates on the 5'→3' strand in the direction of translocation, a feature reported for other RecA-like NTPases: the φ29 packaging motor, DnaB, and Rho ( Aathavan et al., 2009 ; Itsathitphaisarn et al., 2012 ; Thomsen and Berger, 2009 ). Unlike the φ29 ATPase, which translocates dsDNA, DnaB, and Rho are single-stranded nucleic acid translocases, and therefore track one strand by default. Interestingly, both SpoIIIE and the φ29 ATPase encircle dsDNA, positioning multiple subunits in close proximity to the dsDNA helix, while they still possess the ability to discriminate one strand from the other. How these dsDNA translocases achieve strand discrimination remains unclear. Several studies have demonstrated that certain skewed sequences (i.e. sequences whose presence is biased on the leading vs. the lagging strand) impart directionality to FtsK/SpoIIIE translocation ( Besprozvannaya et al., 2013 ; Cattoni et al., 2013 ; Lee et al., 2012 ; Levy et al., 2005 ; Löwe et al., 2008 ). It is tempting to imagine that the strand tracking mechanism presented here could be used by SpoIIIE to read these skewed sequences (i.e. the SpoIIIE Recognition Sequences, SRS). However, the γ domains of SpoIIIE have been shown to be required for reading the SRS ( Ptacin et al., 2008 ) and co-crystal structures of dsDNA with the domain γ reveals it interacting with both DNA strands at the backbone, the major and minor grooves, and individual bases ( Löwe et al., 2008 ). We consider it unlikely therefore, that SpoIIIE enlists the strand-tracking mechanism described here for SRS sequence recognition. The motor-DNA symmetry mismatch should give rise to DNA supercoiling The electrostatic interactions between SpoIIIE and the DNA backbone are likely to have two main purposes in vivo : (i) They serve a load-bearing function by providing SpoIIIE with the grip necessary to strip-bound proteins off the DNA at the high speeds at which the motor operates ( Marquis et al., 2008 ); and (ii) They enable the motor to supercoil the DNA during translocation. The later arises from the symmetry mismatch between the angles spanned by two adjacent SpoIIIE subunits and the angle that separates the phosphates contacted by the motor during a 2-bp step. Figure 7a depicts the SpoIIIE-DNA complex as seen from the N terminus of the motor; in this view, SpoIIIE translocates DNA toward the viewer ( Massey et al., 2006 ). In the two-subunit DNA escort model, the DNA is handed over from one subunit to the next and, for each 2-bp step, the motor-DNA contacts rotate clockwise around the ring by 60°. However, since B-form DNA has a helical pitch of 10.4 bp/turn ( Wang, 1979 ), the dsDNA backbone rotates clockwise by 69° for every 2 bp. Therefore, after each motor step, a counter-clockwise 9° rotation of the DNA relative to the motor is required to align the phosphate backbone with the next translocating subunit. As a result, the two-subunit escort model predicts that SpoIIIE should introduce one supercoil for every ∼80 bp of DNA translocated. The magnitude and direction of this prediction is consistent with both in vivo measurements ( Nicholson and Setlow, 1990 ) and in vitro single-molecule experiments. Indeed, magnetic tweezers experiments revealed that SpoIIIE supercoils DNA by one turn per 100 ± 10 bp of DNA translocated (Jerod Ptacin and Marcelo Nollman, personal communication). It was previously reported that strand tracking by the φ29 ATPase, another ring-shaped dsDNA motor, also leads to DNA supercoiling ( Liu et al., 2014 ). The results presented here for SpoIIIE suggest that DNA supercoiling may be a general feature of ring-shaped dsDNA motors that track one strand. The amount and direction of supercoiling should depend on the (i) the helical pitch of dsDNA, (ii) the periodicity of motor-DNA contacts (step size), and (iii) the motor's inter-subunit coordination mechanism. 10.7554/eLife.09224.013 Figure 7. Two-subunit DNA escort model. ( a ) Diagram illustrating how SpoIIIE supercoils DNA while tracking the phosphate backbone of one DNA strand. Neighboring subunits in the SpoIIIE hexamer are spaced by 60°; consecutive DNA phosphates are spaced by ∼34°; and the backbone contacts of two adjacent subunits are separated by ∼69°. After a 2-bp translocation step, a 9-degree counter-clockwise rotation of the DNA relative to the motor is needed to align the next translocating subunit and the nearest pair of backbone phosphates. ( b ) Diagram of the SpoIIIE hexamer illustrating how the two-subunit DNA escort model enables the motor to bypass an ATPγS-bound subunit (red). For simplicity, only one DNA strand is shown (orange). DNA is translocated out of the page, and each subunit interacts with two neighboring phosphates. The star marks the subunit slated to execute the power-stroke. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.013 10.7554/eLife.09224.014 Figure 7—figure supplement 1. Assessing the strength of the SpoIIIE–DNA interaction in the presence of different nucleotides. To probe the strength of the motor-DNA interaction in the presence of different nucleotides, we pulled on single SpoIIIE-DNA complexes in a nucleotide-free buffer (Apo state, green), 1mM [ATPγS] (cyan), and 1mM [ADP] (orange) and measured the mean pull force, that is, the average force at which the tether ruptured. Error bars represent the SEM. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09224.014 In vivo measurements indicate that, during B. subtilis sporulation, the DNA is negatively supercoiled by 1 turn per 97 ± 6 bp in the forespore and 1 turn per 140 ± 10 bp in the mother cell ( Nicholson and Setlow, 1990 ). Since SpoIIIE is anchored at the septum during sporulation and the B. subtilis DNA is circular, the two-subunit escort model predicts that SpoIIIE translocation should introduce one negative supercoil in the forespore and one positive supercoil in the mother cell for every ∼80 bp translocated. We surmise that the SpoIIIE mechanism is fine tuned to deliver DNA to the forespore in the appropriate negative supercoiled state, similar to what has been proposed for FtsK ( Saleh et al., 2005 ). This mechanism may help to conserve cellular resources by minimizing the amount of maintenance performed by topoisomerases/gyrases, a strategy that may provide a significant advantage in the harsh conditions that prompt sporulation (i.e., starvation). SpoIIIE/FtsK rings can tolerate non-consecutive inactive subunits The results of ATPγS experiments suggest that SpoIIIE can processively translocate DNA with non-consecutive inactive subunits. This conclusion can be rationalized by the two-subunit DNA escort model proposed above: having two adjacent ATPase subunits simultaneously contact the DNA enables the motor to continue translocating if either of the two subunits is inactive, but not when both are disabled. Figure 7b illustrates how the two-subunit DNA escort model can bypass the ATPγS-bound subunit B: (i) subunit A fires and translocates DNA while subunit B escorts the DNA, (ii) the analog-bound subunit B fails to fire while subunit C was poised to escort the DNA (iii) subunit C then fires and translocates the DNA, handing it over to subunit D. During this step, subunit B, which remains bound to ATPγS, escorts the DNA for subunit C. Our conclusions agree with the results of a single-molecule study by Crozat et al., which found that FtsK hexamers with two diametrically opposed inactive subunits translocated DNA as fast as wildtype hexamers ( Crozat et al., 2010 ). The authors of that study proposed a sequential DNA escort mechanism in which at least three motor subunits contact the DNA at any given time. The ATPγS experiments presented here provide additional evidence that SpoIIIE/FtsK motors can bypass individual inactive subunits. Moreover, the strand-tracking behavior reported here for SpoIIIE strongly favors a model in which ring subunits fire sequentially, a key aspect of the DNA escort mechanism proposed here and in the Crozat et al study. This study presents evidence for a type of inter-subunit coordination in ASCE ring NTPases where subunit firing is highly coordinated around the ring, yet the motor possesses sufficient flexibility to bypass non-consecutive inactive subunits. How is this mechanism optimized for the specific biological task of SpoIIIE? In vivo , SpoIIIE is present in low copy numbers during sporulation, with only two motors responsible for the vital task of chromosome translocation at any given time ( Burton et al., 2007 ; Yen Shin et al., 2015 ). As a result, each SpoIIIE ring functions as a single-molecule bottleneck for this process, where the failure of either motor is likely to be lethal for the cell. The coordination mechanism proposed here can potentially explain how B. subtilis safeguards against the failure of individual motor subunits during sporulation. We speculate that other ASCE motors that also represent single-points of failure may have evolved into similar flexible operations. Materials and methods Sample preparation Biotinylated SpoIIIE constructs were generated by ligating the biotin tag sequence from plasmid Pinpoint Xa-1 (Promega, Madison, WI) to the N terminus of SpoIIIE from plasmid pJB103 ( Bath et al., 2000 ). Protein purification was conducted as described previously with the addition of 2 µM biotin in the liquid cultures ( Ptacin et al., 2008 ). DNA tethers were generated using a 5' biotinylated primer (IDT) to PCR amplify a 21 kb region of lambda phage DNA (NEB) and gel extracted. DNA oligos containing MeP inserts (Gene Link or TriLink BioTechnologies) were ligated to gel-purified DNA fragments: a 9167-bp fragment with the ACT 3'-overhang (amplified from λ DNA and digested with AlwNI), and a biotinylated 3976-bp fragment with the GAA 3'-overhang (amplified from φ29 DNA and digested with BglI). The final ligation product was gel-purified using the QIAEX II kit (Qiagen). Optical tweezers experiments In this study, 2.1 µm streptavidin beads (Spherotech) were blocked for 30 min in 50 mM Tris–HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 4% bovine serum albumin (BSA), w/v and 0.1% Tween-20. Then ∼1 pmol of biotinylated SpoIIIE and ∼1 ng of biotinylated DNA were incubated separately onto streptavidin beads and spatially separated in the fluidics chamber. DNA-bound beads and SpoIIIE-bound beads were brought in close proximity to allow SpoIIIE to engage the DNA. DNA translocation was conducted in a reaction buffer containing 50 mM Tris–HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , and 3 mM ATP. Data analysis Pauses were detected using a modified Schwartz Information Criterion (mSIC) method ( Chistol et al., 2012 ). The number and duration of pauses missed by this algorithm were inferred by fitting the pause durations to a single exponential with a maximum likelihood estimator. After removing the detected pauses, the translocation velocity was computed by fitting the data to a straight line. Force-velocity data ( Figure 6—figure supplement 1a ) was gathered in 'passive-mode' ( Smith et al., 2001 ), where the optical trap position is fixed. Single-molecule trajectories were partitioned into segments spanning 2–3 pN, and the velocity was computed for each segment. Tether tension and extension were converted to contour length using the Worm-Like-Chain approximation with persistence length p=30 nm, and stretch modulus S = 1200 pN·nm ( Baumann et al., 1997 ). Estimating the number and duration of missed pauses The pause-detection algorithm can detect only pauses longer than t c , but it is possible to account for the duration and number of pauses missed by the algorithm. We observe that pauses are drawn from a single-exponential distribution P(t) with a mean pause-duration t. (1) P ( t ) = A · e − t τ The number of all pauses ( N all ), the number of detected pauses ( N det ), and the number of missed pauses ( N miss ) are given below. (2) N a l l = ∫ 0 ∞ P ( t ) · d t = ∫ 0 ∞ A · e − t τ · d t (3) N d e t = ∫ t c ∞ A · e − t τ · d t (4) N m i s s = ∫ 0 t c A · e − t τ · d t The duration of all pauses ( T all ) (5) T a l l = ∫ 0 ∞ t · P ( t ) · d t = ∫ 0 ∞ t · A · e − t τ · d t The duration of detected pauses is T det : (6) T d e t = ∫ t c ∞ t · A · e − t τ · d t The duration of missed pauses: (7) T m i s s = ∫ 0 t c t · A · e − t τ · d t Given the number of detected pauses and the mean pause duration calculated by fitting the pause distribution to a single-exponential, it is possible to infer the number of total pauses and the number of missed pauses as follows: (8) N a l l = N d e t · e t c τ (9) N m i s s = N d e t · ( e t c τ − 1 ) If the pause-detection algorithm identifies and removes only pauses longer than t c , then the measured pause-free velocity ( V meas ) is given by the following expression: (10) V m e a s = D T p f T m i s s Here D is the total distance translocated by the motor, T pf is the 'pause-free' time (i.e. only the time spent translocating DNA), and T miss is the total duration of missed pauses. The true pause-free velocity ( V pf ) is given by the following expression: (11) V p f = D T p f = D D V m e a s − ∫ 0 t c t · A · e − t τ · d t Predicting the density of ATPγS-induced pauses The probability of finding the ring in a pause state P pause (i.e. the fraction of the time spent in the paused state) is: (12) P p a u s e = τ p τ p τ x where t p is the total time the motor spends in a pause state and t x is the total time the motor spends translocating DNA. The total pause time t p and the total translocation time t x can be expressed as (13) τ p = · η = ( 1 / k o f f ) · η (14) τ x = x ( t ) v P F where is the average pause duration, η is the number of pauses, k off is a first-order dissociation rate of ATPγS from the ring, x (t) is distance translocated over time and v PF is the pause-free velocity expressed as: (15) v P F = ∑ i = 0 6 p i v i where p i is the probability of the ring being bound to i ATPγS molecules and v i is the pause-free velocity of the ring bound to i ATPγS molecules. Substituting Equation 14 into Equation 12 , we can express the pausing probability as: (16) P p a u s e = η / x ( t ) η / x ( t ) + k o f f / v P F = P D P D + k o f f / v P F We define the pause density (the number of pauses per distance translocated) as PD = η / x (t) . Thus, the PD can be expressed in terms of the pausing probability ( P pause ), the ATPγS dissociation rate ( k off ), and the pause-free translocation velocity ( v PF ): (17) P D = k o f f v P F · P p a u s e ( 1 − P p a u s e ) The pausing probability ( P pause ) can be expressed in terms of the probability that a single subunit is bound to ATPγS ( p). p depends on the concentrations of ATP and ATPγS, as well as the dissociation constants ( k off /k on ) of ATP and ATPγS ( K ATP and K γS ) for individual ATPase subunits ( Sen et al., 2013 ): (18) p = K A T P [ A T P γ S ] K γ S K A T P K γ S [ A T P ] + K A T P [ A T P γ S ] To calculate the expected pause probability, we used the measured K i of ATPγS (124 ± 20 µM) for K γS ( Figure 6—figure supplement 1b ). For K ATP , we used the measured K m of ATP (505 ± 50 µM) as an upper-bound estimate. For a sequential ordinal ATP binding/hydrolysis inter-subunit coordination model (i.e. subunit 1 binds ATP, hydrolyzes ATP, releases P i and ADP, and executes the power-stroke, followed by subunit 2, then subunit 3, etc), the pausing probability is given by P pause = p n , were n is the number of ATPγS molecules required to induce a pause. Sample preparation Biotinylated SpoIIIE constructs were generated by ligating the biotin tag sequence from plasmid Pinpoint Xa-1 (Promega, Madison, WI) to the N terminus of SpoIIIE from plasmid pJB103 ( Bath et al., 2000 ). Protein purification was conducted as described previously with the addition of 2 µM biotin in the liquid cultures ( Ptacin et al., 2008 ). DNA tethers were generated using a 5' biotinylated primer (IDT) to PCR amplify a 21 kb region of lambda phage DNA (NEB) and gel extracted. DNA oligos containing MeP inserts (Gene Link or TriLink BioTechnologies) were ligated to gel-purified DNA fragments: a 9167-bp fragment with the ACT 3'-overhang (amplified from λ DNA and digested with AlwNI), and a biotinylated 3976-bp fragment with the GAA 3'-overhang (amplified from φ29 DNA and digested with BglI). The final ligation product was gel-purified using the QIAEX II kit (Qiagen). Optical tweezers experiments In this study, 2.1 µm streptavidin beads (Spherotech) were blocked for 30 min in 50 mM Tris–HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 4% bovine serum albumin (BSA), w/v and 0.1% Tween-20. Then ∼1 pmol of biotinylated SpoIIIE and ∼1 ng of biotinylated DNA were incubated separately onto streptavidin beads and spatially separated in the fluidics chamber. DNA-bound beads and SpoIIIE-bound beads were brought in close proximity to allow SpoIIIE to engage the DNA. DNA translocation was conducted in a reaction buffer containing 50 mM Tris–HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , and 3 mM ATP. Data analysis Pauses were detected using a modified Schwartz Information Criterion (mSIC) method ( Chistol et al., 2012 ). The number and duration of pauses missed by this algorithm were inferred by fitting the pause durations to a single exponential with a maximum likelihood estimator. After removing the detected pauses, the translocation velocity was computed by fitting the data to a straight line. Force-velocity data ( Figure 6—figure supplement 1a ) was gathered in 'passive-mode' ( Smith et al., 2001 ), where the optical trap position is fixed. Single-molecule trajectories were partitioned into segments spanning 2–3 pN, and the velocity was computed for each segment. Tether tension and extension were converted to contour length using the Worm-Like-Chain approximation with persistence length p=30 nm, and stretch modulus S = 1200 pN·nm ( Baumann et al., 1997 ). Estimating the number and duration of missed pauses The pause-detection algorithm can detect only pauses longer than t c , but it is possible to account for the duration and number of pauses missed by the algorithm. We observe that pauses are drawn from a single-exponential distribution P(t) with a mean pause-duration t. (1) P ( t ) = A · e − t τ The number of all pauses ( N all ), the number of detected pauses ( N det ), and the number of missed pauses ( N miss ) are given below. (2) N a l l = ∫ 0 ∞ P ( t ) · d t = ∫ 0 ∞ A · e − t τ · d t (3) N d e t = ∫ t c ∞ A · e − t τ · d t (4) N m i s s = ∫ 0 t c A · e − t τ · d t The duration of all pauses ( T all ) (5) T a l l = ∫ 0 ∞ t · P ( t ) · d t = ∫ 0 ∞ t · A · e − t τ · d t The duration of detected pauses is T det : (6) T d e t = ∫ t c ∞ t · A · e − t τ · d t The duration of missed pauses: (7) T m i s s = ∫ 0 t c t · A · e − t τ · d t Given the number of detected pauses and the mean pause duration calculated by fitting the pause distribution to a single-exponential, it is possible to infer the number of total pauses and the number of missed pauses as follows: (8) N a l l = N d e t · e t c τ (9) N m i s s = N d e t · ( e t c τ − 1 ) If the pause-detection algorithm identifies and removes only pauses longer than t c , then the measured pause-free velocity ( V meas ) is given by the following expression: (10) V m e a s = D T p f T m i s s Here D is the total distance translocated by the motor, T pf is the 'pause-free' time (i.e. only the time spent translocating DNA), and T miss is the total duration of missed pauses. The true pause-free velocity ( V pf ) is given by the following expression: (11) V p f = D T p f = D D V m e a s − ∫ 0 t c t · A · e − t τ · d t Predicting the density of ATPγS-induced pauses The probability of finding the ring in a pause state P pause (i.e. the fraction of the time spent in the paused state) is: (12) P p a u s e = τ p τ p τ x where t p is the total time the motor spends in a pause state and t x is the total time the motor spends translocating DNA. The total pause time t p and the total translocation time t x can be expressed as (13) τ p = · η = ( 1 / k o f f ) · η (14) τ x = x ( t ) v P F where is the average pause duration, η is the number of pauses, k off is a first-order dissociation rate of ATPγS from the ring, x (t) is distance translocated over time and v PF is the pause-free velocity expressed as: (15) v P F = ∑ i = 0 6 p i v i where p i is the probability of the ring being bound to i ATPγS molecules and v i is the pause-free velocity of the ring bound to i ATPγS molecules. Substituting Equation 14 into Equation 12 , we can express the pausing probability as: (16) P p a u s e = η / x ( t ) η / x ( t ) + k o f f / v P F = P D P D + k o f f / v P F We define the pause density (the number of pauses per distance translocated) as PD = η / x (t) . Thus, the PD can be expressed in terms of the pausing probability ( P pause ), the ATPγS dissociation rate ( k off ), and the pause-free translocation velocity ( v PF ): (17) P D = k o f f v P F · P p a u s e ( 1 − P p a u s e ) The pausing probability ( P pause ) can be expressed in terms of the probability that a single subunit is bound to ATPγS ( p). p depends on the concentrations of ATP and ATPγS, as well as the dissociation constants ( k off /k on ) of ATP and ATPγS ( K ATP and K γS ) for individual ATPase subunits ( Sen et al., 2013 ): (18) p = K A T P [ A T P γ S ] K γ S K A T P K γ S [ A T P ] + K A T P [ A T P γ S ] To calculate the expected pause probability, we used the measured K i of ATPγS (124 ± 20 µM) for K γS ( Figure 6—figure supplement 1b ). For K ATP , we used the measured K m of ATP (505 ± 50 µM) as an upper-bound estimate. For a sequential ordinal ATP binding/hydrolysis inter-subunit coordination model (i.e. subunit 1 binds ATP, hydrolyzes ATP, releases P i and ADP, and executes the power-stroke, followed by subunit 2, then subunit 3, etc), the pausing probability is given by P pause = p n , were n is the number of ATPγS molecules required to induce a pause. Funding Information This paper was supported by the following grants: http://dx.doi.org/10.13039/100000011 Howard Hughes Medical Institute to Carlos Bustamante. http://dx.doi.org/10.13039/100000002 National Institutes of Health R01GM071552 to Carlos Bustamante. http://dx.doi.org/10.13039/100000002 National Institutes of Health R01GM032543 to Carlos Bustamante. http://dx.doi.org/10.13039/100000015 U.S. Department of Energy DE-AC02-05CH11231 to Carlos Bustamante. Additional information Competing interests The authors declare that no competing interests exist. Author contributions NL, Conception and design, Acquisition of data, Analysis and interpretation of data, Drafting or revising the article. GC, Conception and design, Acquisition of data, Analysis and interpretation of data, Drafting or revising the article. CB, Conception and design, Drafting or revising the article.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6397389/

Downregulation of GATA6 in mTOR-inhibited human aortic endothelial cells: effects on TNF-α-induced VCAM-1 expression and monocytic cell adhesion

Increased expression of vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) on the aortic endothelium is an early marker of atherogenesis, promoted in part by elevated levels of inflammatory cytokines such as TNF-α. Mammalian target of rapamycin (mTOR) is a ubiquitous signaling molecule that has been considered to contribute to diverse cellular processes through mTOR complex 1 (mTORC1) or complex 2 (mTORC2). This study aimed to elucidate the role of mTOR signaling in TNF-α-induced VCAM-1 expression by the arterial endothelium. Primary human aortic endothelial cells (HAECs) were treated with low-dose (0.1 ng/ml) TNF-α, and VCAM-1 expression was measured by real-time quantitative PCR, Western blot analysis, and flow cytometry. Inhibition of mTOR through siRNA-mediated depletion or treatment with chemical inhibitors rapamycin or torin 1 suppressed VCAM1 transcription, which translated to inhibition of VCAM-1 surface expression by HAECs and concomitant decreased adhesion of monocytes. A promoter luciferase assay and chromatin immunoprecipitation indicated that mTOR regulated VCAM1 transcription through a mechanism involving transcription factor GATA6. Activation of PKC-α and an increase in miR-200a-3p expression, caused by mTOR inhibition but not disruption of mTORC1 or mTORC2 singly or together, decreased TNF-α-induced GATA6 expression and its enrichment at the VCAM1 promoter. In conclusion, mTOR inhibition activates PKC-α independently of disruption of mTORC1 and/or mTORC2, which challenges the conventional wisdom regarding mTOR signaling. Moreover, mTOR signals through transcriptional and posttranscriptional mechanisms to elicit maximal cytokine-induced endothelial inflammation that precedes atherosclerosis. NEW & NOTEWORTHY Both mammalian target of rapamycin (mTOR) complex 1 (mTORC1) and mTORC2 contribute to PKC-α activation in the human aortic endothelium. Inhibition of mTOR is not equivalent to disruption of mTORC1 and/or mTORC2 in affecting human aortic endothelial cell signaling. Specifically, inhibition of mTOR causes PKC-α activation and miR-200a-3p upregulation, which independently suppresses TNF-α-induced transcription factor GATA6 expression and subsequently inhibits VCAM-1 expression and monocytic cell adhesion onto the aortic endothelium.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2663168/

Killed but Metabolically Active Bacillus anthracis Vaccines Induce Broad and Protective Immunity against Anthrax ▿

Bacillus anthracis is the causative agent of anthrax. We have developed a novel whole-bacterial-cell anthrax vaccine utilizing B. anthracis that is killed but metabolically active (KBMA). Vaccine strains that are asporogenic and nucleotide excision repair deficient were engineered by deleting the spoIIE and uvrAB genes, rendering B. anthracis extremely sensitive to photochemical inactivation with S-59 psoralen and UV light. We also introduced point mutations into the lef and cya genes, which allowed inactive but immunogenic toxins to be produced. Photochemically inactivated vaccine strains maintained a high degree of metabolic activity and secreted protective antigen (PA), lethal factor, and edema factor. KBMA B. anthracis vaccines were avirulent in mice and induced less injection site inflammation than recombinant PA adsorbed to aluminum hydroxide gel. KBMA B. anthracis -vaccinated animals produced antibodies against numerous anthrax antigens, including high levels of anti-PA and toxin-neutralizing antibodies. Vaccination with KBMA B. anthracis fully protected mice against challenge with lethal doses of toxinogenic unencapsulated Sterne 7702 spores and rabbits against challenge with lethal pneumonic doses of fully virulent Ames strain spores. Guinea pigs vaccinated with KBMA B. anthracis were partially protected against lethal Ames spore challenge, which was comparable to vaccination with the licensed vaccine anthrax vaccine adsorbed. These data demonstrate that KBMA anthrax vaccines are well tolerated and elicit potent protective immune responses. The use of KBMA vaccines may be broadly applicable to bacterial pathogens, especially those for which the correlates of protective immunity are unknown.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3614743/

The Post-Antibiotic Era: Promising Developments in the Therapy of Infectious Diseases

An overview of investigational antibiotics highlights that antimicrobial drug development is slower than the emergence and spread of resistant strains. In the last three decades only two antibiotics belonging to truly new classes have been introduced into the market, i.e. linezolid and daptomycin. This situation is fostering a huge amount of research aimed at the development of novel molecules and novel antibacterial approaches. The present review details the state of the art research in the fields of antimicrobial peptides, antivirulence factors, bacteriophages, and antibodies as possible replacements or enhancers of classic antibiotics. If the number of new antibacterials in phase II or III of clinical trials remains disappointing, it seems nonetheless reasonable to expect major breakthroughs, made possible by the synergistic use of computational methods and chemical and biological research. INTRODUCTION After 60 years of use, antibiotics are progressively decreasing their efficacy against infections. Extremely multi-resistant bacteria, such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-resistant Enterococcus faecium , and fluoroquinolone-resistant Pseudomonas aeruginosa , take a consistent death toll. According to the Infectious Diseases Society of America, it is estimated that in US hospitals more people die of MRSA infection than of AIDS and tuberculosis combined ( 1 ). The emergence of resistant bacteria is generated by the strong evolutionary pressure inherent to the mechanism of action of antibiotics and to their increasingly wide-spread use. On the other hand, the cost and the difficulty to identify, characterize and licence new antibiotics has progressively and dramatically lowered the number of new antibacterial agents approved for marketing. In the last 30 years only two antibiotics with a novel mechanism of action, both active against Gram-positive cocci, have been introduced into the market: linezolid, a oxazolidinone that inhibits protein synthesis, and daptomycin, a cyclic lipopeptide that depolarizes cytoplasmic membranes ( 2 ). New hope comes from the discovery that a huge range of natural products may be developed as novel antimicrobial agents. After the discovery of the antibacterial activity of polymixins, basic and applied research is extensively investigating the field of antimicrobial peptides (AMPs), that are produced by species of all kingdoms, ranging from bacteria, fungi and plants to mammals and non-mammalian vertebrates. Hundreds of these peptides possess direct antimicrobial activity against bacteria, fungi, eukaryotic parasites and/or viruses, and some of them are being developed to obtain more active synthetic or semi-synthetic analogues ( 3 ). In recent years the complete sequencing of many bacterial genomes and the availability of new molecular biology techniques such as proteomics, genomics and RNA inhibition led to new insights on host-pathogen interactions. Progressive identification and thorough characterization of many bacterial functions that concur to the virulence of a given bacterial strain make the possibility to target virulence factors quite real and very attractive. The search for anti-virulence factors, including synthetic substances and many natural products derived from animal, vegetal, mycological and bacterial sources, is a rapidly growing field. Other promises come from the possibility to use natural or engineered antibodies as antimicrobial tools, and from bacteriophages, that are already currently used worldwide to control bacterial growth in the food industry. Their medical use in the treatment of bacterial infections, by now limited to Eastern Europe and to the former Soviet Union, is earning a renewed interest in Western countries ( 4 ). The scope of this brief review is to provide a survey of the most recent work that is being performed to identify and bring into clinical use antibacterial molecules that differ from classic antibiotics for their innovative mechanism of action. The paper deals with the recent insights on antimicrobial peptides, antivirulence factors, antibodies and bacteriophages, focusing on the mechanisms of these new strategies but avoiding extensive molecule lists, that anyway would become obsolete in the next few months. Considering the ever-increasing technical breakthroughs, it can be envisaged that in the next two decades some molecules belonging to the above indicated categories will become useful therapeutic tools. ANTIMICROBIAL PEPTIDES The concept of using AMPs as therapeutic tools was first introduced in the late 1990s, however none of them has yet reached the market ( 5 ). AMPs are evolutionary conserved factors ( 6 ) with pleiotropic activities and intriguing potential: they participate to the innate immune response representing the first line of defence against pathogens, and combine antimicrobial activity with angiogenic, immunomodulating and anti-inflammatory properties ( 7 ). Based on their electrical charge, AMPs can be divided into anionic peptides rich in glutamic and aspartic acid (maximins H5 from amphibians, dermicidins from humans), and into the most thoroughly studied cationic peptides (CAMPs). According to their molecular and conformational structure, in turn CAMPs can be divided into four classes: cysteine-rich β-sheet structures with one or more disulphide bonds (defensins from humans); linear α-helical peptides without disulphide bonds (cecropins, magainin, dermaseptin from amphibians, LL37 from humans); loop-structured peptides (microcins from Enterobacteriaceae ) ( 8 ), and extended tryptophan-rich peptides (cathelicins, indolicidin) ( 9 ). Another AMP class includes peptidoglycan recognition proteins (PGRPs), that have been identified at first in the silkworm ( 10 ) and subsequently in insects, humans ad mice ( 11 ), but are not currently being developed as antibacterial drugs. A broad review of the fifteen hundred AMPs identified over the last 20 years is beyond the scope of this review: we will focus on some of them and on their possible use in antimicrobial therapy. The exact mechanism of action of CAMPs has yet to be established, but according to the most accepted model the initial phase is common and consists in an electrostatic interaction with the target cell. Subsequently, two kinds of mechanisms have been defined: the rapid disorganization of the cytoplasmic membrane, that takes seconds to minutes, and the binding of the molecules to intracellular targets, that takes more time (3-5 hours). Defensins, produced by vertebrates, plants and insects, are active against a broad spectrum of bacteria, fungi, protozoa and enveloped viruses ( 12 ). The development of human defensins for therapeutic use has been hindered by different and as yet unsolved problems, such as the technical challenge of producing them at the scale and purity required for a pharmaceutical product, their ability to stimulate the immune system, and their direct toxicity on mammalian cell membranes ( 12 ). However plectasin, a defensin produced by the fungus Pseudoplectania nigrella , shows good activity against a broad spectrum of Gram-positive bacteria, and low cytotoxicity against mammalian cells. The molecule, whose mechanism of action involves the binding to the bacterial cell wall precursor lipid II, is currently under development by Novozymes A/S ( 13 ). Cecropins and magainins kill microorganisms by membrane permeabilization, with a detergent-like effect accompanied by pore formation. ( 14 - 16 ). This mechanism is quite rapid, concentration dependent and, most important, it does not need the interaction with a specific receptor, thus avoiding the induction of resistance. CAMP specificity of action depends upon the differences in the composition and physicochemical properties of germ and host cell membranes. For example, magainin induces pore formation in bacterial membranes rich in anionic phospholipids, but not in animal cell membranes, rich in neutral phospholipids and further stabilized by cholesterol. Microcins are antibacterial peptides, mainly secreted by E. coli species, involved in the regulation of microbial competition within the intestinal microbiota. These molecules exert potent antibacterial activity being active in the nanomolar range, and have a peculiar mechanism of action defined as a "Trojan horse" behaviour: they are recognized as siderophores by outer membrane receptors of susceptible bacteria and internalized; once inside the cell they bind essential enzymes or interact with the inner membrane killing the bacterium ( 17 ). Originally isolated from bovine neutrophils, indolicidin is a CAMP rich in tryptophan and proline residues. It is believed that indolicidin performs its action reaching bacterial cytoplasm, where its amphipathicity allows its interaction with other proteins, and its cationic surface allows its interaction with both the negatively charged bacterial membranes and the negatively charged phosphate backbone of DNA ( 18 ). Indolicidin is a highly potent antibacterial, but its cytotoxicity barred its therapeutic use. However, less toxic novel derivatives showing promising pharmaceutical potential are currently under development. Omiganan, a synthetic indolicidin homologue, has demonstrated in vitro activity against a wide range of Gram-positive and Gram-negative bacteria and fungi. It is now under clinical development for the prevention of catheter-related infections and for the treatment of acne and rosacea ( 9 ). Mechanisms underlying the specificity of action against Gram-positive or Gram-negative bacteria are still poorly understood. It seems that the killing of Gram-negative bacteria relies upon the ability to cross their external membrane. Some CAMPs interact with membrane or cytoplasmatic receptors targeting intracellular proteins, such as heat shock proteins ( 19 , 20 ). A number of CAMPs have been tested or developed for clinical use, especially for topic treatments ( 21 ). The first that has reached the phase III trials is Pexiganan, a magainin II homologue. It was evaluated as an antibiotic cream for foot ulcers, but it was refused a license by the U.S. FDA in 1999 for questionable efficacy ( 9 ). Iseganan, a protegrin I homologue, was tested against oral mucositis, but also failed the efficacy test. Bloodstream infections arising from multidrug-resistant strains are an increasingly alarming threat, especially in immunocompromised patients. Four promising peptides, available for i.v. administration only, are currently under investigation: dalbavancin, a novel semisynthetic lipoglycopeptide that inhibits cell wall synthesis and is especially active against MRSA, is undergoing phase III clinical trials for skin and soft tissue infections and catheter-related bloodstream infections ( 22 ); telavancin and oritavancin, that share their mechanism of action with dalbavancin; human lactoferrin 1-11, that is being tested in patients with Staphylococcus epidermidis bacteremia and in patients with candidemia ( 23 ). To date, most clinical trials have focused on the topical use of peptides, as the oral and i.v. administration routes pose two orders of challenges: the limited stability of the molecules inside the host, where they are exposed to degradation by intestinal, tissue and serum proteases, and the still unknown toxicology. Possible side effects could manifest as direct and immediate cellular damage or as a delayed effect on the immune response. These issues, currently under extensive investigation, are the main causes of the delay of the AMP availability for clinical use. ANTIVIRULENCE FACTORS Most traditional antibiotics target processes essential for in vitro growth, with the implicit assumption that the same processes are essential for in vivo growth also. However, recent work performed on fatty acid biosynthesis inhibitors evidences that in some cases there is a potential disparity between requirements for in vivo and in vitro bacterial survival ( 24 ). Bacterial functions that cause disease in vivo usually fall into two categories: those required for in vivo survival, that in some cases may be also essential for in vitro survival, and those that cause tissue damage and disease. The latter, together with factors that interfere with host immune functions, are classically considered virulence factors. Virulence factor targeting compounds have at least two advantages over classic antibiotics: firstly, they do not exert a selective pressure on bacteria, as they do not target genes essential for bacterial viability in vitro , but only affect functions essential for host/pathogen interaction; secondly, the specificity of the effect should preserve the normal flora constituted by non-virulent resident bacteria ( 25 ). Another possible advantage is that the host, being exposed to intact but harmless bacteria, will develop a sound immune response against a possible reinfection by the virulent form ( 26 ). The relevance of the approach based on virulence factor targeting is underscored by the remarkable amount of correlated research, that is producing the first practical results. Recently, Nielsen et al . have developed a new simple assay to screen compounds that affect Staphylococcus aureus virulence gene expression ( 27 ). On the other hand, the identification of antivirulence molecules poses two orders of challenges: i) to identify targets that are constitutively expressed by bacteria, and ii) the availability of standardized functional assays that should mimic the in vivo conditions of the infectious process, considering that by definition virulence inhibitors will not kill bacteria in vitro ( 24 ). Moreover, the clinical use of such drugs would rely on rapid diagnostic methods, because the specificity of action is linked to a limited spectrum of activity. However, the recent availability of many thoroughly sequenced bacterial genomes makes it possible the selection of antivirulence factors active against conserved targets common to different bacterial species. The two main early steps in the establishment of an infection involve pathogen adhesion to the host and the successive pathogen replication, i.e. the host colonization. Bacterial adhesion has been thoroughly studied in relation to E. coli urinary tract infections. It has been observed that the prevalence and degree of bacterial adherence to uroepithelial cells are closely associated with the clinical category of urinary tract infections. Of isolates from patients with pyelonephritis, or bacteremia, 70 to 100% adhere to uroepithelial cells (with a mean of approximately 30 bacteria per cell), compared with 50 to 60% of strains (with about 20 bacteria per cell) among cystitis patient isolates, 22 to 36% of strains (with about 10 bacteria per cell) among asymptomatic bacteriuria patient isolates, and 10 to 36% of fecal strains (with about seven bacteria per cell) ( 28 ). Adhesion and colonization are the result of a complicate interplay between the germ virulence factors and the early immune mechanisms of the hosts, and their neutralization should allow the early interruption of the infectious process. A different antivirulence approach consists in the inhibition of specific bacterial toxins, that mediate the bulk of pathology observed in several types of bacterial infections. Inhibitors of adhesion Bacterial adhesion to host cells can be mediated by protein molecules present on the surface of the bacterium or by proteinaceous short filaments called pili or fimbriae protruding from the bacterial surface. Gram-positive bacteria such as Staphylococci possess many different cell-wall anchored proteins that play key roles in the infection process, as they mediate bacterial binding to the host cells, acquire essential nutrients, and circumvent the immune respose ( 29 ). The mechanism involved in the anchoring of these proteins to the cell-wall is conserved in almost the entire class of Gram-positive bacteria, and is mediated by a class of cysteine transpeptidases called sortases, that are by now considered an attractive potential target for specific inhibitors. A number of different strategies, such as screening natural products and small compounds libraries, or synthesizing rationally designed peptidomimetics, have been employed to search for sortase inhibitors. Recently Suree et al . have identified two promising small molecules that inhibit S. aureus SrtA sortase but do not impair bacterial growth in vitro ( 30 ). Pili, that are considered the major mediators of bacterial adhesion, are produced by many Gram-negative bacteria, including Neisseriae and fermenting and non-fermenting rods. Genome sequencing of meningococci led to the discovery of several other adhesins, which are normally expressed at low levels in vitro and could be up-regulated in vivo , but their potential roles in pathogenesis remain to be fully defined ( 31 ). In this section we will now deal more in detail with E. coli pili and their inhibitors, because this system is the most investigated and the one that shows the possibility of most promising developments in the immediate future. E. coli adhesion can be prevented by the inhibition of pili formation or of pili binding to the surface of mammalian cells. Pili are multi-protein fibers, that are assembled in the periplasmic space via a highly conserved mechanism called the chaperone-usher pathway, common to different Gram-negative species such as E. coli, P. aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Haemophilus influenzae, and Bordetella pertussis ( 26 ). Beyond type 1 pili, uropathogenic E.coli (UPEC) produce type P pili, more frequent in pyelonephritis-associated strains, and curli, i.e. extracellular amyloid fibers that are major components of the bacterial extracellular matrix ( 32 ). It has been demonstrated that pili- and curli-expressing E. coli adhere better to uroepithelial cells than non-piliated or non-curliated strains do ( 33 ). Small synthetic compounds of the family of N-substituted amino acid derivatives and substituted bicyclic 2-pyridones, called pilicides, have been developed on the basis of the known molecular details of the interaction of pili subunits with the chaperone proteins ( 26 ). By competitively inhibiting the chaperone protein function, pilicides dose-dependently decreased type 1 pili production by UPEC. Pilicides share a common chemical lineage with FN075 and BibC6, two ring-fused 2-pyridones that inhibit curli biogenesis by preventing the polymerization of the major curli subunit protein CsgA ( 34 ). Biological evaluation showed that the reduction of pili consistently correlated with the loss of UPEC's ability to colonize bladder cells and to form biofilms ( 26 ). Curli reduction significantly attenuated UPEC virulence in a murine model of urinary tract infection ( 34 ). Another possibility to inhibit fimbriated E. coli adhesion to cells involves the use of a new family of well defined small macromolecules, called glycodendrimers. These molecules mimic glicans present on the surface of mammalian cells and prevent adhesion by binding to pili ( 35 ). The potential clinical applications of these approaches are currently investigated, and these studies can be considered a first step in the development of new therapeutic tools. Inhibitors of colonization In many instances the successful establishment of an infection depends upon the ability of the involved bacteria to form biofilms, i.e. large colonies of bacteria that adhere to biotic or abiotic surfaces and behave as an organized community reacting to small diffusible signal molecules termed autoinducers or quorum sensors ( 36 ). Gram-negative bacteria mainly produce acyl-homoserine lactone (AHL) autoinducers, whereas Gram-positive bacteria use a two-component sensory system and oligopeptide autoinducers ( 37 ). Quorum sensors are constitutionally produced and secreted by bacteria, and when their concentration reaches a threshold value that depends upon bacterial population density (quorum), they interact with species-specific receptors belonging to the LuxR family of response regulators. LuxR homologues contain two domains, an AHL-binding domain and a DNA-binding domain, that upon ligand binding acts as a transcriptional activator. The whole system is termed quorum sensing (QS). QS systems generally offer three points of attack: the signal generation, the signal molecule, and the signal receptor. In vitro AHL production blockage has been achieved by the use of substrate analogues, such as L/D-S-adenosylhomocysteine, sinefungin and butyryl-S-adenosylmethionine ( 38 ), but none of them have been tested on bacteria in vivo . Halogenated furanones C30 and C56 can reduce bacterial adherence to catheters and increase P. aeruginosa clearance in a murine model of pneumonia ( 37 ). In 2008 Skindersoe et al . performed a screening of 12 antibiotics for their inhibitory activity on P. aeruginosa QS. Their results indicate that aztreonam (AZM), ceftazidime and ciprofloxacin are very active in decreasing the expression of QS-regulated virulence factors by altering the cell membrane permeability ( 39 ). In vitro AZM at 2 mcg/ml down-regulated the expression of 277 P. aeruginosa genes and reduced AHL production by more than 70%. The second possible strategy, i.e. QS signal inactivation, can be achieved by chemical or enzymatic degradation of the molecule, or by its antibody-mediated functional inactivation. A simple way to inactivate AHL is to break the lactone ring by increasing the pH to above 7. This strategy is adopted by a number of plants against invading bacteria. Enzymatic lactonolysis is instead operated by bacteria of the genus Bacillus , and by Arthrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Agrobacterium tumefaciens , and Rhodococcus sp. It seems that the production of AHL-degrading enzymes is employed by these bacteria in the competition with AHL producers ( 40 ). In theory, these enzymes could be used in therapy, but the drawback is that the lactonolysis reaction is reversible at acidic pH, regardless of the method used to open the lactone ring, and the pH of the milieu in inflammation sites tends to be acid. However, the lactone ring is not the only site of the AHL molecule that can be chemically targeted. It has been shown that oxidized halogen compounds, such as hypobromous and hypochlorous acids, interfere with QS-controlled gene expression. The possibility to inactivate the QS signal by means of antibodies has been explored by Miyairi et al . ( 41 ). These Authors observed that mice immunized by subcutaneous injection of 3-oxo-C 12 -HSL-BSA conjugate produced significant amounts of specific antibody in serum and showed a significant increase of survival upon intrapulmonary challenge with a P. aeruginosa suspension. The third and most investigated strategy to interfere with bacterial QS is the classical pharmacological approach to receptor antagonism. Historically, the first examples of QS-blocking compounds were the halogenated furanones produced by the australian microalga Delisea pulchra ( 42 ). In order to obtain more active compounds, a screening of synthetic analogues and a structure-function analysis were performed by different groups ( 43 ). The results showed that C-30 and C-56 furanones were the most effective in reducing QS-related gene expression of P. aeruginosa , and in a mouse model of pulmonary infection both compounds induced a significantly faster clearance of bacteria ( 44 , 45 ). Another extensively explored possibility is to displace AHL signal molecules with inactive AHL analogues obtained by chemical modification of the acyl side chain of the molecule, or of the lactone ring, or of both. It has been observed that the modification of the length of the acyl chain does not affect AHL activity, but results in the production of AHL competitive agonists. However, competitive AHL analogues have been obtained by replacing the C-3 atom with sulphur in the acyl side chain, or by placing aryl substituents at the end of the side chain ( 46 ). Molecules more chemically unrelated to AHL, such as 3-oxo-C12-(aminocyclohexanone) also possess QS inhibiting activity. Several QS inhibitors unrelated to the signal molecules have been identified screening random compound libraries ( 47 ). Among these, 4-nitro-pyridine- N -oxide (4-NPO) significantly lowers the expression of 37% of the QS-regulated genes in P. aeruginosa . Beyond the above cited halogenated furanone from Delisea pulchra , a number of plant extracts and natural compounds inhibiting P. aeruginosa QS has been identified by Rasmussen et al ( 48 , 49 ): bean sprout, chamomile, carrot, garlic, habanero ( Capsicum chinensis ), propolis, water lily, yellow pepper, and two products of Penicillium fungi, patulin and penicillic acid. These Authors further investigated the effects of garlic extract, which contains at least three different QS inhibitors and was able to inhibit QS in a concentration-dependent manner. GeneChip analysis revealed that garlic extract had a profound effect on QS-regulated virulence genes, significantly reduced P. aeruginosa biofilm tolerance to tobramycin, and lowered the pathogenicity of P. aeruginosa in a Caenorhabditis elegans nematode model. The phytoalexin resveratrol (3,5,4'-trihydroxystilbene), an antifungal agent found in grapes and other plants, shows direct antibacterial activity against Neisseria gonorrhoeae and N. meningitidis , but not against P. aeruginosa ( 50 ). However, we observed that resveratrol can inhibit P. aeruginosa QS in vitro ( 51 ). Finally, solenopsin A, a venom alkaloid from the fire ant Solenopsis invicta , has been shown to be able to interfere with P. aeruginosa QS ( 52 ). Inhibitors of toxin production and secretion In many instances toxins have a direct role in causing diseases. Therefore, toxin transcription, expression, and function would make excellent targets for novel antimicrobials. The efficacy of the inhibition of toxin transcription has been demonstrated in a murine model of cholera infection by Hung et al . ( 53 ). These Authors observed that virstatin, an inhibitor of cholera toxin and toxin-coregulated pilus expression, blocked intestinal colonization with Vibrio cholerae . Another example is the efficacy of a synthetic methionyl-tRNA inhibitor, that improved survival in a hamster model of Clostridium difficile infection ( 54 ). The potential use of Bacillus anthracis as a bioweapon by terrorists has prompted the research of anthrax toxin inhibitors. A secreted zinc-dependent metalloprotease, known as lethal factor (LF) because it directly kill host cells, is the major toxin involved in anthrax pathogenesis. A hydroxamate synthesized at Merck Research Laboratories can inhibit LF protease activity in vitro , and protected mice from a challenge with lethal doses of LF or B. anthracis spores ( 55 ). This molecule has been further modified and extensively tested in pharmacological and animal model studies. Several other groups have successfully developed potent LF inhibitors, that are currently under development but none has yet the clinical trial step ( 56 ). Inhibitors of adhesion Bacterial adhesion to host cells can be mediated by protein molecules present on the surface of the bacterium or by proteinaceous short filaments called pili or fimbriae protruding from the bacterial surface. Gram-positive bacteria such as Staphylococci possess many different cell-wall anchored proteins that play key roles in the infection process, as they mediate bacterial binding to the host cells, acquire essential nutrients, and circumvent the immune respose ( 29 ). The mechanism involved in the anchoring of these proteins to the cell-wall is conserved in almost the entire class of Gram-positive bacteria, and is mediated by a class of cysteine transpeptidases called sortases, that are by now considered an attractive potential target for specific inhibitors. A number of different strategies, such as screening natural products and small compounds libraries, or synthesizing rationally designed peptidomimetics, have been employed to search for sortase inhibitors. Recently Suree et al . have identified two promising small molecules that inhibit S. aureus SrtA sortase but do not impair bacterial growth in vitro ( 30 ). Pili, that are considered the major mediators of bacterial adhesion, are produced by many Gram-negative bacteria, including Neisseriae and fermenting and non-fermenting rods. Genome sequencing of meningococci led to the discovery of several other adhesins, which are normally expressed at low levels in vitro and could be up-regulated in vivo , but their potential roles in pathogenesis remain to be fully defined ( 31 ). In this section we will now deal more in detail with E. coli pili and their inhibitors, because this system is the most investigated and the one that shows the possibility of most promising developments in the immediate future. E. coli adhesion can be prevented by the inhibition of pili formation or of pili binding to the surface of mammalian cells. Pili are multi-protein fibers, that are assembled in the periplasmic space via a highly conserved mechanism called the chaperone-usher pathway, common to different Gram-negative species such as E. coli, P. aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Haemophilus influenzae, and Bordetella pertussis ( 26 ). Beyond type 1 pili, uropathogenic E.coli (UPEC) produce type P pili, more frequent in pyelonephritis-associated strains, and curli, i.e. extracellular amyloid fibers that are major components of the bacterial extracellular matrix ( 32 ). It has been demonstrated that pili- and curli-expressing E. coli adhere better to uroepithelial cells than non-piliated or non-curliated strains do ( 33 ). Small synthetic compounds of the family of N-substituted amino acid derivatives and substituted bicyclic 2-pyridones, called pilicides, have been developed on the basis of the known molecular details of the interaction of pili subunits with the chaperone proteins ( 26 ). By competitively inhibiting the chaperone protein function, pilicides dose-dependently decreased type 1 pili production by UPEC. Pilicides share a common chemical lineage with FN075 and BibC6, two ring-fused 2-pyridones that inhibit curli biogenesis by preventing the polymerization of the major curli subunit protein CsgA ( 34 ). Biological evaluation showed that the reduction of pili consistently correlated with the loss of UPEC's ability to colonize bladder cells and to form biofilms ( 26 ). Curli reduction significantly attenuated UPEC virulence in a murine model of urinary tract infection ( 34 ). Another possibility to inhibit fimbriated E. coli adhesion to cells involves the use of a new family of well defined small macromolecules, called glycodendrimers. These molecules mimic glicans present on the surface of mammalian cells and prevent adhesion by binding to pili ( 35 ). The potential clinical applications of these approaches are currently investigated, and these studies can be considered a first step in the development of new therapeutic tools. Inhibitors of colonization In many instances the successful establishment of an infection depends upon the ability of the involved bacteria to form biofilms, i.e. large colonies of bacteria that adhere to biotic or abiotic surfaces and behave as an organized community reacting to small diffusible signal molecules termed autoinducers or quorum sensors ( 36 ). Gram-negative bacteria mainly produce acyl-homoserine lactone (AHL) autoinducers, whereas Gram-positive bacteria use a two-component sensory system and oligopeptide autoinducers ( 37 ). Quorum sensors are constitutionally produced and secreted by bacteria, and when their concentration reaches a threshold value that depends upon bacterial population density (quorum), they interact with species-specific receptors belonging to the LuxR family of response regulators. LuxR homologues contain two domains, an AHL-binding domain and a DNA-binding domain, that upon ligand binding acts as a transcriptional activator. The whole system is termed quorum sensing (QS). QS systems generally offer three points of attack: the signal generation, the signal molecule, and the signal receptor. In vitro AHL production blockage has been achieved by the use of substrate analogues, such as L/D-S-adenosylhomocysteine, sinefungin and butyryl-S-adenosylmethionine ( 38 ), but none of them have been tested on bacteria in vivo . Halogenated furanones C30 and C56 can reduce bacterial adherence to catheters and increase P. aeruginosa clearance in a murine model of pneumonia ( 37 ). In 2008 Skindersoe et al . performed a screening of 12 antibiotics for their inhibitory activity on P. aeruginosa QS. Their results indicate that aztreonam (AZM), ceftazidime and ciprofloxacin are very active in decreasing the expression of QS-regulated virulence factors by altering the cell membrane permeability ( 39 ). In vitro AZM at 2 mcg/ml down-regulated the expression of 277 P. aeruginosa genes and reduced AHL production by more than 70%. The second possible strategy, i.e. QS signal inactivation, can be achieved by chemical or enzymatic degradation of the molecule, or by its antibody-mediated functional inactivation. A simple way to inactivate AHL is to break the lactone ring by increasing the pH to above 7. This strategy is adopted by a number of plants against invading bacteria. Enzymatic lactonolysis is instead operated by bacteria of the genus Bacillus , and by Arthrobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Agrobacterium tumefaciens , and Rhodococcus sp. It seems that the production of AHL-degrading enzymes is employed by these bacteria in the competition with AHL producers ( 40 ). In theory, these enzymes could be used in therapy, but the drawback is that the lactonolysis reaction is reversible at acidic pH, regardless of the method used to open the lactone ring, and the pH of the milieu in inflammation sites tends to be acid. However, the lactone ring is not the only site of the AHL molecule that can be chemically targeted. It has been shown that oxidized halogen compounds, such as hypobromous and hypochlorous acids, interfere with QS-controlled gene expression. The possibility to inactivate the QS signal by means of antibodies has been explored by Miyairi et al . ( 41 ). These Authors observed that mice immunized by subcutaneous injection of 3-oxo-C 12 -HSL-BSA conjugate produced significant amounts of specific antibody in serum and showed a significant increase of survival upon intrapulmonary challenge with a P. aeruginosa suspension. The third and most investigated strategy to interfere with bacterial QS is the classical pharmacological approach to receptor antagonism. Historically, the first examples of QS-blocking compounds were the halogenated furanones produced by the australian microalga Delisea pulchra ( 42 ). In order to obtain more active compounds, a screening of synthetic analogues and a structure-function analysis were performed by different groups ( 43 ). The results showed that C-30 and C-56 furanones were the most effective in reducing QS-related gene expression of P. aeruginosa , and in a mouse model of pulmonary infection both compounds induced a significantly faster clearance of bacteria ( 44 , 45 ). Another extensively explored possibility is to displace AHL signal molecules with inactive AHL analogues obtained by chemical modification of the acyl side chain of the molecule, or of the lactone ring, or of both. It has been observed that the modification of the length of the acyl chain does not affect AHL activity, but results in the production of AHL competitive agonists. However, competitive AHL analogues have been obtained by replacing the C-3 atom with sulphur in the acyl side chain, or by placing aryl substituents at the end of the side chain ( 46 ). Molecules more chemically unrelated to AHL, such as 3-oxo-C12-(aminocyclohexanone) also possess QS inhibiting activity. Several QS inhibitors unrelated to the signal molecules have been identified screening random compound libraries ( 47 ). Among these, 4-nitro-pyridine- N -oxide (4-NPO) significantly lowers the expression of 37% of the QS-regulated genes in P. aeruginosa . Beyond the above cited halogenated furanone from Delisea pulchra , a number of plant extracts and natural compounds inhibiting P. aeruginosa QS has been identified by Rasmussen et al ( 48 , 49 ): bean sprout, chamomile, carrot, garlic, habanero ( Capsicum chinensis ), propolis, water lily, yellow pepper, and two products of Penicillium fungi, patulin and penicillic acid. These Authors further investigated the effects of garlic extract, which contains at least three different QS inhibitors and was able to inhibit QS in a concentration-dependent manner. GeneChip analysis revealed that garlic extract had a profound effect on QS-regulated virulence genes, significantly reduced P. aeruginosa biofilm tolerance to tobramycin, and lowered the pathogenicity of P. aeruginosa in a Caenorhabditis elegans nematode model. The phytoalexin resveratrol (3,5,4'-trihydroxystilbene), an antifungal agent found in grapes and other plants, shows direct antibacterial activity against Neisseria gonorrhoeae and N. meningitidis , but not against P. aeruginosa ( 50 ). However, we observed that resveratrol can inhibit P. aeruginosa QS in vitro ( 51 ). Finally, solenopsin A, a venom alkaloid from the fire ant Solenopsis invicta , has been shown to be able to interfere with P. aeruginosa QS ( 52 ). Inhibitors of toxin production and secretion In many instances toxins have a direct role in causing diseases. Therefore, toxin transcription, expression, and function would make excellent targets for novel antimicrobials. The efficacy of the inhibition of toxin transcription has been demonstrated in a murine model of cholera infection by Hung et al . ( 53 ). These Authors observed that virstatin, an inhibitor of cholera toxin and toxin-coregulated pilus expression, blocked intestinal colonization with Vibrio cholerae . Another example is the efficacy of a synthetic methionyl-tRNA inhibitor, that improved survival in a hamster model of Clostridium difficile infection ( 54 ). The potential use of Bacillus anthracis as a bioweapon by terrorists has prompted the research of anthrax toxin inhibitors. A secreted zinc-dependent metalloprotease, known as lethal factor (LF) because it directly kill host cells, is the major toxin involved in anthrax pathogenesis. A hydroxamate synthesized at Merck Research Laboratories can inhibit LF protease activity in vitro , and protected mice from a challenge with lethal doses of LF or B. anthracis spores ( 55 ). This molecule has been further modified and extensively tested in pharmacological and animal model studies. Several other groups have successfully developed potent LF inhibitors, that are currently under development but none has yet the clinical trial step ( 56 ). ANTIBODIES Antibodies (Abs) are emerging as an important class of therapeutic factors in the field of oncology and infectious diseases ( 57 ). The potential of Abs targeting virulence factors has been shown in animal models of lung infection with P. aeruginosa ( 58 ). The type III secretion system is a virulence mechanism associated with severe disease and increased mortality in patients with ventilator-associated pneumonia caused by P. aeruginosa . The system consists of three separate protein complexes: the secretion apparatus, the translocation or targeting apparatus (PcrV protein), and the secreted toxins with their cognate chaperons. Following positive results obtained in in vitro and in vivo murine models, the efficacy of monoclonal Abs against PcrV is currently under investigation in a phase I/II human trial ( 59 ). The importance of Abs as direct effectors in bacterial killing has been pointed out by studies on the organisms causing Lyme disease and relapsing fever, i.e. Borrelia burgdorferi and B. recurrentis , respectively. Bacteria present in the bloodstream are not affected by complement, because by binding Factor H and C4BP they inhibit both the alternative and the classical complement pathway ( 60 ). However, Abs are required for recovery in both diseases. Indeed, there are numerous Abs that can kill bacteria in a complement-independent manner. The finding that monovalent Fab fragments exert bactericidal effects suggests that agglutination is not involved ( 60 ). The bactericidal function resides in the variable region, that can eliminate the entire serotype population to which it is specific ( 61 ). The direct effect of the antibody on the outer membrane of Borrelia , resulting in the osmotic lysis of the membrane and in bacterial death, mimics the action of many antimicrobial peptides. A different and more sophisticated approach exploits the possibility to produce anti-idiotypic Abs that mimic the effect of AMP. A series of polyclonal and monoclonal recombinant single-chain microbicidal Abs have been produced by idiotypic vaccination with a monoclonal antibody that neutralizes a killer toxin (KT) obtained from Pichia anomala ( 62 ). These anti-idyotipic Abs showed potent in vitro microbicidal activity against pathogenic eukaryotic and prokaryotic microorganisms, such as Candida albicans, Pneumocystis jiroveci, Leishmania major and infantum, Mycobacterium tuberculosis and Gram-positive cocci ( 63 ). Systemic treatments with Abs are however limited by inherent Abs antigenicity. To overcome this problem, taking advantage of the Abs modular domain architecture, alternative reduced formats have been generated, mostly devoid of the Fc region. The study of Abs mimicking the wide-spectrum antimicrobial activity of KT allowed the synthesis of peptides with antifungal, antiviral and antitumor activity ( 57 ). PHAGE THERAPY The first paper concerning bacteriophages was published in 1896, when Hankin reported that a filterable factor present in the waters of the Ganges and Jumna rivers had marked antibacterial activity ( 64 ). About 20 years later Frederick Twort isolated filterable entities capable of destroying bacterial cultures ( 65 ). Twort did not further explore his findings, but two years later Felix d'Herelle, working at the Pasteur Institute in Paris, reported the same phenomenon. d'Herelle identified the new factor as a virus parasitic on bacteria, called it "bacteriophage" and promoted its use in the treatment of bacterial infections ( 66 ). Since then, several studies demonstrated that bacteriophages can be successfully used in the therapy of animal and human bacterial infections ( 67 ), but their human use in Western countries has been hindered so far by cost, safety concerns about injecting phages in the bloodstream, and by the inconsistent outcome of the treatments, often due to the poor characterization of bacteriophage preparations. To be used in therapy to their full potential, phages should be free of direct adverse side effects on the host, should not carry virulence factors or transfer antibiotic resistance genes among bacteria, and should be able to target pathogens but spare commensal bacteria. The state of the art of phage product development has been recently reviewed by Housby and Mann ( 68 ). Phage therapy is already applied in the agricultural, food-processing and fishery industries, and is used for the treatment of bacterial infections in Georgia and Eastern Europe, but there is a need for further carefully controlled empirical data on its efficacy and safety ( 69 ). The most obvious use of bacteriophages consists in the exploitation of their ability to infect and kill susceptible bacteria. This approach has the advantage of the self-amplification of the therapeutic factor at the infection site, that can overcame bacterial defence mechanisms like biofilm formation, but the success of the treatment depends upon many variables that may affect every single step of the lytic bacteriophage replication cycle. The in vivo pharmacokinetics of phages are highly complex ( 70 ), being influenced by the clearance rate of the phages by the immune system of the host and by the fact that bacteria may become phage-resistant by lysogeny or by mutations concerning metabolic steps or surface receptors. Recent experiments performed by Fu et al . ( 71 ) on the efficacy of a bacteriophage cocktail to prevent the formation of P. aeruginosa biofilms on catheters in an in vitro model suggest the potential of the approach, that reduced the number of bacteria by 99.9%, but did not succeed in completely eradicating the bacteria. In our view, the real weakness of this approach resides in the fact that, as is the case with auto-vaccines, to be effective the therapeutic phage should be grown on bacteria isolated from every single patient. This means that results would be quite irreproducible, and, more important, that the process does not fit with the production philosophy of the pharmaceutical industry. A different approach that can overcome these problems involves the use of purified bacteriophage products as anti-infective agents. Bacteriophage endolysins are mureine-degrading enzymes, originally studied and developed to control mucous membrane infections ( 72 ). They work on Gram-positive bacteria only, and have been found active against Bacillus anthracis ( 73 ), Streptococcus pneumoniae ( 74 ) and Streptococcus agalactiae ( 75 ), alone or in combination with conventional antibiotics or lysozyme. Lysins have a short half-life (15-20 min), but their action is so rapid that nanogram quantities of specific lysin can kill specific Gram-positive bacteria in seconds after contact ( 76 , 77 ). Experiments performed on murine models showed that endolysins are per se free of toxicity and, unexpectedly, are not easily inactivated by antibodies ( 78 ). The possible toxic effect of the release of proinflammatory molecules by lysed bacteria has also been addressed. Endotoxin, teichoic and lipoteichoic acids, and peptidoglycan massive release could result in septic shock and multiple organ failure, but so far no side-effects related to lysine-induced bacteriolysis have been reported ( 79 ). According to experiments performed on a murine model, lysins may be able to cure already established infections ( 80 ). Basic applications of endolysins include the elimination of bacteria from mucous membranes, the treatment of bacterial infections, and the biocontrol of bacteria in food. Based on these results and considering that the endolysin target, peptidoglycan, is not present in eukaryotic cells, it can be anticipated that they will also be well tolerated by humans. Phage tail-like bacteriocins, high-molecular-weight molecules produced by a number of Gram-negative bacteria ( 81 ), work by forming pores in the bacterial cell wall, leading to ion loss. Due to their molecular size, bacteriocins are inactive against intracellular bacteria ( 82 ). In recent years a number of studies report experiments performed in vivo on the activity of bacteriophages or their products against Escherichia coli, Enterococcus fecalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae ( 83 ), Pseudomonas aeruginosa ( 84 ), and Yersinia enterocolitica ( 80 ). In some cases, bacteria produce and secrete phage-like molecules to obtain competitive advantages. R-type pyocins are high-molecular-weight bacteriocins carried within the chromosomes of some bacterial species, such as P. aeruginosa , and almost certainly evolved from lysogenic bacteriophages of the Myoviridae family. They bind with their tail fibers to bacterial surface and kill by inserting a core or needle that alters the bacterial membrane. Their mechanism of action, high bactericidal potency (one pyocin particle can kill one bacterium), and focused spectrum suggest that R-type pyocins could be developed as antibacterial agents ( 85 ). CONCLUSIONS Despite the huge amount of basic research currently underway, the number of antibacterials in phase II or III of clinical development remains disappointing. In the last decade the concept of antivirulence factors as a new generation of antibacterial agents became an established theory, and an increasing number of examples of successful applications of such strategy in in vivo animal infection models support the concept in reality ( 24 ). Phage therapy still needs crucial breakthroughs to be accepted in Western countries, whereas AMP and Abs may be considered prototypes of innovative engineered drugs. Several compounds in early development appear promising, but phase II clinical studies are not yet underway ( 1 ). It is possible that over the next 5-10 years the number of approved antibacterials will be similar to that of the past 5 years (about 1 drug per year). However, we can envisage that peptide-based drugs represent an excellent starting material for drug discovery, due to their chemical, physical and conformational diversity ( 86 ). If we consider the huge amount of challenging biological problems that in nature are solved by peptides, and the recent scientific and methodological advances, it seems reasonable to expect major breakthroughs made possible by the synergistic use of computational methods and chemical and biological research ( 86 ). Shape complementarity is a critically important factor in molecular recognition among drugs and their biological receptors. The notion that molecules with similar 3D shapes tend to have similar biological activity has been recognized and implemented in computational drug discovery tools for decades. But the low computational efficiency and the lack of widely accessible software tools limited the use of early shape-matching algorithms. However, recent development of fast and accurate shape comparison tools has changed the landscape, and facilitated the wide spread use of both the ligand-based and receptor-based shape-matching technologies in drug discovery ( 87 ). A first example, showing that some of the challenges concerning peptide-based drugs can be successfully overcome, is the introduction of the T-20 peptide (Fuzeon), that signalled a new era in the AIDS therapy ( 88 ). In our view considering the global scenario, the research in the field of antimicrobials is quite fragmented and not supported by the adequate funding that would allow major breakthroughs or the thorough development of already identified lead compounds. The number of different infectious diseases is large, but bacterial diseases usually do not manifest in great epidemics, at least in developed countries, and the limited number of endemic cases of every single disease is too low to draw the necessary huge investments by the pharmaceutical industry. This situation is not supposed to be going to change in the close future, without the intervention of public funding. CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflict of interest.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7176098/

Expansion of the Transporter-Opsin-G protein-coupled receptor superfamily with five new protein families

Here we provide bioinformatic evidence that the Organo-Arsenical Exporter (ArsP), Endoplasmic Reticulum Retention Receptor (KDELR), Mitochondrial Pyruvate Carrier (MPC), L-Alanine Exporter (AlaE), and the Lipid-linked Sugar Translocase (LST) protein families are members of the Transporter-Opsin-G Protein-coupled Receptor (TOG) Superfamily. These families share domains homologous to well-established TOG superfamily members, and their topologies of transmembranal segments (TMSs) are compatible with the basic 4-TMS repeat unit characteristic of this Superfamily. These repeat units tend to occur twice in proteins as a result of intragenic duplication events, often with subsequent gain/loss of TMSs in many superfamily members. Transporters within the ArsP family allow microbial pathogens to expel toxic arsenic compounds from the cell. Members of the KDELR family are involved in the selective retrieval of proteins that reside in the endoplasmic reticulum. Proteins of the MPC family are involved in the transport of pyruvate into mitochondria, providing the organelle with a major oxidative fuel. Members of family AlaE excrete L-alanine from the cell. Members of the LST family are involved in the translocation of lipid-linked glucose across the membrane. These five families substantially expand the range of substrates of transport carriers in the superfamily, although KDEL receptors have no known transport function. Clustering of protein sequences reveals the relationships among families, and the resulting tree correlates well with the degrees of sequence similarity documented between families. The analyses and programs developed to detect distant relatedness, provide insights into the structural, functional, and evolutionary relationships that exist between families of the TOG superfamily, and should be of value to many other investigators. Introduction Establishing the molecular functions of transport proteins and elucidating their evolutionary relationships can promote breakthroughs in biotechnology, pave the way for the discovery of new drugs, and allow the development of a more comprehensive understanding of the mechanisms responsible for attaining cellular and organismal homeostasis [ 1 , 2 – 6 ]. One of the current efforts in our laboratory is to identify distant relationships between transport proteins and classify their families into Superfamilies. There are more than 1,300 currently recognized TC families from which we have identified over 66 Superfamilies; see the superfamily hyperlink in the Transporter Classification Database (TCDB; http://tcdb.org/ ) [ 7 ]. Transporters play roles in numerous processes essential for life. The Transporter-Opsin-G protein-coupled receptor (TOG) Superfamily is exceptionally diverse, including channels, secondary carriers, and primary active transporters [ 8 ]. Current TOG members are found in all domains of life ( Table 1 ) and have related topologies, usually exhibiting on average 7 or 8 α-helical transmembrane segments (TMSs) that originated from a 4-TMS precursor following a duplication event, often followed by loss of one or more TMSs [ 8 – 10 ]. 10.1371/journal.pone.0231085.t001 Table 1 Properties of representative established members of the TOG superfamily included in this study. Family name ‡ TCDB accession Average protein size (± SD) Typical No. of TMSs Common TMS topology Topology description Domain of life LCT 2.A.43 312 ±76 7 3+4 8 TMS arose by duplication of 4 TMS (4+4). 7 TMS resulted by loss of the N-terminal TMS. Bacteria, Eukaryota TSUP 2.A.102 280 ±57 7–9 4+4 7 TMS arose by loss of the N-terminal TMS. Archaea, Bacteria, Eukaryota 3+4 Sweet 2.A.123 209 ±106 3,7 3+4 7 TMS arose by loss of the N-terminal TMS. 3 arose from 4 TMS with loss of the N-terminal TMS. Archaea, Bacteria, Eukaryota 3 MR 3.E.1 265 ±76 7 3+4 7 TMS arose by loss of the N-terminal TMS. Archaea, Bacteria, Eukaryota HelioR 3.E.3 263 ±31 7 3+4 7 TMS arose by loss of the N-terminal TMS. Bacteria, Eukaryota NiCoT 2.A.52 356 ±70 8 4+4 Duplication of 4 TMS. Archaea, Bacteria, Eukaryota OST 2.A.82 462 ±153 8 4+4 Duplication of 4 TMS. Eukaryota GPCR 9.A.14 429±157 7 3+4 7 TMS arose by loss of the N-terminal TMS. Eukaryota Viruses ‡ Full family names and descriptions can be found in the list of abbreviations and the text. We have improved our methods by incorporating additional requirements to detect distant homology between pairs of transporter families. We rely on the transitivity property of homology (if protein A is homologous to protein B, B is homologous to protein C, and protein C is homologous to protein D, then A is homologous to D) to infer homology between families, where the following requirements should be satisfied by pairs of candidate homologs: 1) significant sequence similarity; 2) topological agreement consistent with the TMS repeat units of the families involved; 3) overlap of the characteristic domains of both families in the alignment, 4) conservation of sequence motifs, and 5) structural similarity consistent with the repeat units of both families if 3D structures are available (See section: Detection of homology between pairs of families). Given the significant growth of publicly available sequence data since our first publication [ 8 ], we also tested the membership of all previously established families to the TOG superfamily. Families PNaS (TC: 2.A.58) and PnuC (TC: 4.B.1) failed to satisfy our stricter criteria and were removed from TOG. The alignments between PNaS homologs and other TOG members failed to satisfy criterion 2 above where the TMSs that aligned were not in agreement with their corresponding repeat units. Family PnuC also failed to satisfy the compatibility of repeat units with other TOG families at both the sequence and 3D structural levels (See discussion in section: Anomalies for previous members of the TOG superfamily). Furthermore, we identified five additional families that met these new requirements and were thus incorporated into the TOG superfamily ( Table 2 ). 10.1371/journal.pone.0231085.t002 Table 2 New families added to the TOG superfamily. Family name ‡ TCDB accession Average protein size (± SD) Typical No. of TMSs Common TMS topology Topology description Domain of Life ArsP 2.A.119 344 ±53 8–13 4+4 8 TMSs resulted by duplication of 4 TMSs. 10 or 12 TMSs arose by insertion of 2 or 4 TMSs between the two 4-TMS halves. †Bacteria, Archaea 4+N+4 KDELR 9.B.191 258 ±59 7–8 4+4 7 TMSs arose by loss of the N-terminal TMS. Eukaryota, Bacteria 3+4 MPC 2.A.105 133 ±32 3 4 3 TMS arose by loss of the N-terminal TMS. Eukaryota 3 AlaE 2.A.104 149 ±22 4 4 Basic repeat unit Bacteria LST 2.A.129 156 ±27 4 4 Basic repeat unit Bacteria, Archaea ‡ Full family names and descriptions can be found in the list of abbreviations and the text. †There are additional topologies observed in family ArsP, for example 4, 3+4 and 3+N+4, where 3 indicates that the corresponding 4-TMS repeat unit lost the N-terminal TMS. Since the first member of the ArsP family (TC: 2.A.119) was functionally characterized [ 11 ], most new members have been annotated as 'putative permease', or 'permease'. Many members have 8 putative TMSs with two internal 4-TMS repeats separated by a hydrophilic loop of variable sizes, but other members may contain extra TMSs in the middle of the protein between the two repeat units, and/or at either the N- or C-termini. Members of the family appear to be restricted to prokaryotes, both bacteria and archaea. Some members are encoded by genes in operons involved in arsenate/arsenite resistance [ 12 ]. Campylobacter jejuni , a pathogen causing gastroenteritis in humans, is prevalent in poultry and is resistant to the organic arsenic compound, roxarsone (4-hydroxy-3-nitrobenzenearsonic acid), which has been used as a food additive in the poultry industry to promote growth. Shen et al. [ 11 ] showed that ArsP contributes to organic arsenic resistance in Campylobacter . Analysis of multiple C . jejuni isolates from various animal species revealed that the presence of an intact arsP gene is associated with elevated resistance to roxarsone. In addition, inactivation of arsP in C . jejuni resulted in a 4-fold reduction in the minimum inhibitory concentration (MIC) of roxarsone and nitarsone compared to the wild-type strain. Furthermore, cloning of arsP into a C . jejuni strain lacking a functional arsP gene led to 8- and 64-fold increases in the MICs of roxarsone and nitarsone, respectively. Neither mutation nor overexpression of arsP affected the MICs of inorganic arsenic including arsenite and arsenate. Moreover, acquisition of the arsP gene in C . jejuni accumulated less roxarsone than the wild type strain lacking the arsP gene. These results indicated that ArsP functions as an efflux transporter for extrusion of organic arsenic and contributes to resistance to these compounds in C . jejuni [ 11 ]. Members of family KDELR (TC: 9.B.191) are involved in the selective retrieval of proteins that reside in the endoplasmic reticulum (ER). The ER-Golgi system has been studied using biochemical, genetic, and electron and light microscopic techniques, leading to an understanding of many aspects of trafficking from the ER to the Golgi apparatus [ 13 ]. This includes some of the signals and mechanisms for selective retention and retrieval of ER resident proteins and export of cargo proteins. Proteins that leave the ER emerge in 'export complexes' or ER 'exit sites' and accumulate in pleiomorphic transport carriers referred to as Vesicular-tubular clusters (VTCs) or ER-Golgi intermediate compartments (ERGIC). These structures then transit from the ER to the Golgi apparatus along microtubules using the dynein/dynactin motor and fuse with the cis cisterna of the Golgi apparatus. Many proteins (including vSNAREs, ERGIC53/p58 and the KDEL receptor) must cycle back to the ER from pre-Golgi intermediates or the Golgi. Murshid and Presley [ 13 ] considered a model suggesting that this cycling occurs via 50-nm COPI-coated vesicles, and in vivo evidence that suggested that retrograde trafficking may occur via tubular structures. Intracellular membrane transport involves the coordinated engagement of a series of organelles and molecular machineries that ensure that proteins are delivered to their correct cellular locations. Due to its central position in the secretory pathway and to the large amounts of signaling molecules associated with it, the Golgi complex plays a role in this regulation. The generation of autonomous signaling by the Golgi complex in response to the arrival of cargo from the ER allows the activation of a series of signaling pathways by the cargo moving from the ER to the Golgi. This regulatory mechanism is called the Golgi control system [ 14 ]. A key player in this control system is the KDEL receptor, which retrieves chaperones back to the endoplasmic reticulum and behaves as a signaling receptor. The KDEL receptor regulates pathways involved in the maintenance of the homeostatic transport apparatus, in particular, of the Golgi complex. Members of family MPC (TC: 2.A.105) are involved in the transport of pyruvate, the end product of glycolysis, into mitochondria. This is an essential process that provides the organelle with a major fuel source. Herzig et al. [ 15 ] reported that MPC is a heterocomplex formed by two members of a family of previously uncharacterized membrane proteins that are conserved from yeast to mammals. Members of the MPC family are in the inner mitochondrial membrane, and yeast mutants lacking MPC proteins show severe defects in mitochondrial pyruvate uptake. Coexpression of mouse MPC1 and MPC2 in Lactococcus lactis promoted transport of pyruvate across the membrane [ 15 ]. MPC1 and MPC2, are essential for mitochondrial pyruvate transport in yeast, Drosophila , and humans [ 16 ]. MPC1 and MPC2 associate to form an ~150-kilodalton complex in the inner mitochondrial membrane. Yeast and Drosophila mutants lacking MPC1 display impaired pyruvate metabolism, with an accumulation of upstream metabolites and depletion of tricarboxylic acid cycle intermediates. Loss of yeast MPC1 results in defective mitochondrial pyruvate uptake, and silencing of MPC1 or MPC2 in mammalian cells impairs pyruvate oxidation. A point mutation in MPC1 provides resistance to a known inhibitor of the mitochondrial pyruvate carrier. Human genetic studies of three families with children suffering from lactic acidosis and hyperpyruvatemia revealed a causal locus that mapped to MPC1, changing single amino acids that are conserved throughout eukaryotes. Thus, MPC1 and MPC2 form an essential part of the mitochondrial pyruvate carrier [ 16 ]. MPCs have been reviewed from historical and functional standpoints [ 17 ]. Members of family AlaE (TC: 2.A.104) are involved in the excretion of L-alanine from the cell. A mutant that is hypersensitive to L-alanyl-L-alanine from a non-L-alanine-metabolizing E . coli strain lacks an inducible L-alanine export system and accumulates intracellular L-alanine with a reduction in the L-alanine export rate. When the mutant was used to clone genes that complement the dipeptide-hypersensitive phenotype, two uncharacterized genes, ygaW and ytfF , and two characterized genes, yddG and yeaS , were identified [ 18 ]. Overexpression of each gene in the mutant resulted in a decrease in the intracellular L-alanine level and enhancement of the L-alanine export rate in the presence of the dipeptide, suggesting that their products function as exporters of L-alanine. Since ygaW had the most striking impact on both the intra- and extracellular L-alanine levels among the four genes identified, Hori et al. [ 18 ] disrupted the ygaW gene in the non-L-alanine-metabolizing strain. The resulting isogenic mutant showed the same intra- and extracellular L-alanine levels as observed in the dipeptide-hypersensitive mutant obtained by chemical mutagenesis. When each gene was overexpressed in the wild-type strain, which does not intrinsically excrete alanine, only the ygaW gene conferred on the cells the ability to excrete alanine. In addition, expression of the ygaW gene was induced in the presence of the dipeptide. Thus, YgaW is likely to be the physiologically most relevant exporter for L-alanine in E . coli . More recently, two charged residues (R45 and D84) were found to be essential for AlaE efflux activity [ 19 ]. Members of family LST (TC: 2.A.129) are involved in the translocation of lipid-linked glucose across the membrane and have a 4 TMS topology. Shigella flexneri bacteriophage SfX, SfV and SfII each has a 3-gene operon encoding a glucosyltransferase (GtrX), which is involved in full O antigen modification (serotype Y to serotype X conversion). Besides the gtrX gene, the other two genes in the gtr locus of SfX are also involved in the O antigen modification process. The first gene in the cluster ( gtrA ) encodes a small hydrophobic protein involved in the translocation of lipid-linked glucose across the cytoplasmic membrane. The second gene in the cluster ( gtrB ) encodes an enzyme catalysing the transfer of the glucose residue from UDP-glucose to a lipid carrier. The third gene ( gtrX ) encodes a bacteriophage-specific glucosyltransferase which is largely responsible for the final step, i.e., attaching the glucosyl molecules onto the correct sugar residue of the O antigen repeat unit. A three-step model for the glucosylation of bacterial O antigen has been proposed [ 20 ]. Salmonella phage P22 also has genes involved in serotype conversion, and they are homologous to the Shigella phage operons cited above [ 21 ]. E . coli also has these genes, probably because they were incorporated into the bacterial chromosome [ 22 ]. The Shigella SfV and SfX phage GtrX proteins have 4 TMSs [ 23 ]. The 12–2 antigen is a S . enterica subspecies I-specific LPS modification that enhances long-term intestinal colonization [ 24 ]. Results Detection of homology between pairs of families Fig 1 illustrates our strategy to detect homology between pairs of families based upon the transitivity principle, whereby two proteins A and D, with poor or no obvious sequence similarity, are deemed homologous if two additional proteins B (homologue of A) and C (homologue of D) can be identified such that a clear path of significant sequence similarity can be traced connecting proteins A and D (A→B→C→D). Homology is then deduced by association between the two families to which proteins A and D belong [ 1 , 8 ]. 10.1371/journal.pone.0231085.g001 Fig 1 Strategy to determine whether two families of transporters in TCDB are homologous. The figure shows a simplified version of our strategy, illustrating the main steps involved and 3 points in the process where homology between two families can be rejected, with only one alternative for success (see text and Methods for details). Transmembranal segments may contain compositional biases and low complexity regions that inflate alignment scores (of otherwise unrelated sequences) beyond thresholds of statistical significance [ 25 , 26 ]. Thus, in addition to sequence similarity across the transitivity path A→B→C→D (criterion 1), four additional criteria were applied to minimize the rate of occurrence of false positives: (2) selection of candidate homologs that show compatibility of TMS topologies and repeat units characteristic of their respective families. This step is done by manual inspection of hydropathy curves of the sequence alignment between proteins B and C to verify that there is an overlay of hydrophobic peaks, hereafter referred to as TMSs, and aligned TMSs must be congruent with the evolutionary path followed by the reference family (e.g., pore-forming TMSs, duplicated TMSs and TMSs lost/gained should correspond well in both families); (3) the characteristic Pfam domains of both families must overlap significantly in the B-C alignment, (4) shared sequence motifs between families strengthen the argument of homology; and (5) if 3D structures are available, structural superpositions consistent with the TMS repeat units of the families involved may provide additional evidence of homology. See Methods for a detailed description of the approach. In the following discussion, the position of a protein or family within the homology transitivity path is specified by appending the corresponding letter, within parenthesis, to the end of the accession (e.g., OGD29236(B), XP_018986354(C), etc.). A and D will always refer to the original query proteins within the two TCDB families being compared, but the name of the families can also be used (e.g., LCT(D) or 2.A.43.1.1(D)). Alignments will be abbreviated by concatenating letters with dashes (e.g., the B-C alignment). E-values are calculated with the Smith-Waterman algorithm as implemented in SSEARCH [ 27 ] unless otherwise specified (See Methods ). Membership to TOG was inferred by comparing all homologous proteins within a candidate family against a positive control comprised of the set of homologs for each of the established families in the TOG superfamily ( Table 1 ), and to a negative control set of 10 families for which no evidence of relationship to TOG has been found (see Methods and S1 Table ). A family was considered a new member of TOG if at least 4 of the 5 aforementioned criteria ( Fig 1 ) were satisfied. If no 3D structures are available for a pair of families, criterion 5 is not considered. No family within the negative control met these requirements when compared to the positive control ( S2 Table ). Unfortunately, only family KDELR of the new families has 3D structures available in PDB; thus, almost all evidence for homology is based on primary sequence analyses. New families added to TOG Fig 2 shows the full-family average hydropathy plots for each of the new families being incorporated into TOG in this report and highlights conserved hydrophobic peaks in the families as putative TMSs. All families exhibit significant conservation of at least 3 TMSs consistent with the basic 4-TMS repeat unit in TOG as well as Pfam domain agreement. Candidate homologs should be compatible with the hydropathy profile of their respective families, and candidate families must have profiles compatible with the profiles of established TOG families. 10.1371/journal.pone.0231085.g002 Fig 2 Average topological features of the five families added to the TOG superfamily. Plots were created for the new families in Table 2 with the AveHAS program [ 28 ] as described in Methods. Red curves represent average hydropathy. Hydrophobic peaks (conserved putative TMSs) are numbered. Gray curves indicate average similarity across the entire family. Vertical bars on the x-axis indicate conserved residues predicted to be in TMSs by HMMTOP [ 29 ]. Notice how the regions containing hydrophobic peaks have the highest levels of conservation. The organo-arsenical exporter (ArsP) family (TC: 2.A.119) The characteristic repeat unit of ArsP is 4+4 where the two 4-TMS units can be separated by regions containing 2 or 4 TMSs, but other compatible topologies are also observed. Fig 3 shows a representative alignment where the two 4-TMS halves of ArsP member CDE72063 (TC: 2.A.119.2.4) are significantly similar (E-value: 1.1×10 −8 ). In this family, even more significant alignments can be found when comparing the repeats of different ArsP homologs. For example, S1 Fig shows a representative alignment (E-value: 7.8×10 −15 ) between two different halves of ArsP homologs PIU02666 and WP_094226599 that provides evidence for the 4-TMS repeat unit. Members of this family may also have 7 TMSs. S2 Fig shows an alignment (E-value: 6.4×10 −44 ) between 8-TMS ArsP member WP_069955515 (TC: 2.A.119.1.5) and its 7-TMS homolog KIL52798 that illustrates how the loss of the N-terminal TMS from a precursor protein with 8 TMSs explains well the origin of the 3+1+3 topology observed in ArsP and other TOG families, which can be more properly written as a 3+4 topology. 10.1371/journal.pone.0231085.g003 Fig 3 A basic 4-TMS repeat unit in family ArsP. A. Hydropathy plot of ArsP member CDE72063 (TC: 2.A.119.2.4) with 8 hydrophobic peaks highlighted in orange bars. The two 4-TMS bundles being compared are shaded blue and green, respectively. B. Alignment (E-value: 1.1×10 −8 ) of the two 4-TMS bundles as identified by the program tmsRepeat (see Methods ). Interruptions in the hydropathy curves indicate gaps in the sequence alignment. The blue and green curves correspond to the first and second 4-TMS bundles, respectively. For clarity, only the regions where hydrophobic peaks overlap in both curves are highlighted. Notice the correspondence of hydrophobic peaks. We identified significant alignments between members of the ArsP family and the established TOG families LCT, TSUP, and NiCoT. Fig 4 shows the best alignment between families ArsP(A) and LCT(D). TMSs 2–4 of the first 4-TMS repeat unit in ArsP homolog OGD29236(B) align (E-value: 1.9×10 −9 ) with TMSs 1–3 of LCT homolog OAD01438(C), in agreement with the observation that 7-TMS proteins in family LCT lost the N-terminal TMS [ 8 ] ( S3 Fig ). All aligned TMSs are complex according to the TMSOC program and the classification proposed by Eisenhaber's group [ 30 ], decreasing the likelihood of a false positive. Protein OGD29236(B) has 13 TMSs with topology 4+N+4+1 (N = 4), which is apparent from the region that aligns with its homologue in TCDB A8VTI4 (TC: 2.A.119.1.2; Fig 4A ) and because the corresponding Pfam domain (PF03773) only covers the first 12 TMSs ( Fig 4C ). The aligned regions between proteins in Fig 4C and 4F show that the B-C alignment in Fig 4G is covered by the Pfam domain (PF03773) in OGD29236(B) and fully includes the 2-TMS Pfam domain (PF04193) associated with each repeat unit in LCT. In addition, we were able to project the Pfam domain PF03773 in OGD29236(B) to protein OAD01438(C) (E-value: 3×10 −6 ; See Methods ). 10.1371/journal.pone.0231085.g004 Fig 4 Evidence of homology between families ArsP and LCT. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families ArsP and LCT. Panels A-C depict relationships within family ArsP. Panels D-F depict relationships within the LCT family and panel G presents the evidence supporting homology between both families. Orange and Cyan bars denote hydrophobic peaks (i.e., inferred TMSs). Pfam domains are shown as colored horizontal bars. Different domain accessions within the same clan have the same color. Thin vertical black lines with wedges delimit the region of a protein involved in an alignment. The wedges in panels A and D delimit the regions covered by the alignments in panels B and E relative to the full-length proteins in panels A and D, respectively. Proteins in Panels C and F have two sets of delimiting wedges. Wedges plotted for positive hydropathy values delimit regions covered by the alignments in panel B or E relative to the full-length proteins in panels C and F, respectively. Wedges plotted for negative hydropathy values delimit regions covered by the alignment in panel G relative to the full proteins in panels C and F, respectively. Interruptions in the hydropathy curves of panels B, E, and G, indicate gaps in the corresponding sequence alignments. A. Hydropathy plot of ArsP member A8VTI4 (TC: 2.A.119.1.2). The central hydrophobicity peak in A8VTI4 corresponds to 2 TMSs as evidenced by alignments with other ArsP homologues that have two clear central hydrophobic peaks (e.g., WP_091710383, PJC47300, and PIN83468). B. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 3.8×10 −43 ) between ArsP member A8VTI4 and its homolog OGD29236. Note that OGD29236 has 4 extra TMSs in the middle, and they align with the region containing the extra central TMSs of A8VTI4. C. Hydropathy plot of ArsP homolog OGD29236. The aligned region and Pfam domain (PF03773) in OGD29236 indicate that the C-terminal TMS is extra. D. Hydropathy plot of LCT member Q12010 (TC: 2.A.43.2.3). E. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 2.7×10 −56 ) between LCT member A8VTI4 and its homolog OAD01438. F. Hydropathy plot of LCT homolog OAD01438. G. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 1.9×10 −9 ) between ArsP homolog OGD29236 and LCT homolog OAD01438. Only the regions where hydrophobic peaks overlap are highlighted in the alignments. Pfam domain PF03773 in OGD29236 can be projected to protein OAD01438 (E-value: 3×10 −6 ; See Methods ). S4 Fig shows that the best B-C alignment (E-value: 8.5×10 −11 ) between families ArsP(A) and TSUP(D) aligns TMSs 5–7 of ArsP member WP_082464241(B) with TMSs 5–7 of TSUP member AHF91483(C), which corresponds to the first 3 TMSs of the second repeat units in both proteins. Both proteins B and C have 8 TMS with a 4+4 topology. Only one of the aligned TMSs in the TSUP homolog is classified as simple by TMSOC [ 30 ]. Given that we found other lower scoring B-C alignments that involve complex TMSs that fully covered one repeat unit and satisfied all other criteria, we trusted the inference. The hydropathy plot of the B-C alignment shows good overlap of hydrophobic peaks ( S4G Fig ). The Pfam domain PF03773 in WP_082464241(B), characteristic of ArsP, can be projected to AHF91483(C) (E-value: 3×10 −6 ), and it covers all 4 TMSs of the second repeat unit. S5 Fig shows the relationship between families ArsP(A) and NiCoT(D) as evidenced by proteins WP_066228546(B) and PHH64764(C). Protein B has an extra N-terminal TMS with topology 1+4+4. The B-C alignment (E-value: 2.1×10 −8 ; S5G Fig ) covers the 4 TMSs that comprise the first repeat unit in both proteins. None of the aligned TMSs are simple according to the TMSOC classification [ 30 ]. NiCoT, member Q7S3L8(D) (TC: 2.A.52.1.8) and its homolog PHH64764(C) apparently have 3 TMSs in their first repeat unit, based on the identification of hydrophobic peaks. By comparing their sequences to other NiCoT homologs with 8 clear hydrophobic peaks (e.g., WP_083909747, WP_028002848, etc.), it is evident that the low-hydrophobicity region between TMSs 1 and 2 is a TMS. The presence of the second TMS is not farfetched as non-hydrophobic α-helical TMSs have been identified in 3D structures [ 31 ]. If we take this into consideration, the hydropathy of the B-C alignment shows reasonable overlap of hydrophobic peaks. In addition, we were able to project the Pfam domain (PF03773) of family ArsP onto PHH64764(C) (E-value: 1.4×10 −5 ; see Methods ). The endoplasmic reticulum retention receptor (KDELR) family (TC: 9.B.191) We identified the topology for KDELR(A) as 4+4 with borderline significance (E-value: 5.0×10 −4 ; Fig 5 ). Alignments of comparable significance were found between members with 7 TMSs, where TMSs 1–3 aligned with TMSs 5–7 in agreement with the 3+1+3 topology observed in TOG. When KDELR members with 7 TMSs are aligned to homologues with 8 TMSs, the alignment covers TMSs 2–8 of the longer proteins, thus also supporting our claim in TOG that the 3+1+3 topology can be written as 3+4, indicating that an ancestral member with 8 TMSs lost the N-terminal TMS ( S6 Fig ). 10.1371/journal.pone.0231085.g005 Fig 5 Basic repeat unit of 4 TMSs in family KDELR (TC: 9.B.191). A representative alignment between 8-TMS KDELR homologs XP_020093034 and GAQ80789, illustrates the 4-TMS repeat unit in KDELR as identified by AncientRep [ 32 ]. Thin black vertical lines with wedges delimit the regions involved in the alignment of the two full-length proteins. Orange and cyan bars highlight hydrophobicity peaks (i.e., inferred TMSs), respectively, for both proteins. A. Hydropathy plot of protein XP_020093034. TMSs 1–4 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. B. Hydropathy plot of protein GAQ80789. Hydrophobic peaks 5–8 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. C. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 9.4×10 −102 ) between the full proteins. D. Hydropathy plot of the 4-TMS alignment (E-value: 5.0×10 −4 ) that provides evidence for the repeat. Interruptions in the hydropathy curves of panels C and D indicate gaps in the corresponding sequence alignments. Family KDELR was found to be related to families Sweet and LCT within TOG. Fig 6 shows the best match (E-value: 5.3×10 −10 ) between families KDELR(A) and Sweet(D), where all 7 TMSs in both proteins KXJ91449(B) and XP_010536596(C) are covered in the alignment. All TMSs in the alignment are complex according to the TMSOC classification [ 30 ]. Hydrophobic peaks overlap well while the Pfam domains of both proteins (i.e., PF00810 and PF03083) belong to the same clan (CL0141). There is one 3D structure available in family KDELR (PDB: 6I6B; TC# 9.B.191.1.8). The group that solved the structure found significant alignments (2.57–3.87 à ) of 3-helix bundles corresponding to the pore forming TMSs [ 33 ]. All together this evidence strongly supports the conclusion of homology for these two families. 10.1371/journal.pone.0231085.g006 Fig 6 Evidence of homology between families KDELR and sweet. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families KDELR and Sweet. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy plot of KDELR member M7SWU9 (TC: 9.B.191.1.7). B. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 1.7×10 −128 ) between KDELR member M7SWU9 and its homolog KXJ91449. C. Hydropathy plot of KDELR homolog KXJ91449. D. Hydropathy plot of Sweet member ANC68268 (TC: 2.A.123.1.27). E. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 5.6×10 −56 ) between Sweet member ANC68268 and its homolog XP_010536596. F. Hydropathy plot of Sweet homolog XP_010536596. G. Hydropathy plot of the 7-TMS alignment (E-value: 5.3×10 −10 ) between KDELR homologue KXJ91449 and Sweet homologue XP_010536596. The full Pfam domains of proteins KXJ91449 (PF00810) and XP_010536596 (PF03083) are included in the alignment and belong to the same clan (CL0141), further supporting the relationship between both families. S7 Fig shows the best match between family KDELR(A) and LCT(D), where TMSs 3–7 of both proteins PIA50795(B) and KXN87232(C) align (E-value: 3.1×10 −9 ) and show good overlap of hydrophobic peaks ( S7G Fig ). All TMSs in the alignment are complex according to the TMSOC classification [ 30 ]. In this case, the characteristic Pfam domain (PF00810) of family KDELR(A) is directly identified in LCT(D) homolog KXN87232(C) (hmmscan E-value: 5.3×10 −5 ) without the need of projection, thus providing further support to the relationship between both families. The alignment shown in S7G Fig does not include a full 4-TMS repeat unit in either protein, but other alignments with lower, albeit significant, quality do. The Mitochondrial Pyruvate Carrier (MPC) family (TC: 2.A.105) Members of family MPC(A) (TC: 2.A.105) typically have 3 TMSs that probably originated from a 4-TMS precursor with loss of the N-terminal TMS. Fig 7 shows a representative example of a 3-TMS MPC member Q9VHB1 (TC: 2.A.105.1.3) aligned with its 4-TMS homolog XP_011342856, where the hydropathy of the alignment (E-value: 2.4×10 −34 ) suggests that members with 3 TMSs lost the N-terminal TMS as observed in several TOG families. 10.1371/journal.pone.0231085.g007 Fig 7 Possible origin of 3-TMS proteins in family MPC. Representative alignment of 3-TMS MPC member Q9VHB1 (TC: 2.A.105.1.3) versus the 4-TMS homologue XP_011342856. Hydropathy plots and Pfam domains for Q9VHB1 and XP_011342856 are shown in panels A and B, respectively. The hydropathy plot of the alignment (E-value: 2.4×10 −34 ) between these two proteins is shown in panel C. Interruptions in the hydropathy curves of panel C indicate gaps in the sequence alignment. The regions of both proteins involved in the alignment shown in panel C, are delimited by the thin black vertical bars with wedges in panels A and B. The first TMS of XP_011342856 is not part of the alignment supporting the notion that an ancestor of protein Q9VHB1 lost its N-terminal TMS. Our analyses identified a relationship between families MPC(A) and Sweet(D). Fig 8 shows that the best match (E-value: 4.7×10 −10 ) aligns all 3 TMSs of MPC member XP_008085704(B) with TMSs 5–7 of the Sweet member BAJ94651(C). All TMSs involved in the alignment are complex according to the TMSOC classification [ 30 ]. This alignment is compatible with the 3+1+3 topology observed in the Sweet family because TMSs 1–3 and 5–7 comprise the two structural units that create the pore across the membrane. In agreement with the symmetry of the Sweet topology, TMSs 1–3 of XP_008085704(B) also match TMSs 1–3 of BAJ94651(C), but at much lower significance levels (E-value: 2.3×10 −3 ). The characteristic Pfam domains of families MPC (PF03650) and Sweet (PF03083, PF04193) belong to the same clan (CL0141) further supporting their relationship. 10.1371/journal.pone.0231085.g008 Fig 8 Evidence of homology between families MPC and sweet. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families MPC and Sweet. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy of MPC member P53311 (TC: 2.A.105.1.1). B. Hydropathy of the alignment (E-value: 2.1×10 −29 ) between MPC member P53311 and its homolog XP_008085704. C. Hydropathy of MPC homolog XP_008085704. D. Hydropathy of Sweet member Q9SMM5 (TC: 2.A.123.1.13). E. Hydropathy of the alignment (E-value: 1.1×10 −71 ) between Sweet member Q9SMM5 and its homolog BAJ94651. F. Hydropathy of Sweet homolog BAJ94651. G. Hydropathy of the 3-TMS alignment (E-value: 4.7×10 −10 ) between MPC homolog XP_008085704 and the Sweet homolog BAJ94651. The Pfam domains of MPC (PF03650; panel C) and Sweet (PF03083; panel F) are covered in the alignment (panel G) and belong to the same clan (CL0141). There are three recognized 3-TMS MPC isoforms known as MPC1, MPC2 and MPC3 types, where MPC3 (found in yeast) shows ~75% sequence identity to MPC2 [ 16 ], while MPC1 and MPC2 are ~30% identical. These MPC types form heterocomplexes that bind other proteins, facilitating transport of pyruvate across the mitochondrial inner membrane [ 15 , 16 ]. We identified several MPC proteins with 7 putative TMSs arranged in a 3+1+3 topology that we believe originated by duplication of a 4-TMS MPC precursor, followed by loss of the N-terminal TMS and sequence divergence of the two halves. However, we cannot eliminate the possibility of an event where MPC types 1 and 2 fused with insertion of the central TMS. For example, TMSs 1–3 of the 7-TMS protein C5K6B0 (TC: 2.A.105.1.8) align best (identity: 46.7%) with all 3 TMSs of the MPC1 homolog Q4N4U8 (TC: 2.A.105.1.6). On the other hand, TMSs 5–7 of C5K6B0 are most similar (Identity: 55.3%) to the 3-TMS MPC2 homolog P38857 (TC: 2.A.105.1.1). The appearance of MPC1-like and MPC2-like proteins in the same polypeptide agrees with previous observations of both isoforms being components of a functional heterocomplex [ 15 ]. The l-alanine exporter (AlaE) family (TC: 2.A.104) Members of family AlaE have 4 characteristic TMSs. Our analyses identify a relationship between families AlaE(A) and ArsP(D). Fig 9 shows the best B-C alignment between these families, where it can be appreciated ( Fig 9G ) that the hydropathy curve of all 4 TMSs in the AlaE(A) homolog WP_039030005(B) overlaps best (E-value: 1.8×10 −8 ) with the 4 TMSs of the first repeat unit in ArsP(D) homolog WP_087291645(C). All TMSs involved in the alignment are complex according to the TMSOC classification [ 30 ]. We were able to project (E-value: 2.4×10 −7 ) the Pfam domain (PF11449) of family ArsP(D) onto the full length of AlaE(A) homolog WP_039030005(B), which provides additional support to the relationship between these families. 10.1371/journal.pone.0231085.g009 Fig 9 Evidence of homology between families AlaE and ArsP. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families AlaE and ArsP. To save space, the word homolog was abbreviated as "hom" in the captions of panels C and F. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy plot of AlaE member A8ANM6 (TC: 2.A.104.1.1). B. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 4.4×10 −69 ) between AlaE member A8ANM6 and its homolog WP_039030005. C. Hydropathy plot of AlaE homolog WP_039030005. D. Hydropathy plot of ArsP member R9KWU8 (TC: 2.A.119.2.2). E. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 4.9×10 −61 ) between ArsP member R9KWU8 and its homolog WP_087291645. F. Hydropathy plot of ArsP homolog WP_087291645. G. Hydropathy plot of the 4-TMS alignment (E-value: 1.8×10 −8 ) between AlaE homolog WP_039030005 and the ArsP homolog WP_087291645. The projection (E-value: 2.4×10 −7 ) of the Pfam domain in the ArsP homolog WP_087291645 (PF11449; panel F) onto the AlaE homolog WP_039030005 (panel C) covers all 4 TMSs of WP_039030005, thus providing additional evidence for homology between these families. The lipid-linked sugar translocase (LST) family (TC: 2.A.129) This family has 4 characteristic TMSs. We identified a relationship between families LST(A) and Sweet (D) through the proteins WP_020576852(B) and WP_068470014(C). Fig 10G shows that the B-C alignment (E-value = 1.5×10 −8 ) covers almost all 4 TMSs of protein B ( Fig 10C ) and the second repeat unit (TMSs 4–7) of protein C ( Fig 10F ), although one pair of TMSs in the alignment is simple according to the TMSOC classification [ 30 ]. Hydrophobic peaks show good overlap. This alignment is congruent with the 3+4 topology of many Sweet(D) members as they lost the N-terminal TMS from an ancestral 4+4 topology [ 8 ]. The Pfam domain (PF04138) of family LST can be projected onto Sweet member WP_068470014(D) (E-value: 9.1×10 −6 ), fully covering the aligned region ( Fig 10F ). 10.1371/journal.pone.0231085.g010 Fig 10 Evidence of homology between families LST and sweet. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy plot of LST member SEM04082 (TC: 2.A.129.1.5). B. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 8.8×10 −35 ) between LST member SEM04082 and its homolog WP_020576852. C. Hydropathy plot of LST homolog WP_020576852. D. Hydropathy plot of Sweet member A0M0P7 (TC: 2.A.123.4.1). E. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 6.3×10 −21 ) between Sweet member A0M0P7 and its homolog WP_068470014. F. Hydropathy plot of Sweet homolog WP_068470014. G. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 1.5×10 −8 ) between LST homolog WP_020576852 and the Sweet homolog WP_068470014. Panel G and the delimited regions in Panels C and F show that 3.5 TMSs are aligned. The projection (E-value: 9.1×10 −6 ) of the Pfam domain in LST (PF04138; panel C) onto the Sweet homologue WP_068470014 covers the second half of the protein (panel F), thus providing additional evidence of homology between these families. Furthermore, we identified additional significant but lower scoring alignments between these two families that completely cover the second repeat unit of Sweet homologs. Given this evidence we are confident that families LST and Sweet are related. Anomalies for previous members of the TOG superfamily The relationships among all families within the TOG superfamily [ 8 ] were tested to determine whether their relationships still hold in light of improved methods and significantly more sequence information available in public repositories. Families PnuC (TC: 4.B.1) and PNaS (TC: 2.A.58) failed to satisfy our improved criteria and were removed from the superfamily pending the discovery of substantiating evidence. Family PnuC (TC: 4.B.1) It has been reported that families PnuC and Sweet have 3+1+3 topologies [ 34 , 35 ]. Evidence suggests that the 3+1+3 topology originated from a 4+4 original arrangement followed by loss of the N-terminal TMS [ 8 ], both in PnuC ( S8 and S9 Figs) and Sweet ( S10 and S11 Figs). Although some members of the PnuC family have regions of sequence similarity with members of the Sweet family, the TMSs involved in the corresponding B-C alignments cannot be reconciled with the repeat units of these families. For example, S12 Fig shows the B-C alignment (E-value: 1.8×10 −8 ) between PnuC(A) homolog OFX33391(B) and Sweet(D) homolog OWY93661(C). Only one TMSs in the alignment is classified as simple by TMSOC [ 30 ]. Both proteins have 7 TMSs with topology 3+1+3. The B-C alignment involves TMSs 2–5 of B and TMSs 3–6 of C, which is not congruent with the topologies of these families. For this alignment to make sense, both proteins need to include at least one complete 3-TMS bundle in the alignment or align the same TMSs in both proteins. Superposition of 3D structures between members of the Sweet and PnuC families revealed that the organization and connectivity of α-helices is different, but they still generate pores of high structural similarity (RMSD ~ 2 à ) [ 34 , 35 ]. This prompted the hypothesis that families Sweet and PnuC are homologous and a domain swapping event could have altered the arrangement of TMSs without disrupting the structure of the pore. However, it has been emphasized that the possibility of structural convergence could not be ruled out [ 35 ]. Understandably, controversy persists given the body of evidence supporting both alternatives [ 36 , 37 ]. Thus, further work and better evidence is required to settle the issue of whether PnuC is homologous to Sweet and thus a member of TOG. Family PNaS (TC: 2.A.58) Proteins in family PNaS show a 4+4+2 characteristic topology ( S13 Fig ). When compared with TOG, alignments covering at least 4 TMSs were found with members of families MR, LCT and TSUP. However, none of these alignments were congruent in terms of the repeat units identified for these families. The best scoring B-C alignment (E-value:1.7×10 −8 ) was identified with family MR(D), see S14 Fig , which has a 3+4 topology that originated from a 4+4 arrangement followed by loss of the N-terminal TMS [ 8 ]. This match has several problems: 1) relative to protein WP_026901115(B), the alignment starts with the sixth hydrophobic peak, or TMS 2 of the second repeat unit. On the other hand, relative to protein AJP85873(C), the alignment starts on the third hydrophobic peak, which is the fourth TMS of the first 4-TMS repeat unit given the loss of the first TMS. This makes the alignment incompatible with the repeat units; 2) the 2 extra TMSs of the PNaS homolog align with TMSs 3–4 of the second repeat unit in AJP85873(C); 3) the hydropathy curve of the B-C alignment ( S14G Fig ) shows that the first 2 hydrophobic peaks have little overlap; and 4) when the hydrophilic region at the C-terminus of the B-C alignment is removed, the scores of the alignment drop significantly (E-value: 3.4×10 −4 ). Altogether, this evidence is not sufficient to justify the membership of family PNaS in the TOG superfamily. This exemplifies a well-known problem, namely that sequence similarity alone may not be sufficient to detect homology when comparing membrane proteins [ 25 , 26 ]. Topologically dissimilar families with unexpected sequence similarity to the TOG superfamily The CaTA family (TC: 1.A.14) Originally, we identified the CaTA family, formerly the TEGT family, as a potential TOG member due to significant sequence alignments with other TOG families (i.e., LCT and TSUP) suggesting that members of CaTA lost the C-terminal TMS. The crystal structure of the B . subtilis CaTA homologue YetJ (TC: 1.A.14.2.3) [ 38 ] revealed that in this 7-TMS protein, TMSs 1–3 and 4–6 form two units wrapped around the seventh TMS, thus presenting a 3+3+1 topology that contrasts with the characteristic 3+1+3 (or 3+4) topology in the TOG superfamily. Our sequence-based search for the repeat unit in family CaTA (see Methods ) revealed alignments matching TMSs 1–3 with 4–6 in agreement with the symmetry observed in the structure ( S15 Fig ). 3D structural comparisons of CaTA members against all existing members of TOG yielded no reliable alignments of known repeat units (see Methods ). Unless further evidence is identified, this family cannot be reliably regarded as a member of TOG, given the sequence and structural information supporting the 3+3+1 topology. Divergent evolutionary pathways sometimes yield similar 3D structures, even when homology is difficult to identify using primary sequence data [ 39 ]. Alternatively, similar sequences may produce different structures under different environments and single protein sequences can assume different structures depending on the environment in which the protein is found [ 40 – 46 ]. On the other hand, substantially divergent structures and sequences can never disprove homology. Nevertheless, when 3D structure and primary sequence analyses support each other, the evidence of homology is stronger. Further characterization of protein structures in different conformations and under different conditions will be necessary to better understand the relationship between families with sequence similarity but different structural topologies. The NicO family (TC: 2.A.113) Members of the NicO family, a member of the LysE superfamily, typically have 6 predicted TMSs organized in a 3+3 topology that contrasts with the known 4+4 topology in the NiCoT family [ 8 ]. Notwithstanding, significant 6-TMS alignments (E-value: 4.0×10 −13 ) were detected between members of NicO and the TOG-member NiCoT familiy. The significance of the alignment cannot be explained by the presence of TMSs with high compositional bias because all 6 TMSs in NicO members are complex or in the twilight zone [ 30 ]. Based on our criteria ( Fig 1 ), and despite the sequence similarity, the lack of agreement between the topologies of these two families is enough to prevent the incorporation of NicO into the TOG superfamily. We consider it possible that the 3-TMS repeat unit of NicO family members and the 4-TMS repeat unit of NiCoT family members were both derived from the same 3 or 4 TMS unit by gain or loss of a TMS. If this proves to be true, the TOG and LysE superfamilies, although potentially dissimilar at the structure level because of the different length of their repeat units, would nevertheless be homologous because they both derived from a common repeat unit. The potential formation of ultra-superfamilies will be the subject of future research. It is interesting that the NicO and NiCoT families, each within different superfamilies and having internal repeats of 3 and 4 TMSs, respectively, exhibited significantly similar sequences, leading us to suggest that their dissimilar repeat units derived from a common origin. These two families, however, are specific for the same substrate, the divalent metal cations Ni 2+ and Co 2+ . Two possibilities thus exist to account for their appreciable levels of sequence similarity: divergence from a common origin, or convergence to form similar heavy metal ion binding sites within unrelated transmembrane domains. While we favor the former possibility, further studies will be required to prove or disprove this conjecture. Integrated analysis of the TOG superfamily Conservation of sequence profiles across the TOG superfamily In our approach, we scanned for conserved sequence regions across the expanded TOG superfamily using the MEME suite [ 47 ]. Based on a training set containing 50 sequences for each TOG family we searched for sequence profiles (MEME models) 15–50 aas wide. Then, identified models were scanned against two test sets of sequences using MAST [ 47 ]. The first set consists of all non-redundant homologs extracted for the TOG superfamily, including new family additions (16,771 proteins), but excluding all proteins that directly participated in the training set. The second test set consisted of all 7,321 non-redundant homologs identified for the negative control families (See Methods ). We identified one sequence profile 50 aas long that recovered homologs of all new families added in this report to TOG, as well as members of previously established TOG families, with the exception of family TSUP (TC# 2.A.102). This particular profile retrieved none of the 7,321 homologs of the negative control families. However, we also identified 4 additional MEME models that, when combined, were able to recover members of all families in TOG, including the new additions, while bringing up only 3 proteins from the negative control. These profiles were biased toward families closer to the Sweet group (e.g., LCT and KDELR), but after running MEME for different model widths and requiring that at least 100 sequences in the training set should present a conserved region, it was possible to identify profiles that map to all TOG families. S1 File presents the results of MEME and MAST in this analysis. Besides the discriminating power, the 50 aas MEME model reveals a clear pattern. If we only consider MAST matches showing E-values 70% of the smaller protein. To form the training set for motif identification with MEME [ 47 ], we selected from TCDB, 50 proteins from each family in the TOG superfamily (including the new additions). If a family had fewer than 50 proteins in TCDB, the remaining proteins were taken from the corresponding group of extracted homologs, and sequences showing more than 80% identity were removed with CD-HIT [ 66 ]. This produced a final training set of 650 proteins for the 13 TOG families. Then, two test sets were generated by combining 1) all homologs extracted, excluding those added to the training set, for the 13 TOG families (16,771 proteins), and 2) all homologs extracted for the families in the negative control (7,321 proteins). MEME was run in two modes: 1) every sequence in the training set contributes one site (OOPS), and 2) each sequence could contribute zero or one site (ZOOPS). We searched for the top 10 motifs with a width of 15–50 residues that showed an E-value Score ≥ 0.4), and low (Score 70% of the smaller protein. To form the training set for motif identification with MEME [ 47 ], we selected from TCDB, 50 proteins from each family in the TOG superfamily (including the new additions). If a family had fewer than 50 proteins in TCDB, the remaining proteins were taken from the corresponding group of extracted homologs, and sequences showing more than 80% identity were removed with CD-HIT [ 66 ]. This produced a final training set of 650 proteins for the 13 TOG families. Then, two test sets were generated by combining 1) all homologs extracted, excluding those added to the training set, for the 13 TOG families (16,771 proteins), and 2) all homologs extracted for the families in the negative control (7,321 proteins). MEME was run in two modes: 1) every sequence in the training set contributes one site (OOPS), and 2) each sequence could contribute zero or one site (ZOOPS). We searched for the top 10 motifs with a width of 15–50 residues that showed an E-value Score ≥ 0.4), and low (Score < 0.4). S3 Table provides the Score and the Confidence level assigned to each inferred relationship within TOG. All the relationships identified within TOG and their confidence levels were plotted in a network layout ( Fig 12 ) using the program Gephi 0.9.2 [ 75 ] ( https://gephi.org/ ). 3D structural analyses When full protein 3D structures do not align properly, evidence of homology can still be detected by cutting structures of transporters into bundles of 3 or more transmembrane α-helices (α-TMSs) based upon to size of the repeat units in TOG families. We extracted α-TMSs from OPM [ 76 ] as well as PDBTM [ 77 ], and if they corresponded to less than one full α-helix, they were extended to full helices using secondary structure assignments from STRIDE [ 78 ]. The purpose is to identify significant structural superpositions of the helix bundles corresponding to the repeat units of two families of transporters. Structures are compared with the CCP4 [ 79 ] implementation of the SSM superpose algorithm [ 80 ] or the TM-align program [ 81 ]. Alignments are ranked based on RMSD values, coverage, and TM-scores. Our program Deuterocol automates all these steps. The researcher must make the final decision after inspection and interpretation of top-scoring alignments. Future versions of this program will implement the step of interpretation of the alignments. Supporting information S1 Table General properties of families within the negative control set. (DOCX) Click here for additional data file. S2 Table Comparison of five new families in TOG with families in the negative control set. (DOCX) Click here for additional data file. S3 Table Relative confidence scores of homology inferences. (DOCX) Click here for additional data file. S1 Fig Basic 4-TMS repeat unit in family ArsP. A representative alignment between proteins PIU02666 and WP_094226599, illustrating the 4-TMS repeat unit in ArsP as identified by AncientRep [ 32 ] (see Methods ). Thin black vertical lines with wedges delimit the regions within full proteins involved in the alignment. Hydrophobic peaks, corresponding to inferred TMSs, are highlighted with orange and cyan vertical bars. A. Hydropathy plot of protein PIU02666. TMSs 2–5 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. Notice that this protein has an extra N-terminal TMS (not highlighted in orange) that is evidenced by its exclusion from the alignment shown in panel D and by the TMSs covered by the Pfam domain (PF03773). B. Hydropathy plot of protein WP_094226599. Hydrophobic peaks 7–10 (shaded in dark gray) participate in the alignment in panel D. The fifth hydrophobicity peak (not highlighted in cyan) corresponds to 2 TMSs as can be easily determined using alignments with other family homologs that have two clear central hydrophobic peaks (e.g., PIN83468, WP_091710383, etc.). C. Hydropathy of the full protein alignment (E-value: 3.2×10 −42 ). Notice how the 2 central TMSs of protein WP_094226599 are mostly aligned with gaps (interruptions in the red curve). D. Hydropathy of the 4-TMS alignment (E-value: 7.8×10 −15 ) that provides evidence for the repeat. Interruptions in the hydropathy curves of panels C and D indicate gaps in the corresponding sequence alignments. (TIF) Click here for additional data file. S2 Fig Possible o rigin of the 3+1+3 topology in ArsP. A. Hydropathy of 7-TMS ArsP homolog KIL52798. B. Hydropathy of 8-TMS ArsP member WP_069955515 (TC: 2.A.119.1.5). C. Hydropathy of the alignment (E-value: 6.4×10 −44 ) between WP_069955515 (red) and KIL52798 (blue). Interruptions in the hydropathy curves of panel C indicate gaps in the sequence alignment. Thin black vertical lines with wedges in panels A-B delimit the region of these proteins involved in the alignment presented in panel C. The loss of the N-terminal TMS in homolog KIL52798, rather than the addition of a TMS in WP_069955515, is evident because 1) it is not part of the alignment; and 2) the Pfam domain PF03773 includes the first TMS. (TIF) Click here for additional data file. S3 Fig Possible origin of the 3+1+3 topology in LCT. A. Hydropathy plot of 7-TMS LCT homolog OAD01438. B. Hydropathy plot of 8-TMS LCT homolog XP_011392522. C. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 1.0×10 −49 ) between OAD01438 (red) and XP_011392522 (blue). Interruptions in the hydropathy curves of panel C indicate gaps in the sequence alignment. Thin black vertical lines with wedges in panels A-B delimit the regions of these proteins involved in the alignment presented in panel C. There are two pieces of evidence supporting the loss of the N-terminal TMS in homolog KIL52798, and thus a 3+4 topology in LCT members with 7 TMSs: 1) the first TMS is not part of the alignment; and 2) The similarity of the hydropathy curve between the first and second 4-TMS halves is evident (Panel B). (TIF) Click here for additional data file. S4 Fig Evidence of homology between families ArsP and TSUP. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families ArsP and TSUP. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy plot of ArsP member Q8EJL9 (TC: 2.A.119.1.6). B. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 5.0×10 −47 ) between ArsP member Q8EJL9 and its homologue WP_082464241. C. Hydropathy plot of ArsP homolog WP_082464241. Note that both proteins Q8EJL9 and WP_082464241 share two properties: 1) the third hydrophobic peak is composed of two TMSs; and 2) there is an extra (not colored) C-terminal hydrophobic peak. Both properties can be easily observed from alignments with other ArsP members, for example WP_069955515 (TC: 2.A.119.1.5), and by the regions covered by the Pfam domain PF03773. D. Hydropathy of TSUP member Q9UYH7 (TC: 2.A.102.4.1). E. Hydropathy of the alignment (E-value: 3.2×10 −28 ) between TSUP member Q9UYH7 and its homologue AHF91483. F. Hydropathy of TSUP homolog AHF91483. G. Hydropathy of the 3-TMS alignment (E-value: 8.5×10 −11 ) between ArsP homologue WP_082464241and TSUP homologue AHF91483. Only the regions where hydrophobic peaks overlap are highlighted in the alignments. The full alignment in panel G is covered by the Pfam domains of both proteins, and the domain (PF03773) in WP_082464241 can be projected to AHF91483 (E-value: 3×10 −6 ), further supporting the relationship between the two families. (TIF) Click here for additional data file. S5 Fig Evidence of homology between families ArsP and NiCoT. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families ArsP and NiCoT. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy plot of ArsP member WP_099137450 (TC: 2.A.119.1.4). B. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 1.8×10 −13 ) between ArsP member WP_099137450 and its homologue WP_066228546. C. Hydropathy plot of ArsP homolog WP_066228546. Note the extra N-terminal TMS in protein WP_066228546, which can be easily observed both from the region that aligns with member WP_099137450 and the region covered by the Pfam domain PF03773. D. Hydropathy plot of NiCoT member Q7S3L8 (TC: 2.A.52.1.8). E. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 6.8×10 −99 ) between NiCoT member Q7S3L8 and its homologue PHH64764. F. Hydropathy of NiCoT homolog PHH64764. G. Hydropathy plot of the 4-TMS alignment (E-value: 2.1×10 −8 ) between ArsP homologue WP_066228546 and NiCoT homologue PHH64764. Only the regions where hydrophobic peaks overlap are highlighted in the alignments. The alignment in panel G is covered by the Pfam domains of both proteins, and the domain (PF03773) in WP_066228546 can be projected to PHH64764 (E-value: 1.4×10 −5 ) further supporting the relationship between these two families. (TIF) Click here for additional data file. S6 Fig Possble origin of the 3+1+3 topology in KDELR. A. Hydropathy plot of 7-TMS KDELR homolog XP_003307390. B. Hydropathy plot of 8-TMS KDELR homolog XP_020093034. C. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 2.0×10 −22 ) between XP_003307390 (red) and XP_020093034 (blue). Interruptions in the hydropathy curves of panel C indicate gaps in the sequence alignment. Thin black vertical lines with wedges in panels A-B delimit the regions of these proteins involved in the alignment presented in panel C. Notice that the alignment contains only hydrophobic peaks 2–8 in XP_020093034. The exclusion of the first hydrophobic peak in XP_020093034 from the alignment provides evidence supporting the loss of the N-terminal TMS in XP_003307390 and other 7-TMS family members. (TIF) Click here for additional data file. S7 Fig Evidence of homology between families KDELR and LCT. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families KDELR and LCT. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy plot of 7-TMS KDELR member P24390 (TC: 9.B.191.1.5). B. Hydropathy plot of the 7-TMS alignment (E-value: 6.0×10 −20 ) between KDELR member P24390 and its homologue PIA50795. C. Hydropathy plot of KDELR homolog PIA50795. Note that the alignment starts in the second hydrophobic peak of homolog PIA50795, which further supports the loss of the N-terminal TMS from KDELR homologs with 7 TMSs. D. Hydropathy plot of LCT member Q60441 (TC: 2.A.43.3.1). E. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 7.9×10 −31 ) between LCT member Q60441 and its homologue KXN87232. F. Hydropathy of LCT homolog KXN87232. G. Hydropathy plot of the 5-TMS alignment (E-value: 3.1×10 −9 ) between KDELR homolog PIA50795 and LCT homolog KXN87232. Only the regions where hydrophobic peaks overlap are highlighted in the alignments. The alignment in panel G includes most of the Pfam domains of both proteins. In addition, KDELR domain (PF00810) is directly found in LCT homologue KXN87232 (hmmscan E-value: 5.3×10 −5 ) without the need of projection, further supporting the relationship between both families. (TIF) Click here for additional data file. S8 Fig Repeat unit in family PnuC. A representative alignment between 8-TMS proteins WP_027672312 and OWU65212 illustrates the 4-TMS repeat unit in PnuC as identified by AncientRep [ 32 ]. Thin vertical black lines with wedges delimit the regions involved in the alignment of the two full-length proteins. Orange and cyan bars highlight hydrophobicity peaks (i.e., inferred TMSs), respectively, for both proteins. A. Hydropathy plot of protein WP_027672312. TMSs 1–4 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. B. Hydropathy plot of protein OWU65212. Hydrophobic peaks 5–8 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. C. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 4.3×10 −14 ) between the full proteins. D. Hydropathy plot of the 4-TMS alignment (E-value: 3.7×10 −7 ) that provides evidence for the repeat. The good overlap of the hydropathy curves increases the significance of the alignment. Interruptions in the hydropathy curves of panels C and D indicate gaps in the corresponding sequence alignments. (TIF) Click here for additional data file. S9 Fig Posible origin of the 3+1+3 topology in PnuC. Representative alignment supporting the loss of the N-terminal TMS in PnuC members with 7 TMSs. A. Hydropathy of 7-TMS PnuC homolog OFX33391. B. Hydropathy of 8-TMS PnuC homolog WP_092670402. C. Hydropathy of the alignment (E-value: 3.0×10 −23 ) between OFX33391 (red) and WP_092670402 (blue). Interruptions in the hydropathy curves of panel C indicate gaps in the sequence alignment. Thin black vertical lines with wedges in panels A and B delimit the regions of these proteins involved in the alignment presented in panel C. The loss of the N-terminal TMS in homolog OFX33391 is supported by the fact that the first TMS in WP_092670402 (panel B) is not part of the alignment shown in Panel C. (TIF) Click here for additional data file. S10 Fig Repeat unit of family sweet. The repeat unit of Sweet members with 7 TMS is 3+1+3 where TMSs 1–3 are highly similary to TMSs 5–7. Here we present a representative example of a Sweet homolog with 8 TMSs showing a 4-TMS repeat as identified by our program tmsRepeat (see Methods ). A. Hydropathy plot of the 8-TMS Sweet homolog PFH37642. Thin black vertical lines with wedges delimit the two 4-TMSs bundles that were initially aligned. The regions within the 4-TMS bundles that were aligned by SSEARCH [ 27 ] (see Methods ) are shaded blue and green, respectively. B. Hydropathy plot showing the alignment (E-value: 1.7×10 −5 ) between TMSs 1–4 (blue) and TMSs 5–8 (green). Interruptions in the hydropathy curves indicate gaps in the sequence alignment. (TIF) Click here for additional data file. S11 Fig Loss of the N-terminal TMS in the sweet family. Representative alignments of Sweet homologs supporting the loss of the N-terminal TMS from original proteins with 8 (panels A-C) and 4 TMSs (panels D-F). The thin black bars with wedges in panels A, B, D, and E, delimit the regions of the proteins that participate in the alignments shown in panels C and F. Interruptions in the hydropathy curves of panels C and F indicate gaps in the corresponding sequence alignments. A. Hydropathy plot of 7-TMS Sweet member ANC68268 (TC: 2.A.123.1.27). B. Hydropathy plot of 8-TMS Sweet homolog PFH37642. This is the same protein used in S10 Fig to identify the 4-TMS repeat unit. C. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 1.9×10 −19 ) between ANC68268 and PFH37642. D. Hydropathy plot of 3-TMS Sweet member C3WG44 (TC: 2.A.123.2.3). E. Hydropathy plot of 4-TMS Sweet homolog WP_082029922. F. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 7.1×10 −16 ) between ANC68268 and PFH37642. The loss of the N-terminal TMS is supported by the fact that the first TMS in proteins PFH37642 and WP_082029922 is not part of their respective alignments, and that all TMSs in proteins ANC68268 and C3WG44 are aligned. (TIF) Click here for additional data file. S12 Fig Insufficient evidence of homology between families PnuC and sweet. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families PnuC and Sweet. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy plot of 7-TMS PnuC member Q8EDN0 (TC: 4.B.1.1.4). B. Hydropathy plot of the 7-TMS alignment (E-value: 6.7×10 −22 ) between Q8EDN0 and its homologue OFX33391. C. Hydropathy plot of 7-TMS PnuC homolog OFX33391. D. Hydropathy plot of Sweet member H3GD93 (TC: 2.A.123.1.22). This protein consists of the quadruplication of a 7-TMS precursor protein. E. Hydropathy plot of the 7-TMS alignment (E-value: 3.5×10 −52 ) between H3GD93 and its homologue OWY93661. Note that OWY93661 has significant alignments (E-value < 10 −30 ) with all 4 repeats in H3GD93; however, we present only the top scoring alignment with the fourth repeat as indicated in panel D. F. Hydropathy of the Sweet homolog OWY93661. G. Hydropathy plot of the 4-TMS alignment (E-value: 1.8×10 −8 ) between PnuC homolog OFX33391 and Sweet homolog OWY93661. Only the regions where hydrophobic peaks overlap are highlighted in the alignments. The alignment of hydrophobic peaks between OFX33391 (peaks 2–5) and OWY93661 (peaks 3–7) is not consistent with their common topologies (3+1+3 or 3+4), suggesting that the evolution of the TMS architecture in family PnuC followed a different path as compared to families in the TOG superfamily, possibly involving an internal rearrangement of TMSs [ 35 ]. (TIF) Click here for additional data file. S13 Fig Repeat unit of family PNaS. A representative alignment between proteins WP_015713122 and OPL07780 with 10 hydrophobic peaks each, suggests the 4-TMS repeat unit in PNaS as identified by AncientRep [ 32 ]. Note that HMMTOP [ 29 ] predicts 9 TMSs in both proteins, but comparisons with other family members support the presence of 10 TMSs. Thin black vertical lines and wedges delimit the regions involved in the alignment of the two full-length proteins. Orange and cyan bars highlight hydrophobicity peaks (i.e., inferred TMSs), respectively, for both proteins. A. Hydropathy plot of protein WP_015713122. TMSs 1–4 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. B. Hydropathy plot of protein OPL07780. TMSs 5–8 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. C. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 1.2×10 −40 ) between the full proteins. D. Hydropathy plot of the 4-TMS alignment (E-value: 4.1×10 −12 ) that provides evidence for the repeat. Interruptions in the hydropathy curves of panels C and D indicate gaps in the corresponding sequence alignments. (TIF) Click here for additional data file. S14 Fig Insufficient evidence of homology between families PNaS and MR. Hydropathy plots are presented across the homology transitivity path between families PNaS and MR. Refer to the legend of Fig 4 for a detailed description of the format. A. Hydropathy plot of PNaS member M7AKZ4 (TC: 2.A.58.2.2). B. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 3.6×10 −46 ) between M7AKZ4 and its homolog WP_026901115. C. Hydropathy plot of PNaS homolog WP_026901115. D. Hydropathy plot of MR member Q12117 (TC: 3.E.1.4.6). E. Hydropathy plot of the 7-TMS alignment (E-value: 1.2×10 −88 ) between Q12117 and its homologue AJP85873. F. Hydropathy of the MR homolog AJP85873. G. Hydropathy plot of the 5-TMS alignment (E-value: 1.7×10 −8 ) between PNaS homolog WP_026901115 and MR homolog AJP85873. Only the regions where hydrophobic peaks overlap are highlighted in the alignments. Note that 1) relative to the full protein WP_026901115 (panel C), the alignment in panel G starts in TMS 6, or the second TMS of the second 4-TMS repeat unit, and relative to AJP85873 (panel F) the alignment starts on the third TMS, or TMS 4 of the first 4-TMS repeat unit considering the loss of the N-terminal TMS in family MR [ 8 ]; 2) in panel G the second TMS of both proteins show little overlap; and 3) TMSs 9–10 of WP_026901115, which are not part of the 4-TMS repeat unit in PNaS ( S13 Fig ), are aligning with TMSs 7–8 of AJP85873. Thus, this alignment is not supportive of a common origin. (TIF) Click here for additional data file. S15 Fig Repeat unit in family CaTA. A representative alignment between proteins EFQ46215 and WP_005742819 supporting the TMS topology 3+3+1 in agreement with available 3D structural data. Thin black bars with wedges delimit the regions involved in the alignment of the two full-length proteins. Orange and cyan bars highlight hydrophobicity peaks (i.e., inferred TMSs) for each full protein, respectively. A. Hydropathy plot of protein EFQ46215. TMSs 1–3 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. B. Hydropathy plot of protein WP_005742819. TMSs 4–6 (shaded in dark gray) participate in the alignment shown in panel D. C. Hydropathy plot of the alignment (E-value: 1.8×10 −4 ) between the full proteins. D. Hydropathy plot of the 3-TMS alignment (E-value: 5.1×1 −6 ) that provides evidence for the repeat. Interruptions in the hydropathy curves of panels C and D indicate gaps in the corresponding sequence alignments. (TIF) Click here for additional data file. S16 Fig MAST match mapped to the structure of the eubacterial MR member xanthorhodopsin. Cartoon representation of the 7-TMS xanthorhodopsin structure in Salinibacter ruber (PDB: 3DDL). The segment of TMSs 1–2 matched by MAST is shown in red, the retinal cofactor is shown in cyan, and residues making contact with retinal (< 6 à ) within the MAST region are shown in yellow. All other residues are grayed. (TIF) Click here for additional data file. S17 Fig MAST match mapped to the structure of the eukaryotic SWEET13 transporter. Cartoon representation of the 7-TMS SWEET13 structure in Arabidopsis thaliana (PDB: 5XPD). The segment of TMSs 1–2 matched by MAST is shown in red, the substrate analog, 2' deoxycytidine 5' monophosphate, is shown in cyan, and residues making contact with the substrate within the MAST region are shown in yellow. All other residues are grayed. (TIF) Click here for additional data file. S18 Fig MAST match mapped to the structure of the eukaryotic KDEL receptor. Cartoon representation of the 7-TMS KDEL receptor structure in Gallus gallus (PDB: 6I6H). The segment of TMSs 1–2 matched by MAST is shown in red, the TAEKDEL signal peptide bound to the pocket is shown in cyan, and residues making contact with the peptide within the MAST region are shown in yellow. All other residues are grayed. (TIF) Click here for additional data file. S1 File MEME/MAST output files with motifs identified for the TOG superfamily. Folders and ouput files are compressed in a zip file. Folder MEME contains the motif models; folder MAST contains the motifs matching the training sets, and folder DATA contains both the training and test sets. Check the included README file for a detailed description. (ZIP) Click here for additional data file. S2 File Sequences used to generate the radial tree of the TOG superfamily. Sequences were renamed to facilitate visualization of the tree. The family name is followed by the 2 last digits of the TC numbers, separated by underscores, to identify the sytems: Family names followed the following convention: SW (Sweet), TS (TSUP), LC (LCT), NI (NiCoT), OS (OST), MR (MR), HE (HelioR), GP (GPCR), AR (ArsP), KD (KDELR), MP (MPC), and LS (LST). (FAA) Click here for additional data file. S3 File Tree of the TOG superfamily in nexus format. Individual sequences are named following the same format as S2 File . (TREE) Click here for additional data file.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1418929/

Efficient Translocation of EspC into Epithelial Cells Depends on Enteropathogenic Escherichia coli and Host Cell Contact

EspC is an autotransporter protein secreted by enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). The pathogenic role of EspC in EPEC infection is unknown. We have shown that the purified EspC produces enterotoxicity and cytotoxicity; for the latter effect, EspC must be internalized. However, the internalization mechanism is unknown. Here we show that azithromycin (an inhibitor of pinocytosis), but not drugs affecting caveole-, clathrin-, or receptor-mediated endocytosis, inhibited purified EspC internalization and cytoskeletal disruption, suggesting that purified EspC is internalized by pinocytosis. Furthermore, unlike in cholera toxin, we were unable to detect a receptor on epithelial cells by pretreatment at 4°C. Upon EspC entry, it is delivered directly into the cell cytosol, as shown by the fact that drugs that inhibit intracellular trafficking had no effect on cytoskeletal disruption. All these data suggest that purified EspC internalization is not a physiological internalization mechanism; hence, we explored EspC internalization during the infection of epithelial cells by EPEC. Like other EPEC virulence factors, EspC secretion is stimulated by EPEC when it is grown in cell culture medium and enhanced by the presence of epithelial cells. Physiologically secreted EspC was efficiently internalized during EPEC and host cell interaction. Additionally, the lack of EspC internalization caused by using an isogenic mutant prevented the cytopathic effect caused by EPEC. These data suggest that EPEC uses an efficient mechanism to internalize milieu-secreted EspC into epithelial cells; once inside the cells, EspC is able to induce the cytopathic effect caused by EPEC.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7725329/

Diversity and evolutionary dynamics of spore-coat proteins in spore-forming species of Bacillales

Among members of the Bacillales order, there are several species capable of forming a structure called an endospore. Endospores enable bacteria to survive under unfavourable growth conditions and germinate when environmental conditions are favourable again. Spore-coat proteins are found in a multilayered proteinaceous structure encasing the spore core and the cortex. They are involved in coat assembly, cortex synthesis and germination. Here, we aimed to determine the diversity and evolutionary processes that have influenced spore-coat genes in various spore-forming species of Bacillales using an in silico approach. For this, we used sequence similarity searching algorithms to determine the diversity of coat genes across 161 genomes of Bacillales. The results suggest that among Bacillales, there is a well-conserved core genome, composed mainly by morphogenetic coat proteins and spore-coat proteins involved in germination. However, some spore-coat proteins are taxa-specific. The best-conserved genes among different species may promote adaptation to changeable environmental conditions. Because most of the Bacillus species harbour complete or almost complete sets of spore-coat genes, we focused on this genus in greater depth. Phylogenetic reconstruction revealed eight monophyletic groups in the Bacillus genus, of which three are newly discovered. We estimated the selection pressures acting over spore-coat genes in these monophyletic groups using classical and modern approaches and detected horizontal gene transfer (HGT) events, which have been further confirmed by scanning the genomes to find traces of insertion sequences. Although most of the genes are under purifying selection, there are several cases with individual sites evolving under positive selection. Finally, the HGT results confirm that sporulation is an ancestral feature in Bacillus . Data Summary All supporting data and methods have been provided within the article or through supplementary data files. Five supplementary tables are available with the online version of this article. A full listing of NCBI accessions for strains used in this paper is available in Table S1 (available in the online version of this article). Biopython scripts to extract significant blast p hits used in this study are available at GitHub – https://github.com/HSecaira/Spore_coat_proteins_BLAST_extraction Impact Statement Species of Bacillales can form a highly resistant cell type, called a spore, under extreme environmental conditions. The spore is surrounded by a proteinaceous coat that mediates interactions with its environment. Spore-coat synthesis, assembly, maturation and spore germination is a complex multiprotein process in which more than 80 different proteins participate. This work provides unique insight into spore-coat protein functions and occurrence during early and later stages of coat synthesis, assembly and spore germination of the most significant spore-forming Bacillales. Similarly, at the Bacillus genus level, a large proportion of coat genes are under positive diversifying selection and/or balancing selection, suggesting high genetic diversity that may confer unique adaptation to ensure spore survival and efficient germination. These results demonstrate the value of comparative genomics to understand evolutionary changes among spore-coat proteins, helping to identify the most conserved or common among Bacillales, as well as the selective pressures working on coat genes that allow Bacillus species-particular interactions with the surrounding environment. Introduction The Bacillales order has great taxonomic and phylogenetic diversity and can thrive in many different environments [ 1 ]. Some members of this order are present in the human and mammalian gut microbiota [ 2, 3 ], while others are pathogens that cause foodborne diseases [ 4 ] or are important human pathogens [ 5–7 ]. A striking feature of the Bacillales is the ability to form a dormant cell type called the endospore or spore [ 8, 9 ]. Spores can survive a wide range of extreme environmental conditions, such as microbial predation, desiccation, heat, UV radiation and toxic chemicals [ 8–12 ]. The metabolic dormancy of spores permits them to remain in this state for hundreds of years [ 13 ]. In addition, the spore can sense its surrounding environment, and when growth conditions are favourable again, it germinates to generate a vegetative form of the bacteria [ 13–15 ]. To survive stress conditions, the bacterial cell undergoes an evolutionarily conserved process called sporulation to produce the spore structure. Sporulation begins in the stationary phase when nutrients begin to be scarce [ 16 ] and culminates in a mature spore composed of two external protective structures: the cortex, assembled between the inner and outer spore membranes, and the proteinaceous coat that is subjected to cross-linking [ 8, 16, 17 ]. Genomic DNA within the spore is contained in the partially dehydrated core [ 16 ]. The bacterial spore coat is a multilayered structure formed by specialized proteins. The endospore confers protection against adverse environmental conditions and contributes to spore environmental interactions, which may lead to germination to resume metabolic activity and growth [ 16, 17 ]. There is a high diversity in spore-coat morphologies among spore-forming species [ 8, 16 ]. Bacillus subtilis has been a major model organism to study spore-coat proteins using different approaches that include using transmission electron microscopy as well as biochemical and genetic tools [ 8 ]. The most internal layer of the spore coat is called the basement layer, which contains the proteins necessary for initiating coat assembly (SpoIVA, SpoVM, SpoVID) [ 8, 16 ]. The basement layer is followed by the inner layer, the outer coat and the crust [ 8 ]. Fig. 1 shows the positions of the four layers of the B. subtilis coat. Other spore-forming species, such as Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus also possess an exosporium [ 8, 16, 18 ], the outermost layer that surrounds the mature spore. It is composed of fine hair-like projections that may be involved in infections by B. anthracis [ 19 ]. Fig. 1. Model of spore-coat structure. Assembly of each layer depend on the multimerization of a morphogenetic coat protein and its dependent individual coat proteins. Four layers with its morphogenetic and morphogenetic-dependent coat proteins are shown: basement layer (red), inner layer (green), outer layer (yellow) and crust (purple). Spore-coat synthesis, assembly and maturation is a complex process involving multiple proteins and requiring several hours to complete [ 8 ]. Assembly of coat layers depends on morphogenetic coat proteins, such as SpoIVA, SpoVM, SpoVID, SafA, CotE, CotH, CotO, CotX, CotY, CotZ, as well as coat proteins that are dependent on these morphogenetic proteins [ 8, 16 ]. SpoIVA and SpoVM are required for spore-cortex formation, coat assembly, anchoring of the coat to the spore surface and spore encasement, whereas SpoVID is necessary for spore encasement [ 8, 16, 20 ]. CotE is the most critical protein for the assembly of the outer coat, and SafA is responsible for the assembly of the inner coat [ 8, 16, 21–23 ]. Several studies demonstrated the existence of a network of genetic interactions that consist of three independent modules: SpoIVA-dependent subnetwork, CotE-dependent subnetwork and SafA-dependent subnetwork [ 8, 24, 25 ], as shown in Fig. 2 . Fig. 2. Spore-coat protein interaction network in Bacillus subtilis . Morphogenetic and morphogenetic-dependent coat proteins interact with each other to form the four layers (basement layer, inner layer, outer layer, crust) of the spore coat. Recruitment of the morphogenetic coat proteins SafA and CotE depend on SpoIVA, whereas recruitment of CotO and CotX/Y/Z depend on CotE, the interaction network is highly hierarchical. Despite the existence of more than 80 different spore-coat proteins, studies have demonstrated that not all of them are required for coat synthesis, assembly, maturation and spore germination [ 8 , 16, 26, 27 ]. Indeed, most coat gene mutations are phenotypically silent or insignificant, except for the morphogenetic coat proteins that control the assembly of other coat proteins [ 8 ]. Similarly, external conditions, such as sporulation temperature, can affect the abundance, stability and proper function of morphogenetic and its dependent coat proteins, thus changing the structure and properties of the coat [ 28 ]. In this work, we wish to infer which coat proteins play a key role in spore-coat synthesis, assembly, maturation and environmental interactions that may promote spore germination and/or spore survival in endospore-forming species of Bacillales. We also seek to determine whether some coat proteins are better conserved within a given taxon. Likewise, we wanted to document any pattern of coat gene conservation that might indicate niche-specific adaptation, so we could discriminate among members of specific taxa that share coat proteins adapted to specific niches. Additionally, we focused on an evolutionary analysis of Bacillus, since in this genus we found the most complete set of spore-coat genes related to those found in our reference genome of B. subtilis . First, we aimed to define monophyletic groups inside the Bacillus genus. Using this information, we estimated the selective pressures and evolutionary histories acting upon the morphogenetic spore-coat proteins in each monophyletic group. Methods Sequence data and spore-coat-protein diversity analyses Based on a thorough literature review as of January 2019, we identified 86 genes that encode spore-coat proteins or proteins related to sporulation or germination process in B. subtilis , see Table 1 . Each gene sequence was downloaded from the SubtiWiki server ( http://subtiwiki.uni-goettingen.de/ ) [ 29 ]. In parallel, 161 annotated genomes of the Bacillales order were retrieved from NCBI's FTP server ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/microbes/ ). This dataset is composed of 60 genomes of the genus Bacillus and 101 genomes of non- Bacillus genera, representing the greatest diversity of spore-forming genera of Bacillales known so far, see Table S1. Table 1. Eighty-six spore-coat genes and their location in the genome of the model organism B. subtilis 168 Spore coat gene Locus Tag Location Function Domain* References cgeA BSU_19780 Crust Maturation of the outermost layer of the spore nd [ 8 ] cgeB BSU_19790 Crust Maturation of the outermost layer of the spore DUF3880†Glycosyl transferases group 1 [ 8 ] cgeC BSU_19770 nd Maturation of the outermost layer of the spore nd [ 8 ] cgeD BSU_19760 nd Maturation of the outermost layer of the spore Glycosyl transferase family 2 [ 8 ] cgeE BSU_19750 nd Maturation of the outermost layer of the spore Acetyltransferase (GNAT) [ 8 ] cotA BSU_06300 Outer layer Spore pigmentation Spore resistance Multicopper oxidase [ 8 ] cotB BSU_36050 Outer layer Spore resistance nd [ 8 , 26 ] cotC BSU_17700 Outer layer Spore resistance nd [ 8 , 26 ] cotD BSU_22200 Inner layer Spore resistance Inner spore coat protein D [ 8 , 26 ] cotE BSU_17030 Outer layer Assembly of the outer layer Outer spore coat protein E [ 8 , 26 ] cotF BSU_40530 Inner layer Spore resistance Coat F [ 8 , 26 , 110 ] cotG BSU_36070 Outer layer Spore resistance nd [ 8 ] cotH BSU_36060 Outer layer Assembly of the outer layer CotH kinase protein [ 8 , 26 ] cotI BSU_30920 nd Bacterial spore kinase Spore envelope Phosphotransferase enzyme [ 8 26 ] cotJA BSU_06890 Basement layer nd Spore coat associated protein JA [ 8 26 110 ] cotJB BSU_06900 Basement layer nd CotJB protein [ 8 26 , 110 ] cotJC BSU_06910 Basement layer Protection against oxidative estress Manganese containing catalase [ 8 26 , 110 ] cotM BSU_17970 Outer layer Spore resistance nd [ 8 26 ] cotO BSU_11730 Outer layer Assembly of the outer and crust layers Spore coat protein CotO [ 8 , 26 89 ] cotP BSU_05550 Inner layer Spore resistance Hsp20/alpha crystallin family [ 8 26 ] cotQ BSU_34520 Outer layer Spore protection nd [ 8 ] cotR BSU_34530 nd Spore lipolytic enzyme Hydrolysis of lysophospholipids Patatin-like phospholipase [ 8 ] cotS BSU_30900 Outer layer Bacterial spore kinase Spore resistance nd [ 8 26 ] cotSA BSU_30910 nd Transfer of glycosyl groups Glycosyl transferases group 1, 4 [ 8 26 ] cotT BSU_12090 Inner layer Spore resistance nd [ 8 ] cotU BSU_17670 Outer layer Spore resistance nd [ 8 26 ] cotV BSU_11780 Crust Spore resistance Spore Coat Protein X and V [ 8 ] cotW BSU_11770 Crust Spore resistance nd [ 8 ] cotX BSU_11760 Crust Assembly of the crust Spore Coat Protein X and V [ 8 ] cotY BSU_11750 Crust Assembly of the crust Spore coat protein Z [ 8 26 ] cotZ BSU_11740 Crust Assembly of the crust Spore coat protein Z [ 8 26 ] cwlJ BSU_02600 Inner layer Spore cortex lytic enzyme Cell Wall Hydrolase [ 8 ] gerPA BSU_10720 Inner layer Germination Spore germination protein gerPA/gerPF [ 8 ] gerPB BSU_10710 Inner layer Germination Spore germination GerPB [ 8 ] gerPC BSU_10700 Inner layer Germination Spore germination protein GerPC [ 8 ] gerPD BSU_10690 Inner layer Germination nd [ 8 ] gerPE BSU_10680 Inner layer Germination Spore germination protein GerPE [ 8 ] gerPF BSU_10670 Inner layer Germination Spore germination protein gerPA/gerPF [ 8 ] gerQ BSU_37920 Inner layer Germination CwlJ inhibitor Spore coat protein GerQ [ 8 ] gerT BSU_19490 Outer layer Germination nd [ 8 ] lipC BSU_04110 Basement layer Spore lipolytic enzyme GDSL-like Lipase/Acylhydrolase family [ 8 26 ] oxdD BSU_18670 Inner layer Protection against toxic compounds Cupin [ 8 ] safA BSU_27840 Inner layer Assembly of the inner layer LysM [ 8 26 ] spoIVA BSU_22800 nd Spore cortex formation, coat assembly and anchoring Stage IV sporulation protein A [ 8 26 ] spoVID BSU_28110 nd Spore encasement LysM [ 8 26 ] spoVM BSU_15810 nd Spore cortex formation, coat assembly, spore encasement Stage V sporulation protein family [ 8 26 ] spsB BSU_37900 Outer layer Spore polysaccharide synthesis CDP-Glycerol:Poly (glycerophosphate) glycerophosphotransferase [ 8 ] spsI BSU_37810 Outer layer Spore polysaccharide synthesis Nucleotidyl transferase [ 8 ] sscA BSU_09958 nd Spore assembly nd [ 8 ] tasA BSU_24620 nd nd Camelysin metallo-endopeptidase [ 26 ] tgl BSU_31270 Inner layer Introduction of cross-links in the coat for GerQ and SafA nd [ 8 26 ] yaaH BSU_00160 Inner layer N-Acetylglucosaminidase Survival of ethanol stress Glycosyl hydrolases family 18 [ 8 26 ] ydgA BSU_05560 nd nd Spore germination protein gerPA/gerPF [ 8 26 ] ydgB BSU_05570 nd nd Spore germination protein gerPA/gerPF [ 8 26 ] ydhD BSU_05710 nd Glycosylase Glycosyl hydrolases family 18 [ 8 26 ] yhaX BSU_09830 Basement layer Spore protection Haloacid dehalogenase-like hydrolase [ 8 26 ] yhbB BSU_08920 nd nd Putative amidase [ 8 26 ] yhcQ BSU_09180 nd nd Coat F [ 26 ] yheC BSU_09780 nd nd YheC/D like ATP-grasp [ 8 ] yheD BSU_09770 Basement layer Spore protection YheC/D like ATP-grasp [ 8 ] yhjQ BSU_10600 nd Prevention of copper toxicity DUF326†[ 8 26 ] yhjR BSU_10610 Inner layer Spore protection Rubrerythrin [ 8 26 ] yisY BSU_10900 Inner layer Spore protection Alpha/beta hydrolase fold [ 8 , 26 110 ] yjqC BSU_12490 Inner layer Protection against oxidative stress Manganese containing catalase [ 8 26 ] yjzB BSU_11320 Basement layer Spore protection nd [ 8 ] yknT BSU_14250 Outer layer Spore protection nd [ 8 26 ] ykvP BSU_13780 nd nd Glycosyl transferases group 1 [ 8 ] ykvQ BSU_13790 nd Glycosylase Glycosyl hydrolases family 18 [ 8 ] ykzQ BSU_13789 Outer layer nd LysM [ 8 ] ylbD BSU_14970 Outer layer Spore protection Putative coat protein [ 26 ] ymaG BSU_17310 Inner layer Spore protection nd [ 8 26 ] yncD BSU_17640 Outer layer Conversion of l -Ala to d -Ala Spore protection Alanine racemase [ 8 26 ] yppG BSU_22250 Basement layer Spore protection YppG-like protein [ 8 26 ] yraD BSU_26990 nd nd Coat F [ 26 110 ] yraF BSU_26960 nd nd Coat F [ 26 110 ] yraG BSU_26950 nd nd nd [ 110 ] ysnD BSU_28320 Inner layer Spore protection nd [ 8 ] ysxE BSU_28100 Inner layer Bacterial spore kinase Spore protection nd [ 8 26 ] ytdA BSU_30850 Outer layer Spore polysaccharide synthesis Nucleotidyl transferase [ 8 ] ytxO BSU_30890 Outer layer Spore protection nd [ 8 ] yutH BSU_32270 Inner layer Bacterial spore kinase Spore protection nd [ 8 26 ] yuzC BSU_31730 Inner layer Spore protection nd [ 8 ] ywrJ BSU_36040 nd nd nd [ 8 26 ] yxeE BSU_39580 Inner layer Spore protection nd [ 8 26 ] yybI BSU_40630 Inner layer Spore protection nd [ 8 ] yeeK BSU_06850 Inner layer Spore protection nd [ 8 26 ] nd , no data available. *Pfam database. †Domain of unknown function. We employed three different strategies to determine the presence/absence of spore-coat proteins in the selected Bacillales genomes: Local blast p was used to search for the 86 spore-coat protein homologues in the collection of Bacillales ( Bacillus and non- Bacillus ) genomes. For this, we created genome databases for all the 161 genomes of Bacillales and searched for all coat proteins in these databases. We considered all hits with a Bit score ≥40 and E -value 1) [ 53, 54 ] and 'M7 β distribution' ( ω 1) [ 55 ], and we performed a 'likelihood ratio test' (LRT) to select the model that best fits the given data. Values of ω 1 represent purifying, neutral, and positive selection, respectively [ 51 ] [ 52 ]. A P -value 1) [ 53, 54 ] and 'M7 β distribution' ( ω 1) [ 55 ], and we performed a 'likelihood ratio test' (LRT) to select the model that best fits the given data. Values of ω 1 represent purifying, neutral, and positive selection, respectively [ 51 ] [ 52 ]. A P -value <0.05 was considered to validate a result as significant. Horizontal gene transfer (HGT) analyses To search for HGT events in sporecoat genes, we employed the software Notung v2.9 [ 56 ] that reconciles a gene tree with a species tree to infer duplication-transfer-loss (DTL) event models with a parsimony-based optimization criterion [ 57 ]. Notung analyses all event histories for temporal feasibility. We selected the 'Prefix of the gene label' option to reconcile the trees. To infer DTL event models, Notung requires rooted trees. For this, we employed the software package beast v1.10.4 [ 38 ] to reconstruct the phylogeny for each spore-coat gene. The best-fit model of nucleotide substitution was inferred using the webserver SMS ( http://www.atgc-montpellier.fr/sms/ ) [ 36 ] with a likelihood-based criterion (AIC) for spore-coat genes. The phylogenetic reconstruction was set up to a strict molecular clock and a Coalescent Bayesian Skyline tree prior. Analyses were run for 10 million and 1000 as echo state. We employed Tracer v1.7 [ 41 ] to assess the effective sample size (ESS) values of the MCMC chains produced by beast , and to confirm that the analysis reached a convergence. Furthermore, TreeAnnotator v1.8.4 was employed to generate a maximum clade credibility tree that summarizes the information of sampled trees produced by beast . For the species tree, we used the tree reconstructed using core amino acid sequences as explained above. Notung HGT results were visualized as a donor-recipient network using Gephi v0.9.2 [ 58 ]. For this, we created 'edge tables' that contained the recipient and donor information. Then, each graph was set without edge direction (i.e. undirected) and displayed using the Force Atlas 2 algorithm with scaling=20 000, stronger gravity, overlap prevention and node size ranked by the number of node connections (i.e. number of HGT events). In order to reduce false positives, we scanned the genomes of the possible candidates of HGT events for traces of integrative, conjugative and mobile elements, based on the results provided by Notung. For this, we downloaded a region of the genome of approximately ten genes upstream and downstream from the spore-coat gene subjected to HGT from the NCBI's FTP server. Then, we used the detection tool 'WU- blast 2 search' of the web server ICEberg 2.0 [ http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/ , which is a database containing information about bacterial integrative and conjugative elements (ICEs), as well as integrative and mobilizable elements (IMEs), and cis -mobilizable elements (CIMEs)] [ 59 ]. Furthermore, we employed the Genomic Island Prediction Software v1.1.2 (GIPSy) [ 60 ] to detect if spore-coat genes under HGT events were present on genomic islands (GEIs). For this, we analysed each Bacillus genome against the most representative genome within each Bacillus group. Hits with an E -value less than 0.001 and a Bit score higher than 40 were considered as valid [ 30 ]. Results Spore-coat-protein diversity across Bacillales In order to understand the diversity of spore-coat proteins on Bacillales, we carried out three distinct methods ( blast , KEEG Orthology and Clustering) to identify the possible existence of 86 B. subtilis 168 spore-coat-protein homologues and related proteins within 161 genomes of Bacillales. Figs. 3 and 4 show which spore-coat protein homologues are present or absent across Bacillus and other spore-forming non- Bacillus species, respectively. The spore-coat proteins CotE, CotJA, CotJB, CotJC, CotR, CotSA, CwlJ, GerQ, SpoIVA, SpoVID, SpoVM and YhbB, originally found in B. subtilis are nearly ubiquitous among the Bacillales genomes analysed in this work. Other spore-coat proteins (GerPA, GerPB, GerPC, GerPD, GerPE and GerPF) are present in Alkalibacillus haloalkaliphilus , Amphibacillus , Geobacillus and Gracibacillus, Halalkalibacillus halophilus , Halobacillus, Paenibacillus beijingensis, Ornithinibacillus halophilus, some Paenibacillus, Paraliobacillus, Paucisalibacillus globulus, Piscibacillus halophilus, Pontibacillus, Tenuibacillus multivorans, Thalassobacillus, Tuberibacillus, some Virgibacillus and Vulcanibacillus modesticaldus (see Fig. 4 ). Overall, non- Bacillus species contain the secondarily significant spore-coat-protein homologues (see Methods for classification of significance) CgeD, CotH, CotR, CotSA, LipC, SpsI, YaaH, YdhD, YhaX, YhcQ, YheC, YheD, YisY, YjqC, YkvP, YkvQ, YkzQ, YlbD, YncD and YtdA. Other spore-coat proteins seem to be taxa-specific, such as CgeB among the Paenibacillus genus or the Geobacillus genus that contain the spore-coat proteins CotD, CotF, TasA, YppG, YraD, YraF, YraG, YutH and YuzC (see Fig. 4 ). Fig. 3. Consolidated heat map of 86 spore-coat-protein homologues over 60 genomes of Bacillus based on three methods: blast p, Clustering and KEGG Orthology. Primarily significant results (dark red) have been confirmed by the three methods, whereas secondarily significant results (orange and yellow) have been confirmed by either one or two methods. *Species and proteins are missing in the KEGG database. Fig. 4. Consolidated heat map of 86 spore-coat-protein homologsue over 101 genomes of non- Bacillus based on three methods: blast p, Clustering and KEGG Orthology. Primarily significant results (dark red) have been confirmed by the three methods, whereas secondarily significant results (orange and yellow) have been confirmed by either one or two methods. The spore-coat proteins CgeA, CgeB, CgeC, CotC, CotG, CotM, CotQ, CotT, CotU, CotV, CotW, CotX, GerT, YdgA, YdgB, YeeK, YjzB, YknT, YmaG, YsnD, YtxO, YwrJ and YxeE are poorly represented in the genomes of Bacillales other than B. subtilis and B. gibsonii (see Figs. 3 and 4 ). For instance, it has been previously reported that CotG is not highly conserved across the Bacillus genus, although its role may be carried out by a non-homologous CotG-like protein that has similar structural regions to CotG [ 61 ]. Therefore, we do not rule out the possibility that non-homologous coat-like proteins with similar structural and chemical features may perform the role of poorly conserved coat proteins. As expected, Halolactibacillus and Jeotgalicoccus genomes contain few spore-coat-protein homologues, since they are non-spore-forming species [ 62, 63 ]. Bacillus beveridgei and Exiguobacterium antarcticum also do not have spore-coat-protein homologues, as outlined by our criteria. Since most of the Bacillus species harbour many coat proteins, we focused on the study of the evolutionary dynamics of these proteins in the Bacillus genus. To achieve this goal, we first carried out a phylogenetic analysis to test the monophyly and delimitate internal groups in Bacillus . This analysis allowed us to distinguish between internal monophyletic groups that were already described and new ones (see below for further details). Subsequently, we performed an analysis of presence/absence of spore-coat proteins homologous proteins at the level of each phylogenetic group within the Bacillus genus. Results show that the Subtilis group possesses the most conserved spore-coat proteins (morphogenetic coat proteins, basement layer, inner layer, outer layer, crust) compared to other Bacillus groups and non- Bacillus spore-forming species. CotC, CotU (outer layer) and CotT (inner layer) are only present in B. subtilis and B. gibsonii . Other spore-coat proteins, such as CotI, CotR, CotSA, YdhD, YhbB, YheC, YkvP, YkvQ and TasA, whose localization has not yet been determined, are widely distributed among members of the Subtilis group (see Fig. 3 ). Our results reveal that morphogenetic spore-coat proteins (CotE, CotH, CotO, CotY, CotZ, SafA, SpoIVA, SpoVID and SpoVM) in the Cereus group are highly conserved. An exception is CotX, which is involved in the assembly of the crust [ 8 ]. Since coat assembly is a highly hierarchical process [ 8 ], other morphogenetic proteins present with the same role, such as CotY and CotZ, may take over the task to compensate for the absence of CotX. Nevertheless, the proteins CgeA, CotV, CotW that are part of the crust in B. subtilis are absent. Other spore-coat proteins (CotF, CotP, CotU, YmaG, YsnD, YuzC, YybI and YeeK) that are part of the inner layer are absent as well. Moreover, several spore-coat proteins present in the outer layer are absent despite the presence of the morphogenetic coat proteins, SpoIVA and CotE (see Fig. 3 ). In the Simplex group, several spore-coat-protein homologues of the crust, inner layer and outer layer are absent. This is not surprising given the absence of the morphogenetic coat proteins CotO, CotY, CotZ that control those processes [ 8 ]. Despite the absence of some spore-coat proteins of the outer and inner layer, in the Pumilus group, the great majority of spore-coat proteins and all the morphogenetic coat proteins are present, including those of the crust. Thus, a proper assembly of the spore coat is highly conserved in this group, which is beneficial for the high spore resistance previously reported [ 64 ]. In the Methanolicus group, the morphogenetic coat proteins CotO, CotH, CotX, and other spore-coat proteins of the crust, inner and outer layer are absent (see Fig. 3 ). Homologues of B. subtilis ' morphogenetic coat proteins CotH, CotX, CotO and CotZ that are responsible for the assembly of the outer layer and the crust are absent in the Coagulans group. Similarly, the Megaterium group does not have detectable protein homologues for CotX, CotY and CotZ. As expected, several spore-coat proteins of the outer layer dependent on CotH and CotO and proteins dependent on CotX, CotY and CotZ are also absent. Thus, the crust may be absent in both groups or possibly it is composed of different proteins, as the case of Bacillus megaterium that possesses an exosporium as the outermost layer of the coat [ 17 ]. However, the strain B. megaterium QM B1551 has an exosporium composed of plasmid-borne orthologues of B. subtilis cotW and cotX genes [ 65 ]. Further studies are needed to clarify these possibilities. The Halodurans group contains a lower number of coat-protein homologues compared to other Bacillus monophyletic groups described here. Except for CotE, this group does not harbour the morphogenetic coat proteins responsible for the assembly of the outer coat and the crust. Hence, as expected, several spore-coat-protein homologues dependent on those morphogenetic proteins are also absent (see Fig. 3 ). Monophyletic analyses We carried out a phylogenetic analysis to test the monophyly and delimitate internal groups in Bacillus . For this purpose, we used a phylogenomics approach that included 60 different Bacillus species. The reconstructed tree allowed us to distinguish eight internal groups, many of which were already known (i.e. Subtilis group, Cereus group), but others were not described, so we named them according to the dominant species in each group (Coagulans group, Megaterium group and Methanolicus group, Fig. 5 ). For hypothesis testing, we enforced the internal group under analysis to be monophyletic in the tree and compared it to the non-forced best tree. Results of monophyletic testing shown that the eight internal groups resolved as monophyletic with high support within the Bacillus genus (Table S3). Fig. 5. Phylogenetic tree reconstruction based on 60 genomes of Bacillus species to evidence internal monophyletic groups. The Subtilis group comprises a well-known species complex commonly found in soil and aquatic sediments with widespread distribution in nature. Members of this group, such as B. subtilis , compose the gut microflora of humans and other animals [ 66, 67 ]. This group shows valuable traits useful for biotechnological, industrial and agricultural applications [ 68, 69 ]. The Cereus group comprises human and plant pathogen species that can thrive in various environments ranging from low nutrient soil to intestinal flora of various animals [ 5–7, 70 ]. The Pumilus group was previously considered in the Subtilis group. However, the monophyly analysis shows enough robust support to consider it as a separate group from Subtilis. The Pumilus group contains species highly resistant to UV-light and H 2 O 2 due to the presence of the spore-coat proteins CotA and YjqC [ 64 ]. Members of the Coagulans group have been isolated from a wide variety of environments, such as the human gut and marine sediments [ 3, 71 ]. Members of the Megaterium group have been extensively used in industrial processes because their high capacity for the production of exoenzymes and ease of cloning genes for the production of recombinant proteins. Some members also are useful in bioremediation and agriculture as plant-growth promotion agents [ 72, 73 ]. Bacteria commonly found in soil and in extreme environments compose the Halodurans group. They have industrial applications, as they produce enzymes with useful activities [ 74 ]. It has been proposed that they could be used as probiotics to improve the intestinal microbial balance [ 75 ]. The Methanolicus group is characterized by bacteria isolated from fresh or groundwater, which have industrial potential [ 76, 77 ]. However, some members were associated with urinary tract infections [ 78 ]. The Simplex group harbours environmental bacteria usually found in soil; some isolates have also been found in the intestinal tract of humans [ 79 ]. Some members of this group are useful for industrial applications focused on the remediation of organic compounds, such as fatty acids and other compounds [ 80, 81 ]. Selection pressure forces In order to understand selection pressures acting on spore-coat genes, we employed the classical approaches of Tajima's D test and the d N /d S ratio (known also as omega, ω ) as well as two new methods (BUSTED, MEME) that use modern algorithms for detecting episodic positive selection in all or a subset of branches on a phylogeny. For this, we created spore-coat-gene datasets for each Bacillus group, based on the results of the consensus heat map. All significant results ( P -value <0.05) of spore-coat genes displaying evidence of positive selection on different Bacillus groups are reported in Table 2 . We successfully extracted and aligned 47 spore-coat genes for the Cereus group, 25 (53.2 %) of which were found to be evolving under positive selection either by having positively selected sites (MEME), being positively selected along its entire gene sequence (BUSTED) or because of possible balancing selection (Tajima's D). Coat genes of the basement layer ( cotJB, cotJC, spoVID, yheD, yppG ) account for 20% of positively selected genes. Similarly, the coat genes of the inner layer ( cotD, gerPC, gerPE, gerQ, safA, tgl, yaaH and yutH ) represent 32 %, whereas the outer layer genes ( cotA, cotB, cotS, yncD, ytdA ) represent 20%. Other coat genes ( cgeD, tasA, cotSA, ydhD, yhbB and yheC ) whose protein products have unknown localization, make up 24% of positively selected genes. Moreover, the morphogenetic coat genes cotZ, spoVID and safA seem to be under positive selection. Table 2. Five summary statistics (Tajima's D, BUSTED, MEME, d N /d S (branch and site models) showing positive selection across different Bacillus groups Cereus group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cgeD 0.77594 0.5 1†0.21094 M1:Nearly neutral 0.2315 M8: β distribution+positive selection 0.2358 cotA −0.18419 0.5 5†0.23041 M2:Positive selection 0.2599 M8: β distribution+positive selection 0.2496 cotB −0.18491 0.5 1†0.24867 M1:Nearly neutral 0.3770 M7: β distribution 0.2904 cotD 0.89921 0.018†2†0.10672 M1:Nearly neutral 0.1481 M7: β distribution 0.1419 cotJB 2.49259‡ 0.145 0 na§ na§ cotJC 1.12785 0.47 1†0.02253 M1:Nearly neutral 0.0301 M7: β distribution 0.0234 cotS −0.12103 0.5 1†0.10342 M1:Nearly neutral 0.1290 M7: β distribution 0.1121 cotSA 0.25413 0.5 3†0.15863 M1:Nearly neutral 0.1975 M8: β distribution+positive selection 0.1988 cotZ 0.04527 0.101 1†0.20776 M1:Nearly neutral 0.2808 M8: β distribution+positive selection 0.2700 gerPC 0.2173 0.028* 1†0.10771 M1:Nearly neutral 0.1678 M7: β distribution 0.1212 gerPE 0.39382 0.414 1†0.14856 M1:Nearly neutral 0.1796 M7: β distribution 0.1621 gerQ 0.62352 0.049* 1†0.05734 M1:Nearly neutral 0.1083 M7: β distribution 0.0670 safA 0.24669 0* 9†0.12459 M1:Nearly neutral 0.1614 M8: β distribution+positive selection 0.1470 spoVID −0.08138 0.5 1†0.15641 M1:Nearly neutral 0.2082 M7: β distribution 0.1764 tasA 0.74152 0.062 2†0.18312 M1:Nearly neutral 0.3561 M7: β distribution 0.2056 tgl 0.28166 0.358 1†0.087 M1:Nearly neutral 0.1146 M7: β distribution 0.0939 yaaH 0.42629 0.5 1†na§ na§ ydhD 0.42629 0.495 1†0.03899 M1:Nearly neutral 0.0584 M7: β distribution 0.0428 yhbB 0.07332 0.5 1†na§ na§ yheC 0.45696 0.454 3†0.15124 M1:Nearly neutral 0.2175 M7: β distribution 0.1732 yheD 0.45696 0.454 3†0.15124 M1:Nearly neutral 0.2175 M7: β distribution 0.1732 yncD −0.29741 0.447 3†0.10343 M1:Nearly neutral 0.1422 M7: β distribution 0.1105 yppG 0.08813 0.002†1‡ 0.13435 M1:Nearly neutral 0.2096 M8: β distribution+positive selection 0.2261 ytdA 0.48066 0.106 1‡ 0.07142 M1:Nearly neutral 0.0897 M7: β distribution 0.0844 yutH −0.12103 0.5 1†0.10342 M1:Nearly neutral 0.1290 M7: β distribution 0.1121 Coagulans group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cgeD 2.40675‡ 0.5 1†0.3661 M1:Nearly neutral 0.5498 M7: β distribution 0.4664 cotD 2.12158‡ 0.5 0 0.16022 M1:Nearly neutral 0.2505 M7: β distribution 0.2142 cotJC 1.63432 0.5 1†0.03028 M1:Nearly neutral 0.0204 M7: β distribution 0.0348 cotY 2.37‡ 0.177 0 0.10084 M1:Nearly neutral 0.2236 M7: β distribution 0.1225 gerPA 2.42801‡ 0.5 1†0.02311 M1:Nearly neutral 0.1871 M7: β distribution 0.0415 gerPB 2.71776‡ 0.5 0 0.14422 M1:Nearly neutral 0.4187 M7: β distribution 0.1980 gerPD 2.06706‡ 0.5 0 0.10075 M1:Nearly neutral 0.1634 M7: β distribution 0.1105 gerPE 2.43753‡ 0.5 0 0.16536 M1:Nearly neutral 0.2685 M7: β distribution 0.1991 gerQ 2.03383‡ 0.5 0 0.09011 M1:Nearly neutral 0.3678 M7: β distribution 0.1817 spoIVA 1.86222‡ 0.282 0 0.03558 M1:Nearly neutral 0.0755 M7: β distribution 0.0471 spsI 2.131‡ 0.5 0 0.05597 M1:Nearly neutral 0.1365 M7: β distribution 0.0653 yaaH 2.04839‡ 0†1†0.08248 M1:Nearly neutral 0.1914 M7: β distribution 0.1098 ydhD 2.36117‡ 0.5 1†0.00316 M1:Nearly neutral 0.1918 M7: β distribution 0.0680 yhbB 2.16596‡ 0.5 0 0.10258 M1:Nearly neutral 0.3634 M7: β distribution 0.1723 yjqC 1.63432 0.315 1†0.03028 M1:Nearly neutral 0.0482 M7: β distribution 0.0348 yppG 2.90119‡ 0.5 1†0.00759 M1:Nearly neutral 0.5161 M7: β distribution 0.2385 ytdA 2.2359‡ 0* 0 0.04891 M1:Nearly neutral 0.1840 M7: β distribution 0.0573 yuzC 2.79561‡ 0.5 0 0.20748 M1:Nearly neutral 0.4965 M7: β distribution 0.3580 Halodurans group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cotE 2.33501‡ 0* 0 0.04718 M1:Nearly neutral 0.2401 M7: β distribution 0.0699 cwlJ 2.22293‡ 0.5 1†0.0022 M1:Nearly neutral 0.0645 M7: β distribution 0.0033 gerQ 1.97623 0.5 1†0.10825 M1:Nearly neutral 0.2912 M8: β distribution+positive selection 0.3657 spoIVA 2.10434‡ 0.5 0 na§ na§ tgl 2.64696‡ 0.467 0 0.14067 M1:Nearly neutral 0.4113 M7: β distribution 0.2242 yhaX 2.47692‡ 0.382 1†0.11997 M1:Nearly neutral 0.2107 M7: β distribution 0.1415 yjqC 1.46076 0.5 1†0.09556 M1:Nearly neutral 0.2018 M8: β distribution+positive selection 0.1790 yraG 2.12556 0.5 1†0.25053 M1:Nearly neutral 0.3815 M7: β distribution 0.3218 ytdA 2.29913‡ 0.5 0 0.04657 M1:Nearly neutral 0.1857 M7: β distribution 0.0672 Megaterium group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) gerT 1.19483 0.023* 0 0.18757 M1:Nearly neutral 0.3623 M7: β distribution 0.2610 spoVID 1.06769 0.5 1†0.21812 M1:Nearly neutral 0.3907 M8: β distribution+positive selection 0.3623 tgl 1.45908 0.006* 0 0.04185 M1:Nearly neutral 0.4516 M7: β distribution 0.0569 yaaH 0.96821 0.5 1†0.00371 M1:Nearly neutral 0.0448 M7: β distribution 0.0062 yncD 1.23026 0.046* 2†0.18115 M1:Nearly neutral 0.3629 M7: β distribution 0.2489 ysxE 0.75614 0.5 1†0.08323 M1:Nearly neutral 0.1546 M7: β distribution 0.0946 yuzC 1.73735 0.052 1†0.06424 M1:Nearly neutral 0.8243 M7: β distribution 0.0789 Methanolicus group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (ite models ) cotE 1.62664 0.047* 0 0.10272 M1:Nearly neutral 0.1996 M7: β distribution 0.1170 cotF 2.45173‡ 0.496 0 0.08622 M1:Nearly neutral 0.0984 M7: β distribution 0.0982 cotJA 2.05089‡ 0 0 0.1059 M1:Nearly neutral 0.2046 M7: β distribution 0.1504 cotJB 2.10987‡ 0.5 0 0.01056 M1:Nearly neutral 0.1407 M7: β distribution 0.0147 cotJC 2.09006‡ 0.496 1†0.02096 M1:Nearly neutral 0.0269 M7: β distribution 0.0233 cotSA 2.6247‡ 0.5 0 0.05597 M1:Nearly neutral 0.1369 M7: β distribution 0.0651 gerPA 2.20951‡ 0.5 0 0.0751 M1:Nearly neutral 0.1302 M7: β distribution 0.0870 gerPB 2.58274‡ 0.168 0 0.00305 M1:Nearly neutral 0.3324 M7: β distribution 0.0064 gerPD 2.52437‡ 0.5 0 0.03528 M1:Nearly neutral 0.0866 M7: β distribution 0.0427 gerPE 2.34308‡ 0.5 0 0.12838 M1:Nearly neutral 0.2792 M7: β distribution 0.1646 gerPF 2.16055‡ 0.001†0 0.06189 M1:Nearly neutral 0.1556 M7: β distribution 0.0677 spoIVA 2.37156‡ 0.5 0 0.02067 M1:Nearly neutral 0.0334 M7: β distribution 0.1654 yaaH 2.11824‡ 0.078 2†0.05627 M1:Nearly neutral 0.1392 M7: β distribution 0.0705 ydhD 2.32379‡ 0.279 2†0.05453 M1:Nearly neutral 0.1255 M8: β distribution+positive selection 0.0832 yhaX 2.10645‡ 0.5 1†0.0897 M1:Nearly neutral 0.1595 M8: β distribution+positive selection 11.1381 yhcQ 1.92212‡ 0.5 0 0.08651 M1:Nearly neutral 0.2220 M7: β distribution 0.1056 yhjR 2.19329‡ 0.5 0 0.13211 M1:Nearly neutral 0.3260 M7: β distribution 0.1913 ylbD 2.39017‡ 0.062 0 0.1214 M1:Nearly neutral 0.3662 M7: β distribution 0.1761 yncD 2.29644‡ 0.5 1†0.09177 M1:Nearly neutral 0.2860 M7: β distribution 0.1239 yraF 2.20974 0.039†0 0.0359 M1:Nearly neutral 0.0781 M7: β distribution 0.0451 yraG 2.43863‡ 0.5 0 0.06799 M1:Nearly neutral 0.1791 M7: β distribution 0.0896 ytdA 2.70168‡ 0.5 0 0.01055 M1:Nearly neutral 0.2670 M7: β distribution 0.1097 yutH 2.28896‡ 0.5 3†0.11558 M1:Nearly neutral 0.3214 M7: β distribution 0.1588 yuzC 2.82223‡ 0.5 0 0.09933 M1:Nearly neutral 0.3239 M7: β distribution 0.1406 Pumilus group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (Site models ) cgeB 0.82607 0.044* 0 0.21246 M1:Nearly neutral 0.2692 M7: β distribution 0.2446 cotH 0.77125 0.5 1†0.09965 M1:Nearly neutral 0.1270 M7: β distribution 0.1097 cotM 0.85448 0.187 1†na§ na§ cotS 0.82748 0.5 1†0.06266 M1:Nearly neutral 0.0795 M7: β distribution 0.0695 cwlJ 0.83023 0.06 1†0.04195 M1:Nearly neutral 0.0587 M7: β distribution 0.0542 gerPD −0.13219 0.03* 0 na§ na§ lipC 0.8556 0.04 1†na§ na§ spoVID 1.21538 0.481 2†0.19841 M1:Nearly neutral 0.2420 M7: β distribution 0.2382 yheC 0.70157 0.5 1†0.27466 M1:Nearly neutral 0.3078 M7:β distribution 0.2939 yisY 0.60511 0.5 1†0.18592 M1:Nearly neutral 0.2201 M7: β distribution 0.2045 yjqC 2.41476‡ 0.5 0 na§ na§ yutH 0.82748 0.5 1†0.06266 M1:Nearly neutral 0.0795 M7: β distribution 0.0695 Simplex group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cotD 0.82064 0.001* 0 0.14089 M1:Nearly neutral 0.2331 M7: β distribution 11.2858 cotH 1.02307 0.5 3†0.10615 M1:Nearly neutral 0.1827 M7: β distribution 0.1246 cotX 0.85129 0.5 1†0.10962 M1:Nearly neutral 0.1725 M7: β distribution 0.1319 gerPE 1.38199 0.442 1†0.25448 M1:Nearly neutral 0.4100 M7: β distribution 0.3257 gerT 0.82125 0.5 1†0.15016 M1:Nearly neutral 0.2152 M7: β distribution 0.1772 spoVID 1.21956 0.288 1†0.21728 M1:Nearly neutral 0.3437 M7: β distribution 0.2686 ydhD 0.58553 0.5 1†0.05483 M1:Nearly neutral 0.0752 M7: β distribution 0.0595 yheD 1.13466 0.187 1†0.06729 M1:Nearly neutral 0.0824 M7: β distribution 0.0724 yisY 2.14444 0.5 1†0.07518 M1:Nearly neutral 0.0921 M7: β distribution 0.0775 yppG 0.6223 0.5 1†0.12362 M1:Nearly neutral 0.2617 M7: β distribution 0.1506 Subtilis group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cgeA 1.83274 0.5 1†0.20934 M1:Nearly neutral 0.3500 M7: β distribution 0.2598 cgeB 1.99094‡ 0.277 2†0.19573 M1:Nearly neutral 0.2863 M7: β distribution 0.2252 cgeD 1.79061 0.5 1†0.19155 M1:Nearly neutral 0.2917 M7: β distribution 0.2294 cgeE 2.63941‡ 0.5 5†0.18444 M1:Nearly neutral 0.3187 M7: β distribution 0.2035 cotA 2.31807‡ 0.367 2†0.10535 M1:Nearly neutral 0.1527 M7: β distribution 0.1138 cotB 1.76891 0* 4†0.22824 M1:Nearly neutral 0.3445 M7: β distribution 0.2801 cotD 0.93573 0.5 1†na§ na§ cotE 2.09262‡ 0.48 1†na§ na§ cotF 2.19577‡ 0.133 2†0.08357 M1:Nearly neutral 0.1216 M7: β distribution 0.0923 cotG 0.79192 0.478 2†0.19177 M1:Nearly neutral 0.2831 M7: β distribution 0.2336 cotH 2.56746‡ 0.5 2†0.10377 M1:Nearly neutral 0.1657 M7: β distribution 0.1152 cotJA 2.1477‡ 0.259 1†0.10669 M1:Nearly neutral 0.1841 M7: β distribution 0.1277 cotJB 2.49259‡ 0.339 0 0.10261 M1:Nearly neutral 0.1765 M7: β distribution 0.1148 cotM 2.35214‡ 0.403 0 0.18183 M1:Nearly neutral 0.3447 M7: β distribution 0.2176 cotO 2.26548‡ 0.5 3†0.22212 M1:Nearly neutral 0.4142 M8: β distribution+positive selection 0.4033 cotP 1.96543‡ 0.5 0 na§ na§ cotV 1.89032 0.291 1†0.23489 M1:Nearly neutral 0.2755 M7: β distribution 0.2484 cotW 1.96128 0.486 2†0.20479 M1:Nearly neutral 0.3099 M7: β distribution 0.2219 cotX 1.7908 0.37 1†0.10867 M1:Nearly neutral 0.1518 M7: β distribution 0.1157 cotY 2.0907‡ 0.5 1†0.06725 M1:Nearly neutral 0.1107 M7: β distribution 0.0735 cotZ 2.08360‡ 0.376 1†0.11551 M1:Nearly neutral 0.1953 M7: β distribution 0.1282 cwlJ 1.79177 0.5 1†0.07168 M1:Nearly neutral 0.1272 M7: β distribution 0.0778 gerPB 2.52228‡ 0.5 1†0.14965 M1:Nearly neutral 0.3683 M7: β distribution 0.2129 gerPC 2.02921‡ 0.5 1†0.11727 M1:Nearly neutral 0.1948 M7: β distribution 0.1287 gerPD 1.95737 0.109 1†0.13235 M1:Nearly neutral 0.2282 M7: β distribution 0.1540 gerPE 2.59394‡ 0.5 1†na§ na§ gerPF 1.30604 0.012* 1†na§ na§ gerQ 2.02092‡ 0.372 0 0.10469 M1:Nearly neutral 0.1790 M8: β distribution+positive selection 0.1383 gerT 2.55712‡ 0.5 2†0.13045 M1:Nearly neutral 0.2122 M7: β distribution 0.1576 lipC 2.75952‡ 0.5 1†na§ na§ oxdD 2.83684‡ 0.478 4†0.06435 M1:Nearly neutral 0.1317 M7: β distribution 0.0733 safA 2.31936‡ 0.005†2†0.16678 M1:Nearly neutral 0.2750 M7: β distribution 0.1930 spoIVA 2.12249‡ 0.5 0 0.01660 M1:Nearly neutral 0.0299 M7: β distribution 0.0192 spoVID 2.66623‡ 0.315 9†0.29849 M1:Nearly neutral 0.5939 M8: β distribution+positive selection 0.5141 spsB 1.71279 0.5 2†0.15996 M1:Nearly neutral 0.2592 M7:β distribution 0.1872 spsI 1.63797 0.304 1†0.07904 M1:Nearly neutral 0.1207 M7:β distribution 0.0886 tasA 2.27556‡ 0.281 2†0.08090 M1:Nearly neutral 0.1036 M7:β distribution 0.0865 tgl 2.36389‡ 0.5 4†na§ na§ yaaH 2.33413‡ 0.024* 5†0.08289 M1:Nearly neutral 0.1270 M7:β distribution 0.0896 ydgB 1.80839 0.011* 0 na§ na§ ydhD 2.32146‡ 0.5 5†0.09731 M1:neutral 0.1422 M7:β distribution 0.1082 yhaX 2.14372‡ 0.421 1†0.06610 M1: Nearly neutral 0.0933 M8: β distribution+positive selection 0.0800 yhbB 2.26467‡ 0.5 0 0.12273 M1:Nearly neutral 0.2253 M7:β distribution 0.1403 yhcQ 2.39963‡ 0.013* 3†0.07439 M1:Nearly neutral 0.0897 M7:β distribution 0.0775 yheC 2.54815‡ 0.5 2†0.10043 M1:Nearly neutral 0.1435 M7:β distribution 0.1088 yheD 2.57861‡ 0.34 4†0.13014 M1:Nearly neutral 0.2168 M7:β distribution 0.1471 yhjQ 1.74733 0.492 1†na§ na§ yhjR 2.72348‡ 0.199 2†na§ na§ yisY 1.97894‡ 0.453 2†0.11089 M1:Nearly neutral 0.1518 M7:β distribution 0.1182 yjqC 2.68998‡ 0.196 1†na§ na§ yjzB 2.59674‡ 0.478 1†na§ na§ yknT 2.47907‡ 0.5 5†0.20519 M1:Nearly neutral 0.3589 M7:β distribution 0.2389 ylbD 2.10676‡ 0.494 1†na§ na§ yncD 1.46348 0.5 1†0.13442 M1:Nearly neutral 0.1868 M7:β distribution 0.1452 yppG 2.31307‡ 0.5 0 0.23211 M1:Nearly neutral 0.4261 M7:β distribution 0.3108 yraD 2.42924‡ 0.499 1†na§ na§ yraG 1.47157 0.498 1†0.09399 M1:Nearly neutral 0.1273 M7:β distribution 0.1089 ysxE 2.27601‡ 0.5 1†0.14151 M1:Nearly neutral 0.2254 M7:β distribution 0.1583 ytdA 2.28755‡ 0* 0 0.03920 M1:Nearly neutral 0.0683 M8:β distribution+positive selection 0.0532 yutH 2.36638‡ 0.391 3†0.11151 M1:Nearly neutral 0.1723 M8:β distribution+positive selection 0.1548 yuzC 2.63657‡ 0.359 1†0.22296 M1:Nearly neutral 0.3048 M7:β distribution 0.2438 ywrJ 1.89712 0.5 1†0.14905 M1:Nearly neutral 0.2068 M7:β distribution 0.1696 yybI 0.53608 0.338 1†0.20922 M1:Nearly neutral 0.2922 M7:β distribution 0.2464 *P value provided by BUSTED. A P value <0.05 indicates evidence of positive selection of the gene †Number of significant sites under positive selection by MEME. ‡Significant at a P value <0.05. §dN/dS values could not be computed in CodeML due to small branch size. In the Coagulans group, the coat genes gerPC, gerPF, gerT, lipC, spoVID, yhaX, yhcQ, yheC, yheD, ylbD, yncD, ysxE, and yutH were highly divergent, except at conserved domains, and could not be properly aligned. Therefore, we discarded those genes and analysed the remaining 23 well-aligned spore coat genes, 18 (78.3 %) of which were found to be under positive selection. Coat genes of the basement layer ( cotJC, spoIVA, yppG ) account for 16.6% of positively selected genes. Likewise, cotD, gerPA, gerPB, gerPD, gerPE, gerQ, yaaH, yjqC, and yuzC (inner layer), spsI, ytdA (outer layer), cgeD, ydhD, and yhbB, (localization class unknown) make up 50 11.1 and 16.6 %, respectively, of coat genes under positive selection. Interestingly, cotY, the only coat gene of the crust present in this group, is under positive balancing selection (or population contraction), according to Tajima's D. The great majority of extracted coat genes ( cotA, cotF, cotJC, cotSA, cotX, lipC, safA, spoVID, spsI, yaaH, ydhD, yhbB, yhcQ, ylbD, yncD, yraD, yraF, ysxE, and yutH ) in the Halodurans group were highly divergent outside conserved domains and could not be properly aligned. Therefore, only 10 spore coat genes (Table S2) were analysed, 9 (90 %, see Table 2 ) of which are under positive selection and the rest of genes are under neutral or negative selection (Table S4). The morphogenetic coat gene spoIVA and yhaX are the only coat genes of the basement layer evolving under positive selection. Our results show that other coat genes, such as cwlJ, gerQ, tgl, and yjqC (inner layer), cotE, ytdA (outer layer), and yraG seem to be under positive selection detected either by Tajima's D, MEME, or BUSTED. In the Megaterium group, we extracted and aligned 35 coat genes, 7 (20 %) of which show traces of positive selection. Coat genes of the inner layer ( tgl, yaaH, ysxE, and yuzC ) account for the majority of positively selected genes, whereas only two genes ( gerT and yncD ) of the outer layer are under positive selection. Additionally, spoVID is the only the morphogenetic coat gene evolving under positive selection in this group. Methanolicus group coat genes with sequences that were highly diverged from reference genes ( cotD, cotM, tasA, cotP, cotS, cotY, cotZ, gerPC, gerT, lipC, spoVID, spsI, tgl, yhbB, yheC, yheD, yjqC, yppG, ysxE , and yybI ) , were not further analysed. However, we successfully aligned 29 spore coat genes in this group, 24 (82.8 %) of which show evidence of positive selection according to Tajima's D, MEME, or BUSTED. The majority of positively selected genes belong to the inner layer of the coat ( cotF, gerPA, gerPB, gerPD, gerPE, gerPF, yaaH, yhjR, yutH, and yuzC ), accounting for 41.6% of positively selected genes. Genes of the basement ( cotJA, cotJB, cotJC, spoIVA, yhaX ) and outer layer ( cotE, ylbD, yncD, and ytdA ) account for 20.8 and 16.6% of genes under positive selection, respectively. Coat genes corresponding to proteins whose localization has not been determined contribute to 20.8% of positively selected genes. In the Pumilus group, we extracted and analysed 55 coat genes, 12 (21.8 %) of which were found to be under positive selection, either along the entire gene sequence or at individual sites. In this group, spore coat genes of the crust are highly conserved and cgeB seems to be positively selected along its entire gene sequence. Coat genes of the basement ( lipC, spoVID ), inner ( cwlJ, gerPD, yisY, yjqC, yutH ) and outer layer ( cotH, cotM, cotS ) also show evidence of positive selection. On the other hand, in the Simplex group, we retrieved and analysed 40 spore coat genes, 10 (25 %) of which are under positive selection. The morphogenetic coat genes cotH, cotX, and spoVID of the outer, crust, and basement layer are under positive selection. It is worth mentioning that cotX is the only coat gene belonging to the crust present in this group. The proteins present in the crust are critical for interaction with the environment. Thus the ability to adhere to and survive on variable surface structures could be a key factor that promotes diversity in coat structure and composition [ 20 ]. Furthermore, coat genes of the basement layer ( spoVID , yheD , and yppG ), inner layer ( cotD , gerPE , and yisY ), outer layer ( cotH , and gerT ), crust ( cotX ), and ydhD (localization not determined) represent 30, 30, 20, 10, and 10% of the total positively selected genes, respectively. The Subtilis group possess the most conserved core of spore coat proteins compared to other groups analysed in this work. This is expected, since all analyses performed here used B. subtilis as a reference to determine the abundance and diversity of spore coat proteins (see Discussion section for further comments). We extracted, aligned, and analysed 77 coat genes, 63 (81.8 %) of which show significant evidence of positive selection detected by Tajima's D, MEME, and/or BUSTED. Nearly all morphogenetic coat protein genes of the basement (except spoVM ), inner, outer layer, and crust are positively selected or show sites under positive selection. For instance, coat genes of the basement layer, inner layer, outer layer, crust, and coat genes of localization not determined account for 14.3, 31.7, 22.2, 11.1, and 20.6% of the total positively selected genes, respectively (see Table 2 ). In addition, coat genes not included in Table 2 , are under purifying selection (ω <1), according to CodeML site and branch models (see Table S4). Horizontal gene transfer (HGT) HGT events can be detected by phylogenetic incongruences [ 82 ]. Additionally, traces of the mechanism of transfer, such as independently conjugative plasmids, integrated prophages, integrative transposons, GEIs, and other unclassified mobile genetic elements may further confirm HGT events [ 82–84 ]. Spore coat genes that displayed evidence of HGT are shown as donor-recipient networks in Fig. 6 for the eight monophyletic groups in Bacillus . Most spore coat genes have been recently transferred, since HGT events are displayed at or near the branch tips of their reconciled phylogenetic trees (not shown) unless otherwise stated. The Cereus group has 37 spore coat genes that have undergone HGT events, according to Notung. Spore coat genes of this group, such as cotD, cotJA, cotY, gerPD, gerPE, yncD have undergone HGT events near the bottom of their reconciled phylogenetic trees. The morphogenetic coat genes safA and spoVID have also undergone HGT events. The Coagulans group has 13 spore coat genes that were laterally transferred between species of this group. According to our results, cotY is the only morphogenetic coat gene showing evidence of a recent HGT event. The Halodurans group has six coat genes that have undergone HGT events. The Methanolicus group harbours 19 coat genes that show evidence for HGT events. spoVM is the only morphogenetic coat gene that has been laterally transferred in the Halodurans and Methanolicus groups. Fig. 6. Spore coat genes under HGT events as donor-recipient networks in the Cereus (pink), Coagulans (magenta), Halodurans (yellow), Methanolicus (green), Pumilus (dark red), Simplex (navy blue), and Subtilis (blue). Edges, nodes and size of nodes represent HGT events, genomes and number of HGT events per genome respectively. In the Megaterium, Pumilus, and Simplex groups, 2, 10, and 14 coat genes, respectively, have been laterally transferred ( Fig. 6 ). The morphogenetic coat genes that control the assembly of the crust, cotX and cotY , are the only morphogenetic coat proteins under HGT events in the Pumilus group. On the other hand, most HGT events of the Simplex group occur between B. butanolivorans and B. simplex . In the Subtilis group, about half of its coat genes (33) have undergone HGT events. Most of the HGT events in this group occur near the tips of the reconciled phylogenetic trees. However, the coat genes cotD, yjqC, yraF, yraG , and ytdA show evidence of HGT near the bottom of reconciled phylogenetic trees, according to Notung ( Fig. 6 ), suggesting an ancient transfer of the genes. All these HGT events have been further confirmed by ICEs ( I ntegrative and C onjugative E lements) using WU- blast 2 of the webserver ICEBerg, see Table S5. Analysis to detect the presence of spore coat genes in genomic islands shows their complete absence in these genomic elements. Spore-coat-protein diversity across Bacillales In order to understand the diversity of spore-coat proteins on Bacillales, we carried out three distinct methods ( blast , KEEG Orthology and Clustering) to identify the possible existence of 86 B. subtilis 168 spore-coat-protein homologues and related proteins within 161 genomes of Bacillales. Figs. 3 and 4 show which spore-coat protein homologues are present or absent across Bacillus and other spore-forming non- Bacillus species, respectively. The spore-coat proteins CotE, CotJA, CotJB, CotJC, CotR, CotSA, CwlJ, GerQ, SpoIVA, SpoVID, SpoVM and YhbB, originally found in B. subtilis are nearly ubiquitous among the Bacillales genomes analysed in this work. Other spore-coat proteins (GerPA, GerPB, GerPC, GerPD, GerPE and GerPF) are present in Alkalibacillus haloalkaliphilus , Amphibacillus , Geobacillus and Gracibacillus, Halalkalibacillus halophilus , Halobacillus, Paenibacillus beijingensis, Ornithinibacillus halophilus, some Paenibacillus, Paraliobacillus, Paucisalibacillus globulus, Piscibacillus halophilus, Pontibacillus, Tenuibacillus multivorans, Thalassobacillus, Tuberibacillus, some Virgibacillus and Vulcanibacillus modesticaldus (see Fig. 4 ). Overall, non- Bacillus species contain the secondarily significant spore-coat-protein homologues (see Methods for classification of significance) CgeD, CotH, CotR, CotSA, LipC, SpsI, YaaH, YdhD, YhaX, YhcQ, YheC, YheD, YisY, YjqC, YkvP, YkvQ, YkzQ, YlbD, YncD and YtdA. Other spore-coat proteins seem to be taxa-specific, such as CgeB among the Paenibacillus genus or the Geobacillus genus that contain the spore-coat proteins CotD, CotF, TasA, YppG, YraD, YraF, YraG, YutH and YuzC (see Fig. 4 ). Fig. 3. Consolidated heat map of 86 spore-coat-protein homologues over 60 genomes of Bacillus based on three methods: blast p, Clustering and KEGG Orthology. Primarily significant results (dark red) have been confirmed by the three methods, whereas secondarily significant results (orange and yellow) have been confirmed by either one or two methods. *Species and proteins are missing in the KEGG database. Fig. 4. Consolidated heat map of 86 spore-coat-protein homologsue over 101 genomes of non- Bacillus based on three methods: blast p, Clustering and KEGG Orthology. Primarily significant results (dark red) have been confirmed by the three methods, whereas secondarily significant results (orange and yellow) have been confirmed by either one or two methods. The spore-coat proteins CgeA, CgeB, CgeC, CotC, CotG, CotM, CotQ, CotT, CotU, CotV, CotW, CotX, GerT, YdgA, YdgB, YeeK, YjzB, YknT, YmaG, YsnD, YtxO, YwrJ and YxeE are poorly represented in the genomes of Bacillales other than B. subtilis and B. gibsonii (see Figs. 3 and 4 ). For instance, it has been previously reported that CotG is not highly conserved across the Bacillus genus, although its role may be carried out by a non-homologous CotG-like protein that has similar structural regions to CotG [ 61 ]. Therefore, we do not rule out the possibility that non-homologous coat-like proteins with similar structural and chemical features may perform the role of poorly conserved coat proteins. As expected, Halolactibacillus and Jeotgalicoccus genomes contain few spore-coat-protein homologues, since they are non-spore-forming species [ 62, 63 ]. Bacillus beveridgei and Exiguobacterium antarcticum also do not have spore-coat-protein homologues, as outlined by our criteria. Since most of the Bacillus species harbour many coat proteins, we focused on the study of the evolutionary dynamics of these proteins in the Bacillus genus. To achieve this goal, we first carried out a phylogenetic analysis to test the monophyly and delimitate internal groups in Bacillus . This analysis allowed us to distinguish between internal monophyletic groups that were already described and new ones (see below for further details). Subsequently, we performed an analysis of presence/absence of spore-coat proteins homologous proteins at the level of each phylogenetic group within the Bacillus genus. Results show that the Subtilis group possesses the most conserved spore-coat proteins (morphogenetic coat proteins, basement layer, inner layer, outer layer, crust) compared to other Bacillus groups and non- Bacillus spore-forming species. CotC, CotU (outer layer) and CotT (inner layer) are only present in B. subtilis and B. gibsonii . Other spore-coat proteins, such as CotI, CotR, CotSA, YdhD, YhbB, YheC, YkvP, YkvQ and TasA, whose localization has not yet been determined, are widely distributed among members of the Subtilis group (see Fig. 3 ). Our results reveal that morphogenetic spore-coat proteins (CotE, CotH, CotO, CotY, CotZ, SafA, SpoIVA, SpoVID and SpoVM) in the Cereus group are highly conserved. An exception is CotX, which is involved in the assembly of the crust [ 8 ]. Since coat assembly is a highly hierarchical process [ 8 ], other morphogenetic proteins present with the same role, such as CotY and CotZ, may take over the task to compensate for the absence of CotX. Nevertheless, the proteins CgeA, CotV, CotW that are part of the crust in B. subtilis are absent. Other spore-coat proteins (CotF, CotP, CotU, YmaG, YsnD, YuzC, YybI and YeeK) that are part of the inner layer are absent as well. Moreover, several spore-coat proteins present in the outer layer are absent despite the presence of the morphogenetic coat proteins, SpoIVA and CotE (see Fig. 3 ). In the Simplex group, several spore-coat-protein homologues of the crust, inner layer and outer layer are absent. This is not surprising given the absence of the morphogenetic coat proteins CotO, CotY, CotZ that control those processes [ 8 ]. Despite the absence of some spore-coat proteins of the outer and inner layer, in the Pumilus group, the great majority of spore-coat proteins and all the morphogenetic coat proteins are present, including those of the crust. Thus, a proper assembly of the spore coat is highly conserved in this group, which is beneficial for the high spore resistance previously reported [ 64 ]. In the Methanolicus group, the morphogenetic coat proteins CotO, CotH, CotX, and other spore-coat proteins of the crust, inner and outer layer are absent (see Fig. 3 ). Homologues of B. subtilis ' morphogenetic coat proteins CotH, CotX, CotO and CotZ that are responsible for the assembly of the outer layer and the crust are absent in the Coagulans group. Similarly, the Megaterium group does not have detectable protein homologues for CotX, CotY and CotZ. As expected, several spore-coat proteins of the outer layer dependent on CotH and CotO and proteins dependent on CotX, CotY and CotZ are also absent. Thus, the crust may be absent in both groups or possibly it is composed of different proteins, as the case of Bacillus megaterium that possesses an exosporium as the outermost layer of the coat [ 17 ]. However, the strain B. megaterium QM B1551 has an exosporium composed of plasmid-borne orthologues of B. subtilis cotW and cotX genes [ 65 ]. Further studies are needed to clarify these possibilities. The Halodurans group contains a lower number of coat-protein homologues compared to other Bacillus monophyletic groups described here. Except for CotE, this group does not harbour the morphogenetic coat proteins responsible for the assembly of the outer coat and the crust. Hence, as expected, several spore-coat-protein homologues dependent on those morphogenetic proteins are also absent (see Fig. 3 ). Monophyletic analyses We carried out a phylogenetic analysis to test the monophyly and delimitate internal groups in Bacillus . For this purpose, we used a phylogenomics approach that included 60 different Bacillus species. The reconstructed tree allowed us to distinguish eight internal groups, many of which were already known (i.e. Subtilis group, Cereus group), but others were not described, so we named them according to the dominant species in each group (Coagulans group, Megaterium group and Methanolicus group, Fig. 5 ). For hypothesis testing, we enforced the internal group under analysis to be monophyletic in the tree and compared it to the non-forced best tree. Results of monophyletic testing shown that the eight internal groups resolved as monophyletic with high support within the Bacillus genus (Table S3). Fig. 5. Phylogenetic tree reconstruction based on 60 genomes of Bacillus species to evidence internal monophyletic groups. The Subtilis group comprises a well-known species complex commonly found in soil and aquatic sediments with widespread distribution in nature. Members of this group, such as B. subtilis , compose the gut microflora of humans and other animals [ 66, 67 ]. This group shows valuable traits useful for biotechnological, industrial and agricultural applications [ 68, 69 ]. The Cereus group comprises human and plant pathogen species that can thrive in various environments ranging from low nutrient soil to intestinal flora of various animals [ 5–7, 70 ]. The Pumilus group was previously considered in the Subtilis group. However, the monophyly analysis shows enough robust support to consider it as a separate group from Subtilis. The Pumilus group contains species highly resistant to UV-light and H 2 O 2 due to the presence of the spore-coat proteins CotA and YjqC [ 64 ]. Members of the Coagulans group have been isolated from a wide variety of environments, such as the human gut and marine sediments [ 3, 71 ]. Members of the Megaterium group have been extensively used in industrial processes because their high capacity for the production of exoenzymes and ease of cloning genes for the production of recombinant proteins. Some members also are useful in bioremediation and agriculture as plant-growth promotion agents [ 72, 73 ]. Bacteria commonly found in soil and in extreme environments compose the Halodurans group. They have industrial applications, as they produce enzymes with useful activities [ 74 ]. It has been proposed that they could be used as probiotics to improve the intestinal microbial balance [ 75 ]. The Methanolicus group is characterized by bacteria isolated from fresh or groundwater, which have industrial potential [ 76, 77 ]. However, some members were associated with urinary tract infections [ 78 ]. The Simplex group harbours environmental bacteria usually found in soil; some isolates have also been found in the intestinal tract of humans [ 79 ]. Some members of this group are useful for industrial applications focused on the remediation of organic compounds, such as fatty acids and other compounds [ 80, 81 ]. Selection pressure forces In order to understand selection pressures acting on spore-coat genes, we employed the classical approaches of Tajima's D test and the d N /d S ratio (known also as omega, ω ) as well as two new methods (BUSTED, MEME) that use modern algorithms for detecting episodic positive selection in all or a subset of branches on a phylogeny. For this, we created spore-coat-gene datasets for each Bacillus group, based on the results of the consensus heat map. All significant results ( P -value <0.05) of spore-coat genes displaying evidence of positive selection on different Bacillus groups are reported in Table 2 . We successfully extracted and aligned 47 spore-coat genes for the Cereus group, 25 (53.2 %) of which were found to be evolving under positive selection either by having positively selected sites (MEME), being positively selected along its entire gene sequence (BUSTED) or because of possible balancing selection (Tajima's D). Coat genes of the basement layer ( cotJB, cotJC, spoVID, yheD, yppG ) account for 20% of positively selected genes. Similarly, the coat genes of the inner layer ( cotD, gerPC, gerPE, gerQ, safA, tgl, yaaH and yutH ) represent 32 %, whereas the outer layer genes ( cotA, cotB, cotS, yncD, ytdA ) represent 20%. Other coat genes ( cgeD, tasA, cotSA, ydhD, yhbB and yheC ) whose protein products have unknown localization, make up 24% of positively selected genes. Moreover, the morphogenetic coat genes cotZ, spoVID and safA seem to be under positive selection. Table 2. Five summary statistics (Tajima's D, BUSTED, MEME, d N /d S (branch and site models) showing positive selection across different Bacillus groups Cereus group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cgeD 0.77594 0.5 1†0.21094 M1:Nearly neutral 0.2315 M8: β distribution+positive selection 0.2358 cotA −0.18419 0.5 5†0.23041 M2:Positive selection 0.2599 M8: β distribution+positive selection 0.2496 cotB −0.18491 0.5 1†0.24867 M1:Nearly neutral 0.3770 M7: β distribution 0.2904 cotD 0.89921 0.018†2†0.10672 M1:Nearly neutral 0.1481 M7: β distribution 0.1419 cotJB 2.49259‡ 0.145 0 na§ na§ cotJC 1.12785 0.47 1†0.02253 M1:Nearly neutral 0.0301 M7: β distribution 0.0234 cotS −0.12103 0.5 1†0.10342 M1:Nearly neutral 0.1290 M7: β distribution 0.1121 cotSA 0.25413 0.5 3†0.15863 M1:Nearly neutral 0.1975 M8: β distribution+positive selection 0.1988 cotZ 0.04527 0.101 1†0.20776 M1:Nearly neutral 0.2808 M8: β distribution+positive selection 0.2700 gerPC 0.2173 0.028* 1†0.10771 M1:Nearly neutral 0.1678 M7: β distribution 0.1212 gerPE 0.39382 0.414 1†0.14856 M1:Nearly neutral 0.1796 M7: β distribution 0.1621 gerQ 0.62352 0.049* 1†0.05734 M1:Nearly neutral 0.1083 M7: β distribution 0.0670 safA 0.24669 0* 9†0.12459 M1:Nearly neutral 0.1614 M8: β distribution+positive selection 0.1470 spoVID −0.08138 0.5 1†0.15641 M1:Nearly neutral 0.2082 M7: β distribution 0.1764 tasA 0.74152 0.062 2†0.18312 M1:Nearly neutral 0.3561 M7: β distribution 0.2056 tgl 0.28166 0.358 1†0.087 M1:Nearly neutral 0.1146 M7: β distribution 0.0939 yaaH 0.42629 0.5 1†na§ na§ ydhD 0.42629 0.495 1†0.03899 M1:Nearly neutral 0.0584 M7: β distribution 0.0428 yhbB 0.07332 0.5 1†na§ na§ yheC 0.45696 0.454 3†0.15124 M1:Nearly neutral 0.2175 M7: β distribution 0.1732 yheD 0.45696 0.454 3†0.15124 M1:Nearly neutral 0.2175 M7: β distribution 0.1732 yncD −0.29741 0.447 3†0.10343 M1:Nearly neutral 0.1422 M7: β distribution 0.1105 yppG 0.08813 0.002†1‡ 0.13435 M1:Nearly neutral 0.2096 M8: β distribution+positive selection 0.2261 ytdA 0.48066 0.106 1‡ 0.07142 M1:Nearly neutral 0.0897 M7: β distribution 0.0844 yutH −0.12103 0.5 1†0.10342 M1:Nearly neutral 0.1290 M7: β distribution 0.1121 Coagulans group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cgeD 2.40675‡ 0.5 1†0.3661 M1:Nearly neutral 0.5498 M7: β distribution 0.4664 cotD 2.12158‡ 0.5 0 0.16022 M1:Nearly neutral 0.2505 M7: β distribution 0.2142 cotJC 1.63432 0.5 1†0.03028 M1:Nearly neutral 0.0204 M7: β distribution 0.0348 cotY 2.37‡ 0.177 0 0.10084 M1:Nearly neutral 0.2236 M7: β distribution 0.1225 gerPA 2.42801‡ 0.5 1†0.02311 M1:Nearly neutral 0.1871 M7: β distribution 0.0415 gerPB 2.71776‡ 0.5 0 0.14422 M1:Nearly neutral 0.4187 M7: β distribution 0.1980 gerPD 2.06706‡ 0.5 0 0.10075 M1:Nearly neutral 0.1634 M7: β distribution 0.1105 gerPE 2.43753‡ 0.5 0 0.16536 M1:Nearly neutral 0.2685 M7: β distribution 0.1991 gerQ 2.03383‡ 0.5 0 0.09011 M1:Nearly neutral 0.3678 M7: β distribution 0.1817 spoIVA 1.86222‡ 0.282 0 0.03558 M1:Nearly neutral 0.0755 M7: β distribution 0.0471 spsI 2.131‡ 0.5 0 0.05597 M1:Nearly neutral 0.1365 M7: β distribution 0.0653 yaaH 2.04839‡ 0†1†0.08248 M1:Nearly neutral 0.1914 M7: β distribution 0.1098 ydhD 2.36117‡ 0.5 1†0.00316 M1:Nearly neutral 0.1918 M7: β distribution 0.0680 yhbB 2.16596‡ 0.5 0 0.10258 M1:Nearly neutral 0.3634 M7: β distribution 0.1723 yjqC 1.63432 0.315 1†0.03028 M1:Nearly neutral 0.0482 M7: β distribution 0.0348 yppG 2.90119‡ 0.5 1†0.00759 M1:Nearly neutral 0.5161 M7: β distribution 0.2385 ytdA 2.2359‡ 0* 0 0.04891 M1:Nearly neutral 0.1840 M7: β distribution 0.0573 yuzC 2.79561‡ 0.5 0 0.20748 M1:Nearly neutral 0.4965 M7: β distribution 0.3580 Halodurans group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cotE 2.33501‡ 0* 0 0.04718 M1:Nearly neutral 0.2401 M7: β distribution 0.0699 cwlJ 2.22293‡ 0.5 1†0.0022 M1:Nearly neutral 0.0645 M7: β distribution 0.0033 gerQ 1.97623 0.5 1†0.10825 M1:Nearly neutral 0.2912 M8: β distribution+positive selection 0.3657 spoIVA 2.10434‡ 0.5 0 na§ na§ tgl 2.64696‡ 0.467 0 0.14067 M1:Nearly neutral 0.4113 M7: β distribution 0.2242 yhaX 2.47692‡ 0.382 1†0.11997 M1:Nearly neutral 0.2107 M7: β distribution 0.1415 yjqC 1.46076 0.5 1†0.09556 M1:Nearly neutral 0.2018 M8: β distribution+positive selection 0.1790 yraG 2.12556 0.5 1†0.25053 M1:Nearly neutral 0.3815 M7: β distribution 0.3218 ytdA 2.29913‡ 0.5 0 0.04657 M1:Nearly neutral 0.1857 M7: β distribution 0.0672 Megaterium group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) gerT 1.19483 0.023* 0 0.18757 M1:Nearly neutral 0.3623 M7: β distribution 0.2610 spoVID 1.06769 0.5 1†0.21812 M1:Nearly neutral 0.3907 M8: β distribution+positive selection 0.3623 tgl 1.45908 0.006* 0 0.04185 M1:Nearly neutral 0.4516 M7: β distribution 0.0569 yaaH 0.96821 0.5 1†0.00371 M1:Nearly neutral 0.0448 M7: β distribution 0.0062 yncD 1.23026 0.046* 2†0.18115 M1:Nearly neutral 0.3629 M7: β distribution 0.2489 ysxE 0.75614 0.5 1†0.08323 M1:Nearly neutral 0.1546 M7: β distribution 0.0946 yuzC 1.73735 0.052 1†0.06424 M1:Nearly neutral 0.8243 M7: β distribution 0.0789 Methanolicus group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (ite models ) cotE 1.62664 0.047* 0 0.10272 M1:Nearly neutral 0.1996 M7: β distribution 0.1170 cotF 2.45173‡ 0.496 0 0.08622 M1:Nearly neutral 0.0984 M7: β distribution 0.0982 cotJA 2.05089‡ 0 0 0.1059 M1:Nearly neutral 0.2046 M7: β distribution 0.1504 cotJB 2.10987‡ 0.5 0 0.01056 M1:Nearly neutral 0.1407 M7: β distribution 0.0147 cotJC 2.09006‡ 0.496 1†0.02096 M1:Nearly neutral 0.0269 M7: β distribution 0.0233 cotSA 2.6247‡ 0.5 0 0.05597 M1:Nearly neutral 0.1369 M7: β distribution 0.0651 gerPA 2.20951‡ 0.5 0 0.0751 M1:Nearly neutral 0.1302 M7: β distribution 0.0870 gerPB 2.58274‡ 0.168 0 0.00305 M1:Nearly neutral 0.3324 M7: β distribution 0.0064 gerPD 2.52437‡ 0.5 0 0.03528 M1:Nearly neutral 0.0866 M7: β distribution 0.0427 gerPE 2.34308‡ 0.5 0 0.12838 M1:Nearly neutral 0.2792 M7: β distribution 0.1646 gerPF 2.16055‡ 0.001†0 0.06189 M1:Nearly neutral 0.1556 M7: β distribution 0.0677 spoIVA 2.37156‡ 0.5 0 0.02067 M1:Nearly neutral 0.0334 M7: β distribution 0.1654 yaaH 2.11824‡ 0.078 2†0.05627 M1:Nearly neutral 0.1392 M7: β distribution 0.0705 ydhD 2.32379‡ 0.279 2†0.05453 M1:Nearly neutral 0.1255 M8: β distribution+positive selection 0.0832 yhaX 2.10645‡ 0.5 1†0.0897 M1:Nearly neutral 0.1595 M8: β distribution+positive selection 11.1381 yhcQ 1.92212‡ 0.5 0 0.08651 M1:Nearly neutral 0.2220 M7: β distribution 0.1056 yhjR 2.19329‡ 0.5 0 0.13211 M1:Nearly neutral 0.3260 M7: β distribution 0.1913 ylbD 2.39017‡ 0.062 0 0.1214 M1:Nearly neutral 0.3662 M7: β distribution 0.1761 yncD 2.29644‡ 0.5 1†0.09177 M1:Nearly neutral 0.2860 M7: β distribution 0.1239 yraF 2.20974 0.039†0 0.0359 M1:Nearly neutral 0.0781 M7: β distribution 0.0451 yraG 2.43863‡ 0.5 0 0.06799 M1:Nearly neutral 0.1791 M7: β distribution 0.0896 ytdA 2.70168‡ 0.5 0 0.01055 M1:Nearly neutral 0.2670 M7: β distribution 0.1097 yutH 2.28896‡ 0.5 3†0.11558 M1:Nearly neutral 0.3214 M7: β distribution 0.1588 yuzC 2.82223‡ 0.5 0 0.09933 M1:Nearly neutral 0.3239 M7: β distribution 0.1406 Pumilus group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (Site models ) cgeB 0.82607 0.044* 0 0.21246 M1:Nearly neutral 0.2692 M7: β distribution 0.2446 cotH 0.77125 0.5 1†0.09965 M1:Nearly neutral 0.1270 M7: β distribution 0.1097 cotM 0.85448 0.187 1†na§ na§ cotS 0.82748 0.5 1†0.06266 M1:Nearly neutral 0.0795 M7: β distribution 0.0695 cwlJ 0.83023 0.06 1†0.04195 M1:Nearly neutral 0.0587 M7: β distribution 0.0542 gerPD −0.13219 0.03* 0 na§ na§ lipC 0.8556 0.04 1†na§ na§ spoVID 1.21538 0.481 2†0.19841 M1:Nearly neutral 0.2420 M7: β distribution 0.2382 yheC 0.70157 0.5 1†0.27466 M1:Nearly neutral 0.3078 M7:β distribution 0.2939 yisY 0.60511 0.5 1†0.18592 M1:Nearly neutral 0.2201 M7: β distribution 0.2045 yjqC 2.41476‡ 0.5 0 na§ na§ yutH 0.82748 0.5 1†0.06266 M1:Nearly neutral 0.0795 M7: β distribution 0.0695 Simplex group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cotD 0.82064 0.001* 0 0.14089 M1:Nearly neutral 0.2331 M7: β distribution 11.2858 cotH 1.02307 0.5 3†0.10615 M1:Nearly neutral 0.1827 M7: β distribution 0.1246 cotX 0.85129 0.5 1†0.10962 M1:Nearly neutral 0.1725 M7: β distribution 0.1319 gerPE 1.38199 0.442 1†0.25448 M1:Nearly neutral 0.4100 M7: β distribution 0.3257 gerT 0.82125 0.5 1†0.15016 M1:Nearly neutral 0.2152 M7: β distribution 0.1772 spoVID 1.21956 0.288 1†0.21728 M1:Nearly neutral 0.3437 M7: β distribution 0.2686 ydhD 0.58553 0.5 1†0.05483 M1:Nearly neutral 0.0752 M7: β distribution 0.0595 yheD 1.13466 0.187 1†0.06729 M1:Nearly neutral 0.0824 M7: β distribution 0.0724 yisY 2.14444 0.5 1†0.07518 M1:Nearly neutral 0.0921 M7: β distribution 0.0775 yppG 0.6223 0.5 1†0.12362 M1:Nearly neutral 0.2617 M7: β distribution 0.1506 Subtilis group Coat gene Summary statistics Tajima's D BUSTED* MEME†d N /d S (branch model ) d N /d S (site models ) cgeA 1.83274 0.5 1†0.20934 M1:Nearly neutral 0.3500 M7: β distribution 0.2598 cgeB 1.99094‡ 0.277 2†0.19573 M1:Nearly neutral 0.2863 M7: β distribution 0.2252 cgeD 1.79061 0.5 1†0.19155 M1:Nearly neutral 0.2917 M7: β distribution 0.2294 cgeE 2.63941‡ 0.5 5†0.18444 M1:Nearly neutral 0.3187 M7: β distribution 0.2035 cotA 2.31807‡ 0.367 2†0.10535 M1:Nearly neutral 0.1527 M7: β distribution 0.1138 cotB 1.76891 0* 4†0.22824 M1:Nearly neutral 0.3445 M7: β distribution 0.2801 cotD 0.93573 0.5 1†na§ na§ cotE 2.09262‡ 0.48 1†na§ na§ cotF 2.19577‡ 0.133 2†0.08357 M1:Nearly neutral 0.1216 M7: β distribution 0.0923 cotG 0.79192 0.478 2†0.19177 M1:Nearly neutral 0.2831 M7: β distribution 0.2336 cotH 2.56746‡ 0.5 2†0.10377 M1:Nearly neutral 0.1657 M7: β distribution 0.1152 cotJA 2.1477‡ 0.259 1†0.10669 M1:Nearly neutral 0.1841 M7: β distribution 0.1277 cotJB 2.49259‡ 0.339 0 0.10261 M1:Nearly neutral 0.1765 M7: β distribution 0.1148 cotM 2.35214‡ 0.403 0 0.18183 M1:Nearly neutral 0.3447 M7: β distribution 0.2176 cotO 2.26548‡ 0.5 3†0.22212 M1:Nearly neutral 0.4142 M8: β distribution+positive selection 0.4033 cotP 1.96543‡ 0.5 0 na§ na§ cotV 1.89032 0.291 1†0.23489 M1:Nearly neutral 0.2755 M7: β distribution 0.2484 cotW 1.96128 0.486 2†0.20479 M1:Nearly neutral 0.3099 M7: β distribution 0.2219 cotX 1.7908 0.37 1†0.10867 M1:Nearly neutral 0.1518 M7: β distribution 0.1157 cotY 2.0907‡ 0.5 1†0.06725 M1:Nearly neutral 0.1107 M7: β distribution 0.0735 cotZ 2.08360‡ 0.376 1†0.11551 M1:Nearly neutral 0.1953 M7: β distribution 0.1282 cwlJ 1.79177 0.5 1†0.07168 M1:Nearly neutral 0.1272 M7: β distribution 0.0778 gerPB 2.52228‡ 0.5 1†0.14965 M1:Nearly neutral 0.3683 M7: β distribution 0.2129 gerPC 2.02921‡ 0.5 1†0.11727 M1:Nearly neutral 0.1948 M7: β distribution 0.1287 gerPD 1.95737 0.109 1†0.13235 M1:Nearly neutral 0.2282 M7: β distribution 0.1540 gerPE 2.59394‡ 0.5 1†na§ na§ gerPF 1.30604 0.012* 1†na§ na§ gerQ 2.02092‡ 0.372 0 0.10469 M1:Nearly neutral 0.1790 M8: β distribution+positive selection 0.1383 gerT 2.55712‡ 0.5 2†0.13045 M1:Nearly neutral 0.2122 M7: β distribution 0.1576 lipC 2.75952‡ 0.5 1†na§ na§ oxdD 2.83684‡ 0.478 4†0.06435 M1:Nearly neutral 0.1317 M7: β distribution 0.0733 safA 2.31936‡ 0.005†2†0.16678 M1:Nearly neutral 0.2750 M7: β distribution 0.1930 spoIVA 2.12249‡ 0.5 0 0.01660 M1:Nearly neutral 0.0299 M7: β distribution 0.0192 spoVID 2.66623‡ 0.315 9†0.29849 M1:Nearly neutral 0.5939 M8: β distribution+positive selection 0.5141 spsB 1.71279 0.5 2†0.15996 M1:Nearly neutral 0.2592 M7:β distribution 0.1872 spsI 1.63797 0.304 1†0.07904 M1:Nearly neutral 0.1207 M7:β distribution 0.0886 tasA 2.27556‡ 0.281 2†0.08090 M1:Nearly neutral 0.1036 M7:β distribution 0.0865 tgl 2.36389‡ 0.5 4†na§ na§ yaaH 2.33413‡ 0.024* 5†0.08289 M1:Nearly neutral 0.1270 M7:β distribution 0.0896 ydgB 1.80839 0.011* 0 na§ na§ ydhD 2.32146‡ 0.5 5†0.09731 M1:neutral 0.1422 M7:β distribution 0.1082 yhaX 2.14372‡ 0.421 1†0.06610 M1: Nearly neutral 0.0933 M8: β distribution+positive selection 0.0800 yhbB 2.26467‡ 0.5 0 0.12273 M1:Nearly neutral 0.2253 M7:β distribution 0.1403 yhcQ 2.39963‡ 0.013* 3†0.07439 M1:Nearly neutral 0.0897 M7:β distribution 0.0775 yheC 2.54815‡ 0.5 2†0.10043 M1:Nearly neutral 0.1435 M7:β distribution 0.1088 yheD 2.57861‡ 0.34 4†0.13014 M1:Nearly neutral 0.2168 M7:β distribution 0.1471 yhjQ 1.74733 0.492 1†na§ na§ yhjR 2.72348‡ 0.199 2†na§ na§ yisY 1.97894‡ 0.453 2†0.11089 M1:Nearly neutral 0.1518 M7:β distribution 0.1182 yjqC 2.68998‡ 0.196 1†na§ na§ yjzB 2.59674‡ 0.478 1†na§ na§ yknT 2.47907‡ 0.5 5†0.20519 M1:Nearly neutral 0.3589 M7:β distribution 0.2389 ylbD 2.10676‡ 0.494 1†na§ na§ yncD 1.46348 0.5 1†0.13442 M1:Nearly neutral 0.1868 M7:β distribution 0.1452 yppG 2.31307‡ 0.5 0 0.23211 M1:Nearly neutral 0.4261 M7:β distribution 0.3108 yraD 2.42924‡ 0.499 1†na§ na§ yraG 1.47157 0.498 1†0.09399 M1:Nearly neutral 0.1273 M7:β distribution 0.1089 ysxE 2.27601‡ 0.5 1†0.14151 M1:Nearly neutral 0.2254 M7:β distribution 0.1583 ytdA 2.28755‡ 0* 0 0.03920 M1:Nearly neutral 0.0683 M8:β distribution+positive selection 0.0532 yutH 2.36638‡ 0.391 3†0.11151 M1:Nearly neutral 0.1723 M8:β distribution+positive selection 0.1548 yuzC 2.63657‡ 0.359 1†0.22296 M1:Nearly neutral 0.3048 M7:β distribution 0.2438 ywrJ 1.89712 0.5 1†0.14905 M1:Nearly neutral 0.2068 M7:β distribution 0.1696 yybI 0.53608 0.338 1†0.20922 M1:Nearly neutral 0.2922 M7:β distribution 0.2464 *P value provided by BUSTED. A P value <0.05 indicates evidence of positive selection of the gene †Number of significant sites under positive selection by MEME. ‡Significant at a P value <0.05. §dN/dS values could not be computed in CodeML due to small branch size. In the Coagulans group, the coat genes gerPC, gerPF, gerT, lipC, spoVID, yhaX, yhcQ, yheC, yheD, ylbD, yncD, ysxE, and yutH were highly divergent, except at conserved domains, and could not be properly aligned. Therefore, we discarded those genes and analysed the remaining 23 well-aligned spore coat genes, 18 (78.3 %) of which were found to be under positive selection. Coat genes of the basement layer ( cotJC, spoIVA, yppG ) account for 16.6% of positively selected genes. Likewise, cotD, gerPA, gerPB, gerPD, gerPE, gerQ, yaaH, yjqC, and yuzC (inner layer), spsI, ytdA (outer layer), cgeD, ydhD, and yhbB, (localization class unknown) make up 50 11.1 and 16.6 %, respectively, of coat genes under positive selection. Interestingly, cotY, the only coat gene of the crust present in this group, is under positive balancing selection (or population contraction), according to Tajima's D. The great majority of extracted coat genes ( cotA, cotF, cotJC, cotSA, cotX, lipC, safA, spoVID, spsI, yaaH, ydhD, yhbB, yhcQ, ylbD, yncD, yraD, yraF, ysxE, and yutH ) in the Halodurans group were highly divergent outside conserved domains and could not be properly aligned. Therefore, only 10 spore coat genes (Table S2) were analysed, 9 (90 %, see Table 2 ) of which are under positive selection and the rest of genes are under neutral or negative selection (Table S4). The morphogenetic coat gene spoIVA and yhaX are the only coat genes of the basement layer evolving under positive selection. Our results show that other coat genes, such as cwlJ, gerQ, tgl, and yjqC (inner layer), cotE, ytdA (outer layer), and yraG seem to be under positive selection detected either by Tajima's D, MEME, or BUSTED. In the Megaterium group, we extracted and aligned 35 coat genes, 7 (20 %) of which show traces of positive selection. Coat genes of the inner layer ( tgl, yaaH, ysxE, and yuzC ) account for the majority of positively selected genes, whereas only two genes ( gerT and yncD ) of the outer layer are under positive selection. Additionally, spoVID is the only the morphogenetic coat gene evolving under positive selection in this group. Methanolicus group coat genes with sequences that were highly diverged from reference genes ( cotD, cotM, tasA, cotP, cotS, cotY, cotZ, gerPC, gerT, lipC, spoVID, spsI, tgl, yhbB, yheC, yheD, yjqC, yppG, ysxE , and yybI ) , were not further analysed. However, we successfully aligned 29 spore coat genes in this group, 24 (82.8 %) of which show evidence of positive selection according to Tajima's D, MEME, or BUSTED. The majority of positively selected genes belong to the inner layer of the coat ( cotF, gerPA, gerPB, gerPD, gerPE, gerPF, yaaH, yhjR, yutH, and yuzC ), accounting for 41.6% of positively selected genes. Genes of the basement ( cotJA, cotJB, cotJC, spoIVA, yhaX ) and outer layer ( cotE, ylbD, yncD, and ytdA ) account for 20.8 and 16.6% of genes under positive selection, respectively. Coat genes corresponding to proteins whose localization has not been determined contribute to 20.8% of positively selected genes. In the Pumilus group, we extracted and analysed 55 coat genes, 12 (21.8 %) of which were found to be under positive selection, either along the entire gene sequence or at individual sites. In this group, spore coat genes of the crust are highly conserved and cgeB seems to be positively selected along its entire gene sequence. Coat genes of the basement ( lipC, spoVID ), inner ( cwlJ, gerPD, yisY, yjqC, yutH ) and outer layer ( cotH, cotM, cotS ) also show evidence of positive selection. On the other hand, in the Simplex group, we retrieved and analysed 40 spore coat genes, 10 (25 %) of which are under positive selection. The morphogenetic coat genes cotH, cotX, and spoVID of the outer, crust, and basement layer are under positive selection. It is worth mentioning that cotX is the only coat gene belonging to the crust present in this group. The proteins present in the crust are critical for interaction with the environment. Thus the ability to adhere to and survive on variable surface structures could be a key factor that promotes diversity in coat structure and composition [ 20 ]. Furthermore, coat genes of the basement layer ( spoVID , yheD , and yppG ), inner layer ( cotD , gerPE , and yisY ), outer layer ( cotH , and gerT ), crust ( cotX ), and ydhD (localization not determined) represent 30, 30, 20, 10, and 10% of the total positively selected genes, respectively. The Subtilis group possess the most conserved core of spore coat proteins compared to other groups analysed in this work. This is expected, since all analyses performed here used B. subtilis as a reference to determine the abundance and diversity of spore coat proteins (see Discussion section for further comments). We extracted, aligned, and analysed 77 coat genes, 63 (81.8 %) of which show significant evidence of positive selection detected by Tajima's D, MEME, and/or BUSTED. Nearly all morphogenetic coat protein genes of the basement (except spoVM ), inner, outer layer, and crust are positively selected or show sites under positive selection. For instance, coat genes of the basement layer, inner layer, outer layer, crust, and coat genes of localization not determined account for 14.3, 31.7, 22.2, 11.1, and 20.6% of the total positively selected genes, respectively (see Table 2 ). In addition, coat genes not included in Table 2 , are under purifying selection (ω <1), according to CodeML site and branch models (see Table S4). Horizontal gene transfer (HGT) HGT events can be detected by phylogenetic incongruences [ 82 ]. Additionally, traces of the mechanism of transfer, such as independently conjugative plasmids, integrated prophages, integrative transposons, GEIs, and other unclassified mobile genetic elements may further confirm HGT events [ 82–84 ]. Spore coat genes that displayed evidence of HGT are shown as donor-recipient networks in Fig. 6 for the eight monophyletic groups in Bacillus . Most spore coat genes have been recently transferred, since HGT events are displayed at or near the branch tips of their reconciled phylogenetic trees (not shown) unless otherwise stated. The Cereus group has 37 spore coat genes that have undergone HGT events, according to Notung. Spore coat genes of this group, such as cotD, cotJA, cotY, gerPD, gerPE, yncD have undergone HGT events near the bottom of their reconciled phylogenetic trees. The morphogenetic coat genes safA and spoVID have also undergone HGT events. The Coagulans group has 13 spore coat genes that were laterally transferred between species of this group. According to our results, cotY is the only morphogenetic coat gene showing evidence of a recent HGT event. The Halodurans group has six coat genes that have undergone HGT events. The Methanolicus group harbours 19 coat genes that show evidence for HGT events. spoVM is the only morphogenetic coat gene that has been laterally transferred in the Halodurans and Methanolicus groups. Fig. 6. Spore coat genes under HGT events as donor-recipient networks in the Cereus (pink), Coagulans (magenta), Halodurans (yellow), Methanolicus (green), Pumilus (dark red), Simplex (navy blue), and Subtilis (blue). Edges, nodes and size of nodes represent HGT events, genomes and number of HGT events per genome respectively. In the Megaterium, Pumilus, and Simplex groups, 2, 10, and 14 coat genes, respectively, have been laterally transferred ( Fig. 6 ). The morphogenetic coat genes that control the assembly of the crust, cotX and cotY , are the only morphogenetic coat proteins under HGT events in the Pumilus group. On the other hand, most HGT events of the Simplex group occur between B. butanolivorans and B. simplex . In the Subtilis group, about half of its coat genes (33) have undergone HGT events. Most of the HGT events in this group occur near the tips of the reconciled phylogenetic trees. However, the coat genes cotD, yjqC, yraF, yraG , and ytdA show evidence of HGT near the bottom of reconciled phylogenetic trees, according to Notung ( Fig. 6 ), suggesting an ancient transfer of the genes. All these HGT events have been further confirmed by ICEs ( I ntegrative and C onjugative E lements) using WU- blast 2 of the webserver ICEBerg, see Table S5. Analysis to detect the presence of spore coat genes in genomic islands shows their complete absence in these genomic elements. Discussion In this work, we reported the existence of several spore coat protein homologs across one hundred sixty-one genomes of spore-forming species of the Bacillales order. The most conserverd proteins are those concerned with the development and assembly of coat and spore germination. Spore coat proteins that directly depend on these morphogenetic and germinant proteins are also preserved. However, some minor spore coat proteins seem to be taxa-specific and/or may confer a unique spore coat morphology and the ability to occupy different ecological niches, as previously suggested [ 8, 16, 23, 26, 27, 85–87 ]. Nevertheless, it is important to mention that the methods used in our diversity analysis are only able to identify homologs of B. subtilis coat proteins across the set of genomes analysed here. This imposes a limitation in the diversity of spore coat proteins described in Bacillales because coat proteins not present in B. subtilis and coat-like proteins that share structural and chemical features to B. subtilis coat proteins cannot be considered using the methodologies of this study. Moreover, homologs of coat proteins with enzymatic activity (e.g. transferases) found across Bacillales are only putative spore coat proteins. Further studies must characterize these proteins to determine if they can be classified as true spore coat proteins. On the other hand, the lack of evidence for spore coat gene homologues in Hallolactobacillus , Jeotgalicoccus and B. beveridgei suggests that a major loss of genes occurred during their evolutionary history, as previously found for the Exiguobacterium genus. This may explain why they do not produce spores [ 88 ]. Some Bacillus species lack the morphogenetic coat proteins CotH and CotO. Several studies have reported that CotH and CotO are minor players in the assembly of the outer coat, because these two proteins are CotE-dependent [ 8, 16, 23, 86 ]. Although CotH and CotO mutants have a disorganized outer coat, the major assembly step is carried out by CotE and CotE-dependent coat proteins [ 23, 86 ]. Recent studies have found that CotO is necessary for encasement of the spore by the crust [ 89 ], thus we can expect CotO to be conserved when coat proteins of the crust are also conserved, as confirmed by our results. Likewise, CotH is a spore kinase that phosphorylates its dependent proteins CotB and CotG [ 90, 91 ]. Our results show that in genomes where CotH is absent, its substrates, CotG and CotB, are also absent [ 91 ]. Nevertheless, the role of CotG may be carried out by a non-homologous CotG-like protein with similar structural regions, as previously reported [ 61 ]. Other CotH-dependent coat proteins, such as CotC and CotU are conserved in few genomes of the Subtilis group, and they are present when CotH and CotG are present. In this case, CotG has a negative role on CotC/CotU/CotS assembly when CotH is not present (i.e. when it is not phosphorylated by its specific kinase) [ 92 ]. The morphogenetic coat proteins CotX, CotY, and CotZ are collectively known as the insoluble fraction of the spore because they influence spore hydrophobicity and accessibility of germinants [ 87, 89, 93 ]. Moreover, they are responsible for crust assembly around the spore [ 8, 25, 89 ]. CotX, CotY, and CotZ mutants have an incomplete outer coat, but resistance to heat or lysozyme is not affected [ 87 ]. Hence, the absence of these morphogenetic coat proteins and their dependent-proteins in various spore-forming species reflects overlapping functions and a spore coat protein interaction network that is highly adapted to unique environmental conditions [ 8, 87, 94 ]. Our results confirm the overlapping functions and highly hierarchical organization of morphogenetic coat proteins in the assembly of the spore coat of B. subtilis but also in several spore-forming species. The morphogenetic coat proteins CotE, SpoIVA, SpoVM, SpoVID, and SafA are present in almost all genomes of spore-forming species analysed. Usually, other proteins dependent on the morphogenetic coat proteins are also well conserved. CotE controls the assembly of the outer coat layer and other coat proteins, designated as CotE-controlled proteins [ 8, 20 ]. SafA has been found to interact with SpoVID in the early stages of coat assembly [ 8, 20, 22 ] and is required for CwlJ-dependent spore germination [ 95 ]. Furthermore, previous studies report that SpoIVA and CotE, SpoVM, and SpoVID contribute to the formation of a spore coat scaffold during earlier stages of sporulation [ 8, 20, 21 ]. Similarly, CotE-controlled proteins, such as CotSA [ 8, 20, 21 ] are conserved in all spore-forming species analysed in this study. The SpoIVA-dependent proteins CotJA, CotJB, and CotJC are also ubiquitous among the one hundred sixty-one spore-forming species analysed in this study. These proteins are necessary for the assembly of the basement layer of the spore coat [ 8, 96, 97 ]. Spore coat proteins that have a role in germination (allowing the passage of germinants) [ 8, 98, 99 ], such as the GerPA-GerPF proteins are well preserved in all spore-forming species addressed here. Another protein involved in germination and highly conserved is GerQ along with CwlJ (a cell wall hydrolase). GerQ is cross-linked in the inner layer of the spore coat and is necessary for the localization of CwlJ [ 8, 100, 101 ]. In Bacillus species, the spore coat protein Tgl responsible for the GerQ, YeeK, and SafA cross-linking [ 8, 100–102 ], is highly conserved. We carried out an analysis to estimate the monophyly extent of different subgroups within the Bacillus genus with the main purpose of executing a detailed study of selection forces operating in these groups. The phylogenetic reconstruction allowed us to distinguish well-known groups inside Bacillus and also new groups. In a recent study, Patel & Gupta [ 103 ] grouped many known Bacillus species into distinct clades. Although various clades according to Patel and Gupta [ 103 ] coincide with the groups found here (Subtilis, Cereus, Simplex, and Halodurans, which is named Alcalophilus clade), other clades show discordance (Firmus and Jeotgali clades) or are absent (Coagulans, Pumilus and Megaterium groups determined in this study). Under the premise that phylogenetic groups may reflect ecological fitness, we performed selection analysis to seek a relationship between the presence/absence of spore coat protein genes and selection forces operating on these genes in different phylogenetic groups within the Bacillus genus. We have detected evidence of positive selection (episodic selection and/or balancing selection) in coat genes from all monophyletic groups of the Bacillus genus. Positively selected coat genes have an important role in the assembly of coat layers (e.g. morphogenetic coat genes) at initial and later stages and germination of the spore. The majority of spore coat genes reported in Table 2 have individual sites evolving under positive selection, according to MEME. We hypothesize that individual selected sites may play a key role in enzymatic activity or as protein-protein interaction modules during coat assembly, as suggested previously [ 91, 104, 105 ]. For example, protein-protein interactions necessary for spore assembly and germination have been described between SafA, CotE, SpoVID, GerQ, CwlJ, Tgl, YaaH, and SafA [ 95, 102, 104, 105 ]. We found that some, if not all, of these coat genes are positively selected in most monophyletic groups of the Bacillus genus. This emphasizes the importance of coat protein interactions. Furthermore, we found few spore coat genes under gene-wide positive selection, and they were different across Bacillus monophyletic groups analysed here. This different pattern of positively selected coat genes may suggest that some spore coat genes play critical roles in specific lineages. A significant proportion of coat genes in the Subtilis, Methanolicus, Halodurans, and Coagulans have individual positively selected sites, suggesting that balancing selection may be working on these genes. The majority of coat genes of the Methanolicus, Halodurans, and Coagulans groups contained divergent sequences outside conserved domains. These results may suggest that high genetic variation is maintained through balancing selection, which in turn may provide significant survival advantages to spore survival and germination under different environmental conditions, as previously suggested [ 8, 25, 26, 85, 106, 107 ]. To reinforce our ideas about the evolutionary role of positively selected coat genes, we discuss the function and interaction of some spore coat genes under positive selection reported in Table 2 . For instance, YheC and YheD are positively selected spore coat proteins that have an ATP binding domain and are part of the same operon [ 8 ]. YheD is located in the basement layer of the spore coat and is dependent on SpoIVA, whereas the localization of YheC has not yet been determined [ 8, 108 ]. During the initial stages of sporulation, YheD forms two rings that encircle the forespore [ 108 ]. In later stages of sporulation, the two rings disappear, and YheD is redistributed around the basement layer of the forespore [ 8, 108 ]. These spore coat proteins are important for the initial stages of sporulation in B. subtilis [ 8, 108 ] and they would also be key in the Subtilis, Cereus, Pumilus, and Simplex groups. YutH and YsxE are bacterial spore kinase proteins located in the inner layer and are both SpoIVA- and SafA-dependent [ 8, 108, 109 ]. YutH and YsxE provide protection against lysozyme, hypochlorite, and predation to the spore [ 109 ]. Thus, these bacterial spore kinases are evolutionarily important for the survival of the spore in different environments [ 109 ]. Our selection pressure analyses revealed that these spore coat genes show positive selection at specific sites. These sites may be highly conserved motifs associated with likely enzymatic activity [ 109 ], or may exert an important function in the final protein product as interaction/binding partners. More studies are needed to test this hypothesis. We have found that the spore kinase and morphogenetic coat gene of the outer layer, cotH shows evidence of positively selected individual sites in the Subtilis, Pumilus, and Simplex groups along with cotB, cotG , and/or cotS . It was previously reported that CotH phosphorylates CotB and CotG interacts with CotS, CotC, and CotU [ 91, 92 ]. The fact that genes encoding CotH and CotH-dependent proteins both have individual sites under diversifying selection highlights the importance of such sites as protein-protein interaction modules that promote adaptation to diverse environmental conditions when sporulation occurs [ 28 ]. The morphogenetic and crust genes cotV, cotX and cotY, cotZ involved in glycosylation state of the spore have been shown to share common domains and a functional dependence between them [ 94 ]. Moreover, coat genes with domains involved in glycosylation (e.g. glycosyl transferase), such as cgeCDE , cgeAB and transferases domains (e.g glycerophosphotransferase, nucleotidyltransferase), such as spsI, spsB , and ytdA influence the morphology and properties of the crust, thus affecting spore surface proteins [ 89, 94 ]. Our results show that in the Subtilis group, crust coat genes are highly conserved and have positively selected sites. Similarly, we show that several coat genes involved in the glycosylation in the outer layer of the spore have positively selected individual sites in the Simplex, Pumilus, Coagulans, Cereus, and Halodurans groups. This highlights the possibility that sequences that are necessary for assembly the crust or that influence spore surface properties, such as hydrophobicity and adhesion, are preserved. Furthermore, our selection results show that there are other coat genes ( Table 2 ) with positively selected sites that have not been extensively studied and may exert important functions during coat assembly and spore germination necessary for spore adaptation to different environmental conditions. Regarding the HGT results, we have found evidence of profuse HGT events of spore coat genes in all Bacillus monophyletic groups, except in the Megaterium, Pumilus, and Simplex groups. Thus, HGT could be involved in enabling spores of various species to better survive diverse environmental stresses. Most HGT events occurred at or near the branch tips of the reconciled gene-species phylogenetic trees, demonstrating a recent occurrence. This supports the idea that the ability to form spores in Firmicutes (in Bacilli and Clostridia ) is an ancestral feature as other researchers have stated [ 27, 85, 88 ]. Moreover, these HGT events are further confirmed by the presence of IS sequences in genomes of the recipient species. Bacterial species that contain spore coat genes associated with HGT events may reflect a complex evolutionary history adapted to lineage-specific environmental conditions [ 26, 88 ]. This idea must be further explored by future studies on the evolutionary dynamics of these species. Nevertheless, we have found some spore coat genes that have undergone HGT events near the bottom of the reconciled phylogenetic trees. A previous study proposed that the putative coat genes yraG and yraF are present in the Subtilis group as part of the same operon and contain a domain that resemble a significant moiety of CotF. Therefore, the YraG and YraF proteins may be functionally relevant in the forespore [ 88 ]. Indeed, our HGT analyses confirm that yraF and yraG have been acquired at the bottom of the Subtilis group. Besides, the Subtilis group, yraG is present only in the Halodurans group. This may suggest that some coat genes not present within monophyletic groups of the Bacillus genus may have been lost at some point, as previously confirmed [ 88 ]. For example, yra genes are not present in the Pumilus group, the most closely-related group to Subtilis. Additional experiments beyond the aim of this study must explore HGT dynamics between monophyletic groups of the Bacillus genus. In summary, we have found that the most conserved coat proteins are the ones with the most important function during the early and later stages of coat synthesis, assembly, and spore germination. This suggests that there is a well-conserved core of coat genes among all Bacillales , whereas other spore coat genes seem to be taxa-specific. Additionally, we found eight monophyletic groups within the Bacillus genus with a significant proportion of coat genes under positive diversifying selection and/or balancing selection, suggesting high genetic diversity that may confer unique adaptation to ensure spore survival and efficient germination. The spore coat genes with individual sites evolving under diversifying selection are likely to participate in protein-protein interactions during all stages of coat formation. Although most coat genes have been subjected to HGT events, they frequently occur near or at the tips of reconciled phylogenetic trees, thus supporting the idea of sporulation as an ancestral feature of Bacillus . Supplementary Data Supplementary material 1 Click here for additional data file.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4083513/

α-Cyclodextrin decreases cholera toxin binding to GM 1 -gangliosides

Cholera toxin (CT), the principal virulence factor secreted by Vibrio cholerae , is an A-B5 type exotoxin that binds to host cell GM1-gangliosides and is responsible for cholera diarrhoea. We tested the hypothesis that the cyclic hexasaccharide α-cyclodextrin (α-CD), but not the cyclic heptasaccharides methyl-β-cyclodextrin (MD-β-CD) and hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) inhibit binding of CT to GM1-gangliosides. We report that α-CD decreases CT binding to GM1-ganglioside-coated microtitre plate wells and on the surface of fixed HeLa cells in a concentration-dependent manner, suggesting that this may be a promising lead for the development of compounds with therapeutic properties.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3503649/

Comparative immunological evaluation of recombinant Salmonella Typhimurium strains expressing model antigens as live oral vaccines

Background Despite the development of various systems to generate live recombinant Salmonella Typhimurium vaccine strains, little work has been performed to systematically evaluate and compare their relative immunogenicity. Such information would provide invaluable guidance for the future rational design of live recombinant Salmonella oral vaccines. Result To compare vaccine strains encoded with different antigen delivery and expression strategies, a series of recombinant Salmonella Typhimurium strains were constructed that expressed either the enhanced green fluorescent protein (EGFP) or a fragment of the hemagglutinin (HA) protein from the H5N1 influenza virus, as model antigens. The antigens were expressed from the chromosome, from high or low-copy plasmids, or encoded on a eukaryotic expression plasmid. Antigens were targeted for expression in either the cytoplasm or the outer membrane. Combinations of strategies were employed to evaluate the efficacy of combined delivery/expression approaches. After investigating in vitro and in vivo antigen expression, growth and infection abilities; the immunogenicity of the constructed recombinant Salmonella strains was evaluated in mice. Using the soluble model antigen EGFP, our results indicated that vaccine strains with high and stable antigen expression exhibited high B cell responses, whilst eukaryotic expression or colonization with good construct stability was critical for T cell responses. For the insoluble model antigen HA, an outer membrane expression strategy induced better B cell and T cell responses than a cytoplasmic strategy. Most notably, the combination of two different expression strategies did not increase the immune response elicited. Conclusion Through systematically evaluating and comparing the immunogenicity of the constructed recombinant Salmonella strains in mice, we identified their respective advantages and deleterious or synergistic effects. Different construction strategies were optimally-required for soluble versus insoluble forms of the protein antigens. If an antigen, such as EGFP, is soluble and expressed at high levels, a low-copy plasmid-cytoplasmic expression strategy is recommended; since it provokes the highest B cell responses and also induces good T cell responses. If a T cell response is preferred, a eukaryotic expression plasmid or a chromosome-based, cytoplasmic-expression strategy is more effective. For insoluble antigens such as HA, an outer membrane expression strategy is recommended. Background Despite the development of various systems to generate live recombinant Salmonella Typhimurium vaccine strains, little work has been performed to systematically evaluate and compare their relative immunogenicity. Such information would provide invaluable guidance for the future rational design of live recombinant Salmonella oral vaccines. Result To compare vaccine strains encoded with different antigen delivery and expression strategies, a series of recombinant Salmonella Typhimurium strains were constructed that expressed either the enhanced green fluorescent protein (EGFP) or a fragment of the hemagglutinin (HA) protein from the H5N1 influenza virus, as model antigens. The antigens were expressed from the chromosome, from high or low-copy plasmids, or encoded on a eukaryotic expression plasmid. Antigens were targeted for expression in either the cytoplasm or the outer membrane. Combinations of strategies were employed to evaluate the efficacy of combined delivery/expression approaches. After investigating in vitro and in vivo antigen expression, growth and infection abilities; the immunogenicity of the constructed recombinant Salmonella strains was evaluated in mice. Using the soluble model antigen EGFP, our results indicated that vaccine strains with high and stable antigen expression exhibited high B cell responses, whilst eukaryotic expression or colonization with good construct stability was critical for T cell responses. For the insoluble model antigen HA, an outer membrane expression strategy induced better B cell and T cell responses than a cytoplasmic strategy. Most notably, the combination of two different expression strategies did not increase the immune response elicited. Conclusion Through systematically evaluating and comparing the immunogenicity of the constructed recombinant Salmonella strains in mice, we identified their respective advantages and deleterious or synergistic effects. Different construction strategies were optimally-required for soluble versus insoluble forms of the protein antigens. If an antigen, such as EGFP, is soluble and expressed at high levels, a low-copy plasmid-cytoplasmic expression strategy is recommended; since it provokes the highest B cell responses and also induces good T cell responses. If a T cell response is preferred, a eukaryotic expression plasmid or a chromosome-based, cytoplasmic-expression strategy is more effective. For insoluble antigens such as HA, an outer membrane expression strategy is recommended. Background Over recent years, there has been considerable interest in the use of attenuated Salmonella Typhimurium strains as live oral vaccines against heterologous antigens or infectious agents [ 1 , 2 ]. Notable advantages to their use include their ability to induce antigen-specific mucosal, humoral and cellular responses after infecting the host via mucosal routes [ 3 - 5 ]. Salmonella strains can be orally administrated, via food or drinking water, which avoids the use of injections for vaccine delivery. Furthermore, vaccine strains may be conveniently and reliably generated in large quantities by standard cell culture-based approaches, which considerably lowers the manufacturing costs [ 6 ]. Consequently, many different strategies have been utilized for the development of live recombinant Salmonella oral vaccines against various heterologous antigens. Some of these approaches utilize episomal expression systems, where high or low copy plasmids are used to express heterologous antigen or epitope genes under the control of various different promoter systems [ 7 - 10 ]. The antigenic proteins may be retained within the cell cytoplasm after expression, or may be targeted to cell surface (outer membrane) of the attenuated Salmonella strains. For example, the Pneumococcal surface protein A (PspA) and codon-optimized influenza hemagglutinin (HA) protein have both been expressed in the cytoplasm of attenuated Salmonella Typhimurium cells via high copy plasmids, for use as live oral vaccine candidates against Streptococcus pneumonia or the H5N1 virus [ 7 , 8 ], respectively. A high copy ice-nucleation protein (Inp) derived surface-expressed system was employed to produce a live recombinant Salmonella oral vaccine against hepatitis B virus, while a low copy OmpA-derived surface display system was used to develop a live recombinant Salmonella oral vaccine against HIV [ 9 , 10 ]. All of these vaccines were demonstrated to induce strong immune responses, especially humoral responses. In other studies, heterologous genes have been expressed in the cytoplasm of attenuated Salmonella via chromosome-based expression cassettes. For instance, a live recombinant Salmonella strain containing a chromosomally-encoded SARS-CoV nucleocapsid gene expressed sufficient cytoplasmic protein to elicit both humoral and cellular immune responses against SARS-CoV [ 11 ]. Salmonella has also been employed as a live delivery vector for eukaryotic expression plasmids harboring antigen genes. This strategy may avoid problems such as codon bias or low levels of antigen expression. Using this approach, live recombinant Salmonella was used to deliver an HA DNA vaccine against the H9N2 virus, and a VP28 DNA vaccine against the white spot syndrome virus in crayfish [ 12 , 13 ]. In several reports, two or three different approaches have been used to construct analogous live recombinant Salmonella oral vaccines that target the same pathogen, and their respective immunogenicities were subsequently compared. In studies aimed at developing a live oral Salmonella vaccine against Mycoplasma hyopneumoniae , identical Adh and NrdF antigen genes were expressed using either plasmid- or chromosome-based systems. Animal tests suggested that the vaccine strain containing the chromosome-based expression system induced a stronger humoral immune response than the one containing the plasmid-based expression system [ 14 ]. Similarly, in efforts to construct a live oral Salmonella -HIV vaccine, the HIV rgp120 antigen was expressed cytoplasmically using either a chromosome-based cassette, a high copy plasmid, or in the outer membrane via an OmpA expression system. Animal experiments subsequently revealed that the membrane-expressed HIV antigen was capable of inducing a better humoral response than the cytoplasmically-expressed HIV antigen expressed using the other two expression systems [ 10 ]. The enhanced green fluorescent protein (EGFP), originally isolated from the Aequorea victoria jellyfish, is an easily expressed, soluble and species-independent reporter protein, which emits green florescence after absorbing blue light. Its intracellular expression levels and location can be conveniently monitored by fluorescence microscopy, using a fluorescence micro-plate reader, or by fluorescence-assisted flow cytometry. Furthermore, it has been reported that it contains a mouse H2-K d -restricted CTL epitope, which could elicit a strong immune response [ 15 ]. All of these characteristics suggest that EGFP could be a good vaccine model antigen in mice [ 16 ]. Despite the development of numerous strategies for the construction of Salmonella vaccine strains, there have been relatively few studies aimed at systematically evaluating and comparing their respective immunogenic properties. Such information would provide invaluable guidance for the future rational design of live recombinant Salmonella oral vaccines. To directly address this issue, we construct analogous sets of live recombinant Salmonella Typhimurium vaccine strains expressing two model antigens: enhanced green fluorescent protein (EGFP) and the hemagglutinin epitope (residues 91–261, HAOP) from H5N1 virus (H5N1 A/Vietnam/1194/2004), via different commonly used strategies. Through systematically evaluating and comparing the immunogenicity of these strains in mice, we identified their respective advantages, as well as deleterious or synergistic effects. The construction strategies of recombinant Salmonella vaccine strains for various needs and different forms of antigens (soluble or insoluble antigens) were also proposed. Results Construction of recombinant Salmonella -EGFP strains Six 'single-recombinant' SL7207-EGFP strains were first constructed to express the EGFP gene by a single strategy in a single chromosomal or episomal context, respectively (Table 1 ). Strains HP, LP and CP were each designed to express EGFP in the cytoplasm of Salmonella from a high copy plasmid, low copy plasmid or chromosome-based prosseA expression cassette, respectively. Strains HO and CO were designed to express EGFP on the outer membrane of SL7207 from a high copy plasmid, or a chromosome-based prosseA- lpp-ompA outer membrane expression cassette, respectively. Strain E carried a high-copy eukaryotic expression plasmid p EGFP driven by a eukaryotic cmv promoter. Consequently, EGFP would not be expected to be expressed in significant amounts until p EGFP was released into cells of the eukaryotic host. HP and HO sub-groups were constructed by using the high copy number plasmid with p UC origin as backbone. These plasmids exist in about 500–700 copies in one bacterial cell [ 17 ]. Low copy number plasmid sub-group LP was constructed using p 15A origin in the backbone. The plasmid exists in 10–12 copies per bacterial cell [ 17 ]. Chromosome-based sub-groups CP and CO were constructed by lambda red recombineering [ 18 ] which resulted in only one copy of EGFP expressing cassette in one bacterial cell. The high-copy eukaryotic expression plasmid p EGFP also uses p UC origin as backbone. Table 1 Plasmids and strains used in this study Plasmids Relevant genotype or characteristics Ref. or source p Bluescript II SK Amp R ; Cloning vector, p UC origin 500–700 copy per cell Stratagene p MD18-T Amp R ; Cloning vector, p UC origin 500–700 copy per cell Takara p Sim6 Amp R ,Lambda-red recombinase plasmid [ 18 ] p loxp-cm-loxp Amp R , Cm R ; p BSK derivative containing EGFP and loxp-cm-loxp fragment [ 57 ] p EGFP Km R ; CMV promoter drived EGFP expression, p UC origin 500–700 copy per cell Lab stock p ACYC177 Cm R ; p 15a origin plasmid, 10–12 copy per cell Lab stock p VAX-1 Km R ; CMV promoter; p UC origin 500–700 copy per cell Lab stock p HP Amp R ; p BSK derivative containing prosseA promoter, egfp gene This study p HAOP Amp R ; p BSK derivative containing prosseA promoter, ha(91–261) gene This study p CP-cm Amp R , Cm R ; p BSK derivative containing prosseA promoter, egfp gene, and loxp-cm-loxp fragment This study p LP Cm R ; p ACYC177 derivative containing prosseA promoter, egfp gene This study p OmpA Amp R ; p MD18-T derivative containing lac promoter, and lpp-ompA gene This study p HO Amp R ; p MD18-T derivative containing lac promoter, and lpp-ompA-egfp gene This study p O-HAOP Amp R ; p MD18-T derivative containing lac promoter, and lpp-ompA-ha(91–261) gene This study p CO-cm Amp R , Cm R ; p BSK derivative containing prosseA promoter, lpp-ompA-egfp gene, and loxp-cm-loxp fragment This study Strains Relevant genotype or characteristics Ref. or source S. typhimurium SL7207 his G46 DEL407 [aroA::Tn10 {Tc s }]; B. Stocker HP Amp R ; SL7207; with plasmid p HP This study LP Cm R ; SL7207; with plasmid p LP This study CP Cm R ; SL7207; htrAprosseA-egfp-cm This study HO Amp R ; SL7207; with plasmid p HO This study CO Cm R ; SL7207; htrAprosseA-lpp-ompA-egfp -cm This study E Km R ; SL7207; with plasmid p EGFP This study CP + HP Cm R ; Amp R ; SL7207; CP with plasmid p HP This study CP + LP Cm R ; SL7207; CP with plasmid p LP This study CP + HO Cm R ; Amp R ; SL7207; CP with plasmid p HO This study CP + E Cm R ; Km R ; SL7207; CP with plasmid p EGFP This study E + LP Cm R ; Km R ; SL7207; LP with plasmid p EGFP This study C-HAOP Amp R ; SL7207; with plasmid p HAOP This study O-HAOP Amp R ; SL7207; with plasmid p O-HAOP This study BSK Amp R ; SL7207; with plasmid p BSK This study ACYC177 Cm R ; SL7207; with plasmid p ACYC177 This study OmpA Amp R ; SL7207; with plasmid p OmpA This study VAX-1 Km R ; SL7207; with plasmid p VAX-1 This study VAX-1 + ACYC177 Cm R ; Km R ; SL7207; with plasmid p VAX-1 and p ACYC177 This study E. coli DH10B endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacX4 Φ Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ- Lab stock Five additional 'double-recombinant' Salmonella -EGFP strains were then constructed, by combining two of the above strategies (Table 1 ). Four of them were created from the chromosome-based EGFP expression strain, CP. This was achieved by establishing the p HP, p LP, p HO, or p EGFP plasmids within CP, generating the double-recombinant CP + HP, CP + LP, CP + HO and CP + E strains, respectively. The p EGFP plasmid was transformed into the LP strain to generate a further double-recombinant strain, E + LP. In vitro and in vivo EGFP expression of recombinant Salmonella strains Detection of EGFP expression and cell morphology of recombinant Salmonella -EGFP strains Out of the six 'single-recombinant' Salmonella -EGFP strains, green fluorescence could be directly observed in cells of the HP, LP, CP and HO strains by fluorescent microscopic analysis (Figure 1 A). Since no fluorescence was observable for the CO strain, EGFP expression was confirmed by Western blotting (Figure 1 C). This revealed that the EGFP gene was being translated within the CO strain. Because EGFP would not be expressed in significant amounts until p EGFP in strain E was released into eukaryotic cells, we detected its expression at different time points in vitro and in vivo , respectively, using Western blotting. In vitro , the EGFP expression was detected by infecting the Caco-2 human colon carcinoma cell line with E strain. Figure 1 D showed that EGFP could be successfully delivered into eukaryotic cells by E strain in vitro , and its expression was found within the eukaryotic cells at 12, 20 and 30 hours after infection. Furthermore, the EGFP expression delivered by E strain was also investigated in mice intestine on day 1, 3 and 7 after inoculation of 1 × 10 11 bacterial cells. Western blotting result (Figure 1 E) showed that EGFP expression was observed in mice intestinal mucosa on day 1 after inoculation. Figure 1 Analysis of in vitro and in vivo expression of recombinant Salmonella- EGFP strains. ( A ) and ( B ) Representative fluorescence microscopy images of EGFP antigen expression in six 'single-recombinant' Salmonella strains: HP, LP, CP, HO, CO and E ( A ) and in five 'double-recombinant' Salmonella strains: CP + HP, CP + LP, CP + HO, CP + E and E + LP ( B ). The SL7207 parent strain was used as a control. B.F. = bright-field images; MERGE = composite of bright-field and fluorescent images. Scale bar represents 5 μm. ( C ) Western blot analysis of EGFP expression in the CO strain. Expression of EGFP protein (theoretical mass ca. 39 kDa) was detected using a GFP rabbit polyclonal IgG. The SL7207 strain was used as a negative control. ( D ) Western blot analysis of EGFP expression in the Caco-2 human colon carcinoma cell line delivered by E strain. Expression of EGFP protein (theoretical mass ca. 26 kDa) was detected at 12, 20 and 30 hours after infection using a GFP mouse monoclonal IgG. The SL7207 strain was used as a negative control. The GAPDH detection was performed as the internal control. ( E ) Western blot analysis of EGFP expression in mice intestine mucosa delivered by E strain. EGFP detection was carried out on day 1, 3 and 7 after inoculation. The SL7207 strain was performed identically as a negative control. The GAPDH was detected as the internal control. Filamentation of bacterial cell (the elongated, rod-like cell morphology) was clearly observable for the HP, HO and E strains. Consequently, the average cell lengths for each of the created strains were determined using the Image J software package, and were compared with those of the parent SL7207 strain. It is shown in Figure 2 A that the average lengths of the HP, HO and E strains were 8.1 μm, 6.0 μm and 5.5 μm, respectively, which was considerably longer than the average length of the SL7207 cells, which was 2.5 μm [ 19 ]. Figure 2 Cell length measurement and determination of EGFP expression levels for recombinant Salmonella strains. ( A ) Cell length measurements for the eleven recombinant Salmonella strains. Each bar in the graph represents the mean length of 20 bacterial cells randomly selected from multiple microscopic fields for each strain, as measured using Image J software. Error bars show the standard deviation. An asterisk indicates that the mean length of the cells were significantly different from those of the SL7207 parent strain, as determined by Student T -test ( P  LP > HO > CP > CO and E (p  E + LP > CP + HO > CP + E (p prosseA-egfp-cm This study HO Amp R ; SL7207; with plasmid p HO This study CO Cm R ; SL7207; htrAprosseA-lpp-ompA-egfp -cm This study E Km R ; SL7207; with plasmid p EGFP This study CP + HP Cm R ; Amp R ; SL7207; CP with plasmid p HP This study CP + LP Cm R ; SL7207; CP with plasmid p LP This study CP + HO Cm R ; Amp R ; SL7207; CP with plasmid p HO This study CP + E Cm R ; Km R ; SL7207; CP with plasmid p EGFP This study E + LP Cm R ; Km R ; SL7207; LP with plasmid p EGFP This study C-HAOP Amp R ; SL7207; with plasmid p HAOP This study O-HAOP Amp R ; SL7207; with plasmid p O-HAOP This study BSK Amp R ; SL7207; with plasmid p BSK This study ACYC177 Cm R ; SL7207; with plasmid p ACYC177 This study OmpA Amp R ; SL7207; with plasmid p OmpA This study VAX-1 Km R ; SL7207; with plasmid p VAX-1 This study VAX-1 + ACYC177 Cm R ; Km R ; SL7207; with plasmid p VAX-1 and p ACYC177 This study E. coli DH10B endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacX4 Φ Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ- Lab stock Five additional 'double-recombinant' Salmonella -EGFP strains were then constructed, by combining two of the above strategies (Table 1 ). Four of them were created from the chromosome-based EGFP expression strain, CP. This was achieved by establishing the p HP, p LP, p HO, or p EGFP plasmids within CP, generating the double-recombinant CP + HP, CP + LP, CP + HO and CP + E strains, respectively. The p EGFP plasmid was transformed into the LP strain to generate a further double-recombinant strain, E + LP. In vitro and in vivo EGFP expression of recombinant Salmonella strains Detection of EGFP expression and cell morphology of recombinant Salmonella -EGFP strains Out of the six 'single-recombinant' Salmonella -EGFP strains, green fluorescence could be directly observed in cells of the HP, LP, CP and HO strains by fluorescent microscopic analysis (Figure 1 A). Since no fluorescence was observable for the CO strain, EGFP expression was confirmed by Western blotting (Figure 1 C). This revealed that the EGFP gene was being translated within the CO strain. Because EGFP would not be expressed in significant amounts until p EGFP in strain E was released into eukaryotic cells, we detected its expression at different time points in vitro and in vivo , respectively, using Western blotting. In vitro , the EGFP expression was detected by infecting the Caco-2 human colon carcinoma cell line with E strain. Figure 1 D showed that EGFP could be successfully delivered into eukaryotic cells by E strain in vitro , and its expression was found within the eukaryotic cells at 12, 20 and 30 hours after infection. Furthermore, the EGFP expression delivered by E strain was also investigated in mice intestine on day 1, 3 and 7 after inoculation of 1 × 10 11 bacterial cells. Western blotting result (Figure 1 E) showed that EGFP expression was observed in mice intestinal mucosa on day 1 after inoculation. Figure 1 Analysis of in vitro and in vivo expression of recombinant Salmonella- EGFP strains. ( A ) and ( B ) Representative fluorescence microscopy images of EGFP antigen expression in six 'single-recombinant' Salmonella strains: HP, LP, CP, HO, CO and E ( A ) and in five 'double-recombinant' Salmonella strains: CP + HP, CP + LP, CP + HO, CP + E and E + LP ( B ). The SL7207 parent strain was used as a control. B.F. = bright-field images; MERGE = composite of bright-field and fluorescent images. Scale bar represents 5 μm. ( C ) Western blot analysis of EGFP expression in the CO strain. Expression of EGFP protein (theoretical mass ca. 39 kDa) was detected using a GFP rabbit polyclonal IgG. The SL7207 strain was used as a negative control. ( D ) Western blot analysis of EGFP expression in the Caco-2 human colon carcinoma cell line delivered by E strain. Expression of EGFP protein (theoretical mass ca. 26 kDa) was detected at 12, 20 and 30 hours after infection using a GFP mouse monoclonal IgG. The SL7207 strain was used as a negative control. The GAPDH detection was performed as the internal control. ( E ) Western blot analysis of EGFP expression in mice intestine mucosa delivered by E strain. EGFP detection was carried out on day 1, 3 and 7 after inoculation. The SL7207 strain was performed identically as a negative control. The GAPDH was detected as the internal control. Filamentation of bacterial cell (the elongated, rod-like cell morphology) was clearly observable for the HP, HO and E strains. Consequently, the average cell lengths for each of the created strains were determined using the Image J software package, and were compared with those of the parent SL7207 strain. It is shown in Figure 2 A that the average lengths of the HP, HO and E strains were 8.1 μm, 6.0 μm and 5.5 μm, respectively, which was considerably longer than the average length of the SL7207 cells, which was 2.5 μm [ 19 ]. Figure 2 Cell length measurement and determination of EGFP expression levels for recombinant Salmonella strains. ( A ) Cell length measurements for the eleven recombinant Salmonella strains. Each bar in the graph represents the mean length of 20 bacterial cells randomly selected from multiple microscopic fields for each strain, as measured using Image J software. Error bars show the standard deviation. An asterisk indicates that the mean length of the cells were significantly different from those of the SL7207 parent strain, as determined by Student T -test ( P  LP > HO > CP > CO and E (p  E + LP > CP + HO > CP + E (p  LP > HO > CP > CO and E (p  E + LP > CP + HO > CP + E (p < 0.01). In vitro growth rates of recombinant Salmonella -EGFP strains In order to investigate whether single and double recombinant strategies would affect the growth of recombinant strains which may further influence bacterial infection abilities in vivo , the doubling times of the six single and five double-recombinant Salmonella -EGFP strains were measured in liquid LB medium supplemented with antibiotics in vitro . Table 2 shows the growth rates of the six single-recombinant Salmonella -EGFP strains. The doubling times of the HP, LP, CP, HO, CO and E strains were 33.2 ± 4.0, 39.2 ± 1.5, 44.2 ± 2.6, 38.9 ± 3.0, 52.5 ± 2.6 and 33.0 ± 3.0 minutes, respectively. Their doubling times were all significantly higher than that of the parental strain SL7207 (26.3 ± 0.9 min, p < 0.05). Comparing the six recombinant strains, the growth rate of the chromosome-based outer-membrane strain CO was considerably slower than that of the other five strains (p < 0.01). Furthermore, the growth rates of strains containing high or low copy-EGFP plasmids were also compared with those of strains containing the corresponding empty vectors. Strains HP and E exhibited similar growth rates to the strains containing the corresponding empty vectors BSK (35.0 ± 1.4 min) and VAX-1 (31.2 ± 1.9 min). This indicated that the metabolic burden associated with maintaining the p BSK and p VAX-1 high copy plasmids was primarily responsible for the increase in doubling times for the HP and E strains. The growth rates of the LP and HO strains were considerably different to those of the corresponding empty-vector strains ACYC177 (42.8 ± 1.7 min, p < 0.01) and OmpA (35.8 ± 1.2 min, p < 0.05). This suggested that both EGFP expression and plasmid burden affected their growth rates. Table 2 In vitro doubling times of six single-recombinant Salmonella -EGFP strains Strains SL7207* HP BSK LP (a) ACYC177 CP HO (b) OmpA CO** E VAX-1 DT (min) 26.3 ± 0.9 33.2 ± 4.0 35.0 ± 1.4 39.2 ± 1.5 42.8 ± 1.7 44.2 ± 2.6 38.9 ± 3.0 35.8 ± 1.2 52.5 ± 2.6 33.0 ± 3.0 31.2 ± 1.9 * The doubling time of the SL7207 strain was significantly different from those of the six single-recombinant strains (p < 0.05); ** The doubling time of the CO strain was significantly increased compared to those of the other five single-recombinant strains (p < 0.01); (a) A significant difference was observed between the doubling times of the LP strain and the strain containing the corresponding empty vector ACYC177 (p < 0.01); (b) The doubling times of the HO and OmpA strains are significantly different (p < 0.05). The growth rates of five double-recombinant Salmonella -EGFP strains were also measured, and are described in Table 3 . The doubling times of strains CP + HP, CP + LP, CP + HO, CP + E, E + LP were: 58.3 ± 2.5, 51.0 ± 2.3, 105.9 ± 7.4, 65.7 ± 2.5 and 68.3 ± 9.9 minutes, respectively. These values were considerably higher than the doubling time of the SL7207 strain (p < 0.01). Also, we found that their growth rates were significantly slower than those of the corresponding single-recombinant parental strains (p < 0.01 or p < 0.05; described in Table 3 ). The growth rate of strain VAX-1 + ACYC177, which contains two empty vectors: p VAX-1 and p EGFP, was measured as a control for the E + LP strain. Experiments revealed that there were no significant differences in the growth rates of these two strains. Taken together, these results indicated that double-recombinant strategies seriously reduced the growth rates of these five strains comparing to that of strains with single strategies and SL7207. Table 3 In vitro doubling times of five double-recombinant Salmonella -EGFP strains Strains SL7207** CP + HP (1) CP + LP (2) CP + HO (1) CP + E (1) E + LP (1) VAX-1 + ACYC177 DT (min) 26.3 ± 0.9 58.3 ± 2.5 51.0 ± 2.3 105.9 ± 7.4 65.7 ± 2.5 68.3 ± 9.9 56.7 ± 6.6 ** the doubling time of the SL7207 strain was significantly different from those of five double-recombinant strains (p < 0.01); Strains marked with (1) or (2) indicates their doubling times were significantly increased compared to their respective single-recombinant parental strains. (1) p < 0.01; (2) p < 0.05. In vitro stability of EGFP expression constructs under antibiotic pressure To maximize plasmid stability and copy-number within the recombinant strains, two strategies were used. Firstly, antibiotics were supplied throughout the entire experimental process. Secondly, all strains were freshly cultured for 10 hours, diluted 1:10 with fresh medium, and then cultured until the OD 600 reached 2 a.u. Immediately prior to oral administration, the stability of the EGFP expression constructs within each of the eleven Salmonella -EGFP strains were evaluated using colony forming unit (CFU) assays. Table 4 summarizes the results of these assays, which evaluate the retention of functional antibiotic-resistance gene cassettes within the six single-recombinant Salmonella -EGFP strains. Three plasmids ( p LP, p HO, p EGFP) and two chromosome-based expression cassettes (CP and CO strains) exhibited good stability, with 100.0% survival rate on the selection plates. However, for the HP strain, only 88.9% of CFUs maintained p HP. This indicated that EGFP expression in the HP strain may be less stable than the other strains, thereby possibly affecting its immunogenic potency. Table 4 Stability of antibiotic markers in six single-recombinant Salmonella -EGFP strains Strain Origin Detection rate for antibiotic marker (%) HP p UC 88.9 LP p 15A 100.0 CP Chromsome-based 100.0 HO p UC 100.0 CO Chromsome-based 100.0 E p UC 100.0 Since the reduction in EGFP expression levels for the five double-recombinant strains may be related to the relative stability of the two EGFP expression cassettes, their respective stabilities were also evaluated using CFU assays, performed immediately prior to oral administration. It may be seen in Table 5 that both expression cassettes were only completely stable (i.e. detected in 100.0% of CFUs) in two of the five double-recombinant strains: CP + LP and CP + E. The chromosome-based EGFP expression cassettes (from the parent CP strain) as well as the low-copy plasmids ( p 15A-replicons, in the LP strains) appeared to be very stable, with a 100.0% detection rate. However, the high copy plasmids ( p UC-replicons) in the double-recombinant strains were significantly less stable. The detection rates for p HP in the CP + HP strain, p HO in the CP + HO strain, and p EGFP in the E + LP strain were 0.8%, 60.0% and 50.0%, respectively. Even though the p 15A and p UC-based plasmids should be entirely compatible within the double-recombinant E + LP strain (and maintained using orthogonal antibiotic resistance strategies), the high-copy plasmid exhibited poorer stability. It may be noted that the relative differences in fluorescence levels between the single and double-recombinant strains (Figure 2 B) correlates-well with the plasmid stability properties revealed by the CFU assays (Table 5 ). Table 5 Stability of antibiotic markers in the five double-recombinant Salmonella -EGFP strains Strains Origin 1 Detection rate for antibiotic marker 1 (%) Origin 2 Detection rate for antibiotic marker 2 (%) Combined detection rate for antibiotic markers (%) CP + HP Chromosome-based 100.0 p UC 0.8 0.8 CP + LP Chromosome-based 100.0 p 15A 100 100.0 CP + HO Chromosome-based 100.0 p UC 60.0 60.0 CP + E Chromosome-based 100.0 p UC 100.0 100.0 E + LP pUC 50.0 p 15A 100.0 50.0 In vivo survival and infection ability of six single-recombinant Salmonella strains and stability of EGFP expression constructs To evaluate the survival and infection abilities of the six single-recombinant Salmonella -EGFP strains and the stabilities of the EGFP expression constructs in vivo ; fecal samples, as well as spleen and mesenteric lymph node samples were collected from each group of mice on days 1, 3 and 7 after the oral administration of 1 × 10 11 bacterial cells, respectively. CFU assays were carried out using LB agar plates with or without the appropriate antibiotics. The SL7207 strain was treated identically as a control. Enumeration of CFUs in feces [Figure 3 A (1)] showed that 10 5 -10 9 cfu/g of the Salmonella cells were present on day one, for the seven administration groups. The CP strain was present in the highest levels in the feces, with 10 9 cfu/g (p < 0.01). The stability assays [Figure 3 A (2)] suggested that the chromosome-based expression strains (CP and CO), as well as the strain with the low copy plasmid (LP), exhibited good stabilities, with 100.0% survival rates on the selection plates. However, strains containing the high copy prokaryotic or eukaryotic plasmids: HP, HO and E, appeared to be less stable; with detection rates of 35.0% (p < 0.01), 90% and 72.2%, respectively. On day 3, fecal bacterial cells in the seven administration groups declined to 10 3 -10 7 cfu/g. The CP strain still exhibited the best survival ability, with 10 7 cfu/g (p < 0.01). Regarding the stability of the constructs, the CP and CO strains remain good stability, with 100% detection rates on the antibiotic selection plates. But the low copy plasmid within the LP strain was somewhat less stable, declining from 100% to 68.9%. Furthermore, there was a considerable loss of the high copy plasmids within the HP, HO and E strains. Only 2.9% and 7.5% of CFUs corresponding to the HP and E strains contained high copy plasmids, respectively, whilst the p HO plasmid in the HO strain declined to very low levels that could not be accurately calculated. The HP, HO and E recombinant strains were significantly less stable than the CP, CO and LP strains (p < 0.01). On day 7, fecal bacterial cells from the six recombinant groups decreased to very low levels, of around 10 3 -10 4 cfu/g, whilst the SL7207 group showed the best reserve, at around 10 5 cfu/g (p < 0.01). Since construct stability could not be accurately calculated at these low levels, this data is not shown here. In summary, the CP chromosome-based expression strain exhibited the highest survival abilities in feces on day 1 and 3 after inoculation. The high copy prokaryotic or eukaryotic plasmids in the HP, HO and E strains appeared to be less stable in fecal samples than the chromosome-based expression cassettes in the CP and CO strains, or the low copy plasmid in the LP strain. Figure 3 In vivo survival, infection ability and construct stability of six single-recombinant Salmonella -EGFP strains. ( A ) Survival ability and construct stability of the six single-recombinant Salmonella -EGFP strains in mice feces. A (1) CFU results for the six single-recombinant strains in mice feces, on days 1, 3 and 7 after oral inoculation. Each bar in the graph represents the mean CFU/g of mice fecal samples randomly collected from six mice in each group. Error bars show the standard deviation. ** indicates that the mean CFU/g was significantly different from those of other strains ( P < 0.01). The SL7207 strain was treated identically as a control. A (2) Construct retention rates for the six single-recombinant strains in mice feces on days 1, 3 and 7 after inoculation. ** indicates that the mean of the construct retention rate in this group was significantly different from those of the other strains ( P < 0.01). ( B ) and ( C ) show the infection ability and construct stability results for the six single-recombinant Salmonella -EGFP strains in mice spleen ( B ) and mesenteric lymph nodes ( C ). B (1) and C (1) show the CFU results in mice spleen and mesenteric lymph nodes on days 1, 3 and 7 after inoculation, respectively. Each ● represents one mouse. Red lines indicate the average CFU/g for each strain. The SL7207 strain was used as a control. B (2) and C (2) show the construct retention rates for the six single-recombinant strains in mice spleen and mesenteric lymph nodes on days 1, 3 and 7 after inoculation, respectively. In A (2), B (2) and C (2), each percentage is the mean construct detection rate based on six mice samples in each group. N/A represents the construct detection rate could not be accurately calculated at this time point. The infection abilities of six single-recombinant Salmonella -EGFP strains were determined by detecting their presence within the mouse spleens and mesenteric lymph nodes, using the SL7207 strain as a control. Figure 3 B (1) & (2) shows the spleen infection results for the recombinant strains. On day 1, spleen infection was observed in the SL7207, LP, CP and CO groups. For the SL7207 group, Salmonella was found in 66.7% of mice spleens (4 out of 6 mice) with an average of 4 × 10 5 cfu/g. 83.3% of mice (5 out of 6 mice) in the LP group were infected with Salmonella , with an average of 4 × 10 5 cfu/g. The detection rate for the low copy plasmid was 100.0%. For the CP and CO groups, the spleen infection rates were 66.7% (4 out of 6 mice) and 50.0% (3 out of 6 mice); with an average of 2 × 10 5 cfu/g and 8 × 10 4 cfu/g, respectively. Their chromosome-based expression cassettes showed good stabilities, with detection rates of 96.9% and 100.0%, respectively. However, no Salmonella infection could be detected for the HP, HO and E strains, which contained the high copy prokaryotic or eukaryotic plasmids. On day 3, the spleen infection levels for the recombinant strains had significantly declined; however, the spleen infection rate in the SL7207 group increased to 100.0% (6 out of 6 mice) with an average of 2 × 10 5 cfu/g. Only 16.7% of mice (1 out of 6 mice) in the HP and CP groups had Salmonella infections in their spleen; with 1 × 10 3 cfu/g and 9 × 10 3 cfu/g, respectively. The construct detection rate in HP group was 0, while that in the CP group was 100.0%. For the LP group, the spleen infection rate declined to 50% (3 out of 6 mice) with an average of 4 × 10 4 cfu/g. The low copy plasmid stability also declined to 30.0%. Even so, the spleen infection rate for the LP group was still higher than those for the HO, CO and E groups; for which no infection was observed. On day 7, the spleen infection rate in the SL7207 administration group was still 100.0%, with an average of 7 × 10 5 cfu/g. For the HP and HO groups, 83.3% of mice spleens (5 out of 6 mice) tested positive for Salmonella infection, with an average 3 × 10 3 of cfu/g. However, no high copy plasmids could be detected in cells of either of these two strains. For the CO and E strains, only 16.7% of mice (1 out of 6 mice) had spleens infected with Salmonella cells, with 3 × 10 5 cfu/g and 3 × 10 3 cfu/g, respectively. The stability of the chromosome-based expression cassette within the CO strain remained at 100.0%, but no p EGFP plasmid could be isolated in the E group. Taken together, the results showed that all six of the recombinant Salmonella -EGFP strains could infect the spleen, but at different time points. The spleen infection rates for the recombinant strains were noticeably lower than those for the SL7207 group on day 3 and day 7. On day one, the LP low copy plasmid strain, and the CP and CO strains containing the chromosome-based expression cassettes had higher spleen infection rates with good stability, compared to the HP, HO and E strains containing high copy prokaryotic or eukaryotic plasmids. Even though infection was observed, the strains containing high copy prokaryotic or eukaryotic plasmid had noticeably poorer stability on day 7. The mesenteric lymph node infection results for the recombinant strains are shown in Figure 3 C (1) & (2). On day 1, Salmonella infections were observed in the SL7207, LP, CP, HO and CO groups; while no infection was detected in the HP and E groups. Only 16.7% mice (1 out of 6 mice) in the SL7207 and CO groups had Salmonella infection in their lymph nodes, with levels of 1 × 10 4 cfu/g and 9 × 10 3 cfu/g, respectively. The detection rate for the chromosome-based expression cassette within the CO strain was 100.0%. In the LP group, the lymph node infection rate was 33.3% (2 out of 6 mice), with an average of 2 × 10 3 cfu/g. For the CP and HO groups, 50.0% of the lymph nodes (3 out of 6 mice) tested positive for Salmonella infection, with an average of 4 × 10 3 cfu/g and 2 × 10 4 cfu/g, respectively. The stability of the EGFP expression cassettes in the LP, CP and HO groups were 92.9%, 100.0% and 73.3%, respectively. On day 3, 33.3% of mice (2 out of 6) in the SL7207 and LP groups had lymph node infections, with an average of 2 × 10 3 cfu/g and 5 × 10 3 cfu/g, respectively. The detection rate for low copy plasmids in the LP strain was 75%. In the HP group, only 16.7% of mice (1 out of 6 mice) tested positive for Salmonella infection, with an average of 3 × 10 3 cfu/g; however, no p HP plasmid could be isolated. For the other four groups (CP, HO, CO and E), no Salmonella infection was detected in the lymph nodes. On day 7, the lymph node infection rates in the SL7207 and HP groups were 33.3% (2 out of 6 mice) with an average of 8 × 10 4 cfu/g and 2 × 10 3 cfu/g, respectively. The detection rate for the high copy plasmid p HP was only 5.0%. For the CO group, 16.7% mice (1 out of 6 mice) tested positive for Salmonella infection in the lymph nodes, with average levels of 7 × 10 4 cfu/g. The stability of the chromosome-based expression cassette within the CO strain was 85.7%. Furthermore, the infection rate for the E group increased to 66.7%, with average counts of 1 × 10 3 cfu/g. However, the detection rate for the high copy plasmid p EGFP was only 25.0%. Considering these results as a whole, all the recombinant strains were able to infect the mice mesenteric lymph nodes at different time points; however, very few high copy plasmids could be detected in the plasmid-based recombinant strains on day 7. In vivo immune response to recombinant Salmonella -EGFP strains EGFP-specific IgG responses in infected mouse sera In order to compare the humoral immune responses mounted against eleven recombinant Salmonella -EGFP strains, ELISA assays were performed to test the anti-EGFP IgG responses using blood sera of infected mice on the 7 th , 28 th and 42 th day after immunization. Results (Figure 4 A) indicated that anti-EGFP IgG responses of mice immunized with six single-recombinant Salmonella -EGFP strains were very weak on the 7 th day after immunization. Only two mice, from the LP and E groups respectively, had a 1:500 anti-EGFP IgG titer. After receiving boosts on day 21 and 35, the anti-EGFP IgG responses in the mice were greatly increased. In the cytoplasmic expression group (HP, LP and CP), 50.0% of mice (3 of the 6 mice) in the HP subgroup had elevated anti-EGFP IgG responses. The average titers were around 1:21,000 on days 28 and 42. 100.0% of mice (all 9 mice) in the LP subgroup had strong anti-EGFP IgG responses, and the highest titer reached 1:200,000. The average titers were 1:47,000 on day 28, and 1:65,000 on day 42. Notably, no response could be detected in the CP subgroup even after two boosts. In the membrane-based expression group, the response rate for anti-EGFP IgG in the HO subgroup was 44.4% (4 out of 9 mice) with an average titer of 1:390 on day 28, and 55.6% (5 out of 9 mice) with an average titer 1:500 on day 42. Only 12.5% of mice (1 of 8 mice) in the CO subgroup had an anti-EGFP IgG response, with a titer of 1:100 on day 28, and 1:500 on day 42. In the eukaryotic expression plasmid group, only 20.0% of mice (1 of 5 mice) responded, having a 1:10,000 anti-EGFP IgG titer on day 28, and a 1: 25,000 titer on day 42. Collectively, based on the response rates, anti-EGFP IgG response of strains containing either high or low-copy prokaryotic expression plasmids were much better than those containing a chromosome-based expression cassette or an eukaryotic expression plasmid; especially the LP strain, which had significantly higher average anti-EGFP IgG titers on day 42 (p < 0.05). Figure 4 In vivo immune response against recombinant Salmonella -EGFP strains. The eleven recombinant Salmonella -EGFP strains were respectively administrated to one of eleven groups of mice (5–10 mice for each group), with an additional group of non-infected mice kept as a negative control. For each group, 1 × 10 11 bacteria were used to prime each mouse for 3 days, and boost on day 21 and 35, by oral gavage. ( A ) and ( B ) summarize the ELISA results showing the EGFP-specific IgG responses raised by the six single-recombinant Salmonella strains ( A ) and the five double-recombinant Salmonella strains ( B ). ELISA assays were performed using mice sera collected on day 7, 28 and 42. * underneath the LP strain in ( A ) indicates the mean ELISA titer raised by LP strain is significantly higher than those of other strain, as determined by One-Way ANOVA ( P < 0.05). ( C ) and ( D ) summarize the mice T cell anti-EGFP IFN-γ responses raised by the six single-recombinant Salmonella strains ( C ), and the five double-recombinant Salmonella strains ( D ), using mice splenocytes collected on day 42. The ratio of spot numbers counted for the immunized mice, to those counted for non-infected mice, were used to evaluate the anti-EGFP IFN-γ response. * underneath the CP and E strain in ( C ) indicates the mean ELISpot ratios raised by CP and E strain were significantly higher than those of strains with high copy plasmids HP and HO; * underneath the CP + LP, CP + E and E + LP strains in ( D ) indicates the mean ELISpot ratios raised by these strains were significantly lower than their relative single parental strains, as determined by One-Way ANOVA ( P < 0.05). Each ▴ represents one mouse. In ( A ) and ( B ), red lines indicate the average titers for each strain. In ( C ) and ( D ), red lines indicate the average ratios for each strain. Humoral immune response assays were also performed for the five double-recombinant Salmonella -EGFP strains, to investigate whether these two-gene constructs were capable of inducing stronger B cell responses. The results from analogous sets of ELISA experiments are shown in Figure 4 B. Anti-EGFP IgG responses in all five mice groups were very weak on 7 th day after immunization. Only 14.3% of mice (1 of 7 mice) in the CP + HP group and 16.7% of mice (1 out of 6 mice) in the E + LP group generated a humoral response, with titres of 1:100 and 1:1,000, respectively. After two boosts on day 21 and 35, the response rate for anti-EGFP IgG in each group had increased. 28.6% of mice (2 of 7 mice) in the CP + HP group had anti-EGFP IgG responses, with average titers of 1:1,400 on day 28, and 1:1,500 on day 42. In the CP + LP group, 60.0% of mice (3 out of 5 mice) had anti-EGFP IgG responses, with average titers of 1:700 on day 28, and 1:2,500 on day 42. For the CP + HO strain, only 16.7% of mice (1 mouse out of 6) had developed a response by day 28; and by day 42, 33.3% (2 of 6 mice) had mounted anti-EGFP IgG responses, with average titers of ca. 1:330. In the E + LP group, 33.3% of mice (2 out of 6 mice) developed anti-EGFP IgG responses, with average titers of 1:17,000 on day 28; and 50.0% of mice (3 out of 6 mice) generated anti-EGFP IgG responses, with average titers of 1:35,000 on day 42. Notably, no response could be detected in the CP + E group even after two boosts. In brief summary, up to day 42, the humoral response rates against the five double-recombinant Salmonella -EGFP strains did not increase as was initially expected. They were lower than the humoral response rates observed for the respective single-recombinant parental strains. EGFP-specific IgG responses in infected mouse sera In order to compare the humoral immune responses mounted against eleven recombinant Salmonella -EGFP strains, ELISA assays were performed to test the anti-EGFP IgG responses using blood sera of infected mice on the 7 th , 28 th and 42 th day after immunization. Results (Figure 4 A) indicated that anti-EGFP IgG responses of mice immunized with six single-recombinant Salmonella -EGFP strains were very weak on the 7 th day after immunization. Only two mice, from the LP and E groups respectively, had a 1:500 anti-EGFP IgG titer. After receiving boosts on day 21 and 35, the anti-EGFP IgG responses in the mice were greatly increased. In the cytoplasmic expression group (HP, LP and CP), 50.0% of mice (3 of the 6 mice) in the HP subgroup had elevated anti-EGFP IgG responses. The average titers were around 1:21,000 on days 28 and 42. 100.0% of mice (all 9 mice) in the LP subgroup had strong anti-EGFP IgG responses, and the highest titer reached 1:200,000. The average titers were 1:47,000 on day 28, and 1:65,000 on day 42. Notably, no response could be detected in the CP subgroup even after two boosts. In the membrane-based expression group, the response rate for anti-EGFP IgG in the HO subgroup was 44.4% (4 out of 9 mice) with an average titer of 1:390 on day 28, and 55.6% (5 out of 9 mice) with an average titer 1:500 on day 42. Only 12.5% of mice (1 of 8 mice) in the CO subgroup had an anti-EGFP IgG response, with a titer of 1:100 on day 28, and 1:500 on day 42. In the eukaryotic expression plasmid group, only 20.0% of mice (1 of 5 mice) responded, having a 1:10,000 anti-EGFP IgG titer on day 28, and a 1: 25,000 titer on day 42. Collectively, based on the response rates, anti-EGFP IgG response of strains containing either high or low-copy prokaryotic expression plasmids were much better than those containing a chromosome-based expression cassette or an eukaryotic expression plasmid; especially the LP strain, which had significantly higher average anti-EGFP IgG titers on day 42 (p < 0.05). Figure 4 In vivo immune response against recombinant Salmonella -EGFP strains. The eleven recombinant Salmonella -EGFP strains were respectively administrated to one of eleven groups of mice (5–10 mice for each group), with an additional group of non-infected mice kept as a negative control. For each group, 1 × 10 11 bacteria were used to prime each mouse for 3 days, and boost on day 21 and 35, by oral gavage. ( A ) and ( B ) summarize the ELISA results showing the EGFP-specific IgG responses raised by the six single-recombinant Salmonella strains ( A ) and the five double-recombinant Salmonella strains ( B ). ELISA assays were performed using mice sera collected on day 7, 28 and 42. * underneath the LP strain in ( A ) indicates the mean ELISA titer raised by LP strain is significantly higher than those of other strain, as determined by One-Way ANOVA ( P < 0.05). ( C ) and ( D ) summarize the mice T cell anti-EGFP IFN-γ responses raised by the six single-recombinant Salmonella strains ( C ), and the five double-recombinant Salmonella strains ( D ), using mice splenocytes collected on day 42. The ratio of spot numbers counted for the immunized mice, to those counted for non-infected mice, were used to evaluate the anti-EGFP IFN-γ response. * underneath the CP and E strain in ( C ) indicates the mean ELISpot ratios raised by CP and E strain were significantly higher than those of strains with high copy plasmids HP and HO; * underneath the CP + LP, CP + E and E + LP strains in ( D ) indicates the mean ELISpot ratios raised by these strains were significantly lower than their relative single parental strains, as determined by One-Way ANOVA ( P < 0.05). Each ▴ represents one mouse. In ( A ) and ( B ), red lines indicate the average titers for each strain. In ( C ) and ( D ), red lines indicate the average ratios for each strain. Humoral immune response assays were also performed for the five double-recombinant Salmonella -EGFP strains, to investigate whether these two-gene constructs were capable of inducing stronger B cell responses. The results from analogous sets of ELISA experiments are shown in Figure 4 B. Anti-EGFP IgG responses in all five mice groups were very weak on 7 th day after immunization. Only 14.3% of mice (1 of 7 mice) in the CP + HP group and 16.7% of mice (1 out of 6 mice) in the E + LP group generated a humoral response, with titres of 1:100 and 1:1,000, respectively. After two boosts on day 21 and 35, the response rate for anti-EGFP IgG in each group had increased. 28.6% of mice (2 of 7 mice) in the CP + HP group had anti-EGFP IgG responses, with average titers of 1:1,400 on day 28, and 1:1,500 on day 42. In the CP + LP group, 60.0% of mice (3 out of 5 mice) had anti-EGFP IgG responses, with average titers of 1:700 on day 28, and 1:2,500 on day 42. For the CP + HO strain, only 16.7% of mice (1 mouse out of 6) had developed a response by day 28; and by day 42, 33.3% (2 of 6 mice) had mounted anti-EGFP IgG responses, with average titers of ca. 1:330. In the E + LP group, 33.3% of mice (2 out of 6 mice) developed anti-EGFP IgG responses, with average titers of 1:17,000 on day 28; and 50.0% of mice (3 out of 6 mice) generated anti-EGFP IgG responses, with average titers of 1:35,000 on day 42. Notably, no response could be detected in the CP + E group even after two boosts. In brief summary, up to day 42, the humoral response rates against the five double-recombinant Salmonella -EGFP strains did not increase as was initially expected. They were lower than the humoral response rates observed for the respective single-recombinant parental strains. Interferon-gamma (IFN-γ) responses to recombinant Salmonella -EGFP strains The T cell anti-EGFP IFN-γ responses against the eleven recombinant Salmonella -EGFP strains were also determined within immunized mice. An equally sized group of uninfected mice was included as a negative control. The anti-EGFP IFN-γ responses were evaluated by determining the ratio of ELISpot numbers counted for the respective groups of immunized mice, divided by the numbers counted for the control mice. Figure 4 C summarizes the ELISpot results obtained for the six single-recombinant Salmonella -EGFP strains. For the cytoplasmic expression group, the average ratios for the HP, LP and CP subgroups were 4.40, 6.51 and 14.05, respectively. For the membrane expression group (HO and CO), the CO subgroup had an average ratio of 6.39, whilst a ratio of 0.92 was obtained for the HO subgroup. The eukaryotic expression plasmid strain (E) generated anti-EGFP IFN-γ responses with an average ratio of 16.55. Comparing the average ratios obtained for the six recombinant strains, the strains containing the eukaryotic expression plasmid (E) or the chromosome-based expression cassette (CP) were capable of inducing stronger anti-EGFP IFN-γ responses than strains containing high-copy prokaryotic plasmids (HP and HO) (p < 0.05). Interestingly, this general trend is almost the opposite of that noted for the humoral immune responses. The anti-EGFP IFN-γ responses raised by the five double-recombinant Salmonella -EGFP strains were also evaluated, to investigate whether strains containing two EGFP expression cassettes induced stronger T cell responses than the corresponding single-recombinant strains. As shown in Figure 4 D, when CP was combined with HP, LP, HO, or E, the average ratios of anti-EGFP IFN-γ responses in mice were 5.33, 1.61, 9.90 and 2.87, respectively. The average ratio of anti-EGFP IFN-γ responses for the E + LP immunized mice versus the control set was 4.95. In summary, the T cell responses against the five double-recombinant Salmonella -EGFP strains had not been enhanced as was initially expected. Responses against several strains, such as CP + LP, CP + E and E + LP, were significantly lower than the respective single-recombinant parental strains CP and E (p < 0.05). Construction and expression analysis of two recombinant Salmonella -HA strains In the first set of experiments, EGFP was used as a model antigen to study and compare the immunogenic potency of various recombinant Salmonella strains, since previous studies have shown this protein to be highly expressed in a soluble form within Salmonella [ 20 - 22 ]. However, many other heterologous antigens, such as viral proteins, may not be readily expressed in Salmonella in a soluble form, due to factors such as codon bias, amino acid composition or protein stability. Therefore, we chose the HA epitope (91aa-261aa) from the avian influenza H5N1 virus as a second model antigen. Considering the codon bias between Salmonella and influenza virus, the gene sequence encoding the HA fragment (HAOP) was first codon optimized for expression within Salmonella , and prepared synthetically by a commercial supplier (GenScript). The HAOP fragment was subcloned into sets of plasmids analogous to those used for the EGFP gene, in order to construct analogous expression systems within the parental Salmonella SL7207 strain. For cytoplasmic expression, HAOP was subcloned into the p BSK-derived plasmid ( p HP), placing it under the control of the prosseA promoter (plasmid p HAOP). For outer membrane expression, HAOP was subcloned into the p HO plasmid to generate p O-HAOP. These two constructs were separately transformed into SL7207, to create a cytoplasmic HA expression strain of Salmonella (C-HAOP) as well as an outer-membrane HA expression strain of Salmonella (O-HAOP). The expression of HAOP in these two recombinant strains was then confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis. As may be seen in Figure 5 A, HAOP was highly expressed within the C-HAOP strain, being present almost exclusively in the pellet fraction after cell lysis. This indicates that it may be predominantly localized within insoluble inclusion bodies in the cell cytoplasm. For the strain O-HAOP, Western blot analysis of cell-membrane extracts demonstrated that the expressed HAOP was associated with the outer membrane (Figure 5 B). Figure 5 Analysis of HA-antigen expression and in vivo immune response for recombinant Salmonella -HA strains. ( A ) Expression analysis of the HAOP antigen in the C-HAOP strain using SDS-PAGE with Commassie Blue staining and Western blot. SL7207 was used as negative control. ( B ) Western blot analysis of HAOP expression in the O-HAOP strain, using the HO strain as the negative control. ( C ) Results from ELISA experiments showing HA-specific IgG response raised by the O-HAOP strain using the HO strain as a negative control. 10 mice were used for each group. 1 × 10 11 bacteria were used to prime each mouse for 3 days, and two boosts were given on day 21 and 35; all by oral gavage. Blood sera from infected mice were collected on days 7, 28 and 42 for ELISA analysis. * underneath Day 42 indicates that the mean ELISA titer raised by the O-HAOP strain was significantly higher than that of the -HAOP strain ( P < 0.05). ( D ) Results from HIA using blood sera taken from mice infected with O-HAOP strain on day 42. Blood sera from non-infected mice, and mice infected with the HO strain (taken on day 42) were also used a controls. * underneath O-HAOP indicates the mean HIA titer raised by O-HAOP strain was significantly different from those of HO and No-infection groups ( P < 0.05). ( E ) T cell anti-HA IFN-γ responses provoked by the O-HAOP and C-HAOP strains, using the HO strain as a negative control. Asterisks indicate that the average ELISpot ratios provoked by O-HAOP were significantly different to those provoked by HO or C-HAOP ( P < 0.05). In ( C ), ( D ) and ( E ), each ▴ represents one mouse. Red lines indicate the average titers in ( C ) and ( D ), and the average ELISpot ratios in ( E ). In vivo immune response to recombinant Salmonella -HA strains Humoral immune response Hemagglutination Inhibition Assays (HIA) HIA tests were performed using blood sera from mice infected with O-HAOP strain on the 42 nd day (i.e. after 3 identical immunizations: one prime and two boosts; same schedule as above). Blood sera from non-infected mice, as well as those analogously immunized with the HO (EGFP) strain were used as negative controls. Results (Figure 5 D) indicated that sera taken from 50.0% O-HAOP-infected mice (5 out of 10 mice) contained neutralization antibodies with titers ranging from 1:16 to 1:128 (average titer of 1:30). The HIA titers within the O-HAOP-infected mice were significantly different to those obtained for the non-infected group (p < 0.05). Interferon-gamma (IFN-γ) responses to recombinant Salmonella -HA strains As performed for the Salmonella -EGFP strains, T cell anti-HA IFN-γ responses raised against the two recombinant Salmonella -HA strains (C-HAOP and O-HAOP) were evaluated using ELISpot assays. Non-infected mice as well as HO-infected mice were used as negative controls. Analogous to before, the anti-HA IFN-γ responses were evaluated by determining the ratio of ELISpot numbers counted for the C-HAOP, O-HAOP or HO infected mice, divided by the number counted for the non-infected control set (Figure 5 E). It was found that the C-HAOP strain could not induce an anti-HA IFN-γ response, with an average ratio of 0.91 obtained, versus 0.69 determined for the HO-infected group. However, the O-HAOP strain elicited a better anti-HA IFN-γ response comparing to the HO and C-HAOP groups (p < 0.05), yielding an average ratio of 2.56. Humoral immune response Hemagglutination Inhibition Assays (HIA) HIA tests were performed using blood sera from mice infected with O-HAOP strain on the 42 nd day (i.e. after 3 identical immunizations: one prime and two boosts; same schedule as above). Blood sera from non-infected mice, as well as those analogously immunized with the HO (EGFP) strain were used as negative controls. Results (Figure 5 D) indicated that sera taken from 50.0% O-HAOP-infected mice (5 out of 10 mice) contained neutralization antibodies with titers ranging from 1:16 to 1:128 (average titer of 1:30). The HIA titers within the O-HAOP-infected mice were significantly different to those obtained for the non-infected group (p < 0.05). Interferon-gamma (IFN-γ) responses to recombinant Salmonella -HA strains As performed for the Salmonella -EGFP strains, T cell anti-HA IFN-γ responses raised against the two recombinant Salmonella -HA strains (C-HAOP and O-HAOP) were evaluated using ELISpot assays. Non-infected mice as well as HO-infected mice were used as negative controls. Analogous to before, the anti-HA IFN-γ responses were evaluated by determining the ratio of ELISpot numbers counted for the C-HAOP, O-HAOP or HO infected mice, divided by the number counted for the non-infected control set (Figure 5 E). It was found that the C-HAOP strain could not induce an anti-HA IFN-γ response, with an average ratio of 0.91 obtained, versus 0.69 determined for the HO-infected group. However, the O-HAOP strain elicited a better anti-HA IFN-γ response comparing to the HO and C-HAOP groups (p < 0.05), yielding an average ratio of 2.56. Hemagglutination Inhibition Assays (HIA) HIA tests were performed using blood sera from mice infected with O-HAOP strain on the 42 nd day (i.e. after 3 identical immunizations: one prime and two boosts; same schedule as above). Blood sera from non-infected mice, as well as those analogously immunized with the HO (EGFP) strain were used as negative controls. Results (Figure 5 D) indicated that sera taken from 50.0% O-HAOP-infected mice (5 out of 10 mice) contained neutralization antibodies with titers ranging from 1:16 to 1:128 (average titer of 1:30). The HIA titers within the O-HAOP-infected mice were significantly different to those obtained for the non-infected group (p < 0.05). Interferon-gamma (IFN-γ) responses to recombinant Salmonella -HA strains As performed for the Salmonella -EGFP strains, T cell anti-HA IFN-γ responses raised against the two recombinant Salmonella -HA strains (C-HAOP and O-HAOP) were evaluated using ELISpot assays. Non-infected mice as well as HO-infected mice were used as negative controls. Analogous to before, the anti-HA IFN-γ responses were evaluated by determining the ratio of ELISpot numbers counted for the C-HAOP, O-HAOP or HO infected mice, divided by the number counted for the non-infected control set (Figure 5 E). It was found that the C-HAOP strain could not induce an anti-HA IFN-γ response, with an average ratio of 0.91 obtained, versus 0.69 determined for the HO-infected group. However, the O-HAOP strain elicited a better anti-HA IFN-γ response comparing to the HO and C-HAOP groups (p < 0.05), yielding an average ratio of 2.56. Discussion B cell responses and soluble antigen expression levels The use of recombinant Salmonella strains as live attenuated vaccines has been attracting increasing interest over recent years, due to the low cost and relative ease by which they may be produced on a large scale. [ 23 - 25 ]. Although numerous Salmonella vaccine systems have been developed, relatively little work has been carried out to systematically investigate which approaches or construction methods reproducibly produce recombinant strains with the highest immunogenicity levels. Here, we used EGFP as a model antigen to study the relationship between immunogenicity and the use of different antigen expression systems in Salmonella . Six recombinant strains, including three cytoplasmic expression strains (HP, LP and CP); two outer-membrane expression strains (HO, CO) and one eukaryotic expression plasmid (strain E), were constructed. Several different pairs of EGFP-expression systems were combined, to produce five additional 'double-recombinant' strains. The antigen expression levels; in vitro and in vivo growth and infection abilities; and the immunogenic properties of these single and double-recombinant strains in mice; were systematically investigated, in order to evaluate their respective advantages, and to identify deleterious or synergistic effects. Within the set of three single-recombinant strains designed for cytoplasmic expression of antigen protein, the high copy plasmid p HP produced the highest amounts of EGFP within the HP cells in vitro (Figure 2 B); resulting in relatively strong B cell responses (anti-EGFP IgG response rate, Figure 4 A), even though the plasmid itself did not exhibit good stability in vitro and in vivo (Table 4 and Figure 3 ). Although the EGFP expression levels in the LP strain (containing the low-copy p LP plasmid) were lower than those in the HP strain, LP elicited a better B cell response, which is probably due to high EGFP expression and improved plasmid stability in vitro and in vivo . The CP strain, which contains a (single-copy) chromosome-based expression cassette, produced lower levels of EGFP expression than the HP and LP strains, and induced a weaker B cell response rate than these two strains. Out of the two single-recombinant strains designed for outer membrane expression, the HO strain, which harbors the high copy number p HO plasmid, expressed higher levels of EGFP than the chromosome-based CO strain in vitro , and also elicited better B cell response rate. The EGFP expression levels in the HO strain were lower than those in HP or LP, the high copy plasmid p HO showed poor in vivo stability (as did p HP), and it also induced a weaker B cell response than the LP strain. The B cell response rate against the E strain, which harbors a eukaryotic expression plasmid, were weaker than those raised by the HP, LP and HO strains; most likely because the EGFP cannot be expressed until p EGFP has entered a host cell. In addition, the eukaryotic plasmid expression levels may not be as high as those generated by Salmonella strains containing high or low copy prokaryotic plasmids. Taken together, these findings suggest the strength of the humoral immunity responses in mice infected with recombinant Salmonella vaccines were positively correlated to antigen expression levels and plasmid stability. Therefore, maintaining high and stable antigen expression levels in recombinant Salmonella strains is of key importance for eliciting a strong B cell response. Furthermore, our results indicate that strains containing low copy prokaryotic plasmids are capable of generating highest B cell responses with relative high antigen expression level and improved stability over high-copy plasmids. During previous efforts to develop live recombinant Salmonella oral vaccines, the expression of heterologous antigens within Salmonella cells was achieved mainly through the use of multi-copy prokaryotic plasmids which contain the antigen of interest under the control of a prokaryotic promoter. Plasmids with various copy numbers have been used [ 26 , 27 ]. In several cases, such as the construction of live attenuated Salmonella oral vaccines against Streptococcus pneumonia , the H5N1 virus or hepatitis B virus; the antigens of interest expressed from high copy prokaryotic plasmids were able to induce strong immune responses, especially humoral responses [ 7 - 9 ]. However, many of these vaccine strains had either negligible or fairly low immunogenicity, due to the instability of the high copy plasmid, or toxic effects induced by the unregulated high-level expression of these heterologous antigens [ 28 - 30 ]. Plasmids may be stably maintained in Salmonella cells during in vitro growth via the use of the appropriate antibiotic. However, the loss of high copy plasmids may easily occur once Salmonella infects and grows inside the host, due to the absence of antibiotic selection pressure; thereby resulting in reduced antigen expression levels and decreased immunogenicity in vivo . Also, the unregulated high level expression of antigen may create a significant metabolic burden, or even toxicity for the Salmonella cell, thus creating a selective pressure for high copy plasmid segregation during cell division [ 27 ]. Here, the LP strain, which contained a low copy plasmid, exhibited relatively high EGFP expression levels with improved in vitro and in vivo stability, compared with strains containing high copy plasmids. This strain induced the highest levels of B cell immunogenicity (Table 4 and Figures 2 B, 3 and 4 ). This result is similar to those reported in previous studies, which have found that lowering the plasmid copy number results in enhanced plasmid stability and a reduction in the expression levels of heterologous antigens to non-toxic levels [ 31 - 34 ]. Problems associated with plasmid instability and toxicity due to high-level antigen expression may be circumvented through the use of a chromosome-based expression strategy. In this and other studies, homologous recombination has been used to insert a heterologous antigen expression cassette into the Salmonella chromosome, resulting in the creation of recombinant strains with good in vitro and in vivo stabilities (Table 4 and Figure 3 ) [ 35 , 36 ]. However, as the heterologous gene is present as a single copy per bacterium, the expression levels may be too low to effectively induce a B cell response. In this study, the poor B cell responses against the chromosome-based expression strains CP and CO were probably due to the low levels of EGFP expression (Figures 2 B and 4 A). Similar findings have been previously reported. For example, during efforts to develop a live Salmonella oral vaccine against fragment C of the tetanus toxin (TetC), the recombination of TetC into the aro C gene of S. typhimurium created a strain with good stability; however low TetC expression levels resulted in poor immunogenicity. One possible way to increase expression levels would be to insert multiple copies of the heterologous antigen genes into chromosome. T cell responses, eukaryotic expression and colonization with good stability Salmonella has been used as a delivery vector for eukaryotic plasmids for more than ten years [ 37 - 40 ]. In these DNA vaccines, the plasmid encoding the target antigen gene is placed under the control of a eukaryotic promoter. Theoretically, Salmonella delivered-mucosal DNA vaccines can invade the Peyer's patches via M cells in the intestinal mucosa, which contain many antigen-presenting cells (APCs); such as macrophages and dendritic cells [ 41 ]. Once phagocytized by the APCs, the recombinant Salmonella cells would be lysed within the phagosomes, releasing the eukaryotic plasmids into the APCs. The APCs would then express the plasmid-encoded antigen and present them to CD4 + or CD8 + T cells in the Peyer's patches or mesenteric lymph nodes via MHC I and MHC II molecules. In addition, the APCs may directly secrete the recombinant antigens from the cells, so that B cells can recognize them via B cell receptors (BCRs). This process induces further mucosal, humoral or cellular immune responses against the heterologous antigen [ 38 , 42 - 45 ]. Many studies have found that Salmonella delivered DNA vaccines were particularly good at generating T cell responses against foreign antigens. In this project, we constructed a Salmonella -DNA vaccine strain (strain E) which contains a high copy eukaryotic plasmid ( p EGFP). Using Western blotting, we confirmed that p EGFP plasmid delivered by the E strain could be used to successfully express EGFP in mice intestinal mucosal sites on day 1 after inoculation (Figure 1 E). Furthermore, we found that this Salmonella -eukaryotic plasmid-based system could induce better T cell responses than the Salmonella -high-copy-prokaryotic plasmid-based systems (Figure 4 C); However, its antibody responses were quite low (Figure 4 A). Analogous findings have previously been reported. In one comparative study, it was shown that an oral Salmonella DNA vaccine strain encoding β-galactosidase induced better T helper cell and CTL responses than oral immunization with a Salmonella strain containing a prokaryotic plasmid-encoded β-galactosidase gene [ 38 ]. Similarly, oral immunization with the surface protein from the hepatitis B virus delivered by a Salmonella DNA vaccine elicited good T cell responses, but its B cell responses were quite low [ 46 ]. Based on our and others' comparative analyses, we consider it likely that the endogenously produced antigen delivered by the Salmonella -DNA vaccine may generate immune responses mainly through the MHC I pathway, thus resulting in higher T cell responses but lower B cell responses. ELISpot results suggested that a chromosome-based expression system (CP strain) could also generate better T cell responses than strains containing high copy prokaryotic plasmids. Furthermore, results from the in vivo survival, infection ability and construct stability assays (Figure 3 ), indicated that the CP strain had better survival abilities and construct stability than strains containing high copy plasmids. These findings indicated that colonization with recombinant vaccine strains with good construct stability is also an important factor for eliciting strong T cell responses. This is most likely due to the following reasons: T cell responses against Salmonella infection can be effectively induced only after the recombinant cells have invaded and proliferated within the APCs [ 47 ]. However, after oral administration, the bacterial cells would be in a low-nutrient environment that lacked antibiotic selective pressure. They would also be subjected to acidic conditions within the GI tract (even if this was partially negated by sodium bicarbonate lavage) as well as attack by the host immune defenses. Consequently, non-integrating (episomal) plasmids would be lost fairly rapidly as observed in survival, infection ability and construct stability analyses (Figure 3 ), thereby greatly reducing the abilities of the bacterium to synthesize antigen protein in vivo . Chromosome-based strains such as CP avoid this problem, albeit at the price of reduced antigen expression levels. Even though the chromosome-based CO strain showed in vivo stabilities equivalent to the CP strain, its T cell responses were lower. It is possible that the membrane-expressed EGFP significantly slowed the growth rate of the CO strain (Table 2 ), resulting in poorer in vivo survival and proliferation abilities (colonization ability), compared to the CP strain (Figure 3 A). It is notable that for the various single-recombinant strains, the general trend observed for the T cell responses ran contrary to the trend observed for the humoral immunity responses (described above). In this regard, the properties of the LP strain are worth commenting on. Even though its induced T cell responses were not as high as those elicited by the E and CP strains, it could simultaneously induce both B cell and T cell responses. It also exhibited better in vivo stability than the strains containing high copy plasmids (Figure 3 ). Consequently, if the aim was to develop a vaccine strain capable of inducing both B cell and T cell responses, then the use of a low copy cytoplasmic expression system may be desirable. Immunogenicity of strains encoding two EGFP expression cassettes Since the strains containing the high or low copy prokaryotic plasmids (HP, LP, HO) could induce better B cell responses, while strains containing the eukaryotic expression plasmid (E) or the chromosome-based expression cassette (CP) elicited higher anti-EGFP IFN-γ responses, we hypothesized that a combination of two individual expression strategies may result in both stronger B and T cell responses. Consequently, we created five double-recombinant strains (CP + HP, CP + LP, CP + HO, CP + E, E + LP). We used CP and E as the starting strains for the construction of these five dual-expression systems, using compatible plasmid replication origins and orthogonal antibiotic resistance genes. The CP + HP, CP + LP, CP + HO and E + LP strains were designed to elicit both stronger B cell and T cell responses. The CP + E strain was constructed to investigate whether it could generate a T cell response that was higher than those of the two individual strains. Contrary to our initial expectations, both the humoral and T cell immune responses against these five double-recombinant strains were not markedly improved, some of them were obviously worse than their individual parent strains (Figure 4 ). There are several possible reasons for this lack of synergy: first, the combination increased the frequency of plasmid loss. According to our in vitro plasmid stability studies (Table 5 ), we found that the detection rates for p HP in the CP + HP strain, p HO in the CP + HO strain and p EGFP in the E + LP strain were 0.8%, 60.0% and 50.0%, respectively. This suggested that the high copy plasmids were more easily displaced in the double-recombinant strains, resulting in a decrease in EGFP expression levels (Figure 2 B) and B cell responses (Figure 4 A and B). Second, antibiotic selection pressure was increased. To maintain the plasmids, we used relatively high concentrations of two antibiotics during the subculturing procedures. However, the high-copy plasmids, containing p UC replication origins, were still frequently lost from the cells. Upon losing the plasmid, the relevant antibiotic will become toxic to the cell, resulting in significantly decreased growth rates for the five double-recombinant strains (Tables 2 and 3 ). It would also cause an increase in 'stress' for the cell, resulting in defects in replication and other growth-related effects; which were manifested in the frequent formation of filamentous cells (Figure 2 A) [ 48 - 50 ]. Furthermore, even though the high-copy plasmids were not lost from some of the recombinant Salmonella strains in vitro ; as was noted for the HO, E and CP + E strains (Tables 4 and 5 ), cell elongation was still observed (Figure 2 A). This may be due to the 'metabolic burden' [ 51 - 53 ] caused by the active maintenance of multiple high copy plasmids within the cell, leading to decreases in its overall immunogenic properties. Expression strategies for insoluble antigens in Salmonella oral vaccine strains As the expression abilities of Salmonella are relatively similar to those of Escherichia coli , this prokaryotic system may not be suitable for the expression of protein antigens from viruses or higher eukaryotes [ 38 ]. Consequently, when constructing a vaccine strain against a virus such as avian influenza H5N1, several factors must be taken into consideration. The first is codon bias; however this may be easily resolved by gene synthesis, using the codons preferred by Salmonella . The second problem is the inability to express soluble antigen within the cytoplasm, or to target it to the cell surface in a correctly folded form. Many antigens from eukaryotic viruses, such as the HA protein from H5N1, cannot be readily expressed in a soluble form within the cytoplasm of Salmonella [ 8 ]. This type of situation can dramatically decrease the B cell and T cell immune response within the infected host. According to our in vivo immune response assays, no detectable B cell or T cell responses could be detected when mice were immunized with the C-HAOP strain, which was designed to cytoplasmically express the HA antigen. It has previously been reported that expressing the antigen protein on the outer membrane of the engineered bacterial cells may increase the immune response [ 54 ], since this may increase the likelihood of recognition by the host immune system. To investigate this issue, we targeted the EGFP protein for outer membrane expression using the lpp-ompA outer membrane expression system. Analogous outer membrane expression cassettes were located on a high-copy plasmid (HO strain) and on the chromosome (CO strain). The B cell responses (Figure 4 A) against these two strains were weaker than those obtained for the LP strain; and the T cell responses (Figure 4 C) against the HO strain were lower than those obtained for the E and CP strains. This may be because the total amounts of EGFP synthesized and exported to the outer membrane were too low to induce an effective B cell response (Figure 2 B), or because the in vivo stabilities of the high copy plasmids were not sufficient to induce an effective T cell response (Figure 3 ). However, this strategy proved somewhat more successful for the HA antigen, which appears to be largely present in insoluble inclusion bodies in the cytoplasm of Salmonella . We found that the use of the lpp-ompA system, which is present in the O-HAOP strain, resulted in the successful export of HA antigen to the outer membrane fraction (Figure 5 B). Furthermore, results from ELISA, HIA and ELISpot assays indicated this strain of Salmonella was capable of inducing better HA-specific B cell and T cell responses than the corresponding C-HAOP strain, which expresses the HA antigen in the cytoplasm (Figure 5 C, D and E). It is possible that the use of the Lpp-OmpA system either helps the HA protein fold into a soluble conformation, or results in the export of increased amounts of HA protein, causing notable enhancements in immunogenicity. B cell responses and soluble antigen expression levels The use of recombinant Salmonella strains as live attenuated vaccines has been attracting increasing interest over recent years, due to the low cost and relative ease by which they may be produced on a large scale. [ 23 - 25 ]. Although numerous Salmonella vaccine systems have been developed, relatively little work has been carried out to systematically investigate which approaches or construction methods reproducibly produce recombinant strains with the highest immunogenicity levels. Here, we used EGFP as a model antigen to study the relationship between immunogenicity and the use of different antigen expression systems in Salmonella . Six recombinant strains, including three cytoplasmic expression strains (HP, LP and CP); two outer-membrane expression strains (HO, CO) and one eukaryotic expression plasmid (strain E), were constructed. Several different pairs of EGFP-expression systems were combined, to produce five additional 'double-recombinant' strains. The antigen expression levels; in vitro and in vivo growth and infection abilities; and the immunogenic properties of these single and double-recombinant strains in mice; were systematically investigated, in order to evaluate their respective advantages, and to identify deleterious or synergistic effects. Within the set of three single-recombinant strains designed for cytoplasmic expression of antigen protein, the high copy plasmid p HP produced the highest amounts of EGFP within the HP cells in vitro (Figure 2 B); resulting in relatively strong B cell responses (anti-EGFP IgG response rate, Figure 4 A), even though the plasmid itself did not exhibit good stability in vitro and in vivo (Table 4 and Figure 3 ). Although the EGFP expression levels in the LP strain (containing the low-copy p LP plasmid) were lower than those in the HP strain, LP elicited a better B cell response, which is probably due to high EGFP expression and improved plasmid stability in vitro and in vivo . The CP strain, which contains a (single-copy) chromosome-based expression cassette, produced lower levels of EGFP expression than the HP and LP strains, and induced a weaker B cell response rate than these two strains. Out of the two single-recombinant strains designed for outer membrane expression, the HO strain, which harbors the high copy number p HO plasmid, expressed higher levels of EGFP than the chromosome-based CO strain in vitro , and also elicited better B cell response rate. The EGFP expression levels in the HO strain were lower than those in HP or LP, the high copy plasmid p HO showed poor in vivo stability (as did p HP), and it also induced a weaker B cell response than the LP strain. The B cell response rate against the E strain, which harbors a eukaryotic expression plasmid, were weaker than those raised by the HP, LP and HO strains; most likely because the EGFP cannot be expressed until p EGFP has entered a host cell. In addition, the eukaryotic plasmid expression levels may not be as high as those generated by Salmonella strains containing high or low copy prokaryotic plasmids. Taken together, these findings suggest the strength of the humoral immunity responses in mice infected with recombinant Salmonella vaccines were positively correlated to antigen expression levels and plasmid stability. Therefore, maintaining high and stable antigen expression levels in recombinant Salmonella strains is of key importance for eliciting a strong B cell response. Furthermore, our results indicate that strains containing low copy prokaryotic plasmids are capable of generating highest B cell responses with relative high antigen expression level and improved stability over high-copy plasmids. During previous efforts to develop live recombinant Salmonella oral vaccines, the expression of heterologous antigens within Salmonella cells was achieved mainly through the use of multi-copy prokaryotic plasmids which contain the antigen of interest under the control of a prokaryotic promoter. Plasmids with various copy numbers have been used [ 26 , 27 ]. In several cases, such as the construction of live attenuated Salmonella oral vaccines against Streptococcus pneumonia , the H5N1 virus or hepatitis B virus; the antigens of interest expressed from high copy prokaryotic plasmids were able to induce strong immune responses, especially humoral responses [ 7 - 9 ]. However, many of these vaccine strains had either negligible or fairly low immunogenicity, due to the instability of the high copy plasmid, or toxic effects induced by the unregulated high-level expression of these heterologous antigens [ 28 - 30 ]. Plasmids may be stably maintained in Salmonella cells during in vitro growth via the use of the appropriate antibiotic. However, the loss of high copy plasmids may easily occur once Salmonella infects and grows inside the host, due to the absence of antibiotic selection pressure; thereby resulting in reduced antigen expression levels and decreased immunogenicity in vivo . Also, the unregulated high level expression of antigen may create a significant metabolic burden, or even toxicity for the Salmonella cell, thus creating a selective pressure for high copy plasmid segregation during cell division [ 27 ]. Here, the LP strain, which contained a low copy plasmid, exhibited relatively high EGFP expression levels with improved in vitro and in vivo stability, compared with strains containing high copy plasmids. This strain induced the highest levels of B cell immunogenicity (Table 4 and Figures 2 B, 3 and 4 ). This result is similar to those reported in previous studies, which have found that lowering the plasmid copy number results in enhanced plasmid stability and a reduction in the expression levels of heterologous antigens to non-toxic levels [ 31 - 34 ]. Problems associated with plasmid instability and toxicity due to high-level antigen expression may be circumvented through the use of a chromosome-based expression strategy. In this and other studies, homologous recombination has been used to insert a heterologous antigen expression cassette into the Salmonella chromosome, resulting in the creation of recombinant strains with good in vitro and in vivo stabilities (Table 4 and Figure 3 ) [ 35 , 36 ]. However, as the heterologous gene is present as a single copy per bacterium, the expression levels may be too low to effectively induce a B cell response. In this study, the poor B cell responses against the chromosome-based expression strains CP and CO were probably due to the low levels of EGFP expression (Figures 2 B and 4 A). Similar findings have been previously reported. For example, during efforts to develop a live Salmonella oral vaccine against fragment C of the tetanus toxin (TetC), the recombination of TetC into the aro C gene of S. typhimurium created a strain with good stability; however low TetC expression levels resulted in poor immunogenicity. One possible way to increase expression levels would be to insert multiple copies of the heterologous antigen genes into chromosome. T cell responses, eukaryotic expression and colonization with good stability Salmonella has been used as a delivery vector for eukaryotic plasmids for more than ten years [ 37 - 40 ]. In these DNA vaccines, the plasmid encoding the target antigen gene is placed under the control of a eukaryotic promoter. Theoretically, Salmonella delivered-mucosal DNA vaccines can invade the Peyer's patches via M cells in the intestinal mucosa, which contain many antigen-presenting cells (APCs); such as macrophages and dendritic cells [ 41 ]. Once phagocytized by the APCs, the recombinant Salmonella cells would be lysed within the phagosomes, releasing the eukaryotic plasmids into the APCs. The APCs would then express the plasmid-encoded antigen and present them to CD4 + or CD8 + T cells in the Peyer's patches or mesenteric lymph nodes via MHC I and MHC II molecules. In addition, the APCs may directly secrete the recombinant antigens from the cells, so that B cells can recognize them via B cell receptors (BCRs). This process induces further mucosal, humoral or cellular immune responses against the heterologous antigen [ 38 , 42 - 45 ]. Many studies have found that Salmonella delivered DNA vaccines were particularly good at generating T cell responses against foreign antigens. In this project, we constructed a Salmonella -DNA vaccine strain (strain E) which contains a high copy eukaryotic plasmid ( p EGFP). Using Western blotting, we confirmed that p EGFP plasmid delivered by the E strain could be used to successfully express EGFP in mice intestinal mucosal sites on day 1 after inoculation (Figure 1 E). Furthermore, we found that this Salmonella -eukaryotic plasmid-based system could induce better T cell responses than the Salmonella -high-copy-prokaryotic plasmid-based systems (Figure 4 C); However, its antibody responses were quite low (Figure 4 A). Analogous findings have previously been reported. In one comparative study, it was shown that an oral Salmonella DNA vaccine strain encoding β-galactosidase induced better T helper cell and CTL responses than oral immunization with a Salmonella strain containing a prokaryotic plasmid-encoded β-galactosidase gene [ 38 ]. Similarly, oral immunization with the surface protein from the hepatitis B virus delivered by a Salmonella DNA vaccine elicited good T cell responses, but its B cell responses were quite low [ 46 ]. Based on our and others' comparative analyses, we consider it likely that the endogenously produced antigen delivered by the Salmonella -DNA vaccine may generate immune responses mainly through the MHC I pathway, thus resulting in higher T cell responses but lower B cell responses. ELISpot results suggested that a chromosome-based expression system (CP strain) could also generate better T cell responses than strains containing high copy prokaryotic plasmids. Furthermore, results from the in vivo survival, infection ability and construct stability assays (Figure 3 ), indicated that the CP strain had better survival abilities and construct stability than strains containing high copy plasmids. These findings indicated that colonization with recombinant vaccine strains with good construct stability is also an important factor for eliciting strong T cell responses. This is most likely due to the following reasons: T cell responses against Salmonella infection can be effectively induced only after the recombinant cells have invaded and proliferated within the APCs [ 47 ]. However, after oral administration, the bacterial cells would be in a low-nutrient environment that lacked antibiotic selective pressure. They would also be subjected to acidic conditions within the GI tract (even if this was partially negated by sodium bicarbonate lavage) as well as attack by the host immune defenses. Consequently, non-integrating (episomal) plasmids would be lost fairly rapidly as observed in survival, infection ability and construct stability analyses (Figure 3 ), thereby greatly reducing the abilities of the bacterium to synthesize antigen protein in vivo . Chromosome-based strains such as CP avoid this problem, albeit at the price of reduced antigen expression levels. Even though the chromosome-based CO strain showed in vivo stabilities equivalent to the CP strain, its T cell responses were lower. It is possible that the membrane-expressed EGFP significantly slowed the growth rate of the CO strain (Table 2 ), resulting in poorer in vivo survival and proliferation abilities (colonization ability), compared to the CP strain (Figure 3 A). It is notable that for the various single-recombinant strains, the general trend observed for the T cell responses ran contrary to the trend observed for the humoral immunity responses (described above). In this regard, the properties of the LP strain are worth commenting on. Even though its induced T cell responses were not as high as those elicited by the E and CP strains, it could simultaneously induce both B cell and T cell responses. It also exhibited better in vivo stability than the strains containing high copy plasmids (Figure 3 ). Consequently, if the aim was to develop a vaccine strain capable of inducing both B cell and T cell responses, then the use of a low copy cytoplasmic expression system may be desirable. Immunogenicity of strains encoding two EGFP expression cassettes Since the strains containing the high or low copy prokaryotic plasmids (HP, LP, HO) could induce better B cell responses, while strains containing the eukaryotic expression plasmid (E) or the chromosome-based expression cassette (CP) elicited higher anti-EGFP IFN-γ responses, we hypothesized that a combination of two individual expression strategies may result in both stronger B and T cell responses. Consequently, we created five double-recombinant strains (CP + HP, CP + LP, CP + HO, CP + E, E + LP). We used CP and E as the starting strains for the construction of these five dual-expression systems, using compatible plasmid replication origins and orthogonal antibiotic resistance genes. The CP + HP, CP + LP, CP + HO and E + LP strains were designed to elicit both stronger B cell and T cell responses. The CP + E strain was constructed to investigate whether it could generate a T cell response that was higher than those of the two individual strains. Contrary to our initial expectations, both the humoral and T cell immune responses against these five double-recombinant strains were not markedly improved, some of them were obviously worse than their individual parent strains (Figure 4 ). There are several possible reasons for this lack of synergy: first, the combination increased the frequency of plasmid loss. According to our in vitro plasmid stability studies (Table 5 ), we found that the detection rates for p HP in the CP + HP strain, p HO in the CP + HO strain and p EGFP in the E + LP strain were 0.8%, 60.0% and 50.0%, respectively. This suggested that the high copy plasmids were more easily displaced in the double-recombinant strains, resulting in a decrease in EGFP expression levels (Figure 2 B) and B cell responses (Figure 4 A and B). Second, antibiotic selection pressure was increased. To maintain the plasmids, we used relatively high concentrations of two antibiotics during the subculturing procedures. However, the high-copy plasmids, containing p UC replication origins, were still frequently lost from the cells. Upon losing the plasmid, the relevant antibiotic will become toxic to the cell, resulting in significantly decreased growth rates for the five double-recombinant strains (Tables 2 and 3 ). It would also cause an increase in 'stress' for the cell, resulting in defects in replication and other growth-related effects; which were manifested in the frequent formation of filamentous cells (Figure 2 A) [ 48 - 50 ]. Furthermore, even though the high-copy plasmids were not lost from some of the recombinant Salmonella strains in vitro ; as was noted for the HO, E and CP + E strains (Tables 4 and 5 ), cell elongation was still observed (Figure 2 A). This may be due to the 'metabolic burden' [ 51 - 53 ] caused by the active maintenance of multiple high copy plasmids within the cell, leading to decreases in its overall immunogenic properties. Expression strategies for insoluble antigens in Salmonella oral vaccine strains As the expression abilities of Salmonella are relatively similar to those of Escherichia coli , this prokaryotic system may not be suitable for the expression of protein antigens from viruses or higher eukaryotes [ 38 ]. Consequently, when constructing a vaccine strain against a virus such as avian influenza H5N1, several factors must be taken into consideration. The first is codon bias; however this may be easily resolved by gene synthesis, using the codons preferred by Salmonella . The second problem is the inability to express soluble antigen within the cytoplasm, or to target it to the cell surface in a correctly folded form. Many antigens from eukaryotic viruses, such as the HA protein from H5N1, cannot be readily expressed in a soluble form within the cytoplasm of Salmonella [ 8 ]. This type of situation can dramatically decrease the B cell and T cell immune response within the infected host. According to our in vivo immune response assays, no detectable B cell or T cell responses could be detected when mice were immunized with the C-HAOP strain, which was designed to cytoplasmically express the HA antigen. It has previously been reported that expressing the antigen protein on the outer membrane of the engineered bacterial cells may increase the immune response [ 54 ], since this may increase the likelihood of recognition by the host immune system. To investigate this issue, we targeted the EGFP protein for outer membrane expression using the lpp-ompA outer membrane expression system. Analogous outer membrane expression cassettes were located on a high-copy plasmid (HO strain) and on the chromosome (CO strain). The B cell responses (Figure 4 A) against these two strains were weaker than those obtained for the LP strain; and the T cell responses (Figure 4 C) against the HO strain were lower than those obtained for the E and CP strains. This may be because the total amounts of EGFP synthesized and exported to the outer membrane were too low to induce an effective B cell response (Figure 2 B), or because the in vivo stabilities of the high copy plasmids were not sufficient to induce an effective T cell response (Figure 3 ). However, this strategy proved somewhat more successful for the HA antigen, which appears to be largely present in insoluble inclusion bodies in the cytoplasm of Salmonella . We found that the use of the lpp-ompA system, which is present in the O-HAOP strain, resulted in the successful export of HA antigen to the outer membrane fraction (Figure 5 B). Furthermore, results from ELISA, HIA and ELISpot assays indicated this strain of Salmonella was capable of inducing better HA-specific B cell and T cell responses than the corresponding C-HAOP strain, which expresses the HA antigen in the cytoplasm (Figure 5 C, D and E). It is possible that the use of the Lpp-OmpA system either helps the HA protein fold into a soluble conformation, or results in the export of increased amounts of HA protein, causing notable enhancements in immunogenicity. Conclusions In this study, we used EGFP and HAOP as model antigens to systematically compare the immunogenic potency of various recombinant Salmonella strains as live, oral antigen-delivery vectors. Our results indicate that if the antigen (such as EGFP) is soluble and easily expressed in Salmonella , a low-copy plasmid-based strategy should be employed, as it can provoke better B cell responses and can also induce T cell responses. If a T cell response is preferred, a eukaryotic plasmid, or chromosome-based expression strategy may achieve better results. For heterologous antigens that are likely to be expressed in an insoluble form within Salmonella (such as HA), an outer membrane-targeting approach is recommended. In addition, we found that the combination of two expression strategies did not enhance the immune response, and hence we caution against the use of such an approach. Methods Ethics statement All animal work was conducted according to relevant national and international guidelines (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments guidelines). 6-8-week-old female BALB/c mice purchased from the Laboratory Animal Unit of the University of Hong Kong were used for this study. This study was approved by the Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research (CULATR) of The University of Hong Kong, with the CULATR Number 2051–09. Bacterial strains, media, chemicals, enzymes and plasmids Escherichia coli strain DH10B (Invitrogen) was used for all plasmid construction experiments. Attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium aroA - strain SL7207 was kindly provided by Dr. B.A.D. Stocker [ 55 ]. All bacteria were cultured in Luria-Bertani (LB) broth at 37°C. Minimal medium for target protein induction was based on the N-salts recipe [ 56 ]. Antibiotics (Sigma) for clone selection were used at the following final concentrations: ampicillin (Amp, 200 μg/ml), kanamycin (Km, 50 μg/ml) and chloramphenicol (Cm, 25 μg/ml). Restriction endonucleases and ligase enzymes were purchased from New England BioLabs (NEB). Taq polymerase ( Pyrobest and Ex-taq ) and the pMD18-T vector were from Takara. Plasmid p Sim6 was a gift from Dr. D.L. Court. Plasmid p Bluescript II SK ( p BSK) was bought from Stratagene. Other plasmids were from lab stocks. Construction of recombinant Salmonella strains expressing model antigens Construction of 'single-recombinant' Salmonella -EGFP strains The compositions of six 'single-recombinant' Salmonella -EGFP strains (i.e. strains containing a single episomal or chromosomal copy of the EGFP gene) are listed in Table 1 . The primers used to construct the six 'single-recombinant' Salmonella- EGFP strains are listed in Table 6 . The prosseA promoter was PCR amplified from pathogenicity island 2 (SPI2) of SL7207 using the NotI-prosseA-F and HindIII-prosseA-R primers; the EGFP gene was PCR amplified from p loxp-cm-loxp with the HindIII-EGFP-F and XhoI-Ter-EGFP-R primers; then these prosseA and EGFP fragments were co-ligated into vector p BSK via NotI and XhoI to create p HP. Table 6 Primers used in this study Primer Name Primer Sequence (5' to 3') NotI-prosseA-F ATTTGCGGCCGC AGAAGAGAACAACGGCAAGTTAC HindIII-prosseA-R CCCAAGCTT ACGATAGATAATTAACGTGC XhoI-floxed-F CCGCTCGAG CCGATCATATTCAATAACCCT XhoI-floxed-R CCGCTCGAG GACTAGTGAACCTCTTCGAGGG HindIII-EGFP-F CCCAAGCTT AAGAAGGAGATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC XhoI-Ter-EGFP-R CCGCTCGAG CGGCCGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC p 15A-F TATCACTTATTCAGGCGTAGCACC p 15A-R ATCGTATGGGGCTGACTTCA ompA-F GGGAATTCCATATG AAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAAACCCGTATGTTGGCTTTGAAATGGG ompA-R CCGCTCGAGTTATGCGGCCGCG TTGTCCGGACGAGTGCCGATGGTGT oEGFP-F ATTTGCGGCCGC AGTGAGCAAGGGCGAGGAGC oEGFP-R CCGCTCGAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC htrA-F CGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTTGCGTTACCTGTTAATCGAGATTGAAACAC AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT htrA-R AGTTGTGGGGAGTTTCACAGAAAAGTGTTGCCCCCTTCCGTGGTGGAAGGGGGACAAAGGTGATTACTG GAGCGGATAACAATTTCACACAGG The p 15A origin was amplified from plasmid p ACYC177 using primers p 15A-F and p 15A-R, and an EGFP expression cassette was amplified from p HP using primers NotI-prosseA-F and XhoI-Ter-EGFP-R. Both fragments were directly ligated together to creat p LP. The lpp - OmpA outer membrane expression cassette was amplified from SL7207 using primers ompA-F and ompA-R, and was ligated into the p MD18-T vector to create plasmid p OmpA. p HO was constructed by ligating an EGFP cassette (amplified from p loxp-cm-loxp using primers oEGFP-F and oEGFP-R) downstream of lpp-OmpA in p OmpA via NotI and XhoI. Strains HP, LP, HO and E were generated by transforming plasmids p HP, p LP, p HO and p EGFP, respectively into SL7207 by electroporation. A loxp-Cm-loxp cassette was PCR amplified from plasmid p loxp-Cm-loxp using primers XhoI-floxed-F and XhoI-floxed-R [ 57 ], digested with XhoI, then ligated into the XhoI site of plasmid pHP to create plasmid p CP-cm. p CO-cm was generated by replacing the EGFP gene in p HP with NdeI lpp-OmpA-EGFP XhoI and XhoI-loxp-Cm-loxp-XhoI fragments. The linear dsDNA fragments used to create the CP and CO chromosome-based expression strains were respectively amplified from p CP-cm and p CO-cm by PCR using a same pair of primers (htrA-F and htrA-R). Red recombineering was used to construct the CP and CO strains, via transient expression of λ-Red genes from p Sim6 in SL7207 according to the method of Yu et al. [ 22 , 58 ]. Transformants were selected by plating onto LB agar plates containing the required antibiotics, incubating at 37°C overnight. Construction of the 'double-recombinant' Salmonella -EGFP strains The compositions of the five 'double-recombinant' Salmonella -EGFP strains (i.e. strains containing two individual copies of the EGFP gene) are described in Table 1 . Strains CP + HP, CP + LP, CP + HO and CP + E were generated by respectively electro-transforming plasmids p HP, p LP, p HO or p EGFP into the CP strain. The LP + E strain was generated by electro-transforming p EGFP into the LP strain. Successful transformants were selected on LB agar plates containing the appropriate antibiotics, incubating at 37°C overnight. Construction of two recombinant Salmonella -HA strains The sequence of the HA epitope (residues 91–261) from the H5N1 virus (H5N1/A/Vietnam/1194/2004) was codon-optimized for translation in Salmonella based on sequence data from the NCBI-GenBank, and synthesized by GenScript (Piscataway, USA). This synthetic codon-optimized HA epitope gene (denoted HAOP) was cloned between the NotI and XhoI sites of p HP (thereby replacing the EGFP gene) to create p HAOP. p O-HAOP was analogously generated by replacing the EGFP gene of p HO with a NotI/XhoI-digested HAOP fragment. Plasmids p HAOP and p O-HAOP were respectively electro-transformed into SL7207 to generate a cytoplasmic-expression HAOP Salmonella strain (denoted C-HAOP) and a membrane-expression HAOP Salmonella strain (denoted O-HAOP). Culture of recombinant Salmonella strains In order to minimize plasmid loss, the recombinant Salmonella strains were freshly streaked from −80°C stocks onto LB agar plates containing the required antibiotics (Table 1 ) and incubated at 37°C overnight. Single colonies were inoculated into 30 ml liquid LB medium with antibiotics and cultured at 37°C with shaking for 10 hours. The 10-hour bacterial cultures were expanded (1:10) into fresh LB medium containing antibiotics, before being further incubated at 37°C until OD 600 = 2. With the exception of the CP and CO strains, cells were then collected by centrifugation (4,000 g, 4°C); washed once with PBS; resuspended in PBS equal to the volume of the original culture; then immediately used for immunization or expression analysis. Further induction was required for the CP and CO strains, using equal volumes of N-salts medium. Prior to induction, freshly-cultured CP or CO strains were collected by centrifugation (4,000 g, 4°C), then washed twice with N-salts medium in equal volume of bacteria cultures. Cells were then resuspended in N-salts medium containing the appropriate antibiotics (equal to the original volume of the bacterial culture), and incubated at 37°C for 24 hours to induce protein expression. After 24 hours, cells were collected for expression analysis or immunization as above. Expression analysis of recombinant Salmonella strains Fluorescence microscopy Fluorescence microscopy (Olympus BX51 microscope) was used to analyze EGFP expression within the eleven recombinant Salmonella strains. Freshly-cultured bacterial cells (10 μl) were immobilized on 1% agarose pads on glass slides, then visualized using a 60x oil-immersion objective lens. Both bright-field and fluorescent field (ex. 488 nm, em. 518 nm) images were captured (Spot RT3 Digital Camera, Spot Advanced Software Version 4.6). Freshly cultured SL7207 cells were used as a negative control. Fluorescence intensity assays A fluorescence micro-plate reader (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific) was used to quantify EGFP expression levels within freshly-cultured recombinant Salmonella strains. 1 × 10 8 cells were resuspended in 100 μl PBS in 96-well plates (IWAKI, 96 well microplate with flat bottom), and EGFP fluorescence intensity was immediately recorded at room temperature (ex. 518 nm, em. 518 nm; time resolution: 500 ms). Measurements were performed in triplicate, and SL7207 was used as a negative control. SDS-PAGE and Western blot analysis Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western blot analysis was performed to detect EGFP expression in the CO strain. The in vitro and in vivo EGFP expression levels in E, HAOP, C-HAOP and O-HAOP strains; were determined using slightly-modified protocols for each strain. CO strain : cells from 4 ml of induced bacterial culture were collected and resuspended in 100 μl PBS + 50 μl of loading buffer (60 mM Tris–HCl, pH 6.8, 25% glycerol, 2%SDS, 14.4 mM β-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) and boiled (10 minutes) to prepare lysates for analysis. GFP rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology) and goat anti-rabbit antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen), were used as the as primary and secondary antibodies, respectively. SL7207 cells were also treated as above as the negative control. E strain : in vitro and in vivo EGFP expression was quantified by Western blot. The EGFP expression in the eukaryotic cells was first detected in vitro by infecting the Caco-2 human colon carcinoma cell line (American Type Culture Collection) with the E strain. The Caco-2 human colon carcinoma cell line was cultured using Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) (Invitrogen) with 20% fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen) and 1% penicillin/streptomycin (P/S) (Invitrogen) in 24-well plate (TPP, USA) with 5 × 10 5 cells per well at 37°C in 5% CO2. After cell confluence reached 90%, the medium was removed and the cells were washed with PBS twice. Then PBS-washed 1 × 10 7 CFU bacterial cells of E strain in DMEM-20% FBS in the absence of antibiotics were used to incubate with the Caco-2 cells. After 2.5 hours incubation, the non-adherent bacteria were removed by washing with PBS three times. DMEM with 20% FBS was added to maintain the cells at 37°C in 5% CO 2 . Cell samples were collected 12, 20 and 30 hours after infection, respectively. Caco-2 cell protein was extracted using RIPA buffer (50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.25% Deoxycholate, 1% NP40) plus protease inhibitor cocktail tablets (Roche). Briefly, cells were harvested and washed with cold PBS twice (2500 x g, 5 min), then RIPA buffer containing protease inhibitor was added to mix the cell pellet completely, and this was incubated at 4°C for 15 minutes. The RIPA/cell mixture was centrifuged (13000 x g, 1 min) and the supernatant was collected for Western blot assay. The protein quantities were measured using the BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc). Equal amounts of protein from the samples were loaded to detect EGFP expression by Western blot using a GFP monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) and a goat anti-mouse secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (DAKO). GAPDH detection was also performed using an HRP conjugated antibody (Abnova). The SL7207 strain was also treated as above as the negative control. EGFP expression delivered by the E strain was also investigated in the mouse intestine. 1 × 10 11 of bacterial cells of the E strain or the SL7207 strain re-suspended in 200 μl PBS, were orally administrated to 6-8-week-old female BALB/c mice after neutralizing the gastric acid (gavage with 100 μl of 3% sodium bicarbonate), respectively. Intestinal mucosa samples from two groups of mice were collected using heated glass slides on day 1, 3 and 7 after inoculation. Total proteins of intestinal mucosa were extracted using RIPA buffer plus protease inhibitor as mentioned before. Equal amounts of protein samples quantified by BCA protein assay were used to perform Western blot, to detect EGFP expression using the same protocol mentioned above. GAPDH was also detected as the internal control. C-HAOP strain : total cell lysate (from 1 × 10 9 bacterial cells) was prepared as described above. For the cell-fraction lysates, 1 × 10 9 cells were resuspended in 100 μl PBS containing protease inhibitors (Roche, Complete EDTA-Free), then sonicated (Sonics, model VCX750; with ice cooling). After centrifugation (12,000 x g; 1 min; 4°C), the supernatant (ca. 90 μl) was decanted and 50 μl of (x3) loading buffer added. The pellet was resuspended in 100 μl of (x1) loading buffer. Samples were similarly boiled (10 mins), prior to Western blot analysis using rabbit polyclonal influenza A virus hemagglutinin antibody (ab36565, Abcam) and goat anti-rabbit antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen) as primary and secondary antibodies, respectively. SL7207 cells were treated as above as negative control. O-HAOP strain : 40 ml of freshly-cultured bacterial cells were harvested by centrifugation (3,500 x g, 15 mins, 4°C), resuspended in 10 ml PBS containing protease inhibitors, then sonicated 4°C). The cell debris was removed by centrifugation (3,500 x g, 10 mins, 4°C), then the supernatant was ultra-centrifuged (100,000 x g, 60 mins, 4°C) to collect the total membrane fraction (as the pellet). A portion of the membrane fraction was resuspended in PBS containing 0.01 mM MgCl2 and 2% Triton X100, and then centrifuged (100,000 x g, 60 mins, 4°C). The inner membrane fraction was collected as the supernatant; whilst the pellet, which contains the outer membrane fraction, was resuspended in 1 ml PBS. The protein concentration of each fraction was measured using the bicinchoninic acid (BCA) protein assay (Thermo Fisher). Each fraction was boiled with loading buffer (as above) and analyzed by Western blotting using rabbit polyclonal influenza A virus hemagglutinin antibody and HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody as primary and secondary antibodies, respectively. The membrane fraction from the HO strain was used as a negative control. Morphological observation of recombinant Salmonella -EGFP strains Microscopic images of SL7207 and the various recombinant Salmonella -EGFP strains were captured using light microscopy (Olympus BX51 microscope). Twenty cells from each recombinant strain, as well as the SL7207 control were randomly selected from the microscopic images for cell length analysis using the Image J software program [ 58 ]. The mean cell length for each strain was reported ± standard deviation and then compared to the SL7207 control. In vitro growth of recombinant Salmonella -EGFP strains and stability of EGFP expression constructs under antibiotic pressure To assess the growth of the six single-recombinant and five double-recombinant Salmonella -EGFP strains in vitro , the doubling times of these eleven recombinant strains were measured in liquid LB broth with antibiotics. Apart from using SL7207 as a general negative control, the empty vectors: p BSK, p ACYC177, p OmpA, p VAX-1 were electro-transformed into SL7207 to create strains: BSK, ACYC177, OmpA and VAX-1 as the negative controls of HP, LP, HO, E strains, respectively. The VAX-1 + ACYC177 strain was generated by co-electrotransforming p ACYC177 and p VAX-1 into SL7207, as a negative control for the E + LP strain. 10-hour bacterial cultures from each strain obtained using the protocol described in Part 3 were diluted 1:100 into fresh LB medium containing antibiotics. The diluted cultures were then incubated at 37°C with shaking. Bacterial growth was measured spectrophotometrically using OD 600 , at intervals of 30 mins. Four replicates were performed for each strain, and the mean is reported ± standard deviation. The stability of the six single-recombinant and five double-recombinant Salmonella -EGFP strains under antibiotic selective pressure, prior to oral administration were measured via colony forming unit (CFU) assay. 1 × 10 9 cells from each strain were collected and resuspended in 1 ml fresh LB. Six 1:10 serial dilutions were performed, and 10 μl of each dilution was spread on LB agar plates, or LB agar plates containing the appropriate antibiotics as listed in Table 1 . Colonies were counted after incubation overnight at 37°C. Three replicates were performed for each dilution, and the mean is reported ± standard deviation. In vivo survival and infection ability of six single-recombinant Salmonella strains and stability of EGFP expression constructs In order to determine the survival and infection abilities of the six single-recombinant Salmonella EGFP strains, and the in vivo stabilities of the six EGFP expression constructs, 1 × 10 11 of freshly cultured bacterial cells from each of the six strains resuspended in 200 μl PBS, were separately orally administrated to 6-8-week-old female BALB/c mice after neutralizing the gastric acid. 6 mice were grouped for each of the six strains, and one group of mice immunized with SL7207 was kept identically as the negative control. Fecal, spleen and mesenteric lymph nodes samples were collected from each group on days 1, 3 and 7 after administration for CFU assays, respectively. All the samples were homogenized and re-suspended in 9 × LB broth according to sample weights. Then seven 1:10 serial dilutions were carried out in a final volume 100 μl. 10 μl of each dilution was spread on LB agar plates, or LB agar plates containing the appropriate antibiotics as listed in Table 1 . Enumeration was performed after incubation overnight at 37°C. Three replicates were performed for each dilution, and the mean is reported ± standard deviation. In vivo immune response assays Animal immunization 6-8-week-old female BALB/c mice purchased from the Laboratory Animal Unit of the University of Hong Kong (CULATR 2051–09) were used for all in vivo immune response tests. Identical batches of 1 × 10 11 of PBS-washed, freshly-cultured bacterial cells resuspended in 200 μl PBS were used for each immunization procedure (prime and boost) for each strain. Immediately prior to oral administration, each mouse was orally gavaged with 100 μl of 3% sodium bicarbonate to neutralize gastric acid. Cells were administered by oral gavage; giving two boosts on day 21 and day 35 after the initial prime. Groups of 5–10 mice were used for each of the 11 recombinant Salmonella -EGFP strains, and one group of non-infected mice were kept identically as the negative control. In analogous parallel experiments, three further groups of 5–10 mice were orally immunized with the C-HAOP, O-HAOP or HO (as control) strains; with an additional group of non-infected mice kept as a negative control. Humoral immunity assays ELISA Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were used to detect antigen-specific IgG response using mice serum on day 7, 28 and 42. ELISA plates (Ni-NTA HisSorb TM plate, QIAgen) were pre-coated with 100 ng GFP (Millipore) or H5 antigen (H5N1, A/Vietnam/1203/2004, Immune Technology Corp.) in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA, at 4°C overnight. The pre-coating solution was removed, then unreacted sites were blocked with 200 μl of PBS containing 1% BSA, incubating for 2 hours at room temperature. After removal of blocking buffer, serial dilutions of mice serum in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA were added, then plates were incubated at room temperature for 2 hours. Unbound serum antibodies were washed-off with PBST (6 washes). Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen, 20,000-fold dilution in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA) was added and plates were incubated at room temperature for 1 hour. After 6 washes with PBST, 200 μl of TMB solution (Calbiochem) was added, and plates were incubated at room temperature until the appearance of a blue color. The reaction was stopped by adding 50 μl of 2 M sulphuric acid, then intensities were determined at 450 nm using a microplate reader (Spectra Max 340, GrandTech Scientific). Hemagglutination inhibition assay (HIA) Hemagglutination inhibition assays (HIA) were performed according to a standard protocol with minor modifications [ 59 ]. Briefly, serial two-fold dilutions of O-HAOP vaccinated mice serum (ranging from 1:8 to 1:256, in PBS; final volume of 25 μl;) were added to wells of a microtiter plate, together with 25 μl of H5N1 virus suspension (H5N1/A/Vietnam/1194/2004). Microplates were incubated at room temperature for 30 minutes with gentle shaking. 50 μl of chicken red blood cell suspension was added to each well, and plates were incubated at room temperature with gentle shaking until the chicken red blood cell control (chicken red blood cell in 50 μl PBS) formed a button at the bottom of a well. The HIA titer for each serum sample was defined as the highest dilution of serum that could completely inhibit hemagglutination. Sera from non-infected mice, as well as those inoculated with the HO strain were used as negative controls. Three replicates were performed for each dilution. ELISpot ELISpot assays were used to detect the antigen-specific mouse IFN-γ response as described in the Mabtech manual of ELISpot kit. The ELISpot plate (Mabtech) was first activated by adding 50 μl of 70% ethanol to each well for 2 minutes, followed by washing 5 times with 200 μl sterile water. Wells were then pre-coated with 100 μl of 15 μg/ml anti-mouse IFN-γ antibody (AN18 Mabtech) diluted in sterile PBS, incubating at 4°C overnight. Excess antibody was then removed by washing 5 times with 200 μl sterile water. Plates were incubated with 200 μl of RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) for 30 minutes. During incubation, spleens taken from day 42 mice were homogenized and treated with red blood cell lysis buffer (10 mM KHCO 3 , 150 mM NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA). The spleen cell homogenates were filtered (40 μm cell strainer, BD Falcon) then centrifuged (1000 x g, 8 minutes, 4°C). Cell pellets were suspended in RPMI 1640 medium containing 10% FBS. 2 × 10 5 cells in 100 μl RPMI 1640 medium containing 10% FBS were added to each pre-coated well. For each mice, 200 ng of H5 or GFP antigen and 100 anti-mouse CD28 (BD Pharmingen) were added to triplicate wells as sample stimulatory agents; 2 ng phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma), 100 ng Ionomycin calcium salt (INO, Sigma) and 100 ng anti-mouse CD28 were added into triplicate wells as the stimulatory agents of positive control; Meanwhile, another triplicate wells was added no stimulatory agents as negative control. Plates were then incubated at 37°C for 44 hours. Wells were then washed 5 times with 200 μl PBS, and incubated with 100 μl of 1 μg/ml detection antibody (R4-6A2-biotin, Mabtech) in PBS-0.5% FBS for 2 hours at room temperature. Unbound antibody was removed by washing 5 times with 200 μl PBS, then plates were incubated with 100 μl of 1000-fold diluted Streptavidin-HRP in PBS + 0.5% FBS for 1 hour at room temperature. After washing 5 times with 200 μl PBS, 100 μl of TMB solution was added, and plates were allowed to develop at room temperature until distinct spots emerged. Colour development was stopped by washing extensively with water. After allowing spots to dry at room temperature in a fume hood, plates were analyzed using an ELISpot reader (C.T.L. Analyzers, LLC). Statistical analysis Differences between the means of two experimental groups were analyzed by the Student's t -test. One-Way ANOVA (SPSS 16.0, SPSS Inc., Chicago, USA) was performed to compare the differences of multiple groups. Results are presented as mean values ± standard error, and at least three independent replicates were performed for each condition. Ethics statement All animal work was conducted according to relevant national and international guidelines (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments guidelines). 6-8-week-old female BALB/c mice purchased from the Laboratory Animal Unit of the University of Hong Kong were used for this study. This study was approved by the Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research (CULATR) of The University of Hong Kong, with the CULATR Number 2051–09. Bacterial strains, media, chemicals, enzymes and plasmids Escherichia coli strain DH10B (Invitrogen) was used for all plasmid construction experiments. Attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium aroA - strain SL7207 was kindly provided by Dr. B.A.D. Stocker [ 55 ]. All bacteria were cultured in Luria-Bertani (LB) broth at 37°C. Minimal medium for target protein induction was based on the N-salts recipe [ 56 ]. Antibiotics (Sigma) for clone selection were used at the following final concentrations: ampicillin (Amp, 200 μg/ml), kanamycin (Km, 50 μg/ml) and chloramphenicol (Cm, 25 μg/ml). Restriction endonucleases and ligase enzymes were purchased from New England BioLabs (NEB). Taq polymerase ( Pyrobest and Ex-taq ) and the pMD18-T vector were from Takara. Plasmid p Sim6 was a gift from Dr. D.L. Court. Plasmid p Bluescript II SK ( p BSK) was bought from Stratagene. Other plasmids were from lab stocks. Construction of recombinant Salmonella strains expressing model antigens Construction of 'single-recombinant' Salmonella -EGFP strains The compositions of six 'single-recombinant' Salmonella -EGFP strains (i.e. strains containing a single episomal or chromosomal copy of the EGFP gene) are listed in Table 1 . The primers used to construct the six 'single-recombinant' Salmonella- EGFP strains are listed in Table 6 . The prosseA promoter was PCR amplified from pathogenicity island 2 (SPI2) of SL7207 using the NotI-prosseA-F and HindIII-prosseA-R primers; the EGFP gene was PCR amplified from p loxp-cm-loxp with the HindIII-EGFP-F and XhoI-Ter-EGFP-R primers; then these prosseA and EGFP fragments were co-ligated into vector p BSK via NotI and XhoI to create p HP. Table 6 Primers used in this study Primer Name Primer Sequence (5' to 3') NotI-prosseA-F ATTTGCGGCCGC AGAAGAGAACAACGGCAAGTTAC HindIII-prosseA-R CCCAAGCTT ACGATAGATAATTAACGTGC XhoI-floxed-F CCGCTCGAG CCGATCATATTCAATAACCCT XhoI-floxed-R CCGCTCGAG GACTAGTGAACCTCTTCGAGGG HindIII-EGFP-F CCCAAGCTT AAGAAGGAGATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC XhoI-Ter-EGFP-R CCGCTCGAG CGGCCGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC p 15A-F TATCACTTATTCAGGCGTAGCACC p 15A-R ATCGTATGGGGCTGACTTCA ompA-F GGGAATTCCATATG AAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAAACCCGTATGTTGGCTTTGAAATGGG ompA-R CCGCTCGAGTTATGCGGCCGCG TTGTCCGGACGAGTGCCGATGGTGT oEGFP-F ATTTGCGGCCGC AGTGAGCAAGGGCGAGGAGC oEGFP-R CCGCTCGAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC htrA-F CGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTTGCGTTACCTGTTAATCGAGATTGAAACAC AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT htrA-R AGTTGTGGGGAGTTTCACAGAAAAGTGTTGCCCCCTTCCGTGGTGGAAGGGGGACAAAGGTGATTACTG GAGCGGATAACAATTTCACACAGG The p 15A origin was amplified from plasmid p ACYC177 using primers p 15A-F and p 15A-R, and an EGFP expression cassette was amplified from p HP using primers NotI-prosseA-F and XhoI-Ter-EGFP-R. Both fragments were directly ligated together to creat p LP. The lpp - OmpA outer membrane expression cassette was amplified from SL7207 using primers ompA-F and ompA-R, and was ligated into the p MD18-T vector to create plasmid p OmpA. p HO was constructed by ligating an EGFP cassette (amplified from p loxp-cm-loxp using primers oEGFP-F and oEGFP-R) downstream of lpp-OmpA in p OmpA via NotI and XhoI. Strains HP, LP, HO and E were generated by transforming plasmids p HP, p LP, p HO and p EGFP, respectively into SL7207 by electroporation. A loxp-Cm-loxp cassette was PCR amplified from plasmid p loxp-Cm-loxp using primers XhoI-floxed-F and XhoI-floxed-R [ 57 ], digested with XhoI, then ligated into the XhoI site of plasmid pHP to create plasmid p CP-cm. p CO-cm was generated by replacing the EGFP gene in p HP with NdeI lpp-OmpA-EGFP XhoI and XhoI-loxp-Cm-loxp-XhoI fragments. The linear dsDNA fragments used to create the CP and CO chromosome-based expression strains were respectively amplified from p CP-cm and p CO-cm by PCR using a same pair of primers (htrA-F and htrA-R). Red recombineering was used to construct the CP and CO strains, via transient expression of λ-Red genes from p Sim6 in SL7207 according to the method of Yu et al. [ 22 , 58 ]. Transformants were selected by plating onto LB agar plates containing the required antibiotics, incubating at 37°C overnight. Construction of the 'double-recombinant' Salmonella -EGFP strains The compositions of the five 'double-recombinant' Salmonella -EGFP strains (i.e. strains containing two individual copies of the EGFP gene) are described in Table 1 . Strains CP + HP, CP + LP, CP + HO and CP + E were generated by respectively electro-transforming plasmids p HP, p LP, p HO or p EGFP into the CP strain. The LP + E strain was generated by electro-transforming p EGFP into the LP strain. Successful transformants were selected on LB agar plates containing the appropriate antibiotics, incubating at 37°C overnight. Construction of two recombinant Salmonella -HA strains The sequence of the HA epitope (residues 91–261) from the H5N1 virus (H5N1/A/Vietnam/1194/2004) was codon-optimized for translation in Salmonella based on sequence data from the NCBI-GenBank, and synthesized by GenScript (Piscataway, USA). This synthetic codon-optimized HA epitope gene (denoted HAOP) was cloned between the NotI and XhoI sites of p HP (thereby replacing the EGFP gene) to create p HAOP. p O-HAOP was analogously generated by replacing the EGFP gene of p HO with a NotI/XhoI-digested HAOP fragment. Plasmids p HAOP and p O-HAOP were respectively electro-transformed into SL7207 to generate a cytoplasmic-expression HAOP Salmonella strain (denoted C-HAOP) and a membrane-expression HAOP Salmonella strain (denoted O-HAOP). Culture of recombinant Salmonella strains In order to minimize plasmid loss, the recombinant Salmonella strains were freshly streaked from −80°C stocks onto LB agar plates containing the required antibiotics (Table 1 ) and incubated at 37°C overnight. Single colonies were inoculated into 30 ml liquid LB medium with antibiotics and cultured at 37°C with shaking for 10 hours. The 10-hour bacterial cultures were expanded (1:10) into fresh LB medium containing antibiotics, before being further incubated at 37°C until OD 600 = 2. With the exception of the CP and CO strains, cells were then collected by centrifugation (4,000 g, 4°C); washed once with PBS; resuspended in PBS equal to the volume of the original culture; then immediately used for immunization or expression analysis. Further induction was required for the CP and CO strains, using equal volumes of N-salts medium. Prior to induction, freshly-cultured CP or CO strains were collected by centrifugation (4,000 g, 4°C), then washed twice with N-salts medium in equal volume of bacteria cultures. Cells were then resuspended in N-salts medium containing the appropriate antibiotics (equal to the original volume of the bacterial culture), and incubated at 37°C for 24 hours to induce protein expression. After 24 hours, cells were collected for expression analysis or immunization as above. Construction of 'single-recombinant' Salmonella -EGFP strains The compositions of six 'single-recombinant' Salmonella -EGFP strains (i.e. strains containing a single episomal or chromosomal copy of the EGFP gene) are listed in Table 1 . The primers used to construct the six 'single-recombinant' Salmonella- EGFP strains are listed in Table 6 . The prosseA promoter was PCR amplified from pathogenicity island 2 (SPI2) of SL7207 using the NotI-prosseA-F and HindIII-prosseA-R primers; the EGFP gene was PCR amplified from p loxp-cm-loxp with the HindIII-EGFP-F and XhoI-Ter-EGFP-R primers; then these prosseA and EGFP fragments were co-ligated into vector p BSK via NotI and XhoI to create p HP. Table 6 Primers used in this study Primer Name Primer Sequence (5' to 3') NotI-prosseA-F ATTTGCGGCCGC AGAAGAGAACAACGGCAAGTTAC HindIII-prosseA-R CCCAAGCTT ACGATAGATAATTAACGTGC XhoI-floxed-F CCGCTCGAG CCGATCATATTCAATAACCCT XhoI-floxed-R CCGCTCGAG GACTAGTGAACCTCTTCGAGGG HindIII-EGFP-F CCCAAGCTT AAGAAGGAGATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC XhoI-Ter-EGFP-R CCGCTCGAG CGGCCGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC p 15A-F TATCACTTATTCAGGCGTAGCACC p 15A-R ATCGTATGGGGCTGACTTCA ompA-F GGGAATTCCATATG AAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAAACCCGTATGTTGGCTTTGAAATGGG ompA-R CCGCTCGAGTTATGCGGCCGCG TTGTCCGGACGAGTGCCGATGGTGT oEGFP-F ATTTGCGGCCGC AGTGAGCAAGGGCGAGGAGC oEGFP-R CCGCTCGAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC htrA-F CGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTTGCGTTACCTGTTAATCGAGATTGAAACAC AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT htrA-R AGTTGTGGGGAGTTTCACAGAAAAGTGTTGCCCCCTTCCGTGGTGGAAGGGGGACAAAGGTGATTACTG GAGCGGATAACAATTTCACACAGG The p 15A origin was amplified from plasmid p ACYC177 using primers p 15A-F and p 15A-R, and an EGFP expression cassette was amplified from p HP using primers NotI-prosseA-F and XhoI-Ter-EGFP-R. Both fragments were directly ligated together to creat p LP. The lpp - OmpA outer membrane expression cassette was amplified from SL7207 using primers ompA-F and ompA-R, and was ligated into the p MD18-T vector to create plasmid p OmpA. p HO was constructed by ligating an EGFP cassette (amplified from p loxp-cm-loxp using primers oEGFP-F and oEGFP-R) downstream of lpp-OmpA in p OmpA via NotI and XhoI. Strains HP, LP, HO and E were generated by transforming plasmids p HP, p LP, p HO and p EGFP, respectively into SL7207 by electroporation. A loxp-Cm-loxp cassette was PCR amplified from plasmid p loxp-Cm-loxp using primers XhoI-floxed-F and XhoI-floxed-R [ 57 ], digested with XhoI, then ligated into the XhoI site of plasmid pHP to create plasmid p CP-cm. p CO-cm was generated by replacing the EGFP gene in p HP with NdeI lpp-OmpA-EGFP XhoI and XhoI-loxp-Cm-loxp-XhoI fragments. The linear dsDNA fragments used to create the CP and CO chromosome-based expression strains were respectively amplified from p CP-cm and p CO-cm by PCR using a same pair of primers (htrA-F and htrA-R). Red recombineering was used to construct the CP and CO strains, via transient expression of λ-Red genes from p Sim6 in SL7207 according to the method of Yu et al. [ 22 , 58 ]. Transformants were selected by plating onto LB agar plates containing the required antibiotics, incubating at 37°C overnight. Construction of the 'double-recombinant' Salmonella -EGFP strains The compositions of the five 'double-recombinant' Salmonella -EGFP strains (i.e. strains containing two individual copies of the EGFP gene) are described in Table 1 . Strains CP + HP, CP + LP, CP + HO and CP + E were generated by respectively electro-transforming plasmids p HP, p LP, p HO or p EGFP into the CP strain. The LP + E strain was generated by electro-transforming p EGFP into the LP strain. Successful transformants were selected on LB agar plates containing the appropriate antibiotics, incubating at 37°C overnight. Construction of two recombinant Salmonella -HA strains The sequence of the HA epitope (residues 91–261) from the H5N1 virus (H5N1/A/Vietnam/1194/2004) was codon-optimized for translation in Salmonella based on sequence data from the NCBI-GenBank, and synthesized by GenScript (Piscataway, USA). This synthetic codon-optimized HA epitope gene (denoted HAOP) was cloned between the NotI and XhoI sites of p HP (thereby replacing the EGFP gene) to create p HAOP. p O-HAOP was analogously generated by replacing the EGFP gene of p HO with a NotI/XhoI-digested HAOP fragment. Plasmids p HAOP and p O-HAOP were respectively electro-transformed into SL7207 to generate a cytoplasmic-expression HAOP Salmonella strain (denoted C-HAOP) and a membrane-expression HAOP Salmonella strain (denoted O-HAOP). Culture of recombinant Salmonella strains In order to minimize plasmid loss, the recombinant Salmonella strains were freshly streaked from −80°C stocks onto LB agar plates containing the required antibiotics (Table 1 ) and incubated at 37°C overnight. Single colonies were inoculated into 30 ml liquid LB medium with antibiotics and cultured at 37°C with shaking for 10 hours. The 10-hour bacterial cultures were expanded (1:10) into fresh LB medium containing antibiotics, before being further incubated at 37°C until OD 600 = 2. With the exception of the CP and CO strains, cells were then collected by centrifugation (4,000 g, 4°C); washed once with PBS; resuspended in PBS equal to the volume of the original culture; then immediately used for immunization or expression analysis. Further induction was required for the CP and CO strains, using equal volumes of N-salts medium. Prior to induction, freshly-cultured CP or CO strains were collected by centrifugation (4,000 g, 4°C), then washed twice with N-salts medium in equal volume of bacteria cultures. Cells were then resuspended in N-salts medium containing the appropriate antibiotics (equal to the original volume of the bacterial culture), and incubated at 37°C for 24 hours to induce protein expression. After 24 hours, cells were collected for expression analysis or immunization as above. Expression analysis of recombinant Salmonella strains Fluorescence microscopy Fluorescence microscopy (Olympus BX51 microscope) was used to analyze EGFP expression within the eleven recombinant Salmonella strains. Freshly-cultured bacterial cells (10 μl) were immobilized on 1% agarose pads on glass slides, then visualized using a 60x oil-immersion objective lens. Both bright-field and fluorescent field (ex. 488 nm, em. 518 nm) images were captured (Spot RT3 Digital Camera, Spot Advanced Software Version 4.6). Freshly cultured SL7207 cells were used as a negative control. Fluorescence intensity assays A fluorescence micro-plate reader (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific) was used to quantify EGFP expression levels within freshly-cultured recombinant Salmonella strains. 1 × 10 8 cells were resuspended in 100 μl PBS in 96-well plates (IWAKI, 96 well microplate with flat bottom), and EGFP fluorescence intensity was immediately recorded at room temperature (ex. 518 nm, em. 518 nm; time resolution: 500 ms). Measurements were performed in triplicate, and SL7207 was used as a negative control. SDS-PAGE and Western blot analysis Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western blot analysis was performed to detect EGFP expression in the CO strain. The in vitro and in vivo EGFP expression levels in E, HAOP, C-HAOP and O-HAOP strains; were determined using slightly-modified protocols for each strain. CO strain : cells from 4 ml of induced bacterial culture were collected and resuspended in 100 μl PBS + 50 μl of loading buffer (60 mM Tris–HCl, pH 6.8, 25% glycerol, 2%SDS, 14.4 mM β-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) and boiled (10 minutes) to prepare lysates for analysis. GFP rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology) and goat anti-rabbit antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen), were used as the as primary and secondary antibodies, respectively. SL7207 cells were also treated as above as the negative control. E strain : in vitro and in vivo EGFP expression was quantified by Western blot. The EGFP expression in the eukaryotic cells was first detected in vitro by infecting the Caco-2 human colon carcinoma cell line (American Type Culture Collection) with the E strain. The Caco-2 human colon carcinoma cell line was cultured using Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) (Invitrogen) with 20% fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen) and 1% penicillin/streptomycin (P/S) (Invitrogen) in 24-well plate (TPP, USA) with 5 × 10 5 cells per well at 37°C in 5% CO2. After cell confluence reached 90%, the medium was removed and the cells were washed with PBS twice. Then PBS-washed 1 × 10 7 CFU bacterial cells of E strain in DMEM-20% FBS in the absence of antibiotics were used to incubate with the Caco-2 cells. After 2.5 hours incubation, the non-adherent bacteria were removed by washing with PBS three times. DMEM with 20% FBS was added to maintain the cells at 37°C in 5% CO 2 . Cell samples were collected 12, 20 and 30 hours after infection, respectively. Caco-2 cell protein was extracted using RIPA buffer (50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.25% Deoxycholate, 1% NP40) plus protease inhibitor cocktail tablets (Roche). Briefly, cells were harvested and washed with cold PBS twice (2500 x g, 5 min), then RIPA buffer containing protease inhibitor was added to mix the cell pellet completely, and this was incubated at 4°C for 15 minutes. The RIPA/cell mixture was centrifuged (13000 x g, 1 min) and the supernatant was collected for Western blot assay. The protein quantities were measured using the BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc). Equal amounts of protein from the samples were loaded to detect EGFP expression by Western blot using a GFP monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) and a goat anti-mouse secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (DAKO). GAPDH detection was also performed using an HRP conjugated antibody (Abnova). The SL7207 strain was also treated as above as the negative control. EGFP expression delivered by the E strain was also investigated in the mouse intestine. 1 × 10 11 of bacterial cells of the E strain or the SL7207 strain re-suspended in 200 μl PBS, were orally administrated to 6-8-week-old female BALB/c mice after neutralizing the gastric acid (gavage with 100 μl of 3% sodium bicarbonate), respectively. Intestinal mucosa samples from two groups of mice were collected using heated glass slides on day 1, 3 and 7 after inoculation. Total proteins of intestinal mucosa were extracted using RIPA buffer plus protease inhibitor as mentioned before. Equal amounts of protein samples quantified by BCA protein assay were used to perform Western blot, to detect EGFP expression using the same protocol mentioned above. GAPDH was also detected as the internal control. C-HAOP strain : total cell lysate (from 1 × 10 9 bacterial cells) was prepared as described above. For the cell-fraction lysates, 1 × 10 9 cells were resuspended in 100 μl PBS containing protease inhibitors (Roche, Complete EDTA-Free), then sonicated (Sonics, model VCX750; with ice cooling). After centrifugation (12,000 x g; 1 min; 4°C), the supernatant (ca. 90 μl) was decanted and 50 μl of (x3) loading buffer added. The pellet was resuspended in 100 μl of (x1) loading buffer. Samples were similarly boiled (10 mins), prior to Western blot analysis using rabbit polyclonal influenza A virus hemagglutinin antibody (ab36565, Abcam) and goat anti-rabbit antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen) as primary and secondary antibodies, respectively. SL7207 cells were treated as above as negative control. O-HAOP strain : 40 ml of freshly-cultured bacterial cells were harvested by centrifugation (3,500 x g, 15 mins, 4°C), resuspended in 10 ml PBS containing protease inhibitors, then sonicated 4°C). The cell debris was removed by centrifugation (3,500 x g, 10 mins, 4°C), then the supernatant was ultra-centrifuged (100,000 x g, 60 mins, 4°C) to collect the total membrane fraction (as the pellet). A portion of the membrane fraction was resuspended in PBS containing 0.01 mM MgCl2 and 2% Triton X100, and then centrifuged (100,000 x g, 60 mins, 4°C). The inner membrane fraction was collected as the supernatant; whilst the pellet, which contains the outer membrane fraction, was resuspended in 1 ml PBS. The protein concentration of each fraction was measured using the bicinchoninic acid (BCA) protein assay (Thermo Fisher). Each fraction was boiled with loading buffer (as above) and analyzed by Western blotting using rabbit polyclonal influenza A virus hemagglutinin antibody and HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody as primary and secondary antibodies, respectively. The membrane fraction from the HO strain was used as a negative control. Morphological observation of recombinant Salmonella -EGFP strains Microscopic images of SL7207 and the various recombinant Salmonella -EGFP strains were captured using light microscopy (Olympus BX51 microscope). Twenty cells from each recombinant strain, as well as the SL7207 control were randomly selected from the microscopic images for cell length analysis using the Image J software program [ 58 ]. The mean cell length for each strain was reported ± standard deviation and then compared to the SL7207 control. In vitro growth of recombinant Salmonella -EGFP strains and stability of EGFP expression constructs under antibiotic pressure To assess the growth of the six single-recombinant and five double-recombinant Salmonella -EGFP strains in vitro , the doubling times of these eleven recombinant strains were measured in liquid LB broth with antibiotics. Apart from using SL7207 as a general negative control, the empty vectors: p BSK, p ACYC177, p OmpA, p VAX-1 were electro-transformed into SL7207 to create strains: BSK, ACYC177, OmpA and VAX-1 as the negative controls of HP, LP, HO, E strains, respectively. The VAX-1 + ACYC177 strain was generated by co-electrotransforming p ACYC177 and p VAX-1 into SL7207, as a negative control for the E + LP strain. 10-hour bacterial cultures from each strain obtained using the protocol described in Part 3 were diluted 1:100 into fresh LB medium containing antibiotics. The diluted cultures were then incubated at 37°C with shaking. Bacterial growth was measured spectrophotometrically using OD 600 , at intervals of 30 mins. Four replicates were performed for each strain, and the mean is reported ± standard deviation. The stability of the six single-recombinant and five double-recombinant Salmonella -EGFP strains under antibiotic selective pressure, prior to oral administration were measured via colony forming unit (CFU) assay. 1 × 10 9 cells from each strain were collected and resuspended in 1 ml fresh LB. Six 1:10 serial dilutions were performed, and 10 μl of each dilution was spread on LB agar plates, or LB agar plates containing the appropriate antibiotics as listed in Table 1 . Colonies were counted after incubation overnight at 37°C. Three replicates were performed for each dilution, and the mean is reported ± standard deviation. In vivo survival and infection ability of six single-recombinant Salmonella strains and stability of EGFP expression constructs In order to determine the survival and infection abilities of the six single-recombinant Salmonella EGFP strains, and the in vivo stabilities of the six EGFP expression constructs, 1 × 10 11 of freshly cultured bacterial cells from each of the six strains resuspended in 200 μl PBS, were separately orally administrated to 6-8-week-old female BALB/c mice after neutralizing the gastric acid. 6 mice were grouped for each of the six strains, and one group of mice immunized with SL7207 was kept identically as the negative control. Fecal, spleen and mesenteric lymph nodes samples were collected from each group on days 1, 3 and 7 after administration for CFU assays, respectively. All the samples were homogenized and re-suspended in 9 × LB broth according to sample weights. Then seven 1:10 serial dilutions were carried out in a final volume 100 μl. 10 μl of each dilution was spread on LB agar plates, or LB agar plates containing the appropriate antibiotics as listed in Table 1 . Enumeration was performed after incubation overnight at 37°C. Three replicates were performed for each dilution, and the mean is reported ± standard deviation. Fluorescence microscopy Fluorescence microscopy (Olympus BX51 microscope) was used to analyze EGFP expression within the eleven recombinant Salmonella strains. Freshly-cultured bacterial cells (10 μl) were immobilized on 1% agarose pads on glass slides, then visualized using a 60x oil-immersion objective lens. Both bright-field and fluorescent field (ex. 488 nm, em. 518 nm) images were captured (Spot RT3 Digital Camera, Spot Advanced Software Version 4.6). Freshly cultured SL7207 cells were used as a negative control. Fluorescence intensity assays A fluorescence micro-plate reader (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific) was used to quantify EGFP expression levels within freshly-cultured recombinant Salmonella strains. 1 × 10 8 cells were resuspended in 100 μl PBS in 96-well plates (IWAKI, 96 well microplate with flat bottom), and EGFP fluorescence intensity was immediately recorded at room temperature (ex. 518 nm, em. 518 nm; time resolution: 500 ms). Measurements were performed in triplicate, and SL7207 was used as a negative control. SDS-PAGE and Western blot analysis Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western blot analysis was performed to detect EGFP expression in the CO strain. The in vitro and in vivo EGFP expression levels in E, HAOP, C-HAOP and O-HAOP strains; were determined using slightly-modified protocols for each strain. CO strain : cells from 4 ml of induced bacterial culture were collected and resuspended in 100 μl PBS + 50 μl of loading buffer (60 mM Tris–HCl, pH 6.8, 25% glycerol, 2%SDS, 14.4 mM β-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) and boiled (10 minutes) to prepare lysates for analysis. GFP rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology) and goat anti-rabbit antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen), were used as the as primary and secondary antibodies, respectively. SL7207 cells were also treated as above as the negative control. E strain : in vitro and in vivo EGFP expression was quantified by Western blot. The EGFP expression in the eukaryotic cells was first detected in vitro by infecting the Caco-2 human colon carcinoma cell line (American Type Culture Collection) with the E strain. The Caco-2 human colon carcinoma cell line was cultured using Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) (Invitrogen) with 20% fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen) and 1% penicillin/streptomycin (P/S) (Invitrogen) in 24-well plate (TPP, USA) with 5 × 10 5 cells per well at 37°C in 5% CO2. After cell confluence reached 90%, the medium was removed and the cells were washed with PBS twice. Then PBS-washed 1 × 10 7 CFU bacterial cells of E strain in DMEM-20% FBS in the absence of antibiotics were used to incubate with the Caco-2 cells. After 2.5 hours incubation, the non-adherent bacteria were removed by washing with PBS three times. DMEM with 20% FBS was added to maintain the cells at 37°C in 5% CO 2 . Cell samples were collected 12, 20 and 30 hours after infection, respectively. Caco-2 cell protein was extracted using RIPA buffer (50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.25% Deoxycholate, 1% NP40) plus protease inhibitor cocktail tablets (Roche). Briefly, cells were harvested and washed with cold PBS twice (2500 x g, 5 min), then RIPA buffer containing protease inhibitor was added to mix the cell pellet completely, and this was incubated at 4°C for 15 minutes. The RIPA/cell mixture was centrifuged (13000 x g, 1 min) and the supernatant was collected for Western blot assay. The protein quantities were measured using the BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc). Equal amounts of protein from the samples were loaded to detect EGFP expression by Western blot using a GFP monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) and a goat anti-mouse secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (DAKO). GAPDH detection was also performed using an HRP conjugated antibody (Abnova). The SL7207 strain was also treated as above as the negative control. EGFP expression delivered by the E strain was also investigated in the mouse intestine. 1 × 10 11 of bacterial cells of the E strain or the SL7207 strain re-suspended in 200 μl PBS, were orally administrated to 6-8-week-old female BALB/c mice after neutralizing the gastric acid (gavage with 100 μl of 3% sodium bicarbonate), respectively. Intestinal mucosa samples from two groups of mice were collected using heated glass slides on day 1, 3 and 7 after inoculation. Total proteins of intestinal mucosa were extracted using RIPA buffer plus protease inhibitor as mentioned before. Equal amounts of protein samples quantified by BCA protein assay were used to perform Western blot, to detect EGFP expression using the same protocol mentioned above. GAPDH was also detected as the internal control. C-HAOP strain : total cell lysate (from 1 × 10 9 bacterial cells) was prepared as described above. For the cell-fraction lysates, 1 × 10 9 cells were resuspended in 100 μl PBS containing protease inhibitors (Roche, Complete EDTA-Free), then sonicated (Sonics, model VCX750; with ice cooling). After centrifugation (12,000 x g; 1 min; 4°C), the supernatant (ca. 90 μl) was decanted and 50 μl of (x3) loading buffer added. The pellet was resuspended in 100 μl of (x1) loading buffer. Samples were similarly boiled (10 mins), prior to Western blot analysis using rabbit polyclonal influenza A virus hemagglutinin antibody (ab36565, Abcam) and goat anti-rabbit antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen) as primary and secondary antibodies, respectively. SL7207 cells were treated as above as negative control. O-HAOP strain : 40 ml of freshly-cultured bacterial cells were harvested by centrifugation (3,500 x g, 15 mins, 4°C), resuspended in 10 ml PBS containing protease inhibitors, then sonicated 4°C). The cell debris was removed by centrifugation (3,500 x g, 10 mins, 4°C), then the supernatant was ultra-centrifuged (100,000 x g, 60 mins, 4°C) to collect the total membrane fraction (as the pellet). A portion of the membrane fraction was resuspended in PBS containing 0.01 mM MgCl2 and 2% Triton X100, and then centrifuged (100,000 x g, 60 mins, 4°C). The inner membrane fraction was collected as the supernatant; whilst the pellet, which contains the outer membrane fraction, was resuspended in 1 ml PBS. The protein concentration of each fraction was measured using the bicinchoninic acid (BCA) protein assay (Thermo Fisher). Each fraction was boiled with loading buffer (as above) and analyzed by Western blotting using rabbit polyclonal influenza A virus hemagglutinin antibody and HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody as primary and secondary antibodies, respectively. The membrane fraction from the HO strain was used as a negative control. Morphological observation of recombinant Salmonella -EGFP strains Microscopic images of SL7207 and the various recombinant Salmonella -EGFP strains were captured using light microscopy (Olympus BX51 microscope). Twenty cells from each recombinant strain, as well as the SL7207 control were randomly selected from the microscopic images for cell length analysis using the Image J software program [ 58 ]. The mean cell length for each strain was reported ± standard deviation and then compared to the SL7207 control. In vitro growth of recombinant Salmonella -EGFP strains and stability of EGFP expression constructs under antibiotic pressure To assess the growth of the six single-recombinant and five double-recombinant Salmonella -EGFP strains in vitro , the doubling times of these eleven recombinant strains were measured in liquid LB broth with antibiotics. Apart from using SL7207 as a general negative control, the empty vectors: p BSK, p ACYC177, p OmpA, p VAX-1 were electro-transformed into SL7207 to create strains: BSK, ACYC177, OmpA and VAX-1 as the negative controls of HP, LP, HO, E strains, respectively. The VAX-1 + ACYC177 strain was generated by co-electrotransforming p ACYC177 and p VAX-1 into SL7207, as a negative control for the E + LP strain. 10-hour bacterial cultures from each strain obtained using the protocol described in Part 3 were diluted 1:100 into fresh LB medium containing antibiotics. The diluted cultures were then incubated at 37°C with shaking. Bacterial growth was measured spectrophotometrically using OD 600 , at intervals of 30 mins. Four replicates were performed for each strain, and the mean is reported ± standard deviation. The stability of the six single-recombinant and five double-recombinant Salmonella -EGFP strains under antibiotic selective pressure, prior to oral administration were measured via colony forming unit (CFU) assay. 1 × 10 9 cells from each strain were collected and resuspended in 1 ml fresh LB. Six 1:10 serial dilutions were performed, and 10 μl of each dilution was spread on LB agar plates, or LB agar plates containing the appropriate antibiotics as listed in Table 1 . Colonies were counted after incubation overnight at 37°C. Three replicates were performed for each dilution, and the mean is reported ± standard deviation. In vivo survival and infection ability of six single-recombinant Salmonella strains and stability of EGFP expression constructs In order to determine the survival and infection abilities of the six single-recombinant Salmonella EGFP strains, and the in vivo stabilities of the six EGFP expression constructs, 1 × 10 11 of freshly cultured bacterial cells from each of the six strains resuspended in 200 μl PBS, were separately orally administrated to 6-8-week-old female BALB/c mice after neutralizing the gastric acid. 6 mice were grouped for each of the six strains, and one group of mice immunized with SL7207 was kept identically as the negative control. Fecal, spleen and mesenteric lymph nodes samples were collected from each group on days 1, 3 and 7 after administration for CFU assays, respectively. All the samples were homogenized and re-suspended in 9 × LB broth according to sample weights. Then seven 1:10 serial dilutions were carried out in a final volume 100 μl. 10 μl of each dilution was spread on LB agar plates, or LB agar plates containing the appropriate antibiotics as listed in Table 1 . Enumeration was performed after incubation overnight at 37°C. Three replicates were performed for each dilution, and the mean is reported ± standard deviation. In vivo immune response assays Animal immunization 6-8-week-old female BALB/c mice purchased from the Laboratory Animal Unit of the University of Hong Kong (CULATR 2051–09) were used for all in vivo immune response tests. Identical batches of 1 × 10 11 of PBS-washed, freshly-cultured bacterial cells resuspended in 200 μl PBS were used for each immunization procedure (prime and boost) for each strain. Immediately prior to oral administration, each mouse was orally gavaged with 100 μl of 3% sodium bicarbonate to neutralize gastric acid. Cells were administered by oral gavage; giving two boosts on day 21 and day 35 after the initial prime. Groups of 5–10 mice were used for each of the 11 recombinant Salmonella -EGFP strains, and one group of non-infected mice were kept identically as the negative control. In analogous parallel experiments, three further groups of 5–10 mice were orally immunized with the C-HAOP, O-HAOP or HO (as control) strains; with an additional group of non-infected mice kept as a negative control. Animal immunization 6-8-week-old female BALB/c mice purchased from the Laboratory Animal Unit of the University of Hong Kong (CULATR 2051–09) were used for all in vivo immune response tests. Identical batches of 1 × 10 11 of PBS-washed, freshly-cultured bacterial cells resuspended in 200 μl PBS were used for each immunization procedure (prime and boost) for each strain. Immediately prior to oral administration, each mouse was orally gavaged with 100 μl of 3% sodium bicarbonate to neutralize gastric acid. Cells were administered by oral gavage; giving two boosts on day 21 and day 35 after the initial prime. Groups of 5–10 mice were used for each of the 11 recombinant Salmonella -EGFP strains, and one group of non-infected mice were kept identically as the negative control. In analogous parallel experiments, three further groups of 5–10 mice were orally immunized with the C-HAOP, O-HAOP or HO (as control) strains; with an additional group of non-infected mice kept as a negative control. Humoral immunity assays ELISA Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were used to detect antigen-specific IgG response using mice serum on day 7, 28 and 42. ELISA plates (Ni-NTA HisSorb TM plate, QIAgen) were pre-coated with 100 ng GFP (Millipore) or H5 antigen (H5N1, A/Vietnam/1203/2004, Immune Technology Corp.) in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA, at 4°C overnight. The pre-coating solution was removed, then unreacted sites were blocked with 200 μl of PBS containing 1% BSA, incubating for 2 hours at room temperature. After removal of blocking buffer, serial dilutions of mice serum in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA were added, then plates were incubated at room temperature for 2 hours. Unbound serum antibodies were washed-off with PBST (6 washes). Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen, 20,000-fold dilution in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA) was added and plates were incubated at room temperature for 1 hour. After 6 washes with PBST, 200 μl of TMB solution (Calbiochem) was added, and plates were incubated at room temperature until the appearance of a blue color. The reaction was stopped by adding 50 μl of 2 M sulphuric acid, then intensities were determined at 450 nm using a microplate reader (Spectra Max 340, GrandTech Scientific). Hemagglutination inhibition assay (HIA) Hemagglutination inhibition assays (HIA) were performed according to a standard protocol with minor modifications [ 59 ]. Briefly, serial two-fold dilutions of O-HAOP vaccinated mice serum (ranging from 1:8 to 1:256, in PBS; final volume of 25 μl;) were added to wells of a microtiter plate, together with 25 μl of H5N1 virus suspension (H5N1/A/Vietnam/1194/2004). Microplates were incubated at room temperature for 30 minutes with gentle shaking. 50 μl of chicken red blood cell suspension was added to each well, and plates were incubated at room temperature with gentle shaking until the chicken red blood cell control (chicken red blood cell in 50 μl PBS) formed a button at the bottom of a well. The HIA titer for each serum sample was defined as the highest dilution of serum that could completely inhibit hemagglutination. Sera from non-infected mice, as well as those inoculated with the HO strain were used as negative controls. Three replicates were performed for each dilution. ELISpot ELISpot assays were used to detect the antigen-specific mouse IFN-γ response as described in the Mabtech manual of ELISpot kit. The ELISpot plate (Mabtech) was first activated by adding 50 μl of 70% ethanol to each well for 2 minutes, followed by washing 5 times with 200 μl sterile water. Wells were then pre-coated with 100 μl of 15 μg/ml anti-mouse IFN-γ antibody (AN18 Mabtech) diluted in sterile PBS, incubating at 4°C overnight. Excess antibody was then removed by washing 5 times with 200 μl sterile water. Plates were incubated with 200 μl of RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) for 30 minutes. During incubation, spleens taken from day 42 mice were homogenized and treated with red blood cell lysis buffer (10 mM KHCO 3 , 150 mM NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA). The spleen cell homogenates were filtered (40 μm cell strainer, BD Falcon) then centrifuged (1000 x g, 8 minutes, 4°C). Cell pellets were suspended in RPMI 1640 medium containing 10% FBS. 2 × 10 5 cells in 100 μl RPMI 1640 medium containing 10% FBS were added to each pre-coated well. For each mice, 200 ng of H5 or GFP antigen and 100 anti-mouse CD28 (BD Pharmingen) were added to triplicate wells as sample stimulatory agents; 2 ng phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma), 100 ng Ionomycin calcium salt (INO, Sigma) and 100 ng anti-mouse CD28 were added into triplicate wells as the stimulatory agents of positive control; Meanwhile, another triplicate wells was added no stimulatory agents as negative control. Plates were then incubated at 37°C for 44 hours. Wells were then washed 5 times with 200 μl PBS, and incubated with 100 μl of 1 μg/ml detection antibody (R4-6A2-biotin, Mabtech) in PBS-0.5% FBS for 2 hours at room temperature. Unbound antibody was removed by washing 5 times with 200 μl PBS, then plates were incubated with 100 μl of 1000-fold diluted Streptavidin-HRP in PBS + 0.5% FBS for 1 hour at room temperature. After washing 5 times with 200 μl PBS, 100 μl of TMB solution was added, and plates were allowed to develop at room temperature until distinct spots emerged. Colour development was stopped by washing extensively with water. After allowing spots to dry at room temperature in a fume hood, plates were analyzed using an ELISpot reader (C.T.L. Analyzers, LLC). Statistical analysis Differences between the means of two experimental groups were analyzed by the Student's t -test. One-Way ANOVA (SPSS 16.0, SPSS Inc., Chicago, USA) was performed to compare the differences of multiple groups. Results are presented as mean values ± standard error, and at least three independent replicates were performed for each condition. ELISA Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were used to detect antigen-specific IgG response using mice serum on day 7, 28 and 42. ELISA plates (Ni-NTA HisSorb TM plate, QIAgen) were pre-coated with 100 ng GFP (Millipore) or H5 antigen (H5N1, A/Vietnam/1203/2004, Immune Technology Corp.) in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA, at 4°C overnight. The pre-coating solution was removed, then unreacted sites were blocked with 200 μl of PBS containing 1% BSA, incubating for 2 hours at room temperature. After removal of blocking buffer, serial dilutions of mice serum in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA were added, then plates were incubated at room temperature for 2 hours. Unbound serum antibodies were washed-off with PBST (6 washes). Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase (Invitrogen, 20,000-fold dilution in 100 μl of PBS containing 0.2% BSA) was added and plates were incubated at room temperature for 1 hour. After 6 washes with PBST, 200 μl of TMB solution (Calbiochem) was added, and plates were incubated at room temperature until the appearance of a blue color. The reaction was stopped by adding 50 μl of 2 M sulphuric acid, then intensities were determined at 450 nm using a microplate reader (Spectra Max 340, GrandTech Scientific). Hemagglutination inhibition assay (HIA) Hemagglutination inhibition assays (HIA) were performed according to a standard protocol with minor modifications [ 59 ]. Briefly, serial two-fold dilutions of O-HAOP vaccinated mice serum (ranging from 1:8 to 1:256, in PBS; final volume of 25 μl;) were added to wells of a microtiter plate, together with 25 μl of H5N1 virus suspension (H5N1/A/Vietnam/1194/2004). Microplates were incubated at room temperature for 30 minutes with gentle shaking. 50 μl of chicken red blood cell suspension was added to each well, and plates were incubated at room temperature with gentle shaking until the chicken red blood cell control (chicken red blood cell in 50 μl PBS) formed a button at the bottom of a well. The HIA titer for each serum sample was defined as the highest dilution of serum that could completely inhibit hemagglutination. Sera from non-infected mice, as well as those inoculated with the HO strain were used as negative controls. Three replicates were performed for each dilution. ELISpot ELISpot assays were used to detect the antigen-specific mouse IFN-γ response as described in the Mabtech manual of ELISpot kit. The ELISpot plate (Mabtech) was first activated by adding 50 μl of 70% ethanol to each well for 2 minutes, followed by washing 5 times with 200 μl sterile water. Wells were then pre-coated with 100 μl of 15 μg/ml anti-mouse IFN-γ antibody (AN18 Mabtech) diluted in sterile PBS, incubating at 4°C overnight. Excess antibody was then removed by washing 5 times with 200 μl sterile water. Plates were incubated with 200 μl of RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) for 30 minutes. During incubation, spleens taken from day 42 mice were homogenized and treated with red blood cell lysis buffer (10 mM KHCO 3 , 150 mM NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA). The spleen cell homogenates were filtered (40 μm cell strainer, BD Falcon) then centrifuged (1000 x g, 8 minutes, 4°C). Cell pellets were suspended in RPMI 1640 medium containing 10% FBS. 2 × 10 5 cells in 100 μl RPMI 1640 medium containing 10% FBS were added to each pre-coated well. For each mice, 200 ng of H5 or GFP antigen and 100 anti-mouse CD28 (BD Pharmingen) were added to triplicate wells as sample stimulatory agents; 2 ng phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma), 100 ng Ionomycin calcium salt (INO, Sigma) and 100 ng anti-mouse CD28 were added into triplicate wells as the stimulatory agents of positive control; Meanwhile, another triplicate wells was added no stimulatory agents as negative control. Plates were then incubated at 37°C for 44 hours. Wells were then washed 5 times with 200 μl PBS, and incubated with 100 μl of 1 μg/ml detection antibody (R4-6A2-biotin, Mabtech) in PBS-0.5% FBS for 2 hours at room temperature. Unbound antibody was removed by washing 5 times with 200 μl PBS, then plates were incubated with 100 μl of 1000-fold diluted Streptavidin-HRP in PBS + 0.5% FBS for 1 hour at room temperature. After washing 5 times with 200 μl PBS, 100 μl of TMB solution was added, and plates were allowed to develop at room temperature until distinct spots emerged. Colour development was stopped by washing extensively with water. After allowing spots to dry at room temperature in a fume hood, plates were analyzed using an ELISpot reader (C.T.L. Analyzers, LLC). Statistical analysis Differences between the means of two experimental groups were analyzed by the Student's t -test. One-Way ANOVA (SPSS 16.0, SPSS Inc., Chicago, USA) was performed to compare the differences of multiple groups. Results are presented as mean values ± standard error, and at least three independent replicates were performed for each condition. Abbreviations EGFP: Enhanced green fluorescent protein; HA: A fragment of the hemagglutinin protein from the H5N1 influenza virus; HAOP: A synthetic codon-optimized HA epitope gene; IFN- γ : Interferon-gamma; CFU: Colony forming unit; ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assays; HIA: Hemagglutination Inhibition Assays; APCs: Antigen-presenting cells. Competing interests They authors declare that they have no competing interests. Authors' contributions SYZ, BY, JDH, KYY and BJZ designed the experiments. SYZ, BY, KZ, MC, YHH and SFY performed the experiments. SYZ, BY and JDH analyzed the data. SYZ, BY, RMW, KYY, BJZ and JDH drafted and revised the manuscript. SYZ and BY contribute equally to this manuscript. All the authors read and approved the final manuscript. Acknowledgments This work was supported by an RFCID grant (07060572) to JDH, and by the Research Fund for the Control of Infectious Diseases Commissioned Study of Food and Health Bureau of Hong Kong Government.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9744759/

Dysregulated inflammasome activity in intestinal inflammation – Insights from patients with very early onset IBD

Inflammatory bowel disease (IBD) is a multifactorial disorder triggered by imbalances of the microbiome and immune dysregulations in genetically susceptible individuals. Several mouse and human studies have demonstrated that multimeric inflammasomes are critical regulators of host defense and gut homeostasis by modulating immune responses to pathogen- or damage-associated molecular patterns. In the context of IBD, excessive production of pro-inflammatory Interleukin-1β has been detected in patient-derived intestinal tissues and correlated with the disease severity or failure to respond to anti-tumor necrosis factor therapy. Correspondingly, genome-wide association studies have suggested that single nucleotide polymorphisms in inflammasome components might be associated with risk of IBD development. The relevance of inflammasomes in controlling human intestinal homeostasis has been further exemplified by the discovery of very early onset IBD (VEO-IBD) patients with monogenic defects affecting different molecules in the complex regulatory network of inflammasome activity. This review provides an overview of known causative monogenic entities of VEO-IBD associated with altered inflammasome activity. A better understanding of the molecular mechanisms controlling inflammasomes in monogenic VEO-IBD may open novel therapeutic avenues for rare and common inflammatory diseases. Inflammasomes – Central coordinators of innate immunity Inflammasomes are multimeric cytosolic protein complexes controlling immune tolerance, inflammation, host defense, cell clearance, and tissue repair ( 1 , 2 ). The modal composition of inflammasomes based on common adaptors and effectors paired with cell-type specific sensors allows mounting of context-dependent responses to distinct threats ( 3 , 4 ). As a first step of inflammasome activation, sensor proteins (e.g., Absent in melanoma 2 (AIM2), Nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich Repeat (NLR) and Pyrin domain (PYD) containing protein (NLRP) 3, NLR family, apoptosis inhibitory protein (NAIP)/NLR family caspase activation and recruitment domain (CARD) domain-containing protein 4 (NLRC4), PYRIN) detect various danger signals including pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or damage-associated molecular patterns (DAMPs) ( Figure 1 ) ( 1 , 3 , 4 ). Whereas some sensors are specific to distinct signals (e.g., AIM2, NLRC4), others (e.g., NLRP3) are promiscuous and can respond to a variety of stimuli ( 1 , 4 – 15 ). Sensor proteins contain CARD or pyrin domains (PYD) mediating the interaction with adaptors and/or effectors ( 4 , 16 ). Upon activation, some sensor proteins can directly recruit the effector Caspase (CASP) 1 via their CARD ( Figure 1 ) ( 13 , 16 – 19 ). In contrast, sensor proteins lacking a CARD recruit the adapter protein apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC) via interaction of PYD ( 20 – 22 ). In turn, ASC can interact with pro-CASP1 via CARD resulting in oligomerization of inflammasome components and activation of pro-CASP1 by autoproteolysis ( Figure 1 ) ( 3 , 4 , 13 , 21 , 23 , 24 ). Finally, mature CASP1 cleaves the inflammasome substrates pro-Interleukin (IL)-1β, pro-IL-18 and Gasdermin D (GSDMD) ( Figure 1 ) ( 1 , 3 , 4 , 23 , 25 – 29 ). While IL-1β and IL-18 trigger activation and recruitment of other immune cells contributing to inflammation and host defense, insertion of mature GSDMD into cell membranes induces pore formation and pyroptosis ( Figure 1 ) ( 1 , 3 , 4 , 25 , 26 ). Figure 1 Schematic overview of inflammasome activation. Various PAMPs and DAMPs induce activation of sensor proteins resulting in oligomerization and recruitment of ASC and pro-CASP1. Upon autoproteolysis of pro-CASP1, mature CASP1 cleaves the inflammasome effector molecules pro-IL-1β, pro-IL-18, and GSDMD, which induce inflammation and pyroptosis. Complex regulatory mechanisms on transcriptional and post-translational level are required to facilitate balanced inflammasome-mediated immune responses. On transcriptional level, nuclear factor κ-B (NF-κB)-mediated signaling has been shown to be critical for transcription of central inflammasome components (e.g., NLRP3 and IL1B ) upon Toll-like receptor (TLR)-mediated detection of PAMPs or DAMPs ( 30 , 31 ). This process is often referred to as priming or signal 1 of NLRP3 inflammasomes ( 1 , 30 , 31 ). The subsequent triggering of sensor proteins was termed activation step or signal 2 and can involve post-translational processes. For example, NLRP3 inflammasome activation requires ATP-mediated deubiquitination of NLRP3 by BRCA1/BRCA2-Containing Complex Subunit 3 (BRRC3) but is inhibited by interferon (IFN)-γ-induced nitrosylation ( 1 , 31 – 34 ). Furthermore, various kinases were shown to control activity of NLRC4, Pyrin (see also MEFV below), or ASC by phosphorylation ( 1 , 35 – 38 ). The role of inflammasomes in intestinal inflammation Inflammasomes in intestinal epithelial cells The intestinal epithelial barrier represents the first line of defense against pathogens and is critical in controlling intestinal immunity. Inflammasomes have been shown to play a central role in the defense strategy of intestinal epithelial cells (IEC), which is reflected by the expression of a diverse repertoire of inflammasome sensor proteins including NLRC4, NLRP3, and NLRP6 ( 39 ). In contrast to other epithelial cell types, IEC were shown to produce higher levels of IL-18 but less IL-1β indicating that IL-18 has a distinct role in intestinal homeostasis ( 39 – 42 ). For example, IL-18 has been involved in controlling infections by stimulating IFN-γ production from T and NK cells and supporting T H 1 responses ( 31 , 43 , 44 ). In addition, the induction of epithelial inflammasomes contributes not only to activation of immune cells via IL-18 but supports also viral clearance by inducing direct release of IFNs ( 16 , 45 ). Furthermore, IEC-related inflammasomes stimulate mucus secretion, pyroptosis, or expulsion of infected epithelial cells ( 16 , 46 – 48 ). Inflammasomes in immune cells Inflammasomes are primarily known for their function in innate immune cells (e.g., macrophages, granulocytes) and intestinal myeloid cells are the major source of IL-1β in the gut ( 31 ). Inflammasome activity in immune cells of the gut is critical for the detection of a wide variety of pathogens (e.g., bacteria, viruses, parasites) and the induction of appropriate host defense mechanisms ( 4 , 16 ). Pathogen-induced activation of inflammasomes results in production of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-18, which induce a cascade of signaling pathways culminating in recruitment of other immune cells (e.g., neutrophils) ( 4 , 16 ). Upon IL-1β sensing, immune cells produce various pro-inflammatory molecules (e.g., IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-α) fueling inflammation in the gut ( 31 ). In adaptive immune cells, IL-1β was shown to induce T cell survival and proliferation as well as increased immunoglobulin production by B cells ( 31 ). Furthermore, IL-1β contributes to polarization of T H 17 cells that are important mediators of intestinal inflammation ( 49 , 50 ). Although immune cell-derived IL-1β can induce epithelial repair by stimulating renewal of intestinal stem cells, excess IL-1β might amplify intestinal inflammation by increasing epithelial barrier permeability and production of cytokines and chemokines ( 51 – 54 ). In addition to production of cytokines, inflammasome-dependent activation of pyroptosis in immune cells restrains intracellular replication of pathogens in infected immune cells ( 4 , 16 , 55 ). Moreover, inflammasomes were also shown to contribute to discrimination between pathogenic and commensal microbiota in the gastrointestinal tract ( 16 , 56 ). Inflammasomes in infectious diseases affecting the gastrointestinal tract Various pattern recognition receptor families including the inflammasome sensor proteins of the NLR protein family have evolved in humans to recognize foreign and/or potentially dangerous material. Several pathogens affecting gastrointestinal health have been shown to trigger activation of inflammasomes. For example, NLRP3 inflammasomes contribute to the clearance of various bacterial (e.g., Helicobacter pylori , Campylobacter jejuni , Yersinia enterocolitica ) and viral (e.g., adenovirus, enterovirus) species ( 16 , 57 – 63 ). Furthermore, NAIP/NLRC4 can be triggered by components (e.g., Flagellin or type 3 secretion system) from various enteric bacterial species including Escherichia coli, Salmonella enterica , and Listeria monocytogenes ( 12 , 14 – 16 , 64 ). Moreover, Clostridium difficile infections , a major cause for antibiotic-related diarrhea and pseudomembranous colitis, result in toxin-mediated activation of Pyrin inflammasomes and increased IL-1β-dependent tissue damage ( 16 , 65 , 66 ). Mechanistically, infection-induced activation of inflammasomes contributes to pathogen clearance by cytokine-mediated recruitment and activation of immune cells (e.g, neutrophils) and pyroptosis of infected cells limiting pathogen propagation ( 16 , 41 , 46 , 47 , 56 ). Furthermore, active inflammasomes can limit further uptake of pathogens and can increase pathogen killing of professional phagocytes ( 16 , 67 ). In IEC, inflammasome activation can lead to expulsion of infected cells into the gastrointestinal lumen, which may hinder pathogens to overcome the intestinal barrier ( 16 , 41 , 46 , 47 ). Inflammasomes in IBD pathogenesis Previous studies have indicated that inflammasomes are implicated in IBD pathogenesis, as mucosal IL-1 production is significantly enhanced during active disease ( 68 ). Furthermore, higher IL-1β levels were detected in LPS-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with Crohn's disease (CD) and long-standing ulcerative colitis (UC) ( 69 ). In line, expression of IL-18 was also shown to be higher in lamina propria mononuclear cells isolated from patients with CD ( 70 , 71 ). Moreover, IL-1β signatures have been detected in macrophages/monocytes isolated from inflamed intestinal tissues of IBD patients by single-cell transcriptomics and deep immunoprofiling ( 72 ). Correspondingly, Liso et al. have recently demonstrated that failure to respond to anti-TNF therapy was associated with increased IL-1β in sera and colonic biopsy specimens from patients with UC ( 73 ). Genetic effects on inflammasome dysregulation in IBD susceptibility were suggested by polymorphisms in genes involved in inflammasome activity (e.g., NLRP3, IL-18) ( 31 , 74 – 76 ). Additionally, mutations in the NLRP3 regulator CARD8 were shown to result in increased NLRP3 inflammasome activity and CD ( 77 ). The important role of inflammasomes in controlling homeostasis of the intestinal tract has been further demonstrated by amelioration of experimental colitis through blockade of the inflammasome effector molecules IL-1β and IL-18 in different murine models ( 50 , 73 , 78 , 79 ). Based on these studies, IL-1 blockade is considered as potential therapy for IBD and is currently being evaluated in a phase II randomized placebo-controlled double-blinded trial for patients with acute severe colitis ( 80 ). Inflammasomes in intestinal epithelial cells The intestinal epithelial barrier represents the first line of defense against pathogens and is critical in controlling intestinal immunity. Inflammasomes have been shown to play a central role in the defense strategy of intestinal epithelial cells (IEC), which is reflected by the expression of a diverse repertoire of inflammasome sensor proteins including NLRC4, NLRP3, and NLRP6 ( 39 ). In contrast to other epithelial cell types, IEC were shown to produce higher levels of IL-18 but less IL-1β indicating that IL-18 has a distinct role in intestinal homeostasis ( 39 – 42 ). For example, IL-18 has been involved in controlling infections by stimulating IFN-γ production from T and NK cells and supporting T H 1 responses ( 31 , 43 , 44 ). In addition, the induction of epithelial inflammasomes contributes not only to activation of immune cells via IL-18 but supports also viral clearance by inducing direct release of IFNs ( 16 , 45 ). Furthermore, IEC-related inflammasomes stimulate mucus secretion, pyroptosis, or expulsion of infected epithelial cells ( 16 , 46 – 48 ). Inflammasomes in immune cells Inflammasomes are primarily known for their function in innate immune cells (e.g., macrophages, granulocytes) and intestinal myeloid cells are the major source of IL-1β in the gut ( 31 ). Inflammasome activity in immune cells of the gut is critical for the detection of a wide variety of pathogens (e.g., bacteria, viruses, parasites) and the induction of appropriate host defense mechanisms ( 4 , 16 ). Pathogen-induced activation of inflammasomes results in production of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-18, which induce a cascade of signaling pathways culminating in recruitment of other immune cells (e.g., neutrophils) ( 4 , 16 ). Upon IL-1β sensing, immune cells produce various pro-inflammatory molecules (e.g., IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-α) fueling inflammation in the gut ( 31 ). In adaptive immune cells, IL-1β was shown to induce T cell survival and proliferation as well as increased immunoglobulin production by B cells ( 31 ). Furthermore, IL-1β contributes to polarization of T H 17 cells that are important mediators of intestinal inflammation ( 49 , 50 ). Although immune cell-derived IL-1β can induce epithelial repair by stimulating renewal of intestinal stem cells, excess IL-1β might amplify intestinal inflammation by increasing epithelial barrier permeability and production of cytokines and chemokines ( 51 – 54 ). In addition to production of cytokines, inflammasome-dependent activation of pyroptosis in immune cells restrains intracellular replication of pathogens in infected immune cells ( 4 , 16 , 55 ). Moreover, inflammasomes were also shown to contribute to discrimination between pathogenic and commensal microbiota in the gastrointestinal tract ( 16 , 56 ). Inflammasomes in infectious diseases affecting the gastrointestinal tract Various pattern recognition receptor families including the inflammasome sensor proteins of the NLR protein family have evolved in humans to recognize foreign and/or potentially dangerous material. Several pathogens affecting gastrointestinal health have been shown to trigger activation of inflammasomes. For example, NLRP3 inflammasomes contribute to the clearance of various bacterial (e.g., Helicobacter pylori , Campylobacter jejuni , Yersinia enterocolitica ) and viral (e.g., adenovirus, enterovirus) species ( 16 , 57 – 63 ). Furthermore, NAIP/NLRC4 can be triggered by components (e.g., Flagellin or type 3 secretion system) from various enteric bacterial species including Escherichia coli, Salmonella enterica , and Listeria monocytogenes ( 12 , 14 – 16 , 64 ). Moreover, Clostridium difficile infections , a major cause for antibiotic-related diarrhea and pseudomembranous colitis, result in toxin-mediated activation of Pyrin inflammasomes and increased IL-1β-dependent tissue damage ( 16 , 65 , 66 ). Mechanistically, infection-induced activation of inflammasomes contributes to pathogen clearance by cytokine-mediated recruitment and activation of immune cells (e.g, neutrophils) and pyroptosis of infected cells limiting pathogen propagation ( 16 , 41 , 46 , 47 , 56 ). Furthermore, active inflammasomes can limit further uptake of pathogens and can increase pathogen killing of professional phagocytes ( 16 , 67 ). In IEC, inflammasome activation can lead to expulsion of infected cells into the gastrointestinal lumen, which may hinder pathogens to overcome the intestinal barrier ( 16 , 41 , 46 , 47 ). Inflammasomes in IBD pathogenesis Previous studies have indicated that inflammasomes are implicated in IBD pathogenesis, as mucosal IL-1 production is significantly enhanced during active disease ( 68 ). Furthermore, higher IL-1β levels were detected in LPS-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with Crohn's disease (CD) and long-standing ulcerative colitis (UC) ( 69 ). In line, expression of IL-18 was also shown to be higher in lamina propria mononuclear cells isolated from patients with CD ( 70 , 71 ). Moreover, IL-1β signatures have been detected in macrophages/monocytes isolated from inflamed intestinal tissues of IBD patients by single-cell transcriptomics and deep immunoprofiling ( 72 ). Correspondingly, Liso et al. have recently demonstrated that failure to respond to anti-TNF therapy was associated with increased IL-1β in sera and colonic biopsy specimens from patients with UC ( 73 ). Genetic effects on inflammasome dysregulation in IBD susceptibility were suggested by polymorphisms in genes involved in inflammasome activity (e.g., NLRP3, IL-18) ( 31 , 74 – 76 ). Additionally, mutations in the NLRP3 regulator CARD8 were shown to result in increased NLRP3 inflammasome activity and CD ( 77 ). The important role of inflammasomes in controlling homeostasis of the intestinal tract has been further demonstrated by amelioration of experimental colitis through blockade of the inflammasome effector molecules IL-1β and IL-18 in different murine models ( 50 , 73 , 78 , 79 ). Based on these studies, IL-1 blockade is considered as potential therapy for IBD and is currently being evaluated in a phase II randomized placebo-controlled double-blinded trial for patients with acute severe colitis ( 80 ). Monogenic VEO-IBD – A powerful model to define key factors controlling inflammasome activity IBD is a complex disease triggered by environmental factors, immune dysfunctions, epithelial barrier defects, and imbalances of the microbial flora in genetically susceptible individuals ( 81 ). In particular, children with rare very early onset IBD (VEO-IBD) show severe and refractory inflammatory conditions different from forms observed in adults ( 82 ). Based on the early age of onset and the aggressive phenotype VEO-IBD patients are considered to have a higher genetic susceptibility. In line, >75 distinct single inherited genetic defects have been identified as molecular cause for VEO-IBD ( 83 , 84 ). Notably, the majority of reported monogenic entities are underlying primary immunodeficiencies and genetic diagnosis has critical implications for the prognosis and therapy of VEO-IBD patients. For example, hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has been established as curative standard of care for VEO-IBD patients associated with inborn errors of immunity ( 85 ). Notably, several studies on monogenic VEO-IBD have demonstrated that altered inflammasome activity plays a critical role in the pathogenesis of human intestinal inflammation and illustrated that inflammasome plasticity is regulated by complex networks ( Figure 2 ). Thus, monogenic VEO-IBD represents a powerful model highlighting critical molecular nodes forming the skeleton of inflammasome regulation. A better understanding of human inflammasome biology will guide the development of personalized therapies for VEO-IBD but will also portray novel concepts for the treatment of common IBD. To stimulate research on inflammasome biology in IBD pathogenesis, we herein aim to provide an overview of genes known to cause (monogenic) IBD and influence inflammasome activity. Therefore, we screened for genetic defects reported in recent position papers ( 83 , 86 – 89 ) related to monogenic IBD to summarize links to inflammasome-related genes and -mediated processes ( Table 1 ). Figure 2 Graphical presentation of a network of inflammasome-associated monogenic defects causing VEO-IBD. Several proteins, that are several candidates for monogenic VEO-IBD (highlighted in red), have been shown to contribute to inflammasome dysregulation via various mechanisms. Table 1 Overview of monogenic forms of IBD associated with inflammasome dysregulation. Gene Disease Effect on IL-1β production Effect of IL-1 blockade References ADAM17 Neonatal inflammatory skin and bowel disease not clear n.a. BTK X-linked agammaglobulinemia 1 context-dependent + (mouse) ( 90 , 91 ) CASP8 Caspase-8 deficiency ↑ n.a. ( 92 ) CYBA Chronic granulomatous disease ↑ + ( 78 , 93 ) CYBB Chronic granulomatous disease ↑ + ( 78 , 93 ) IKBKG Anhidrotic X-linked ectodermal dysplasia and immunodeficiency not clear n.a. IL10/IL10RA/IL10RB IL-10 (receptor) deficiency ↑ + ( 94 – 96 ) MEFV Familial Mediterranean Fever ↑ + ( 97 – 100 ) MVK Mevalonate kinase deficiency ↑ + ( 38 , 97 , 101 , 102 ) NCF1 Chronic granulomatous disease ↑ + ( 78 , 93 ) NCF2 Chronic granulomatous disease ↑ + ( 78 , 93 ) NLRC4 Autoinflammation with infantile enterocolitis ↑ IL-18 ( 103 – 105 ) PTEN PTEN hamartoma tumor syndrome ↓ n.a. ( 106 ) RIPK1 RIPK1 deficiency ↑ n.a. ( 107 , 108 ) STAT1 IPEX-like disease not clear n.a. TRIM22 TRIM22 defect ↓ n.a. ( 109 ) WAS Wiskott-Aldrich syndrome ↑ + ( 110 – 112 ) XIAP X-linked lymphoproliferative syndrome 2 ↑ n.a. ( 113 – 115 ) Alphabetical list of IBD candidate genes showing effects on IL-1β production as well as the therapeutic efficacy of IL-1 blockade in the corresponding disorder. If a robust phenotype on IL-1β production has been documented the effect is indicated by arrows (up: higher IL-1β production; down: lower IL-1β production). Beneficial effects of IL-1 blockade are indicated by a plus sign. For BTK deficiency, only mouse data are available. For NLRC4 mutations, IL-18 blockade was shown to be effective. N.a., not assessed. Inflammasome dysregulation in monogenic VEO-IBD Sensor proteins NLRC4 The most direct link between IBD pathogenesis and dysregulated inflammasome activation has been provided by the discovery of patients carrying mutations in genes encoding for sensor proteins. In particular, de novo gain-of-function in NLRC4 could be identified in patients presenting with a range of clinical manifestations of autoinflammation and macrophage activation syndrome, including severe very early onset enterocolitis ( 103 , 104 ). The reported gain-of-function mutations cause spontaneous oligomerization and activation of the NAIP/NLRC4 inflammasome without the requirement of physiological triggers resulting in spontaneous cleavage of pro-CASP1 and excessive release of IL-1β and IL-18, pyroptosis of macrophages, and chronic inflammation ( 103 , 104 ). In addition, Steiner et al. have recently identified an autosomal recessive NLRC4 mutation associated with increased IL-1β and IL-18 secretion in a patient with autoinflammation accompanied by diarrhea ( 116 ). Although the underlying mechanisms of biallelic NLRC4 deficiency remain elusive, IL-18 blockade was shown to be effective in treatment of NLRC4-mediated macrophage activation syndrome indicating that epithelial-derived IL-18 might be a critical pathomechanistic driver ( 105 ). Taken together, patients with germline NLRC4 mutations demonstrate that a tight regulation of NLRC4-associated inflammasomes is necessary to maintain intestinal homeostasis and physiological immune cell function. MEFV Patients with mutations in the Mediterranean fever gene ( MEFV , encoding for pyrin) have been shown to develop an autoinflammatory syndrome called Familial Mediterranean Fever (FMF) characterized by periodic fever attacks and associated with early-onset IBD-like phenotypes ( 38 , 97 , 117 , 118 ). Even though mutations in MEFV are discussed rather as risk factors for VEO-IBD, underlying mechanisms in FMF provide important insights into dysregulated inflammasome activity. In steady state, pyrin molecules are phosphorylated by serine/threonine-protein kinase N (PKN)1/2 allowing binding of the chaperone protein 14-3-3 and maintenance of inactive pyrin ( 38 , 97 ). In turn, activity of PKN1/2 is controlled by Rho GTPases that are critical regulators of actin cytoskeletons indicating that pyrin-mediated inflammasome activity is coupled to cytoskeleton dynamics ( 37 , 38 , 65 ). Various bacterial toxins (e.g., TcdB from Clostridium difficile ) cause inhibition of Rho GTPases by post-translational modification, which results in reduced PKN1/2 activity, pyrin phosphorylation, and 14-3-3 recruitment, subsequently leading to increased pyrin activity ( 38 , 65 , 97 ). Similar to other inflammasomes, oligomerized pyrin recruits ASC and CASP1 resulting in inflammation and pyroptosis by inducing cleavage of pro-IL-1β, pro-IL-18 and GSDMD ( 119 ). Gain-of-function mutations in MEFV can cause increased IL-1β production and levels of IL-1β are indicative of disease activity in FMF patients ( 97 , 98 ). As first line therapy, FMF can be successfully treated with colchicine by blocking polymerization of microtubuli and maintaining pyrin in an inactive state through subsequent activation of Rho GTPases and PKN1/2 ( 99 , 120 – 122 ). Notably, FMF might be also treated using IL-1β antagonists demonstrating the central role of an inflammasome-mediated pathogenesis in FMF ( 99 , 100 , 120 ). Inflammasome regulators MVK Mevalonate kinase (MVK) catalyzes the phosphorylation of mevalonate, which is a critical step in the biosynthesis of cholesterol as well as isopentenyl diphosphate and other polyisoprenoid metabolites ( 97 , 123 ). Furthermore, the mevalonate pathway also produces precursors of geranylgeranyl pyrophosphate required for prenylation of proteins ( 101 ). Notably, prenylation is a critical post-translational modification of small Rho GTPases, which are important for the regulation of the pyrin inflammasome (see also MEFV ) ( 38 , 65 , 97 , 101 ). In patients with MVK deficiency, loss-of-function mutations impair production of mevalonate metabolites resulting in accumulation of metabolic precursors and lack of products like geranylgeranyl pyrophosphate ( 38 , 65 , 97 , 101 ). The underlying mechanisms of enhanced inflammasome activity in MVK deficiency are not fully understood, but defective protein prenylation of small GTPases causes reduced pyrin phosphorylation and thereby induces spontaneous activation of pyrin inflammasomes ( 38 , 65 , 97 , 101 ). Similar to MEFV, patients with MVK deficiency suffer from an autoinflammatory syndrome characterized by recurrent episodes of fever, arthralgia, lymphadenopathy, and splenomegaly ( 38 , 124 , 125 ). Of note, MVK-deficient patients can also present with very-early onset diarrhea and abdominal pain reminiscent of IBD ( 38 , 124 , 125 ). Interestingly, the disease severity of MVK deficiency is dependent on the residual activity of mutated MVK ( 38 , 124 ). Severe forms of MVD present as mevalonic aciduria associated with developmental delay and severe systemic inflammation ( 126 ). Analogous to FMF patients, MVK-deficient patients with VEO-IBD have been successfully treated by biologics blocking IL-1β signaling leading to improved endoscopic, histologic and laboratory parameters of inflammation ( 102 ). IKBKG NF-κB signaling is a critical cellular signaling pathway in human cells controlling pleiotropic functions such as inflammatory responses, cell stress, cell survival, and cell growth ( 127 – 129 ). Several studies have demonstrated that NF-κB signaling is critical for the expression of NLRP3 inflammasome components (e.g., NLRP3, IL1B ) in response to various danger signals (priming step) ( 30 , 31 ). In unstimulated conditions, NF-κB is inhibited by binding to the inhibitor of κB (IκB) ( 130 – 132 ). Upon cellular activation, IκB proteins are phosphorylated by the IκB kinase (IKK) complex (IKKα, IKKβ, IKKγ/NF-κB essential modulator (NEMO)) releasing IκB and enabling NF-κB-mediated signaling ( 132 – 136 ). In males, hypomorphic mutations in NEMO , a gene with X-linked inheritance encoding a regulatory subunit of the IKK complex, cause immunodeficiency and hypohidrotic ectodermal dysplasia associated with severe bacterial, viral, and fungal infections ( 137 – 139 ). Many NEMO-deficient patients further present with VEO-IBD characterized by intractable diarrhea and failure-to-thrive ( 137 , 138 ). On a molecular level, NEMO deficiency causes aberrant TLR-, TNFR-, and IL-1R-mediated signaling impairing critical immune cell functions in response to infection ( 137 ). Of note, HSCT was shown to cure immunodeficiency and susceptibility to infections in patients with NEMO deficiency, but failed to cure intestinal inflammation indicating an important role of NEMO and NF-κB signaling in controlling intestinal epithelial cell homeostasis ( 138 ). In fact, NEMO was shown to be a critical regulator of TNF-mediated and RIPK1-dependent cell death in intestinal epithelium and NEMO-deficient epithelial cells displayed increased cell death as well as reduced production of antimicrobial molecules leading to increased permeability of the intestinal barrier for luminal microbiota and to intestinal inflammation ( 140 , 141 ). Genetic variants disturbing NF-κB signaling are obvious candidates causing inflammasome activation defects. In line, Greten et al. could show that inhibition or deletion of IKKβ results in reduced expression of IL-1β mRNA and immature protein upon LPS stimulation in mouse macrophages ( 142 ). However, they could also detect higher levels of mature IL-1β secreted by IKKβ-deficient macrophages, which might be a result of increased CASP1 activation due to enhanced apoptosis ( 142 ). Similar to these studies on IKKβ, Zhao. et al. reported that pharmacological suppression of NEMO ubiquitination resulted in reduced Il1b and Nlrp3 expression in LPS-stimulated mouse macrophages ( 143 ). Despite scarce evidence, it is tempting to speculate that NEMO deficiency might also result in aberrant NLRP3 inflammasome activation similar to IKKβ. However, since NF-κB signaling controls various central (non-)immune functions, it is hard to differentiate the effects on single effector mechanisms such as inflammasome activation. NOD2 and TRIM22 Nucleotide-binding oligomerization domain 2 (NOD2) is an intracellular pattern recognition receptor (PRR) of the NLR protein family detecting muramyl dipeptide (MDP), which is a component of the bacterial cell wall ( 81 , 144 – 146 ). Upon activation, NOD2 signaling induces expression of pro-inflammatory cytokines via RIPK2- and NF-κB-mediated signaling and contributes to clearance of different pathogens ( 144 , 146 , 147 ). Of note, genome-wide association studies demonstrated that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in NOD2 represent the strongest genetic risk factor for the development of CD ( 81 , 148 , 149 ). However, mono- or biallelic NOD2 mutations are not considered as a monogenic cause for IBD, as they can be also frequently found in the genome of healthy humans ( 81 , 150 ). In contrast, mutations in the NOD2 regulator tripartite motif containing 22 gene ( TRIM22 ) were shown to cause severe refractory VEO-IBD associated with diarrhea, failure-to-thrive, and multiple infections ( 151 ). TRIM22 is a RING finger E3 ubiquitin ligase that catalyzes K63 polyubiquitination of NOD2 and thereby controls NOD2 signaling function ( 151 ). Since NOD2 can regulate NF-κB signaling, it is likely that NOD2 signaling may also influence expression of important inflammasome components (i.e., NLRP3 , IL1B, IL18 ). Indeed, studies in a mouse model of MDP-induced eye inflammation could demonstrate NOD2-mediated production of IL-1β and IL-18 in vivo ( 152 ). In the human setting, macrophages from CD patients expressing homozygous NOD2 frameshift mutations fail to induce IL1B expression upon MDP stimulation demonstrating a critical role for NOD2 in regulating IL1B expression ( 153 ). Furthermore, PBMCs from NOD2-deficient CD patients demonstrated a reduced IL-1β secretion in response to MDP/TNF-α co-stimulation indicating that NOD2 signaling also regulates post-translational mechanisms influencing inflammasome activity ( 153 ). In line, Hsu et al. demonstrated that MDP and Anthrax toxin stimulation induces formation of the NOD2/NLRP1/CASP1 complex catalyzing IL-1β maturation in mouse macrophages ( 154 ). Contrary to MDP stimulation, NOD2 was shown to negatively regulate TLR1/2-mediated induction of Il1b expression indicating the complex signaling mechanisms controlled by NOD2 and NF-κB ( 155 ). Interestingly, TRIM22 was also shown to support NLRP3 inflammasome responses upon oxygen-glucose deprivation in a neuronal cell line substantiating a potential role of NOD2-mediated signaling on inflammasome activation ( 109 ). Similar to the expressivity of NOD2-deficient patients, the role of NOD2 in inflammasome activation and intestinal inflammation models is not completely understood ( 156 , 157 ). For example, Umiker et al. showed that colitis in Nod2 knock-out (KO) mice was driven by NLRP3 inflammasome activity, but the underlying mechanisms of increased NLRP3 activity are still unclear ( 157 ). Cell death regulators CASP8, RIPK1, and XIAP Patients with X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) deficiency present with a primary immunodeficiency characterized by hemophagocytic lymphohistiocytosis, severe infections, splenomegaly, and cytopenia ( 113 , 158 , 159 ). However, XIAP deficiency was also shown to often manifest with VEO-IBD ( 113 , 158 – 161 ). Up to 4% of pediatric IBD has been associated with mutations in XIAP ( 113 , 160 , 161 ). As proposed by its name, XIAP can block apoptosis by inhibiting CASP-3, -7, and -9 via baculovirus IAP repeat (BIR) domains ( 113 , 162 – 164 ). Furthermore, XIAP was shown to be essential for propagation of NOD2-mediated NF-κB signaling downstream of NOD2 and expression of important NLRP3 inflammasome components ( 113 , 165 , 166 ). In line, cells deficient for XIAP-related signaling components [receptor-interacting protein kinase (RIPK)2, BIRC2, and BIRC3] fail to induce expression of IL1B upon exposure to the NOD2 agonist MDP ( 113 , 165 , 166 ). However, loss of XIAP resulted in increased IL-1β secretion and cell death in response to various TLR agonists providing a rationale for autoinflammatory symptoms observed in XIAP deficiency ( 113 – 115 ). Aberrant inflammasome and cell death responses upon loss of XIAP in myeloid cells were shown to be dependent on TNF-, RIPK3-, and CASP8-mediated signaling processes ( 113 – 115 ). In the absence of XIAP, TLR- and TNFR-mediated signaling induces ubiquitination of RIPK1 causing activation of RIPK1 and RIPK3, which results in formation of a complex called ripoptosome that recruits and activates CASP8 ( 113 , 115 , 167 , 168 ). Mature CASP8 can induce apoptosis, NLRP3 inflammasome activation, and cleavage of IL-1β demonstrating a direct XIAP-RIPK-CASP8-inflammasome axis ( 113 , 114 ). Of note, TLR- or TNFR-mediated RIPK3 activation in the absence of CASP8 has been shown to induce NLRP3 inflammasomes and necroptotic cell death ( 113 , 114 ). In line with the importance of the XIAP-ripoptosome-CASP8 axis, germline loss-of-function mutations in RIPK1 and CASP8 were recently shown to cause VEO-IBD ( 92 , 107 , 108 ). Interestingly, RIPK1 and CASP8 deficiencies resulted in increased premature NLRP3 inflammasome activity characterized by higher IL-1β secretion without requirement of a second signal. Of note, enhanced inflammasome activity was associated with abnormal cell death responses ( 92 , 107 , 108 ). Overall, identification of causative mutations in all these three genes controlling activation of NLRP3 inflammasomes downstream of different immune signaling pathways exemplified the role of inflammasome activation and cell death regulation in IBD pathophysiology and intestinal homeostasis. The only available curative treatment option for VEO-IBD caused by XIAP deficiency is allogeneic HSCT demonstrating the urgency to find treatment alternatives ( 113 , 159 , 169 ). Similarly, there are no curative therapeutics available for RIPK1 or CASP8 deficiencies affecting both the immune system and intestinal epithelium. Since all three genetic defects are characterized by an increased inflammasome activity with higher IL-1β secretion, usage of therapies targeting inflammasomes and/or anti-IL-1R antibodies might represent an attractive approach for treatment. Interleukin-10 receptor IL-10R deficiency was the first identified monogenic cause for severe VEO-IBD accompanied by perianal disease and folliculitis, which can be only cured by allogeneic HSCT due to the underlying primary immunodeficiency ( 85 , 170 ). The IL-10 receptor is a heterotetrameric protein complex consisting of two IL-10R1 and IL-10R2 subunits, which are encoded by IL10RA and IL10RB ( 171 ). The corresponding ligand IL-10 is a highly potent anti-inflammatory cytokine controlling pleiotropic functions in the immune systems ( 171 – 175 ). Of note, IL-10-mediated signaling was also shown to inhibit NLRP3 inflammasome activation on a transcriptional and post-translational level ( 94 , 176 ). In line, IL-10-deficient mice showed increased NLRP3 inflammasome activation and IL-1β levels ( 94 , 95 , 177 ). Enhanced inflammasome activity manifested in mice prior to onset of colitis and the disease could be successfully treated by blockade of NLRP3 inflammasomes or IL-1β signaling demonstrating that symptoms of IL-10 deficiency are mediated by inflammasome perturbation ( 96 , 177 , 178 ). Analogously, cells from IL-10R-deficient patients showed increased and premature NLRP3 inflammasome activation as well as enhanced IL-1β secretion ( 94 – 96 ). Mechanistically, deficient IL-10 signaling was demonstrated to result in altered inflammasome activation by causing defective mitophagy ( 95 ). Interestingly, increased IL-1β production in human IL-10R-deficient macrophages can be also caused by alternative inflammasome activation, which is a CASP1-independent process mediated by CASP8 ( 94 ). Of note, IL-1β receptor blockade has been shown to ameliorate symptoms in IL-10R-deficient patients providing therapeutic windows for curative allogeneic HSCT ( 94 ). WAS The X-linked Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) presents with a life-threatening immunodeficiency characterized by thrombocytopenia and recurrent infections and is caused by mutations in the homonymous gene ( 179 – 181 ). Upon cellular activation, autoinhibition of Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASp) is resolved and WASp transfers G-actin to the Arp2/3 complex inducing actin filament formation and branching ( 181 – 184 ). Overall, WASp deficiency has been shown to disturb actin polymerization resulting in impaired chemotactic, migratory, phagocytic, and activation responses of immune cells and platelets ( 181 , 185 ). Of note, WAS patients can manifest with VEO-IBD and WASp deficiency was shown to cause experimental colitis in mice ( 110 , 186 , 187 ). In fact, intestinal inflammation in Was KO mice is driven by macrophages, which develop an inflammatory phenotype characterized by higher levels of pro-inflammatory IL-1β and IL-23 as well as reduced levels of anti-inflammatory IL-10 ( 110 ). Analogously, macrophages from WAS patients showed a pro-inflammatory phenotype with higher expression of IL-1β ( 110 ). Furthermore, WASp-deficient cells exhibited an increased NLRP3 inflammasome activity, which might be caused by defective clearance of pathogens due to failure of actin assembly around phagocytosed pathogens and defective autophagy ( 111 ). Correspondingly, enteropathogen infection of myeloid cells expressing mutant WASp has been shown to enhance ASC speck formation and pyroptosis, indicative of robust inflammasome activation in WASp deficiency ( 111 ). Increased inflammasome activation might contribute to autoinflammatory symptoms observed in WAS and might be a target to bridge WAS patients for HSCT, similar to IL-10R-deficiency ( 110 – 112 ). In fact, anti-IL-1R therapy was shown to ameliorate symptoms in one WASp-deficient patient ( 112 ). Interestingly, increased inflammasome activation in WASp-deficient cells could be also inhibited by treatment with type I IFNs representing another potential therapeutic option prior to HSCT ( 111 ). NADPH complex Chronic granulomatous disease (CGD) leads to increased susceptibility of recurrent bacterial and fungal infections and is caused by a defective function of the NADPH oxidase complex in innate immune cells ( 188 – 190 ). Interestingly, up to 40% of CGD patients develop intestinal inflammation reminiscent of IBD ( 191 , 192 ). The NADPH oxidase complex contains gp91-phox, p67-phox, p47-phox, and p22-phox subunits, which are encoded by the genes CYBB, NCF2, NCF1 , and CYBA , respectively ( 190 ). Of note, mutations in all four genes have been shown to cause defective production of ROS in innate immune cells resulting in impaired defense against pathogens ( 190 ). Production of ROS has been identified as a common intermediate step induced by different inflammasome activators (e.g., ATP, asbestos, silica) and inhibition of ROS generation has been shown to block NLRP3 inflammasome activation ( 5 , 193 , 194 ). Based on these findings defective ROS production might disturb inflammasome activity, however CGD patients show an inflammatory phenotype associated with increased IL-1β release upon TLR stimulation ( 78 , 93 ). As a potential mechanistic link, De Luca et al. demonstrated that peripheral blood-derived macrophages from NADPH oxidase-deficient mice and CGD patients exhibited defective autophagy resulting in increased IL-1β release ( 78 ). Correspondingly, treatment with Anakinra has been shown to enhance a rapid and sustained amelioration of colitis in CGD patients ( 78 ). Other immune defects associated with VEO-IBD and altered inflammasome activity Many inborn errors of immunity are known to present with VEO-IBD, which might be a consequence of the complex interplay between the microbial flora and the immune system at the intestinal barrier. For example, phosphatase and tensin homolog (PTEN) regulates phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling by dephosphorylating PI(3,4,5)P 3 and loss-of-function mutations in PTEN have been shown to cause autoimmunity or immunodeficiency associated with IBD ( 195 – 197 ). PTEN has been also shown to interact with NLRP3 and KO of PTEN resulted in reduced NLRP3 inflammasome activation after TLR stimulation ( 106 ). In detail, PTEN was shown to remove inhibitory phosphorylation from NLRP3 at position Y32, T193, and T195, which enables interaction of NLRP3 with ASC and subsequent oligomerization allowing enhanced inflammasome activation ( 106 ). Although data from mouse studies show inflammasome dysregulation in PTEN deficiency, a role of inflammasome activation in human patients with PTEN mutations remains to be demonstrated. The Bruton tyrosine kinase (BTK) is important for B cell receptor (BCR) signaling as well as B cell development and mutations in BTK are the most common cause for hypogammaglobulinemia ( 198 – 202 ). Besides its role for B cell development and function, BTK was also shown to interact with NLRP3 and modulate phosphorylation of NLRP3 in myeloid cells ( 90 , 91 , 203 ). Of note, Btk KO mice develop severe TNBS-induced colitis, which can be improved by IL-1β blockade indicating a central role of inflammasome activation in BTK-dependent colitis development ( 91 ). However, the consequence of BTK activity on human NLRP3 inflammasome activity remains controversial, as reports have shown either increased or decreased NLRP3 inflammasome activation in murine Btk KO cells and cells from patients with BTK deficiency ( 90 , 91 ). Signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) is a critical signaling molecule in interferon (IFN) responses and STAT1 deficiency causes Mendelian susceptibility to mycobacterial disease associated with severe infections ( 204 , 205 ). In addition, dominant gain-of-function mutations in STAT1 have been shown to cause a severe immune deficiency associated with polyendocrinopathy and enteropathy ( 206 ). Interestingly, STAT1 is also an essential mediator of type I IFN signaling, which can inhibit NLRP1 and NLRP3 inflammasomes ( 207 , 208 ). Correspondingly, alterations in STAT1 activity and subsequently changed type I IFN responses might predispose patients to dysregulated inflammasome activity upon challenge with pathogens, which still needs to be shown in IBD patients. Mutations in A disintegrin and metalloprotease 17 (ADAM17) can cause VEO-IBD associated with skin inflammation and susceptibility to gastrointestinal and skin infections ( 209 ). ADAM17 has been shown to cleave the pro-inflammatory cytokine TNF-α, which is produced as membrane-bound precursor after activation ( 210 – 212 ). In line, PBMCs from patients with ADAM17 deficiency produce reduced amounts of TNF-α upon LPS stimulation ( 209 ). TNF-α-mediated activation of NF-κB signaling has been shown to induce expression of NLRP3 inflammasome components (e.g., NLRP3, IL-1β, and IL-18) and modulate pyrin inflammasome activity ( 210 , 213 , 214 ). In line, targeting TNF-α in a mouse model of autoinflammation caused by NLRP3 mutations was shown to ameliorate symptoms ( 213 ). Thus, it is tempting to speculate that failure to produce mature TNF-α in ADAM17 deficiency might also result in disturbed inflammasome activation. Sensor proteins NLRC4 The most direct link between IBD pathogenesis and dysregulated inflammasome activation has been provided by the discovery of patients carrying mutations in genes encoding for sensor proteins. In particular, de novo gain-of-function in NLRC4 could be identified in patients presenting with a range of clinical manifestations of autoinflammation and macrophage activation syndrome, including severe very early onset enterocolitis ( 103 , 104 ). The reported gain-of-function mutations cause spontaneous oligomerization and activation of the NAIP/NLRC4 inflammasome without the requirement of physiological triggers resulting in spontaneous cleavage of pro-CASP1 and excessive release of IL-1β and IL-18, pyroptosis of macrophages, and chronic inflammation ( 103 , 104 ). In addition, Steiner et al. have recently identified an autosomal recessive NLRC4 mutation associated with increased IL-1β and IL-18 secretion in a patient with autoinflammation accompanied by diarrhea ( 116 ). Although the underlying mechanisms of biallelic NLRC4 deficiency remain elusive, IL-18 blockade was shown to be effective in treatment of NLRC4-mediated macrophage activation syndrome indicating that epithelial-derived IL-18 might be a critical pathomechanistic driver ( 105 ). Taken together, patients with germline NLRC4 mutations demonstrate that a tight regulation of NLRC4-associated inflammasomes is necessary to maintain intestinal homeostasis and physiological immune cell function. MEFV Patients with mutations in the Mediterranean fever gene ( MEFV , encoding for pyrin) have been shown to develop an autoinflammatory syndrome called Familial Mediterranean Fever (FMF) characterized by periodic fever attacks and associated with early-onset IBD-like phenotypes ( 38 , 97 , 117 , 118 ). Even though mutations in MEFV are discussed rather as risk factors for VEO-IBD, underlying mechanisms in FMF provide important insights into dysregulated inflammasome activity. In steady state, pyrin molecules are phosphorylated by serine/threonine-protein kinase N (PKN)1/2 allowing binding of the chaperone protein 14-3-3 and maintenance of inactive pyrin ( 38 , 97 ). In turn, activity of PKN1/2 is controlled by Rho GTPases that are critical regulators of actin cytoskeletons indicating that pyrin-mediated inflammasome activity is coupled to cytoskeleton dynamics ( 37 , 38 , 65 ). Various bacterial toxins (e.g., TcdB from Clostridium difficile ) cause inhibition of Rho GTPases by post-translational modification, which results in reduced PKN1/2 activity, pyrin phosphorylation, and 14-3-3 recruitment, subsequently leading to increased pyrin activity ( 38 , 65 , 97 ). Similar to other inflammasomes, oligomerized pyrin recruits ASC and CASP1 resulting in inflammation and pyroptosis by inducing cleavage of pro-IL-1β, pro-IL-18 and GSDMD ( 119 ). Gain-of-function mutations in MEFV can cause increased IL-1β production and levels of IL-1β are indicative of disease activity in FMF patients ( 97 , 98 ). As first line therapy, FMF can be successfully treated with colchicine by blocking polymerization of microtubuli and maintaining pyrin in an inactive state through subsequent activation of Rho GTPases and PKN1/2 ( 99 , 120 – 122 ). Notably, FMF might be also treated using IL-1β antagonists demonstrating the central role of an inflammasome-mediated pathogenesis in FMF ( 99 , 100 , 120 ). NLRC4 The most direct link between IBD pathogenesis and dysregulated inflammasome activation has been provided by the discovery of patients carrying mutations in genes encoding for sensor proteins. In particular, de novo gain-of-function in NLRC4 could be identified in patients presenting with a range of clinical manifestations of autoinflammation and macrophage activation syndrome, including severe very early onset enterocolitis ( 103 , 104 ). The reported gain-of-function mutations cause spontaneous oligomerization and activation of the NAIP/NLRC4 inflammasome without the requirement of physiological triggers resulting in spontaneous cleavage of pro-CASP1 and excessive release of IL-1β and IL-18, pyroptosis of macrophages, and chronic inflammation ( 103 , 104 ). In addition, Steiner et al. have recently identified an autosomal recessive NLRC4 mutation associated with increased IL-1β and IL-18 secretion in a patient with autoinflammation accompanied by diarrhea ( 116 ). Although the underlying mechanisms of biallelic NLRC4 deficiency remain elusive, IL-18 blockade was shown to be effective in treatment of NLRC4-mediated macrophage activation syndrome indicating that epithelial-derived IL-18 might be a critical pathomechanistic driver ( 105 ). Taken together, patients with germline NLRC4 mutations demonstrate that a tight regulation of NLRC4-associated inflammasomes is necessary to maintain intestinal homeostasis and physiological immune cell function. MEFV Patients with mutations in the Mediterranean fever gene ( MEFV , encoding for pyrin) have been shown to develop an autoinflammatory syndrome called Familial Mediterranean Fever (FMF) characterized by periodic fever attacks and associated with early-onset IBD-like phenotypes ( 38 , 97 , 117 , 118 ). Even though mutations in MEFV are discussed rather as risk factors for VEO-IBD, underlying mechanisms in FMF provide important insights into dysregulated inflammasome activity. In steady state, pyrin molecules are phosphorylated by serine/threonine-protein kinase N (PKN)1/2 allowing binding of the chaperone protein 14-3-3 and maintenance of inactive pyrin ( 38 , 97 ). In turn, activity of PKN1/2 is controlled by Rho GTPases that are critical regulators of actin cytoskeletons indicating that pyrin-mediated inflammasome activity is coupled to cytoskeleton dynamics ( 37 , 38 , 65 ). Various bacterial toxins (e.g., TcdB from Clostridium difficile ) cause inhibition of Rho GTPases by post-translational modification, which results in reduced PKN1/2 activity, pyrin phosphorylation, and 14-3-3 recruitment, subsequently leading to increased pyrin activity ( 38 , 65 , 97 ). Similar to other inflammasomes, oligomerized pyrin recruits ASC and CASP1 resulting in inflammation and pyroptosis by inducing cleavage of pro-IL-1β, pro-IL-18 and GSDMD ( 119 ). Gain-of-function mutations in MEFV can cause increased IL-1β production and levels of IL-1β are indicative of disease activity in FMF patients ( 97 , 98 ). As first line therapy, FMF can be successfully treated with colchicine by blocking polymerization of microtubuli and maintaining pyrin in an inactive state through subsequent activation of Rho GTPases and PKN1/2 ( 99 , 120 – 122 ). Notably, FMF might be also treated using IL-1β antagonists demonstrating the central role of an inflammasome-mediated pathogenesis in FMF ( 99 , 100 , 120 ). Inflammasome regulators MVK Mevalonate kinase (MVK) catalyzes the phosphorylation of mevalonate, which is a critical step in the biosynthesis of cholesterol as well as isopentenyl diphosphate and other polyisoprenoid metabolites ( 97 , 123 ). Furthermore, the mevalonate pathway also produces precursors of geranylgeranyl pyrophosphate required for prenylation of proteins ( 101 ). Notably, prenylation is a critical post-translational modification of small Rho GTPases, which are important for the regulation of the pyrin inflammasome (see also MEFV ) ( 38 , 65 , 97 , 101 ). In patients with MVK deficiency, loss-of-function mutations impair production of mevalonate metabolites resulting in accumulation of metabolic precursors and lack of products like geranylgeranyl pyrophosphate ( 38 , 65 , 97 , 101 ). The underlying mechanisms of enhanced inflammasome activity in MVK deficiency are not fully understood, but defective protein prenylation of small GTPases causes reduced pyrin phosphorylation and thereby induces spontaneous activation of pyrin inflammasomes ( 38 , 65 , 97 , 101 ). Similar to MEFV, patients with MVK deficiency suffer from an autoinflammatory syndrome characterized by recurrent episodes of fever, arthralgia, lymphadenopathy, and splenomegaly ( 38 , 124 , 125 ). Of note, MVK-deficient patients can also present with very-early onset diarrhea and abdominal pain reminiscent of IBD ( 38 , 124 , 125 ). Interestingly, the disease severity of MVK deficiency is dependent on the residual activity of mutated MVK ( 38 , 124 ). Severe forms of MVD present as mevalonic aciduria associated with developmental delay and severe systemic inflammation ( 126 ). Analogous to FMF patients, MVK-deficient patients with VEO-IBD have been successfully treated by biologics blocking IL-1β signaling leading to improved endoscopic, histologic and laboratory parameters of inflammation ( 102 ). IKBKG NF-κB signaling is a critical cellular signaling pathway in human cells controlling pleiotropic functions such as inflammatory responses, cell stress, cell survival, and cell growth ( 127 – 129 ). Several studies have demonstrated that NF-κB signaling is critical for the expression of NLRP3 inflammasome components (e.g., NLRP3, IL1B ) in response to various danger signals (priming step) ( 30 , 31 ). In unstimulated conditions, NF-κB is inhibited by binding to the inhibitor of κB (IκB) ( 130 – 132 ). Upon cellular activation, IκB proteins are phosphorylated by the IκB kinase (IKK) complex (IKKα, IKKβ, IKKγ/NF-κB essential modulator (NEMO)) releasing IκB and enabling NF-κB-mediated signaling ( 132 – 136 ). In males, hypomorphic mutations in NEMO , a gene with X-linked inheritance encoding a regulatory subunit of the IKK complex, cause immunodeficiency and hypohidrotic ectodermal dysplasia associated with severe bacterial, viral, and fungal infections ( 137 – 139 ). Many NEMO-deficient patients further present with VEO-IBD characterized by intractable diarrhea and failure-to-thrive ( 137 , 138 ). On a molecular level, NEMO deficiency causes aberrant TLR-, TNFR-, and IL-1R-mediated signaling impairing critical immune cell functions in response to infection ( 137 ). Of note, HSCT was shown to cure immunodeficiency and susceptibility to infections in patients with NEMO deficiency, but failed to cure intestinal inflammation indicating an important role of NEMO and NF-κB signaling in controlling intestinal epithelial cell homeostasis ( 138 ). In fact, NEMO was shown to be a critical regulator of TNF-mediated and RIPK1-dependent cell death in intestinal epithelium and NEMO-deficient epithelial cells displayed increased cell death as well as reduced production of antimicrobial molecules leading to increased permeability of the intestinal barrier for luminal microbiota and to intestinal inflammation ( 140 , 141 ). Genetic variants disturbing NF-κB signaling are obvious candidates causing inflammasome activation defects. In line, Greten et al. could show that inhibition or deletion of IKKβ results in reduced expression of IL-1β mRNA and immature protein upon LPS stimulation in mouse macrophages ( 142 ). However, they could also detect higher levels of mature IL-1β secreted by IKKβ-deficient macrophages, which might be a result of increased CASP1 activation due to enhanced apoptosis ( 142 ). Similar to these studies on IKKβ, Zhao. et al. reported that pharmacological suppression of NEMO ubiquitination resulted in reduced Il1b and Nlrp3 expression in LPS-stimulated mouse macrophages ( 143 ). Despite scarce evidence, it is tempting to speculate that NEMO deficiency might also result in aberrant NLRP3 inflammasome activation similar to IKKβ. However, since NF-κB signaling controls various central (non-)immune functions, it is hard to differentiate the effects on single effector mechanisms such as inflammasome activation. NOD2 and TRIM22 Nucleotide-binding oligomerization domain 2 (NOD2) is an intracellular pattern recognition receptor (PRR) of the NLR protein family detecting muramyl dipeptide (MDP), which is a component of the bacterial cell wall ( 81 , 144 – 146 ). Upon activation, NOD2 signaling induces expression of pro-inflammatory cytokines via RIPK2- and NF-κB-mediated signaling and contributes to clearance of different pathogens ( 144 , 146 , 147 ). Of note, genome-wide association studies demonstrated that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in NOD2 represent the strongest genetic risk factor for the development of CD ( 81 , 148 , 149 ). However, mono- or biallelic NOD2 mutations are not considered as a monogenic cause for IBD, as they can be also frequently found in the genome of healthy humans ( 81 , 150 ). In contrast, mutations in the NOD2 regulator tripartite motif containing 22 gene ( TRIM22 ) were shown to cause severe refractory VEO-IBD associated with diarrhea, failure-to-thrive, and multiple infections ( 151 ). TRIM22 is a RING finger E3 ubiquitin ligase that catalyzes K63 polyubiquitination of NOD2 and thereby controls NOD2 signaling function ( 151 ). Since NOD2 can regulate NF-κB signaling, it is likely that NOD2 signaling may also influence expression of important inflammasome components (i.e., NLRP3 , IL1B, IL18 ). Indeed, studies in a mouse model of MDP-induced eye inflammation could demonstrate NOD2-mediated production of IL-1β and IL-18 in vivo ( 152 ). In the human setting, macrophages from CD patients expressing homozygous NOD2 frameshift mutations fail to induce IL1B expression upon MDP stimulation demonstrating a critical role for NOD2 in regulating IL1B expression ( 153 ). Furthermore, PBMCs from NOD2-deficient CD patients demonstrated a reduced IL-1β secretion in response to MDP/TNF-α co-stimulation indicating that NOD2 signaling also regulates post-translational mechanisms influencing inflammasome activity ( 153 ). In line, Hsu et al. demonstrated that MDP and Anthrax toxin stimulation induces formation of the NOD2/NLRP1/CASP1 complex catalyzing IL-1β maturation in mouse macrophages ( 154 ). Contrary to MDP stimulation, NOD2 was shown to negatively regulate TLR1/2-mediated induction of Il1b expression indicating the complex signaling mechanisms controlled by NOD2 and NF-κB ( 155 ). Interestingly, TRIM22 was also shown to support NLRP3 inflammasome responses upon oxygen-glucose deprivation in a neuronal cell line substantiating a potential role of NOD2-mediated signaling on inflammasome activation ( 109 ). Similar to the expressivity of NOD2-deficient patients, the role of NOD2 in inflammasome activation and intestinal inflammation models is not completely understood ( 156 , 157 ). For example, Umiker et al. showed that colitis in Nod2 knock-out (KO) mice was driven by NLRP3 inflammasome activity, but the underlying mechanisms of increased NLRP3 activity are still unclear ( 157 ). MVK Mevalonate kinase (MVK) catalyzes the phosphorylation of mevalonate, which is a critical step in the biosynthesis of cholesterol as well as isopentenyl diphosphate and other polyisoprenoid metabolites ( 97 , 123 ). Furthermore, the mevalonate pathway also produces precursors of geranylgeranyl pyrophosphate required for prenylation of proteins ( 101 ). Notably, prenylation is a critical post-translational modification of small Rho GTPases, which are important for the regulation of the pyrin inflammasome (see also MEFV ) ( 38 , 65 , 97 , 101 ). In patients with MVK deficiency, loss-of-function mutations impair production of mevalonate metabolites resulting in accumulation of metabolic precursors and lack of products like geranylgeranyl pyrophosphate ( 38 , 65 , 97 , 101 ). The underlying mechanisms of enhanced inflammasome activity in MVK deficiency are not fully understood, but defective protein prenylation of small GTPases causes reduced pyrin phosphorylation and thereby induces spontaneous activation of pyrin inflammasomes ( 38 , 65 , 97 , 101 ). Similar to MEFV, patients with MVK deficiency suffer from an autoinflammatory syndrome characterized by recurrent episodes of fever, arthralgia, lymphadenopathy, and splenomegaly ( 38 , 124 , 125 ). Of note, MVK-deficient patients can also present with very-early onset diarrhea and abdominal pain reminiscent of IBD ( 38 , 124 , 125 ). Interestingly, the disease severity of MVK deficiency is dependent on the residual activity of mutated MVK ( 38 , 124 ). Severe forms of MVD present as mevalonic aciduria associated with developmental delay and severe systemic inflammation ( 126 ). Analogous to FMF patients, MVK-deficient patients with VEO-IBD have been successfully treated by biologics blocking IL-1β signaling leading to improved endoscopic, histologic and laboratory parameters of inflammation ( 102 ). IKBKG NF-κB signaling is a critical cellular signaling pathway in human cells controlling pleiotropic functions such as inflammatory responses, cell stress, cell survival, and cell growth ( 127 – 129 ). Several studies have demonstrated that NF-κB signaling is critical for the expression of NLRP3 inflammasome components (e.g., NLRP3, IL1B ) in response to various danger signals (priming step) ( 30 , 31 ). In unstimulated conditions, NF-κB is inhibited by binding to the inhibitor of κB (IκB) ( 130 – 132 ). Upon cellular activation, IκB proteins are phosphorylated by the IκB kinase (IKK) complex (IKKα, IKKβ, IKKγ/NF-κB essential modulator (NEMO)) releasing IκB and enabling NF-κB-mediated signaling ( 132 – 136 ). In males, hypomorphic mutations in NEMO , a gene with X-linked inheritance encoding a regulatory subunit of the IKK complex, cause immunodeficiency and hypohidrotic ectodermal dysplasia associated with severe bacterial, viral, and fungal infections ( 137 – 139 ). Many NEMO-deficient patients further present with VEO-IBD characterized by intractable diarrhea and failure-to-thrive ( 137 , 138 ). On a molecular level, NEMO deficiency causes aberrant TLR-, TNFR-, and IL-1R-mediated signaling impairing critical immune cell functions in response to infection ( 137 ). Of note, HSCT was shown to cure immunodeficiency and susceptibility to infections in patients with NEMO deficiency, but failed to cure intestinal inflammation indicating an important role of NEMO and NF-κB signaling in controlling intestinal epithelial cell homeostasis ( 138 ). In fact, NEMO was shown to be a critical regulator of TNF-mediated and RIPK1-dependent cell death in intestinal epithelium and NEMO-deficient epithelial cells displayed increased cell death as well as reduced production of antimicrobial molecules leading to increased permeability of the intestinal barrier for luminal microbiota and to intestinal inflammation ( 140 , 141 ). Genetic variants disturbing NF-κB signaling are obvious candidates causing inflammasome activation defects. In line, Greten et al. could show that inhibition or deletion of IKKβ results in reduced expression of IL-1β mRNA and immature protein upon LPS stimulation in mouse macrophages ( 142 ). However, they could also detect higher levels of mature IL-1β secreted by IKKβ-deficient macrophages, which might be a result of increased CASP1 activation due to enhanced apoptosis ( 142 ). Similar to these studies on IKKβ, Zhao. et al. reported that pharmacological suppression of NEMO ubiquitination resulted in reduced Il1b and Nlrp3 expression in LPS-stimulated mouse macrophages ( 143 ). Despite scarce evidence, it is tempting to speculate that NEMO deficiency might also result in aberrant NLRP3 inflammasome activation similar to IKKβ. However, since NF-κB signaling controls various central (non-)immune functions, it is hard to differentiate the effects on single effector mechanisms such as inflammasome activation. NOD2 and TRIM22 Nucleotide-binding oligomerization domain 2 (NOD2) is an intracellular pattern recognition receptor (PRR) of the NLR protein family detecting muramyl dipeptide (MDP), which is a component of the bacterial cell wall ( 81 , 144 – 146 ). Upon activation, NOD2 signaling induces expression of pro-inflammatory cytokines via RIPK2- and NF-κB-mediated signaling and contributes to clearance of different pathogens ( 144 , 146 , 147 ). Of note, genome-wide association studies demonstrated that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in NOD2 represent the strongest genetic risk factor for the development of CD ( 81 , 148 , 149 ). However, mono- or biallelic NOD2 mutations are not considered as a monogenic cause for IBD, as they can be also frequently found in the genome of healthy humans ( 81 , 150 ). In contrast, mutations in the NOD2 regulator tripartite motif containing 22 gene ( TRIM22 ) were shown to cause severe refractory VEO-IBD associated with diarrhea, failure-to-thrive, and multiple infections ( 151 ). TRIM22 is a RING finger E3 ubiquitin ligase that catalyzes K63 polyubiquitination of NOD2 and thereby controls NOD2 signaling function ( 151 ). Since NOD2 can regulate NF-κB signaling, it is likely that NOD2 signaling may also influence expression of important inflammasome components (i.e., NLRP3 , IL1B, IL18 ). Indeed, studies in a mouse model of MDP-induced eye inflammation could demonstrate NOD2-mediated production of IL-1β and IL-18 in vivo ( 152 ). In the human setting, macrophages from CD patients expressing homozygous NOD2 frameshift mutations fail to induce IL1B expression upon MDP stimulation demonstrating a critical role for NOD2 in regulating IL1B expression ( 153 ). Furthermore, PBMCs from NOD2-deficient CD patients demonstrated a reduced IL-1β secretion in response to MDP/TNF-α co-stimulation indicating that NOD2 signaling also regulates post-translational mechanisms influencing inflammasome activity ( 153 ). In line, Hsu et al. demonstrated that MDP and Anthrax toxin stimulation induces formation of the NOD2/NLRP1/CASP1 complex catalyzing IL-1β maturation in mouse macrophages ( 154 ). Contrary to MDP stimulation, NOD2 was shown to negatively regulate TLR1/2-mediated induction of Il1b expression indicating the complex signaling mechanisms controlled by NOD2 and NF-κB ( 155 ). Interestingly, TRIM22 was also shown to support NLRP3 inflammasome responses upon oxygen-glucose deprivation in a neuronal cell line substantiating a potential role of NOD2-mediated signaling on inflammasome activation ( 109 ). Similar to the expressivity of NOD2-deficient patients, the role of NOD2 in inflammasome activation and intestinal inflammation models is not completely understood ( 156 , 157 ). For example, Umiker et al. showed that colitis in Nod2 knock-out (KO) mice was driven by NLRP3 inflammasome activity, but the underlying mechanisms of increased NLRP3 activity are still unclear ( 157 ). Cell death regulators CASP8, RIPK1, and XIAP Patients with X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) deficiency present with a primary immunodeficiency characterized by hemophagocytic lymphohistiocytosis, severe infections, splenomegaly, and cytopenia ( 113 , 158 , 159 ). However, XIAP deficiency was also shown to often manifest with VEO-IBD ( 113 , 158 – 161 ). Up to 4% of pediatric IBD has been associated with mutations in XIAP ( 113 , 160 , 161 ). As proposed by its name, XIAP can block apoptosis by inhibiting CASP-3, -7, and -9 via baculovirus IAP repeat (BIR) domains ( 113 , 162 – 164 ). Furthermore, XIAP was shown to be essential for propagation of NOD2-mediated NF-κB signaling downstream of NOD2 and expression of important NLRP3 inflammasome components ( 113 , 165 , 166 ). In line, cells deficient for XIAP-related signaling components [receptor-interacting protein kinase (RIPK)2, BIRC2, and BIRC3] fail to induce expression of IL1B upon exposure to the NOD2 agonist MDP ( 113 , 165 , 166 ). However, loss of XIAP resulted in increased IL-1β secretion and cell death in response to various TLR agonists providing a rationale for autoinflammatory symptoms observed in XIAP deficiency ( 113 – 115 ). Aberrant inflammasome and cell death responses upon loss of XIAP in myeloid cells were shown to be dependent on TNF-, RIPK3-, and CASP8-mediated signaling processes ( 113 – 115 ). In the absence of XIAP, TLR- and TNFR-mediated signaling induces ubiquitination of RIPK1 causing activation of RIPK1 and RIPK3, which results in formation of a complex called ripoptosome that recruits and activates CASP8 ( 113 , 115 , 167 , 168 ). Mature CASP8 can induce apoptosis, NLRP3 inflammasome activation, and cleavage of IL-1β demonstrating a direct XIAP-RIPK-CASP8-inflammasome axis ( 113 , 114 ). Of note, TLR- or TNFR-mediated RIPK3 activation in the absence of CASP8 has been shown to induce NLRP3 inflammasomes and necroptotic cell death ( 113 , 114 ). In line with the importance of the XIAP-ripoptosome-CASP8 axis, germline loss-of-function mutations in RIPK1 and CASP8 were recently shown to cause VEO-IBD ( 92 , 107 , 108 ). Interestingly, RIPK1 and CASP8 deficiencies resulted in increased premature NLRP3 inflammasome activity characterized by higher IL-1β secretion without requirement of a second signal. Of note, enhanced inflammasome activity was associated with abnormal cell death responses ( 92 , 107 , 108 ). Overall, identification of causative mutations in all these three genes controlling activation of NLRP3 inflammasomes downstream of different immune signaling pathways exemplified the role of inflammasome activation and cell death regulation in IBD pathophysiology and intestinal homeostasis. The only available curative treatment option for VEO-IBD caused by XIAP deficiency is allogeneic HSCT demonstrating the urgency to find treatment alternatives ( 113 , 159 , 169 ). Similarly, there are no curative therapeutics available for RIPK1 or CASP8 deficiencies affecting both the immune system and intestinal epithelium. Since all three genetic defects are characterized by an increased inflammasome activity with higher IL-1β secretion, usage of therapies targeting inflammasomes and/or anti-IL-1R antibodies might represent an attractive approach for treatment. Interleukin-10 receptor IL-10R deficiency was the first identified monogenic cause for severe VEO-IBD accompanied by perianal disease and folliculitis, which can be only cured by allogeneic HSCT due to the underlying primary immunodeficiency ( 85 , 170 ). The IL-10 receptor is a heterotetrameric protein complex consisting of two IL-10R1 and IL-10R2 subunits, which are encoded by IL10RA and IL10RB ( 171 ). The corresponding ligand IL-10 is a highly potent anti-inflammatory cytokine controlling pleiotropic functions in the immune systems ( 171 – 175 ). Of note, IL-10-mediated signaling was also shown to inhibit NLRP3 inflammasome activation on a transcriptional and post-translational level ( 94 , 176 ). In line, IL-10-deficient mice showed increased NLRP3 inflammasome activation and IL-1β levels ( 94 , 95 , 177 ). Enhanced inflammasome activity manifested in mice prior to onset of colitis and the disease could be successfully treated by blockade of NLRP3 inflammasomes or IL-1β signaling demonstrating that symptoms of IL-10 deficiency are mediated by inflammasome perturbation ( 96 , 177 , 178 ). Analogously, cells from IL-10R-deficient patients showed increased and premature NLRP3 inflammasome activation as well as enhanced IL-1β secretion ( 94 – 96 ). Mechanistically, deficient IL-10 signaling was demonstrated to result in altered inflammasome activation by causing defective mitophagy ( 95 ). Interestingly, increased IL-1β production in human IL-10R-deficient macrophages can be also caused by alternative inflammasome activation, which is a CASP1-independent process mediated by CASP8 ( 94 ). Of note, IL-1β receptor blockade has been shown to ameliorate symptoms in IL-10R-deficient patients providing therapeutic windows for curative allogeneic HSCT ( 94 ). WAS The X-linked Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) presents with a life-threatening immunodeficiency characterized by thrombocytopenia and recurrent infections and is caused by mutations in the homonymous gene ( 179 – 181 ). Upon cellular activation, autoinhibition of Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASp) is resolved and WASp transfers G-actin to the Arp2/3 complex inducing actin filament formation and branching ( 181 – 184 ). Overall, WASp deficiency has been shown to disturb actin polymerization resulting in impaired chemotactic, migratory, phagocytic, and activation responses of immune cells and platelets ( 181 , 185 ). Of note, WAS patients can manifest with VEO-IBD and WASp deficiency was shown to cause experimental colitis in mice ( 110 , 186 , 187 ). In fact, intestinal inflammation in Was KO mice is driven by macrophages, which develop an inflammatory phenotype characterized by higher levels of pro-inflammatory IL-1β and IL-23 as well as reduced levels of anti-inflammatory IL-10 ( 110 ). Analogously, macrophages from WAS patients showed a pro-inflammatory phenotype with higher expression of IL-1β ( 110 ). Furthermore, WASp-deficient cells exhibited an increased NLRP3 inflammasome activity, which might be caused by defective clearance of pathogens due to failure of actin assembly around phagocytosed pathogens and defective autophagy ( 111 ). Correspondingly, enteropathogen infection of myeloid cells expressing mutant WASp has been shown to enhance ASC speck formation and pyroptosis, indicative of robust inflammasome activation in WASp deficiency ( 111 ). Increased inflammasome activation might contribute to autoinflammatory symptoms observed in WAS and might be a target to bridge WAS patients for HSCT, similar to IL-10R-deficiency ( 110 – 112 ). In fact, anti-IL-1R therapy was shown to ameliorate symptoms in one WASp-deficient patient ( 112 ). Interestingly, increased inflammasome activation in WASp-deficient cells could be also inhibited by treatment with type I IFNs representing another potential therapeutic option prior to HSCT ( 111 ). NADPH complex Chronic granulomatous disease (CGD) leads to increased susceptibility of recurrent bacterial and fungal infections and is caused by a defective function of the NADPH oxidase complex in innate immune cells ( 188 – 190 ). Interestingly, up to 40% of CGD patients develop intestinal inflammation reminiscent of IBD ( 191 , 192 ). The NADPH oxidase complex contains gp91-phox, p67-phox, p47-phox, and p22-phox subunits, which are encoded by the genes CYBB, NCF2, NCF1 , and CYBA , respectively ( 190 ). Of note, mutations in all four genes have been shown to cause defective production of ROS in innate immune cells resulting in impaired defense against pathogens ( 190 ). Production of ROS has been identified as a common intermediate step induced by different inflammasome activators (e.g., ATP, asbestos, silica) and inhibition of ROS generation has been shown to block NLRP3 inflammasome activation ( 5 , 193 , 194 ). Based on these findings defective ROS production might disturb inflammasome activity, however CGD patients show an inflammatory phenotype associated with increased IL-1β release upon TLR stimulation ( 78 , 93 ). As a potential mechanistic link, De Luca et al. demonstrated that peripheral blood-derived macrophages from NADPH oxidase-deficient mice and CGD patients exhibited defective autophagy resulting in increased IL-1β release ( 78 ). Correspondingly, treatment with Anakinra has been shown to enhance a rapid and sustained amelioration of colitis in CGD patients ( 78 ). Other immune defects associated with VEO-IBD and altered inflammasome activity Many inborn errors of immunity are known to present with VEO-IBD, which might be a consequence of the complex interplay between the microbial flora and the immune system at the intestinal barrier. For example, phosphatase and tensin homolog (PTEN) regulates phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling by dephosphorylating PI(3,4,5)P 3 and loss-of-function mutations in PTEN have been shown to cause autoimmunity or immunodeficiency associated with IBD ( 195 – 197 ). PTEN has been also shown to interact with NLRP3 and KO of PTEN resulted in reduced NLRP3 inflammasome activation after TLR stimulation ( 106 ). In detail, PTEN was shown to remove inhibitory phosphorylation from NLRP3 at position Y32, T193, and T195, which enables interaction of NLRP3 with ASC and subsequent oligomerization allowing enhanced inflammasome activation ( 106 ). Although data from mouse studies show inflammasome dysregulation in PTEN deficiency, a role of inflammasome activation in human patients with PTEN mutations remains to be demonstrated. The Bruton tyrosine kinase (BTK) is important for B cell receptor (BCR) signaling as well as B cell development and mutations in BTK are the most common cause for hypogammaglobulinemia ( 198 – 202 ). Besides its role for B cell development and function, BTK was also shown to interact with NLRP3 and modulate phosphorylation of NLRP3 in myeloid cells ( 90 , 91 , 203 ). Of note, Btk KO mice develop severe TNBS-induced colitis, which can be improved by IL-1β blockade indicating a central role of inflammasome activation in BTK-dependent colitis development ( 91 ). However, the consequence of BTK activity on human NLRP3 inflammasome activity remains controversial, as reports have shown either increased or decreased NLRP3 inflammasome activation in murine Btk KO cells and cells from patients with BTK deficiency ( 90 , 91 ). Signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) is a critical signaling molecule in interferon (IFN) responses and STAT1 deficiency causes Mendelian susceptibility to mycobacterial disease associated with severe infections ( 204 , 205 ). In addition, dominant gain-of-function mutations in STAT1 have been shown to cause a severe immune deficiency associated with polyendocrinopathy and enteropathy ( 206 ). Interestingly, STAT1 is also an essential mediator of type I IFN signaling, which can inhibit NLRP1 and NLRP3 inflammasomes ( 207 , 208 ). Correspondingly, alterations in STAT1 activity and subsequently changed type I IFN responses might predispose patients to dysregulated inflammasome activity upon challenge with pathogens, which still needs to be shown in IBD patients. Mutations in A disintegrin and metalloprotease 17 (ADAM17) can cause VEO-IBD associated with skin inflammation and susceptibility to gastrointestinal and skin infections ( 209 ). ADAM17 has been shown to cleave the pro-inflammatory cytokine TNF-α, which is produced as membrane-bound precursor after activation ( 210 – 212 ). In line, PBMCs from patients with ADAM17 deficiency produce reduced amounts of TNF-α upon LPS stimulation ( 209 ). TNF-α-mediated activation of NF-κB signaling has been shown to induce expression of NLRP3 inflammasome components (e.g., NLRP3, IL-1β, and IL-18) and modulate pyrin inflammasome activity ( 210 , 213 , 214 ). In line, targeting TNF-α in a mouse model of autoinflammation caused by NLRP3 mutations was shown to ameliorate symptoms ( 213 ). Thus, it is tempting to speculate that failure to produce mature TNF-α in ADAM17 deficiency might also result in disturbed inflammasome activation. CASP8, RIPK1, and XIAP Patients with X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) deficiency present with a primary immunodeficiency characterized by hemophagocytic lymphohistiocytosis, severe infections, splenomegaly, and cytopenia ( 113 , 158 , 159 ). However, XIAP deficiency was also shown to often manifest with VEO-IBD ( 113 , 158 – 161 ). Up to 4% of pediatric IBD has been associated with mutations in XIAP ( 113 , 160 , 161 ). As proposed by its name, XIAP can block apoptosis by inhibiting CASP-3, -7, and -9 via baculovirus IAP repeat (BIR) domains ( 113 , 162 – 164 ). Furthermore, XIAP was shown to be essential for propagation of NOD2-mediated NF-κB signaling downstream of NOD2 and expression of important NLRP3 inflammasome components ( 113 , 165 , 166 ). In line, cells deficient for XIAP-related signaling components [receptor-interacting protein kinase (RIPK)2, BIRC2, and BIRC3] fail to induce expression of IL1B upon exposure to the NOD2 agonist MDP ( 113 , 165 , 166 ). However, loss of XIAP resulted in increased IL-1β secretion and cell death in response to various TLR agonists providing a rationale for autoinflammatory symptoms observed in XIAP deficiency ( 113 – 115 ). Aberrant inflammasome and cell death responses upon loss of XIAP in myeloid cells were shown to be dependent on TNF-, RIPK3-, and CASP8-mediated signaling processes ( 113 – 115 ). In the absence of XIAP, TLR- and TNFR-mediated signaling induces ubiquitination of RIPK1 causing activation of RIPK1 and RIPK3, which results in formation of a complex called ripoptosome that recruits and activates CASP8 ( 113 , 115 , 167 , 168 ). Mature CASP8 can induce apoptosis, NLRP3 inflammasome activation, and cleavage of IL-1β demonstrating a direct XIAP-RIPK-CASP8-inflammasome axis ( 113 , 114 ). Of note, TLR- or TNFR-mediated RIPK3 activation in the absence of CASP8 has been shown to induce NLRP3 inflammasomes and necroptotic cell death ( 113 , 114 ). In line with the importance of the XIAP-ripoptosome-CASP8 axis, germline loss-of-function mutations in RIPK1 and CASP8 were recently shown to cause VEO-IBD ( 92 , 107 , 108 ). Interestingly, RIPK1 and CASP8 deficiencies resulted in increased premature NLRP3 inflammasome activity characterized by higher IL-1β secretion without requirement of a second signal. Of note, enhanced inflammasome activity was associated with abnormal cell death responses ( 92 , 107 , 108 ). Overall, identification of causative mutations in all these three genes controlling activation of NLRP3 inflammasomes downstream of different immune signaling pathways exemplified the role of inflammasome activation and cell death regulation in IBD pathophysiology and intestinal homeostasis. The only available curative treatment option for VEO-IBD caused by XIAP deficiency is allogeneic HSCT demonstrating the urgency to find treatment alternatives ( 113 , 159 , 169 ). Similarly, there are no curative therapeutics available for RIPK1 or CASP8 deficiencies affecting both the immune system and intestinal epithelium. Since all three genetic defects are characterized by an increased inflammasome activity with higher IL-1β secretion, usage of therapies targeting inflammasomes and/or anti-IL-1R antibodies might represent an attractive approach for treatment. Interleukin-10 receptor IL-10R deficiency was the first identified monogenic cause for severe VEO-IBD accompanied by perianal disease and folliculitis, which can be only cured by allogeneic HSCT due to the underlying primary immunodeficiency ( 85 , 170 ). The IL-10 receptor is a heterotetrameric protein complex consisting of two IL-10R1 and IL-10R2 subunits, which are encoded by IL10RA and IL10RB ( 171 ). The corresponding ligand IL-10 is a highly potent anti-inflammatory cytokine controlling pleiotropic functions in the immune systems ( 171 – 175 ). Of note, IL-10-mediated signaling was also shown to inhibit NLRP3 inflammasome activation on a transcriptional and post-translational level ( 94 , 176 ). In line, IL-10-deficient mice showed increased NLRP3 inflammasome activation and IL-1β levels ( 94 , 95 , 177 ). Enhanced inflammasome activity manifested in mice prior to onset of colitis and the disease could be successfully treated by blockade of NLRP3 inflammasomes or IL-1β signaling demonstrating that symptoms of IL-10 deficiency are mediated by inflammasome perturbation ( 96 , 177 , 178 ). Analogously, cells from IL-10R-deficient patients showed increased and premature NLRP3 inflammasome activation as well as enhanced IL-1β secretion ( 94 – 96 ). Mechanistically, deficient IL-10 signaling was demonstrated to result in altered inflammasome activation by causing defective mitophagy ( 95 ). Interestingly, increased IL-1β production in human IL-10R-deficient macrophages can be also caused by alternative inflammasome activation, which is a CASP1-independent process mediated by CASP8 ( 94 ). Of note, IL-1β receptor blockade has been shown to ameliorate symptoms in IL-10R-deficient patients providing therapeutic windows for curative allogeneic HSCT ( 94 ). WAS The X-linked Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) presents with a life-threatening immunodeficiency characterized by thrombocytopenia and recurrent infections and is caused by mutations in the homonymous gene ( 179 – 181 ). Upon cellular activation, autoinhibition of Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASp) is resolved and WASp transfers G-actin to the Arp2/3 complex inducing actin filament formation and branching ( 181 – 184 ). Overall, WASp deficiency has been shown to disturb actin polymerization resulting in impaired chemotactic, migratory, phagocytic, and activation responses of immune cells and platelets ( 181 , 185 ). Of note, WAS patients can manifest with VEO-IBD and WASp deficiency was shown to cause experimental colitis in mice ( 110 , 186 , 187 ). In fact, intestinal inflammation in Was KO mice is driven by macrophages, which develop an inflammatory phenotype characterized by higher levels of pro-inflammatory IL-1β and IL-23 as well as reduced levels of anti-inflammatory IL-10 ( 110 ). Analogously, macrophages from WAS patients showed a pro-inflammatory phenotype with higher expression of IL-1β ( 110 ). Furthermore, WASp-deficient cells exhibited an increased NLRP3 inflammasome activity, which might be caused by defective clearance of pathogens due to failure of actin assembly around phagocytosed pathogens and defective autophagy ( 111 ). Correspondingly, enteropathogen infection of myeloid cells expressing mutant WASp has been shown to enhance ASC speck formation and pyroptosis, indicative of robust inflammasome activation in WASp deficiency ( 111 ). Increased inflammasome activation might contribute to autoinflammatory symptoms observed in WAS and might be a target to bridge WAS patients for HSCT, similar to IL-10R-deficiency ( 110 – 112 ). In fact, anti-IL-1R therapy was shown to ameliorate symptoms in one WASp-deficient patient ( 112 ). Interestingly, increased inflammasome activation in WASp-deficient cells could be also inhibited by treatment with type I IFNs representing another potential therapeutic option prior to HSCT ( 111 ). NADPH complex Chronic granulomatous disease (CGD) leads to increased susceptibility of recurrent bacterial and fungal infections and is caused by a defective function of the NADPH oxidase complex in innate immune cells ( 188 – 190 ). Interestingly, up to 40% of CGD patients develop intestinal inflammation reminiscent of IBD ( 191 , 192 ). The NADPH oxidase complex contains gp91-phox, p67-phox, p47-phox, and p22-phox subunits, which are encoded by the genes CYBB, NCF2, NCF1 , and CYBA , respectively ( 190 ). Of note, mutations in all four genes have been shown to cause defective production of ROS in innate immune cells resulting in impaired defense against pathogens ( 190 ). Production of ROS has been identified as a common intermediate step induced by different inflammasome activators (e.g., ATP, asbestos, silica) and inhibition of ROS generation has been shown to block NLRP3 inflammasome activation ( 5 , 193 , 194 ). Based on these findings defective ROS production might disturb inflammasome activity, however CGD patients show an inflammatory phenotype associated with increased IL-1β release upon TLR stimulation ( 78 , 93 ). As a potential mechanistic link, De Luca et al. demonstrated that peripheral blood-derived macrophages from NADPH oxidase-deficient mice and CGD patients exhibited defective autophagy resulting in increased IL-1β release ( 78 ). Correspondingly, treatment with Anakinra has been shown to enhance a rapid and sustained amelioration of colitis in CGD patients ( 78 ). Other immune defects associated with VEO-IBD and altered inflammasome activity Many inborn errors of immunity are known to present with VEO-IBD, which might be a consequence of the complex interplay between the microbial flora and the immune system at the intestinal barrier. For example, phosphatase and tensin homolog (PTEN) regulates phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling by dephosphorylating PI(3,4,5)P 3 and loss-of-function mutations in PTEN have been shown to cause autoimmunity or immunodeficiency associated with IBD ( 195 – 197 ). PTEN has been also shown to interact with NLRP3 and KO of PTEN resulted in reduced NLRP3 inflammasome activation after TLR stimulation ( 106 ). In detail, PTEN was shown to remove inhibitory phosphorylation from NLRP3 at position Y32, T193, and T195, which enables interaction of NLRP3 with ASC and subsequent oligomerization allowing enhanced inflammasome activation ( 106 ). Although data from mouse studies show inflammasome dysregulation in PTEN deficiency, a role of inflammasome activation in human patients with PTEN mutations remains to be demonstrated. The Bruton tyrosine kinase (BTK) is important for B cell receptor (BCR) signaling as well as B cell development and mutations in BTK are the most common cause for hypogammaglobulinemia ( 198 – 202 ). Besides its role for B cell development and function, BTK was also shown to interact with NLRP3 and modulate phosphorylation of NLRP3 in myeloid cells ( 90 , 91 , 203 ). Of note, Btk KO mice develop severe TNBS-induced colitis, which can be improved by IL-1β blockade indicating a central role of inflammasome activation in BTK-dependent colitis development ( 91 ). However, the consequence of BTK activity on human NLRP3 inflammasome activity remains controversial, as reports have shown either increased or decreased NLRP3 inflammasome activation in murine Btk KO cells and cells from patients with BTK deficiency ( 90 , 91 ). Signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) is a critical signaling molecule in interferon (IFN) responses and STAT1 deficiency causes Mendelian susceptibility to mycobacterial disease associated with severe infections ( 204 , 205 ). In addition, dominant gain-of-function mutations in STAT1 have been shown to cause a severe immune deficiency associated with polyendocrinopathy and enteropathy ( 206 ). Interestingly, STAT1 is also an essential mediator of type I IFN signaling, which can inhibit NLRP1 and NLRP3 inflammasomes ( 207 , 208 ). Correspondingly, alterations in STAT1 activity and subsequently changed type I IFN responses might predispose patients to dysregulated inflammasome activity upon challenge with pathogens, which still needs to be shown in IBD patients. Mutations in A disintegrin and metalloprotease 17 (ADAM17) can cause VEO-IBD associated with skin inflammation and susceptibility to gastrointestinal and skin infections ( 209 ). ADAM17 has been shown to cleave the pro-inflammatory cytokine TNF-α, which is produced as membrane-bound precursor after activation ( 210 – 212 ). In line, PBMCs from patients with ADAM17 deficiency produce reduced amounts of TNF-α upon LPS stimulation ( 209 ). TNF-α-mediated activation of NF-κB signaling has been shown to induce expression of NLRP3 inflammasome components (e.g., NLRP3, IL-1β, and IL-18) and modulate pyrin inflammasome activity ( 210 , 213 , 214 ). In line, targeting TNF-α in a mouse model of autoinflammation caused by NLRP3 mutations was shown to ameliorate symptoms ( 213 ). Thus, it is tempting to speculate that failure to produce mature TNF-α in ADAM17 deficiency might also result in disturbed inflammasome activation. Conclusion Several monogenic VEO-IBD defects have been linked to dysregulated inflammasome activity demonstrating the central role of inflammasomes in intestinal homeostasis. As perturbation of inflammasomes can be caused by various genetic entities, studies on monogenic VEO-IBD have highlighted that inflammasomes are controlled by complex regulatory networks and represent a critical common path of human intestinal inflammation. Therefore, targeting inflammasomes and regulatory molecules might be attractive strategies for the treatment of IBD patients. Further studies on the underlying mechanisms in monogenic IBD as disease model will shed light on inflammasome biology and help to identify potential therapeutic targets for rare and common IBD. Author contributions DI and DK wrote the manuscript and prepared the figures. All authors contributed to the article and approved the submitted version. Funding This work has been supported by the Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, DFG (Heinz Maier-Leibnitz-Preis, Collaborative Research Consortium SFB1054 project A05), Else Kröner-Fresenius-Stiftung, Helmholtz Association/Helmholtz Munich (Helmholtz Young Investigator Group), and Care-for-Rare Foundation. Conflict of interest The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest. Publisher's note All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7879871/

An unusual case of spontaneous pneumomediastinum secondary to tracheal tear in a trumpeter

INTRODUCTION Music brings happiness to people but it can be hazardous to those playing the music instrument. Playing musical instruments are associated with variety of health hazards such as hypersensitivity pneumonitis, anthrax, tuberculosis, asthma, inguinal hernia, and laryngocele.[ 1 2 ] Herein, we describe a rare case of spontaneous pneumomediastinum due to tracheal tear in a trumpeter. Spontaneous pneumomediastinum can be defined as presence of free air from the airways or the lung parenchyma in the mediastinum without any apparent antecedent cause.[ 1 2 3 ] It excludes cases with definite cause such as infections, thoracic trauma, hollow organ perforation, and iatrogenic injuries.[ 3 ] It was first described by Louis Hamman in 1939, hence, it is also called as Hamman's syndrome. It is a rare condition generally affecting young adults.[ 1 4 ] The most common clinical presentation is chest pain, dyspnea, and subcutaneous emphysema.[ 1 5 ] There are only a few published case reports of pneumomediastinum but tracheal tear due to trumpet blowing has not been reported as an etiology to the best of our knowledge and this might be the first case report of pneumomediastinum secondary to tracheal tear in a trumpeter. CASE REPORT A 28-year-old reformed smoker, trumpeter by profession presented with complaints of acute onset chest pain and breathlessness of 1-year duration. The chest pain was central in location with no radiation. He gave a history of worsening of symptoms on blowing trumpet and on exertional activities. His general physical examination was within normal limits and on auscultation there was vesicular breath sounds bilaterally and Hamman's crunch was not heard. His chest radiograph was normal and computed tomography (CT) of chest showed focal irregularity and loss of integrity of the right posterolateral wall of the trachea at DV1 level, at about 6.3 cm proximal to level of carina. There was also subcentimetric air attenuating pockets seen outside the lumen of trachea [ Figure 1 ]. He underwent fiber-optic bronchoscopy which confirmed the lesion [ Figure 2 ]. He was managed conservatively. Figure 1 High-resolution computed tomography of chest showing (a) defect in the trachea and (b) air in the mediastinum (pneumomediastinum) Figure 2 Bronchoscopy picture of the trachea showing defect in the lumen DISCUSSION Spontaneous pneumomediastinum was first described by Louis Hamman in 1939. The incidence of pneumomediastinum has not been clearly established mainly because there are few case series and case reports. The entity is also underestimated especially when there is low index of suspicion as the clinical signs and symptoms are not specific and radiographic signs are not easy to identify.[ 1 5 6 7 ] It generally affects young adult males with mean age of 20 years. The cause of pneumomediastinum can be described by these mechanisms: (a) infection of mediastinum with gas forming organisms, (b) perforation of the esophagus or tracheobronchial tree causing break in cutaneous or mucosal barrier leading to air entry into the mediastinum, and (c) alveolar rupture due to the presence of a decreasing pressure gradient between the alveoli and the lung interstitium.[ 1 3 5 7 ] The incidence of spontaneous pneumomediastinum in trumpeter has been rarely reported in literatures. One of the studies reported increased maximal respiratory pressure in young people who played wind instruments.[ 2 8 ] These individuals have increased chances of mechanical injury to oropharyngeal tissue due to increased expiratory pressures. In a study by Bouhuys reported that the average expiratory pressure was highest in trumpeter (150 cm H 2 0) as compared to people playing flute (50 cm H 2 0 and Oboe (25 H 2 0).[ 9 ] The predisposing condition includes bronchial asthma, coughing, sneezing, and corticosteroids.[ 1 4 6 ] The usual presenting symptoms include acute onset, centrally located chest pain radiating to neck and shoulders, dyspnea, odynophagia, and cough. The clinical findings include subcutaneous emphysema and Hamman's sign which is considered pathognomonic of pneumomediastinum is characterized by crackling sound on auscultation which is synchronous with the heartbeat.[ 1 4 5 7 8 ] The diagnostic test includes chest radiograph and CT of chest. The finding includes: A radiolucent band (hyperlucency) in the retrosternal area (on lateral view), a band of hyperlucency parallel to the left side of the cardiac silhouette with a fine radiopaque line indicating the elevated mediastinal pleura, radiolucent lines in the mediastinum extending toward the neck; and air surrounding mediastinal structures such as the aorta, trachea, esophagus, or thymus gland. The chest CT scan is considered the gold standard of imaging tests, capable of detecting pneumomediastinum even in patients with small amounts of mediastinal air.[ 1 2 4 5 10 ] The defect in the trachea-bronchial tree can be confirmed by bronchoscopy. The treatment of spontaneous pneumomediastinum is generally conservative. The course of disease is generally self-limiting and there is no significant complications.[ 1 4 5 11 ] CONCLUSION We conclude that spontaneous pneumothorax is a rare entity and it presenting secondary to tracheal tear in a trumpeter has not been reported earlier. It can be diagnosed on the basis of clinical and radiological findings. The treatment is mainly conservative. Declaration of patient consent The authors certify that they have obtained all appropriate patient consent forms. In the form the patient(s) has/have given his/her/their consent for his/her/their images and other clinical information to be reported in the journal. The patients understand that their names and initials will not be published and due efforts will be made to conceal their identity, but anonymity cannot be guaranteed. Financial support and sponsorship Nil. Conflicts of interest There are no conflicts of interest. Declaration of patient consent The authors certify that they have obtained all appropriate patient consent forms. In the form the patient(s) has/have given his/her/their consent for his/her/their images and other clinical information to be reported in the journal. The patients understand that their names and initials will not be published and due efforts will be made to conceal their identity, but anonymity cannot be guaranteed. Financial support and sponsorship Nil. Conflicts of interest There are no conflicts of interest.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3595258/

Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging

In vivo bioluminescent imaging permits the visualization of bacteria in live animals, allowing researchers to monitor, both temporally and spatially, the progression of infection in each animal. We sought to engineer stably luminescent clinical strains of Staphylococcus aureus , with the goal of using such strains in mouse models. The gram-positive shuttle vector pMAD was used as the backbone for an integration plasmid. A chloramphenicol resistance gene, a modified lux operon from Photorhabdus luminescens , and approximately 650 bp of homology to the chromosome of the USA300 S. aureus strain NRS384 were added, generating plasmid pRP1195. Electroporation into strain RN4220 followed by temperature shift led to integration of pRP1195 into the chromosome. The integrated plasmid was transferred to clinical strains by phage transduction. Luminescent strains displayed no in vitro growth defects. Moreover, luminescence was stable in vitro after three rounds of subculture over 48 hours of growth in the absence of antibiotics. Mice were infected with a luminescent strain of NRS384 in skin and intravenous models. In a mouse skin model, luminescent bacteria were present in lesions that formed and cleared over the course of several days, and in an intravenous model, bacteria inoculated in the mouse tail vein were observed spreading to multiple tissues. No statistically significant difference in virulence was observed between NRS384 and the luminescent strain in either infection model. These preliminary data suggest that this luminescent USA300 strain is suitable for use in mouse models. Similar strains were engineered using other sequenced clinical strains. Because these strains are stably luminescent, they should prove useful in animal models of infection. Introduction Staphylococcus aureus is responsible for a variety of illnesses, including skin and soft tissue infections, pneumonia, septic arthritis, endocarditis, and osteomyelitis. The incidence of infections with antibiotic-resistant strains is increasing, with community-acquired methicillin-resistant S. aureus (CA-MRSA) becoming a particular concern (reviewed in [1] ). Studies of these infections using animal models are facilitated by the use of bioluminescent imaging (BLI), which allows tracking of the spatial progression of infection in individual animals over time. For use in BLI, bacterial strains should be clinically relevant and brightly and stably luminescent. Although there are several reports using luminescent S. aureus strains in vivo [2] , [3] , [4] , [5] , [6] , the strains used are often not stably luminescent. One issue is that if the genes required for luminescence are carried on a plasmid, then the signal may be lost in vivo in the absence of antibiotic selection, due to plasmid segregation. Moreover, in some of these reports, the strains used in BLI were luminescent versions of laboratory-passaged strains, which may not be clinically relevant to current human diseases. In this report, we describe an integrative plasmid developed to engineer stably and brightly luminescent clinical strains of S. aureus . In preliminary experiments, we used one of these strains, a luminescent version of the USA300 MRSA strain NRS384, in two mouse models of infection. We found that the luminescent strain was as virulent as the wild-type strain, and that progression of the infections could be followed easily over time using BLI. The integrative plasmid and the luminescent clinical strains described here should prove useful in these and other animal models of S. aureus infection. Materials and Methods Bacterial strains and plasmids Bacterial strains and plasmids are listed in Table 1 . The backbone for the integrative plasmid was the shuttle plasmid pMAD [7] . The kanamycin resistance gene aphA(3) , originally from S. aureus [8] , was amplified from pSS4332 [9] and inserted at the BglII site of pMAD, yielding plasmid pRP1179. Approximately 660 bp in the area of USA300HOU_1102 (annotated as a pseudogene in the sequenced USA300 strain TCH1516 [10] ) was amplified from the S. aureus USA300 strain NRS384 and inserted into BamHI/SalI-digested pRP1179, generating pRP1186. Next, a modified luxBADCE operon, originally from Photorhabdus luminescens [11] , was amplified from a derivative of pSS4530 [12] such that the operon was under the control of a modified gapA promoter with consensus -35, extended -10, and -10 regions ( TTGACA CTGCGTAAGGTTTG TG T TATAAT ) and inserted at the EagI site of pRP1186, yielding pRP1190. Separately, the chloramphenicol resistance gene cat (originally from pC194 [13] ) was amplified from pBT2 [14] , digested with KpnI, and inserted into similarly digested pMAD, generating plasmid pRP1192. Finally, a 6.8 kb BamHI-SalI fragment of pRP1190 (including the USA300HOU_1102 homology and the lux operon) was ligated with similarly digested pRP1192, generating pRP1195 ( Fig. 1 ). Thus, pRP1190 (with aphA(3) ) is suitable for use in S. aureus strains that are kanamycin-sensitive, whereas pRP1195 (with cat ) is suitable for use in strains that are chloramphenicol-sensitive. Plasmids were transformed into RN4220 by electroporation as previously described [15] followed by growth at 30°C. For integration into the bacterial chromosome, strains were grown at 30°C overnight in tryptic soy broth (TSB) with 10 µg/ml chloramphenicol, followed by subculture (1∶100 dilution) in TSB without antibiotics at 30°C for 1–2 h, shift to 43°C for 6–7 h, serial dilution, plating on tryptic soy agar (TSA) with 10 µg/ml chloramphenicol, and overnight incubation at 43°C. Plates were imaged, and luminescent colonies were selected for further passage and analysis. Integration at the intended site was confirmed by PCR. Freely replicating or integrated plasmids were transferred to clinical strains by phi80 phage transduction as previously described [16] . 10.1371/journal.pone.0059232.g001 Figure 1 Map of integrative plasmid pRP1195. Features added to the pMAD backbone as described in Materials and Methods include: cm , chloramphenicol resistance gene; homology, PCR fragment in the area of pseudogene USA300_HOU1102 amplified from NRS384; LuxB, A, D, C, and E, modified lux operon from Photorhabdus luminescens . 10.1371/journal.pone.0059232.t001 Table 1 Plasmids and strains used in this work. Plasmid/strain Description/features Source/reference Plasmids pMAD S. aureus shuttle vector [7] pSS4530 modified luxBADCE operon [11] , [12] pSS4332 source of kanamycin resistance gene aphA(3) [8] , [9] pBT2 source of chloramphenicol resistance gene cat [13] , [14] pRP1179 pMAD with aphA(3) from pSS4332 This work pRP1186 pRP1179 with homology to USA300HOU_1102 This work pRP1190 pRP1186 with luxBADCE from pSS4530, under control of modified gapA promoter This work pRP1192 pMAD with cat from pBT2 This work pRP1195 pRP1192 with luxBADCE and homology to USA300HOU_1102 from pRP1190 This work S. aureus RN4220 Restriction-deficient laboratory strain [18] NRS384 USA300-0114 CA-MRSA NARSA collection MW2 CA-MRSA [19] , [20] Newman Methicillin-sensitive [21] , [22] SAP140 RN4220 with freely replicating pRP1195 This work SAP143 RN4220 with pRP1195 integrated at USA300HOU_1102 (temperature shift of SAP140) This work SAP149 NRS384 with integrated pRP1195 via transduction from SAP143 This work SAP224 NRS384 with freely replicating pRP1195 via transduction from SAP140 This work SAP231 NRS384 with integrated pRP1195 (temperature shift of SAP224) This work SAP221 MW2 with freely replicating pRP1195 via transduction from SAP140 This work SAP227 MW2 with integrated pRP1195 (temperature shift of SAP221) This work SAP217 Newman with freely replicating pRP1195 via transduction from SAP140 This work SAP229 Newman with integrated pRP1195 (temperature shift of SAP217) This work In vitro growth and luminescence To assess the kinetics of growth in vitro , strains were grown overnight in TSB and subcultured at a dilution of 1∶100, and OD 600 readings were taken at regular intervals. To assess the stability of luminescence following extended in vitro growth, strains were grown in TSB and subcultured three times (at 16, 24, and 40 h) in the absence of antibiotics, and after 48 h, serial dilutions were plated on TSA and incubated at 37°C. Mouse infections Animal studies were conducted at the animal facility of the Center for Biologics Evaluation and Research, under the guidelines of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), which approved the animal protocols used. All efforts were undertaken to minimize animal suffering. For a skin and soft tissue model of infection, TSB without (NRS384) or with (SAP149) 10 µg/ml chloramphenicol was inoculated at a dilution of 1∶50 with an overnight culture, incubated at 37°C with shaking, grown to an OD 600 of approximately 0.8, and then centrifuged at 4000× g for 15 min. The pellet was resuspended in PBS, and bacteria were counted using a hemocytometer and diluted in PBS to a concentration of 1.0×10 11 cells/ml. The bacterial count was confirmed by serial dilution and plating of the suspension. BALB/c mice were anesthetized intraperitoneally with 2 mg ketamine (Ketaject, Phoenix Pharmaceutical, St. Joseph, MO) and 0.1 mg xylazine (AnaSed, Akorn, Decatur, IL). Left ears were swabbed with 70% isopropanol, and a Morrow Brown needle (Morrow Brown Allergy Diagnostics, Oakhurst, NJ) was used to administer 1.0×10 9 CFU to the left ear of each mouse. The mean delivered dose was found to be approximately 2.0×10 7 CFU/lesion with a standard deviation of 1.0×10 7 CFU/lesion. Mice were euthanized on days 1, 4, and 7 following infection, and the left ears were cleansed with 70% ethanol. Ear pinnae were removed using sterile scissors and homogenized in 500 μl of PBS with a Polytron PT 1200 handheld homogenizer (Kinematica, Bohemia, NY). Serial dilutions were plated on TSA and incubated overnight at 37°C, and CFU per ml of homogenate was calculated. For an intravenous model, TSB without (NRS384) or with (SAP149) 10 µg/ml chloramphenicol was inoculated at a dilution of 1∶100 with an overnight culture, incubated at 37°C with shaking, and grown to an OD 600 of approximately 0.63. This absorbance reading was found to correspond to approximately 3.66×10 8 CFU/ml (data not shown). The culture was centrifuged at 4000× g for 10 min, and the pellet was resuspended in PBS. BALB/c mice were injected via the tail vein with 2×10 7 CFU of NRS384 or SAP149 in a volume of 100 µl. The dose was verified by serial dilution and plating on TSA. Over the course of 21 days, moribund mice were euthanized according to an IACUC-approved protocol. Imaging, image processing, and statistical analyses To follow the progression of the infection, mice were imaged with an IVIS-50 instrument (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) as previously described [12] . Agar plates were imaged with an LAS-3000 imaging system (Fujifilm Medical Systems, Stamford, CT). Typical settings for assessing luminescence were f/0.85, 1 min, no filter. Images were adjusted for brightness and contrast using PhotoShop CS3 (Adobe Systems, San Jose, CA). Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA) was used for statistical analyses. Bacterial strains and plasmids Bacterial strains and plasmids are listed in Table 1 . The backbone for the integrative plasmid was the shuttle plasmid pMAD [7] . The kanamycin resistance gene aphA(3) , originally from S. aureus [8] , was amplified from pSS4332 [9] and inserted at the BglII site of pMAD, yielding plasmid pRP1179. Approximately 660 bp in the area of USA300HOU_1102 (annotated as a pseudogene in the sequenced USA300 strain TCH1516 [10] ) was amplified from the S. aureus USA300 strain NRS384 and inserted into BamHI/SalI-digested pRP1179, generating pRP1186. Next, a modified luxBADCE operon, originally from Photorhabdus luminescens [11] , was amplified from a derivative of pSS4530 [12] such that the operon was under the control of a modified gapA promoter with consensus -35, extended -10, and -10 regions ( TTGACA CTGCGTAAGGTTTG TG T TATAAT ) and inserted at the EagI site of pRP1186, yielding pRP1190. Separately, the chloramphenicol resistance gene cat (originally from pC194 [13] ) was amplified from pBT2 [14] , digested with KpnI, and inserted into similarly digested pMAD, generating plasmid pRP1192. Finally, a 6.8 kb BamHI-SalI fragment of pRP1190 (including the USA300HOU_1102 homology and the lux operon) was ligated with similarly digested pRP1192, generating pRP1195 ( Fig. 1 ). Thus, pRP1190 (with aphA(3) ) is suitable for use in S. aureus strains that are kanamycin-sensitive, whereas pRP1195 (with cat ) is suitable for use in strains that are chloramphenicol-sensitive. Plasmids were transformed into RN4220 by electroporation as previously described [15] followed by growth at 30°C. For integration into the bacterial chromosome, strains were grown at 30°C overnight in tryptic soy broth (TSB) with 10 µg/ml chloramphenicol, followed by subculture (1∶100 dilution) in TSB without antibiotics at 30°C for 1–2 h, shift to 43°C for 6–7 h, serial dilution, plating on tryptic soy agar (TSA) with 10 µg/ml chloramphenicol, and overnight incubation at 43°C. Plates were imaged, and luminescent colonies were selected for further passage and analysis. Integration at the intended site was confirmed by PCR. Freely replicating or integrated plasmids were transferred to clinical strains by phi80 phage transduction as previously described [16] . 10.1371/journal.pone.0059232.g001 Figure 1 Map of integrative plasmid pRP1195. Features added to the pMAD backbone as described in Materials and Methods include: cm , chloramphenicol resistance gene; homology, PCR fragment in the area of pseudogene USA300_HOU1102 amplified from NRS384; LuxB, A, D, C, and E, modified lux operon from Photorhabdus luminescens . 10.1371/journal.pone.0059232.t001 Table 1 Plasmids and strains used in this work. Plasmid/strain Description/features Source/reference Plasmids pMAD S. aureus shuttle vector [7] pSS4530 modified luxBADCE operon [11] , [12] pSS4332 source of kanamycin resistance gene aphA(3) [8] , [9] pBT2 source of chloramphenicol resistance gene cat [13] , [14] pRP1179 pMAD with aphA(3) from pSS4332 This work pRP1186 pRP1179 with homology to USA300HOU_1102 This work pRP1190 pRP1186 with luxBADCE from pSS4530, under control of modified gapA promoter This work pRP1192 pMAD with cat from pBT2 This work pRP1195 pRP1192 with luxBADCE and homology to USA300HOU_1102 from pRP1190 This work S. aureus RN4220 Restriction-deficient laboratory strain [18] NRS384 USA300-0114 CA-MRSA NARSA collection MW2 CA-MRSA [19] , [20] Newman Methicillin-sensitive [21] , [22] SAP140 RN4220 with freely replicating pRP1195 This work SAP143 RN4220 with pRP1195 integrated at USA300HOU_1102 (temperature shift of SAP140) This work SAP149 NRS384 with integrated pRP1195 via transduction from SAP143 This work SAP224 NRS384 with freely replicating pRP1195 via transduction from SAP140 This work SAP231 NRS384 with integrated pRP1195 (temperature shift of SAP224) This work SAP221 MW2 with freely replicating pRP1195 via transduction from SAP140 This work SAP227 MW2 with integrated pRP1195 (temperature shift of SAP221) This work SAP217 Newman with freely replicating pRP1195 via transduction from SAP140 This work SAP229 Newman with integrated pRP1195 (temperature shift of SAP217) This work In vitro growth and luminescence To assess the kinetics of growth in vitro , strains were grown overnight in TSB and subcultured at a dilution of 1∶100, and OD 600 readings were taken at regular intervals. To assess the stability of luminescence following extended in vitro growth, strains were grown in TSB and subcultured three times (at 16, 24, and 40 h) in the absence of antibiotics, and after 48 h, serial dilutions were plated on TSA and incubated at 37°C. Mouse infections Animal studies were conducted at the animal facility of the Center for Biologics Evaluation and Research, under the guidelines of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), which approved the animal protocols used. All efforts were undertaken to minimize animal suffering. For a skin and soft tissue model of infection, TSB without (NRS384) or with (SAP149) 10 µg/ml chloramphenicol was inoculated at a dilution of 1∶50 with an overnight culture, incubated at 37°C with shaking, grown to an OD 600 of approximately 0.8, and then centrifuged at 4000× g for 15 min. The pellet was resuspended in PBS, and bacteria were counted using a hemocytometer and diluted in PBS to a concentration of 1.0×10 11 cells/ml. The bacterial count was confirmed by serial dilution and plating of the suspension. BALB/c mice were anesthetized intraperitoneally with 2 mg ketamine (Ketaject, Phoenix Pharmaceutical, St. Joseph, MO) and 0.1 mg xylazine (AnaSed, Akorn, Decatur, IL). Left ears were swabbed with 70% isopropanol, and a Morrow Brown needle (Morrow Brown Allergy Diagnostics, Oakhurst, NJ) was used to administer 1.0×10 9 CFU to the left ear of each mouse. The mean delivered dose was found to be approximately 2.0×10 7 CFU/lesion with a standard deviation of 1.0×10 7 CFU/lesion. Mice were euthanized on days 1, 4, and 7 following infection, and the left ears were cleansed with 70% ethanol. Ear pinnae were removed using sterile scissors and homogenized in 500 μl of PBS with a Polytron PT 1200 handheld homogenizer (Kinematica, Bohemia, NY). Serial dilutions were plated on TSA and incubated overnight at 37°C, and CFU per ml of homogenate was calculated. For an intravenous model, TSB without (NRS384) or with (SAP149) 10 µg/ml chloramphenicol was inoculated at a dilution of 1∶100 with an overnight culture, incubated at 37°C with shaking, and grown to an OD 600 of approximately 0.63. This absorbance reading was found to correspond to approximately 3.66×10 8 CFU/ml (data not shown). The culture was centrifuged at 4000× g for 10 min, and the pellet was resuspended in PBS. BALB/c mice were injected via the tail vein with 2×10 7 CFU of NRS384 or SAP149 in a volume of 100 µl. The dose was verified by serial dilution and plating on TSA. Over the course of 21 days, moribund mice were euthanized according to an IACUC-approved protocol. Imaging, image processing, and statistical analyses To follow the progression of the infection, mice were imaged with an IVIS-50 instrument (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) as previously described [12] . Agar plates were imaged with an LAS-3000 imaging system (Fujifilm Medical Systems, Stamford, CT). Typical settings for assessing luminescence were f/0.85, 1 min, no filter. Images were adjusted for brightness and contrast using PhotoShop CS3 (Adobe Systems, San Jose, CA). Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA) was used for statistical analyses. Results Development and integration of a luminescence plasmid In order to engineer strains of S. aureus that would be stably luminescent, we sought to integrate a plasmid into the bacterial chromosome. The shuttle plasmid pMAD [7] , which contains a temperature-sensitive replication module, was used as the backbone. Because some clinical strains already carry erythromycin resistance, a gene encoding resistance to chloramphenicol [13] was added. In a search for potential integration sites, we considered pseudogenes in the chromosome of the sequenced USA300 strain TCH1516 [10] (Accession NC_010079.1). We selected pseudogene USA300HOU_1102 (Gene ID: 5776586) as the site for integration, for the following reasons: 1) it is a pseudogene in several sequenced strains, decreasing the likelihood that insertion at that site would affect fitness or virulence; 2) flanking genes are encoded "toward" it, decreasing the likelihood of polar effects; and 3) the region is 98–100% conserved in 32 sequenced S. aureus strains, including strains commonly used in research (e.g., MW2, Newman, COL, and N315), enabling the use of homology cloned from one strain for integration of the plasmid into the chromosomes of multiple strains. A 662-bp PCR fragment in the area of pseudogene USA300HOU_1102 (coordinates 1171718-1172379) was amplified from the USA300 strain NRS384 and inserted into the plasmid, to permit integration of the plasmid into the bacterial chromosome via homologous recombination. Lastly, a modified lux operon originally from Photorhabdus luminescens [11] , [12] was added, under the control of a strong constitutive promoter, leading to the development of the integrative plasmid pRP1195 ( Fig. 1 ). The plasmid was transformed by electroporation into the restriction-deficient laboratory strain RN4220, and chromosomal integrants were selected by temperature shift in the presence of chloramphenicol. Phage phi80 was used to transduce the integrated plasmid into the strains NRS384, MW2, and Newman. In later experiments, freely replicating plasmid pRP1195 was transduced into the clinical strains and then integrated into the chromosomes of those strains by temperature shift in the presence of chloramphenicol. The site of integration was confirmed by PCR ( Fig. 2 ) and sequencing. 10.1371/journal.pone.0059232.g002 Figure 2 PCR analysis of plasmid integration. Primers specific for pRP1195 and chromosomal sequences were used in PCR reactions with chromosomal DNA from SAP231 (integrant) and NRS384 (WT) as templates. Primers used were: C1, ( GCATGCCATTTTCTTTATCATAAGTG ); C2, ( CAGTTATGGTGGTCTTATAGAGAGAC ); P1, ( CAGTCAGAGGAGCGCCGACAACACC ); P2, ( TTTCGTTTGTTGAACTAATGGGTGC ). Molecular weight in kilobases is indicated on the left. Evaluation of luminescent strains in vitro The luminescent strains exhibited similar growth kinetics in vitro , relative to each other and to the parental strains ( Fig. 3A ). In order to assess the stability of the luminescence, the strains were grown in broth culture and subcultured three times over the course of 48 h in the absence of antibiotics, and serial dilutions were plated. All colonies were found to be luminescent ( Fig. 3B ), confirming the stability of the integrated plasmid in vitro . 10.1371/journal.pone.0059232.g003 Figure 3 Analysis of in vitro growth. A) In vitro growth curves. Strains were grown overnight in TSB with (luminescent strains) or without (parental strains) 10 µg/ml chloramphenicol and subcultured at a dilution of 1∶100 in TSB without antibiotic. MW2-Lux, SAP227; Newman-Lux, SAP229; NRS384-Lux, SAP231. B) Luminescence after in vitro outgrowth. SAP231 was grown in TSB and subcultured three times over the course of 48 h. Serial dilutions were plated on TSA in the absence of antibiotics, and plates were imaged as described in Materials and Methods . Animal infections In an intravenous model, mice were injected via the tail vein with the wild-type USA300 strain (NRS384) or with the luminescent derivative (SAP149). When mice infected with the luminescent strain were imaged over the course of 6d, luminescent bacteria were apparent by day 1 and were observed to have spread throughout the body of each animal ( Fig. 4A ). Mice injected with either strain succumbed to the infection, with time of death varying from 1 to 21 days ( Fig. 4B ). There was no statistically significant difference between the survival curves of mice infected with each strain. 10.1371/journal.pone.0059232.g004 Figure 4 BALB/c intravenous infection with wild-type or luminescent NRS384. In an intravenous model, mice were injected via the tail vein with either the wild-type USA300 strain (NRS384) or the luminescent strain (SAP149). Mice injected with the luminescent strain were imaged over the course of 6d (A); images are representative. There was no statistically significant difference in survival of mice injected with the two strains (B) by either the log-rank (Mantel-Cox) Test ( P = 0.46) or the Gehan-Breslow-Wilcoxon Test ( P = 0.68); n = 20 mice per group. In a skin and soft tissue model of infection, wild-type or luminescent bacteria were transferred to a Morrow-Brown needle and inoculated onto the left ear of mice. Mice infected with the luminescent strain SAP149 were imaged over the course of several days ( Fig. 5A ). Luminescence was apparent on day 1 following infection, increased over the course of 3–5 days, and then began to wane. By day 7, the infection had nearly cleared, as evidenced by the reduction in luminescence and confirmed by bacterial counts ( Fig. 5B ). There was no statistically significant difference in CFU per ml of ear pinna homogenate between mice infected with the luminescent strain and those infected with the wild-type USA300 strain, suggesting that integration of the plasmid into the bacterial chromosome did not affect virulence. 10.1371/journal.pone.0059232.g005 Figure 5 BALB/c skin and soft tissue infection with wild-type or luminescent NRS384. In a skin and soft tissue model (SSTI), mice were inoculated in the left ear with NRS384 or SAP149. Mice inoculated with SAP149 were imaged over the course of several days (A); images are representative. On days 1, 4, and 7 post infection, mice were euthanized and ear pinna homogenates were serially diluted and plated (B). There was no statistically significant difference in CFU recovered per ml of homogenate between mice infected with each strain (two-tailed t-test; P = 0.55; bars represent 95% confidence interval; n = 8 mice per group). Development and integration of a luminescence plasmid In order to engineer strains of S. aureus that would be stably luminescent, we sought to integrate a plasmid into the bacterial chromosome. The shuttle plasmid pMAD [7] , which contains a temperature-sensitive replication module, was used as the backbone. Because some clinical strains already carry erythromycin resistance, a gene encoding resistance to chloramphenicol [13] was added. In a search for potential integration sites, we considered pseudogenes in the chromosome of the sequenced USA300 strain TCH1516 [10] (Accession NC_010079.1). We selected pseudogene USA300HOU_1102 (Gene ID: 5776586) as the site for integration, for the following reasons: 1) it is a pseudogene in several sequenced strains, decreasing the likelihood that insertion at that site would affect fitness or virulence; 2) flanking genes are encoded "toward" it, decreasing the likelihood of polar effects; and 3) the region is 98–100% conserved in 32 sequenced S. aureus strains, including strains commonly used in research (e.g., MW2, Newman, COL, and N315), enabling the use of homology cloned from one strain for integration of the plasmid into the chromosomes of multiple strains. A 662-bp PCR fragment in the area of pseudogene USA300HOU_1102 (coordinates 1171718-1172379) was amplified from the USA300 strain NRS384 and inserted into the plasmid, to permit integration of the plasmid into the bacterial chromosome via homologous recombination. Lastly, a modified lux operon originally from Photorhabdus luminescens [11] , [12] was added, under the control of a strong constitutive promoter, leading to the development of the integrative plasmid pRP1195 ( Fig. 1 ). The plasmid was transformed by electroporation into the restriction-deficient laboratory strain RN4220, and chromosomal integrants were selected by temperature shift in the presence of chloramphenicol. Phage phi80 was used to transduce the integrated plasmid into the strains NRS384, MW2, and Newman. In later experiments, freely replicating plasmid pRP1195 was transduced into the clinical strains and then integrated into the chromosomes of those strains by temperature shift in the presence of chloramphenicol. The site of integration was confirmed by PCR ( Fig. 2 ) and sequencing. 10.1371/journal.pone.0059232.g002 Figure 2 PCR analysis of plasmid integration. Primers specific for pRP1195 and chromosomal sequences were used in PCR reactions with chromosomal DNA from SAP231 (integrant) and NRS384 (WT) as templates. Primers used were: C1, ( GCATGCCATTTTCTTTATCATAAGTG ); C2, ( CAGTTATGGTGGTCTTATAGAGAGAC ); P1, ( CAGTCAGAGGAGCGCCGACAACACC ); P2, ( TTTCGTTTGTTGAACTAATGGGTGC ). Molecular weight in kilobases is indicated on the left. Evaluation of luminescent strains in vitro The luminescent strains exhibited similar growth kinetics in vitro , relative to each other and to the parental strains ( Fig. 3A ). In order to assess the stability of the luminescence, the strains were grown in broth culture and subcultured three times over the course of 48 h in the absence of antibiotics, and serial dilutions were plated. All colonies were found to be luminescent ( Fig. 3B ), confirming the stability of the integrated plasmid in vitro . 10.1371/journal.pone.0059232.g003 Figure 3 Analysis of in vitro growth. A) In vitro growth curves. Strains were grown overnight in TSB with (luminescent strains) or without (parental strains) 10 µg/ml chloramphenicol and subcultured at a dilution of 1∶100 in TSB without antibiotic. MW2-Lux, SAP227; Newman-Lux, SAP229; NRS384-Lux, SAP231. B) Luminescence after in vitro outgrowth. SAP231 was grown in TSB and subcultured three times over the course of 48 h. Serial dilutions were plated on TSA in the absence of antibiotics, and plates were imaged as described in Materials and Methods . Animal infections In an intravenous model, mice were injected via the tail vein with the wild-type USA300 strain (NRS384) or with the luminescent derivative (SAP149). When mice infected with the luminescent strain were imaged over the course of 6d, luminescent bacteria were apparent by day 1 and were observed to have spread throughout the body of each animal ( Fig. 4A ). Mice injected with either strain succumbed to the infection, with time of death varying from 1 to 21 days ( Fig. 4B ). There was no statistically significant difference between the survival curves of mice infected with each strain. 10.1371/journal.pone.0059232.g004 Figure 4 BALB/c intravenous infection with wild-type or luminescent NRS384. In an intravenous model, mice were injected via the tail vein with either the wild-type USA300 strain (NRS384) or the luminescent strain (SAP149). Mice injected with the luminescent strain were imaged over the course of 6d (A); images are representative. There was no statistically significant difference in survival of mice injected with the two strains (B) by either the log-rank (Mantel-Cox) Test ( P = 0.46) or the Gehan-Breslow-Wilcoxon Test ( P = 0.68); n = 20 mice per group. In a skin and soft tissue model of infection, wild-type or luminescent bacteria were transferred to a Morrow-Brown needle and inoculated onto the left ear of mice. Mice infected with the luminescent strain SAP149 were imaged over the course of several days ( Fig. 5A ). Luminescence was apparent on day 1 following infection, increased over the course of 3–5 days, and then began to wane. By day 7, the infection had nearly cleared, as evidenced by the reduction in luminescence and confirmed by bacterial counts ( Fig. 5B ). There was no statistically significant difference in CFU per ml of ear pinna homogenate between mice infected with the luminescent strain and those infected with the wild-type USA300 strain, suggesting that integration of the plasmid into the bacterial chromosome did not affect virulence. 10.1371/journal.pone.0059232.g005 Figure 5 BALB/c skin and soft tissue infection with wild-type or luminescent NRS384. In a skin and soft tissue model (SSTI), mice were inoculated in the left ear with NRS384 or SAP149. Mice inoculated with SAP149 were imaged over the course of several days (A); images are representative. On days 1, 4, and 7 post infection, mice were euthanized and ear pinna homogenates were serially diluted and plated (B). There was no statistically significant difference in CFU recovered per ml of homogenate between mice infected with each strain (two-tailed t-test; P = 0.55; bars represent 95% confidence interval; n = 8 mice per group). Conclusions In a previous study, we found that Bacillus anthracis engineered to be luminescent via integration of a plasmid by homologous recombination is very stably luminescent, even in the absence of antibiotic selection [12] . In the present work, we used a similar approach to engineer luminescent S. aureus strains and found comparable stability. Our initial methods included integration of pRP1195 into RN4220, followed by transduction of the integrated plasmid into the strains NRS384 (USA300), MW2, and Newman. Because phage phi80 can package up to 42 kb of DNA [17] , such an approach is less than ideal, as RN4220-specific DNA sequences could potentially be transferred to the target strain. To avoid such a possibility, we subsequently engineered additional luminescent strains by transducing the freely replicating plasmid from RN4220 to the target strains, shifting to the non-permissive temperature for plasmid replication, and isolating integrants. These strains should differ from the parent strains only in the presence of the integrated plasmid and should therefore prove useful in studies of S. aureus pathogenesis.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1890507/

Density-equalizing Euclidean minimum spanning trees for the detection of all disease cluster shapes

Existing disease cluster detection methods cannot detect clusters of all shapes and sizes or identify highly irregular sets that overestimate the true extent of the cluster. We introduce a graph-theoretical method for detecting arbitrarily shaped clusters based on the Euclidean minimum spanning tree of cartogram-transformed case locations, which overcomes these shortcomings. The method is illustrated by using several clusters, including historical data sets from West Nile virus and inhalational anthrax outbreaks. Sensitivity and accuracy comparisons with the prevailing cluster detection method show that the method performs similarly on approximately circular historical clusters and greatly improves detection for noncircular clusters.

PMC

Anthrax

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5799185/

Transcriptomic changes in the pre-implantation uterus highlight histotrophic nutrition of the developing marsupial embryo

Early pregnancy is a critical time for successful reproduction; up to half of human pregnancies fail before the development of the definitive chorioallantoic placenta. Unlike the situation in eutherian mammals, marsupial pregnancy is characterised by a long pre-implantation period prior to the development of the short-lived placenta, making them ideal models for study of the uterine environment promoting embryonic survival pre-implantation. Here we present a transcriptomic study of pre-implantation marsupial pregnancy, and identify differentially expressed genes in the Sminthopsis crassicaudata uterus involved in metabolism and biosynthesis, transport, immunity, tissue remodelling, and uterine receptivity. Interestingly, almost one quarter of the top 50 genes that are differentially upregulated in early pregnancy are putatively involved in histotrophy, highlighting the importance of nutrient transport to the conceptus prior to the development of the placenta. This work furthers our understanding of the mechanisms underlying survival of pre-implantation embryos in the earliest live bearing ancestors of mammals. Introduction While eutherian mammals primarily nourish their embryos via a placenta, a key feature of marsupial reproduction is a very short period of placentation during a short gestation, followed by an extended investment in lactation 1 . In eutherians, the embryo becomes closely apposed to the uterine epithelium, before implanting into the uterine tissue very early in pregnancy to form the placenta e.g. 2 – 5 . In contrast, marsupial implantation and placentation do not occur until at least two thirds of the way through pregnancy, making marsupials ideal models for studying the uterine environment required for survival of the mammalian early embryo. In marsupials, the embryo remains unattached within the uterine lumen for most of pregnancy, and is reliant on uterine secretions for nutrient supply 4 , 6 . The conceptus is coated in several layers, including a tough outer shell coat secreted by the epithelial cells and endometrial glands of the utero-tubal junction and cranial part of the uterus 7 , 8 . The shell coat persists until implantation, and is permeable to gases and other small molecules of up to 40 kDa in size, permitting histotrophic nutrition 9 . The shell coat may also prevent maternal immune attack of the embryo 8 . At implantation, the embryo hatches from the shell coat, enabling placentation through direct contact between the trophoblast and the receptive maternal uterine epithelium 3 , 10 . Placentation in marsupials has been well-studied from morphological e.g. 5 , 11 , 12 , physiological e.g. 13 , 14 and genetic e.g. 15 – 17 perspectives. In contrast, pre-implantation marsupial pregnancy has received much less attention, particularly from genetic studies, which have focused on the immunological changes in the uterus 15 , 18 . Understanding the complete physiology of pre-implantation marsupial pregnancy is important, because this period represents the majority of gestation, when the embryo is growing and undergoing early organogenesis 19 . The physiology of this period of mammalian pregnancy is an important area of medical research e.g. 20 , due to the high rate of human pregnancy failure [~40–50% of human pregnancies are lost before 20 weeks, 75% of which have been attributed to implantation failure 21 ]. Failure to implant is also a major impediment to assisted reproductive technologies such as IVF 21 . As successful establishment of pregnancy requires both a healthy conceptus and a receptive uterus, information about both the maternal and the embryonic components during mammalian pregnancy is required to fully understand implantation 22 . In this study, we describe the uterine transcriptome of the model marsupial Sminthopsis crassicaudata (fat-tailed dunnart) in the period of pre-implantation uterine receptivity. The fat-tailed dunnart has a very brief (13.5 day) pregnancy 23 . Prior to implantation, which occurs around day 10 of pregnancy, the conceptus lies closely apposed to maternal tissues within folds of the uterine epithelium 8 , 24 , 25 . Subsequently, a yolk sac placenta forms, which erodes part of the maternal epithelium but does not breach maternal capillaries i.e. endotheliochorial placentation 3 . As the pre-implantation shelled embryo spends twice as long in the uterus as the period of placental attachment, modifications of the uterine environment for efficient gas, nutrient and waste transport must occur during the pre-implantation phase early in pregnancy. The ultrastructural modifications to cell-cell adhesion in the early pregnant S. crassicaudata uterus are possibly related to these functional requirements 12 , 26 , 27 . Here, we describe the uterine pre-implantation transcriptome in S. crassicaudata and identify the broad genetic underpinnings of maternal maintenance of the early marsupial conceptus during pregnancy. We focus on identifying the genes underpinning nutrient transport, which we hypothesise are critical in nourishing the developing embryo prior to the formation of the placenta. Results Transcriptome sequencing and annotation Our transcriptome sequencing recovered ~29–35 million paired reads from each of 3 pregnant (days 6–8 of pregnancy) and 3 non-pregnant dunnart uteri. After normalisation, 50.7 million reads were assembled into 234,671 transcripts from 136,066 'genes' using Trinity 28 . The longest was 25,519 bp, the shortest 201 bp and the mean length 1,371.3 bp. We assessed the assembly completeness using BUSCO 29 and recovered 90% complete or partial alignments of 3950 mammalian orthologs. All sequence data have been uploaded to GenBank (BioProject ID PRJNA399240). We used Kallisto 30 to estimate abundance and DESeq2 31 to call differential expression. In total, 1,871 transcripts were differentially expressed between pregnant and non-pregnant animals (FDR-adjusted P  8) was used for downstream analysis. Samples for transcriptomics were sequenced after Truseq RNA sample prep with on an Illumina HiSeq 2500 with 100 bp paired-end sequencing, at the Ramaciotti Centre for Genomics, Sydney, Australia. Reads from all samples were combined in a de novo assembly with Trinity v2.0.4 28 , using the default parameters and the–trimmomatic and–min_kmer_cov 2 options. To assess the assembly completeness we used BUSCO v2.0.1 29 with the default parameters in the transcriptome mode (-m tran), and searched against the tetrapod set of orthologs (tetrapoda_odb9). We used Kallisto 30 to estimate abundance and DESeq2 31 to call differential expression as implemented in the Trinity pipeline. We assessed correlation of gene expression between samples using the PtR script in Trinity. We annotated transcripts and assigned GO terms using the default parameters of the Trinotate pipeline v3.0.2 28 ; which allowed us to identify particular gene functions on which to focus our analyses. Graphical representation of enriched GO terms was carried out using the cateGOrizer tool 97 . KEGG pathway analysis of annotated genes was carried out using DAVID version 6.8 (available: http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp , last accessed June 2017) 98 , using EASE score of 0.1 and M. domestica as background. P-values were Benjamini-Hochberg corrected to account for multiple hypothesis testing. Differentially expressed genes between non-pregnant and pre-implantation uterus in M. domestica were compared to the S. crassicaudata uterine gene expression data using discontiguous megablasts optimised for cross-species comparison, using the –task dc-megablast option and the default parameters. Monodelphis domestica transcripts 18 identified as differentially expressed between non-pregnant and mid-gravid (pre-implantation) uterus (adjusted P  8) was used for downstream analysis. Samples for transcriptomics were sequenced after Truseq RNA sample prep with on an Illumina HiSeq 2500 with 100 bp paired-end sequencing, at the Ramaciotti Centre for Genomics, Sydney, Australia. Reads from all samples were combined in a de novo assembly with Trinity v2.0.4 28 , using the default parameters and the–trimmomatic and–min_kmer_cov 2 options. To assess the assembly completeness we used BUSCO v2.0.1 29 with the default parameters in the transcriptome mode (-m tran), and searched against the tetrapod set of orthologs (tetrapoda_odb9). We used Kallisto 30 to estimate abundance and DESeq2 31 to call differential expression as implemented in the Trinity pipeline. We assessed correlation of gene expression between samples using the PtR script in Trinity. We annotated transcripts and assigned GO terms using the default parameters of the Trinotate pipeline v3.0.2 28 ; which allowed us to identify particular gene functions on which to focus our analyses. Graphical representation of enriched GO terms was carried out using the cateGOrizer tool 97 . KEGG pathway analysis of annotated genes was carried out using DAVID version 6.8 (available: http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp , last accessed June 2017) 98 , using EASE score of 0.1 and M. domestica as background. P-values were Benjamini-Hochberg corrected to account for multiple hypothesis testing. Differentially expressed genes between non-pregnant and pre-implantation uterus in M. domestica were compared to the S. crassicaudata uterine gene expression data using discontiguous megablasts optimised for cross-species comparison, using the –task dc-megablast option and the default parameters. Monodelphis domestica transcripts 18 identified as differentially expressed between non-pregnant and mid-gravid (pre-implantation) uterus (adjusted P < 0.001) were searched against the S. crassicaudata uterine transcriptome assembly, and the results compared to the S. crassicaudata differential gene expression results from DESeq2. Differentially expressed genes shared between the two species were analysed using the DAVID functional annotation tool version 6.8 (available: http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp , last accessed November 2017) 33 , with GO_ALL biological process, cellular component and molecular function terms, using M. domestica as background. The Functional Annotation Clustering option was used to group significantly enriched GO terms using a modified Fisher's Exact Test by function and the DAVID Fuzzy clustering algorithm 33 . Grouping was performed using DAVID settings for highest stringency and P-values were Benjamini-Hochberg corrected to account for multiple hypothesis testing. KEGG pathway analysis using DAVID was carried out using an EASE score of 0.1 and Benjamini-Hochberg corrected P-values. Data availability statement All sequence data have been uploaded to GenBank (BioProject ID PRJNA399240). Electronic supplementary material Supplementary Material Supplementary Material Electronic supplementary material Supplementary information accompanies this paper at 10.1038/s41598-018-20744-z.

PMC